Avaliação da imunogenicidade de antígenos - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
ADELIANE CASTRO DA COSTA
AVALIAÇÃO
DA
RECOMBINANTES
IMUNOGENICIDADE
DO
Mycobacterium
DE
ANTÍGENOS
tuberculosis
PARA
DESENVOLVIMENTO DE TESTE DE DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
PARA A TUBERCULOSE.
GOIÂNIA-GO, 2012
i
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas
(TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG
a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG,
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da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
[ X ] Dissertação
[ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a):
Adeliane Castro da Costa
CPF:
013.515.115-56
E-mail:
[email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página?
[ x ]Sim
[ ] Não
Vínculo Empregatício do autor
Agência de fomento:
País:
Título:
Aluno
Sigla:
CNPqFAPEG
Brasil
UF:
GO
CNPJ:
Avaliação da Imunogenicidade de Antígenos Recombinantes do Mycobacterium tuberculosis para
Desenvolvimento de Teste de Diagnóstico Sorológico para a Tuberculose.
Palavras-chave:
Tuberculose; Diagnóstico laboratorial; Imunidade Humoral
Título em outra língua:
Immunogenicity Evaluation of Recombinant Mycobacterium tuberculosis Antigens for
the Development of Serological Diagnostic Test.
Palavras-chave em outra língua:
Tuberculosis; Laboratory diagnosis; Humoral Immunity
Área de concentração:
Imunologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
28/02/2012
Programa de Pós-Graduação:
Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador(a):
Profª. Drª Ana Paula Junqueira-Kipnis
CPF:
E-mail:
37014692100
[email protected]
Co-orientador(a):
CPF:
E-mail:
3. Informações de acesso ao documento:
Liberação para disponibilização?1
[ ] total
[ X] parcial
Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões:
[ X ] Capítulos. Especifique: CAPÍTULO 3- PEDIDO DE PATENTE_____________
[ ] Outras restrições: _____________________________________________________
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______________________________
Data: ____ / ____ / _____
Assinatura do (a) autor(a)
. 1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão
deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão
sempre disponibilizados
ii
ADELIANE CASTRO DA COSTA
AVALIAÇÃO
DA
RECOMBINANTES
IMUNOGENICIDADE
DO
Mycobacterium
DE
ANTÍGENOS
tuberculosis
PARA
DESENVOLVIMENTO DE TESTE DE DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
PARA A TUBERCULOSE.
Dissertação
de
Mestrado
apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical
e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção
do Título de Mestre em Medicina
Tropical e Saúde Pública.
Orientadora:
Profª.
Drª
Ana
Paula Junqueira-Kipnis
GOIÂNIA-GO, 2012
iii
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
C837a
Costa, Adeliane Castro.
Avaliação da imunogenicidade de antígenos recombinantes do
Mycobacterium tuberculosis para desenvolvimento de teste de
diagnóstico sorológico para a tuberculose [manuscrito] / Adeliane
Castro da Costa. - 2012.
xv, 105 f. : il., figs, tabs.
Orientadora: Profª. Drª Ana Paula Junqueira Kipnis.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2012.
Bibliografia.
1. Tuberculose. 2. Diagnóstico laboratorial. 3.
Imunidade Humoral. I. Título.
CDU: 616.24-002.5
iv
Este trabalho é dedicado
Á Deus, meu pai, companheiro e amigo fiel.
“A Ele Toda Honra e Toda Glória”
Aos meus pais
Antônio Dias da Costa e
Aidê Castro da Costa
por terem me concedido a vida.
“Razão do meu viver”.
Aos meus irmãos
Vagner Castro da Costa e
Graciélia Castro da Costa,
“Sem vocês nada eu seria”.
"Há mais mistérios entre o céu e a terra do que pode sonhar a nossa vã filosofia".
(Shakespeare)
v
AGRADECIMENTOS
À professora Drª Ana Paula Junqueira-Kipnis por ter me dado crédito, instruções e
ensinamentos, soube desempenhar seu papel de mestre, atua como verdadeiro
lapidador de obras. Ela contribuiu e contribui em cada etapa deste mestrado e deste
trabalho. A ela devo minha formação, admiração e respeito. Foi uma honra tê-la
como orientadora, com toda certeza posso dizer que ao seu lado cresci. Meus
sinceros agradecimentos.
Ao professor Drº André Kipnis por participar da banca do exame de qualificação,
pelas orientações e materiais cedidos ao laboratório. Certamente contribuístes
diretamente a este trabalho e a minha formação. Por todo suporte científico doado
desde a escrita às correções finais deste manuscrito. Muito obrigada.
À professora Drª Irmtraut Araci Hoffmann Pfrimer por fazer parte de minha
formação acadêmica e aceitar participar de minha banca de qualificação e defesa.
Esteja certa de que é grande minha admiração por seu perfil profissional. Muito
obrigada.
Ao professor Drº João Alves de Araújo Filho por participar da banca do exame de
qualificação e defesa, por todas as orientações cedidas, as quais certamente foram
cruciais para lapidar este trabalho. Minha Gratidão.
À professora Drª Mara Carvalhaes por participar da banca do exame de
qualificação.
Suas
orientações
certamente
foram
valiosíssimas
para
o
aprimoramento deste trabalho. Muito obrigada.
À colega, colaboradora e amiga Drª Michelle Cristina Guerreiro dos Reis que foi
peça chave na construção dessa dissertação ao realizar o recrutamento e coleção
das amostras de plasma aqui utilizadas, além de contribuir com seu conhecimento
científico. Muitíssimo obrigada.
vi
À colega Msc. Cristina de Melo Cardoso Almeida por ter contribuído com o
recrutamento de pacientes e controles e coleção de amostras de soros utilizadas
neste estudo. Seu suporte certamente foi valioso para a construção desse trabalho.
Meus sinceros agradecimentos.
Ao Professor e Drº Afrânio Kritski e Drª Marta por terem doado amostras de soro
para a conclusão deste trabalho. Muito obrigada.
Ao aluno de doutorado Eduardo Martins de Souza por ter contribuído diretamente
na construção deste trabalho ao realizar a clonagem da proteína aqui utilizada.
Muito obrigada.
À Msc., colega, colaboradora e amiga Bruna Daniella de Sousa Silva por me
acompanhar durante o mestrado, sanando minhas principais dúvidas. Certamente
foi peça importante na construção deste trabalho e em minha formação. Meus
sinceros agradecimentos.
À colega, colaboradora e amiga Monalisa Martins Trentini por todo auxílio,
dedicação e entusiasmo em todos os experimentos. Muito obrigada.
Aos colegas, amigos e companheiros do laboratório de imunopatologia das doenças
infecciosas: Abadio, Aléx, André, Bruna, Danilo, Duanne, Eduardo, Fernando,
Letícia, Marcos, Mayara, Michelle, Monalisa, Patrícia, Juliana, Viviane, Camilla.
Agradeço ao companheirismo, a compreensão e a todos os momentos que passamos
juntos, todos contribuíram diretamente para meu crescimento pessoal e profissional.
Muito Obrigada.
Aos colegas e amigos do laboratório de Bacteriologia Molecular: Aline, Fábio,
Dellys, Rogério, Suellen, Lázaro. Muito obrigada pelo companheirismo e dedicação.
A todos os professores do IPTSP especialmente do departamento de imunologia.
Muito obrigada.
vii
Aos funcionários da secretaria geral e da secretaria do curso de pós-graduação:
Senhor Fernando, Valéria, Divina, José Clementino, Kariny, José Almi. Agradeço
toda assistência.
Aos Amigos: Zélia de Oliveira Meira, Teodora Ataíde, Edmilson Barbosa,
Donizete+, Adriana Cândido, Leonardo, Poliana Candido, Louvable Nunes, Marcos
E. Ferreira, Maria A. Borges, Glêisson J. de Jesus, Jailma Bastos, Patrícia S. de
Souza Hélio S. de Souza, Edivânia, Edivân, Jean Carlos, pela amizade e bom ânimo.
Muito obrigada.
Às agências de fomento CNPq, Sectec e FAPEG pelo financiamento do projeto.
Certamente seria inviável realizar este trabalho sem este apóio. Muito obrigada.
Ao CAPES pela bolsa de Mestrado. Muito obrigada.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho.
Muito obrigada.
viii
SUMÁRIO
1. CAPÍTULO 1- REVISÃO DE LITERATURA........................................................1
1.1. Epidemiologia........................................................................................................1
1.2. Agente Etiológico..................................................................................................2
1.3. Proteínas imunogênicas do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) utilizadas nesta
dissertação.....................................................................................................................4
1.4. Patogenia e Resposta Imune à Tuberculose...........................................................6
1.4.1. Linfócitos B........................................................................................................9
1.5. Diagnóstico da Tuberculose.................................................................................12
1.5.1. Bacteriológico...................................................................................................12
1.5.1.1. Baciloscopia...................................................................................................12
1.5.1.2. Cultura............................................................................................................13
1.5.1.3. Histopatológico..............................................................................................13
1.5.1.4. Interferon-Gamma Release Assays (IGRAs)……………...……...…..…….13
1.5.1.5. Testes sorológicos utilizados em pesquisa para diagnóstico da TB..............15
1.6. JUSTIFICATIVA................................................................................................19
2. CAPÍTULO 2- RESPOSTA IMUNE HUMORAL AO ANTÍGENO rGROES DO
Mycobacterium tuberculosis EM PACIENTES COM TUBERCULOSE E SEUS
CONTATOSDOMICILIARES...................................................................................20
2.1. OBJETIVOS........................................................................................................21
2.1.1. Objetivo Geral...................................................................................................21
2.1.2. Objetivos específicos....................................................................................... 21
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................22
2.2.1. População de Estudos...................................................................................... 22
ix
2.2.2. Coleta das amostras...........................................................................................22
2.2.2. Prova Tuberculínica (PT)................................................................................. 23
2.2.4. Antígeno Protéico............................................................................................ 23
2.2.5. Anticorpos Conjugados.....................................................................................23
2.2.6. ELISA (Ensaio Imuno-Enzimático)..................................................................23
2..2.7. Análise Estatística............................................................................................24
2.3. Resultados............................................................................................................25
2.3.1. Características Clínicas e Epidemiológicas......................................................25
2.3.2. Padronização de Ensaio Imuno-enzimático (ELISA) utilizando antígeno
rGroEs do Mycobacterium tuberculosis.....................................................................27
2.3.3. Detecção de anticorpos das classes IgM e IgG em amostras de plasma de
pacientes com Tuberculose Pulmonar e Contatos domiciliares no momento do
diagnóstico por ensaio imunoenzimático (ELISA).....................................................29
2.3.4. Discussão..........................................................................................................32
2.3.5. Conclusões........................................................................................................35
3. CAPÍTULO 3- AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DA PROTEÍNA DE
FUSÃO
MPT-51_HspX_AG85
PARA
DESENVOLVIMENTO
DE
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO PARA A TUBERCULOSE.................................36
3.1. Objetivos..............................................................................................................37
3.1.1. Objetivo Geral...................................................................................................37
3.1.2. Objetivos Específicos........................................................................................37
3.2. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................38
3.2.1. População de Estudos...................................................................................... 38
3.2.2. Controles Saudáveis..........................................................................................38
3.2.3. Coleta das amostras e realização da Prova Tuberculínica (PT)........................39
3.2.4. Antígenos recombinantes protéicos..................................................................39
3.2.4. 1. Transformação de plasmídio pET23a/Fusão em E.coli BL21 pLysS..........39
3.2.4.2. Indução da Expressão Protéica......................................................................40
x
3.2.4.3. Purificação de Proteínas em condição desnaturante......................................40
3.2.5. Padronização de ELISA com Proteína de Fusão..............................................41
3.2.5.1. Padronização de ELISA (Ensaio Imuno-Enzimático) com Proteína de
Fusão...........................................................................................................................41
3.2.5.2.
ELISA
Indireto
para
Detecção
de
IgM
e
IgG
sérica...........................................................................................................................42
3.2.5.3. Ensaio de Competição....................................................................................42
3.3. Validação de Ensaio de ELISA para detecção de anticorpos Séricos específicos
para a Proteína de Fusão.............................................................................................43
3.4. Análise Estatística................................................................................................44
3.5. RESULTADOS...................................................................................................45
3.5.1. Dados Clínicos e Epidemiológicos da População de Estudos..........................45
3.5.2. Análise da expressão e purificação da proteína de fusão recombinante...........46
3.5.3. Padronização do ELISA para detecção de anticorpos séricos das classes IgM e
IgG específicos para a proteína de fusão....................................................................50
3.5.4. Reconhecimento da proteína de fusão por anticorpos séricos IgG em pacientes
com TB pulmonar ativa, utilizando a técnica de ELISA............................................51
3.5.5. Reconhecimento da Proteína de Fusão por anticorpos Séricos IgM em
pacientes com TB pulmonar ativa, utilizando a técnica de ELISA........................... 53
3.5.6. Ensaio de Competição.......................................................................................56
3.7. DISCUSSÃO.......................................................................................................58
3.8. CONCLUSÕES...................................................................................................64
3.9.REFERÊNCIAS....................................................................................................65
4. ANEXOS................................................................................................................83
xi
TABELAS E FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figuras
Figura 1. Representação da parede celular do Mtb. A bactéria está envolta por uma
membrana citoplasmática que permanece abaixo de peptidoglicano rígido (PG). A
parede celular é composta por arabinogalactana, proteínas, lipoarabinomanana
(LAM), ácidos micólicos e glicolipídios.
Adaptado de Gorocica et
al.
2005...............................................................................................................................3
Figura 2. Padronização de ELISA utilizando antígeno rGroES nas concentrações de
5µg/ml
(Linear)
e
10µg/ml
(Pontilhado),
nas
diluições
de
1/5,1/10,1/20,1/40,1/80,1/160,1/320 e 1/640, utilizando plasma de indivíduos com
TB, controle PT- e controle PT+, para avaliação da resposta imune humoral em
ambas as concentrações de antígeno...........................................................................28
Figura 3. Níveis de anticorpos da classe IgM no plasma de pacientes com
tuberculose ativa e contatos intradomiciliares (CID) PT- e PT+, no momento do
diagnóstico, contra o antígeno recombinante MtGroES. * Diferença estatística entre
os pacientes TB ativa e CID PT-.*p= 0.0497, test t de Student. Pacientes: n= 45;
contatos: n= 96 PT- e contatos: n=76 PT+.................................................................30
Figura 4. Níveis de anticorpos da classe IgG no plasma de pacientes com
Tuberculose ativa e contatos intradomiciliares (CID) PT- e PT+, no momento do
diagnóstico, contra o antígeno recombinante MtGroES.* Diferença estatística entre
os pacientes TB ativa e CID PT-.*p= 0.0168, test t de Student. Pacientes: n= 37;
contatos: n= 85 PT- e contatos: n=56 PT+.................................................................31
Figura 5. Gel de poliacrilamida 12% corado com azul de comassie, com materiais
coletados nas diferentes fases da purificação da proteína recombinante. Peso
Molecular (PM), Sobrenadante (SN), ELUATO, Primeiro Lavado (1ºLAV), Segundo
Lavado (2º LAV), Terceiro Lavado (3º LAV), Primeira Eluição (1ºELU), Segunda
xii
Eluição
(2º
ELU).
Proteína
de
Fusão
(30
kD)..............................................................................................................................47
Figura 6. Gel de poliacrilamida 12% corado com azul de comassie, com
repurificação dos materiais coletados nas diferentes fases da purificação da proteína
recombinante. Primeiro Lavado (1ºLAV), Segundo Lavado (2º LAV), Primeira
Eluição
(1ºELU),
Segunda
Eluição
(2º
ELU).
Proteína
de
Fusão
(30
kD)..............................................................................................................................48
Figura 7. Gel de poliacrilamida corado com azul de comassie para quantificação da
proteína de fusão recombinante purificada. Concentrações decrescentes da proteína
de fusão foram aplicadas no gel para comparar com concentrações decrescentes de
BSA............................................................................................................................ 49
Figura 8. Padronização de ELISA utilizando proteína de fusão nas concentrações de
5µg/ml (Pontilhado) e 10µg/ml (Linear), nas diluições de 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80,
1/160, 1/320 e 1/640, utilizando pool de soro de indivíduos com TB e pool de soros
de controle PT-, para verificar a concentração ideal de antígeno e diluição ideal de
soros a serem testados nos ensaios. Neste ensaio foi dosado anticorpos séricos da
classe IgG.
Em a, resultados adicionando o grupo de indivíduos PT
positiva........................................................................................................................50
Figura 9. Níveis de anticorpos da classe IgG em amostras de soro, diluídos em 1/40,
de pacientes com Tuberculose ativa e grupo controle saudável, específicos para a
proteína de fusão. Diferença estatística entre os pacientes TB ativa e grupo controle
saudável, ****p< 0, 0001, test t de Student. Pacientes: n= 34 e controles negativos:
n= 35...........................................................................................................................51
Figura 10. Curva ROC do ensaio de ELISA para verificar a sensibilidade e
especificidade do teste para a dosagem de IgG de indivíduos com TB pulmonar Ativa
e
um
grupo
controle.......................................................................................................................52
xiii
Figura 11. Níveis de anticorpos da classe IgM em amostras de soro, diluídos em
1/40, de pacientes com Tuberculose ativa e grupo controle saudável, específicos para
a proteína de fusão. Diferença estatística entre os pacientes TB ativa e grupo controle
saudável, ****p<0, 0001, test t de Student. Pacientes: n= 35 e controles negativos:
n= 39...........................................................................................................................54
Figura 12. Curva ROC do ensaio de ELISA para dosagem de IgG contra a proteína
de
fusão
de
indivíduos
com
TB
pulmonar
ativa
e
um
grupo
controle.......................................................................................................................55
Figura 13. Resultado de Ensaio de Competição. Níveis séricos de anticorpos da
classe IgG em amostras de soro, diluídos em 1/40, de nove (9) pacientes com
tuberculose ativa e nove (9) indivíduos controle saudáveis, antes e após incubação
prévia
com
o
antígeno
específico....................................................................................................................57
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabelas
Tabela 1. Dados sócio-epidemiológicos dos pacientes com TB e contatos
domiciliares.................................................................................................................26
Tabela 2. Dados para a validação de ensaio de ELISA. Legenda: A (Verdadeiros
Positivos (VP)); B (Falsos Positivos (FP)); C (Falsos Negativos (FN)) e D
(Verdadeiros Negativos (VP)); A+B (Total de Positivos no teste); C+D (Total de
negativos
no
teste);
SE
=Sensibilidade
e
ES
=Especificidade...........................................................................................................44
Tabela 3. Dados Clínicos e Epidemiológicos da População de Estudo, composta por
indivíduos
com
Tb
e
controles
saudáveis.................................................................................................................... 45
xiv
Tabela 4. Sensibilidade, especificidade e valores preditivos do teste pata detecção de
anticorpos
IgG
específicos
para
proteína
de
fusão............................................................................................................................53
Tabela 5. Sensibilidade, especificidade e valores preditivos do teste para detecção de
anticorpos
IgM
específicos
para
proteína
de
fusão............................................................................................................................56
Quadro
Quadro 1. Sensibilidade, especificidade e Área sob a Curva (AUC) dos testes de
ELISA
usados
em
pesquisa
para
o
diagnóstico
da
TB.............................................................................................................................. 18
xv
ABREVIATURAS
FN- Falso Negativo
AIDSdo
inglês:
Acquired
Immunodeficiency Syndrome
FP- Falso Positivo
AUC- do inglês: Area Under the
Curve
HDTAA- Hospital de
Tropicais Anuar Auad
Doenças
BAARBacilo
Resistente
HIVdo
inglês:
Immunodeficiency Virus
Human
Álcool
Ácido
HRPdo
peroxidase
BCG- Bacilo Calmette-Guérin
inglês:
Horseradish
BCR- Receptor de Célula B
HSP- do inglês: Heat Shock Protein
BK- Bacilo de Koch
IC - Intervalo de Confiança
BSA- do
Albumin
inglês:
Bovine
Serum
IgA- Imunoglobulina A
CAIS- Centros de Assistência Integral
à Saúde
CEPMHA-Comitê de Ética em
Pesquisa Médica Humana e Animal
IgG- Imunoglobulina G
IgM- Imunoglobulina M
IGRAs- Ensaio
Interferon Gama
de
Pesquisa
de
CFP10- do inglês: Culture filtrate
protein of 10kDa
IP-10- do inglês: inducible protein 10
CID- Contatos Intradomiciliares
IL-Interleucina
CSU- Colorado State University
IFN-γ- Interferon Gama
DOTSCurso
de
Tratamento
diretamente Observado Curto
LAM- Lipoarabinomanana
E1- Isoniazida,
Pirazinamida
EIR- Rifampicina,
Etambutol
Rifampicina
e
Isoniazida
e
ELISA- Ensaio Imunoenzimático
ESAT- do inglês: primary antigen
secretion
FAPEG- Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de Goiás
LB Ágar- Ágar Lúria Bertani
LM - Lipomanana
LPS- Lipopolissacarídeo
MHC- Complexo de
Histocompatibilidade Principal
MS- Ministério da Saúde
Mtb- Mycobacterium tuberculosis
NK- Células Natural Killer
xvi
NO- Óxido Nítrico
QFT-GIT- QuantiFERON-TB Gold
In-Tube
OMS ou WHO - Organização Mundial
de Saúde
ROC- Receiving Operating Curve
OPD- Ortophenilenediamina
SES- Secretaria do Estado da Saúde
PAMPsPadrões
Moleculares
Associados aos Patógenos
Spais- Superintendência de Políticas e
Atenção Integral à Saúde
PBMC- do inglês: Peripheral blood
mononuclear cells
SVS- Secretaria de Vigilância e Saúde
TB – Tuberculose
PBS-Tampão Salina Fosfato
TB-DOTtherapy
PG - Peptideoglicano
PT- do inglês:
Derivative
Purified
Protein
PPE- Proteína codificada pelo gen
Rv2430c do Mtb
TB-directly
observed
Th- Linfócito T Auxiliar
TLR- Toll-like receptor (Receptor
Semelhante ao Toll)
TNF-α- Fator de Necrose Tumoral alfa
PRR- do inglês: Pattern Recognition
Receptor
VPN- Valor Preditivo Negativo
PT- Prova Tuberculínica
VPP- Valor Preditivo Positivo
PstSt- do inglês: phosphate binding
proteins
WT-Selvagem
ii
RESUMO
Título: Avaliação da imunogenicidade de antígenos recombinantes do
Mycobacterium tuberculosis para o desenvolvimento de teste de diagnóstico
sorológico para Tuberculose.
Introdução: A Tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo
Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Segundo a OMS um terço da população mundial
está infectado pelo Mtb e cerca de 5% destes indivíduos desenvolverão a doença
ativa. Este agente, Mtb, pode afetar vários órgãos, tendo o pulmão como principal
alvo (TB Pulmonar). O diagnóstico da TB pode ser confirmado pela baciloscopia em
amostras biológicas. Porém, esta técnica apresenta uma sensibilidade variável (35% a
85%), portanto sugere-se o desenvolvimento de novos métodos laboratoriais que
melhorem este desempenho. Esta dissertação teve como primeiro objetivo avaliar a
imunogenicidade e antigenicidade da proteína GroES recombinante de Mtb em
pacientes com TB e seus contatos domiciliares, e como segundo objetivo, avaliar a
performance de uma proteína de fusão recombinante expressando epítopos
imunodominantes de proteínas previamente identificadas como imunogênicas e
antigênicas: Antígeno 85C, MPT-51 e Hsp-X na discriminação de pacientes com TB
ativa de controles saudáveis de área endêmica.
Métodos: No primeiro estudo utilizou-se uma população de 45 pacientes com TB
ativa e 172 contatos intradomiciliares (CID). No segundo estudo, 35 pacientes com
TB ativa e 39 indivíduos controles saudáveis. Todos os indivíduos que aceitaram
participar foram submetidos à prova tuberculínica (PT) e a coleta de sangue para
obtenção de plasma e soro. Foi realizado o método de ELISA indireto para pesquisa
de anticorpos das classes IgG e IgM anti-GroES e anti proteína de fusão.
Resultados e conclusões: Os resultados para o rGroES demonstraram que para o
IgM-rGroES, CID, PT negativa, apresentaram níveis de anticorpos (0.233±0.142)
superiores aos pacientes (0,193±0,140; p=0,0497). IgM-rGroES não apresentou
diferença entre TB ativa e CID, PT positiva (0,213±0,151). Para o IgG-rGroES, os
indivíduos com TB ativa apresentaram níveis superiores (0,203±0,214), quando
comparados aos CID PT negativo (0,121±0,145; p=0,0168). Para o IgG-rGroES, com
um ponto de corte de 0,052 a sensibilidade foi 78,38% (IC95%: 61,8-90,2%); a
especificidade foi 31,76% (IC95%: 22,1-42,8%). Os indivíduos com TB ativa
apresentaram IgG-rGroES (0,203±0,214) semelhantes aos CID PT positivo
(0,167±0,181). Concluindo, o rGroES é um antígeno imunogênico e antigênico, pois
foi reconhecido pela resposta imune humoral de indivíduos com TB ativa e TB
latente. Os resultados para a proteína de fusão demonstraram que para IgG,
indivíduos com TB ativa apresentaram níveis de anticorpos superiores (0,407±0,141)
aos controles saudáveis (0,167±0,072; p<0,0001). Com ponto de corte de 0,179 a
sensibilidade foi 100% (IC95%: 89,72-100%); a especificidade foi 71,4% (IC95%:
53,70-85,36%). Para IgM-proteína de fusão, indivíduos com TB ativa apresentaram
níveis superiores (0,305±0,09), que os controles saudáveis (0,212±0,057; p<0,0001).
Com um ponto de corte de 0,226, a sensibilidade foi 80,0% (IC95%: 63,06-91,56%);
a especificidade foi 61,54% (IC95%: 44,62-76,64%). Concluímos que o teste de
ELISA com a Proteína de Fusão pode ser utilizado para o preparo de um kit de
diagnóstico da TB uma vez que apresenta uma sensibilidade e especificidade
superiores que as encontradas no teste padrão ouro.
Palavras-chave: Tuberculose; Diagnóstico laboratorial; Imunidade Humoral
ii
ABSTRACT
Title: Immunogenicity evaluation of recombinant Mycobacterium tuberculosis
antigens for the development of serological diagnostic test.
Introduction: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium
tuberculosis (Mtb). According to the WHO, one-third of the world population is
infected with Mtb and about 5% of these individuals will develop active disease. Mtb
can affect various organs, having the lungs as its main target (pulmonary TB). TB
diagnosis can be confirmed by the presence of alcool acid resistant bacilli in
biological samples. However, this technique has a variable sensitivity (35% to 85%)
therefore, it is necessary the development of new laboratory methods. The first
objective of this work was to evaluate the immunogenicity and antigenicity of the
recombinant protein GroES from Mtb using an indirect ELISA in TB patients and
their household contacts; the second objective was evaluate the performance of a
recombinant fusion protein expressing immunodominant epitopes previously
identified as immunogenic and antigenic: Antigen 85C, MPT-51 and Hsp-X in the
discrimination of patients with active TB from healthy controls from endemic areas.
Methods: This is a transversal study. In the first study it was tested the recombinant
GroES antigen in an indirect ELISA and the study population was constituted of 45
patients with active TB and 172 healthy household contacts (HHC). The second
study tested a recombinant fusion protein in an indirect ELISA and the study
population was, composed by 35 patients with active TB, and 39 healthy control
subjects (HC). All individuals who agreed to participate underwent tuberculin skin
test (TST) and blood samples were withdrawn to obtain plasma and serum. We
performed an indirect ELISA for IgG and IgM specific to GroES and the fusion
protein.
Results and conclusions: The results showed that in the IgM-ELISA specific for
rGroES, the HHC, TST negative individuals, had antibody levels (0.233 ± 0.142)
higher than active TB patients (0.193±0.140;p=0.0497). No differences were
observed between active TB and HHC, TST positive for IgM specific to rGroEs. For
the IgG-ELISA specific for rGroES, individuals with active TB had higher levels
(0.203±0.214) when compared to HHC-TST negative (0.121±0.145; p=0.0168). For
the IgG-ELISA-rGroES, using a cut-off of 0.052, the sensitivity was 78.38% (95%
CI: 61.8 to 90.2%), and the specificity was 31.76% (95% CI: 22.1 to 42.8%).
Individuals with active TB had IgG-rGroES (0.203±0.214) similar to the HHC,
TST+ (0.167±0.181). In conclusion, the rGroES an antigen is immunogenic and
antigenic, it was recognized by the humoral immune response of individuals with
active and latent TB. The results for the ELISA specific for the fusion protein
showed for IgG, that patients with active TB had higher antibody levels
(0.407±0.141), than healthy controls (0.167±0.072; p<0.0001). The cutoff of 0.179
allowed a sensitivity of 100% (95% CI: 89.72-100%); and the specificity was 71.4%
(95% CI: 53.70-85.36%). ELISA for specific IgM to fusion protein, showed that
individuals with active TB presented higher levels (0.305±0.09), than the healthy
controls (0.212±0.057; p<0.0001). In this case, using a cutoff of 0.226, the sensitivity
was 80.0% (95% CI: 63.06-91.56%), and the specificity was 61.54% (95% CI:
44.62-76.64%). We conclude that the indirect ELISA using the fusion protein
presented the best performance and can be improved in order to prepare a kit for the
diagnosis of TB.
Keywords: Tuberculosis; Laboratory diagnosis; Humoral Immunity
iii
CAPÍTULO 1 - REVISÃO DA LITERATURA
1.1. Epidemiologia
A Tuberculose (TB) é uma doença contagiosa causada pelo Mycobacterium
tuberculosis (Mtb) que infecta cerca de um terço da população mundial. Estima-se que a TB
provoca em torno de oito milhões de novos casos e cerca de dois milhões de mortes por ano
(WHO 2009). O Mtb pode afetar vários órgãos, mas acomete principalmente os pulmões (TB
Pulmonar). As principais manifestações da doença pulmonar são: tosse produtiva com mais
de 15 dias, febre vespertina baixa, suor noturno, dor no tórax e perda de peso (Jackett et al.
1988).
Uma das principais preocupações da Organização Mundial de Saúde (OMS) em
relação a TB são os casos em que a doença está associada ao Vírus da Imunodeficiência
Humana (HIV). Segundo a WHO, em 2009 a TB foi responsável por 9,4 milhões de casos
novos, sendo que destes, 1,1 milhões estavam infectados pelo HIV. Neste mesmo ano, a
doença causou a morte de 1,7 milhões de pessoas, sendo que destas 380 mil estavam
infectadas pelo HIV. Atualmente, a taxa de incidência global atinge 137 casos por 100 mil
habitantes (WHO 2010).
Nas Américas, o Brasil e o México detêm 50% dos casos de TB, sendo que o Brasil
ocupa o 19º lugar entre os 22 países que concentram 80% de todos os casos no mundo, com
cerca de 5000 mortes causadas por todas as formas clínicas da tuberculose (pulmonar e extra
pulmonar). A cada ano são notificados no país 85 mil casos novos, possuindo cerca de 50
milhões de infectados (MS/SVS 2010)
Em 2010 foram notificados 856 casos novos de tuberculose, com incidência de 14,6
casos a cada 100.000 habitantes, uma das menores do país. Neste estado, Goiânia é um dos
municípios que exige atenção prioritária do Programa Nacional de Controle de Tuberculose
(MS/SVS 2011).
1
1.2. Agente Etiológico
O agente causador da TB é o bacilo de Koch, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), uma
micobactéria pertencente à ordem Actinomycetales, subordem Corynebacteriaceae, família
das Mycobacteriaceae e gênero Mycobacterium. O Mtb pertence a um complexo denominado
Complexo Mycobacterium tuberculosis, sendo constituído de seis espécies que incluem M.
africanus, M. bovis, M. canettii, M. microti, M. pinnipedii e M. caprae. Entretanto, somente o
M. africanus, M. bovis e o M. tuberculosis (Mtb) causam tuberculose humana (Roberts et al.
1991).
Os bacilos do Mtb consistem em bastonetes aeróbicos imóveis e não esporulados,
caracterizados por serem finos retos e por não produzirem toxinas. Eles medem de 1 a 4 µm
de comprimento por 0,2 a 0,6 µm de diâmetro. Possuem longo período de duplicação (16 a 20
horas) dependendo da oferta de oxigênio, de nutrientes e do pH do meio. Seu cultivo pode ser
realizado in vitro em meios de cultura enriquecidos, sólidos ou líquidos, como LowensteinJensen e Middlebrook 7H10 ou 7H11(Crump et al. 2003; Adler et al. 2005).
Por apresentar em sua parede celular composição rica em lipídios, os bacilos possuem
uma superfície hidrofóbica fazendo com que sejam resistentes a muitos desinfetantes e
corantes comuns de laboratórios. Dificilmente coram-se pelo método de Gram devido às
características da sua parede celular, apesar de serem classificados como Gram positivos. O
complexo de ácidos micólicos, arabinogalactanas, e peptidoglicano presentes na parede
celular, constituem uma barreira periférica hidrofóbica, que durante a coloração por ZiehlNielsen retém a fucsina, não sendo descorados pelo álcool-ácido. Os ácidos micólicos (ácidos
graxos de cadeia longa) parecem ser o suporte molecular da álcool-ácido-resistência (BAAR)
(Aderem & Underhill 1999).
O envelope do bacilo Mtb apresenta três componentes: membrana citoplasmática,
parede celular, e uma cápsula externa. A membrana citoplasmática de micobactérias é
composta por fosfolipídeos que são compartilhados pela família Actinomycetales (Mahapatra
et al. 2005). A parede celular das micobactérias é bastante complexa, rica em lipídios e
recoberta por uma espessa camada de peptidoglicano. A cápsula externa não está bem
delimitada das outras camadas, embora represente o conjunto de componentes do envelope do
Mtb.
Na membrana plasmática estão ancorados alguns glicolipídios tais como
fosfatidilinositol, manosídeos, lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM), os quais se
2
estendem até o exterior da parede celular. A LAM parece ter um importante papel na
virulência das diferentes espécies de micobactérias (Briken et al. 2004). A camada de
peptidoglicanos forma a base na qual estão ligados arabinogalactana, que são polissacarídeos
ramificados nos quais se ligam lipídios, glicolipídios e peptidoglicanos adicionais, como
apresentado na figura 1.
Figura 1. Representação da parede celular do Mtb. A bactéria está envolta por uma
membrana citoplasmática que permanece abaixo de peptidoglicano rígido (PG). A parede
celular é composta por arabinogalactana, proteínas, lipoarabinomana na (LAM), ácidos
micólicos e glicolipídios. Adaptado de Gorocica et al. 2005.
A parede celular protege o conteúdo da célula, fornece suporte mecânico, sendo
responsável pela morfologia da bactéria. Atravessando o envelope, desde a membrana
citoplasmática, alguns glicolipídeos como a fosfatidilinositol, além de certas proteínas
chamadas porinas formam canais hidrofílicos os quais permitem a passagem passiva de
solutos através da camada de ácido micólico (Briken et al. 2004).
A cápsula que está presente no envelope do Mtb representa um conjunto de
componentes constituídos por proteínas, polissacarídeos e pequenas quantidades de lipídios
em seu interior. O envelope do bacilo da tuberculose parece ser uma estrutura dinâmica que
pode ser remodelado quando o microrganismo está crescendo ou persistindo em diferentes
ambientes (Kremer et al. 2005). Um exemplo de proteína constituinte da cápsula é o antígeno
85c (Ag85c) que tem atividade de micolil transferase, participando da síntese dos ácidos
micólicos, contribuindo para a manutenção da integridade da parede e com a patogenicidade
do Mtb (Draper et al. 2005).
3
1.3. Proteínas imunogênicas do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) utilizadas nesta
dissertação
Com o avanço da biologia molecular foi possível realizar o sequenciamento gênico do
Mtb para investigação de proteínas que podem estar envolvidas na patogenicidade, virulência
ou mecanismos de evasão do bacilo. Já foi possível identificar um grande número dessas
proteínas, sendo que muitas delas têm funções conhecidas (Cole et al. 1998; Nagai et
al.1991). A caracterização imunológica dessas proteínas revelou que algumas delas são
potencialmente imunogênicas in vivo, em modelos humanos e animal (Turneer et al.1988;
Rabahi et al. 2007; Almeida et al. 2008; Reis et al. 2009). Dentre as caracterizadas, as
proteínas GroES, MPT-51, Complexo Ag 85, HspX , ESAT-6, CFP-10 e GLcB estão sendo
largamente estudadas (Sable et al. 2005).
O antígeno GroES (Rv3418c), também conhecido como HSP10 (Boesen et al.1995),
possui de 10kDa a 14kDa e é codificado pela região gênica groES. Faz parte das proteínas de
choque térmico (heat shock proteins- HSP) com atividade de chaperonina, produzida e
secretada pelo Mtb quando este se encontra em condições de estresse. O GroES é uma
proteína altamente conservada entre espécies e seus homólogos estão presentes em células
procariotas, tais como, M. avium, M. leprae, M. intracellulare, E. coli, dentre outras (Young
et al. 1988; Hussain et al. 2004; Aravindhan et al. 2007). O GroES do Mtb apresenta uma
região C terminal, distinta da proteína do M.leprae (Chua-Intra et al. 2002). O GroES se
apresenta na forma oligomérica de anel composta entre seis a oito subunidades idênticas. Esta
proteína atua de maneira sincronizada para a liberação das proteínas dobradas pelo GroEL,
uma chaperonina codificada pela região groEL (Chua-Intra et al. 2002). A imunogenicidade
deste antígeno já foi comprovada uma vez que é capaz de ser reconhecido por linfócitos de
indivíduos com TB ativa ou reatores ao PT (latente) (Arend et al. 2000; Boesen et al. 1995).
Além disso, indivíduos saudáveis recém-vacinados com BCG também são capazes de
reconhecer o GroES (Boesen et al. 1995; Ravn et al. 1997).
O MPT-51(Rv3803c) é uma proteína de 27-kDa codificada pelo gene fbpC1 do
genoma do Mtb, M. leprae, M. avium e M. bovis BCG (Nagai et al.1991; Rinke de Wit et al.
1993; Ohara et al. 1997b). Esta proteína liga-se à fibronectina da matriz extracelular, processo
o qual pode determinar sua fixação nos tecidos do hospedeiro e sua virulência (Kitaura et al.
2000). Além disso, o MPT-51 apresenta importância significativa como marcador de
4
diagnóstico da TB, permitindo sua detecção precoce, especialmente em pacientes com AIDS
(Ramalingam et al. 2003; Almeida et al. 2008).
O complexo antigênico Ag 85 é composto pelas proteínas Ag 85C (Rv 0129c), Ag85A
(Rv3804c) e Ag85B (Rv1886c), sendo codificadas pelos genes fbpC2, fbpA e fbpB
respectivamente, apresentando peso molecular que varia entre 30 a 32-kDa (Ohara et al.
1997a). O Ag 85C possui atividade micolil transferase, participando da síntese do ácido
micólico que faz parte da constituição da parede celular das bactérias, contribuindo para
manutenção de sua integridade e patogênese do Mtb (Harth et al. 2002; Sanki et al. 2009).
Devido a sua característica imunodominante, o Ag85C vem sendo avaliado como forte
candidato a marcador de diagnóstico da tuberculose (Samanich et al. 2000; Kashyap et al.
2010).
O antígeno HspX (Rv2031c), é uma proteína de choque térmico, codificado pela
região gênica acr, com peso molecular de 16-kDa, também conhecida como proteína αcristalina (Chang et al. 1996). O antígeno HspX tem ação de chaperonina, o qual auxilia na
conformação final das proteínas (Qamra et al. 2005). Estudos demonstraram que
micobactérias deficientes do gene Acr reduzem seu crescimento dentro dos macrófagos.
Condições que induzem um ambiente intracelular com hipóxia e presença de doadores de NO,
permitem a prevalência de transcritos do HspX (Yuan et al. 1998). Em infecções humanas,
este antígeno parece ser expresso preponderantemente na fase latente da tuberculose,
desencadeando resposta imune tanto humoral quanto celular (Rabahi et al. 2007). Por todos
estes fatores, o antígeno HspX é considerado potente biomarcador da tuberculose latente
(Spratt et al. 2010).
O ESAT-6 (do inglês Early Secreted Antigen Targed 6) e CFP-10 (do inglês Culture
filtrate protein 10) são codificadas na região RD-1 do gene (do inglês Regions of Difference
1) de várias espécies do complexo M. tuberculosis, exceto nos subtipos do M. bovis BCG
(Sorensen et al.1995). Esses antígenos são usados em estudos de testes diagnósticos, como
QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) e TSPOT.TB (Chee et al. 2010; Ling et al.
2011). Possuem alta sensibilidade e especificidade in vitro e in vivo para diagnóstico baseado
na detecção de interferon gama (Zhang et al. 2006).
O GLcB (Rv1837c) é um antígeno protéico codificado pelo gen GlcB do M.
tuberculosis e do M.leprae. É uma enzima malato sintetase G, de 80-kDa, que utiliza a via
glioxalato, permitindo que a bactéria assimile o composto carbono, necessário para sua
5
replicação dentro do macrófago (Smith et al.2003), tem sido vista na participação da
virulência do M. tuberculosis ( Kinhikar et al. 2006).
Diversos outros antígenos protéicos do M. tuberculosis são estudados e publicados na
literatura. Alguns antígenos como, 88-kDa, MPT32, PPE (Rv2430c), MTB-48, PstS1 e
proteína indutora 10 (IP-10) são testados isolados ou em complexos na tentativa de melhorar
a acurácia dos testes diagnóstico (Quadro 1).
1.4. Patogenia e Resposta Imune à Tuberculose
A primeira linha de defesa contra patógenos que entram nos pulmões, como por
exemplo, o Mtb, são macrófagos, granulócitos e células dendríticas. Os macrófagos alveolares
são as primeiras células a interagirem com o bacilo. Estudos demonstram que tanto em
humanos como em camundongos os macrófagos alveolares reconhecem os PAMPs do Mtb
por meio de receptores de reconhecimento do padrão (PRR‘s) presentes nessas células, os
quais permitem a ativação e fagocitose do bacilo. Entre os PRRs podem-se citar os receptores
para Fc de imunoglobulinas, complemento, manose, proteína surfactante, CD14, e CD43
(Schlesinger et al. 1990; Peterson et al. 1995; Zimmerli et al. 1996; Randhawa et al. 2005).
Fragmentos da proteína C3 do complemento são capazes de opsonizar antígenos do Mtb,
permitindo uma interação com os receptores CR1, CR3 e CR4 presentes nos macrófagos
(Maglione & Chan 2009). É importante observar que independente do receptor utilizado na
interação com o macrófago, o colesterol, presente na membrana celular, favorece a
ancoragem e assim a internalização da bactéria (Gatfield et al. 2000; Pieters 2001). Já foi
demonstrado in vitro que a interação dos bacilos do Mtb com os receptores Fc de
imunoglobulinas de macrófagos promove o aumento da produção de intermediários reativos
de oxigênio, permitindo que ocorra a fusão dos fagossomos com os lisossomos (Armstrong et
al. 1975). Em contrapartida, quando as bactérias interagem com o CR3 há impedimento da
explosão respiratória, em um processo que impede a fusão dos fagossomos com os lisossomos
(Sturgill-Koszycki et al. 1994).
A capacidade de inibir a fusão do fagossoma com o
lisossoma, a modulação do padrão de morte de células infectadas, além da propriedade de se
reproduzir dentro do compartimento endossomal dá ao bacilo a capacidade de sobrevivência
dentro dessas células (Flynn & Chan 2001).
Após estarem infectados, os macrófagos alveolares produzem principalmente IL-12 e
TNF-α e quimiocinas que atuam no recrutamento de outras células para o local da infecção. A
6
IL-12 pode aumentar o reconhecimento de antígenos do Mtb por linfócitos T, induzindo sua
proliferação em sinergismo com a IL-2, agindo como fator de crescimento durante a fase
precoce de expansão dos linfócitos T em infecções pelo Mtb. Além disso, amplia o
recrutamento de linfócitos T citotóxicos para o local da infecção, induz a produção de IFN-γ
pelas células natural killer (NK) e linfócitos T. Enquanto o IFN-γ aumenta a produção de
TNF-α pelos monócitos infectados por Mtb, o TNF-α induz a produção de IFN-γ pelas células
NK (Bancroft et al. 1989; Sampaio et al.1992). O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que
exerce efeito microbicida em macrófagos humanos infectados pelo Mtb, sendo importantes
para a formação do granuloma e contenção da micobactéria em macrófagos de murinos
(Barnes et al. 1990).
As células NK desempenham um papel importante na TB humana, as quais regulam
diferentes aspectos da resposta imune. Estas células possuem maior citotoxicidade contra
macrófagos infectados com Mtb, além de aumentar a capacidade dos linfócitos T CD8 + para
produzir IFN-γ e para lisar células infectadas com Mtb, fazendo uma conexão entre a resposta
imune inata e a resposta imune adaptativa (Vankayalapati 2002 & Vankayalapati 2004). Há
ainda um subconjunto de células NK capazes de reconhecer antígenos pela via não clássica de
apresentação, por meio das moléculas CD1d. Esta molécula permite a apresentação de
lipídios presentes na parede do Mtb. Uma vez ativado, essas moléculas CD1d contribuem para
a defesa do hospedeiro humano contra a infecção por Mtb. Macrófagos humanos derivados de
monócitos que expressam moléculas CD1d podem induzir funções efetoras das células NK T
contra células infectadas com Mtb quando ativados. Estas funções incluem secreção de IFN-γ,
proliferação, atividade lítica e atividade anti-micobacteriana (Vankayalapati 2002 &
Vankayalapati 2004).
Com o início da infecção, outros monócitos, assim como células dendríticas são
recrutados da corrente sanguínea, sendo responsáveis pela manutenção da infecção no
hospedeiro (Dannenberg 1991; Sturgill-Koszycki et al. 1994, Pedroza-González et al. 2004).
Os monócitos são recrutados para os pulmões, onde eles aumentam a expressão de CD11c e
tornam-se CD11b+/mid/CD11c+/mid, os quais se diferenciam em macrófagos alveolares (CD11b /mid
CD11c+/high) e células dendríticas (CD11b+/high/CD11c+/high) (Gonzalez-Juarrero et al.
2003).
Após a ativação as células dendrídicas sofrem um processo de maturação que é
acompanhada por um aumento da síntese de MHC de classe I, pela expressão de moléculas
co-estimuladoras, como CD80 (B7.1) e CD86 e CD40, sendo observados nos primeiros dias
7
de infecção ao Mtb (Gonzalez-Juarrero et al. 2003). Por meio de estudos in vitro, utilizando
células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de humanos foi observado que células
dendríticas infectadas com Mtb passam a expressar CD54, CD80 (B7.1), secretando um
elevado número de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1 e IL-12 (Underhill et
al., 1999). Esta ativação pode facilitar a migração destas células para os linfonodos, ativando
os linfócitos T por meio da produção de IL-12 (Henderson et al. 1997). Ensaio in vitro para
avaliar o perfil de secreção de citocinas foi realizado em PBMC após estimulação com Mtb,
revelando que macrófagos derivados de monócitos infectados com Mtb passam a secretar IL1ß, IL-6, TNF-α, IL-18 e IL-10. Foi possível observar que IL-1ß e IL-18 são produzidas nas
16 primeiras horas após a estimulação, enquanto a IL-6, IL-10 e TNF-α são produzidas mais
tardiamente após 24 horas de estímulos. Foi ainda constatado que células dendríticas
derivadas de monócitos passam a produzir níveis baixos de IL-12p70 e grande quantidade de
IFN-α. A produção de citocinas é de fundamental importância, pois atuam no recrutamento de
subpopulações de células que agem na resposta ao Mtb para formação e manutenção do
granuloma, dentre essas predominam as células T auxiliares (CD4 +) e T citotóxicas (CD8+)
(Araújo-Filho et al. 2008; Giacomini et al. 2001).
Os linfócitos T CD8+ citolíticos reconhecem antígenos do Mtb quando este é
processado e apresentado por macrófagos e células dendríticas infectados via MHC de classe
I, moléculas CD1 e outras vias de apresentação (Lewinsohn et al. 1998). Uma vez ativados,
esses linfócitos produzem IFN-γ e TNF-α que são potentes ativadores de macrófagos
infectados, podendo também destruir células infectadas via CD95-Fas ou por meio da
liberação de perforinas e granzimas, induzindo apoptose das células-alvo (Molloy et al. 1994;
Lewinsohn et al. 1998; Brookes et al. 2003).
Dentre as populações de células ativadas após a infecção pelo Mtb encontram-se as
células Th1 (TCD4+). Esta população celular é ativada com a participação da IL-12
produzidas por macrófagos e células dendríticas infectadas. As células Th1 se expandem em
resposta aos antígenos do Mtb apresentado pelas células dendríticas nos nódulos linfáticos, e
depois o linfócito TCD4+ efetor migra para o local da infecção (Humphreys et al. 2006;
Giacomini et al. 2001). As células TCD4+ são componentes importantes para a contenção do
crescimento bacteriano e para a geração de resposta granulomatosa no pulmão. Eles são
capazes de produzir IFN-γ que promovem o recrutamento de células mononucleares para
formação de granuloma, tais como macrófagos e monócitos os quais atuam no controle da
replicação do bacilo. Na ausência dos linfócitos TCD4+, poucas células mononucleares são
8
recrutadas para o pulmão, impossibilitando a formação do granuloma normal (Saunders et al.
2002).
Com o estabelecimento da infecção dos macrófagos estes recrutam outras células do
sistema imune e formam uma estrutura organizada chamada de granuloma (Dannenberg
1991). Trabalhos utilizando camundongos isogênicos demonstram que a expansão das
micobactérias nos granulomas se dá por ciclos de morte de macrófagos infectados e a
fagocitose por múltiplos macrófagos que são constantemente recrutados (Davis &
Ramakrishnan 2009).
Após a infecção com os bacilos, ocorre a formação de granulomas epitelióides, antes
de se estabelecer a imunidade adaptativa (Davis & Ramakrishnan 2009). Também chamada
de infecção primária ou primo-infecção, esta fase é caracterizada por apresentar lesões
exsudativas com reação inflamatória aguda, contendo leucócitos circundando os bacilos. Este
tipo de exsudato é absorvido em 90% dos casos, com cicatrização.
Com o estabelecimento da resposta imune adaptativa, a formação do granuloma
coincide com a expansão bacteriana, sugerindo que esta aceleração é impulsionada pelo
crescimento bacteriano (Volkman et al. 2004; Davis & Ramakrishnan 2009). É então
estabelecida a tuberculose ativa com formação de lesão tecidual caracterizada por uma
inflamação granulomatosa de três zonas: uma com células gigantes multinucleadas contendo
os bacilos, uma camada média de células epitelióides e uma camada periférica de fibroblastos,
células mononucleares e linfócitos T e B dispersos. A primeira zona apresenta necrose
caseosa central, sendo denominados tubérculos. Posteriormente ocorre a cicatrização por
tecido fibroso ou calcificação (Cosma et al. 2003). Os granulomas parecem ser benéficos para
o indivíduo por conter e restringir a micobactéria (Ulrichs & Kaufmann 2006). No entanto,
resultados sugerem que a formação do granuloma é uma ferramenta para a expansão da
infecção pelo Mtb (Davis & Ramakrishnan 2009).
1.4.1. Linfócitos B
Os linfócitos B são um dos principais componentes do sistema imune, sendo
responsáveis pela imunidade humoral. Tanto em humano quanto em camundongo essas
células são produzidas no fígado fetal antes do nascimento e na medula óssea após o
nascimento. Em camundongos, os estágios de desenvolvimento dos linfócitos B estão bem
caracterizados, sendo continuamente geradas das células tronco hematopoiéticas da medula
9
óssea. Há cinco subtipos de linfócitos B maduros nos camundongos, sendo que os principais
são as células B-2 e as células B-1(Baumgarth et al. 2011).
As células B-2 são divididas em células B foliculares (CD23+ IgD hi IgMlow ) e células
B de zona marginal (CD21+ CD1dhi IgMhi IgDlow), representando 15% e mais de 70%,
respectivamente, constituindo a maioria das células B do baço. Estas células estão
relacionadas com a produção de anticorpos específicos, em um processo que depende da
ativação dos linfócitos T, participando preferencialmente da resposta imune adaptativa (Li et
a. 2001).
As células B-1 são representadas pelas subpopulações B-1a (CD43+ CD19hi CD5+
IgMhi IgDlow) e B-1b (CD43+ CD19hi IgMhi IgDlow), representando 2% e menos de 1% da
população de células B do baço, respectivamente. As células B-1 são encontradas
predominantemente nas cavidades pleurais e peritoniais (Li et al. 2001), órgãos linfóides
secundários, mucosas, sangue, medula óssea, parênquima pulmonar, lâmina própria intestinal,
dentre outros. No baço e na medula óssea essas células produzem IgM que contribuem para a
manutenção dos anticorpos naturais circulantes em larga escala, estando mais envolvidas na
resposta imune inata, a qual independe da ativação pelas células T (Martin et al. 2000; Li et
al. 2001). Esta IgM secretada nos tecidos se liga a antígenos próprios alterados, componentes
de células apoptóticas, contribuindo para a manutenção da homeostasia tecidual (Baumgarth
et al. 2011).
As células B são células produtoras de anticorpos específicos, sendo células efetoras
do sistema imune adaptativo. Nem toda produção de anticorpos é desencadeada pela ativação
prévia do sistema imune, sendo que estes podem ser produzidos sem a ausência de
microrganismos (Hooijkaas et al. 1984; Bos et al. 1989; Haury et al. 1997). As células B
podem proliferar e secretar anticorpos em resposta aos componentes das bactérias gramnegativas, como lipopolissacarídeo (LPS), independentemente do reconhecimento por meio
do BCR. As células B expressam inúmeros receptores do sistema imune inato, incluindo os
Toll-like receptor 3, 7, 8 e 9 (TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9). Por meio do TLR4 estas células
fazem o reconhecimento do LPS, permitindo sua ativação independente dos linfócitos T
(Meyer-Bahlburg et al. 2008; Bekeredjian-Ding et al. 2009; Crampton et al. 2010).
Os mecanismos de produção de anticorpos específicos dependem da atuação das
células T helper (Th) para que haja a maturação de anticorpos, bem como a memória
imunológica. As células B também funcionam como células apresentadoras de antígenos,
ativando células T de uma maneira específica. Além disso, as células B induzidas tanto por
10
Th1 como por Th2 respondem produzindo anticorpos que ora favorece a entrada do
microrganismo na célula ou a sua eliminação pela ativação do sistema complemento (Abebe
& Bjune 2009; Maglione & Chan 2009).
Por se localizarem em compartimentos intracelulares, é sabido que os bacilos da TB
não são expostos aos anticorpos. No entanto, durante as etapas iniciais de infecção, os
anticorpos isoladamente ou em conjunto com as citocinas fornecem funções importantes,
como a prevenção da entrada de bactérias na superfície das mucosas. O papel de anticorpos
em infecções bacterianas intracelulares tem sido controverso. Entretanto tem sido observada
sua participação em infecções agudas, além de infecções crônicas, como a produzida pelo Mtb
(Salinas-Carmona et al. 2004; Williams et al. 2004; Reljic & Ivanyi 2006; Feng et al. 2011).
Em se tratando de proteção para TB, os anticorpos poderiam aumentar a imunidade
por meio da neutralização de toxinas, opsonização, ativação do complemento, promoção da
liberação de citocinas, citotoxicidade dependente de anticorpos, e apresentação de antígenos
reforçada (Igietseme et al. 2004; Reljic & Ivanyi 2006). Por meio da opsonização, os
anticorpos podem aumentar a internalização dos bacilos do Mtb pelos neutrófilos, monócitos
ou macrófagos, permitindo assim maior estimulação das células TCD4 + e TCD8+ quando os
bacilos são processados pelas células dendríticas.
Em 2011, Feng e colaboradores verificaram que células B de memória CD19+ CD27+
e plasmoblastos CD19+ CD27high CD20+/- estão consideravelmente diminuídos no fluído
pleural e aumentados no sangue periférico de pacientes com TB pleural; Células B de
memória com o fenótipo CD27+ IgD+ e CD27+ IgD- encontram-se diminuídos em líquido
pleural e aumentados em sangue periféricos; Células B naives CD27 - IgD+ e células B CD27 IgD- estão marcadamente aumentadas no fluído pleural em relação ao sangue periférico; Há
um número maior de células B expressando IgM de superfície em relação a IgG, sendo que
estes dois padrões de células estão mais aumentadas no sangue periférico em relação ao fluído
pleural.
Os anticorpos das classes IgG, IgA e IgM estão presentes nas secreções das mucosas
do trato respiratório inferior dos seres humanos infectados pelo Mtb (Boyton & Openshaw
2002; Feng et al. 2011). Os anticorpos das classes IgG e IgM estão presentes em soro de
indivíduos com TB, específicos para proteínas do Mtb (Rabahi et al. 2007; Almeida et al.
2008; Reis et al. 2009; Costa et al. 2011; Limongi et al. 2011; Feng et al. 2011).
11
1.5. Diagnóstico da Tuberculose
A suspeita clínica da tuberculose (TB) começa com quadro clínico constituído por
febre baixa, geralmente vespertina, cansaço excessivo, sudorese noturna, falta de apetite,
adinamia, perda de peso e indisposição. Os sinais e sintomas vão depender da localização da
doença. Quando a lesão é pulmonar, tem-se no início tosse seca contínua, seguida por
secreção por mais de quatro semanas e sangramento respiratório. Enquanto que nas formas
extrapulmonares, os sinais e sintomas dependerão do órgão afetado. Por ser uma doença
infecciosa, faz-se necessário a confirmação diagnóstica por meio da identificação do Mtb em
materiais da lesão. A confirmação do diagnóstico pode ser realizada por métodos, tais como
métodos histopatológicos, imunológicos e radiografia do tórax, podendo ser confirmado por
meio de exames bacteriológicos (Campos 2006).
Os exames bacteriológicos padronizados são o exame direto e a cultura do Mtb. Esses
exames baseiam-se na detecção de bacilos do Mtb (bacilo de Koch: BK) em amostras do trato
respiratório (TB pulmonar) ou em espécimes provenientes de outros locais do corpo (TB
extrapulmonar). A baciloscopia e a cultura em meio de Löwenstein-Jensen são consideradas o
―padrão ouro" para o diagnóstico de tuberculose ativa (Campos 2006).
1.5.1. Bacteriológico
1.5.1.1. Baciloscopia
A baciloscopia é um exame bacteriológico utilizado na detecção do M. tuberculosis
em materiais de lesão pela técnica de coloração de Ziehl-Nielsen. A coloração de ZiehlNielsen se baseia no uso de um corante fucsina fenicado, seguida de uma descoloração com
álcool-ácido e posterior contraste com corante azul de metileno. A presença de bactérias
álcool-ácido resistentes (BAAR) indica a presença de Mycobacterium sp. (Zimmer et al.
1999). Esta técnica apresenta sensibilidade variável (34-80%), devido principalmente a sua
capacidade de detecção das bactérias em material biológico, a qual depende da quantidade de
bacilos presentes. Portanto, esta técnica não permite o diagnóstico correto de indivíduos
paucibacilares (Campos 2006; Waard & Robledo 2007; Abu-Raddad et al. 2009).
12
1.5.1.2. Cultura
A cultura permite a detecção de Mtb em casos de TB com baixa carga bacilar, além de
testar a sua sensibilidade aos quimioterápicos, se solicitado pelo médico responsável.
Entretanto, a cultura também apresenta sensibilidade variável (30-80%). Devido ao
crescimento lento do Mtb, o resultado deste teste demora de 28 a 30 dias, além de requerer
estrutura laboratorial que não se encontram disponíveis na maioria das regiões endêmicas. Por
isso, este método não é adotado como auxiliar no diagnóstico em países em desenvolvimento
(Walton et al. 2005; Waard & Robledo 2007; Davies & Pai 2008).
Apesar da identificação microscópica e cultura de micobactérias no escarro serem os
métodos mais comuns de diagnóstico da tuberculose pulmonar, a detecção de tuberculose
extrapulmonar por meio destas técnicas são menos viáveis devido à ausência das secreções
para análise (Singh & Espitia 2007). Casos de TB pulmonar em que o indivíduo não apresenta
produção de escarro, o diagnóstico fica comprometido, podendo resultar em diagnóstico
falso-negativo (Jackett et al.1988).
1.5.1.3. Histopatológico
Este exame permite identificar lesão granulomatosa, necrose de caseificação e outras
apresentações da lesão tecidual causada pelo Mtb. Entretanto, as apresentações
histopatológicas não são patognomônicas da doença, pelo fato de poder estar presentes e
serem observadas em outras doenças, tais como a sarcoidose e micoses. Para certificar que a
lesão granulomatosa é realmente causada pelo Mtb, faz-se necessário identificá-lo no interior
do granuloma (Campos 2006).
1.5.1.4. Interferon-Gamma Release Assays (IGRAs)
O QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) e TSPOT.TB foram desenvolvidos
com o intuito de substituir a PT ( Prova Tuberculínica), teste utilizado para o diagnóstico da
TB latente, apesar de estarem mais relacionados com a doença ativa (Lalvani et al. 2001;
Mori et al. 2004; Ling et al. 2011). Eles se baseiam na detecção de interferon gama, quando
células de pacientes são estimulados com dois antígenos, o ESAT6 e CFP10 ou utilizando a
13
pesquisa de interferon gama em PBMC por meio da estimulação com Ag85A do M.bovis
BCG (Proteína de 32 kDa) (Chee et al. 2010; Ling et al. 2011).
Em 2010, Simsek e colaboradores avaliaram a utilização do TST (Teste
Tuberculínico) e o T-SPOT.TB no diagnóstico da Tb ativa e da Tb latente. Para este ensaio
utilizou 136 indivíduos divididos em grupos (47 pacientes com Tb ativa, 47 controles sem
exposição ao Mtb e 42 indivíduos contatos de pacientes com Tb ativa). O T-SPOT.TB
apresentou uma sensibibilidade e VPN (83,0%, 82,6%) significantemente superiores aos
encontrados no TST (38,3%, 60,8%) no diagnótico da Tb ativa. Nesta mesma análise o TSPOT.TB apresentou especificidade e VPP (80,9%, 81,3%) inferiores aos encontrados no
TST (95,7%, 90,0%).
Na África do Sul, Ling e colaboradores (2011) avaliaram a acurácia de dois IGRAs
(QuantiFERON TB Gold In-Tube (QFT-GIT) and TSPOT.TB) no diagnóstico da tuberculose
pulmonar. Para este ensaio, utilizaram 395 indivíduos com suspeita de tuberculose. O
QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) apresentou uma sensibilidade de 76% e
especificidade de 42%, enquanto o TSPOT.TB apresentou sensibilidade de 84% e
especificidade de 47%.
Na Alemanha, Alsleben e colaboradores (2011) avaliaram os ensaios de pesquisa de
interferon gama (IGRAS) no diagnóstico de TB ativa e TB latente em crianças quando a
produção do IFN-γ é estimulada pela proteína indutora 10 (IP-10). Para este estudo utilizaram
uma população composta por 48 crianças, sendo que dessas 11 eram TB ativa, 14 TB latente,
8 apresentavam linfoadenopatia causada por micobactérias não-tuberculóide e 15 possuiam
infecção no trato respiratório. Todos os grupos foram submetidos à pesquisa de IP-10 e
interferon gama. Foi observado que os grupos acima relacionados apresentaram níveis de IP10 na média de 12.702 pg/ml, 9.109 pg/ml, 97 pg/ml, and 84 pg/ml, respectivamente, sendo
que os níveis de IFN-γ estão fortemente correlacionados (r 2 = 0.69). Os dados sugerem que
esta proteína pode ser um importante biomarcador em TB pediátrica, uma vez que está
relacionada com a indução da produção de IFN-γ na TB.
Os IGRAs são mais sensíveis que a PT e estão mais relacionados com a doença ativa.
Entretanto, em áreas endêmicas para a TB, sua utilização para o diagnóstico é inviável,
porque o teste é incapaz de discriminar a TB Ativa da TB latente (Mazurek et al. 2007; Pai et
al. 2008). Esta situação faz com que os IGRAs apresentem uma sensibilidade insuficiente
para serem utilizados no diagnóstico da TB Ativa (Ling et al. 2011).
14
1.5.1.5. Testes sorológicos utilizados em pesquisa para diagnóstico da TB
A sorologia para a TB vem sendo explorada desde 1898 por Arlöing, que mostrou que
soros de pacientes com TB poderiam aglutinar bacilos da tuberculose. Naquele tempo se
utilizava bactérias inteiras, filtrado de culturas, extratos de bactérias, tuberculinas e seus
derivados protéicos purificados (PT). Com o melhoramento da engenharia genética e das
técnicas imunocromatográficas, passou-se a utilizar antígenos individuais purificados, tais
como proteínas, lipopolissacarídeos e glicolipídeos, por exemplo, Ag 85, proteína 38 kDa e
LAM. De uma maneira geral, testes utilizando antígenos individuais permitem a obtenção de
uma boa especificidade com perda na sensibilidade, o que inviabiliza a utilização destes em
um teste de triagem diagnóstica. Devido a esses fatores, até o momento não foi possível
desenvolver um teste que seja sensível e específico o suficiente para substituir as técnicas
convencionais para diagnóstico da TB (Bothamley et al.1995; Al Zahrani et al. 2000; Singh et
al. 2003; Raqib et al. 2003; Lopez-Marin et al. 2003; Julián et al. 2004).
Com a observação de que a resposta imune humoral a TB é bastante heterogenia,
passou-se a empregar misturas de múltiplos antígenos do Mtb (Campos 2006). Já foi
demonstrado que a utilização de coquetel de proteínas melhora a sensibilidade e
especificidade dos testes na TB (Shin et al. 2008). Atualmente, a fusão de proteínas
imunodominantes do Mtb é uma sugestão para se melhorar os testes diagnósticos (Singh e
Espitia 2007). A possibilidade de se fundir genes que codificam proteínas imunodominantes
do Mtb já é uma realidade que vem sendo adotada, permitindo inovações na área do
sorodiagnóstico da TB.
Trabalhos realizados por Steingart e colaboradores (2007) demonstraram que
atualmente há vários testes imunológicos sendo comercializados em países em
desenvolvimento para o diagnóstico de tuberculose pulmonar ativa, porém, eles apresentam
uma sensibilidade e especificidade variável (0,09-59,7%; 53-98%), especificidade esta que
não é um ponto positivo em um teste de triagem diagnóstica por tornar a sensibilidade muito
baixa. Segundo a OMS (WHO 2011), não estão recomendados a utilização dos testes
comerciais para sorodiagnóstico da tuberculose, pois os resultados destes testes são
inconsistentes, imprecisos, além de apresentarem muitos casos de falso-positivo e falsonegativo.
Samanich e colaboradores (2000) avaliaram a utilização do antígeno 85C em
sorodiagnóstico para TB, bem como indivíduos HIV positivo com TB. Neste estudo foi
15
avaliada a reatividade de coortes de imunodeficiência humana vírus (HIV)-negativo, com
baciloscopia positiva; HIV-negativos, com baciloscopia negativa; e pacientes HIV-infectados
com TB, com três dos antígenos candidatos à adesão, uma proteína de 88-kDa, antígeno 85C
e MPT32. Os resultados demonstram que antígenos identificados com base em sua
reatividade com soros de pacientes com TB fornecem alta sensibilidade para o diagnóstico
sorológico verificando que 80% dos indivíduos com tuberculose respondem ao antígeno 85C.
Na Índia, Kashyap e colaboradores (2007) avaliaram a detecção do complexo antígeno
85 no diagnóstico da tuberculose. Para este ensaio utilizou pacientes com TB confirmada
(24), indivíduos com diagnóstico clínico para TB (104), controles doentes (49) e controles
saudáveis (20). A sensibilidade foi de 82% e a especificidade foi de 86% para o diagnóstico
da TB. Dos pacientes com TB confirmada foi possível detectar 96%, enquanto para os
clinicamente diagnosticados, 79% foram positivos para o teste.
Choudhary e colaboradores (2003) avaliaram a produção de anticorpos da classe IgG
em três grupos de indivíduos na Índia, constituído por pacientes com TB primária (32),
pacientes com TB recidiva (30) e pacientes com TB extrapulmonar (30) comparado aos
controles saudáveis (10) frente ao antígeno PPE (Rv2430c) do Mtb utilizando a técnica de
ELISA. Nos dois primeiros casos, os pacientes foram diagnosticados por baciloscopia e no
terceiro caso, a TB foi confirmada por biópsia de tecido. Foi observado que teste de ELISA
com pesquisa de anticorpos da classe IgG específicos ao antígeno PPE consegue discriminar
pacientes com TB primária de controle saudável (p<0,0001), a partir do qual conclui que a
resposta imune com produção de anticorpos frente a esta proteína pode estar relacionada com
a manifestação e progressão da tuberculose.
Na Coréia do Sul, Shin e colaboradores (2008), comparam por meio de abordagem
proteômica as proteínas do filtrado de cultura do Mtb (H37Rv) com as proteínas da linhagem
K do Mtb (Cepa variante). Em seguida avaliaram a aplicação individual e combinada de cinco
antígeno, sendo três antígenos recombinantes (rCFP-10, rESAT-6, rHspX) e dois antígenos
nativos, complexo Ag85 e PstS1, em sorodiagnóstico. Para este ensaio, foram utilizados 46
pacientes com TB ativa e 46 indivíduos controles saudáveis. A sensibilidade foi variável,
dependendo do antígeno testado, (rCFP-10, rESAT-6, rHspX, complexo Ag85, PstS1-45,8%;
36,9%; 67,3%; 47,8%; 56,5%), respectivamente, para uma especificidade fixa de 100%. A
combinação de todas as proteínas apresentou uma sensibilidade de 77,7%. Os resultados
mostram que o ensaio realizado com as proteínas da cepa variante apresenta um melhor
desempenho que o ensaio utilizando as proteínas do H37Rv, uma vez que a curva ROC foi
16
0,913 e 0,867, respectivamente. Quando se avalia o potencial discriminatório dos antígenos
individualmente, o rHspX apresenta melhor desempenho (Quadro 1).
Na China, Wu e colaboradores (2010) testaram os antígenos recombinantes 38-kDa e
MTB-48, além da fusão das proteínas CFP-10 e ESAT-6 no diagnóstico da tuberculose
pulmonar. Para este ensaio, utilizaram 250 indivíduos com tuberculose ativa e 260 indivíduos
saudáveis. A sensibilidade assim como a especificidade foi variável, dependendo do antígeno
testado, (61,2-74,4%; 73,8-85,4%, respectivamente) (Quadro 1).
Na China, Wu e colaboradores (2011) testaram uma proteína de fusão contendo os
antígenos recombinantes 38-kDa-16-kDa- 6 kDa (ESAT-6) do
Mtb. Para este ensaio,
utilizaram 105 pacientes com TB pulmonar, 25 pacientes com TB não pulmonar e 20
controles saudáveis. A sensibilidade assim como a especificidade foi 65,4% e 84,8%,
respectivamente, apresentando menos falsos negativos que o kit de ELISA comercial para
diagnóstico da TB, o TB-DOT (do inglês TB- Directly Observed Therapy). A área sob a
curva (AUC) encontrada foi de 0,751 (Quadro 1).
O antígeno MPT-51 é uma proteína que já vem sendo utilizada como marcador da
tuberculose, principalmente em indivíduos co-infectados com HIV (Sing et al. 2005).
Almeida e colaboradores (2008) avaliaram a resposta imune humoral de pacientes com TB
(39) e controles saudáveis (39) ao rMPT-51 e rGlcB por meio da técnica de ELISA. A
sensibilidade e a especificidade foram: IgM-rMPT-51 (77.6-96.9%); IgG-rMPT-51(4.198,0%); IgM-rGlcB (8,2-95,9%); IgG-rGlcB (75,5-65,0% ), respectivamente. O antígeno
rMPT-51 apresentou melhor potencial discriminatório quando se avaliou a presença de IgM
específica (Quadro 1).
17
Quadro 1. Sensibilidade, especificidade e área sob a curva (AUC) dos testes de ELISA
usados em pesquisa para o diagnóstico da TB.
Teste
Antígeno
Anticorpo
Sensibilidade
Especificidade
AUC
Referência
IgM
77,6%
96,9%
0,814
Almeida et al.
IgG
4,1%
98,0%
0,628
2008
IgM
8,2%
95,9%
0,636
IgG
75,5%
65,0%
0,738
padrão
BAAR
rMPT-51
BAAR
rGlcB
Almeida et al.
2008
BAAR
CFP10
IgG
45,8%
100%
0,889
Shin et al. 2008
BAAR
ESAT-6
IgG
36,9%
100%
0,75
Shin et al. 2008
BAAR
Hsp-X
IgG
67.3%
100%
0,90
Shin et al. 2008
Complexo
Shin et al. 2008
BAAR
Ag 85
IgG
47,8%
100%
0,87
BAAR
PstS1
IgG
56,5%
100%
0,89
Shin et al.2008
Combinação
BAAR
de proteínas
IgG
77,7%
100%
0,91
Shin et al.2008
BAAR
38-kDa
IgG
73,6%
85,4%
0,788
Wu X et al.2010
BAAR
MTB-48
IgG
73,2%
77,7%
0,733
Wu X et al.2010
IgG
73,2%
73,8%
0,762
Wu X et al.2010
IgG
65,4%
84,8%
0,751
Wu L et al.2011
CFPBAAR
10/ESAT-6
(Fusão)
38-kDa-16-
BAAR
kDa-ESAT-6
(Fusão)
18
1.6. JUSTIFICATIVA
Apesar do avanço da ciência desde a sua descoberta, a tuberculose continua sendo um
dos principais problemas de saúde pública. A Organização Mundial de Saúde acredita que um
terço da população mundial está infectada com o bacilo da TB e que surgem
aproximadamente 8,8 milhões de novos casos com 2 a 3 milhões de mortes a cada ano.
O Brasil ocupa o 19º lugar em número de casos e o 108º país em incidência no
mundo. No estado de Goiás, a taxa de incidência da doença é de 14,6 casos para cada 100.000
habitantes. Apesar da incidência da TB no estado ter diminuído bastante, a tuberculose
representa o principal fator de risco para mortalidade entre indivíduos com infecção pelo HIV
e os casos que permanecem devem-se a fatores como: descuido dos governos no controle da
doença, programas de controle de tuberculose mal administrados, pobreza, crescimento e
migração populacional e resistência do patógeno às drogas.
Os métodos laboratoriais usados para diagnosticar a TB apresentam falhas, fator que
pode contribuir para transmissão e disseminação da doença. Além disso, nos casos de TB
extrapulmonar o diagnóstico torna-se mais delicado devido à ausência de foco inflamatório de
fácil acesso, inviabilizando o diagnóstico rápido. Por isso é necessário o desenvolvimento de
testes que detectem o indivíduo na fase inicial da doença, independente do tipo de TB.
Segundo dados da OMS (2011), o uso dos testes sorológicos comerciais para o
diagnóstico da TB não está autorizado, devido à grande variação da sensibilidade e
especificidade. Esta idéia é um ponto de partida para o incentivo ao desenvolvimento de testes
que possam superar os existentes. O desenvolvimento de técnicas sorológicas capaz de
assegurar o diagnóstico da TB é de grande importância, pois permite minimizar os riscos de
falsos resultados para diversos tipos de TB.
A descoberta de antígenos, bem como o desenvolvimento de antígenos recombinantes
que possam melhorar um teste rápido de triagem diagnóstica da TB é de grande utilidade. A
fusão de proteínas imunogênicas trás a possibilidade de melhora destes testes, com a
tendência de se apresentar maires sensibilidades e especificidades.
19
CAPÍTULO 2
RESPOSTA IMUNE HUMORAL AO ANTÍGENO rGroES DO Mycobacterium
tuberculosis EM PACIENTES COM TUBERCULOSE E SEUS CONTATOS
DOMICILIARES
ARTIGO PUBLICADO NA REVISTA DE PATOLOGIA TROPICAL DA UFG
20
2.1. OBJETIVOS
2.1.1. Objetivo Geral
Avaliar a resposta imune humoral de pacientes com TB pulmonar ativa e contatos
intradomiciliares por meio da análise de anticorpos das classes IgM e IgG específicos ao
antígeno GroES do Mtb.
2.1.2. Objetivos específicos
Padronizar um ensaio de ELISA utilizando o antígeno recombinante GroES do Mtb.
Avaliar os níveis séricos de anticorpos IgM específicos para o antígeno recombinante
GroES do Mtb em pacientes com tuberculose ativa e contatos destes pacientes.
Avaliar os níveis séricos de anticorpos IgG específicos para o antígeno recombinante
GroES do Mtb em pacientes com tuberculose ativa e contatos destes pacientes.
21
2.2. MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. População de Estudos
Este é um estudo observacional sobre resposta imune humoral de pacientes com
tuberculose pulmonar e seus contatos. Os critérios de inclusão foram: a) pacientes:
diagnóstico de tuberculose pulmonar – sintomatologia característica, radiografia sugestiva,
baciloscopia positiva (escarro ou líquido bronco-alveolar) ou negativa, realizado pela equipe
médica nos Centros de Assistência Integral à Saúde (CAIS) da região metropolitana de
Goiânia e no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad (HDTAA), maiores de 18 anos e de
qualquer sexo; b) contatos: indivíduos residentes no mesmo domicílio ou lote, freqüentadores
assíduos e empregados domésticos do domicílio do paciente, de qualquer sexo ou idade. Os
participantes assinaram termo de consentimento livre e esclarecido, e os indivíduos menores
de 18 anos foram incluídos mediante autorização dos seus responsáveis. Este estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Médica Humana e Animal (CEPMHA) do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, protocolo nº 161/07. A população de
estudos constituiu-se de 45 pacientes com TB pulmonar ativa e 172 contatos. Todos os
indivíduos com TB e contatos destes que aceitaram participar da pesquisa foram submetidos à
coleta de sangue para obtenção do plasma. Todos os contatos dos pacientes com TB foram
submetidos à PT. A constatação da vacinação com a BCG (Bacilo Calmette-Guérin) foi feita
pela presença da cicatriz vacinal no braço direito.
2.2.2. Coleta das amostras
Depois de preenchido o termo de consentimento livre e esclarecido, foi coletado 20 ml
de sangue heparinizado para obtenção do plasma de cada indivíduo no momento do
diagnóstico. As amostras de plasma foram obtidas após centrifugação do sangue a 2.500 rpm
por 15 minutos. Alíquotas de 500μl foram congeladas a -200C até o momento do uso. Todas
as amostras foram descongeladas apenas uma vez para realização dos ensaios. As coletas
foram realizadas no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad (HDTAA) em Goiânia e no
Cais Nova Era em Aparecida de Goiânia.
22
2.2.3. Prova Tuberculínica (PT)
Foi aplicado intradermicamente 100μl de PT Rt 23551 (Statens Serum Institut,
Copenhagen, Denamark) no antebraço esquerdo de cada contato dos pacientes. A leitura da
induração cutânea foi realizada 72 horas após a aplicação e os contatos foram classificadas de
acordo com os parâmetros estabelecidos pela OMS em PT positivos (induração cutânea maior
ou igual a 10 mm) e PT negativos (induração cutânea menor que 10 mm).
2.2.4. Antígeno Protéico
Neste estudo, foi utilizado o antígeno protéico recombinante GroES (rGroES) do Mtb,
que foi fornecido ao Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública pelo Laboratório de pesquisa da Universidade Estadual do
Colorado (CSU), mediante convênio firmado entre a Universidade Federal de Goiás e a
Universidade Estadual do Colorado (CSU), sob contrato número NO1-AI-75320.
2.2.5. Anticorpos Conjugados
Neste estudo foram utilizados os seguintes anticorpos conjugados: IgG- anticorpo
monoclonal de coelho, anti- IgG humana conjugado com peroxidade (IgG-HRP, Sigma
Aldrich), na concentração de 1/10.000. IgM – anticorpo monoclonal de coelho, anti-IgM
humana marcada com peroxidase (IgG-HRP, Sigma Aldrich), na concentração de 1/2.500.
Ambos os anticorpos conjugados foram diluídos para uso em ELISA indireto.
2.2.6. ELISA (Ensaio Imuno-Enzimático)
Foi realizado o método de ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-rGroES
das classes IgM e IgG dos pacientes com doença ativa e dos contatos. Sucintamente, após
padronização de todas as etapas, as placas de poliestireno de 96 poços (Corning- high
binding) foram adsorvidas com o antígeno rGroES (10μg/mL) diluído em tampão carbonatobicarbonato 0.015 M, pH 9.8. Depois de incubadas por 18h na temperatura de 4 a 8°C, as
placas foram bloqueadas utilizando o tampão carbonato-bicarbonato, leite desnatado 1%, por
2h a 37ºC. As amostras de plasma dos indivíduos incluídos no estudo foram diluídas (1/20)
23
em tampão PBS, leite desnatado 0.06% e incubadas por 2h a 37ºC. Após a incubação, as
placas foram lavadas seis vezes com PBS 0.05% de Tween 20 e foram acrescentados 50L de
conjugados IgM e IgG (Sigma Aldrich), nas concentrações 1/2.500 e 1/10.000,
respectivamente, diluídos em PBS, 0,06% leite desnatado e incubado por 1h a 37°C. Após
semelhante lavagem das placas, foi adicionado solução de substrato pH 5.0 composta por 5mg
de OPD, 20L de H2O2 em 5mL de tampão citrato-fosfato, por placa. Em cada poço colocouse 50l da solução de substrato e incubou-se por 5 minutos a temperatura ambiente. Após
esse período, foi adicionada a solução de parada 50l/poço, composta por H2SO4 2N. A
leitura das amostras foi feita em leitora de ELISA (Multiskan Plus) a 492nm. A diluição das
amostras teste foi realizada em duplicata e a média da absorvância foi expressa em densidade
óptica. Controles negativos foram utilizados em todas as placas.
2.2.7. Análise Estatística
A partir dos resultados das leituras expressos em densidade ótica foi realizada a
construção dos gráficos. A análise estatística foi realizada no programa GraphPad Prisma 5.
As leituras dos indivíduos foram comparadas por meio do test t de Student, pelo qual foi
considerado significância p<0,05. Por meio deste programa é possível realizar a análise da
Curva ROC. A Curva ROC é requerida para avaliar a acurácia do teste, sendo que sua análise
nos fornece vários Cut-off. Ao estabelecer a sensibilidade e especificidade ideais para o teste
proposto obtém-se o Cut-off desejado.
24
2.3. RESULTADOS
2.3.1. Características Clínicas e Epidemiológicas
As características clínicas e epidemiológicas dos participantes do estudo encontram-se
na Tabela 1. Dos 45 pacientes com tuberculose pulmonar ativa que participaram da pesquisa,
66,66% (n=30) eram do sexo masculino. A média de idade dos indivíduos do sexo masculino
foi de 41,1 anos. Desses, 56,66% (n=17) receberam a vacina BCG, enquanto 43,33% (n=13)
não receberam; 93,33% (n=28) tiveram RX do tórax sugestivo de tuberculose pulmonar;
93,33% (n=28) tiveram resultado de BAAR positivo, 3,33% (n=1) tiveram BAAR negativo e
somente 3,33% (n=1) não foram submetidos à realização da técnica de BAAR. Todos os
pacientes receberam tratamento com o esquema 1(rifampicina, isoniazida e pirazinamida)
para a tuberculose pulmonar.
A média de idade dos indivíduos do sexo feminino foi de 43,86 anos. Dessas, 46,66%
(n=7) receberam a vacina BCG na infância, enquanto 53,33% (n=8) não a receberam; 93,33%
(n=14) apresentaram RX do tórax sugestivo de tuberculose pulmonar, enquanto 6,66% (n=1)
não realizaram RX pulmonar; 66,66% (n=10) tiveram resultado de BAAR positivo, 20%
(n=3) negativo e apenas 13,33% (n=2) não foram submetidos à técnica de BAAR; A maioria
das mulheres (n=14) receberam o esquema de tratamento 1(E1), enquanto uma delas foi
tratada com o esquema EIR (rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol) de tratamento
para tuberculose pulmonar, como observado na tabela 1.
25
Tabela 1. Dados sócio epidemiológicos dos pacientes com TB e contatos domiciliares
TB (N=45)
Contatos (N=172)
Gênero
Homens
Mulheres
30 (66,6%)
15 (33,3%)
88 (51,46%)
84 (49,12%)
Idade (anos)
Homens
Mulheres
41,10 (21-83)
43,86 (21-70)
31,40 (6-73)
34,6 (8-80)
BCG
Sim
Homens
Mulheres
17 (56,66%)
7 (46,66%)
68 (77,27%)
64 (76,19%)
Não
Homens
Mulheres
13 (43,33%)
8 (53,33%)
20 (22,27%)
20 (23,80%)
PT
Negativa
Homens
Mulheres
Positiva
Homens
Mulheres
RAIO X
Sugestivo
Homens
Mulheres
Não realizado
Homens
Mulheres
BAAR
Positivo
Homens
Mulheres
52 (59%)
44 (52,3%)
36 (40,9%)
40 (47,6%)
28 (93,33%)
14 (93,33%)
2 (6,66%)
1 (1,66%)
28 (93,33%)
10 (66,66%)
Negativo
Homens
Mulheres
1 (3,33%)
3 (20%)
Não realizado
Homens
Mulheres
1 (3,33%)
2 (13,33%)
Tratamento
E1
Homens
Mulheres
EIR
Homens
Mulheres
30 (100%)
14 (93,33%)
1 (6,66%)
26
Os dados sócio-epidemiológicos dos contatos recrutados no momento do
diagnóstico encontram-se na Tabela 1. Dos 172 contatos domiciliares dos pacientes com
tuberculose pulmonar que aceitaram participar da pesquisa, 51,46% (n=88) eram do sexo
masculino, enquanto 49,12% (n=84) eram do sexo feminino. A média de idade dos
contatos participantes do sexo masculino foi de 31,4 anos. Desses, 77,27% (n=64)
receberam a vacina BCG na infância, entretanto, 22,27% (n=20) não receberam a vacina.
Após realização da PT, 52 indivíduos com idade variando entre 6 e 73 anos,
apresentaram PT negativa enquanto que 36 indivíduos apresentaram positivos.
A média de idade dos contatos participantes do sexo feminino foi de 34,6 anos.
Sendo que dessas, 76,19% (n=64) receberam a vacina BCG na infância, enquanto que
23,80% (n=20) não a receberam; Após realização da PT, 44 indivíduos com idade
variando entre 8 e 80 anos, apresentaram PT negativa enquanto que 40 indivíduos
apresentaram positivos.
2.3.2. Padronização de Ensaio Imuno-enzimático (ELISA) utilizando
antígeno rGroEs do Mycobacterium tuberculosis
O objetivo inicial do projeto foi o de padronizar o ensaio imuno-enzimático
(ELISA) para identificar a concentração do antígeno e a diluição ideal do plasma.
Para a padronização deste ELISA, foram realizados diversos testes com diferentes
concentrações de antígeno recombinante GroES do Mtb e diferentes diluições dos
plasmas, sempre em diluições seriadas e em duplicata. Assim, as concentrações dos
antígenos testadas foram: 5µg/mL e 10µg/mL. Já as diluições dos plasmas foram: 1:5,
1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 e 1:640. Para verificar a diluição ideal das amostras,
foi utilizado pool de plasma de pacientes com tuberculose pulmonar ativa, pool de
plasma de indivíduos PT- e pool de plasma de indivíduos PT+. Isso gerou curvas, sendo
possíveis observar e determinar as melhores concentrações de antígenos e diluições do
anticorpo primário que possibilitasse uma diferença nas leituras dos plasmas positivos e
negativos, com as menores quantidades possíveis de plasmas e de antígenos. Foram
utilizados 3 controles para o ensaio imuno-enzimático: branco (contendo todos os
componentes do ensaio, exceto bloqueio e anticorpo), controle do conjugado (contendo
27
todos os reagentes do ensaio, exceto o anticorpo primário) e controle do bloqueio
(contendo todos os reagentes do ensaio, exceto o antígeno).
0.5
O.D(492nm)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50
350
400
450
500
550
600
650
Diluições
5g/mL
TB
CONTROLE PPD -
CONTROLE PPD +
10g/mL
TB
CONTROLE PPD -
CONTROLE PPD +
Figura 2. Padronização de ELISA utilizando antígeno rGroES nas concentrações de
5µg/ml
(Linear)
e
10µg/ml
(Pontilhado),
nas
diluições
de
1/5,1/10,1/20,1/40,1/80,1/160,1/320 e 1/640, utilizando plasma de indivíduos com TB,
controle PT- e controle PT+, para avaliação da resposta imune humoral em ambas as
concentrações de antígeno.
Com a padronização das condições para o ELISA, determinou-se que para o
rGroES a concentração ótima de antígeno era de 10µg/mL e a diluição do anticorpo
primário 1:20 para os testes posteriores com os plasmas individualmente. Foi utilizado as
mesmas concentrações de antígenos e a mesma diluição das amostras para a detecção de
anticorpos IgM e IgG.
28
2.3.3. Detecção de anticorpos das classes IgM e IgG em amostras de plasma
de pacientes com Tuberculose Pulmonar e Contatos domiciliares no momento do
diagnóstico por ensaio imunoenzimático (ELISA)
Após a padronização do ensaio imuno-enzimático para o antígeno rGroES do
Mtb, foram realizados testes com amostras de plasmas de pacientes com tuberculose
pulmonar ativa e seus contatos intradomiciliares, a fim de se avaliar a resposta imune
humoral destes por meio da detecção de anticorpo das classes IgM e IgG, no momento
do diagnóstico.
Foram testados plasmas de 45 pacientes com TB pulmonar ativa recémdiagnosticada, independente de sexo, etnia, e apresentando diagnóstico confirmado pelo
BAAR positivo do escarro, diagnóstico clínico e de 172 contatos domiciliares dos
pacientes selecionados, totalizando 217 indivíduos. Os contatos intradomiciliares (CID)
foram divididos em PT positiva e PT negativa, para que fosse possível verificar se havia
diferença na resposta imune humoral entre estes.
Na análise dos anticorpos da classe IgM, observou-se que os CID, PT negativa,
apresentaram níveis de anticorpos da classe IgM específicos para o rGroES (0,2328
±0,1423) superiores aos pacientes (0,1931±0,1400), com p = 0,0497 (Figura 3). Quando
indivíduos com TB ativa e CID PT positiva foram comparados, níveis semelhantes de
anticorpos da classe IgM específicos ao rGroES foram encontrados (TB= 0,1931 ±
0,1400; CID PT+ (0,2128 ± 0,1510).
Entretanto não foi possível por meio desta técnica discriminar indivíduos PT
negativa de PT positiva.
29
1.2
1.0
*
IgM O.D(492nm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
PACIENTES
PPD-
PPD+
Figura 3. Níveis de anticorpos da classe IgM no plasma de pacientes com tuberculose
ativa e contatos intradomiciliares (CID) PT- e PT+, no momento do diagnóstico, contra o
antígeno recombinante MtGroES. * Diferença estatística entre os pacientes TB ativa e
CID PT-.*p= 0.0497, test t de Student. Pacientes: n= 45; contatos: n= 96 PT- e contatos:
n=76 PT+.
Na análise dos anticorpos da classe IgG, os indivíduos com tuberculose ativa
apresentaram níveis superiores desses anticorpos, específicos ao rGroES, (0,2034 ±
0,2142) quando comparados aos níveis encontrados nos CID PT- (0,1211 ± 0,1456), com
p=0.0168. Utilizando a curva ROC (Receiving Operating Curve), quando considerando
os contatos intradomiciliares, PT negativa, como controles negativos, e fixando uma
sensibilidade acima de 78% (uma vez que para o teste padrão ouro de diagnóstico para
TB, a cultura do bacilo, apresenta sensibilidade variando de 65 a 85%), obteve-se
sensibilidade de 78,38% (IC 95% de 61,79% a 90,17%) e especificidade de 31,76%, (IC
95% de 22,08 % a 42,76%), para um Cut-off de 0,0520. Para este ELISA a área sobre a
curva (AUC) foi de 0,6367. No entanto, os indivíduos com tuberculose ativa
apresentaram níveis de anticorpos da classe IgG específicos ao rGroES (0,2034 ± 0,2142)
semelhantes aos CID PT+ (0,1673 ± 0,1815) (Figura 4).
30
1.2
*
1.0
O.D(492nm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
PACIENTE
PPD-
PPD+
Figura 4. Níveis de anticorpos da classe IgG no plasma de pacientes com Tuberculose
ativa e contatos intradomiciliares (CID) PT- e PT+, no momento do diagnóstico, contra o
antígeno recombinante MtGroES.* Diferença estatística entre os pacientes TB ativa e
CID PT-.*p= 0.0168, test t de Student. Pacientes: n= 37; contatos: n= 85 PT- e contatos:
n=56 PT+.
31
2.3.4. Discussão
O estudo da resposta imune humoral de indivíduos com TB ativa contra antígenos
do Mtb é importante, pois permite a observar o comportamento desta resposta e possível
aprimoramento de um teste diagnóstico da TB. Com este intuito foi realizado este estudo
observacional para o qual foi utilizado um teste de ELISA a fim de comparar a resposta
imune humoral contra o antígeno rGroES do Mtb de pacientes com tuberculose pulmonar
ativa recém-diagnosticada e seus contatos intra-domiciliares (Costa et al. 2011).
A análise dos dados obtidos no estudo observacional demonstra que a maioria dos
indivíduos com TB ativa eram do sexo masculino. De acordo com a Organização
Mundial de Saúde, a TB afeta mais homens do que mulheres devido ao dinamismo e
liberdade da vida social, o que os tornam mais expostos aos diversos tipos de
enfermidades, justificando estarem mais presentes neste grupo de estudo como população
doente (WHO 2006). Craig e colaboradores em 2007 relatam os fatores sociais que
podem estar relacionados com a gestão da TB e seu impacto na sociedade, tais como uso
do álcool, taxa de migração, países emergentes, dentre outros. Tais fatores podem
determinar e justificar os motivos que propiciam a presença de maior número de casos de
homens com tuberculose em relação às mulheres.
Quanto à faixa etária destes indivíduos, a média de idade observada foi de 42
anos, variando de 21 a 83 anos de idade. A TB é uma enfermidade que atinge, na maioria
das vezes, a população de indivíduos em fase reprodutiva e economicamente ativa, de
acordo com o que se observa neste estudo e neste país que é endêmico para a doença
(WHO 2009).
A maioria dos indivíduos com TB ativa foram vacinados com BCG na infância.
Porém, alguns indivíduos não formam cicatriz vacinal, uma vez que esta pode estar na
dependência de citocinas do tipo Th2 ativadas após a vacinação com BCG, podendo
sofrer variações individuais (Djuardi et al. 2010). Como avaliado anteriormente, nosso
grupo demonstra que a vacina BCG não influencia a resposta imune humoral de
indivíduos doentes, portanto não se constitui um problema para a população de estudos
(Rabahi et al. 2007). Apesar de a profilaxia da TB ser realizada com a vacina BCG,
estudos demonstram que sua proteção apresenta uma variabilidade muito grande, de 0% a
80%, o que a torna com eficácia reduzida, principalmente após dez anos de imunização
32
(Kaufmann 2004). Este é um dado já consolidado e que se perpetua enquanto não se
desenvolve uma nova vacina para a TB ou um reforço que seja capaz de substituí-la.
Em infecções pelo Mtb, a resposta imune humoral induzida por linfócitos Th2
impedem respostas imunes exacerbadas que possam prejudicar o hospedeiro, sendo,
portanto uma resposta regulatória. Dessa maneira, os linfócitos Th2 produzem citocinas
como IL-4 que induzem a produção de anticorpos pelos linfócitos B, os quais podem agir
neutralizando resíduos tóxicos de parede celular, inibindo a ativação de células,
regulando assim a resposta imunológica (Orme & Cooper 1999; Silva & Boéchat 2004).
Estes anticorpos específicos para o agente bacteriano parecem conferir pouca ou
nenhuma imunidade protetora contra a micobactéria (Bonato et al. 1998). Os anticorpos
irão opsonizar o Mtb e suas proteínas secretadas, facilitando o reconhecimento pelas
células do sistema imune (Flynn & Chan 2001). Há muito tem se estudado o papel dos
anticorpos na resposta imune humana à tuberculose com o intuito de utilizá-los em seu
diagnóstico laboratorial (Jackett et al. 1988).
Na resposta imune humoral de indivíduos saudáveis PT negativa, os níveis
plasmáticos de IgM anti-rGroES foram superiores aos pacientes com TB, havendo
diferença estatística significativa entre os dois grupos (p=0.0497). Segundo Chua-Intra e
colaboradores (2002), o antígeno GroES é conservado entre espécies e seus homólogos
estão presentes em células procariotas, o que poderia explicar a detecção de anticorpos
IgM em nosso grupo de contatos PT negativos. Entretanto, é importante salientar que a
identificação de infecção por Mtb entre os contatos de pacientes tuberculosos bacilíferos
é muito difícil, uma vez que a negatividade da PT pode estar associada a uma janela de
reconhecimento imunológica, não necessariamente evidenciando uma ausência de
infecção (Xi et al. 2010). Ferrero e colaboradores (1995) têm demonstrado que o
antígenos GroES é uma proteína protetora quando há infecção em mucosa de
camundongos. Essa IgM detectada no grupo de indivíduos saudáveis pode ser uma
resposta protetora, impossibilitando o desenvolvimento de infecção.
Esses anticorpos podem representar uma resposta imune protetora, por isso não se
evidencia presença de infecção neste grupo. A presença de GroES em bactérias
colonizadoras do hospedeiro nos permite sugerir que a produção de anticorpos contra
essa proteína seja contínua e natural, a medida que o organismo é sugeito a algum tipo de
stress (Chua-Intra et al. 1998).
33
Ao contrário, avaliando a resposta imune humoral de pacientes com TB,
verificou-se níveis plasmáticos superiores (p=0.0169) de anticorpos IgG anti-rGroES
nestes indivíduos em relação aos seus CID PT negativa, sugerindo que este antígeno pode
discriminar estes dois grupos quando se avalia a presença de IgG. Estes achados
concordam com Young & Garbe (1991) e Boesen et al. (1995) os quais relatam que o
GroES é um antígeno imunodominante do Mtb capaz de provocar forte resposta de
células B em indivíduos infectados e forte resposta de células T nas primeiras fases da
tuberculose ativa.
Segundo Verbon e colaboradores (1991), de 35-50% dos pacientes com Tb
repondem com produção de anticorpos específicos ao GroES do Mtb, quando se realiza o
mapeamento de anticorpos específicos a essa proteína na superfície de linfócitos B, sendo
que essa produção não é evidenciada em indivíduos saudáveis. Em 2002, Chua-Intra, ao
estimular PBMC com sequência N terminal, sequências específicas de GroEs do Mtb,
verifica maior ativação das células dos pacientes com TB em relação a PBMC de
indivíduos saudáveis, sugerindo uma atividade imunogênica acentuada desse antígeno em
pacientes com TB.
O antígeno GroES vem sendo utilizado como marcador de TB acítica, sendo
produzido preponderantemente no líquido acítico de pacientes com TB em relação a
líquido acítico de pacientes com TB não acítica, capaz de discriminar os dois grupos,
quando se utiliza anticorpos IgG específicos para pesquisa dessa proteína (Kashyap et al.
2010). A detecção acentuada do GroES pode ser verificada por meio de ELISA indireto,
ao utilizar anticorpos IgG específicos (Kashyap et al. 2010).
34
2.3.5. Conclusões
Foi avaliada a resposta imune humoral de pacientes com TB pulmonar ativa e contatos
intradomiciliares por meio da análise de anticorpos das classes IgM e IgG específicos ao o
antígeno GroES do Mtb.
Realizou-se a padronização do ensaio de ELISA utilizando o antígeno recombinante
GroES do Mtb.
CID PT negativa apresentam níveis superiores de anticorpos IgM anti-GroES do Mtb
em relação a pacientes com TB ativa.
Anticorpos da classe IgG anti-GroES do Mtb são capazes de discriminar pacientes
com TB ativa e seus CID PT negativa.
CID PT positiva não apresentam diferença quanto aos níveis de anticorpos IgM e IgG
anti-GroES do Mtb em relação a pacientes com TB ativa
35
Capítulo 3
AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DA PROTEÍNA DE FUSÃO
MPT-51-HSP-X-AG85 PARA DESENVOLVIMENTO DE DIAGNÓSTICO
SOROLÓGICO
PARA
A
TUBERCULOSE.
36
3.1. OBJETIVOS
3.1.1. Objetivo Geral
Avaliar a imunogenicidade e antigenicidade de uma proteína de fusão contendo as
proteínas Hsp-X, Ag85c e MPT-51 do Mtb para o diagnóstico da TB.
3.1.2. Objetivos Específicos
Padronizar um ensaio de ELISA utilizando a proteína de fusão em indivíduos com
TB pulmonar ativa.
Verificar se anticorpos séricos
IgM e IgG específicos à Proteína de Fusão
discrimina os pacientes com TB pulmonar ativa do grupo controle saudável
Estudar a possível utilização da Proteína de Fusão como marcador de TB
pulmonar ativa em sorodiagnóstico, por meio da técnica de ELISA.
37
3.2. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1. Populações de Estudos
A população de estudos foi composta por 35 indivíduos com TB ativa pareados
por sexo e idade com controles saudáveis. Os voluntários foram selecionados
independentes do sexo, maiores de 18 anos e moradores do estado de Goiás.
Os pacientes foram obtidos em duas Unidades Públicas de Saúde de Goiás:
Hospital de Doenças Tropicais Dr. Anuar Auad e Centro de Referência em Diagnóstico e
Terapêutica, no período de março de 2005 a março de 2006. Os critérios de inclusão para
indivíduos diagnosticados foram os do Ministério da Saúde, que considera como
tuberculose ativa os pacientes que apresentam manifestações clínicas como tosse
produtiva e febre baixa por mais de três semanas e baciloscopia ou cultura positiva para o
M. tuberculosis, além de radiografia torácica sugestiva para a doença. Os indivíduos com
outras doenças crônicas e/ou imunossupressoras como a infecção pelo HIV, ou em uso de
medicamentos supressores (corticóides), mulheres gestantes ou aquelas que não tiveram
diagnóstico confirmado foram excluídos, além de indivíduos com idade inferior a 18
anos.
3.2.2. Controles Saudáveis
Este grupo foi composto por voluntários saudáveis selecionados aleatoriamente na
comunidade, moradores do estado de Goiás e que atenderam os critérios: Não ter tido
contato prévio conhecido com caso índice de TB; Prova Tuberculínica (PT) não reator,
HIV soronegativos e sem manifestações de doenças crônicas e parasitárias. Foram
excluídos ainda aqueles indivíduos em uso de medicamentos imunossupressores bem
como mulheres gestantes. Estes voluntários foram selecionados e pareados de acordo
com o sexo e idade (±6 anos) com os pacientes com Tuberculose ativa.
Os dados clínicos e epidemiológicos dos indivíduos com TB ativa foram obtidos
após revisão dos prontuários dos pacientes. Os dados dos controles saudáveis foram
obtidos no momento do recrutamento.
38
3.2.3. Coleta das amostras e realização da Prova Tuberculínica (PT)
Dos voluntários selecionados para a pesquisa, foram coletados seis mililitros (mL)
de sangue total, sem anticoagulantes. Após identificação, as amostras foram processadas,
sendo feita a separação do soro a 2.500 rpm por 10 minutos. Os soros foram aliquotados
e armazenados a -20°C. Alíquotas de amostras de soros armazenados a -20°C foram
descongeladas uma única vez, no momento de realização dos ensaios.
Foi aplicado intradermicamente 100μl de PPD Rt 23 (Statens Serum Institut,
Copenhagen, Dinamarca) no antebraço esquerdo de cada voluntário do grupo controle. A
leitura da induração cutânea foi realizada 72 horas após a aplicação e os indivíduos foram
classificadas de acordo com os parâmetros estabelecidos pela OMS em PT positivos
(induração cutânea maior ou igual a 10 mm) e PT negativos (induração cutânea menor
que 10 mm).
3.2.4. Antígenos recombinantes protéicos
3.2.4.1. Transformação de plasmídio pET23a/Fusão em E.coli BL21 pLysS
O antígeno recombinante protéico, Proteína de Fusão, foi produzido em E. coli,
no Laboratório de Imunopatologia e Doenças Infecciosas do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP), da Universidade Federal de Goiás (UFG).
Os vetores contendo os genes foram transformados em células competentes E.
coli BL21 pLysS. Alíquotas de 50µL de células competentes de E. coli BL21 pLysS
foram mantidas no gelo por 15 minutos. Após, foi adicionado 1µL de DNA plasmidial
pET23a/Fusão e incubado por 5 minutos no gelo. Em seguida foram transferidas para
uma cubeta de eletroporação e submetidas a choque elétrico em eletroporador sob
voltagem de 2.5KV. Em seguida, foi adicionado 1 mL de meio SOC-Broth na cubeta para
remover as células, e transferí-las para novo tubo estéril e incubá-la por 1 hora a 37°C,
sob agitação em shaker. Logo após este período de incubação foram plaqueadas em meio
seletivo LB Ágar contendo ampicilina e cloranfenicol e incubadas a 37°C por 18 horas.
39
3.2.4.2. Indução da Expressão Protéica
Para a seleção das bactérias transformadas, após 24 horas de cultura em
homogeneização constante a 150 rpm no Shaker, os pré-inóculos foram incubados em 1
litro de meio LB (Lúria Bertanii) 20µg/mL de cloranfenicol e 100µg/mL de ampicilina,
incubando por 4 horas em Shaker a 37°C. Após 4 horas de incubação, foi adicionado
1mL de IPTG a 0.4M (Indutor) e a cultura foi incubada por mais 4 horas no Shaker a
37ºC. Após este período a cultura foi centrifugada a 9.000 xg por 10 minutos. O
sedimento obtido foi armazenado a -20ºC.
3.2.4.3. Purificação de Proteínas em condição desnaturante
O sedimento bacteriano descrito no procedimento anterior foi ressuspendido em
10ml de tampão de lise desnaturante pH 8.0 e incubado a temperatura ambiente (1525ºC) por 60 minutos, homogeneizando de 10 em 10 minutos. Após o tempo de
incubação, a suspensão celular foi homogeneizada de 2 a 3 vezes por inversão. O lisado
foi centrifugado em tubos cônicos por 45 minutos a 9000 xg a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi transferido para tubo falcon de 15mL, sendo retirado uma alíquota de 20
µL e estocado a -20ºC para a análise em SDS-PAGE. O sobrenadante foi aplicado na
coluna, coletando as quatro primeiras gotas (Eluato) para que fosse feito a análise em
SDS-PAGE. A coluna foi lavada duas vezes com 4ml de tampão desnaturante de
lavagem do qual foi coletado as 4 primeiras gotas em tubo eppendorf. Após foi obtida a
primeira e a segunda eluição. Para obtenção da primeira eluição, foi aplicado 1 ml de
tampão desnaturante de eluição pH 4.5. Deste foi coletado todo o filtrado em eppendorf e
separado uma alíquota de 20µL para a análise em SDS-PAGE. A segunda eluição foi
obtida aplicando 1mL de tampão desnaturante de eluição pH4.5 do qual foi coletado todo
o filtrado em eppendorf e separado uma alíquota de 20µL para análise em SDS-PAGE.
Após a purificação, todas as frações de proteínas foram analisadas em SDS-PAGE,
coradas em azul de comassie e posteriormente quantificadas.
40
3.2.5. Padronização de ELISA com Proteína de Fusão
De cada etapa resultante da purificação das proteínas descritas anteriormente, foi
acrescido solução tampão de amostra, em seguida as mesmas foram fervidas a 98ºC por 5
minutos. Posteriormente, as amostras foram aplicadas em gel SDS-PAGE a 12%, em
seguida foram submetidas à eletroforese, a 80 volts e a 100mA de amperagem. Quando
as amostras entraram no gel de resolução, a voltagem foi aumentada para 100 volts até o
final da corrida.
3.2.5.1. Padronização de ELISA (Ensaio Imuno-Enzimático) com Proteína de
Fusão
Para a padronização do ELISA, foram realizados testes com duas concentrações
de antígenos (Costa et al., 2011) e diferentes diluições de soro, sempre em diluições
seriadas e em duplicata. Assim, as concentrações dos antígenos testadas foram: 5µg/mL e
10µg/mL. Já as diluições das amostras de soros foram: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160,
1:320 e 1:640 (Figura 8). Para verificar as diluições ideais dos soros, foram utilizado pool
de soros de pacientes com tuberculose pulmonar ativa, pool de soros de indivíduos PT- e
pool de soros de indivíduos PT+. Foram utilizados 3 controles para o ensaio imunoenzimático: branco (contendo todos os componentes do ensaio, exceto bloqueio e
anticorpo), controle do conjugado (contendo todos os reagentes do ensaio, exceto o
anticorpo primário) e controle do bloqueio (contendo todos os reagentes do ensaio,
exceto o antígeno). Nos ensaios realizados após a padronização foi utilizado pool de
soros TB positivos e de soros TB negativos como controles da reação na placa.
Neste estudo foram utilizados anticorpos conjugados anti-IgG- anticorpo
monoclonal de coelho, anti-IgG humana conjugado com peroxidade (IgG-HRP, Sigma
Aldrich), na concentração de 1/10.000.
Não foi realizada padronização para dosagem de IgM, uma vez que as diversas
classes de anticorpos se comportam da mesma maneira frente a diferentes concentrações
dos antígenos utilizados para construir a proteína de fusão (Rabahi et al., 2007; Almeida
et al., 2008; Reis et al., 2009; Costa et al., 2011; Limongi et al., 2011).
41
3.2.5.2. ELISA Indireto para Detecção de IgM e IgG sérica
Após ensaio de padronização, foi realizado ELISA indireto para pesquisa de
anticorpos específicos para proteína de fusão da classe IgM e IgG em pacientes com
doença ativa e controles saudáveis. As placas de poliestireno de 96 poços (Costar- high
binding) foram adsorvidas com a Proteína de Fusão (10μg/mL) diluído em Tampão
Carbonato-Bicarbonato 0,015 M, pH 9.6. Depois de incubadas por 18 horas na
temperatura de 4°C a 8°C, as placas foram bloqueadas utilizando-se 100µL de solução
bloqueio, composta por tampão carbonato-bicarbonato e leite desnatado 1%, sendo
novamente incubadas por duas horas a 37ºC. 50µL por poço das amostras de soro dos
pacientes TB pulmonar e controles saudáveis diluídas 1/5, 1/10, 1/20 e 1/40 em tampão
PBS, leite desnatado 0,06% foram adicionadas a placa e a mesma foi incubada de 4°C a
8°C . Após a incubação, as placas foram lavadas seis vezes com PBS 0,05%, Tween 20 e
depois acrescentados 50µL de conjugado IgM e IgG humana conjugada com peroxidase
(Sigma Aldrich) na concentração de 1/2.500 e 1/10.000, respectivamente, diluídos em
PBS 1X, leite desnatado 0,06% e incubados por uma hora a 37°C. Após semelhante
lavagem das placas, foi adicionada 50µL de tampão citrato-fosfato contendo OPD
(1mg/mL), 20µL de H2O2 e incubados por 15 minutos a temperatura ambiente, longe do
alcance da luz. Após esse período, foi adicionada 50µL/poço de H2SO4 4N para bloquear
a reação enzimática. A leitura das amostras foi feita em leitora de ELISA (Multiskan
Plus) a 492nm. As amostras foram avaliadas em duplicata e a média da absorbância
expressa em densidade óptica.
3.2.5.3. Ensaio de Competição
Foi realizado um teste de ELISA de competição para verificar a especificidade do
teste utilizado neste trabalho. A placa de ELISA foi adsorvida por 18 horas em geladeira
com proteína de fusão a 10μg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,015 M, pH 9.6. A
reação de ELISA foi bloqueada utilizando-se o tampão carbonato-bicarbonato e leite
desnatado 1% por duas horas a 37ºC. Soros de 9 pacientes com TB ativa e de 9 controles
saudáveis foram diluídos a 1/40 em duplicata, tampão PBS, leite desnatado 0,06%. 10µL
de solução de proteína de fusão a 20 µg/mL foram adicionadas a 50µL de soro diluído a
1/40 e a placa de ELISA foi incubada por 6 horas a temperatura ambiente em
42
homogeneização constante. Após a incubação, as placas foram lavadas seis vezes com
PBS 0,05%, Tween 20 e depois acrescentados 50µL de conjugado IgG humana
conjugada com peroxidase (Sigma Aldrich) na concentração de 1/10.000 diluídos em
PBS 1X, leite desnatado 0,06% e incubados por uma hora a 37°C. Após semelhante
lavagem das placas, foi adicionada 50µL de tampão citrato-fosfato contendo OPD
(1mg/mL), 20µL de H2O2 e incubados por 15 minutos a temperatura ambiente, longe do
alcance da luz. Após esse período, foi adicionada 50µL/poço de H2SO4 4N para bloquear
a reação enzimática. A leitura das amostras foi feita em leitora de ELISA (Multiskan
Plus) a 492nm. As amostras foram avaliadas em duplicata e a média da absorbância
expressa em densidade óptica.
3.3. Validação de Ensaio de ELISA para detecção de anticorpos Séricos
específicos para a Proteína de Fusão
A validação deste teste foi realizada calculando o valor preditivo positivo (VPP),
valor preditivo negativo (VPN), sensibilidade e especificidade do ensaio. O VPP indica o
quanto o teste é específico, enquanto que o VPN indica o quanto o teste pode ser sensível
para determinado diagnóstico. Então, quanto mais sensível o teste, maior é o VPN e,
quanto mais específico o teste melhor é o VPP.
Utilizando a curva ROC (Receiving Operating Curve), quando foram
consideradas as leituras em cada ELISA dos 39 indivíduos controles negativo e dos 35
indivíduos com TB ativa, foram fixadas as sensibilidades bem como as especificidades de
cada teste com seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%), por meio dos quais
foram obtidos os Cut-off (ponto de corte) que são utilizados como critérios de
positividade para seus respectivos ensaios. Os valores de VPP e VPN foram calculados
com base na tabela 2X2 (Arantes 1992).
43
Tabela 2. Dados para a validação de ensaio de ELISA.
Positivos
Negativos
(Doentes)
(não doentes)
Positivos
A
B
A+B
Negativos
C
D
C+D
A+C
B+D
TOTAL
Desempenho
SE =A/A+C
ES =D/B+D
VPP=A/ A+B
VPN=D/ C+D
TOTAL
Legenda: A (Verdadeiros Positivos (VP)); B (Falsos Positivos (FP)); C (Falsos
Negativos (FN)) e D (Verdadeiros Negativos (VP)); A+B (Total de Positivos no teste);
C+D (Total de negativos no teste); SE =Sensibilidade e ES =Especificidade.
3.4. Análise Estatística
Os resultados obtidos foram tabulados nos programas Excel (Versão 2007) e
Prism 4 software (Graphpad Software 4.0). A diferença entre os grupos foi avaliada
utilizando o teste t de student após a análise não paramétrica (Mann Whitney U). Foram
consideradas significantemente diferentes ensaios onde p<0.05.
O valor do cut-off foi utilizado para a determinação do critério de positividade do
teste. A seleção do cut-off foi realizada utilizando como parâmetros o IC95% da
sensibilidade do teste padrão ouro da TB: Cultura (S= 65 a 85%). O ponto de corte que
permitisse a melhor sensibilidade ou que estivesse dentro dos valores do teste padrão
ouro foi escolhido utilizando a análise da curva ROC (Receiver Operator Characteristic).
44
3.5. RESULTADOS
3.5.1. Dados Clínicos e Epidemiológicos da População em Estudo
Dentre os indivíduos com TB ativa, a maioria era do sexo masculino (26/35) os
quais apresentaram média de idade de 44 anos, variando de 20 a 73 anos. A maioria
(23/35) recebeu a vacina BCG; Vinte e nove indivíduos apresentaram bacilos álcoolácido resistentes (BAAR) no escarro. Em relação a este grupo, amostras de escarro de
dezesseis pacientes tiveram cultura para Mtb; uma amostra (1) apresentou resultado
negativo. As demais amostras de escarro não foram submetidas à cultura bacteriológica.
O grupo controle pareado por sexo e idade apresentou 18/39 indivíduos vacinados
com BCG e todos eram PT negativos.
Tabela 3. Dados Clínicos e Epidemiológicos da População em Estudos.
Grupos
Controles Saudáveis
TB Ativa
(39)
(35)
Sexo (Homens/Mulheres)
30/9
26/9
Idade Média: (variação)
43,6: (19-73)
44: (20-73)
18/21
23/12
BAAR (Positivo/Negativo/ NI)
-
29/04/02
Cultura (Positivo/Negativo/NR)
-
16/ 01/18
BCG (Vacinados/SI*)
SI*=Não informado pelo indivíduo
NR- Não Realizado
NI- Não Informado
45
3.5.2. Análise da expressão e purificação da proteína de fusão recombinante.
A construção dos plasmídios de clonagem e de expressão foi realizada no
Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas do IPTSP e será parte integrante
de um pedido de patente. A purificação da proteína recombinante foi realizada em coluna
de cromatografia de troca iônica, e a eletroforese em gel desnaturante do processo de
purificação está demonstrada na Figura 5. Devido à presença de outras três bandas
protéicas nos eluatos não correspondentes ao peso molecular da proteína de fusão, foi
realizada uma nova purificação dos eluatos da coluna cromatográfica (Figuras 6).
Para determinar a concentração da proteína de fusão (peso molecular de cerca de
30 a 35kDa) comparou-se intensidade da banda da proteína de fusão, em gel
desnaturante, com concentrações conhecidas de soro albumina bovina. Neste caso a
proteína purificada e utilizada neste trabalho apresentou uma concentração de 1,6 mg/ml
(Figura 7). Após a determinação da concentração protéica, foram procedidos os
experimentos de padronização dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA).
46
Figura 5. Gel de poliacrilamida 12% corado com azul de comassie, com materiais
coletados nas diferentes fases da purificação da proteína recombinante. Peso Molecular
(PM), Sobrenadante (SN), ELUATO, Primeiro Lavado (1ºLAV), Segundo Lavado (2º
LAV), Terceiro Lavado (3º LAV), Primeira Eluição (1ºELU), Segunda Eluição (2º ELU).
Proteína de Fusão (30 kD).
47
Figura 6. Gel de poliacrilamida 12% corado com azul de comassie, com repurificação
dos materiais coletados nas diferentes fases da purificação da proteína recombinante.
Primeiro Lavado (1ºLAV), Segundo Lavado (2º LAV), Primeira Eluição (1ºELU),
Segunda Eluição (2º ELU). Proteína de Fusão (30 kD).
48
Figura 7. Gel de poliacrilamida corado com azul de comassie para quantificação da
proteína de fusão recombinante purificada. Concentrações decrescentes da proteína de
fusão foram aplicadas no gel para comparar com concentrações decrescentes de BSA.
49
3.5.3. Padronização do ELISA para detecção de anticorpos séricos das classes
IgM e IgG específicos para a proteína de fusão.
Na figura 8 apresenta-se os resultados da padronização do ELISA para detecção de
IgG sérica anti a proteína de fusão. Como pode ser observada na cinética dos resultados
das diluições seriadas do soro, a diluição do soro a 1/40 foi a que permitiu melhor
distinção entre indivíduos doentes e controles. Quanto à concentração do Ag a ser usado
na placa, entre 5 e 10µg/mL, as duas concentrações permitiram distinguir os grupos
pesquisados, no entanto, quando utilizada a concentração de 5µg/mL não havia distinção
entre os grupos PT+ e PT-, em qualquer das diluições (Figura 8a). Ao contrário, quando
utilizada a concentração de 10µg/mL a distinção entre os grupos foi maior na diluição
sérica de 1/40 previamente definida.
1.1
1.1
1.0
a
TB 5 g/ml
PPD - 5 g/ml
1.0
PPD +5 g/ml
0.9
TB 10 g/ml
PPD - 10 g/ml
0.8
0.7
O.D (492nm)
0.9
0.8
0.6
0.5
0.4
0.3
O.D (492nm)
0.7
0.2
0.1
0.0
0
0.6
1
2
3
4
5
6
7
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
10
20
30
40
TB 5 g/ml
50
60
70
80
P - 5 g/ml
90
100
TB 10 g/ml
400
500
600
PT - 10 g/ml
Figura 8. Padronização de ELISA utilizando proteína de fusão nas concentrações de
5µg/ml (Pontilhado) e 10µg/ml (Linear), nas diluições de 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80,
1/160, 1/320 e 1/640, utilizando pool de soro de indivíduos com TB e pool de soros de
controle PT-, para verificar a concentração ideal de antígeno e diluição ideal de soros a
serem testados nos ensaios. Neste ensaio foram dosados anticorpos séricos da classe IgG.
Em a, resultados adicionando o grupo de indivíduos PT positiva.
50
8
3.5.4. Reconhecimento da proteína de fusão por anticorpos séricos IgG em
pacientes com TB pulmonar ativa, utilizando a técnica de ELISA
Os níveis séricos de anticorpos específicos para a proteína de fusão da classe IgG
foram dosados utilizando as amostras de soro na diluição 1/40 e a proteína de fusão na
concentração de 10µg/mL. Os indivíduos TB ativa apresentaram níveis de anticorpos IgG
superiores aos dos controles saudáveis PT negativos (TB=0,407±0,141; C=0,167±0,072;
p< 0,0001) (Figura 9).
0.8
****
0.7
0.6
34/34
D.O (492nm)
0.5
0.4
0.3
10/35
0.2
Ponto de
Corte = 0,179
0.1
0.0
TB ATIVA
CONTROLE
Figura 9. Níveis de anticorpos da classe IgG em amostras de soro, diluídos em 1/40, de
pacientes com Tuberculose ativa e grupo controle saudável, específicos para a proteína
de fusão. Diferença estatística entre os pacientes TB ativa e grupo controle saudável,
****p< 0,0001, test t de Student. Pacientes: n= 34 e controles negativos: n= 35.
Os resultados da curva ROC estão apresentados na figura 10. A área sob a curva
foi de 0,946.
51
100
Sensibilidade %
75
0.9462
50
25
0
0
25
50
75
100
100% - Especificidade %
Figura 10. Curva ROC do ensaio de ELISA para verificar a sensibilidade e
especificidade do teste para a dosagem de IgG de indivíduos com TB pulmonar ativa e
um grupo controle.
Ao se fixar uma sensibilidade de 100% com intervalo de confiança de 95%
variando de 89,7% a 100% obteve-se uma especificidade de 71,4% (IC 95% de 53,7% a
85,3%). Neste caso o ponto de corte foi de 0,179 (Figura 10). Para a validação dos
ensaios de ELISA com a proteína de fusão foi realizado o cálculo do VPP e VPN com o
auxílio da tabela 2X2 (Arantes 1992) (Tabela 4). Os resultados obtidos foram,
respectivamente, 77% e 100%.
52
Tabela 4. Sensibilidade, especificidade e valores preditivos do teste para detecção de
anticorpos IgG específicos para proteína de fusão.
Ag
PC
Ptn de
Fusão
(IgG)
0,179
Paciente
TB
N°≥ ponto de
corte
34/34
CT *
N°≥ ponto
de Corte
SE %
(IC 95%)
ES%
(IC 95%)
VPP
%
VPN
%
10/35
100
(89,7-100)
71.4
(53,7-85,3)
77%
100%
Legenda: Ag (Antígeno); PC (Ponto de Corte); CT (Controles); SE (Sensibilidade); ES
(Especificidade); VPP (Valor Pretitivo Positivo); VPN (Valor Preditivo Negativo); Ptn
(Proteína)
3.5.5. Reconhecimento da Proteína de Fusão por anticorpos Séricos IgM em
pacientes com TB pulmonar ativa, utilizando a técnica de ELISA
Além de se avaliar os níveis de anticorpos IgG específicos para a Proteína de
Fusão, também foram avaliados os níveis de anticorpos da classe IgM específicos. Todos
os ensaios foram procedidos em duplicata.
Os indivíduos com TB pulmonar ativa apresentaram média de leituras de
anticorpos IgM específicos para a proteína de fusão superiores (TB=0,305±0,09;C=
0,212±0,057; p < 0,0001) (Figura 11).
53
0.8
0.6
IgM (D.O 492nm)
****
0.4
28/35
15/39
0.2
Ponto de
Corte=0,226
0.0
TB ATIVA
CONTROLE
Figura 11. Níveis de anticorpos da classe IgM em amostras de soro, diluídos em 1/40, de
pacientes com Tuberculose ativa e grupo controle saudável, específicos para a proteína de
fusão. Diferença estatística entre os pacientes TB ativa e grupo controle saudável,
****p<0,0001, test t de Student. Pacientes: n= 35 e controles negativos: n= 39.
Os resultados da curva ROC estão apresentados na figura 12. A área sob a curva
foi de 0,821.
54
100
Sensibilidade %
75
0.8212
50
25
0
0
25
50
75
100
100% - Especificidade %
Figura 12. Curva ROC do ensaio de ELISA para dosagem de IgG contra a proteína de
fusão indivíduos com TB pulmonar ativa e um grupo controle.
Ao se fixar uma sensibilidade de 80,0% com intervalo de confiança de 95%
variando de 63,06% a 91,56% obteve-se uma especificidade de 61,54% (IC 95% de
44,62% a 76,64%). Neste caso, o ponto de corte foi de 0,226. Os VPP e VPN foram
calculados para realizar a validação dos ensaios, obtendo-se os resultados de 65,0% e
77,0%, respectivamente, por meio da tabela 2X2 (Arantes 1992) (Tabela 5).
55
Tabela 5. Sensibilidade, especificidade e valores preditivos do teste para detecção de
anticorpos IgM específicos para proteína de fusão.
Ag
PC
0,226
Ptn de
Fusão
(IgM)
Paciente
TB
N°≥
ponto de
corte
28/35
CT *
N°≥
ponto
de Corte
15/39
SE%
(IC95%)
80.0
(63,0691,56)
ES%
(IC 95%)
VPP%
(IC95%)
61,54
(44,6276,64)
65,0%
VPN%
(IC95%)
77,0%
Legenda: Ag (Antígeno); PC (Ponto de Corte); CT (Controles); SE (Sensibilidade); ES
(Especificidade); VPP (Valor Pretitivo Positivo); VPN (Valor Preditivo Negativo); Ptn
(Proteína)
3.5.6. Ensaio de Competição
Para verificar a especificidade do ensaio de ELISA utilizando a proteína de fusão,
o soro de nove indivíduos com TB ativa e de nove controles saudáveis foram utilizados.
Na figura 13 demonstra-se que após incubação prévia dos soros tanto de contatos quanto
de TB, diluídos com o antígeno, ocorre uma redução das densidades óticas, sendo mais
proeminente no grupo TB ativa (p<0,05).
56
0.8
D.O (492nm)
0.6
0.4
0.2
0.0
Paciente
Paciente + Ag
Controle
Controle + Ag
Figura 13. Resultado de Ensaio de Competição. Níveis séricos de anticorpos da classe
IgG em amostras de soro, diluídos em 1/40, de nove (9) pacientes com tuberculose ativa
e nove (9) indivíduos controle saudáveis, antes e após incubação prévia com o antígeno
específico.
57
3.6. DISCUSSÃO
Há muito se tem isolado e caracterizado proteínas imunogênicas, produzidas pelo
M. tuberculosis (Mtb) com o intuito de utilizá-las no desenvolvimento de novos testes
diagnósticos da tuberculose, em especial os sorodiagnósticos como marcadores de
qualquer fase da doença (Turneer et al. 1988; Nagai et al. 1991). Portanto, faz-se
necessário conhecer a resposta imune humoral de indivíduos com TB ativa contra
antígenos do Mtb, com o objetivo de estudar o comportamento desta resposta e, em
sequencia, aprimorar este estudo para um possível teste diagnóstico da TB.
Com este intuito foi realizadas meta-análises onde se demonstraram a importância
de se combinar antígenos a fim de melhorar o desempenho de proteínas produzidas pelo
Mtb no diagnóstico sorológico da tuberculose (Singh & Espitia 2007; Shin et al. 2008;
Wu et al. 2010; Wu L et al. 2011). Com este intuito, nosso grupo construiu uma proteína
de fusão artificial para tentar melhorar os testes de diagnóstico da TB.
A análise dos dados socioepidemiológicos obtidos demonstra que a maioria dos
indivíduos com TB ativa eram do sexo masculino. De acordo com a Organização
Mundial de Saúde, a TB afeta mais homens do que mulheres devido ao dinamismo e
liberdade da vida social, o que os tornam mais expostos aos diversos tipos de
enfermidades, justificando estarem mais presentes neste grupo de estudo como população
doente (WHO 2006). Craig e colaboradores em 2007 relataram os fatores sociais que
podem estar relacionados com a gestão da TB e seu impacto na sociedade, tais como uso
do álcool, taxa de migração, países emergentes, dentre outros. Tais fatores podem
determinar e justificar os motivos que propiciam a presença de maior número de casos de
homens com tuberculose em relação às mulheres.
Quanto à faixa etária destes indivíduos, a média de idade observada foi de 44
anos, variando de 20 a 73 anos de idade. A TB é uma enfermidade que atinge, na maioria
das vezes, a população de indivíduos em fase reprodutiva e economicamente ativa, de
acordo com o que se observa neste estudo e neste país que é endêmico para a doença
(WHO 2009).
A maioria dos indivíduos com TB ativa foram vacinados com BCG na infância.
Porém, alguns indivíduos não formam cicatriz vacinal, uma vez que esta pode estar na
dependência de citocinas do tipo Th2 ativadas após a vacinação com BCG, podendo
sofrer variações individuais (Djuardi et al. 2010). Como avaliado anteriormente, nosso
58
grupo demonstrou que a vacina BCG não influencia a resposta imune humoral de
indivíduos doentes, portanto não se constitui um problema para a população de estudo
(Rabahi et al. 2007). Apesar de a profilaxia da TB ser realizada com a vacina BCG,
estudos demonstram que sua proteção apresenta uma variabilidade muito grande, de 0% a
80%, apresentando eficácia reduzida, principalmente após os dez anos de imunização
(Kaufmann 2004). Este é um dado já consolidado e que se perpetua enquanto não é
desenvolvida uma nova vacina para a TB ou um reforço que seja capaz de substituí-la.
Em infecções pelo Mtb, a resposta imune humoral induzida por linfócitos Th2
impedem respostas imunes exacerbadas que possam prejudicar o hospedeiro, sendo,
portanto uma resposta regulatória. Dessa maneira, os linfócitos Th2 produzem citocinas
como IL-4 que induzem a produção de anticorpos pelos linfócitos B, os quais podem agir
neutralizando resíduos tóxicos de parede celular, inibindo a ativação de células,
regulando assim a resposta imunológica (Orme & Cooper 1999; Silva & Boéchat 2004).
Estes anticorpos específicos para o agente bacteriano parecem conferir pouca ou
nenhuma imunidade protetora contra a micobactéria (Bonato et al. 1998). Os anticorpos
irão opsonizar o Mtb e suas proteínas secretadas, facilitando o reconhecimento pelas
células do sistema imune (Flynn & Chan 2001). Há muito tem se estudado o papel dos
anticorpos na resposta imune humana à tuberculose com o intuito de utilizá-los em seu
diagnóstico laboratorial (Jackett et al. 1988).
A análise da resposta imune humoral de indivíduos com tuberculose pulmonar
ativa tem sido realizada através da dosagem de anticorpos específicos para vários
antígenos do Mtb. Trabalhos realizados por Rabahi et al. (2007) e Almeida et al. (2008)
caracterizaram e identificaram dois antígenos do Mtb como marcadores específicos de
doença ativa e um antígeno como marcador de indivíduos com infecção latente para a
tuberculose, quando o soro dos participantes foi analisado utilizando a técnica de ELISA.
Rabahi et al. (2007) avaliando trabalhadores da área da saúde, observou que o antígeno
recombinante HSPX poderia ser utilizado para discriminar indivíduos PT positiva dos PT
negativa através dos anticorpos IgM. Do mesmo modo Almeida et al. (2008) empregando
o antígeno MPT51 recombinante, observou que este antígeno tem a habilidade de
discriminar pacientes com TB ativa de controles saudáveis através da dosagem de
anticorpos das classes IgM e IgG.
Com o intuito de verificar o potencial da combinação gênica de proteínas para o
sorodiagnóstico, uma fusão gênica foi contruída e se constituíram de epítopos
59
imunodominantes de MPT-51, HSPX e Ag85c. Essas proteínas já se mostraram
imunogênicas e antigênicas tanto na resposta imune humoral quanto celular.
Estudos têm sido realizados para explorar o diagnóstico sorológico da TB,
avaliando o papel dos anticorpos na resposta imune humana à tuberculose, para
desenvolver método de diagnóstico laboratorial (Jackett et al. 1988). Para este fim é
necessário a caracterização de marcadores específicos da doença (Singh e Espitia 2007).
Para este estudo transversal utilizamos indivíduos com TB ativa e indivíduos saudáveis
como grupo controle. Dessa maneira verificamos a capacidade da proteína recombinante
do Mtb de discriminar indivíduos com tuberculose ativa de indivíduos saudáveis, por
meio da técnica de ELISA, ao avaliar o soro de anticorpos de ambos os grupos. A análise
da presença de anticorpos das classes IgG e IgM específicas para a proteína de fusão
demonstraram que os indivíduos com TB estudados apresentam níveis séricos destes
anticorpos significantemente superiores, quando comparados ao grupo controle.
Almeida e colaboradores (2008), utilizando o antígeno MPT-51 discriminou
pacientes com TB ativa de controles saudáveis, obtendo uma diferença estatística
significativa (p<0,001), com sensibilidade de 67,3%, especificidade de 91,6%, VPP de
91,6% e VPN de 85,6%, no que diz respeito a anticorpos IgM, o que nos leva a conclusão
de quão sensível e específico é o teste de ELISA quando se utiliza apenas o MPT-51
como marcador da TB ativa. Entretanto, quando a IgG específica para o MPT-51 foi
avaliada a eficácia do teste não se repetiu. Neste presente trabalho, a dosagem da IgG
específicas para a proteína de fusão conseguiu discriminar perfeitamente estes dois
grupos.
Shin et al., em 2008, demonstraram que o HspX sozinho foi a proteína com menor
capacidade discriminatória que as outras proteínas produzidas e testadas do Mtb em
ensaios sorológicos (ESAT-6, CFP10 e o antígeno 85A). Os ensaios de ELISA, na
avaliação de anticorpos IgG específicos, realizados com HspX apresentaram uma
sensibilidade de 60,8%, para o diagnóstico de TB ativa, enquanto que um coquetel de
proteínas apresentou sensibilidade de 75,4%. Em nosso trabalho, utilizando a proteína de
fusão, foi possível obter sensibilidade superior (80% e 100%), quando se avalia a
presença de anticorpos das classes IgM e IgG específicas para a proteína de fusão,
respectivamente.
Samanich et al. (2000), ao estudar o potencial de utilização no sorodiagnóstico o
antígeno 85C, avaliando a resposta imune humoral em indivíduos com TB ativa,
60
observou que 80% dos indivíduos com tuberculose respondem a este antígeno, quando
avaliados por meio da técnica de ELISA. No ensaio de ELISA desenvolvido neste
trabalho pode-se observar que 100% dos indivíduos com TB reconhecem a proteína de
fusão, comprovando que a utilização de proteínas de fusão melhora a sensibilidade dos
testes diagnósticos. Além disso, parece que a proteína de fusão criada consegue manter
ou melhorar a imunorreatividade das proteínas originais, sugerindo sua potencial
aplicação diagnóstica. Testes diagnósticos para hanseníase, utilizando proteína de fusão,
introduzem a possibilidade de geração de proteínas quiméricas que possam oferecer
maior sensibilidade para a detecção de pacientes (Stefani et al. 2008). Pode-se, portanto,
inferir que este trabalho caminha para o aperfeiçoamento do diagnóstico da TB.
Wu e colaboradores (2010), em estudo avaliando níveis séricos de IgG, verificou
que a utilização de combinações de antígenos podem aumentar a sensibilidade e
especificidade dos testes de diagnóstico para a TB, distinguindo os indivíduos com TB
dos indivíduos saudáveis (p<0,001). Em nosso estudo, avaliando IgG específicas para
proteína de fusão obtivemos melhor discriminação entre os dois grupos (p<0,0001), em
relação ao estudo previamente citado. O teste apresentou bom desempenho, com
sensibilidade de 100% e especificidade de 71%, além de VPP de 77,0% e VPN de 100%
(Tabela 5).
Segundo a WHO (2011) a sensibilidade de um teste de diagnóstico para a TB
precisa ser acima de 80%. O teste de IgG desenvolvido neste trabalho apresentou uma
sensibilidade de 100% com intervalo de confiança de 95% variando de 89,7% a 100%.
Esta sensibilidade apresenta um significado clínico muito importante, pois representa a
ausência de falsos negativos, uma vez que apresentou um VPN de 100%. O VPN mostra
quem são os verdadeiros negativos. Portanto, pode-se inferir deste trabalho que este teste
pode ser eficaz na exclusão dos indivíduos saudáveis, premitindo o rastreamento dos
possíveis portadores da TB ativa.
Surpreendentemente, em uma análise de custo e efetividade dos testes de
diagnóstico sorológicos para a TB, Menzies (2012) relata que a maioria dos testes de
diagnósticos sorológicos para TB na Índia apresentam resultados falsos positivos e falsos
negativos, representando um risco social e financeiro. No entanto, acreditamos que um
teste sorológico seria um risco financeiro caso as autoridades de saúde não assumissem o
seu custo. Além do mais, para se afirmar tão viemente que estes testes não funcionam,
61
seria interessante a realização de ensaios utilizando os testes avaliados em outra
população para testificar sua eficácia.
Em outro estudo, Shin e colaboradores (2008), utilizando população composta por
46 pacientes com TB ativa, diagnosticados pela técnica de Ziell-Nielsen, e por 46
indivíduos controles saudáveis, observou que ao utilizar antígenos derivados da cepa
H37Rv (rCFP-10, rESAT-6, rHspX, complexo Ag85, PstS1-45,8%) em um ELISA ao
dosar anticorpos da classe IgG, obteve uma curva ROC de 0,86. Em nosso estudo, foi
obtida curva ROC de 0,94, superior ao encontrado no trabalho anterior, verificando que a
combinação de diferentes proteínas permite melhorar a acurácia dos testes, possibilitando
a obtenção de resultados melhores ou semelhantes.
Os níveis de anticorpos séricos da classe IgM específicos para a proteína de fusão
dos pacientes com TB, dosados pela técnica de ELISA, foram inferiores aos níveis de
anticorpos IgG. Entretanto, os anticorpos IgM também discriminaram os pacientes com
TB em relação ao grupo controle. Esta distinção foi bastante clara, havendo diferença
estatística significativa entre os dois grupos (p<0,0001). Este teste apresentou uma
sensibilidade de 80% e especificidade de 61,5%. O VPP foi de 65% e o VPN de 77%
(Tabela 6).
A maioria dos trabalhos que avaliam testes diagnóstico para TB pesquisam IgG
específicas (Samanich et al. 2000; Shin et al. 2008; Wu et al. 2010). Pode-se dizer que a
IgG é a melhor determinante da doença, devido a maior especificidade desta
imunoglobulina. A imunoglobulina M é um anticorpo de fase aguda que pode ser
encontrada na fase crônica em menores proporções que a imunoglobulina G. Quando se
avaliou a produção de anticorpos IgM frente ao antígenos
rGroES do Mtb, entre
pacientes com TB e indivíduos PT-, não foi possível discriminar os dois grupos quanto a
doença (Costa et al. 2011). No entanto, trabalho anterior demonstrou que IgM especifica
para antígeno HspX do Mtb foi capaz de discriminar indivíduos que foram infectados
recentemente daqueles que apresentam infecção antiga ao Mtb, sem manifestação da
doença (Rabahi et al. 2007). No presente trabalho, não se avaliou indivíduos infectados
latentes, e apesar dos níveis séricos de anticorpos IgM terem sido um pouco inferiores
aos níveis séricos de anticorpos IgG, os resultados demonstram uma discriminação entre
TB ativa e controle saudável para a proteína de fusão (p<0.0001).
Feng e colaboradores (2011) também encontraram níveis séricos de IgM
inferiores ao níveis de IgG, porém encontraram nas células mononucleares de sangue
62
periférico de indivíduos com TB, o dobro da concentração de IgM em relação a IgG de
superfície. Por ser uma doença crônica, a TB se caracteriza por ativar repetidamente a
resposta imune. Os antígenos representados na proteína de fusão podem ser produzidos
pelo Mtb na fase aguda, crônica ou constantemente durante a doença, podendo então
reativar momentaneamente a produção de IgM específica. Por haver mais IgM de
superfície com relação a IgG, em indivíduos com TB (Feng et al. 2011), pode ser que esta
IgM seja continuamente secretada frente aos antígenos imunodominantes do Mtb
contidos na proteína de fusão, permitindo serem observados em ensaios sorológicos.
Segundo Margotto (2010), a acurácia dos testes diagnósticos é determinada pela
análise da curva ROC, a qual considera a eficácia do teste quando este apresenta a área
sob a curva (AUC) próxima de 1. Quanto mais próxima de 1, mais sensível e específico é
o teste. Tanto o ELISA para detecção de IgM, quanto para a detecção de IgG foram
considerados eficazes, uma vez que apresentaram a AUC de 0,821 e 0,94,
respectivamente.
As diferenças estatísticas apresentadas tanto para anticorpos IgM quanto para
anticorpos IgG demonstraram que a combinação de três antígenos imunodominantes do
Mtb que compõem a proteína de fusão maximizou a eficácia do sorodiagnóstico sem
comprometer a especificidade (Wu L et al. 2011). Por este estudo ter utilizado um
número pequeno de pacientes e controles, é necessário que estes resultados sejam
confirmados em uma população maior de pacientes com TB.
63
3.7. CONCLUSÕES
Foi avaliada a imunogenicidade da proteína de fusão HspX_Ag85c_MPT-51 de
Mtb para o diagnóstico da TB.
Foi realizada a padronização de ensaio de ELISA utilizando a proteína de fusão
em indivíduos com TB pulmonar ativa.
Anticorpos da classe IgG e IgM específicos para a Proteína de Fusão discriminam
pacientes com TB ativa e controles saudáveis .
A proteína de fusão pode ser utilizada em testes de diagnóstico de pacientes com
TB ativa.
64
3.9. REFERÊNCIAS
Abebe F, Bjune G 2009. The protective role of antibody response during
Mycobacterium tuberculosis infection. Clin and Exper Immunol 157: 235-243.
Abu-Raddad LJ, Sabatelli L, Achterberg JT, Sugimoto JD, Longini IM Jr, Dye C,
Halloran ME 2009. Epidemiological benefits of more-effective tuberculosis vaccines,
drugs, and diagnostics. Proc. Natl Acad. Sci. 106:13980–13985.
Aderem A, Underhill DM 1999. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual
Reviews.17:593-6231.
Adler H, Straud C, Frei R 2005. Comparison of Bac T/Alert 3D, Lowenstein-Jensen
médium and Middlebrook 7H10/7H11 biplate for recovering mycobacterial from
clinical specimes. EJCMID. 24:449-500
Almeida CMC, Vasconcelos AC Jr, Kipnis A, Andrade AL, Junqueira-Kipnis AP
2008. Humoral immune responses of tuberculosis patients in Brazil indicate
recognition of Mycobacterium tuberculosis MPT-51 and GlcB. Clin Vaccine
Immunol.15:579-81.
Alsleben N, Ruhwald M, Rüssmann H, Marx FM, Wahn U, Magdorf K
2011.
Interferon-gamma inducible protein 10 as a biomarker for active tuberculosis and
latent tuberculosis infection in children: A case-control study. Scand J Infect Dis. 2011
Nov 21. [Epub ahead of print]
Al Zahrani K, Al Jahdali H, Poirier L, Rene P, Gennaro ML, Menzies D 2000.
Accuracy and utility of commercially available amplification and serologic tests for
the diagnosis of minimal pulmonary tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 162:
1323-9.
65
Arantes GR 1992. The predictive value of the standard tuberculin test in BCGvaccinated children. RSP. 26. http://dx.doi.org/10.1590/S0034-89101992000400008
Araújo-Filho JA, Vasconcelos-Jínior AC, Sousa EM, Kipnis A, Junqueira-Kipnis AP
2008. Cellular responses to MPT-51, GlcB and ESAT-6 among MDR-TB andactive
tuberculosis patients in Brasil. Tuberculosis. 88:474-81
Aravindhan V, Sulochana S, Sujatha Narayanan, Paramasivam CN & Narayanan PR
2007. Identification & differentiation of Mycobacterium avium & M. intracellulare by
PCR- RFLP assay using the groES gene. Indian J Med Res. 126: 575-579
Arend SM, Geluk A, van Meijgaarden KE, van Dissel JT, Theisen M, Andersen P,
Ottenhoff THM 2000. Antigenic equivalence of human T-cell responses to
Mycobacterium tuberculosis-specific RD1-encoded protein antigens ESAT-6 and
culture filtrate protein 10 and to mixtures of synthetic peptides. Infection and
Immunity. 68: 3314-21.
Armstrong JA, Hart PD 1975. Phagosome-lysosome interactions in cultured
macrophages infected with virulent tubercle bacilli. Reversal of the usual nonfusion
pattern and observations on bacterial survival. J Exp Med. 142: 1-16.
Bancroft GJ, Sheehan KC, Schreiber RD, and Unanue ER 1989. Tumor necrosis factor
is involved in the T cell-independent pathway of macrophage activation in scid mice.
J. Immunol. 143:127-130.
Barnes PF, Fong SJ, Brennan PJ, Twomey PE, Mazumder A, and Modlin RL 1990.
Local production oftumor necrosis factor and interferon-Y in tuberculous pleuritis. J.
Immunol. 145:149-154.
Baumgarth N 2011. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective
effector functions. Nat Rev Immunol. 11:34-46.
66
Bekeredjian-Ding I, Jego G 2009. Toll-like receptors — sentries in the B-cell
response. Immunology. 128: 311–323.
Boesen H, Jensen BN, Wilcke T, and Andersen P 1995. Human T-cell responses to
secreted antigen fractions of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63:1491–
1497.
Bonato VL, Lima VM, Tascom RE, Lowrie DP, Silva CL 1998. Identification and
characterization of protective T cells in hsp 65 DNA-vaccinated and Mycobacterium
tuberculosis- infected mice. Infect. Immun. 66:169-75.
Bos NA, Kimura H, Meeuwsen CG, De Visser H, Hazenberg MP, Wostmann BS,
Pleasants JR, Benner R, Marcus DM 1989. Serum immunoglobulin levels and
naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c
mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur. J. Immunol. 19:2335–2339.
Bothamley GH, Beck JS, Schreuder GM, D'Amaro J, de Vries RR, Kardjito T, Ivanyi
J 1989. Association of tuberculosis and M. tuberculosis specific antibody levels with
HLA. J Infect Dis.159: 549-55.
Boyton RJ, Openshaw PJ 2002. Pulmonary defences to acute respiratory infection. Br
Med Bull. 61:1-12.
Briken V, Porcelli SA, Besra GS and Kremer L 2004.
Mycobacterial
lipoarabinomannan and related lipoglycans: from biogenesis to modulation of the
immune response. Mol Microbiol. 53: 391-403.
Brookes RH, Pathan AA, McShane H, Hensmann M, Price DA, Hill AV 2003. CD8+
T cell-mediated suppression of intracellular Mycobacterium tuberculosis growth in
activated human macrophages. Eur J Immunol. 33: 3293-302.
Campos HS 2006. Diagnóstico da tuberculose. Pulmão RJ. 15:92-99.
67
Chang Z, Primm TP, Jakana J, Lee IH, Serysheva I, Chiu W, Gilbert HF, Quiocho FA
1996. Mycobacterium tuberculosis 16-kDa antigen (Hsp16.3) functions as an
oligomeric structure in vitro to suppress thermal aggregation. J Biol Chem. 12:721823.
Chee CB, KhinMar KW, Gan SH, Barkham TM, Koh CK, Shen L, Wang YT 2010.
Tuberculosis treatment effect on T cell interferon-γ responses to Mycobacterium
tuberculosis-specific antigens. Eur. Respir. 36: 355–361.
Choudhary RK, Mukhopadhyay S, Chakhaiyar P, Sharma N, Murthy KJR, Katoch
VM, Hasnain SE 2003. PPE Antigen Rv2430c of Mycobacterium tuberculosis Induces
a Strong B-Cell Response. Infect. Immun. 71: 6338–6343.
Chua-Intra B, Ivanyi J, Hills A, Thole J, Moreno C, and Vordermeier HM 1998.
Predominant recognition of species-specific determinants of the GroES homologues
from Mycobacterium leprae and M. tuberculosis. Immunology. 93: 64–72.
Chua-Intra B, Wilkinson RJ, Ivanyi J 2002. Selective T-Cell Recognition of the NTerminal Peptide of GroES in Tuberculosis. Infect. Immun. 70:1645-7.
Cole ST, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D, Gordon SV,
Eiglmeier K, Gas S, Barry CE 3rd, Tekaia F, Badcock K, Basham D, Brown D,
Chillingworth T, Connor R, Davies R, Devlin K, Feltwell T, Gentles S, Hamlin N,
Holroyd S, Hornsby T, Jagels K, Krogh A, McLean J, Moule S, Murphy L, Oliver K,
Osborne J, Quail MA, Rajandream MA, Rogers J, Rutter S, Seeger K, Skelton J,
Squares R, Squares S, Sulston JE, Taylor K, Whitehead S, Barrell BG 1998.
Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome
sequence. Nature. 393:537-544.
Cosma CL, Sherman DR, and Ramakrishnan L 2003. The secret lives of the
pathogenic mycobacteria. Annu. Rev. Microbiol. 57:641–676.
68
Costa AC, Reis MCG, Silva BDS, Trentini MM e Junqueira-Kipnis AP 2011.
Resposta Imune Humoral ao antígeno rGroES do Mycobacterium tuberculosis em
pacientes com tuberculose e seus contatos. Revista de Patologia Tropical. 40: 23-34.
Craig GM, Booth H, Story A, Hayward A, Hall J, Goodburn A, Zumla A. J Adv Nurs
2007. The impact of social factors on tuberculosis management. J Adv Nurs. 58:41824.
Crampton SP, Voynova E, Bolland S 2010. Innate pathways to B-cell activation and
tolerance. Ann. NY Acad. Sci. 1183:58–68.
Crump JA, Tanner DC, Mirrett S, McKnight and Reller LB 2003. Controlled
comparison of Bactec 13A, MYCO/F LYIC, BacT/ALERT MB, and ISOLADOR 10
systems for detection of mycobacteremia. J Clin Microbio. 41: 1987-1990.
Dannenberg AM Jr 1991. Delayed-type hypersensitivity and cell-mediated immunity
in the pathogenesis of tuberculosis. Immunol Today. 12: 228-33.
Davies PD, Pai M 2008. The diagnosis and misdiagnosis of tuberculosis. Int. J.
Tuberc. Lung Dis. 12:1226–1234.
Davis JM, Ramakrishnan L 2009. The Role of the Granuloma in Expansion and
Dissemination of Early Tuberculous Infection. CELL. 136: 37–49.
Djuardi Y, Sartono E, Wibowo H, Supali T, Yazdanbakhsh M 2010. A Longitudinal
Study of BCG Vaccination in Early Childhood: The Development of Innate and
Adaptive Immune Responses. PLoS ONE. 5:e14066.
Draper P, Daffe M 2005. The cell envelope of Mycobacterium tuberculosis with
special reference to the capsule and outher permeability barrier. In Tuberculosis and
the Tubercle bacillus. ASM Press. 261-273.
69
Feng L, Li L, Liu Y, Qiao D, Li Q, Fu X, Wang H, Lao S and Wu C 2011. Feng B
lymphocytes that migrate to tuberculous pleural fluid via the SDF-1/CXCR4 axis
actively respond to antigens specific for Mycobacterium tuberculosis. Eur J Immunol.
41:3261-9
Ferrero RL, Thiberge J-M, Kansau I, Wuscher N, Huerre M, Labigne A 1995. The
GroES of Helicobucter pylori confers protective immunity against mucosal infection
in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 92: 6499-6503.
Flynn JL, Chan J 2001. Immunology of tuberculosis. Annual Review. 19: 93-129.
Gatfield J, Pieters J 2000. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into
macrophages. Science. 288: 1647-50.
Giacomini E, Iona E, Ferroni L, Miettinen M, Fattorini L, Orefici G, Julkunen I,
Coccia EM 2001. Infection of human macrophages and dendritic cells with
Mycobacterium tuberculosis induces a differential cytokine gene expression that
modulates T cell response. J. Immunol. 166:7033.
Gonzales-Juarrero M, Shim TS, Kipnis A, Junqueira-Kipnis AP and Orme IM 2003.
Dinamics of macrophage cell populations during murine pulmonary tuberculosis. J
Immunol. 171:3128-3135
Gorocica P, Carmem Ji-Ménez-Martinez MC, Garfias Y, Sada I, Lascurain R 2005.
Componentes glicosilados de la envoltura de Mycobacterium tuberculosis que
intervienen en La patogénesis de la tuberculosis. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. 18:142153. www.iner.gob.mx.
Harth G, Horwitz MA, Tabatadze D and Zamecnik PC 2002. Targeting the
Mycobacterium tuberculosis 30/32-KDa mycolyl transferase complex as a therapeutic
strategy against tuberculosis: Proof of principle by using antisense technology. Proc
Natl Acad Sci USA A. 99: 15615-15619.
70
Haury M, Sundblad A, Grandien A, Barreau C, Coutinho A, Nobrega A 1997. The
repertoire of serum IgM in normal mice is largely independent of external antigenic
contact. Eur. J. Immunol. 27:1557–1563.
Henderson RA, Watkins SC, Flynn JL 1997. Activation of human dendritic cells
following infection with Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 159:635-43
Hooijkaas H, Benner R, Pleasants JR, Wostmann BS 1984. Isotypes and specificities
of immunoglobulins produced by germ-free mice fed chemically defined ultrafiltered
―antigen-free‖ diet. Eur. J. Immunol. 14: 1127–1130.
Humphreys IR, Stewart GR, Turner DJ, Patel J, Karamanou D, Snelgrove RJ, Young
DB 2006. A role for dendritic cells in the dissemination of mycobacterial infection.
Microbes Infect. 8:1339-46.
Hussain R, Shahid F, Zafar S, Dojki M, Dockrell HM 2004. Immune profiling of
leprosy and tuberculosis patients to 15-mer peptides of Mycobacterium leprae and M.
tuberculosis GroES in a BCG vaccinated area: implications for development of
vaccine and diagnostic reagents. Immunology. 111: 462-461
Igietseme JU, Eko FO, He Q, Black CM 2003. Antibody regulation of T-cell
immunity: Implications for vaccine strategies against intra-cellular immunity:
implications for vaccine strategies against intracellular pathogens. Expert Rev
Vaccines. 3: 23-34.
Jackett PS, Bothamley GH, Batra HV, Mistry A, Young DB, Ivanyi J 1988.
Specificity of antibodiesto immunodominant mycobacterial antigens in pulmonary
tuberculosis. J Clin Microbiol. 26:2313-8.
Julián E, Matas L, Alcaide J, Luquin M 2004. Comparison of antibody responses to a
potential combination of specific glycolipids and proteins for test sensitivity
improvement in tuberculosis serodiagnosis. Clin Diagn Lab Immunol. 11: 70-6.
71
Kashyap RS, Rajan AN, Ramteke SS, Agrawal VS, Kelkar SS, Purohit HJ, Girdhar M
Taori GM and Daginawala HF 2007. Diagnosis of tuberculosis in an Indian population
by an indirect ELISA protocol based on detection of Antigen 85 complex: a
prospective cohort study. BMC Infectious Diseases. 7:74
Kashyap RS, Saha SM, Nagdev KJ, Kelkar SS, Purohit HJ, Taori GM, Daginawala
HF 2010. Diagnostic Markers for Tuberculosis Ascites: A Preliminary Study.
Biomarker Insights. 5: 87–94.
Kaufmann SH 2004. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. 63: 1150-1156.
Kinhikar AG, Vargas D, Li H, Mahaffey SB, Hinds L, Belisle JT, Laal S 2006.
Mycobacterium tuberculosis malate synthase is a laminin-binding adhesin. Mol
Microbiol. 60: 999-1013
Kitaura H, Ohara N, Naito M, Kobayashi K and Yamada T 2000. Fibronecti-biding
proteins secreted by Mycobacterium avium. Apmis. 108:558-564
Kremer L, Besra G 2005. A waxy tale, by Mycobacterium tuberculosis. In
Tuberculosis and the Tubercle bacillus. ASM Press, Washington DC. 287-305.
Lalvani A, Pathan AA, Durkan H, Wilkinson KA, Whelan A, Deeks JJ, Reece WH,
Latif M, Pasvol G, Hill AV 2001. Enhanced contact tracing and spatial tracking of
Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells.
Lancet. 357: 2017–2021.
Lewinsohn DM, Alderson MR, Briden AL, Riddell SR, Reed SG, Grabstein KH 1998.
Characterization of Human CD8 T Cells Reactive with Mycobacterium tuberculosis–
infected Antigen-presenting Cells. J. Exp. Med. 187: 1633–1640
Li X, Martin F, Oliver AM, Kearney JF & Carter RH 2001. Antigen receptor proximal
signaling in splenic B-2 cell subsets. J. Immunol. 166: 3122–3129.
72
Limongi LCS, Olival L, Conde MB, Junqueira-Kipnis AP 2011. Determination of
level of specific IgA to the HspX recombinant antigen of Mycobacterium tuberculosis
for the pleural tuberculosis. J Bras Pneumol. 37:302-307.
Lindquist S 1986. The heat shock responsc. Ann Rev Biochem. 55:1151-1191.
Ling DI, Pai M, Davids V, Brunet L, Lenders L, Meldau R, Calligaro G, Allwood B,
van Zyl-Smit R, Peter J, Bateman E, Dawson R, Dheda K 2011. Are interferon-γ
release assays useful for active tuberculosis in a high-burden setting? Eur Respir J.
38:649-56.
Lopez-Marin LM, Segura E, Hermida-Escobedo C, Lemassu A, Salinas-Carmona MC
2003. 6,6´-Dimycoloyl trehalose from a rapidly growing Mycobacterium:an
alternative antigen for tuberculosis serodiagnosis. FEMS Immunol Med Microbiol. 36:
47-54.
Mahapatra S, Basu J, Brennan P, Crick D 2005. Structure, biosynthesis, and genetics
of the Mycolic Acid-Arabinogalactan-Peptidoglycan complex. In Tuberculosis and the
Tubercle bacillus. ASM Press, Washington DC. 275-285
Margotto
PR
2010.
Curva
ROC
como
fazer
e
interpretar
no
SPSS.
www.paulomargotto.com.bt
Martin F, Kearney JF 2000. B-cell subsets and themature preimmune repertoire.
Marginal zone and B1 B cells as part of a ―natural immune memory‖. Immunol Rev.
175: 70–79.
Mazurek GH, Weis SE, Moonan PK, Daley CL, Bernardo J, Lardizabal AA, Reves
RR, Toney SR, Daniels LJ, LoBue PA
2007. Prospective comparison of the
tuberculin skin test and 2 whole-blood interferon-γ release assays in persons with
suspected tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 45: 837–845
73
Menzies D 2012. Hammering the point home: serologic testing costs more and harms
more patients than other strategies for the diagnosis of active tuberculosis in India.
EBM. 17:58-59
Meyer-Bahlburg A, Rawlings DJ 2008. B cell autonomous TLR signaling and
autoimmunity. Autoimmun. 7: 313–316
Ministério da Saúde. Secretária de Vigilância em Saúde 2006. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Nota técnica nᵒ. 66/CGPNI/DEVEP/SVS/MS.
Ministério da Saúde/Secretaria de Vigilância em Saúde (MS/SVS) 2011. Ministério da
Saúde. Datasus: Informações em Saúde.http//tabnet.datasus.gov.br/tabnet.htm.
Molloy A, Laochumroonvorapong P, Kaplan G 1994. Apoptosis, but not necrosis, of
infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus Calmette-Guérin. J.
Exp.Med. 180:1499–1509.
Mori T, Sakatani M, Yamagishi F, Takashima T, Kawabe Y, Nagao K, Shigeto E,
Harada N, Mitarai S, Okada M, Suzuki K, Inoue Y, Tsuyuguchi K, Sasaki Y, Mazurek
GH, Tsuyuguchi I 2004. Specific detection of tuberculosis infection : an interferon γ
based assay using new antigens. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170: 59–64.
Maglione PJ, Chan J 2009. How b cells shape the immune response against
Mycobacterium tuberculosis. Eu Immunol. 39: 676-686.
Nagai S, Wiker HG, Harboe M, Kinomoto M 1991. Isolation and partial
characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium
tuberculosis. Infection and Immunity. 59:372-82.
Ohara N, Ohara-Wada N, Kitaura H, Nishiyama T, Matsumoto S and Yamada T
1997a. Analysis of the genes encoding the antigen 85 complex and MPT51 from
Mycobacterium avium. Infection and Immunity. 65:3680–3685.
74
Ohara N, Nishiyama T, Ohara-Wada N, Matsumoto S, Matsuo T and Yamada T
1997b. Characterization of the transcriptional initiation regions of genes for the major
secreted protein antigens 85C and MPB51 of Mycobacterium bovis BCG. Microbial
Pathogenesis. 65: 303–310.
Orme M & Cooper M 1999. Cytokine/chemokine cascades in immunity to
tuberculosis. Immunology Today. 20:307-312
Pai M, Zwerling A, Menzies D 2008. Systematic review: T cell based assays for the
diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann. Intern. Med. 149: 177–184.
Pedroza-González A, García-Romo GS, Aguilar-León D, Calderon-Amador J,
Hurtado-Ortiz R, Orozco-Estevez H, Lambrecht BN, Estrada-García I, HernándezPando R, Flores-Romo L 2004. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during
murine pulmonary infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Int J Exp
Pathol. 85: 135-45.
Peterson PK, Gekker G, Hu S, Sheng WS, Anderson WR, Ulevitch RJ, Tobias PS,
Gustafson KV, Molitor TW, Chao CC 1995. CD14 receptor-mediated uptake of
nonopsonized Mycobacterium tuberculosis by human microglia. Infect Immun.
63:1598-602.
Pieters J 2001. Entry and survival of pathogenic mycobacteria in macrophages.
Microbes Infect. 3: 249-55.
Qamra R, Mande SC, Coates AR and Henderson B 2005. The unusual chaperonins of
Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb) 85:385-394.
Rabahi MF, Junqueira-Kipnis AP, Reis MCG, Oelemann W, Conde MC 2007.
Humoral response to HspX and GlcB to previous and recent infection by
Mycobacterium tuberculosis. BMC Infect Dis. 7:148.
75
Ramalingam B, Uma Devi KR & Raja A 2003. Isotype-specific anti-38 and 27 kDa
(mpt 51) response in pulmonary tuberculosis with human immunodeficiency virus
coinfection. Scand. J. Infect. Dis. 35:234–239.
Randhawa AK, Ziltener HJ, Merzaban JS, Stokes RW 2005. CD43 is required for
optimal growth inhibition of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and in mice.
J Immunol. 175:1805-12.
Raqib R, Rahman J, Kamaluddin AK, 2003. Rapid diagnosis of active tuberculosis by
detecting antibodies from lymphocyte secretions. J Infect Dis. 188: 364-70.
Ravn P, Boesen H, Pedersen BK, Andersen P 1997. Pedersen, and P. Andersen.
Human T cell responses induced by vaccination with Mycobacterium bovis bacillus
Calmette-Gue´rin. J. Immunol. 158:1949–1955.
Reis MCG, Rabahi MF, Kipnis A and Junqueira-Kipnis AP 2009. Health Care
Workers Humoral Immune Response Against GLcB, MPT51 and HSPX from
Mycobacterium tuberculosis. BJID. 13: 417-421
Reljic R, Ivanyi J 2006. A case for passive immunoprophylaxis against tuberculosis.
Lancet Infect Dis. 6: 813-818.
Rinke de Wit TF, Bekelie S, Osland A, Wieles B, Janson AA and Thole JE 1993. The
Mycobacterium leprae antigen 85 complex gene family: identification of the
recognition of the genes for the 85A, 85C, and related MPT51 proteins. Infect Immun.
61: 3642-3647.
Roberts GD, Koneman E.W, end Kim Y.K 1991. Manual of clinical microbiology.
Mycobacterium. Washington DC. Book. 304-339.
Sable SB, Kaur S, Karla M, Verma I and Khuller GK, Dobos K and Belisle JT 2005b.
Peripheral blood and pleural fluid mononuclear cell responses to low-molecular-mass
secretory polypeptides of immunity to tuberculosis. Infect Immun. 73:3547-3558.
76
Salinas-Carmona
MC,
Perez-Rivera
I
2004.
Humoral
immunity
through
immunoglobulin M protects mice from an experimental actinomycetoma infection by
Nocardia brasiliensis. Infect Immun. 72: 5597-604.
Samanich KM, Keen MA, Vissa VD, Harder JD, Spencer JS, Belisle JT, Zolla-Pazner
S, Laal S 2000. Serodiagnostic potential of culture filtrate antigens of Mycobacterium
tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 7:662-8.
Sampaio EP, Moreira AL, Sarno EN, Malta AM, and Kaplan G 1992. Prolonged
treatment with recombinant interferon 'y induces erythema nodosum leprosum in
lepromatous leprosy patients. J. Exp. Med. 175:1729-1737.
Sanki AK, Boucau J, Ronning DR, Sucheck SJ 2009. Antigen 85C-mediated acyltransfer between synthetic acyl donors and fragments of the arabinan. Glycoconj J. 26:
589-96.
Saunders BM, Frank AA, Orme IM, Cooper AM 2002. CD4 is required for the
development of a protective granulomatous response to pulmonary tuberculosis. Cell
Immunol. 216: 65-72.
Schlesinger N, Lardizabal A, Rao J, Rao J, McDonald R 2005. Tuberculosis of the
spine: experience in an inner city hospital. J Clin Rheumatol. 11:17-20.
Senol G, Ecevit C and Öztürk A 2009. Humoral immune response against 38- and 16kDa mycobacterial antigens in childhood tuberculosis. Pediatric Pulmonology.
44:439-444
Shin AR, Shin SJ, Lee KS, Eom SH, Lee SS, Lee BS, Lee JS, Cho SN, Kim HJ 2008.
Improved sensitivity of diagnosis of tuberculosis in patients in Korea via a cocktail
enzyme-linked immunosorbent assay containing the abundantly expressed antigens of
the K strain of Mycobacterium tuberculosis. Clin Vac Immunol. 15:1788–1795.
77
Silva JRL, Boéchat N 2004. O ressurgimento da tuberculose e o impacto do estudo da
imunopatologia pulmonar. J. Bras. Pneumol. 30:478-484.
Simsek H, Alpar S, Uçar N, Aksu F, Ceyhan I, Gozalan A, Cesur S and Ertek M 2010.
Comparison of Tuberculin Skin Testing and T-SPOT.TB for Diagnosis of Latent and
Active Tuberculosis. J. Infect. Dis. 63: 99-102.
Sing KK, Dong Y, Hinds L, Keen MA, Belisle JT, Zolla-Pazner S, Achkar JM, Nadas
AJ, Arora VK, Laal S 2003.Combined use of serum and urinary antibody for diagnosis
of tuberculosis. J Infect Dis. 188: 371-377.
Sing KK, Dong Y, Belisle JT, Harder J, Arora VK and Laal S 2005. Antigens of
Mycobacterium tuberculosis recognized by antibodies during incipient, subclinical
tuberculosis . Clin Diagn Lab Immunol. 12: 354-358.
Singh M, Espitia C. Immunological Diagnosis. In: Palomino JC, Leão SC, Ritacco V.
Tuberculosis
From basic science to
patient
care,
2007.
HTTP://www.tuberculosistextbook.com/tuberculosis2007.pdf.
Disponível em:
Acesso
em:
05/10/2010.
Smith CV, Huang CC, Miczak A, Russell DG, Sacchettini JC, Höner zu Bentrup K
2003. Biochemical and structural studies of malate synthase from Mycobacterium
tuberculosis. J Biol Chem. 278: 1735-1743
Sorensen AL, Nagai S, Houen G, Andersen P and Andersen AB 1995. Purification
and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by
Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63:1710-1717
Spratt JM, Britton WJ, Triccas JA 2010. In vivo persistence and protective efficacy of
the bacille Calmette Guerin vaccine overexpressing the HspX latency antigen. Bioeng
Bugs. 1:61-65.
78
Stefani MMA 2008. Desafios na era pós genômica para o desenvolvimento de testes
laboratoriais para o diagnóstico da hanseníase. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 41: 89-94
Steingart KR, Henry M, Laal S, Hopewell PC, Ramsay A, Menzies D, Cunningham J,
Weldingh K, Pai M 2007. Commercial serological antibody detection tests for the
diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review. PLoS Med. 4(6):e202.
Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chakraborty P, Haddix PL, Collins HL, Fok AK,
Allen RD, Gluck SL, Heuser J, Russell DG 1994. Lack of acidification in
Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.
Science. 263: 678-81.
Superintendência de Políticas e Atenção Integral à Saúde (Spais/SES-GO), 2009.
Disponível em: HTTP: // www.sgc.goias.gov.br/upload/links/arq_364_tuberculose.
Acesso em 06/10/2010.
Turneer M, Van Vooren JP, De Bruyn J, Serruys E, Dierckx P, Yernault JC 1988.
Humoral immune response in tuberculosis: immunoglobulin G, A and M directed
against the P32 protein antigen of Mycobacterium tuberculosis. Microbiol. 26:171419.
Waard JH and Robledo J. Conventional Diagnosis Methods. Tuberculosis From basic
science
to
patient
care,
2007.
HTTP://www.tuberculosistextbook.com/tuberculosis2007.pdf.
Disponível
em:
Acesso
em:
05/10/2010.
Walton C, Hawkey PM, James VL 2005. Examination of specimens for mycobacteria
in clinical laboratories in 21 countries: a 10- year review of the UK National Quality
Assessment Scheme for Mycobaceria Culture. Clin Microbiol Infect. 11: 1016-1021.
Williams A, Reljic R, Naylor I, Clark SO, Falero-Diaz G, Singh M, Challacombe S,
Marsh PD, Ivanyi J 2004. Passive protection with immunoglobulin A antibodies
against tuberculous early infection of the lungs. Immunology. 111: 328-33.
79
World Health Organization 2006. The global Plan to Stop TB 2006-2005. Geneve.
World Health Organization
World Health Organization 2009. Global Tuberculosis Control: Surveillance,
Planning, and Financing . Geneva, Switzerland: World Health Organization Press.
World Health Organization 2010. Global Tuberculosis Control: Surveillance,
Planning, and Financing . Geneva, Switzerland: World Health Organization Press.
World Health Organization 2011. Tuberculosis Serodiagnostic Tests Policy Statement.
www.who.int/tb
Wu L, Zhang M, Sun M, Jia B, Wang X 2011. Humoural Immune Responses to a
Recombinant 16-kDa-38-kDa-ESAT-6 Mycobacterial Antigen in Tuberculosis. J Int
Med Res. 39: 514-21.
Wu X, Yang Y, Zhang J, Li B, Liang Y, Zhang C 2010. Humoral Immune Responses
against the Mycobacterium tuberculosis 38-Kilodalton, MTB48, and CFP-10/ESAT-6
Antigens in Tuberculosis. CVI. 17: 372–375.
Young DB, Lathigra R, Hendrix, Sweetser D, Young RA 1988. Stress proteins are
immune targets in leprosy and tuberculosis. Proc Natl Acad USA. 85: 4267-70
Young DB, and Garbe TR 1991. Heat shock proteins and antigens of Mycobacterium
tuberculosis. Infect. Immun. 59:3086–3093.
Yuan Y, Crane DD, Simpson RM, Zhu YQ, Hickey MJ, Sherman DR, Barry CE 3rd
1998. The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of Mycobacterium tuberculosis is
required for growth in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 95:9578–9583.
Ulrichs T, Kaufmann SH 2006. New insights into the function of granulomas in
human tuberculosis. J. Pathol. 208: 261–269.
80
Underhill DM, Ozinsky A, Smith KD, Aderem A 1999. Toll-like receptor-2 mediates
mycobacteria-induced proinflammatory signaling in macrophages. Proc Natl Acad Sci
U S A. 96: 14459-63.
Vankayalapati R, Wizel B, Weis SE, Safi H, Lakey DL, Mandelboim O, Samten B,
Porgador A, Barnes PF 2002. The NKp46 receptor contributes to NK cell lysis of
mononuclear phagocytes infected with an intracellular bacterium. J Immunol. 168:
3451-7.
Verbon A, Hartskeerl RA, Kolk AHJ 1991. Murine and human B cell epitope mapping
of the Mycohacterium tuberculosis 10 kDa heat shock protein using overlapping
peptides. Clin Exp Immunol. 86:6-12.
Volkman HE, Clay H, Beery D, Chang JC, Sherman DR, and Ramakrishnan L 2004.
Tuberculous granuloma formation is enhanced by a mycobacterium virulence
determinant. PLoS Biol. 2: 1946–1956.
Xi S, Zhang Q, Liu C, Xie H, Yue L, Zhao Y, Zang B, Gao XEffects of HSYA on
expression of bFGF protein and MMP-9 in BGC-823 transplantation tumor of nude
mice. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 35: 2877-2881.
Zhang H, Shi CH, Xue Y, Bai YL, Wang LM, Xu ZK 2006. Immune response and
protective efficacy induced by fusion protein ESAT6-CFP10 of M.tuberculosis in
mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 22:443-446.
Zimmer K, Dräger KG, Klawonn W, Hess RG 1999. Contribution to the diagnosis of
Johne‘s disease in cattle. Comparative studies on the validity of Ziehl-Neelsen
staining, faecal culture and a commercially avaible DNA-Probe test in detecting
Mycobacterium paratuberculosis in faeces from cattle. J. Vet. Med. B. 46: 137- 140.
81
Zimmerli S, Edwards S, Ernst JD 1996. Selective receptor blockade during
phagocytosis does not alter the survival and growth of Mycobacterium tuberculosis in
human macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 15: 760-70.
82
4. ANEXOS
4.1. Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética
83
4.2. Anexo 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - PACIENTE
Título do projeto: Padronização de um teste de ELISA para triagem de indivíduos com
alto risco de adoecimento para tuberculose, atendidos na rede pública e privada de saúde
de Goiás.
Pesquisador responsável: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis, Imunologista.
Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas – IPTSP/UFG - sala 325.
Telefone para contato: (62) 3209-6126.
Este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido contém informações sobre a pesquisa
indicada acima. Para assegurar que você esteja informado sobre a sua participação nesta
pesquisa, pedimos que leia (ou peça que alguém leia) este Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido. Você também deverá assinar este termo (ou fazer sua marca perante uma
testemunha). Você receberá uma cópia deste termo.
Você esta sendo convidado (a) a participar, como voluntário (a), em uma pesquisa que
será conduzida na Universidade Federal de Goiás (Goiânia-Goiás). Após ser esclarecido
(a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final
deste documento, que está em duas vias. Uma delas é a sua e a outra é do pesquisador
responsável. Em caso de recusa você não será penalizado de forma alguma. Em caso de
dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Goiás, nos telefones: 3269 83 38- 3269 8426.
Esta pesquisa tentará padronizar um teste para identificar os indivíduos com risco de
adoecimento entre os contatos de casos de tuberculose. O resultado desse projeto
contribuirá para melhoria do diagnóstico precoce da tuberculose favorecendo o controle
da doença.
O pesquisador gastará cerca de vinte minutos com você para explicar-lhe o motivo da
pesquisa, anotar algumas informações sobre o seu estado de saúde atual e pedir o seu
consentimento para participar neste projeto. Neste período, um questionário será
preenchido para facilitar a análise dos resultados futuramente. Serão coletados 20 ml do
seu sangue para obtenção do soro e de células.
Em qualquer momento da pesquisa você poderá desistir de participar sem nenhum
prejuízo no tratamento e acompanhamento de seu parente com tuberculose ou seu, caso
você venha a contrair a doença. As amostras de sangue serão processadas para
determinação dos níveis de IgM e IgG responsivas aos antígenos do causador da
tuberculose. Um banco de soros e células dos pacientes com tuberculose e dos seus
84
contatos será formado para utilizar em estudos posteriores que auxiliem no diagnóstico
da tuberculose.
Embora não exista nenhum risco em potencial durante a coleta de sangue, algumas vezes
podem ocorrer vermelhidão e dor no local da coleta. Algumas pessoas podem desmaiar
durante a coleta. Se isto acontecer interromperemos a sua participação imediatamente.
Os dados obtidos, assim como seu estado de saúde e resultados de seus testes serão
mantidos confidenciais pela pesquisadora responsável. Em momento algum sua
informação pessoal se tornará pública. Os resultados deste estudo serão publicados em
uma revista científica internacional.
Este estudo tem duração prevista de Março de 2008 a Março de 2011. Embora seja
improvável que esta pesquisa lhe cause algum dano, você terá direito de pleitear
indenização junto à Instituição Financiadora - Fapeg.
Consentimento da participação
Eu,_____________________________________________________________________
_, RG/CPF/______________________, abaixo assinado, concordo em participar do
estudo Padronização de um teste de ELISA para triagem de indivíduos com alto risco de
adoecimento para tuberculose atendidos na rede pública e privada de saúde de Goiás, sob
a responsabilidade da Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis, como sujeito voluntário. Fui
devidamente
informado
e
esclarecido
pesquisador:_______________________________________sobre
a
pelo
pesquisa,
os
procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes
da minha participação. Foi me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer
momento, sem que isto leve a qualquer penalidade ou interrupção do acompanhamento
do meu parente.
Local e Data: _____________________________________________________
Nome do participante (letra de forma):__________________________________
Assinatura _____________________________________________
Asssinatura Dactiloscópica:
Testemunhas com RG.
1.Nome/assinatura: __________________________________
2. Nome/assinatura: _______________________________
Carimbo e assinatura do pesquisador:
85
4.3. Anexo 3-Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - CONTATOS
Título do projeto: Padronização de um teste de ELISA para triagem de indivíduos com
alto risco de adoecimento para tuberculose, atendidos na rede pública e privada de saúde
de Goiás.
Pesquisador responsável: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis, Imunologista.
Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas – IPTSP/UFG - sala 325.
Telefone para contato: (62) 3209-6126.
Este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido contém informações sobre a pesquisa
indicada acima. Para assegurar que você esteja informado sobre a sua participação nesta
pesquisa, pedimos que leia (ou peça que alguém leia) este Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido. Você também deverá assinar o termo (ou fazer sua marca perante uma
testemunha). Você receberá uma cópia deste termo.
Você esta sendo convidado (a) a participar, como voluntário (a), em uma pesquisa que
será conduzida na Universidade Federal de Goiás (Goiânia-Goiás). Após ser esclarecido
(a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final
deste documento, que está em duas vias. Uma delas é a sua e a outra é do pesquisador
responsável. Em caso de recusa você não será penalizado de forma alguma. Em caso de
dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Goiás, nos telefones: 3269 83 38- 3269 8426.
Esta pesquisa tentará padronizar um teste para identificar os indivíduos com risco de
adoecimento entre os contatos de casos de tuberculose. O resultado desse projeto
contribuirá para melhoria do diagnóstico precoce da tuberculose favorecendo o controle
da doença.
O pesquisador gastará cerca de vinte minutos com você para explicar-lhe o motivo da
pesquisa, anotar algumas informações sobre o seu estado de saúde atual e pedir o seu
consentimento para participar neste projeto. Neste período, um questionário será
preenchido para facilitar a análise dos resultados futuramente. Serão coletados 20 ml do
seu sangue para obtenção do soro e de células. Um teste intradérmico (injeção na pele)
para o diagnóstico da tuberculose será realizado. Este teste chama-se PT e é
regulamentado pelo Ministério da Saúde para auxiliar no diagnóstico da tuberculose. Para
saber se você é positivo ou negativo, após 72 horas será medida a reação na sua pele com
uma régua especial no Laboratório onde foi realizado o exame.
86
Caso você seja positivo, será encaminhado ao médico do setor para o tratamento
profilático (tratamento para evitar o adoecimento por tuberculose).
Caso você seja negativo, você será acompanhado diretamente pelos pesquisadores
durante dois anos para avaliar se você apresenta risco ou não de desenvolver tuberculose.
Para este acompanhamento, você deverá comparecer ao Laboratório de Imunopatologia
das Doenças Infecciosas na Universidade Federal de Goiás ou ao posto de saúde onde foi
realizado o diagnóstico da tuberculose: quatro semanas, doze semanas, seis meses, um
ano e aos dois anos após o diagnóstico da tuberculose do seu parente. Estas visitas
permitirão o seu acompanhamento para o desenvolvimento de qualquer sinal (tosse,
febre, etc) que possa indicar que você está infectado com a tuberculose. Serão fornecidos
os vales transportes (SIT PASS) para cada visita. Caso você não possa comparecer,
telefonar no número do responsável pela pesquisa, que os pesquisadores irão até a sua
casa.
Em qualquer momento da pesquisa você poderá desistir de participar sem nenhum
prejuízo no tratamento e acompanhamento de seu parente com tuberculose ou seu, caso
você venha a contrair a doença.
Nestas visitas serão realizados coletas de sangue e o teste intradérmico. Estas amostras
serão processadas para determinação dos níveis de IgM e IgG responsivas aos antígenos
do causador da tuberculose. Um banco de soros e células dos pacientes com tuberculose e
dos seus contatos será formado para utilizar em estudos posteriores que auxiliem no
diagnóstico da tuberculose.
Embora não exista nenhum risco em potencial durante a coleta de sangue, algumas vezes
podem ocorrer vermelhidão e dor no local da coleta. Algumas pessoas podem desmaiar
durante a coleta. Se isto acontecer interromperemos a sua participação imediatamente. O
teste intradérmico gera vermelhidão e coceira nas pessoas positivas. Isto não gera
nenhum prejuízo para você e passará com 24 horas.
Os dados obtidos, assim como seu estado de saúde e resultados de seus testes serão
mantidos confidenciais pela pesquisadora responsável. Em momento algum sua
informação pessoal se tornará pública. Os resultados deste estudo serão publicados em
uma revista científica internacional.
Ao participar desta pesquisa o senhor (a) terá como benefício direto o seu
acompanhamento durante dois anos para identificar possíveis riscos para o
desenvolvimento da tuberculose. Não haverá nenhum tipo de pagamento ou gratificação
financeira pela sua participação.
87
Este estudo tem duração prevista de Março de 2008 a Março de 2011. Embora seja
improvável que esta pesquisa lhe cause algum dano, você terá direito de pleitear
indenização junto à Instituição Financiadora - Fapeg.
Consentimento da participação
Eu,________________________________________________________________,
RG/CPF/______________________, abaixo assinado, aceito participar do estudo
‗Padronização de um teste de ELISA para triagem de indivíduos com alto risco de
adoecimento para tuberculose atendidos na rede pública e privada de saúde de Goiás‘,
sob a responsabilidade da Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis, como sujeito voluntário. Fui
devidamente
informado
e
esclarecido
pelo
pesquisador_______________________________________ sobre a pesquisa, os
procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes
da minha participação. Foi me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer
momento, sem que isto leve a qualquer penalidade ou interrupção de meu
acompanhamento e de meu parente.
Local e Data: _____________________________________________________
Nome do participante (letra de forma): __________________________________
Assinatura _____________________________________________
Asssinatura Dactiloscópica:
Testemunhas com RG.
1.Nome/assinatura: __________________________________
2. Nome/assinatura: _________________________________
Carimbo e assinatura do pesquisador:
88
4.4. Anexo 4- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa-UFGO
89
90
4.5. Anexo 5- Parecer do SUS e Ciência e Tecnologia do Estado de Goiás
91
4.6. Anexo 5- Termo de Consentimento dos Voluntários
4.6.1. Controles Saudáveis
92
4.6.2. Pacientes com Tuberculose
93
4.7. Anexo 6- Questionários
4.7.1. Controles saudáveis
Questionário do Projeto: Caracterização dos antígenos protéicos naturais e
recombinantes do Mycobacterium tuberculosis induzidos em condições de stress.
Dados:
Nome:
Data admissão: / /
Número na pesquisa: /
Data nascimento:
Idade: anos
Endereço:
Fone:
Cor pele:
Sexo: F[]
M[]
Profissão:
Anamnese:
Teve contato com TB ativa?
Sim []
Não []
Teve contato com hanseníase?
Sim []
Não []
BCG: Sim [] Não [] número de doses: []
Data da última dose:
Não sabe []
Não sabe []
PPD: Sim [] Não [] Resultado [] mm
Uso de medicamentos: Sim []
Data início:
Não []
Qual?
Complicações:
Doenças:
Prévia: sim []
Crônica: sim []
não [] Qual?
não [] Qual?
Doença pulmonar? Sim [] não
Alergia? sim [X] não []
Nos últimos dias teve:
Febre? sim []
não []
Dores musculares? Sim []
não[]
Está gripado ou resfriado?
sim []
Fumante? sim []
Etilista? sim []
não []
não []
não []
94
4.7.2- Pacientes
Anexo 5- Prontuário Pacientes nº:
Questionário do Projeto: Caracterização dos antígenos protéicos naturais e
recombinantes do Mycobacterium tuberculosis induzidos em condições de stress.
Nome:
Data admissão:
Número na pesquisa:
Data nascimento:
Idade: [] anos
Endereço:
Fone:
Cor pele:
Sexo: F[]
M[]
Profissão:
Hipótese diagnóstico:
_______________________________________________________________________
Exames:
Escarro: AAFB
+ []
– []
Biopsia:
Resultado: pos. [] neg .[]
Tecido:
Cultura:
Resultado: pos. [] neg .[]
Meio:
HIV:
Resultado: pos. [] neg .[]
PPD: [] mm
Outros:
Mycobacterium
_______________________________________________________________________
Sim []
Não []
Não sabe []
Teve contato com TB ativa?
Teve contato com hanseníase?
Sim []
Não []
Não sabe []
BCG: Sim [] Não [] número de doses: []
Data da última dose:
_______________________________________________________________________
TB ativa no momento? Sim [] Não [] Não sabe [] Data do início:
É tuberculose primária? Sim [] Não [] Não sabe []
Lesão Cavitária: []
Área afetada:
Não cavitária: []
Pleural: [] Outra:
_______________________________________________________________________
Com que idade? [] anos
História prévia de TB
Foi uma tuberculose primária?
Sim []
Não []
Não sabe []
Existe evidência de lesões?
Sim []
Não []
Não sabe []
_______________________________________________________________________
Data de início:
Tratamento anti TB
INH: Sim []
Não []
Não sabe []
ETH: Sim []
Não []
Não sabe []
RIF: Sim []
Não []
Não sabe []
PYZ: Sim []
Não []
Não sabe []
STP: Sim []
Não []
Não sabe []
_______________________________________________________________________
__Resultado da quimioterapia
Ainda no tratamento?
Curado []
Voltou []
Morte []
Uso de corticóide? Sim [] Não []
Qual?
Data início:
Complicações:
Doenças:
Concomitante: Sim []
Não 
Qual?
Prévia:
Sim []
Não 
Qual?
Crônica:
Sim []
Não 
Qual?
95
96