FUNGOS: um estudo sobre a sua ocorrência nos alimentos
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LEONARDO FILIPE DA SILVA FUNGOS: um estudo sobre a sua ocorrência nos alimentos Belo Horizonte 2008 LEONARDO FILIPE DA SILVA FUNGOS: um estudo sobre a sua ocorrência nos alimentos Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como exigência parcial para a conclusão do curso de Especialização em Microbiologia Área de Micologia. Orientador: Ary Correa Junior Belo Horizonte 2008 Autor: Leonardo Filipe da Silva Título: Fungos Subtítulo: um estudo sobre sua ocorrência nos alimentos Natureza: Trabalho de conclusão de curso Objetivo: Título de Especialista em Microbiologia Instituição: Universidade Federal de Minas Gerais Área de Concentração: Micologia Data da Aprovação: ____/____/____ BANCA EXAMINADORA: ____________________________________ ORIENTADOR DO CONTEÚDO ____________________________________ ORIENTADOR DA METODOLOGIA Aos meus pais, pelo incentivo nos estudos Aos amigos que sempre me apoiaram. RESUMO A ocorrência de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) vem aumentando de modo significativo em nível mundial. Vários são os fatores que contribuem para a emergência dessas doenças, dentre os quais destacam-se: o crescente aumento das populações, a existência de grupos populacionais vulneráveis ou mais expostos, o processo de urbanização desordenado e a necessidade de produção de alimentos em grande escala. Os fungos são microrganismos que podem crescer em diferentes substratos, podendo trazer benefícios ou causar doenças e contaminações. Nos alimentos, os fungos sob condições favoráveis podem multiplicar-se e provocar sua deterioração. Com objetivo de verificar possível contaminação de fungos em diferentes tipos de alimentos, foi realizado um levantamento sobre os locais onde sua ocorrência é maior, e quais os alimentos apresentam maior facilidade de contaminação. Pretende-se apresentar a diversidade de fungos presentes em diferentes tipos de alimentos e auxiliar na sua prevenção. Palavras-chave: Doenças. Fungos. Alimentos. SUMÁRIO INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 07 1 OS FUNGOS E AS SUAS RELAÇÕES .............................................................. 08 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 Grupos especiais de fungos deteriorantes de alimentos ..................................... Fungos xerofílicos ................................................................................................. Fungos termorresistentes ...................................................................................... Fungos toxigênicos ................................................................................................. 11 11 12 13 2 AS MICOTOXINAS NOS ALIMENTOS ........................................................... 15 3 PREVENÇÃO E CONTROLE DE DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTO............................................................................................................ 17 3.1 3.1 Objetivos da Vigilância Epidemiologia ......................................................... 18 4 ATITUDES DE RISCO DO CONSUMIDOR EM RESTAURANTES ........... 19 5 O CONTROLE DE QUALIDADE NA INDUSTRIA ALIMENTÍCIA 22 5.1 Programa estadual de monitoramento da qualidade de alimento-(Prog Visa) 23 5.2 O funcionamento do laboratório de micologia .................................................. 24 6 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 25 6.1 Metodologia utilizada para contagem e identificação de bolores e leveduras 25 viáveis em alimentos 6.2 6.3 6.4 6.5 Material ................................................................................................................. Reagentes ............................................................................................................... Procedimento ......................................................................................................... Cálculo para contagem de células ........................................................................ 25 25 26 26 7 TECNICAS PARA IDENTIFICAÇÃO .............................................................. 27 7.1 7.2 7.3 7.4 Purificação ............................................................................................................. Microcultivo ........................................................................................................... Preparo de lâminas de fungo filamentoso............................................................ Preparo da lâmina de gram .................................................................................. 27 27 27 28 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 29 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 30 7 INTRODUÇÃO A alimentação é necessidade básica para qualquer sociedade. Influencia a qualidade de vida por ter relação com a manutenção, prevenção ou recuperação da saúde. Deve ser saudável, completa, variada, agradável ao paladar e segura para, assim, cumprir seu papel. Vários são os fatores que contribuem para transmissão de doenças por alimentos, dentre os quais destacam-se: o crescente aumento das populações, a existência de grupos populacionais vulneráveis ou mais expostos, o processo de urbanização desordenado e a necessidade de produção de alimentos em grande escala. Contribui ainda, o deficiente controle dos órgãos públicos e privados, no tocante à qualidade dos alimentos ofertados às populações. Acrescentam-se outros determinantes para o aumento na incidência das doenças transmitidas por alimentos, tais como a maior exposição das populações a alimentos destinados ao pronto consumo coletivo “fast-foods”, o consumo de alimentos em vias públicas, a utilização de novas modalidades de produção, o aumento no uso de aditivos e a mudanças de hábitos alimentares, sem deixar de considerar as mudanças ambientais, a globalização e as facilidades atuais de deslocamento da população, inclusive no nível internacional. A alimentação é essencial para o homem desde o nascimento. É da alimentação que ele retira os nutrientes necessários ao funcionamento do organismo, ou seja, à vida. Esses nutrientes estão nas carnes e nos vegetais e a química orgânica se encarrega de transformá-los e distribuí-los de maneira que eles sejam úteis ao nosso organismo. Com o aumento da população, um estudo sobre a qualidade dos alimentos é de fundamental importância para o monitoramento do produto consumido pela população.Este trabalho tem como objetivo, apresentar um levantamento sobre a ocorrência de fungos nos alimentos. 8 1 OS FUNGOS E AS SUAS RELAÇÕES Os bolores e as leveduras são fungos, mas eles diferem na sua morfologia. As leveduras são unicelulares e geralmente maiores que as bactérias, são ovais, mas algumas vezes alongadas ou esféricas, não possuem flagelo. Os bolores são organismos multinucleados que aparecem como filamento. O corpo ou talo de um fungo filamentoso consiste em um micélio e nos esporos. Cada micélio é uma massa de filamentos chamada hifa. Cada hifa é formada pela reunião de muitas células. As paredes rígidas das hifas são formadas de quitina, celulose e glicose.(TANIWAK) A reprodução das leveduras é assexuada, comumente por brotamento ou gemulação. Os fungos filamentosos se reproduzem por disseminação dos esporos e o processo de germinação do esporo inicia-se com a formação de um tubo germinativo. A nutrição dos fungos ocorre por absorção, auxiliada por enzimas secretadas no meio, que quebram moléculas orgânicas em porções menores que podem ser transportadas mais facilmente para dentro da célula. Os fungos são microrganismos heterótrofos. Em laboratório, muitos fungos podem crescer em uma mistura chamada meio de cultura, contendo açúcar, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico, alguns minerais, vitaminas e outros nutrientes necessário para o seu crescimento. Mas nem todos se nutrem do mesmo modo alguns fungos podem ser: Fungos sapróbioss: a maior parte dos fungos obtém o alimento de que necessita a partir de organismos mortos ou de substâncias orgânicas em decomposição.São os saprófitos (do grego sapros = pútrido; phyton = planta). Uma das espécies mais comuns é o agáricocampestre (Psalliota campestris), freqüentemente cultivado em cavernas, sobre esterco fermentado. Fungos simbióticos: os fungos, grande parte em sua maioria, vivem em associação com outros organismos vegetais vivos, e cedem a estes uma parte de água que as hifas absorvem, inclusive no estado de vapor. Os "parceiros" do fungo, por sua vez, o suprem do alimento que estão em condições de produzir. Muito conhecida é a união entre fungos e algas. O produto dessa estreita associação é um tipo particular de organismo vegetal - os liquens – também chamado de parasitismo controlado onde os organismos são capazes de viver e desenvolver-se nos ambientes mais inóspitos. A relação de igual para igual, de intercâmbio 9 entre duas formas de vida diferentes, útil para ambas, é denominada simbiose (do grego syn = junto; bios = vida). Os fungos que vivem em simbiose com outros vegetais denominam-se simbiônticos. Fungos parasitas: os fungos que se desenvolvem à custa de outros organismos, sem que estes obtenham vantagens dessa associação, chamam-se parasitas. No mundo vegetal, o maior número de espécies parasitas encontra-se exatamente entre os fungos e chega a alguns milhares. Se um fungo parasitar o corpo de um organismo vivo, animal ou vegetal, poderá prejudicá-lo seriamente e até provocar a morte. Entre as doenças vegetais ocasionadas por fungos, cita-se a ferrugem, que, no Brasil, tem sido o flagelo dos cafezais. As micoses que atacam a pele de homens e animais (o pé-de-atleta, por exemplo) são provocados por fungos. O ergotismo é uma doença incurável que afeta pessoas e animais que ingiram cereais infectados pela cravagem do centeio, que é um fungo.( SAMSON) Os fungos são microrganismos largamente distribuídos no meio ambiente, incluindo o ar, a água, o solo e o pó. Como conseqüência os alimentos podem tornar-se contaminados com uma ampla variedade de espécies fúngicas originárias de fontes ambientais e que sob condições favoráveis podem multiplicar-se nos alimentos e provocar deterioração (TANIWAK). Os fungos apresentam uma grande versatilidade para crescer em substratos e condições que outros microrganismos não são capazes de utilizar, como por exemplo: a) crescimento em condições de atividade de água(a w) reduzida: dentro do limite de 0,65 até 0,99; b) crescimento em condições de pH reduzido: 3,0 e abaixo; c) crescimento em uma ampla faixa de temperatura < 0 °C a 40 °C; d) utilização de uma grande versatilidade de substrato como fontes de carbono, nitrogênio e energia; e) capacidade de esporulação e disseminação em diferentes condições. Estes atributos tornam os fungos potencialmente capazes de causar deterioração em alimentos com diferentes níveis de umidade e em condições climáticas que vão desde o subártico até o tropical. Os fungos são importantes em alimentos pelas seguintes razões: a) ao crescer nos alimentos causam mudanças indesejáveis, tanto na composição química quanto na estrutura e aparência. Desta forma, o alimento passa a ser rejeitado, o que representa perda econômica e/ou desperdício de matéria-prima; 10 b) podem produzir toxinas que representam sério risco para saúde humana e animal pois podem provocar doenças que levam à morte. Desta forma a detecção e quantificação de fungos são uma análise essencial na caracterização microbiológica dos alimentos, sendo a população fúngica um parâmetro importante no julgamento das condições de higiene e das praticas de controle durante a manufatura e distribuição de alimentos. A microbiologia de alimentos estuda a participação dos fungos na deterioração e/ou manufatura dos alimentos. O conhecimento da química e toxicologia, na detecção e enumeração dos fungos é muito importante.As técnicas para detecção e enumeração estão sendo incorporadas aos programas de garantia de qualidade microbiológica, sendo importante ressaltar que métodos de quantificação da biomassa fúngica também são importantes nos exames de biodeterioração e na avaliação dos processos fermentativos. Em geral, os fungos apresentam filamentos, as chamadas hifas, com paredes rijas, ricas em quitina, têm características heterotróficas, isto é, não possuem clorofila e, portanto, necessitam de material orgânico para viver, sendo sua nutrição feita por absorção de nutrientes graças à presença de enzimas que são por eles produzidas e que degradam produtos como, por exemplo, celulose e amido. Por outro lado, os fungos são eucarióticos, isto é, possuem um núcleo típico no interior de suas células, comparável ao das plantas e animais. Reproduzem-se por via sexual ou assexual e assim possuem divisões celulares do tipo mitose e meiose, tendo sempre como produto final os esporos que são órgãos de reprodução, resistência e disseminação. Na verdade, o reino dos fungos é um dos mais numerosos. Estimase que existam pelo menos um milhão e quinhentas mil espécies de fungos espalhadas pelo mundo. Isso é muito mais do que todas as espécies vegetais e animais somados, excluindo-se os insetos. E por incrível que pareça, apenas cerca de 70 mil espécies de fungos foram até hoje descritas, ou seja, menos de 5% das possivelmente existentes. 11 1.1 Grupos especiais de fungos deteriorantes de alimentos Os grupos especiais de fungos deteriorantes mais importantes em alimentos são os xerofílicos, os termorresistentes e os toxigênicos. Esses fungos são os principais perigos biológicos destes alimentos. Seu risco está na produção de micotoxinas por algumas espécies. Estes compostos ao serem ingeridos acumulam-se no organismo causando uma série de transtornos, desde ataques ao fígado a alguns tipos de cancer. 1.1.1 Fungos xerofílicos De acordo com a definição de Pitt fungos xerofílicos são aqueles capazes de crescer em atividade de água abaixo de 0,85, mesmo que não em toda e qualquer condição de pH, temperatura, potencial redox e outros fatores de crescimento. Os xerofílicos moderados são definidos como aqueles capazes de crescer em aw abaixo de 0,85, mas não são fastidiosos em seus requerimentos de condições especiais para crescimento. Neste grupo, encontram-se as espécies xerofílicas de Penicillium, Aspergillus (particularmente a série de Aspergillus restrictus) e Eurotium (série Aspergillus glaucus), as linhagens de Wallemia sebi e poucos outros.( SAMSON) Os xerofilicos fastidiosos extremos são aqueles que, além de exigirem aw reduzida para crescimento, também crescem pobremente quando o soluto no meio de cultura não é um açúcar. Nesse grupo encontram-se Xeromyces bisporus, Chysosporium fastidium, Chysosporium farinicola, Crysosporium inops, Crysosporium xerophilum, Eremascus albus e Eremascus fertilis. Os fungos Basipeptospora halophila e Polupaecium pisce são descritos como bolores halofílicos, que crescem melhor na presença de cloreto de sódio do que em meios só com carboidratos.( SAMSON) A maioria dos fungos capaz de crescer em baixa atividade de água pode também crescer em aw alta, porém algumas espécies exigem e dependem de condições de baixa a w para crescimento e desenvolvimento de colônias nos meios de recuperação. Essa codição é alcançada através da adição de humectantes como o cloreto de sódio, os álcoois poli-hídricos (glicerol ou propileno glicol) e os açúcares (glicose, frutose ou sacarose). A grande maioria dos fungos é incapaz de crescer na faixa de a w entre 0,61-0,70, com exceção das especies dos grupos Aspergillus glaucus e Aspergillus restrictus, das linhagens de Xeromyces bisporus e Wallemia sebi, das espécies de Chysosorium e algumas espécies de Eurotium e Scopulariopsis. Da mesma forma, somente poucas espécies de leveduras 12 conseguem crescer nesta faixa de a w, sendo descritas como osmofílicas, pois costumam deteriorar produtos com alto teor de açúcar. A espécie mais comumente implicada é Zygosaccharomyces rouxxi, associada à deterioração de xaropes de açúcar de cana, xaropes de frutas, caldas de chocolate, mel, produtos confeitados, geléias, concentrados de frutas e frutas secas. Alguns destes produtos também podem ser deteriorados por Zygosaccharomyces bailli, porém, essa espécie é mais comum em alimentos ácidos como os molhos de saladas, maionese e pickles, com aw maior. X. bisporus, o fungo mais xerofílico conhecido até o momento, é um importante deteriorador de alimentos com baixa aw. Tem sido isolado de ameixas secas e outros alimentos como tâmaras e alcaçuz. O baixo índice de ocorrência desse fungo na análise de alimentos deve-se, provavelmente, muito mais aos métodos inadequados de isolamento, do que à sua ausência nos produtos( PITT). As frutas secas, com a w menos que 0,70, são bons substratos para o crescimento de X. bisporus, C. fastidium e umas poucas espécies de Eurotium. Em geléias estes xerofílicos podem crescer tão bem como outros fungos menos tolerantes à baixa a w. As espécies de Eurotium e a série de A .restrictus estão entre os xerofílicos mais prevalentes na invasão de grãos e condimentos. Além destes, W. sebi, Aspergillos, Penincilios e outros bolores capazes de crescer em a w menor que 0,85 são comumente encontrados nesses produtos (PITT). O desenvolvimento de fungos xerofílicos pode ser evitado nos alimentos com a w menor que 0,65, se essa condição for mantida durante todo período de estocagem. Em alimentos com aw superior à 0,70, já existe a possibilidade de deterioração microbiana, embora outros fatores estejam envolvidos, com a temperatura de estocagem, a disponibilidade de oxigênio, a presença de antifúngicos, os métodos de garantir a manutenção da a w e o número e tipos de microrganismos xerofílicos presentes. A contaminação dos alimentos por microorganismos xerofílicos deve ser evitada, mesmo que as codições não permitam o crescimento, pois podem sobreviver por longos períodos, contaminar outros alimentos ou causar problemas após a reidratação. 1.1.2 Fungos termorresistentes Como a maiorias dos microrganismos, os fungos são destruídos pelo calor, sendo o micélio inativado por um tratamento térmico de poucos segundos a 80 ºC. Os esporos são mais resistentes do que o micélio, embora menos resistentes do que os de bactérias. Os 13 conídios das espécies de Aspergillus são inativados a 70 ºC por 10 min., enquanto os ascoporos de Eurotium requerem 80ºC (PITT,1996, p. 84). Ocasionalmente, algumas espécies sobrevivem a temperaturas de 100 ºC por períodos curtos (SAMSON, 2002, p 47). Os esporos fúngicos causam problemas em alimentos ácidos preservados por pausterização, onde as bactérias não são capazes de crescer. Os fungos mais resistentes são os ascomicetos, que apresentam um estágio sexuado no ciclo de vida, no qual produzem ascosporos mais resistentes do que os conídios. A deterioração de frutas e produtos termoprocessados de frutas por linhagens termorresistentes de Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Neosartorya fischeri, Talaromyces flavus, T. bacillisporus e Eupenicillium brifeldianum têm sido descritos (PITT, 1996, p. 121). B. fulva e B. nivea causam problemas consideráveis para a indústria de alimentos, porque ocorrem em produtos de grande significado econômico, como os sucos de frutas, geralmente conservados pela pausterização (PITT, 1996, p. 147). As espécies de Byssochlamys podem também produzir dióxido de carbono quando crescem sob condições de baixo teor de oxigênio, provocando estufamento das embalagens de sucos, bem como deteriorização visualmente percebidas em recipientes transparentes, ou ainda deterioração de frutas enlatadas ou enfarrafadas. Os ascosporos de Byssochlamys sp. e alguns outros fungos temorresitentes, sobrevivem á temperaturas de ordem de 90 ºC, por períodos prolongados. O tempo de redução decimal de B .fulva á temperatura de 90 ºC encontra-se em torno de 1 e 12 mim, dependendo do isolado, pH, aw , presença de conservadores e níveis de açúcar. A suceptibilidade ao calor aumenta com a redução do pH e presença SO2 e diminui com a elevação da concentração de açúcar. Os ascoporos de Neosartorya fischeri são mais resistentes ao calor do que os de Byssocharlamys, mas esta espécie tem sido raramente implicada na deterioração de alimentos.(SAMSON,2002) 1.1.3 Fungos toxigênicos Desde a descoberta da aflatoxina, em 1960, é reconhecida capacidade de muitos fungos de origem alimentar em produzir micotoxinas. As micotoxinas representam um sério risco para a saúde humana e animal (PITT, 1996, p. 135), embora a gravidade dos casos de envenenamento seja muito variável, dependendo das espécies envolvidas. Os dados permitem observar que uma mesma toxina pode ser produzida por uma variedade de fungos diferentes, como a patulina, por exemplo, produzida por Aspergillus 14 clavatus. Aspergillus terreus, Penicillium expansum e P. griseofulvum. Também pode-se observar que alguns fungos são capazes de produzir várias toxinas diferentes, como Aspergillus flavus, por exemplo, que produz aflatoxinas, aflatrem, ácido aspergílico, ácido ciclopiazônico. Nem todos os fungos produzem toxinas, de forma que a simples presença de fungos em um alimento não implica em que toxinas tenham sido ou venham a ser produzidas. Por outro lado, a simples ausência de sinais visíveis de emboloramento também não pode ser interpretada como ausência de toxinas, pois as toxinas podem permanecer em um alimento mesmo depois que o fungo que a produziu tenha desaparecido do produto processado (SOARES,2000). 15 2 AS MICOTOXINAS NOS ALIMENTOS Os problemas causados pelo desenvolvimento de fungos nos alimentos e suas matérias-primas são motivo de preocupação para a indústria de alimentos para animais. Não apenas pelo fato de reduzir consideravelmente os valores nutritivos do produto no qual se utilizou grãos contaminados, mas também pelas micotoxinas que se encontram presentes uma vez que haja a contaminação fúngica.Pesquisadores, fabricantes de alimentos e demais envolvidos na cadeia da produção animal buscam alternativas capazes de, se não eliminar, minimizar as perdas causadas, tanto por fungos como por seus metabólitos tóxicos, às “Micotoxinas”( ZANDONAD,2007). Existindo o desenvolvimento de fungos nos grãos e subprodutos, matérias-primas básicas de rações para animais, seu valor nutritivo cai drasticamente, porque seus nutrientes são utilizados pelos fungos em seu metabolismo. Os principais nutrientes afetados pela contaminação por fungos são as proteínas, os carboidratos, os aminoácidos e os ácidos graxos. O conteúdo e propriedades físico-químicas do óleo dos grãos (Martinez, 1997) também são afetados. Em especial nos países tropicais, as perdas causadas por fungos são em torno de 4 %, podendo chegar até 30 % em alguns países, principalmente, devido a temperaturas e umidades relativas altas, onde as chuvas possam evitar uma secagem adequada dos grãos e, serviços de transporte e armazenagem inadequados que podem propiciar a quebra dos grãos e o ataque de insetos, respectivamente. O desenvolvimento de fungos pode acontecer sem haver sinais visíveis ao olho humano, podendo, desta forma invadir os grãos destruindo o embrião e rompendo os grânulos de amido no endosperma. As perdas em energia metabolizável no milho podem variar de 5 % a 25 %, sendo as gorduras destruídas mais rapidamente do que as proteínas e carboidratos. Também observou-se queda no conteúdo de aminoácidos no trigo mofado, sendo a cisteína, lisina e arginina os mais afetados. Os fungos também apresentam atividade lipásica elevada, determinando mudanças que deterioram os grãos de oleaginosas, demonstrado pelo aumento do conteúdo de ácidos graxos livres dos grãos.Talvez um efeito ainda de maior impacto seja a presença de micotoxinas, produtos do metabolismo fúngico que se desenvolvem-se nos cereais, oleaginosas e seus subprodutos. Numerosos trabalhos relatam os efeitos danosos das micotoxinas sobre as espécies domésticas. Por exemplo, muitas micotoxinas prejudicam o sistema imunológico causando reações específicas a antibióticos, funções medidas por células, ou ambas; levando a uma diminuição da resistência, a possibilidade do fracasso das vacinas, aumento da morbidez e mortalidade, que é caracterizado por moléstias infecciosas de origem bacteriana ou virótica. Durante esses 16 episódios, a necrópsia revela claramente um agente de doença infecciosa, cuja origem etiológica é prontamente diagnosticada. Neste caso, muitas vezes não descobrindo outros fatores predisponentes, como micotoxinas. Desta forma, as micotoxicoses crônicas ocorridas no campo, na maioria das vezes passam desapercebidas ou confundidas com outros males, levando a severas perdas econômicas que, felizmente, hoje em dia começam a ser quantificadas, sendo então, implementadas medidas preventivas, testes diagnósticos e produtos para o seu combate(ZANDONAD,2007). De um modo geral as micotoxinas são capazes de causar stress nas células imunológicas tornando-as inabilitadas para combater agentes infecciosos como bactérias que possam invadir o organismo dos animais. Quando ingeridas em doses baixas, as micotoxinas levam a uma morte prematura de tais células, processo este denominado “Apoptosis” que tem como resultado um aumento da susceptibilidade a infecções por microrganismos patogênicos. Em dosagens maiores chegam a causar lesões hepáticas que interferem nas funções normais do fígado, afetando a produção de bile como é o caso da Aflatoxina que somada a outras micotoxinas como Ocratoxina, Toxina T-2 e Rubratoxina aumentam a fragilidade capilar, provocando hemorragias e hematomas principalmente em aves, ocasionando, consequentemente, a condenação das carcaças nos abatedouros por hematomas. A Zearalenona quando consumida através de alimentos contaminados tem sido responsável por danos reprodutivos como mortalidade embrionária, abortos e cios irregulares em porcas e marrãs. Citrinina e Ocratoxina também têm sido relacionadas a casos de nefropatias em suínos. Paralelamente aos relatos de casos patológicos determinados pela contaminação dos alimentos por micotoxinas, vão surgindo dados importantes de pesquisas que estudam a ocorrência de contaminação fúngica e presença destas nas matériasprimas e rações utilizadas na alimentação animal. (KARAM, M. O. et. al.) 17 PREVENÇÃO E CONTROLE DE DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS 3 Vários países da América Latina estão implantando ou implementando sistemas nacionais de vigilância epidemiológica das DTA, face aos limitados estudos que se tem dos agentes etiológicos, a forma como esses contaminam os alimentos e as quantidades necessárias a serem ingeridas na alimentação para que possa se tornar um risco. Estas medidas vêm sendo estimuladas por recomendações e acordos internacionais, onde se destacam os subscritos pelo Brasil na VII Reunião Interamericana de Saúde Ambiental de Nível Ministerial (RIMSA) e na XXXV Reunião do Conselho Diretor da Organização PanAmericana da Saúde – OPAS (Fundação Nacional de Saúde, 1998). Apesar da comprovada relação de várias doenças com a ingestão de alimentos contaminados, do elevado número de internações hospitalares e persistência de altos índices de mortalidade infantil por diarréia, em algumas regiões do país pouco se conhece da real magnitude do problema, devido à precariedade das informações disponíveis, fazendo-se necessária à estruturação de um Sistema de Vigilância Epidemiológica das Doenças Transmitidas por Alimentos (VE-DTA), capaz, inclusive, de detectar a introdução de novos patógenos. Diante da complexidade do problema, da fragmentação e desarticulação das ações entre as várias áreas envolvidas, este Manual pretende apresentar o sistema VEDTA, que tem como marco metodológico a integração intrainstitucional e interinstitucional nos três níveis de governo. Este documento também visa normatizar as ações e instrumentos utilizados na investigação de surtos de doenças transmitidas por alimentos, orientar quanto ao fluxo de informação do Sistema VE-DTA e dar suporte técnico para o desenvolvimento das atividades, proporcionando o trabalho integrado (PEREIRA, M.G. 1995). O Sistema Nacional de Vigilância Epidemiológica das Doenças Transmitidas por Alimentos - VE-DTA será instituído e constituído de acordo com as áreas de competência e níveis governamentais pelos órgãos que desenvolvem atividades de: - Vigilância Epidemiológica; - Vigilância Sanitária; - Vigilância Ambiental; 18 - Defesa e Inspeção Sanitária Animal; - Defesa e Inspeção Sanitária Vegetal; - Laboratórios de Saúde Pública; - Laboratórios de Defesa Sanitária Animal; - Laboratório de Defesa Sanitária Vegetal; - Educação em Saúde; - Assistência à Saúde; - Saneamento. 3.1 Objetivos da Vigilância Epidemiologia O Sistema Nacional de Vigilância Epidemiológica das Doenças Transmitidas por Alimentos tem por objetivos: - Reduzir a incidência das DTA no Brasil a partir do conhecimento do problema e de sua magnitude; -Subsidiar as medidas de prevenção e controle, contribuindo para melhoria da qualidade de vida da população. - Conhecer o comportamento das DTA na população; - Detectar, intervir, prevenir e controlar surtos de DTA; - Identificar os locais, alimentos e os agentes etiológicos mais envolvidos em surtos de DTA; - Detectar mudanças no comportamento das DTA; - Identificar tecnologias ou práticas de produção e prestação de serviços de maior risco de DTA; - Identificar e disponibilizar subsídios às atividades e condutas relacionadas à assistência médica das DTA; - Identificar e disponibilizar subsídios científicos, com vista à definição de medidas de prevenção e controle de DTA; - Desenvolver atividades de educação continuada para profissionais de saúde, produtores de alimentos e prestadores de serviços de alimentação e consumidores (Fundação Nacional de Saúde, 1998). 19 4 ATITUDES DE RESTAURANTES RISCO DO CONSUMIDOR EM A preferência atual dos consumidores por refeições mais convenientes influenciou o mercado da alimentação coletiva. Ele cresce no mundo todo e, no Brasil, atende a mais de dois milhões de trabalhadores. Além da praticidade, o auto-serviço oferece refeições variadas e de baixo custo2, permitindo ao consumidor compor o seu prato, de acordo com sua preferência. Dados da Associação Brasileira da Indústria de Alimentos2 mostram que, do momento da implantação do Plano Real, em julho de 1994, até 2001, houve um crescimento de 190,7% dos setores de serviços de alimentação e de 16,5% dos de alimentação fora do lar. O número de restaurantes comerciais no Brasil duplicou na última década e movimentou R$ 5,2 bilhões de reais, em 2001(ZANDONAD, 2007). No entanto, o propósito das Unidades Produtoras de Refeições (UPR) não deve ser apenas alimentar o homem, mas “bem alimentá-lo”. Isso significa não oferecer apenas produtos sensorialmente adequados, mas, sobretudo, produtos seguros em especial sob o aspecto higiênico-sanitário. Nesse contexto, uma alimentação saudável preconiza a ingestão de alimentos com adequado controle higiênico-sanitário uma vez que a contaminação dos produtos pode provocar sérios danos à saúde, como as toxinfecções alimentares (ZANDONAD,2007). A Organização Mundial de Saúde (OMS) define doença transmitida por alimento (DTA) como “uma doença de natureza infecciosa, tóxica, através do consumo de alimento ou água”. Almeida Filho & Rouquayro 2006 definem surto como uma ocorrência epidêmica restrita a um espaço delimitado. Assim, surto de DTA é a ocorrência de dois ou mais casos que apresentem sintomas semelhantes após a ingestão de alimento ou água, de mesma origem, implicados como veículo da doença, exceto em caso de botulismo, quando uma ocorrência única já é considerada um surto. A incidência de doenças relacionadas ao consumo de alimentos cresce anualmente; o número de refeições realizadas fora de casa potencializa o surgimento de doenças transmitidas por alimentos (DTA) e, conseqüentemente, os surtos de toxinfecções alimentares. Para Smith & Fratamico, o consumo de refeições fora do domicílio é um dos fatores que mais contribuiu para o aumento da ocorrência de DTA uma vez que, nas 20 Unidades Produtoras de Refeição (UPR), as refeições são produzidas em larga escala e tornase mais difícil o controle efetivo de todas as preparações produzidas. A contaminação dos alimentos se inicia na produção da matéria-prima e se estende às etapas de transporte, recepção, armazenamento. Durante a manipulação pode haver contaminação por condições precárias de higiene de manipuladores, equipamentos, utensílios, ambiente e condições inadequadas de armazenamento dos produtos prontos para consumo. Vencida a etapa de preparação/industrialização, os alimentos continuam expostos à contaminação nos centros de distribuição, supermercados, restaurantes, nas mercearias e residências. De acordo com dados de Almeida, mais de 70% dos casos de DTA têm origem na contaminação dos alimentos pelo seu consumidor final. A higiene alimentar é fundamental para a garantia de qualidade dos produtos alimentícios e se insere em todas as operações relacionadas à manipulação de qualquer gênero alimentício (ZANDONAD,2007). Foi realizado um estudo exploratório com técnica de observação não participante, com amostragem de conveniência para a escolha das UPR e amostra sistematizada para a escolha dos consumidores observados. Foram selecionadas 10 UPR localizadas no Distrito Federal no ano de 2004, com cardápio médio e formal, participantes do estágio supervisionado em produção da Universidade de Brasília. O número de consumidores a serem observados em cada UPR foi determinado de modo a obter uma amostra representativa para uma população desconhecida. Este número foi estimado, com um intervalo de confiança de 95%, em 347 consumidores em cada UPR, tendo sido possível ampliar a amostra total para um número maior de consumidores, em virtude do retorno esperado do estudo para os responsáveis das UPR. A pesquisa foi desenvolvida em três etapas: na primeira observou-se a lavagem das mãos pelos consumidores antes do auto-serviço, com amostra de 1.901 consumidores. Na segunda etapa, foi construído o instrumento a partir da observação e definição das atividades de risco e, na terceira etapa observaram-se as práticas das atitudes de risco por parte dos consumidores. Em cada UPR, a primeira etapa foi realizada em dois dias, baseando-se na observação do uso do lavatório localizado no refeitório pelos consumidores para lavagem das mãos, apesar de apenas cinco das UPR selecionadas disporem dessa estrutura. Para elaboração do instrumento de observação das atitudes de risco, foram observadas as atitudes praticadas pelos consumidores, no momento do auto-serviço, em uma das UPR, por um período de uma semana. Treze atitudes de risco foram selecionadas e avaliadas pela técnica de juízes, cujas sugestões foram incorporadas ao instrumento definitivo a saber: a) não lavar as mãos imediatamente antes do auto-serviço; b) mexer no cabelo perto das preparações expostas no 21 balcão; c) falar em cima das preparações no balcão de distribuição; d) deixar a gravata, a manga de camisas, bolsas, blusas, vestidos ou casacos tocarem nas preparações; e) deixar parte do corpo encostar nas preparações; f) tossir sobre as preparações; g) espirrar sobre preparações; h) utilizar o utensílio de uma preparação em outra já servida no prato do consumidor ; i) trocar os utensílios das preparações; j) deixar o utensílio cair dentro da preparação; l) retirar alimentos do seu prato e devolvê-los às cubas com a mão ou utensílio disponível; m) consumir alimentos antes da pesagem; n) arrumar alimentos no prato com os utensílios das preparações. A terceira etapa foi realizada durante três dias em cada UPR, e se ateve à observação e quantificação do número de consumidores que praticavam atitudes de risco no momento do auto-serviço. A observação foi efetuada a cada cinco indivíduos dentro do intervalo de uma hora, do período de maior movimentação do refeitório, indicado pelos nutricionistas dos estabelecimentos(ZANDONAD,2007). 22 5 O CONTROLE DE QUALIDADE NA INDÚSTRIA ALIMENTÍCIA Nos dias de hoje manter a alta qualidade de produtos e serviços padronizados exige um trabalho intenso que envolve profissionais especializados e treinados. O departamento de controle de qualidade faz um rigoroso controle de pragas, higiene sanitária, e o controle da produção é feito por meio de uma verificação constante por amostragem de produtos. O controle de qualidade ainda faz a auditoria nos caminhões que transportam os produtos até as lojas, além de exercer um trabalho de verificação das lojas por meio das auditorias de qualidade, que verificam aspectos de trabalho, condições de armazenamento e manipulação do produto (MERCK,1986, p. 55). A análise de riscos numa indústria de alimento é o primeiro e definitivo passo na montagem de um plano de Análise de Perigos e definição de Pontos Críticos de Controle (APPCC) da unidade fabril. O perigo poderá ser potencial, seu risco poderá ser baixo, dada à tecnologia (medidas preventivas) empregada na fábrica. Um perigo é qualquer fator ou agente que se presente no produto, pode causar dano ao consumidor, provocando uma injúria ou uma doença (CARDOSO, 2000, p. 95). A análise de perigos é um procedimento lógico e racional para levantar os perigos e avaliar os seus riscos associados com a produção, elaboração, distribuição e consumo do alimento. Está análise considera as matérias-primas, os ingredientes, as etapas do processamento, o pessoal envolvido e possíveis abusos no ambiente do distribuidor e do consumidor. É feita diretamente no ambiente da produção, sendo individual para cada caso(CARDOSO, 2000, p. 95). Isto é, ainda não há como realizar uma análise de riscos à distância. Cada processo é tratado individualmente, sendo necessário a observação direta do funcionamento da cadeia produtiva. Os perigos são considerados de ordem: biológica, química e física. Os Pontos Críticos de Controle (PCC) microbiológicos são etapas do processo em que uma falha no seu controle poderá representar um potencial risco á saúde pública, em razão da presença de patógenos ou de suas toxinas. Nas diversas etapas da cadeia produtiva de um produto alimentício haverá sempre pontos importantes de controle (PC) e pontos críticos de controle. Com base no APPCC, um PC é uma etapa, procedimento, ocupação ou posição ao longo da cadeia produtiva do alimento em que um controle inadequado, insuficiente ou incompleto resultaria em contaminação do produto, mas há procedimentos, operações ou 23 práticas em etapas posteriores a esta posição que eliminem ou previnem que a contaminação chegue ao usuário do produto. A diferença do PCC é que não há etapas posteriores a estas capazes de eliminar o perigo ou prevenir que a contaminação chegue ao usuário do produto. Ou seja, a falha no controle em um PCC resulta na produção de alimento com alta probabilidade de causar doença alimentar no consumidor. Para os órgãos da vigilância sanitária é suficiente um plano APPCC que garanta a qualidade sanitária do alimento, ou seja, que elimine ou reduza os riscos de ordem: biológicos (protozoários, fungos, bactérias e suas toxinas), físicos (materiais estranhos, vidros, fragmentos de madeira, pedras, materiais plásticos e outros) e químicos (resíduos de defensivos agrícolas, resíduos de material de limpeza e metais tóxicos). O sistema APPCC tem se tornado instrumento base da regulamentação da vigilância sanitária de alimentos em diversas partes do mundo inclusive no Brasil (CARDOSO, 2000, p. 95). 5.1 Programa estadual de monitoramento da qualidade de alimento - (Prog Visa) Em meados de 2000, iniciou-se no estado de Minas Gerais, o Programa Estadual de Monitoramento da Qualidade dos Alimentos – PROGVISA, que trabalha com o envio de amostras de alimentos aos laboratórios da FUNED, decorrentes da demanda municipal. Inicialmente as coletas dos alimentos eram realizadas por poucos municípios e poucas Diretorias de Ações Descentralizadas de Saúde (GRS) atendendo também as denuncias pontuais relacionadas a investigação de surtos alimentares e reclamação de consumidores. Este programa tem por objetivo monitorar a qualidade dos alimentos e águas oferecidas ao consumo, contribuir para o esclarecimento e identificação dos agentes causadores de doenças transmitidas por estes produtos e atender ao consumidor mediante denúncias ao Ministério Público, Institutos de defesa do consumidor e Órgãos de Vigilância Sanitária. Conforme esperado, o programa aumentou sua área de atuação passando a abranger todas as GRS, incorporando categorias alimentícias determinadas pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), e demandas municipais oriundas de surtos alimentares. O programa de coleta passou a ser considerado como um importante projeto da vigilância pelo fato de promover a descentralização das ações, aproximando a necessidade municipal da elaboração de uma política estadual, permitindo a estruturação da Vigilância Sanitária (VISA) no município, através da cobrança da população. A vigilância sanitária tem se preocupado em desenvolver ações mais visíveis para população e capazes de promover a integração dos 24 órgãos atuantes na área da saúde, fazendo com que os cidadãos tenham acesso a produtos e serviços de qualidade (DINIZ,2006). 5.2 O funcionamento do laboratório de micologia O laboratório de micologia da FUNED está inserido no IOM (Instituto Otávio Magalhães) dentro da DIVISA (Divisão de Vigilância Sanitária). Este realiza análise micológicas em amostras de diversos tipos de alimentos, onde são verificadas a presença de bolores e leveduras nos alimentos. O laboratório faz parte da DIVISA (Divisão de Vigilância Sanitária) que tem por finalidades de planejar, dirigir, orientar, coordenar e executar atividades de vigilância sanitária e ambiental desenvolvidas pelos órgãos públicos de saúdes. A VISA é uma atividade multidisciplinar que regulamenta e controla a fabricação, produção, transporte, armazenamento, distribuição e comercialização de produtos e prestação de serviços de interesse da saúde pública. As amostras de alimentos são recolhidas em estabelecimentos comercias por meio da VISA e encaminhada aos laboratórios da FUNED para respectivas análises.A vigilância sanitária é importante a medida em que fiscaliza e protege a população das situações de risco externos que a saúde individual, coletiva e ambiental são expostas. De acordo com a legislação sanitária, Lei 8.142. o consumidor tem quatro direitos fundamentais: a) consumir produtos e serviços suficientes para manter sua sobrevivência; b) consumir produtos e serviços com boa qualidade sanitária; c) informação sobre a qualidade dos produtos e serviços; d) acesso aos serviços públicos que atuam na defesa e proteção da saúde do consumidor. O objetivo da vigilância sanitária é proteger e evitar a ocorrência de agravos á saúde por meio do acompanhamento do cumprimento de padrões adequados aos grupos de fatores de risco. Em Belo Horizonte é a VISA que faz a plena fiscalização e vigilância em todos os estabelecimentos, serviços e produtos de interesse a saúde localizados nos limites de seu território. 25 6 MATERIAL E MÉTODOS UTILIZADOS PARA CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS 6.1 Metodologia utilizada para contagem e identificação de bolores e leveduras viáveis em alimentos Os bolores e leveduras devem ser enumerados pelo método de plaqueamento em superfície. Este método propicia o máximo de exposição das células ao oxigênio atmosférico e permite uma maior uniformidade no desenvolvimento das colônias aumentando a precisão dos resultados e facilitando o subseqüente isolamento de culturas puras. 6.1.1 Técnica para contagem 6.2 Material a) balança; b) cabine de segurança biológica; c) contador de colônias; d) estufa de bancada; e) geladeira; f) misturador e preparador de amostras (STOMACHER); g) pipetador automático; h) pipetas graduadas (1 e 10 ml); i) placas de petri (9cm de diâmetro). 6.3 Reagentes a) água peptonada 0,1%; b) alça de vidro; c) álcool 70%; d) meio de Cultura DG18. 26 6.4 Procedimento a) após o envio da amostra do produto para o laboratório de micologia, deve-se registrar a amostra no caderno de protocolo de amostras; b) ao iniciar o trabalho fazer a assepsia da cabine de segurança biológica com álcool 70% e gaze esterilizada; c) antes de abrir as embalagens, limpar a sua área externa com álcool 70%, para remoção dos contaminantes presentes, no interior da cabine de segurança biológica; d) pesar 25g da amostra, em béquer, e transferir para um saco de STOMACHER contendo 225mL de água peptonada 0,1%; e) homogeneizar por 2 min. no STOMACHER; f) a partir desta diluição (10-1), transferir 10 mL da solução 10-1 para 90 mLde água peptonada 0,1% obtendo a diluição 10 -2, e assim sucessivamente para todas as diluições necessárias; g) marcar as placas na tampa, com numero da amostra, a diluição equivalente e a data de inoculação; h) para alimentos granulados, em pó, em calda, massa ou em pasta: espalhar 0,1mL, 0,3mL, 0,3mL e 0,3mL com alça de vidro, em placas contendo 20mL do meio de cultura DG18 (Agar Dicloran Glicerol 18%); i) incubar a 25°C por cinco dias, sem inverter a posição das placas; j) observar as placas com três dias de incubação, e caso haja crescimento de bolores com colônias espalhadas, efetuar a contagem com três dias, para prevenir a perda das placas por espalhamento total dessas colônias. Caso não observe risco de espalhamento, re-incubar as placas e contar com cinco dias de incubação. 6.5 Cálculo para contagem de células a) selecionar as placas com 15 a 150 colônias e cantá-las, usando o contador de colônias; b) calcular o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama ou mL somando as contagens obtidas em cada uma das quatro placas multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada (UFC/g ou ml + N° de colônias/diluição). Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula na apresentação dos resultados. 27 7 Técnicas para identificação 7.1 Purificação a) retirar uma parte da colônia e colocar em um microtubo de 10 mL contendo 1000l de tween 80 (0,1%); b) agitar em vórtex; c) pipetar 20 uL da suspensão e inocular em três pontos distintos, nos meios Cezapec e Agar extrato de malte; d) incubar no B.O.D a 25 ºC, sem inverter, por cinco dias; e) fazer lâmina da colônia para identificação. 7.2 Microcultivo a) autoclavar a placa de Petri preparada com os materiais: bastão de vidro ou palito de picolé, lâmina, lamínula embalada em papel alumínio e algodão; b) colocar um pequeno pedaço de meio de cultura PDA (Ágar Batata Dextrose), previamente autoclavado, sobre a lâmina ; c) retirar, observando sentido centro-borda, uma parte da colônia a ser identificado e colocá-la sobre o meio de cultura com a colônia; d) umidecer o algodão com aproximadamente 3,0ml de água destilada estéril; e) incubar no B.O.D a 25ºC, sem inverter, por sete dias; f) fazer lâmina da colônia para identificação. 7.3 Preparo de lâminas de fungo filamentoso Para o preparo da lâmina: a) retiramos um pedaço da colônia no sentido centro-borda com uma agulha de platina; b) é transferido para a lâmina contendo uma gota de corante azul de Amnan; c) cobrir a lâmina com lamínula; d) observar ao microscópio; e) fazer a identificação. 28 7.4 Preparo da lâmina de gram Para preparo de lâminas de leveduras: a) pegamos um a gota de água destilada com a alça de vidro; b) colocamos na lâmina; c) retiramos um pedaço da colônia com a alça de vidro e colocamos sobre a lâmina; d) esperamos secar; e) coramos utilizando a bateria de Gram (1° lugol, 2° cristal violeta, 3° éter-acetona,4° safranina); f) observa ao microscópio. Protocolo cedido pelo laboratório de Micologia da Fundação Ezequiel Dias (FUNED). 29 CONCLUSÃO A prevenção da contaminação dos alimentos não é tarefa exclusiva dos manipuladores de alimentos, pois os consumidores também desempenham papel importante na cadeia analisada. A partir dos resultados obtidos nos levantamentos, identificou- -se a necessidade de os consumidores serem conscientizados sobre as atitudes apropriadas para uma boa alimentação, a fim de serem evitadas não só possíveis contaminações como também as doenças transmitidas por alimentos contaminados. Assim, conclui-se que a higiene pessoal do consumidor, e do manipulador de alimentos é o principal fator a ser monitorado para evitar a contaminação dos alimentos. 30 REFERÊNCIAS ANDRADE, P. S. Programa de alimentos da vigilância sanitária. 4. ed. Belo Horizonte: EDITORA, 2006. Associação Brasileira das Indústrias da Alimentação. Mercado de Food Service no Brasil. Disponível em: http://www.abia.org.br. Acesso em 20 jan. 2008. 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