resumo expandido anatomia e enzimas digestivas do canal

RESUMO
EXPANDIDO
XVIII Simpósio
de Mirmecologia
023 345
A
ANATOMIA E ENZIMAS DIGESTIVAS DO CANAL ALIMENTAR DE LARVAS DE
ACROMYRMEX SUBTERRANEUS (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)
Anatomy and digestive enzymes of larval Acromyrmex subterraneus (Hymenoptera: Formicidae)
M. Erthal Junior, C.P. Silva, R.I. Samuels
Fundação de Apoio à Escola Técnica, Instituto Superior de Tecnologias em Ciências Agrárias, Av. Wilson
Batista s/no, CEP 28070-620, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil. E-mail: [email protected]
1
As larvas de formigas são importantes para suas
colônias não somente como fonte de novos adultos,
mas também como casta digestiva, suprindo as operárias com nutrientes e enzimas (HÖLLDOBLER & WILSON,
1990). Alguns trabalhos mostram claramente como as
larvas fortalecem os laços sociais, como em Messor
captatus e Solenopsis invicta, onde as larvas oferecem
enzimas proteolíticas e nutrientes aos adultos e rainha,
e estes, por outro lado, retribuem oferecendo às larvas
carboidrases e alimentos coletados no campo (DELAGE,
1968; SORENSEN et. al., 1983; VINSON e SORENSEN, 1986).
Desta forma, estudos da fisiologia larval são de vital
importância para se compreender o papel das larvas de
formigas na colônia como um todo.
Embora as formigas cortadeiras dos gêneros
Acromyrmex e Atta sejam consideradas as pragas agrícolas mais sérias da América do Sul (CHERRETT, 1986),
pouco é conhecido sobre a fisiologia e bioquímica
larval destas espécies. Estas formigas estão intrinsecamente relacionadas ao cultivo de um fungo
basideomiceto (família Lepiotaceae), que precisa ser
constantemente abastecido de folhas frescas para se
desenvolver. Além de alimento, Acromyrmex e Atta
oferecem ao fungo dispersão na natureza e ambiente
protegido para seu desenvolvimento, removendo
contaminantes, secretando antibióticos e formando
associações simbióticas com bactérias benéficas tais
como actinomicetos e Burkholderia (CURRIE & STUART,
2001; SANTOS et al., 2004). Em retorno, o fungo supre as
formigas com nutrientes contidos nas hifas e na
estafila, que são corpos de frutificação ricos em nutrientes (MARTIN, 1992). O fungo é o alimento exclusivo
das larvas, rainha e alados (HÖLLDOBLER & WILSON,
1990), além de suplementar a dieta das operárias, em
quantidades variáveis, ainda não muito claras
(LITTLEDYKE & CHERRETT, 1976; SILVA et al., 2003).
O substrato fúngico é oferecido às larvas por uma
casta especializada de operárias adultas responsáveis pelos cuidados com a prole (WILSON, 1980). Estas
operárias preparam o bolo alimentar e o depositam no
2
3
tórax das larva, próximo a cabeça, para que as larvas
possam se alimentar. As larvas preferem se alimentar
e se desenvolvem mais quando supridas com estafila
ao invés da hifa fúngica (QUINLAN & CHERRETT, 1979).
Desta forma, as atividades enzimáticas detectadas no
intestino das larvas podem ser procedentes delas
mesmas, do fungo simbionte ou repassadas pelos
adultos por trofalaxia. As enzimas fúngicas são muito importantes na simbiose entre as attines e seus
fungos, já que algumas enzimas se mantêm ativas no
canal alimentar e após sua excreção, na forma de
líquido fecal, que é depositado nas folhas antes que
estas sejam incorporadas ao jardim de fungo. Estas
enzimas podem estar contribuindo para o sucesso da
colonização do fungo no tecido foliar através da
liberação de nutrientes ou como agente facilitador de
crescimento. Uma nova hipótese, proposta por Poulsen
e BOOMSMA (2005), sugere o papel do líquido fecal na
seleção contra fungos não clonais no ninho.
Este estudo foi conduzido com o objetivo de entender o papel das larvas de Acromyrmex subterraneus na
fisiologia digestiva da colônia. Observações em microscópio estereoscópico foram realizadas para a
descrição anatômica do canal alimentar das larvas.
As atividades enzimáticas foram determinadas na
glândula labial, no epitélio do intestino médio (fração
solúvel e fração particulada) e conteúdo luminal do
intestino médio (espaço ecto-endoperitrófico). O pH
do conteúdo luminal do intestino médio e a taxa de
fluxo da dieta também foram investigados. Enzimas
com alta atividade foram parcialmente caracterizadas usando técnicas de cromatografia e eletroforese.
Cinco colônias adultas de Acromyrmexsubterraneus
subterraneus, neste trabalho tratada como A.
subterraneus, foram adequadamente mantidas no laboratório e supridas com folhas de Acalipha sp.,
Ligustrum sp., pétalas de rosas e Neston ®. As larvas
foram selecionadas por tamanho (comprimento do
corpo ≥ 3,0 mm) e pela coloração marrom escura do
intestino médio, indicativo da presença do alimento.
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil
Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil.
Biológico, São Paulo, v.69, suplemento 2, p.345-349, 2007
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XVIII Simpósio de Mirmecologia
Sob microscópio estereoscópico, com 10 x de aumento, algumas larvas foram dissecadas e com uma
câmera lúcida o desenho anatômico do intestino e da
glândula labial foi obtido.
As faixas de pH do intestino médio foram estimado
pela ingestão de dietas contendo indicadores de pH
misturados a mel 10%. Grupos de 15 larvas para cada
solução indicadora foram dissecadas 24 hs depois para
o registro visual da coloração. As larvas foram alimentadas com solução contendo corante azul de Evans e mel
10%, e dissecadas por até cinco dias após a ingestão.
Os insetos foram dissecados em NaCl 215 mM
para obtenção do intestino médio e glândula labial.
Cada lote de amostras continha compartimentos intestinais de 5 ou 10 insetos/500 µL de solução salina.
Para a avaliação da atividade enzimática, os lotes
foram homogeneizados e centrifugados (20.000 g, 20
min a 4o C). Os substratos utilizados foram
direcionados para detecção das seguintes enzimas:
celulase, carboximetilcelulase, quitinase/lizosima,
amilase, pectinase, laminarinase, β-glucanase,
xilanase, trealase, lactase, β-glicosidase (classes 1 e 2),
α-galactosidase, α-manosidase, aα-glicosidase,
tripsina, quimotripsina, aminopeptidase e atividade
proteolítica inespecífica (azoalbumina).
Lotes de amostras contendo entre 20 e 40 intestinos foram aplicados em uma coluna de interação
hidrofóbica (Fenil-Agararose), onde foram eluidas
com tampão citrato fosfato 0,1M, pH 5,5, contendo 1M
de sulfato de amônio, em fluxo constante de 1 mlL/
min. Após cinco minutos, um segundo tampão (citratofosfato sem sulfato de amônio) passou a ser eluído em
gradiente linear crescente até 55 mL, quando a concentração de sulfato de amônio chegou a 0M, seguindo-se de mais 5 mL de eluição isocrática. As frações
(cada uma com 1 mL de elato) foram transferidas para
o gelo e ensaiadas para detecção de picos de atividade
de a-amilase, laminarinase, α-galactosidase, βglicosidase tipo 1 e 2, quitinase e α-manosidase.
SDS-PAGES foram usados para detecção de αglicosidases, β-glicosidases, α-galactosidases,
amilases e proteinases. A metodologia detelhada está
descrita em ERTHAL et al. (2004).
Os indicadores de pH azul de bromofenol, azul de
bromotimol e violeta de bromocresol indicaram que a
porção anterior do intestino médio das larvas de A.
subterraneus (aproximadamente ¼ do comprimento
total) apresenta faixa de pH ácida, entre 3,0 e 6,8,
enquanto que a porção posterior apresenta pH em
torno da neutralidade, entre 5,2 e 7,6.
O corante ingerido pela boca é prontamente transferido para o intestino médio através do esofago. No
intestino médio, o alimento se desloca lentamente.
Cinco dias após a ingestão do corante, este preencheu
no máximo 1/10 do comprimento total do intestino
médio.
Com exceção de quitina azure, celulose azure, celulose microcristalina, carboximetilcelulose, N-Phe-Ala-pNA
e Bz-Arg-pNA, todos os 21 substratos testados foram
degradados por amostras do intestino das larvas, com
atividades absolutas e específicas variando entre 0,1 e 167
(mU/animal). As amostras do tecido epitelial apresentaram atividades contra 10 substratos testados, sendo áamilase, á-glucosidase, â-glucosidase, á-manosidase,
quimotripsina e aminopeptidase as mais ativas. Estas
enzimas (exceto á-amilase) também foram detectadas na
fração particulada do epitélio, onde suas atividades (absoluta e específica) são geralmente superiores em relação
à fração solúvel. As maiores atividades foram detectadas
no conteúdo luminal do intestino médio das larvas, com
exceção para aminopeptidase, que foi mais ativa na
fração particulada do tecido epitelial. No conteúdo
luminal, a atividade de carboidrases foi maior no espaço
endoperitrófico do que no espaço ectoperitrófico, enquanto que a atividade proteolítica foi similar em ambos
(Tabela 1). Os substratos amido, glicogênio, MU-βquitotriosídeo, NPαGlu, NPβGlu, NPαGal, NPαMan e
azoalbumina foram os mais degradados.
Similarmente aos adultos, a glândula labial das
larvas apresenta alta atividade contra MU- βquitotriosídeo, atividades intermediárias contra amido e glicogênio e traços de atividade de uma
aminopeptidase (Tabela 1).
A Figura 1 apresenta a atividade de algumas enzimas
nas frações de elato obtidas em uma coluna de interação
hidrofóbica. Aα-glicosidase (NPαGlu) das larvas apresenta polaridade mediana, diferente, portanto, da á-glicosidase
hidrofílica das operárias. O ensaio das frações contra
NPβGlu revelou perfil de atividade semelhante ao observado no reto das operárias, com a presença de 3 picos de
atividade. A a-galactosidase detectada é hidrofílica, perfil
semelhante ao observado no intestino de operárias da
mesma espécie. A atividade de quitinase/lisozima no
intestino médio das larvas apresentou pico de atividade na
fração 6 (caracter hidrofílico) e quando o ensaio foi realizadocommaceradodaglândulalabial,detectou-seatividade
de uma quitinase/lisozima de caráter hidrofóbico, onde o
pico de atividade máxima ocorreu na fração 51. Estes
resultados sugerem alguns aspectos importantes destas
quitinases: a) a presenças de duas quitinases no canal
alimentar das larvas: uma secretada pela glândula labial
e outra de origem incerta, possivelmente proveniente do
jardim de fungo; b) o perfil cromatográfico da quitinase da
glândula labial das larvas e adultos é semelhante, tratando-se, possivelmente, de uma mesma enzima; c) a quitinase
produzida pela glândula labial das larvas não permanece
ativa no conteúdo luminal do intestino médio. Os ensaios
contra amido e glicogênio revelaram a presença de uma áamilase hidrofóbica, com pico de atividade entre as frações
53 e 56. O ensaio contra laminarina indicou a presença de
uma laminarinase hidrofóbica, com atividade máxima na
fração 59.
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Tabela 1 – Atividade das enzimas (mU/animal) detectadas nos compartimentos intestinais das larvas de Acromyrmex
subterraneus.
Compartimentos intestinais
Enzima
α-amilase
quitinase
pectinase
xilanase
laminarinase
β 1-3 glucanase
β-glucosidase tipo 1
β-glucosidase tipo 2
α-galactosidase
α-glicosidase
α-manosidase
proteinase
tripsina
quimotripsina
aminopeptidase
Gl labial
Epitélio
9,4
2 400
0
0
0
0
0
0
0
0
+
2,8
0
0
0
0
0
1,5
0,6
0
5,5
1,4
1,2
0
0,2
1,7
Na Figura 2 pode-se observar o perfil eletroforético
de algumas carboidrases e proteinases presentes no
trato digestivo das larvas de A. subterraneus. Similarmente aos adultos, as larvas apresentam apenas uma
á-glucosidase, detectada no intestino médio, no entanto, a á-glicosidase das larvas apresenta menor
migração eletroforética em relação à á-glicosidase
das operárias. As larvasapresentam alta diversidade
de â-glucosidases, com quatro bandas de atividade
visualizadas. As duas bandas superiores ou de menor migração eletroforética são coincidentes com as
bandas visualizadas no SDS-PAGE do reto dos adultos. No SDS-PAGE usado para detecção de á galactosidase, três bandas de atividade podem ser
visualizadas. Duas bandas, as de menor e maior
migração também foram observadas no gel das operárias, no entanto, as larvas apresentam uma enzima
a mais em relação aos adultos, que apresenta migração intermediária no gel. Duas bandas de atividade
de á-amilase foram detectadas no intestino médio das
larvas. A comparação dos SDS-PAGES usados para
detecção de á-amilases das larvas e dos adultos sugere que ambos tenham as mesmas enzimas. O gel de
gelatina indica que as larvas apresentam grande
diversidade de proteinases, com quatro bandas de
atividade presentes no espaço ecto e endoperitrófico.
Algumas bandas apresentam migração eletroforética
similar aos adultos, sugerindo que algumas
proteinases podem ser comuns e importantes para
ambos.
O desenho anatômico revelou que, similarmente a
outros himenópteros, a glandula labial de A.
subterraneus apresenta dois tubos secretórios e não
Espaço ectoperitrófico
93
18
7,3
0
7,8
0
51
4,2
16
48
45
28
0
0,7
0,5
Espaço endoperitrófico
167
81
3,2
3,8
11
7,8
69
12
41
123
53
58
0,1
0,8
0,7
quatro como em alguns Myrmicinae (ZARA & CAETANO,
2003).
O conteúdo luminal do intestino médio das larvas
apresentou atividade para 21 substratos, sendo que a
maior diversidade e valores de atividades detectáveis
ocorreram no conteúdo luminal do espaço
endoperitrófico. Os ensaios de pH sugerem a existência de um mecanismos de compartimentação, favorecendo a atividade de carboidrases na região anterior
e proteolítica na posterior.
As enzimas presentes na glândula labial de larvas e adultos de A. subterraneus são similares. Este
mesmo perfil ocorre em A. octospinosus (FEBVAY &
KERMARREC, 1983), que também é micófaga, indicando que o fungo (composto de quitina e glicogênio,
como polissacarídeo de reserva) é atacado por estas
enzimas.
Polissacaridases estão presentes no espaço
ectoperitrófico,
enquanto
que
muitas
dissacaridases estão muito ativas no espaço
endoperitrófico, o que sugere ausência de um sistema de compartimentação de enzimas. Esta característica é semelhante ao processo digestivo de
holometábolos primitivos, como coleópteros (TE RRA , 1988), que exploram recursos alimentares estáveis, enquanto que os holometábolos mais avançados se adaptaram na exploração de recursos
efêmeros. No caso específico das formigas
cortadeiras, o fungo e as folhas de plantas, cortadas
durante todo o ano na região Neotropical (ANJOS et
al ., 1998), representam recursos estáveis, indicando que a fisiologia da digestão desta formiga pode
ser uma adaptação ao seu hábito alimentar.
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Fig. 1 - Atividade de α-glucosidase (NPαGlu), β-glucosidase (NPβGlu e celobiose), α-galactosidase (NPαGal), αmanosidase (NPαMan),α-amilase (glicogênio e amido), laminarinase e quitinase nas frações cromatográficas, de uma
fenil-agarose, onde se aplicaram amostras de intestino médio de larvas de Acromyrmex subterraneus. LG – glândula labial;
M – Intestino médio.
Fig. 3 - SDS-PAGES para detecção de α-glucosidase, β-glucosidases, α- galactosidases, α-amilases e proteinases no
intestino médio das larvas de Acromyrmex subterraneus. As setas indicam a presença de bandas de atividade. ecto e endo,
significam conteúdo luminal do espaço ectoperitrófico e endoperitrófico, respectivamente.
O fato das larvas não defecarem justifica a lentidão
que a dieta contendo corante se movimentou no intestino médio. O tempo de residência alto pode explicar
esta característica, pois a permanência de alimento
por períodos prolongados poderia dispensar um sistema com intensa extrusão e absorção de água e íons
tornando o processo digestivo mais eficiente
energeticamente.
A atividade de pectinase e laminarinase são, provavelmente, desnecessárias no intestino médio. Estas
enzimas podem estar sendo usadas como fonte de
aminoácidos para as larvas.
As enzimas α-glicosidase, β-glicosidase, αmanosidase e proteases (tripsínica e aminopeptidase)
foram detectadas no tecido epitelial, sugerindo a participação secretora das larvas. A origem de Pectinase,
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laminarinase, β1-3glucanase e á-galactosidase pode
ser fúngica.
Os ensaios cromatográficos para detectar atividade quitinolítica na glândula labial das larvas apresentaram perfis similares aos da glândula das operárias. Interessantemente, o pico de atividade
quitinolítica do intestino médio das larvas não coincide com o pico da glândula labial, indicando que a
quitinase produzida na glândula não está ativa no
intestino médio. É possível que a digestão da quitina
seja extra oral, ocorrendo nos segmentos torácicos do
ventre das larvas, como em outras espécies de formig a s (HÖ L L D O B L E R & WILSON , 1990). A quitinase
hidrofílica presente no intestino médio é de origem
incerta. A preservação das propriedades da matriz
peritrófica, que contém quitina, pode ser o motivo da
inibição observada.
Altas atividades de α-glicosidase e α-amilases,
como a observada paraA. subterraneus, são comuns em
muitas espécies de insetos. Esta enzima pode estar
atuando na digestão intermediária e final de amido
ou glicogênio (TERRA & FERREIRA, 2005).
Diversas β-glicosidases ocorrem no intestino médio de A. subterraneus. Elas podem ser importantes na
degradação de glico-lipídeos, glico-proteínas, quitina
e para evitarem a degradação de glicosídeos tóxicos
de plantas, podendo estar relacionada com a polifagia
desta espécie de formiga.
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