Apresentação do PowerPoint

CONTROLE MICROBIOLÓGICOPREVENÇÃO DE PERDAS
E DA FLOCULAÇÃO
Profª Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis
Porf. Dr. Edilson José Guerra
PRINCIPIO: o conhecimento das causas que
conduzem aos problemas é que poderá proporcionar
soluções viáveis.
Na industria sucroalcooleira as perdas em uma safra
são provenientes de diferentes áreas, que nem
sempre estão sobre o controle humano, tais como:
•Área agrícola: depende do clima;
•Área industrial: depende da engenharia das máquinas
e do designer do processo instalado;
•Área
operacional:
deve
estar
coordenada com todas as demais.
completamente
Portanto, o conhecimento integrado de todos os
setores deve existir dentro do limite de cada um.
Com certeza, o controle terá condições de ser
exercido com mais facilidade quando a referência é a
PRODUÇÃO DE ÁLCOOL
Ainda:
A produção de açúcar e álcool com eficiência está
vinculada aos acontecimentos de todo o complexo que
envolve uma usina produtora de açúcar e álcool, assim
como de uma destilaria autônoma.
Em qualquer dos processos industriais seja usina ou
destilaria os microrganismos estão presentes.
Para o controle dos microrganismos é necessário
conhecê-los, pois podem pertencer a diferentes
domínios :
• Bactérias
• Eucariotos: destacando-se aqui as leveduras
Cada grupo requer formas específicas de
manutenção, crescimento e controle.
• BACTÉRIAS – PROCARIOTOS
• Seres primitivos
As formas predominantes na indústria
sucroalcooleira são:
Esféricas = cocos Alongadas = bastonetes
As bactérias heterotróficas são as mais
freqüentes nas usinas.
As bactérias para se desenvolverem na indústria
utilizam os componentes do caldo de cana para
suprir suas necessidades.
Nestas condições podem causar grandes prejuizos:
• Diminuem o rendimento geral: açúcar e álcool;
• Produzem ácidos orgânicos (ácido láctico);
• Produzem gomas (dextrana);
• Interferem com a atividade da levedura ao:
- diminuir a viabilidade e brotamento;
- causar a floculação.
ORIGEM DAS BACTÉRIAS NO PROCESSO
O solo é o grande reservatório de
microrganismos e atingem a indústria por
vários caminhos:
• Terra aderida à cana;
• Poeira trazida pelo vento;
• Água de lavagem;
• Assepcia inadequada do caminho do caldo
permitindo a formação de biofilmes
Embora as indústrias hoje são bem cuidadas, e
possuem bons controles, ainda assim, os processos não
são assépticos.
Isto deixa os processos vulneráveis à contaminações
por bactérias e leveduras.
Numa seqüencia bem geral os processos resumem-se
no seguinte esquema
PRINCIPAIS ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO
Colheita da cana
Transporte para a indústria
Lavagem da cana
Trituração e moagem
Purificação do caldo (peneiramento)
Aquecimento/ Sulfitação /Calagem
Decantação e filtração
Resfriamento em trocadores de calor
Melaço
Mel ou água
Preparo do mosto
Fermento
Fermentação
Tratamento
Centrifugação
pé de cuba
Creme ou leite
de levedura
ÁLCOOL
Vinho
Destilação
Vinhaça
• Todos os pontos requerem vigilância
constante quanto á presença de bactérias no
clado e nas máquinas e tubulações.
Mediante o controle dos diferentes pontos há
possibilidade de rastreamento das
contaminações.
O controle pode ser feito mediante:
• Microscopia - (mais difícil);
• Cultivo de bactérias – em placas ou chips;
• Método de óxido-redução (relativo)
• Análise de metabólitos- ex.ácido láctico
(cuidado com as formas D e L do ácido láctico).
O laboratórista atento vai verificar a presença das
bactérias e mediante isolamento em cultura pura.
A partir destas culturas pode-se fazer os testes de
indução da floculação, mesmo que não tenha ocorrido
no processo: é a PREVENÇÃO
Quanto mais conhecimento sobre a (s) bactérias das
culturas puras, melhor serão as ações sobre o seu
controle e a sua eliminação. Assim é importante
conhecer:
¾Resistência a diferentes temperaturas;
¾Temperatura máxima e mínima de crescimento;
¾Esporulação;
¾Sensibilidade ao etanol;
¾Sensibilidade ao pH
¾Produção de metabólitos ácidos;
¾Produção de goma;
¾Consumo de álcool.
Deixar tudo registrado e se possivel documentar
com fotos, esquemas, diagramas, figuras.
Isto vai facilitar quando o problema surgir em
outras ocasiões.
Asim, não haverá dúvidas e comparações são
sempre úteis.
• Abordaremos o controle preventivo da floculação,
pois após ocorrer o fenômeno, os gastos para
retomar o processo à normalidade são grandes
[ isto é PREJUIZO]
Os mecanismos de floculação são diversos:
•indução por bactérias;
•causas químicas; (fatores reversíveis)
•Fator genético (irreversível)
-O procedimento que será descrito foi utilizado por
GUERRA (1995) em uma unidade industrial, onde
ocorria persistente floculação safra após safra.
Os estudos iniciaram-se antes de surgir o problema,
pois previa-se a futura ocorrência.
Ponto de coleta escolhido: entre dorna 1 e 2 (processo
de fermentação contínua), média do Brix era 5º e 8,5º
alcoólico, pH 4,3
AÇÕES A SEREM PROVIDENCIADAS
1. Exame microscópico constante do fermento, pois
as bactérias podem estar na dorna desde o início e
os flocos (5 ou 6 células aglomeradas) ainda não
apareceram de forma característica. Mesmo que
seja apenas um floco, o problema já é severo e as
medidas a serem tomadas são imediatas.
2 - Isolamento da bactéria e da levedura.
Bactéria pode induzir a floculação.
Levedura pode ter fator genético, químico e
bacteriano.
O isolamento da levedura deve ser feito quando o
fermento chega na usina e deve ser guardado em
tubos para ser a referência.
3 - Cultivar constantemente as bactérias
e a levedura do processo.
Ficar atento ao aparecimento de biotipos
diferentes.
Isolar em cultura pura ambas (bactérias e
leveduras), mantê-las em estoque para
comparações.
Documentar fotograficamente sempre.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Cultivar a levedura em cultura pura em CSN, 15º Brix
em Erlenmeyer de 250mL, podendo-se seguir o
seguinte protocolo: -Preparo do inóculo com levedura
Levedura
Cultivo
de proceso
em cultura pura
Meio CSN
15ºBrix
INÓCULO com
levedura
- Preparo do inóculo com bactéria
CSN +
Purificação
Ciclohexamida
CSN 8ºBrix
CSN
Inóculo
com bactéria
Protocolo experimental de indução da floculação
Inóculos
Volume
Bactérias
Pool
(mL)
1 2 3 4
1+2 + 3 + 4
mL de inóculo
20
20 20 20 20
20
levedura
mL de inóculo
10 10 10 10 2,5 +2,5 + 2,5
bactéria
+2,5
mL H2O
10
10
esterilizada
CSN 15º Brix
70
70 70 70 70
70
Floculação
Legenda: (-)negativa (+)fraca (++)média (+++)intensa
Período de incubação e leitura:
Deixa-se crescer 24 horas e depois verifica-se a
intensidade da floculação. Pode ser em proveta
(visual) ou em colorímetro.
Procura-se para o controle das bactérias que
induziram a floculação suas características principais:
- morfologia: cocos ou bastonetes
-Teste de Gram : (+) ou (-)
-Sensibilidade: antibiograma para seleção do biocida/
antibiótico.
-Teste CMI = CIM = MIC: determina a concentração
inibitória mínima ao qual a bactéria é mais sensível.
Pode acontecer de uma bactéria ser sensível a
um produto e outra ser resistente, mas ambas
estão circulando no processo. Neste caso,
associar os produtos aos quais ambas são
sensíveis para eliminar as espécies de
bactérias que induzem a floculação ou
produzem outros distúrbios ex: produção de
ácido láctico.
Quando se trata de uma população mista
(ex.vinho) pode-se aplicar um microbiocida de
amplo espectro para eliminar a maior parte
das bactérias.
Para documentar a floculação pode-se usar
um colorímetro ou apenas o visual.
Com colorímetro pode-se usar λ 540-600.
Microrganismos
Tempo Levedura
de
Min.
1
2
3
processo
0
0,749
0,750 0,730 0,740
Pool
1+2+3
0,740
20
0,720
0,730
0,710
0,720
0,700
40
0,710
0,691
0,670
0,650
0,610
50
0,700
0,540
0,490
0,510
0,400
60
0,700
0,500
0,450
0,450
0,300
Maior densidade ótica mais intensa é a floculação.
Quando a avaliação é visual pode-se usar as linhas de
Wickerhan para auxiliar.
Estas linhas poderão auxiliar nas anotações.
Para documentar a floculação visualmente
pode-se optar por um protocolo simples.
Tempo Levedura Levedura
de
selvagem
Min.
processo
0
-
Microrganismos
Pool
1
2
3
1+2+3
-
-
-
-
30
-
-
+
++
-
++
60
-
++
+++
+++
-
+++
É importante fazer tubos em triplicatas.
O processo visual é mais impírico mas pode
ser um recurso eficiente.
Para que a floculação ocorra é importante
considerar o n° de bactérias em relação ao n°
de células de levedura.
Nesta situação pode-se optar por um protocolo,
como por exemplo.
Volumes
mL de
S.cerevisiae
mL de salina
1 2
9 9
Número de tubos
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
1 1
1
Bactéria 1
9,3x108 (mL)
1 1 1
Bactéria 2
9,5x107(mL)
1 1 1
Bactéria 3
9,5x106 (mL)
Floculação
Tempo (min.)
1 1
Controle
<3
<3
= 60
1
Como verificar as características das
bactérias indutoras da floculação.
Ex: verificação quanto ao crescimento em
diferentes temperaturas após 24 horas de
inoculação da cultura pura.
Temp. °C
Bactéria 1
Número de tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
36
40
45
50
+ + + + + + + + + - -
Bactéria 2 + + + +
+
+ -
-
-
-
-
-
Bactéria 3
Levedura
+
-
+ - -
-
-
-
-
-
+ + + +
+ + + -
+++ crescimento normal
--- crescimento ausente
Choque térmico na cultura
Cultivar a bactéria em CSN 9° Brix durante 24
h a 36°C. A seguir colocar os tubos a 100°C
durante 3 min. Resfriar.
A seguir colocá-los para desenvolverem o
crescimento das bactérias em diferentes
temperaturas.
NÚMERO DE TUBOS
T ºC de
crescimento
1 23 4 5 6 7 8 9
50
60
70
10 11 12 13 14 15
80
90
Crescimento
Bactéria 1
+ + + + + + + +
+
+
+
+
+
+
+
Crescimento
Bactéria 2
+ + + + + + + +
+
-
-
-
-
-
-
Crescimento
Bactéria 3
+ + + - - - - -
-
-
-
-
-
-
-
+++ crescimento normal
--- crescimento ausente
Crescimento das bactérias indutoras da floculação
frente a diferentes pH, cultivadas em meio CSN
durante 24 horas a 36°C
NÚMERO DE TUBOS
pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2,5
3,0
4,0
6,0
7,0
Crescimento
Bactéria 1
- - -
+ + + + + + +
+ + -
-
-
Crescimento
Bactéria 2
- - -
- - - + + + +
+ + -
-
-
Crescimento
Bactéria 3
- - -
- - - + + + +
+ + + + -
+++ crescimento normal
--- crescimento ausente
++- crescimento reduzido
Procedimento de verificação da variação do pH das
bactérias cultivadas em meio CSN durante 24 horas a
36°C
Culturas
de
Bactérias
Bactéria 1
Tempo de cultivo
0
1
2
4
4,0 4, 4,0 3,
0
9
Bactéria 2 4,0 4, 3,9 3,
0
9
Bactéria 3 4,0 4, 4,3 4,
3
1
6
8
10
…24 Variação do pH
3,7
3,8 3,4
3,4
0,6
3,7
3,7 3,4
3,2
0,8
4,0
3,9 3,8
3,4
0,9
Verificação da acidez (mg NaOH/100 ml) do meio de
cultivo para verificar a capacidade de produção de
ácido pelas bactérias cultivadas em meio CSN
durante 24 horas a 36°C
Acidez (mg NaOH/100mL)
Meio de
cultura
0
2
6
10
24
Variação
da acidez
Bactéria 1
3,06
3,99
4,84
7,1
7,90
9,07
6,01
Bactéria 2
3,06
3,75
4,89
6,86
10,49
10,49
7,43
Bactéria 3
3,06
3,60
3,93
5,57
7,80
9,95
6,84
S.cerevisiae
3,06
3,10
3,80
4,1
4,50
4,80
1,14
Culturas
Verificação do decaimento dos graus Brix,
teor alcóolico, acidez e porcentagem do
fermento com a levedura de processo
contaminada experimentalmente com as
bactérias 1; 2 e 3 cultivadas em meio
CSN 16,6 ° Brix, 24 horas a 36°C
(t i li
t )
MÉDIA DOS º BRIX
Tempo
(horas)
S.
cerevisiae
Culturas de bactérias
1
2
3
0
13,3
14,1
14,2
14,1
15
8,4
9,3
8,7
9,7
20
5,0
6,5
7,3
7,5
24
3,7
4,8
4,8
5,5
1,29
3,44
3,12
3,8
% alcool
8,2
7,17
7,36
7,23
% V fermento
5,0
4,8
2,9
2,5
Acidez
mg NaOH/100mL
Pode-se verificar ainda a produção de glicerol.
Avaliação comparativa nas primeiras 15 horas de
fermentação dos efeitos exercidos pelas bactérias 1; 2
e 3 e o pool (1+2+3) sobre a fermentação alcóolica.
Cultura com 15 horas de fermentação
S.
Culturas de bactérias
cerevisiae
1
2
3
1+2+3
% viabilidade
99,7
92,2
90,5
88,3
86,7
%
brotamento
18,0
4,6
1,6
5,4
7,3
% de brotos
mortos
98,5
61,7
51,4
68,1
61,4
1,4 x 108
7,9 x 107
8,4 x 107
8,5 x 107
6,2 x 107
-
1,9 x 108
1,7 x 108
3,8 x 108
2,6 x 108
Nº celulas de
leveduras/mL
UFC/mL
bactérias
Avaliação comparativa dos dados das culturas
Cultura com 15 h de fermentação
Levedura e cultura de bactérias
1
2
3
1+2+3
% da diminuição
da viabilidade
7,5
9,2
11,5
13,0
% diminuição do
brotamento
74,4
91,2
70,0
59,4
%diminuição
viabilidade do
brotamento
37,4
47,8
30,9
37,7
% diminuição
levedura
43,6
40,0
39,3
55,7
Como controlar as bactérias?
Teste de antibiograma.
Cultivar as bactérias em meio CSN liquido por 24
h a 30°C, a seguir colocar 0,1mL da cultura na
superfície de uma placa contendo CSN sólido.
Esparramar com espátula de Drigalsky ou
swab.
Embeber discos virgens de celulose com os
antibióticos/biocidas e colocar na superfície da
placa.
Incubar na posição invertida durante 24 h, 36°C e
medir o halo de inibição em mm.
Agente antimicrobiano
Culturas
Bactéria 1
Kamoran Sanicol Quaternario de
amônio
25
25
30
Bactéria 2
25
30
35
Bactéria 3
25
30
-
-
-
-
S. cerevisiae
(-) ausência de inibição
Este quadro é apenas hipotético.
Avaliação da sensibilidade a diferentes
concentrações de antimicrobianos.
Teste de Concentração Mínima
Inibitória (CMI) em meio de CSN 9º Brix
com verde de bromo cresol, cultivado
durante 24 horas a 36 ºC.
Penicilina V Potássica [ ] ppm
Culturas
Bactéria 1
0,5
+++
1,0
+++
2,0
+++
3,0
+++
4,0
---
Bactéria 2
+++
+--
---
---
---
Bactéria 3
+++
+++
+++
+++
+++
Pool(1+2+3)
+++
+++
+++
+++
+++
+++ crescimento normal
+--- crescimento mínimo
+-- crescimento diminuto
--- ausência de crescimento
Nestas condições é necessário testar outros
antimicrobianos, e a eficiência das
associações. Enquanto houver uma
linhagem resistente o problema não se
resolve.
Hoje existe no mercado antibacterianos de
“largo espectro” que atuam sobre muitas
espécies de bactérias.
Contudo a aplicação correta destes produtos
deve sempre ser acompanhada de
antibiograma e de CMI.
Assim pode-se controlar as contaminações e
floculação.
“ Lembre-se: microbiologia representa
98% de transpiração
2% de inspiração”
Obrigada pela atenção
[email protected]