Atividade antimicrobiana do Pg-AMP recombinante, um peptídeo

55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
1
Atividade antimicrobiana do Pg-AMP1 recombinante,
um peptídeo rico em glicina, isolado de goiaba
(Psidium guajava L.)
Tavares, LS1; Rettore, JVP1; Singulani, JL1; Duque, APN1; Silva, ON1; Franco, OL2; Santos, MO1
Laboratório de Genética, Departamento de Biologia –UFJF; 2 Laboratório de Análises Proteômicas e Bioquímicas – UCB;
letí[email protected]
1
Palavras-chave: Pg-AMP1. Peptídeo Antimicrobiano. Expressão Heteróloga. AMP. Glycine-rich protein.
A busca por novos antibióticos de amplo espectro de ação tem aumentado nas últimas décadas devido ao número
crescente de bactérias resistentes aos antibióticos convencionais. O peptídeo recombinante Pg-AMP1, expresso em
um sistema heterólogo em Escherichia coli, apresentou atividade antibacteriana contra linhagens Gram-positivas
e Gram-negativas. A partir da seqüência de aminoácidos do peptídeo isolado de sementes de goiaba (Psidium
guajava L.) o gene correspondente ao peptídeo foi modificado utilizando-se o códon preferencial para expressão
em E. coli e construído um vetor de expressão. Uma região codificadora para cauda de histidina foi fusionada ao
gene pg-amp1 permitindo a purificação por cromatografia de afinidade com íons de níquel imobilizados em coluna
de sefarose. Utilizando SDS-PAGE e análise in sílico identificamos a massa molecular do Pg-AMP1 recombinante
de 7, 368 kDa e pI 8.93. O peptídeo recombinante foi expresso principalmente na forma insolúvel, agregando-se em
corpos de inclusão que foram tratados com agentes desnaturantes obtendo o peptídeo solúvel. Após a purificação
pela coluna de níquel obtivemos um rendimento de 13 mg por litro de meio de cultura. O peptídeo Pg-AMP1
recombinante apresentou atividade contra as bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa
e contra as Gram-positivas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermides. O peptídeo recombinante PgAMP1 não mostrou atividade contra os fungos fitopatogênicos testados. Devido a sua ação contra estas cepas de
bactérias patogênicas humanas, o Pg-AMP1 recombinante torna-se um promissor antimicrobiano a ser utilizado
no desenvolvimento de novos antibióticos contra cepas resistentes aos fármacos comumente usados.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq e CAPES
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Investigação da microbiota endofítica de microplantas
assintomáticas de Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe
Esposito, NP1; Abreu-Tarazi, MF de1; Almeida,, CV2 de; Tsai, SM3; Almeida,M1 de
Laboratório de Morfogênese e Biologia Reprodutiva de Plantas, ESALQ/USP.
Biologia Celular e Molecular, CENA/USP, Piracicaba, SP.
[email protected]
1
2
InVitro Palm Consultoria EDB Ltda. 3Laboratório de
Palavras-chave: micropropagação, cúrcuma, axênica, endófito, Bacillus pumilus.
A presença de microrganismos em plantas micropropagadas é freqüentemente atribuída a problemas referentes
ao manuseio nos subcultivos. Entretanto, já existem evidencias que esses microrganismos sejam endófitos,
uma vez que, não necessariamente, sua presença nas microplantas afeta negativamente seu desenvolvimento,
podendo ainda ser uma associação neutra ou benéfica. Dessa forma, o principal objetivo deste trabalho foi a
investigação da presença de bactérias endofíticas em microplantas assintomáticas, visando contestar a existência
de propágulos verdadeiramente axênicos e sugerindo uma possível relação benéfica entre bactérias endofíticas e a
plantas micropropagadas. Para tanto, foram avaliadas microplantas de cúrcuma (Curcuma zedoaria) consideradas
axênicas, provenientes de subcultivos conduzidos por manipuladores diferentes, e mantidas em dois ambientes
controlados, porém com condições de luminosidade e temperatura também diferentes. Amostras de tecidos
dessas microplantas foram utilizadas para o isolamento de bactérias endofíticas por meio de fragmentação e
trituração (duas diluições 10-1 e 10-2). Os tecidos, fragmentados ou triturados, foram incubados em placas de Petri
com diferentes meios de cultura (BDA, LB, TSA, TSB, PCAT e BG-11). As placas foram mantidas em B.O.D a 28ºC
até o surgimento de colônias. Após 48h de incubação foi possível verificar o surgimento das primeiras colônias
bacterianas, as quais foram purificadas pelo método de estrias e, em seguida, cultivadas em meio LB líquido a
28ºC sob agitação por 48h. Após esse período, a cultura foi centrifugada para a realização da extração do DNA
bacteriano. Uma alíquota do DNA extraído foi utilizada para a reação de amplificação (PCR) do fragmento do gene
16S rRNA de Bacteria com os primers fD1 e rD1. O produto dessa amplificação foi purificado, e posteriormente
utilizado para o sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As seqüências geradas foram comparadas com
sequências depositadas no GenBank do NCBI e no Ribossomal Database Project, apresentando alta similaridade
com Bacillus pumilus. Essa bactéria caracteriza-se como microrganismo cultivável, presente nas microplantas
avaliadas, independentemente do manipulador do subcultivo ou das condições de manutenção das culturas nas
quais as microplantas foram submetidas. Além disso, pode-se afirmar que os processos de autoclavagem e assepsia
dos materiais de cada laboratório não influenciou na presença do B. pumilus com origem no interior dos tecidos
das microplantas, comprovando a existência de uma microbiota persistente e específica alheia às condições
externas de cultivo. Além disso, cabe ressaltar que B. pumilus vem sendo estudado exaustivamente por sua grande
importância como endofítico benéfico à planta hospedeira e responsável, segundo a literatura, por promover o
crescimento vegetal, aumentar a emergência de raízes, aumentar o potencial de colonização de raízes, além de
aumentar os índices de germinação de sementes, de desenvolvimento de raízes, de absorção de nutrientes e água,
bem como suprimir várias doenças de plantas.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Elaboração de protocolo de Nested PCR em um tubo
único para detecção do fitoplasma associado aos
sintomas do Huanglongbing dos citros
da Silva, ACB1,2; Augusto, MLV1,2; Ayres, AJ1; Teixeira, DC1
FUNDECITRUS - Fundo de Defesa da Citricultura - Araraquara, São Paulo, Brasil
Centro Universitário de Araraquara - Uniara
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Huanglongbing, Citros, Fitoplasma, Nested PCR, DNAr 16S
A doença de Huanglongbing (HLB) dos citros é considerada uma das mais graves da citricultura brasileira, sendo a
sua ocorrência relatada no Brasil no ano de 2005. Atualmente, três liberibacter: Candidatus Liberibacter asiaticus,
Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, e um fitoplasma ( fitoplasma-HLB) estão
associados com o HLB. A detecção dos agentes envolvidos com o HLB é realizada através de técnicas de PCR
(Reação da Polimerase em Cadeia), o que permite um diagnóstico mais preciso da doença. Quando se objetiva o
diagnóstico de doenças que requerem a adoção de medidas de controle com a erradicação de plantas doentes,
como é o caso do HLB, quanto mais rápido e preciso for o diagnóstico, mais rápida será também a eliminação
da planta sintomática, o que, em outras palavras, significa a redução de fonte de inóculo em um pomar. Na
PCR, a sensibilidade e especificidade do método são de fundamental importância. E quando o método não é
suficientemente adequado, pode-se fazer o uso de técnicas como o Nested PCR. Atualmente, a diagnose de Ca.
L. asiaticus e Ca. L. americanus, as duas formas de liberibacter presentes no Brasil, baseia-se em uma reação de
PCR duplo, enquanto que a diagnose do fitoplasma-HLB baseia-se na detecção por meio de uma reação de PCR
simples. O PCR duplo para liberibacter tem-se mostrado satisfatório. Entretanto, o PCR usado na detecção do
fitoplasma-HLB requer maior especificidade e sensibilidade. Assim, um protocolo de Nested PCR em um tubo
único foi desenvolvido para a detecção do fitoplasma-HLB, utilizando-se primers obtidos da região do DNAr 16S
do fitoplasma-HLB. A reação foi inicialmente otimizada em reações de PCR simples e posteriormente utilizada
para o Nested PCR em tubo único. Os resultados mostraram amplificação específica para as amostras de DNA
provenientes de plantas doentes, comprovada pelo seqüenciamento do fragmento amplificado. A metodologia
está sendo agora avaliada em testes de sensibilidade, em relação aos métodos convencionais usados na rotina de
diagnose do fitoplasma-HLB.
Apoio Financeiro: FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA-FUNDECITRUS
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Identificação molecular de linhagens de Bacillus
Megaterium capazes de produzir polihidroxialcanoatos
Oliveira, IM1; Krueger; CL1; Bendia, AG1; Castro-Silva, MA2; Vasconcellos, R3; Lima, AOS1
Laboratório de Genética Molecular, CTTMAR, UNIVALI.
Laboratório de Microbiologia Aplicada, CTTMAR, UNIVALI.
3
Departamento de Bioquímica, CCB, UFSC.
1
2
Palavras-chave: Polihidroxialcanoatos, Bacillus, gene 16S.
Polihidroxialcanoatos são polímeros lineares, metabólitos secundários de uma variedade de procariontes,
sintetizados na ausência de algum nutriente e em excesso de fontes de carbono. Estes são polímeros completamente
biodegradáveis, e, além disso, possuem propriedades termoplásticas e de insolubilidade em água, similares aos
polímeros e elastômeros utilizados atualmente. Com a problemática do acúmulo de resíduos plásticos surgiu,
como alternativa, o uso de polímeros naturais, tendo como principal matéria fontes renováveis de carbono,
como resíduos agro-industriais. Dentre os microrganismos conhecidos produtores de bioplástico estão diversas
bactérias do gênero Bacillus. Estes apresentam forte potencial industrial por apresentarem rápido crescimento
e adaptabilidade. Desta forma, buscou-se isolados de Bacillus potenciais produtores de PHA que crescessem em
meio amiláceo, sendo então identificados molecularmente e analisados quanto a sua produção. A análise partiu
do banco de isolados de Bacillus e Paenibacillus do Laboratório de Microbiologia Aplicada (UNIVALI/SC), no
qual foram utilizados 4 isolados previamente identificados como potenciais produtores de PHA. A identificação
molecular foi realizada a partir da amplificação do gene 16S rRNA, onde primeiramente foi realizada uma etapa
de extração do DNA genômico dos isolados. Em seguida, o DNA extraído foi submetido à técnica de Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se um par de iniciadores específicos. Os produtos de PCR foram clonados
em plasmídio utilizando o Kit InsTAcloneTM PCR Cloning (Fermentas, MD), e o plasmídio recombinante foi inserido
por choque elétrico em célula competente E. coli DH10B. O plasmídio foi seqüenciado utilizando-se os iniciadores
universais e o iniciador interno 16S rRNA. Por fim, a homologia das seqüencias de 16S rRNA foi determinada
pela sua comparação com as seqüencias depositadas no banco de dados GenBank (NCBI), pelo método BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool). Os resultados demonstraram que os isolados selecionados pertencem à
espécie Bacillus megaterium, conhecidamente produtor de PHA em condições de excesso de carbono no ambiente
e limitação de nutriente. As linhagens identificadas foram, então, crescidas em meio mineral limitado (300mL),
tendo como fontes de carbono (1) glicose 2% (p/v) e (2) amido hidrolisado 2% (v/v), para a produção do polímero.
A biomassa celular foi seca, liofilizada e submetida à metanólise. A partir da amostra de PHA solúvel obtida, foi
realizado teste de cromatografia gasosa para a determinação de PHA das células, tendo como padrão interno o
ácido benzóico (-HB). Os resultados confirmaram a produção do polímero P(3HB) por estes isolados, sendo que
a utilização de amido como fonte de carbono para produção de PHA se mostrou eficiente, tendo em vista o valor
atingido de 24% de PHB, em relação ao peso seco celular e rendimento de 4,4g de massa seca/L de cultura, em um
dos isolados analisados.
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Identification and characterization of
Gluconacetobacter diazotrophicus mutants related with
biofilm formation
Pádua, VLM3; Loureiro, MM1,2; Costa, CF3; Ventura, RC1; Oliveira, BSG3; Baldani, JI4; Hemerly, AS5; Coelho,
AMA1
Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos – Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro – Campus Duque de Caxias.
3
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular – Centro Universitário da Zona Oeste (RJ).
4
Laboratório de Genética e Bioquímica – Embrapa-Agrobiologia – Seropédica – RJ.
5
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas – Universidade Federal do Rio de Janeiro.
1
2
Keywords: biofilm, mutagenesis, G. diazotrophicus
Many bacterial pathogens, symbionts and commensals are especially creative in their regulatory processes to
adapt to sudden changes in nutrient availability, and the response to host secondary defenses. A particularly
important example of bacterial adaptation is the ability to sessile grown as biofilm, forming an optimized niche
embedded in a gel-like extracellular polymer network of microbial origin. The bacterium Gluconacetobacter
diazotrophicus is found mainly in the intercellular spaces and vascular tissues of plants from different families,
especially sugarcane, resulting in substantial benefits to culture. The bacterium must adapt to the interaction
with insects, spores of fungi and, particularly, to different plant species and in different circumstances. The
complete genomic sequences of G. diazotrophicus (PAL5) was decoded (RioGene Project) and following up this
work, a library containing random mutations by insertion of the transposon EZ-Tn5TM <KAN-2> (Epicenter ®)
was generated at Embrapa-Agrobiologia. This work is based on the identification G. diazotrophicus mutants with
reduced capacity to biofilm formation using glass wool as surface. Selection was based on growth in LGIP medium
in polystyrene plates of 96 wells containing glass wool fibers in suspension. The culture was stained with crystal
violet, washed with ethanol and measured in spectrophotometer at 600nm to estimate the amount of biofilm.
Knockout genes were identified through of direct bi-directional sequencing from genomic DNA, using terminal
transposon-specific primers. Among the selected mutants, one carries a gene coding to a putative transcriptional
regulator with LacI domain and other to a diguanylate cyclase protein (GGDEF). The first usually bind DNA via a
helix-turn-helix motif and includes periplasmic binding proteins. The periplasmic binding proteins are the primary
receptors for chemotaxis and transport of many sugar based solutes. The last mutant GGDEF is often linked to
regulatory domains, synthesizing cyclic di-GMP, which is used as an intracellular signalizing molecule. Processes
regulated by this domain include exopolysaccharide synthesis, biofilm formation, motility and cell differentiation.
The characterization of sugarcane plantlets free of microorganisms and inoculated with mutants and wild type
bacterial strains are under investigation and should provide valuable information about the importance of biofilm
to the establishment of efficient association of plant and bacteria.
Financial Support: Finep-MCT, Faperj, Capes and CNPq.
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Análise da diversidade bacteriana associada aos
utrículos de Utricularia giba
Crescente, JG1; Storte-Santos, FC1; Miranda, VFO2; Araújo, WL1
Laboratório de Ecologia Molecular e Ecologia Microbiana - Universidade de Mogi das Cruzes
Laboratório de Sistemática Vegetal - Universidade de Mogi das Cruzes
1
2
Palavras-chave: PLANTA CARNÍVORA, 16S RRNA, CHROMOBACTERIUM, IODOBACTER, ENDOPHYTES
O gênero Utricularia representa 42% do total de plantas carnívoras conhecidas. Este gênero é encontrado em
todo o mundo, em locais de grande umidade, luminosidade, e até em ambientes pobres em nutrientes, desde
que ofereçam condições para a planta reutilizar certos nutrientes e absorver outros da água, além de obter
nutrientes por meio da captura e degradação de pequenos invertebrados. Neste contexto, tem sido descrito que
bactérias podem estar envolvidas com o processo de degradação destas presas, as quais são capturadas por folhas
modificadas denominadas de utrículos. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram i) isolar bactérias
associadas aos utrículos de Utricularia giba; ii) identificar as bactérias por meio do sequenciamento dos genes
16S rRNA e iii) analisar filogeneticamente os isolados bacterianos por meio da análise da seqüência de genes
conservados. Para isso, bactérias foram isoladas de dois espécimes de U. giba de duas áreas, sendo uma próximo
à estrada Mogi-Salesópolis (S23°33’23.0” O46°08’13.2”), e outra no trevo de Mogi-Bertioga, próximo ao moinho
holandês (23°49’26.36”S 46°07’40.01”O), e em seguida caracterizadas por meio da análise da seqüência do gene
16S rRNA. Os resultados obtidos mostraram que a comunidade bacteriana cultivável de U. giba é composta por
isolados pertencentes aos gêneros Chromobacterium, Aquitalea, Iodobacter e Gulbenkiania, os quais não têm sido
descrito em associação com outras espécies de plantas. Esta composição da comunidade bacteriana associada
aos utrículos de U. giba pode sugerir que a habilidade da planta em capturar presas e/ou a sua presença em
um ambiente aquático pode favorecer o estabelecimento de uma comunidade bacteriana com características
fisiológica diferentes daquelas previamente descrita em outras plantas hospedeiras. Tendo em vista que este é a
primeira descrição da comunidade bacteriana associada à U. giba, atenção será dada à aspectos taxonômicos dos
diferentes isolados obtidos, visto que novos genótipos bacterianos poderão ser descritos.
Apoio Financeiro: FAPESP (processo nº 07/58277-7)
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Eletroforese de enzimas multilocos de isolados
de Staphylococcus aureus ampicilina-resistentes
provenientes de ambientes aéreos odontológicos
Bassi, RC1; Boriollo, MFG1; Bernardo, WLC2; Rosa, EAR3; Höfling, JF2
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
Laboratório de Estomatologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, PR,
Brasil.
3
Laboratório de Microbiologia e Imunologia Oral, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, UNICAMP, Piracicaba, SP, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, ampicilina-resistente, MLEE, análises de agrupamento, clínica odontológica.
A presente pesquisa avaliou a diversidade genética e a distribuição de linhagens de S. aureus ampicilina-resistente
em diferentes ambientes clínicos odontológicos (ar) através da eletroforese de enzimas multiloco (MLEE) e análises
de agrupamento. Um total de 44 isolados de S. aureus, previamente coletados e identificados, durante um período
de doze meses de multi-atividades na clínica integrada (dentística, periodontia, endodontia, ortodontia e/ou
cirurgia) e serviço de urgência, da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas,
SP, Brasil, bem como caracterizados fenotipicamente por testes de sensibilidade antimicrobiana e de produção
de b-lactamases, foram genotipados. Culturas bacterianas foram desenvolvidas em frascos contendo 200mL de
BHI (Brain Heart Infusion) a 37oC por 24h, sob agitação constante a 150rpm. Após o crescimento, as células foram
centrifugadas a 5.000´g por 3 minutos, e lavadas duas vezes em solução de fosfato de potássio pH 7,5 (40mM),
submetendo cada lavagem a mesma força centrífuga. Enzimas foram extraídas em solução de fosfato de potássio
pH 7,5 (40mM) empregando pérolas de vidro e aparelho BeadBeater (Biospec Products, Inc.) e, em seguida, foram
separadas em gel de amido (Penetrose 30) a 13% (m/v) em tampão (1:29) Tris-ácido cítrico pH 8,0 (solução 1:1;
Tris[hidroximetil]aminometano 687mM, ácido cítrico monohidratado 157mM, em água destilada). A eletroforese
foi realizada em sistema horizontal e contínuo [tampão do eletrodo: solução 1:1 de Tris-ácido cítrico pH 8,0], sob
uma tensão de 130 volts a 4oC overnight. Para assegurar a reprodutibilidade dos resultados, enzimas celulares
da linhagem-padrão de S. aureus ATCC-29213 foram sistematicamente aplicados nas extremidades de cada gel.
Após a corrida eletroforética, o gel foi fatiado em lâminas de 1,5mm de espessura que, cuidadosamente, foram
colocadas em recipientes de porcelana branca e submetidas ao processo de revelação enzimática por métodos
descritos previamente para 9 loci: catalase (Cat EC 1.11.1.6), álcool desidrogenase (Adh EC 1.1.1.1), glucose-6fosfato desidrogenase (G6pdh EC 1.1.1.49), glucose desidrogenase (Gdh EC 1.1.1.47), malato desidrogenase (Mdh
EC 1.1.1.37), b-galactose desidrogenase (Gldh EC 1.1.1.48), a-esterase, b-esterase (ab Est EC 3.1.1.1), manitol-1fosfato desidrogenase (M1p EC 1.1.1.14). A diversidade genética das linhagens de S. aureus foi determinada pelo
coeficiente de distância genética de Nei (1972) e os seus relacionamentos foram determinados pelo método SAHN
(sequential, agglomerative, hierarchic, nonoverlapping clustering methods), algoritmo UPGMA (unweighted pairgroup method using an arithmetic average), e visualizados em um dendrograma. Neste estudo observa-se a dinâmica
da propagação aérea, e ao longo do tempo, dessas linhagens de S. aureus, idênticas ou altamente relacionadas,
ampicilina-, eritromicina e tetraciclina-resistentes, e aponta para a necessidade da criação de barreiras de
contenção e higienização periódica nesses ambientes, a fim de prevenir a sua transmissão e propagação em
ambientes odontológicos, profissionais e seus pacientes.
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Cloning and expression of a amilopullunase gene from
Pyrococcus furiosus in Pichia pastoris (Komagataella
phaffii)
Galdino, AS; Moraes, LMP; Torres, FAG
Laboratório de Biologia Molecular - Instituto de Ciências Biológicas- UnB.
[email protected]
Keywords: amilopullulanase, Pyrococcus furiosus, Pichia pastoris, Komagataella phaffii, Heterologous expression.
The use of methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a cellular host for the expression of enzymes has gained much
interest for biotechnological application for the production of industrial enzymes in recent years. Because of its
powerful and versatile system, P. pastoris provides the potential for producing soluble, correctly folded recombinant
proteins that have undergone all the post-translational modification required for functionality. In the present
work, a Pyrococcus furiosus amilopullulanase gene (Pfapu) was isolated by PCR using a set of primers designed to
amplify its coding region. A c.2.5-kb amplicon was cloned into pGEM-T vector and sequenced. Sequence analysis
obtained showed 100% of identity with the Pyrococcus furiosus DNA sequence deposited in GenBank (accession
no. DQ192527). After that, the Pfapu was digested with Xho I and Not I and subcloned into the yeast expression
vector pPIC9 vector linearized with the same enzyme. The resulting vector was named pPICPfapu. Pichia pastoris
GS115 was transformed with the resulting plasmid and successful amilopullulanase expression was observed after
the formation of distinct hydrolysis halo around colonies grown on plates containing 1% pululan. No pullulan
hydrolysis halo was observed in cells transformed with pPIC9 alone. The successful expression of APU in pichia
pastoris shows this enzyme may be used in biotechnological process that involves starch degradation or detergent
industry.
Financial support: CAPES, CNPq E FAPDF
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Variação intra-específica em linhagens de Xylella
fastidiosa por PCR-RFLP do gene recA
Fenerich, PC; Lemos, EGM; Lemos, MVF.
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária. Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Via de
Acesso Prof. Paulo D. Castellane s/n, CEP 14884-900. Unesp/Campus de Jaboticabal, SP, Brasil.
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, PCR-RFLP, recA, haplótipos, mutação
O gene relacionado à recombinação e reparo (recA) é indispensável para a manutenção e a diversificação do
material genético nas bactérias assim como em outros organismos. Trinta e uma linhagens de Xylella fastidiosa, de
origem geográfica e hospedeiros diferentes, foram analisadas utilizando a técnica de PCR-RFLP (polimorfismo no
comprimento de fragmentos de restrição). Entre as enzimas de restrição usadas, a StyI, PvuI e a BssHII mostraram
maior variabilidade nos fragmentos gerados. A distribuição haplotípica sugere a possibilidade de alterações
genéticas da sequência de nucleotídeos do gene recA, atribuídas às interferências de origens relacionadas a eventos
de mutação e recombinação genéticas nesta região.
Órgão Financiador: Capes
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Seleção de Bacillus produtores de
polihidroxialcanotatos (PHA) e avaliação da presença
do gene PHAC por meio da PCR
Bendia, AG1; Krueger; CL1; Oliveira, IM1; Castro-Silva, MA2; Vasconcellos, R3; Lima, AOS1
Laboratório de Genética Molecular, CTTMAR, UNIVALI.
Laboratório de Microbiologia Aplicada, CTTMAR, UNIVALI.
3
Departamento de Bioquímica, CCB, UFSC.
1
2
Palavras-chave: Polihidroxialcanoatos, Bacillus, Resíduo Amiláceo, Gene PhaC, PCR.
Os materiais plásticos possuem ampla aplicação na sociedade moderna, porém o acúmulo de resíduos plásticos
tem apresentado grande problemática que em maior prazo pode causar danos graves aos ecossistemas. Em
contrapartida, os polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres sintetizados por várias bactérias e armazenados
na forma de inclusões citoplasmáticas como reserva energética e poder redutor. Estes polímeros possuem
características termoplásticas, biocompatíveis e biodegradáveis, além de serem produzidos a partir de fontes
renováveis de baixo custo. Trabalhos anteriores demonstram que bactérias do gênero Bacillus produzem
constitutivamente o polímero, sendo deste modo de grande importância a busca de produtores naturais visando
aplicações industriais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi selecionar bactérias do gênero Bacillus capazes
de produzir PHA a partir de resíduo amiláceo, bem como verificar a presença do gene PhaC nos isolados mais
promissores quanto a síntese do polímero. Inicialmente, 72 isolados de Bacillus de 21 espécies diferentes, presentes
na coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia Aplicada (UNIVALI/SC), foram cultivados em
meio com limitação de fósforo e 2% (p/v) do resíduo industrial, rico em amido e açúcares redutores. Para análise
qualitativa de produção de PHA, foi adicionado ao meio o corante vermelho do Nilo, e a partir da visualização
em microscópio de epifluorescência, foram selecionados 4 isolados que apresentaram melhor capacidade de
produção de P(3HB) a partir do resíduo amiláceo. Os isolados foram submetidos à reação de amplificação do
gene PhaC por meio da PCR. Para tanto, um par de primers internos para o gene PhaC foi desenhado, utilizando
seqüências homólogas e regiões conservadas de diferentes espécies de Bacillus. Para analisar a melhor condição de
amplificação, visando obter a seqüência de DNA alvo e melhor especificidade dos primers para o gene PhaC, foram
testadas variações de concentração de MgCl2 (1, 2, 3, 4 e 5mM). Dentre as variações analisadas, a que se mostrou
melhor em relação as demais foi de 4mM. Os produtos amplificados foram avaliados por eletroforese, em gel de
agarose 2%. A análise do perfil eletroforético indica que em todos os isolados o gene de interesse foi amplificado,
porém segmentos inespecíficos são observados na maioria das condições testadas. Tal técnica possibilitou avaliar
a presença do gene PhaC nos isolados de Bacillus, podendo ser empregada também para outras espécies de Bacillus
potencialmente produtoras do polímero. Portanto, os isolados apresentam potencial para a produção de P(3HB)
em substrato de baixo custo, sendo um próximo passo avaliá-los em uma escala superior de produção, bem como
realizar a etapa de seqüenciamento para realmente afirmar a presença do gene PhaC.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Molybdate uptake system of Xanthomonas axonopodis
pv. Citri contributes to virulence symptoms in grapefruit
Oshiro, EE1; Kim, J2; Siciliano, F3; Vojnov, A3; Wang, N2; Ferreira, RCC1
Laboratório de Genética de Microrganismos, Dept. Microbiologia- ICB II USP, São Paulo, Brazil.
Citrus Pathology and Bacteriology Laboratory, CREC- University of Florida, Lake Alfred, EUA.
3
Fundación Pablo Cassará, Centro de Ciencia y Tecnología “Dr. Cesar Milstein”, Buenos Aires, Argentina.
1
2
Keywords: ModA protein, TEM, Biolfilm, Xanthan gum, virulence symptoms, Citrus paradisi
Brazil is the largest producer of citrus in the world whose agribusiness has been affected by citrus canker. This
disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac) infect mainly orange crop and induce premature death.
The sequencing of genome of Xac opened perspectives to study of important genes belonged of physiology and
nutritional systems. The molybdate uptake system is an ABC transporter responsible to internalize molybdate. This
molecule is connected to cofactor called pterin and this complex (molybdopterin) is important to redox reaction in
carbon, nitrogen and sulfur global cycles. The aim of this study is correlate molybdate uptake of Xac with virulence
in grapefruit. Besides the regulation protein is lack in the molybdate uptake system in Xac, mutant strain in this
system has shown different virulence symptoms. The mutant strain was built by introduction of spectinomycin
and streptomycin cassette into the modA gene. The encoded protein ModA was unable to uptake the molybdate in
periplasmic space and this way can not delivery the molecule to permease in membrane plasmatic. The xanthan
gum production in mutant strain (XNmodA5) reduced twice and the biofilm became immature impairing the
adhesion. The images from transmission electronic microscopy (TEM) of the lesion in grapefruit have shown the
XNmodA5 strain living freely instead of condensed in extracellular polysaccharide matrix. The RT-PCR from RNA
extracted of bacteria grew in grapefruit has shown the rpfF and hrpG there were no difference between wild type
and mutant. Nevertheless, the gumB gene was less expressed in XNmodA5. Theses data clarifies the molybdate
uptake system role is more than nutritional and suggest an involvement in xanthan gum regulatory.
Support: FAPESP
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Conservancy and genetic diversity of the oligopeptide
permease of pathogenic bacterial species inhabiting
the human gastrointestinal tract
Nepomuceno, RSL; Izabel, HA; Castro, AP; Ferreira, LCS; Ferreira, RCC.
Universidade de São Paulo
Keywords: CONSERVACY, GENETIC DIVERSITY, OLIGOPEPTIDE PERMEASE, PATHOGENIC BACTERIA, OPPA
The gastro-intestinal tract (GT), that begins at the oral cavity and ends at the rectum, is a complex habitat for
thousands of bacterial species inhabiting distinct epithelial surfaces. Along its length, different selective forces,
such as nutrient availability and presence of antimicrobial compounds, favor or restrict the permanence and
proliferation of specific bacterial species. The aim of the present study was the detection of genes encoding a
nutrient transport system specifically involved with the uptake of oligopeptides. The oligopeptide uptake system
(Opp), an ATP-binding component-type active transport system, has been investigated in Streptococcus mutans,
the etiological agent of tooth decay, as well as Shigella, Salmonella and Escherichia coli strains belonging to different
species and pathotypes. The Opp system is composed by a substrate-binding component (OppA) and a multicomponent cytoplasmic membrane-associated complex delimiting a transmembrane pore and ATPase domain
that generates energy from ATP hydrolysis to the transport process. Fifty eight enterobacteria strains, isolated from
different mammalian hosts, and ten S. mutans strains, including seven isolates recovered from caries active lesions,
were evaluated for the expression of OppA based on specific polyclonal antibodies raised against recombinant
proteins derived from E. coli K12 and S.mutans UA159 strains. The OppA protein was detected in only four of
the ten S. mutans strains analyzed with the anti-S. mutans OppA antibody, including one derived from a caries
lesion. In contrast, all pathogenic E. coli, Shigella and Salmonella strains investigated for the expression of OppA
as demonstrated in Western blots carried out with the anti-E.coli K12 antibodies, suggesting that expression of
the OppA is particularly relevant for enteric gram-negative bacterial strains. The OppA-encoding genes of five
E. coli, four Shigella, and five Salmonella strains were sequenced. Overall the OppA proteins encoded by E. coli
and Shigella strains were 99% identical, while the identity shared with the Salmonella orthologs reached 84%.
The polymorphic sites at the respective amino acid sequences suggest that the proteins show similar biological
activities. In conclusion, the present data indicate that the Opp system represents an important and conserved
ABC-transporter among enteric gram-negative bacterial species. In contrast, S. mutans, a gram-positive inhabitant
of the oral cavity, the expression of the Opp system does not seem to be required for growth as well as pathogenicity
to human hosts.
Supported by FAPESP and CNPq
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Análise in silico do sistema de restrição-modificação
do Tipo II da bactéria Xylella fastidiosa
Virgilio, S¹; Takita, MA²
¹Universidade Federal de São Calos – UFSCar – Campus Araras.
2
Laboratório de Biotecnologia - Centro APTA Citros Sylvio Moreira - Instituto Agronômico de Campinas.
[email protected]
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, sistema RM, endonuclease, metiltransferase e bioinformática.
Os sistemas de restrição-modificação (RM) foram inicialmente identificados como elementos de proteção contra
bacteriófagos. Apesar de não serem únicos, são bastante efetivos em certas circunstâncias. Funcionam através de
atividades enzimática opostas, endonuclease e DNA metiltransferase, que interagem com sequências específicas
de DNA. As endonucleases clivam a dupla fita de DNA e as metiltransferases transferem um grupo metil para o
DNA, nas bases nitrogenadas adenina ou citosina, protegendo-o da clivagem pela endonuclease. O sistema RM do
Tipo II é o mais simples e mais comum, sendo a metiltransferase e endonuclease codificadas por duas proteínas
separadas de ação independente, que reconhecem o mesmo sítio no genoma bacteriano. Xylella fastidiosa foi o
primeiro fitopatógeno a ter seu genoma inteiramente seqüenciado onde foram encontrados vários sistemas
restrição-modificação, principalmente do tipo I. Apenas um sistema do tipo II foi identificado e, interessantemente,
este não aparece no isolado Temecula de Xf causadora da doença de Pierce em videiras. Assim, o isolado 9a5c da
bactéria Xf, capaz de causar a clorose variegada dos citros (CVC), apresenta quatro sistemas do tipo I, um do tipo
II e um do tipo III. As seqüências da endonuclease e metiltransferase do tipo II foram utilizadas para busca por
seqüências similares no NCBI. As seqüências foram alinhadas no programa ClustalW2, na qual foram utilizadas
nove de enzima de restrição e trinta de metiltransferase. A grande quantidade de metiltransferase, em comparação
à endonuclease, sugere maior conservação nas atividades de metilação. Todavia, observou-se que a conservação
em termos de seqüência é maior entre as enzimas de restrição. Busca no REBASE mostra um putativo sítio de
reconhecimento, e o ponto exato desta clonagem é ainda desconhecido, uma vez que baseia-se nas análises de
similaridade. Atualmente, estamos trabalhando na clonagem e caracterização destas diferentes enzimas.
Apoio financeiro: FAPESP
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Uso da técnica BOX-PCR na caracterização molecular
de isolados rizosféricos de plantas de milho
Fernandes, GC; Souza, JAM; Campanharo, JC
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias UNESP-Jaboticabal.
[email protected]
Palavras-chave: PCR; Primer BOX; Caracterização Molecular; RPCPs; Milho
A cultura do milho representa grande importância para o Estado de São Paulo e para o país devido sua grande
utilização. O estudo dos microrganismos endofíticos é de grande importância para elucidação da interação
endófito-planta e por serem potencialmente vantajosos em diversos aspectos. Vários trabalhos têm utilizado a
técnica BOX-PCR para tipificação de diferentes organismos, tais como, Brucella spp., Rhizobium e Bradyrhizobium.
O primer BOX (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’), amplifica regiões conservadas e repetitivas do DNA
cromossômico bacteriano. A amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase), destas regiões genômicas da
subunidade BOXA, produz um padrão de bandas semelhante a um fingerprinting. Este trabalho teve por objetivo
a caracterização genética de dez estirpes de bactérias promotoras de crescimento de plantas, isoladas da rizosfera
de plantas de milho cultivadas em diferentes solos brasileiros. As células bacterianas armazenadas a -80ºC foram
crescidas em meio DYGS (Glicose – 2g/L; Peptona – 1,5g/L; Extrato de Levedura – 2 g/L; KH2PO4 – 0,5g/L;
MgSO4.7H2O – 0,5g/L; Ácido Glutâmico – 1,5g/L; H2O q.s.p. 1000 ml e pH de 6,8). Extraiu-se os DNAs bacterianos
(o pellet celular (0.05g) foi ressuspenso em 400 μL de solução salina 0.85%; 40 μL de solução lisozima (20 mg/
mL); 13 μL de solução RNAse (10 mg/mL); 44 μL de SDS a 20%; 158 μL de solução acetato de Sódio 3M; 650 μL de
clorofórmio: Álcool Isoamílico (24:1); dois volumes de etanol absoluto; 1 mL de Etanol 70% e 100 μL de TE (10:1).
Para verificação da integridade, os DNAs extraídos foram quantificados em gel de agarose 0,8%. A análise molecular
foi realizada por PCR através do oligonucleotídeo iniciador BOX-A1R (Tampão 10X – 2.0 μL; MgCl2 (25mM) – 1.6
μL; DNTP- 0.4 μL; primer 5pmol- 1.0 μL; DNA Taq-Polimerase- 0.5 μL; DNA (30ng) – 1.5 μL e água Milli-Q estéril
e filtrada q.s.p. 20 μL. A amplificação dos DNAs foi realizada usando um ciclo a 95°C por 5 min.; 40 ciclos por 1
min. a 95°C; 1 min. a 60°C e 5 min. a 72°C e manutenção a 4°C. Os fragmentos amplificados foram separados por
eletroforese a 50 V em gel de agarose a 1.5%. Após seis horas o gel foi visualizado em fotodocumentador (GEL
DOC 200 – BioRad). Observou-se que a ampliação dos DNAs pela técnica BOX-PCR, indicou uma alta diversidade
genética entre os isolados bacterianos, revelando que essa metodologia é eficiente, rápida e de baixo custo para
caracterização das estirpes.
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Duplex-PCR para identificação de Clostridium
estertheticum e CLOS tridium gasigenes
Santana, AR1; Jardim, EAGV1; Santos, WM1; Santos, GLP1; Mesquita, AQ1; Matias, GC1; Almeida, TL1;
Medeiros, NX1; Jardim, ACMV1
Laboratório de Biologia Molecular - Centro de Pesquisas em Alimentos – Escola de Veterinária – UFG.
[email protected]
1
Palavras-chave: Duplex-PCR, Clostridium estertheticum, Clostridium gasigenes, carne embalada a vácuo, carne bovina in natura.
O gênero Clostridium pertencente à família Clostridiaceae, são procariotos, unicelulares, bastonetes gram positivos,
anaeróbios estritos, formadores de esporos, maioria produtores de toxinas e pequena parte patogênica à espécie
humana. Trabalhos de vários autores indicam as bactérias Clostridium estertheticum e Clostridium gasigenes como
principais agentes causadores de deterioração em cortes primários de carnes resfriadas sob temperaturas entre
-1,5 e 2ºC embaladas a vácuo, causando tufamento das embalagens devido à produção de ácido butírico, butanol e
vários ésteres butíricos resultantes de seu metabolismo. Pouco se conhece sobre estes microrganismos, mas sabese que ambos pertencem a um grupo de clostrídios psicrofílicos associados à carne, não produzem toxinas, porém
deteriora a carne refrigerada embalada a vácuo em aproximadamente quatro e duas semanas, respectivamente,
levando o produto cárneo à rejeição, desclassificação e severas perdas econômicas para a industria. Considerando
o significado econômico do problema diante da escala de produção industrial brasileira para exportação de
carne bovina in natura e a dificuldade no isolamento e identificação dos agentes por métodos microbiológicos
convencionais, fez-se necessário a realização de protocolo Duplex-PCR para a detecção simultânea dos C.
estertheticum e C. gasigenes, possibilitando assim a adoção de medidas corretivas em tempo hábil pelo serviço de
garantia da qualidade industrial. Para extração do DNA utilizou-se o kit High Pure Template Preparation Kit. Em
seguida foi adicionado 45µl do mix para PCR. Na preparação do mix, foi utilizado para cada reação água ultra
pura; tampão 10x; dNTP a 100mM; MgCl2 a 1mM; Taq DNA Polymerase a 5U/µl e os pares de primers RFP/RRP e
16SDBR/16SDBF. Como controle negativo foi utilizado mistura para PCR sem DNA e como controle positivo gDNA
de C. estertheticum e C. gasigenes. No primeiro ciclo de amplificação a temperatura de desnaturação inicial foi de
94°C/5’, seguido de 29 ciclos a 94°C/1’; 60°C/1’, e 72°C/1’ e extensão final de 72°C/10’. Após a amplificação, o produto
de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 2% submerso em TBE 0,5X, sob voltagem de 100V/90’. O gel
foi corado com o intercalante de DNA GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10.000X e visualizado em equipamento fotodocumentador digital Gel Doc XR. Resultados positivos foram obtidos pela amplificação de fragmentos do gene
16S com 641pb para C. estertheticum e 935pb para C. gasigenes. Conclui-se através dos resultados alcançados que a
utilização do protocolo de Duplex-PCR pode ser utilizado para a identificação simultânea dos microorganismos, o
que possibilitará maior eficiência de controle dos procedimentos de limpeza e desinfecção na indústria frigorífica,
evitando assim prejuízos econômicos para toda cadeia de produtos cárneos.
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16
Caracterização da bactéria endossimbionte Wolbachia
em diferentes populações de moscas-das-frutas do
complexo Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae)
Marcon, HS1; Coscrato, VE1; Selivon, D2; Perondini, ALP2; Marino, CL1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, UNESP, Botucatu – SP.
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, USP, São Paulo/SP.
[email protected]
12-
Palavras-chave: Wolbachia, mosca-das-frutas, transferência horizontal, wsp, variabilidade.
A Wolbachia é uma bactéria endossimbionte amplamente distribuída entre artrópodes e nematóides. A atenção
dada a esta bactéria ocorre devido às alterações reprodutivas que elas causam em seus hospedeiros e a forma de
sua transmissão, que pode ser feita através de transferência vertical, via citoplasma dos ovos, e horizontal, ou seja,
entre organismos de espécies diferentes. As técnicas moleculares auxiliaram na detecção e estudo da Wolbachia,
e a utilização dos primers 16S rDNA, ftsZ e wsp, possibilitaram a sua divisão em oito supergrupos taxonômicos
designados de A a H. Em insetos é mais freqüente a observação dos grupos A e B de Wolbachia. A Wolbachia
tem sido estudada como um potencial agente no isolamento reprodutivo e especiação dos seus hospedeiros, o
que esta diretamente relacionada aos diferentes tipos de linhagens da bactéria encontrada. Neste trabalho foram
utilizados os primer 16S rDNA, ftsZ e wsp em quatro populações de diferentes espécies de moscas-das-frutas
do gênero Anastrepha, coletadas em três regiões do estado de São Paulo, buscando avaliar os supergrupos que
estariam infectando estas moscas. Nas 76 amostras analisadas foi detectada a infecção com o supergrupo A de
Wolbachia. Dados preliminares indicam a presença de vários tipos de perfis moleculares do supergrupo A. Os
perfis observados estão distribuídos entre duas linhagens de Wolbachia. Estes resultados abrem a perspectiva de
investigar o efeito que estas linhagens da bactéria tem sobre a biologia da Anastrepha.
Apoio Financeiro: Processo: 07/52828-1 - FAPESP
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Cloning and characterization of AraL, a putative
homolog of a transcriptional regulator in Xylella
fastidiosa involved in oxidative stress response
Barbosa, D; Santos, DS; Silva, VS; Costa de Oliveira, RL; Nunes, LR
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Brazil
Corresponding authors: [email protected]; [email protected]
Keywords: Xylella fastidiosa, oxidative stress, transcriptional regulator, soxRS.
The phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa is capable of colonizing the xylem of several different plant species,
and in certain occasions, these bacteria have been observed to grow into great densities, physically blocking the
vessels and interfering with the normal flow of sap in the plant. This situation seems to be associated with the
onset of disease; such as in the case of Citrus Variegated Chlorosis (CVC), that affects orange and lime trees. One
of the most important aspects of the plant defense system against microbial invasion is the so-called Oxidative
Burst, which consists of a rapid and transient production of huge amounts of Reactive Oxygen Species (ROS), a very
efficient method to kill microorganisms and prevent diseases. Thus, phytopathogenic and endophytic microbes
must be capable to counteract the deleterious effects of ROS, which is achieved through the action of specific
enzyme systems that are normally induced when the cell is exposed to ROS. Genes that encode such enzymes are
collectively known as Oxidative Stress Response genes (OSR genes), and have been proposed to play an important
role in virulence mediated by phytopathogenic bacteria. Among them, SoxR regulator activates the production
of SoxS which triggers the transcription of several genes related to detoxification of ions O2- and cell protection.
An extensive analysis through DNA microarray hybridization of the most representative Xf genes expression in
response to oxidative stress pointed to araL (ORF XF1254) as a putative Xf homolog of soxS. Beyond the high
sequence similarity, we detected upregulation both in microarray and qPCR when the cells were exposed to ROS
generator agents. In order to evaluate the araL expression in vivo we inoculated a suspension of Xf cells in petioles
of orange plant (Citrus sinensis) and extracted them at several periods to submit to qPCR. An increasing expression
was detected few hours after inoculation. Our efforts are currently focused on cloning and standardization of araL
expression assays to purify its product and analyze the structure of this probable regulator involved in oxidative
stress response
Finantial support: FAEP FAPESP.
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Study of the natural diversity of heat-labile toxins
(LT) produced by enterotoxigenic escherichia coli
(ETEC) strains human-derived as an approach for the
discovery of new vaccine adjuvants
Rodrigues, JF1; Mathias-Santos, C1; Sbrogio-Almeida, ME2; Cabrera-Crespo, J2; Amorin, JH1; Holmgren, J3;
Farah, SC4; Ferreira, LCS1
Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences II – USP.
Division of Technological Development, Butantan Institute.
3
Department of Microbiology and Immunology, University of Göteborg.
4
Department of Biochemistry, Institute of Chemistry – USP.
1
2
Keywords: heat-labile toxin, enterotoxigenic Escherichia coli, biodiversity, LT natural variant, adjuvant.
Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) represents an important etiological agent of diarrheal disease, particularly
among children and travellers in developing countries. The bacterial strains are characterized by the production
of at least one of two enterotoxins: heat-labile toxin (LT) and heat stable toxin (ST). LT toxins has also been
studied as vaccine adjuvant effects when administered via parenteral, mucosal and transcutaneous routes but
the inherent high toxicity of the reference LT has precluded its use in vaccine formulations for human and animal
use. We determined the occurrence of a great genetic diversity of the etx operon, encoding LT toxin, revealing 50
polymorphic sites on the etxAB genes and 23 amino acid changes at the A (18) or B (5) subunits, which generated
16 LT variant. One of these variants (LT4) showed reduced toxic activity measured either in vitro with cultured cells
(Y-1 cells) or in vivo in rabbit ligated ileal loops. In the present study we carried out biological and immunological
characterizations of the natural LT variant (LT4) with two polymorphic sites at the A subunit (K4R, and K213E)
and three at the B subunit (S4T, A46E, and E102K) and an in vitro derived form (LTK4R) carrying only the K4R
amino acid replacement generated by site-specific mutagenesis..The functional analyses of the LT forms confirmed
the reduced toxicity of LT4 and LTK4R is directly related to partial loss of the ADP-ribosylation enzymatic activity.
In nasal immunizations of C57BL/6 mice using ovalbumin (OVA) as a model antigen, LT4 e LTK4R retained strong
immunogenic and adjuvant properties in comparison to a reference toxin (LT1) with regular toxic effects. These
profiles were observed both in humoral (systemic and local antibody titers) and cellular immune resposes, such
as measured in vivo by cytotoxic activity and number of OVA-specific INF-g+ CD8+ lymphocytes. The LT4 variant
showed immune modulatory features biased to type 1 immune responses, as measured by secreted cytokines in
spleen cells of immunized mice, with regard to LT1. Taken together, our results demonstrate the study of natural
biodiversity of enterotoxins produced by ETEC strains isolated from human subjects revealed the presence of
natural LT variant endowed with reduced toxic effects and preserved immunological properties. Besides the impact
on host-pathogen interactions, the present findings may contribute for the development of safer and effective
vaccine adjuvants.
Financial supports: FAPESP and CNPq
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Development of a novel diagnosis method for canine
ehrlichiosis: DNA isothermal amplification
Chiari, MF1; Rocha, BG1; Araujo-Moreira, FM1; Matheucci Junior, E1,2
1
2
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de São Carlos.
QGene.
Keywords: Ehrlichia canis, Rhipicephalus sanguineus, PCR, LAMP, diagnostic method.
Canine monocytic ehrlichiosis (CME) is an infectious disease caused by the bacteria Ehrlichia canis, mainly
transmited by the vector Rhipicephalus sanguineus, which has worldwide distribution whith high occurrence
on tropical and subtropical areas. This canine disease can cause animal death and can affect humans. Using
imunological and microscopical diagnosis methods, it was showed a 20 to 30% of infected dogs. In this study we
have used 60 individuals of the Municipal Canil of São Carlos – SP that were submitted to DNA amplification for
detection using standard PCR and LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification). The forward primers desidned
were based on the 16S RNA ribosomal gene. A 409 base pair sequence of the dog chromosome 26 was used as PCR
positive control. The reactions were performed with 100 ng of each DNA sample. The control amplicon was detected
for all samples, while the positive ehrlichiosis samples were verified in 48 individuals (80% of the present sample).
LAMP method was established with four pairs of primers, and the results showed the same efficiency observed
for PCR technique. However some advantages were verified for LAMP amplification: more sensitive, faster (60
minutes of reaction), requires a simple waterbath and the fragment can be visualized with fluorescence. We can
conclude that CME disease can be efficiently detected and with low costs using DNA isothermal amplification.
Supported by QGene
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Endophytic and rhizoplane bacterial communities
associated to Eucalyptus roots infected by Ceratocystis
fimbriata
Ferreira, A1; Andreote, FD2; Gonzáles, ER3; Azevedo, JL1; Araújo, WL4
Departamento de Genética, Esalq/USP. Piracicaba, São Paulo.
Embrapa Meio Ambiente. Jaguariúna, São Paulo.
3
Suzano Bahia Sul Papel e Celulose S/A. Suzano, São Paulo.
4
Núcleo Integrado de Biotecnologia, UMC. Mogi das Cruzes, São Paulo.
[email protected]
1
2
Keywords: Plant-bacteria-phytopathogen interaction, Endosphere, 16S rRNA, DGGE, PCA
Brazil is one of the largest producers of Eucalyptus in the world, and the demand to increase in the yield led to the
expansion of the cultivation area. It results in changes of factors influencing eucalyptus cultivation and incidence
of new pathogens like Ceratocystis fimbriata. The infection by pathogen can influence the host ecology and change
the composition of bacterial communities associated. We used plants in four infestation stages by C. fimbriata
to assess the effects caused in the rhizoplane and endophytic bacterial communities. The culturable bacterial
diversity was assessed by isolation and 16S rRNA gene characterization by ARDRA and sequencing. Additionally,
total bacterial diversity was assessed by the culture-independent approach DGGE. Results showed that healthy
plants presented a higher bacterial density in the rhizoplane, while the endophytic community was bigger in
highly infected plants. Thirteen and eight ARDRA ribotypes were observed in the cultured bacteria isolated from
rhizoplane and endosphere of roots, respectively. The most frequent species found among isolates was Bacillus
cereus. However, only the occurrence of species Pseudomonas fluorescens, P. veronii and Rahnella aquatilis were
correlated with less disease occurrence. The DGGE analysis showed that the fungus infestation interferes in the
composition of the assessed bacterial communities. Principal Components Analysis (PCA) on the basis of DGGE
band patterns separated samples in the four stages of disease infection. The results obtained in the present work
provide information about the pathogenic-associated microorganisms and show important features caused by C.
fimbriata infection in plants.
Financial Support: CNPq and Suzano Papel e Celulose.
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Identification of Burkholderia spp from environmental
samples of Bahia and prospection of strains with
potential biotechnological applications
Santini, AC¹,²; Santos, HRM²; Silva-Neto, AB¹,²; Gross, E²; Corrêa, RX¹
¹Laboratório de Genética Molecular Aplicada – Centro de Biotecnologia e Genética – Universidade Estadual de Santa Cruz.
2
Laboratório de Química e Física do Solo - Depto de Ciências Agrárias e Ambientais – Universidade Estadual de Santa Cruz.
[email protected]
Keywords: Nitrogen fixing, growth promoting, biological control, sequencing, recA
Burkholderia is a free living bacteria from soil, rhizosphere and root nodules that promotes plants grow, fixes nitrogen,
shows bioremediation and biocontrol potential and often causes infections in cystic fibrosis patients. This genus
comprises more than 40 species, and currently novel species have been disclosed by molecular tools. Considering
the high genetic diversity within this genus, probably because of its large genome ( from 6 to 9 MB), and its diverse
biotechnological potential, the aim of this study is to identify environmental isolates of Burkholderia from Bahia by
sequencing a fragment of the recA gene and test their potential as biocontrol agent against oomycetes. The choice
of this gene and not of the 16S rDNA was due to a Burkholderia peculiarity – the high similarity within the 16S
rDNA among species. The 50 isolates were obtained from root nodules of Inga vera from Serra Bonita Ecological
Reserve, Camacã, Bahia. The primers BUR3 and BUR4 generated a 385 pb fragment of recA gene. The preliminary
sequencing analysis of 4 strains showed high similarity (91 to 94%) with Burkholderia sp 383 from the Genebank
showing e-value ranging from e-71 to e-140 and alignment scores from 274 to 503 bits. This result is consistent with the
origin of the materials, belonging to the same specie and from the same region. Besides, other studies demonstrate
that each bacterium have preference for specific plants. Our preliminary results showed low similarity among
strains obtained in the same region. Therefore, other isolates will be sampled in different regions in Bahia.
Support: CAPES
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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22
Global gene expression analysis of copper stress
response in the phytopathogen Xylella fastidiosa
Muranaka, L S1; Machado, MA2; Takita, MA2; De Souza, AA2
UNICAMP- Universidade de Campinas. Genetics and Molecular Biology Graduation Program. Institute of Biology- IB.
Centro APTA Citros Sylvio Moreira.
[email protected]
1
2
Keywords: microarray, Xylella fastidiosa, Copper, stress response, biofilm
Xylella fastidiosa is a xylem-limited plant pathogen bacterium with a wide host range. This bacterium causes a
large number of diseases in many economically important crops, such as Citrus Variegated Clorosis (CVC) in citrus
plants in Brazil. The genomes of several strains of this phytopathogen were completely sequenced, enabling large
scale functional studies. It has been shown that the main pathogenicity mechanism seems to be associated with
the formation of a biofilm inside the vessels and a consequent blockage. In some early studies our group verified
that X.fastidiosa cells when in biofilm are more resistant to some compounds than planktonic cells. This resistance
is a complex phenomenon that can not be associated with only one factor. The objective of this work was to study
the difference in gene expression of X. fastidiosa biofilm when it was exposed to a sub inhibitory dose of copper,
which was lethal for the planktonic cells. With this propose we performed a whole genome microarray analysis.
The copper was chosen as toxic agent because it is commonly used in agriculture. Globally, 109 (3.85%) genes
were induced and 107 (3.78%) were repressed. We observed the repression of genes related to aerobic respiration,
protein biosynthesis and cellular division, indicating a global reduction in the cellular metabolism that can be
associated with a common stress response of this plant pathogen. We also observed the up regulation of genes
encoding hemagglutinins. Since hemagglutinins are related with the cell-cell adherence, this could be a strategy
of the bacteria to increase the tridimensional structure of the biofilm reducing the access of the compound to the
some of the cells. In addition, some type IV pili that are involved with the movement and migration of the bacteria
were repressed. These may indicate that under an unfavorable condition, the expansion of the biofilm is restricted.
We also observed the induction of a lot of genetic mobile elements such as transposons and phage-related genes, as
a response to increase genetic diversity. These results demonstrate a very complex bacterial response to the stress.
Financial Aid: FAPESP and CNPq
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23
Clonagem, expressão, purificação e caracterização
inicial do regulador transcricional de resposta a estresse
oxidativo XfOxyR, do fitopatógeno Xylella fastidiosa
Toledo, MAS1; Pelloso, AC1; Schneider, DRS1; Saraiva, AM1; Azzoni, AR1; Souza, AP1 2
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Departamento de Biologia Vegetal – Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
12-
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, OxyR, regulador transcricional, estresse oxidativo, dicroísmo circular
As perdas na agricultura nacional e internacional em decorrência da infecção pelo fitopatógeno Xylella fastidiosa
de diversas espécies de cultivares o tornou alvo de diversos estudos procurando conhecer e compreender os
mecanismos de sua patogenicidade. Tais estudos foram impulsionados com a publicação da seqüência do genoma
deste bacilo em 2000 a qual revelou diversas características sobre a bactéria e forneceu subsídios para diversas
pesquisas. O presente trabalho visa caracterizar o produto protéico da orf Xf1273 de X. fastidiosa, o qual possui
elevada similaridade de seqüência com um regulador transcricional de resposta a estresse oxidativo OxyR (da
família LysR) de Escherichia coli. No modelo descrito para tal regulador transcricional, este atua como um sensor
citoplasmático monitorando o estado oxi/redox da célula. Na presença de fatores oxidativos, gerados sob condições
estressantes, como por exemplo, durante a infecção do hospedeiro e/ou dos mecanismos de defesa deste, ocorre a
oxidação de duas cisteínas do sítio catalítico desta proteína formando uma ponte dissulfeto a qual acarreta uma
alteração na estrutura terciária da molécula tornando-a ativa transcricionalmente. O resultado direto é a transcrição
de genes que codificam glutationa transferases, alciltransferases, peroxidases entre outros, envolvidos na eliminação
de agentes oxidativos. A orf Xf1273 foi clonada nos vetores pET28a e pET29 e a proteína correlata foi solubilizada
por uréia quando expressa fusionada à S-tag (N-terminal) do pET29. Posteriormente, adequando-se as condições
de expressão e extração, a proteína de interesse foi expressa e purificada fusionada apenas à His-tag (N-terminal)
do pET28a. A XfOxyR expressa em pET29 teve sua estrutura secundária analisada por dicroísmo circular (CD),
indicando preponderância de alfa-hélices e sua seqüência de aminoácidos confirmada por espectrometria de massa.
A proteína expressa no vetor pET28 foi purificada com grande eficiência e utilizada para testes de interação com o
promotor da orf Xf1273 (gel-shift ou EMSA), devido a auto-regulação ser uma característica marcante de reguladores
transcricionais da família LysR e será submetida a analise de sua estrutura secundária por dicroísmo circular. Ensaios
preliminares de gel-shift indicaram que a proteína XFOxyR interage, de fato com seu promotor indicando uma
possível atividade auto-regulatória desta. Adicionalmente, foram realizados testes preliminares de complementação
funcional em uma de E. coli deficiente para a OxyR sendo que linhagens selvagens apresentam maior crescimento
em placa com discos de difusão de peróxido de hidrogênio, enquanto linhagens knockout para OxyR apresentam
crescimento reduzido em direção ao disco. A linhagem mutante foi complementada com o vetor pET29a contendo
a orf Xf1273 e quando comparada com a linhagem selvagem e os controles foi possível observar uma retomada do
fenótipo selvagem desta. De tal modo, a orf Xf1273 codifica, de fato, um fator de transcrição envolvido na resposta a
estresse oxidativo sendo tal resposta de grande importância para um organismo fitopatogênico.
Apoio Financeiro: FAPESP
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24
Caracterização enzimático-estrutural de uma proteína
de sobrevivência de fase estacionária E (SurE) de
Xylella fastidiosa: comportamento alostérico e seu
provável papel no metabolismo
Saraiva, AM1; Reis, MA2 3; Tada, SF1; Pelloso, AC1; Toledo, MAS1; Aparício, R3; Souza, AP1 4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Instituto de Física “Gleb Wataghin” - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
3Instituto de Química - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
4Departamento de Biologia Vegetal – Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
E-mail: [email protected]
12-
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, SurE, nucleotidase, Small-angle X-ray scattering (SAXS), alosterismo
Os dados gerados pelo sequenciamento do genoma da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa 9a5c contribuíram
para um maior entendimento do intricado metabolismo deste microrganismo. Neste contexto, este trabalho visa
à caracterização da proteína SurE (stationary phase survival protein E) de Xylella (XfSurE) cuja função, embora
ainda não totalmente conhecida, seja provavelmente de uma nucleotidase. A saber, nucleotidases são enzimas
que participam no processo de desfosforilação de nucleosídeos, processo vital para o correto balanço dos mesmos
para a síntese de DNA e RNA. O estudos de XfSurE se basearam na sua expressão em E. coli, seguido de purificação
da enzima recombinante por cromatografia de afinidade ao níquel. A atividade de nucleotidase foi testada com
diversos substratos fosforilados, incluindo nucleosídeos mono e trifosfatados. Dentre estes, a enzima XfSurE
apresentou maior afinidade para nucleosídeos purínicos monofosforilados (3’-AMP > 5’-GMP > 5’-dAMP > 5’AMP). Ensaios de cinética utilizando estes quatro substratos mostraram que a enzima possui um comportamento
notadamente alostérico com coeficiente de Hill em torno de 2,6; indicando, portanto, uma cooperatividade positiva
(h>1). Adicionalmente, através da técnica de SAXS (Small-angle X-ray scattering) foi possível determinar que a
proteína possui organização tetramérica (confirmado também por cromatografia de gel filtração). Com base nesta
mesma técnica, foi possível modelar alguns envelopes desta proteína, sobre os quais foi possível observar e inferir
movimentos de torções de sua estrutura. Tais movimentos podem explicar as propriedades alostéricas de XfSurE,
por facilitar o acesso do substrato ao sítio catalítico, o que pode esclarecer a cooperatividade positiva da enzima.
A resolução da estrutura tridimensional desta proteína está em andamento e uma vez determinada, pode agregar
valiosos dados para o seu entendimento. Sob o ponto de vista funcional, especula-se que XfSurE também seja
inibida por altos níveis de ATP na célula, uma vez que a enzima não possui atividade para este substrato e, em E.
coli, a proteína EcSurE é inibida por ADP e ATP. Essa também pode estar envolvida na regulação e degradação da via
c-di-GMP (diguanilato cíclico), um mensageiro secundário, envolvido na sinalização celular em Xanthomonas sp.
nos processos de ataque e colonização da bactéria à planta. Em suma, este trabalho exibe a primeira caracterização
enzimático-estrutural de uma proteína SurE além de ser a primeira SurE de um fitopatógeno a ser caracterizada.
Através deste estudo, objetiva-se fornecer maiores subsídios para o entendimento do metabolismo desta bactéria,
responsável por numerosos prejuízos a diversas culturas agrícolas em todo o mundo.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Efeito da antibioticoterapia sobre a comunidade
bacteriana endofítica de microplantas de abacaxizeiro,
manjericão e pupunheira
Abreu-Tarazi, MF¹; Leone, GF¹; Almeida, CV²; Tsai, SM³; Almeida, M
¹Laboratório de Morfogênese e Biologia Reprodutiva de Plantas, ESALQ/USP.
2
In Vitro Palm Consultoria EDB Ltda. 3Laboratório de Biologia Celular e Molecular, CENA/USP.
[email protected]
Palavras-chave: in vitro, bactéria, endófitos, antibióticos, 16S rRNA.
A utilização biotecnológica e agrícola da microbiota endofítica já foi constatada em inúmeras culturas, porém raros
são os relatos sobre bactérias endofíticas de plantas micropropagadas, sem inoculação artificial. Essa carência de
estudos pode ser conseqüência da característica fastidiosa ou não cultivável, de grande parte dos endófitos, levando
à necessidade de aplicação de técnicas independentes de cultivo para seu estudo. Sabendo-se que as interações
simbióticas entre plantas e bactérias podem influenciar a morfogênese vegetal, o presente trabalho buscou
avaliar por meio de técnicas de biologia molecular, o efeito do uso de antibióticos sobre a comunidade endofítica
de bactérias de microplantas de abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel, manjericão
(Ocimum basilicum L.) e pupunheira (Bactris gasipaes Kunth-Arecaceae) e suas conseqüências na morfogênese
in vitro. Seguindo rigorosos critérios de assepsia, foram selecionadas oito microplantas assintomáticas de cada
espécie. As unidades experimentais foram tubos (50ml), contendo duas microplantas por espécie, inoculadas em
meio com metade da concentração de sais de MS livre de antibióticos, ou com solução estéril de antibióticos
(estreptomicina, ampicilina, tetraciclina e ciprofloxacina) na concentração de 200μg.ml-1. Foram realizadas quatro
repetições. Os tubos foram mantidos no escuro, sob rotação horizontal (150rpm), a 25 ±2°C, por 10 dias. Após esse
período, para cada tubo, uma microplanta foi utilizada para extração do DNA genômico total, e a outra mantida
em sala de crescimento para avaliação morfogenética por 30 dias. A partir do DNA extraído, foram realizadas
reações para amplificação (PCR) do fragmento do gene 16S rRNA de Bacteria com os primers fD1 e rD1. Em
seguida, foi realizada outra PCR, desta vez com o intuito de garantir a exclusão de 16S rRNA cloroplastidial com
os primers f799 e r1492. Os resultados revelaram que, independente da espécie estudada, os produtos de PCR
com os primers fD1 e rD1, para todas as microplantas (tratadas com antibióticos ou não), geraram fragmentos
de aproximadamente 1500pb, evidenciando a presença inicial de fragmentos do gene 16S rRNA. Por outro lado,
as reações de PCR com os primers f799 e r1492 resultaram em dois fragmentos distintos (entre 700 e 1100pb),
sendo que o fragmento menor, proveniente de bactérias, não foi detectado nas amostras de plantas submetidas
à antibioticoterapia, comprovando a ausência de DNA bacteriano após a atuação de antibióticos. Em relação à
morfogênese, todas as microplantas submetidas à antibioticoterapia apresentaram inicialmente estagnação do
crescimento, seguido de amarelecimento de folhas, ou oxidação de raízes e/ou parte aérea e conseqüentemente
morte das culturas. Conclui-se que o uso de antibióticos causa alteração na microbiota bacteriana endofítica,
evidenciada pela redução ou eliminação de fragmentos do gene 16S rRNA de bactérias em microplantas de
abacaxizeiro, manjericão e pupunheira, causando um desequilíbrio nas relações planta-microrganismo e levando
a alterações na morfogênese das culturas in vitro.
Apoio Financeiro: FAPESP e InVitroPalm.
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Perfis genéticos e toxigênicos de isolados brasileiros
de Bacillus cereus
Santos, CA1; Scarpassa, JA1; Leonel, LV2; Fazion, FAP1; Arantes, OMN1; Vilas-Bôas, GT1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina (UEL). 2Centro Universitário Filadélfia (UniFil), Londrina/PR.
[email protected]
1
Palavras-chave: Bacillus cereus, solo, toxi-infecções alimentares, fatores de virulência, RE-PCR.
Linhagens de Bacillus cereus são isoladas de uma variedade de ambientes, inclusive alimentos e solo. Esta espécie é
freqüentemente associada a eventos de doença transmitida por alimento (DTA), podendo causar vômito e diarréia.
Vinte três isolados brasileiros de B. cereus provenientes de alimentos envolvidos em surtos de síndrome diarréica,
14 isolados obtidos de alimentos não associados à intoxicação alimentar e 15 isolados provenientes de diferentes
amostras de solo foram caracterizados fenotípica e molecularmente. Empregando-se RE-PCR comparou-se o
grau de diversidade genética de seis locos codificantes para fatores de virulência, dentro e entre cada grupo de
isolados. Apesar de amplamente distribuídas, tanto a ocorrência quanto a diversidade genética média dos genes
codificantes para fatores de virulência analisados, foi maior no grupo de isolados associados a surtos de DTA (`H =
0,8158), demonstrando que linhagens de B. cereus potencialmente causadoras de surtos de intoxicação alimentar,
não apresentam um perfil genético específico, com a presença de um gene obrigatório ou de um determinado
alelo para um gene específico. Além disso, a análise de variância molecular (AMOVA) considerando todos os
locos analisados evidenciou que a porcentagem de variação genética dentro de cada grupo de isolados foi maior
(92,22%) que entre os grupos (7,78%) P <0,05. Estes resultados demonstram que o conjunto gênico de B. cereus é
a principal característica que permite a distribuição cosmopolita desta bactéria. Por outro lado, a expressão dos
genes codificantes para os fatores de virulência é um fator determinante mais do comportamento que da presença
desta bactéria no ambiente, como a habilidade da mesma provocar intoxicações alimentares.
Apoio Financeiro: Fundação Araucária, UEL, CAPES e CNPq.
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27
Expressão heteróloga e endereçamento protéico em
Lactococcus lactis da proteína hipotética Rv1419p
de Mycobacterium tuberculosis: desenvolvimento de
vacina alternativa contra a tuberculose experimental
Lima, FA1; Miyoshi, A1; Azevedo,V1
1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Instituto de Ciências Biológicas/UFMG
Palavras-chave: Expressão heteróloga, Mycobacterium tuberculosis, proteína hipotética, Lactococcus lactis, vacina.
A tuberculose, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis, é uma das doenças infecciosas mais graves no
mundo e, apesar da vacinação com Mycobacterium bovis (BCG), é responsável por milhões de mortes anuais.
Devido ao alto impacto na saúde pública acarretada pela tuberculose, a ausência de uma vacina preventiva eficaz
e o aumento de problemas terapêuticos decorrentes da resistência a fármacos, existe uma clara necessidade
de um melhor entendimento dos mecanismos da imunopatogênese da doença e desenvolvimento de novas
estratégias profiláticas. Neste contexto, esse trabalho propõe-se a construir linhagens de Lactococcus lactis
produtoras da proteína hipotética Rv1419p de M. tuberculosis H37Rv e avaliar o potencial biotecnológico e imunoterapêutico dessas linhagens na geração de respostas imunes eficazes contra a tuberculose. Para esse fim, a ORF
rv1419 foi obtida por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis H37Rv, clonada no vetor pCR - Blunt
II TOPO sendo essa construção posteriormente transformada em Escherichia coli DH5α. Posteriormente a
ORF foi subclonada nos vetores de expressão e endereçamento protéico pXylT:CYT e pXylT:SEC e os vetores
recombinantes transformados em L. lactis para a expressão e produção, citoplasmática ou secretada, da proteína.
Nossos resultados preliminares constituem o primeiro passo rumo a obtenção desta proteína recombinante, e
poderá contribuir para estudos imunológicos mais profundos e para o desenvolvimento de uma nova estratégia
contra a tuberculose experimental.
55º Congresso Brasileiro de Genética
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28
Sequenciamento parcial revela um possível novo
gene em Bacillus thuringiensis com provável dupla
especificidade
Gonçalves, JF1; Laia, ML2; Cordeiro, JX1; Figueiredo, CS1, Bergamasco, VB1; Lemos, MVF1
Departamento de Biologia Aplicada a Agropecuária, UNESP/FCAV.
Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC, Campus III, Lages, SC.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: proteína cristal; caminhamento cromossômico; códon
A bactéria gram-positiva Bacillus thuringiensis é um microrganismo encontrado no solo e tem sido utilizada no
controle biológico de pragas há várias décadas. Uma proteína, produzida durante a fase de esporulação, chamada
proteína cristal, atua sobre as pragas de maneira muito seletiva e eficiente, fato que evita a contaminação do meio
ambiente, de aplicadores, de leitos de rios e de nascentes, além de preservar os inimigos naturais. Por isso, essa
bactéria é, sem dúvidas, uma alternativa viável ao controle biológico de pragas na agricultura. Desse modo, vários
laboratórios em muitos países têm se empenhado na busca de novos isolados de B. thuringiensis e no estudo do
conteúdo de seus genes cry, responsáveis pela expressão das proteínas cristal. Assim, utilizando as técnicas PCRRFLP, biblioteca genômica, hibridação de colônias e caminhamento cromossômico, objetivou-se neste estudo
sequenciar um novo gene cry nesta espécie de bactéria. Após identificação de um fragmento de DNA, no isolado
BR64, similar a genes cry, passou-se a sequenciar o mesmo. Inicialmente, foi construída uma biblioteca genômica
parcial do isolado BR64. Por meio de hibridação de colônias, clones positivos para a sonda produzida a partir do
fragmento de DNA obtido do isolado BR64 foram selecionados e sequenciados. Essa metodologia não foi eficiente,
uma vez que uma alto grau de falsos positivos foram selecionados pela técnica de hibridação de colônias. Assim,
passou-se a utilizar caminhamento cromossômico a partir do contíguo obtido até então. Atualmente, 3.520 bases
do gene já foram sequenciadas. Além disso, já é possível saber onde se encontra a região de início do gene e é
possível estimar, por meio de bioinformática, que mais 500 bases, mais ou menos, serão suficientes para se atingir
o final do gene (códon de parada). Este provável gene demonstrou ser similar (e não idêntico) ao gene cry 032,
efetivo contra nematoides, e ao cry 1EA, efetivo contra lepidópteros Os resultados obtidos até o presente são muito
promissores e deverão ser úteis ao controle biológico de pragas na agricultura.
Apoio financeiro: FAPESP
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29
Clonagem e expressão em Escherichia coli do gene
cry1Ia de Bacillus thuringiensis com alta atividade
contra pragas das ordens Coleoptera e Lepidoptera
Bergamasco, VB1; Gonçalves, JF1; Polanczyk, RA2; Sena, JAD1; Lemos, MVF1
Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada – Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária – Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal - SP.
2
Centro de Ciências Agrárias – Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Alegre - ES.
[email protected]
1
Palavras-chave: gene cry, Spodoptera frugiperda, Anthomomus grandis, bioensaio e proteína Cry.
O controle de pragas da cultura algodoeira, como a lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)
e o bicudo-do-algodoeiro Anthonomus grandis (Coleoptera), pode ser feito utilizando proteínas Cry de Bacillus
thuringiensis. Esta é uma alternativa ao uso intensivo de inseticidas químicos, devido à resistência de pragas e à
crescente preocupação com a geração de resíduos químicos. As proteínas Cry ou delta-endotoxinas são codificadas
pelos genes cry, que podem ser isolados de B. thuringiensis e clonados em Escherichia coli ou modificados em
plantas. Com este propósito, o presente trabalho teve por objetivo o isolamento, a caracterização e a clonagem
do gene cry1Ia de uma linhagem brasileira de B. thuringiensis, assim como a expressão de sua proteína Cry1Ia
em E. coli e a avaliação da atividade inseticida desta proteína frente a larvas de S. frugiperda e A. grandis. O gene
cry1Ia (lepidóptero e coleóptero específico) foi inicialmente clonado em pGEM T-Easy, transformado em E. coli
DH5α e seqüenciado utilizando a estratégia “Gene Walking”. O gene completo foi isolado através de PCR com
oligonucleotídeos iniciadores desenhados a partir da seqüência de nucleotídeos obtida e posteriormente foi
clonado no vetor pET28a(+), introduzido em E. coli BL21(DE3) e expresso por indução com IPTG. A produção da
proteína foi confirmada pelas técnicas de SDS-PAGE e Western Blotting, demonstrando a eficiência do sistema
bacteriano de E. coli na expressão da proteína Cry1Ia, com peso molecular de aproximadamente 81 kDa. Esta
proteína foi, posteriormente, utilizada nos bioensaios quantitativos frente às larvas neonatas de S. frugiperda e A.
grandis, com CL50 de 0,002 μg/ml e de 5,23 μg/ml respectivamente. Estes resultados comprovam a alta toxicidade
desta nova proteína para ambas as espécies, sendo de grande interesse para a obtenção de plantas transgênicas de
algodão resistentes a estas pragas.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES.
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30
Messenger RNA detection by reverse transcription-PCR
of 16S rDNA, katf, inva, and rpf genes of Salmonella
enterica serovar enteritidis PT4 in viable but
nonculturable state
Mendes, RA1; Santos, MT1; Carmo, CP1; Araújo, EF1; Mantovani, HC1
Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa – MG.
[email protected]
1
Keywords: Salmonella enterica serovar Enteritidis, viable but nonculturable state, RT-PCR, 16S rDNA gene, invA gene
The foodborne pathogen Salmonella enterica serovar Enteritidis phagotype 4 is currently a major cause of
gastroenteritis in humans. The entry into dormant state named viable but nonculturable (VBNC) by this pathogen
is a survival strategy to respond to stress conditions in the food production chain. VBNC denotes a state in which
the cells cannot be detected by standard culture on enriched agar media, although remaining viable and capable
of resuscitation under favorable conditions. Recently, the resuscitation promoting factor gene, rpf of Salmonella
Typhimurium has been cloned in S. Oranienburg and the recombinant protein Rpf was able to induce the
resuscitation of cells of S. Oranienburg VBNC state. In the absence of growth, various viability assays have been
successfully employed to detect the presence of VBNC cells, such as direct viable count; fluorescence microcopy
using various dyes; and more recently molecular genetic methods, e.g., PCR. This work investigated the maintenance
of viability and potential virulence of Salmonella Enteritidis PT4 in VBNC state by reverse transcription-PCR.
Messenger RNA of housekeeping genes, 16S rDNA and one of the stationary-phase-induced genes, katF as well
as virulence gene, invA, and resuscitation promoting factor gene, rpf were investigated on RNA extracted from
exponentially growing and VBNC cells. VBNC cells were obtained in Butterfield Phosphate Solution (BPS) added
of 1.2 mol/L NaCl after incubation at 4°C for 67 days. The quantity of total RNA extracted from log cells (60 µg/109
cells) was 60 times higher than VBNC cells (3.6 µg/1010 cells). This quantitative difference of RNA confirms the
drastic reduction of metabolic activity in VBNC state. The 16S rDNA, katF, invA and rpf genes were transcripted
in cells at the logarithmic phase. The 16S rDNA gene was detected in the VBNC cells whereas no detection of the
katF, invA and rpf genes was observed in the VBNC populations. These data suggest that the pathogenic strain
S. Enteritidis PT4 in VBNC state do not maintain the expression of the virulence gene, invA. The 16S rDNA gene
proved to be a good viability marker for S. Enteritidis PT4 in VBNC state.
Financial support: FAPEMIG
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Isolamento de linhagens de bactérias da biodiversidade
do solo do cerrado secretoras de amilase e aplicação
dessa em processos biotecnologicos
Passini, MRZ¹; Sá, FVJ¹; Guerra, OG¹
¹Laboratório de Genética Molecular e de Microrganismos/Biotecnologia - Departamento de Ciências Naturais. Campus de Três Lagoas UFMS
[email protected]
Palavras-chave: secreção de enzimas amilolíticas, halos de amilolise, linhagens de bactéria, biodiversidade do Cerrado; biotecnologia
Esse estudo teve o intuito de isolar linhagens de bactérias amilolíticas da biodiversidade do solo do Cerrado,
com objetivo final de contribuir com a obtenção de novas amostras com melhor potencial industrial. Nos
últimos anos, com os grandes avanços tecnológicos, novas pesquisas para a identificação de microrganismo
têm sido estimuladas, com a intenção de descobrir mais sobre os mesmos, pois a utilização desses em processos
biotecnologicos tem preferência, devido às facilidades operacionais e econômicas, comparando com animais e
vegetais. Desde microrganismos até animais mais derivados como o homem é encontrada a amilase, essa proteína
degrada o amido que é um polissacarídeo produzido em plantas. As enzimas amilolíticas ocupam o segundo lugar
na produção mundial de enzimas, ficando atrás apenas das proteases. Portanto, são de grande importância na
biotecnologia atual com aplicações nas indústrias têxteis, papel e celulose, de couro, detergentes, bebidas destiladas
e panificação, além dessas áreas outras vêm sendo atendidas como, por exemplo, farmacêutica, médica e químicoanalítica. Para o isolamento das linhagens de bactérias com atividade amilolítica, foi coletado em cinco pontos
diferentes 250g de solo no município de Três Lagoas/MS. As amostras foram cultivadas em meio M9 acrescido de
uma única fonte de carbono, o amido que se encontrava a uma concentração final no volume de meio de 0,5%. As
cinco amostras foram incubadas separadamente, 10g das amostras foi colocado em 100ml de meio M9 líquido, onde
permaneceu por 48h. Após a incubação, retirou-se 500µl do sobrenadante e esse foi semeado em 100ml de meio
M9 liquido e permaneceu incubado por 120h. Ao término desse período, as amostra foram diluídas para encontrar
na Câmara de Neubauer aproximadamente 300 Unidades Formadoras de Colônia (UFC). Utilizou a diluição 10-4
para todas as amostras, e estas foram plaqueadas em meio M9 sólido. Da amostra um semeou 100µl, amostra dois
semeou 160µl, amostra três semeou 200µl, amostra quatro semeou 100µl e amostra cinco semeou 180µl. Em todas
essas esperava-se encontrar 270UFC. Entretanto foi encontrado na amostra um 220UFC, na dois 192UFC, na três
300UFC, na quatro 337UFC e na cinco 353UFC. Após o crescimento as placas foram abertas e emborcadas sobre
outra contendo cristais de iodo sublimado. As linhagens de bactérias que promoverem a degradação do amido
geraram um halo incolor ao redor das colônias, sendo que o meio de amido não degradado encontrava-se azul
violeta. Neste estudo possibilitou concluir que existem linhagens de bactérias na biodiversidade do Cerrado que
produzem algum tipo de enzima amilolítica e que puderam ser expressas e excretadas in vitro. Todas as amostras
apresentaram atividade enzimática, exibindo possível potencial biotecnológico.
Apoio Financeiro: UFMS e CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Uso do PCR tempo real para o exame e quantificação
de cepa específica de Helicobacter pylori
Oliveira, EG1; Mafra, FFP1; Oliveira, MV2; Bassani, RA3; Mascara, D¹*
Laboratório de Genética Aplicada a Hospedeiros e Simbiontes – Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes
(UMC);
2
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes (UMC)
3
Hospital das Clínicas Luzia de Pinho Melo, Mogi das Cruzes.
[email protected]
1
Palavras-chave: Cepa m1; PCR tempo-real; marcador molecular; vacA; Helicobacter pylori
Helicobacter pylori é um bacilo, multiflagelado, gram-negativo cujo habitat natural é o epitélio gástrico humano.
Entretanto, a presença da H. pylori pode estar associada a patologias gastrointestinais. Sua patogenicidade devese a diversos fatores, incluindo a diversidade genotípica das cepas infectantes. Combinações entre alelos no loco
vacA estão relacionadas com as formas mais agressivas de H. pylori. O loco vacA contém duas regiões variáveis: a
região “s” e a região “m” (variantes m1 e m2). As linhagens m1+ são indicadas como mais patogênicas. A utilização
de PCR para a detecção da H.pylori constitui uma importante e sensível ferramenta diagnóstica, todavia falsos
negativos podem ocorrer devido ao polimorfismo genômico do microorganismo. A aplicação do PCR quantitativo
(tempo-real ou qPCR) tem sido descrito como método para a análise populacional deste e outros patógenos. O
objetivo do presente estudo foi desenvolver metodologia para estimar a densidade de populações m1 de H.pylori
em biópsias humanas através de marcadores específicos. Efetuamos a extração do DNA genômico em sistema
fenol-clorofórmio a partir de biopsias gástricas coletadas no setor de endoscopia do Hospital das Clínicas Luzia
de Pinho Melo (HCLPM). O DNA foi amplificado através de primers específicos para o gene m1 de H. pylori. Após
a amplificação, amostras m1 positivas foram submetidas à determinação da concentração de DNA, seguidas de
diluições seriadas das amostras para a realização do qPCR conforme protocolo do fabricante (Invitrogen). Este
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (UMC/HCLPM) e registrado junto ao CONEP, sob nº.
0120.0.237.000-07. Todas as amostras coletadas foram obtidas somente após a concordância e assinatura pelos
pacientes do termo de esclarecimento. Primers desenhados para o gene selecionado (vacA/m1) foi utilizado em
uma curva de eficiência de amplificação com SYBR Green (Invitrogen), o que resultou em níveis de eficiência
próximos a 100% entre 25 e 200ng de DNA inicial. A dissociação realizada após as amplificações indicou que o
primer foi específico, não havendo amplificações inespecíficas. Propomos a correlação entre a massa de biópsia
analisada e o DNA amplificado de modo a possibilitar a quantificação relativa da população de H. pylori. As análises
foram realizadas com a finalidade de verificar a densidade das populações do microorganismo na mucosa gástrica
em pacientes portadores de quadro distintos de afecções.
Apoio Financeiro: CNPq/UMC-FAEP; FAPESP
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Avaliação da patogenicidade das cepas m1 e
m2 de Helicobacter pylori (e-Proteobacteria;
Helicobacteraceae) baseado na presença da inserção
s1 e do gene caga
Mafra, FFP1; Oliveira, EG1; Tersariol, ILS²; Bassani, RA³; Mascara, D¹*
Laboratório de Genética Aplicada a Hospedeiros e Simbiontes – Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes
(UMC);
2
Centro de Investigação Bioquímica, Universidade de Mogi das Cruzes (UMC);
³Hospital das Clínicas Luzia de Pinho Melo, Mogi das Cruzes.
[email protected]
1
Palavras-chave: Helicobacter pylori; Cepa m1; Cepa m2; vacA; cagA
Helicobacter pylori é um bacilo gram-negativo, multiflagelado responsável pela ocorrência de diversas afecções
no trato gástrico de seres humanos. Este patógeno infecta cerca de 50% da população mundial, entretanto, 15%
desta população não manifesta sintomas clínicos. Tem sido relatado que o nível de patogenicidade da H.pylori está
diretamente relacionado a variantes alélicas s (s1 ou s2) e m (m1 ou m2) do gene vacA (citotoxina vacuolizante) e da
presença do gene cagA (citotoxina associada ao gene A). Estudos indicam que a cepa s1+m1 cagA positivo apresenta
maior grau de morbidade, entretanto, esta correlação ainda não encontra-se totalmente elucidada. Desta forma o
objetivo do presente estudo é avaliar o potencial patológico das cepas m1 e m2 em relação a inserção s1 do gene
vacA e a presença do gene cagA. Efetuamos a coleta de 64 amostras de biópsias gástricas no setor de Endoscopia
do Hospital Luzia de Pinho Melo as quais foram submetidas a extração do DNA genômico através da técnica
fenol-cloroformio. O DNA extraído foi amplificado por PCR utilizando primers específicos para o gene Urease C
usado como marcador da presença do microorganismo, vacA (s1a, s1b, m1 e m2) e cagA e a seguir identificados os
alelos por eletroforese em gel de agarose a 2% de acordo com o peso molecular do produto amplificado. O presente
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (UMC/HCLPM) e registrado junto ao CONEP, sob nº.
0120.0.237.000-07. Todas as amostras somente foram coletadas após a concordância e assinatura pelos pacientes
do termo de esclarecimento. Das amostras analisadas, 78,1% foram positivas para o gene Urease indicando alta
prevalência do microorganismo na população estudada. A infecção pelas cepas m1 e m2 foram respectivamente
46% e 48%. 80% dos indivíduos com úlcera apresentaram infecção pela cepa m2 e 20% apresentaram infecção
pela cepa m1. De maneira análoga, indivíduos com cepas s1+m2+cagA positivo apresentaram maior incidência
de úlcera e gastrite do que indivíduos com cepas s1+m1 cagA positivo (P > 0,05). Indivíduos com pangastrite
apresentaram valores iguais na taxa de infecção por cepas s1+m1 cagA positivo e s1+m2 cagA positivo (11,8%).
Através da utilização de marcadores moleculares foi possível verificar como conclusão que indivíduos infectados
com a cepa m2 apresentam patologias mais severas do que aquelas infectadas pela cepa m1, indicando uma
possível correlação do grau de morbidade com uma cepa específica. Esta conclusão também contesta dados da
literatura que indicam que a cepa m1 apresenta maior grau de morbidade em relação a cepa m2.
Apoio Financeiro: UMC-FAEP; FAPESP
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Influência da clonagem e expressão em Xanthomonas
do gene sacB de Zymomonas mobilis na síntese de
exopolissacarídeo
Padilha, F1,2; Maia-Araujo, YLF2,3; Rosato, YB1; Pereira, S2,3; Fricks, AT2,3; Scamparini, ARP¹;
Departamento de Ciência de Alimentos, UNICAMP, Campinas, SP.
Laboratório de Biomateriais - Instituto de Tecnologia e Pesquisa – Aracaju, SE. 3Universidade Tiradentes- Programa de Pós-Graduação
em Saúde e Ambiente e Programa de Doutorado RENORBIO – Aracaju, SE.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: levana, Zymomonas mobilis, recombinante, Xanthomonas, produção
A produção de exopolissacarídeos bacterianos é um processo complexo que envolve diversos compostos
como açúcares nucleotídeos, açúcares específicos, enzimas tipo glicosil transferase, modificações enzimáticas,
polimerases, proteínas associadas à membrana e cofatores. A complexidade do processo e nossa relativa
ignorância dos eventos moleculares que estão envolvidos fazem com que haja dificuldade na manipulação da
produção de exopolissacarídeo bacteriano, na alteração das condições de cultura ou na mudança da estrutura
destes polissacarídeos. Neste trabalho o objetivo foi transferir e expressar o gene sacB de Zymomonas mobilis para
a bactéria do gênero Xanthomonas, e caracterizar o polímero produzido pela linhagem recombinante, verificando
a influência da adição deste gene na produção de goma. O gene sacB foi amplificado e extraído para posterior
eletroporação. A bactéria foi eletrotransformada usando-se um plasmídio com o gene da levanasacarase (SacB).
Os clones obtidos a partir da eletrotransformação foram utilizados na produção de exopolissacarídeo (EPS). Para
a fermentação foram utilizados os meios YM e RS para crescimento celular e os meios RS com alta concentração
de sacarose e I+II para produção de EPS. A incubação foi feita a 28ºC, 200 rpm, pH 7.0. O caldo fermentado foi
centrifugado e o sobrenadante precipitado com etanol (1:3, v/v). O EPS precipitado foi secado, dializado e pesado
para cálculo da produtividade e posterior análises de cromatografia e viscosidade aparente. Os resultados obtidos
nos experimentos mostram que dos nove clones obtidos somente três apresentaram na composição química de
seu EPS a presença de frutose, característica do polímero de levana, tendo também um acréscimo na viscosidade
aparente quando comparado à linhagem não transformada.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Avaliação da eficácia de protocolos para extração de
DNA bacteriano de solo de Manguezal
Silva, SA1; Kudaka, LS1; Vagenas, DNF2
Graduadas em biologia pela Universidade São Judas Tadeu - USJT;
Professora de Engenharia Genética da Universidade São Judas Tadeu – USJT.
1
2
Palavras-chave: Manguezal, extração de DNA, solo, arquebactérias, archaea.
Os manguezais são considerados como ecossistemas especializados, tanto por causa da sua localização (estuários,
locais onde os rios encontram-se com o mar) quanto por causa de sua diversidade. Mesmo esta sendo pequena,
é a interação das características biológicas destas espécies e as forças ambientais que operam nesse sistema que
se pode determinar a organização do manguezal além da geomorfologia e os processos que moldam a paisagem
caracterizando sua arquitetura diferenciada. A conservação e o uso da diversidade biológica com finalidades
econômicas ou sociais constituem um desafio, assim como existe uma potencialidade muito grande para a
exploração de plantas e animais, maior ainda é a u do uso de utilização. Infelizmente, quando se menciona a
ecologia e a manutenção das espécies raramente os microrganismos são lembrados. O grupo das arquebactérias
(Clostridium sp; Desulfovibrios sp; Desulfobacter sp; Desulfuromonas sp; Desulfococcus sp) são semelhantes
às bactérias em muitos aspectos da estrutura celular, o que o destaca é a sua parede celular não apresentar
peptideoglicano, mas por um análogo (pseudopeptideoglicano), ou podendo ser compostas por polissacarídeos,
proteínas ou glicoproteínas. Uma característica marcante de Archaea é a capacidade de habitar ambientes em
condições extremas de temperatura, salinidade e pressão, incluem também espécies aeróbias e com tolerancia
a pH variavel. O solo possui uma população de microrganismos que pode ser analisada através de métodos
moleculares, pela extração de DNA diretamente de amostras de solo e de sedimentos. Existem poucos protocolos
para extração de DNA de microrganismos, sendo que a maioria destina-se a Escherichia coli. Pensando nisso, o
ensaio de protocolos e alterações daqueles já existentes pode colaborar para uma maior variedade de recursos
utilizáveis nesses trabalhos e até melhorar os resultados já obtidos. Seria possível a realização de extração de DNA
de organismos distintos partindo de um único protocolo? Se o protocolo a ser avaliado apresenta-se eficiência
para a extração de Escherichia coli, então é possível realizar a extração de outros microrganismos com a mesma
eficácia. O presente estudo tem objetivo avaliar a eficácia de protocolos modificados para melhor extração de
DNA de microrganismos isolados em solos de manguezais. Os protocolos analisados foram MARMUR, 1961 e
Kit comercial. Acrescentando SDS (dodecil sulfato de sódio), ao protocolo original do Marmur, observamos uma
quantidade significativa e qualitativa de DNA de todos os microrganismos isolados de solo de manguezal.
Apoio Financeiro: UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU - USJT
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Proteases extracelulares em aeromonas e atividade
sobre diferentes substratos
Zacaria, J; Costa, SOP; Delamare, APL; Echeverrigaray, S
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul.
[email protected]
Palavras-chave: Aeromonas, Proteases, zimograma, variabilidade, especificidade por substrato.
O gênero Aeromonas é constituído por bactérias Gram-negativas pertencentes à família Aeromonadaceae. Estas
bactérias são encontradas em ambientes aquáticos de todo o mundo, incluindo águas cloradas e poluídas. São
patógenos oportunistas tanto de animais de sangue quente quanto animais de sangue frio. Bactérias deste gênero
produzem uma série de fatores de virulência destacando-se toxinas extracelulares e enzimas, entre elas as proteases.
Proteases extracelulares desempenham um importante papel na invasão e no estabelecimento desta bactéria
em infecções, atuando sobre as defesas primarias do hospedeiro. Com o objetivo de estudar a diversidade de
proteases extracelulares em Aeromonas, este trabalho avaliou o perfil proteolítico de extratos brutos de 17 espécies
de Aeromonas, mediante eletroforese em géis de poliacrilamida, utilizando gelatina e caseína como substratos.
Além disto, bactérias representando as espécies A. hydrophila, A. caviae, A. trota, A. media, A. sobria e A. veronii
var. sobria, selecionadas com base em resultados obtidos, foram avaliadas quanto a capacidade de degradação
de distintos substratos: gelatina, caseína, ovoalbumina fração V, soroalbulmina bovina fração V, gamaglobulina,
fibrinogênio, elastina e colágeno. Todas as bactérias empregadas neste estudo foram classificadas através de
métodos bioquímicos e confirmadas mediante RFLP-PCR do gene 16sRNA. Os resultados obtidos mostraram
grande variedade de proteases extracelulares em Aeromonas. Empregando gelatina como substrato, 17 diferentes
bandas com pesos moleculares variando entre 94KDa a 22KDa foram identificadas. Quando empregada caseína
como substrato, 8 diferentes bandas com pesos moleculares variando entre 63KDa a 22KDa foram identificadas. A
avaliação de inibidores enzimáticos permitiu a caracterização de uma serino protease de 63KDa e de pelo menos
quatro metaloproteases com pesos moleculares de 94KDa, 83KDa, 65KDa e 49KDa. No que se refere à avaliação
da atividade proteolítica sobre diferentes substratos, todas as espécies selecionadas apresentaram algum grau de
atividade sobre gelatina, caseína, fibrinogênio, elastina e colágeno. A. hydrophila e A. sobria apresentaram relevante
atividade sobre ovoalbumina fração V, soroalbulmina bovina fração V, gamaglobulina e fibrinogênio, com bandas
correspondentes a 63KDa e 22KDa. A. veronii var. sobria apresentou pequena atividade sobre ovoalbumina fração
V com uma banda de 49KDa. Os dados confirmam a presença de diversas proteases extracelulares em Aeromonas,
conforme evidenciado pela análise dos genomas de A. hydrophila e A. salmonicida, assim como ampla variação
nos perfis de proteases entre espécies e linhagens deste gênero. Além disto, os resultados confirmam o potencial
de algumas proteases extracelulares destas bactérias como fatores de patogenicidade dada a sua capacidade de
hidrolise de distintas proteínas como elastina, globulina, fibrinogênio e colágeno.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES.
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Susceptibilidade antibacteriana e detecção do gene
mecA de Staphylococcus aureus provenientes
das mãos de dentistas durante procedimentos
odontológicos
Pereira, RFR1,2; Bassi, RC1; Lopes, JRG1; Silva, JJ1; Pinto, LHF1; Fiorini, JE3; Barros, LM4; Boriollo, MFG1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
Universidade Federal de Alfenas, Faculdade de Ciências Biológicas – FCB/UNIFAL, Alfenas, MG, Brasil.
[email protected]
3
Laboratório de Biologia e Fisiologia de Microrganismos, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
4
Faculdade de Odontologia de Alfenas, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
1
2
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, susceptibilidade antibacteriana, gene mecA, procedimentos odontológicos.
A espécie Staphylococcus aureus tem sido considerada um dos principais patógenos oportunistas para humanos,
sendo encontrada como agente primário de certos processos supurativos (osteomielite, foliculite, terçol, síndrome
da pele escaldada e infecções urinárias) ou atuar apenas como agente de infecção secundária. Infecções durante
procedimentos clínicos e cirúrgicos causados por esta bactéria constituem um problema relevante, considerando
sua possível resistência aos principais antibióticos empregados na prática médica. Portanto, se faz necessário a
utilização de metodologias profiláticas adequadas em locais propensos a essas infecções, tais como ambientes
hospitalares e odontológicos. A presente pesquisa investigou a existência de Staphylococcus spp. e S. aureus nas
mãos de dentistas antes e após os procedimentos odontológicos, a susceptibilidade antibacteriana e a presença
do gene mecA de S. aureus. Amostras de swab provenientes de ambas as mãos de estudantes, da Faculdade de
Odontologia de Alfenas – UNIFENAS, antes e logo após a assepsia e, posteriormente, após os procedimentos
odontológicos (± 2h30min), foram inoculadas em Agar Manitol Salgado e mantidas a 37oC por 48 horas. Colônias
indicativas de fermentação do manitol por staphylococci patogênicos (i.e., presença de halo amarelo em torno das
colônias) foram subcultivadas em caldo BHI (Brain Heart Broth) a 37ºC por 24 horas. As espécies de S. aureus foram
identificadas pelo teste de aglutinação (Staphy Test), coloração de Gram, teste de coagulase e DNAse. Espécies de
S. aureus identificadas foram introduzidas em meio MHA suplementado com NaCl 4% e oxacilina (6mg/mL) a fim
de detectar a presença do gene mecA e o teste de susceptibilidade foi realizado pelo método de difusão em discos.
Um total de 14 profissionais (73,7%) apresentaram Staphylococcus spp. e S. aureus em ambas as mãos ou em apenas
uma delas, antes da primeira lavagem, após a primeira lavagem, ou nas mãos ou nas luvas após atendimento
aos pacientes (±2h30min) (3,9 ± 5,6 UFC/cm2). Resistência antimicrobiana foi observada 87,1% dos isolados de
S. aureus: AMP (53,0%), AMO (55,3%), OXA (12,9%), TET (11,4%), VAN (2,3%), CFE (7,6%), CFL (7,6%), CFO (8,3%),
CLIN (6,8%) e ERI (44,7%). Multi-resistentes foram observados em 41,7% dos isolados, contudo apenas 1 isolado
(0,7%) foi caracterizado como portador do gene mecA. Sugere-se a implantação de medidas mais eficazes para a
redução ou eliminação e monitoramento periódico de S. aureus multi-resistentes em profissionais dentistas a fim
de prevenir a sua transmissão e propagação em ambientes odontológicos e pacientes.
Apoio financeiro: FAPEMIG e Lab. Genética e Biologia Molecular – UNIFENAS
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Monitoramento prospectivo de Staphylococcus aureus
em ambientes aéreos odontológicos e detecção do
gene mecA por método microbiológico
Silva, JJ1,2; Pereira, RFR1,3; Bassi, RC1; Souza, STS1; Fiorini, JE4; Barros, LM5; Boriollo MFG1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
Faculdade de Ciências Biomédicas, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
3
Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL, Alfenas, MG, Brasil.
4
Laboratório de Biologia e Fisiologia de Microrganismos, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
5
Faculdade de Odontologia de Alfenas, Universidade de Alfenas - UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil.
1
2
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, gene mecA, clínica odontológica, ambiente aéreo, monitoramento.
Staphylococcus aureus tem sido responsável por parte das infecções relacionadas com ambientes clínicos
odontológicos e hospitalares. Um estudo prospectivo foi realizado nas Clínicas Odontológicas da Faculdade de
Odontologia, da UNIFENAS, do município de Alfenas, estado de Minas Gerais, durante um período de 6 meses.
Espécimes provenientes do ambiente aéreo foram coletados por meio de placas de Petri (90mm´15mm), contendo
Agar Manitol Salgado (Mannitol Salt Phenol-red Agar), abertas por 2 horas, em 2 turnos de trabalho, e a partir
de 2 horas após o inicio de cada turno. Essas placas permaneceram dispostas em 134 locais, duas vezes ao mês,
respeitando um intervalo de 15 dias (± 2 dias) entre uma coleta e outra, de Julho a Dezembro de 2008, totalizando
2948 coletas. Logo após a coleta, essas placas foram conduzidas ao Laboratório de Genética – UNIFENAS, onde
permaneceram incubadas a 37oC por 48h. Colônias indicativas de fermentação do manitol por staphylococci
patogênicos (i.e., presença de halo amarelo em torno das colônias) foram subcultivadas em caldo BHI (Brain
Heart Broth) a 37ºC por 24h. As espécies de S. aureus foram identificadas pelo teste de aglutinação (Staphy Test),
coloração de Gram, teste de coagulase (gold standard) (Coagu-Plasma) e DNAse. Discos de oxacilina e cefoxitina
foram empregados para a detecção de ORSA/MRSA (Oxacillin-Resistant Staphylococcus aureus/MethicillinResistant Staphylococcus aureus). Isolados de S. aureus foram cultivados em 5mL de caldo BHI a 37oC por 2 a 8h. Um
inóculo ajustado na escala 0,5 de MacFarland (1.5´108 CFU.mL-1) foi introduzido em meio MHA (Mueller Hinton
Agar), suplementado com NaCl 0,4% (m/v). Discos contendo oxacilina 1mg e cefoxitina 30mg foram aplicados nas
placas, as quais foram incubadas a 37oC por 24h. A interpretação para a resistência ou sensibilidade à oxacilina
e cefoxitina foi realizada conforme os critérios adotados pela NCCLS. Para a detecção do gene mecA, os isolados
de S. aureus foram cultivados em 5mL de caldo BHI a 37oC por 2 a 8h. Um inóculo direto, ajustado na escala 0,5
de MacFarland (1.5´108 CFU.mL-1), foi introduzido em meio MHA, suplementado com NaCl 4% (m/v) e 6mg/mL
de oxacilina, e incubado a 33-35oC por 24h. A presença de crescimento nesse meio foi indicativo da presença do
gene mecA. Um total de 14,1% das colônias (n = 3083) sugestivas de Staphylococci patogênicos foi identificado na
maioria desses ambientes. Destas, 66,5% foram identificadas como S. aureus, sendo 7,6% portadores do gene mecA.
Tais resultados apontam para a necessidade da implantação de barreiras de contenção eficientes nos diferentes
ambientes clínicos odontológicos a fim de prevenir a propagação de ORSA/MRSA, bem como medidas de redução
ou eliminação desses patógenos potencialmente virulentos a fim de prevenir possíveis processos infecciosos.
Apoio financeiro: FAPEMIG (processo no. APQ-3897-4.03/07).
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Análise comparativa de colagenases de origem
microbiana
de Guzzi, CA; Riboldi, MB; Soares, M; Bueno, RCO; Fardelone, LC; Alegria, MC, Thiemann, JE; AstolfiFilho, S*
Divisão de Biotecnologia - Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda.
*Centro de Apoio Multidisciplinar – Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
Palavras-chave: Clostridium, colagenase, gelatinase, análise filogenética e bioinformática.
As colagenases comerciais são muito utilizadas no debridamento de lesões superficiais, ulcerações (úlcera varicosa,
úlcera por decúbito, gangrenas das extremidades e gangrenas diabéticas) e em lesões de difícil cura. O uso de
colagenases microbianas no tratamento de feridas auxilia na remoção do tecido necrosado, atuando diretamente
sobre o colágeno local, permitindo que o processo de cicatrização seja acelerado através do aumento da atividade
de migração dos macrófagos, precursores de monócitos, fibroblastos e queratinócitos, além de potencializar a
cicatrização devido à nova síntese e remodelagem do colágeno. Processos fermentativos de Clostridium histolyticum
são a principal fonte para a obtenção de colagenases com fins comerciais. Análises dos componentes extracelulares
destes fermentados mostram a presença de colagenases e gelatinases ( fruto da degradação C-terminal das
colagenases), além de diversas outras proteases, peptídeos, carboidratos, lipídios, pigmentos e compostos fenólicos.
As colagenases e gelatinases são capazes de degradar colágeno nativo (apenas as colagenases) e/ou desnaturado
(colagenases e gelatinases). Estruturalmente, a maioria das colagenases é composta pelos domínios S1, S2 e S3.
Enquanto o domínio S1 contém a região catalítica e S2 tem função estrutural, o domínio S3 é responsável pela
ligação ao colágeno nativo. Desta forma, apenas as proteínas que apresentam o domínio S3 completo são capazes
de degradar a complexa estrutura do colágeno. As demais, com domínios S3 parciais ou ausentes, são incapazes
de ligar-se e degradar o colágeno nativo, mas mantém a propriedade de atuar sobre colágenos parcialmente
enovelados ou desnaturados (gelatinas). O principal objetivo deste trabalho foi mapear, utilizando ferramentas
de bioinformática, colagenases e gelatinases de diversas espécies microbianas incluindo Clostridium botulinum,
C. sporogenes, C. tetani, C. histolyticum, C. bifermentans, C. septicum, C. perfrigens, C. limosum, C. sordellii e C. novyi,
cujas colagenases apresentam similaridade entre si. A partir de sequências públicas disponíveis no NCBI (National
Center for Biotechnology Information), foram selecionadas proteínas identificadas como colagenases e gelatinases,
além de proteínas desconhecidas que apresentam domínios similares à colagenases e gelatinases caracterizadas.
Análises filogenéticas, aliada a estudos de similaridade e composição dos domínios S1, S2 e S3, permitiram agrupar
as sequências que apresentam maior proximidade estrutural. Através deste mapeamento in silico é possível prever
princípios de estrutura/função envolvendo estabilidade, substratos e inibidores.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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40
Utilização da técnica de RAPD - Randon Amplified
Polymorphic DNA - na tentativa de se obter novos
genes do fitoplasma associado aos sintomas do
Huanglongbing do citros
Augusto, MLV1,2; da Silva, ACB1,2; Martins, EC1; Ayres, AJ1; Teixeira, DC1
FUNDECITRUS - Fundo de Defesa da Citricultura - Araraquara, São Paulo, Brasil
Centro Universitário De Araraquara - Uniara
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Huanglonbing, citros, fitoplasma, RAPD.
Huanglongbing (HLB) é uma doença destrutiva dos citros, e representa uma grande ameaça para a indústria citrícola
do mundo. Atualmente, três espécies de Ca. Liberibacter estão associadas com o HLB dos citros, Candidatus
(Ca.) Liberibacter (L.) asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus. Ca.
Liberibacter é uma bactéria Gram negativa, restrita aos vasos do floema, não cultivável, pertencente à subdivisão
alfa do grupo das proteobactérias. Em 2007, foi descoberto que além das liberibacters, um fitoplasma estava
associado aos sintomas do HLB ( fitoplasma-HLB). O mesmo foi caracterizado através da análise do DNA
ribosomal 16S (DNAr 16S) obtido por amplificação com primers universais que amplificam DNAr 16S bacteriano.
A sequencia apresentou 99% de identidade com o Pigeon Pea Witches’ broom Phytoplasma pertencente ao grupo
IX 16Sr na classificação dos fitoplasmas. Ao contrário das liberibacters já bem caracterizadas a nível molecular, do
fitoplasma-HLB somente a sequencia do DNAr 16S-23S é conhecida. Assim, para uma melhor caracterização desse
fitoplasma foi iniciado um trabalho na tentativa de se identificar novas regiões gênicas através da técnica de RAPD
(Randon Amplified Polymorphic DNA). A técnica foi utilizada pelo emprego de primers de sequencias aleatórias,
ou primers definidos a partir de regiões gênicas conhecidas de outros fitoplasmas. DNA genômico foi obtido a
partir de folhas de plantas infectadas pelo fitoplasma-HLB e de plantas sadias. Das reações de RAPD feitas, os
fragmentos específicos amplificados foram purificados do gel e utilizados para clonagem em vetor plasmidial.
As análises dos clones foram feitas pelo uso de enzimas de restrição, e aqueles que apresentaram o inserto de
tamanho correspondente aos fragmentos clonados foram seqüenciados. As seqüências obtidas foram analisadas
utilizando-se o programa BLAST, na busca de homologias com seqüência de genes conhecidos.
Apoio Financeiro: FUNDECITRUS
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41
Utilização de DOT BLOT para avaliar o efeito de
diferentes fontes de carbono no perfil de expressão
gênica em Gluconacetobacter diazotrophicus
Galisa, PS1; Alves, GC2,; Ferreira, VL3; Vidal, MS4; Baldani, JI4; Simões-Araujo, JL4
Doutorando em Agronomia - UFRRJ/Embrapa Agrobiologia;
Doutoranda em Agronomia - UFRRJ/Embrapa Agrobiologia;
3
Graduanda em Agronomia - UFRRJ/Embrapa Agrobiologia;
4
Embrapa Agrobiologia – CNPAB.
[email protected].
1
2
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, Expressão gênica, Endofíticos.
Gluconacetobacter diazotrophicus é das bactérias responsável pela fixação biológica do nitrogênio (N2). Essa
bactéria tem seu habitat endofítico (não patogênico) em diversas culturas de grande importância agrícola, como
a cana-de-açúcar, o café, a banana e a batata doce. Neste trabalho foi investigado o perfil de expressão gênica de
G. diazotrophicus (estirpe PAL5) com o objetivo de identificar genes cuja padrão de expressão esteja relacionada
com a utilização de diferentes fontes de carbono. Fragmentos Derivados de Transcritos (FDTs), obtidos por cDNAAFLP utilizando 2 combinações de enzimas de restrição (HindIII/TaqI e PstI/TaqI), foram amplificados por PCR,
imobilizados em membrana de náilon e utilizados para hibridização com cDNA obtidos de G. diazotrophicus
cultivada em diferentes coondições. Para a síntese do cDNA marcado com 32P foram utilizados 20 μg de RNA total
extraído da bactérias cultivadas em meio LGI com diferentes fontes de carbono (glicose, manitol e glicerol). Os
cDNAs foram sintetizados através da reação de transcriptase reversa utilizando o kit “SuperScriptTm First-Strand
Synthesis System for RT-PCR” (Invitrogen Life Technologies), iniciadores randômicos e 5 μl de 32PdCTP (10 mCi/ml).
Para cada tratamento foram utilizadas 3 membranas contendo 173 FDTs, sendo que 88 FDTs mostraram sinais
de hibridização, indicando indução do gene correspondente. Após o sequenciamento dos FDTs as seqüências
analisada apresentando similaridades com os genes envolvidos em diferentes processos metabólicos. Dentre
os genes diferencialmente expressos foi observado homologia com reguladores transcricionais da família LysR,
proteína multi-extrusão antimicrobiana, glicosil transferease, reguladores transcricionais LacI, genes envolvido
com síntese de carboidrato e peptideoglicano associado à lipoproteína entre outros. A utilização de diferentes
fontes de carbono pela bactéria necessita da ativação de vários genes relacionados a diversos processo metabólicos.
Uma análise mais detalhada do padrão de expressão destes genes, utilizando uma abordagem quantitativa, ainda
precisa ser realizada para um maior detalhamento da importância relativa dos mesmos na utilização desta fontes
de carbono pela bactéria.
Apoio financeiro: Projeto Pronex/FAPERJ, Instituto Milênio, CNPq, CAPES e EMBRAPA
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Identificação de genes de bacteriocinas em linhagens
de Bacillus isolados da região amazônica
Velho, RV1,2; Medina, LFC2,3; Valiati, VH3; Brandelli, A2
PPG em Biologia Celular e Molecular - UFRGS
ICTA – Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos – UFRGS
3
Laboratório de Biologia Molecular - UNISINOS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: bacteriocinas, PCR, biodiversidade, identificação molecular e análise filogenética
Bacteriocinas são substâncias antimicrobianas de natureza protéica, sintetizadas por várias espécies de
bactérias. Esta classe de substâncias apresenta características de estabilidade ao calor, ao baixo pH, refrigeração
e congelamento; apresentando-se como um agente potencial a ser aplicado em sistemas de conservação de
alimentos. A biodiversidade microbiana da Amazônia, bem como seu potencial biotecnológico, não tem sido
plenamente estudada. Poucos trabalhos mostram produtos do metabolismo microbiano com potencial uso em
indústrias. Neste âmbito, o objetivo deste trabalho foi identificar a presença dos genes spf e ituD das bacteriocinas
surfactina e iturina A, respectivamente, em linhagens do gênero Bacillus, isoladas de ambientes aquáticos da região
amazônica. Paralelamente, realizou-se a identificação molecular do gene rDNA 16S. Das cinco linhagens testadas,
todas apresentaram o gene ituD e quatro, o gene sfp. Os produtos das amplificações pela PCR dos genes ituD e rDNA
16s foram sequenciados e para as inferências filogenéticas foi possível a utilização de 759 e 723pb, respectivamente.
Todos os modelos de reconstrução filogenéticos (Neighbor-joining –NJ, no Paup 4.0b10 - Máxima Verossimilhança
– MV, no PHYML 2.4.4 e Bayesiana -IB, no MrBayes 3.1.2) resultaram, apesar de baixo suporte (bootstrap > 50 e <
55%), em topologias similares agrupando todas as cinco linhagens próximas a B. subtilis. Quando os genes foram
avaliados conjuntamente, o suporte para a monofilia do agrupamento aumentou para 61% nas analises por NJ
e MV. Na análise IB o modelo evolutivo mais adequado (NKY) foi identificado no programa MrModeltest 2.2 e a
probabilidade a posteriori de 90% ratificou as linhagens amazônicas avaliadas como proximamente relacionadas
a B. subtilis e tendo de B. amiloliquefaciens como grupo irmão. Entre os 759pb do gene ituD somente em 6 (0,9%)
das posições foram variáveis entre B. subtilis do GenBank com as linhagens avaliadas e em 17 (2,2%) com B.
amiloliquefaciens, ratificando a maior similaridade genética com a espécie B. subtilis.
Apoio Financeiro: CNPq/CAPES
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43
Ubiquidade de Mesoplasma sp em formigas da tribo
ATTINI
Mantovani, JD; Rodovalho, CM; Martins Jr, J; Bacci Jr, M
Laboratório de Evolução Molecular - Centro de Estudos de Insetos Sociais – Instituto de Biociências de Rio Claro – UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: simbiose, Attini, 16S, Mollicutes e bactérias intracelulares
As formigas da tribo Attini apresentam reconhecida associação com microrganismos. As cerca de 200 espécies
desta tribo vivem em mutualismo obrigatório com fungos basidiomicetos e facultativo com bactérias gramnegativas (Burkholderia) ou estreptomycetas (Pseudonocardia), ambas produzindo antibióticos que protegem as
formigas contra fungos entomopatogênicos. Outra relação não menos relevante é aquela recentemente relatada
por nosso grupo de pesquisa entre Attini derivadas da espécie Atta laevigata e bactérias parasitas intracelulares
obrigatórias no grupo dos Mollicutes (Mesoplasma sp). No presente trabalho, nós descrevemos o desenho de
primers e a padronização de protocolos de PCR específicos para a região 16S de Mollicutes, de modo a prospectar
estes parasitas intracelulares em outros gêneros de formigas Attini. Uma única banda de 500 pares de base foi
amplificada a partir de DNA genômico de A. laevigata e sua sequência nucleotídica determinada e confirmada como
sendo de Mesoplasma sp. O mesmo procedimento revelou sequências 16S de Mesoplasma sp associadas a Attini
derivadas nos gêneros Acromyrmex, Atta, Serycomyrmex, Cyphomyrmex, às Attini basais nos gêneros Apterostigma,
Mycetarotes, Mycocepurus e Mycetagroicos e à Attini intermediária no gênero Trachymyrmex. Foram detectados
10 haplótipos 16S com identidade acima de 93 % entre si. Estes haplótipos, segundo a análise de MJ Network,
estão divididos em duas linhagens: uma associada a Mycetagroicus sp (dois haplótipos) e outra associada às Attini
nos demais gêneros analisados (oito haplótipos). Nesta segunda linhagem, um único haplótipo esteve associado a
formigas pertencentes a oito gêneros distintos, distribuídos em diferentes latitudes geográficas, nos municípios de
Registro (SP), Rio de Janeiro (RJ), Cabrália (SP), Júlio de Castilhos (RS), Fazenda de Cascata (BA) e Ferreira Gomes
(AP). Estes resultados sugerem ampla distribuição da mesma espécie do parasita intracelular entre algumas Attini,
provavelmente resultante de uma infecção recente que se espalhou rapidamente entre estas formigas.
Apoio: CNPq e FAPESP.
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Diversidade de bactérias endofíticas de plantas
cultivadas em área contaminada por metais pesados
Ferreira, AJ1; Francisco, L; Espósito, E; Araújo, WL1
¹Universidade de Mogi das Cruzes- Núcleo integrado de Biotecnologia-NIB
Palavras-chave: ENDÓFITOS, METAIS PESADOS, MATA ATLÂNTICA, RIZOSFERA, DIVERSIDADE
As plantas podem abrigar microrganismos endofíticos, os quais são capazes de colonizar o interior da planta
hospedeira sem causar danos ou formar estruturas externas visíveis. Estes microrganismos podem produzir
metabólitos úteis à hospedeira, promovendo o crescimento da planta hospedeira, reduzindo o estresse biótico
e abiótico, bem como diminuindo a incidência de patógenos. Entretanto, apesar do ambiente mais estável no
interior da planta hospedeira, variações neste ambiente podem resultar em seleção de genótipos microbianos e/ou
resultarem em um desequilíbrio desta comunidade endofítica. Dessa forma, tendo em vista que o solo do Parque
Nagib Najar na cidade de Mogi das Cruzes, SP apresentou inconformidade nos níveis de Ferro, Manganês, Chumbo,
Cromo, Níquel, Cádmio, Cobre e Zinco, os objetivos do presente trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias
endofíticas Tecoma stans (ipê mirim) e Blechnum brasiliense (Pteridofita), encontradas em quatro pontos (1, 2, 5 e 6)
do parque, onde foram observados diferentes níveis de contaminação. Para isolamento da comunidade endofítica,
caules e rafes das plantas foram desinfetados superficialmente, macerados e diluições apropriadas foram semeadas
sobre meio TSA. A densidade bacteriana variou de 1,89 a 4,03 (Log10 UCF. g caule-1), sendo maior em Blechnum
brasiliense. Foi observado também que esta densidade bacteriana variou de acordo com o ponto de amostragem,
tendo as plantas amostradas no ponto 2 uma menor densidade bacteriana. Este resultado sugere que a variação
nos níveis de poluentes podem atuar no nível de colonização da planta hospedeira por bactérias endofíticas. Por
meio da análise da sequência do gene 16S rRNA, foi observado que a comunidade bacteriana associada às plantas
avaliadas é composta por 26 gêneros, dentre eles Methylobacterium, Agrobacterium, Enterobacter, Stenotrophomonas,
Curtobacterium e Rhizobium. Entretanto alguns gêneros, tais como Angulomicrobium, Massiliatimonae, Pandoraea,
Hymenobacter e Aquabacterium, não foram relatados anteriormente como endófitos. Alguns desses gêneros como
Bacillus, Methylobacterium e Xanthomonas estão sendo avaliados quanto à promoção de crescimento vegetal e
controle de patógenos, podendo assim permitir inferências sobre os efeitos da contaminação do solo sobre a
capacidade de regeneração vegetal da área, visto que estes isolados podem ter sido selecionados pela presença de
metais pesados dentre outros contaminantes. Além disso, a comunidade da rizosfera está sendo avaliada por meio
de PCR-DGGE, permitindo uma avaliação da interação das comunidades da rizosfera e endofítica, bem como o
efeito da contaminação por metais pesados sobre estas comunidades.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Caracterização inicial de três fatores de transcrição
pertencentes a família LysR de Xylella fastidiosa
Pelloso, AC1; Toledo, MAS1; Saraiva, AM1; Schneider, DRS1; Azzoni, AR1; Souza, AP1 2
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Departamentos de Biologia Vegetal – Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
E-mail: [email protected]
12-
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, reguladores transcricionais, LysR, CysB, Dicroísmo Circular.
Após o seqüenciamento do genoma da Xylella fastidiosa, linhagem 9a5c, houve um grande aumento de informações
relacionadas a este organismo, porém grande parte das proteínas produzidas por esta bactéria ainda não apresentam
funções preditas. No presente estudo, objetiva-se a caracterização inicial de três proteínas deste microrganismo, a
saber: XfCysB (orf Xf0683), XfLysRL (orf Xf1448) e XfycjZ (orf Xf1480). Essas proteínas apresentam alta similaridade
com membros da família de reguladores transcricionais do tipo LysR (LTTR). Os LTTR constituem a família de
reguladores mais comuns em procariotos e apresentam funções diversas tais como regulação de genes envolvidos
no metabolismo, divisão celular, quorum sense, virulência, resposta ao estresse oxidativo, entre outros. Dentre as
proteínas em estudo, a única proteína que possui predição de classificação mais específica dentro da família LysR
é a XfCysB, cujas proteínas homólogas já caracterizadas estão envolvidas na regulação do operon cys, o qual está
envolvido na biosintese de cisteína. O inicio dos estudos com as proteínas se deu pela clonagem das respectivas
orfs no vetor pET28a e expressão destas em Escherichia coli linhagem(DE3), sendo que, em seguida, as respectivas
proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao níquel. A partir da proteína XfLysRL
purificada, ensaios utilizando a técnica de dicroísmo circular foram realizados para a análise inicial de sua estrutura
secundária, os quais revelaram que esta proteína apresenta uma estrutura estável e enovelada até 44°C. Foram
feitos também para esta proteína, testes funcionais iniciais em que foram realizados géis shift da proteína com
um promotor de OxyR de X. fastidiosa. No primeiro teste, houve uma interação entre o promotor e a XfLysRL,
entretanto, no segundo teste, no qual se adotou condições mais adstringentes na reação, tal interação não ocorreu.
Deste modo, pôde se concluir que a interação presente no primeiro teste de gel shift foi devido a uma interação
inespecífica entre a proteína e o promotor. Em resumo, este trabalho se trata de uma caracterização preliminar
destas três proteínas de X. fastidiosa e que, portanto, mais testes ainda serão necessários para completar esta
análise. Estes futuros ensaios incluem o dicroísmo circular das proteínas XfCysB e XfycjZ, a produção de anticorpos
das proteínas para testes funcionais destas e sua possível detecção em diferentes fases da formação do biofilme
de X. fastidiosa ( forma colonizadora e patogênica da bactéria) e realização de SAXS (espalhamento de raio X a
baixo ângulo), onde poderá observar o estado oligomérico das proteínas, se estão monodispersas em solução e
alteração estruturais mediante a presença de indutores. Deste modo, pesquisas sobre as características de LysR
em X. fastidiosa e sua análise estrutural é considerada de grande importância, devido a grande variedade e funções
realizadas por estas e o impacto causado nas lavouras de citrus pela bactéria.
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Limiar de detecção de Salmonella typhimurium em
diferentes caldos de enriquecimento seletivo por PCR e
Salting-out
Berg, R¹; Silva, DG²; Conde, SO¹; Lemos, MVF¹; Fagliari, JJ²
¹Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Animal do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, da FCAV – UNESP
– Campus de Jaboticabal.
²Laboratório de Apoio à Pesquisa do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, da FCAV – UNESP – Campus de Jaboticabal.
[email protected]
Palavras-chave: Salmonella Typhimurium, salting-out, PCR, caldos de enriquecimento seletivo, diluição seriada
O isolamento microbiológico da Salmonella e a posterior sorotipagem é utilizado como um método referencial
para o diagnóstico de amostras ambientais e clínicas provenientes de animais infectados com esta bactéria. Tal
técnica é baseada no cultivo bacteriológico em meios seletivos, seguido pela caracterização das colônias suspeitas
em testes bioquímicos e sorológicos, o que demanda longos períodos que podem variar de 4 a 7 dias. Sendo assim,
vários métodos alternativos têm sido desenvolvidos, como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) associada a
caldos de enriquecimento seletivo, que vem sendo considerada uma técnica promissora por facilitar e agilizar o
diagnóstico de salmonelose em amostras de fezes, uma vez que permite a multiplicação da bactéria alvo, além da
diluição de células mortas e substâncias inibitórias da PCR. Do mesmo modo, o isolamento de DNA pelo método
de salting-out tem sido atualmente utilizado com sucesso na extração de DNA de Salmonella, por apresentar
vantagens em termos de sensibilidade e tempo de armazenamento das amostras. Diante desta perspectiva, o
presente trabalho objetivou avaliar o limiar de detecção de Salmonella Typhimurium nos caldos de enriquecimento
seletivo Rappaport-Vassiliadis (RV), selenito cistina (SC) e tetrationato Muller-Kauffmann (TMK) pela técnica de
PCR, por meio da detecção do gene rfbJ, específico para Salmonella do sorogrupo B, associada à extração de DNA
pelo método de salting-out. Após o enriquecimento da cultura pura de Salmonella Typhimurium nos caldos RV,
SC e TMK a 37ºC durante 18 horas, sob agitação, realizou-se uma diluição seriada (1:10) de cada um dos meios e
posterior contagem do número de bactérias em ágar nutriente. A partir de alíquotas das diluições seriadas dos três
caldos de enriquecimento seletivo foi realizada a extração de DNA pelo método de salting-out, PCR e separação dos
produtos da PCR por eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Os limites de detecção de Salmonella Typhimurium nos
caldos SC, TMK e RV foram de 105, 106, 107 UFC/mL, respectivamente. Os resultados obtidos mostraram que a PCR
associada à utilização do caldo RV proporcionou maior limiar de detecção de Salmonella Typhimurium.
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Genetic diversity and diagnostic marker development
for Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae
Munhoz, CF1; Weiss, B1; Zucchi, MI2; Fungaro, MHP3; Hanai, LR1; Oliveira, ALM3; Vieira, MLC1*
Universidade de São Paulo, ESALQ, Departamento de Genética, Caixa Postal 83, 13400-970, Piracicaba, SP;
Instituto Agronômico – IAC, Campinas, SP;
3
Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR.
[email protected]
1
2
Keywords: Xanthomonas axonopodis; Genetic diversity; AFLP; Population structure; Molecular diagnosis, Passiflora, Passion fruit
X. axonopodis pv. passiflorae is responsible for the bacterial leaf spot of passion fruits, a disease that has spread
rapidly since it was observed in Brazil in 1969. It affects leaves and fruits, leading to commercial losses mostly when
plants are exposed to high temperatures and humidity. The pathogen attacks the yellow passion fruit (Passiflora
edulis f. flavicarpa) as the sweet passion fruit (P. alata), and chemical control has had inconsistent results. Therefore,
the development of resistant varieties is the most promising solution for controlling the disease. In addition, the
assessment of genetic diversity within a pathogen collection obtained from different locations should also be
very informative. Then, the objective of this work was to establish a collection of X. axonopodis pv. passiflorae
obtained from different Brazilian geographic locations; to measure the genetic diversity within the collection using
the AFLP technique; to infer the structure of the bacterial population, assigning every isolate to a subpopulation
or cluster; and to construct PCR primers based on the analysis of the 16S–23S rRNA ITS region for diagnosis
purposes. Considerable diversity among isolates (87) was detected using AFLP loci (89), and the analysis of
molecular variance showed that differences among localities (22) contributed to most part of the variance (49.4%).
The flow of isolates among localities was restricted. The software Structure assigned isolates to 13 genotypic groups
and showed there were localities with very homogeneous clusters; however, several isolates belonging to different
clusters were found in some other localities. Based on the discovery of a SNP in the 16S–23S rRNA ITS sequence,
a primer set was designed for diagnosis purposes. The PCR amplicon was specific to pv. passiflorae, i.e. it was
detected in all isolates of pv. passiflorae but in none of the 8 other pathovars of X. axonopodis used as controls. In
addition, bioassays were carried out and X. axonopodis pv. passiflorae was detected even in asymptomatic plants,
thus confirming the sensibility of the primer set here designed.
Financial support: FAPESP and CAPES.
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Geração e caracterização de um mutante b-1,4Endoglucanase defectivo de gluconacetobacter
diazotrophicus PAL5T
Meneses, CHSG1,2; Rouws, LFM2; Simões-Araújo, JL2; Vidal, MS2; Baldani, JI2
Pós-graduação em Biotecnologia Vegetal, UFRJ.
Embrapa Agrobiologia, Seropédica, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Celulase, Gluconacetobacter diazotrophicus, colonização endofítica, mutagênese insercional, atividade endoglicolítica.
O sequenciamento do genoma da bactéria G. diazotrophicus, bactéria endofítica de cana-de-açúcar conhecida por
beneficiar o crescimento e o acúmulo de nitrogênio desta planta, devido principalmente à fixação biológica de
nitrogênio (FBN), tem possibilitado diversos projetos de genômica funcional, com o objetivo de confirmar a função
das sequências gênicas identificadas na G. diazotrophicus estirpe PAL5T. Dentre os diversos estudos em andamento,
destacam-se as enzimas envolvidas no processo de colonização dos tecidos das plantas de cana-de-açúcar. Especulase que a bactéria produza enzimas que degradem a parede celular, permitindo a colonização de novos vasos do
xilema. A identificação de um gene (ORF GDI_2537) com similaridade de seqüência a genes de endoglucanases
de outros organismos fomentou o presente estudo. O presente trabalho objetivou gerar, por meio de inserção de
transposon, um mutante defectivo na produção de β-1,4-endoglucanase, bem como avaliar o fenótipo do mutante
em condições de cultivo definidas, em relação à estirpe selvagem PAL5T. Para estudar a função desse gene, foram
construídos vetores para a inativação do gene eglA de acordo com a seguinte estratégia: eglA do genoma de G.
diazotrophicus foi amplificado por PCR, utilizando-se um par de iniciadores específicos; o produto de PCR ligado
ao vetor pGEMT Easy e uma alíquota da ligação foi utilizada para transformar células de Escherichia coli estirpe
DH10B. As bactérias recuperadas após seleção em meio de cultivo suplementado com o antibiótico ampicilina
foram selecionadas analisadas quanto a presença da construção contendo o gene eglA de G. diazotrophicus. O gene
eglA clonado foi interrompido in vitro pela inserção do transposon EZ::TN<KAN-2>™, (Epicentre Biotechnologies,
Madison, USA) e mobilizado para E. coli por eletroporação. Uma vez obtida a construção contendo o gene eglA de G.
diazotrophicus interrompido pela inserção do transposon, pMeglA (plasmídeo Mutagênese eglA), este foi utilizado
na transformação da estirpe PAL5T de G. diazotrophicus,com o intuito de se obter mutantes por recombinação
homóloga dupla. O fenótipo foi avaliado pela atividade de endoglucanase através da formação de halos de coloração
amarela em meio de cultura contendo carboximetilcelulose corados com vermelho do congo. Tanto a estirpe
selvagem como o mutante eglA- apresentaram um comportamento negativo no que diz respeito a degradação de
carboximetilcelulose (CMC), sugerindo ausência de atividade do gene eglA apesar de G. diazotrophicus apresentar
um gene que codifica para uma endoglucanase.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPERJ/PRONEX.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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49
Efeito do uso de bactérias endofíticas na promoção
de crescimento e tolerância à seca em mudas de
cacaueiro (Theobroma cacao L.)
Silva, AB1; Leite, HAC1; de Souza, JT2; Loguercio, LL1
Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia – UFRB
[email protected]
1
2
Palavras-chave: inoculação endofítica, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, seqüenciamento do 16S rDNA e hsp-60, cacau.
Microrganismos endofíticos compreendem fungos e bactérias que habitam os espaços intercelulares dos tecidos
vegetais, sem causar quaisquer danos ao hospedeiro e podendo, em várias circunstâncias, beneficiá-los pela
promoção de crescimento, indução de resistência sistêmica, produção de toxinas, sideróforos e outros metabólitos
que afetam o desenvolvimento dos fitopatógenos, aumento da tolerância do hospedeiro à fatores de estresse, entre
outros. Neste trabalho avaliou-se os efeitos da inoculação de bactérias endofíticas na promoção de crescimento e
tolerância à seca em mudas de cacau comum (cv ‘Sial 70’). Isolados bacterianos – ‘344 e ‘629’ – obtidos de cacaueiros
sadios, e os mutantes ‘344-3.2’ e ‘344-1.1’ crescidos em meio TSA-Rifampicina a 150 μg/ml foram inoculados tanto
por imersão de sementes nas suspensões bacterianas, quanto por aplicação destas por rega no solo, após 20 dias
de germinação, sendo 1010 UFC.ml-1 de inóculo em ambos os casos. O tratamento de déficit hídrico foi realizado
90 dias após a inoculação das mudas. Pela morfologia de colônias recuperadas a partir de partes das plântulas
(raiz, haste e folhas), verificou-se a presença dos endofíticos em todas as partes da planta hospedeira, a partir de
15-20 dias de inoculação. Após seqüenciamento dos genes 16S rDNA e hsp-60 (heat-shock protein 60 kDa) para os
isolados 344 e 629, bem como rpo-B (subunidade β da RNA polimerase) para o 344, estes foram classificados como
Enterobacter cloacae (344) e Bacillus sp (629). A avaliação das mudas 27 dias após privação de água sugere que
as plantas do tratamento 344-1.1 inoculado por imersão de sementes em suspensão bacteriana apresentaram-se
mais tolerantes à ausência de rega do que os demais tratamentos deste método. De forma semelhante, as mudas
do tratamento 344-1.1+629 inoculadas por rega no solo foram menos sensíveis, mantendo vitalidade remanescente
em relação aos demais tratamentos deste método. Estes resultados indicaram efeito de aumento da tolerância
à estresse por déficit hídrico. Em outro experimento em que os indivíduos não foram submetidos à privação de
rega, após 180 dias, a avaliação da matéria-seca das mudas para os diversos tratamentos de inoculação endofítica
mostrou diferenças de crescimento positivas em relação às mudas controle não inoculadas, indicando efeito
de promoção de crescimento. Neste momento, testes moleculares estão sendo desenvolvidos para identificar a
presença in planta dos isolados inoculados e quantificar os níveis de colonização nas diversas partes das mudas.
Apoio: CNPq
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50
Caracterização da linhagem LBM 5006 Bacillus
amyloliquefaciens quanto ao seu potencial como
produtora de bacteriocinas
Basso, AP1; Velho, RV1,2; Medina, LFC1,3; Valiati, VH3; Brandelli, A1
ICTA – Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos – UFRGS
PPG em Biologia Celular e Molecular - UFRGS
3
Laboratório de Biologia Molecular - UNISINOS
1
2
Palavras-chave: bacteriocinas, PCR, identificação microbiana, análise filogenética e biodiversidade
A linhagem LBM 5006 de Bacillus amiloliquefaciens foi isolada de solo da Mata Atlântica, próximo à Santo Amaro
da Imperatriz (27° 24′S, 48° 27′W), Santa Catarina. Esta linhagem apresentou atividade antimicrobiana contra
isolados de Staphylococcus aureus (isolado de alimento), Listeria monocytogenes ATCC 7644, Bacillus cereus ATCC
9634, entre outros patógenos de alimentos. O presente trabalho teve como objetivo identificar à presença dos
genes das bacteriocinas surfactina e iturina A. A linhagem apresentou o gene ituD, mas não o gene sfp responsáveis
pela produção competente de iturina A e surfactina, respectivamente. Além da confirmação da presença dos
genes também foram realizadas análises filogenéticas com base nas sequências nucleotídicas correspondentes
ao gene 16S. Os produtos das amplificações pela PCR foram sequenciados e recuperaram-se 1244pb utilizados
nas inferências filogenéticas através de dois métodos: (1) Máxima Verossimilhança executada no programa
PHYML 2.4.4 e Neighbor-Joining (NJ) no Paup 4.0b10. Sequências nucleotídicas de 12 linhagens do gênero Bacillus
(B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus e B. sphaericus) e Staphylococcus aureus como grupo
externo foram obtidas no GenBank. Os valores de confiança dos nós foram acessados por 1000 replicações do
tipo bootstrap. Com os dois modelos obtiveram-se hipóteses bem suportadas, com bootstrap de 82% e 74% (MV e
NJ), que a linhagem LBM 5006 é B. amiloliquefaciens e, como recorrente na literatura, próximo filogeneticamente
a B. subtilis. A taxa de substituição nucleotídica (0,28 ± 0,14 %) entre a linhagem LBM 5006 e as espécies de B.
amiloliquefaciens do GenBank é aproximadamente três vezes menor que entre B. subtilis e B. amiloliquefaciens (0,76
± 0,24 %) e muito menos que as diferenças intra-específicas das linhagens de B. amiloliquefaciens (0,57 ± 0,27 %).
Portanto, a diversidade nucleotídica coloca LBM 5006 dentro do espectro de variação desta última, suportando a
condição de serem da mesma espécie. No momento, o gene da iturina A esta sendo caracterizado molecularmente
com intuito de utilizá-lo como possível marcador filogenético.
Apoio Financeiro: CNPq/CAPES
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51
Diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio
simbiontes dos nódulos de Inga spp.
Santos, HRM1; Dias, JCT2; Gross, E3
Mestranda em Genética e Biologia Molecular PPGGBM/UESC
Professor DCAA/UESC
3
Professor DCAA/UESC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Diversidade de bactérias simbióticas, Leguminosas, Mimosoideae
O gênero Mimosa pertence à família das leguminosas, subfamília Mimosoideae, e é formado por cerca de 480
espécies, em sua maioria de distribuição neotropical, especialmente no Brasil (LEWIS, 1987). Muitas destas
plantas são utilizadas na reabilitação de solos degradados por sua agressividade e capacidade de se desenvolver
em condições edáficas adversas (DE FARIA; LIMA, 1998). Essas características são em parte devido à simbiose
com rizóbios, bactérias fixadoras de nitrogênio simbiontes, que ocorre através da formação de nódulos caulinares
e radiculares. Os nódulos de leguminosas apresentam grande diversidade anatômica e morfológica, entretanto,
podem ser classificados, basicamente, em dois tipos: os determinados e os indeterminados, que diferem pela
presença de meristema permanente nesse último. Atualmente, as informações taxonômicas sobre bactérias são
em grande parte fornecidas através da biologia molecular e manipulação do DNA. Nos estudos com rizóbio, têmse observado uma utilização crescente da técnica de PCR (polymerase chain reaction) e o seqüenciamento da
subunidade menor do DNA ribossômico (16S rDNA). A análise de diferentes tipos de isolados, pode ser realizada
através da comparação das seqüências obtidas com o banco de genes (GenBank, p. ex.) buscando alinhamentos
significativos. O presente estudo isolou bactérias dos nódulos de Inga sp. e caracterizou morfo-anatomicamente
essas colônias bacterianas. O DNA genômico desses isolados foi extraído, amplificado e seqüenciado com o intuito
de identificar através do 16S rDNA as bactérias simbiontes. Amostras de nódulos de Inga sp. foram coletados
na Reserva Ecológica de Serra Bonita, localizada no município de Camacan- BA e as bactérias do interior dos
nódulos foram isoladas e crescidas em meio de cultura 79 sendo a morfo-anatomia das colônias avaliadas 72 h
após o isolamento. O DNA cromossômico dos rizóbios foi extraído e a região que codifica o 16S rRNA amplificada
e seqüenciada. As seqüências confirmadas nas direções 3´ e 5´ foram submetidas ao banco de genes (GenBank) e
comparadas com outras buscando alinhamentos significativos. A grande maioria das colônias bacterianas isoladas
apresentou coloração amarela, brilhante, com bordas inteiras, com produção de mucopolissacarídeos e tiveram
crescimento rápido (24 -48 h). No total foram seqüenciados 11 isolados de Inga spp. Os isolados apresentaram
seqüências consenso com aproximadamente 600 pares de bases e através de BLAST tiveram alinhamentos
significativos com o gênero Burkholderia e Rhizobium. Essas betaproteobactérias têm grande versatilidade
nutricional e apresentam resistência a antibióticos produzidos por outros microrganismos, ao que se soma sua
capacidade de síntese de enzimas pectolíticas, úteis na invasão dos tecidos vegetais, lhes conferindo vantagens
competitivas (WILLENS; COLLINS, 1993). Os resultados do presente estudo confirmam a ampla distribuição
desses gêneros como nodulante de Mimosa em uma ampla diversidade de biomas.
Apoio Financeiro: CAPES e UESC
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52
Analysis of expression of the transcription activators
SyrM1, SyrM2, NodD1, NodD2 and TtsI of Rhizobium
sp. NGR234
Pinheiro, FC1; Schreiner, PG1; Souza, EM2; Cruz, LM2; Monteiro, RA2; Steffens, MBR2; Wassem, R1
1
2
Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná; Caixa Postal 19071, CEP 81531-990
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná
Keywords: NGR234, transcriptional regulators, nodulation genes, rhizobia, type three secretion system
Rhizobium sp. NGR234 is a symbiotic nitrogen fixing microorganism that induces root nodules in plants from the
Fabaceae family, providing fixed nitrogen in exchange for carbon sources. This microorganism is able to establish
this symbiosis with 112 genera, and has driven several studies that aim to understand the molecular basis of this
promiscuity. It is known that genes involved with nodulation, protein secretion through the type III secretion
system and modification of cellular surface signaling molecules (exopolysaccharides and lipopolysaccharides) are
involved with host specificity. In NGR234, the expression of such genes is under control of the transcriptional
activators NodD1, NodD2, SyrM1, SyrM2 and TtsI. The target genes of these regulators are well established, except
for SyrM1, and allowed the proposition of a regulatory cascade. However, the expression of the regulators is still
not completely clear, especially at later stages after plant infection. In order to better understand this regulation,
promoter regions from nodD1, nodD2, syrM1, syrM2, and ttsI genes were cloned upstream from the gfp gene and
the resulting plasmids were transferred into wild type and derivative strains. syrM1 expression is apparently
constitutive and its product, SyrM1, inhibits the expression of nodD2. syrM2, nodD2 and ttsI are only expressed
under inducing conditions and are dependent on NodD1, as seen before. In addition to that, nodD2 is negatively
regulated by SyrM1, SyrM2 and probably also by NodW. nodD1 is also constitutively expressed, but seems to be
partially self activated. These results are in accordance with previous results and expand the current view, since
several strains were assayed and experiments were performed for up to 96 hours.
Supported by: Fundação Araucária, Instituto Milênio/CNPq.
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53
SigA binds to Nod and tts gene promoters of Rhizobium
sp. NGR234
Bonato, P1; Bonatto, AC1; Monteiro, RA2; Souza, EM2; Pedrosa, FO2; Wassem, R1
Departamento de Genética, UFPR Caixa Postal 19071, Curitiba, PR, CEP 81531-990
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, UFPR
1
2
Keywords: nitrogen fixation, nodulation, transcriptional regulation, sigma factor, Rhizobium sp. NGR234
Formation of nitrogen-fixing root nodules in leguminous plants by rhizobia involves a complex exchanging of
chemical signals between both partners. Flavonoids released by plants trigger a regulatory cascade controlled by
the transcription regulator NodD protein and activates the expression of nod genes, which are responsible for the
synthesis of Nod factors. This cascade also leads to activation of tts genes by the TtsI protein, resulting in secretion
of proteins by the type three secretion system (T3SS). The regulation of bacterial gene expression in symbiosis
is well studied in the broad host-range Rhizobium sp. NGR234, which carries a symbiotic plasmid (pNGR234a)
with many of the symbiotic genes. Rhizobial genes, including symbiotic ones, are poorly expressed in Escherichia
coli probably due to differences between the transcriptional machineries. In order to elucidate whether SigA, the
rhizobial housekeeping sigma factor, acts in the transcription of nod and tts genes and to compare with the E. coli
machinery, the His-tagged SigA protein of NGR234 was overexpressed, purified and tested in vitro. Electrophoretic
mobility shift assays using a nod gene promoter (NB3) and a tts gene promoter (TB8) of NGR234 showed that Histagged SigA is able to bind to both sequences. This ability was further enhanced by the E. coli RNA polymerase. We
have also confirmed RNA polymerase binding to target promoter sequences by DnaseI footprinting in nod genes,
but were unable to observe a footprint in the tts gene, TB8.
Supported by: Fundação Araucária, Instituto Milênio/CNPq.
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Differential proteomic analysis of nodules of Phaseolus
vulgaris produced by Rhizobium sp. NGR234 and nopJKukolj, C1; Hungria, DB1; Monteiro, RA2; Chubatsu, LS2; Pedrosa, FO2; Huergo, LF2; Wassem, R1
Depto. de Genética – Setor de Ciências Biológicas - UFPR
Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular – Setor de Ciências Biológicas - UFPR
[email protected]
1
2
Keywords: rhizobia, NGR234, nopJ, proteome, nitrogen fixation
The productivity of leguminous crops is dependent on symbiotic associations between plants and microorganisms
able to fix atmospheric nitrogen, called rhizobia. Productivity of cultivated beans in Brazil is low and exhibit
very high amplitude of variation; ranging from 400 kg/ha to more than 3,000 kg/ha. Furthermore, productivity is
mainly dependent on the use of chemical nitrogen fertilizers, which have high manufacturing costs. Since beans
are an important source of protein for human consumption, it is imperative the development of low-cost and
environmentally friendly technologies to increase productivity. Although the use of rhizobial inoculants on soybean
is widely spread in Brazil, their use in other legumes is limited, due to poor understanding of biological factors
important for the establishment of an effective interaction. Common beans (Phaseolus vulgaris) are colonized
by Rhizobium sp. NGR234, in a process involving the concerted action of genes for nodulation, nitrogen fixation
and type three secretion system (T3SS). NopJ is a protein effector secreted by NGR234 through the T3SS and is
directly injected into the plant cell cytoplasm, but its function is still unknown. Interestingly, a nopJ- mutant strain
nodulates Phaseolus much more efficiently than the wild type strain. In order to understand the effect of NopJ on
the interaction between Rhizobium sp. NGR234 and P. vulgaris, beans were grown under sterile conditions and
inoculated with wild type or nopJ- strains of NGR234. The nodules were harvested 4 and 6 weeks after inoculation.
Protein extracts were obtained for analysis in two-dimensional electrophoresis gels by using strips of immobilized
pH gradient followed by SDS-PAGE. The gels were stained with Coomassie Blue G-250, and the protein profiles
analyzed. Protein identification of differential spots, using MALDI-TOF, will allow us to identify potential plant
targets during the interaction and may contribute to the elucidation of Rhizobium-Phaseolus mechanism of
interaction.
Financial support: Instituto do Milênio (CNPq); Proteopar
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Caracterização e diversidade genética de isolados de
Phytophthora spp. em citros com base em marcadores
AFLP e ITS
Astolpho, HA¹; Spósito, MB¹; Feichtenberger, E²; Belasque Jr, J¹
¹Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus)
²Unidade de Pesquisa e Desenvolvimento de Sorocaba/SP (APTA)
Palavras-chave: Marcadores moleculares, gomose de Phytophthora, Polimorfismo, AFLP
Doenças causadas por patógenos do gênero Phytophthora ocorrem em todas as regiões produtoras de citros.
Entre as várias manifestações da doença, a podridão do pé e a gomose em troncos e ramos são as mais sérias,
podendo levar a morte da planta. A doença no Brasil é causada principalmente por duas espécies de Phytophthora:
P. nicotianae e P. citrophthora. O presente trabalho teve como objetivo o estudo de uma população de 134 isolados
de Phytophthora spp. provenientes de diferentes municípios dos Estados de São Paulo e Minas Gerais, baseandose na análise de AFLP (EcoRI e MseI) e região ITS. Para a amplificação da região ITS as reações foram conduzidas
com os pares de primers I1/I4 e NICF1/NICR2.1. Para a reação de AFLP apenas a segunda amplificação da PCR foi
seletiva. Os nucleotídeos GC foram seletivos para o primer EcoRI (E20), os nucleotídeos GG para o primer (E21)
do EcoRI, e os nucleotídeos CC foram seletivos para o primer M16 (Bonants et al., 2000). O padrão de bandas
obtido para cada isolado foi transformado em matriz binária, e os isolados foram comparados entre si. Foram
consideradas somente as bandas fortes para definição de score um. Como haplótipo, foi considerado cada perfil
único de seqüência de bandas e isolados com as mesmas seqüências sendo pertencentes ao mesmo haplótipo.
O resultado foi a presença de 17 haplótipos diferentes com os primers E21/M16 e 19 haplótipos com os primers
E20/M16 (AFLP). Não se observou polimorfismo entre as espécies com pares de primers da região ITS. Através do
marcador AFLP, observou-se um número de 20 e 19 bandas para os perfis comuns com os primers E21/M16 e E20/
M16 respectivamente. Houve a separação das espécies de Phytophthora com o marcador AFLP.
Bonants, P.J.M.; Deweerdt, M.H.; Veld, W.A.M.; Baayen, R.P. Molecular Characterization of Natural Hybrids of
Phytophthora nicotianae and P. cactorum. Phytopathology 90:867-874, 2000.
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Identification and characterization of rock phosphate
solubilizing microorganisms isolated from maize
rhizosphere
Gomes, EA1; Silva, UC2; Lana, UGP1; Oliveira, CA2; Parentoni, SN1; Guimarães, CT1; Vasconcelos, MJV1;
Marriel, IE1
Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG
Centro Universitário UNIFEMM, Sete Lagoas, MG
[email protected]
1
2
Keywords: Genetic characterization, rock phosphate solubilization, rhizosphere, P-solubilizing microorganisms, Zea mays
Many soil microorganisms are able to transform insoluble forms of phosphorus to an accessible soluble form,
contributing to plant nutrition as potential inoculants or biofertilizers. The objective of this work was to screen
and evaluate the rock phosphate solubilization activity of microorganisms isolated from the rhizosphere of maize
cultivated in an oxisol with phosphorus deficiency. The isolates were identified based on nucleotide sequence data
from the 16S ribosomal DNA (rDNA) for bacteria, including actinobacteria and the internal transcribed spacer
(ITS) rDNA for the fungi. Initially, these microorganisms were selected based on the solubilization efficiency of
inorganic and organic phosphate sources in a modified Pikovskaya’s liquid medium culture containing sodium
phytate (phytic acid), soybean lecithin, aluminum phosphate (AlPO4), and tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2). The
capacity of rock phosphate solubilization was evaluated among 58 isolates, 39 of bacteria, 13 of fungi and 6 of
actinobacteria. The greatest solubilization in medium containing phosphate rock was observed among the bacteria.
Strains B58 and B31, identified as Burkholderia and Bacillus, respectively, were the most effective, mobilizing 19.74%
(B58) and 19.62% (B5) of the total phosphorus, after 10 days of growth. These values are comparable with the simple
superphosphate fertilizer, produced by reaction between the finely ground rock phosphate and sulfuric acid, which
the content of soluble P accounts for 20% of total P. Among the fungi, the isolate F14 (Penicillium) showed a greater
capacity for solubilization of rock phosphate, mobilizing 14.81%, while among the actinobacteria, the solubilization
capacity was very low, reaching a maximum of 1.38%. It was observed a high correlation between the percentage
of P solubilization and the final pH of culture medium, which may be related to the ability of microorganisms to
produce organic acids and/or inorganic, promoting a decrease in pH and phosphate solubilization.
Financial support: McKnight Foundation, Fapemig and Embrapa Milho e Sorgo.
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First characterization of Microsporidian microsatellite loci
Haag, KL1,2; Dutra, CG1; Ebert, D2
Laboratório de Biodiversidade e Evolução – Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Brasil
Department of Evolutionary Biology – Zoological Institute – University of Basel – Switzerland
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microsporidia, microsatellite, polymorphism, sexual reproduction
Microsporidians are very ancient eukaryotes related to fungi. Whether they have sexual reproduction has been
a puzzle for many decades. Octosporea bayeri is an obligate intracellular parasite of Daphnia magna, and several
evidences suggest that they experience a coevolutionary arms race. The development of genetic markers for O.
bayeri would be useful to characterize the dynamics of coevolution, and to provide evidence for the occurrence
of sex in Microsporidia. Since its genetics was absolutely unknown, a draft of the O. bayeri genome was obtained
by shotgun sequencing, using the Solexa technology. Subsequently, the database was mined for microsatellites,
which could be used as PCR-based markers of population polymorphism. In parallel, total genomic DNA was
extracted from a sample (n=16) of individual O. bayeri-infected D. magna, representative of the entire species’
geographic distribution, corresponding to the Skerry Island belt in the Baltic Sea. A smaller sample (n=5) of
Flabelliforma magnivora isolates, a close relative of O. bayeri, was used for comparison. Our results are the first
data on Microsporidian microsatellites. Surprisingly, 3 microsatellite loci already screened for polymorphism are
monomorphic in O. bayeri, and a fourth locus shows fixed heterozygosis. The results are consistent with a SNP
analysis made on the same sample (data presented elsewhere). However, F. magnivora showed, on average, 3 alleles
for same loci. The reduced amount of polymorphism in natural populations, contrasting with F. magnivora, indicates
that O. bayeri is a recent species, which probably originated after the last Ice Ages (20-10,000 years before present).
A lineage of Flabelliforma, which is found in England and Belgium, might have spread northwards together with its
host, when the ice sheet of the Scandinavian region melted. Fixed heterozygosis rejects the hypothesis of sex in O.
bayeri, while F. magnivora alleles seem to be randomly assorted by recombination. It is possible that the lack of a
second (unknown) host, required to complete the sexual cycle, drove O. bayeri into clonality.
Apoio financeiro: CNPq e Swiss National Science Foundation
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58
Identification of secreted soluble proteins from
Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of
the Asian soybean rust
Brommonschenkel, SH; Zaramela, LS; Gava, SG; de Oliveira, JC
Departamento de Fitopatologia/Instituto de Biotecnologia Aplicada a Agropecuária, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000, Viçosa,
Minas Gerais, Brazil
[email protected]
Keywords: Phakopsora pachyrhizi, ferrugem da soja, efetores, genes de virulência, genes de patogenicidade
Phakopsora pachyrhizi is the causal agent of the Asian soybean rust, the most important fungal disease of soybean
in Brazil and worldwide. Our objective is to identify the secretome of in planta infection structures in order to
identify and characterize the function of proteins secreted that may function as virulence effectors required for
the establishment of the biotrophic interaction and/or as triggers of plant resistance responses. These secreted
proteins are being identified using both biocomputational signal peptide prediction and the yeast-based ‘signal
sequence trap’ system (YST). cDNA and YST libraries were prepared from mRNA isolated from infected soybean
leaves harvested at different times after inoculation (1 to 12 days a.i.) and from purified haustorium and mycelium.
ESTs derived from sequenced cDNA clones were assembled into contigs. The putative open reading frames from
contigs and singlets with hits to known fungal genes as well as the sequences with no-hits to NCBI sequences
were screened for N-terminal signal peptides, transmembrane domains and sub-cellular localization. Positive YST
clones were rescued into E. coli and 5´-end sequenced. The YST sequences were also compared to NCBI sequences
and with sequences from our EST database and the open reading frames analysed for transmembrane domains
and sub-cellular localization. Several PP soluble extracellular proteins, many of them with unknown function were
identified. Further functional characterization will include transcript expression analyses, particle bombardment
and Agrobacterium-mediated delivery of candidate effectors into soybean cells to evaluate their ability to trigger or
suppress plant defense responses.
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Interações Planta-Praga/MCT/CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
of Guignardia citricarpa
Goulin1, E; Figueiredo1, JG; Tanaka1, F; Kava-Cordeiro1, V; Galli-Terasawa1, L; Glienke1*, C
UFPR, Department of Genetics, Curitiba, PR, Brazil; Brazil, *Corresponding author: Chirlei Glienke, Department of Genetics, Federal
University of Paraná. Caixa Postal: 19031, Centro Politécnico, Jardim das Américas, Curitiba, Paraná, Brazil.CEP 80531-980. Phone:
0055-41-33611562, fax: 0055-41-33611793
[email protected]
1
Keywords: Agro transformation, Agrobacterium tumefaciens, G. citricarpa, ammonium glufosinate, gfp
Guignardia citricarpa, a plant pathogen which causes the disease called Citrus Black Spot (CBS), was successfully
transformed via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The strain EHA105 of A. tumefaciens bearing
the vector pPZP201BK was used for transformation. The bar gene, rendering ammonium glufosinate resistant
transformants, and the gfp gene were employed as selection markers. The protocol of Agrobacterium tumefaciensmediated transformation described by Covert et al. (2001) were adapted for the present work. Some of the changes
were: i) Initially, spores of G. citricarpa were submitted to a temperature of 40ºC for 5 minutes. Such procedure
increased the germination rate making agro transformation easier; ii) The culture medium pH was changed to
5,8, since this is the optimum pH for G. citricarpa to grow. iii) After co-cultivation between G. citricarpa and A.
tumefaciens, selective medium was added to the membranes instead of transferring them to the selective medium.
These changes significantly contributed for the success of agro transformation. Microscopic observations to confirm
agro transformation were carried out using epifluorescence microscopy. Hyphaes and spores of G. citricarpa, which
grew in the selective medium were observed and compared to control colonies and colonies bearing the gfp gene.
The stability of T-DNA integration into the potential transformants was verified by growing them on minimum
medium containing an amino acid solution but no ammonium glufosinate. The clones were transferred to selective
medium after six consecutives periodic transfers on minimum medium. All transformants were still ammonium
glufosinate resistant, therefore indicating mitotic stability. Molecular analysis of the potential transformants was
done through PCR. The primers barR (TCAGATCTCGACGGG) and barF (ATGAGCGAACGACGC) were used
to detect the bar gene. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was an efficient method to obtain
ammonium glufosinate resistant transformants. Other methods of T-DNA insertion had already been tested, but
none showed positive results. Having transformants is essential to study the interaction between plants and its
pathogens, aiming the control of the disease.
Financial Support: CNPq and FUNDECITRUS
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Cure, transmission and modifications on dsRNA’S
purification protocol in Guignardia citricarpa
Alvarez, TM; Montenegro, DH; Silva, TM; Adamoski, D; Stringari, D; Galli-Terasawa, LV; Glienke, C;
Kava-Cordeiro, V
LABGEM – Departamento de Genética – UFPR
[email protected]
Keywords: double stranded RNA, isogenic strains, dsRNA cure, dsRNA transmission, phenol-chloroform extraction
Guignardia citricarpa is an ascomycete of extreme importance for the Brazilian citrus culture since it’s the causal
agent of Citrus Black Spot (CBS). Some isolates from this species are infected by a double stranded RNA virus
causing unknown effects on the fungal host. One of the ways to analyze the influence of dsRNA in G. citricarpa
is to obtain isogenic strains that differ from each other only by the presence or absence of this genetic material.
Two methods were tested to obtain isogenic strains: cure of dsRNA from the infected isolate, and infection of a
dsRNA-free isolate. Several cure processes described on literature were tested with no success for G. citricarpa.
The first positive results were obtained after some isolates were cultured under stressing conditions (35ºC). After
that, when grown under normal conditions, they developed sector-like regions in their colonies possibly due to a
genetic material reorganization. These sector-like regions had their total nucleic acids purified and, in some cases,
it was confirmed that dsRNA was eliminated. DsRNA transmission occurs by hyphal anastomosis after two strains,
one bearing the virus and the other with no viral infection, reach each other in a petri dish. The isolates used in
this essay were chosen based on the presence or absence of dsRNA and also on a morphological marker unrelated
to the presence or absence of dsRNA, described for G. citricarpa. This marker corresponds to the appearance of
a yellow halo around the fungal colony, when grown on oatmeal medium. Selected strains were: 1) positive for
dsRNA infection and positive for the morphological marker. 2) Negative for dsRNA infection and negative for the
morphological marker. These contrasting isolates were inoculated in pairs. In some cases it was possible to observe
incompatibility between strains since there was no contact between hyphae. When compatibility was observed,
monosporic colonies were obtained from that region and essayed regarding the presence of a yellow halo. Isolates
with no halo formation are being investigated regarding the presence of dsRNA. Identification of a dsRNA band
in agarosis gel after nucleic acids purification is not always easy and precise due to the need of a large amount
of total nucleic acids to make it visible. Phenol-chloroform extraction is normally used. In this study, instead of
using pH 8,0 phenol, it was used an acid phenol (pH 4,7). Acidification was obtained with sodium acetate. In this
condition, genomic DNA tends to precipitate into the organic phase while RNA is solubilized with the supernatant.
Purifications with acid phenol showed a fainter genomic DNA band when compared to regular pH 8,0 phenol. This
provided a more efficient DNase treatment that facilitates identification of a dsRNA band.
Financial support: FAPESP, CNPq e Tesouro Nacional.
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The role of carbonic anhydrases in growth,
development, and virulence of the pathogenic
fungus, Aspergillus fumigatus
Goldman, GH1; Soriani, FM1; Figueiredo, BCP1; Ferreira; MES1
1
Departamento de Ciências Farmacêuticas, FCFRP/USP, São Paulo, Brazil
Keywords: Aspergillus fumigatus, carbonic anhydrases, pathogenic fungus, virulence, growth
Gas carbon (CO2) represents only 0.033 % of the atmospheric gases but it is found at concentrations of roughly
5-6% in the human bloodstream and in tissues, where respiration takes place. The reversible interconversion
between CO2 and HCO3- is in equilibrium and it is spontaneously balanced. This reaction is slow without catalyst,
but can be rapidly facilitated by Zn2+-metalloenzymes named carbonic anhydrases (CAs). There are some studies
suggesting that the fungal CA not only is crucial for cell survival and proliferation, but also mediate various CO2related signaling cascades that are important for virulence and differentiation of pathogenic fungi. In this study,
we decided to investigate the role of CO2 and the CAs in growth, differentiation, and virulence in the pathogenic
fungus A. fumigatus. We identified three CAs in A. fumigatus named cafA-C. We generated A. fumigatus cafA, cafB,
and cafC null alleles using an in vivo S. cerevisiae fusion-based approach. Surprisingly, different to other fungal
CA mutants, none of the caf deletion strains showed striking growth defects under both ambient and high CO2
conditions, except for DcafA and DcafC that had pronounced reduction in conidiation in minimum medium (MM).
In addition, DcafA has also a slightly reduced radial growth when grown in complete medium (CM) at 5% CO2.
In order to determine which CAs are crucial for growth and development, we constructed a series of double CA
deletion mutants. Strikingly, only the DcafA DcafB double deletion mutant, but not DcafA DcafC and DcafB DcafC
double mutants, was unable to grow in both MM and CM at 0.033% CO2, of which growth defects can be restored by
high CO2, indicating that CafA and CafB play redundant roles in regulating growth under ambient air. Mutations in
the CA genes could disturb the physiological balance between CO2/H2O and HCO3-/H+, affecting the physiological
pH regulation. Thus, we evaluated if the different deletion strains were more sensitive to different pHs at either
0.033 or 5% CO2. There were no differences in terms of growth rate and conidiation between the wild strain and the
caf mutants suggesting that there is not a direct correlation between pH regulation and carbon dioxide conditions
for A. fumigatus growth and conidiation. Then, we evaluated the virulence of A. fumigatus DcafA, DcafB, and DcafA
DcafB mutant strains using a murine model for invasive aspergillosis and verified that infection with these strains
not caused loss of virulence when compared to the corresponding wild type strain.
Financial support: FAPESP
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Análise da diversidade genética em isolados de
Pseudocercospora griseola empregando marcadores
IRAP e REMAP
Gonzaga, LL 1,2; Santos, LV1,2; Lima, SS1,2; Araújo, EF1,2; Queiroz, MV1,2
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária – BIOAGRO
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pseudocercospora griseola, IRAP, REMAP, mancha angular e variabilidade
A mancha-angular, causada pelo fitopatógeno Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, é uma das
doenças mais importantes que acometem o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) e encontra-se amplamente
distribuída, abrangendo todas as regiões onde se cultiva esta leguminosa. Estudos anteriores demonstraram a ampla
variabilidade genética do fungo, o que dificulta os programas de melhoramento genético. Novos tipos de marcadores
têm sido descritos nos últimos anos, tais como IRAP (inter-retrotransposon amplified polymorphism) e REMAP
(retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism), que são baseados em seqüências de retrotransposons e
microsatélites. O objetivo desse trabalho foi testar a eficiência desses marcadores para a detecção de variabilidade
em P. griseola. Como não existe qualquer retrotransposons descrito para P. griseola, foi utilizada a seqüência de
um retrotransposon de Colletotrichum lindemuthianum (patógeno do feijoeiro) e sequências de microsatélites
descritas para outros fungos, como base para a escolha dos oligonucleotídeos. Inicialmente, foram testadas 4 e 16
combinações de oligonucleotídeos para IRAP e REMAP, respectivamente, e o DNA de dois diferentes isolados. As
combinações que produziram o maior número de bandas foram usadas para a análise de 60 isolados pertencentes
a diferentes patótipos. Foram obtidas 344 (REMAP) e 422 (IRAP) bandas e, entre estas, 76 e 118, respectivamente,
foram polimórficas. As duas técnicas foram eficientes para a detecção de variabilidade e podem ser usadas como
ferramentas para estudo de diversidade genética e caracterização de isolados de P. griseola.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Padrões de eletroforese de enzima multilocos (MLEE) de
amostras de Candida albicans isoladas de exsudato vaginal
Melo, JO¹; Santos, PO¹; Ponzzes, CMPBS¹; Alves, JAB¹; Santos, MS¹; Trindade, RC¹; Mann, RS2
¹Laboratório de Microbiologia Aplicada - Universidade Federal de Sergipe/UFS. 2Laboratório de Biologia Molecular. Departamento de
Agronomia-DEA/UFS
[email protected]
Palavras-chave: Isoenzimas, sistemas isoenzimáticos, MLEE, MDH e C. albicans
Sabe-se que o padrão de bandas revelado pela atividade isoenzimática pode determinar a relação genética
intraespecífica de organismos de interesse médico isolados de um mesmo sítio ou até mesmo de sítios diferentes.
O objetivo deste estudo foi caracterizar 28 amostras de C. albicans isoladas de exsudato vaginal por análise de
eletroforese de enzima multiloco (MLEE). A extração, a corrida eletroforética e a escolha dos sistemas isoenzimáticos
- álcool-desidrogenase (ADH), glicose desidrogenase (GDH), malato desidrogenase (MDH), aspartato desidrogenase
(ASD), peroxidase (PO) e sorbitol desidrogenase (SDH) - foram realizadas de acordo com Alfenas (2006), bem como
a interpretação numérica e genética dos padrões eletroforéticos. As similaridades genéticas foram calculadas de
acordo com o coeficiente de Dice usando o pacote estatístico NTSYS-pc versão 2.1 e o método de UPGMA. A
interpretação numérica do padrão isoenzimático da população dos isolados de C. albicans a partir da investigação
dos sistemas ADH, GDH, MDH, ASD e SDH possibilitaram a identificação de polimorfismo, apresentando um total
de 17 bandas distintas, sendo que o sistema MDH demonstrou a maior diversidade de bandas (7), seguido pelo
sistema SDH (4). Os sistemas ADH, GDH e ASD foram os que apresentaram menor quantidade de bandas distintas
(2 para ambos). Das enzimas testadas, a peroxidase foi a única que não apresentou atividade. A combinação de
bandas (interpretação numérica) das 5 enzimas estudadas revelou 27 tipos eletroforéticos (TE-1 a TE-27) na
população em análise. A interpretação genética do padrão isoenzimático dos isolados de C. albicans evidenciou 8
locos gênicos (Adh, Gdh, Asd, Sdh-1, Sdh-2, Mdh-1, Mdh-2 e Mdh-3) para as 5 enzimas estudadas. Com exceção do
Mdh-2 (loco monomórfico), todos se apresentaram como polimórficos. Mdh-1 e Mdh-3 apresentaram 3 alelos e os
demais dois alelos. A combinação dos alelos existentes em todos os locos, a exemplo da combinação numérica,
também evidenciou 27 TEs na população de isolados. O número de TEs identificados por interpretação genética,
através da freqüência alélica e o de TEs encontrados por interpretação numérica foram iguais, apresentando 100%
de concordância. Foi observada uma alta freqüência de alelos nulos para os locos Sdh-1, Sdh2, Mdh-1, Mdh-2 e
Mdh-3. A matriz de similaridade obtida com a composição dos TEs para 8 locus, demonstrou seis agrupamentos.
O número médio de isolados por grupo foi 3, sendo que sete isolados foram considerados como moderadamente
relacionados ou não relacionados. As amostras em estudo apresentaram alta freqüência de alelos nulos para os
locos Sdh-1, Sdh2, Mdh-1, Mdh-2 e Mdh-3. A partir da combinação de todas as enzimas, SDH e MDH, são as maiores
responsáveis pela distinção dos isolados entre si. A MLEE dos isolados de C. albicans demonstrou os indivíduos
similares, moderadamente relacionados e não relacionados sendo, portanto, útil nesse tipo de análise.
Apoio Financeiro: FAPITEC e CAPES.
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Sequenciamento amostral do genoma do fungo
basidiomiceto Puccinia psidii, agente causal da
ferrugem do eucalipto
Milanez, GP; Silva, RR; Oliveira, JC; Brommonschenkel, SH
Departamento de Fitopatologia/Instituto de Biotecnologia Aplicada a Agropecuária, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000, Viçosa,
Minas Gerais, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Puccinia psiidii, ferrugem do eucalipto, sequenciamento amostral, patogenicidade, virulência
A ferrugem do eucalipto, causado pelo fungo basidiomiceto Puccinia psidii Winter, é considerada a principal
doença da eucaliptocultura no Brasil. Todavia, são inexistentes estudos de caracterização do genoma de Puccinia
psidii objetivando a identificação de genes envolvidos na patogenicidade e virulência. Como o objetivo de obter
uma visão da estrutura e composição do genoma de Puccinia psdii foi construída uma biblioteca genômica
no vetor fosmídeo pCCFOS1, constituída por 27.648 clones, com insertos de tamanho médio de 40kpb. Foram
seqüenciadas uma das extremidades dos insertos de 2016 clones por seqüenciamento de passagem única. As
seqüências foram processadas para retirada das seqüências do vetor e comparadas com seqüências depositas
nos bancos de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), e do genoma de Puccinia graminis (http://
www.broad.mit.edu/annotation/genome/puccinia_graminis), utilizando-se o algoritmo BLASTx. Dentre as
1867 seqüências obtidas (aproximadamente 1.0 Mb), 329 (17,62%) apresentaram similaridade com seqüência
repetitivas (transposons, retrotransposons, etc.), 361 (19,44%) codificam algum tipo de proteína (proteínas de
membrana, do metabolismo, enzimas ou proteínas putativas e preditas), e 1177 (63,04%) não tiveram similaridade
com nenhuma proteína no banco. Foram identificadas seqüências que codificam para proteínas secretadas que
possivelmente estão envolvidos no processo de infecção e patogênese de Puccinia psidii. Os clones fosmídeos
que contém essas seqüências estão sendo completamente caracterizados visando obter a estrutura completa
dos genes para estudos funcionais.
Suporte financeiro: Rede Genoma de Minas Gerais/FAPEMIG, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em
Interações Planta-Praga/MCT/CNPq, CNPq.
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Molecular and physiological characterization of
Dekkera bruxellensis isolated from brazilian
ethanolic fermentation
Avansini,SH1; Meneghin, MC1; Codato, C1; Ceccato-Antonini, SR1
Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Socio-economia Rural, Universidade Federal de São Carlos, Araras, Brazil
[email protected]
1
Keywords: Ethanol fermentation, PCR fingerprinting, Microsatellite primer, contamination yeast, ethanol tolerance
The yeast Saccharomyces cerevisiae is responsible for the major part of alcoholic fermentation for fuel production,
nevertheless, contaminations are very frequent especially with yeasts from the species Dekkera bruxellensis. There
are some controversies about their role during the process because in Brazil they are eliminated from the process
when the alcohol content is elevated due to low resistance to ethanol and besides are poor ethanol producers.
However, in other countries this species has been considered as good ethanol producers and highly tolerant to the
alcohol. Here three strains of D. bruxellensis isolated from different samples, geographic regions and harvesting
years were analyzed regarding their ethanol tolerance, killer sensitivity/activity, fermentation profile and molecular
characterization by ITS region sequencing and PCR-fingerprinting with (GTG)5. There was great variability in the
assimilation profiles among the strains. They neither show sensitivity to killer strains nor killer activity, but sensitivity
to ethanol from 1%, depending on strain and initial inoculum size and low ethanol production. The multiple
sequence alignment of 500 bp ITS region showed a great similarity between the strains CCA059 and CCA155. The
PCR-fingerprint reveled also two amplification patterns including CCA059 and CCA155 in a group and CCA077
in another. Results indicated a pattern related to geographic delimitation, since the first group was isolated from
different samples in the same distillery but in different harvesting years. It is concluded that assimilation tests
cannot be used to characterize D. bruxellensis due to extensive variation among the strains as well as biotyping by
killer system, but PCR-amplification patterns can be useful. Additional strains and molecular methods are needed.
Support: FAPESP and CNPq
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Silenciamento de RNA como ferramenta para
exploração da função de genes no dermatófito
Trichophyton rubrum
Silveira, HCS1; Segato, F2; Prade, RA2; Cazzaniga, RA1; Rossi, A3; Martinez-Rossi, NM1
Departamento de Genética, FMRP-USP
Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University OK
3
Departamento de Bioquímica e Imunologia, FMRP-USP
1
2
Palavras-chave: Trichophyton rubrum, dermatófito e silenciamento de RNA
Trichophyton rubrum é um dermatófito que acomete seres humanos, é cosmopolita e o mais prevalente entre
as micoses. Os dermatófitos são fungos que consomem substratos queratinizados do hospedeiro para sua
sobrevivência. Para isto, liberam uma ampla variedade de proteases importantes na patogenicidade. O
conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nos processos de adaptação deste patógeno é fundamental
para o entendimento de sua instalação no hospedeiro e manutenção da infecção. Uma das frentes promissoras no
descobrimento da função gênica são as metodologias baseadas na inativação do RNAm por silenciamento (RNAi).
A fim de silenciar genes em T. rubrum, construímos um plasmídeo com repetições invertidas do promotor do
gene TrpC de Aspergillus nidulans que flanqueiam um gene de interesse. Neste caso utilizamos o gene pyrG que
codifica a orotidine 5’-phosphate decarboxylase, uma enzima essencial para a biossíntese de uracil, subseqüente
formação de uridina. Mutantes para este gene são cultivados em excesso de uracil e uridina. Dessa forma, o
RNA dupla fita é transcrito, desencadeando o mecanismo de RNAi para silenciar o gene alvo. Para a construção
do plasmídeo, primeiramente por PCR de fusão, fusionou-se os fragmentos de TrpC e do gene da orotidine
5’-phosphate decarboxylase, obtendo-se um produto amplificado de 1.500 pb. Este fragmento foi clonado através
do sitio de clivagem de Hind III no vetor pCSN43, que contém o gene de resistência a higromicina, originando
o plasmídeo pTrpC/hyg. Essa construção é uma poderosa ferramenta genética porque o mecanismo celular de
RNA de interferência pode ser facilmente induzido e vários genes de interesse poderão ser clonados e silenciados.
Além disso, o descobrimento de funções celulares e vias metabólicas em T. rubrum podem elucidar as respostas
moleculares envolvidas na interação patógeno-hospedeiro e fornecer novas abordagens para o desenvolvimento
de novos antifúngicos.
Suporte financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES e FAEPA
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Gene expression modulation in the chitin synthetic
pathway induced by thioridazine in Paracoccidioides
brasiliensis
Rodrigues, ACFO1; Oliveira, MV1; Rodrigues, T2; Nunes, LR1; Costa de Oliveira, RL1
Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes, SP, Brasil
Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica (CIIB), Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes, SP, Brasil
[email protected]
1
2
Keywords: Paracoccidioidomycosis, Paracoccidioides brasiliensis, microarray, thioridazine
Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic
mycosis considered endemic in Latin America. Approximately 80 % of the PCM cases registered worldwide have
occurred in Brazil, which makes this disease an important health problem in this country. Phenothiazines were
mainly used as antipsychotic drugs, but they have also been used as antiemetic and antihistaminic. Nonetheless,
literature data have shown that this class of drugs also presented antimicrobial activity in vitro and in vivo against
bacteria, pathogenic yeasts and some protozoa, which led us to evaluate the effects of the piperidinic phenothiazine
derivative thioridazine (TR) on gene expression of cultured P. brasiliensis yeast cells. The exposure of the pathogenic
yeasts to different concentrations of TR resulted in the inhibition of cell growth and promoted alterations
in the expression of more than 1,800 P. brasiliensis genes, as assessed by competitive hybridizations with DNA
microarrays. The TR-mediated down-regulation of genes that encode enzymes from the chitin synthetic pathway
was particularly relevant and these results were confirmed by real-time RT-PCR experiments. We also performed
an assay to quantify the amount of chitin in the cell wall of P. brasiliensis yeasts exposed to the same experimental
conditions used in the gene expression studies. The investigation of the TR ability to affect chitin synthesis, an
essential structural component of fungal cell wall, which is absent in mammalian cells, has a pharmacological
relevance, since TR may act on a different target from those aimed by conventional antifungal agents.
Finantial support: FAEP (FUNDAÇÃO DE AMPARO AO ENSINO E PESQUISA)/UMC
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Acompanhamento da diversidade genética de
leveduras em dornas de fermentação para produção
de álcool combustível através do microssatélite (GTG)5
Marques, ELS¹; Marques, JV¹; Moura, KS¹; Hoff, O¹; Silva-Filho, EA¹
¹Laboratório de Genética e Microbiologia Aplicada – BIOGEN/UFAL
[email protected]
Palavras-chave: fermentação alcoólica, diversidade genética, leveduras fermentativas, tipagem genética de leveduras
A produção industrial de álcool combustível se baseia na fermentação dos açúcares a partir de caldo cru, sem
tratamento prévio, contribuindo para a instalação de microrganismos contaminantes como bactérias e leveduras
nativas que irão competir pelo açúcar com a linhagem de Saccharomyces cerevisiae inoculada. A contaminação
bacteriana tem sido controlada com sucesso com o uso de antibióticos, porem não há produto químico disponível
para combater eventos de contaminação por levedura, resultando em queda do rendimento do processo fermentativo.
Com a finalidade de conhecer a dinâmica das populações de leveduras nativas e selecionar aquelas com melhores
características fermentativas e de competição, foram realizadas coletas quinzenais de mosto fermentado na Usina
Serra Grande durante todo período da safra 2008/09 para tipagem por DNA utilizando iniciadores para regiões
microssatélites. As amostras de mosto fermentado foram diluídas e plaqueadas em superfície do meio YPD com
verde de bromocresol de forma a se obter de 10 a 15 colônias as quais foram todas tipadas de acordo com SilvaFilho (2003). Com base no nosso banco de perfis para o marcador (GTG)5, foram encontrados durante todo período
de safra vinte e cinco perfis de linhagens nativas de S. cerevisiae e perfis de leveduras selvagens não-Saccharomyces
encontradas nas coletas 3, 5 e 6 ainda não catalogadas no banco de perfis. Essas espécies estão sendo identificadas
por PCR/RFLP de acordo com Esteve-Zarzoso (1999). O perfil P6 foi o mais frequente, aparecendo em quatro das
cinco coletas, sendo o perfil dominante nas coletas 2 e 4, com respectivamente 25 e 31,25%. O perfil P8 apareceu em
três das cinco coletas, mas a sua frequência foi sempre inferior a 8%. Com relação a dominância nas demais coleta,
O perfil P13 dominou a coleta 1 com 37,5% e reapareceu na coleta 4, o perfil P1 dominou a coleta 3 com 40%, porém
ele não apareceu nas coletas subseqüentes. O perfil P28 dominou a coleta 5, sendo a única coleta na qual esse perfil
está presente e o perfil P2 apareceu na coleta 4 e dominou a ultima coleta com 30,9%. A seleção e monitoramento
de leveduras dominantes através da tipagem genética por DNA em fermentação alcoólica demonstrou ser um
procedimento eficiente e rápido, podendo ser utilizado no acompanhamento da levedura inoculada e na seleção
de linhagens de S. cerevisiae nativas com maior poder de dominância. A técnica utilizada pode ser utilizada
com vantagens sobre outros processos de seleção atualmente empregados em destilarias produtoras de álcool
combustível para monitorar linhagens de S. cerevisiae, e a presença de leveduras selvagens não-Saccharomyces
prejudiciais da fermentação.
Apoio financeiro: Usina Serra Grande S/A.
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Influência do hospedeiro na estrutura genética
de Moniliophthora perniciosa na Bahia utilizando
microssatélites
Jucá, FF1; Souza, LA2; Lima, SS2; Gramacho, KP3
Laboratório de Fitopatologia Molecular. Universidade Estadual de Santa Cruz – Departamento de Ciência Biológicas. 2Laboratório de
Fitopatologia Molecular - Universidade Estadual de Santa Cruz – Depto. De Ciências Agrárias e Ambientais. 3Centro de Pesquisa do
Cacau - Comissão Executiva do Plano da Lavoura do Cacaueira.
[email protected]
1
Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, Marcadores microssatélites, fungo, pressão de seleção
A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa, foi descrita pela
primeira vez no Suriname em 1895. As perdas ocasionadas por esse patógeno podem chegar a 90% na produção
comercial de cacau. A introdução da vassoura-de-bruxa na região cacaueira da Bahia afetou o conjunto das
vantagens comparativas desta região para a produção de cacau e a preservação deste setor econômico tornouse mais dependente de fatores tecnológicos, como o desenvolvimento de variedades melhoradas e técnicas
para o controle da doença. O melhoramento genético visando resistência à doença é tido como a melhor
opção de controle. Contudo, as variedades resistentes em sua quase totalidade, derivam de uma única fonte
de resistência, o clone Scavina 6, e em 2002 é identificada a redução da resistência de descendentes deste
clone e captado um processo de evolução do patógeno: isolados amostrados em materiais resistentes diferem
genéticamente dos amostrados em genótipos susceptíveis. A fim de encontrar medidas mais duradouras as
variações no hospedeiro e no patógeno sob certas condições ambientais devem ser consideradas sob um ponto
de vista da epidemiologia molecular. O objetivo deste trabalho foi examinar, através de SSR a diversidade e
a diferenciação genética dentro e entre isolados de M. perniciosa (i) provenientes de vassouras vegetativas e
de almofadas florais e (ii) das cultivares de cacau resistentes, Scavinas descencendente e não descendentes, e
suscetíveis à vassoura-de-bruxa. A diversidade genotípica foi calculada com o progama Multilocus que variou
entre 0,82 a 0,95. demonstrando que o número de lócus foi suficiente para estimar a diversidade. A diversidade
genética (Hnb) variou entre 0,26 ± 0,24, o número médio de alelos/lócus atingiu 2,5. A diferenciação genética
observada com análise de correspondência fatorial (AFTD) demonstrou diferença quanto à origem (θ= 0,34;
P<0,0001) e cultivares hospedeiras (θ=0,11; P<0,0001). A diversidade gênica foi similar nos dois locais, com
polimorfismo superior no Campo 11 (58%) e no BAG (50%). Testes de similaridade (ΦST e AMOVA) revelaram
11% da variabilidade entre os isolados de diferentes cultivares e 88,71 % ocorreu intra-populacional. Não foi
encontrada diferença genética entre locais, sim entre origens e cultivar hospedeira. A AFTD diferenciou os
isolados em três grupos: o grupo 1, formado por isolados oriundos da cultivar CCN10, o grupo 2 por isolados
da cultivar TSH565 e o grupo 3 por isolados dos Sca6, TSH516, TSH1188 e o cultivar suscetível, O SIC 17. É
hipotetizado que novos genótipos são produzidos por eventos de mutação, e que seus genótipos produzidos
são favorecidos pela seleção, aumentando sua freqüência nas próximas gerações. E a ampla distribuição de
uma única fonte de resistência impõe uma forte pressão para a evolução do patógeno, e o surgimento de maior
diversidade genotípica e com tempo o aparecimento de novas linhagens mais adaptadas e virulentas.
Apoio Financeiro: CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Caracterização de dois novos genes no fungo
Moniliophtora perniciosa, uma nitrilase e uma indol3-acetoaldeído desidrogenase, com potencial para
síntese de auxina e possíveis papéis deste hormônio
no estabelecimento da vassoura-de-bruxa do cacau
Moraes, MH1; Cabrera, OG1; Pereira, GAG1
Laboratório de Genômica e Expressão, Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Unicamp
[email protected]
1
Palavras-chave: Moniliophtora perniciosa, vassoura-de-bruxa, auxina, nitrilase, indol-3-acetoaldeído desidrogenase
Foi constatado que o fungo hemibiotrófico Moniliophtora perniciosa, causador da doença vassoura-de-bruxa do
cacaueiro, é capaz de produzir o hormônio vegetal auxina em seus basidiocarpos, colocando este hormônio como
um possível agente de patogenicidade. Este projeto visa identificar as vias biossíntéticas pelas quais o fungo estaria
produzindo auxina. Foram usadas ferramentas de bioinformática que levaram a identificação de 5 genes putativos
no genoma do fungo que podem codificar enzimas atuantes no último passo para produção de auxina, sendo 4
nitrilases, MpNIT1-4, e uma indol-3-acetoaldeído desidrogenase, MpIAD. MpNIT1 se destacou por possuir alta
similaridade com nitrilases de plantas descritas como produtoras de auxina, também apresentou alta similaridade
com uma nitrilase de Theobroma cacao ainda não descrita, estas similaridades foram maiores do que com as outras
nitrilases do fungo, levantando questões sobre sua origem e função que podem estar relacionadas a seu hospedeiro,
porém não há dados sobre nenhum fungo que utiliza essa via para a produção deste hormônio. Entretanto, MpIAD
tem similaridade com a indol-3-acetoaldeído desidrogenase de Ustilago maydis, um fungo biotrófico que utiliza
esta enzima para a biossíntese de auxina. Estas evidências tornam os genes MpIAD e MpNIT1 alvos para uma
caracterização mais detalhada. Foi realizada a expressão heteróloga em E. coli de MpNIT1 clonada no plasmídeo
de expressão Pet28a. Através de western blot utilizando anticorpos anti-His tag foi confirmada a expressão de
MpNIT1 com marcação para a massa predita de seu monômero (35,4 kDa), também foi identificada uma marcação
mais intensa para proteínas de aproximadamente 120 kDa, sugerimos que esta marcação pode ser resultante da
formação de multímeros de MpNIT1 já que nitrilases de outros organismos podem formar agregados de 2 até 18
subunidades. Testes enzimáticos estão sendo realizados para verificar se MpNIT1 é capaz de metabolizar indol-3acetonitrila produzindo auxina. MpIAD já foi isolada a partir de cDNA e as perspectivas são de clonar e expressar
em E. coli, para que seja feito o ensaio enzimático testando sua capacidade de converter indol-3-aceoaldeído em
auxina. Também identificamos a presença de auxina nos esporos do fungo por análise de cromatografia gasosa,
sugerimos que a auxina identificada em basidiocarpos se deve à formação de esporos nestas estruturas. A presença
deste hormônio nos esporos poderia beneficiar o fungo inibindo a resposta hipersensitiva e a resistência a patógenos
biotróficos facilitando o estabelecimento e disseminação de M. perniciosa no início da infecção.
Apoio financeiro: Fapesp
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Desenvolvimento de um protocolo para a transformação
genética do fungo Moniliophthora perniciosa, causador
da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro
Minete-Cardozo, L¹; Grassi, MCB¹; Rincones, J¹; Pereira, GAG¹
¹Laboratório de Genômica e Expresão - Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes - Instituto de Biologia, Universidade Estadual
de Campinas
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Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, Vassoura-de-bruxa, transformação genética, Agrobacterium tumefaciens, fitopatógeno
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro
(Theobroma cacao). Esta doença afeta a produção de cacau nas ilhas do Caribe e em países da América do Sul, entre
eles o Brasil, onde tem causado grandes prejuízos socioeconômicos. O estudo funcional e a manipulação genética
de M. perniciosa são essenciais para aumentar o conhecimento biológico sobre a interação planta-patógeno e
auxiliar o desenvolvimento de estratégias de combate à doença. Para tanto, a transformação genética do fungo
apresenta-se como ferramenta fundamental. Neste trabalho, procuramos desenvolver um protocolo eficiente
para a transformação do fungo M. perniciosa, de fácil reprodução, e que gerasse transformantes estáveis. Dentre
os métodos utilizados atualmente para a transformação de fungos filamentosos, foram testados a eletroporação,
a transformação de protoplastos utilizando PEG, e a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens
(ATMT). O único sistema que se mostrou eficaz foi a ATMT do micélio dicariótico do fungo, tendo a higromicina
como marcador de resistência. A eficiência obtida esteve entre 5 e 40%. A transformação foi confirmada por PCR, e
o southern blot indicou inserção única no genoma. Os transformantes mostraram estabilidade mitótica e meiótica,
mantendo o DNA exógeno em meio não seletivo. A obtenção de esporos a partir do micélio transformado permitiu
regenerar hifas com todas as células transformadas. Para aperfeiçoar o protocolo de transformação, foi analisada a
influência de parâmetros como a linhagem de M. perniciosa, cepa de A. tumefaciens, tempo de cocultivo, e volume
de suspensão de A. tumefaciens. Dentre os parâmetros analisados, os que demonstraram exercer a maior influência
sobre a eficiência do protocolo foram as linhagens do fungo e as cepas de A. tumefaciens. Os resultados obtidos,
sobretudo a obtenção de um micélio com todas as células transformadas e a ocorrência de integração única no
genoma, indicada pelo southern blot, são promissores e representam a base para o desenvolvimento de sistemas
de silenciamento de genes específicos. O projeto representa um grande avanço na manipulação genética de M.
perniciosa e no desenvolvimento de estratégias para o combate à Vassoura-de-bruxa.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Expressão diferencial do gene que codifica uma
pectato liase em Colletotrichum lindemuthianum
Cnossen, A; Fontenelle, MR; Araujo, EF; Bazzolli, DMS; Queiroz, MV
Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos - Depto de Microbiologia –UFV
[email protected]
Palavras-chave: Expressão diferencial, pectato liase, Colletotrichum lindemuthianum, fase necrotrófica, antracnose
O fungo Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose no feijoeiro comum. A identificação
de genes essenciais para o desenvolvimento da doença é uma etapa importante para o seu controle. Genes que
codificam enzimas degradadoras da parede celular têm merecido destaque e já foram localizadas importantes
enzimas secretadas durante a fase necrotrófica do fungo, tais como as pectinases. O gene que codifica uma pectato
liase foi identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum, na
qual o RNAm foi extraído de folhas com sete dias de infecção. O objetivo deste trabalho foi caracterizar esse gene
para posterior isolamento de mutantes e analisar a regulação durante o desenvolvimento da doença. A seqüência
de DNA identificada foi analisada e apresentou identidade de seqüência (79%) com o gene que codifica a porção
N-terminal da pectato liase C de Fusarium solani. Na seqüência de aminoácidos, foi encontrado um possível domínio
conservado pfam0321 da superfamília de pectato liases. Devido ao reduzido tamanho da seqüência analisada, não
se identificou domínios e motivos mais específicos. Contudo, a pectato liase C da bactéria Erwinia chrysanthemi,
possui um motivo de ß hélice paralelo, com ligação a cálcio, que constitui o sítio de atividade pectinolítica. A
partir de uma árvore filogenética construída no programa MEGA com seqüências de pectato liases de diversos
fungos, observou-se um agrupamento do gene de C. lindemuthianum com os genes de Aspergillus fumigatus e
de Neosartorya fischeri. Em relação a análise da expressão diferencial do gene por RT-PCR semi-quantitativo em
diferentes estágios de infecção no feijoeiro, detectou-se que com cinco dias de infecção a quantidade de transcrito
foi superior ao observado em outros estágios. Esse resultado já era esperado, visto que na fase necrotrófica as
hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de
depolimerases, dentre estas, a pectato liase. A detecção de proteínas envolvidas na patogenicidade é fundamental
para se desenvolver estratégias de controle da antracnose do feijoeiro, direcionando os programas de melhoramento
genético para alvos específicos.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq
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Metagenômica como ferramenta de estudo da
diversidade de leveduras na fermentação do cacau
Duarte, EAA1; Viana, AJC1; Dias, RJC1; Chaves, F2; Leone, J2; Hammerstone, J2; Cascardo, JCM1
Laboratório de Genômica e Proteômica, Universidade Estadual de Santa Cruz
Mars Cacao, Barro Preto, Bahia, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Theobroma cacao, Fermentação, rDNA 26S, diversidade, metagenômica
A fermentação em cacau acontece de forma espontânea na presença de diferentes microrganismos, principalmente
as leveduras as quais estão diretamente associadas aos precursores de aroma, sabor e cor do chocolate. Apesar das
diferentes condições de fermentação impostas entre os produtores locais e de outros países o estudo da diversidade
desses microrganismos é crucial ao entendimento e melhor rendimento desse processo e seu produto final. Portanto,
este trabalho visou à identificação de leveduras e outros microrganismos presentes em oito diferentes tempos de
fermentação do cacau (0, 12, 24, 72, 96, 144 e 168 horas) via seqüenciamento do domínio D1/D2 da subunidade do
rDNA 26S. O DNA das amostras foi extraído pelo método CTAB adaptado e as amplificações via PCR foram feitas
utilizados os primes NL-1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) e NL-4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG) para
as regiões supracitadas. Os fragmentos obtidos foram purificados com o kit GFX®, inseridos no vetor pTZ57R/
T® e clonados em E. coli (DH 10β). As colônias selecionadas tiveram seus insertos confirmados por PCR e foram
posteriormente sequenciadas. O resultado parcial das sequencias analisadas para seis diferentes tempos de
fermentação do cacau estudado gerou o alinhamento com espécies de Kloeckera spp, Candida spp, Saccharomyces
cerevisiae, Lachancea kluyveri, Trichomonascus sp e diversos genes parciais 26S rDNA de leveduras não cultiváveis,
depositadas no Genbank. O dendograma obtido desse alinhamento dispõe dos diferentes microrganismos
identificados neste estudo relacionados proximamente com outros já estudados, corroborando com a idéia inicial
da importância de determinadas espécies de leveduras, especialmente S. cerevisiae na fermentação do cacau.
Esse é o primeiro relato de metagenômica de fermentação de cacau, onde várias leveduras não-cultiváveis foram
identificadas.
Apoio financeiro: CNPq, MARS Cacao
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Paracoccidioides brasiliensis transcriptional
profile changes induced by chlorpromazine
Silva, FA1; Rodrigues, ACFO1; Nunes, LR1; Costa de Oliveira, RL1
Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes, SP, Brasil
[email protected]
1
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis, chlorpromazine, transcriptional profile, microarray, paracoccidioidomycosis
Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a dimorphic and thermoregulated fungus associated with the development of
paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most prevalent systemic mycosis that affects millions of residents in
Latin America. The great medical importance of the PCM and the reduced range of drugs currently available to its
treatment lead to the search for new drugs with antifungal activity. Phenothiazines are antipsychotic drugs used
in schizophrenia treatment that have displayed antimicrobial activity against several types of microorganisms.
One phenothiazine derivative, chlorpromazine (CPZ) has not only showed ability to inhibit calmodulin, leading to
multiple cellular effects but also demonstrated activity against pathogenic fungi such as Candida albicans, Aspergillus
genus representatives and Cryptococcus neoformans. In this study we evaluate the effect of CPZ on Paracoccidioides
brasiliensis using the biochip constructed in our lab, carrying representative sequences of 4,692 genes from this
microorganism, to monitor the overall gene expression modulation promoted by this drug in sub lethal conditions.
We have shown that treatment resulted in a decrease in the rate of fungal growth in a concentration-dependent
manner. Microarray hybridization analyses with RNA samples revealed that a representative portion of the genome
was modulated as a result of the drug exposure. The analyzes of the down- or up-regulated genes may be helpful
to elucidate the mechanisms by which the drug affect different cellular processes of the fungus in respect to its
physiology and pathogenicity.
Supported by CNPq and FAEP-UMC.
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Caracterização genética de linhagens de fungos
basidiomicetos
Dias, DC1; Vilela, FC1; Nakamura, SS2; Santos, RL2; Linde, GA3; Colauto, NB3; Valle, JS3
Acadêmica de Farmácia – PIBIC/Universidade Paranaense (UNIPAR)
Acadêmico de Farmácia – PIC/UNIPAR
3
Laboratório de Biologia Molecular/UNIPAR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pleurotus, Schizophyllum, ITS, PCR-RFLP, caracterização genética
O gênero Pleurotus compreende um grupo de cogumelos ligninolíticos com propriedades medicinais e aplicações
biotecnológicas e ambientais importantes. Devido à produção de basidiomas de alta qualidade organoléptica
o cultivo de Pleurotus tem crescido nos últimos anos, sendo P. ostreatus o terceiro cogumelo mais cultivado
no mundo. Schizophyllum commune, espécie amplamente distribuída e encontrada em todos os continentes,
também apresenta propriedades ligninolíticas com potencial biotecnológico e tem chamado atenção devido a
sua capacidade em causar basidiomicoses em pacientes imunodeprimidos. As sequências de DNA que codificam
RNAs ribossomais (rRNA) têm sido utilizadas no estudo de relações taxonômicas e variabilidade genética em
fungos. Os genes rRNA nucleares de fungos estão arranjados em seqüências repetidas separadas por diferentes
espaçadores, dentre eles dois ITS (espaçadores internos transcritos), úteis na caracterização genética por serem
sequências curtas e facilmente amplificadas por PCR. Nesse trabalho empregamos a técnica de PCR-RFLP de ITS
para a caracterização genética de linhagens de P. ostreatus, P. florida e S. commune da micoteca da Universidade
Paranaense – UNIPAR. O DNA foi extraído de corpos de frutificação previamente secos e congelados. Os dois ITS
foram amplificados em uma única seqüência (ITS1-5.8S-ITS2) empregando-se os primers universais ITS1 e ITS4 (25
ng de DNA; 0,2 mM de cada primer; 1,5 U de Taq DNA polimerase; tampão 1x; 100 mM de dNTP e 1,5 mM MgCl2).
Os amplicons foram digeridos com três enzimas de restrição (EcoRI, HaeIII e HinfI) segundo recomendações do
fabricante. A PCR resultou na amplificação de um único fragmento com aproximadamente 650 pb para todas as
linhagens, o que está de acordo com os dados de sequenciamento dos ITS (GenBank) de espécies de Pleurotus
(média de 660 pb) e de S. commune (média de 650 pb). Cada enzima testada gerou dois padrões de restrição
para cada espécie, revelando dois haplótipos distintos capazes de distinguir o gênero Pleurotus de Schizophylum.
Tais marcadores moleculares podem ser úteis na identificação e caracterização de linhagens, auxiliando na
identificação taxonômica e na certificação de produtos comerciais a base desses cogumelos, linhagens para cultivo
e procedência de produtos de interesse biotecnológico. A técnica de PCR-RFLP constitui um método facilmente
aplicável e de custo relativamente baixo, permitindo uma análise rápida de sequências. Apesar das endonucleases
utilizadas terem sido suficientes na distinção dos gêneros, é fundamental que outras enzimas sejam avaliadas,
conferindo maior segurança na caracterização, além de possibilitar potencial distinção em nível de espécie.
Apoio Financeiro: UNIPAR/DEGPP/COPIC
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Uncovering endophytic colonization of the fungus
Trichoderma virens during the interaction with
sugarcane plants
Romão, AS1; Ferreira, A1; Araújo, WL2
Laboratório de Genética de Microrganismos – Departamento de Genética, ESALQ/USP
Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana, NIB, Universidade de Mogi das Cruzes
[email protected]
1
2
Palavras-chave: colonization, Trichoderma virens, endophyte, microscopy, sugarcane
Trichoderma virens has been proved to be an effective biocontrol agent against a wide range of economically
important fungal pathogens on different host plants. This species is usually considered a free-living soil saprophyte,
however, there are also reports showing this fungus can be avirulent plant symbiont contributing with plant
protection and growth promotion. Here we report the endophytic-colonization patterns of T. virens strain 223,
previously isolated from inner parts of sugarcane roots. In order to make the colonization studies T. virens was
cotransformed with GFP (gfp) gene and hygromycin B (hyg B) gene as selective marker, using Agrobacterium­­mediated transformation. After confirming the integration of the hyg B and gfp genes into T. virens genome by PCR
and Southern-blot analysis, the transformant with the most similar features to the wild type strain was selected
to carry out reisolation and microscopy studies. Reisolation assay involved inoculation of sugarcane plants with
106 spores.mL-1 and isolation of fungi after 20, 40 and 60 days, on PDA media containing the selective marker
hygromycin B. The results attested this T. virens strain is a sugarcane endophyte and is localized preferentially
in roots rather than stems and leaves. The colonization of sugarcane roots by T. virens was investigated by
epifluorescence (EM) and scanning electron microscopy (SEM). Sugarcane plants were grown on MS medium and
inoculated with T. virens 106 spores.mL-1 suspension. Plant roots were sampled up to 7 days post-inoculation and
further processed for EM and SEM observation. EM analysis revealed a dense colonization of root surfaces and
fungal penetration into intercellular spaces, which was restricted mainly to the root epidermis. SEM of entire roots
showed preferential fungal growth and migration along cell junctions. Freeze-fractured roots observed by SEM
confirmed EM results that show an intercellular fungal colonization of outer root tissues. This study demonstrated
the growth, localization and colonization of an endophytic T. virens in sugarcane, providing knowledge for further
investigations on potential roles of this fungus during symbiotic interaction with its host plant.
Financial support: FAPESP.
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Identificação de leveduras de processos
fermentativos de produção de etanol do Paraná
através de técnicas moleculares
Lopes, DD1; Andrade-Nobrega, GM2; Paccola-Meirelles, LD2
Estudante Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular,
Docente Departamento de Biologia Geral. Laboratório de Genética de Microrganismos, Departamento de Biologia Geral, Centro de
Ciências Biológicas, Campus Universitário – Universidade Estadual de Londrina.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Etanol combustível, Saccharomyces cerevisiae, leveduras industriais, leveduras contaminantes, técnicas moleculares
Leveduras são organismos amplamente encontrados na natureza que possuem grande importância econômica
por participarem de diversos processos industriais de fermentação. O gênero Saccharomyces é o mais utilizado na
indústria produtora de fermentados que tem como produto final o álcool, seja para o uso como biocombustível
ou para obtenção de bebidas alcoólicas. Linhagens de Saccharomyces cerevisiae têm sido utilizadas como inóculo
na produção de álcool combustível. No entanto, devido à facilidade de contaminação, a levedura fermentadora
propagada no inicio da safra é rapidamente substituída por leveduras selvagens contaminantes as quais são mais
adaptadas ao processo, causando decréscimo da produtividade e consideráveis prejuízos para indústria. Desta
forma, o isolamento e caracterização morfológica e genética de leveduras fermentativas industriais, são muito
importantes visto que objetivam identificar as linhagens de maior produtividade, bem como os indesejáveis
contaminantes. Durante muito tempo, a caracterização genética tem sido feita por meio de cariotipagem
eletroforética (PFGE), que permite diferenciar eficientemente as linhagens fermentadoras daqueles contaminantes.
No entanto, a técnica é demorada e demanda alto custo. Uma técnica descrita na literatura para leveduras de vinho
é o RFLP-mtDNA, que envolve a digestão do DNA mitocondrial por enzimas de restrição. Mais recentemente, a
utilização de primers baseados em regiões microssatélites vem sendo utilizados, pois permite gerar um padrão
denominado “fingerprinting” e um bom poder discriminatório. Além de rápida, por se tratar de PCR, esta técnica
não requer uma quantidade elevada de DNA como o RFLP-mtDNA. O presente trabalho teve por objetivo estudar
comparativamente as diferentes metodologias moleculares de identificação de leveduras, quanto à viabilidade
econômica, reprodutibilidade, praticidade e confiabilidade. Para isso, foram testadas e comparadas as técnicas de
pfge, amplificação do DNA cromossômico com primer (GTG)5 e digestão do DNA mitocondrial com a enzima de
restrição HinfI, aliando-as à caracterização morfológica. O DNA genômico e mitocondrial de amostras de leveduras
coletadas em usinas de álcool do Paraná foram extraídos e utilizados para as técnicas de PCR com primer (GTG)5
e na digestão com enzima de restrição HinfI, respectivamente. Em seguida, foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose. Os perfis obtidos em cada metodologia foram analisados e comparados com os obtidos em linhagens
controle, comumente utilizadas em indústria, sendo BG-1, CAT-1, SA-1 e PE-2 e dos contaminantes isolados das
amostras. Nas três técnicas foi observado polimorfismos entre as diferentes linhagens industriais na produção
de etanol e os contaminantes. Resultados obtidos demonstram que o PCR-fingerprinting e RFLP-DNAmt são tão
eficientes quanto o PFGE, técnica mais utilizada atualmente no Brasil, e que cada técnica empregada de forma
única ou combinada revela-se promissora para ser utilizada na identificação de leveduras do processo fermentativo.
Apoio Financeiro: PROPPG-UEL e CNPq.
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O uso de RAPD-PCR para análise de diversidade genética
de isolados do gênero Trichoderma spp. utilizando
Clusters genéticos gerados com software STRUCTURE 2.2
Santos, PR1; Lopes, FAC1; Ferracin, LM2; Fungaro, MHP2; Ulhoa, CJ1
Laboratório de Enzimologia – Universidade Federal de Goiás
Laboratório Genoma – Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Trichoderma spp., RAPD-PCR, STRUCTURE 2.2, Análise filogenética, Cluster
Introdução: Os fungos classificados com sendo pertencentes ao gênero Trichoderma spp. são assexuados e são
isolados de amostras de solo. A grande dificuldade na identificação/classificação de fungos está associada ao fato
de que a taxonomia deste grupo envolve classificações de taxa baseados em aspectos morfológicos, os quais são
aplicados às chaves de classificação. Além disso, fases sexuadas (teleomórficas) e assexuadas (anamórficas) de
um mesmo genótipo são classificadas com espécies distintas e apresenta capacidade singular de compartilhar
material genético, o que resulta na dificuldade de distinção dos indivíduos. Neste aspecto, técnicas moleculares
de classificação e identificação estão contribuindo de forma significativa para o entendimento das relações
filogenéticas entre as diferentes espécies de fungos. Além disso, a utilização de métodos moleculares, como o
seqüenciamento de genes conservados em um grande número de amostras é um processo dispendioso. A técnica
de RAPD-PCR é uma ferramenta muito utilizada em estudos de caracterização e discriminação genotípica em
vários organismos, que pode auxiliar análises filogenéticas quando o número amostral é grande. As diferenças entre
as seqüencias, através de polimorfismos de fragmentos de DNA, revela um padrão único, uma impressão digital
genética, que pode ser útil como identidade do isolado, permitindo assim, um agrupamento de isolados similares,
diminuindo o número de amostras de DNA e/ou isolados que serão utilizados em análises posteriores. Objetivo:
Este trabalho teve como objetivo, aplicar a técnica conhecida como RAPD (Random amplified polymorphic DNA)PCR, na tentativa de fazer o agrupamento dos isolados do gênero Trichoderma spp., levando em consideração
sua similaridade genética, diminuindo a quantidade de amostras a serem seqüenciadas para posterior análise
filogenética. Materiais e métodos: 100 isolados de Trichoderma spp., cedidos pela EMBRAPA – Arroz e Feijão – GO,
foram cultivados e do micélio liofilizado foi extraído o DNA pelo método de CTAB. O DNA foi utilizado na reação
de RAPD-PCR, utilizando os primers OPX-1, OPX-3 e OPX-13, e o produto da PCR foi submetido à eletroforese
em gel de agarose 1,5% e visualizado com brometo de etídio. A análise dos dados foi feita com o programa
STRUCTURE 2.2. Resultados e conclusão: Os isolados foram classificados de acordo com a região e/ou cidade de
onde foram retirados. Dentre os 100 isolados apresentados foi possível observar oito clusters genéticos. Como o
teste de atribuição permite uma visualização mais adequada da estrutura genética das populações em estudo,
identificando a participação de cada genótipo (isolados), em determinado cluster genotípico, foi considerado que
cada cluster correspondia a uma possível espécie. Entretanto, a confirmação dessas espécies necessita de mais
estudos, que estão em andamento.
Apoio Financeiro: FINEP, CAPES, CNPq, FUNAPE-UFG.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Potencial biotecnológico dos extratos etanólicos
de Banisteriopsis anisandra
Pádua, MS¹; Castro, AHF¹; Ricardino, J da S¹; Mendes-Costa, MC1
¹Laboratório de Pesquisa em Fungos – Centro Universitário de Lavras
[email protected]
Palavras-chave: biotecnologia, micro-organismos patogênicos, Concentração Mínima Inibitória (CMI)
Banisteriopsis anisandra Juss é uma liana pertencente à família Malpighiaceae, a qual possui distribuição
pantropical, incluindo 75 gêneros e cerca de 1.300 espécies, das quais aproximadamente 90% são neotropicais. Este
gênero é amplamente citado na literatura com relação ao seu potencial medicinal incluindo ação antiflamatória,
atividade antifebril, adstringente e outras. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial biotecnológico dos
extratos etanólicos de B. anisandra sobre micro-organismos patogênicos. Os micro-organismos utilizados foram
Sthapylococcus aureus, Cândida albicans e dois fungos filamentosos Rhizoctonia solani e Fusarium oxysporum.
Foram preparados dois extratos etanólicos nas concentrações de 25%, 50% e 100%, de folhas e fragmentos
caulinares da espécie, coletados na Reserva Biológica do UNILAVRAS-Boqueirão Ingaí/MG. Os extratos etanólicos
foram preparados com 30g de material seco e etanol a 80% sendo que o extrato II foi cozido por 10 minutos. Para
S. aureus e C. albicans foi determinada a Concentração Mínima Inibitória (CMI) testando os extratos etanólicos
nas concentrações de 20%, 15%, 10% e 5%. Foram feitas 4 repetições e os halos da bactéria foram medidos após
24 horas, da levedura por 4 dias, e os fungos filamentosos foram analisados quanto ao Índice de velocidade de
crescimento micelial durante 8 dias. Os extratos etanólicos I e II de B. anisandra mostraram atividade inibitória no
crescimento da bactéria S. aureus, sendo sua CMI de 5% utilizando o extrato etanólico I com halos de 17 mm a 24
mm, e a 10%, do extrato etanólico II com halos de 18 mm a 21 mm. Os extratos etanólicos I e II inibiram a levedura
C. albicans, obtendo um CMI de 20% para ambos os extratos, tendo o extrato I de 11,5mm a 23,5mm e o extrato II
de 15 a 20,5mm. Os fungos R. solani e F. oxysporum não apresentaram inibição pelos extratos etanólicos I e II. Este
é o primeiro relato da atividade antimicrobiana de B. anisandra e confirma a sua potencialidade para obtenção de
antibióticos e usos biotecnológicos.
Apoio Financeiro: UNILAVRAS
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Isolamento de linhagens de leveduras da
biodiversidade do solo do cerrado produtoras de
enzima amilolíticas com interesse biotécnológico
Sá, FVJ¹; Passini, MRZ¹; Zanchetta, A¹; Guerra, OG¹
¹Laboratório de Genética Molecular e Microorganismo – Departamento de Ciências Naturais – Campus de Três Lagoas – UFMS
[email protected]
Palavras-chave: biotecnologia, enzimas amiloliticas, linhagens de levedura, cerrado, amido
O grande potencial em diversas aplicações biotecnológicas e o rápido desenvolvimento científico levou ao
isolamento de um grande número de novas espécies de linhagens de levedura. Entretanto, hoje, sabe-se que a
riqueza da biodiversidade de leveduras na natureza é enorme, há mais de 700 espécies descritas e estima-se que
estas representem somente uma pequena fração (cerca de 5%) do total existente no planeta. Os microrganismos da
biodiversidade do Cerrado e sua ocorrência ainda são pouco explorados cientificamente. Este trabalho teve como
objetivo isolar e analisar linhagens de levedura dessa biodiversidade que utilizam de forma satisfatória o amido
cozido como única fonte de carbono, visando sua futura aplicabilidade biotecnológica. O amido é um polissacarídeo
amplamente distribuído na natureza que tem grande aplicação industrial, pode ser facilmente degradado por
enzimas amilolíticas produzidas por microorganismos. Atualmente, microorganismos que degradam amido
apresentam grande importância biotecnológica, tais como aplicações nas indústrias têxteis, papel e celulose, de
couro, detergentes, cervejas, bebidas destiladas, panificação, cereais, ração animal, indústria química e farmacêutica.
Foram coletados 250 g de solo em cinco pontos diferentes do Bosque da 2ª Cia de Infantaria de Três Lagoas-MS,
que consiste em um remanescente urbano de Cerrado sensu-stricto, para que ocorresse o isolamento de linhagens
de leveduras produtoras de enzimas amiloliticas. Colocou-se dez gramas de cada uma das cinco amostras de solo
separadamente em 100 ml de meio mínimo (meio S) líquido para levedura, acrescido de antibiótico, utilizando
como única fonte de carbono o amido cozido, que foi preparado numa solução em concentração de 5%, estando
numa concentração final de meio de 0,5%. Após a semeadura, as amostras foram acomodados em temperatura
ambiente e agitados manualmente em intervalos de meia em meia hora em período diurno por 120 horas. Após
incubação, transferiu-se 500 µl do sobrenadante de cada amostra para nova, estes também foram acomodados
em temperatura ambiente e agitados manualmente em intervalos de meia em meia hora em período diurno por
120 horas. Posteriormente, foram plaqueados 100 µl de cada amostra a em meio mínimo (meio S) sólido para
levedura. O plaqueamento foi feito em duplicata. As placas foram incubadas em estufa BOD a 28ºC por 15 dias.
Após o crescimento as placas foram abertas e emborcadas sobre outra contendo cristais de iodo sublimado. As
linhagens de bactérias que promoverem a degradação do amido geraram um halo incolor ao redor das colônias,
sendo que o meio de amido não degradado encontrava-se azul violeta. Houve variação no número e forma de
colônias crescidas, entretanto todas as amostras mostraram-se produtoras de enzimas amilolíticas. Podendo-se
que existem linhagens de levedura isoladas da biodiversidade do Cerrado que produziram algum tipo de enzima
amilolítica que puderam ser expressas e excretadas in vitrApoio Financeiro:UFMS
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Variabilidade endofítica associada a plantas taníferas
do cerrado brasileiro: potencial biotecnológico
Pereira, VM¹; Nascimento, MS¹; Souza, SR¹; Mendes-Costa, MC¹
¹Laboratório de Pesquisa em Fungos – Centro Universitário de Lavras-Unilavras
[email protected]
Palavras-chave: Potencial biotecnológico, fungos endofíticos, antagonismo e biodiversidade
O Cerrado é o bioma brasileiro que mais sofre ação antrópica perdendo anualmente grandes extensões, assim, a
pesquisa com espécies nele encontrado tem sua importância aumentada devido à grande quantidade de endêmicos
e à perda rápida de habitats naturais. Adicionado a isto, entre todos os produtores de substancias naturais, os
micro-organismos representam rica fonte de metabólitos ativos que atuam como antibióticos, agroquímicos,
anticancerígenos, entre outros. Técnicas biotecnológicas possibilitam o isolamento de DNA para a construção
de bibliotecas genômicas para a produção de clones com habilidade de biosintetizar produtos naturais bioativos.
Duas espécies, o pequi Caryocar brasiliense (Camb.) e o barbatimão Stryphnodendron adstringens (Mart.) produzem
tanino e têm alto valor econômico agregado, os fungos neles encontrados podem apresentar características
interessantes já que o tanino também é utilizado como antifúngico. O presente trabalho visou contribuir para o
conhecimento dos fungos endofíticos associados a pequi e barbatimão com vistas ao seu potencial biotecnológico.
Das espécies foram retiradas amostras de caule, folha, flor e fruto coletadas em cinco plantas diferentes com cinco
amostras por planta com sete fragmentos cada. Os fungos foram isolados a partir dos fragmentos colocados
em placas de Petri contendo meio de cultura BDA de 1 a 30 dias em BOD. Para o antagonismo foi utilizado o
pareamento de culturas em placas de Petri contendo BDA, onde 50 fungos foram testados separadamente com
Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Colletotrichum lindemuthianum, Candida albicans e Trichophyton
mentagrophytes em cinco repetições. A avaliação do antagonismo foi feita observando o crescimento micelial por
10 dias. Dos 1400 fragmentos retirados de todas as partes das duas plantas foram encontrados 739 fungos. Do
pequi obteve-se 347, sendo 176 de caule, 145 de folha, 23 de fruto e apenas três da flor. Do barbatimão obtevese 392, sendo 155 de caule, 114 de folha, 84 de flor e 39 de fruto. No antagonismo, os patógenos F. oxysporum, R.
solani, e T. mentagrophytes cresceram mais do que os antagonistas, não havendo interações antagônicas favoráveis
aos endófitos. Com C. lindemuthianum e C. albicans não houve interações antagônicas, porém na competição por
espaço e alimento, os endófitos foram mais efetivos. O número de isolados foi alto comparado a outros trabalhos,
mostrando que a diversidade de fungos encontrados em pequi e barbatimão é grande, podendo haver inclusive
espécies novas. Os endófitos escolhidos para os testes de antagonismo não mostraram atividade antagônica frente
aos microrganismos testes, porém, entre alguns houve uma competição favorável ao antagonista mostrando um
potencial que deve ser explorado para fins biotecnológicos.
Apoio financeiro: CNPq
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Transcription profiling of the oxidative stress response
regulon from Paracoccidioides brasiliensis
Oliveira, MV; Costa de Oliveira, RL; Nunes, LR
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Brazil
Corresponding authors: [email protected]; [email protected]
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis, microarray, quantitative PCR, oxidative stress
Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a dimorphic and thermoregulated fungus associated with the development of
paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most prevalent granulomatose systemic mycosis affecting residents of
South America, with endemic areas in Brazil, Colombia and Venezuela. To evaluate changes in gene expression
profile of this human pathogen in a genomic scale, our group has undertaken the construction of a comprehensive
P. brasiliensis biochip, carrying representative sequences from 4,692 genes from this microorganism. During
temperature-induced mycelium-to-yeast dimorphic shift monitoring, a great number of oxidative stress-response
genes displayed up-regulation at several time points of the differentiation into the yeast parasitic form of the
fungus. To further investigate these genes in P. brasiliensis, we conducted microarray hybridization analyses
with RNA samples obtained from cells incubated in the presence of ROS-generating agents, such as Paraquat®
(methyl viologen), and hydrogen peroxide (H2O2). The expression pattern of several genes (glycerol 3-phosphate
dehidrogenase, superoxide dismutase, histidine kinase) showed that the oxidative stress occurred. Some genes
like thiol-specific antioxidant and peroxiredoxin, showed an unexpected down-regulation. The tyrosine pathway,
that includes 4-HPPD enzyme, the biotin pathway and in particular the chitin synthesis, displayed up-regulation
and must be investigated as a potential targets for the development of alternative treatments against the
paracoccidioidomycosis.
Financial support: FAPESP, FAEP
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Variabilidade de produtos naturais bioativos associados
a micro-organismos endofíticos isolados de Eremanthus
erythropappus
Frias, UA¹; Carvalho, DT1; Takahashi, JA2; Mendes-Costa, MC¹
¹Laboratório de Pesquisas em Fungos – Centro Universitário de Lavras-UNILAVRAS
2
Departamento de Química – Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Potencial biotecnológico, Candeia, Leveduras
Nos últimos anos, tem aumentado o interesse na investigação de fungos endofíticos, os quais são fontes de novos
compostos bioativos. Das folhas de E. erythropappus coletadas em um candeial nativo na FLONA de Passa Quatro MG, foi isolada uma espécie leveduriforme, não identificada, (Lev1) que apresentou atividade antagonística frente
a fungos fitopatogênicos e endofíticos. O presente trabalho teve como objetivo isolar metabólitos secundários para
fins biotecnológicos a partir do fermentado da Lev 1. O endofítico Lev 1 foi cultivado em meio líquido BD. Para o
processo extrativo separou-se o corpo celular leveduriforme do meio de cultura por filtração a vácuo. A extração
dos metabólitos se deu utilizando como líquido extrator Acetato de Etila e posteriormente Butanol ambos em
funil de separação. O extrato obtido foi evaporado e o sólido obtido fracionado em coluna cromatográfica com
Hexano, Acetato de Etila, e Etanol em gradiente crescente de polaridade e a purificação das amostras se deu
através do uso de CCD (cromatografia em camada delgada). Os sólidos purificados no final foram caracterizados
em relação a seu ponto de fusão e analisados por técnicas espectrométricas de UV, IV, RMN 1H e RMN 13C. Testes
biológicos foram realizados com componentes isolados da Lev 1 frente a Coletrotrichum lindemunthianum e
Rhyzoctonia. Solani. Após o fracionamento em coluna foram obtidas 220 frações que foram agrupadas de acordo
com o resultado obtido em CCD. Destas, 5 amostras tiveram os pontos de fusão identificados como 104, 50, 61, 66,
98 e 123°C respectivamente. As mesmas foram submetidas a analises espectrométricas de RMN 1H e RMN 13C. A
característica mais marcante da Lev1 foi a sua resistência, pois mesmo depois de ter sido filtrada e o extrato ainda
passado no evaporador rotativo com a retirada do solvente ela cresceu no meio de cultura, inibindo o crescimento
do fungo C. lindemuthianum e apresentando um crescimento acima do esperado, mostrando ser o seu crescimento
induzido pela presença do fungo. Os testes fitoquímicos foram positivos para alcalóides e taninos. A espécie Lev
I isolada da Candeia é altamente resistente a solventes orgânicos, apresentando antagonismo frente a fungos
fitopatogênicos mostrando ter grande potencial biotecnológico. O próximo passo será o isolamento do DNA da
Lev1 para identificação molecular da espécie e possível aproveitamento de suas potencialidades.
Apoio financeiro: FAPEMIG e CNPq
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Eletroforese de enzimas multiloco e características de
enzimas hidrolíticas de Candida albicans isolado de
pacientes com fissuras lábio-palatais
Pinto, LHF1,2; Bassi, RC1; Lopes, JRG1; Pereira, RFR1; Barros, LM3; Boriollo, MFG1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil
3
Faculdade de Odontologia de Alfenas, Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Candida albicans, marcadores isoenzimáticos (MLEE), SAPs e PLs, cavidade bucal, fissuras lábio-palatais
As fissuras lábio-palatais são anomalias decorrentes de síndromes hereditárias determinadas por herança,
alterações cromossômicas ou fatores ambientais. Em portadores destas fissuras, mesmo após terapias de
reabilitação, pode-se observar a persistência do quadro clínico. Este fato predispõe estes pacientes ao acúmulo
de biofilme dental, principalmente na região anterior da mandíbula, favorecendo a proliferação de espécies de
Candida e outros agentes microbiológicos. Leveduras do gênero Candida compõem a microbiota bucal residente,
entretanto, sob determinadas circunstâncias, podem agir como oportunistas, provocando candidoses superficiais
ou sistêmicas. Esta é considerada a infecção fúngica mais freqüente da cavidade bucal humana, sendo C. albicans
a principal espécie relacionada. A presente pesquisa investigou a diversidade genética e o potencial de virulência
de 133 isolados bucais de C. albicans provenientes de 22 portadores de fissuras lábio-palatais, tratados no Centro
Odontológico da UNIFENAS, da cidade de Alfenas, do estado de Minas Gerais, Brasil. Espécimes bucais foram
coletados com o auxílio de swabs, inoculados diretamente em placas contendo meio de cultura Chromagar® Candida.
A identificação preliminar de isolados bucais de C. albicans e C. dubliniensis foi realizada com base na coloração
verde das colônias sobre os meios cromogênicos. De 10 a 15 colônias verdes por amostra, foram selecionadas ao
acaso e subcultivadas em meio inclinado ágar Sabouraud dextrose neutro a 37oC por 24-48h para obtenção de
culturas puras. A identidade dos isolados bucais de C. albicans foi confirmada pelos testes de crescimento de
colônias sobre o meio SDA a 42-45oC por 24-48h e ausência de produção abundante de clamidósporos sobre meio
ágar caseína a 24oC por 48h. Genótipos de 1 a 11 isolados bucais de C. albicans por paciente foram analisados por
marcadores isoenzimáticos: ADH (EC 1.1.1.1), SDH (EC 1.1.1.14), M1P (EC 1.1.1.17), MDH (EC 1.1.1.37), GDH (EC
1.1.1.47), G6PDH (EC 1.1.1.49), ASD (EC 1.4.3.x), CAT (EC 1.11.1.6), PO (EC 1.11.1.7) e LAP (EC 3.4.1.1). O potencial
de virulência in vitro, ou seja, as características de enzimas hidrolíticas de aspartil poteinases (SAPs) e fosfolipases
(PLs) foram analisadas através de procedimentos microbiológicos, a fim de determinar um potencial de virulência
in vitro. Padrões monoclonais e policlonais na colonização bucal por C. albicans nos pacientes e entre os mesmos
foram observados, sem qualquer correlação com as atividades fortemente positivas in vitro para SAPs (100% dos
isolados) e PLs (46%) ou características clínicas dos hospedeiros. Esses resultados apontam para a necessidade de
um monitoramento dessa espécie oportunista e espécies relacionadas na cavidade bucal dos pacientes portadores
de fissuras lábio-palatais, uma vez que os mesmos podem apresentar uma susceptibilidade intrínseca à colonização
bucal. Em adição, as características de virulência poderiam facilitar os processos de infecção e, consequentemente,
sua disseminação sistêmica.
Apoio financeiro: FAPEMIG e Faculdade de Odontologia de Alfenas - UNIFENAS
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Disparidade entre eletroforese de enzimas multiloco,
eletroforese em gel de campo pulsado e marcadores
microssatélites em rastreamento epidemiológicos de
Candida albicans
Boriollo, MFG1; Bassi, RC1; Souza, HMB2; Souza, SACD2; Figueira, AVO2; Barcellos, FG3; Pizzirani-Kleiner, AA4
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas, UNIFENAS, Alfenas, MG, Brasil
Laboratório de Melhoramento de Plantas, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brasil
3
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA Soja
4
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Candida albicans, rastreamento epidemiológico, MLEE, PFGE, marcadores microssatélites
A revolução em biologia molecular tem aumentado dramaticamente a capacidade dos pesquisadores para estudar inúmeras
infecções fúngicas, especialmente aquelas causadas pelo patógeno oportunista C. albicans e outras espécies de Candida.
Múltiplos sistemas moleculares encontram-se disponíveis para os propósitos científicos epidemiológicos, genéticos, evolutivos,
taxonômicos e sistemáticos, como por exemplo, MLEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis), EK (Electrophoretic Karyotyping),
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism) e Microssatélites ou SSRs
(Simple Sequence Repeats). O propósito da presente pesquisa foi avaliar a paridade entre os métodos de MLEE, PFGE e SSRs
na identificação de linhagens de C. albicans. O estudo envolveu 75 isolados bucais de C. albicans provenientes de crianças
clinicamente saudáveis. MLEE: Culturas de leveduras foram desenvolvidas em frascos contendo 50mL de meio YEPD a 37°C por
18h. Após a centrifugação e lavagem das células, as enzimas foram extraídas com água destilada gelada e pérolas de vidro usando
aparelho BeadBeater (Biospec Products, Inc.). Extratos citoplasmáticos foram separados em géis de amido a 13% (130V/4°C/
overnight), e posteriormente submetidos ao processo de revelação para 11 sistemas: ADH(EC1.1.1.1), SDH(EC1.1.1.14), M1P(EC1.1.1.17),
MDH(EC1.1.1.37), IDH(EC1.1.1.42), GDH(EC1.1.1.47), G6PDH(EC1.1.1.49), ASD(EC1.4.3.x), CAT(EC1.11.1.6), PO(EC1.11.1.7) e LAP(EC3.4.1.1). SSRs: DNA extraído,
a partir de protocolos previamente descritos para leveduras, foi quantificado por espectrofotometria (260nm). Genótipos
de três loci microssatélites foram determinados individualmente por PCR (HIS3 F5´-TGGCAAAAATGATATTCCAA-3´/R5´TACACTATGCCCCAAACACA-3´, EF3 F5´-TTTCCTCTTCCTTTCATATAGAA-3´/R5´-GGATTCACTAGCAGCAGACA-3´,
CDC3 F5´-CAGATGATTTTTTGTATGAGAAGAA-3´/R5´-CAGTCACAAGATTAAAATGTTCAAG-3´), eletroforese em gel de
poliacrilamida em tampão desnaturante (60W/42mA/1500V; 50-55°C; 90min) e procedimentos de coloração por nitrato de
prata. PFGE: Células de leveduras recém cultivadas (109 celulas/mL), tratadas previamente com solução de liticase, foram
misturadas com 1% de solução de agarose (low gelling temperature) (100mM EDTA pH 8,0, 10mM Tris-HCl pH 7,6 e 20mM
NaCl). Então, plugs de agarose foram inicialmente incubados em 5mL de 500mM sodium EDTA pH 8,0, 10mM Tris-HCl pH 7,6,
7,5% b-mercaptoethanol a 37°C por 48h, e posteriormente incubados em 6,25mL de 100mM EDTA pH 8.0, 10mM Tris-HCl pH
7.6, 20mM NaCl, 1mg de Proteinase K/mL e 1% sodium N-laurylsarcosine, a 50°C por 48h. A separação do DNA cromossômico
foi realizado através de um sistema CHEF-DRII (BioRad) (4V.cm-1/14°C/90-325s/48h/120°). Após a eletroforese, os géis foram
corados com brometo de etídio e (1mg.mL-1) e fotografados. A partir da interpretação genética (i.e., regra comumente aceita
na dedução da composição alélica de organismos diplóides) dos métodos de MLEE e SSRs, e da interpretação numérica
(i.e., presença e ausência de bandas eletroforéticas) do método de PFGE, os resultados mostraram baixa concordância na
determinação de linhagens (MLEE´SSRs: 19.7%concordância; MLEE´PFGE: 22.4%concordância; SSRs´PFGE: 19.7%concordância). Estes
resultados sugerem ambigüidade na interpretação dos resultados de genotipagem de isolados de C. albicans em estudos
de rastreamento empregando os três métodos, separadamente. Por outro lado, o emprego desses resultados em associação
poderia fornecer dados mais consistentes na determinação dessas linhagens.
Apoio financeiro: ESALQ/USP, CENA/USP e UNIFENAS
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Análise da diversidade genética de Puccinia psidii
Winter baseado na técnica de PCR
Fernandes, MA1,3; Otto, JCS1; Bortoloto, TM1; Furtado, EL2,3; Marino, CL1
Departamento de Genética, IB, UNESP-Botucatu, SP
Departamento de Defesa Fitossanitária, FCA, UNESP-Botucatu, SP
3
Bolsistas CNPq
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ferrugem das Mirtáceas, Puccinia psidii, RAPD, reações de PCR e variabilidade
A ferrugem nas Mirtáceas é causada pelo fungo Puccinia psidii e consiste num grande problema para o plantio
de diversas espécies, em várias regiões brasileiras. O conhecimento da existência de polimorfismo molecular
entre diferentes cepas da espécie de P. psidii é uma estratégia interessante para entender como a planta responde
aos diferentes patógenos, sendo assim, o desenvolvimento de ferramentas que permitam o conhecimento da
variabilidade deste patógeno é importante para o melhoramento de plantas resistentes. Este trabalho teve como
objetivo avaliar a variabilidade molecular do fungo P. psidii através do uso de marcadores moleculares do tipo RAPD
(Randon Amplified Polymorfic DNA), baseado na técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction). Foram coletadas
folhas infectadas em árvores de jambo (Syzygium jambus) e eucalipto (Eucalyptus grandis) e extraídos uredósporos
do fungo em 13 pústulas de jambo e oito pústulas de eucalipto, separadamente, ao acaso. Extraiu-se o DNA com
a resina Chelex®. As reações de PCR foram realizadas com quatro primers RAPD (Operon®) pertencentes aos kits
OPH, OPM, OPX. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, e foi construída uma
matriz com base na presença (1) ou ausência (0) das bandas. A análise de diversidade e distância genética foram
realizadas com o software PopGene 1.32, foi gerado um dendograma com base na análise de UPGMA baseado
em matriz de distância genética de Nei, 1978. Dos primers analisados foram encontradas 29 marcas polimórficas,
variando de três marcas (OPH-03) a nove marcas (OPM-10 e OPX-06). Como resultado preliminar, observou-se pela
análise do dendograma que foi gerado dois grandes grupo, o primeiro contendo os indivíduos de jambo e segundo
contendo os indivíduos do eucalipto, onde a maior distância encontrada entre o primeiro grupo foi de 0,2916 e no
segundo foi de 0,2669. A maior distância gerada pelo dendograma foi de 0,3412.
Apoio Financeiro: CNPq
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Amino acids alterations in Lanosterol 14-alpha
Demethylase (ERG11) related to fluconazole resistance
in sequential clinical isolates of Cryptococcus
neoformans and one Isolate of animal origin from
psittacine birds of Cryptococcus gattii
Rossi, SA¹; Matsumoto, MT1; Benaducci, T¹; Oliveira, HC¹; Derossi, AP³; Oliveira, RMZ³; Raso, TF²;
Mendes Giannini, MJS¹; Fusco-Almeida, AM1
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP – Araraquara – SP – Brazil
² Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP – Jaboticabal – SP – Brazil
³ Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ – Rio de Janeiro – RJ – Brazil
[email protected]
1
Keywords: Cryptococcus neoformans; Cryptococcus gattii; Resistance; 14-alpha Demethylase; Fluconazole; Psittacine
Cryptococcus neoformans is encapsulated yeast, agent of cryptococcosis that can affect immunocompetent and
especially immunocompromised hosts. The molecular typing of the agent is very important to know the genetic
types related to the resistance phenotypes. The objective of this study was to analyze the ERG11 gene present in
the serial isolates recovered from one patient with elevated MIC (Minimum Inhibitory Concentration) values for
fluconazole. To achieve this objective, four sequential clinical isolates of C. neoformans (isolates 26, 27, 28 and 30)
from one patient from Rio de Janeiro State were selected. All the isolates were previously tested against antifungal
drugs fluconazole, itraconazole, 5-flucytosine and amphotericin-B by microdilution test using standard methods
(NCCLS) M27A-2 with modifications. The MIC values were 2, 16, 16 and 64 µg/ml, respectively. The molecular
typing was made for all isolates, using the RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) method, with initial
sequence 6 properly chosen and tested, and all isolates presented identical profiles. The first and the fourth
isolates (susceptible and resistant) were selected to analyze mutation points at the ERG11 gene sequence through
sequencing of amplified products using primers designed from the gene sequence. The ERG11 gene sequence of
the isolate 30 (resistant) showed significant points of mutation when aligned with the sequence of the isolate 26
(susceptible) and the reference gene. The sequence of the translated protein Lanosterol 14-alpha Demethylase of
the isolate 30 (resistant) also showed amino acids changes when aligned with the sequence of the isolate 26 and
the reference gene. Generally, these mutations were located close to the conformational regions in form of helix
and loops. Our results suggested that the amino acids substitutions that occurred at the interaction sites of the
protein may have caused structural modifications and consequently the fit of the protein with the active portion
of fluconazole.
Financial support: CNPq, FAPESP, CAPES and PADC
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88
Isolation and caracterization of recombinant 14-33 protein of Paracoccidioides brasiliensis related to
adhesion and invasion of human epithelial cells
Silva,JF1; Matsumoto, MT1; Fusco-Almeida, MA1; Soares, CMA2; Mendes Giannini, MJS1
Depto de Análises Clínicas – FCFAr – UNESP, Araraquara/SP
Laboratório de Biologia Molecular, UFG, Goiânia/GO
[email protected]
1
2
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis, adhesins, 14-3-3 proteins
Paracoccidiodes brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), is a dimorphic fungus, which
develops a mycelial form at room temperature and multiple-budding yeast in the infected host or in culture at 37ºC.
Microbial virulence is a set of mechanisms that enable the infectious agent to penetrate the host protection barriers
and then survive against the defense mechanisms, multiply and cause disease. Several virulence mechanisms
are involved in this disease. The 14-3-3 proteins are a family of conserved regulatory molecules expressed in all
eukaryotic cells. As intrinsic feature of the 14-3-3 proteins is their ability to bind a variety of functionally diverse
signaling proteins, including kinases, phosphatases and transmembrane receptors. This plurality of interacting
proteins allows 14-3-3 to play important roles in a wide range of vital regulatory processes, such as mitogenic signal
transduction, apoptotic cell death and cell cycle control. Our group is involved in the study of proteins related to
eukaryotic cells P.brasiliensis adhesion and invasion. Then, we isolated an adhesin that binding to laminin and it
was characterized as a protein 14-3-3. After amplification of P. brasiliensis cDNA by PCR, the fragment of 798pb
was cloned into the expression vector pET32a. E. coli strain DH10B were transformed with the recombinant vector
and the expression of 14-3-3 recombinant protein was induced by adding 0,4mM of IPTG in liquid cultures. After
induction, a GST-14-3-3 protein of 59kDa was detected by SDS-PAGE. The identity of GST-14-3-3 protein was
confirmed by immunoblot. The investigation are in process to verify the P. brasiliensis localization of the 14-3-3
protein in the fungal cell and in the interaction process with epithelial cells, beyond elucidating the role of this
protein as modulating of the signaling events of P. brasiliensis invasion process to the epithelial cells.
Supported by: FAPESP, CNPq, CAPES, PADC-FCF
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Isolamento e identificação de Colletotrichum spp
endofíticos de plantas da vegetação espontânea em
pomares cítricos
Bini, PA1; Waculicz-Andrade, CE1; Adamoski, D1; Kava-Cordeiro, V1; Galli-Terasawa, Lv1; Spósito, M2;
Glienke, C1
Laboratório de Genética de Microrganismos - Departamento de Genética - UFPR
Fundo de Defesa da Citricultura
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endofítico, vegetação espontânea, Colletotrichum spp, Queda Prematura dos Frutos Cítricos e PCR
A “Queda Prematura dos Frutos Cítricos” (QPFC) é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum acutatum
(Simmonds) que ocorre nos trópicos e subtrópicos úmidos das Américas. No Brasil, atualmente, está presente nos
Estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Bahia, Minas Gerais, Goiás e Amazonas. O presente trabalho teve
por objetivo verificar a possibilidade de plantas da vegetação espontânea em sistemas de produção de citros no
Paraná abrigarem o fungo C. acutatum como endofítico, e assim constituir-se em fonte de inóculo do patógeno.
Foram investigadas 22 espécies vegetais: Agriãozinho (Synedrellopsis grisebachii), Apaga-Fogo (Alternanthera
tenella), Beldroega (Portulaca oleracea), Bosta de Banana (Tibet, Carrapicho) (Cenchrus echinatus), Brachiária
(Brachiaria sp), Buva (Conyza bonariensis), Capim Colchão (Digitaria horizontalis), Capim Margoso (Digitaria
insularis), Capim Sempre-Verde (Panicum maximum variedade Gongyloides var.), Carrapicho Arroz Bugre, Caruru
(Amaranthus deflexus), Capim Coloninho (Echinochloa colonum (L.) Link), Erva de Santa Luzia (Chamaesyce
hirta), Falsa Serralha (Emilia sonchifolia), Capim Favorito (Rhynchelytrum repens), Guanxuma (Sida rhombifolia),
Maria Pretinha (Solanum americanum Mill), Pé-de-Galinha (Eleusine indica), Picão Preto (Bidens pilosa), Poaia
(Cephaelis ipecacuanha A. Richard), Trapoeraba (Commelina benghalensis) e Vassoura (Sida sp.). Foram realizados
5 isolamentos, sendo obtidos 70 isolados de Colletotrichum spp. Os isolados foram avaliados quanto as suas
características macroscópicas e microscópicas após crescimento de microcultivo em meio BDA a 28°. Os isolados
foram identificados em nível de espécie por meio de PCR utilizando os pares de primers CaInt/ITS4, CgInt/ITS4 e
Col1/ITS4 específicos para as espécies C. acutatum C. gloeosporioides e C. boninense respectivamente.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq
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Identification of genes related with micronutrients
depletion associated on binding of Paracoccidioides
brasiliensis to type I collagen
Oliveira, HC1; Matsumoto, MT1; Peres da Silva, R1; Silva, JF1; Rossi, SA1; Fusco-Almeida, AM1;
Soares, CMA2; Mendes Giannini, MJS1
Depto de Análises Clínicas – FCFAr – UNESP, Araraquara/SP; 2Laboratório de Biologia Molecular, UFGO, Goiânia/GO
[email protected]
1
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis; Micronutrients depletion; Host-patogen interection; Representational Differential Analysis
Paracoccidioides brasiliensis is an ascomycota fungal human pathogen and its infection may cause
paracoccidioidomycosis, the most widespread systemic mycosis in Latin America. The capacity of this fungal to
provoke human illness and to cause mycosis depends probably on factors such as: fungal virulence, its ability to
interacting with the host superficial structures, invading them and on the host immunological response. One of
the strategies used by the pathogen may be the expression of genes related to its microniche, involving adaptation
to the conditions of the host, which may also be related to the uptake of micronutrients. The aim of this study was
to investigate the effect of micronutrients depletion in the interaction of P. brasiliensis to type I collagen by RDA
(representational differential analysis) assay. For this, we cultured the fungus in a chemically defined media (MVM)
with depletion of iron, cooper and zinc. After, the fungus was put at contact with the type I collagen and evaluated
by flow cytometry. An increase of binding to type I collagen was observed when the fungal was cultured without
copper. RDA assay was developed to demonstrate the genes involved in this process. Two hybridizations were
performed in the proportions of 1:10 and 1:100 of tester and driver respectively, with an excess of driver to remove the
identical sequences in both conditions. The differentially expressed products were amplified, resulting in distinct
patterns that were sequenced revealing genes involved in the P. brasiliensis binding process to type I Collagen. This
way, enlarging these data, it’s very important for better understanding of genes role in the pathogenicity.
Supported by: FAPESP, CNPq/FINEP and CAPES.
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Functional analysis of protein kinase C in Aspergillus nidulans
Barreiro, ACC1, 2; Almeida, RS2; Goldman, MH3; Goldman, GH2
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2 Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto and 3Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil
[email protected]
1
Keywords: Aspergillus nidulans, protein kinase C, calcineurin and calcium signal transduction
The multicellular fungus Aspegillus nidulans is an excellent model for the study of a wide array of biological
processes. This microorganism is easily manipulated using classical and molecular genetics, what makes it a
powerful tool in understanding fundamental biological principles and for biotechnology and industrial applications,
as well as human, animal and plant fungal pathogenesis. Signal transduction is essential for the translation of
environmental cues to appropriate physiological and biochemical responses. For example, an apropriated response
to environmental calcium concentrations is important for several cellular processes, including fertilization and
development, muscle contraction, cell division, differentiation, programmed cell death and chromatin remodeling
in multicellular eukaryotes. Among cellular components involved in such regulation are the Ca2+/calmodulindependent phosphatase (calcineurin) and the protein kinase C (PKC). A. nidulans genome contains two putative
PKCs: (1) PkcA, which is essential to its viability, shows all the architectural features of fungal PKCs and (2) PkcB
lacks some of the characteristic features of PKCs and its role in cellular regulation remains unknown. In contrast
to mamalian PKCs, this protein is suggested to be not regulated by calcium in A. nidulans, making crucial the study
and understanding of such unknown regulation. To analyze the hipothesis of a calcium-independent regulation,
we investigated the phenotype of pkcA overexpression upon different genetic backgrounds using a conditional
A. nidulans mutant strain (alcA::pkcA ΔcnaA). The lack of calcineurin causes severe defects in growth extension,
branching and conidial architecture, whereas the overexpression of pkcA gene was able to reduce the intensity of
those phenotypes, suggesting a compensatory effect of protein kinase C pathway towards the signal transduction
regulated by calcineurin. Moreover, to clarify the role of the second protein kinase C (PkcB) in this filamentous
fungus, we produced a pkcB null mutant strain. Although the lack of PkcB was not lethal, the mutant strain showed
severe growth defects and absence of conidiation. In summary, our results showed a genetic interaction between
the pathways of calcineurin and protein kinase C and demonstrated for the first time the importance of the
presence of a second protein kinase C in A.n idulans.
Financial support: FAPESP and CNPq, Brazil, and John Simon Guggenheim Foundation, USA.
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92
Caracterização de isolados de Mycosphaerela fijiensis
por meio de ERIC-PCR
Paixão, RDV1; Souza, A1; Gasparotto, L2; Hanada, RE3; Sousa, NR1; Silva, GF1
Laboratório de Biologia Molecular - Embrapa Amazônia Ocidental
Laboratório de Fitopatologia - Embrapa Amazônia Ocidental
3
INPA - Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sigatoka-negra, ERIC-PCR, diversidade, fitopatógeno, Mycosphaerella fijiensis
A banana é uma das frutas mais consumidas a nível mundial e sua exploração ocorre na maioria dos países
tropicais e subtropicais, destacando-se o Brasil. Das doenças da bananeira destaca-se a Sigatoka-Negra, que é
causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis, e sua detecção ocorreu no Brasil em meados de 90. Os sintomas da
doença caracterizam-se principalmente por despigmentações da folha, ocasionando perda de área fotossintética
e consequentemente baixo desenvolvimento das plantas. O estudo da diversidade por meio de marcadores
moleculares, juntamente com a busca de estratégias para o controle da doença é a forma mais econômica e
ambientalmente correta. O marcador molecular baseado na amplificação de repetições intergênicas denominado
ERIC-PCR- Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus tem sido usado em fungos para subsidiar a definição
de metodologias de avaliação de doenças por meio da obtenção de fingerprints e na análise da variabilidade do
patógeno. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial da técnica de ERIC-PCR para a caracterização da
diversidade de isolados de M. fijiensis. Foram analisados 19 isolados provenientes de quatro regiões diferentes do
Estado do Amazonas. As reações de PCR foram realizadas em volume final de 20µL, contendo 0,8 mM de dNTP, 0,5
µM dos primers ERIC1R e ERIC2, 2 mM de MgCl2, 50ng de DNA e 1 U de Taq Polymerase. A amplificação seguiu o
programa: 94°C por 3 min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 1 min, 52°C por 1 min, 65°C por 8 min e uma extensão
final de 65°C por 10 min, os fragmentos foram separados em gel de agarose 1,5%. Foram obtidas 23 bandas todas
polimórficas com tamanhos entre <100 a 3000 pares de base. Os valores da similaridade genética estimada pelo
coeficiente Jaccard, variaram de 0,09 a 1. O presente estudo mostrou pela primeira vez que o marcador ERIC-PCR
pode ser considerado uma ferramenta valiosa para caracterização da população de M.fijiensis.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAM
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Caracterização das proteínas PalA E PalB relacionadas
a via de sinalização por pH em Mycosphaerella fijiensis
Queiroz, CB1; Pereira, ELS1; Sousa, NR1; Gaparotto, L2; Hanada, RE3; Silva, GF1
Laboratório de Biologia Molecular - Embrapa Amazônia Ocidental
Laboratório de Fitopatologia - Embrapa Amazônia Ocidental
3
Institudo Nacional de Pesquisa do Amazonas - INPA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: transdução de sinal, gene Pal, PacC, pH e sigatoka-negra
A bananicultura tem enfrentado mundialmente vários problemas fitossanitários, entre os quais destaca-se a sigatokanegra causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis Morelet, considerado atualmente o patógeno mais danoso aos
plantios de banana e plátanos. O pH é um importante componente fisiológico relacionado à patogenicidade em
muitos fungos e tem sido foco de estudos para o desenvolvimento de formas de controle em plantas cultivadas. O
sistema de sinalização por pH em fungos é codificado por seis genes, palA, palB, palC, palF, palH e palI. A proteína
PalA é caracterizada pelo domínio BRO1 que interage com proteínas do ESCRT (Endosomal Sorting Complex
Required of Transport) e está associado ao recrutamento do fator de transcrição PacC para clivagem proteolítica
por PalB. A transdução de sinal mediada por pH culmina na clivagem do fator de transcrição PacC um ativador de
genes expressos em pH alcalino e repressor de genes expressos em pH ácido. Em M. fijiensis os genes que codificam
o fator de transcrição pacC e as seis proteínas Pal foram identificados (Queiroz et al 2009). O presente trabalho tem
como objetivo caracterizar as proteínas PalA e PalB de M. fijiensis. As proteínas deduzidas foram alinhadas com o
auxilio do programa ClustalX e análise filogenética usando o MEGA 4.2. PalA e PalB, possuem ORFs de 2569 e 2806
pb ambas interrompida por 2 íntrons e a proteína deduzida apresentam respectivamente 823, 882 aminoácidos.
PalBMf apresenta três domínios conservados MIT, Calpain Like Protease, Calpain III, nas posição 17 a 73, 121 a
444, 607 a 735 respectivamente. O alinhamento de 25 sequências de PalB de diferentes espécies mostram que os
resíduos relacionados ao sítio ativo Cys214, His382 e Asn402 estão conservados. A análise filogenética da proteína
PalBMf agrupou os ascomicetos por ordem, família ou gênero, enquanto o homólogo Calpain 7 em vertebrados
formou um único cluster. Em PalAMf o domínio BRO1 foi localizado entre os resíduos 5 e 376. A análise filogenética
agrupou os fungos filamentosos por ordem ou gênero e o homólogo Alix por filo entre os metazoários. Os dados
analisados indicam que em M. fijiensis os genes palB e palA codificam proteínas ativas. Análises preliminares do
crescimento de M. fijiensis em diferentes pHs tem revelado a habilidade deste patógeno em alterar o pH durante o
cultivo para valores acima de 8,0 independente do pH inicial, isto sugere que o fator de transcrição pacC pode está
relacionado com a virulência neste patosistema.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Análise da expressão gênica através de PCR em tempo
real da enzima álcool desidrogenase em linhagens
industriais da levedura Dekkera bruxellensis
Liberal, ATS; Morais Jr, MA
Laboratório de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética, UFPE
[email protected]
Palavras-chave: Fermentação alcoólica, Dekkera bruxellensis, ADH
A levedura Dekkera bruxellensis é a principal contaminante de diversos processos fermentativos, inclusive na
fermentação das destilarias de álcool combustível. Nosso grupo de pesquisa vem identificando e analisando genes
responsáveis pelas vias do metabolismo central e genes relacionados com a adaptação dessa levedura ao processo
industrial a partir do banco de dados do seqüenciamento desta levedura. Identificamos recentemente dois genes
na D. bruxellensis, ADH3Db e ADH7Db ambos relacionados ao gene ADH que codifica enzimas da família álcool
desidrogenase, enzima que catalisa a conversão de acetaldeído a etanol na última etapa da via do metabolismo
fermentativo. O objetivo deste trabalho foi o de analisar a expressão gênica dos dois genes ADH identificados na
D. bruxellensis, através da PCR em tempo real. Foram utilizadas duas linhagens da levedura D. bruxellensis: a 248,
isolada da fermentação alcoólica, e a CBS 74, isolada da fermentação de cerveja. Estas leveduras foram inoculadas
em meio Yeast Nitrogen Base (YNB) com glicose 2% a 37ºC. Foram coletadas alíquotas do cultivo em 0,1DO e 1DO
de concentração celular, que foram submetidas à extração de RNA (Kit Total RNA isolation – NucleoSpin RNA II). A
partir do RNA extraído foi sintetizado o cDNA (kit ImProm-II™ Reverse Transcription System Promega II). Os ensaios
de PCR em Tempo Real foram realizados na plataforma ABI Prism 7300 Applied Biosystems (kit SYBR Green PCR
Master Mix). A expressão dos genes ADHDb sempre foi maior ao ser atingida 1DO de crescimento celular, sendo
que, a linhagem 248 apresentou maior expressão do gene ADH7Db enquanto a linhagem CBS 74 apresentou maior
expressão do gene ADH3Db. O gene ADH7Db apresentou quatro vezes mais expressão na linhagem 248 que na CBS
74; enquanto que o gene ADH3Db apresentou quinze vezes mais expressão na linhagem CBS 74 quando comparada
à linhagem 248. Por serem linhagens de D. bruxellensis isoladas de processos fermentativos diferentes é esperado
diferenças na expressão gênica. Esta diferença ocorre devido ao metabolismo diferenciado que é necessário em
cada processo fermentativo específico e que podem estar relacionadas ao momento ou a intensidade da expressão.
O gene ADH7 está mais relacionado à síntese de álcool e tolerância ao aldeído, como a linhagem 248 foi isolada
da produção de álcool, apresenta maior resposta ao seu meio utilizando esse gene. Entretanto a linhagem CBS
74 foi isolada da fermentação de cerveja, tendo assim maior expressão do gene ADH3 que está relacionado à
fermentação/respiração do metabolismo fermentativo. A análise de expressão dos dois genes permitiu verificar as
diferenças nos dois momentos metabólicos estudados entre as duas linhagens de D. bruxellensis.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes
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Análise da expressão gênica da sintase da quitina
(MpCHS), das quitinases (MpCHIT1 e MpCHIT2) e
do gene de autofagia (MpATG8) de moniliophthora
perniciosa em sistema artificial (bolachas)
Gomes, DS1; Dias, CV1; Pires, ABL1; Lopes, MA1,2; Cascardo, JCM1; Góes-Neto, A2; Micheli, F1,3
Laboratório de Genômica e Expressão Gênica, DCB, Universidade Estadual de Santa Cruz, Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16, 45650-000
Ilhéus-BA, Brasil. 2Laboratório de Pesquisa em Microbiologia, DCBio, Universidade Estadual de Feira de Santana, Km 3, BR 116 (norte),
44031-460 Feira de Santana-BA, Brasil. 3UMR DAP, Cirad, Avenue Agropolis TA80/02, 34398 Montpellier cedex 5, France
1
Palavras-chave: quitinases, sintases da quitina, autofagia, expressão gênica e PCR em tempo real
O Moniliophthora perniciosa é o agente causador da doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Desde que se instalou
na região sul da Bahia provocou drástica redução na produção do cacau, ocasionando uma grave crise econômica,
social e ecológica. A análise da expressão gênica da sintase da quitina (MpCHS), das quitinases (MpCHIT1,
MpCHIT2) e do gene de autofagia (MpATG8) durante as fases do desenvolvimento do fungo Moniliophthora
perniciosa realizada através da técnica de PCR em tempo real, pode servir de base para compreensão da biologia
do fitopatógeno. Os resultados obtidos sugerem a participação dos genes MpCHS, MpCHIT1, MpCHIT2 e MpATG8
nos processos de diferenciação, morfologia e desenvolvimento do fungo M. perniciosa. O MpCHS apresenta uma
alta expressão na fase rosa escuro sugerindo participação na formação dos nós hifais e das ramificações, que
correspondem ao primeiro sinal de formação do corpo de frutificação. Os genes de quitinases apresentam perfis de
expressão diferentes nas fases do desenvolvimento do M. perniciosa. O MpCHIT1 apresentou uma maior expressão
no basidioma sugerindo a sua participação nos processos de maturação e morfologia do corpo de frutificação.
Os resultados da expressão do MpCHIT2 sugerem o envolvimento nos processos de diferenciação dos tecidos e
morfologia do primórdio. As expressões de MpCHIT2 e MpATG8 são diretamente correlacionadas, sugerindo a
participação de MpCHIT2 no processo de autofagia do M. perniciosa. O estudo da expressão dos genes MpCHS,
MpCHIT1, MpCHIT2 e MpATG8 foi de fundamental importância para compreensão do papel funcional destes
genes durante o desenvolvimento do M. perniciosa.Apoio financeiro: CAPES, CNPq, BNB, FAPESB
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Standardization of a one-step real-time RT-PCR SYBR
Green I-based for mayaro virus infection diagnosis
Maia, FGM; Figueiredo, LTM
Virology Research Center - Faculty of Medicine of Ribeirão Preto - University of São Paulo - Brazil
[email protected]
Keywords: Arbovirus, Mayaro, Diagnosis, RT-PCR, SYBR Green I
Mayaro fever is among the five most common diseases caused by arthropod-borne viruses (arbovirus) in Brazil.
Mayaro virus (MAYV), which is a member of the genus Alphavirus of the family Togaviridae, is the causative
agent of a febrile illness and arthralgia syndrome in humans at the Amazon region. The genome of these viruses
is composed of a single-stranded positive-sense RNA. Most human Alphavirus infections produce non-specific
clinical symptoms that are similar to those caused by other arboviruses such as Oropouche or Dengue. An early
and specific diagnosis of Mayaro fever is important for appropriate treatment and epidemiological surveillance.
Thus, a rapid, reliable and feasible laboratory technique is absolutely necessary. The reverse-transcriptase
polymerase chain reaction (RT-PCR) is becoming the most used tool for viral infection diagnosis due to
characteristics like time saving, low cost, sensitivity and specificity. The one-step real-time RT-PCR SYBR Green
I-based can be even more efficient and also has the capability of viral load quantitation, which provides valuable
data for research and disease follow up. Here we describe the initial steps for development of this technique.
MAYV (strain BeAr 20290) was propagated in Aedes albopictus C6/36 cell culture. Viral RNA was extracted using
QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, USA) according to manufacturer´s instructions yielding a 60mL final
volume. RT-PCR was performed using cM3W (ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC) a genus-specific
reverse primer and nMAY (GGAAGTTGGCCAAGGC) a specie-specific inner forward primer, which anneals
to the non-structural protein 1 gene; SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen
Corp.); and the SmartCycler (Cepheid, Inc) real-time termocycler. The fluorescence threshold was reached in
just 20 cycles and there was no unspecific amplification. The 270 base pair amplicon showed an expected high
temperature of melting (Tm) of 85,9oC. The primers and protocol with SYBR Green I- based real-time RT-PCR
showed to be suitable for MAYV diagnosis. The next step is to determine sensitivity, standard curve, specificity
and to validate it by testing patients samples.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
97
Avaliação da hipótese de ligação cultural entre
as epidemias de HIV-1C na América do Sul e no
Moçambique
Fontella, R1; Soares, MA1,2; Schrago, CG1
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Genética – CPQ, Instituto Nacional de Câncer
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Brasil, HIV-1, Moçambique, filogeografia, América do Sul, subtipo C
Análises filogenéticas indicaram que epidemia do subtipo C do HIV-1 na America do Sul teve como origem a
introdução única de uma população viral proveniente do Leste Africano (Burundi ou Quênia). Essa população
viral provavelmente entrou no continente através da região sul do Brasil, onde a prevalência do HIV-1C é maior.
Recentemente, foi sugerido que fatores históricos e culturais poderiam elucidar com mais precisão a origem do
subtipo C sul-americano, pois existiria uma ligação entre entrada do HIV-1C na América do Sul com a migração
para o Brasil de refugiados de Moçambique durante o período de guerra civil desse país (1975-1980). A hipótese
de origem Moçambicana do HIV-1C sul-americano implicaria na afinidade filogenética entre as sequências desse
país e o clado sul-americano. Para avaliar essa hipótese, analisamos sequências do gene pol provenientes de
Moçambique, Portugal e Brasil, além de uma amostragem randômica de sequências de outras regiões geográficas.
A seleção foi feita buscando a maior diversidade genética e amplitude de data de amostragem possíveis. As
reconstruções filogenéticas foram realizadas utilizando o método de máxima verossimilhança implementado no
programa PhyML 3.0 com o modelo de substituição GTR+I+G e com avaliação da credibilidade estatística dos
clados através do teste aLRT. A filogenia obtida demonstrou que as amostras moçambicanas se apresentaram
espalhadas por toda a árvore. Amostras da Índia e de Portugal formaram dois grupos monofiléticos, bem como as
sequências sul-americanas, que obtiveram um valor de suporte de aLRT de 90. Como demonstrado anteriormente,
amostras de Burundi e do Quênia foram as mais proximamente relacionadas como o clado sul-americano. A
hipótese de origem da epidemia de HIV-1C brasileira estar relacionada à migração de refugiados de Moçambique
não foi suportada por análises filogenéticas. Apesar da identificação da localização geográfica exata da população
ancestral que originou o HIV-1C sul-americano ser difícil, a hipótese de associação cultural entre as epidemias de
HIV-1C na América do Sul e Moçambique é bastante improvável.
Apoio financeiro: CAPES, Faperj, CNPq
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Avaliação de mutações de resistência e polimorfismos
do HIV-1 em pacientes não usuários de antiretrovirais
Junqueira, DM1,2; Medeiros, RM2; Matte, MCC2; Almeida, SEM2
¹Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Genética – UFRGS 2Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde
FEPPS – Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CDCT 3Sanatório Partenon – Porto Alegre/RS
[email protected]
Palavras-chave: HIV-1, mutações, resistência, polimorfismos, antiretroviral
As mutações de resistência aos medicamentos anti-retrovirais são um grande obstáculo no tratamento de
pacientes HIV-positivos, pois afetam a eficácia dos regimes terapêuticos. A avaliação dessas mutações em vírus
de pacientes não tratados é fundamental para a compreensão da dinâmica viral. Desta forma, o objetivo deste
estudo foi avaliar a prevalência de mutações de resistência e polimorfismos nos genes virais da protease (PT) e da
transcriptase reversa (TR) em pacientes naïve na população de Porto Alegre. Noventa e nove amostras de sangue
de pacientes HIV-positivos, que não iniciaram a terapia anti-retroviral, foram coletadas entre os anos de 2005 e
2007. Os genes da PT e TR foram amplificados através de nestedPCR, seqüenciados e subtipados através de análises
filogenéticas. A identificação de mutações e polimorfismos no genoma viral foi realizada no HIV Drug Resistance
Database of Stanford University. Das amostras analisadas, duas apresentaram mutações relacionadas à resistência
aos inibidores de protease (PI), quatro aos inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (NRTI) e
três aos inibidores de transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (NNRTI). Quinze seqüências exibiram
mutações incomuns, em códons onde, previamente, foram relatadas mutações de resistência. Noventa e seis
seqüências virais (96%) mostraram polimorfismos comuns usualmente relacionados a pacientes sob tratamento
com PI, entre eles, dois foram significativamente frequentes: I93L[53/99(53,3%)] e L63P[35/99(35,3%)]. Do total
de amostras analisadas, 9,1% exibiram mutações de resistência. Este valor revela um aumento significativo da
frequência destas mutações quando comparado com trabalhos anteriores realizados na região onde a prevalência
atinge 3%. Além disso, estes valores encontram-se acima da média nacional que chega a 6%. Investigações futuras
são necessárias para entender o papel dos polimorfismos virais na resistência às drogas.
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Diversidade genética do Papiloma Vírus Humano (HPV) em
amostras cervicais de mulheres do Rio de Janeiro, Brasil
Lordello, CX1,2; Oliveira-Silva, M3; Zardo, LMG2; Bonvicino, CR2,3; Moreira, MAM2
Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto Nacional de Câncer (INCA)
3
Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Papiloma Vírus Humano, diversidade genética, gene L1, amostras cervicais, Nested PCR
O câncer de colo de útero é o segundo tipo de câncer mais comum entre mulheres no Brasil. O principal fator de
risco para o desenvolvimento do câncer cervical é a infecção por Papiloma Vírus Humano (HPV), classificado na
família Papillomaviridae. O,gênero Alphapapillomavirus inclui.cepas associadas a lesões em mucosa, classificadas
em alto ou baixo-risco de acordo com o potencial oncogênico. Os tipos de baixo-risco são geralmente encontrados
em lesões genitais externas ou lesões cervicais benignas, enquanto os de alto-risco estão frequentemente
associados a displasias de alto grau e carcinomas. Este estudo propõe analisar a diversidade genética de amostras
cervicais positivas para HPV, pela técnica de Captura-Híbrida, com o objetivo de caracterizar os genótipos de HPV
circulantes no estado do Rio de Janeiro. O DNA de 323 amostras de secreção cervical, coletadas com swab, foi
isolado. Os iniciadores utilizados para amplificação de uma região do gene L1 do capsídeo viral, por Nested PCR,
foram MY09/11 e GP05/06. O fragmento de 140pb, obtido na segunda etapa, foi amplificado em 132 amostras, que
foram submetidas à reação de sequenciamento utilizando a Plataforma de Sequenciamento de DNA – PDTIS/
FIOCRUZ. Noventa e três seqüências foram obtidas e analisadas filogeneticamente pelo método de Neighbor-Joining
e modelo Kimura-2-parâmetros. Os iniciadores específicos TS18 e HPV16-V1/V2 foram também utilizados visando
à detecção com maior sensibilidade dos HPV18 e HPV16, principais tipos virais associado ao câncer cervical. Neste
estudo, os tipos virais prevalentes foram HPV16 (22,9%), HPV18 (10,4%), HPV58 (9,38%), HPV66 (6,25%) e HPV45
(6,25%). Adicionalmente, duas amostras indicaram a ocorrência de co-infecção: uma agrupou-se com HPV83,
HPV52 e HPV16, e a outra amostra agrupou-se com os HPV16 e HPV66. Todas as suspeitas de infecções múltiplas
serão confirmadas através de clonagem. No presente estudo, reportamos uma alta variabilidade de tipos de HPV
no Rio de Janeiro, além dos incluídos nas vacinas comerciais, alertando para a necessidade de mais estudos acerca
da diversidade do HPV no Brasil.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES.
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Estudo comparativo da dinâmica evolutiva
dos sorotipos de vírus da dengue
Costa, RL¹; Schrago, CG²
¹Laboratório Nacional de Computação Científica – LNCC
2
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
[email protected]
Palavras-chave: dengue, evolução molecular, taxas de substituição, tempo de divergência, skyline plot
Os vírus, especialmente de RNA, possuem uma rápida taxa evolutiva, acumulando variação genética em um
intervalo de tempo acessível a estudos epidemiológicos. Sendo assim, exibem alta diversidade e servem como
bons modelos para análises filogenéticas, inferência de padrões e processos microevolutivos. Dentre os vírus de
RNA, o vírus da Dengue (Flavivirus) é o agente da mais ampla doença viral transmitida por um inseto vetor (gênero
Aedes). De acordo com a OMS a dengue vem crescendo dramaticamente nas últimas décadas, excedendo mais de
50 a 100 milhões de pessoas nos países tropicais por ano (OMS, 1999). Para estimar as relações e taxas evolutivas,
foi utilizada a região completa do gene E (envelope lipídico) dos quatro sorotipos, totalizando 327 sequências de
41 países, extraídas do GenBank isoladas por um período de 54 anos (1953 - 2007). Todas as sequências foram
alinhadas através do ClustalX e as taxas evolutivas (substituição de nucleotídeos por sítio por ano) e tempos
de coalescência (TMRCA) foram estimadas usando inferência Bayesiana através de simulação estocástica via
cadeia de Markov (MCMC), disponível no pacote Beast 1.4.8. Em todas as análises foram empregados o modelo
de substituição de nucleotídeo GTR +G4, que melhor se adequou aos dados, e o relógio molecular relaxado
com taxas evolutivas não correlacionadas, modeladas por uma distribuição lognormal. Os dados dos sorotipos
foram analisados tanto agrupados quanto isolados e o padrão de crescimento da epidemia foi inferido através do
Bayesian skyline plot (BSP). Os quatro sorotipos são consideravelmente diferentes e exibiram taxas de substituições
de nucleotídeos semelhantes tanto nas análises isoladas quanto em conjunto. Os sorotipos DENV2 e DENV4
(7,69x10-4; 8,26x10-4 substituições/sitio/ano, respectivamente, e com tempo de coalescência aproximadamente
de 1354 anos), apareceram como distintos do grupo DENV1 e DENV3 (7,093x10-4; 7,74x10-4 substituições/sitio/
ano, respectivamente, e tempo de coalescência de aproximadamente 886 anos). A filogenia sugere que a primeira
divergência entre os sorotipos aconteceu há aproximadamente 1679 anos. O resultado exibido pelo BSP mostrou
um padrão semelhante de crescimento do número efetivo de infecções para DENV I-III, com pico de crescimento
há cerca de 30 anos.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, Faperj e LNCC.
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Detecção de dengue virus em amostras de mosquitos
capturados pelo M. I. Dengue no campus Pampulha da
UFMG
Barbosa, EGV; Vilela, APP; Silva, LM; Diniz, PMM, Nunes, AC.
Laboratório de Genética Molecular de Protozoários Parasitas – Instituto de Ciências Biológica – UFMG
[email protected]
Palavras-chave: monitoramento, campus pampulha, Dengue virus, M. I. Dengue e biologia molecular
A dengue é uma infecção viral causada pelo Dengue virus (DENV), atualmente são reconhecidos quatro subtipos
(DENV1-4). O principal vetor da doença é o Aedes aegypti, um mosquito de hábitos diurnos que se alimenta,
preferencialmente, de sangue humano. Eles se desenvolvem em recipientes com água e são altamente adaptados
às condições antrópicas, transmitindo o vírus a altas taxas nas zonas urbanas. No Brasil, em 2008, até a semana
epidemiológica 48, foram registrados 787.726 casos suspeitos de dengue e 448 óbitos em decorrência da dengue.
A dengue apresenta um alto impacto para a economia brasileira e mundial. Além de causar o afastamento do
trabalho, há os custos do tratamento dos doentes. Estudos apontam que o custo mundial do tratamento da dengue
- excluindo a vigilância do vírus e controle do vetor - pode chegar a U$1,8 bilhão anuais. Diante dos impactos
econômicos e das dificuldades no controle do vetor é necessária a utilização de sistemas de monitoramento que
permitam controle efetivo da dengue. Para auxílio no controle do vetor foi desenvolvido o M. I. Dengue, um sistema
de monitoramento inteligente da dengue que informa o tamanho da população e a localização de Aedes aegypti
numa determinada área (www.midengue.com.br). Esse trabalho teve com objetivo acompanhar a circulação viral
em mosquitos capturados pelo M. I. Dengue no campus Pampulha da UFMG. Armadilhas MosquiTRAP™ foram
instaladas em 37 unidades existentes no campus Pampulha e mosquitos adultos fêmeas foram coletados de Abril
de 2008 à Janeiro de 2009. As amostras foram triadas e distribuídas em “pools” de no máximo 20 mosquitos. Os
mosquitos foram macerados em solução de lise com micropistilos de plástico autoclavável. O material foi então
submetido à técnica de extração de RNA viral com solução de sílica descrita por Boom e colaboradores (1990).
Para a produção de DNA complementar (cDNA) a partir do RNA extraído foram utilizados iniciadores antisenso
de Lanciotti e colaboradores (1992). A produção de cDNA foi seguida de Semi-Nested PCR para identificação dos
subtipos (DENV1-3). Os resultados foram utilizados para a confecção de mapas da circulação viral. Nos meses
analisados foram processados 2095 mosquitos em 215 pools. Do total de pools analisados 47 estavam positivos
(~22%). Nas amostras, verificou-se a presença de DENV2 e 3, sendo que em algumas unidades foi possível detectar
os dois subtipos simultaneamente. Mais do que o simples acompanhamento da circulação viral nos mosquitos do
campus Pampulha esse trabalho teve importância para demonstrar a viabilidade de um monitoramento viral em
larga escala. A inclusão da virologia nos processos de análise do M. I. Dengue, além de agregar valor ao serviço,
forneceriam maior poder de predição contra possíveis epidemias.
Apoio Financeiro: FAPEMIG BITEC
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Distribuição genotípica do vírus da hepatite C (HCV)
em diferentes grupos de risco à infecção na Amazônia
Brasileira
Sawada, L1; Pinheiro, ACC1; Velasco, MC2; Pimenta, ASC1, 2; Rezende, PR1,2; Rojas, MFM2; Chagas, MCM2;
Crespo, DM3; Crescente, JÂB4; Oliveira Filho, AB1; Lemos, JAR1,2.
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil1.
Fundação Centro de Hematologia e Hemoterapia do Pará, Belém, Pará, Brasil2.
Secretaria de Estado de Saúde Pública, Belém, Pará, Brasil3.
Núcleo de Medicina Tropical, Universidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil4.
[email protected]
Palavras-chave: infecção por HCV, genótipo, grupo de risco, endemia genotípica e Amazônia brasileira
A infecção pelo HCV é a principal causa de hepatite crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. Estima-se que 2,2%
da população mundial esteja infectada pelo HCV, sendo a maioria assintomática e desconhecedora do estado de
portador do vírus. A análise filogenética das seqüências nucleotídicas possibilita classificar o HCV em seis genótipos
e diversos subtipos. Sendo que, os diferentes genótipos apresentam diferenças quanto à susceptibilidade a terapia
antiviral e evidências sugerem relação com complicações clínicas distintas. Os únicos estudos de epidemiologia
molecular do HCV na Amazônia Brasileira ocorreram nos Estados do Acre e Amazonas em doadores de sangue e
profissionais de saúde, sendo indicada elevada freqüência do genótipo 1 (~74%) seguido pelos genótipos 3 (~25%) e 2
(~1%). Pesquisas epidemiológicas em grupos de risco à infecção pelo HCV na Amazônia Brasileira, especificamente
no Estado do Pará, são extremamente escassas. Desse modo, este trabalho determinou a freqüência genotípica
do HCV em 68 doadores de sangue (controle), 51 pacientes com múltiplas transfusões de sangue, 56 pacientes
hemodialisados e 47 usuários de drogas no Estado do Pará. O diagnóstico da infecção foi feito por PCR em tempo
real e a genotipagem através do seqüenciamento nucleotídico da 5´ UTR, seguida de análise filogenética (4Peaks,
ClustalX, Modelgenerator, PHYML, MrModeltest, Mr. Bayes). A análise da freqüência genotípica entre os grupos
populacionais foi realizada através do teste do qui-quadrado (BioEstat 5.0). Em doadores de sangue, a distribuição
do HCV foi constituída pelos genótipos 1 (92,6%) e 3 (7,4%). No grupo de pacientes multitransfundidos foi detectada
máxima prevalência do genótipo 1 (100%), provavelmente reflexo da transmissão específica deste genótipo. Por
outro lado, na população de hemodialisados foram detectados os genótipos 1 (89,3%), 2 (1,8%) e 3 (8,9%), reflexo
de maior diversidade de vias de transmissão (transfusional, intrafamiliar, nosocomial). No grupo de usuários de
drogas foi detectada a maior freqüência do genótipo 3 (40,4%), com prevalência do genótipo 1 (59,6%), sugerindo
que o compartilhamento da maquinaria de abuso permite a difusão de cepas do genótipo 3. Por fim, as freqüências
genotípicas do HCV foram significativamente distintas entre doadores de sangue e usuários de drogas (c2=18.58;
p<0.001). Em suma, o estudo evidenciou a elevada freqüência do genótipo 1 em diferentes grupos populacionais no
Estado do Pará. Desse modo, apontando uma possível endemia genotípica do HCV na Amazônia Brasileira.
Apoio Financeiro: SECTAM, FUNTEC, PN-DST/AIDS, CNPq, FAPESPA.
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Pesquisa de Hepacivirus em primatas não-humanos
Holanda, GM; Soares MCP; Ribeiro, NAB
Seção de Hepatologia Animal – Instituto Evandro Chagas
[email protected]
Palavras-chave: Hepacivirus, PCR, primatas não-humanos, vírus da hepatite C, biologia molecular
A evolução viral é um conhecimento limitado pela ausência de dados sobre espécies virais não identificadas.
Uma estratégia bastante usada para esse objetivo é identificar em espécies hospedeiras, vírus filogeneticamente
relacionados. Como acontece com o VHB (Vírus da Hepatite B) encontrado em espécies de marmotas, esquilos e
aves. No entanto, existem grupos taxonômicos virais monotípicos (uma única espécie) como o gênero Hepacivirus,
até o presente momento, representado apenas pelo VHC (Vírus da Hepatite C). Porém do ponto de vista
evolutivo a existência de um gênero viral monotípico é pouco provável. Esse vírus, ou aqueles filogeneticamente
relacionados, ainda não foi identificado em espécies de animais silvestres, provavelmente pela ausência de uma
metodologia diagnóstica apropriada. A gravidade das infecções provocadas pelo VHC no homem são graves,
sendo assim requerem uma investigação sobre Hepacivirus em animais silvestres, que possam cruzar a barreira
específica, passando a infectar humanos. Este trabalho teve como objetivo pesquisar a presença de Hepacivirus
em 254 amostras de primatas não-humanos, mantidos no criobanco da Seção de Hepatologia do Instituto
Evandro Chagas (SAHEP-IEC). Para esse objetivo foram utilizados iniciadores desenhados e testados na Seção
de Hepatologia do IEC para o diagnóstico de Hepacivirus: APE1, APE2 e APE3, os quais ligam-se nas posições
449-467, 133-153 e 302-321, respectivamente, correspondendo a região IRES (Internal Ribossomal Entry Site), do
VHC. Os iniciadores foram testados em 17 amostras, quantificadas pelo método de Amplicor HCV Monitor Test,
Version 2.0. Foram analisadas 254 amostras pertencentes a 22 espécies de primatas não-humanos. Sendo que os
resultados apresentaram 183 amostras com bandas inespecíficas e específicas, 65 sem nenhuma amplificação e
4 amostras com bandas especificas. As amostras positivas para 188 pb foram obtidas de 2 espécies diferentes,
Pithecia pithecia chrysocephala e Cebus apella, sendo que também foram identificadas 2 amostras com elevado
grau de amplificação e tamanhos diferente de 188 pb, para as espécies, Cebus apella com tamanho de 500 pb e
Pithecia pithecia chrysocephala com tamanho de 100 pb. A presença de resultados positivos indicam a possibilidade
de infecção pelo VHC, ou vírus filogeneticamente relacionados em primatas não-humanos, a ser confirmado pela
aplicação de outras ferramentas da Biologia Molecular. Desse modo, as amostras positivas serão posteriormente
sequênciadas, alinhadas e comparadas com sequências já descritas na literatura.
Apoio Financeiro: PIBIC-Fapespa, Instituto Evandro Chagas
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Freqüência de aberrações cromossômicas encontradas
em bovinos (Bos taurus) infectados pelo BPV-1 e 2
Melo, TC1; Diniz, N1; Campos, SRC 3; Beçak, W3; Rieger, TT2; Ferraz, OP3; Stocco, RC3
Laboratório de Genética e Citogenética Animal (Depto. de Genética, UFPE); 2Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, (UFPE);
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, Brazil.
[email protected]
1
3
Palavras-chave: Bos taurus; papilomavirus bovino; alterações cromossômicas
O papilomavírus bovino (BPV) é representado por 10 subtipos virais, epiteliotrópicos ou mucosotrópicos, que
são transmitidos entre bovinos por meio do sangue contaminado e/ou contato entre epitélios. O vírus pode estar
presente na forma latente nos linfócitos do hospedeiro, podendo originar instabilidades cromossômicas. Neste
contexto, este estudo teve como objetivo avaliar alterações cromossômicas que podem resultar deste processo de
instabilidade. Foram coletadas amostras de sangue periférico de bovinos Bos taurus taurus, submetidas a avaliação
de presença das seqüências de BPV por reação em cadeia da polimerase (PCR). Em seguida, foram estabelecidas
culturas de linfócitos para análise citogenética. Foram coletadas amostras de 61 bovinos, apresentando papilomatose
(animais sintomáticos) e sem sinais clínicos (animais assintomáticos) e a análise citogenética foi processada em
“teste cego” (em coloração convencional e bandamento C). Os resultados mostraram que no momento da coleta
28 animais não estavam infectados pelo vírus e 33 estavam infectados pelos tipos 1 e/ou 2. O grupo de bovinos
infectados foi subdividido em dois subgrupos: sintomáticos e assintomáticos. Analisando os animais infectados pelo
BPV, o grupo sintomático (com papilomatose), 17 bovinos, apresentou média de 42,71 % de células apresentando
aberrações cromossômicas por indivíduo, enquanto o grupo assintomático (sem papilomatose), 16 bovinos,
apresentou uma média de 40,19 %. Foram analisados entre 50 a 100 células por amostra, totalizando 2203 células,
das quais 918 (42%) apresentavam uma ou mais aberrações cromossômicas. As taxas de alterações cromossômicas
observada nos bovinos sintomáticos (42,7±7,8) e assintomáticos (40,2±11) foram comparadas com os índices de
aberrações espontâneas observado no grupo controle (animais não infectados) (4±2). Para analisar diferenças
estatísticas entre os três grupos, foi utilizado o Teste Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Mann Whitney. Estas
análises mostraram que a variabilidade de células alteradas entre o grupo controle e os infectados por BPV é maior
no grupo dos bovinos infectados (P < 0,0001). No entanto, diferenças significativas não foram observadas entre os
subgrupos infectados por BPV (P= 0,62). As alterações cromossômicas identificadas nas análises realizadas foram:
associação cêntrica (AC), fragmento acêntrico (FA), associação telomérica (AT), associação telomérica por uma
cromátide (ATcr), quebra cromatídica (QT), quebra cromossômica (QM), gaps, aneuploidia, poliploidia, adição ou
deleção de segmento cromossômico (add ou del) e separação precoce de cromátides (SPcr). A possibilidade de
distinção entre animais infectados e não infectados por meio dos níveis de aberrações cromossômicas se constitui
em uma evidência da ação viral sobre a cromatina hospedeira. As altas taxas de anormalidades cromossômicas
(numéricas e estruturais) relacionadas à ação do BPV possibilitaram a distinção entre animais acometidos por
vírus dos animais não infectados.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, FACEPE.
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105
Identificação de papilomavírus bovino (BPV) em sangue
de bovinos e cultura de linfócitos em uma fazenda
leiteira do estado de Pernambuco
Diniz, N1; Melo, TC1; Mori, E2; Brandão, PE2; Richtzenhain, LJ2; Beçak, W3; Carvalho, RF2; Stocco, RC3
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, SP, Brasil
3
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Papilomavírus; PCR; digestão enzimática; seqüenciamento; variante de BPV-1
Papilomavírus bovinos (BPVs), da família Papillomaviridae, acometem o gado com a indução do aparecimento de
verrugas, cânceres de bexiga e do trato digestório, causando importantes prejuízos à economia pecuarista. Dez
tipos de BPV já foram bem caracterizados (BPV-1 a 10). O presente trabalho teve como foco detectar seqüências
do genoma de BPVs em amostras de sangue de animais de uma fazenda leiteira em Pernambuco e nas culturas
de linfócitos correspondentes, visando investigar a presença dos tipos virais, mais especificamente 1, 2 e 4, a
eventual presença simultânea de mais de um tipo viral e o tipo mais freqüente. Para o diagnóstico viral, utilizou-se
a técnica da PCR, com iniciadores específicos direcionados aos genes L1, L2 e E7, respectivamente. A confirmação
dos produtos amplificados foi realizada por digestão enzimática e posterior seqüenciamento. Foram detectadas
seqüências virais em todos os animais investigados, independente da presença de papilomas aparentes. Os tipos
1 e 2 foram detectados diretamente de amostras de sangue e em cultura celular de linfócitos, enquanto que o tipo
4 não foi detectado em nenhuma das amostras. Os resultados positivos puderam ser confirmados por digestão
enzimática. A presença viral em sangue corrobora trabalhos descritos na literatura que discutem a disseminação
do BPV pelo sangue, enquanto que a detecção em cultura indica relação do vírus com o linfócito. A partir do
seqüenciamento de algumas amostras positivas para BPV-1, sugeriu-se a presença de nova variante viral em
comparação às seqüências depositadas no GenBank. Em conjunto, os resultados sugerem o papel dos linfócitos
como sítios de latência viral, além da presença de uma variante de BPV-1 circulando entre os animais estudados.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, FACEPE
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106
Expressão da proteina recombinante L1 de papiloma
virus bovino do tipo 4 em Escherichia coli
Ruiz, RM¹,²; Carvalho, RF¹; Freitas, AC3; Stocco, RC¹; Sircili, MP²; Beçak, W¹
¹Laboratório de Genética, Instituto Butantan; ²Laboratório de Bacteriologia, Instituto Butantan, 3Departamento de Genética, UFPE.
[email protected]
Palavras-chave: papilomavirus bovino, L1, proteína recombinante, clonagem, escherichia coli
O papilomavírus está associado com diferentes processos carcinogênicos em humanos e animais. No gado, o
papilomavírus bovino (BPV) está associado com tumores cutâneos, neoplasias malignas do trato gastrointestinal
superior e da bexiga urinária. Estes vírus apresentam o genoma de aproximadamente 7900 pb de DNA, com
dez possíveis fases de leitura, divididas entre regiões de codificação precoce (E) e tardia (L). As proteínas de
transcrição e replicação são codificadas na região E, estando associadas tanto com a proliferação descontrolada
como a perda de diferenciação das células infectadas. A região L do genoma contém os genes responsáveis pelas
proteínas estruturais do vírus, L1 e L2, codificadas durante o processo de maturação da partícula viral. Estudos
preliminares indicaram a eficiência do uso das proteínas L como antígenos vacinais para o controle da infecção por
papilomavírus no gado. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi a clonagem e expressão da proteína recombinate
L1 do BPV-4 em Escherichia coli. O gene L1 de BPV-4 foi amplificado através da reação de PCR e clonado no vetor
pGEM-T Easy (Promega). O inserto clonado, contendo toda a matriz de leitura L1 de BPV-4, foi então liberado
através da digestão com as enzimas EcoRI e XhoI e subclonado no vetor de expressão pET-28a (Novagen). O
plasmídeo recombinante foi submetido a análise por sequenciamento, a qual revelou homologia com o gene L1 de
BPV-4 depositado no GeneBank. A detecção da proteína recombinante L1 foi realizada por métodos imunológicos
e microscopia eletrônica, que revelou agregados de proteína no citoplasma bacteriano. A purificação da proteína
recombinante foi realizada por cromatografia de afinidade, utilizando-se colunas de resina de níquel. O método
aqui apresentado pode ser utilizado no intuito de desenvolver uma vacina profilática para BPV do tipo 4.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, FACEPE
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Caracterização de células de cultivo primário de lesões
papilomatosas de pele, esôfago e bexiga de bovinos
afetados por BPV: imunohistoquímica e citogenética
Campos, SRC1,2; Lima, AA3; Caetano, HVA1, 5; Ferraz, OP¹; Carvalho, RF¹; Felix, PM¹; Miranda, PM¹;
Tofanello, WS¹; Birgel Jr, EH4; Assaf, SL¹; Dagli, MLZ5; Beçak, W¹; Stocco, RC¹
Laboratório de Genética, Instituto Butantan
Departamento de Morfologia, Universidade Federal de São Paulo
3
Escola de Farmácia, UFOP
4
Hospital Veterinário, FMVZ-USP
5
Departamento de Patologia, FMVZ-USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Papilomatose, aberrações cromossômicas, imunohistoquímica, citoqueratinas, vimentina
O papilomavírus bovino faz parte de um grupo de oncovírus de DNA, que se caracterizam por infectar o epitélio do
seu hospedeiro. Em bovinos, o BPV comumente causa apenas lesões benignas na pele, mas em alguns casos pode
levar a processos neoplásicos como a hematúria enzoótica e o carcinoma de trato digestório superior, conhecido
como “caraguatá”. Apesar de não ter sido relatada a integração do papilomavírus à cromatina da célula hospedeira em
bovinos, já foi demonstrado em diversos trabalhos a presença de um maior número de aberrações cromossômicas
em animais infectados por BPV. Neste trabalho, foi realizado um estudo de caracterização imunohistoquímica e
citogenética de células provenientes de cultivos primários de papiloma de pele, papiloma de esôfago e mucosa
de bexiga de animais infectados por BPV. Para estabelecimentos dos cultivos, foram coletados fragmentos das
respectivas lesões em bovinos acometidos por papilomatose e uma amostra de pele de um animal assintomático
usado como controle. Os fragmentos foram incubados em meio DMEM (Cultilab™), suplementado com 10%
soro fetal bovino e mantidos a 37° C, em atmosfera de 5% de CO². Todos esses animais foram testados quanto à
presença de DNA viral nas lesões e em diferentes passagens do cultivo através de PCR usando primers genéricos e
específicos. Nas primeiras passagens, foram realizadas preparações citogenéticas, submetidas a hipotonização em
solução 0,075 M KCl pré-aquecida a 37ºC por 30 minutos e fixadas na proporção de 3:1 em metanol e ácido acético.
As lâminas foram coradas em Giemsa 2% e analisadas em fotomicroscópio. As células cultivadas também foram
marcadas com anticorpos anti-vimentina e anti-pan-citoqueratina para caracterização do tipo celular. Todos os
animais foram confirmados como BPVs positivos para BPV-1, BPV-2 e alguns para BPV-4. Foi observada uma maior
freqüência de aberrações cromossômicas nos animais afetados do que no animal controle usado nesse estudo
e, apesar de não ter sido observada diferença significativa entre os grupos, há um maior número de aberrações,
principalmente naqueles com seqüências de BPV-4. Todas as linhagens estudadas foram marcadas como vimentina
positiva, que representa o filamento intermediário que caracteriza células mesenquimais. As mesmas linhagens
foram positivas para pan-citoqueratina, marcador de células de origem epitelial, sendo mais evidente a expressão
em linhagens de papiloma de esôfago e mucosa de bexiga. Em diversos trabalhos, é relatada a expressão alterada
de genes de citoqueratina em células com crescimento maligno, o que indicaria a expressão desse filamento como
possível indicativo para neoplasias. Alguns estudos demonstraram que certos tipos de células metastáticas têm
características de linhagens epitelial e mesenquimal, caracterizando um processo chamado Transição EpitelialMesenquimal (TEM), onde também é observada a marcação simultânea de citoqueratina e vimentina.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP
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Avaliação do polimorfismo no códon 72 do gene
p53 em mulheres analisadas durante avaliação
ginecologica de rotina em Ouro Preto, Minas Gerais
Felix, PM1; Miranda, PM1, 2,3; Campos, SRC1,2; Carvalho, RF1; Lima, AA1,3; Lima Filho JL4; Martins DBG4;
Beçak, W1; Stocco, RC1
Laboratório de Genética – Instituto Butantan
Departamento de Morfologia – Universidade Federal de São Paulo
3
Escola de Farmácia de Ouro Preto – Universidade Federal de Ouro Preto
4
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: p53, p21, polimorfismo, HPV.
Introdução: O gene p53 (17p13.1) é constituído por 11 éxons, sendo o primeiro deles não-codificante. A proteína
p53 é composta por 393 aminoácidos, apresentando quatro domínios com funções distintas: transativação, ligação
ao DNA, tetramerização e regulação. A proteína p53 é importante na carcinogênese por atuar na preservação da
integridade genômica; ativa transcricionalmente o gene p21, induzindo a síntese da proteína p21, cuja função é inibir
as quinases dependentes de ciclina (Cdks), interrompendo o ciclo celular em G1. p53 ativa o gene GADD-45 (Growth
Arrest DNA Damage Inducible) que atua corrigindo lesões no DNA. A proteína p53 também ativa genes envolvidos
no mecanismo de apoptose e suprime a ação de genes anti-apoptóticos. A proteína E6 de papilomavírus humano
de alto risco tem capacidade de se ligar a p53 levando a sua rápida degradação, sendo esta associação um fator de
risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino. O códon 72 apresenta diferentes alelos, o que resulta na
inserção de diferentes aminoácidos nesta posição da proteína: arginina (Arg - CGC) e prolina (Pro - CCC), gerando
os genótipos: Arg/Arg, Arg/Pro e Pro/Pro. Objetivos: Avaliar a freqüência do polimorfismo no códon 72 do gene p53
de 348 mulheres selecionadas randomicamente, em exame ginecológico de rotina com determinação dos tipos de
HPVs eventualmente identificados nas amostras estudadas. Materiais e Métodos: A análise foi feita em amostras
endocervicais de 348 mulheres de Ouro Preto, Minas Gerais que utilizam o Sistema Único de Saúde. Para detectar
o polimorfismo no códon 72 do éxon 4 do gene p53, utilizou-se a técnica de PCR, com primers específicos para cada
alelo. O amplificado foi submetido à separação em gel de agarose 2% por eletroforese. Resultados: As freqüências
dos genótipos foram: Arg/Arg 41% (141), Arg/Pro 48% (168) e Pro/Pro 11% (39). A infecção por HPV ocorreu em
15,3% (53) das pacientes e 8,0% (28) apresentaram alterações relevantes no exame citológico. Correlacionando
as alterações citológicas e as freqüências genotípicas temos: ASC-US: Arg/Arg 21,4% (6); Arg/Pro 21,4% (6); Pro/
Pro 7,1% (2). LSIL: Arg/Arg 10,7% (3); Arg/Pro 14,3 (4); Pro/Pro 3,6% (1). ASC-H: Arg/Arg 14,3 (4); Arg/Pro 7,1% (2)
não ocorreu genótipo Pro/Pro neste grupo. Conclusão: O genótipo Arg/Arg não se apresentou mais freqüente nas
amostras onde se observa ASC-US e LSIL, porem é mais freqüente nas amostras que apresentaram ASC-H que uma
alteração citológica mais avançada, sugerindo que esta relação possa ser um indicativo de risco.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, PRONEX, FACEPE.
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Clonagem do gene E6 de papilomavírus bovino Tipo
1 em Escherichia coli: perspectivas para produção de
antígenos recombinantes de BPV
Mazzuchelli-de-Souza, J¹; Tofanello, WS¹; Ruiz, RM¹,2; Sircili, MP2; Beçak, W¹; Stocco, RC¹; Carvalho, RF¹
¹Laboratório de Genética, Instituto Butantan; 2Laboratório de Bacteriologia, Instituto Butantan
[email protected]
Palavras-chave: BPV-1, clonagem, E6, Escherichia coli, papilomavírus
Papilomavírus (PVs) se constituem em vírus de DNA dupla fita circular com aproximadamente 7900 pb. Os PVs
induzem tumores benignos (verrugas) de pele e mucosas, que geralmente regridem de forma espontânea. Porém,
devido a uma gama de fatores, podem persistir, tornando-se malignos. Dentre os diferentes tipos de papilomavírus
bovino (BPVs), os tipos 1 e 2 (BPV-1 e -2) têm a capacidade de infectar hospedeiros de outras espécies: nos eqüinos,
tais tipos virais estão associados ao desenvolvimento de sarcóides. No gado, infecções por BPV-1 estão associadas
ao surgimento de verrugas na pele, pênis, tetas e úbere, além de estarem associadas com o desenvolvimento de
cânceres na bexiga urinária. Essas doenças resultam em alta morbidade e mortalidade nos animais infectados,
causando perdas econômicas relevantes. Foi demonstrado que pelo menos dois genes, E5 e E6, codificam proteínas
transformantes, associadas à oncogênese celular. A proteína E6 interage com proteínas celulares, alterando a
função de proteínas reguladoras como a p53. A clonagem e a expressão do gene E6 de BPV-1 e a purificação da
respectiva proteína permitiriam a produção de insumos biotecnológicos para a prevenção das infecções virais.
No presente trabalho, buscamos a clonagem do gene em questão em sistema bacteriano. Iniciadores específicos
foram desenhados e a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para amplificação do gene E6 de BPV-1,
utilizando-se como sequência alvo o DNA genômico viral previamente clonado no vetor pAT153. O produto gerado
foi sequenciado, analisado para confirmação da sequência do gene E6 e clonado no vetor pJET 1.2/blunt GeneJETTM.
O plasmídeo recombinante foi então incorporado a células de E. coli, linhagem DH5α, por meio da técnica de
choque térmico. Colônias recombinantes foram selecionadas através da resistência ao antibiótico ampicilina. Os
resultados demonstraram que E. coli é um sistema adequado para clonagem de genes do papilomavírus bovino,
possibilitando estudos para análise da expressão gênica viral e purificação de proteínas recombinantes, visando,
entre outros, desenvolvimento de métodos diagnósticos e vacinas.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, FUNDAP.
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Interação HPV co-fatores ambientais: avaliação
em mulheres em exame ginecologico de rotina no
município de Ouro Preto-MG
Miranda, PM1; Pitol, BCV2; Moran, MS2; Sana, DEM2; Silva, NTS2; Carvalho, RF1; Felix, PM1; Giovanni, DNS¹;
Tofanello, WS1; Campos, SRC1; Lima Filho, JL4; Martins, DBG4; Carneiro, CM2; Silva, IDCG3; Beçak, W¹;
Stocco, RC¹; Lima, AA¹ ²
¹Laboratório de Genética, Instituto Butantan,
²Escola de Farmácia-UFOP,
³Laboratório de Tocoginecologia-UNIFESP,
4
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami- UFPE.
[email protected]
Palavras-chave: papilomavirus humano, HPV, câncer cervical, PCR, RFLP.
O papilomavírus humano (HPV) é o vírus mais prevalente envolvido nas doenças sexualmente transmissíveis e um
importante desafio de saúde pública. O HPV está associado a vários tipos de neoplasias sendo a principal causa dos
cânceres cervicais. É um fator de risco essencial, embora não suficiente, para o desenvolvimento do câncer do colo
uterino. Alguns co-fatores podem influenciar na progressão desse quadro: tabagismo, consumo de álcool, inicio
precoce da vida sexual, multiparidade, uso de contraceptivos orais. A ingestão do broto da samambaia Pteridium
aquilinum, que contém substâncias mutagênicas e carcinogênicas, parte da dieta de algumas populações como a
de Ouro Preto-MG e Japão, é descrita como associada a neoplasias gástricas em consumidores crônicos. O presente
trabalho tem como objetivo verificar a presença de HPV em amostras cervicais de mulheres, coletadas durante
avaliação ginecológica de rotina, na região de Ouro Preto- MG. O consumo de samambaia busca investigar este
consumo como eventual co-fator para neoplasia cervical oriunda da ação do HPV e desenvolvimento de câncer
cervical. Selecionamos pacientes recebidas pelos Postos de Saúde do Município de Ouro Preto-MG, as quais foram
submetidas à anamnese, coleta do material biológico para Análise Citológica (Exame Papanicolaou) e Análise
Molecular (HPV). A detecção e tipagem do HPV foram feitas por PCR/RFLP e Sequenciamento. Avaliamos 461
pacientes: 81 (17,5%) apresentaram infecção pelo HPV; 65 pacientes tiveram o tipo viral identificado pelo método
PCR/RFLP e 16 por sequenciamento. Dessas, 60% apresentaram infecções por HPV de Alto Risco Oncogênico, 34%
HPV Baixo Risco e 6% HPV de Risco Oncogênico Indeterminado. Os tipos mais prevalentes foram HPV16 (43%),
HPV6 (15,4%) e HPV61(10,7%). Considerando as 81 pacientes HPV positivas, 38 mulheres eram consumidoras de
broto de samambaia. Avaliando pacientes positivas para o tipo HPV16, 20 eram consumidoras de samambaia e 6
apresentaram Atipias Celulares de Significado Indeterminado (ASC-US). Os dados obtidos corroboram a hipótese
de que as prevalências virais podem variar conforme as diferentes regiões do país e que outros co-fatores regionais
devem ser investigados. Estudos populacionais devem ser desenvolvidos previamente a abordagens vacinais,
comparando estudos de prevalência populacional e estudos de prevalência em lesões neoplásicas.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, PRONEX, FAPESP, FACEPE.
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Clonagem do gene E6 do papilomavírus bovino do Tipo
2 em Escherichia coli
Tofanello, WS; Mazzuchelli-de-Souza, J; Ruiz, RM; Sircili, MP; Beçak, W; Stocco, RC; Carvalho, RF
¹Laboratório de Genética Instituto Butantan
[email protected]
Palavras-chave: BPV-2, clonagem, E6, papilomatose bovina, Escherichia coli
A papilomatose é uma doença infecto-contagiosa, caracterizada por lesões verrucosas localizadas na pele ou
mucosa em diversas espécies de mamíferos, incluindo o homem e animais domésticos. Especificamente em bovinos,
os vírus (BPVs) associados á esta enfermidade são causadores de uma série de manifestações clinicas, causando
sensíveis perdas e levando a consideráveis prejuízos econômicos. Os animais acometidos apresentam redução na
produção de leite e perda de peso. Os vírus do papiloma se constituem em um grupo de vírus de DNA que infecta as
células basais dos epitélios, induzindo a formação de tumores. Os tumores são em geral benignos e normalmente
regridem espontaneamente. Entretanto, a malignização dos mesmos pode ocorrer. Dentre as proteínas envolvidas
no processo de malignização celular, a proteína viral E6 está associada à proliferação e transformação celular.
A clonagem e expressão do gene E6 do vírus do papiloma bovino do tipo 2 (BPV-2) em sistema bacteriano e a
purificação da respectiva proteína são aspectos relevantes na produção de insumos biotecnológicos. No presente
projeto, foram projetados iniciadores específicos para amplificação do gene E6 de BPV-2. A reação de amplificação
foi realizada a partir de cópias virais previamente clonadas em vetor pAT153. O produto de PCR gerado foi
seqüenciado e analisado, confirmando-se a seqüência gerada como sendo E6 de BPV-2 e a seguir clonado no vetor
pJET1.2/blunt GeneJET™. Com o vetor obtido, células de E. coli, linhagem Dh5α, foram transformadas por choque
térmico sendo as colônias selecionadas em relação à presença do inserto E6. Os resultados demonstraram que o
sistema bacteriano utilizado foi adequado para a clonagem do gene e sugerem que a expressão da proteína E6 de
BPV-2 nesse sistema pode trazer contribuição importante para a obtenção de proteína de relevância antigênica
para processos vacinais envolvendo o papilomavírus bovino.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP
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A differential rapid fluorescent genetic typing assay
for poxviridae infections and its application in clinical
veterinary investigation
Delatorre, EO1; Travassos, CEPF2; Medina-Acosta, E1,3
Laboratório de Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro;
Laboratório de Sanidade Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro;
3
Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
1
2
Keywords: differential diagnosis, genetic test, QF-PCR, poxviridae
Introduction: The family Poxviridae consists of a group of double-stranded DNA viruses with similar morphology,
which replicate entirely in the cell cytoplasm of vertebrates and invertebrates. Several cases of pustule-vesicular
disease have recently occurred in many farms in the Southeast of Brazil, affecting the dairy cattle, milkers and
their families. The increased transmission risk of poxviruses from animals to humans requires the development of
efficient methods for rapid discrimination of pathogenic viruses. Objectives: To develop a single differential genetic
typing assay for Orthopoxvirus and Parapoxvirus by multiplex quantitative-fluorescence-PCR. Methodology: Novel
(untyped) genus-specific loci were identified using in silico comparative analyses of 80 genomes of members of
the genera Orthopoxvirus and Parapoxvirus from public databases. Target-specific primers were custom-modified
with different fluorochromes to facilitate the identification of amplification products. DNA was extracted from
lesion crusts in cattle with signs indicative of poxvirus infections. Control DNA was from tissue cultured Vaccinia
virus Western Reserve strain. Amplification was in a GeneAmp ® 9700 thermocycler (Applied Biosystems) and the
products analyzed in ABI Prism ® 310 sequencer (Applied Biosystems). Results: We designed two pairs of primers
genus-specific and two pairs species-specific. The genus-specific products are 142 bp (Orthopoxvirus) and 188 bp
(Parapoxvirus). Of the clinical samples investigated, three were positive for Orthopoxvirus, and one for Parapoxvirus.
The primer pairs can be combined in a biplex PCR differential genetic assay. Conclusion: Using a single biplex PCR
reaction it was possible to discriminate between clinical samples infected with Orthopoxvirus or Parapoxvirus in
less than 24 hours from sample collection. The assay developed constitutes the first single reaction discriminating
kit for genetic testing with broad application in animal and human health, epidemiological surveillance and public
safety.
Support: FAPERJ, NUDIM
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Uso de Nested PCR para estudo de prevalência de
Plasmodium sp. em Anopheles darlingi no município de
Porto Velho (RO)
Félix, GMF1; Santos, LM2; Gama, RA2; Fonseca, CG2; Braga, EM1
Laboratório de Malária - Universidade Federal de Minas Gerais
Laboratório de Genética Quantitativa e Conservação Animal - Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: malária, Plasmodium, Nested PCR, Anopheles darlingi, prevalência
A malária é atualmente a doença parasitária que mais mata no mundo, com mais de 40% da população mundial
vivendo em áreas de risco, e respondendo por cerca 500 milhões de casos anuais, dos quais 1,5 a 2,7 milhões vão
a óbito. Grande parte da prevalência (90%) e dos óbitos ocorre no continente africano onde o principal parasito
é o Plasmodium falciparum. No Brasil foram registrados cerca de 300 mil casos de malaria no ano de 2008, sendo
aproximadamente 80% destes devido ao Plasmodium vivax. A malaria humana é transmitida por anofelinos, sendo
o Anopheles darlingi a principal espécie envolvida na transmissão no território brasileiro. O presente estudo teve
como objetivo analisar a prevalência de infecção em mosquitos desta espécie, coletados no município de Porto
Velho (RO), nos anos de 2005, 2007 e 2008, utilizando as metodologias de atração humana e armadilha BG Sentinel.
Os mosquitos foram estocados em tubos contendo álcool 70%, separados de acordo com horário, localidade, data,
tipo de armadilha e local de coleta (peri ou intradomicílio). A infecção dos mosquitos foi verificada utilizando-se a
amplificação do gene estrutural 18 ssrRNA, segundo o protocolo de Nested PCR descrito por Snounou e cols (1993),
o qual permite a diferenciação entre as quatro espécies de plasmódios humanos. Os mosquitos foram macerados e
o DNA extraído utilizando o Kit Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega). Como controle positivo
foi utilizado DNA de P. falciparum extraído de cultura in vitro, e como controle negativo mosquitos não infectados.
Dos 6.000 mosquitos coletados, 1.000 já tiveram seus DNAs extraídos. Destes, 247 já foram avaliados por Nested
PCR, sendo apenas dois positivos para P. vivax, ambos capturados utilizando a armadilha BG Sentinel. Nossos
dados preliminares indicam uma taxa de prevalência de 1% para P. vivax, corroborando outros dados de prevalência
de infecção anofélica publicados para a região amazônica. Os resultados da PCR comparados aos dados da coleta
e dados epidemiológicos poderão fornecer informações sobre o comportamento de mosquitos infectados e não
infectados, relevantes para o monitoramento e controle dos vetores.
Apoio Financeiro: FAPEMIG
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Construção de cassetes de expressão de proteínas
heterólogas em lactobacilos para uso em vacinas orais
contra coccidiose aviária
Viana, PHFC; Moreira, JLS; Nunes, AC
Laboratório de Genética molecular de Protozoários Parasitas – Instituto de Ciências Biológicas. Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG).
[email protected]
Palavras-chave: coccidiose, vacina oral, bactéria recombinante, PCR e lactobacilos.
A coccidiose, doença inflamatória do epitélio intestinal de animais, é causada por protozoários parasitas do gênero
Eimeira e é facilmente disseminada na avicultura. Os custos da doença estão estimados em U$3 bilhões por ano em
todo o mundo. O uso de anticoccídicos cria resistência dos parasitas aos fármacos e depositam resíduos metabólicos,
prejudiciais à saúde, nos ovos e carne das aves. O desenvolvimento de vacinas orais é pré-requisito para indução
de imunidade protetora contra a maioria dos patógenos entéricos de mucosa de homens e animais. Elas são
mais convenientes, seguras e podem ser aplicadas em larga escala sem grandes custos, se comparadas às vacinas
parenterais. Uma estratégia estudada envolve o desenvolvimento de bactérias recombinantes como carreadoras de
antígenos. A família TRAP (thrombospondin-related anonymous protein) é constituída de proteínas relacionadas
a invasão de células hospedeiras e/ou locomoção. EmTFP250 é um antígeno dessa família de aproximadamente
246KDa, presente em Eimeria maxima, associado à imunidade maternal desenvolvida contra este parasito.
Witcombe e colaboradores (2004) produziram uma proteína recombinante, derivada da região C-terminal de
EmTFP250, capaz de induzir forte resposta imunológica em frangos e de ser reconhecida por anticorpos maternais
protetores. A resposta imunológica elicitada por EmTFP250 e seu derivado recombinante é capaz de proteger
frangos contra coccidiose causada por E. maxima. Em 2006, um trabalho do nosso grupo de pesquisa descreveu
um novo vetor, pLBSGFPEmR, contendo o gene repórter gfp, para expressão de proteínas heterólogas em bactérias
láticas. A partir dele, puderam ser construídos os vetores pSECGFPEmR e pCYTGFPEmR, direcionando os produtos
expressos para a forma secretada e citoplasmática respectivamente. O presente trabalho teve como objetivos a
amplificação por PCR do segmento gênico codificador da região C-terminal da proteína EmTFP250 e a construção
dos vetores pLBScTFPEmR, pSECcTFPEmR e pCYTcTFPEmR, para o endereçamento diferencial do antígeno de
Eimeria maxima. Para a amplificação do antígeno selecionado, foram desenhados “primers” a partir da seqüência de
EmTFP250 depositada no Gen Bank, inserindo sítios para as enzimas XhoI e EcoRI. Como molde, foi utilizado DNA
genômico extraído de oocistos de Eimeria maxima. O amplicon gerado de aproximadamente 660pb foi clonado
em pCR2.1-TOPO® e então seqüenciado para a confirmação do gene amplificado. Para a construção dos vetores
pLBScTFPEmR, pSECcTFPEmR e pCYTcTFPEmR, os plasmídios pLBSGFPEmR, pSECGFPEmR e pCYTGFPEmR
foram digeridos com XhoI e EcoRI, purificados e ligados com o fragmento correspondente a cTFP, substituindo
assim o gene repórter gfp pela seqüência codificadora do cTFP. A partir deste trabalho, ainda há muito que se fazer,
começando por ensaios de expressão de EmTFP250 em E. coli e lactobacilos, comprovando a funcionalidade dos
novos vetores construídos, importante etapa para o desenvolvimento de uma vacina oral recombinante veiculada
por lactobacilos contra coccidiose aviária.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
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Use of seminested PCR as a tool for detection of DNA
from Leishmania sp
Silva, JGL¹; Silva, TM²; Ariosa, MCF¹; Marques, MJ¹
*
¹Laboratório de Biologia Molecular de Microorganismos – Departamento de Ciências Biomédicas. Universidade Federal de Alfenas –
Unifal/MG
²Laboratório de Bioenergética e defesas antioxidantes em Trypanosoma cruzi – Instituto de Biologia. Universidade Estadual de Campinas
- UNICAMP
*[email protected]
Keywords: seminested PCR, leishmaniases, molecular diagnosis, promastigote forms, biological samples
The leishmaniases are a group of diseases caused by an intracellular protozoan of the genus Leishmania, which
promastigote forms can be transmitted to humans by the bite of Lutzomyia female insect. Leishmania is the
second most common cause of diseases by protozoa in terms of new cases and deaths, and surpassed only by
the Plasmodium. The diagnosis can be achieved through epidemiological, clinical and, laboratory analysis. The
laboratory techniques involve methods of detection of the parasite, such as direct search, isolation in culture,
animal inoculation and, histopathology. However, these methods present problems related to sensitivity. In turn,
the immunodiagnostic techniques, such as the detection of cellular immune response of antibodies and antigens
in immunocomplexes present difficulties such as cross-reactivity. Often it is necessary a combination of these tests
for a conclusive diagnosis. In this context, the Polymerase Chain Reaction (PCR), through in vitro amplification of
specific sequences of DNA, has shown improvements in relation to sensitivity and specificity in the leishmaniases
diagnosis. However, advances are still required in this methodology, such as Seminested PCR, which has been
shown to be a new option for molecular diagnosis on the basis of its excellent capacity on amplification of specific
DNA sequences. To test the ability of Seminested PCR on detection of Leishmania DNA in samples of reference
strains and in biopsies from patients with leishmaniasis, promastigote forms of L. (V.) braziliensis (M2903), L. (L.)
amazonensis (PH8) and L. (L.) chagasi (BH46) were grown in Schneider’s Medium (10% fetal bovine serum and 1%
Penicillin 1000μL/mL) in incubator at 23º C until the log phase of growth (106 parasites/ml) The samples had their
DNA extracted together with that of biopsies from 10 patients from different regions of Minas Gerais. The extraction
was performed with WizardTM Kit (Promega) as instructed by the manufacturer and then, DNA was subjected to
Seminested PCR. In the first stage of the reaction, in a final volume of 5μL, two primers (LINR4 and LIN17, at
10pmol/μL) were used. In the second step, a third primer (LIN19, at 10pmol/μL) was used in a final volume of 50μL
for each reaction tube. The amplified product was then applied in 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide,
subjected to electrophoresis (80V, 60mA, 90min) and viewed in ultraviolet light. This methodology provided the
taking of DNA amplified from samples of Leishmania sp reference strains and from samples of patients. The
fragments sizes were approximately 720bp. These preliminary results show that Seminested PCR can detect DNA
of Leishmania sp, including those in biological samples from patients, which shows that this is an appropriate tool
for the laboratory diagnosis of the leishmaniases.
Financial Support: CNPq, FAPEMIG, FINEP, Unifal-MG.
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Microarray analysis of attenuated Leishmania major
overexpressing an exogenous spliced leader gene
array
Ferreira, TR1; Raymond, F2; Madore, E2; Toledo, JS1; Corbeil, J2; Papadopoulou, B2; Cruz, AK1
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil
Research Centre in Infectious Diseases of CHUL, Laval University, Québec, Canada
*[email protected]
1
2
Keywords: leishmania, SL, microarray, spliced, genes
Several primitive eukaryotic cells display peculiar mechanisms of gene expression control that are not yet fully
understood. Among such intriguing microorganisms are the protozoa of the Leishmania genus, etiological agents of
the worldwide neglected disease leishmaniasis. During its life cycle between the insect vector (promastigote form)
and the mammalian host (amastigote form), the parasite go through extensive modification of morphological and
biochemical features, but mechanisms to regulate gene expression at the transcriptional level are still unknown.
No RNA polymerase II promoters for protein coding genes have been found. DNA transcription generates large
polycistronic RNAs containing genes of unrelated functions. Therefore, modulation of gene expression is mainly
focused at the post-transcriptional level. To produce translatable mRNAs these long transcripts must undergo a
trans-splicing event, which is coupled to polyadenylation. This bimolecular process transfers a 39nt sequence, the
spliced leader (SL), to the 5’ extremity of each pre-mRNA in the primary transcript and adds a poly(A) tail to the 3’
of the upstream gene sequence. With that in mind, in a previous study we generated a L. major mutant containing
a cosmid with ~100 copies of the SL gene and a control cell line transfected with the empty cosmid. Surprisingly,
the SL mutant displayed important virulence attenuation during mice in vivo infections but promastigotes grew
properly in culture. Biochemical and molecular mechanisms have been investigated in the SL mutant. Herein we
present the results of an oligonucleotide microarray analysis comparing global expression profiles between the
SL overexpressor and the control strain carrying the empty vector. RNA extracted from 4 different promastigote
cultures was synthesized into cDNA and labeled with Alexa fluorophores, in a dye-swap manner. A slide containing
8 arrays with 9,173 60-mer probes for the L. major and L. infantum genomes was used. Fluorescent signal of hybridized
spots was measured in an Agilent Scanner G2505B. Normalization and statistical analysis were performed in R
2.2.1 using the LIMMA package. We found 68 differentially expressed genes presenting a statistically significant
difference ratio greater than 1.5 fold. The majority of these genes are annotated as hypothetical conserved,
indicating the participation of several proteins of unknown functions in the SL overexpressor mutant. Other
genes code for proteins related to metabolic processes, biosynthetic pathways, translation, and nucleic acid and
protein modification. The predicted protein function of differentially expressed genes was predominantly classified
as binding, catalytic activity, hydrolase activity and nucleotide binding. Many of these processes were also found
altered in a previously conducted proteomic analysis. Taken together, these results suggest that in response to the
imbalanced expression of SL RNA in the SL mutant, the parasite try to maintain cell homeostasis to control the
spliced population of mRNA and an elevated translation activity.
Financial support: CBIE and FAPESP
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Desenvolvimento e caracterização de marcadores
moleculares do tipo microssatélites para Giardia
duodenalis
Durigan, M1; Franco, RMB2; Zucchi, MI3; Sousa, AP1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
Laboratório de Protozoologia, Depto de Biologia Animal, Universidade Estadual de Campinas
3
Centro de Pesquisas e Desenvolvimento em Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Giardia duodenalis, protozoário, microssatélite, marcador molecular, giardiose
Giardia duodenalis é o protozoário flagelado causador da giardiose, uma das mais comuns doenças de veiculação
hídrica do mundo, de alta prevalência, que acomete o homem e outros animais em países desenvolvidos e,
principalmente, em países em desenvolvimento. A contaminação dos rios das principais sub-bacias hidrográficas
do estado de São Paulo constitui uma importante questão em saúde pública. A espécie G. duodenalis possui
enorme diversidade genética de maneira que foi sub estruturada em sete assembléias genéticas. Estudos recentes
têm identificado uma sub estruturação ainda maior das assembléias o que sugere a necessidade de se trabalhar
com marcadores hipervariáveis como os microssatélites. Esse trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e
caracterização de marcadores microssatélites para Giardia duodenalis. Uma busca completa por microssatélites
simples e perfeitos no genoma total de Giardia foi realizada utilizando-se o software web-based SSRIT (www.gramene.
org) e o software SciRoKo 3.4. Dos microssatélites encontrados, grande parte refere-se a motivos trinucleotídeos,
que pode ser explicado pelo fato do genoma desse organismo ser, em sua maior parte, expresso, de forma que
o motivo mais freqüente foi AAC/GTT. Foram desenvolvidos 20 primers para caracterização de microssatélites
de motivos dinucleotídeos e 20 para motivos trinucleotídeos. Para tal caracterização, foram utilizadas amostras
clínicas, provenientes de humanos e outros animais, e ambientais, obtidas em rios, coletadas no estado de
São Paulo. Essas análises permitem o estudo de aspectos populacionais desse parasita, bem como inferências
epidemiológicas sobre origem de contaminação de regiões.
Apoio Financeiro: Fapesp e CNPq
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The 62bp indel on the 3’UTR regulates mRNA stability
on Trypanosoma cruzi
Simas, CRS¹; Ürmenyi, TP¹; Rondinelli, E2; Silva, R¹*
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro. 2Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Rio de Janeiro.
*[email protected]
1
Keywords: Trypanosoma cruzi, mRNA stabilization and allelic polymorphism
Trypanosoma cruzi, a kinetoplastida that causes Chagas disease, presents a peculiar gene arrangement, gene
expression and RNA processing such as trans-splicing. The CL Brener clone is a hybrid of two different T. cruzi strains.
We have characterized allele polymorphism in the Universal Minicircle Sequence Biding Protein (TcUMSBP) gene
locus. The presence of a 62bp polymorphism (62bp indel) in the intergenic region corresponding to the 3’UTR of the
adjacent gene, the beta proteasome affects the mRNA processing generating differential RNA accumulation and
two sites of polyadenylation. The polycistronic RNAs derived from these alleles generate mature RNAs carrying two
types of 3’UTR, which also differ in 62 bases. Our goal is to investigate if these two kinds of transcripts have different
properties regarding the RNA stabilization. We cloned the two polymorphic intergenic regions downstream to the
CAT (Chloramphenicol acetyl transferase) gene in plasmids having the Hsp70 intergenic region as the upstream
region. Epimastigotes were transfected, in duplicate, with 100mg of each plasmid construct, and after 48 hrs,
CAT assays were performed in triplicate. CAT activity was higher (2x) in cells transfected with the 62bp insertion
intergenic region. This shows that the mRNA containing the 62 indel stabilizes the RNA or turns it more efficient
for translation. To answer this question we are quantifying the CAT mRNA using qRT-PCR in these experiments
and determining the site of polyadenylation by cloning and sequencing the 3´UTR of the CAT mRNA. We are also
preparing co-transfections with plasmids containing the luciferase gene to better characterize these results.
Supported by: FAPERJ and CNPq
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Diversidade microbiana do solo do Cariri paraibano
pela análise da biblioteca metagenômica do gene 16S
rDNA
Grisi, TCSL1; Padilha, IQM2; Rangel, LTLD2; Maracajá-Coutinho, VRH2; Lima, LFA3; Araújo, DAM1,2
Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia, Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraíba.
Laboratório de Bioinformática, Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraíba.
3
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: metagenômica, diversidade microbiana, 16S rDNA, solo, Cariri.
O Cariri paraibano é uma região semi-árida, com temperaturas elevadas e baixa pluviosidade onde as práticas de
desmatamento, para implantação de culturas ou pecuária extensiva, têm acarretado alterações na microbiota
edáfica, antes mesmo destas serem estudadas. O conhecimento sobre a composição da comunidade microbiana
do solo nesse tipo de ambiente é escasso, com poucas informações disponíveis baseadas no uso de técnicas
tradicionais de isolamento e cultivo de microrganismos específicos. No entanto, tem sido demonstrado que os
microrganismos cultivados representam apenas uma pequena fração da diversidade de espécies nas amostras.
A Metagenômica surge nesse contexto como uma nova metodologia de análise das comunidades microbianas
que independe de cultivo, utilizando a amplificação do gene 16S do DNA ribossômico e análise dos dados pelas
ferramentas da bioinformática, nos estudos sistemáticos e filogenéticos microbianos. Neste trabalho objetivou-se
avaliar as comunidades microbianas presentes no solo do Cariri paraibano, onde amostras do solo foram coletadas
na cidade São João do Cariri-PB e o DNA total foi extraído com Kit FastDNA® SPIN Kit for Soil – BIO 101, de acordo
com o fabricante. O gene 16S rDNA para o domínio Bacteria foi amplificado utilizando os primers 27F e 1525R,
clonado em vetor pGEM-T Easy (Promega) e transformado em células quimicamente competentes de Escherichia
coli DH10B. Os clones foram selecionados em meio LB-ampicilina(100µg/mL)-xgal-IPTG e após extração
plasmidial foram sequenciados utilizando sequenciador ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). As sequências
obtidas foram triadas utilizando o software cross-match e comparadas no banco da NCBI, através de BLASTn,
considerando identidade maior que 90% e e-value igual a 0. Dos 208 clones seqüenciados até o momento, foram
identificados diferentes gêneros bacterianos pertencentes aos filos Proteobacteria (13,4%), Firmicutes (5,2%),
Acidobacteria (4,5%), Actinobacteria (3%), Cyanobacteria (0,7%), Bacteroidetes (2,2%), Planctomycete (0,7%) e
72,5% não apresentaram similaridade com seqüências conhecidas, anotadas como uncultured bacterium, os quais
foram agrupados em um cladograma das relações de similaridade entre os grupos. Os dados mostraram uma
grande diversidade bacteriana nesse tipo de ambiente, com possibilidade de busca de novos genes com potencial
biotecnológico.
Apoio Financeiro: CNPq
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One quarter of all metagenomics sequences can be
clustered but only a small fraction can have a genus
assigned due to the limitation of sequenced genomes
Guedes, RLM1; Velloso, HM1; Ortega, JM1
- Laboratório de Biodados – Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
Keywords: metagenomic, complete genomes, MegaBLAST, clustering.
Prokaryotic genome sequencing has advanced considerably, almost attaining the first thousand of complete
genomes. Today there are 884 available genomes comprising 304 distinct genus. Conversely, metagenomics
projects have produced 17.65 million sequences. We set up to cluster the entire metagenomics collection with
2,821,787 CDS obtained from complete genomes. The clustering procedure used MegaBLAST pair-wise alignments
under an E-value threshold of 1e-10. Only alignments with more than 96% identity and aligning over 70% of the
potential overlap between the two sequences were retained. A program was developed to run the single-linkage
of such a large amount of alignments (a 41 GB file), and all results were used to populate a local MySQL database,
which also contains information about all the 17 metagenomics projects and their descriptions. According with
the nature of this sampling procedure, 4.36 million metagenomics sequences (25%) were able to form (a) 704,330
clusters containing only metagenomics sequences (3,563,185), together with (b) 30,349 clusters (containing 797,360
metagenomics sequences) adding CDS from the complete genomes. Thus, 4% of the clusters match a CDS from
the collection of complete genomes. Most of these clusters (96.74%) grouped metagenomics sequences with CDS
of a single genus (a total of 29,360 sequences).This proportion is in agreement with the fraction of clusters that
comprise a single genus by using only the genomes in the procedure. Thus, the clustering program developed here
is capable of attributing a single genus assignment to clusters of metagenomics sequences. Moreover, availability of
genomes limits the genus assignment to only 4% of the metagenomics clusters. Furthermore, 25% of the available
metagenomics sequences can be efficiently clustered by our procedure.
Support: FAPEMIG
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Functional screening in metagenomic libraries
Agnez Lima, LF; Silva, RCB; Sena, DCS; Silva, UB; Pachione, RG; Kramer, MAF
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica – Departamento de Biologia Celular e Genética – Centro de Biociências – UFRN.
[email protected]
Keywords: metagenome, DNA repair, functional selection.
The total number of prokaryotic cells on Earth has been estimated at 4 to 6x1030 and only about 1% of microorganisms
present in the environment can be cultivated by standard techniques of cultivation and plating. Therefore, it
is a huge biological and genetic pool that can be exploited, for the identification and characterization of genes
with biotechnological potential. Within this perspective, the metagenomics approach has been applied in this
work. Functional screening methods were performed aiming to identify new genes related to: DNA repair and/or
oxidative stress resistance; metal resistance; saline stress; petroleum degradation; and production of surfactant,
protease, lipase and amylase. Environmental DNA (eDNA) was extracted from soil samples collected in several
biomes from Rio Grande do Norte (Brazil) and after random fragmentation (1-2 kb) the metagenomic libraries
were obtained using the expression vector pBC (Stratagene). The libraries have been analyzed functionally using
solid or liquid medium containing specific substrate as H2O2, metals, Arabian oil, and others. Until this moment
151 clones showing some activity were selected and are being better analyzed. Concerning the oxidative stress,
22 clones were obtained after selection with H2O2. The partial sequences of these clones indicate the presence of
hypothetical proteins, phenylacetate-CoA oxygenase/reductase, phosphocarrier protein HPr, response regulator,
methyltransferase, aminopeptidase N, ribose-5-phosphate isomerase, DNA polymerase, biotin-protein ligase. In
this moment, we are defining the approaches to test specific activities for each clone. The sequence data obtained
matched with the functions tested, highlighting the success of metagenomics approaches combined with functional
screening methods, which leading to very promising results. In parallel to functional screening, the analysis of
biodiversity has been done by the sequencing of rDNA 16S libraries. PCR using eDNA and universal primers for
eubacteria and archaea have been done. The PCR products have been cloned and sequenced. The 16S sequences
indicate a high biodiversity in the samples, with some majority groups depending of environment conditions.
Financial support: CNPq
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Seed Server, an automated web tool for grouping of
genes related to seed sequences
Guedes, RLM1; Fernandes, GR1; Coelho-Jr, OS1; Ribeiro, HAL1; Barbosa-Silva, A2; Ortega, JM1
- Laboratório de Biodados – Universidade Federal de Minas Gerais
- Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin
[email protected]
1
2
Keywords: homology, seed linkage, UniRef Enriched Kegg Orthology, web tool.
Discovery of biological activities in the human organism often relies on description of functional assays primarily
conducted in other organisms. An example was the cloning of human telomerase TERT after the describing of a
lower eukaryote homologue. Invariably, the grouping of homologous genes demands comparison of completely
sequenced genomes. However, our laboratory developed a method named Seed Linkage to cluster cognate
proteins from multiple organisms beginning with only one sequence, through connectivity saturation with that
Seed sequence. Here we present the implementation of Seed Server, a web tool designed to group genes related
to seed sequences using two collaborative clustering procedures: (I) Seed Linkage and (II) UniRef Enriched Kegg
Orthology (UEKO), a database produced by our group by using Kegg Orthology members to recruit and enlarge the
homologous groups using additional members obtained from UniRef50 clusters. Seed Server verifies the recruited
sequences using two complementary approaches: (I) PSI-BLAST searches using Seed sequences as query and the
recruited sequences as database, validating the recruitment whenever the resultant e-value is lower than a given
cutoff (1e-10 default); (II) Secondary structure overlap, determined by the index SOV being over a cutoff (75%
default). To verify the operability of Seed Server clusters of tRNA synthetases were used as Seed to group additional
sequences. Using 57 archaea arpartyl tRNA synthetases from KO database, additional 15 sequences have been
recruited by Seed Linkage within the archaea clade, 11 of them belonging to the Uniprot Enrichment of KO and four
ones constituting novel additions. UEKO recruitments outside the archea clade grouped 736 and 426 additional
members from KO and UniRef enrichment, respectively. 593 KO and 339 UEKO recruited sequences have been
validated by both PSI-BLAST and SOV procedures. Similar behavior was observed for all other analyzed tRNA
synthetases. In conclusion, grouping of genes related to seed sequences by the web tool Seed Server is efficient and
reliable. Seed Server is available at biodados.icb.ufmg.br.
Supported by FAPEMIG