Esterilização, Assepsia e Preparo de Meios de Cultura.

19/11/2013
TÉCNICAS LABORATORIAIS EM MICROBIOLOGIA
ESTERILIZAÇÃO E ASSEPSIA
Disciplina: Microbiologia Geral
Esterilização, Assepsia
e Preparo de Meios de
Cultura.
• PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA
* Os estudantes devem estar concentrados
nas tarefas que desenvolvem, compreender o
equipamento, os reagentes e os materiais
biológicos que usam.
CONCEITOS
ASSEPSIA – Impede a entrada de microrganismos em
ANTI-SEPSIA – Inativação ou redução do número de
áreas de trabalho .
microrganismos
ESTERILIZAÇÃO – eliminação de toda e qualquer forma de
presentes
em
um
tecido
vivo,
com
substâncias anti-sépticas.
vida presente em um determinado material ou ambiente.
DESINFESTAÇÃO – Inativação ou redução do número de
microrganismos presentes em um material inanimado, não
SANITIZAÇÃO – é o tratamento que leva à diminuição da
vida microbiana nos utensílios alimentares e equipamentos
implicando na eliminação de todos os microrganismos viáveis.
Porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto ou
superfície
de
trabalho
(eliminação
de
microrganismos
de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde
pública.
patogênicos).
ESTERILIZAÇÃO
Processo que promove a completa eliminação
ou destruição de todas as formas de
microrganismos presentes:
•vírus,
•fungos,
•bactérias,
Finalidade da esterilização:
•Evitar a contaminação;
•As técnicas assépticas:
• minimizam a possibilidade das culturas serem
contaminadas por organismos vivos do ambiente
• e impedem que os organismos, especialmente
os patógenos, escapem para o meio
•protozoários, esporos
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Assepsia:
•Todas as condições, gestos e atitudes que tendem a
manter o estado de ausência de microrganismos
contaminantes no meio em que atuam.
•Agentes desinfetantes:
•São tipicamente aplicados em objetos,
superfícies
•Agentes antissépticos:
•São aplicados em tecidos vivos
Higienização do Laboratório:
• É fundamental ter os cuidados de assepsia do
laboratório e do material nele utilizado
Assepsia:
•Agentes desinfetantes:
• Álcool 70%: superfícies de trabalho e câmara de fluxo
laminar, entre outros.
• Porque não utilizar Álcool absoluto ????
• Hipoclorito de sódio ou de cálcio: o cloro oxida os
componentes celulares
• Detergentes
• Fosfato Trissódico
• Dietilpirocarbonato (DEPC): inibidor RNAses
Higienização do Laboratório:
• Bancadas e todas as superfícies devem ser desinfestadas,
• O piso do laboratório, deve ser limpo diariamente com pano
umedecido em solução desinfestante.
• Partículas estranhas podem constitui-se de
contaminantes
• Ocasionando perda de experimentos e, ou,
interferência nos resultados
• Durante a higienização do piso NÃO se deve varrer, para
evitar a suspensão de partículas no ar, principalmente em
ambientes com câmara de fluxo laminar
• Na entrada do laboratório é recomendável manter um pano
umedecido em solução desinfestante para limpar os
calçados
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
a) ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO:
• Para vidrarias.
• ESTUFA OU FORNO DE PASTEUR
• Geralmente 180 °C por 2 horas;
• Remove toda umidade do material
• Deve-se envolver todo o material a ser esterilizado em
papel alumínio ou outro tipo, para evitar
contaminações posteriores
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Tabela1.Temperatura e tempo necessários para esterilização de
vidrarias em estufa.
Temperatura
Tempo de exposição (min)
170 -180
60
160
120
150
150
140
180
121
Durante 1 dia ou 1 noite
B
Figura 1. Estufas para esterilização de vidrarias
•A esterilização de materiais metálicos pela chama de um
bico de Bunsen (Flambagem) (300 a 600 º C)
Figura 2 Bico de Bunsen e esquema da chama
Figura 3 Bico de Bunsen e transferência asséptica
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
b) ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO:
• Meios de cultura e outros líquidos como soluções Tampões.
Utiliza-se AUTOCLAVE
Tabela 2. Tempo requerido para esterilização de líquidos em
autoclaves de acordo com o volume.
Volume do
recipiente
Minutos de exposição
a 120ºC e 1 atm
Erlenmeyer de
1000 ml
17 – 20
Erlenmeyer de
500 ml
15 – 17
Erlenmeyer de
250 e 125 ml
12 – 15
Tubos de ensaio
12 – 15
Figura 4. Esquema de autoclave horizontal, Autoclave vertical utilizada para
esterilização de meios de cultura; Detalhe do cesto de esterilização.
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Preparação de materiais e vidrarias para
esterilização em autoclave:
• O acondicionamento correto de materiais e de
vidrarias é importante para a esterilização
eficiente em autoclave
B
• Pipetas, placas de Petri, tubos e demais
intrumentos
devem
estar
corretamente
embalados, para que posterior a esterilização
possam ser guardados sem ser contaminados.
A
Figura 5. Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura (A);
Detalhe do registro e manômetro (B).
Preparação de materiais e vidrarias para
esterilização em autoclave:
•
Placas e Pipetas devem ser condicionadas em papel de embrulho ou jornal e
identificadas
Preparação de materiais e vidrarias para
esterilização em autoclave:
•
Placas e Pipetas devem ser condicionadas em papel de embrulho e identificadas
Figura 7. (A) Pipeta embrulhada em Kraft(B) Placas de Petri sendo embrulhadas
em papel Kraft
Figura 6. Placas de Petri sendo embrulhadas em
papel Kraft (A); Pipeta embrulhada em Kraft(B).
Preparação de materiais e vidrarias para
esterilização em autoclave:
•
Tubos de cultura devem possuir um tampão de algodão, cobertos por uma coifa feita com
pedaço de papel de embrulho
Procedimentos para a esterilização de
materiais e vidrarias em autoclave:
Figura 8. (A) Tubo de ensaio (B) Tubo de ensaio com boneca
Figura 9. Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura
(A); Detalhe do nível da água em 1 cm abaixo da cruzeta (B).
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Procedimentos para a esterilização de materiais e
vidrarias em autoclave:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Observar o nível de água, que deve estar até 1 cm abaixo da cruzeta;
Colocar o cesto da autoclave;
Colocar todo o material a ser esterilizado na parte superior do cesto;
Fechar a tampa, apertando os manípulos em cruz;
Ligar a autoclave na potência máxima e abrir o registro (válvula de escape);
Aguardar a saída do vapor por 3 a 5 minutos, fechando o registro posteriormente;
Alcançada a temperatura de trabalho (121°C), colocar a chave na posição média,
ajustando, quando necessário, os pesos que controlam a quantidade de vapor;
Marcar o tempo, que deverá ser de 15 a 30 minutos, dependendo do material;
Terminado o tempo de esterilização, desligar a autoclave e deixar que o ponteiro do
manômetro atinja a posição zero;
Abrir o registro aos poucos e aguardar a saída do vapor da autoclave, de maneira
que ele seja escoado completamente;
Em seguida, abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais, colocando-os em
estufa de secagem.
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
Procedimentos para a esterilização de
materiais e vidrarias em autoclave:
• Não abrir o registro antes que o manômetro
atinja a posição zero, para evitar que o material
esterilizado fique muito molhado e que os
papéis que o envolvem se rasguem;
• Nunca abandonar o local de esterilização,
conferindo sempre a temperatura da autoclave,
e evitando a quebra de materiais e o RISCO DE
EXPLOSÃO.
Filtragem
c) ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO:
• Para substâncias que não podem ser esterilizadas pelo calor.
• Utilizam-se filtros apropriados
• Filtros Milipore (0,45 µ e 0,2 µ), proporcionam bons
resultados de esterilização por filtração
Filtro com
poro de 5 m
Figura 10: Tipos de Filtros
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
d) ESTERILIZAÇÃO POR SUBSTÂNCIA GASOSAS:
• Óxido de propileno pode ser utilizado para esterilizar placas
de Petri de plástico com ou sem meio de cultura
• Pilhas de placas são acondicionadas em sacos plásticos,
adiciona um chumaço de algodão embebido com 3-10 ml de
OP por 24 h.
• Placas devem ser retiradas em condições assépticas
Bactérias
retidas no
filtro
Figura 11: Exemplo de Filtragem
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
e) ESTERILIZAÇÃO DE SOLOS :
• Utiliza-se Autoclave a 120° C por duas horas por 2 dias
consecutivos
• Após a esterilização o solo deve permancer em repouso por
5-7 dias
f) ESTERILIZAÇÃO POR RADIAÇÃO ULTRA VIOLETA
• Lâmpadas UV eficientes na eliminação ou redução de
microrganismos do ar
• Utilizadas em Câmara asséptica
• CUIDADO!!!
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A
B
Figura 12. Câmara asséptica utilizada nas práticas de isolamento, plaqueamento e
repicagem (A); Detalhe do interior da câmara (B).
Figura 13: Esquema do Filtro da Câmara de Fluxo Laminar
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO
g) ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS:
• Brometo de metila (solos): liberado até 2015
• Desinfestantes:
• Hipoclorito de Sódio
• Álcool 70%
• Detergentes
• Fosfato Trissódico
• Dietilpirocarbonato (DEPC): inibidor RNAses
MEIOS DE CULTURA
• Destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos e
fornecem os princípios indispensáveis ao seu crescimento.
• O que são ?
• Materiais nutrientes preparados no laboratório para
crescimento de microrganismos
• Substratos naturais ou artificiais
• Devem conter as substâncias exigidas para o crescimento
e multiplicação
• Devem atender as exigências de fontes de C, N, energia e
sais minerais.
• Função: Isolamento, cultivo, preservação, estudos
morfológicos
MEIOS DE CULTURA
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
• Há uma variedade de meios de cultura, alguns vendidos
comercialmente
Figura 15: Balança semi analítica pesando meio de cultura
Figura 14. Frascos de Meio de Cultura comercial tradicionalmente utilizado em
técnicas de isolamento de microrganismos
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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
a) Quanto a Consistência:
-Líquidos: isolamento, formato, cor e tamanho da colônia
formada.
-Sólidos: cultivo, formação de gás, odor e alterações no
pH produzidas pelas bactérias, preservação.
-Semi-sólidos: a diferença entre esses tipos é a
quantidade de ágar que é acrescentada ao meio.
Figura 16 . Meio de Cultura sendo vertido para placa de Petri em
condições assépticas.
SÓLIDO
Meio Líquido
Bradyrhizobium sp
Derxia sp
SEMI -SÓLIDO
Figura 17 . Exemplos de Meios de Cultura de diferentes consistências
MEIOS DE CULTURA
*ÁGAR:
Figura 18. Exemplo de Meio de Cultura de consistência líquida
MEIOS DE CULTURA
b) Quanto a Composição:
• polissacarídeo que tem muitas propriedades que o
tornam um agente solidificante ideal,
Naturais: material natural com composição desconhecida
• formado por extrato de algas marinhas, é usado na
preparação de meios sólidos;
Sintéticos: composição química conhecida
Ex: Extrato de Malte, batata, extrato de carne.
• Utilizado em uma concentração em torno de 1,5%
(p/v), ou 1,5 g/100ml
Semi-sintéticos: quando não se conhece a composição
de alguns componentes do meio
• Funde-se em torno do ponto de ebulição da água
(100°C), formando uma solução transparente que
permanece no estado líquido em torno de 40 °C.
Ex: Batata-dextrose-ágar (BDA)
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MEIOS DE CULTURA
c) Quanto a Especificidade:
-Gerais: utilizados por uma ampla gama de microrganismos
-Seletivos: Específicos para isolamento, crescimento e
multiplicação de determinadas espécies ou Gênero de
microrganismos
d) Condições de cultivo:
Bactérias: pH neutro
MEIOS DE CULTURA
- Os meios, após sua preparação, devem ficar sobre o
balcão ou interior da câmara de fluxo laminar até o
esfriamento à temperatura ambiente.
- quando a quantidade de meios preparados é pequena e de
uso imediato, eles devem ser armazenados em geladeira
e, preferencialmente, dentro de sacos plásticos para evitar
maior desidratação.
Fungos: condições ácidas
SOLUÇÕES TAMPONANTES
-Vírus: não crescem em meios de cultura
Ex: Fitovírus
Sobrevivem nas células vivas do Hospedeiro
Meio de Cultura: Planta
Inoculação: introdução do vírus por meio de
microferimentos em presença de Soluções
Tamponantes no tecido vegetal do Hospedeiro
Figura 19. Inoculação mecânica de vírus de plantas
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