Melhoramento de plantas ornamentais Lívia Mendes de Castro Doutoranda em Fitotecnia ESALQ/USP As necessidades do setor de ornamentais a) Novidades como mola propulsora para manter e estimular o interesse dos consumidores de flores e plantas ornamentais; b) Modernas técnicas de melhoramento genético levam a variedades de: mais fácil cultivo maior apelo ao público maior durabilidade; As necessidades do setor de ornamentais c) novas variedades selecionadas mais adequadas ao cultivo intensivo e de baixo custo; d) aprimoramento das características desejadas pelos consumidores: cor da moda, durabilidade, altura, perfume Melhoramento Genético TRADICIONAL Seleção Introduções Cruzamentos Também pode utilizar cultura de tecidos X BIOTECNOLOGIA Cultura de Tecidos Vegetais Melhoramento Genético Tradicional Gladíolo (Gênero Gladiolus) FATORES DE SELEÇÃO (cormos) Alta taxa de propagação, Cormo deve ter bom crescimento, Resistência a pragas/doenças, Condições climáticas adversas, Adaptação à mecanização FATORES DE SELEÇÃO (flores) Alta qualidade comercial (potencial ornamental) sob grande variação de temperatura e luminosidade, Sejam fáceis de manusear, embalar e armazenar, Capacidade para a antese após 2-3 dias de armazenamento a seco das hastes cortadas. Melhoramento Gladíolo COLETA E CONSERVAÇÃO DE PÓLEN POLINIZAÇÃO: Melhoramento Gladíolo 1 3 2 4 Melhoramento Gladíolo 5 6 Melhoramento Gladíolo Melhoramento Bromélia Melhoramento Bromélia Melhoramento Bromélia Melhoramento Bromélia A Experiência da Bromélias Rio Introdução Início das atividades 1993 Local Campinas, SP Início programa de Melhoramento Genético 1995 A Experiência da Bromélias Rio Principais Gêneros Aechmea Guzmania Vriesea Principais Gêneros Tillandsia Neoregelia Área de Genética – 5000 m² Objetivos Obtenção de novas cultivares que possuam: Valor comercial Competitividade no mercado Novidade Vantagens culturais Processo de polinização Fig 1: Retirada do pólen do parental masculino Fig 2: Preparação da flor do parental feminino Fig 3: Processo de Polinização Formação de Sementes Fig 4: Detalhe das cápsulas formadas após a polinização Fig 5: Cápsulas maduras Fig 6: Detalhe da cápsula madura já colhida Fig 7: Sementes prontas para semeadura Germinação das Sementes Fig 8: Germinação das sementes Fig 9: Transplante para vaso comunitário Fig 10: Transplante para bandejas de células individuais Colocadas em ambiente especial para germinação e crescimento Transplantes Fig 11: Mudas transplantadas para pote intermediário Fig 12: Mudas transplantadas para Avaliação das Plantas Fig 13: Plantas resultantes de cruzamentos prontas para avaliação Fig 14: Plantas resultantes de cruzamentos escolhidas após avaliação Etapas do processo de melhoramento e lançamento de novas cultivares ETAPA INICIAL – TEMPO (meses) Polinização até formação das sementes Maturação das sementes Semeadura 1º transplante 1º transplantes até multivaso AECHMEA 3 3 2,5 2,5 VRIESEA 3 3 6 3,5 GUZMANIA 3 3 3 3 NEOREGELIA 3 3 2,5 2,5 Etapas do processo de melhoramento e lançamento de novas cultivares ETAPA INTERMEDIÁRIA – TEMPO (meses) MT para PI PI para PF PF até Indução Indução até auge flor Formação Matrizeiro AECHMEA 3 4 8 2,5 1,5 VRIESEA 4 4,2 14 3,5 2 GUZMANIA 4 5 10 3 2 NEOREGELIA 3,5 4 8 2 1,5 Etapas do processo de melhoramento e lançamento de novas cultivares ETAPA FINAL – TEMPO (meses) Isolamento e micropropagação Cultivo Comercial Tempo Total (meses) Tempo Total (anos) AECHMEA 18 18 66 5,5 VRIESEA 24 24 91 7,6 GUZMANIA 24 20 80 6,7 NEOREGELIA 20 20 70 5,8 Resultado dos cruzamentos Tempo total para obtenção de uma nova cultivar >> 7 anos Aproveitamento: máx. 1% das plantas obtidas Cruzamentos realizados: 1500 Guzmania; 1500 Vriesea; 500 demais gêneros Exemplo de uma nova cultivar obtida por cruzamento - Aechmea Mãe: Aechmea chantinii x Aechmea tesmanii loreto Filho: Aechmea 416C Pai: Aechmea fasciata sem espinho Exemplo de uma nova cultivar obtida por cruzamento - Guzmania Mãe: Guzmania Hilda Pai: Guzmania lingulata amarela Filho: Guzmania 509 Exemplo de melhoramento Aechmea com espinho original Aechmea sem espinho melhorada Ferramenta Auxiliar no Melhoramento Cultura de Tecidos Vegetais Cultura de Tecidos Vegetais Micropropagação de ornamentais Variação Somaclonal em Diversos Sistemas de Cultura de Tecidos Variação Somaclonal : variação genotípica e/ou fenotípica ocorrida em plantas regeneradas Variação Somaclonal em Diversos Sistemas de Cultura de Tecidos Variantes Somaclonai de Heliconia bihai obtidas in vitro A B A ) VCL – Variação da clorofila na folha B) LSV – Variante de porte baixo Variantes Somaclonai de Heliconia bihai obtidas in vitro C D C ) VCPP – Variante da coloração do pseudocaule e pecíolo D) Haste floral normal Inovações Tecnológicas no Melhoramento Genético de Plantas Ornamentais BIOTECNOLOGIA Inovações Tecnológicas no Melhoramento Genético de Plantas Ornamentais Porque usar? Características Genéticas propagação vegetativa juvenilidade alta heterozigozidade cruzamentos com grande segregação ausência de características de interesse no “pool” gênico ex. flôres azuis, resistência à doenças, etc. Tecnologias Complementares no Melhoramento Genético de Plantas Ornamentais Cruzamento e seleção Indução de mutação Técnicas biotecnológicas micropropagação variação somaclonal limpeza de vírus Transgenia Marcadores moleculares (melhoramento assistido) Micropropagação de plantas ornamentais Finalidades: propagação intensiva de novas variedades e espécies e redução do tempo de lançamento redução do tempo de lançamento limpeza de vírus – indexação (limpeza clonal) manutenção de germoplasma e identidade genética manutenção do vigor híbrido ou heterose Micropropagação de plantas ornamentais Indução de Mutações em Ornamentais: ampliação da variabilidade genética Mutações são mudanças na seqüência de nucleotídeos do material genético de um organismo. Citoplasmática ou nucleares. Pode ser natural ou induzidas. Induzidas de forma química ou física. Mutantes espontâneos em trevo (Trifolium repens L.) ORIGINAL MUTANTE Métodos de obtenção de novas cultivares Cruzamento : X INDUÇÕES DE MUTAÇÕES Aumento da variabilidade. OBJETIVO: IMPORTÂNCIA EM ORNAMENTAIS Cultivares mutantes liberados ornamentais - 552 culturas - 1700 INDUÇÕES DE MUTAÇÕES Mutagênicos físicos e Mutagênicos químicos PRINCÍPIOS BÁSICOS: A ocorrência é ao acaso Método eficaz de seleção A mutação é um evento unicelular A maioria das mutações são deletérias Usar grandes populações TRATAMENTOS E PARTES DAS PLANTAS IN VIVO IN VITRO Sementes Sementes Estacas Estacas Folhas Folhas Pólen Pólen Plantas Plantas Ápices Brotos axilares Pecíolo Raiz Suspensões celulares Protoplastos AGENTES MUTAGÊNICOS Radiações mutagênicas ionizantes Raios-X, Raios-gama; Nêutrons, U.V Alta penetração nos tecidos (Acidente Césio 137) Doses: energia absorvida: Gray (Gy) Raio X Centro de Energia Nuclear na Agricultura - CENA Centro de Energia Nuclear na Agricultura - CENA Mutação in vitro Mutação in vivo AGENTES MUTAGÊNICOS Mutagênicos Químicos: Agentes alquilantes: EMS – metanossulfonato de etila PM 124 Uso: concentração, tempo, pH Ex.: EMS 0,1 M (12,4 g/l), 5 horas pH 7.0 AÇÃO ALVO EFEITOS DIRETA RADIAÇÃO INDIRETA IONIZAÇÃO RADICAIS LIVRES HORMÔNIOS ENZIMAS DNA PROTEÍNAS ● ● ● FISIOLÓGICOS (V1M1; M1) GENÉTICOS (V2M1; M2) EFEITOS FISIOLÓGICOS (M1; V1M1) Redução: Na germinação Na sobrevivência Na altura da planta No número de brotos Aumento da esterilidade Importância Seleção da dose: LD e /ou GR 30 – 50 EFEITOS GENÉTICOS (M2; M3… V2M1; V3M1…) Mutações gênicas Mutações cromossômicas Seleção da Dose Escolha do material a ser tratado e ocorrência do quimerismo QUIMERISMO Organização túnica-corpo Existência na mesma planta de dois ou mais tecidos somáticos geneticamente distintos. TIPOS DE QUIMERISMO • Podem ser divididas quanto ao arranjamento das células que lhe deu origem em: setorial, mericlinal e periclinal. ORIGEM DO QUIMERISMO • Quimeras surgem quando uma ou mais células do meristema sofre mutação. IDENTIFICAÇÃO DO QUIMERISMO Se a célula mutada fica no meristema , em seguida, todas as outras células que são produzidas pela divisão desta será também mutada. O resultado será a células de diferentes genótipos em crescimento adjacentes em um tecido vegetal. Se a localização da célula no momento da mutação está em uma região onde a divisão celular é pouco, então a probabilidade de detectar esta mutação é baixa. Além disso, se os resultados da mutação em um genótipo não são muito diferentes morfologicamente do resto da planta, então a probabilidade de identificação da planta como uma quimera também é baixa. Indução de mutações pode ser feita tanto em estacas (ou partes propagativa) como em sementes. Indução de mutações pode ser feita tanto in vitro como in vivo. Indução de mutações pode ser feita tanto de forma química como de forma física. Indução de mutações somáticas em gemas in vivo Indução de mutações somáticas em gemas in vitro Indução de mutações somáticas em gemas in vivo Indução de mutações somáticas em gemas in vivo Indução de mutações somáticas em gemas in vitro Indução de mutações somáticas em gemas in vitro Indução de mutações somáticas em gemas in vitro Exemplos de programas de melhoramento com indução de mutações envolvendo ornamentais Calathea Aster spp. Chrysanthemum Gladíolos Bromélias Stromanthe INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO Indução de mutação em crisântemo de vaso SELEÇÃO DOS MUTANTES •Coloração •Morfologia •Cor e Morfologia • Realizada no florescimento período Empresa: Dekker de Wit de EXEMPLOS 13 08 22 Cherry Dark 36 63 110 Indução de Mutação "in vitro" em Aster sp. OBJETIVOS E ATIVIDADES - Obter flores de Aster com novas colorações e novos formatos no cultivar The king (cor roxa) 1) cultivo de plantas "in vitro“; 2) determinação da sensitividade de plantas "in vitro" a raiosgama (aster cv. the king) LD 50 3) Irradiação de plantas "in vitro" com doses de 15,20,25 e 30 gy de raios-gama; 4) Multiplicação das plantas irradiadas (3 subcultivos); 5) Plantio em estufas comerciais, seleção dos mutantes no florescimento. Indução de Mutação "in vitro" em Aster sp. Taxa de Crescimento: Média de Plantas Dose (Gy) (cm) % 0 2,185 a 100,0 10 1,860 ab 85,2 15 1,785 abc 81,7 20 1,347 bcd 61,7 25 1,440 bcd 65,9 30 1,263 cd 57,8 35 1,194 54,6 d Indução de Mutação "in vitro" em Aster sp. Indução de Mutação "in vitro" em mini-rosa Indução de Mutação em Rosa de Vaso Indução de Mutação em Gladíolo • Esquema Irradiação de bulbilhos com diferentes dosagens de raios-gama: 10,20 e 30 Gy. Plantio 1° ano. Colheita do bulbo pequeno. Beneficiamento e armazenamento dos bulbos. Plantio 2° ano . Avaliação dos mutantes durante o florescimento Seleção e propagação dos mutantes de interesse Indução de Mutação em Gladíolo Variedade Está Bonita Indução de Mutação em Gladíolo Variedade Red Beauty Métodos de transformação genética de plantas: exemplos em ornamentais Fundamentos da Biotecnologia • Identificação e isolamento de genes – bactérias são excelente fontes • Manipulação e modificação dos genes • Transferência de gene para plantas • Avaliação das plantas modificadas Transformação de Plantas Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração, Método de transferência de gene, Identificação de células transformadas por seleção, Regeneração de plantas de células transformadas, Plantas transgênicas analisadas para confirmar presença do transgene, Plantas transgênicas avaliadas para performance. Métodos de Transformação Genética Métodos diretos • Os métodos diretos são aqueles que provocam modificações nas paredes e membranas celulares para introdução de DNA exógeno, através de processos físicos ou químicos. Eletroporação de protoplastos. A transformação mediada por PEG (polietilenoglicol). Bombardeamento de partículas. Métodos de Transformação Genética Métodos indiretos • O método indireto requer a utilização de um vetor biológico para a introdução do DNA na planta. Vetores:Agrobacterium tumefaciens e A. rhizogenes. Eletroporação de protoplastos ou uso de PEG • Os plasmídeos são incorporados aos protoplastos, pelo processo de endocitose. • A freqüência de assimilação dos plasmídeos é normalmente baixa, mas pode ser elevada com a adição de PEG (polietileno glicol) ou pela eletroporação. • maior problema a dificuldade de regeneração do protoplasto Os protoplastos são expostos a pulsos curtos de corrente contínua e alta voltagem, em presença do DNA exógeno (Fromm et al., 1985). Transformação mediada por PEG Polietilenoglicol (PEG), usado em combinação com Ca+2, Mg+2 e pH alcalino, promove a ligação do DNA exógeno à superfície dos protoplastos. O DNA é absorvido pela célula por endocitose. O tratamento com PEG pode danificar grande número de células, reduzindo a capacidade de regeneração. Bombardeamento de partículas • Esse método consiste na aceleração de micropartículas de metal, que atravessam a parede celular e a membrana plasmática, carreando DNA para o interior da célula (Sanford, 1988). • Também chamado de aceleração de microprojéteis ou método biolístico. • Um microprojétil é definido como qualquer partícula capaz de ser acelerada, de maneira que penetre nas células (Sanford, 1990). Agrobacterium • Agrobacterium é uma bactéria de solo, Gramnegativa, aeróbica, pertencente à Família Rhizobiaceae (Zambrisky, 1988). A. tumefaciens A. rhizogenes • As bactérias possuem plasmídeos que recebem denominações de acordo com a alteração de desenvolvimento vegetal que provocam: Ti, indutor de tumores, e Ri, indutor de raízes. Desarmamento da bactéria. • a inclusão de genes marcadores no T-DNA: (uidA- β-glucuronidase) ou genes de resistência a antibióticos hpt II (higromicina) ou npt II (canamicina). Exemplo de espécies ornamentais transformadas Rosa Tulipa Cravo Crisântemo Gérbera Lírio Etapas da transformação genética de plantas Etapas da transformação genética de plantas Etapas da transformação genética de plantas Aplicações de transgênicos • Características de Produção -”Input” – visam redução de custo de produção • resistência à doenças, pragas, herbicidas • “performance” - produtividade e eficiência • Características de Consumo -”Output” – acrescentam valor - “value added” • novas cores, formas, tamanho, conservação, fragrância Riscos Associados a Transgênicos • Vazamento de Informação Genética • resistência à pragas, doença, herbicidas para ervas daninhas aparentada • Efeitos Ambientais Adversos • invasão de habitats naturais • Alergia • resistência a degradação digestiva • estabilidade ao calor e ácido – consumidores mais confiantes com transgênicos do que alimentos transgênicos ornamentais Aplicações de Transgênicos para Produção - “Input” • Resistência à insetos * – uso de toxina de Bacillus thurigiensis - Bt • Resistência à viroses * – introdução de gene da capa protéica • Resistência à fungos e bactérias – introdução de quitinase e glucanase • Fusarium oxysporium f.sp. dianthii Resistência a Insetos • Genes codificando para proteínas inseticidas (cry1, cry2, cry3) isolados de Bacillus thuringiensis - toxinas Bt • Genes de toxinas de Bt modificados e introduzidos em plantas – milho, algodão, batata, crisântemo. Resistência a Vírus Planta manipuladas para expressar proteínas virais podem ser resistentes aquele vírus. Isolar gene codificando capa protéica do vírus. Adicionar promotor constitutivo para expressar esse gene na planta. Produzir plantas transgênicas. Avaliar para resistência ao vírus promotor 35 S gene da capa protéica do vírus Aplicações de Transgênicos para Consumo - “Output” • Novas cores * – alteração da biossíntese de antocianinas • Redução da senescência - “longa vida” * – inibição da síntese/ação de etileno • Alteração de Tamanho e Forma de Plantas e Flores * – alteração sensibilidade à fitohormônios, genes homeóticos • Alteração da fragrância – biossíntese de monoterpenos Pigmentação de Flores • Função: – atração de polinizadores – repelir herbívora – proteção contra UV • Mutação de cor afeta isolamento genético e especiação na natureza • Estudos em Petúnia e Antirrhinum (boca de leão) Rota de Biossíntese de Antocianinas Dihidroxikaempeferol O HO OH F3’5’H OH OH O OH Dihidromiricetina F3’H O HO OH Dihidroxikaempeferol O HO OH OH OH dihidroquercitina OH HO OH O OH O DFR AS 3GT OH OH O OH O DFR AS 3GT OH Rota de Biossíntese de Antocianinas Delfinidina-3-glucosídeo Pelargonidina-3-glucose OH O HO OH O HO OH OH O-Glucose OH O-Gluc OH Cianidina-3-glucosídeo HO O OH O-Glucose OH OH Alteração da Cor por Introdução de GeneEnzima 1. baixa atividade de DFR de Petunia ausência de flor laranja (pelargonidina) 2. ausência de F3’5’H em rosa e cravo ausência de flores azuis (delfinidinas) 3. introdução de chalcone redutase > formação de cor amarela Expressão de dfr de milho em Petúnia sem F3’5’H com F3’5’H Introdução de F3’5’H em cravo Alteração da Cor por Antisenso ou Senso • Antisenso de CHS - inibe síntese de antocianina e flavonóis Co-supressão por introdução de CHS (cópia extra) normal transgênico normal transgênico transgênico transgênico Co-supressão por introdução de CHS (cópia extra) Co-supressão por introdução de CHS (cópia extra) Produtos Transgênicos Comerciais • Florigene - Austrália – A partir de cravo branco - gene F3’5’H • Cravo “Moondust” - 1996 • Cravo “Moonshadow” – 1998 • Novartis – introdução de Dfr de gérbera em petúnia • Petúnia laranja Modificando Qualidade na Pós-Colheita • Etileno regula amadurecimento e senescência de flores e frutos SAM ACC Etileno Expressão Gênica Senescência Maturação • Biossíntese e resposta ao etileno são alvos para engenharia genética Controlando a Senescência SAM ACC Etileno Expressão Gênica Maturação Senescência Métodos de controle de senescência incluem: – Desligando genes responsáveis pela síntese de etileno – Bloqueando a ação de etileno – Desligando genes expressos durante a maturação/senescência Crisântemo com gene cryA controle Cravo “White Sim” 8 dias pós-colheita 35S-antisenso aco controle PROTEÇÃO E REGISTRO DE CULTIVARES Vantagens de uma proteção efetiva para ornamentais a) amplo acesso via licenciamento aos produtos de vanguarda no mercado internacional. b) maior satisfação do consumidor, maior competitividade e maior absorção de mão-de-obra. • Consumo interno per capita hoje de US$ 7,00 • Consumo potencial pelo menos equivalente ao dobro. Vantagens de uma proteção efetiva para ornamentais c) Consolidação do Brasil como exportador de ornamentais no mercado internacional de flores (avaliado em US$ 48 bilhões anuais) e abertura de novos mercados. • Participação nacional neste mercado é de apenas 0,22% , mas o potencial do país permite um crescimento para cerca de 1,5% nos próximos anos. d) Mais fácil acesso de nossas exportações crescentes de ornamentais aos mercados preferenciais dos países desenvolvidos pela maior credibilidade da floricultura nacional; Vantagens de uma proteção efetiva para ornamentais e) Desenvolvimento de empresas nacionais de melhoramento genético em floricultura, que utilizem nossa diversidade natural para pesquisas de variedades novas brasileiras; f) Auto-sustentação, via royalties, dos setores de pesquisa governamentais ligados ao agro-negócio, (Embrapa, EPAGRI, IAC, ESALQ, FAPESP, entre outras Universidades). Situação atual : Ornamentais passíveis de proteção A Lei nº 9.456 de 25 de abril de 1997, promulgada juntamente com o Decreto nº 2366 de 5 de Novembro de 1997, criou o Sistema de Proteção de Cultivares no Brasil. No sistema atual brasileiro de proteção de cultivares uma flor ou planta só pode ser protegida se tiver seus descritores (características diferenciadoras de cada espécie ou gênero) publicados pelo Ministério de Agricultura, via órgão de proteção, no caso SNPC - Serviço de Proteção de Cultivares. Situação atual : Ornamentais passíveis de proteção Somente em 2002 foi publicado os descritores da primeira ornamental: a ROSA. Até o momento são protegíveis e dispõem de formulários com descritores publicados no site do MAPA link SNPC as seguintes espécies vegetais e/ou gêneros: 1. Amarílis ( Hippeastrum Herbl) 2. Antúrio (Anthurium Schott) 3. Aster (Aster L) 4. Begônia elator ( Begonia x Helmatis Forsch) Situação atual : Ornamentais passíveis de proteção 5. Bromélia (Guzmania spp) 6. Calanchoe (Kalanchoe Adans) 7. Cimbídio (Cymbidium Sw.) 8. Cravo ( Dianthus L) 9. Crisântemo (Chrysanthemun spp) 10. Estatice (Limonium Mill.,Goniolimon Boiss. E Psythostachys (Jausb e Spach) Nevski). 11. Gérbera ( Gerbera Cass) 12. Grama Esmeralda e Santo Agostinho (Zoysia japonica Stend e Slenolaphrumn Secundatum (Walt) Rutze) 13. Gipsofila (Gypsophila spp) 14. Hibisco ( Hibiscus rosa-sinensis) 15. Hipérico ( Hypericum L) 16. Lírio (Lilium L) 17. Poinsetia (Euphorbia pulcherrima Willd.Exklotzsch) 18. Rosa (Rosa L) 19. Solidago ( Solidago virgaurea L) 20. Violeta ( Saintpaulia H. Wendl) Quantidade de ornamentais protegidas hoje por espécie ou gênero: 15 variedades de ROSA 3 variedades de GRAMA 1 variedade de CRISÂNTEMO Em andamento atualmente processos de proteção para cerca de 40 novas variedades de ornamentais, incluindo crisântemos, rosas, bromélia, violeta e begônia. Não é muito se considerarmos que no mundo, 60 % das proteções concedidas são de ornamentais. Perigo ! Syngonathus chrisanthus (Sempre viva) Campo, rupestre (Santa Catarina) OBRIGADA!