anais da xx semana científica “benjamin eurico malucelli”

ANAIS DA XX SEMANA CIENTÍFICA
“BENJAMIN EURICO MALUCELLI”
2011
COMISSÃO ORGANIZADORA
Presidente
Coffee Break e eventos comemorativos
Prof. Dr. Bruno Cogliati
Mariana Sayuri Berto Udo (coordenadora)
Thaisa Sandini
Financeiro
Carolina Costola
Wanderley Quinteiro Filho (coordenador)
Viviane Ferraz de Paula.
Prof. Dr. Bruno Cogliati
Profa. Dra. Cristina Massoco
Recepção do evento
Poliana Ferreira
Divulgação
Viviane Ferraz-de-Paula
Viviane Ferraz-de-Paula (coordenadora)
Wanderley Moreno Quinteiro Filho
Sistema Informática
Luciana Allegretti
Adriana Tiemi Akamini
Thalita Michelucci
Brindes, Homenagens e Afins
Mini-Cursos (coordenadores)
Carolina Costola
Prof. Dr. Bruno Cogliati
Thalita Mallucelli
Imunohistoquímica e Patologia Molecular
Pedro Henrique de Oliveira Viadanna
Equipe de Apoio
Enfermidades de Animais Silvestres
Gabriele Bin
Adriana Siqueira
Izabel Mattos
Medicina Veterinária Forense
Katia Groch
Fernado Pipole
Patrocínios
Tatiane Marisis
Prof. Dr. Bruno Cogliati (coordenador)
Thiago Kirsten
Milena Pinheiro
Beatriz Dorr
Wanderley Moreno Quinteiro Filho
Comissão Cientifica
Milena Pinheiro (coordenadora)
Maria Eugenia Moraes
PROGRAMAÇÃO CIENTÍFICA
12 de Outubro de 2011
MINI-CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA FORENSE
MANHÃ
9:00 - 9:50 – Traumatologia Veterinária
MV MSc Caio Rodrigues dos Santos
Doutorando do Programa de Patologia Experimental e Comparada
Departamento de Patologia – FMVZ/USP
9:50 – 10:50 – Principais Causas de Óbito em Pet Shops e Similares
MV MSc Anna Carolina Barbosa Esteves Maria
Doutoranda do Programa de Patologia Experimental e Comparada
Departamento de Patologia – FMVZ/USP
10:50 – 11:20 – COFFEE BREAK
11:20 – 12:30 – PALESTRA A DEFINIR
12:30 – 14:00 – ALMOÇO
TARDE
14:00 – 15:15 – Exame de Corpo de Delito em Cenas de Crime – Parte 1
MV Alberto S. Yoshida
Perito Criminal - Polícia Científica de São Paulo
Mestrando do Programa de Patologia Experimental e Comparada
Departamento de Patologia – FMVZ/USP
15:15 – 15:45 – COFFEE BREAK
15:45 – 17:00 – Exame de Corpo de Delito em Cenas de Crime – Parte 2
MV Alberto S. Yoshida
Perito Criminal - Polícia Científica de São Paulo
Mestrando do Programa de Patologia Experimental e Comparada
Departamento de Patologia – FMVZ/USP
13 de Outubro de 2011
MINI-CURSO DE IMUNOHISTOQUÍMICA E PATOLOGIA MOLECULAR
MÓDULO I – IMUNOHISTOQUÍMICA (MANHÃ)
8:30 - 9:00 – Procedimentos de coleta e fixação de materiais biológicos para técnicas histológicas,
imunológicas e moleculares
Dr. Thiago Pinheiro Arrais Aloia
Laboratório de Neuroimunomodulação
Departamento de Patologia - FMVZ - USP
9:00 - 10:00 – Fundamentos básicos de imunohistoquímica, padronização de reações e controle da
qualidade laboratorial
Dra. Suely Nonogaki
Laboratório de Imunohistoquímica
Instituto Adolf Lutz
10:00 - 10:15 – Palestra satélite
10:15 - 10:30 – COFFEE BREAK
10:30 - 11:30 – Aplicação de painéis imunohistoquímicos no diagnóstico de neoplasias
Dra. Sheila Siqueira
Setor de Anatomia Patológica
Hospital das Clínicas - FMUSP
11:30 - 12:00 – Análise de imagens e quantificação dos resultados imunohistoquímicos
Dra. Tereza Cristina de Silva
Laboratório de Anatomia Microscópica e Imunohistoquímica
Departamento de Cirurgia - FMVZ - USP
12:00 - 12:15 – Palestra satélite (GE Healthcare)
12:15 - 14:00 – ALMOÇO
MÓDULO II – PATOLOGIA MOLECULAR (TARDE)
14:00 - 14:30 – Construção de microarranjos teciduais (TMAs) e aplicação na imunohistoquímica e
patologia molelcular
Esp. Cinthya dos Santos Cirqueira
Laboratório de Investigação em Patologia Hepática (LIM 14)
Departamento de Patologia - FMUSP
14:30 - 15:00 – Hibridização in situ por fluorescência (FISH) em tecido parafinado
Esp. Cinthya dos Santos Cirqueira
Laboratório de Investigação em Patologia Hepática (LIM 14)
Departamento de Patologia - FMUSP
15:00 - 15:30 – Extração de material genético (DNA/RNA) de tecidos parafinados ou congelados
MSc. Lucas Martins Chaible
Departamento de Patologia
Laboratório de Oncologia Experimental - FMVZ - USP
15:30 - 15:45 – Palestra satélite
15:45 - 16:00 – COFFEE BREAK
16:00 - 16:30 – Ferramentas moleculares no estudo de doenças genéticas
Dra. Ana Paula Bastos
Laboratório de Nefrologia Celular, Genética e Molecular
Departamento de Clínica Médica - FMUSP
16:30 - 17:00 – Expressão gênica global utilizando microarranjos de DNA
MSc. Maria Fernanda Bandeira de Melo Galletti
Laboratório de Bioquímica e Imunologia de Artrópodes
Departamento de Parasitologia - ICB - USP
17:00 - 17:30 – Fundamentos da análise proteômica e espectrometria de massas
Profª. Dra. Andréa Cristina Fogaça
Laboratório de Bioquímica e Imunologia de Artrópodes
Departamento de Parasitologia - ICB - USP
17:30 - 17:45 – Palestra satélite (INOPAT)
13 de Outubro de 2011
MINI-CURSO DE ENFERMIDADES EM ANIMAIS SILVESTRES
13 de Outubro de 2011
8:30 - 9:00 – Introdução ao mini-curso de enfermidades infecciosas de animais silvestres
MV Pedro Henrique de Oliveira Viadanna
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ - USP
9:00 - 9:40 – Enfermidades infecciosas em mamíferos terrestres I
MV Ms Elmer Alexander Genoy Puerto
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ - USP
9:40 - 10:15 – Enfermidades infecciosas em mamíferos terrestres II
MV Marina Galvão Bueno
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ - USP
10:15 - 10:30 – COFFEE BREAK
10:30 - 11:30 – Enfermidades infecciosas em anfíbios
MV Dra. Cátia Dejuste de Paula
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ – USP
11:30 - 12:30 – Enfermidades infecciosas em aves marinhas, modulo I
MV Claudia Niemeyer
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ - USP
12:30 - 14:00 – ALMOÇO
13:45 - 14:45 – Enfermidades infecciosas em aves marinhas, modulo II
MV Ralph Eric Thijl Del Val Oñoro Vanstreels
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ – USP
14:45 - 15:45 – Enfermidades infecciosas em reptéis
MV Gustavo Bauer
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ – USP
15:45 - 16:00 – COFFEE BREAK
16:00 - 17:00 – Enfermidades infecciosas em cetáceos e pinípedes
MV Omar Antonio Gonzales Viera
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ - USP
17:00 - 18:00 – Enfermidades infecciosas em peixes
MV Pedro Henrique de Oliveira Viadanna
LAPCOM - Departamento de Patologia - FMVZ – USP
13 de Outubro de 2011
APRESENTAÇÕES DE PÔSTERES
17:30 – 20:00 – Apresentação de Pôsteres* e Coquetel (eventos simultâneos)
FIXAÇÃO DOS POSTERS DEVERÁ OCORRER NO DIA 13/10/2011 das 8:30 às 12:00.
*Ocorrerá Avaliação dos Pôsteres com Menção Honrosa para os melhores trabalhos
14 de Outubro de 2011
XV PREMIO JOVEM CIENTISTA PROF. DR. MARIO MARIANO
I PRÊMIO DE FOTOGRAFIA CIENTÍFICA PROF. DR. IDÉRCIO LUIZ SINHORINI
99:00 – 12:00 – Apresentações Orais
Iniciação Cientifica – Ciências Biomédicas
Mestrado – Ciências Biomédicas
Doutorado – Ciências Biomédicas
12:00 – 14:00 – Almoço
14:00 – 16:00 – Apresentações Orais
Iniciação Cientifica – Medicina Veterinária
Mestrado – Medicina Veterinária
Doutorado – Medicina Veterinária
17:00 – 18:00 – Premiações e Homenagens
18:00 - Confraternização
APRESENTAÇÕES EM PÔSTER
AVALIAÇÃO DOS POSSÍVEIS EFEITOS TÓXICOS DA Uncaria tomentosa EM RATOS:
ESTUDOS PRELIMINARES
Mendes, P. F.1; Górniak, S. L.1, Caniceiro, B. D.1, Hueza, I. M.2
1Laboratório
de Farmacologia e Toxicologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo,
FMVZ-USP, SP
2Instituto
de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - Campus
Diadema, SP
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Atribui-se, historicamente, a Uncaria tomentosa, planta nativa das
Américas, conhecida como “Unha-de-gato”, várias propriedades terapêuticas, como antiinflamatória,
anticancerígena, antioxidante e imunoestimulante. Apesar de vários estudos revelarem o potencial
fitoterápico da Uncaria tomentosa, poucos são os trabalhos que empregam protocolos estabelecidos por
agências regulamentadoras internacionais para avaliar seus possíveis efeitos tóxicos. O presente estudo
tem como objetivos avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração sub-crônica (28 dias) do
extrato seco de Uncaria tomentosa, comercialmente disponível no mercado, sobre o sistema imune de
ratos. MÉTODOS: Foram utilizados 40 ratos machos (Wistar), divididos em 4 grupos iguais sendo 1
grupo controle e 3 experimentais, os quais foram tratados com extrato seco da planta durante 28 dias,
por gavage, nas doses de 0, 15, 75, 150 mg/kg de peso vivo de Uncaria tomentosa. Os animais foram
avaliados, a cada 3 dias, quanto ao ganho de peso e consumo de ração para o ajuste da dose. Ao final
do experimento, os ratos foram pesados e anestesiados com Xilazina e Cetamina (5,0 e 50 mg/kg,
respectivamente por via I.M.) para coleta de amostras sanguíneas para determinação do hemograma
completo. Após o aprofundamento anestésico e a eutanásia dos animais, foram coletados o timo e o
baço, para determinação do peso relativo e celularidade de cada órgão e da medula óssea. Amostras
teciduais de fígado, rins, placas de Peyer, linfonodos mesentéricos, timo e baço, também foram
coletadas para realização de estudo anatomopatológico e morfometria do timo, baço e linfonodos.
RESULTADOS: Apesar da ausência de diferenças estatísticas quanto ao consumo de ração avaliado
entre os grupos de animais, verificou-se uma redução estatisticamente significante no ganho de peso
dos animais tratados com as doses de 15 e 150 mg/kg da planta. Quanto à avaliação hematológica e os
parâmetros relacionados aos órgãos linfóides, a análise estatística empregada não detectou nenhuma
diferença estatisticamente significante entre os grupos de animais estudados. CONCLUSÃO: Este
estudo preliminar não foi capaz de demonstrar nenhum efeito tóxico da Uncaria tomentosa nos
parâmetros avaliados. Entretanto, é importante ressaltar que outros protocolos necessitam ser aplicados
para melhor avaliar a segurança desta planta para a população.
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO PARA LEISHMANIOSE CANINA: UMA COMPARAÇÃO
ENTRE O TESTE RÁPIDO DPP-BIO-MANGUINHOS, ELISA-BIO-MANGUINHOS E
ELISA IN HOUSE
1
Tomokane TY, 1Carvalho AK, 1Aschar, M, 1Rosa MF, 1Matta VLR,
1
Corbett CEP, 1Laurenti MD
1Laboratório
de Patologia de Moléstias Infecciosas - LIM50, Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (SP), Brasil
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: O teste diagnóstico para leishmaniose canina (Lcan) recomendado
pelo Ministério da Saúde é o ELISA-Bio-Manguinhos (ELISA-Bio), entretanto a eficácia do método
vem sendo questionada, devido à sua baixa especificidade, por essa razão é necessário o
desenvolvimento de novas tecnologias. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi comparar o
desempenho dos ensaios sorológicos para diagnóstico da Lcan: ELISA-Bio, teste DPP, que é um teste
imunocromatográfico rápido, recentemente desenvolvido pelo Instituto de Tecnologia em
Imunobiológicos Bio-Manguinhos e ELISA-in house, padronizado em nosso laboratório utilizando
como antígeno, lisado de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi.
MÉTODOS: Foram utilizados soros de cães com infecção comprovada (n=66), confirmada por
imunohistoquímica, e controles negativos, constituído por animais saudáveis de área não endêmica
(n=18) e também animais com o parasitismo negativo de área endêmica (n=44). Para detectar reação
cruzada, soros de animais com outras infecções foram utilizados, como erliquiose (n=17),
toxoplasmose (n=9), neosporose (n=6), co-infecção de neosporose e toxoplasmose (n=4), doença de
Chagas (n=6), babesiose (n=9), toxocaríase (n=9) e dirofilariose (n=3).
Para comparar o desempenho dos testes sorológicos, a sensibilidade e especificidade foram
determinadas. Além disso, o teste kappa foi aplicado para verificar o nível de concordância entre eles.
RESULTADOS: Considerando a imuno-histoquímica como padrão-ouro para comprovação da
infecção, verificou-se a sensibilidade de 96,97% no ELISA-in house e de 93,94% no teste DPP e ELISABio. A especificidade no ELISA-in house foi de 88,00%, no teste DPP, foi 86,40% e no ELISA-Bio
68,80%. Em relação à reatividade cruzada com outras infecções, foi observado que o ELISA-Bio
apresenta resultados falso-positivos em 20% dos casos. Excelente concordância foi encontrada entre o
ELISA-in house e o teste DPP, e boa entre o ELISA-in house e ELISA-Bio e entre ELISA-Bio e DPP.
CONCLUSÕES: Os resultados indicam que o teste DPP e o ELISA-in house apresentaram melhor
desempenho para o correto diagnóstico de leishmaniose canina. Apesar da alta sensibilidade do ELISA-
Bio, a especificidade pode não ser suficiente para sozinho, diagnosticar a leishmaniose canina.
SUPORTE FINANCEIRO: LIM-50/HCFMUSP.
INTERAÇÕES MEDICAMENTOSAS: AVALIAÇÃO DOS RISCOS EM UM GRUPO DE
IDOSOS VESTIBULOPATAS
Fontes, A.M.1; Zurlo, H.F.1; Dourado, I.C.R.1; Lima, J.L.1;
Prezotto, A.O.2; Paulino, C.A.3
1Alunos
de Iniciação Científica; 2Biomédica; 3Professora Orientadora
Instituto de Saúde - Graduação e Pós-Graduação - UNIBAN Brasil - São Paulo
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Com o envelhecimento crescem as doenças crônicas, o uso de
fármacos e a possibilidade de interações medicamentosas. São muitas as doenças associadas que
acometem idosos, entre elas, as vestibulopatias, decorrentes de alterações nos sistemas nervoso central,
vestibular, sensorial e neuro-musculoesquelético, que comprometem o equilíbrio corporal. O objetivo
deste estudo foi investigar as possíveis interações medicamentosas em homens idosos com queixas
vestibulares. MÉTODOS: Estudo retrospectivo, descritivo e analítico, com abordagem quantitativa e
qualitativa, a partir de 35 prontuários de homens, idosos, idade entre 60 a 85 anos, atendidos em
Laboratório de Pesquisa em Reabilitação do Equilíbrio Corporal e Inclusão Social, em São Paulo, entre
2009 e 2010. A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética em Pesquisa (Protocolo nº 1054/2010) e
os idosos assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Os medicamentos referidos
foram classificados por grupos farmacológicos, por meio do DEF (2008/2009), e as interações
medicamentosas foram analisadas por meio do Software The Medical Letter Drug Interations Program (The
Medical Letter - USA®). RESULTADOS: As principais queixas vestibulares relatadas foram: tontura,
zumbido e perda auditiva. Observou-se que a maioria dos idosos usava medicamentos (83%), sendo
80% (2009) e 87% (2010). Dos grupos farmacológicos referidos, os 3 mais prevalentes foram: Antihipertensivos (85%), Diuréticos (30%) e Antiulcerosos e Analgésicos (25%) em 2009, e Antihipertensivos (54%), Antivertiginosos (38%) e Diuréticos (31%) em 2010. Em 2009, 4 idosos não
usavam fármaco e 1 deles só usava 1; em 2010, 2 não usavam e 4 só usavam 1 fármaco. Ocorreram
interações medicamentosas em 10 idosos (67%) em 2009, e em 8 idosos (89%) em 2010. Na análise
qualitativa das interações, foram apontados vários tipos de efeitos, sobretudo: toxicidade resultante das
interações; redução de efeitos terapêuticos de algum dos princípios ativos envolvidos; efeitos relativos à
pressão arterial (hipo ou hipertensão); efeitos sobre a glicemia (hipo e hiperglicemia), além de
hiponatremia e lesão no trato gastrintestinal. CONCLUSÕES: A polifarmacoterapia nesses idosos
pode ser inapropriada, pelo maior risco de reações adversas, ou pela redução dos efeitos terapêuticos de
alguns medicamentos, o que pode complicar as disfunções vestibulares e a saúde em geral. APOIO:
UNIBAN/CNPq.
EQUILÍBRIO CORPORAL EM IDOSOS: AVALIAÇÃO DAS QUEIXAS E DO USO DE
MEDICAMENTOS
Lima, J.L.1; Dourado, I.C.R.1; Zurlo, H.F.1; Fontes, A.M.1;
Prezotto, A.O.2; Paulino, C.A.3
1Alunos
de Iniciação Científica; 2Biomédica; 3Professora Orientadora
Instituto de Saúde - Graduação e Pós-Graduação - UNIBAN Brasil - São Paulo
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: O equilíbrio corporal é necessário para a orientação espacial do
indivíduo no ambiente, a fim de manter sua postura normal. As disfunções do equilíbrio corporal
(disfunções vestibulares) são particularmente importantes na população idosa e, pela associação com
outras doenças, levam a um maior consumo de medicamentos. Assim, esse estudo levantou as
principais queixas vestibulares e os medicamentos referidos por idosos da comunidade. MÉTODOS:
Estudo retrospectivo, descritivo e analítico, a partir do levantamento de prontuários de idosos
atendidos no Laboratório de Pesquisa em Reabilitação do Equilíbrio Corporal e Inclusão Social de uma
Universidade Particular de São Paulo, após aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa (Protocolo nº
1054/2010). Participaram do estudo 104 idosos (N=104) de ambos os gêneros, atendidos no ano de
2010, da faixa etária entre 60 a 92 anos, e que concordaram em assinar um Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido. Foram levantadas as 3 principais queixas vestibulares, a quantidade de
medicamentos e os grupos farmacológicos classificados por meio do DEF (2008/2009).
RESULTADOS: Dos 104 idosos estudados, 89 eram mulheres (85%) e 15 eram homens (14%). Do
total de idosos, 92 (88%) apresentavam queixas de tonturas, sendo 81 mulheres (91%) e 11 homens
(73%). Do total de mulheres 71% relataram zumbido e 57% perda auditiva. Dos homens, 47%
relataram zumbido e 80% perda auditiva. A farmacoterapia foi relatada por 95 idosos (91%), dos quais,
82 mulheres (86%) e 13 homens (14%); fazem uso de medicamentos 92% do total de mulheres e 86%
do total de homens. Entre as mulheres o consumo maior foi de 2 fármacos (18%) na faixa de 60 a 65
(7%); nos homens, houve maior consumo de 1 medicamento (31%) nas faixas de 60 a 65 e 71 a 75 anos
(15%). O grupo dos anti-hipertensivos foi o mais prevalente entre mulheres (57%) e homens (54%).
CONCLUSÕES: As mulheres foram maioria, pois procuram mais atendimento, talvez pelas queixas
ou maior preocupação com a saúde; houve maior prevalência de zumbido nas mulheres e perda
auditiva nos homens; o consumo de medicamentos é alto nesses idosos, requerendo maior cuidado
com as reações adversas. APOIO: UNIBAN/CNPq.
AÇÃO DE INIBIDORES DE FOSFOLIPASE A2 CITOSÓLICA, SECRETÓRIA E CÁLCIO
INDEPENDENTE CONTRA FORMAS PROMASTIGOTAS E AMASTIGOTAS DE
Leishmania (Leishmania) amazonensis
Maria Luiza A.C.Bordon¹, Luiz Felipe D. Passero¹, Márcia D. Laurenti¹,
Carlos Eduardo P. Corbett ¹, Marcos Hikari Toyama²
¹Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.
²Universidade Estadual Paulista, Campus Experimental do Litoral Paulista,
São Paulo, Brasil.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Visto a importância da enzima fosfolipase A2 (PLA2) na
progressão da leishmaniose tegumentar, o objetivo deste trabalho foi analisar a ação de inibidores de
PLA2 citosólica (MAFP), cálcio independente (HELSS) e secretória (Ácido Aristolóquio) contra formas
promastigotas e amastigotas intracelulares. MÉTODOS: Atividade antipromastigostas: Formas
promastigotas (2x108 parasito/mL) foram incubadas com inibidores em diferentes concentrações.
Inibição da entrada de promastigotas em macrófagos peritoneais: Formas promastigostas foram
incubadas com inibidores em concentrações atóxicas. Após 24h, foram utilizadas para infectar
macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c. Atividade terapêutica dos inibidores de PLA2:
Macrófagos foram infectados (5 promastigotas/macrófago) e, posteriormente, tratados com inibidores
em concentrações não tóxicas as células hospedeiras. Inibição da PLA2 dos macrófagos: Macrófagos
peritoneais foram incubados com inibidores em concentrações não tóxicas. Após 24h, infectados (5
promastigotas/macrófago). A análise deu-se através do índice de infecção (II). RESULTADOS:
Atividade anti-promastigotas: MAFP, HELSS e Ácido Aristolóquio inibiram 50% o crescimento das
formas promastigotas (IC50) nas concentrações 50,5 µM, 15,09 µM e 94,08 µM, e a Anfotericina B, 49
µM. Inibição da entrada de formas promastigotas em macrófagos peritoneais: formas
promastigotas tratadas com 4,8 e 9,6 µM de MAFP induziram II em macrófagos peritoneais de 334,62 e
318,17. Com HELSS, observou-se IIs 47,37, 131,25 e 35,95 com 0,93, 1,87 e 3.85 µM do inibidor,
respectivamente, e com 9,76, 19,5 e 39,06 µM de Ácido Aristolóquio encontrou-se IIs 0, 13,88 e 16,53.
Os controles apresentaram II de 568,28. Atividade terapêutica in vitro: macrófagos infectados
tratados com 2,4 e 4,8 µM de MAFP apresentaram II de 308,35 e 321,65, respectivamente, enquanto
com 0,93 e 3,75 µM de HELSS, apresentaram II de 231,85 e 269,02, respectivamente; com 19,5 e 39,06
µM Ácido Aristolóquio os IIs obtidos foram 271,99 e 302,39. Macrófagos não tratados apresentaram II
de 422,34. Inibição da PLA2 de macrófagos: macrófagos tratados com 0,93, 1,87 e 3,75 µM de
HELSS apresentaram II de 201,33, 221,55 e 246,07 quando comparados ao controle infectado (II=
424,27). MAFP e Ácido Aristolóquio, não alteraram o II significativamente. CONCLUSÃO: A
utilização dos inibidores MAFP, HELSS e Ácido Aristolóquio, sugeriram que a inibição da PLA2 pode
ser uma via importante para o desenvolvimento de tratamentos contra a leishmaniose.
ESTUDOS EM CAMUNDONGOS PARA VERIFICAR SE A SUPLEMENTAÇÃO COM
SELÊNIO PREVINE O AUMENTO DA SUSCETIBILIDADE AO DESENVOLVIMENTO
DE CÂNCER INDUZIDA PELA PTERIDIUM AQUILINUM
Nakahara, S. B. R.; Caniceiro B. D; Wyshocki Jr., H. L.; Latorre A. O.
Departamento de Patologia, FMVZ-USP
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: A Pteridium aquilinum (Pa) ou samambaia do campo,como é
conhecida popularmente, é uma planta tóxica de distribuição cosmopolita, sendo conhecida por causar
intoxicação em rebanhos em diversas partes do mundo e câncer em animais e seres humanos que se
alimentam da planta ou do leite de animais que a ingeriram [1]. Além disto, estudos realizados pelo
nosso grupo demonstraram que a Pa também tem efeito imunossupressor sobre as células NK, o qual
foi revertido pela suplementação com selênio [3,4]. Ainda, foi possível demonstrar que a diminuição da
citotoxicidade das células NK em camundongos favoreceu o desenvolvimento de lesões préneoplásicas induzidas por uretano [2]. Assim, o objetivo deste estudo é verificar se a suplementação
com selênio previne esta maior suscetibilidade ao desenvolvimento de câncer observada em
camundongos tratados com a planta e com o carcinógeno uretano. MATERIAIS E MÉTODOS:
Estão sendo tratados 125 camundongos C57BL/6 fêmeas separados em 5 grupos iguais. Inicialmente
são 14 dias de tratamento diário, por gavage, com extrato aquoso dos brotos da Pa [30g/kg/dia] (Pt,
PtSeUr e PtUr) ou água (Co e Ur) e, em seguida, 5 dias/semana por 10 semanas. Nestas 10 semanas
faz-se a indução das lesões pulmonares pela aplicação ip. de uretano [1mg/g] semanalmente (PtSeUr,
PtUr e Ur) e PBS (Co e Pt). A suplementação com selênio é feita no grupo PtSeUr [1,3mg/kg]. O
ajuste das doses é a cada 3 dias após a pesagem dos animais e os consumos de água e ração são
verificados semanalmente. Todos os camundongos são suplementados com tiamina [10 mg/L] na água.
Após a 12º semana, os camundongos permanecerão 26 semanas sem tratamento para surgimento das
lesões pulmonares. Após a eutanásia, serão analisados todos os órgãos e a fenotipagem de linfócitos no
sangue. Para avaliação da imunidade, será analisada citotoxicidade das células NK e dos linfócitos T
CD8+ em camundongos tratados por 30 dias com a planta e/ou selênio. PERSPECTIVAS
FUTURAS: Ao final do experimento é esperado maior número e gravidade das lesões nos
camundongos tratados com a planta+carcinógeno comparado àqueles tratados com o carcinógeno e
que este efeito tenha sido evitado naqueles tratados com a planta+carcinógeno+selênio.
REFERÊNCIAS
[1] ALONSO-AMELOT, M. E.; AVENDANO, M. Human carcinogenesis and bracken fern: A review of the evidence.
Current Medicinal Chemistry, v. 9, n. 6, p. 675-686, 2002.
[2] CANICEIRO, B. D.; LATORRE, A. O.; FUKUMASU, H.; HARAGUCHI, M.; GÓRNIAK, S. L. O papel da
imunotoxicidade causada pela Pteridium aquilinum na carcinogênese pulmonar induzida em camundongos. In: SEMANA
CIENTÍFICA BENJAMIN EURICO MALUCELLI, 18., 2009, São Paulo. Anais... São Paulo: Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo, 2009. p. 18-19.
[3] LATORRE, A. et al. Immunomodulatory effects of Pteridium aquilinum on natural killer cell activity and select aspects
of the cellular immune response of mice. Journal of Immunotoxicology [S.I.], v. 6, n. 2, p. 104-114, 2009 2009.
[4] LATORRE, A. O. et al. Selenium reverses Pteridium aquilinum-induced immunotoxic effects. Food Chem Toxicol
[S.I.], v. 49, n. 2, p. 464-70, Feb 2011.
IMUNODETECÇÃO DE LINFÓCITOS T CD4+/CD8+ E CÉLULAS NK NAS
COLANGITES LINFOCÍTICAS EM FELINOS: ESTUDO RETROSPECTIVO EM
BIOPSIAS HEPÁTICAS
Bastos, C. A.¹; Daniel, A. G. T.²; Reche Júnior, A.3; Alves, V. A. F.4; Cogliati, B.¹
¹Laboratório de Patologia Morfológica e Molecular, Departamento de Patologia,
FMVZ-USP
²Universidade Metodista de São Paulo
³Departamento de Clínica Médica, FMVZ-USP
4Laboratório
de Investigação em Patologia Hepática (LIM 14),
Departamento de Patologia, FMUSP
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A síndrome colangite/colangiohepatite (SCCH) é uma afecção de
casuística extremamente significativa dentre as doenças hepáticas em felinos. Esta síndrome
compreende a inflamação dos ductos biliares e, por conseguinte, do parênquima hepático situado ao
seu redor. A SCCH pode ocorrer em conjunto com a doença intestinal inflamatória e pancreatite, sendo
clinicamente denominada de tríade felina. Histologicamente, as colangites podem ser divididas em
quatro subcategoriasː colangite neutrofílica, colangite linfocítica, colangite esclerosante e colangite
crônica associada à infestação parasitária. Para diferenciá-las na clínica, é estritamente necessária a
realização da biópsia hepática. A etiologia da colangite linfocítica ainda é pouco esclarecida, mas há
fortes indícios de que haja um componente imunomediado envolvido. A imunofenotipagem do
infiltrado inflamatório periportal e ductal demonstrou a presença, predominantemente, de linfócitos T.
O desenvolvimento de muitas doenças auto-imunes sistêmicas parece estar relacionado com o aumento
do número de células T CD4+. Já foi demonstrado um significativo aumento na freqüência e número
absoluto de linfócitos T CD4+ e CD8+ periportais e células NK no fígado de pacientes humanos
portadores doenças colestáticas auto-imunes. No entanto, não existem dados sobre a
imunofenotipagem das subpopulações de linfócitos e seu recrutamento nas colangites felinas. Assim,
este projeto objetiva determinar a participação e quantificar os linfócitos T CD4+ e CD8+, assim como
as células NK, na colangite linfocítica felina. MÉTODOS: Serão utilizadas biopsias hepáticas de 10
felinos diagnosticados com a colangite linfocítica. Nessas amostras, serão investigadas a proliferação e
destruição das células epiteliais biliares pela imunodetecção da citoqueratina 19 (K19), assim como a
imunofenotipagem do infiltrado inflamatório será realizada pela detecção dos marcadores de linfócito
T, B e macrófagos (CD3, Pax5 e Mac387, respectivamente), além da diferenciação dos linfócitos T
(CD4 e CD8) e células NK. A quantificação das células positivas será realizada no programa de análise
de imagens Image ProPlus. RESULTADOS: Ainda não possui por se tratar de projeto.
CONCLUSÃO: Dessa maneira, a melhor compreensão das colangites linfocíticas em felinos permitirá
a instauração de terapias e métodos diagnósticos mais adequados, proporcionando melhor qualidade de
vida e prognóstico aos pacientes.
AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E ULTRAESTRUTURAL DOS ESFERÓIDES
CELULARES EM MODELO 3D DA DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO
ALCOÓLICA IN VITRO
Landi, M. F. A.¹; Silva, T. C.¹; Oliveira, C. P. M. S.²; Dagli, M. L. Z.³;
Hernandez-Blazquez, F. J.4; Cogliati, B.¹
¹Laboratório de Patologia Morfológica e Molecular, Departamento de Patologia,
FMVZ-USP
²Laboratório de Gastroenterologia Clínica e Experimental, Departamento de Gastroenterologia, FMUSP
³Laboratório de Oncologia Experimental, Departamento de Patologia, FMVZ-USP
4Laboratório
de Anatomia Microscópica e Imunohistoquímica, Departamento de Cirurgia, FMVZ-USP
E-mail [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) esta
intimamente relacionada com a obesidade e pode ser definida pelo acúmulo excessivo de lipídeos nos
hepatócitos, podendo evoluir de esteatose para esteatohepatite, fibrose, cirrose e carcinoma
hepatocelular. Atualmente, a esteatohepatite não alcoólica é a terceira maior causa de indicação ao
transplante hepático, sendo necessário, portanto, o desenvolvimento de novas drogas e terapias mais
efetivas. Modelos in vitro podem simular alguns aspectos fisiopatogênicos da DHGNA, reduzindo os
custos e o uso de animais de experimentação nos testes pré-clínicos, assim como acelerando o processo
de desenvolvimento de novas moléculas. No entanto, o modelo tradicional de cultivo celular em
monocamada apresenta algumas limitações fisiológicas, as quais podem ser superadas pelo modelo
tridimensional proposto neste projeto. O cultivo 3D de agregados multicelulares em esferóides tem
como objetivo mimetizar o microambiente encontrado no fígado, permitindo ainda a interação de
células e seus subprodutos em modelos de cocultivo. Este trabalho visa estabelecer e validar um
modelo inédito de cultivo celular 3D da DHGNA. MÉTODOS: O modelo 3D será obtido pelo
cocultivo de linhagens de hepatócitos C3A/HepG2, induzidos à esteatose pela incubação com ácidos
graxos livres não esterificados, com células estreladas LX-2 humanas. O modelo de cocultivo 3D será
obtido pelo cultivo celular em placas que permitem baixa aderência, favorecendo assim, a formação de
esferóides multicelulares. Após o cultivo dos esferóides durante 24, 48 e 72 horas, serão analisadas a
citotoxicidade e a dosagem de triglicérides intracelular. Posteriormente, os esferóides serão processados
histologicamente para análise histoquímica, quantificação da fibrose e dos vacúolos lipídicos. O padrão
morfológico da distribuição celular nos esferóides será avaliado por imunofluorescência e quantificação
das células estreladas ativadas e hepatócitos. Adicionalmente, as características ultraestruturais dos
esferóides celuares serão avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão. Este modelo in vitro
permitirá o rápido avanço nos testes de novas drogas, além de melhor compreender os mecanismos
presentes na transição entre a doença hepática gordurosa e a esteatohepatite, auxiliando no
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
BIOSSEGURIDADE EM GRANJAS COMERCIAIS DE ANSERIFORMES:
COLONIZAÇÃO INTESTINAL POR Salmonella spp. COMO INDICADOR DE
VULNERABILIDADE
Silva, Juliana Isabel Giuli da1; Limone, Carla Regina2; Ferreira, A.J.P.3;
Knöbl, Terezinha3*
Medica veterinária autônoma: [email protected]
1
2
Graduanda da Faculdades Metropolitanas Unidas do Complexo Educacional FMU
3
Docentes do Departamento de Patologia da FMVZ/USP
E. mail: [email protected] (Knöbl, T.)
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Biosseguridade é o conjunto de normas adotadas em uma granja
para impedir a ocorrência de doenças. A criação comercial de aves é dotada de legislação específica no
sentido de erradicar doenças de importância econômica, incluindo as infecções por Salmonella spp [2]. A
salmonelose aviária é considerada a doença bacteriana de maior impacto na avicultura, em função da
mortalidade elevada de aves e do risco zoonótico de alguns sorotipos [1]. Embora os anatídeos jovens
sejam bastante susceptíveis à salmonelose e os surtos tornem-se freqüentemente epizoóticos, não existe
definição sobre o controle de doenças entéricas , e nem mesmo uma definição sobre as normas de
biosseguridades específicas para estas criações [3].
O objetivo deste trabalho foi elaborar um
questionário de biosseguridade que permita comparar a vulnerabilidade em diferentes criatórios de
anseriformes, utilizando a colonização intestinal por Salmonella como um indicador de sanidade.
MÉTODOS: O questionário foi adaptado a partir da IN.19 de 15/02/2002 [2]. O modelo criado foi
composto por 24 questões, permitindo a classificação das granjas em 4 níveis de vulnerabilidade. Com
base em uma tabela amostral, foi determinado o número de aves necessárias para o isolamento de
Salmonella, a partir de suabes de cloaca. RESULTADOS PARCIAIS: O questionário foi aplicado em
uma granja localizada no município de Caieiras, SP, onde estavam alojadas 70 aves. De acordo com os
dados obtidos pelo questionário foi possível classificar a granja como altamente vunerável. Na granja
foram avaliados 34 anseriformes das espécies cisne chinês (Anser cygnoides), ganso Egito (Alopochen
aegyptiacus),pato selvagem (Cairina moschata) e marreco de Pequim (Ana boschas). O exame bacteriológico
das fezes identificou 5 (14,70%) aves positivas para Salmonella sp. CONCLUSÕES: O questionário
elaborado foi útil na classificação das granjas de acordo com a vulnerabilidade. O isolamento de
Salmonella em elevado percentual é compatível com a biosseguridade do local. A aplicação em outras
granjas determinará se a colonização por Salmonella spp é um bom indicativo para a monitoria sanitária
destes plantéis. AGRADECIMENTOS: Ao Laboratório de Ornitopatologia FMVZ/USP pelo apoio
para realização do trabalho.
ESTUDO DA CORRELAÇÃO ENTRE POLUIÇÃO AMBIENTAL POR CHUMBO E
AFECÇÕES PULMONARES EM PRIMATAS NEOTROPICAIS DE VIDA LIVRE NA
GRANDE SÃO PAULO
Nardi, A. F.1, Carretero, M. E.1, Sá, L. R. M.1.
1Laboratorio
de Gastroenteropatologia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Nos centros urbano-industriais os estudos sobre a poluição
ambiental evidenciam que é um fator de risco para a saúde humana. Devido à importância na saúde
pública, diversos países tentam adequar medidas de proteção e de sustentabilidade ambiental utilizando
o biomonitoramento. Especialmente em São Paulo há áreas remanescentes de Mata Atlântica sendo
habitat de primatas neotropicais, os quais podem ser utilizados como biomonitores pela proximidade
filogenética com o homem e nos casos dos sagüis, por serem semi-domiciliados, refletem com maior
realidade a exposição humana aos poluentes. O objetivo deste projeto é determinar os níveis de
chumbo nos pulmões e estudar as afecções pulmonares que acometem primatas neotropicais que
habitam o ecossistema poluído da grande São Paulo, podendo criar subsídios para aplicação de políticas
públicas em benefício à saúde humana e a conservação do meio ambiente. MÉTODOS: Serão
estudados machos e fêmeas de 20 saguis-de-tufos-brancos (Callithrix jacchus), 20 saguis-de-tufos-preto
(Callithrix penicillata), de 10 saguis híbrido (Callithrix spp.) e de 20 bugios ruivos (Alouatta guariba
clamitans) procedentes do Parque Ecológico do Tietê (PET) e Parque Ibirapuera (PI) na Grande São
Paulo durante o período de julho de 2011 a julho de 2012. Serão realizados estudos clinico e
epidemiológico referentes aos dados na ficha clínica individualizada; estudo anatomopatológico, sendo
a necropsia realizada no Departamento de Patologia da FMVZ, com coleta de fragmentos de órgãos e
fixados em formol 10% para posterior exame microscópico e, quantificação de chumbo em tecido
pulmonar por espectroscopia por energia dispersiva dos raios-x (EDX) em parceria com o Laboratório
de Poluição Atmosférica (LIM-05) da Faculdade de Medicina da USP. RESULTADOS E
EXPECTATIVAS FUTURAS: Foram necropsiados um C. jacchus (macho), quatro Callithrix sp
(fêmeas) e coletado amostras para as demais análises que estão em andamento. Os resultados obtidos
no projeto possibilitarão o levantamento de dados sobre a qualidade do meio ambiente a qual estamos
inseridos, evidenciando se o ambiente está poluído e desequilibrado podendo futuramente conscientizar
a população e as autoridades competentes para geração de políticas de melhoria ambiental,
beneficiando a todos.
TUMOR VENÉREO TRANSMISSÍVEL (TVT) EM MEMBRO POSTERIOR ESQUERDO
DE CÃO
Altarugio, R.¹; Silva, L. B.¹; Mendes, P. F.¹; Niero, R.2; Croce, G. B.3.
1Graduandas
2Docente
do Centro Regional Universitário de Espírito Santo do Pinhal - SP (UNIPINHAL - SP)
das disciplinas de Semiologia de Pequenos Animais, Terapêutica e Clínica Médica de Pequenos Animais do curso
de Medicina Veterinária do Centro Regional Universitário de Espírito Santo do Pinhal - SP (UNIPINHAL - SP)
3Docente
da disciplina de Anatomia Patológica do curso de Medicina Veterinária do Centro Regional Universitário de
Espírito Santo do Pinhal - SP (UNIPINHAL - SP)
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: O Tumor Venéreo Transmissível (TVT) é uma neoplasia
transmissível por células transplantáveis, com localização predominantemente venérea, afetando o pênis
e a vagina de cães, podendo também ser encontrado em regiões extragenitais. Histologicamente
caracteriza-se pela presença de células basofilicas arredondadas com pequena relação núcleo citoplasma,
e macroscopicamente apresenta- se como pequenas áreas elevadas, com aspecto de couve-flor ou
nodular, de coloração avermelhada, friável, com presença de secreção serosanguinolenta. O objetivo
deste trabalho é relatar o aparecimento de TVT em um local incomum em um cão SRD, senil, que
apresentou resposta à terapia quinzenal empregando se o quimioterápico Sulfato de Vincristina.
MÉTODOS: Foi atendido no Hospital Veterinário (HOVET) do UNIPINHAL, um cão SRD, macho,
com aproximadamente 12 anos de idade com 25 kg, apresentando grande lesão ulcerada localizada em
membro inferior esquerdo com crescimento contínuo relatado pela proprietária. Após anamnese,
exames físicos e laboratoriais, os resultados foram encaminhados ao setor de Anatomia Patológica do
HOVET, para pesquisa da origem da neoformação. Após a realização de exame citológico do local
lesionado observou-se microscopicamente a presença de fileiras de células variando do formato
redondo ao poliédrico, com vacuolizações distintas e pequena relação núcleo/citoplasma sendo os
núcleos grandes, basofílicos e centrais, compatível com o diagnóstico de TVT. O tratamento preliminar
preconizado foi realizado mediante administração de cefalexina 30 mg/kg, PO, BID, durante 7 dias,
com a finalidade de controlar a proliferação bacteriana existente no local da lesão, posteriormente o
animal foi submetido a sessões quinzenais de quimioterapia utilizando-se o quimioterápico Sulfato de
Vincristina a 0,75mg/m2, por via intravenosa, totalizando 5 aplicações. RESULTADOS: O protocolo
preconizado para administração do Sulfato de Vincristia é semanal, porém o animal apresentava
leucopenia significativa após cada aplicação, por este motivo optou-se pelas aplicações quinzenais.
Após o término do tratamento o animal apresentou remissão completa da neoplasia. CONCLUSÃO:
Considerando as características incomuns da neoplasia apresentada neste caso, conclui-se que apesar da
idade do animal e da localização do tumor, a terapia padrão empregada no tratamento deste tipo de
neoplasia mostrou-se satisfatoriamente efetiva na elucidação deste caso.
AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS EXPRESSÕES DE VEGFR E DO FATOR
VIII EM MASTOCITOMAS CUTÂNEOS CANINOS
Barbosa, D.F.L.1, *; Kleeb, S.R.2; Xavier, J.G.2,3; Catão-Dias, J.L.4; Fukumasu, H.1;
Strefezzi, R.F.1
1
Curso de Medicina Veterinária, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP;
2
4
Universidade Metodista de São Paulo; 3 Universidade Paulista;
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Do total de tumores de pele em cães, de 7 a 21% são
mastocitomas. Essas neoplasias são graduadas com base em características histomorfológicas que são
consideradas indicadores prognósticos. Na tentativa de predizer o comportamento dos mastocitomas
de forma mais precisa, diversos métodos estão sendo estudados. Os melhores resultados foram
alcançados com marcadores de proliferação e com a imunomarcação da proteína KIT. O
desenvolvimento da microcirculação é uma importante exigência para que haja expansão, disseminação
e metástase. Isso acontece porque ela é crucial para o desenvolvimento da neoplasia primária. A
angiogênese é um processo regulado por várias substâncias, com destaque para o fator de crescimento
para endotélio vascular (VEGF). Considerando-se que a maioria dos compostos antiangiogênicos está
associada ao VEGF e seus receptores, é de grande utilidade que se determine a expressão do VEGFR
para sua utilização como fator prognóstico, bem como na orientação terapêutica antineoplásica. O
objetivo do presente estudo é verificar o valor prognóstico da imunomarcação de VEGFR e Fator VIII
(fator de von Willebrand) em mastocitomas cutâneos caninos. MÉTODOS: Serão utilizados 24 casos
de mastocitomas cutâneos caninos, de diferentes graus histológicos [1], provenientes dos arquivos das
Instituições colaboradoras. Os tumores sofrerão processamento imuno-histoquímico utilizando os
anticorpos anti-VEGFR e anti-Fator VIII. A imunomarcação para VEGFR será avaliada
determinando-se a porcentagem de células positivas em 5 campos de marcação intensa (“hot spots”). A
marcação para Fator VIII será avaliada determinando-se o número médio de vasos por µm2,
mensurado em 5 “hot spots” em meio ao tecido tumoral, à objetiva de 20 aumentos. Os resultados
obtidos nas imunomarcações serão comparados aos graus histopatológicos, à mortalidade dos animais
em função dos mastocitomas, e ao tempo de sobrevida com o auxílio do software GraphPad Prism®
sendo α = 5%. RESULTADOS ESPERADOS: Considerando-se que a neovascularização facilita a
expansão e disseminação tumorais, espera-se encontrar correlação positiva entre as marcações imunohistoquímicas e os graus histopatológicos e mortalidade, e negativa para o tempo de sobrevida.
REFERÊNCIAS
[1] PATNAIK, A.K.; EHLER, W.J.; MACEWEM, E.G., 1984. Canine cutaneous mast cell tumor: morphologic grading and
survival time in 83 dogs. Vet. Pathol., 21, 469-474.
ESTUDO RETROSPECTIVO DAS DOENÇAS HEPÁTICAS EM AVES SILVESTRES,
EXÓTICAS E DOMÉSTICAS ATENDIDAS NO AMBULATÓRIO DE AVES DO
HOSPITAL VETERINÁRIO (HOVET-FMVZ/USP) ENTRE
2000 E 2011
Araújo, N. R.¹; Brito, M. G.²; Torres, L. N.³; Guerra, J. M.³; Sá, L. R. M.4; Cogliati, B.¹
¹Laboratório de Patologia Morfológica e Molecular, Departamento de Patologia,
FMVZ-USP
²Ambulatótio de Aves, HOVET, FMVZ-USP
³Serviço de Patologia Animal, HOVET, FMVZ-USP
4Laboratório
de Gastroenterologia Comparada, Departamento de Patologia, FMVZ-USP
INTRODUÇÃO: O fígado é a maior glândula do corpo, apresentando grande variedade de funções
como intervenção na digestão, ajuda na eliminação de toxinas e participação no metabolismo das
proteínas, gorduras e carboidratos. Constitui-se como um órgão parenquimatoso, glandular, lobado na
maioria das espécies e inclusive nas aves domésticas, o qual apresenta dois lobos, sendo o direito maior
que o esquerdo. Os lóbulos hepáticos são formados por conjunto de células epiteliais, os hepatócitos,
que estão dispostas radialmente e formam cordões duplos. Nas aves jovens, o fígado apresenta
coloração amarela associada com a absorção do saco vitelínico. O fígado está exposto a infecções ou
outras causas de lesões através de via hematógena, biliar e por penetração direta. As células epiteliais
(hepatócitos e colangiócitos) são os principais alvos da maioria das doenças hepáticas. As principais
alterações hepáticas podem ser divididas em do desenvolvimento, adquiridas, circulatórias,
inflamatórias e neoplásicas. Devido à grande diversidade de doenças hepáticas que acometem aves
silvestres, exóticas e domésticas, este trabalho visa fazer um levantamento das principais alterações
hepáticas nos animais atendidos no Ambulatório de Aves do Hospital Veterinário da FMVZ-USP,
correlacionando os aspectos histoquímicos e morfométricos com as principais alterações clínicas e
laboratoriais. MÉTODOS: Serão revisados os prontuários clínicos dos animais atendidos no
Ambulatório de Aves do HOVET, FMVZ-USP, no período de janeiro de 2000 a Junho de 2011, para o
levantamento dos animais com sintomatologia clínica e/ou laboratorial de doença hepática. Após esta
seleção, os laudos histopatológicos serão obtidos no Serviço de Patologia Animal do Departamento de
Patologia da FMVZ-USP. Os dados epidemiológicos extraídos dos laudos serão referentes à população
acometida (espécie, idade e sexo) e às alterações clinico - laboratoriais. A classificação histopatológica
das lesões será realizada nas lâminas coradas por hematoxilina-eosina. Ainda, serão realizadas
colorações especiais, como picrossírius para visualização da fibrose hepática; reticulina para
impregnação por prata das fibras reticulares; Perls para visualização dos depósitos férricos e; PAS com
e sem diástase para determinação do glicogênio hepático. A análise da área ocupada pelas fibras
colágenas e pelo glicogênio no tecido hepático será realizada pelo programa de análise de imagens
Image ProPlus.
ABORDAGEM MACROSCOPICA DAS LESOES DECORRENTES DE TRAUMAS
FISICOS EM BUGIOS RUIVOS DE VIDA LIVRE: OCORRENCIA E RELAÇÃO COM A
CAUSA DE MORTE
Ampuero, F.1; Sá, L.R.M.2
Laboratório de Gastroenterologia Experimental e Comparada, VPT, FMVZ-USP
1. Aluna de graduação em Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo
2. Professora Doutora, Laboratório de Gastroenteropatia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo
Email: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: O bugio ruivo (Alouatta guariba clamitans) é uma das espécies mais
frequentemente atendidas na Divisão Técnica de Medicina Veterinária e Biologia da Fauna Silvestre
(DEPAVE-3). O objetivo deste trabalho é determinar a ocorrência das causas de morte relacionadas a
traumas físicos, excetuando-se as injúrias térmicas, e avaliar sua importância para a conservação da
espécie no referido município MÉTODOS: Foram estudados 46 bugios provenientes do DEPAVE-3,
que vieram a óbito no período de junho de 2006 a dezembro de 2010 e foram encaminhados para
necropsia. As causas de morte foram definidas com base nas principais alterações macroscópicas.
RESULTADOS: Vinte e um dos bugios necropsiados apresentaram, como moléstia principal, lesões
decorrentes de traumas físicos (45,6%), sendo 66,7% machos e 33,3% fêmeas. Dezesseis apresentaram
lesões decorrentes de traumas inespecíficos (76,2%) e cinco apresentaram lesões decorrentes de trauma
por predador (23,8%). Doze bugios foram submetidos a eutanásia (57,15%) devido a gravidade das
lesões apresentadas, cinco chegaram mortos (23,80%) e quatro vieram a óbito durante o tratamento
(19,05%). Quanto à faixa etária, 38,15% eram adultos, 33,30% infantes, 19,05% senis e 9,50%
subadultos. Nos casos de trauma inespecífico foram observados traumas abertos em membros pélvicos,
torácicos ou cauda – lesões cutâneas ulceradas e necróticas com exposição e necrose da musculatura,
presença de larvas de mosca e fraturas expostas –, e traumas fechados –hematomas múltiplos, traumas
cranianos com hemorragia subdural e traumas torácicos com hemorragia mediastinal e pulmonar. Nos
casos de trauma por predador foram observadas lesões cutâneas perfuro contusas características de
mordedura, ruptura da musculatura intercostal e fratura de costelas. CONCLUSÃO: Os traumas
físicos decorrentes de agressão entre indivíduos e por predadores, bem como lesões ocasionadas em
infantes são uma importante causa de morte de bugios ruivos de vida livre na cidade de São Paulo. As
características macroscópicas encontradas indicam que, na maioria dos casos, as lesões não são fatais,
mas a severidade e localização resultam na eutanásia do individuo. A associação do estudo
anatomopatológico com a etologia da espécie poderá auxiliar na elaboração de estratégias de
conservação do bugio ruivo nessa cidade. AGRADECIMENTOS: Aos médicos veterinários do
DEPAVE-3 e a FAPESP (2011/00271-9).
AVALIAÇÃO DA TILÁPIAS DO NILO (OREOCHROMIS NILOTICOS) COMO
BIOMONITORES DA POLUIÇÃO POR CADMIO NOS LAGOS DO PARQUE
IBIRAPUERA
Gonçalves TLS, Carretero ME, Sá LRM
Laboratório de Gastroenterologia Experimental e Comaparada, Departametno de Patologia, FMVZ-USP
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Os peixes são uma alternativa saudável para a alimentação do
homem. Na musculatura esquelética que é fonte de alimento também são acumulados os poluentes
prejudiciais para a saúde do homem. Assim a análise da concentração de metais nos tecidos de peixes é
uma importante ferramenta para o biomonitoramento da poluição do ambiente aquático. O objetivo
geral deste projeto é determinar os níveis de cádmio nos tecidos de tilápias do nilo (Oreochromis niloticus)
e correlacionar esse metal com as afecções que acometem as tilápias dos lagos do Parque Ibirapuera.
MÉTODOS: Serão estudadas no total, 60 Tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus), provenientes de três
pontos pré definidos do Parque Ibirapuera (PI), no qual 30 espécimes foram capturados em julho de
2011 e outros 30 animais que serão capturados em janeiro de 2012. A captura, o transporte e a
necropsia foram autorizadas pelo ICMBio, número 28371-1. Os animais capturados serão anestesiados
com a dosagem de 190 mg/L de benzocaína e será realizada a eutanásia por aprofundamento de plano
anestésico. Para tanto, o projeto possui protocolo da comissão de Bioética da Faculdade de Medicina
Veterinária da USP com número 2272/2011. Os animais serão identificados e necropsiados
individualmente conforme Yanong (2003). Serão representados para microscopia de luz seis animais
por ponto estudado do PI com fragmentos de todos os órgãos. RESULTADOS: Trinta necropsias
foram realizadas e a análise histopatológica dos órgãos e demais análises estão em andamento.
CONCLUSÃO: Os resultados deste projeto possibilitarão a determinação dos riscos a que estão
expostos tanto a ictiofauna como o homem residente da Grande São Paulo. Espera-se que futuramente
sejam implementadas medidas para conter o prejuízo causado pela poluição do ambiente.
AGRADECIMENTOS: Aos médicos veterinários e biólogos do Parque Ibirapuera.
CARACTERIZAÇÃO HISTOMORGOLÓGICA DA MUCOSA DO INTESTINO DELGADO
DE CÃES FILHOTES, ADULTOS E IDOSOS
Pedrinelli, V.¹; Gomes, M. O. S.2; Carciofi, A. C.3, Sá, L. R. M.4
Laboratório de Gastroenterologia Experimental e Comparada 1, 4; Laboratório de Pesquisas em Nutrição e Doenças
Nutricionais de Cães e Gatos “Prof. Dr. Flávio Prada” 2, 3
1.Aluna de Graduação em Medicina Veterinária pela FMVZ-USP/SP. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo . 2. Doutoranda do Laboratório de Pesquisas em Nutrição e Doenças Nutricionais de Cães e
Gatos “Prof. Dr. Flávio Prada”, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Julio de
Mesquita Filho”, Campus de Jaboticabal. 3. Prof. Doutor do Laboratório de Pesquisas em Nutrição e Doenças Nutricionais
de Cães e Gatos “Prof. Dr. Flávio Prada”, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista
“Julio de Mesquita Filho”, Campus de Jaboticabal.
4. Profª Drª do Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de
São Paulo.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Características como idade, estado fisiológico e sensibilidade ou
não ao nutriente interferem diretamente na absorção de nutrientes. Portanto, para que haja um melhor
aproveitamento dos nutrientes pelo animal ao longo de sua vida, é necessário conhecer as
particularidades da mucosa intestinal nas diferentes faixas etárias. Este estudo visa à caracterização
histomorfológica da mucosa duodenal e do íleo em cães filhotes, adultos e idosos, para que seja possível
compreender as diferenças histomofológicas do intestino entre cada uma delas. MATERIAL E
MÉTODOS: Utilizar-se-ão três grupos de cães com diferentes idades pertencentes ao Laboratório de
Pesquisas em Nutrição e Doenças Nutricionais de Cães e Gatos, da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias (FCAV), da Universidade Estadual Paulista – Unesp, Campus de Jaboticabal: Grupo 1: 10
cães Beagles com seis meses de idade, Grupo 2: 10 cães da raça Beagle com 5 anos de idade e o Grupo
3: grupo misto em raça e animais com idade superior a 10 anos. Os animais receberão uma mesma dieta
padrão produzida na FCAV, e nenhum outro tipo de intervenção por 30 dias, quando será realizada a
biópsia intestinal. Os fragmentos coletados serão fixados em formol 10% e processados segundo
técnica padrão para exame microscópico de órgãos. A morfologia dos fragmentos será avaliada quanto
a: relação vilo/cripta, tamanho da vilosidade, hiperplasia da cripta, intensidade do infiltrado
inflamatório na lâmina própria, tipo do infiltrado inflamatório e densidade de linfócitos intraepiteliais.
A presença de ulceração e de agente infecto-parasitários será avaliada com relação à ocorrência ou não
do evento. RESULTADOS: Os procedimentos de biópsia endoscópica já foram realizados e as
lâminas já foram confeccionadas. A leitura das lâminas de histologia está em andamento.
AGRADECIMENTOS: Agradecimentos ao Laboratório de Pesquisas em Nutrição e Doenças
Nutricionais de Cães e Gatos, da FCAV/UNESP- Jaboticabal e ao Laboratório de Gastroenterologia
Experimental e Comparada da FMVZ-USP.
ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA DE BIÓPSIAS HEPÁTICAS
REALIZADAS EM CÃES COM HEPATITES CRÔNICAS OU LESÕES NODULARES
Santos, M. H.¹; Hagen, S. C. F.²; Alves, V. A. F.³; Cogliati, B.¹
¹Laboratório de Patologia Morfológica e Molecular, Departamento de Patologia,
FMVZ-USP
²Setor de Diagnóstico por Imagem, Departamento de Cirurgia, FMVZ-USP
³Laboratório de Investigação em Patologia Hepática (LIM 14), Departamento de Patologia, FMUSP
INTRODUÇÃO: A investigação da etiologia das doenças hepáticas crônicas em cães tem avançado
muito pouco nas últimas décadas e, muitas vezes permanece como uma doença idiopática, sem
tratamento específico e com prognóstico impreciso. A biópsia hepática guiada por ultrassonografia tem
como objetivo obter amostras de tecido para um diagnóstico histológico mais fidedigno das
hepatopatias, incluindo neoplasias, reações hiperplásicas, degenerativas, inflamatórias, necróticas,
colestáticas e, principalmente, nos casos de hepatopatias onde os achados clínicos e laboratoriais são
inconclusivos. Ainda, a biopsia constitui uma importante ferramenta de prognóstico e monitorização
terapêutica do paciente, associada com o acompanhamento clínico, laboratorial e ultrassonográfico. A
técnica de biopsia que tem sido mais empregada na medicina veterinária é a guiada por ultrassom,
utilizando a agulha Tru-cut de natureza cortante. Além do exame histopatológico e imunohistoquímico,
as amostras de tecido hepático podem ser colhidas para quantificação de cobre e também pode ser
enviado para cultura e pesquisa de microrganismos patogênicos. Sendo assim, este projeto visa avaliar
as principais alterações anatomopatológicas no fígado de cães portadores de hepatite crônica ou
nódulos hepáticos e correlacioná-las com os aspectos clínico-cirúrgicos, utilizando a biopsia hepática
por agulha grossa e guiada por ultrasom. MÉTODOS: Para isso, cães portadores de hepatopatias
crônicas ou nódulos hepáticos, identificados na triagem clínica e/ou ultrasonografia, serão registrados e
acompanhados pelo grupo de pesquisa. Os animais aptos serão submetidos à biópsia hepática por
agulha grossa e os fragmentos serão processados histologicamente. A análise histopatológica será
baseada na avaliação conjunta das colorações de Hematoxilina-Eosina, Tricômio de Masson,
Picrossírius, Reticulina, Perls e Rodanina. De acordo com a suspeita clínica do animal e da análise
histopatológica, serão aplicados painéis de anticorpos (imunohistoquímica) a fim de determinar a
etiologia precisa da doença hepática. Desta forma, a compreensão dos mecanismos fisiológicos e
patológicos possibilitará a instauração da terapia mais adequada baseada em seu real diagnóstico e
prognóstico.
ANÁLISE DA CASUÍSTICA DE NEOPLASIAS EM GATOS DOMÉSTICOS (Felis catus,
Lineu, 1758) DO SERVIÇO DE PATOLOGIA ANIMAL DA FMVZ/USP ENTRE 1998-2008
Adriana de Siqueira1, Fabiana Cecília Cassiano3, Paulo César Maiorka2
1.
Doutoranda, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
2.
Professor Associado, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de
São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
3.
Aluna de Iniciação Científica, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Há uma tendência crescente da adoção do gato como animal de
companhia, devido ao seu comportamento e adaptação a ambientes pequenos. Nos últimos anos houve
aumento da demanda por serviços veterinários de qualidade, o que culminou na pesquisa mais acurada
acerca das doenças. Consequentemente, os animais vivem mais, e neoplasias e doenças degenerativas
tem sido mais diagnosticadas. O presente estudo teve como objetivo delinear o perfil das neoplasias
dos gatos domésticos do Serviço de Patologia Animal da FMVZ/USP entre janeiro de 1998 e
dezembro de 2008. MÉTODOS: Foram colhidos dados de exames histopatológicos da casuística de
gatos domésticos no período entre janeiro de 1998 a dezembro de 2008: idade, sexo, raça, pelagem,
local da lesão, diagnóstico. As idades foram alocadas em faixas etárias (A, 0 a 6 meses; B, 7 meses a 2
anos; C, 3 a 6 anos; D, 7 a 10 anos; E, 11 a 14 anos; F >15 anos). RESULTADOS: De 585 submissões
de exames histopatológicos, 318 (54,4%) foram diagnosticadas como neoplasias. Destas, 199 (62,58%)
são fêmeas e 114 (35,85%) são machos. Com relação à idade, verifica-se que há 1 (0,31%) animal na
faixa etária A (0 a 6 meses), 9 (2,83%) na faixa etária B (7 meses a 2 anos), 47 (14,78%) na faixa etária C
(3 a 6 anos), 110 (34,59%) na faixa etária D (7 a 10 anos), 95 (29,87%) na faixa etária E (11 a 14 anos) e
31 (9,75%) na faixa etária F (mais de 15 anos). A distribuição dos locais dos tumores revelou que 39,4%
localizavam-se na pele, 9,7% na mama, 8,8% no pavilhão auricular, 7,9% na cavidade oral, 6,6% no
intestino, 3,8% em membros e 1,9% na cavidade nasal, sendo que os outros locais perfizeram menos de
1,5% cada. A neoplasia mais frequente foi o carcinoma de células escamosas (90/318; 28,1%), seguida
pelo fibrossarcoma (32/318; 10,1%) e linfoma (27/318; 8,5%). CONCLUSÕES: Os gatos domésticos
apresentam maior predisposição ao desenvolvimento de neoplasias epiteliais malignas, sobretudo as
fêmeas. Verificou-se que a maioria dos animais possuia entre 6 a 14 anos de idade. APOIO: FAPESP.
OPIOIDERGIC STIMULATION IN FEMALE RATS:
ENDOCRINE AND BEHAVIORAL ASPECTS
Cruz, A.M. 1; Sukikara, M. H. 2; Felippe, E. C. G. 1; Anselmo-Franci, J. A. 3; Canteras, N. S. 2; Oliveira,
C. A. 1; Felicio, L. F. 1
1
Faculdade De Medicina Veterinária E Zootecnia, USP
2
3
Instituto De Ciências Biomédicas, USP
Faculdade De Odontologia - Fisiologia, USP Ribeirão Preto
INTRODUCTION: Opioid peptides play an important role in maternal behavior as well as in
physiological and pathological phenomena involving motivation. OBJECTIVES: This study was
designed to investigate the endocrine and behavioral aspects of opioidergic stimulation induced by
morphine treatment. METHODS: Adult Wistas nulliparous female rats were timed-mated with
sexually experienced males. First experiment: daily 3.5 mg/Kg doses of morphine or saline from day 17
to 21 of pregnancy were administered. On day 5 of lactation, animals pretreated were challenged with
saline or morphine 1.5 mg/Kg, and maternal behavior was evaluated. Second experiment: 30 minutes
after saline or morphine injections from day 17 to 21 of pregnancy, a blood sample was collected.
Corticosterone, progesterone, estradiol and prolactin serum concentrations were measured after each
morphine or saline injection. A third experiment investigated the effects of daily progesterone
injections from day 17 to 21 of pregnancy on morphine inhibitory effects on maternal behavior during
lactation. Pregnant rats were treated with progesterone 400µg or peanut oil once per day, beggining on
day 17 of pregnancy, during 5 days. On day 5 of lactation, dams were challenged with saline or 1.5
mg/Kg morphine, and maternal behavior was evaluated. RESULTS: First experiment showed 100%
of animals from groups SS (n=10), SM (n=10) and MS (n=10) displayed full maternal behavior, while
0% of MM animals group (n=10) displayed this behavior. In the second experiment no significant
differences were found in corticosterone, estradiol, or prolactin serum concentrations. Progesterone
concentrations were consistently and significantly increased from days 18 to 20 of morphine treatment.
Progesterone pretreated dams were more sensitive to morphine-induced inhibition of maternal
behavior, as showed in the third experiment. Fisher test revealed a significant lower number of rats
showing full maternal behavior in group PM as compared to groups PS and OS, p<0.03 and p<0.01
respectively. This effect is similar to the one observed for morphine pretreated animals.
CONCLUSIONS: Progesterone emerges as a potential mediator for morphine-induced changes in
opioid sensitivity during late pregnancy and early lactation. Increased serum progesterone
concentrations may account for behavioral effects observed in lactating rats treated with morphine
during late pregnancy. FINANCIAL SUPPORT: FAPESP and CNPQ.
PESQUISA DE MYCOPLASMA GALLISEPTICUM EM AVES DE VIDA LIVRE
PRÓXIMAS ÀS GRANJAS AVÍCOLAS NO INTERIOR DE SÃO PAULO
Guimarães, M.B.1; Hurtado, R.H.2; Bello, P.C.3; Ferreira, A.J.P4.
1- Pós-graduanda do Departamento de Patologia FMVZ/USP
2-
Pós-graduanda do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde FMVZ/USP.
3- Mestre em Patologia pela FMZ/USP.
3- Prof. Dr. do Departamento de Patologia FMVZ/USP.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: O Mycoplasma gallisepticum (MG) consta na Lista B da OIE (Office
International des Epizooties) e no PNSA (Plano Nacional de Sanidade Avícola). As principais lesões
causadas nas aves de produção acarretam em queda na produção de ovos, redução no ganho de peso
dos frangos e condenação de carcaças, fazendo desta doença umas das mais onerosas da avicultura
comercial mundial. O objetivo do trabalho consistiu na pesquisa de Mycoplasma gallisepticum através da
técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), em aves de vida livre que adentram as granjas
avícolas na região de Louveira e Mogi das Cruzes no Estado de São Paulo. MATERIAL E
MÉTODOS: As aves foram capturadas com rede de neblina, identificadas, anilhadas, submetidas à
avaliação do estado geral e biometria. Após estes registros, foram coletadas amostras da cavidade oral
com auxílio de swabs estéreis, mantidos em meio Frei, seguida pela incubação da amostra em estufa
mantida a 37°C, extração do DNA pelo método de fervura, amplificação do material genético,
utilizando-se os primers específicos e corrida eletroforética. RESULTADOS: Foram identificadas 167
aves de vida livre pertencentes a 19 espécies, sendo o pardal (Passer domesticus) mais prevalente com 55
(32,9%) aves. Uma amostra positiva para o agente pesquisado
foi identificada na espécie Passer
domesticus. CONCLUSÃO: O MG tem sido isolado em aves de vida livre com conjuntivite, como o
pássaro dourado americano (Carduelis tristis) e o pássaro roxo (Carpodacus purpureus). A recuperação dos
sinais clínicos da doença pode variar de acordo com a susceptibilidade da espécie envolvida e trabalhos
descrevem que populações de pássaros (Carpodacus mexicanus) com quadro clínico de conjuntivite e
isolamento de novas cepas de Mycoplasma gallisepticum foram dizimadas em regiões da América do Norte.
No nosso estudo, a presença de uma única amostra positiva para o Mycoplasma gallisepticum deve-se pela
boa condição de saúde em que as aves se encontravam, cujo sequenciamento genético ainda
determinará se o MG será de origem vacinal ou de campo. Este achado representa o potencial de
transmissão de patógenos que as aves de vida livre podem ter em relação às aves de produção.
AGRADECIMENTOS: Agradecemos ao patrocínio da Wildlife Conservation Society para a
realização do trabalho.
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE Leishmania infantum chagasi ISOLADA DE
CÃES DE DUAS REGIÕES DO BRASIL
Batista, L. F. S.1; Segatto, M.2; Guedes, C. E. S.1; Rodrigues, C. A. T.3; Sousa, R.4; Macedo, A. M.2;
Schriefer, N. A.4; Veras, P. S. T.1
1 Laboratório
de Patologia e Biointervenção, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador Bahia
2 Departamento
3
4
de Bioquímica e Imunologia – ICB, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte – MG
Departamento de Morfofisiologia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande – MS
Serviço de Imunologia, Hospital Universitário Professor Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia, Salvador - BA
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: Correlações entre a diversidade genética dos isolados do L. infantum
chagasi e suas respectivas origens geográficas têm sido descritas de acordo com a evolução e o tempo de
origem da leishmaniose visceral (LV) no Velho Mundo. Porém, a diversidade da L. infantum chagasi que
circula entre hospedeiros e vetores no Novo Mundo é pouco conhecida. O presente estudo investigou
o grau de diversidade genética entre isolados de L. infantum chagasi obtida de cães de duas cidades
brasileiras endêmicas para LV, Jequié-BA e Campo Grande-MS, distantes 2.933 km entre si.
MATERIAL E MÉTODOS: O DNA genômico de isolados de 44 cães com sorologia positiva para
L. infantum chagasi, obtidos nos anos 2006 e 2008 foi amplificado randomicamente pela técnica de
RAPD utilizando-se três iniciadores. A matriz binária gerada pela RAPD foi analisada pelo programa
PAUP e gerou um dendrograma de UPGMA. Para validar os achados obtidos pela RAPD foi utilizada
a técnica de MLMT. Sete marcadores de microssatélites conhecidamente polimórficos para L. infantum
chagasi de 41 isolados foram convertidos em uma matriz binária pelo programa Factor do pacote Phylip.
Foi gerado um dendrograma de UPGMA pelo programa Treecon. A robustez dos ramos foi testada
por análise de Bootstrap (1.000 replicações). A estrutura da população foi analisada pelo programa
STRUCTURE e a análise da diversidade intrapopulacional (MNA, P, Fst, Fis, He) foi realizada
utilizando-se o programa Arlequin. RESULTADOS: A hipótese dos autores foi de que estes isolados
mostrariam um significativo grau de divergência genética. No entanto, foram observados agrupamentos
heterogêneos nos dendrogramas de RAPD e MLMT; duas populações (K=2) não correlacionadas com
nenhuma das origens estudadas e predominância de alelos homozigotos. CONCLUSÃO: Os
resultados indicam que há alto grau de homogeneidade genética entre isolados de Jequié e Campo
Grande, nenhuma associação entre genótipo e suas respectivas origens geográficas, além de reforçar a
teoria de que a L. infantum chagasi foi introduzida recentemente nas Américas. APOIO: CNPq,
FUNDECT e FAPESB.
ESTUDO DO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO DE OSTEOSSARCOMA
CANINO EM CULTURA CELULAR EM TRÊS DIMENSÕES
Sanches, DS.,1 Chaible, LM.,1 Mennecier, G.,1 Nagamine, MK.1, Latorre, AO.,1
Dagli, MLZ.1
1. Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
(FMVZ-USP), São Paulo, SP, Brasil.
Email: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A diferenciação de osteoblastos se caracteriza por um processo
dividido em três principais etapas: proliferação, maturação de matriz extracelular e mineralização.
Recentemente, tem sido mostrado que perfis de expressão gênica obtidos de cultura celular em três
dimensões têm refletido com mais precisão respostas clínicas quando comparados com cultura celular
em duas dimensões. Esferóides são uteis em testes de citotoxicidade a diferentes drogas, não somente
devido à redistribuição das fases de crescimento celular e microambientes heterogêneos, mas também
devido à barreira à penetração existente em regiões pobremente vascularizadas dos tumores que podem
em parte ser estimuladas. Nesse sentido o objetivo do corrente estudo é de verificar o pocesso de
diferenciação induzida de osteoblastos neoplásicos de cães em cultura celular em três dimensões.
MÉTODOS: Aqui nós reportamos o desenvolvimento e estabelecimento de uma linhagem celular de
osteossarcoma canino e a resposta destas células em cultura em três dimensões, quando expostos a três
diferentes agentes: Arctigenina (ARC), Genisteína (GEN), e Tricostatina A (TSA). Para isso foram
realizados: teste de ciclo celular através de citometria do fluxo, ensaios de MTT e Cristal violeta, estudo
morfológicos através de imunoistoquímica e histoquímica de tricômico de masson. RESULTADOS:
Uma resposta dose dependente em termos de viabilidade celular e proliferação foi observada após o
tratamento com os diferentes princípios ativos. Foi também verificado a indução à diferenciação dos
osteoblastos em cultura celular em três dimensões. CONCLUSÕES: Nós concluímos até o presente
momento que os três princípios ativos interferem nos processos de proliferação, viabilidade celular e
principalmente em direção a diferenciação de osteoblastos neoplásicos caninos.
PNEUMONIA POR VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO (RSV)
EM MURIQUI DO SUL (Brachyteles arachnoides)
Santos,SV1, Strefezzi, RDF2, Pissinatti, A,3 Takakura, CFH4, Kanamura, C 5,
Duarte, MIS6, Catão-Dias, JL7
1. Doutoranda, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP), São Paulo, SP,
Brasil.
2. Professor, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo (FZEA-USP), Pirassununga,
SP, Brasil - Campus de Pirassununga, Brasil.
3. Diretor, Centro de Primatologia do Rio de Janeiro (CPRJ), Guapimirim, RJ, Brasil.
4. Técnica de microscopia eletrônica, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP), São Paulo, SP, Brasil.
5. Diretora, Laboratório de Imuno-histoquímica do Instituto Adolfo Lutz (IAL), São Paulo, SP, Brasil
6. Professora, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP), São Paulo, SP, Brasil.
7. Professor, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP), São Paulo, SP,
Brasil.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO: O gênero Brachyteles, endêmico do Brasil, é constituído por duas espécies de
muriquis, o B. arachnoides e B. hypoxanthus. Estudos recentes demonstraram que suas populações
selvagens podem estar seriamente reduzidas. O vírus sincicial respiratório (RSV) é um vírus RNA
envelopado, inicialmente isolado de chimpanzés com coriza em 1956 e, atualmente, é considerado
causa importante de doença respiratória, moderada a severa e altamente contagiosa em criança.
MÉTODOS: Através de estudo retrospectivo envolvendo histórico clínico, necroscopia;
histopatologia a partir de fragmentos de órgãos preservados em formalina a 10% corados pelo método
da hematoxilina e eosina e pelas técnicas de Ziehl Neelsen e Gram, para diagnóstico diferencial
bacteriano; imuno-histoquímica, pelo método fosfatase, utilizando-se o anticorpo anti-RSV (código
Ab22501, da Albcam®) e análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão a partir de
amostras emblocadas em parafina segundo protocolo desenvolvido por Duarte et al., 1993, obteve-se o
agente viral como envolvido na causa de morte de um espécimen de muriqui do Sul cativo do CPRJ.
RESULTADOS: O vírus sincicial respiratório (RSV) foi diagnosticado em fragmento pulmonar
representado por pneumonia sincicial difusa moderada a grave em Muriqui do sul (Brachyteles arachnoideso
sem apresentar sinal clínico respiratório evidente. CONCLUSÕES: O relato alerta clínicos e criadores
conservacionistas que o RSV pode acometer primatas do novo mundo (RSV), sobretudo este atelídeo.
Como se trata de um vírus com potencial zoonótico, manejos profiláticos como adoção de medidas de
biossegurança evitando o contato entre humanos e PNH se faz necessário, garantindo a sanidade,
manutenção,
reprodução
e
conseqüente
conservação
dos
Brachyteles
arachnoides.
AGRADECIMENTOS: CAPES, CNPq, FAPESP (Proc. no 2010/51801-5), FM-USP, IAL, CPRJ,
IBAMA, FAPERJ, FINEP, American Society of Primatologists, Conservation International, Greater
Los Angeles Zoo Association.
INQUÉRITO SOROLOGICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS SELECIONADAS EM Cebus
flavius (SCHREBER, 1774), DE VIDA LIVRE, BRASIL
Marina Galvão Bueno (1); José Luiz Catão-Dias (1); Plautino de Oliveira Laroque (2); Silvio de Arruda
Vasconcellos (3); José Soares Ferreira Neto (3); Solange Maria Gennari (3); Fernando Ferreira (3); Marcia
Dalastra Laurenti (4); Eufrosina Setsu Umezawa (5); Norival Kesper Junior (5); Mônica Mafra Valença
Montenegro (2).
1. Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária/Departamento de Patologia, Brasil (FMVZ/VPT, Av.
Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87 CEP 05508 270 - Cidade Universitária, São Paulo/SP, Brasil, Tel: 3091-1434. Email: [email protected]); 2. Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Primatas Brasileiros, CPB/ICMBIO; 3.
Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária/Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde
Animal, Brasil; 4. Universidade de São Paulo /Faculdade de Medicina/LIM50, Brasil; 5. Instituto de Medicina
Tropical/USP, Brasil.
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: O Macaco-prego-galego (Cebus Flavius) é um primata neotropical
criticamente ameaçado, endêmico de algumas áreas fragmentadas do nordeste brasileiro, como Alagoas,
Paraíba, Rio Grande do Norte e Pernambuco. A População de vida livre é estimada em cerca de 1.000
indivíduos. O desmatamento e a caça são as principais ameaças, mas as doenças infecciosas podem
desempenhar um papel importante na conservação desta espécie. Este trabalho teve por objetivo
investigar a ocorrência de doenças infecciosas selecionadas em um grupo de C. flavius de vida livre.
MATERIAL E MÉTODOS: O soro provenientes de 18 animais foi testado quanto a presença de
anticorpo contra Leishmania spp., Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Leptospira spp. (24 cepas) e Brucella
abortus, utilizando-se testes sorológicos não comerciais (ELISA, TESA-blot, Teste de aglutinação
modificado, Teste de soroaglutinação microscópica, Soroaglutinação com antígeno acidificado
tamponado, respectivamente). RESULTADOS: Todos os animais apresentaram resultados negativos
para Leptospira spp. e B. abortus, entretanto 27,7% (5/18) apresentaram anticorpos contra Leishmania
spp., 22.2% (4/18) contra T. cruzi e 11.1% (2/18) contra T. gondii. Pode-se considerar que os 4 animais
que apresentaram anticorpos anti-T. cruzi foram efetivamente infectados por este, uma vez que o
TESA-blot é um teste de referencia para detecção da Doença de Chagas. Entretanto, entre os 5 animais
que foram positivos para Leishmania, não podemos negar a possibilidade de reação cruzada com
anticorpos anti-T. cruzi em 4 animais, ou infecção mista. CONCLUSÃO: Considerando o baixo
número de espécimes de vida livre, a ocorrência de doenças infecciosas pode representar uma ameaça
para a populações restante de C. flavius. O conhecimento do impacto causado pela zoonoses é uma
questão importante para futuras ações de manejo, tais como translocações e reintroduções, no qual
podem ajudar na conservação dos C. Flavius. AGRADECIMENTOS: FAPESP 09/51466-4 e
09/53561-4; ICMBIO/CPB.
HEMOGRAMA DE PINGUINS DE MAGALHÃES APTOS À SOLTURA REABILITADOS
DE PETRÓLEO
Niemeyer, C.1; Canabarro, PL.2; Pedroso, VM.2; Martins, AM.2; Adornes, AC.2,
Silva Filho, RP.2, Catão-Dias, JL.1.
1
Laboratório de Patologia Comparada de Animais Selvagens - VPT, FMVZ - USP;
2Centro
de Reabilitação de Animais Marinhos, Museo Oceanográfico - FURG.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Pingüins de Magalhães (Spheniscus magellanicus) são aves migratórias
especializadas na natação, assim refletem alterações e impactos do ambiente marinho, tais como a
ocorrência de vazamentos de petróleo, impactos da indústria pesqueira, etc, que estejam em sua rota
migratória. De 11 de junho à 12 de julho de 2011, o CRAM (Centro de Reabilitação de Animais
Marinhos) da FURG localizado em Rio Grande – RS recebeu 137 pinguins de Magalhães contaminados
com petróleo. Durante o processo de reabilitação as aves foram clinicamente tratadas e lavadas. Um
dos parâmetros clínicos que avaliam as aves para a soltura é o padrão sanguíneo, assim o presente
trabalho apresenta os dados hematológicos de 24 pinguins de magalhães soltos no primeiro lote de aves
reabilitadas em 2011. MÉTODO: Aproximadamente 5ml de sangue foram coletados de cada pinguim
pela punção da veia jugular em tubos contendo heparina. O sangue para hematócrito foi centrifugado a
12.000g em microtubos, a contagem total de celulas vermelhas e brancas foi realizada manualmente
usando corante Natt-herrick e câmara de Neubauer. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada
em microscópio óptico com uma lâmina de esfregaço sanguíneo à fresco fixada com metanol e corada
com Rosenfeld. A hemoglobina foi determinada pelo método comercial Hemoglobina – Labtest® e o
espectofotômetro LabQuest®. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Os resultados estão colocados na
Tabela 01.
Tabela 1 - Valores hematológicos de 24 pinguins de magalhães aptos para soltura no CRAM - FURG
Eritrócitos (1012/L)
Hematócrito (%)
Hemoglobina (g/dl)
VCM (fL)
CHCM (g/L)
Leucócitos (109/L)
Heterófilos (%)
Linfócitos (%)
Eosinófilos(%)
Monócitos (%)
Média +/- des pad
[min – max]
9.25 +/- 1.2
[7.6 – 11.95]
43 +/- 3
[37 – 51]
23.88 +/- 3.5
[14.7 – 29.6]
47.68 +/- 6.36
[36.53 – 60.25]
50.69 +/- 8.64
[31.15 – 67.28]
2.41 +/- 1.04
[0.7 – 5.05]
55 +/- 8
[41 – 71]
40 +/- 8
[26 – 59]
4 +/- 3
[0 – 14]
0
Total
1.36 +/- 0.70
[0.42 – 2.77]
0.94 +/- 0.39
[0.25 – 2.17]
0.09 +/- 0.08
[0 – 0.39]
0
A análise hematológica dessas aves aparentemente saudáveis e aptas à soltura faz parte de um
estudo que busca padrões clínicos para a espécie. Estes resultados podem servir de base para outros
centros de reabilitação, assim como aquários e zoológicos que mantém a espécie em cativeiro.
AGRADECIMENTOS: FAPESP e CNPq.
EVALUATION OF PERFORMANCE PARAMETERS, IMMUNITY AND BACTERIA
MIGRATION IN HEAT-STRESSED BROILER CHICKENS INFECTED BY
SALMONELLA ENTERITIDIS
WM Quinteiro-Filho1, AVS Gomes1, Ribeiro A, V Ferraz-de-Paula1, Pinheiro, M. L.; CS AstolfiFerreira1, AJP Ferreira1, J Palermo-Neto1
Department of Pathology, School of Veterinary Medicine, University of São Paulo
E-mail: [email protected]
Introduction: Stressful stimuli are known to change the immune function. A relevant environmental
stress to the poultry production is the heat stress. The aim of our work was search for effects of heat
stress on performance parameters, corticosterone serum level, IgA plasma level, IFN-lambda levels and
bacteria migration to spleen of broilers chickens infected with Salmonella enteritidis, searching for a
neuroimmune relationship. Methods: One hundred sixty chickens were housed in 2 rooms, infected or
not with Salmonella enteritidis (106UFC/animal). Animals were divided in four groups: control (C); heat
stress (HS); salmonella+control (SC); and salmonella+heat stress (SHS). Controls group (C and SC)
were kept under 21±1° C of environmental temperature. Both HS and SHS groups were exposed to
31±1°C (10h/day) from day 35 to 42. The production parameters were determinate by weight gain
(WG), feed consumption (FCo) and feed conversion (FC) during heat stress period. At 42nd day, 10
birds per group were randomly selected to compose all groups. Blood samples were harvested to
analyze corticosterone serum levels, IgA and IFN-lambda plasma levels by ELISA and spleen were
harvested to analyze bacteria migration by microbiology assay. Results: We observed that heat stress
per se decreased performance parameters such as body weight (g) (p<0.01) and food intake (g) (p<0.01),
increased corticosterone serum levels (ng/ml) (p<0.05). However, in heat stress group infected with
Salmonella FC (p<0.01) was increased compared with HS and SC. We also showed that in SHS, IgA
levels (ng/ml) (p<0.05) and INF-lambda (ng/ml) (p<0.05) were even lower than that observed in CS
group and, additionally, induced bacterial migration into the spleen (p<0.05), showing a deficiency of
the host to cope with the infection. Conclusion:
Thus, we believe that heat stress impaired
performance parameters, moreover the heat stress and the Salmonellainfection together impair more
intensely these parameters, principally feed conversion. Furthermore,
heat stress induced CNS
activation increasing corticosterone levels, which in turn decreased the immune system activity and lead
to impairment of mucosal barrier, which in turn increased chicken’s susceptibility to Salmonella
migration to the spleen. Sources of research support: Fapesp and CNPq.
URB602, UM INIBIDOR DA MONOACILGLICEROL LIPASE, REDUZ INFLAMAÇÃO
EM MODELO MURINO DE INFLAMAÇÃO PULMONAR AGUDA
Costola-de-Souza C. 1, Ribeiro A. 1, Ferraz-de-Paula V. 1, Almeida V.I., Gomes P.F., Machado T.M.,
Honda B., Akamine A.T., Pinheiro M.L., Palermo-Neto J. 1
1Grupo
de Neuroimunomodulação, Departmento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Estudos recentes indicam a importância do Sistema
Endocanabinóide em diferentes processos fisiopatológicos (Guindon, Hohmann, 2009), onde
endocanabinóides, como o 2-araquidonilglicerol (2-AG), modulam respostas imunes (Cabral, GriffinThomas, 2009). Baseado nos fatos, o uso do éster cicloexílico do ácido [1,1'-bifenil]-3-il-carbamico
(URB602) pode ser uma ferramenta para investigar os papéis do 2-AG, sendo que este fármaco
bloqueia a degradação do 2-AG através da inibição da enzima Monoacilglicerol lípase, tornado possível
a amplificação dos efeitos intrínsecos do 2-AG. Assim, analisamos os efeitos do URB602 em uma
perspectiva neuroimune. Especificamente, nosso objetivo foi estabelecer a curva dose-resposta para os
efeitos anti-inflamatórios do URB602 em um modelo murino de inflamação pulmonar aguda.
MÉTODOS: Cinquenta e cinco camundongos C57BL/6 machos foram utilizados; os camundongos
foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n=8-11 animais por grupo). O grupo 1 (URB10)
recebeu 10mg/kg; grupo 2 (URB15) 15mg/kg; grupo 3 (URB20) 20mg/kg e o grupo 4 (URB25)
25mg/kg de URB602 por via intraperitoneal (i.p.) 30 minutos antes de instilações nasais de LPS (100
ug/mL). O grupos 5 e 6 (veíc+sal e veíc +LPS) receberam o veículo do fármaco e após trinta minutos
salina estéril ou LPS intranasal, respectivamente. Vinte e quatro horas após a instilação nasal de LPS ou
salina, os camundongos foram submetidos à eutanásia por exsanguinamento após anestesia com
cetamina e xilazina (100 e 20mg/kg, respectivamente, i.p.) e foi coletado o lavado bronco-alveolar
(LBA) para a contagem de células totais e diferenciais (linfócitos, macrófagos e neutrófilos). Os dados
foram analizados utilizando análise estatística ANOVA de uma via seguida pelo teste de post-hoc
Dunnett. RESULTADOS: Observou-se que o tratamento com LPS aumenta o número de células no
LBA comparado aos animais tratados com salina estéril. Além disso, as análises estatísticas
demonstraram que animais tratados com doses iguais ou superiores a 15mg/kg de URB602
apresentaram redução no número de células inflamatórias induzidas por LPS no LBA (p < 0,05). Não
foram encontradas diferenças significantes na contagem diferencial de linfócitos e macrófagos entre os
grupos, entretanto houve redução no número de neutrófilos no LBA em todos os grupos tratados com
URB602. CONCLUSÕES: Demonstrou-se que o URB602, nas doses superiores a 15mg/kg, foi capaz
de reduzir parâmetros inflamatórios em um modelo murino de inflamação pulmonar aguda e que o
tratamento com URB602 reduz a migração de neutrófilos no LBA. AGRADECIMENTOS: FAPESP
/ CAPES.
REFERÊNCIAS
GUINDON, J.; HOHMANN, A.G. The endocannabinoid system and pain. CNS & Neurological Disorders Drug
Targets, v.8, n.6, p.403-421, 2009.
CABRAL, G.A.; GRIFFIN-THOMAS, L. Emerging role of the cannabinoid receptor CB2 in immune regulation:
therapeutic prospects for neuroinflammation. Expert Reviews in Molecular Medicine, v.11, n.e3, p.1-31, 2009.
CITOCINAS PERIFÉRICAS NÃO ESTÃO ALTERADAS NO CAMUNDONGO 3XTG-AD,
UM MODELO MURINO DA DOENÇA DE ALZHEIMER
Kinoshita, D.; Pinheiro, M. L.; Ribeiro, A.; Conh, D.W. H.; Costa-Pinto, F. A.;
Gimenez-Llort, L.; Sá-Rocha, L.C.
Departamento de Patologia, FMVZ – USP
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: O camundongo 3xTg-AD, um modelo murino da Doença de
Alzheimer, expressa três genes humanos mutados (PS1M146V, tauP301L e APPswe) que induzem o
aparecimento de placas beta amilóide e emaranhados neuro-fibrilares de uma forma dependente da
idade e da região cerebral, muito semelhante ao que acontece em pacientes com a doença. Estudos em
humanos e em modelos animais demonstraram que, associado às placas de beta amilóide, há ativação
da microglia e aumento de mediadores inflamatórios. Estudos em pacientes com Doença de Alzheimer
tentaram verificar se mediadores inflamatórios também se encontravam alterados na periferia, na
tentativa de estabelecer biomarcadores para a doença. Entretanto, os resultados não foram conclusivos,
demonstrando ora aumento, ora diminuição ou ainda níveis inalterados de mediadores inflamatórios no
sangue desses pacientes. Neste estudo, procurou-se verificar se o camundongo 3xTg-AD apresenta
alterações nos níveis periféricos de alguns mediadores inflamatórios, uma vez que, assim como em
pacientes humanos, esses camundongos apresentaram neuro-inflamação associada à placas beta
amilóide. MÉTODOS:
Foram utilizados camundongos 3xTg-AD e seu controle Wild Type
(WT) nas idades de 4, 5, 6, 7 e 8 meses. O soro dos camundongos foi coletado através de punção da
veia submandibular. Foram dosadas as seguintes citocinas/quimiocinas através de citometria de fluxo:
IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP1 e IL-10. RESULTADOS: Não encontramos diferenças nos níveis dos
mediadores inflamatórios analisados, com relação ao genótipo ou à idade analisados. CONCLUSÕES:
Apesar da presença de neuroinflamação associada à placas de beta amilóide nos camundongos 3xTgAD, não foram encontradas alterações nos níveis de diversos mediadores inflamatórios na periferia. Ao
menos nesse modelo murino, a neuroinflamação não está associada a aumento de mediadores
inflamatórios na periferia. AGRADECIMENTOS: CNPq e FAPESP.
ALPHA 7 NICOTINIC RECEPTOR STIMULATION MODIFIES CYTOKINE
PRODUCTION AND Α7-NACHR EXPRESSION IN BONE MARROW-DERIVED
DENDRITIC CELLS
Pinheiro, M. L.1; Nijhuis, L.E.J.2; Duarte, J. M.2; Ribeiro, A.1; de Jonge, W. J.2;
Palermo-Neto, J.1
1Neuroimmunomodulation
2Tytgat
Research Group, University of São Paulo, Brazil
Institute, Academic Medical Center, University of Amsterdan, Netherlands
INTRODUCTION: The inflammatory reflex is a neurophysiological mechanism that regulates the
immune system. Recent studies indicate that the vagus nerve modulates the immune response through
a “nicotinic anti-inflammatory pathway”. The aim of this work was to investigate the effects of an
alpha7 nicotinic agonist (Anabasine) on bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) cytokine
production and on the alpha7 nicotinic receptor (α7 nAChR) expression on immature and mature
BMDCs. METHODS: Bone marrow was harvested from the femur and tibiae of C57BL/6 mice and
cells were resuspended at a concentration of 2x106 cells/ml in RPMI with GM-CSF (2µL/mL) for 3
days. cells were then changed to RPMI with GM-CSF (1µL/mL) and remained in culture for 3 days.
On day 6 the immature BMDCs received vehicle or Anabasine (10-4, 10-5, 10-6, 10-7 and 10-8M) and, 30
minutes later all samples were exposed to LPS (1µg/mL). After 24 hours the supernatant was collected
to measure cytokines by ELISA. In another experiment the BMDCs were generated similarly, and in
day 6 cells were treated with vehicle, vehicle+LPS, or Anabasine 10-4M+LPS and 24 hours later cells
were harvested to check the α7 nAChRs expression on immature and mature BMDCs by conventional
PCR. RESULTS: Anabasine (10-4, 10-5 and 10-6M) decreased IL-12 production (Vehicle: 95.59±23.9;
10-4M: 18.14±8.1; 10-5M: 34.33±11.6; 10-6M: 56.87±17.2; 10-7M: 87.66± 17.5; 10-8M: 115.37±20.5)
whereas the 10-4 and 10-5M treatment increased IL-10 production (Vehicle: 169.73±26.2; 10-4M:
251.47±46.4; 10-5M: 242.47±44.1; 10-6M: 193.51±17.4; 10-7M:
177.12±8.9; 10-8M: 198.39±27.6).
immature BMDCs and the mature BMDCs treated with Anabasine 10-4M had higher expression of
α7 nAChRs, than the mature BMDCs treated with vehicle. CONCLUSIONS: We showed that the
α7 nAChR stimulation modifies BMDCs activity and α7 nAChRs expression. These finds suggest that
the cholinergic system can regulate adaptive immunity. ACKNOWLEDGMENTS: Fapesp.
CONSEQUÊNCIAS NEUROIMUNES DA ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA: AUMENTO
DA LIBERAÇÃO DE CORTICOSTERONA E DE CITOCINAS DE PERFIL Th1 NA
PROLE DE CAMUNDONGOS MACHOS
Zager, A.; Pinheiro, M.L.; Ribeiro, A.; Ferraz-de-Paula, V.; Palermo-Neto, J.
Laboratório de Pesquisa em Neuroimunomodulação, Departamento de Patologia – FMVZ-USP
São Paulo/SP – Brasil
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Em condições de inflamação aguda durante a gestação, a ativação
imunológica da mãe provoca aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias por células imunes e
de glicocorticóides, tanto na mãe como nos fetos. Essas citocinas atravessam a barreira placentária e a
barreira hemato-encefélica e podem interferir no desenvolvimento fetal, particularmente sobre o eixo
HPA e imunidade. Assim, o objetivo do presente estudo foi detalhar eventuais alterações na liberação
de corticosterona e na resposta imune inata e adquirida em resposta à um estressor agudo na vida adulta
da prole. MÉTODOS: Lipopolissacarídeo (LPS derivado de E. coli sorotipo 0127:B8; na dose de 0,12
µg/g de peso do animal) ou salina estéril foram administrados em dose única no dia gestacional 17. Na
vida adulta, a prole de camundongos machos foi submetida ao estresse de contenção por 2 horas. Em
seguida, os animais foram sacrificados para análise de corticosterona plasmática, fagocitose e burst
oxidativo de neutrófilos, balanço de citocinas Th1/Th2 e fenotipagem de células dendríticas em cultura
de esplenócitos. RESULTADOS: Nossos resultados demonstram que a prole de mães submetidas à
ativação imune durante o final da gestação apresenta aumento na liberação de corticosterona após o
estresse de contenção em relação à prole pré-tratada com salina, apesar de valores basais similares.
Quanto à resposta imune, nenhuma alteração foi encontrada na atividade de neutrófilos, na
fenotipagem e na expressão de moléculas co-estimulatórias por céls dendríticas. No entanto, foi
encontrado um aumento da produção de IL-12 em cultura de céls aderentes da prole submetida à
ativação imune materna. CONCLUSÕES: Nossos resultados demonstraram que a administração
única de LPS no terço final da gestação (dia 17) foi capaz de aumentar a atividade do eixo HPA e
estimular a produção de citocinas de perfil Th1 na prole de camundongos machos. Tomadas em
conjunto, essas evidências sugerem que um processo imune-inflamatório durante o desenvolvimento
fetal modula não só a resposta endócrina à um estressor agudo como também a imunidade mediada por
células. APOIO FINANCEIRO: CNPq e FAPESP (Projeto Temático #09/51886-3, e 09/51998-6
para AZ).
DICOTOMIA NA RESPOSTA IMUNE CELULAR CAUSADA POR DIFERENTES
ESPÉCIES DE Leishmania DO NOVO MUNDO EM MODELO EXPERIMENTAL
MURINO
Carvalho, A.K.1*, Francesquini, F.C.1, Salmazi, K.I.L.C.2, Passero, L.F.D.1, Gomes1, C.M.C., Silveira,
F.T.3,4, Corbett, C.E.P.1; Laurenti, M.D.1
1-
Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas (LIM-50), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brasil;
2-
Laboratório de Imunologia Clínica e Alergia (LIM-60), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil;
34-
Laboratório de Leishmanioses, Instituto Evandro Chagas, Belém, Brasil;
Núcleo de Medicina Tropical, Universidade Federal do Pará, Belém, Brasil.
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Estudos anteriores mostraram que a infecção causada por
L.(L.)amazonensis em camundongos BALB/c leva ao aumento do tamanho da lesão e a replicação
descontrolada de parasitas no ponto de inoculação enquanto que a infecção por L.(V.)braziliensis é
caracterizada pela auto-resolução da lesão com parasitismo reduzido, que se correlaciona ao
aumento do número de células CD8+ na lesão. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar
a resposta imune celular no linfonodo de drenagem destes modelos experimentais. MÉTODOS:
camundongos BALB/c foram inoculados nas patas traseiras com 106 promastigotas/pata de
L.(L.)amazonensis e L.(V.)braziliensis , o grupo controle foi inoculado com PBS. Na 4ª e 8ª semana PI os
linfonodos de drenagem foram coletados e processados para determinar as populações de células
CD3+, CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo. As células de linfonodo foram cultivadas sob estímulo
específico para analisar a produção de citocinas no sobrenadante de cultura através do
ELISA. RESULTADOS: Na 4ª semana PI, o percentual de CD3+, CD4+ e CD8+ não alteraram em
relação ao controle, contudo, na 8ª semana PI, ocorreu uma redução na porcentagem de células CD3+
e CD4+ em ambos os grupos em comparação com o grupo controle, mas houve um aumento no
percentual de células CD8+ em ambos os grupos. Em relação ao perfil de citocinas, altos níveis de IL-4
e IL-10 foram observados na infecção por L.(L.)amazonensis, mas na infecção por L. (V.) braziliensis
altos níveis de IFN- foram detectados na 4ª semana PI. Na 8ª semana PI um perfil de citocinas
Th1/Th2 misto foi observado na infecção por L.(L.)amazonensis, mas na infecção por L.(V.)braziliensis
foi observada uma respostaTh1 predominante com alto nível de IFN-γ. CONCLUSÕES: O aumento
de linfócitos T CD8+ em linfonodos de drenagem, bem como na lesão do ponto de inoculação (dados
não mostrados) e uma maior produção de IFN- γ podem ser fatores associados à eficiente
eliminação do parasito, conduzindo ao controle da infecção por L.(V. )braziliensis. Por outro lado, a
supressão da resposta imune celular leva à proliferação e manutenção dos parasitos na infecção causada
por L.(L.)amazonensis em camundongos BALB/c. AGRADECIMENTOS: FAPESP, CAPES, LIM-50
HC-FMUSP.
AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DOS PROCESSOS DE APOPTOSE, NECROSE E
AUTOFAGIA NA HIPOPLASIA MEDULAR DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À
DESNUTRIÇÃO PROTEICA
Beltran, J.S.O. ; Silva, G.B; Nakajima K. ; Crisma, A.R.; Borelli, P.
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, FCF/USP
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Desequilíbrios nutricionais e metabólicos podem induzir
apoptose, a necrose e/ou autofagia. Assim, a compreensão dessas interações pode ser relevante devido
ao impacto sobre o crescimento, desenvolvimento e demais funções celulares. Neste trabalho avaliamos
estes processos em células de medula óssea (MO) de camundongos desnutridos. MATERIAIS E
MÉTODOS: Camundongos machos C57BI/6J, adultos, foram separados em dois grupos:grupo
controle (C) e grupo desnutrido (D), que receberam, respectivamente, ração contendo 12% ou 2% de
caseína durante 5 semanas. Após este período os animais foram eutanaziados e células da MO foram
marcadas com anexina V, PI e caspase 3 para avaliação, por citometria de fluxo, de apoptose e
necrose.Avaliando-se ainda, parte da via de sinalização de autofagia (mTOR e Akt) por Western
Blotting. RESULTADOS E CONCLUSÕES: Não encontramos diferenças estatísticas entre os
grupos para Anexina V (C:12.92 ± 2.336, n=7; D:11.48 ± 1.966, n=10); PI ( C: 0.4274± 0.08397 , n= 5;
M: 0.8143 ± 0.2173 , n = 8 ); Anexina V e PI (C:32.39 ± 4.130, n=7; D:43.76 ± 4.617 n=10); Caspase 3
(C:4.862 ± 1.177 n=5; D: 5.214 ± 0.9239,n=9). Já o resultado de mTor (C:59.23 ± 2.281,n=4; D:81.98
± 3.662,n=5) foi significativamente maior nos animais do grupo D em relação ao grupo C e o resultado
de Akt foi significativamente menor no grupo D em relação ao grupo C (C:63.85 ± 4.637,n=6; D:45.42
± 7.519,n=6). Estes resultados sugerem alterações na via de Akt e mTor, e, nossa hipótese é de que a
hipoplasia medular observada na desnutrição possa ser decorrente da autofagia quer em função de
mecanismo de reparo ou ainda por bloqueio de genes que regulam a apoptose.
ANÁLISE PROTEÔMICA DO ESTROMA MEDULAR DE CAMUNDONGOS
SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO PROTÉICA
1
Graziela Batista da Silva, 2Layra Lucy Albuquerque, 2Iana Suly Santos Katz,
1
Jackeline Soares de Oliveira Beltran, 3Dulce Marta Schimieguel,
2
Orlando Garcia Ribeiro, 1Primavera Borelli
1Departamento
2Laboratório
3Departamento
de Análises Clínicas e Toxicológicas, FCF-USP
de Imunogenética, Instituto Butantan, USP
de Análises Clínicas e Toxicológicas - UFRGN
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: O estroma medular (EM) é composto por células estromais, matriz
extracelular (MEC), citocinas e fatores de crescimento; formando um microambiente para a
proliferação, diferenciação e maturação das células hematopoiéticas. Dados já publicados do grupo
demonstraram que o EM estabelecido por meio das culturas de longa duração (CLD) de camundongos
desnutridos não é capaz de manter a hematopoiese, também foi observado alterações na MEC. O
presente trabalho teve como objetivo avaliar o estabelecimento e a análise do perfil protéico do EM por
meio da CLD.
MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizados camundongos C57Bl/6J, machos, adultos, separados
em 2 grupos. O grupo controle (C) recebeu ração com 12% de caseína e o grupo desnutrido (D) com
2% de caseína, por 5 semanas. Após este período os animais foram sacrificados para a obtenção das
células totais da medula óssea para a realização das CLD. Foram realizados nas CLD avaliação do
estabelecimento do EM; por sistema de escores durante os dias de cultivo e análise do perfil protéico
por meio da eletroforese bidimensional. RESULTADOS: Não houve diferença quantitativa em
relação à celularidade, entre os grupos. Porém o grupo D apresentou menor confluência no 28° e 35°
dia, quando comparado ao grupo C, (C=69%±10; D=60%±4, C= 78%±11; D=70%±4,
respectivamente). Na análise proteômica do EM, foi observado que o grupo D apresentou um perfil
protéico diferente do grupo C, tanto do 28° quanto no 35° dia. O grupo D do 28° dia, não sintetizou
algumas proteínas e aparentemente diminuiu a síntese de outras proteínas quando comparado ao grupo
C. No 35° dia o grupo D teve um perfil protéico semelhante do 28° dia, mas o grupo sintetizou
proteínas que o grupo C do mesmo período não havia sintetizado. CONCLUSÃO: Alterações do
perfil protéico do EM sugerem possível remodelamento da MEC, que pode estar envolvido com esta
menor confluência das células estromais e poderiam contribuir a não sustentação da hematopoiese, mas
ainda são necessários a caracterização das células estromais e o seqüenciamento das proteínas da MEC
que irá auxiliar na elucidação da participação do microambiente na manutenção da hematopoiese.
AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO
PARASSIMPÁTICO EM UM MODELO DE RESPOSTA ALÉRGICA ALIMENTAR EM
CAMUNDONGOS
Gomes, P. F.1, Almeida, V. I1, Ribeiro, A.1, Ferraz-de-Paula, V.1, Pinheiro, M.L.1, Akamine, A. T.1,
Quinteiro-Filho, W. M. 1, Palermo-Neto, J.1.
1Grupo
de Neuroimunomodulação, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Recentemente foi descrita uma via anti-inflamatória na qual o
principal mediador é a acetilcolina (ACh). Demonstrou-se que após insultos inflamatórios ocorre uma
resposta reflexa e inconsciente, via nervo vago, com liberação de Acetilcolina (Tracey, 2003). Este
fenômeno foi chamado de Reflexo Inflamatório. Macrófagos e outras células produtoras de citocinas
expressam receptores para acetilcolina, sendo os efeitos até momento atribuídos à subunidade α7 (α7
nAChR) do receptor nicotínico. Agonistas deste receptor podem levar à inibição da liberação de
citocinas pró-inflamatórias (CZURA; TRACEY, 2005; TRACEY 2007). O Objetivo do trabalho é
avaliar a participação do sistema nervoso autônomo parassimpático em um modelo de resposta alérgica
alimentar em camundongos, utilizando-se de um agonista nicotínico. MÉTODOS: Serão utilizados
camundongos Balb./C, macho com 6 a 8 semanas, provenientes do Biotério do Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo. Os animais serão
divididos em 4 grupos: Alérgico + veiculo; Alérgico + anabasina; Não alérgico + anabasina; Não
alérgico + veiculo; Fármaco: Utilizaremos a anabasina, um agonista de receptor nicotínico α7, na dose
de 4mg/Kg. Os camundongos serão imunizados nos dias 0 e 14 com injeção intraperitoneal de 4µg de
OVA grau V preparado em PBS com 1,6 mg de gel de Alumina em um volume total de 0,4 ml/animal.
Os animais dos grupos alérgico + anabasina e não-alérgico + anabasina receberão anabasina via
intraperitoneal trinta minutos antes do desafio.Nos dias 21, 22 e 23 os camundongos receberão 0,5 ml
de solução de OVA 60% por gavage, no dia 24 os camundongos serão eutanasiados. SUPORTE
FINANCEIRO: FAPESP.
ENVOLVIMENTO DO MK-801 NOS EFEITOS INDUZIDOS PELA ANFETAMINA NA
RESPOSTA INFLAMATÓRIA ALÉRGICA PULMONAR
Hamasato EK1, Ribeiro A1, Ferraz-de-Paula V1, Pinheiro ML1, Quinteiro-Filho, W1, Damazo, AS3,
Ligeiro de Oliveira AP2, Palermo-Neto J. 1
1 Grupo
de Pesquisa em Neuroimunomodulação, Departamento de Patologia,
Universidade de São Paulo
2 Departamento
de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo
3 Faculdade
de Ciências Médicas, Universidade Federal do Mato Grosso
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Estudos de nosso laboratório mostraram a participação da
corticosterona e das catecolaminas nos efeitos induzidos pela anfetamina sobre a migração celular em
um modelo de inflamação alérgica pulmonar. Contudo, além das vias neuroendócrina e noradrenérgica
estudados, têm sido considerados outros mecanismos através dos quais a anfetamina modularia a
resposta imune. Neste sentido, estudos têm demonstrado que o glutamato atua não apenas como um
neurotransmissor central, mas também, como um importante modulador imune por atuar em
receptores presentes em células do sistema imune. Desta forma, pareceu-nos relevante abordar, a
participação do sistema glutamatérgico nos efeitos induzidos pela anfetamina no modelo de inflamação
alérgica pulmonar. MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizados camundongos machos adultos da
linhagem BALB/C, com 8-10 semanas de idade, provenientes de proles obtidas no Biotério do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo (FMVZ - USP). Os animais foram utilizados segundo as normas e procedimentos éticos relativos
ao uso de animais de laboratório do Comitê de Ética da FMVZ – USP (Protocolo nº 1633/2009). Para
a indução da inflamação alérgica pulmonar os animais foram imunizados no dia D(0) com 0,4 mL de
uma solução de 10 µg de OVA (Grau II) adsorvida em 10 mg de hidróxido de alumínio diluídos em
PBS (phosfate-buffered saline) administrada por via intraperitoneal (i.p). No dia D(7), os animais receberam
um reforço com a mesma solução pela via intraperitoneal (i.p). O desafio com o aerossol de OVA
(Grau II) 2,5% diluída em PBS foi realizado, colocando-se os animais, duas vezes por dia (manhã e
tarde) por um período de 20 minutos, durante os D(13) e D(14) em uma câmara (18,5 x 18,5 x 13,5)
conectada a um nebulizador ultrassônico. O pré-tratamento com MK-801, antagonista dos receptores
glutamatérgico – NMDA (0,25mg/Kg) foi realizado 30 minutos antes do tratamento com anfetamina
(2mg/Kg) ou salina (0,9% NaCl) nos dias 13 e 14. No dia 15, 12 horas após a última nebulização com
OVA, coletamos o lavado broncoalveolar (LBA) e o pulmão. Os leucócitos totais do LBA foram
contados em câmaras de Neubauer e a contagem diferencial após coloração de Rosenfeld, empregandose critérios morfológicos. A quantificação das citocinas (IL-5, IL-13 e IL-10), das imunoglobulinas (IgE
e IgE-OVA) e da corticosterona foi realizada por ELISA. A expressão das moléculas de adesão Lselectina e ICAM-1 foram determinadas em amostras de células coletadas do LBA por citometria de
fluxo. O pulmão foi fixado, processado e corado com azul de toluidina e borato de sódio para análise
histológica. Os cortes histológicos foram analisados por morfometria através do Software Axiovision
(Zeiss) para determinação das áreas teciduais e contagem dos mastócitos. As células foram expressas
em média ± desvio padrão por mm2 de tecido pulmonar. RESULTADOS: O tratamento com MK801 antes da administração de anfetamina em camundongos OVA sensibilizados e desafiados reverteu
a: diminuição no número de leucócitos totais bem como o número de eosinófilos e neutrófilos no LBA;
diminuição da porcentagem de expressão das moléculas L-selectina e ICAM-1 em granulócitos do
LBA; diminuição das citocinas IL-10 e IL-13 no sobrenadante do LBA e a diminuição da desgranulação
de mastócitos pulmonares. Além disso, não modificou a produção de IgE total e IgE OVA e os níveis
de corticosterona plasmáticos. CONCLUSÃO: Nossos resultados, como um todo, sugerem que o
aumento do número de leucócitos observado no LBA de animais OVA sensibilizados e desafiados e
tratados com MK-801 + anfetamina tenha sido decorrente: do aumento da expressão de moléculas de
adesão L-selectina e ICAM-1 em células do LBA, do aumento da liberação das citocinas IL-13 e IL-10
no LBA e da maior desgranulação de mastócitos pulmonares. Tomados em seu conjunto, quer nos
parecer que os efeitos induzidos pela anfetamina implicam na ativação do sistema glutamatérgico via
receptores NMDA. Possivelmente, as diferenças dos efeitos do MK-801, da anfetamina ou a
combinação de fármacos se devam a uma modulação diferenciada do eixo hipotálamo pituitária adrenal
(HPA) e o sistema nervoso autônomo simpático (SNAS). Não se descarta, também, uma ação direta do
MK-801 em células imunes. AGRADECIMENTOS: FAPESP (2009/01826-4, 2009/51886-3) e
CNPq.
DIFERENCIAÇÃO, CAPACIDADE ENDOCÍTICA E FUNÇÃO APRESENTADORA DE
ANTÍGENO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS ISOLADAS DE CAMUNDONGOS
SUBMETIDOS À VAGOTOMIA SUBDIAFRAGMÁTICA
Cruz, D. G.; Massoco, C. O.
Departamento de Patologia Experimental e Comparada, FMVZ, USP.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: A identificação da via colinérgica na modulação da resposta imune
e inflamatória tem sido apoiada por um número crescente de pesquisas nos últimos anos,
principalmente nos estudos onde foram empregados modelos de vagotomia ou estimulação do nervo
vago. Mais especificamente, demonstrou-se que o sistema nervoso central é capaz de ser informado
sobre o estado da inflamação via sinais neurais aferentes devido à inervação vagal nos órgãos e células
do sistema retículo-endotelial. Em resposta a esta sinalização o arco eferente motor exerce um efeito
anti-inflamatório na periferia através da liberação de acetilcolina, diminuindo a produção de citocinas
pró-inflamatórias por células imunes, tais como macrófagos. Evidências recentes da presença de
receptores colinérgicos em células mais especializadas do sistema imune, como as células dendríticas
(DCs), sugere a participação do sistema parassimpático na modulação da resposta imune. Uma provável
hipótese é que o efeito anti-inflamatório da via colinérgica pode alterar indiretamente a função de
células dendríticas, uma vez que “sinais de perigo” como o aumento de citocinas pró-inflamatórias,
TNF-α e IL-1, induz a ativação destas células. O objetivo do presente trabalho é analisar a influência da
via vagal sobre a geração, diferenciação e ativação das DCs de camundongos utilizando o modelo de
vagotomia subdiafragmática em camundongos C57BL/6. METODOLOGIA: Camundongos
C57BL/6 serão submetidos à laparotomia, sendo que em um grupo o nervo vago subdiafragmático será
localizado e seccionado, e outro grupo terá apenas os ramos nervosos vagais separados, mas não
seccionados (grupo sham). Após o período pós-operatório será realizada a coleta e isolamento das
células dendríticas de órgãos linfóides secundários, bem como a geração de DCs a partir da medula
óssea. Estas células serão avaliadas quanto ao estágio de diferenciação, a capacidade endocítica e função
apresentadora de antígeno por citometria de fluxo, bem como a dosagem de citocinas IL-12p70 e IL10.
CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE iNOS E PARASITISMO EM LINFONODO
DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS COM LEISHMANIA (LEISHMANIA)
INFANTUM CHAGASI
Francesquini Fc1; Tomokane Ty1; Batista, Lfs1; Marcondes M2; Corbett Cep1; Laurenti Md1
1Laboratório
de Patologia de Moléstias Infecciosas - LIM50, Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
2Departamento
de Clínica Cirurgia e Reprodução Animal, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual
Paulista Júlio de Mesquita Filho
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A produção de óxido nítrico (NO) pela óxido nítrico sintetase
induzível (iNOS ou iNOS2) representa um dos principais mecanismos microbicidas em macrófagos
murinos. Estudos recentes sugerem que a expressão de iNOS por macrófagos desempenham um
importante papel no controle da infecção por Leishmania em cães. Assim, o objetivo desse trabalho foi
avaliar a expressão de NOS2 em linfonodo de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) i. chagasi.
MATERIAL E MÉTODOS: Vinte e um cães infectados por Leishmania, 11 sintomáticos e 10
assintomáticos provenientes do Centro de Controle de Zoonoses, foram submetidos à eutanásia e
fragmentos de linfonodo foram coletados em solução de formol 10%, processados histologicamente e
por imuno-histoquímica, usando como anticorpos primários, soro de camundongo cronicamente
infectado por Leishmania e anticorpo policlonal anti-NOS2 humano (Santa Cruz), e como sistema de
revelação foi utilizado o kit LSAB (DakoCytomation) e NovoLink (Novocastra), respectivamente.
Imagens foram obtidas utilizando o sistema de análise de imagem (Zeiss) com o objetivo de quantificar
o número de formas amastigotas de Leishmania e de células NOS2+. A correlação entre o número de
parasitos e o número de células expressando NOS2 foi realizado através do teste de Spearman.
RESULTADOS: Não foram observadas diferenças no parasitismo tecidual e na expressão de NOS2
entre os cães sintomáticos e assintomáticos. Apesar disso, houve correlação negativa entre o
parasitismo e células NOS2+ em cães sintomáticos (rs= -0,8273, p= 0,0017) e em cães assintomáticos
(rs= -0,6565, p= 0,0391). Em outras palavras, a alta expressão de NOS2 foi relacionada com o baixo
parasitismo no linfonodo de cães sintomáticos e assintomáticos. CONCLUSÕES: Os resultados
sugerem que a expressão de NOS2 pode ser responsável pelo controle do parasitismo em linfonodo de
cães. SUPORTE FINANCEIRO: FAPESP, LIM50/HC-FMUSP.
AVALIAÇÃO DA INFECÇÃO POR Leishmania (Viannia) braziliensis NA PRESENÇA DO
LISADO DE GLÂNDULA SALIVAR DE Psychodopygus wellcomei E Lutzomyia longipalpis
1
Francesquini, F.C; 1Carvalho,A.K.; 1Passero, L.F.D.; 1Tomokane,T.Y.; 1Bordon, M.L.A.C.; 2Silveira,
F.T.; 1Corbett, C.E.P.; 1Laurenti, M.D.
1Laboratório
de Patologia de Doenças Infecciosas(LIM-50), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (SP),
2Laboratório
de Leishmanioses, Instituto Evandro Chagas, Belém (PA), BRASIL
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Leishmaniose é uma importante doença tropical causada por
parasitos do gênero Leishmania, e transmitida através de flebotomíneos fêmeas durante o repasto
sanguíneo. A saliva do flebotomíneo vetor desempenha um importante papel na infecção por
Leishmania, pois a inoculação do parasita na presença do lisado da glândula salivar (LGS) em modelos
murinos resulta no aumento do tamanho de lesão e do parasitismo. A maioria dos trabalhos sobre o
efeito da saliva na infecção por Leishmania foi realizada com LGS de fletobomíneos colonizados,
entretanto, estudos mostram que há diferença no perfil da infecção quando são utilizadas LGS de
flebotomíneos capturados em campo. Além do mais, estudos sobre o efeito da saliva no binômio
natural vetor/parasita são escassos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o perfil da
infecção por Leishmania (V.) braziliensis na presença de LGS de Psychodopygus wellcomei (binômio natural
vetor/parasita) e LGS Lu. longipalpis, ambos provenientes de captura em campo. MÉTODOS:
Camundongos BALB/c foram inoculados nas patas traseiras com 106 promastigotas de L.braziliensis,
L.braziliensis + meio par de LGS de Psy. wellcomei, L.braziliensis + meio par de LGS Lu. longipalpis, (ambos
coletados em campo), e o controle inoculado apenas com PBS. A evolução da lesão foi avaliada até a 9ª
semana pós-infecção (PI) quando foram coletadas biópsias do ponto de inoculação para análise
histopatológica e determinação da carga parasitária através da diluição limitante. RESULTADOS: Foi
observado que tanto na infecção por L.braziliensis + LGS Psy. wellcomei quanto por L.braziliensis + LGS
Lu. longipalpis a lesão foi maior na 8ª semana PI que na infecção por L.braziliensis. Entretanto a análise
histopatológica mostra um infiltrado inflamatório mais intenso na infecção de L.braziliensis + LGS Psy.
wellcomei quando comparado com os outros dois grupos, os quais apresentam um infiltrado inflamatório
discreto
e focal. A carga parasitária não apresentou diferença entre os grupos estudados.
CONCLUSÃO: O binômio natural vetor/saliva resultante da infecção L.braziliensis + LGS Psy.
wellcomei apresenta uma tendência a exacerbar a infecção quando comparado a infecção por L.braziliensis
+ LGS Lu. longipalpis e por L.braziliensis em camundongos BALB/c. AGRADECIMENTOS: CAPES,
LIM50 HC-FMUSP.
POSSÍVEL AÇÃO DO FIPRONIL NA RESPOSTA COMPORTAMENTAL EM
LABIRINTO EM CRUZ ELEAVADO NA PROLE MASCULINA DE RATOS
1
Mariana Sayuri Berto Udo, 1 Thaísa Meira Sandini, 2Helenice De Souza Spinosa
1Programa
de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade
de São Paulo, São Paulo/SP, Brasil;
2Departamento
de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo/SP,
Brasil.
INTRODUÇÃO: O fipronil, um inseticida de amplo espectro, usado para o controle de pragas em
diversas áreas, é um bloqueador dos canais de cloreto acoplados aos receptores GABA. Apesar de ser
mais tóxico aos insetos, o fipronil também pode atuar como interferente endócrico em mamíferos.
Sabe-se que o GABA é um dos principais neurotransmissores relacionado a ansiedade e que o Labirinto
em Cruz Elevado (LCE) é o modelo experimental mais adequado para essa verificação. OBJETIVOS:
Avaliação da resposta comportamental em LCE, na idade adulta, da prole de ratos expostos ao fipronil
durante a gestação. METODOLOGIA: Ratas Wistar prenhes (n=8 por grupo) receberam, por
gavagem, do 6º ao 20º dia de gestação, diferentes doses de uma solução de fipronil (0,1; 1,0 e
10,0mg/Kg/dia). As ninhadas foram padronizadas para 8 filhotes (4 fêmeas e 4 machos) e o desmame
ocorreu no dia 21 de lactação. A prole foi avaliada na idade adulta (75 dias de vida) no LCE quanto à
porcentagem de entrada e permanência em cada braço. Os resultados foram analisados estatisticamente
pela ANOVA. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Os resultados não mostraram diferenças
significantes entre os filhotes do sexo feminino, porém, os filhotes machos, cujas mães estiveram
expostas a maior dose de fipronil durante a gestação, apresentaram uma preferência maior pelos braços
fechados, tanto em relação à porcentagem de entradas (p<0,05) quanto à permanência (p<0,05) quando
comparados ao controle sugerindo que o fipronil alterou a emocionalidade desses animais tornando-os
mais ansiosos. APOIO FINANCEIRO: CAPES e FAPESP, respectivamente aos primeiros autores.
A EXPOSIÇÃO PRÉ-NATAL AO SENECIO BRASILIENSIS PROMOVE AUMENTO DA
ATIVIDADE MOTORA DE RATOS NA IDADE ADULTA
Sandini, T.M, 1Udo, M.S.B, 2Reis-Silva, T. M., 2Spinosa, H.S.
1
1Programa
de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas, Faculdade de
Farmácia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, Brasil;
2Departamento
de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A intoxicação por Senecio spp., é a uma das principais intoxicações
atribuídas por plantas em bovinos. A intoxicação que ocorre especialmente por Senecio brasiliensis pode
variar em função dos metabólitos formados (pirróis) e da espécie animal ter a capacidade de detoxificalos ou não. Sabe-se, que resíduos de pirróis podem ser econtrados em diversos tecidos do animal
durante um longo período após cessar a exposição. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a
atividade motora em campo aberto da prole de ratas expostas durante a gestação ao Senecio brasiliensis.
MATERIAL E MÉTODOS: Ratas fêmeas prenhes receberam, por gavagem, do 6° até o 20º dia de
gestação, o extrato butanólico das folhas secas da planta Senecio brasiliensis em diferentes doses (3, 6 e 9
mg/Kg/dia), cuja maior dose mostrou baixa toxicidade em experimento prévio realizados em nossos
laboratórios, após a administração por 28 dias. RESULTADOS: Os resultados mostraram não haver
diferenças significantes entre os grupos quando se avaliou a atividade motora no campo aberto
(freqüência de locomoção, levantar, “grooming” e duração de imobilidade) durante o período pós-natal
nos dias 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21 de vida. No entanto, na idade adulta (75 dias de vida) observou-se
aumento de locomoção dos filhotes machos provenientes do grupo de 6 e 9 mg/kg. CONCLUSÃO:
Estes resultados indicam que a exposição pré-natal ao Senecio brasiliensis não alterou a atividade geral no
campo aberto da prole lactante, porém observou-se aumento da atividade motora na idade adulta. Esse
dado pode indicar uma possível falta de adaptação dos animais ao meio ambiente. Outros estudos
comportamentais (labirinto em cruz elevado, interação social) estão sendo realizados para esclarecer
esse achado. AGRADECIMENTOS: FAPESP.
ESTUDO DA TOXICIDADE DA UNCARIA TOMENTOSA EM RATOS WISTAR:
AVALIAÇÃO DOS POSSÍVEIS EFEITOS TÓXICOS NO SISTEMA REPRODUTIVO
Santanna, M. J.; Górniak, S. L.
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A Uncaria tomentosa é uma planta da família Rubiaceae que cresce
nas terras altas da floresta amazônica e tem como nome popular no Brasil unha-de-gato, devido ao seu
formato curvilíneo de suas folhas. Esta planta vem sendo amplamente utilizada na medicina popular
como anticancerígeno, imunomodulador e antiinflamatório, e ainda, como terapia para úlceras gástricas,
diarréia, gonorréia, artrite, reumatismo, acne, doenças do trato urinário. Embora muitos estudos
tenham sido realizados com a U. tomentosa, verificando seus potenciais efeitos terapêuticos, muito
poucos dados são encontrados, relativos à sua avaliação de toxicidade. Considerando que esta planta
vem sendo amplamente utilizada no Brasil, o objetivo deste trabalho é o de avaliar os possíveis efeitos
tóxicos na reprodução. MÉTODOS: Serão utilizados ratos Wistar machos e fêmeas a partir de 5
semanas de vida. Estes animais receberão os diferentes tratamentos por via oral, através de gavagem: o
extrato aquoso da U. tomentosa será administrado nas doses de 15, 75 e 150 mg/kg; o bisfenol, na dose
de 100 µg/kg, que é uma substância sabidamente desregulador endócrino (como controle positivo), e
ainda, um grupo de animais que receberá água durante todo o período experimental (controle). Os ratos
machos da geração parental receberão o extrato aquoso da U. tomentosa até o período de acasalamento
(durante 70 dias); enquanto que nas fêmeas, será proposto a administração da U. tomentosa 14 dias antes
do período de acasalamento, e continuando, durante todo o período de prenhez, até o 21º dia de vida
da geração F1 (somando 56 dias). Será realizada coleta de fragmentos tanto da geração parental quanto
da geração F1 para posterior análise, além da avaliação das alterações no comportamento sexual das
mães e quaisquer alterações na viabilidade dos fetos.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA ATRAVÉS DE
SANGUE COLETADO EM PAPEL DE FILTRO
1
Aschar M; 1Rosa, MF, 2Braga ET; 1Tomokane TY; 1Laurenti MD; 2Marcondes M;
1
Corbett CEP; 1da Matta VLR.
1Laboratório
de Patologia de Moléstias Infecciosas (LIM-50), Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
2Departamento
de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária da UNESP- Araçatuba,
São Paulo
INTRODUÇÃO: O cão é considerado o principal reservatório doméstico de Leishmania (L.) i. chagasi.
A eutanásia de cães soropositivos é recomendada como uma medida de controle da leishmaniose
visceral (LV) no Brasil. Portanto, um diagnóstico acurado da doença é importante tanto para o
programa de controle da LV como para clínicos veterinários. OBJETIVO: Investigar o desempenho
da PCR em tempo real (qPCR) no diagnóstico parasitológico de LV canina usando sangue coletado em
papel de filtro. MATERIAL E MÉTODO: Foram colhidos sangue periférico e fragmentos de
linfonodo poplíteo de 45 animais (35 sintomáticos e 7 assintomáticos) de área endêmica de LV canina
(Araçatuba, São Paulo). Parte do sangue foi acondicionada e congelada a –20°C e a outra (40
microlitros) foi depositada em papel de filtro especial (Whatman FTA® card), estocado à temperatura
ambiente. Os fragmentos de linfonodo foram armazenados a –20°C. Após extração, o DNA de todas
as amostras foi amplificado por qPCR, gerando um produto de 120 pares de base de Leishmania (L) i.
chagasi. A sorologia foi realizada por ELISA com antígeno bruto do parasito. RESULTADOS: Houve
detecção de DNA de parasitos no sangue colhido em papel de filtro em 80% dos casos e, em 82% no
linfonodo. No sangue total congelado foi encontrado em apenas 41% dos animais. A sorologia foi
positiva em 47% dos casos. Considerando-se os assintomáticos, 6 dos 7 animais foram positivos no
sangue colhido em papel de filtro, 4 no linfonodo e 3 no sangue congelado. Apenas 1 animal foi
positivo por ELISA. COMENTÁRIOS: Neste estudo, os dados revelaram que a recuperação de
DNA de Leishmania do sangue colhido em papel de filtro foi mais elevada quando comparada ao sangue
congelado e similar ao linfonodo. Ressalta-se que esta amostra clínica foi também mais eficaz na
determinação de infecção nos casos assintomáticos por PCR em tempo real. Portanto, sangue coletado
em papel de filtro, além da facilidade da coleta, se mostrou adequado para confirmar infecção por
método molecular. APOIO: FAPESP e LIM50 HC-FMUSP.
ESTUDO DA HELICOBACTERIOSE EM AMOSTRAS GÁSTRICAS DE CÃES E GATOS:
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA, IDENTIFICAÇÃO DO GÊNERO E
COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Débora Cristina Romero, Lilian Rose Marques de Sá
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A associação entre a infecção pelo H. pylori no homem e a indução
de gastrites, úlceras, carcinoma gástrico e do linfoma gástrico tipo MALT está bem estabelecida. Por
outro lado, nos animais a infecção é predominantemente por outras espécies de helicobactérias, sendo
que há poucos dados na literatura que não expõe um consenso e mostra informações conflitantes sobre
o papel do Helicobacter spp na fisiopatogenia das gastropatias causadas por essas bactérias nos animais. O
projeto tem como objetivo contribuir para o estudo da helicobacteriose gástrica e sua relação com
doenças gástricas em cães e gatos domésticos, que vierem a óbito no HOVET –FMVZ/USP no
período de um ano. Para tanto, espera-se determinar a ocorrência e a freqüência do gênero Helicobacter
quanto à sua distribuição na mucosa gástrica (fundo, corpo e antro) nesses animais e ainda comparar os
métodos de diagnóstico entre si na identificação do gênero e na resposta imune da mucosa gástrica do
hospedeiro. MATERIAIS E MÉTODOS: Serão coletadas amostras gástricas do fundo, corpo e antro
de cães e gatos, de qualquer raça, sexo e idade que vierem a óbito natural ou nos quais for realizada
eutanásia no HOVET, durante o período de um ano. Serão utilizados métodos como o teste rápido da
urease, citologia, histopatologia, histoquímica, biologia molecular e imuno-histoquímica tanto para a
identificação do agente como para avaliar sua relação com as lesões gástricas considerando aspectos
epidemiológicos e clínicos dos animais. RESULTADOS: Até o momento foram coletadas 18 amostras
gástricas de cães e 7 gatos. Os resultados obtidos pelo teste de urease das amostras caninas resultou em
15 amostras positivas para o agente e 3 negativas. Das 7 amostras felinas, 6 foram positivas e 1 foi
negativa. Espera-se adicionar estes resultados aos outros métodos que serão utilizados para buscar
respostas quanto à presença da bactéria e sua correlação com a resposta do hospedeiro e as
gastropatias. AGRADECIMENTOS: Agradecimentos ao Serviço de Patologia do VPT, ao
Laboratório de Ornitopatologia, ao HOVET, e a CAPES.
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO CANCEROSAS DE
NEOPLASIAS MAMÁRIAS DE CADELAS
Tatiane M. Giovani1; Lucas S. Machado2; Arina L. Rochetti2; Silvia H. S. Godoy2; Ricardo F. Strefezzi1,3;
Heidge Fukumasu1,2.
1 Programa
de Pós-graduação em Patologia Experimental e Comparada – FMVZ-USP,
São Paulo-SP
2
Departamento de Ciências Básicas – FZEA-USP, Pirassununga-SP
3
Departamento de Zootecnia – FZEA-USP, Pirassununga-SP
INTRODUÇÃO: Em cães, cânceres são a principal causa de óbitos de animais idosos, sendo as
neoplasias mamárias as mais freqüentes em cadelas. Recentemente a descoberta de populações de
células tumorais com características de células-tronco, implicaram na hipótese das células-tronco
cancerosas (Cancer Stem Cells, abreviação CSCs) que postula a existência de sub-populações de células
responsáveis pela recidiva tumoral após a quimioterapia e pela manutenção do crescimento tumoral.
Por definição, as CSCs possuem propriedades semelhantes às células-tronco normais (CTs) como
pluripotência, potencial de auto-renovação, capacidade de diferenciação em diferentes tipos celulares.
Após a marcação com o corante vital Hoechst 33342 em células da medula óssea, cujas, possuíam
fenótipo de células-tronco hematopoiéticas, uma população nomeada de lateral (do inglês Side
Population, SP) apresentaram menor marcação com o corante vital, situando-se no canto inferior
esquerdo quando da análise pelo citômetro de fluxo nas duas fluorescências emitidas. Esta propriedade
que populações de CTs e CSCs possuem é relacionada à maior expressão de proteínas transportadoras,
podendo ser considerado uma bomba de efluxo de múltiplas drogas. Outra característica importante
das CTs e das CSCs de tumores de mama de humanos é a alta atividade de aldeído-desidrogenase
(ALDH), sendo considerado também como um fator relacionado com pior prognóstico clínico. Cabe
ressaltar ainda que em humanos, a população de CSCs de tumores de mama é rica em células
CD44+/CD24-/low,
fato
ainda
não
verificado
em
tumores
de
cadelas.
OBJETIVO
E
METODOLOGIA: Portanto, o intuito deste projeto é de determinar a existência e caracterizar a
população de células-tronco cancerosas (CSCs) em tumores sólidos de glândula mamária em cadelas,
verificando seu potencial prognóstico sobre o grau histológico, tempo de sobrevida e tempo sem
recidiva tumoral, através de: 1) Isolar a população “Side Population” enriquecida em CSCs de tumores
sólidos de mama de cadelas. 2) Identificar biomarcadores que distingam a população SP (Aldefluorhigh,
CD44+, CD24-/low) da população não-SP dos tumores; 3) Correlacionar % CSCs com grau histológico,
tempo sem recidiva tumoral e sobrevida nos animais estudados; 4) Confecção das lâminas de tissue
microarray com os tumores de mama de cadela; 5) Validar os marcadores por imunohistoquímica nos
tumores dos mesmos animais (ALDH, CD44, E-CADH e TWIST).
ROLE OF NEUROCHEMISTRY IN THE ADAPTIVE VALUE OF BEHAVIOR:
COMPETITION BETWEEN MATERNAL BEHAVIOR AND THE SICK DURING
LACTATION
Amanda F. Do Nascimento, Maria Martha Bernardi e Luciano Freitas Felício
Veterinary School, Pathology Department, University Of São Paulo São Paulo, Brazil
INTRODUTION AND OBJECTIVES: In mammals, the amount of caring a mother offer to her
offspring is defined as maternalbehaviour(MB). MB is a complexbehaviour with specific characteristics
for each species, which are determined by physiological changes which happens a bit before or right
after parturition (Numan 1994 ; MATTSON et al,2001). During this special period , the main objective
is to ensure hers and her offspring´s survival. Of according to Hart (1988), the changes found in sick
animals, were defined in group as sickbehaviour(SB), which corresponds to an organized group
of behavioural and physiological changes. Infections caused by LPS during pregnancy might cause
mental diseases and among many other problems(Have et al, 2006). By knowing little about the
possible relationship between MB and SB, we used the LPS, an endotoxinderived from the wall of a
bacterium, as an inducer of SB. METHODS AND RESULTS: For the study of MB and MB
aggressive, 20 lactating rats were divided by 2 groups, control and experimental. The experimental
group received 100ug/kg LPSintraperitoneally(i.p), 48h afterendotoxinadministration, began the
observations of general activity in open field, MB and MB aggressive. For choice these days, were used
20 virgin female rats they receivedip 100 µg/kg, where were measured temperature and weight body,
and also the consumption of water and food during 120 hours. Females of control group were
observed in the same way, but were treated with vehicle of LPS. The results showed that: 1) In female
virgin rats treated with LPS there were changes in all parameter settings evaluated 2) In period of
lactation was observed a decrease in latency to load the first baby. CONCLUSIONS: One hypothesis
to explain the small effects of experimental inflammation induced by LPS in female rats during
lactation, would be that this period is more relevant to care, feeding and protecting offspring, than
express SB. On the other hand, can not affirm, given our results, that the lactating rats responded to
LPS. Just as observed in the final stages of pregnancy, in which the immune system is depressed.
FINANCIAL SUPPORT: FAPESP.
BIBLIOGRAPHY
HART BL. NeurosciBiobehav Rev. 1988;12(2):123-37
MATTSON BJ, WILLIAMS S, ROSENBLATT JS, MORRELL JI. Behav. Neurosci. 2001 Jun;115(3):683-94.
MEYER, U.; FELDON, J.; SCHEDLOWSKI, M.; YEE, B. K. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, v. 29, n. 6, p.
913-947, 2005.
NUMAN, BJ. In : Knobil, E ; Neill, J. The Physiology of Reproduction, N. York: Raven Press, pag: 221-302, 1994.
PRESENÇA DE CONTAMINANTES AMBIENTAIS EM TECIDOS DE
TARTARUGA-VERDE (Chelonia mydas) PROVENIENTES DA COSTA BRASILEIRA:
ESTUDO DA PREVALÊNCIA EM ANIMAIS ACOMETIDOS PELA
FIBROPAPILOMATOSE: PROJETO DE PESQUISA.
Sánchez-Sarmiento, A. M.1,6, Rossi, S. 2, Vale, L. A. S.3, Werneck, M. R.4,
Baptistotte, C.4, Santos, R. G.5, Matushima, E. R.1
1 Laboratório
de Patologia Comparada de Animais Selvagens, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade São Paulo, SP.
2 Programa
de Pós-Graduação em Ecologia Aplicada, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – Universidade de São
Paulo, SP.
3 Grupo
de Pesquisa em Química Verde e Ambiental, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, SP.
4 Projeto
5 Departamento
Tamar-ICMBio.
de Oceanografia e Ecologia, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES.
E-mail:[email protected]
INTRODUÇÃO: A ação do homem nos âmbitos marinho e costeiro vem ameaçando o ecossistema
de numerosas populações, como acontece com as tartarugas marinhas [1]. Isto é consequência do
aumento das intervenções antropogênicas, as quais repercutem na saúde dos habitats, afetando
negativamente espécies de longa vida, como a Chelonia mydas. Este quelônio encontra-se catalogado
como espécie em perigo pela International Union for Conservation of Nature (IUCN) [2] e no Brasil tem sido
listado como vulnerável [3]. As ameaças à espécie incluem captura por pesca, degradação do habitat nas
áreas de alimentação e nidificação e doenças. Dentre as doenças infecciosas, se destaca a
fibropapilomatose (FP), considerada uma das mais importantes ameaças à sobrevivência da tartarugaverde [4]. A fibropapilomatose é uma afecção tumoral, debilitante e potencialmente fatal para as
tartarugas marinhas [5]. Numerosas hipóteses têm surgido a respeito da etiologia da doença, mas ainda
nada é conclusivo. Contudo existe o consenso de que a etiologia da mesma seja multifatorial. O
aumento da ocorrência desta doença tem sido implicada à degradação dos habitats marinhos
relacionada aos contaminantes ambientais e seus metabólitos. Compostos organoclorados (OCs) como
os bifenilos policlorados (PCBs) são persistentes, bio-acumulam e bio-magnificam no ambiente
marinho através do tempo, sendo conhecidos por causarem efeitos adversos na saúde, por alterarem a
imunidade e serem apontados como agentes carcinogênicos. OBJETIVOS: pretende-se avaliar as
tendências desses compostos estabelecendo uma relação entre a sua concentração em diferentes tecidos
de C. mydas, com e sem presença de fibropapilomatose, para assim conhecer os possíveis efeitos destes
compostos na saúde das populações de tartarugas-verde da costa brasileira. MATERIAL E
MÉTODOS: Fragmentos de tecidos foram coletados durante a necrópsia de indivíduos provenientes
das regiões de Ubatuba-SP e Vitória-ES. Após etapa de preparação das amostras, estas foram
submetidas à Extração Acelerada por Solvente (ASE) e injetadas no Cromatógrafo a gás com
espectrômetro de massas (CG-EM/EM), para identificação e quantificação dos PCBs segundo as
metodologias desenvolvidas para analise de matrizes biológicas [6]. AGRADECIMENTOS: Ao
Projeto Tamar-ICMBio. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP,
2011/04565-7,
e
Conselho
Nacional
de
Desenvolvimento
Científico
e
Tecnológico
–
CNPq,130082/2011-2.
REFERÊNCIAS:
[1] Seminoff, J. A. Chelonia mydas. 2004. In: IUCN 2010. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2010.4.
<www.iucnredlist.org>. Downloaded on 04 November 2010.
[2] IUCN. 2010. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2010.4. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on
04 October 2011.
[3] Martins, M.; Molina, F. B. 2008. Panorama Geral dos Répteis Ameaçados do Brasil In: Machado, A. B. M., Drummond,
G. M., Paglia, A. P. (Eds.), Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção. Ministério do Meio Ambiente
(Brasil): disponível em <http://www.mma.gov.br>. Acesso em 04 de outubro de 2011.
[4] Work, T. M.; Balazs, G. H. 1997. Causes of green turtle (Chelonia mydas) morbidity and mortality in Hawaii. In: Annual
symposi in the sea turtle biology and conservation, 17., Florida. Proceedings…
[5] Baptistotte, C.; Scalfone, J. T.; Gallo, B. M. G.; Santos, A. S.; Castilhos, J. C.; Lima, E. H. S. M.; Bellini, C.; Barata, P. C.
R. 2001. Prevalence of sea turtle fibropapillomatosis in Brazil. In: Annual symposium on sea turtle biology and conservation,
21., Philadelphia. Proceedings…
[6] van de Merwe, J. P.; Hodge, M.; Whittier, J. M.; Lee, S. Y. 2009. Analysing persistent organic pollutants in eggs, blood
and tissue of the green turtle (Chelonia mydas) using gas chromatography with tandem mass spectrometry (GC-MSyMS). Anal
Bioanal Chem, 393: 1719-1731.
TERAPIA FOTODINÂMICA NO TRATAMENTO DE TUMORES: AVALIAÇÃO DO
EFEITO SOBRE O SISTEMA IMUNOLÓGICO
Del-Grande, M.P.¹; Dagli, M.L.Z.¹
¹Departamento de Patologia. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo
(VPT/FMVZ/USP)
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A terapia fotodinâmica (Photodynamic Therapy - PDT) é um
método de tratar neoplasias baseado na interação entre luz, oxigênio molecular e um agente
fotossensibilizador endovenoso, tópico ou oral. Após a administração do fotossensibilizante, o tumor é
iluminado com luz visível, ativando o agente, e produzindo espécies reativas de oxigênio, altamente
citotóxicas, que provocam morte celular e destruição tecidual. A característica singular da PDT no
tratamento de neoplasias é a participação ativa do sistema imunológico. Os efeitos fototóxicos na
membrana celular levam à liberação de mediadores inflamatórios. A inflamação local e as células
dendriticas acumuladas, junto à destruição das células neoplásicas, determinam a condição necessária
para a apresentação de antígenos tumorais aos linfócitos T CD4. Estes sensibilizarão os linfócitos T
CD8, causando uma resposta imunológica específica para tal neoplasia, envolvida na erradicação de
focos disseminados e/ou metastáticos da mesma. Ademais há sensibilização de linfócitos B,
produzindo resposta humoral. Pretende-se investigar os efeitos in vivo da PDT sobre o sistema
imunológico, para tanto, utilizar-se-á o tumor de Ehrlich na sua forma sólida. MATERIAL E
MÉTODOS: A fim de verificar a resposta do tumor de Ehrlich ao tratamento com a PDT,
camundongos com células tumorais inoculadas no subcutâneo do dorso receberão a PDT baseada no
ácido 5-aminolevulínico ou azul de metileno. Posteriormente mensurar-se-á os tumores durante 10 dias,
e comparar-se-á à evolução tumoral em animais não tratados. Já para averiguar o efeito da PDT em
focos tumorais secundários, animais previamente inoculados no dorso e tratados com a PDT ou
excisão cirúrgica, e o grupo controle sem tratamento, serão novamente inoculados no coxim plantar,
que será mensurado por 10 dias, a fim de se comparar o crescimento do tumor secundário dentre os
grupos. Os tumores secundários serão excisados e analisados histologicamente ao fim de ambos os
experimentos.Para determinar o efeito da PDT (usada em um foco primário) sobre metástases
pulmonares, animais tratados previamente, com PDT ou remoção cirúrgica, e os controles sem
tratamento e sem tumor, receberão endovenosamente células tumorais, a fim de gerar metástases
pulmonares. Após os animais serão sacrificados e fragmentos dos pulmões serão analisados
histologicamente e contar-se-á as colônias metastáticas, comparando-se os grupos.
PARTICIPAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO SIMPÁTICO E DO EIXO
HIPOTÁLAMO-PITUITÁRIA- ADRENAL NAS ALTERAÇÕES NEUROIMUNES
INDUZIDAS PELA CONVIVÊNCIA COM UM COMPANHEIRO DOENTE
Machado, T.R.M.; Alves, G.J.; Palermo-Neto, J.
Departamento de Patologia - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia- FMVZ-USP E-mail:
[email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Os trabalhos na área de neuroimunomodulação vêm contribuindo
de forma marcante para o entendimento da regulação/modulação das respostas adaptativas dos
organismos frente ao estresse ou às doenças. A integração de modelos biológicos e psicológicos surge e
torna-se cada vez mais importante para a neuroimunologia. Sabe-se que em um estresse o eixo
Hipotálamo-Pituitária-Adrenal (HPA) e o Sistema Nervoso Autônomo Simpático (SNAS) podem ser
ativados e, então, modular a resposta imune. A convivência prolongada com um animal conspecífico
severamente doente (injetado com células do tumor ascítico de Ehrlich) levou a alterações
comportamentais e de imunidade em camundongas (inata e adquirida) (MORGULIS et al., 2004;
ALVES et al. 2011, 2010, 2007, 2006). O presente trabalho, tem como objetivo avaliar alterações
neuroimunes em camundongos machos que conviveram por 11 dias com companheiros “doentes”
inoculados com tumor ascítico de Ehrlich, além de analisar a participação do eixo HPA e do SNAS
nestes efeitos. MÉTODOS: Os camundongos serão separados em pares e deixados em coabitação
durante 7 dias. No oitavo dia (dia 0 dos experimentos) serão divididos em dois grupos: controle e
experimental. No 11° dia, os procedimentos serão feitos com os “companheiros”. Serão realizadas as
seguintes avaliações: 1) corticosterona sérica; 2) noradrenalina e adrenalina plasmática; 3) noradrenalina
no hipotálamo e córtex frontal; 4) crescimento tumoral; 5) burst oxidativo e fagocitose de neutrófilos
por citometria de fluxo; 6) comportamento em campo aberto; 7) peso e histologia da glândula adrenal;
8) níveis de citocinas no baço (IFN- gama, IL-4, IL-12, IL-10, IL-6 e TNF- alfa) por ELISA; 9) níveis
de citocinas (IL-1β, IL-6 e TNF- α) no hipotálamo e córtex frontal, por Polimerase Chain Reaction
(PCR) real time; 10) expressão de enzimas de síntese de catecolaminas (tirosina hidroxilase e dopamina
hidroxilase) no hipotálamo e córtex frontal por PCR; 11) reavaliação da atividade SNAS e do eixo HPA
através do uso dos fármacos 6- hidroxidopamina (depletor noradrenérgico) e Metirapona (inibidor da
síntese de corticosterona).
DETECTION OF E. COLI AND EVALUATION OF ANTIMICROBIAL
RESISTANCE FROM CLOACAL SWABS OF GOLDEN CONURE
(GUARUBA GUAROUBA) KEPT IN CAPTIVITY IN SAO PAULO STATE –BRAZIL
Prioste, Fabíola E. S.1; Zwargg, Ticiana S.1; Teixeira, Rodrigo H. F.2;
Matushima, Eliana R.1
1 Faculdade
2Parque
de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
Zoológico Municipal Quinzinho de Barros – Sorocaba, São Paulo
INTRODUCTION: Golden conure (G. guarouba) is a endemic parrot from Brazilian Amazon Forest,
endangered since 1981 by the IUCN (1). There are approximately 600 golden conures kept in captivity
in Brazil and 1200 in wildlife (2). Those in captivity are considered an excellent research area, giving the
data base for a best comprehension for the wildlife ones. METHODS: In this study, we
performed cloacal swabs of 86 subjects, males and females, from Zoos and Breeding Programs at São
Paulo
state
–
Brazil,
proceeding to
culture for
E.
coli.
Samples with bacterial growth were tested to antimicrobial susceptibility for 16 different medicines.
RESULTS AND DISCUSSION: 50% of the total sample have shown a growth of E. Coli. It seems
that E.coli is a normal enterobacteria on this population. Results on the susceptibility tests shows highly
resistance for Ampicilin, Amoxicilin + Clavulanic Acid and Penicilines (100%), a medium resistance
for Cephalexin (67%), a low resistance for Enrofloxacin (7%), and a non-resistance for
Chloramphenicol (0%). This last one has shown the best susceptibility result (86%). Although the
Tetracycline showed one of the lowest resistance (9%), it was intermediate in 60% of the samples, not
representing a good choice of treatment for colibacilosis in these birds. All samples are stored at –
80ºC for future tests. ACKNOWLEDGEMENTS: Parque Zoológico Municipal Quinzinho de
Barros, Zooparque Itatiba, Zoológico Municipal de Mogi-mirim, Criadouro Comercial Arco-íris,
Orquidário Municipal de Santos, Parque Zoológico Municipal de Bauru, Criadouro Comercial Três
Marias, Criadouro Comercial Grizotto, Fundação Parque Zoológico de São Paulo, Criadouro
Conservacionista Fundação Lymington.
REFERENCES:
(1)IUCN redlist. http://www.iucnredlist.org/apps/redlist/details/150489/0
(2)LARANJEIRAS,
T. O.
Distribuição geográfica, história natural e conservação da Ararajuba (Guaruba guarouba) –
Psittacidae. 114fl. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – INPA – Universidade Federal do Amazonas, Manaus,
2008.
AVALIAÇÃO DO ESTRESSE POR CALOR SOBRE A ATIVIDADE DE LINFÓCITOS E A
RESPOSTA VACINAL AO PARAMIXOVÍRUS (DOENÇA DE NEWCASTLE) EM
FRANGOS DE CORTE
Honda, B., Ferreira, A. J. P., Raso, T. F., Quinteiro-Filho, W. M, Ribeiro, A.,
Ferraz de Paula, V., Costola, C., Gomes, P. F., Pinheiro, M. L., Palermo-Neto, J.
Departamento de Patologia Animal (VPT) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnica da Universidade de São Paulo
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: A neuroimunomodulação é o ramo da ciência que estuda as
relações bidirecionais entre os sistemas nervoso e imune. Com relação ao sistema de produção de
frangos de corte, uma série de fatores como ambiente, estado nutricional, fisiológico e social podem
gerar estresse que, de acordo com experimentos realizados em nossos laboratórios, relacionam-se com
perdas zootécnicas, imunossupressão e comportamento doentio. A utilização de vacinas na produção
de frangos de corte contra uma grande variedade de doenças infecciosas se tornou bastante comum;
porém, a resposta vacinal ou natural pode ser diversificada. Neste ponto, destaca-se Doença de
Newcastle que se posiciona na lista “A” da Organização Internacional de Epizootias. O conhecimento
desses pontos permite a importância da compreensão da presença e da patogênese dos fatores de risco
relacionados à imunossupressão para o sucesso da produção e para a otimização da saúde e do bemestar dos animais, permitindo assim, a utilização de todo o potencial genético e nutricional investidos na
criação. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos do estresse por calor sobre a
atividade de linfócitos e sobre a resposta vacinal ao paramixovírus (Doença de Newcastle) em frangos
de corte sob uma perspectiva neuroimunológica. MÉTODOS: 96 frangos de corte da linhagem Cobb
serão divididos em quatro grupos: dois controles e dois experimentais, sendo que ambos receberão a
vacinação para Newcastle pela via ocular em duas doses aos 7 e aos 14 dias. Os animais do grupo
experimental serão submetidos ao estresse térmico entre 7 e 14 dias de vida, sendo que os controle
permanecerão em um ambiente termoneutro. Após 5 dias da última dose da vacina, os animais serão
sacrificados e as amostras coletadas. Serão avaliados: níveis séricos de IgA, IgM, IgG e corticosterona;
imunofenotipagem de linfócitos B e T; ensaio de proliferação linfocitária; e tamanho e características
histopatológicas da bursa. RESULTADOS ESPERADOS: Como já observado nos trabalhos
desenvolvidos pelo nosso grupo, espera-se que os animais do grupo experimental apresentem uma
resposta vacinal diferenciada, podendo não permitir uma proteção adequada ao vírus em questão e uma
não utilização de todo seu potencial genético e nutricional.
HEALTHY EVALUATION OF FREE-LIVING CAPYBARAS
(HYDROCHOERUS HYDROCHAERIS) IN SÃO PAULO STATE – BRAZIL
Rosely Gioia-Di Chiacchio,(1)(2)(3) Mario Antonio Ferraro Rego,(4) Fábio Futema,(1) Ana Carla
Aparicio,(1) Milton Kolber,(1) Fabrizia Aparecida Tavolari,(1) Monika Scheibel,(1) Aldo Francisco
Alves Neto,(1) Enio Eduardo Bovino,(1) Elisa San Martin Mouriz Savani, (5) Rosane Correa de
Oliveira,(6) Henri Donnarumma Levy Bentubo,(7) and Eliana Reiko Matushima,(2).
(1) Veterinary Medicine School of Universidade Paulista UNIP, São Paulo, Brazil;
(2) Departament of Patology – FMVZ-USP, São Paulo, Brazil ;
(3) Veterinary Medicine School of Universidade Anhanguera, São Paulo, Brazil;
(4) Alberto Löfgren State Park – Horto Florestal, São Paulo, Brazil;
(5) Laboratory of Zoonosis and Vector-borne Diseases – CCZ, São Paulo, Brazil;
(6) Laboratory of Identification and Research of Synanthropic Fauna – CCZ, São Paulo, Brazil;
(7) Nucleus of Pathogenic Fungi – Laboratory of Preventive Veterinary Medicine – UnicSul, São Paulo, Brazil.
E-mail : [email protected]
BACKGROUND: Capybara (Hydrochoerus hydrochaeris), Caviidae family, is the largest living rodent in
the world, widely distributed in Brazil and responsible for the transmission of macular fever (Rickettsia
rickettsii) by the vector Amblyomma cajennense. In 1991, a couple of capybaras were found at Park Alberto
Löfgren (PEAL). The population of these animals has risen to 63 in 2006. OBJECTIVE: Assess the
health of the capybaras as well as the prevention of zoonotic and environmental impacts. METHODS
AND MATERIALS: 23 capybaras under physical and chemistry restraint, identified for biometric
registration and physiological parameters were submitted to collection of biological materials (stool,
rectal swab, hair, ectoparasites and peripheral blood for: blood count, biochemical tests and serology
for leishmaniosis, rabies, leptospirosis, Chagas disease and macular fever) and also preventative
worming. RESULTS AND DISCUSSION: Parasitological tests results were positive for Protozoophaga
sp (11/23), Strongyloides spp (2 / 23) and Vionella spp (6 / 23), considered normal microbiota. Amblyomma
cajennense and Amblyomma dubitatum free of Rickettsia rickettsii were identified. Blood count showed
anemia, leukopenia and marked eosinophilia in 100% of animals. Serological tests were negative.
Dermatophyte fungi were not isolated but, just opportunistic molds (Cladosporidium sp (25%),
Penicillium sp (30%), Acremonium sp (22%)) and yeasts (Candida spp. (20%) and Rodothorula sp
(4%)). CONCLUSION: The animals proved to be free of zoonotic infections, but preventive
measures should be adopted to prevent the proliferation of these animals, avoiding the emergence of
diseases and devastation of the park plant. ACKNOWLEDGEMENTS: Dr. Ana Lúcia Arromba,
head of Horto Florestal and the whole crew who helped us to conclude our research, especially Mr.
Hugo da Fonseca Alves Pereira.
REFERENCES
1. Costa., D.S.; Paula., T.A.R.; Fonseca., C.C.; Neves., M.T.D., 2002 Reprodução de Capivaras, Arq.
ciên. Vet. Zool. UNIPAR, vol. 5, (1), p. 111-118.
2. Pereira., H.F.A.; Eston., M.R., 2007 Biologia e manejo de capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) no
parque estadual Alberto Löfgren, São Paulo, Brasil, Ver. Inst. Flor., São Paulo, v. 19 (1), p. 55-64.
PERFIL ANATOMOPATOLÓGICO DE CÃES DA RAÇA BEAGLE
Castro, S.O. 1,2; Taricano, I.D.1; Maiorka, P. 2
Instituto de Educação para Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico Royal - Instituto Royal, 2 Faculdade de Medicina
Veterinária – FMVZ – VPT- Universidade de São Paulo E-E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: A utilização dos cães em estudos toxicológicos deve acontecer de
forma criteriosa tanto na quantidade como na qualidade da saúde, como preconiza da Lei Nº 11.794 de
08 de outuro de 2008, que estabelece procedimentos para o uso científico de animais [4] [1]. Os animais
devem ser saudáves, ter peso e idades adequadas ao experimento [1][3]. Na maioria dos estudos de
toxicidade pede-se avaliações hematológicas, bioquímicas e antomopatológicas, sendo que a padronizão
dos principais parâmetros traz segurança aos resultados experimentais, redução do número de animais
[5] e bem-estar animal[6]. O objetivo deste estudo será avaliar o perfil
dos cães a partir do
levantamento de dados referentes a exames laboratoriais bioquímicos, hematológicos e
anatomopatológicos realizados no ano de 2009, no Laboratório de Análises Clínicas do Instituto de
Educação para Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico Royal - Labtox, e promover discussão sobre a
necessidade de uma padronização de cães destinados a testes toxicológicos. MÉTODOS: Os dados
foram coletados em 2009 no Labtox. Foram utilizados 38 cães Beagle com idades entre 4 e 14 meses
objetivando experimentos científicos. Os dados da Patologia formam adquiridos de cães que foram
utilizados como grupo controle de estudos em toxicologia. Foi realizada tabulação de dados obtidos
para cálculos de média, desvio padrão, valor máximo e mínimo de cada determinação.
RESULTADOS: Os resultados estão em fase de avaliação. CONCLUSÃO: Os resultados estão
sendo avaliados. AGRADECIMENTOS: Agradeço a equipe do Instituto Royal, especialmente Dra.
Ingrid Dragan Taricano, pela gentileza de ceder os dados para avaliação desta padronização. Ao meu
orientador Prof.Dr. Paulo César Maoirka que deposita confiança em meu trabalho, e minha família que
apoia meu ideais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1]ANVISA. Guia para condução de estudos não clínicos de segurança necessários ao desenvolvimento de medicamentos.
01/03/2010.
[2]CCAC.
Canadian
Council
on
Animal
Care.
Annual
Report.
2009-2010.
Consulta
em:
29/09/2010.
http://www.ccac.ca/en/About_CCAC/About_CCAC_Main.htm.
[3]KA.L.Environmental Enrichment of Nonhuman Primates, Dogs and Rabbits Used in Toxicology Studies. Toxicologic
Pathology 31:1, 132-137.2003.
1
[4]Lei Nº 11.794. Inciso VII do§ 1º do art. 255 da Constitutição Federal. 08/10/ 2008.
[5]RUSSEL, W.M.S.; BURCH, R.L. The principles of humane experimental technique. Consulta: 29/09/2010.
http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc
[6]The Welfare of Dogs Animal Welfare. Volume 4, 161-177, DOI: 10.1007/978-1-4020-4362-8_9 Bayne.2006.
IMUNOMARCAÇÃO DE METALOPROTEINASES E SEUS RESPECTIVOS
INIBIDORES TECIDUAIS COMO POTENCIAIS INDICADORES PROGNÓSTICOS
PARA MASTOCITOMAS CUTÂNEOS CANINOS
Pulz, L.H.1; Kleeb, S.R.2; Xavier, J.G.2,3; Catão-Dias, J.L.1; Luvizotto, M.C.R.4; Fukumasu, H.5;
Strefezzi, R.F.5
1 Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP;
2 Universidade Metodista de São Paulo; 3 Universidade Paulista;
4 Setor de Patologia, Curso de Medicina Veterinária da UNESP-Araçatuba;
5 Curso de Medicina Veterinária, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Representando entre 11 e 27% de todas as neoplasias malignas
cutâneas caninas, os mastocitomas são tumores de difícil tratamento e de prognóstico reservado a
sombrio. Apresentam características macroscópicas diversas, o que dificulta previsões sobre seu
comportamento. As Metaloproteinases de Matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas envolvidas na
remodelação do colágeno cicatricial e neovascularização durante a reparação tecidual. Seu envolvimento
com a invasão tumoral e estabelecimento de metástases tem sido investigado e demonstrado em
diversas neoplasias humanas. Também são considerados importantes os Inibidores Teciduais de
Metaloproteinases (TIMPs). Dois deles, TIMP-1 e TIMP-2, interferem com as atividades das
metaloproteinases 9 e 2, respectivamente, e têm sido relacionados à inibição de invasão e metástases. O
objetivo deste trabalho consiste nas determinações imuno-histoquímicas das MMPs 2 e 9, bem como
de seus respectivos inibidores (TIMP-2 e TIMP-1) em mastocitomas cutâneos caninos. Busca-se
detectar possíveis relações entre as expressões destas proteínas, além de compará-las à graduação
histopatológica e à evolução clínica dos casos verificando sua capacidade indicadores do
comportamento biológico desta neoplasia.
MÉTODOS: Serão utilizados casos de mastocitomas provenientes dos arquivos de histopatologia das
Instituições colaboradoras. Novos casos desta neoplasia também poderão ser incluídos, sendo
descartados os casos sob tratamento radio ou quimioterápico. Os mastocitomas serão classificados
histologicamente [1] e as marcações imunohistoquímicas serão realizadas com os anticorpos primários
para MMP-2 , MMP-9 , TIMP-1 e TIMP-2. As mesmas serão quantificadas determinando-se a
porcentagem de células positivas para cada marcador, contadas em 5 campos de marcação intensa (“hot
spots”) à objetiva de 40 aumentos. A análise estatística será realizada com auxílio do software
GraphPad Prism® com α = 5%. RESULTADOS ESPERADOS: Considerando-se o envolvimento
das enzimas estudadas na expansão e disseminação tumorais, espera-se encontrar correlação positiva
entre as marcações para MMPs e os graus histopatológicos e mortalidade, e negativa para o tempo de
sobrevida, bem como o inverso para as TIMPs.
PNEUMOPATIAS EM NEONATOS DE SAGUIS MANTIDOS EM CATIVEIRO
Maria Eugenia Carretero, Lilian Rose Marques de Sá
Laboratório de Gastroenterologia Experimental e Comparada, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
de São Paulo, São Paulo, Brasil
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO e OBJETIVO: A venda de animais silvestres legalizados pelo IBAMA representam
um mercado crescente. Em particular, a comercialização predominante é dos infantes cuja taxa de
mortalidade varia entre 12 a 25% principalmente devido a pneumopatias. Assim, o objetivo deste
trabalho é caracterizar as pneumopatias que acometem infantes I estágio 1 e estágio 2 pertencentes às
espécies saguis-de-tufos-brancos ou STB (Callithrix jacchus), saguis-de-tufos-pretos ou STP (Callithrix
penicillata) e sagüis híbridos ou SH (Callithrix spp.) nascidos em cativeiro. MATERIAIS E
MÉTODOS: Foram estudados 13 neonatos de STB (sete fêmeas, cinco machos e um indeterminado),
12 neonatos STP (oito fêmeas, três machos e um indeterminado) e 11 SH (sete fêmeas e quatro
machos), com até 28 dias de vida, nascidos em criador comercial no período de outubro de 2007 a
outubro de 2008. As necropsias e exame para microscopia de luz foram realizadas segundo a técnica de
Rokitansky. RESULTADOS: Os 36 neonatos eram representativos da população total no criadouro (p
= 0,1067) e, também das espécies estudadas STB (p =0,0531), STP (p =0,0501) e SH (p=0,1931),
respectivamente. Os 36 animais foram divididos segundo os estágios 1 (um a 14 dias de vida) e o
estágio 2 (15 a 28 dias de vida). Não houve amostras suficientes do estágio 2 para correlações
estatísticas. As pneumopatias foram observadas em 12 casos dos 36 neonatos analisados. Houve
diferença estatística para as causas de morte por pneumopatia dos SH em relação aos STB e STP,
respectivamente p =0,0106 e p =0,0162. A idade média para óbito devido às pneumopatias foram de 14
dias e, no inverno houve maior frequência das pneumopatias. Macroscopicamente, os pulmões estão
avermelhados com impressão negativa do gradil costal e fluido esbranquiçado seroso aerado nas vias
aéreas. Microscopicamente, observou-se a pneumonia aspirativa por conteúdo alimentar, atelectasia
adquirida e broncopneumonia. CONCLUSÕES: Os neonatos de STB, STP e SH nascidos em
cativeiro nos meses de inverno são acometidos por pneumonia aspirativa, atelectasia e
broncopneumonia que ocasionam colapso respiratório durante os primeiros 14 dias de idade.
Acreditamos que falhas no manejo são os principais fatores para ocasionar as pneumopatias.
AGRADECIMENTOS: Criadouro A.J.B.; FAPESP: 2008/03229-0 e 2006/56993-4.
COLIBACILOSE EM FRANGOS DE CORTE- RELATO DE CASO
Moraes, M. E; Pereira, G. B. A.; Santanter, S. H.; Silva, J. I. G.; Astolfi-Ferreira, C. S.; Ferreira, A. J. P
Programa de Patologia Experimental e Comparada da FMVZ/ USP
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: Escherichia coli é importante em avicultura por causar queda de
produtividade, danos à carcaça, redução de peso e por agravar algumas infecções primárias. O objetivo
do trabalho foi descrever a ocorrência de colibacilose em pintinhos que foram alojados para um
experimento e determinar o perfil aos antimicrobianos das amostras isoladas. MÉTODOS: Pintinhos
de corte com um dia de idade, provenientes de incubatório comercial, foram alojados no aviário da
FMVZ – USP, para a realização de um expeimento, em julho de 2011.Como as aves apresentaram
mortalidade acima do esperado, realizou-se a necropsia de todas as aves mortas e o cultivo de fígado,
pulmão, coração, cérebro ou saco da gema em BHI e posteriormente em ágar MacConkey. Quando
havia colônias sugestivas de Escherichia coli esta era submetida a séria bioquímica para a identificação.
Antimicrobianos (n=11) foram usados para testar as nove amostras de Escherichia coli. RESULTADOS:
A mortalidade foi verificada desde o segundo dia de experimento. As aves apresentaram diarréia,
onfalite, prostração e à necropsia havia perihepatite, pneumonia, pericardite e aerosaculite, esses sinais
se tornaram mais intensos no decorrer dos dias. Isolou-se apenas E. coli de cinco amostras de fígado
(F1, F2, F3, F4 e F5), uma de cérebro (Ce), uma de saco da gema (Sa), uma de pulmão (Pu) e uma de
coração (Co).
Todas as amostras foram sensíveis ao cloranfenicol, tetraciclina, doxiciclina,
enrofloxacina, norfloxacina, ampicilina e ciprofloxacina. Houve suscetibilidade
intermediária ao
ceftiofur (Ce, F4, F5, Pu e Sa), estreptomicina (F3, F4, Pu, Co e Sa), amicacina (F5) e cefalexina (Sa).
Determinou-se mortalidade de 22,35% (38/170) aos sete dias. Embora E.coli seja considerado um
agente secundário a outras infecções, neste caso foi o agente primário capaz de causar lesões severas,
inclusive sepse, e mortalidade significativa devido à alta patogenicidade desta cepa apresentou
sensibilidade a maioria dos antibióticos testados. Assim, é sugerido que a patogenicidade bacteriana seja
inversamente proporcional à resistência aos antimicrobianos. É importante ressaltar a importância do
manejo sanitário no incubatório e de reprodutoras. CONCLUSÕES: Os pintinhos de corte
apresentavam colibacilose e nenhuma amostra isolada apresentou resistência aos antimicrobianos
testados.
FIBROMA CUTÂNEO EM UMA TARTARUGA MORDEDORA (CHELYDRA
SERPENTINA) EM CATIVEIRO
Omar Gonzales-Viera1*, Gustavo Bauer1, Luciana S. Aguiar2, Luciana T. Brito2,
José L. Catão-Dias1
1Laboratorio
de Patologia Comparada de Animais Selvagens (LAPCOM), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo;
2Laboratorio
de Imuno-histoquímica, Divisão de Patologia, Instituto Adolfo Lutz
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: Os fibromas são neoplasias mesenquimais benignas, conformado
por tecido conjuntivo fibroso. Esta neoplasia é ocasionalmente observada em répteis e rara em
tartarugas. O objetivo deste estudo foi relatar um fibroma cutâneo em uma tartaruga mordedora
mantida em cativeiro. MATERIAL E MÉTODOS: O animal foi uma fêmea, adulta, a qual
apresentava uma massa pedunculada com superfície descamada de aproximadamente 3.5 cm de
comprimento e 1.5 cm de largura na região palmar do membro torácico direito. A massa foi
completamente retirada mediante cirurgia e fixada em formol tamponado a 10%, depois o fragmento
foi cortado longitudinalmente observando-se, na superfície de corte, um tecido esbranquiçado,
brilhante, mole e pouco vascularizado. Os fragmentos foram incluídos em parafina, cortados a 3 µm e
corados com Hematoxilina e Eosina (HE), Tricromico de Masson (TM) e Azul Alciano (AA). A
Imuno-histoquímica foi realizada pela técnica do polímero conjugado com anticorpo secundário, a
recuperação antigênica foi mediante calor úmido com tampão Tris-EDTA (pH 9.0), visualizado com 33´diaminobenzidina e contra-corados com Hematoxilina de Harris, os marcadores utilizados foram
vimentina e desmina, em um título de 1:100 e 1:50 respectivamente. RESULTADOS E
CONCLUSÃO: Microscopicamente foram observadas células fusiformes com dois ou três núcleos
embebidos em uma matriz formada por abundante tecido conjuntivo, a qual foi positiva para colágeno
(TM) e negativa para mucopolissacarídeos (AA). A imuno-histoquimica deu positividade citoplasmática
das células fusiformes para vimentina, enquanto foi negativa para desmina. Segundo o estudo
macroscópico, histológico, histoquímico e imuno-histoquímico a massa foi diagnosticada como
fibroma cutâneo palmar no membro torácico direito. Para os autores este é o primeiro relato deste tipo
de neoplasia em uma tartaruga mordedora em cativeiro.
PRIMARY URINARY BLADDER HEMANGIOSARCOMA IN A CAPTIVE SADDLEBACK
TAMARIN (Saguinus fuscicollis)
Omar Gonzales-Viera1*, Tatiana Quevedo2, Alfonso Chavera3, Rosa Perales3,
Cristina T Kanamura4 e José L Catão-Dias1
1Laboratório
de Patologia Comparada de Animais Selvagens (LAPCOM), Departamento de Patologia (VPT), Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade de São Paulo (USP)
2Patronato
3Facultad
del Parque de las Leyendas (PATPAL), Lima, Perú
de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima, Perú
4Departamento
de Patologia, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil.
E-mail: [email protected]
INTRODUCTION: An adult male captive saddleback tamarin (Saguinus fuscicollis) was found dead
without clinical signs before. RESULTS: At necropsy, the main finding was bloody urine, reddish
mucosa and marked thickening of the folds and wall of urinary bladder. Additionally, there were
observed multiple hemorrhagic areas in the kidneys and in the subepicardial myocardial tissue. Tissue
samples were fixed in 10% formalin and then they were taken to the Laboratory for histological and
immunohistochemical examination. Microscopically, transepithelial bleeding was seen in urinary
bladder mucosa while the submucosa had multiple spindle cells with anisocytosis, anisokaryosis, two or
three cores with multiple nucleoli, scant and in some cases foamy cytoplasm. Atypical mitotic figures
were rarely seen. These spindle cells formed irregular vascular spaces that were filled and surrounded by
several erythrocytes with a marked suppurative inflammatory infiltrate. No other tissues were affected
by the neoplastic cells. Immunohistochemistry was performed and the endothelial cells did not have
affinitive for Anti-CD31 or CD34; however, others antibodies as Factor VIII will be tested to get a
positive reaction. Based in gross and histological examination, urinary bladder hemangiosarcoma was
diagnosed. CONCLUSION: This neoplasm has not been previously reported in a nonhuman primate.
AVALIAÇÃO DOS PRIMATAS NEOTROPICAIS DA GRANDE SÃO PAULO COMO
BIOMONITORES DA POLUIÇÃO POR CHUMBO, MERCÚRIO E CÁDMIO: ESTUDO
MULTIDISCIPLINAR
Carretero, M. E.1,Nardi, A. F.1, Quináglia, G.2,Sá, L. R. M.1.
1Laboratorio
de Gastroenterologia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo;
2Laboratório de Análises Toxicológicas, CETESB
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A Grande São Paulo é a terceira maior aglomeração urbana do
mundo com intensa atividade industrial e tráfego de veículos que contribuem para o acúmulo de
poluentes no ambiente. Estudos têm demonstrado que a poluição ambiental é um fator de risco para a
saúde humana. Assim, diversos países tentam adequar medidas de proteção à saúde humana e de
sustentabilidade ambiental utilizando o biomonitoramento. Na Grande São Paulo há áreas
remanescentes de Mata Atlântica que são habitats de primatas neotropicais, os quais podem ser
utilizados como biomonitores pela proximidade filogenética com o homem e nos casos dos sagüis, por
serem semi-domiciliados, refletem com maior realidade a exposição humana aos poluentes. O objetivo
deste projeto é determinar os níveis de chumbo, mercúrio e cádmio no tecido hepático dos primatas
neotropicais procedentes da Grande São Paulo e, correlacionar esses metais com as afecções que os
acometem. MATERIAIS E MÉTODOS: Serão estudados machos e fêmeas de 20 saguis-de-tufosbrancos (Callithrix jacchus), 20 saguis-de-tufos-preto (Callithrix penicillata), de 10 saguis híbrido
(Callithrixspp.) e de 20 bugios ruivos (Alouatta guariba clamitans) de vida livre encaminhados pelos Parque
Ecológico do Tietê (PET) e Parque Ibirapuera (PI) durante o período de julho de 2011 a julho de 2012.
Serão realizados estudos clinico e epidemiológico referentes a identificação individual e tempo médio
de duração dos sinais clínicos observados; estudo anatomopatológico segundo técnica padrão para
mamíferos não ruminantes; estudo para análise de danos em DNA pela técnica do Cometa; estudo de
quantificação de chumbo, mercúrio e cádmio em tecido hepático e na água dos parques segundo
normas da U.S. EPA a ser realizado pela CETESB. RESULTADOS: Foram necropsiados um C. jacchus
(machos) e quatro Callithrix sp (fêmeas). A qualidade das águas doce de ambos os parques para o
parâmetro de metais pesados é classe I. As demais análises estão em andamento. CONCLUSÃO: Os
resultados obtidos no projeto possibilitarão o levantamento de dados sobre a qualidade do meio
ambiente a qual estamos inseridos, podendo futuramente contribuir no estabelecimento de políticas de
melhoria ambiental que poderá beneficiar a todos. AGRADECIMENTOS: Aos médicos veterinários
e biólogos do Parque Ibirapuera e Parque Ecológico do Tietê, e ao Cnpq.
ESTUDO DAS ALTERAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS DE CORUJAS-ORELHUDAS
(RHINOPTYNX CLAMATOR) QUE HABITAM ECOSSISTEMA POLUÍDO POR
CHUMBO DA GRANDE SÃO PAULO
Lívia Chimati Fatini, Maria Eugenia Carretero, Lilian Rose Marques de Sá
Laboratório de Gastroenterologia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia, FMVZ-USP
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: As aves de rapina, como a coruja-orelhuda (Rhinoptynx clamator),
são ótimos biomonitores para os efeitos causados pelos metais como chumbo e mercúrio, por estarem
no topo da cadeia trófica. A determinação das causas de morte e dos processos mórbidos de corujasorelhudas de vida livre geram informações importantes para a elaboração de protocolos zoossanitários
e manutenção das espécies e, por fim, da sustentabilidade ambiental. Sendo assim, é relevante verificar a
correlação entre os poluentes liberados pelas atividades do homem com potenciais danos teciduais, os
metais pesados, que possam levar a manifestações mórbidas em animais de vida livre. O objetivo geral
deste projeto é, portanto, determinar os níveis de chumbo no fígado de corujas-orelhudas (Rhinoptynx
clamator) e correlacionar esse metal com o estresse oxidativo e com as afecções que acometem as corujas
de vida livre em ecossistema poluído na Grande São Paulo. MÉTODOS: Serão estudadas corujasorelhudas (R. clamator), machos e fêmeas, jovens e adultos, provenientes do Parque Ecológico do Tietê
(PET) que vieram à óbito natural durante o período de julho de 2011 a julho de 2012. As carcaças serão
conservadas refrigeradas até o momento dos exames. Para a determinação e caracterização da causa de
morte serão associados os dados clínicos e epidemiológicos; a avaliação macro e microscópicos;
avaliação dos danos de DNA, através do teste Cometa; e a concentração do metal chumbo, pela leitura
por espectometria de absorção atômica em forno de grafite. RESULTADOS: Já foram realizadas 8
necropsias, sendo que quatro delas apresentam trauma como moléstia principal e foi realizada a
eutanásia em 7. Até o presente momento as demais análises estão em andamento. CONCLUSÃO: Os
resultados obtidos no projeto possibilitarão o levantamento de dados sobre a qualidade do meio
ambiente a qual estamos inseridos, evidenciando se o ambiente está poluído e desequilibrado, o que
pode gerar enfermidades nos animais que o habitam, para conscientizar a população e as autoridades
competentes, que poderão futuramente gerar políticas de melhoria ambiental, beneficiando a todos.
AGRADECIMENTOS: aos médicos veterinários e biólogos do Parques Ecológico do Tietê e ao
CNPq.
ESTUDO DA CORRELAÇÃO ENTRE POLUIÇÃO AMBIENTAL POR CHUMBO E
AFECÇÕES PULMONARES EM PRIMATAS NEOTROPICAIS DE VIDA LIVRE NA
GRANDE SÃO PAULO
Nardi, A. F.1, Carretero, M. E.1, Sá, L. R. M.1.
1Laboratorio
de Gastroenterologia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: Nos centros urbano-industriais os estudos sobre a poluição
ambiental evidenciam que é um fator de risco para a saúde humana. Devido à importância na saúde
pública, diversos países tentam adequar medidas de proteção e de sustentabilidade ambiental utilizando
o biomonitoramento. Especialmente em São Paulo há áreas remanescentes de Mata Atlântica que são
habitats de primatas neotropicais, os quais podem ser utilizados como biomonitores pela proximidade
filogenética com o homem e nos casos dos sagüis, por serem semi-domiciliados, refletem com maior
realidade a exposição humana aos poluentes. O objetivo deste projeto é determinar os níveis de
chumbo nos pulmões e estudar as afecções pulmonares que acometem primatas neotropicais que
habitam o ecossistema poluído da grande São Paulo, podendo criar subsídios para aplicação de políticas
públicas em benefício à saúde humana e a conservação do meio ambiente. MATERIAIS E
MÉTODOS: Serão estudados machos e fêmeas de 20 saguis-de-tufos-brancos (Callithrix jacchus), 20
saguis-de-tufos-preto (Callithrix penicillata), de 10 saguis híbrido (Callithrix spp.) e de 20 bugios ruivos
(Alouatta guariba clamitans) procedentes do Parque Ecológico do Tietê (PET) e Parque Ibirapuera (PI) na
Grande São Paulo durante o período de julho de 2011 a julho de 2012. Serão realizados estudos clínico
e epidemiológico a partir dos dados das fichas clínicas individualizadas; estudo anatomopatológico,
sendo realizada a coleta de fragmentos de órgãos e fixados em formol 10% para posterior exame
microscópico e, quantificação de chumbo em tecido pulmonar por espectroscopia por energia
dispersiva dos raios-x (EDX) em parceria com o Laboratório de Poluição Atmosférica (LIM-05) da
Faculdade de Medicina da USP. RESULTADOS: Foram necropsiados um C. jacchus (macho), quatro
Callithrix sp (fêmeas) e coletado amostras para as demais análises que estão em andamento.
CONCLUSÃO: Os resultados obtidos no projeto possibilitarão o levantamento de dados sobre a
qualidade do meio ambiente a qual estamos inseridos, evidenciando se o ambiente está poluído e
desequilibrado podendo futuramente conscientizar a população e as autoridades competentes para
geração de políticas de melhoria ambiental, beneficiando a todos. AGRADECIMENTOS: Ao Parques
Ibirapuera e Ecológico do Tietê e aos técnicos do Laboratório de Poluição Atmosférica (LIM-5) da
FMUSP.
VARIAÇÃO DE VALORES HEMATOLEUCOCITÁRIOS DE CYPRINUS CARPIO
(LINEAUS, 1752), EM RELAÇÃO A DUAS RAÇÕES DIFERENTES E USO DE ÓLEO DE
CRAVO COMO ANESTÉSICO, SÃO PAULO, SP, BRASIL
Viadanna, P.H.O.1; Farias, T.V.2; Sakabe, R.2; Pilarski, F.2; Matushima, E.R.3
1Pós-graduando
do Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada, Laboratório de Patologia
Comparada de Animais Silvestres, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP
2CAUNESP,
3 USP,
Departamento de Ictiopatologia, Jaboticabal, SP.
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Patologia, São Paulo, SP.
Email [email protected]
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: O aquarismo é uma atividade mundialmente difundida, que, pela
via legal gera segundo a FAO (1996-2005) renda direta de aproximadamente US $ 278 milhões e para a
indústria aquarista, algo em torno de US$ 1.000 milhão (CATO e BROWN 2003). A necessidade
relacionar a nutrição com os parâmetros hematológicos de carpa comum motivou essa pesquisa, onde
duas rações contendo 40% de proteína bruta e outra com 28% de proteína bruta foram fornecidas aos
peixes por três meses. Após administração das dietas, foram realizadas colheitas sanguíneas seriadas no
período de maio a setembro de 2011, no Departamento de Patologia, da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, para avaliar o nível de arraçoamento mais
adequados para carpas adultas. Também foi realizado o mesmo procedimento após anestesia com
eugenol. MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizadas cinco carpas adultas, mantidas em tanque de
500L. Foram feitas duas coletas de sangue , em julho e maio sem anestésico, e duas no mês de
setembro, utilizando o eugenol, na diluição de 50mg/L. Outro fator analisado nesse trabalho, foi a
relação nutrição-hematologia, onde as três primeiras coletas foram referentes à ração com 40% de
proteína bruta (PB) e a quarta coleta a ração com 28% de PB. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os
resultados demonstraram que não houve diferença significativa com relação aos valores
hematimétricos, quando comparou-se carpas com ou sem anestesia, e carpas alimentadas com ração
contendo 40% PB e 28,05% PB. Contudo, foi observada diferença significativa em relação aos valores
leucocitários, onde os peixes anestesiados apresentaram valores mais elevados, e os resultados foram:
Maio, média de 20.500±3.500 leucócitos; Julho, média de 18.667±9.019; Setembro, média de 26.500 ±
7.882, e Setembro, média de 35.375±6.047. Carpas nutridas com ração contendo 28%PB e anestesiadas
com óleo de cravo obtiveram uma média leucócitos maiores que os demais grupos testados (média de
35.375 leucócitos). CONCLUSÃO: Com relação ao nível de proteína bruta na dieta, concluímos que a
ração com 28,05% é melhor para carpas adultas, do que a ração de 40%, tendo em vista o aumento de
leucócitos circulantes, e que, em relação as dietas não foram encontras diferenças significativas no
número de leucócitos, somente o óleo de cravo afetou este parâmetro.
APRESENTAÇÕES ORAIS
EXPOSIÇÃO PERINATAL AO GLIFOSATO-ROUNDUP® NO DESENVOLVIMENTO
FÍSICO E COMPORTAMENTAL DA PROLE DE RATOS NA INFÂNCIA E EM
PARÂMETROS SEXUAIS DA PROLE MASCULINA DE RATOS OBSERVADOS NA
IDADE ADULTA
Ricci, E.L.; Paiva, A.S.; Bernardi, M.M.; Spinosa, H.S.
Universidade de São Paulo, Universidade Presbiteriana Mackenzie
RESUMO
O glifosato é um herbicida de amplo espectro, sistêmico pós-emergente e não seletivo largamente
utilizado na produção agrícola. É considerado um dos maiores poluidores de rios e águas de superfície
e sua presença na cadeia alimentar aponta para a possibilidade da contaminação não só de animais,
como de seres humanos. Vários trabalhos recentes sugerem que este herbicida é um desregulador
endócrino. Recentemente, estudo de nosso grupo mostrou que a exposição de ratos púberes a este
herbicida alterou a morfologia testicular e reduziu os níveis de testosterona plasmática. Nossa hipótese
é que a exposição perinatal ao herbicida no período de diferenciação sexual do cérebro de ratos possa
alterar o desenvolvimento físico e comportamental da prole de ratos na infância e parâmetros sexuais
na idade adulta. Para tanto, ratas prenhes receberam o herbicida na dose de 50mg/kg do 150 ao 210 dias
da gestação e até o 70 dia da lactação. Foram estudados, as proles feminina e masculina de ratas, o seu
desenvolvimento físico e comportamental na infância e o comportamento sexual de machos na idade
adulta. Na dose de 50mg/kg não houve qualquer tipo de alteração no peso materno, no peso dos
filhotes, no desenvolvimento físico, sexual e comportamental da prole , ou seja, nesta dose não houve
efeito reprodutivo de longo prazo.
INTRODUÇÃO
Na atualidade a produção e disseminação de substâncias químicas no ambiente aumentam de
maneira geométrica e tanto animais como os homens estão expostos diariamente a muitas destas
substâncias e seus metabólitos. Estas substâncias químicas agem como misturas tendo efeitos
compensatórios, sinergistas e multiplicativos. Entre estas substâncias está o glifosato [N(fosfonometil)glicina], um herbicida sistêmico,pós-emergente e não seletivo largamente utilizado na
agricultura, representando cerca de 30% do mercado mundial de herbicidas não seletivos, registrado em
mais de 130 países e considerado um dos maiores poluentes de rios e águas de superfície. O glifosato
pertence ao grupo químico dos aminoácidos fosfonados e seu modo de ação consiste na alteração de
processos bioquímicos vitais nas plantas, como a biosíntese de aminoácidos, proteínas e ácidos
nucléicos. Este herbicida é absorvido pelo tecido vivo e translocado, via floema, através da planta para
raízes e rizomas, e sua ação inibe enzimas específicas como a enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintase
(EPSP) suspendendo a síntese de aminoácidos aromáticos. As plantas tratadas com glifosato morrem
lentamente, em poucos dias ou semanas, e devido ao transporte por todo o sistema, nenhuma parte da
planta sobrevive. Em condições normais, a enzima EPSP catalisa, na planta, a reação que envolve a
transferência do enolpiruvil do fosfoenolpiruvato (PEP) para o shikimato-3-fosfato (S3P), formando 5enolpiruvil shikimato-3-fosfato (EPSP) e fosfato inorgânico (Pi). O glifosato forma um complexo
ternário estável com a enzima EPSP sintase e S3P (EPSPS3P-glifosato). Esse provável complexo
ternário representa a forma atualmente aceita como responsável pela atividade do herbicida.
O glifosato apresenta elevada eficiência na eliminação de ervas daninhas sendo é indicado no
controle de ervas daninhas anuais e perenes, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, em culturas de arroz
irrigado, cana-de-açúcar, café, citros, maçã, milho, pastagens, soja (plantio direto ou indireto), fumo,
uva e soqueira em cana-de-açúcar, nas culturas de ameixa, banana, cacau, nectarina, pêra, pêssego,
seringueira e plantio direto do algodão.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO), o DL50 oral em ratos do glifosato
puro é de 4.230 mg/kg. Esta toxicidade baixa é atribuída ao mecanismo de ação tóxica do glifosato ser
exclusivo de plantas, pois o caminho metabólico em que ele age (mecanismo do ácido "shikimico") só
ocorre em plantas e em alguns microorganismos mais complexos. A dose diária aceitável por massa
corpórea deste composto é relativamente baixa (ADI = 0,05 mg.Kg-1.d-1). Os estudos crônicos orais
não mostraram perda de peso, efeitos ao sangue e pâncreas ou, ainda, evidência de carcinogenicidade
nos seres humanos. No entanto, estudos feitos com ratos demonstraram perda de peso, descarga nasal
e morte de matrizes grávidas, além de desordens digestivas [1]
Frente aos efeitos desreguladores em endócrinos do glifosato e a ausência de estudos dos
efeitos m longo prazo da exposição perinatal ao glifosato este trabalho teve como objetivo a
investigação dos efeitos em longo prazo da exposição perinatal ao glifosato em parâmetros
reprodutivos e bioquímicos da prole de ratos.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Foram utilizados ratos Wistar, fêmeas e machos adultos, obtidos do biotério do Departamento
de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária (FMVZ). Água e comida foram fornecidas ad libitum
aos animais durante todo procedimento experimental.
Drogas
Foram utilizadas as seguintes drogas: 17 β – Estradiol (SIGMA); Progesterona (SIGMA);
Roundup Transorb® (Monsanto Co., St. Louis, MO) cuja composição é de 648 g/L de sal de
isopropilamina de glifosato, 480 g/L de equivalente ácido de N-fosfonometilglicina (glifosato) e 594
g/L de ingredientes inertes.
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
As ratas prenhes receberam o herbicida dos 150 aos 210 dias da gestação e até o 70 dia da
lactação.
Este período de tratamento foi escolhido por abranger o período de determinação e
organização sexual do cérebro em ratos[2,3,4].
As fêmeas prenhes foram pesadas no GD 0, GD 7, GD 14 e GD 21. Durante o período de gestão foi
avaliado também o consumo de água e de ração. Após o nascimento dos filhotes, os mesmos foram
pesados a cada dois dias e foram submetidos avaliação do desenvolvimento físico (peso, abertura dos
olhos, erupção dos dentes incisivos e desdobramento da orelha, decida dos testículos, abertura vaginal),
reflexológico (preensão palmar, endireitamento, sobressalto, geotaxia negativa e andar adulto) e
comportamental (teste de campo aberto).
A idade adulta os machos foram avaliado quanto ao seu comportamento sexual (latência para
primeira monta, latência para primeira intromissão, latência para primeira ejaculação, número de
montas, primeira ejaculação, número total de ejaculações em 40mim.
RESULTADOS
As figuras 1-2 apresentam os resultados para o desenvolvimentos reflexológico e sexual da prole
de ratas expostas prenatalmente a 50 mg/Kg de glifosato. A análise estatística não indicou a existência
de diferenças significantes entre os dados do grupo experimental em relação àqueles do grupo controle.
Assim como o desenvolvimento físico, motor e peso materno também não apresentaram diferenças
significantes.
Fig.1. Avaliação do desenvolvimento reflexológico da prole de ratas tratadas com glifosato durante a
gestação. Teste t de Student
Latência para primeira monta
Latência para primeira intromissão
40
200
segundos
30
segundos
250
Controle
Experimental
20
150
100
10
50
0
0
Grupos
Grupos
Latência para primeira ejaculação
Número de montas após a primeira ejaculação
40
50
40
Média ± SEM
minutos
30
20
10
30
20
10
0
0
Grupos
Grupos
Número total de ejaculações em 40 minutos
Média ± SEM
60
40
20
0
Grupos
Fig.2. Avaliação do comportamento sexual dos filhotes machos de ratas tratadas prenatalmente com 50
mg/Kg de glifosato ou seu veículo. Teste t de Student.
CONCLUSÃO
Diante dos diversos trabalhos realizados com o herbicida, glifosato - Roundup Transorb e seus
grandes efeitos a natureza e aos seres humanos, utilizamos o estudo perinatal de ratas expostas ao
glifosato e pudemos determinar que na dose de 50mg/kg não houve qualquer tipo de alteração no peso
materno, no peso dos filhotes, no desenvolvimento físico, sexual e comportamental da prole , ou seja,
nesta dose não houve efeito reprodutivo de longo prazo. Sendo assim conforme Dallegrave [3] a devida
dose, 50mg/kg em ratas prenhes não causaram efeitos nas mães, mas ao contrário do que o mesmo
declara, também não demonstrou efeito na prole.
REFERÊNCIAS
[1] BERNARDI, M. M.;DE SOUZA, H.; PALERMO NETO, J. Effects of single and long-term haloperidol administration
on open field behavior of rats. Psychopharmacology (Berl), v.73, n.2, p.171-5. 1981.
[2] BATATINHA, M. J.;DE SOUZA-SPINOSA, H.; BERNARDI, M. M. Croton zehntneri: possible central nervous
system effects of the essential oil in rodents. J Ethnopharmacol, v.45, n.1, Jan, p.53-7. 1995.
[3] DALLEGRAVE E, MANTESE FD, OLIVEIRA RT, ANDRADE AJ, DALSENTER PR, LANGELOH A. Pre- and
postnatal toxicity of the commercial glyphosate formulation in Wistar rat. Arch Toxicol. 2007 Sep;81(9):665-73.
Epub 2007 Jul 19.
[4] WALSH, R. N.; CUMMINS, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychol Bull, v.83, n.3, May, p.482-504. 1976
[1] Bradberry et al., 2004).
USO DA PROTEÍNA VP22 COMO FERRAMENTA PARA INTERNALIZAR PROTEÍNAS
EM CÉLULAS TRONCO VISANDO SUA DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS
PRODUTORAS DE INSULINA
Gabanyi I1,2, Lojudice F.H.1,2, Kossugue P. M.1,2, Rebelato E3, Demasi M.A.1,2,
Sogayar M.C.1,2#
1Chemistry
Institute, University of São Paulo, Biochemistry Department,
São Paulo, Brazil.
2Cell
and Molecular Therapy Center (NUCEL), University of São Paulo,
São Paulo, Brazil.
3Biomedical
Sciences Institute, University of São Paulo, Physiology Department, São Paulo, SP, Brazil
RESUMO
O Diabetes Mellitus tipo I (DM1) é causado pela destruição autoimune das células β
pancreáticas, responsáveis pela produção e liberação de insulina. Uma das terapias utilizadas para o
tratamento do DM1 é o transplante de ilhotas pancreáticas, porem este não pode ser mais amplamente
utilizado dada, entre outros fatores, a falta de massa celular adequada para ser infundida no paciente.
Uma possível solução é o desenvolvimento de fontes alternativas de células produtoras de insulina, a
partir de células-tronco, que possuem a capacidade de se diferenciarem neste tipo celular.
O Pax4 é um dos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação de células β, sendo
essencial para o apropriado desenvolvimento e maturação destas, é capaz de induzir a diferenciação de
células-tronco em células produtoras de insulina in vitro. Para introduzir o Pax4 nas células-tronco, sem
provocar alterações no genoma das células diferenciadas, dados os potenciais efeitos indesejáveis de
vetores que se integram ao genoma, recorreu-se às proteínas contendo domínio de transdução (PTDs),
pequenas sequências peptídicas que permitem a translocação de proteínas através de membranas
celulares e sua internalização em células-alvo.
Uma das PTDs mais comumente estudadas é a VP22, produto do gene UL49 do Herpes
Simplex vírus tipo I. Testamos a capacidade de translocação da VP22 em células tronco utilizando a
proteína de fusão VP22.eGFP e construímos a proteína de fusão VP22.Pax4 permitindo a inserção do
Pax4 em células-tronco, possibilitando que este ative a transcrição de certos genes que aumentariam a
eficiência de diferenciação das células-tronco em células produtoras de insulina.
INTRODUÇÃO
O Diabetes Mellitus já afeta mais de 285 milhões de pessoas em todo o mundo. Dentre os
tipos mais conhecidos de Diabetes, está o do tipo I (DM1), que é causado pela destruição autoimune
das células β pancreáticas, prejudicando a liberação da insulina, levando à desregulação da glicemia
sanguínea.
Terapias utilizadas para tratar o DM1 são: reposição de insulina exógena, transplante de
pâncreas e de ilhotas pancreáticas, mas, infelizmente, nenhuma delas tem obtido êxito completo,
portanto, é de grande interesse pesquisas para o aprimoramento destas terapias. Um dos maiores
problemas em relação ao transplante de ilhotas pancreáticas é a falta de massa celular adequada para ser
infundida no paciente. Fontes alternativas de células produtoras de insulina estão sendo pesquisadas, a
capacidade de células-tronco se diferenciarem em células produtoras de insulina, já foi demonstrada
[3,6].
O gene Pax4, é um dos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação de células β, é
essencial para o desenvolvimento e a maturação destas células [7]. Já foi comprovada a capacidade do
Pax4 de induzir a diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina [3,5]. Trabalhos
com terapia gênica visam à obtenção de um grande número de células diferenciadas, sem que o genoma
destas seja alterado, dadas as possíveis consequências indesejáveis que alterações genômicas podem
acarretar. Uma alternativa para a solução destes problemas é a incorporação de proteínas com domínio
de transdução (PTDs), pequenas seqüências peptidicas que permitem a translocação de proteínas
através de membranas celulares com sua internalização em células-alvo [4].
Umas das PTDs mais comumente estudadas é a VP22, descrita como translocadora entre
células de mamíferos em cultura, ela é exportada para o meio de cultura e se insere nas células vizinhas.
Sendo capaz de transportar proteínas de uma célula para outra, é muito útil nos estudos de processos
celulares e moleculares [1]. Porém, a capacidade da VP22 de translocar proteínas em células tronco
ainda não foi verificada. Portanto, o objetivo deste trabalho é verificar se a capacidade de translocação
da VP22, verificada em diversos tipos celulares, também se aplica à células tronco. Com isso analisar se
a adição da proteína de fusão VP22.Pax4 poderia trazer alguma melhora para protocolos de
diferenciação de células tronco em células produtoras de insulina, visando o tratamento do DMI.
MATERIAL E MÉTODOS
Modelos celulares: USP4 células-tronco embrionárias de camundongo (mESC), célulastronco adultas de polpa dentaria (hDPSC) e linhagens celulares 293T e CHO.
Construção dos plasmídeos: Para construção do vetor pVP22.Pax4 o cDNA
correspondente ao Pax4 e o vetor pVP22 (Invitrogen) foram digeridos com as enzimas de restrição
EcoRI e NotI. Para construção do vetor pVP22.eGFP o eGFP foi subclonado a partir do
pLPCX.eGFP, clivado com HindIII assim como o pVP22. Após à digestão à 37˚C overnight, vetor e
inserto foram purificados e ligados pela ação da enzima T4 DNA ligase.
Transfecção transitória e estável: Utilizamos o kit LipofectAMINE 2000 (Invitrogen); os
vetores pVP22, pVP22.Pax4, pVP22.eGFP foram transfectados em células CHO para seleção de clones
estáveis e em 293T para obtenção de extratos proteicos.
Tratamento das células-tronco hDPSC e mESC com VP22.eGFP: O extrato proteico de
~6.106 células 293T era obtido 48h após sua transfecção com pVP22.eGFP ou pLPCX.eGFP, com
300µl do High Salt buffer, de acordo com o protocolo da Invitrogen. Cada lamínula, contendo as célulastronco, era colocada em uma câmara de perfusão aberta e tratada com uma mistura de 150µl do extrato
protéico e 150µl de Krebs sem NaCl e 11.2mM de glicose por 30min. A lamínula era lavada com Krebs
e incubada com DAPI 1:10 em Krebs por 10min. Ao final ela era lavada novamente e mantida em
Krebs 24mM de glicose para análise no microscópio confocal Zeiss LSM 510, (488nm para o eGFP e
350nm para o DAPI), em uma câmara de perfusão aberta.
Diferenciação de mESC em células produtoras de insulina: O protocolo utilizado foi o
proposto pela doutoranda Patrícia M. Kossugue e consiste de 8 estágios onde diferentes compostos
indutores de diferenciação são adicionados. A co-cultura com células CHO expressando VP22.Pax4 ou
VP22 era feita durante os estágios 4 a 6, totalizando 10 dias. As células CHO (~5.105) eram plaqueadas
em um “Millicell” (cell culture insert with hanging geometry- Millipore) e transferidas para a placa
contendo as células em diferenciação no dia seguinte. Ao final do protocolo de diferenciação, as células
foram coradas com ditizona e Newport Green para análise do conteúdo de insulina. E a expressão genica
foi analisada por q-RT-PCR.
RESULTADOS
Para testar a habilidade da VP22 internalizar diferentes pronteínas em células tronco
construimos dois vetores VP22.eGFP e VP22.Pax4, a capacidade destes dois vetores produzirem as
respectivas proteínas de interesse: VP22.eGFP e VP22.Pax4, foi confirmada através de RT-PCR,
Western blot e microscopia de fluorescência (Fig 1). Após obter extratos proteicos contendo
VP22.eGFP tratamos dois diferentes tipos de células tronco: mESCs e HDPSCs, e observamos através
de microscopia confocal que a VP22 era capaz de trasnduzir o eGFP para dentro destas células(Fig 2).
Selecionamos também clones de células CHO produtoras de VP22.Pax4 e utilizamos estas células para
verificar se a VP22 seria capaz de transduzir o Pax4 nas células mESC durante um protocolo de
diferenciação em células produtoras de insulina. A adição da proteína Pax4 levou a formação de um
maior número de cluster produtores de insulina e a alterações de expressão em determinados genes
relacionados com a diferenciação de células produtoras de insulina (Fig 3).
FP
eG
. eG
22
P
V
FP
80kDa
B
C
Fig 1: Confirmação da expressão das proteínas VP22; VP22.Pax4 e VP22.eGFP por Western blot do
extrato proteíco (A, B). Expressão da proteína VP22.eGFP em células 293T visualizadas por
microscopia confocal (C).
B
A
Fig 2: Tratamento de células mESC (A) e HDPSC (B) com extratos proteicos contendo eGFP ou
VP22.eGFP.
*
C
BCLXL
INS2
*
*
*
*
D
ISL1
NES
*
*
D
NGN3
*
Fig 3: Analise do número de agregados celulares formados ao final do protocolo diferenciação corados
com ditizona (A) e com Newport Green (B) para confirmação da produção de insulina, e quantificação
do número de agregados (C). Analise por qRT-PCR da expressão gênica de Bclxl; Ins2; Ngn3; Isl1; Nes
durante o protocolo de diferenciação (D).
CONCLUSÃO
Dada a presença do eGFP dentro das células tronco em cultura e as respostas biológicas
observadas nas mESC em diferenciação após a adição da VP22.Pax4, o presente trabalho demonstra
que é possível utilizar a VP22 como ferramenta para internalizar proteínas de interesse em células
tronco sem que o genoma destas seja afetado. Concluímos, então, que a utilização da VP22 como
ferramenta para internalização de proteínas em células-tronco é viável e que a adição do Pax4 pode
trazer melhorias para protocolos que busquem a produção de células produtoras de insulina.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos o Dr. Stuart Perkins, pela gentil doação do anticorpo anti-VP22. Esse trabalho foi
financiado pela FAPESP, FINEP, CNPq e PRP-USP.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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and Nkx2.2 are essential to initiate pancreatic β-cell differentiation. Developmental Biology 266:178-189, 2004.
RECEPTORES CANABINÓIDES CB1 NOS NÚCLEOS DA BASE: ABORDAGENS
MORFOLÓGICAS E FARMACOLÓGICAS EM RATOS HEMIPARKINSONIANOS
Chaves, G. P. ; Mazucanti, C. H. Y. ; Real, C. C. ; Britto, L. R. G. ; Torrão, A. S.
Departamento de Fisiologia e Biofísica – ICB - USP
RESUMO
Apesar das evidências farmacológicas indicarem a ocorrência dos receptores CB1 nos núcleos
da base, são necessários mais estudos sobre questões morfológicas e funcionais. Além disso, na Doença
de Parkinson (DP) a função do CB1 e sua relação com outros neurotransmissores não está clara. Nós
investigamos, por imunohistoquímica, possíveis co-localizações de CB1 com marcadores de células
gliais, axônios, dendritos e neurônios dopaminérgicos. Também analisamos, em ratos DP-induzidos,
alterações de diferentes proteínas nos núcleos da base em decurso temporal e o efeito do tratamento
agudo com AM 404 (inibidor da recaptação de anandamida) e ACEA (agonista canabinóide).
Resumidamente, nossos resultados mostraram aparente co-localização de CB1 com axônios e
dendritos, principalmente na substância negra (SN) e Globo Pálido externo (GPe) e pouca colocalização com células gliais em geral. Em ratos DP-induzidos houve uma diminuição gradual de CB1
na SN. De maneira geral a ativação aguda do receptor CB1 foi prejudicial à lesão.
INTRODUÇÃO
O sistema canabinóide endógeno é constituído pelos neuromediadores canabinóides, seus
receptores (CB1 e CB2) e suas enzimas de síntese e degradação [1,4]. Este sistema parece desempenhar
uma função modulatória em vários processos neurobiológicos, incluindo processos de neuroproteção,
neurodegeneração e plasticidade neuronal [3,6,8]. Por ser um processo neurodegenerativo, a DP
também se tornou alvo dos estudos de neuroproteção possivelmente desempenhada pelo sistema
canabinóide [5,7,9]. Muito embora evidências farmacológicas indiquem a ocorrência de CB1 nos
núcleos da base [2], dados morfológicos e funcionais são escassos sobre esta questão. Além disso, a
função do CB1 na DP e a sua relação com outros sistemas neurotransmissores (como o sistema
gabaérgicos) são pouco claras. Os objetivos deste trabalho foram: (1) investigar possíveis colocalizações de CB1 com marcadores de células gliais, elementos estruturais de neurônios e tirosina
hidroxilase (TH) nos núcleos da base de ratos intactos, e nos núcleos da base de ratos DP-induzidos
por 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA); (2) analisar os níveis de GAD (ácido glutâmico descarboxilase) e
CB1 em diferentes sobrevidas; e (3) avaliar os efeitos do tratamento agudo com AM 404 e ACEA.
MATERIAL E MÉTODOS
Foi realizada imunocoloração dupla de CB1 com marcadores de astrócitos (GFAP),
oligodendrócitos, microglia (OX-42), axônios (neurofilamentos), dendritos (MAP-2) e TH nos núcleos
da base de ratos normais. Outros ratos receberam duas injeções de 6-OHDA (6µg em 0,5µl cada
injeção) no estriado direito e o estriado esquerdo foi utilizado como controle. Os animais foram
divididos em cinco grupos: (1) para avaliação temporal da DP com diferentes tempos de sobrevivência
(1, 5, 10, 20 e 60 dias); (2) tratados de forma aguda com 2 mg/kg de AM 404; ou (3) DMSO (veículo) e
sacrificados sete dias pós-lesão; (4) tratados de forma aguda com 0,5, 1, 2 e 4mg/kg de ACEA; ou (5)
DMSO e sacrificados 16 dias pós-lesão. Cortes de encéfalos do grupo de avaliação temporal foram
submetidos à imunohistoquímica para TH e CB1, e immunoblotting para GAD. Para o grupo tratado com
AM 404 e seu controle, os cortes foram processados por imunohistoquímica para TH, GFAP e OX42,
e os cortes do grupo ACEA e seu controle, para TH. Os resultados foram analisados por ANOVA ou
teste t não pareado.
RESULTADOS
Nos estudos de imunocoloração (N =4) encontramos pouca co-localização de CB1 com
marcadores de células gliais, aparente co-localização de CB1 com MAP-2, especialmente na SN e no
GPe e co-localização de CB1 com marcador de axônios, principalmente na SN. Co-localização de CB1
com TH não foi claramente detectada nos núcleos da base. Já em ratos DP-induzidos, não houve
diferenças na expressão de GAD nos núcleos da base em todas as sobrevidas analisadas (N = 5 p>
0,05), mas houve uma diminuição gradual de TH e CB1 na SN (Figura 1). No grupo tratado com AM
404 houve uma diminuição de 10% na expressão de TH (N = 5, p <0,05), e aumento de 20 e 26% na
expressão de GFAP (N = 5, p <0,01) e OX 42 (N = 5 , p <0,05), respectivamente, na SN. A dose mais
elevada da ACEA diminuiu em 30% os níveis de TH na SN quando comparada ao grupo DMSO (N =
5, p <0,01), enquanto as outras doses não produziram efeitos significativos (Figura 2). Nenhum efeito
foi encontrado no estriado em ambos os grupos tratados.
Figura 1: Expressão de TH (A) e CB1 (B) na Substância Negra após 1, 5, 10, 20 e 60 da injeção
unilateral intraestriatal de 6-OHDA. Comparação entre as porcentagens dos lados experimentais
calculadas em relação aos lados controles do mesmo grupo (linha tracejada). Análise estatística por
ANOVA (uma via) com pós- teste de Tukey. * p< 0,05, ** p < 0,01 e *** p<0,001.
Figura 2: Curva dose-resposta de ACEA com 0,5, 1, 2 e 4 mg/kg em animais submetidos à injeção
unilateral intraestriatal de 6-OHDA. Expressão de TH expressa em porcentagem na Substância
Negra, comparando o lado controle (linha tracejada) com lado experimental. Análise estatística por
ANOVA (uma via) com pós- teste de Tukey. * p < 0,05 em relação ao DMSO e # p < 0,05 em
relação ao grupo 1mg/kg.
CONCLUSÃO
Este estudo contribui para o conhecimento da localização celular de CB1 nos núcleos da base e
ainda mostra que a expressão do receptor CB1 diminui em nosso modelo de DP por um evento que,
aparentemente não está relacionado ao sistema gabaérgico. É possível que este evento esteja
relacionado com algum efeito indireto da perda de neurônios dopaminérgicos. No entanto, a ativação
aguda do CB1 parece ter efeitos deletérios em nosso modelo de DP.
AGRADECIMENTOS
FAPESP e CNPq.
REFERÊNCIAS
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ESTUDO TOXICOCINÉTICO DO ALCALÓIDE INDOLIZIDÍNICO SUAINSONINA EM
RATOS JOVENS E ADULTOS
1
Pípole F , Cunha L.C1, Lippi L.L1, Stegelmeier B2, Gardner D2 & Hueza I.M3
1Departamento
de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP,
São Paulo/SP – Brasil
2
Poisonous Plant Research Laboratory, United States Departament of Agriculture, Logan/Utah – USA
3
Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas, UNIFESP, Diadema, SP, Brasil
RESUMO
O presente estudo visou avaliar os parâmetros toxicocinéticos do alcalóide indolizidínico
suainsonina em ratos jovens e adultos.Para isso, uma dose de 7,0g/kg do extrato aquoso de Ipomoea
carnea foi administrada aos animais e então, procedeu-se a coleta de sangue para determinação da
suainsonina plasmática nos tempos: T0 (0min), T1 (30min), T2 (3h), T3 (6h), T4 (9h), T5 (12h) T6
(15h), T7 (18h), T8 (21h) e T9 (24h). Animais adultos apresentaram maior concentração plasmática e
exposição à droga quando comparados com animais jovens. Com base nos resultados obtidos é
possível sugerir que os altos níveis de suainsonina em ratos adultos ultrapassem os limites para
exposição segura o que corrobora com os sinais clínicos da intoxicação observados apenas neste grupo
de animais.
INTRODUÇÃO
A suainsonina (Su) é um alcalóide indolizidínico produzido por diversas plantas tóxicas
amplamente distribuídas no mundo, como Canescens swainsona na Austrália [3], espécies pertencentes ao
gênero Astragalus e Oxytropis na América do Norte [10] e algumas espécies de Ipomoea, como Ipomoea
carnea (IC) encontrada em todo o Brasil e em outros países de clima tropical [2]. Além disso, alguns
fungos como os do gênero Metarhizium [9] e Rhizoctonia podem também produzir este alcalóide como
metabólito secundário [5].
A intoxicação natural ocorre quando diferentes espécies animais, tais como, bovinos, ovinos e
caprinos ingerem cronicamente essas plantas, resultando em grandes perdas econômicas em todo o
mundo[8].
O mecanismo de ação tóxico deste alcalóide ocorre por meio da inibição de duas enzimas: 1) αmanosidase (αM), resultando em acúmulo de oligossacarídeos nos lisossomos e vacuolização de
diferentes células do organismo; 2) manosidase-II do Complexo de Golgi, cuja inibição interfere no
metabolismo de glicoproteínas, como quimiocinas, citocinas, anticorpos etc., o que pode vir a resultar
em imunossupressão[6]. De fato, estudos de imunotoxicidade anteriores realizados em nosso
laboratório mostraram que a IC administrada a ratos adultos (70 dias) e ratos jovens (21 dias), por 14
dias, promoveu aumento do peso relativo do baço, diminuição da celularidade de medula óssea e do
peso relativo do timo e ainda alterou as populações de linfócitos T e B[4]; porém, estas alterações
foram observadas apenas naqueles animais adultos, o mesmo não tendo sido observado nos animais
jovens. Teria a toxicocinética da Su particularidades diferentes entre as idades estudadas?
Assim, o principal objetivo do presente estudo foi o de realizar um estudo toxicocinético do
principal principio tóxico da IC, a Su, em ratos jovens e adultos.
MATERIAL E MÉTODOS
Para isso, foram utilizados 60 ratos, sendo 30 jovens (21 dias) e 30 adultos (70 dias), separados
em 10 grupos iguais (n= 3 animais por período) denominados de acordo com o tempo de avaliação, a
saber: T0 (0min), T1 (30min), T2 (3h), T3 (6h), T4 (9h), T5 (12h) T6 (15h), T7 (18h), T8 (21h) e T9
(24h). Todos os animais passaram por jejum alimentar de 12 horas e então, receberam 7,0g/kg do
extrato aquoso de IC que correspondem exatamente a 5,0mg/kg de Su. Após a administração, os
animais foram eutanasiados nos tempos descritos anteriormente para a determinação de Su no soro.
Além disso, todos os animais foram submetidos à necropsia para aferição do pH do suco gástrico.
Os seguintes parâmetros toxicocinéticos: meia vida biológica (T1/2), tempo e concentração
máxima (Tmax e Cmax), Área sobre a curva (ASC) e Volume de distribuição (Vd) foram determinados
por meio do Software Noncompartmental PharmacoKinetics Data Analysis PK Solutions 2.0.
RESULTADOS
A tabela 1 mostra e a figura 1 ilustra os dados do perfil toxicocinético da Su nos animais jovens
e adultos. É possível observar que ratos adultos apresentaram maior concentração (Cmax) e exposição
(ASC) ao xenobiótico quando comparados com ratos jovens.
Tabela 1- Parâmetros toxicocinéticos da suainsonina e valores de pH do suco gástrico de ratos jovens e
adultos.
Adultos
Jovens
T1/2 (h)
2,3
2,2
ASC (ug-hr/mL)
3096
1811,5
Cmax (ug/mL)
671
400
Tmax (h)
1,4
0,5
Vd (mL)
5,3
8,6
pH
3,0
3,0
Figura 1 – Perfil toxicocinético da suainsonina em ratos adultos (A) e jovens (B)
CONCLUSÕES
Em farmacocinética utiliza-se com freqüência o conceito de janela terapêutica, quando o efeito
farmacológico máximo (Emax) está diretamente relacionado com o Cmax. Concentrações plasmáticas
acima do Cmax não aumentam o efeito; porém, aumentam significativamente a toxicidade [7]. Assim,
uma possível explicação dos efeitos imunotóxicos anteriormente descritos em animais adultos seja
decorrente do Cmax da Su neste grupo de animais ser maior do que aquele apresentado por animais
jovens e portanto, superior aos limites de segurança à exposição.
Entretanto, não é possível explicar, neste momento, o mecanismo responsável pela maior
concentração plasmática da Su em ratos adultos, uma vez que não houve diferenças no pH do suco
gástrico entre animais jovens e adultos , fato que poderia interferir na absorção do agente tóxico e
ainda, uma busca na literatura revelou não haver diferenças nas concentrações de glicoproteína p em
ratos wistar jovens e adultos [1], que é sabidamente uma bomba de efluxo, ou seja promove de forma
ativa a saída de substâncias do interior da célula.
Muitos são os trabalhos que são realizados com uma mesma substância, cujos resultados muitas
vezes não são compatíveis com outros estudos semelhantes realizados em outros laboratórios. O
presente trabalho claramente mostra a necessidade da realização de estudos toxicocinéticos de um
xenobiótico antes de se iniciar uma experimentação, para, além de determinar os períodos mais
adequados para a re-exposição da substância, que estão diretamente relacionados à sua T1/2, também
detectar diferenças existentes no perfil toxicocinético deste xenobiótico, não só na espécie estudada,
como também no gênero, na idade, ou seja, nos fatores que possam interferir neste parâmetro
toxicológico que poderá vir a interferir nos resultados esperados, colaborando assim para uma melhor
fidelidade dos resultados alcançados.
AGRADECIMENTOS
CAPES
REFERÊNCIAS
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PNEUMONIA POR VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO (RSV)
EM MURIQUI DO SUL (Brachyteles arachnoides)
Stéfanie Vanessa Santos1, Ricardo De Francisco Strefezzi2, Alcides Pissinatti3,
Cleusa Fumika Hirata Takakura4, Cristina Kanamura5, Maria Irma Seixas Duarte6,
José Luiz Catão-Dias7
1. Doutoranda, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP), São Paulo, SP,
Brasil.
2. Professor, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo (FZEA-USP), Pirassununga,
SP, Brasil - Campus de Pirassununga, Brasil.
3. Diretor, Centro de Primatologia do Rio de Janeiro (CPRJ), Guapimirim, RJ, Brasil.
4. Técnica de microscopia eletrônica, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP), São Paulo, SP, Brasil.
5. Diretora, Laboratório de Imuno-histoquímica do Instituto Adolfo Lutz (IAL), São Paulo, SP, Brasil
6. Professora, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP), São Paulo, SP, Brasil.
7. Professor, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP), São Paulo, SP,
Brasil.
E-mail: [email protected]
RESUMO
O vírus sincicial respiratório (RSV) foi diagnosticado em fragmento pulmonar representado por
pneumonia sincicial difusa moderada a grave em Muriqui do sul (Brachyteles arachnoides). Através de
estudo retrospectivo envolvendo histórico clínico, necroscopia, histopatologia, imuno-histoquímica e
microscopia eletrônica se considerou o agente como envolvido na causa de morte de um espécimen de
muriqui do Sul cativo do CPRJ, sem sinal clínico respiratório evidente. O relato alerta clínicos e
criadores conservacionaistas que o RSV pode acometer primatas do novo mundo (RSV), sobretudo
este atelídeo. Como se trata de um vírus com potencial zoonótico, manejos profiláticos como adoção
de medidas de biossegurança evitando o contato entre humanos e PNH se faz necessário, garantindo a
sanidade, manutenção, reprodução e conseqüente conservação dos Brachyteles arachnoides.
INTRODUÇÃO
O gênero Brachyteles, endêmico do Brasil, é constituído por duas espécies de muriquis, o B.
arachnoides e B. hypoxanthus [7]. Estudos recentes demonstraram que suas populações selvagens podem
estar seriamente reduzidas. Na tentativa de reverter a situação atual, esforços têm sito realizados
visando a conservação dos muriquis. No entanto, dados relativos à condição sanitária de Brachyteles spp.
são extremamente escassos.
O vírus respiratório sincicial (RSV) é um vírus RNA envelopado, inicialmente isolado de
chimpanzés com coriza em 1956 e, atualmente, é considerado causa importante de doença respiratória,
moderada a severa e altamente contagiosa em criança [3,5]. Em um estudo molecular sobre a incidência
de afecções respiratórias causadas por RSV em humanos recém nascidos apontaram que 11,1%
(36/316) da população apresentava infecção (REIS, 2006). Acredita-se que primatas não-humanos
(PNH) tenham sido infectados por meio do contato com o homem, visto que anticorpos anti-RSV
foram detectados em humanos e PNH [6]. Em PNH, a doença é caracterizada por sinais respiratórios
moderados a intensos como tosses, espirros, descarga óculo-nasal mucopurulenta [2]. Nos casos graves
demonstrou-se a ocorrência de bronquiolite e broncopneumonia necrotizante, com células sinciciais
multinucleadas e corpúsculo de inclusão intracitoplasmático. A letalidade dos casos está associada com
lesões alveolares e tromboses microvasculares, caracterizando a síndrome de angústia respiratória aguda
[1]. Estudos de imunoprofilaxia para o RSV são frequentemente realizados em PNH [3]. Medidas
profiláticas devem ser estabelecidas no sentido de minimizar o contato desses animais com seres
humanos, já que os mesmos podem facilitar a transmissão do vírus.
O presente relato de caso descreve a ocorrência de pneumonia sincicial associada à infecção
por RSV em muriqui do sul, primata atualmente considerado em perigo de extinção.
DESCRIÇÃO DO CASO
Um primata da espécie Brachyteles arachnoides, macho, 16 anos de idade, cativo no Centro de
Primatologia do Rio de Janeiro desde 1990, manifestou os seguintes sinais clínicos: hiporexia, apatia,
edema testicular e ferimentos causados por conflitos de disputa hierárquica com outro macho. Não
foram relatados sinais clínicos relacionados ao sistema respiratório. Em 2006 o animal veio a óbito,
ainda assintomático. À necrópsia a carcaça apresentava bom estado nutricional, pesando 10,5 kg, e
comprimento total de 1185 mm. Foram observados: exsudato catarral em intestino delgado,
principalmente em duodeno; vesícula seminal aumentada; rim direito apresentando fibrose capsular e
abcessos que substituíam cerca de 80% do parênquima do órgão; fígado de volume aumentado,
acinzentado e friável; pulmão: broncopneumonia bilateral severa com congestão e consolidação
pulmonares (Fig. 1).
Fragmentos de órgãos foram preservados em solução de formalina a 10% e processados para
histopatologia nos Laboratórios de Histologia do Departamento de Patologia da FMVZ-USP e da
Faculdade de Medicina da USP. Os cortes histológicos foram corados pelo método da hematoxilina e
eosina.
RESULTADOS
A análise histopatológica revelou pneumonia sincicial crônica difusa, moderada a grave, com
células gigantes distribuídas difusamente, além de trombose e congestão pulmonar moderada. Os cortes
corados pelas técnicas de Ziehl Neelsen e Gram apresentaram resultados negativos para presença de
bactérias. Foram detectados também microtrombos em vasos cardíacos, além de necrose de coagulação
difusa moderada e fibrose. O baço apresentava linfocitólise em centros germinativos e degeneração
folicular acompanhada de calcificação. Outras alterações foram extensos infartos renais e
glomerulonefrite membranosa intersticial; duodenite moderada com infiltrado misto, acompanhada de
linfangiectasia marcante; peritonite crônica com células gigantes; depleção linfóide com histiocitose e
necrose vascular fibrinóide em linfonodo; hepatite necrótica multifocal e hemossiderose moderada.
A análise por imuno-histoquímica pelo método da fosfatase utilizando-se o anticorpo antiRSV (código Ab22501, da Albcam®) revelou imunomarcação positiva para RSV em células sinciciais
no parênquima pulmonar (Fig.2).
A avaliação ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão das amostras de
fragmentos pulmonares revelou diversas partículas virais esféricas a pleomórficas, com diâmetro
aproximado de 200 nm, contendo projeções de superfície que variavam de 8 a 12 nm de comprimento,
no interior de macrófagos (Fig.3).
A presença de células sinciciais, aliada à comprovação por imuno-histoquímica e microscopia
eletrônica de infecção por RSV, permitem o diagnóstico de pneumonia sincicial por RSV. Sabe-se que o
vírus sincicial é considerado causa importante de doença respiratória, altamente contagiosa em crianças
[3,5]. No presente relato, descrevemos a ocorrência deste pneumovírus em PNH acometendo animal
senil, que levou a lesões alveolares e trombose da microvasculatura, caracterizando a síndrome de
angústia respiratória aguda. Além disso, os resultados histopatológicos revelaram lesões renais
provavelmente decorrentes da trombose microvascular sistêmica, típica de infecções por RSV. Notouse também, que o atelídeo não manifestou sinal clínico respiratório contrariando os relatos em outros
primatas não-humanos, em que a doença é caracterizada por sinais respiratórios moderados a severos,
como tosse, espirros e descarga óculo-nasal muco-purulenta [2].
Fig.1
Fig.2
CONCLUSÃO
Os muriquis são suscetíveis ao RSV e podem apresentar episódios de pneumonias sinciciais
seguidas de síndrome de angústia respiratória. O presente relato contribui para melhorias no manejo,
manutenção e conservação deste atelídeo. Além disso, por tratar-se de um vírus potencialmente
zoonótico, o presente relato alerta para a necessidade
de adoção de medidas de biossegurança.
Fig.3
AGRADECIMENTOS
CAPES, CNPq, FAPESP (Proc. no 2010/51801-5), FM-USP, IAL, CPRJ, IBAMA, FAPERJ,
FINEP, American Society of Primatologists, Conservation International, Greater Los Angeles Zoo
Association.
REFERÊNCIAS
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Chicago: Academic Press, 1995. 512p.
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nascidos do município de São Paulo: comparação de técnicas diagnósticas e caracterização molecular. 2006. 133f.
Tese (Doutorado em Ciências)- Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, 2006.
[6] RICHARDSON-WYATT; L. S.; BELSHE, L. B.; LONDON, W. T.; SLY, D. L; CAMARGO, E.; CHANOCK, R. M.
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4, p. 413-415, 1981.
[7] TALEBI M, BASTOS A, LEE PC: Diet of southern muriquis in continuous Brazilian Atlantic forest. Int J Primatol ,
26:1175–87, 2005.
INFECÇÃO EM CAMUNDONGOS PELO HERPESVÍRUS EQÜINO TIPO I INDUZ A
RESPOSTA SISTÊMICA E PULMONAR DE CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS
Mori C.M.C.1, Mori E.1, Ribeiro A.1, de Paula V.F.1, Miyashiro S.I.1, Zanuzzi C.N.2, Galosi C.M.2,
Brandão P.E.1 , Richtzenhain L.J.1 , Maiorka P.C.2
1. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
2. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Bs As, Argentina.
RESUMO
Camundongos infectados com as estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 desenvolveram infecção
aguda dos pulmões, seguida pela disseminação do vírus para os órgãos viscerais e cérebro. Embora os
mecanismos que regulam a quimiotaxia de leucócitos durante a infecção pelo EHV-1 ainda não tenham
sido explorados em grande detalhe, estudos recentes têm demonstrado a importância das citocinas na
inflamação e nos mecanismos imunopatológicos envolvidos na evolução da doença. O objetivo deste
estudo foi caracterizar o perfil de citocinas produzidas na resposta imune local (pulmonar) e sistêmica
em camundongos BALB/c infectados com duas estirpes brasileiras (A4/72 e A9/92) e uma argentina
(AR4) do EHV-1. As concentrações de IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α, IL-12p70 e MCP-1 foram
mensuradas no plasma e no fluido do lavado broncoalveolar (LBA) utilizando um kit de ELISA. Os
camundongos infectados com a estirpe AR4 apresentaram maior número de células no LBA (p <0,05),
e maior concentração de TNF-α, IL-6 e MCP-1 no LBA (p <0,01), indicando infecção pulmonar pelo
EHV-1 A concentração plasmática de IL-6 também foi maior nos camundongos infectados com a
estirpe AR4 (p <0,05). Já a concentração de MCP-1 foi maior no plasma dos camundongos infectados
com as estirpes A4/72 e A9/92, e no LBA dos camundongos infectados com a estirpe A9/92 (p
<0,01). Os camundongos infectados com a estirpe A9/92 apresentaram também maior concentração
de IFN-γ no plasma (p <0,05). Estes achados sugerem que as estirpes A4/72 e A9/92 foram capazes
de causar uma infecção sistêmica em camundongos.
INTRODUÇÃO
Idealmente, as citocinas coordenam a resposta inflamatória com o intuito de eliminar patógenos
com o mínimo de injúria tecidual. As citocinas tipo CD(4)(+) T helper 1 (Th1) tendem a produzir uma
resposta pró-inflamatória responsável pela morte de parasitas intracelulares. As principais citocinas tipo
Th1 são o interferon-gama (IFN-γ) e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α). A reposta pró-
inflamatória excessiva pode levar a um incontrolado dano tissular, que necessita de um mecanismo
controlador que neutralize essa ação. As citocinas tipo CD(4)(+) T helper 2 (Th2) por sua vez, como por
exemplo, a interleucina-10 (IL-10) apresenta uma resposta antiinflamatória predominante. Em excesso,
a resposta Th2 poderá inibir a ação antimicrobiana mediada pela resposta Th1. Portanto, um cenário
ideal seria uma resposta balanceada entre as respostas Th1 e Th2 frente a um desafio imune.
O herpesvírus eqüino tipo 1 (EHV-1) é o agente responsável por diferentes formas de doença
em cavalos dentre as quais se destacam a doença respiratória, o abortamento e doença neurológica. O
modelo murino por meio da infecção intranasal mimetiza todas essas formas clínicas da doença [1,2].
Mori et al. (2011) demonstraram diferenças de tropismo tecidual e virulência nas diferentes estirpes
virais do EHV-1, com predominância de manifestações neurológicas em camundongos infectados pelas
estirpes brasileiras A4/72 e A9/92. Estudos recentes avaliaram a resposta imune após a infecção pelo
EHV-1, tanto no modelo murino [4] quanto in vitro utilizando leucócitos de cavalo [5,6], demonstrando
a importância das quimiocinas e/ou citocinas em orquestrar os eventos envolvidos na inflamação após
a infecção viral.
Para melhor compreensão da resposta inflamatória sistêmica e pulmonar após a infecção
experimental pelo EHV-1, o perfil de diferentes citocinas/quimiocinas foi investigado no plasma e no
lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos BALB/c inoculados por via intranasal com as estirpes
A4/72 e A9/92 que causam meningoencefalite fatal no modelo murino e a estirpe AR4 que causa
somente infecção local pulmonar.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 16 camundongos BALB/c, fêmeas, com oito semanas de idade, provenientes
do Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo. Os camundongos foram alojados em micro-isoladores de policarbonato no
biotério do Instituto Biológico de São Paulo a temperatura de 22–24 ºC, umidade relativa do ar entre 40
e 60% e ciclo de 12 horas de claro e 12 horas de escuro, permanecendo em aclimatação por uma
semana antes do início dos experimentos. Água filtrada e autoclavada e ração comercial foram
fornecidas ad libitum. As condições de alojamento e manejo, bem como os procedimentos
experimentais adotados, foram aprovados pela Comissão de Bioética do Instituto Biológico de São
Paulo (protocolo 70/08 CETEA-IB) e estão de acordo com a as recomendações internacionais [3].
Após anestesia inalatória com isofluorano, grupos de quatro camundongos foram desafiados por via
intranasal com a dose infectante de 104 DICT50/25µL das estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 e da
estirpe argentina AR4 do EHV-1. Quatro camundongos do grupo controle foram submetidos aos
mesmos procedimentos e receberam 25 µL do meio de cultura MEM de Eagle estéril. No 2º dia pósinoculação (dpi) os camundongos foram anestesiados com isofluorano e o sangue foi colhido com
ETDA por punção cardíaca terminal. As amostras de sangue foram centrifugadas para separação do
plasma que foi estocado a -80ºC. Os pulmões foram lavados duas vezes com alíquotas de 0,75 mL de
PBS contendo 3mM de EDTA por meio de uma cânula inserida na traquéia para obter o fluido do
lavado broncoalveolar (LBA). A contagem total de células do LBA foi realizada em câmara de
Neubauer utilizando o corante azul de tripan. Posteriormente, o fluido do LBA foi centrifugado (2.450
x g, 7 min) e o sobrenadante estocado a -80ºC. Um kit ELISA para quantificação de citocinas murinas
(Cytometric Bead Array – CBA, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) foi utilizado para dosagem de IL6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF-α e IL-12p70 no plasma e fluido do LBA. Para a avaliação
histopatológica fragmentos de pulmão foram fixados em formol a 10% e confeccionou-se de lâminas
coradas por HE. A reação de imuno-histoquímica foi realizada segundo protocolo descrito por Mori et
al. (2011).
RESULTADOS
Os camundongos inoculados com a estirpe argentina AR4 apresentaram sintomas respiratórios
como dispnéia e taquipnéia, pêlos arrepiados e discreta perda de peso no 2º dpi. Conforme descrito na
literatura, no 2º dpi não foi possível observar sinais clínicos evidentes nos camundongos infectados
com as estirpes neuropatogênicas brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1, os quais apresentavam
sintomas respiratórios e neurológicos severos com 100% de mortalidade no 3º dpi [2].
Observou-se aumento na contagem total de células do LBA somente no grupo desafiado com a
estirpe argentina AR4 (p<0,05) no 2º dpi. Não houve diferença estatística nas concentrações de IL-10 e
IL-12p70 tanto no plasma quanto no fluido do LBA. No fluido do LBA dos camundongos inoculados
com a estirpe AR4 houve aumento significante nas concentrações de TNF-α e IL-6 quando
comparados aos grupos controle e inoculados com as estirpes A4/72 e A9/92 (p<0,01). Observou-se
aumento da proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) no fluido do LBA dos camundongos
inoculados com a estirpe argentina AR4 e com a estirpe brasileira A9/92 (p<0,01). Em relação à
dosagem de citocinas no plasma observou-se aumento significativo na concentração de IFN-γ nos
camundongos inoculados com a estirpe A9/92 e de IL-6 nos camundongos inoculados com a estirpe
AR4 no 2º dpi (p<0,05). A MCP-1 aumentou significativamente nos camundongos inoculados com as
estirpes neuropatogênicas A4/72 e A9/92 (p<0,01) (Fig.1).
No exame histopatológico observou-se presença de infiltrado inflamatório nos pulmões,
espessamento da parede dos alvéolos pulmonares, áreas de hemorragia, peribronquiolite e zonas de
erosão com restos celulares na luz dos brônquios. A marcação imuno-histoquímica revelou a presença
de grande quantidade de células infectadas pelo EHV-1 na luz dos brônquios e bronquíolos.
Figura 1.
Concentrações de IFN-γ, TNF-α, IL-6 e MCP-1 (pg/ml) no fluído do lavado
broncoalveolar (LBA) e no plasma de camundongos BALB/c inoculados por via
intranasal com as estirpes brasileiras A9/92 e A4/72 e a estirpe argentina AR4 do EHV1, no 2º dpi. *(p<0,01), **(p<0,05)
CONCLUSÃO
Os resultados indicam que a infecção foi restrita aos pulmões dos camundongos inoculados
com a estirpe AR4 do EHV-1, induzindo uma resposta inflamatória localizada. Por outro lado, as
infecção com as estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 induziu uma resposta sistêmica nos camundongos.
Esses dados sugerem que as citocinas pró-inflamatórias IFN-γ, TNF-α, IL-6 e MCP-1 são fatores
determinantes tanto dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento dos sintomas, como na defesa do
hospedeiro contra a infecção EHV-1.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP), números dos processos 2009/51886-3 e 2007/58861-0 e pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – número do processo 473735/2008-3.
REFERÊNCIAS
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Galosi CM, Barbeito CG, Vila Roza MV, Cid de la Paz V, Ayala MA, Corva SG, Etcheverrigaray ME, Gimeno EJ.
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ESTUDO DO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO DE OSTEOSSARCOMA
CANINO EM CULTURA CELULAR EM TRÊS DIMENSÕES
Sanches, DS.,1 Chaible, LM.,1 Mennecier, G.,1 Nagamine, MK.1, Latorre, AO.,1
Dagli, MLZ.1
1. Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
(FMVZ-USP), São Paulo, SP, Brasil.
E-mail: [email protected]
RESUMO
A diferenciação de osteoblastos se caracteriza por um processo dividido em três principais
etapas: proliferação, maturação de matriz extracelular e mineralização. Recentemente, tem sido
mostrado que perfis de expressão gênica obtidos de cultura celular em três dimensões têm refletido
com mais precisão respostas clínicas quando comparados com cultura celular em duas dimensões.
Esferóides são uteis em testes de citotoxicidade a diferentes drogas, não somente devido à
redistribuição das fases de crescimento celular e microambientes heterogêneos, mas também devido à
barreira à penetração existente em regiões pobremente vascularizadas dos tumores que podem em parte
ser estimuladas. Aqui nós reportamos o desenvolvimento e estabelecimento de uma linhagem celular de
osteossarcoma canino e a resposta destas células em cultura em três dimensões, quando expostos a três
diferentes agentes: Arctigenina (ARC), Genisteína (GEN), e Tricostatina A (TSA). Uma resposta dose
dependente em termos de viabilidade celular e proliferação foi observada após o tratamento com os
diferentes princípios ativos. Foi também verificado a indução à diferenciação dos osteoblastos em
cultura celular em três dimensões. Nós concluímos até o presente momento que os três princípios
ativos interferem nos processos de proliferação, viabilidade celular e principalmente em direção a
diferenciação de osteoblastos neoplásicos caninos.
INTRODUÇAO
Tumores ósseos primários do esqueleto são comuns em cães e humanos, tendo como principal
tipo o osteossarcoma (OSA). Em cães tem-se uma incidência de aproximadamente 65 a 85% para
OSAs e 15% para condrossarcomas. Os OSAs acometem 4% de todas as moléstias neoplásicas, e 98%
dos tumores ósseos primários do esqueleto apendicular [1,2]. Possui alto potencial metastático, e 90%
morrem ou são eutanasiados devido a complicações associadas às metástases pulmonares [3,4].
Os programas de diferenciação de osteoblastos normais foram bem estudados e atualmente
bem entendidos. Em contraste a base molecular da perda de diferenciação associada a carcinogênese
ainda não é bem entendida e possivelmente variam entre os tipos de câncer e entre os tecidos. Com
significante impacto, a terapia através da diferenciação tem sido introduzida em estudos pré-clínicos e
clínicos, com benefícios, trazendo esperança de que as relações entre diferenciação e carcinogênese
possam ser usadas no tratamento de pacientes com câncer. O foco do corrente estudo é o de
caracterizar os aspectos ligados ao processo de diferenciação induzida por diferentes agentes tais como
ARC, GEN e TSA em cultura celular tridimensional de OSAs caninos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Um animal canino da raça fila, 7anos, fêmea, foi diagnosticado através de exame radiográfico
com suspeita de tumor ósseo, em úmero proximal direito, sendo então submetido a cirurgia de
amputação. Parte do tumor foi dividido fragmentos os quais foram então encaminhados ao exame
histopatológico de rotina através de cortes de 5um laminados e corados em Hematoxilina e Eosina.
Outros fragmentos foram coletados logo apos a cirurgia para o estabelecimento de linhagem celular de
osteoblastos neoplásicos e colocados em cultura em três dimensões. As células foram submetidas a
tratamentos com ARC, GEN, e TSA, por diferentes períodos de tempo, para avaliação dos processos
de diferenciação através de laminas corada com tricômico de Masson e expressão de marcadores ósseos
(OC e OP) através de imunoistoquímica. Processos de proliferação foi avaliado através de ensaios de
MTT e cristal violeta. Foi verificada também a ploidia da linhagem estabelecida a distribuição nas fases
do ciclo celular através de ensaios de incorporação de iodeto de propídeo e Brdu analisados por
citometria de fluxo.
RESULTADOS
Após a cirurgia de retirada foi realizado o exame histopatológico de rotina do tumor, o qual teve
como diagnostico OSA osteoblástico produtivo. Após o estabelecimento de linhagem neoplásica de
OSA canino, o qual se mostrou estabelecida apos 21 passagens com células hipodiploides. As células
foram então colocadas em garrafas especiais de baixa adesão celular permitindo a formação dos
esferóides. No estudo morfológico através do tricômico de Masson verificou-se deposição precoce e
em quantidade maior de matriz extracelular dos grupos tratados comparados aos controles. Resultado
semelhante foi observado quando avaliados a expressão de marcadores ósseos, nos quais se verificou a
presença de marcação positiva em cinco dias para os grupos tratados comparados aos 10 dias dos
grupos controles. Nos ensaios de proliferação celular pelo MTT e Cristal violeta pode se verificar
diminuição da viabilidade e da multiplicação celular em função do tempo com resposta dose
dependente.
CONCLUSÃO
Até o presente momento podemos concluir que a cultura celular em três dimensões se faz em
um ótimo modelo para o estudo de novos candidatos a terapia antitumoral, assim como para estudo de
processos de diferenciação e proliferação celular. Também concluímos que os agentes utilizados
possuem atividade antitumoral através da indução de diferenciação e diminuição da atividade
proliferativa e viabilidade celular de osteoblastos neoplásicos de cães.
AGRADECIMENTOS
A FAPESP e a Capes pelo suporte financeiro.
REFERÊNCIAS
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[2] POOL RR, THOMPSON KG: 2002. Tumors of bones, In : Tumors in domestic animals, 1th ed., pp. 245-318. State
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(Suppl. 2), S77–S83.
ESTUDO QUÍMICO DOS COMPONENSTES TÓXICOS DA MALPIGHIACEAE
Mascagnia rigida
Cunha L.C1, Pípole F1, Carvalho L.R2, Lago J.H.G3, Gorniak S.L1
1Departamento
de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, São Paulo/SP;
2Núcleo
3 Departamento
de Pesquisa em Ficologia, Instituto de Botânica, São Paulo/SP;
de Ciências Exatas e da Terra, Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas, UNIFESP/ São
Paulo
RESUMO
O monofluoracetato de sódio (FAS) identificado como o princípio ativo de Dichapetalum
cymosum, planta sul africana causadora de intoxicações e mortes de bovinos, caprinos e ovinos, passou a
ser sintetizado para uso como rodenticida, na década de 1940. Nos anos seguintes, outras espécies de
plantas como Acacia georginae, Gastrolobium spp, Oxylobium spp, Palicourea marcgravii e Arrabidea bilabiata
também mostraram conter essa toxina, causadora de “morte súbita”. Esse evento pode ser explicado
pela transformação do FAS em fluorocitrato, através da “Sintese Letal”, o qual bloqueia a ação da
aconitase, interrompendo diretamente o ciclo de Krebs e a produção de ATP no organismo intoxicado.
Existem ainda plantas tóxicas que causam “morte súbita”, com quadro clínico semelhante ao
decorrente da ingestão de FAS, mas cujos princípios ativos não foram identificados caso da Mascagnia
rígida, a planta mais frequente na região Nordeste do país. Devido às perdas econômicas que ocasiona,
nosso objetivo foi identificar a substância tóxica nela presente. Para tanto, a planta seca e moída foi
submetida à extração com água deionizada, a quente; o extrato aquoso foi concentrado a vácuo e
submetido a diversos processos cromatográficos (planar e em coluna), com diferentes fases
estacionárias e móveis, até que se conseguisse o isolamento do princípio ativo. O estudo deste material
purificado, por espectrometria de Infravermelho, mostrou a presença de mais uma carboxila, indicando
a presença de mono, di e trifluoracetato de sódio, na amostra. Anteriormente, estudos químicos em
Dichapetalum toxicarium mostraram também, como resultado, a mesma mistura de sais.
INTRODUÇÃO
O fluoroacetato de sódio (FAS) foi identificado por Marais, em 1944, como sendo o princípio
tóxico da planta Dichapetalum cymosum (“gifblaar”), causadora de intoxicações em ovelhas, na África do
Sul [12]. Por sua toxicidade, foi sintetizado e amplamente utilizado como raticida da década de 1940 até
a de 1980. Por ser de difícil detecção química e não contar com tratamento eficiente para os casos de
intoxicação acidental, teve seu uso proibido em diversos países, e restringido em outros [9] [5].
Outras plantas, dispersas por diversas regiões do mundo, também produzem essa substância:
Acacia georginae, na América do Sul [6], Gastrolobium spp e Oxylobium spp, na Austrália [1] e Palicourea
marcgravii [7] e Arrabidea bilabiata [2], no Brasil. Estas duas últimas plantas causam prejuízos financeiros
de grande monta, para a pecuária brasileira, por provocarem a “morte súbita” nos rebanhos bovinos e
ovinos [9].
A toxicidade do FAS ocorre pela ação do fluorocitrato, seu metabólito ativo, formado no
organismo por meio da denominada “Sintese Letal” [10]. O FAS é incorporado à acetil coenzima A
formando a fluoroacetil coenzima A. Esta, por sua vez, conjuga-se ao oxaloacetato no ciclo de Krebs,
formando o fluorocitrato que age competitivamente, bloqueando a ação da aconitase. Com o bloqueio
desta enzima, deixa de ocorrer a conversão de citrato em isocitrato, interrompendo diretamente o ciclo
e a produção de ATP no organismo intoxicado com consequente acúmulo de citrato em vários tecidos
[8].
Existem ainda outras plantas tóxicas que pertencem ao grupo das que causam “morte súbita”,
com quadro clínico semelhante, mas cujos princípios ativos não foram identificados. Entre elas está a
Mascagnia rigida (“tingui”, “timbó”), a mais difundida e importante da região Nordeste do país, que
promove intoxicação em bovinos e caprinos e causa expressivas perdas [4] [11], merecendo particular
atenção por parte dos veterinários, pesquisadores e criadores.
Tomando por base esses dados, desenvolvemos estudos cujo objetivo foi determinar a
identidade do princípio ativo produzido pela planta tóxica Mascagnia rigida.
MATERIAL E MÉTODOS
Caracterização da natureza química do princípio ativo de Mascagnia rigida, por cromatografia
Planar.
Preparo do extrato aquoso: 200 g de folhas verdes e secas foram submetidos a extração a
quente, com água deionizada. Esse extrato foi concentrado a pressão reduzida, em rotoevaporador e
submetido a cromatografia em camada delgada para detecção de monofluoracetato de sódio, utilizandose como fase estacionária, cromatofolhas de celulose e como fase móvel, a solução composta pelos
solventes etanol/hidróxido de amônio/piridina/água (95:3:1:1, v/v/v/v) e como agente derivatizante,
azul do Nilo [13]. Como contraprova, utilizou-se extrato aquoso de Palicourea marcgravii.
Isolamento da substância contida na Mascagnia rigida.
Com base nesses resultados, foram delineados ensaios cromatográficos em placa e em coluna,
para o isolamento da substância detectada por cromatografia planar. Foram utilizadas como fase
estacionária: celulose, sílica octadecilsilanizada (fase reversa), XAD2, Oasis HLB, Oasis MAX; e como
fases móveis as seguintes misturas de solventes: a) etanol/hidróxido de amônio/piridina/água (95:3:1:1,
v/v/v/v); 2) clorofórmio/metanol/água (64:36:8, v/v/v), metanol/água, em diferentes proporções. Os
ensaios por cromatografia em coluna foram realizados a pressão ambiente, a vácuo e sob pressão
positiva.
Determinação da estrutura da substância tóxica.
Para a determinação da estrutura da substância isolada por métodos cromatográficos, foram
empregados os seguintes processos: espectrometria de infravermelho (IV), ressonância nuclear de
carbono e de flúor (RMN 13C e de F) e Cromatografia de Alta Eficiência/espectrometria de massas.
RESULTADOS
Caracterização da natureza química do princípio ativo de Mascagnia rigida, por cromatografia
Planar.
O resultado da cromatografia planar comprovando a presença de FAS, no extrato aquoso de P.
marcgravii, está mostrado na figura1.
Figura 1. Cromatograma em celulose de: a, b, c – padrão de fluoracetato de sódio; d,
e, f – extrato aquoso de M. rigida; g, h, i – extrato aquoso de P. marcgravii. Fase móvel:
etanol/hidróxido de amônio/piridina/água (95:3:1:1, v/v/v/v); agente derivatizante:
azul do Nilo.
Para isolar o FAS, substância de massa molecular pequena (100 Da) e de polaridade alta, foram
realizadas séries de experimentos cromatográficos e a partir dos resultados apresentados, foi elaborado
um protocolo que será devidamente registrado. Na comprovação da identidade do FAS isolado, o
emprego das técnicas espectrofotométricas (RMN 13C e de F) foi dificultado pelo tempo e custo da
análise e também pela inexperiência do operador, em espectrometria de Flúor.
O IV apresentou bons resultados e foi possível inferir, pela comparação dos espectros do
padrão de FAS com o do material purificado obtido a partir do extrato aquoso da M. rígida, que a planta
contém mistura de mono, di e trifluoracetato de sódio, pois seu espectro IV mostrou a presença de
mais de um grupo carboxílico (Figura 2)
1
2
Figura 2. Espectros de IV de 1) amostra de material purificado de M. rígida; 2) padrão de
FAS.
Os dados obtidos nos espectros estão compilados na Tabela 1.
Tabela 1–Vibrações do grupo carboxílico para os sais halogenados (tri, di monofluorácetico)
FAS
3433
1623
1440
882
----------
3422
1633
1454; 1406, 1384
1111; 831 e 1073; 669,696
padrão
Amostra
901
Vickery e colaboradores (1973) também obtiveram indicações da presença de di e
trifluoracetato, além do monofluoracetato, em Dichapetalum toxicarium. Os resultados dos estudos por
Cromatografia de Alta Eficiência/espectrometria de massas não serão apresentados neste trabalho.
CONCLUSÃO
À semelhança com plantas como Dichapetalum toxicarium, M. rígida contém mistura de mono, di e
trifluoracetatos, ao invés de um único sal halogenado.
AGRADECIMENTOS
CAPES
REFERÊNCIAS
[1] APLIN, T. E. H. Poison plants of Western Australia. Toxic species of genera Gastrolobium and Oxylobium. Journal of
Agriculture, Western Australia, v. 8, p. 42-52, 200-206, 241-243, 408, 414, 1968.
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[3] MARAIS, J. S. C. Monofluoroacetic acid, the toxic principle of Gifblaar, Dichapetalum cymosun . Onderstepoort Journal
of Veterinary Science and Animal Industry, v. 20, n. 1, p. 67-73, 1944.
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2004.
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[7] OLIVEIRA, M. M. Chromatographic isolation of monofluoracetic acid from Palicourea marcgravii St. Hil. Experientia,
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Human Toxicology, v. 32, p. 427-429, 1990.
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[11] RIET-CORREA, F.; SCHILD, A. L.; LEMOS, R. A. A.; BORGES, J. R. J. Plantas que produzem morte súbita.
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[13] VICKERY, B.; VICKERY, M. L.; ASHU, J. T. Analysis of plant for fluoroacetic acids. Phytochemistry, v. 12, p. 145147, 1973.
PERFIL ESPERMÁTICO E DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES DO EJACULADO E
SÊMEN EPIDIDIMÁRIO DE CÃES.
Angrimani, D.S.R1; Lucio, C.F. 1; Veiga, G.A.L. 1; Silva, L.C.G. 1; Regazzi, F.M. 1; Nichi, M. 1; Vannucchi,
C.I. 1.
1 Departamento
De Reprodução Animal - Universidade De São Paulo, São Paulo - Sp - Brasil.
RESUMO
O escopo desta pesquisa foi comparar o perfil espermático e das enzimas antioxidantes do
ejaculado e de amostras oriundas dos distintos segmentos epididimários de cães. Foram utilizados cinco
cães, entre 1 a 6 anos, dos quais obteve-se amostras de sêmen por manipulação digital do pênis. Após
uma semana, foram colhidas amostras do sêmen epididimário pós-orquiectomia. As amostras foram
avaliadas quanto a motilidade e vigor espermático em análise subjetiva e computadorizada e quanto ao
perfil de catalase, glutationa e superóxido dismutase (SOD). O sêmen da cauda do epidídimo
apresentou características semelhantes ao ejaculado quanto à motilidade, vigor e permeabilidade de
membrana espermática. Houve diferença significativa de tais amostras com aquelas obtidas da cabeça e
corpo do epidídimo, sendo justificado pela imaturidade espermática nestes segmentos. Os valores de
catalase foram reduzidos em todas as amostras analisadas, já a SOD foi detectada sem diferenças
estatísticas em todos os segmentos. Ocorreu maior produção de glutationa na cauda do epidídimo em
relação aos outros segmentos, justificado por ser o segmento mais ativo na síntese de proteínas.
INTRODUÇÃO
A recuperação do sêmen diretamente do epidídimo permite a obtenção de material genético
após castração ou post mortem, alternativa para a reprodução de animais de alto valor zootécnico ou
animais silvestres em risco de extinção. Entre as limitações existentes nesta técnica, pode-se destacar a
perda da qualidade espermática, possivelmente, relacionada à maior concentração de espécies reativas
de oxigênio (ROS), também chamada de estresse oxidativo[6]. As ROS podem causar danos estruturais
diretamente ao espermatozóide, tais como no DNA, lipídeos, carboidratos e proteínas, podendo
induzir a apoptose e morte celular. Assim, prejudica-se os índices de motilidade, vigor e morfologia
espermática, também podendo diminuir a defesa enzimática[6].
Os antioxidantes são substâncias que, em baixas concentrações, retardam ou previnem
significantemente a oxidação de determinado substrato. O organismo produz antioxidantes que
minimizam os efeitos das ROS em condições naturais[3]. Dentre os antioxidantes enzimáticos
encontrados no plasma seminal, destacam-se a superóxido dismutase (SOD), glutationa
peroxidade/glutationa redutase e catalase[6]. Na espécie canina, o perfil das enzimas antioxidantes ainda
não foi precisamente determinado, bem como a ausência de padronização para o processamento do
sêmen epididimário.
Em face do exposto, o objetivo deste estudo foi comparar o perfil espermático e enzimas
antioxidantes do ejaculado com amostras oriundas dos distintos segmentos epididimários (cabeça,
corpo e cauda) de cães.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados cinco cães de raças distintas, entre 1 a 6 anos. Do mesmo animal, foram
obtidas, por manipulação digital do pênis, amostras das três frações do ejaculado (frações prostáticas e
seminal). Após o período de uma semana, foram colhidas amostras do sêmen epididimário pósorquiectomia. Os epidídimos foram acondicionados a 5°C por até 19 horas e, em seguida, o sêmen foi
colhido através de pequenas incisões (<1mm) individuais da cauda, corpo e cabeça do epidídimo, com
o auxílio de um bisturi, e aspirado por pipeta automática e depositado em 100µL do diluidor TALP.
As amostras seminais foram avaliadas quanto à motilidade e vigor em análise subjetiva ao
microscópio óptico (40X) e quanto à análise computadorizada do sêmen (Computer Assisted Sperm
Analysis - CASA; Hamilton-Thorne Ceros 12.1). Para a avaliação da permeabilidade da membrana
plasmática dos espermatozóides, realizou-se esfregaço seminal corado pela eosina/nigrosina e
contagem da porcentagem de espermatozóide vivos e mortos em microscopia óptica (1000X).
As enzimas catalase, SOD e glutationa foram determinadas em todas as amostras de líquido
prostático (fração I e fração III do ejaculado), fração rica do ejaculado (fração II), sêmen da cabeça,
corpo e cauda do epidídimo. As quantificações foram realizadas em espectofotômetro, com
comprimento de onda e temperatura descritas para cada enzima: SOD[2], glutationa[5] e catalase[1].
Os resultados foram testados utilizando a análise de variância para medidas repetidas
(ANOVA). O Teste de LSD foi utilizado para identificação da origem das diferenças no nível de
significância de 5%, isto é, para um p<0,05 considerou-se que houve diferença estatística.
RESULTADO
Na avaliação subjetiva, o sêmen proveniente do ejaculado (fração II) demonstrou valor de
motilidade espermática superior aos segmentos epididimários, seguido das amostras da cauda, corpo e
cabeça, com diferenças estatísticas entre elas (Tabela 1). Quanto ao vigor espermático, não houve
diferença entre o ejaculado e o sêmen da cauda do epidídimo, os quais diferiram em relação ao corpo
do epidídimo, sendo o sêmen proveniente da cabeça o de menor vigor (Tabela 1). As amostras
provenientes da cabeça e corpo do epidídimo apresentaram maior permeabilidade de membrana em
relação ao ejaculado (Tabela 1). Desta forma, pode-se sugerir maior maturidade espermática das
amostras da cauda epididimária, diferentemente das amostras de corpo e cabeça. Estas últimas
apresentaram alterações possivelmente relacionadas à imaturidade espermática, já que tais segmentos
estão relacionados à aquisição da motilidade progressiva dos espermatozóides[7].
Tabela 1. Valores médios e desvios padrão das avaliações subjetivas do sêmen do ejaculado (fração II) e
dos três segmentos epididimários. São Paulo, 2011.
Ejaculado (Fração II)
Cauda
Corpo
Cabeça
Motilidade Espermática (%)
82,0±6,04A
63±5,12B
37±3,96C
0,2±0,13D
Vigor Espermático (1-5)
3,6±0,24A
3,3±0,26A
2,5±0,27B
0±0C
Membrana Íntegra (%)
90,2±5,88A
69,3±4,74B
59,4±6,83B
55,5±7,61B
A-D
na mesma linha indicam diferença estatística (p≤0,05)
Na avaliação pelo CASA, foi observada maior motilidade no sêmen ejaculado e da cauda do
epidídimo, bem como maior porcentagem de espermatozóides rápidos em relação ao corpo e cabeça
(Tabela 2). A motilidade progressiva foi significativamente maior no sêmen ejaculado, apresentando
queda progressiva entre cauda, corpo e cabeça. As amostras do corpo e cabeça do epidídimo
apresentaram maior porcentagem de espermatozóides estáticos, diferindo significativamente do sêmen
ejaculado e da cauda (Tabela 2).
Tabela 2. Valores médios e desvios padrão da análise computadorizada (CASA) do sêmen ejaculado
(fração II) e dos três segmentos epididimários. São Paulo, 2011.
Ejaculado (Fração II)
Cauda
Corpo
Cabeça
Motilidade (%)
78±7,58A
68,7±3,55A
35,4±5,01B
0,6±0,26C
Motilidade Progressiva (%)
55,6±5,27A
33,7±2,10B
8,7±1,26C
0±0D
Espermatozóides Rápidos (%)
65,8±7,55A
54,3±4,55A
22,4±3,90B
0,1±0,10C
Espermatozóides Estáticos (%)
10,0±5,51D
23,2±2,29C
56,7±4,85B
94,8±2,61A
A-D
na mesma linha indicam diferença estatística (p≤0,05)
Quanto à dosagem de antioxidantes, a concentração de superóxido dismutase não apresentou
diferenças estatísticas quando comparada as três frações do ejaculado (Tabela 3) ou mesmo entre os
segmentos epididimários (Tabela 4), resultado que corrobora com estudos realizados em humanos e
roedores[6]. Relata-se a expressão da superóxido dismutase em diversos tecidos do trato reprodutivo
masculino, dentre eles os testículos, a próstata, vesículas seminais e os epidídimos[6].
Tabela 3. Médias e desvios padrão das enzimas antioxidantes nas frações do ejaculado (fração I, II e
III). São Paulo, 2011.
A.B
SOD (UI/mL)
GPx (UI/mL)
Catalase (UI/mL)
Fração I
80,02±35,64A
15,54±2,24A,B
0,75±0,44A
Fração II
116,1±16,96A
46,56±1,74A
0,35±0,35A
Fração III
91,25±10,32A
8,75±1,74B
1,17±0,91A
na mesma coluna indicam diferença estatística (p≤0,05)
Para a dosagem de catalase, foram obtidos valores reduzidos em todas as amostras analisadas,
reforçando os resultados de estudos em homens e ratos (Tabela 3; Tabela 4). Em tais espécies, a
catalase foi detectada no trato reprodutivo em níveis baixos, porém atribui-se à contaminação das
amostras, como por exemplo, por neutrófilos[8]. Assim, recomenda-se a purificação das amostras com o
intuito de eliminar a possibilidade de contaminação do sêmen. Não houve diferenças estatísticas entre
as três frações do ejaculado (Tabela 3), entretanto, quando comparados os segmentos epididimários,
encontrou-se maior concentração deste antioxidante na cauda (Tabela 4).
Tabela 4. Médias dos valores de antioxidantes nas frações do ejaculado (fração I, II e III). São Paulo,
2011.
A.B
SOD (UI/mL)
GPx (UI/mL)
Catalase (UI/mL)
Cabeça
109,78±12,49A
36,43±9,05A
0,09±0,05A
Corpo
121,83±11,52A
47,45±9,65A
0±0A
Cauda
136,15±11,68A
85,94±12,04B
0,41±0,16B
na mesma coluna indicam diferença estatística (p≤0,05)
Na análise da glutationa, observou-se diferença estatística nos valores da fração II, quando
comparada às frações I e III (Tabela 3). De forma semelhante, houve diferença entre a cauda e cabeça e
o corpo do epidídimo (Tabela 4). Entretanto, quando comparada a dosagem da glutationa da fração II
com a dos demais segmentos epididimários, notou-se variação estatística apenas da cauda do epidídimo,
apresentando valores mais elevados. Tal resultado é semelhante ao obtido com epidídimos de ratos,
para os quais observou-se maior produção de glutationa na cauda do epidídimo, justificada por ser o
segmento mais ativo na síntese de proteínas, em função do térmico do ciclo de maturação
espermático[4]. É interessante ressaltar que a fração II do ejaculado apresentou concentrações de
glutationa inferiores à cauda do epidídimo, o que pode ser explicado pela diluição do sêmen em fluidos
prostáticos, fato que não ocorre durante a colheita direta da cauda do epidídimo.
CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos, evidencia-se que o sêmen da cauda do epidídimo, tanto na
análise subjetiva como na avaliação computadorizada, apresentou características semelhantes ao
ejaculado em relação à motilidade, vigor e permeabilidade de membrana. Portanto, o sêmen oriundo da
cauda do epidídimo pode ser empregado para as biotécnicas do sêmen, diferentemente do segmento do
corpo e cabeça do epidídimo.
Quanto à dosagem de antioxidantes, verificou-se que a SOD está sendo produzida na mesma
quantidade em todos os segmentos epididimários e nas três frações do ejaculado. Ainda, o corpo do
epidídimo não apresentou a enzima catalase. Entretanto, ao analisar a dosagem de glutationa, nota-se
maior produção na cauda do epidídimo, em comparação ao corpo e cabeça do epidídimo e às três
frações do ejaculado. Ainda, é possível concluir que a refrigeração dos epidídimos por até 19 horas em
5ºC não altera as características seminais das amostras obtidas a partir da cauda do epidídimo.
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Reproduction. 65, 696-703.
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L. G.; TAPIA, J. A.; PEÑA, F. J., 2010. Determination of glutation peroxidase and superoxide dismutase activities in
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[6] NICHI, M. Efeito do tratamento com antioxidantes e ácidos graxos poli-insaturados em amostras espermáticas
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Universidade de São Paulo, 2009.
[7] OLIVA, S.U.; RINALDO, P.A.; STUMPP, T., 2009. Biologia epididimária: maturação espermática e expressão gênica. O
Mundo da Saúde. 33, 4, 419-425.
[8] VERNET, P.; AITKEN, R.J.; DREVET J.R., 2004. Antioxidant strategies in the epididymis. Molecular and Cellular
Endocrinology. 216, 31-39.
REPARO DE LESÕES INDUZIDAS NA ARTICULAÇÃO FEMOROTIBIOPATELAR DE
OVINOS ATRAVÉS DO IMPLANTE DE BIOMATERIAIS ASSOCIADOS À CÉLULASTRONCO DE POLPA DENTÁRIA HUMANA
Silva, M. V. M.1; Pignatari, G. C.1; Feitosa, M. T.1; Fernandes, I. R.1; Russo, F. B.1; Da Silva, L. C. L. C.1;
Hagen, S. C. F.1; Unruh, S. M.1; Miglino, M. A.1; Seitz, D.2; Beltrão-Braga, P. C. B.1,3
1Departamento
de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (USP).
2Friedrich
3
Baur Forchungsinstitu - Universität Bayreuth, Alemanha.
Escola de Artes, Ciências e Humanidades da Universidade de São Paulo, Brasil.
RESUMO
A terapia celular com células-tronco (CT) surgiu nos últimos anos como uma esperança para o
tratamento de doenças, sem tratamento efetivo, como a osteoartrite (OA) em joelho. Nesse trabalho
utilizamos células-tronco imaturas de polpa dentária humana (CTPD), cultivadas ou não em associação
com biomateriais para o tratamento de lesões osteoarticulares em joelhos de ovinos. As CTPD
humanas foram transduzidas com o gene repórter, EGFP, facilitando o monitoramento das mesmas in
vitro e in vivo. A capacidade de adesão e acomodação das células de polpa dentária no biomaterial foi
observada in vitro 24 horas e um mês após sua aplicação no mesmo, sendo que ocorreu uma maior
dispersão celular no período mais longo, segundo as análises realizadas por técnicas de microscopia
eletrônica de varredura e histologia. Exames radiográficos, ultrassonográficos e artroscópicos foram
feitos para acompanhar a evolução dos tratamentos. Os resultados revelaram que o biomaterial
encontrava-se devidamente inseridos na articulação, sem sinais de rejeição. Além disso, as CTPD
humanas aderem bem ao biomaterial e que em associação possuem uma excelente capacidade aparente
de reconstituição do tecido lesado. Com a realização deste trabalho, concluímos que o protocolo de
terapia utilizado é um bom modelo para o estudo de OA e serve para futuras aplicações clínicas.
INTRODUÇÃO
A osteoartrite (OA) é uma doença articular degenerativa que se caracteriza principalmente por
eventos que desestabilizam a ligação normal de degradação e síntese dos condrócitos da cartilagem
articular, matriz extracelular e osso subcondral [1,2]. O processo patológico da doença ativa afeta todos
os tecidos da articulação, levando a uma alteração metabólica local, alterando o processo de reparo
tecidual e culminando com uma insuficiência articular [2].
Atualmente, com os avanços dos conhecimentos e das técnicas moleculares, a ciência conseguiu
gerar informações importantes para o diagnóstico e tratamento de uma série de doenças outrora sem
tratamento, como as doenças ósseas [6]. Sendo assim, a terapia celular surgiu como uma alternativa,
utilizando as células-tronco (CT) para o tratamento dessas enfermidades.
As CT possuem o potencial de auto-renovação, proliferação, capacidade de responder a
estímulos externos e de originar linhagens celulares com diferentes funções [5].
As
células-tronco
oriundas da polpa dentária humana dos dentes decíduos (CTPD) são uma fonte de células-tronco
mesenquimais (MSC) de fácil obtenção, possuem facilidade no cultivo celular, alta habilidade de
proliferação e diferenciação in vitro em várias linhagens celulares [4].
Junto à terapia celular, temos a engenharia de biomateriais, que tem se mostrado ativa no auxílio
da mesma, pois funcionam como suporte às células, aumentando a sobrevivência após o transplante e
ainda podem permitir que a diferenciação seja mais eficiente [7]. Desta maneira, utilizamos um
biomaterial desenvolvido pela Friedrich-Baur-Institute, na Alemanha constituído por implantes
cerâmicos de hidroxiapatita (HA) e quitosana. Este biomaterial é reabsorvível e altamente
biocompatível unindo um implante cartilaginoso sólido e fornecendo substrato para a construção de
osso subjacente [3]. Além disso, o material é poroso, o que permite a passagem de células, e pode ser
aplicado mimetizando a zona de transição da cartilagem com a superfície óssea [3].
O presente trabalho propõe uma nova abordagem para terapia de lesões orteoarticulares em
ovinos utilizando biomaterial associado ou não a CTPD visando à restauração tanto do tecido ósseo
como cartilaginoso.
MATERIAL E MÉTODOS
As células CTPD humanas foram transduzidas com retrovírus recombinantes carregando o
gene repórter, EGFP. Depois as CTPDs transduzidas com EGFP foram cultivadas em meio Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12 – LGC Biotecnologia) contendo 15% de soro fetal bovino
definitivo (SFB – Hyclone, LGC Biotecnologia), 1% de Penicilina/Estreptomicina (LGC
Biotecnologia), 1% de L-glutamina (Life Technologies) e 1% de aminoácidos não essenciais (MEM
NEAA – Life Technologies) e mantidas em estufa a 37o C com atmosfera úmida contendo 5% de gás
carbônico (CO2).
O biomaterial utilizado neste projeto foi desenvolvido pelo Friedrich-Baur-Forschungsinstitut
für Biomaterilien/ Universitat Bayreuth e Biocer Entwicklungs – GMBH, na Alemanha.
Análise do Biomaterial e da adesão das CTPD ao biomaterial
O biomaterial foi colocado sobre o poço de uma placa de 12 orifícios e embebido por
aproximadamente 3 horas em meio de cultura para CTPD, sendo o meio trocado a cada 30 minutos,
por três vezes. As CTPD humanas foram lavadas duas vezes com tampão salina fostato (PBS),
tripsinizadas, homogeneizadas suavemente e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos. O precipitado
celular obtido foi ressuspendido em meio de cultura e submetido a contagem, sendo 1,5x106 células
aplicadas na superfície do biomaterial que contém a matriz cartilaginosa. Após 30 minutos, meio de
cultura foi acrescentado para cobrir todo o biomaterial. A análise de adesão celular ao biomaterial foi
feita após incubação a 37oC em atmosfera úmida de 5% de CO2 por 24, 48 horas e um mês, sendo que
nesse ultimo caso o meio de cultura era trocado a cada três dias. Para tanto, realizamos a contagem das
células que sobraram no orifício da placa e processamos o biomaterial histologicamente.
Para a MEV, novamente 1,5x106 células foram colocadas no biomaterial e cultivadas em placas
de Petri de 35mm de diâmetro. Em seguida, o meio de cultivo foi retirado e uma lavagem com PBS foi
realizada para posterior fixação com glutaraldeído (3%). Após 2 horas, o fixador foi retirado e as placas
contendo os biomateriais foram lavadas em água destilada e pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1% por
1 hora, seguida de lavagens em água destilada e série crescente de álcoois (50% a 100%). As placas com
o cultivo celular e o biomaterial foram secas em estufa 37°. Na seqüência, foram submetidas a um
revestimento metálico sputting com ouro no aparelho metalizador EMITECH K550, sendo analisadas e
fotografadas em microscópio eletrônico de varredura (LEO 435VP - Zeiss, Germany).
Procedimento Cirúrgico
Após pré-medicação e anestesia adequada, o ovino foi submetido a um procedimento cirúrgico
de artrotomia parapatelar medial, na articulação femorotibiopatelar esquerda. Em seguida, dois pontos
na pele foram feitos para melhor visualização da patela e a mesma foi deslocada lateralmente através de
pressão manual e o membro do animal foi flexionado para melhor visualização dos côndilos femoral
medial e lateral. Com o auxílio de um punch para biópsia de pele de 5 mm foram delimitados os quatros
defeitos osteocondrais, sendo dois na porção proximal do sulco femoral e outros dois na parte distal.
Os defeitos subcondrais com profundidade de 6 mm foram criados com auxílio de furadeira e broca
cirúrgica de 4,5 mm em baixa rotação. A profundidade dos defeitos ósseos foi medida com o auxílio de
um medidor de profundidade cortical, com o intuito de padronizar os defeitos osteocondrais criados e
também para o encaixe perfeito do biomaterial em estudo. Nestes defeitos foram adicionados os
seguintes tratamentos: inserção do biomaterial, das CTPD associadas ao biomaterial, somente as CTPD
e o controle, sem tratamento para a lesão. Em seguida, o animal foi provido de analgésico pósoperatório, mantido em baias e assistido clinicamente.
Para monitorar a evolução clínica do animal e dos devidos tratamentos após procedimento
cirúrgico foram realizados os seguintes exames diagnósticos de imagem: exame radiográfico,
ultrassonográfico e de artroscopia em diferentes momentos.
RESULTADOS
O cultivo das CTPD foi satisfatório observando células e com morfologia fibroblastóides,
alongadas, fusiformes, pontiagudas. Após a transdução com o gene repórter, a morfologia das CTPD
não foi alterada e as mesmas expressaram este gene quando visualizada por microscopia de
epifluorescência.
No ensaio de potencial de adesão das CTPD ao biomaterial observamos após 48h que a
porcentagem de adesão das células ao biomaterial foi alta, em torno de 75% e que apenas 25% do
número total de células encontravam-se aderida no orifício da placa.
Ainda com o objetivo de analisar o potencial de adesão dessas células, os biomateriais foram
mantidos com ou sem células durante 24 horas e um mês. Neste caso pudemos observar que as
estruturas do quitosana foram mantidas quando não houve inserção das células, após 24h de
associação, as CTPDs, encontravam-se mais próximas uma das outras e em um mês mais afastadas,
porém, nas duas condições as células aparentemente estavam aderidas à porção de quitosana do
biomaterial, resultados comprovados por HE e MEV.
Após a caracterização in vitro, as CTPDs aderidas ao biomaterial foram aplicadas na articulação
femorotibiopatelar do ovino através do procedimento cirúrgico mencionado.
Exames radiográficos após 36, 87, 159, 231 e 300 dias do procedimento cirúrgico monstram ao
final do período uma diminuição do espaçamento radiotransparente. Esses exames mostraram que o
biomaterial foi biocompatível com o animal e que os mesmos ficaram perfeitamente inseridos nas
lesões.
Exames ultrassonográficos 66, 87, 122 dias após cirurgia revelaram que os quatro tratamentos
apresentaram um abaulamento de todas as lesões apresentando um aspecto irregular da linha base. Nos
exames realizados após 245 e 311 dias da cirurgia observamos em todas as lesões uma acentuada
diminuição do diâmetro e da profundidade com aspecto regular da linha base, principalmente na lesão
proximal do côndilo lateral. Além disso podemos dizer que no tratamento com CTPD associado ao
biomaterial houve um nivelamentocom o osso subcondral adjacenteNas artroscopias realizadas 93, 174,
280 dias do pós-cirúgico foi observadano orifício proximal medial da articulação femorotibiopatelar
esquerda, local onde foi implantado o biomaterial, uma invaginação do tecido cicatricial com a presença
de alguns pontos hemorrágicos. No local onde foi inserido o biomaterial associado à CTPD, orifício
proximal lateral da articulação, uma área cicatricial no plano da superfície articular, discretamente
irregular com uma coloração esbranquiçada similar a cartilagem adjacente foi observada. Já, no orifício
distal medial local onde foi aplicado apenas células, observamos uma área cicatricial de superfície
irregular e retraída em relação ao plano articular, com coloração esbranquiçada e apresentando
proliferações de aspecto viloso. Entretanto, no orifício distal lateral utilizado como controle,
observamos uma área cicatricial de superfície irregular, retraída em relação ao plano articular,
apresentando áreas hemorrágicas centrais e proliferação de aspecto viloso.
CONCLUSÕES
Os resultados comprovam que as o biomaterial foi compatível e não tóxico as CTPDs in vitro,
permitindo o fluxo de cultura e mantendo assim, a viabilidade das células. Os resultados in vivo obtidos
através dos exames de imagem revelaram que aparentemente o tratamento das lesões utilizando o
biomaterial e o biomaterial associados às CTPDs foram mais eficientes que os demais. Sendo assim,
podemos dizer que este trabalho pode ser uma alternativa para o tratamento de lesões osteocondrais
em um modelo animal. Além disso, o exame artroscópico foi mais eficiente e adequado ao nosso
estudo, permitindo uma boa visualização do tratamento, sendo que os demais exames apenas
permitiram um acompanhamento dos tratamentos.
AGRADECIMENTOS
A FAPESP, INCTC, CNPq pelo suporte financeiro.
REFERÊNCIAS
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HIERARQUIA E GÊNERO MODULAM RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE CÃES
A. T. Akamine1, M. L. Pinheiro1, A. Ribeiro1, V. Ferraz-de-Paula1, V. I. Almeida1, I. D. Taricano2 e F. A.
Costa-Pinto1
1Departamento
2Instituto
de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia / USP,
de Educação, Pesquisa e Desenvolvimento Tecnologico Royal
RESUMO
A posição no ranking hierárquico (dominante – subordinado) dentro de uma matilha influencia
a vulnerabilidade de cães a diversas doenças. Submetemos os animais a um estresse agudo (transporte –
T1) e outro prolongado (reorganização hierárquica imposta – T2) e observamos seus efeitos no sistema
imune de cães Beagles, de 4 meses de idade de ambos os sexos. Avaliamos hemograma, contagem
diferencial de leucócitos circulantes, fenotipagem de linfócitos e atividade de neutrófilos. A posição
hierárquica influenciou a atividade de neutrófilos, e os diferentes estímulos estressores estudados
induziram alterações na imunidade inata e adquirida dos animais, variando entre machos e fêmeas.
Resultados foram considerados quando (p<.05).
INTRODUÇÃO
A relação entre higidez e estresse é evidente e influenciável por diversos fatores ambientais,
sendo que a capacidade individual em lidar com estes fatores é variável e produz alterações significantes
nas respostas orgânicas [1]. Cães alojados em canis são submetidos a situações de estresse devido à
alterações contínuas em seu ambiente, relações sociais e estado emocional podendo levar o animal a
uma condição de maior vulnerabilidade frente a desafios imunológicos aos quais ele é exposto [2].
Neste sentido, compreender as relações entre diferentes padrões comportamentais, referidos
aqui como personalidade dos animais, e seu perfil imunológico, determinante na resistência ou
vulnerabilidade
ao
desenvolvimento
de
enfermidades,
torna-se
crucial
[3].
Parâmetros
comportamentais, como nível hierárquico, podem ser correlacionados a determinados perfis
imunológicos. É consensual que a reação individual ao estresse é um importante fator relacionado à
vulnerabilidade de doenças [4]. Natoli e colaboradores verificaram que gatos bold são mais vulneráveis
ao vírus da imunodeficiência felina [5], porém não foi avaliado se essa vulnerabilidade se deve somente
ao fato de que esses animais se expõem mais ao vírus ou se é devido a maneira como seu sistema imune
responde frente à exposição ao patógeno.
Neste contexto, a neuroimunomodulação que é a ciência que estuda a relação entre Sistema
Nervoso Central e Sistema Imune [6] demonstrando a importância entre estas relações tanto em
processos fisiológicos como patológicos [7]. Esta interação é mediada sobremaneira por uma série de
substâncias comuns ao sistema nervoso central, imune e endócrino, incluindo citocinas, hormônios,
neurotransmissores bem como seus receptores [8]. Pesquisas na área de Neuroimunomodulação têm
sido realizadas há decadas com roedores, mas com cães ainda são escassos.
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da personalidade de cães, alojados
em canis comerciais, sobre alterações imune-neuroendócrinas induzidas por desafios ambientais
(transporte e rearranjo hierárquico) e estabelecer possíveis correlações de comportamento e perfil
imunológico, caracterizando a personalidade de cães (não-invasivo) como valor preditivo do perfil
imunológico (invasivo).
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 30 cães (Canis familiaris) jovens (4 a 6 meses), da raça Beagle, de ambos os
sexos, pesando de 3 a 3,5kg, provenientes de canil comercial (Instituto de Educação, Pesquisa e
Desenvolvimento Tecnológico Royal). A avaliação clínica foi realizada sempre por dois médicos
veterinários e qualquer alteração descartaria o indivíduo do experimento. Os animais foram utilizados
segundo as normas e procedimentos éticos relativos ao uso de animais de laboratório do Comitê de
Ética da FMVZ – USP (nº1799/2009).
Análise comportamental
Todos os animais foram filmados nas baias (filmadora JVC mod. GZ-MG630SUB fixada ao
teto, de modo a filmar cada baia por completo) na presença de seus companheiros habituais durante
cinco horas, para caracterização do etograma de suas ações independentes e da interação com seus
companheiros, empregando-se uma análise focal (Altmann, 1974) por meio do método animal-focal
(Boinski, Swing et al., 1999).
As observações foram analisadas empregando-se uma listagem de comportamentos que aborda
todas as ocorrências em cada animal por vez (ou seja, análise focal) com base em 110 classes de
comportamentos que foram incluídas no etograma (De Palma, Viggiano et al., 2005) divididos em 12
categorias e analisadas de acordo com a duração e frequência do padrão avaliado para a determinação
da personalidade. A coleta e análise dos dados comportamentais dos cães foram realizadas por meio do
programa Observer® XT 10.1 (Noldus Information Technology, Holanda).
Análise imunológica
Os animais foram submetidos a coleta de sangue pela veia jugular, seguindo protocolo de rotina
do Instituto Royal, ao qual foram previamente habituados. Todas as coletas foram realizadas entre 7 e
9h da manhã para que as variáveis analisadas não fossem influenciadas pelo ritmo circadiano. O
hemograma e a contagem diferencial de leucócitos circulantes foram feitos de acordo com técnicas
padronizadas no Laboratório de Hematologia desta faculdade.
A fenotipagem de linfócitos foi realizada através da incubação de amostras de sangue de cada
animal com os seguintes anticorpos marcados com fluorocromos (AbDSerotec) em 3 tubos distintos:
Tubo A (anti-CD3-FITC/anti-CD4-PE), Tubo B (anti-CD3-FITC/anti-CD8-PE) e Tubo C (antiCD21-PE). Para avaliar o burst oxidativo e a fagocitose realizada por neutrófilos as amostras de sangue
de cada animal foram preparadas segundo método preconizado por Hasui e colaboradores (Hasui,
Hirabayashi et al., 1989) e todas as soluções, reagentes e estímulos foram preparados conforme descrito
por Alves, 2005 (Alves, Vismari et al., 2006). A fenotipagem e a atividade de neutrófilos foram
analisadas utilizado-se um citômetro de fluxo (FACScalibur Becton Dickinson Immunocytometry
Sistem, San Jose, Ca, USA). Para todas as análises foram utilizados 10.000 eventos.
RESULTADOS
Experimento 1: Efeitos do transporte sobre parâmetros imunológicos de cães com diferentes
temperamentos - Os animais foram filmados e a personalidade de cada um foi definido por meio da
análise dos vídeos. Amostras de sangue destes animais foram coletadas e as técnicas descritas em
Materiais e método foram empregadas. Vinte dias após a primeira coleta, os cães foram transportados
em duplas dentro de caixas de transporte pelo veículo Volkswagen Kombi do Instituto Royal do canil 1
(São Roque) para o canil 2 (São Paulo), em viagem com duração de 2h. Foram coletadas novas
amostras de sangue no prazo máximo de 1h após o transporte e repetimos as técnicas citadas. A
personalidade dos animais foi confrontada com as variáveis imune-neuroendócrinas para verificarmos
possíveis correlações entre diferentes perfis comportamentais e as alterações imunológicas induzidas
pelo desafio ambiental (transporte).
Observamos que em seu ambiente habitual, sem a introdução de fatores estressantes, animais
subordinados apresentaram aumento na porcentagem (%NF) e intensidade de fagocitose (IF) (Fig.1).
Após serem submetidos ao transporte, o número de leucócitos circulantes aumentou tanto em animais
subordinados quanto nos dominantes sem alterar a porcentagem de seus subtipos (Fig.2). Além disso,
observamos um aumento na %NF e IF, sendo que a IF foi maior em machos (Fig. 3). O burst oxidativo
basal (BOxB) e o burst oxidativo induzido por Staphylococcus aureus (BOxSa) foi aumentado para ambos
os sexos, sendo duas vezes maior em fêmeas (Fig.4). O transporte aumentou a porcentagem de células
CD3+CD4+ (linfócitos T helper) e diminui CD3+CD8+ (T citotóxico), embora a proporção
CD4+/CD8+tenha aumentado somente para fêmeas (Fig.5), e a porcentagem de células
CD21+(linfócitos B) foi diminuída (Fig.6).
Deste modo, o estímulo de transporte mostrou-se capaz de alterar parâmetros imunológicos
dos animais subordinados quanto dos dominantes, diferentemente para machos e fêmeas. Em seguida
avaliamos se o reagrupamento hierárquico apresentaria o mesmo efeito que o estresse por transporte,
visto que a hierarquia é um fator importante para a atividade de neutrófilos e o reagrupamento teria um
efeito de estressor mais prolongado sobre os animais.
Experimento 2: Efeitos do estresse por reagrupamento hierárquico sobre parâmetros
imunológicos de cães - Os animais oriundos do experimento anterior foram submetidos a um novo
agrupamento (animais conhecidos mas que não foram companheiros de baia) por 15 dias, tempo para
que nova hierarquia social fosse estabelecida. Após esse período foram coletadas amostras de sangue e
realizamos os mesmos ensaios do experimento anterior. As filmagens foram repetidas e serão
analisadas com os mesmos critérios. A personalidade dos animais e as alterações decorrentes do
rearranjo hierárquico serão confrontados com as análises das variáveis imune-neuroendócrinas para
verificarmos possíveis correlações entre as alterações no ranking hierárquico (dominante passando a ser
subordinado ou subordinado passando a ser dominante) e as possíveis alterações imunológicas
induzidas por este desafio ambiental.
O reagrupamento reduziu o número de leucócitos circulantes em machos e aumentou em
fêmeas (Fig. 7). A %NF aumentou em machos e diminuiu em fêmeas; e a intensidade de fagocitose foi
aumentada sendo maior em machos do que em fêmeas (Fig. 8). O BOxB foi aumentado independente
de gênero mas o BOxSa foi aumentado somente em machos (Fig. 9). Em relação aos linfócitos, não
houve diferença significativa entre as subpopulações devido ao reagrupamento. Os resultados deste
experimento confirmam o primeiro resultado obtido de que a hierarquia é importante principalmente
com relação a atividade de neutrófilos.
Fig. 1 - %NF e IF maiores em animais subordinados no T0.
Fig.2 – Aumento de leucócitos após transporte, maior em machos em T0.
Fig. 3 – Aumento da %NF e IF após transporte, sendo o aumento de IF maior em machos.
Fig. 4 – Aumento do BOxB e BOxSa após transporte em ambos os sexos, porém significativamente
maior em fêmeas.
Fig.5 – Após o transporte, aumento na porcentagem de células CD3+CD4+, diminuição de
CD3+CD8+. Aumento da proporção CD4+/CD8+ somente nas fêmeas.
Fig. 6 – Porcentagem de células CD21-like diminuída após o transporte.
Fig.7 – Reagrupamento reduz leucócitos em machos e aumenta em fêmeas
Fig.8 – Após reagrupamento, aumento de %NF em machos, redução em fêmeas. Aumento da IF
estatisticamente maior em machos.
Fig.9 – Aumento de BOxB após reagrupamento. Aumento de BOxSa somente em machos.
Lista de abreviaturas:
%NF – Porcentagem de neutrófilos fagocóticos; IF – Intensidade de fagocitose; BOxB – Burst
oxidativo Basal; BoxSa – Burst oxidativo induzido por Staphylococcus aureus
CONCLUSÃO
Estímulos estressores agudos ou prolongados afetam o sistema imunológico de cães, e o fato de
serem dominantes ou subordinados está relacionado com as alterações encontradas no sistema imune
inato. O gênero também mostrou-se importante nesta questão, e observamos que influencia tanto o
sistema imune inato quanto o adaptativo. Estamos analisando comportamento (hierarquia) dos animais
no T2 pois nos parece claro que a alteração do status social produzirá efeitos maiores no sistema imune
diferentemente em relação ao animal que continua no seu status de T0.
AGRADECIMENTOS
Gostaríamos de agradecer às Agências que financiaram esta pesquisa: FAPESP, CAPES e
CNPq.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA TÉCNICA DE CITOLOGIA VAGINAL COMO MÉTODO
ISOLADO PARA DETERMINAÇÃO DA FASE DO CICLO ESTRAL EM CADELAS
Lopes, P. R.; Gonçalves, J. S. A.; Regazzi, F. M.; Dias, L. M. K.; Furtado, P. V.;
Oliveira, C. A.
Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
RESUMO
As fases do ciclo estral da cadela podem ser diferenciadas por exames de citologia vaginal e
dosagens hormonais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da técnica de citologia vaginal
como método isolado para determinar a fase do ciclo. Amostras de sangue foram colhidas e citologias
vaginais foram realizadas paralelamente em 6 cadelas.
Concentrações de progesterona foram
determinadas por radioimunoensaio. As lâminas de citologia vaginal foram numeradas ao acaso. Oito
médicos veterinários analisaram as lâminas e atribuíram a cada uma a fase do ciclo estral. Foi avaliada a
correlação entre os laudos e os níveis séricos de progesterona e contabilizou-se o número de acertos.
Os veterinários conseguiram determinar em apenas 45% das lâminas a fase correta do ciclo estral. A
utilização da citologia vaginal como ferramenta única é um método pouco eficaz para determinação da
fase do ciclo estral em cadelas.
INTRODUÇÃO
A cadela é uma espécie monoéstrica, predominantemente não sazonal, que apresenta quatro
fases bem estabelecidas em seu ciclo estral: proestro, estro, diestro e anestro [4]. Estas fases podem ser
diferenciadas por exames de dosagens hormonais ou citológicos [2]. Estabelecer critérios para a
identificação dos estádios do ciclo estral é essencial para se determinar o momento ideal para cobertura
ou inseminação artificial [7].
Para o acompanhamento do ciclo estral na cadela, a forma mais prática e usual é através de seu
comportamento sexual, associado à citologia vaginal [8]. O exame de citologia vaginal constitui uma das
ferramentas mais utilizadas no manejo do cruzamento em cães [5].
A colpocitologia baseia-se no estádio de maturação que as células do epitélio vaginal apresentam
através do processo esfoliativo. O epitélio da mucosa vaginal é bastante sensível aos hormônios
ovarianos, cujo estímulo desencadeia um processo cíclico de diferenciação, proliferação e maturação
celular [6], ou seja, o perfil citológico da cadela sofre mudanças bem características de acordo com as
fases do ciclo estral [8].
Para a distinção das diferentes fases do ciclo é importante que se conheçam os tipos celulares
predominantes. Durante o proestro, há um aumento no número de camadas do epitélio vaginal e
posterior descamação celular. No início do proestro há predomínio de células parabasais e
intermediárias, poucas células superficiais. Há hemácias, neutrófilos e ocasionalmente bactérias e muco.
Na medida em que a cadela se aproxima do final do proestro, há aumento na quantidade de células
superficiais nucleadas e anucleadas e diminuição das células parabasais e intermediárias. Neutrófilos e
hemácias tendem a desaparecer [5].
O estro se caracteriza pela presença de 80 a 100% de células superficiais [5]. A mudança abrupta
dos tipos celulares indica o primeiro dia de diestro [3]. No diestro voltam a aparecer na lâmina células
parabasais e intermediárias e neutrófilos normalmente estão presentes [5].
A dosagem de LH nas cadelas não é realizada rotineiramente, pois é dispendiosa e consome
tempo, o que explica o fato de muitos pesquisadores e clínicos optarem pela mensuração das
concentrações de progesterona sérica para estimar a ocorrência da ovulação [3].
A relação entre as concentrações séricas de progesterona e a evolução da fase folicular na cadela
é a seguinte: < 1ng/mL no anestro ou proestro; 1,0 a 1,9 ng/mL no dia anterior ao pico de LH; 2,0 a
2,9ng/mL no dia do pico de LH; 3,0 a 3,9ng/mL no dia anterior a ovulação; 4,0 a 10,0 ng/mL no dia
da ovulação; >10ng/mL após a ovulação [1].
O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da técnica de citologia vaginal como método
isolado para determinar a fase do ciclo estral em cadelas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a composição do grupo experimental, foram utilizadas seis cadelas da raça buldogue inglês,
de um a nove anos de idade, hígidas, provenientes de um canil particular.
Amostras de sangue foram colhidas e citologias vaginais foram realizadas paralelamente em
todos os animais a partir dos primeiros sinais de proestro, como edema vulvar e descarga vaginal
sanguinolenta, por 8-20 dias, a cada 2-5 dias, totalizando 31 amostras sanguíneas e 31 lâminas de
citologia vaginal.
As concentrações de progesterona das amostras séricas foram determinadas pela técnica de
radioimunoensaio em fase sólida por meio de conjunto diagnóstico comercial desenvolvido para a
avaliação quantitativa de progesterona no soro humano e já validado para a espécie canina.
As lâminas de citologia vaginal foram numeradas, ao acaso, de 1 a 31. Oito observadores (médicos
veterinários) analisaram as lâminas em microscópio óptico e atribuíram a cada lâmina a fase do ciclo
estral em que achavam que os animais se encontravam (proestro, estro, diestro ou anestro).
A fase do ciclo estral de cada animal foi caracterizada de acordo com as concentrações de
progesterona. Foi considerado animais em proestro aqueles que apresentaram valores de progesterona
< 2,0 ng/mL; animais em estro entre 2,0 e 10,0 ng/mL e animais em diestro > 10,0 ng/mL. Não havia
animais em anestro.
RESULTADOS
Haviam no total 31 lâminas, sendo 7 lâminas de proestro, 11 de estro e 13 de diestro, de acordo
com as dosagens de progesterona sérica correspondente a cada lâmina.
As porcentagens de acertos de cada observador na leitura das 31 lâminas, bem como média e
desvio padrão por fase do ciclo estral e pelo total de lâminas encontram-se registrados na Tabela 1. Na
média, os observadores conseguiram determinar em apenas 45% das lâminas a fase correta do ciclo.
Nenhum observador acertou a fase do ciclo estral em cinco lâminas. Observa-se que não há
problemas de coloração nestas lâminas. Sugere-se que a possível causa desta baixa acurácia no exame
seja a não correlação dos tipos celulares predominantes apresentados nas lâminas com aqueles
usualmente encontrados em cada fase. Todos os observadores acertam a fase do ciclo em quatro
lâminas.
Tabela 1 – Porcentagem de acertos de cada observador e médias e desvios padrão de acertos por fase do ciclo
estral e total de lâminas.
Observador
% acertos
Proestro
Estro
Diestro
Total
1
42,86
9,10
61,54
38,70
2
57,14
9,10
61,54
41,93
3
28,57
54,55
30,77
38,70
4
42,86
72,73
38,46
51,61
5
85,71
63,64
30,77
54,84
6
71,43
36,36
38,46
48,39
7
42,86
36,36
38,46
38,70
8
57,14
54,55
30,77
45,16
Média±DP
53,57±17,13 A
42,05±22,24 A
41,35±12,13 A
44,75±5,92
* Médias com letras iguais não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p> 0,05).
CONCLUSÃO
De acordo com os dados deste trabalho, recomenda-se a associação da colpocitologia com a
dosagem sérica de progesterona para determinação da fase do ciclo estral de cadelas. A colpocitologia é
uma ferramenta pouco eficaz para determinar a fase do ciclo estral em que a cadela se encontra e deve
ser utilizada com muita cautela pelos médicos veterinários que a utilizam para este fim.
AGRADECIMENTOS
À agência FAPESP pelo financiamento do projeto. Aos médicos veterinários Andressa
Dalmazzo, Cristina F. Lúcio, Daniel Angrimani, Jana T. Clemente e Mariana Semião Francisco pela
colaboração na pesquisa.
REFERÊNCIAS
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FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F., 2001. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. São Paulo: Varela,. pp. 6995.
FORMAÇÃO DE CORPÚSCULOS LIPÍDICOS INDUZIDA POR UMA FOSFOLIPASE A2
(CB), ISOLADA DO VENENO DA SERPENTE Caudisona durissa terrificus, EM MACRÓFAGOS
E OS SEGUNDOS MENSAGEIROS ENVOLVIDOS
Giannotti,K.C.1; Leiguez, E.1; Fortes-Dias, C.L.2; Nascimento, N.G.1;
Hage, R.1; Teixeira, C.1
1Laboratório
de Farmacologia, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil; 2Laboratório de Biologia Molecular e
Bioinformática, Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, Brasil.
RESUMO
Corpúsculos lipídicos (CLs) são inclusões citoplasmáticas presentes em número elevado em
leucócitos associados a síndromes metabólicas, como aterosclerose. Nessas síndromes, são encontrados
níveis elevados de fosfolipases A2 (FLA2), enzimas lipolíticas que induzem a síntese de mediadores
lipídicos. Do veneno da serpente Caudisona durissa terrificus foi isolada a CB, uma FLA2 que inibe funções
de macrófagos (MΦ), mas estimula a produção de mediadores inflamatórios, como PGE2 e PGD2. No
entanto, o efeito da CB na formação de CLs, em MΦ, é desconhecida. Neste trabalho foram avaliados
os efeitos da CB, em MΦ isolados, quanto à: i) formação de CLs e segundos mensageiros; ii) alterações
ultraestruturais e iii) distribuição e expressão da proteína ADRP. A CB foi capaz de induzir a formação
de CLs e o recrutamento e aumento da ADRP. Esta proteína co-localizou nos CLs e teve aumento de
expressão em períodos coincidentes com o aumento do número de CLs. Ainda, foi observada a
ativação das vias da PKC, PI3K, MEK1/2, ERK1/2, JNK e 5-LO, mas não da p38MAPK, PTK, COX-1,
12-LO e do receptor de lipoxina para a formação de CLs, estimulada pela CB. A biogênese de CLs,
induzida pela CB, depende da iFLA2, mas não da cFLA2. Ademais, foram evidenciadas a dilatação do
retículo endoplasmático e a associação deste com os CLs. Estes dados poderão contribuir para o
conhecimento das ações de sFLA2s na funcionalidade de MΦs, além de fornecer subsídios para
utilização de toxinas, com estrutura e função de FLA2, como ferramentas para o estudo de distúrbios
lipídicos.
INTRODUÇÃO
Os corpúsculos lipídicos (CLs) são inclusões citoplasmáticas presentes na maioria das células
eucarióticas, importantes para o metabolismo lipídico, armazenamento e transporte de lipídeos neutros.
Essas organelas contêm concentrações elevadas de lipídeos neutros em seu interior e são envoltas por
uma monocamada de fosfolipídeos de membrana, na qual estão ancoradas proteínas específicas, como
a ADRP (adipose differentiation-related protein) [1]. Esta proteína está relacionada à captação de ácidos
graxos para o interior dos corpúsculos, sendo considerada um marcador dessas inclusões lipídicas. O
aumento da formação dos CLs é verificado em condições em que há aumento das concentrações
intracelulares de ácidos graxos, em leucócitos ativados por patógenos, em leucócitos associados
processos inflamatórios e/ou a doenças humanas inflamatórias e/ou relacionadas a distúrbios lipídicos,
como é o caso da aterosclerose [2] e do diabetes [3]. Desse modo, atribui-se um papel importante a
essas organelas na desintoxicação celular e em doenças de natureza inflamatória ou infecciosa. Além
disso, a formação dos CLs está relacionada à síntese de mediadores lipídicos, pois compartimentalizam
enzimas dos sistemas ciclooxigenase (COX) e 5-lipoxigenase (5-LO), prostaglandinas e ácido
araquidônico (AA), além de proteínas de transdução de sinal [4]. A partir do veneno da serpente
Caudisona durissa terrificus foi isolada a CB, uma FLA2 secretada. Esta enzima é encontrada no veneno
total, complexada à crotapotina, constitutindo a crotoxina, o componente majoritário do veneno e
também sob a forma livre. A CB é neurotóxica e miotóxica. Em macrófagos, esta enzima inibe funções
de defesa, como o espraiamento e a fagocitose, mas estimula a produção de H202 e NO e de
mediadores inflamatórios, como a PGE2 e PGD2 além do AA, o precursor destes mediadores [5; 6]. No
entanto, o efeito da CB na formação de corpúsculos lipídicos, em macrófagos, não é conhecida. Desse
modo, os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos da CB, em macrófagos murinos, em cultura,
quanto: i) à formação de CLs e aos segundos mensageiros envolvidos neste efeito; ii) às alterações
ultraestruturais dessas células e iii) à distribuição e a expressão da proteína ADRP.
MATERIAL E MÉTODOS
Os macrófagos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Swiss machos, após 96
horas da injeção de tioglicolato a 3%. A viabilidade celular, sob a ação da CB, foi avaliada pelo teste do
MTT. A formação dos CLs foi mensurada por marcação com tetróxido de ósmio a 1% e contagem sob
microscopia de contraste de fase. As alterações ultraestruturais, induzidas pela CB, em macrófagos,
foram avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão 1 hora após incubação das células com a
toxina, seguida de fixação e processo específico de contrastação. Para determinar a relação
concentração-efeito da toxina, os macrófagos (2x105 células) foram incubados com diferentes
concentrações da CB (0,1; 0,2; 0,4 e 0,8 µM) ou RPMI (controle), por 1 hora. A cinética deste efeito foi
avaliada em macrófagos incubados com a CB (0,4 µM) ou RPMI, por 1, 3, 6 e 12 horas. Para avaliar a
distribuição da proteína ADRP, após 3 horas de incubação com a CB, foi realizada a técnica de
imunofluorescência e a análise por microscopia confocal. Para avaliar a participação dos segundos
mensageiros envolvidos na formação de CLs, induzida pela CB, foram efetuadas interferências
farmacológicas com inibidores específicos de diferentes proteínas de transdução de sinal. O teor
protéico da ADRP foi mensurado por Western Blotting em macrófagos incubados com a CB ou RPMI,
por 1, 3, 6 e 12 horas. Os dados obtidos foram analisados por ANOVA, seguido do teste de Tukey.
Foram considerados significativos valores de p< 0,05.
RESULTADOS
Os resultados mostraram que a CB não modificou a viabilidade celular dos macrófagos em
nenhuma das concentrações (0,1 a 0,8 µM) ou tempos de incubação testados (1-12h). A incubação dos
macrófagos com a CB, nas concentrações de 0,2 a 0,8 µM, mas não a concentração de 0,1 µM, resultou
em um aumento significativo do número de CLs em relação ao controle. Este efeito foi observado a
partir da 1ª hora e manteve-se até a 12ª hora. A análise ultraestrutural confirmou esses resultados e
demonstrou a presença de CLs fracamente eletrondensos, em macrófagos estimulados com a CB, mas
não em células controles, com alguns CLs em estreita associação com o retículo endoplasmático (RE).
Ainda, foram observadas dilatações do RE, em células estimuladas com a CB. Além disso, a CB induziu
o recrutamento da ADRP para os CLs e causou aumento do teor protéico da mesma nos macrófagos,
após 1, 3 e 12 horas de incubação. O pré-tratamento dos macrófagos com os compostos H-7 (6 µM),
inibidor da PKC ou LY294002 (1 µM), inibidor da PI3K ou com o inibidor da JNK (JNKi II, 2 µM) ou
PD98059 (25 M), inibidor da ERK1/2, ou U0126 (25 M) inibidor da MEK1/2, reduziram
significativamente a formação de CLs induzida pela CB. Da mesma forma, o composto BEL (2 µM),
inibidor da fosfolipase A2 independente de cálcio e o composto MK-886 (1 µM), inibidor da 5-LO,
reduziram significativamente a formação de CLs induzida pela CB (0,4 µM). No entanto, o prétratamento das células com os compostos SB202190 (5 µM), inibidor da p38MAPK ou BOC-2 (10 µM),
antagonista do receptor de lipoxina ou herbimicina A (5 M), inibidor da PTK ou valeril salicilato (30
µM), inibidor da COX-1 ou baicaleina (10 µM), inibidor da 12-LO ou pirrolidina-2α (1 µM), inibidor da
fosfolipase A2 citosólica, não alterou a formação de CLs estimulada pela CB.
CONCLUSÃO
A CB é capaz de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos peritoneais
murinos em cultura. Além disso, a CB induz o recrutamento e aumento do teor protéico da ADRP
nessas células. Uma vez que houve a co-localização da ADRP com os CLs, bem como o aumento do
seu teor protéico em períodos coincidentes com o aumento do número de CLs, sugere-se que esta
proteína tenha um papel fundamental na formação destas inclusões, induzida pela CB. Em relação aos
segundos mensageiros envolvidos na formação de CLs, estimulada pela CB, foi observado que este
efeito é mediado pela ativação das vias da PKC, PI3K, MEK1/2, ERK1/2, JNK e 5-LO, mas não da
p38MAPK, PTK, COX-1 ou 12-LO. Da mesma forma, a utilização do antagonista do receptor de lipoxina
não alterou a formação de CLs induzida pela CB, sugerindo que este mediador não esteja envolvido na
formação destas inclusões. Ainda, a biogênese de CLs, induzida pela CB, depende da iFLA2, mas não da
cFLA2, indicando uma interação entre fosfolipases A2 secretadas e as independentes de cálcio para a
formação de CLs. As alterações ultraestruturais do RE e as evidências de associação dos CLs com esta
organela sugerem que o RE seja um sítio relevante para a síntese dos CLs, sob o efeito da CB. Em
conjunto, estes dados poderão contribuir para o conhecimento das ações desencadeadas por sFLA2s,
do grupo IIA, na funcionalidade de macrófagos, que são elementos centrais na resposta imune inata,
além de fornecer subsídios para a utilização de toxinas com estrutura e função de fosfolipases A2 como
ferramentas para o estudo de distúrbios ligados a homeostasia lipídica. Ainda, este estudo poderá
contribuir para o melhor entendimento dos efeitos desencadeados pelo veneno de Caudisona durissa
terrificus, uma vez que os CLs são sítios intracelulares para a síntese de mediadores envolvidos na
resposta imune inata.
AGRADECIMENTOS
À CAPES, pela bolsa de mestrado concedida; ao CNPq e INCTTOX, pelo apoio à pesquisa; e
ao Alexander (Instituto Butantan), por viabilizar o uso do microscópio confocal.
REFERÊNCIAS
[1] BRASAEMLE, D.L., DOLIOS, G., SHAPIRO, L., WANG R., 2004. Proteomic analysis of proteins associated with lipid
droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol. Chem. 279, 45, 46835-46942.
[2] WANG, X.; REAPE, T. J.; LI, X.; RAYNER, K.; WEBB, C. L.; BURNAND, K. G.; LYSKO, P. G. Induced expression
of adipophilin mRNA in human macrophages stimulated with oxidized low-density lipoprotein and in atherosclerotic
lesions. FEBS Lett. 462, 1-2, 145-150, 1999.
[3] VAN HERPEN, N.A.; SCHRAUWEN-HINDERLING, V.B., 2008. Lipid accumulation in non-adipose tissue and
lipotoxicity.Physiol Behav. 94, 2, 231-41.
[4] BOZZA, P. T.; PAYNE, J. L.; GOULET, J. L.; WELLER, P. F., 1996. Mechanisms of platelet-activating factor-induced
lipid body formation: requisite roles for 5-lipoxygenase and de novo protein synthesis in the compartmentalization of
neutrophil lipids. J. Exp. Med.183, 4, 1515-1525.
[5] SAMPAIO, S. C.; RANGEL-SANTOS, A. C.; PERES, C. M.; CURI, R.; CURY, Y., 2005. Inhibitory effect of
phospholipase A(2) isolated from Crotalus durissus terrificus venom on macrophage function. Toxicon. 45, 5, 671-676.
[6] MOREIRA, V.; GUTIÉRREZ, J.M.; SOARES, A.M.; ZAMUNÉR, S.R.; PURGATTO, E.; TEIXEIRA, C., 2008.
Secretory phospholipases A2 isolated from Bothrops asper and from Crotalus durissus terrificus snake venoms induce
distinct mechanisms for biosynthesis of prostaglandins E2 and D2 and expression of cyclooxygenases. Toxicon. 52, 3,
428-39.
EFEITOS TRANSGERACIONAIS DA ADMINISTRAÇÃO PRÉ-NATAL DO
LIPOPOLISSÁCARIDEO (LPS) EM CAMUNDONGOS COM DEPRESSÃO-SIMILE OU
NÃO, SELECIONADOS PELO MODELO DE SUSPENSÃO NA CAUDA
1, 2 Reis-Silva, Thiago Marinho; 1, 3 Bernardi, Maria Martha
1-Grupo de Pesquisa em Neuroimunomodulação, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2-Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, 3-Instituto de Ciências da
Saúde, Universidade Paulista, São Paulo, SP, Brasil.
RESUMO
Dados da literatura sugerem que a depressão, doença que afeta milhões de pessoas, poderia
estar ligada a alterações no sistema imune durante a gestação. O aumento da compreensão das bases
biológicas e comportamentais desse transtorno são de grande importância. Assim, o objetivo desse
trabalho foi avaliar o comportamento e sistema imune de camundongos submetidos a modelos
experimentais de depressão. Para isso, camundongos machos e fêmeas foram separados em diferentes
grupos após seleção de um comportamento depressivo-simile e saudável pelo teste da suspensão da
cauda (TSC). Após formação dos grupos, animais de mesmo comportamento foram cruzados. As
fêmeas de cada grupo receberam no 15° dia da prenhês 100µg/kg de LPS intraperitoneal ou solução
salina à 0,9%. A prole destas fêmeas (geração F1) foi avaliada na idade adulta pelo TSC e cruzadas com
machos de comportamento similar também avaliados pelo TSC. Procedeu-se da mesma forma para se
obter as gerações F2 e F3. O objetivo deste procedimento foi verificar se a ativação do sistema imune
por uma endotoxina na geração parental selecionada com um comportamento depressivo-simile ou não,
influenciaria as respostas dos animais das gerações F1, F2 e F3. Os resultados revelaram que os animais
submetidos ao TSC e classificados como depressivos e saudáveis tiverem mais descendentes com o
mesmo comportamento durante as 3 gerações avaliadas. Notou-se ainda que a exposição da endotoxina
na geração parental influenciou as respostas no TSC na dependência da geração e sexo.
INTRODUÇÃO
A depressão afeta hoje mais de 121 milhões de pessoas em todo mundo e estimá-se que em
aproximadamente uma década se tornará a 2° doença mais responsável pela perda prematura de vida
entre todas as idades e sexos [6]. Esse transtorno possui uma alta comorbidade, contribuindo para uma
sobrecarga do sistema de saúde em diversos paises [3], no qual o Brasil está incluso. Atualmente, cerca
de 25% das pessoas afetadas por esse transtorno não tem acesso a tratamentos efetivos [6]. Dessa
forma estudos que busquem um aumento da compreensão das bases biologicas e comportamentais
desse transtorno são de grande valia. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o comportamento e
sistema imune de camundongos submetidos a modelos experimentais de depressão.
MÉTODOS
Camundongos da linhagem swiss, machos e fêmeas, foram submetidos ao teste de suspensão da
cauda (TSC) [4] e dividos em 4 grupos experimentais (depressivo-veículo (DV), depressivo-lps (DL),
saudável-veículo (SV) e saudável-lps (SL)) de acordo com o seu resultado. Esse teste consiste na
suspensão do camundongo pela cauda a cerca de 50cm do solo durante o período de 6 minutos, nos
quais o tempo de imobilidade do animal é avaliado. Esse teste teve como objetivo avaliar o
comportamento depressivo-simile e saudável do animal. Com os grupos estabelecidos, as fêmeas foram
cruzadas com machos de comportamento semelhante também avaliados pelo TSC e após a
confirmação da prenhes, foram administrados 100µg/kg de LPS intraperitoneal (IP) no 15° dia ou
solução salina à 0,9%. Com o nascimento dos filhotes, foram realizados testes de comportamento
materno [2] no 5° dia de lactação e após a maturação dos mesmos (aproximadamente 60 dias), foi
realizado o teste de suspensão da cauda para avaliar o comportamento depressivo-simile e saudável
dessa geração, seguido da avaliação motora em Campo Aberto [1]. Esses procedimentos foram
realizados até a obtenção das 3 gerações filiais usadas no trabalho. Além disso, após o desmame dos
filhotes de cada geração, os camundongos da geração anterior (machos e fêmeas) foram eutanasiadas
para coleta de sangue e estruturas cerebrais para futuras análises.
RESULTADOS
Os resultados reveleram que os animais submetidos ao teste de suspensão da cauda e
classificados como depressivo-simile (DV e DL) e saudáveis (SV e SL ) tiverem mais descendentes com
o mesmo comportamento durante 3 gerações filias (GF) avaliadas. Abaixo segue a tabela com a
proporção e porcentagem dos comportamentos avaliados.
Geração Filial 1
Grupo
DV
DL
SV
SL
Tabela 1.
machos.
Fêmeas
Machos
Total de Comportamento
Comportamento
Total de Comportamento
Comportamento
%
% Grupo
%
Animais Depressivo
Saudável
Animais Depressivo
Saudável
24
17
70,83
7
29,17 DV
19
15
78,94
4
27
18
66,66
9
33,33 DL
31
29
93,54
2
19
7
36,84
12
63,15 SV
24
9
37,5
15
18
6
33,33
12
66,66 SL
23
8
34,78
15
Proporção do comportamento tipo-depressivo e saudável da geração filial 1 de
%
21,05
6,45
62,5
65,21
fêmeas e
Geração Filial 2
Grupo
DV
DL
SV
SL
Tabela 2.
Fêmeas
Machos
Total de Comportamento
Comportamento
Total de Comportamento
Comportamento
%
% Grupo
%
Animais Depressivo
Saudável
Animais Depressivo
Saudável
34
23
67,64
11
32,35 DV
22
20
90,9
2
28
20
71,42
8
28,57 DL
20
16
80
4
25
9
36
15
64 SV
19
8
42,1
11
23
8
34,78
15
65,21 SL
17
4
23,52
13
Proporção do comportamento tipo-depressivo e saudável da geração filial 2 de
%
9,1
20
57,9
76,47
fêmeas e
machos.
Geração Filial 3
Fêmeas
Machos
Total de Comportamento
Comportamento
Total de Comportamento
Comportamento
Grupo
%
% Grupo
%
%
Animais Depressivo
Saudável
Animais Depressivo
Saudável
DV
20
18
90
2
10 DV
20
14
70
6
30
DL
25
17
68
8
32 DL
24
20
83,33
4
16,66
SV
11
3
27,27
8
72,72 SV
14
2
14,28
12
85,71
SL
3
0
0
3
100 SL
11
0
0
11
100
Tabela 3. Proporção do comportamento tipo-depressivo e saudável da geração filial 3 de fêmeas e
machos.
Verificou-se que, na geração F1, F2 e F3, as fêmeas do grupo DV obtiveram um maior tempo
de imobilidade quando comparadas com as do grupo SV no TSC, contudo, só foi encontrada diferença
significante na geração F1. As fêmeas do grupo DL e SL não apresentaram diferenças significantes
estatisticamente, exceto na geração F2. No entanto, nota-se uma tendência na distinção do tempo de
imobilidade entre os grupos DV e DL vs SV e SL. Nos machos, foi encontrada diferença estastística
nos tempos de imobilidade dos grupos DV e SV como DL e SL nas 3 gerações filiais avaliadas pelo
TSC. Notou-se uma relação com o uso da ndotoxina, sendo esse sexualmente dimórfico. Segue abaixo
os gráficos comparativos das 3 gerações de fêmeas e machos. Para análise estatistica foi realizado
ANOVA de uma via para dados paramétricos assumindo P < 0.05. Foi utilizado o Teste de Bartlett
para igualdade de variâncias e, caso significante, o teste de Kruskal-Wallis. Os gráficos são apresentado
em média e desvio padrão.
Geração F1 - Fêmeas Avaliadas
100
Geração F2 - Fêmeas Avaliadas
Geração F3 - Fêmeas Avaliadas
150
*
100
80
60
40
***
100
Segundos
Segundos
Segundos
80
50
20
60
40
20
0
0
DV
DL
SV
SL
0
DV
DL
SV
SL
DV
DL
SV
SL
Gráfico 1. Fêmeas avaliadas pelo Teste de Suspensão da Cauda – Geração filial 1 (DV n=24, DL n=27,
SV n=19, SL n=18), 2 (DV n=34, DL n=28, SV n=25, SL n=23) e 3 (DV n=20, DL n=25, SV n=11,
SL n=3)
Geração F1 - Machos Avaliados
Geração F3 - Macho s Avaliado s
Geração F2 - Machos Avaliados
150
100
80
**
***
*
***
50
60
40
DL
SV
SL
DV
DL
40
0
0
DV
***
20
20
0
**
60
Segundos
100
Segundos
Segundos
80
DV
DL
SV
SL
SV
SL
Gráfico 2. Machos avaliados pelo Teste de Suspensão da Cauda – Geração filial 1 (DV n=19, DL
n=31, SV n=24, SL n=23), 2 (DV n=22, DL n=20, SV n=19, SL n=17) e 3 (DV n=20, DL n=24, SV
n=14, SL n=11)
CONCLUSÃO
Foi possível notar que a administração da endotoxina (LPS) influiu no comportamento
depressivo-simile e saudável, sendo sexualmente dimórfico. Além da relação com o uso da endotoxina, é
possível pensar que a transmissão do comportamento poderia estar relacionada com a interação com o
ambiente [5] (no caso a relação materna). Contudo, ainda é cedo para afirmar quais as relações que esse
comportamento tem, de fato, com o comportamento materno, uma vez que diversos testes desse
trabalho ainda se encontram sob análise.
Pode-se concluir que o Teste de Suspensão da Cauda foi capaz de selecionar um
comportamento que se manteve durante as 3 gerações avaliadas nesse trabalho,
e que esse
comportamento teve relação com o uso da endotoxina. Assim, os objetivos desse trabalho foram
alcançados parcialmente, uma vez que já foram obtidos resultados através
de um modelo
comportamental de depressão [4]. Cabe agora continuar com futuros experimentos e à análise dos já
realizados para que novos dados possam ser discutidos.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia por me permitir realizar
os experimentos em seus laboratórios de comportamento, a minha orientadora Maria Martha Bernardi
pela orientação e amizade, ao grupo de neuroimunomodulação pelo constante aprendizado e por
último, mas não menos importante, ao CAPES, que me permitiu através do auxilio financeiro a
dedicação a esse trabalho.
REFERÊNCIAS
[1] ARCHER, J. Tests for emotionality in rats and mice: A review. Animal Behaviour. v. 21, p. 205–235, 1973.
[2] CHAMPAGNE, F. A., FRANCIS, D. D., MAR, A., & MEANEY, M. J. Variations in maternal care in the rat as a
mediating influence for the effects of environment on development. Physiology and Behavior.. 79, 359–371, 2003.
[3] COX, B. M.; ALSAWAH, F.; MCNEILL, P. C.; GALLOWAY, M. P. & PERRINE, S. A., 2011. Neurochemical,
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[4] STERU, L., 1985. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology.
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[5] TANG, W.; HO, S., 2007. Epigentic reprogramming and imprinting in origins of disease. Rev. Endocr Metab. Disord. 8,
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[6]
World
Health
Organization.
Depression
URL:http://www.who.int/mental_health/management/depression/definition/en/ Acesso: -Jan-2010.
PESQUISA DE ISOFORMAS DA FIBRONECTINA EM CULTURAS DE LONGA
DURAÇÃO DE ESTROMA MEDULAR DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À
DESNUTRIÇÃO PROTÉICA
1
Graziela Batista da Silva, 1Jackeline Oliveira Soares Beltran, 2Iana Suly Santos Katz, 1Karina Nakajima,
1
Amanda Rabello Crisma, 2Orlando Garcia Ribeiro, 1Primavera Borelli
1Departamento
2Laboratório
de Análises Clínicas e Toxicológicas, FCF-USP São Paulo
de Imunogenética, Instituto Butantan, USP São Paulo
INTRODUÇÃO
A fibronectina (FN) esta presente na matriz extracelular (MEC) dos tecidos, exercendo várias
funções tais como manutenção da integridade do tecido, adesão, proliferação, diferenciação e migração
celular. No entanto estes processos dependem da interação entre célula/MEC e esta interação ocorre
por meio dos domínios presentes na FN [3, 7, 8]. Porém alguns destes domínios, denominados EDA,
EDB e IIICS podem estar excluídos, incluídos ou parcialmente incluídos na FN em virtude do splicing
alternativo, podendo assim ocorrer variantes de FN, denominadas de isoformas e estas podem exercer
diferentes funções [1, 2, 7] Dados já publicados do grupo evidenciaram alterações quantitativas de FN
in vivo [5, 6] e no ciclo celular de células tronco/progenitoras hematopoéticas (Lin ) na medula óssea
(MO) de camundongos desnutridos, ocasionando hipoplasia [4, 6]. O presente trabalho teve como
objetivo avaliar a produção e a pesquisa de isoformas, ex vivo, de FN no estroma medular obtido por
meio de cultura de longa duração (CLD) de células da MO de animais desnutridos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BI/6J, machos, 3 meses de idade, separados
em 2 grupos. O grupo controle (C) recebeu uma ração com 12% de caseína e o grupo desnutrido (D)
com 2% de caseína, por 5 semanas. Após este período os animais foram sacrificados para a obtenção
das células totais da MO para a realização das CLD onde foram utilizadas com 3x106 células totais
cultivadas a 33°C, 5% CO2 por 28 e 35 dias em meio Iscove's com 25% de soro eqüino. Foram
realizados, nas CLD, western blotting (WB) para a quantificação da FN e região EDA e RT-PCR para
pesquisa de isoformas de FN.
RESULTADOS
No estroma medular do 28° dia o grupo D apresentou aumento significativo na quantidade de
FN em relação ao grupo C (figura 1). No entanto no 35° dia o grupo D apresentou uma menor
quantidade de FN em relação ao grupo C (figura 1). Também foi observado que o grupo D do 35° dia
apresentou menor quantidade de FN em relação ao grupo D do 28 ° dia. Em relação à região EDA o
grupo D tanto do 28° dia quanto no 35° dia apresentou menor quantidade da região EDA quando
comparados ao grupo C do 28° e 35° dia (figura 2). Foi observado por meio do RT-PCR no estroma
medular do 28° dia, tanto o grupo C quanto do grupo D, apresentam RNAm para FN, no entanto
ambos os grupos apresentam RNAm para FN com a ausência e a presença das regiões EDA, EDB e as
três subunidades da IIICS, regiões estas suscetíveis ao splicing alternativo (figura 3).
Fibronectina Total
*
**
100
**
*
80
u.a
60
40
20
di
as
35
di
as
35
id
o
le
D
es
nu
tr
nt
ro
Co
Co
D
es
nu
tr
nt
ro
le
id
o
28
28
di
as
di
as
0
Grupos controle de 28 dias (n=7) e 35 dias (n=
Figura 1: Quantificação da fibronectina total do grupo
7), o grupo desnutrido de 28 dias (n=9) e 35 dias (n=8). Os resultados estão expressos por
média ± desvio padrão. O n indica o número de animais utilizados no experimento. *p < 0,
05 quando comparado o grupo desnutrido ao grupo controle; **p<0,01 quando comparado o
grupo desnutrido com o grupo controle
Região EDA
**
*
100
*
u.a
80
60
40
20
di
as
35
di
as
D
es
nu
tr
id
o
35
Co
nt
ro
le
28
D
es
nu
tr
id
o
Co
nt
ro
le
28
di
as
di
as
0
Grupos
Figura 2: Quantificação da região EDA do grupo controle de 28 e 35 dias (n=4) e o
grupo desnutrido de 28 e 35 dias (n=4). Os resultados estão expressos por média ±
desvio padrão. O n indica o número de animais utilizados no experimento. *p < 0, 05
quando comparado o grupo desnutrido ao grupo controle; **p<0,01 quando comparado
o grupo desnutrido com o grupo controle
FibronectinaTotal
A
C
C
C D
D
RegiãoEDA
D
B
D
C
C
C
D
D D
D
bp
500
400
bp
500
400
300
250
200
FN
150
EDA(+)
300
250
200
150
EDA(-)
100
100
50
Região EDB
IIICS
C
C
C
C
D D
D
D
D
bp
(120) 500
(95) 400
300
250
200
(0)
150
100
bp
600
500
400
300
250
200
150
C
C
C
D
D
D D
EDB(+)
EDB(-)
50
100
50
Figura 3: Pesquisa de isoformas da fibronectina pelo RT-PCR das culturas de longa duração do 28° dia.
(A): RNAm da fibronectina total. (B) RNAm da região EDA, onde EDA (+) refere-se a presença da
região e EDA (-) a ausência da região. (C) Variantes da região IIICS, onde (120) refere-se a presença
completa da região, (95) a inclusão parcial da região e (0) a exclusão total da região. (D) RNAm da
região EDB, onde EDB (+) refere-se a presença da região e EDB (-) a ausência da região. (C) animais
controle, (D) animais desnutridos. O número de animais utilizados para este experimento foi de n=3
para o grupo controle e n=4 para o grupo desnutrido.
CONCLUSÃO
O aumento de FN no grupo D no estroma medular do 28º dia reproduziu os dados obtidos in
vivo. A diminuição da FN no 35º dia do grupo D poderia ser devido à menor produção de FN e ou a
degradação por metalaproteinases e outras proteases. A menor quantidade da região EDA no grupo D
tanto 28º e 35º dia, pode ser resultante de splicing alternativo na molécula da FN. O estroma medular do
grupo D possui diferentes isoformas de FN, e estas refletem em alterações na interação célula/MEC,
conseqüentemente levando a alterações observadas no ciclo celular das células Lin- nos animais
desnutrido.
AGRADECIMENTOS
Fapesp e CAPES
REFERÊNCIAS
[1] BRENMOEHL, J.; LANG, M., HAUSMANN, M.; LEEB, S. N.; FALK, W.; SCHÖLMERICH, J.;GÖKE, M.;
ROGLER, G., 2007. Evidence for a differential expression of fibronectin splice forms ED-A and ED-B in Crohn’s
disease (CD) mucosa. Int. J. Colorectal. Dis. 22, 611-623.
[2] FRENCH-CONSTANT C., 1995. Alternative splicing of fibronectin-many different proteins but few different
functions. Exp. Cell Res., 22, 261- 271.
[3] LEISS, M; BECKMANN, K; GIRÓS, A; COSTELL, M; FASSLER, R., 2008. The role of integrin binding sites in
fibronectin matrix assembly in vivo. Cur. Opin. Cell Biol. 20, 502-507.
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camundongos submetidos á desnutrição protéica. São Paulo, 170 p. 616.15 CDD (N163a).
[5] VITURI, C. L.; BORELLI, P. ALVAREZ-SILVA, M.; TRETIN, A. Z., 2000. Alteration of the bone marrow in
extracelullar matrix in mice undernourished. Braz. J. Med. Biol. Res. 33, 889-95.
[6] XAVIER, J.G., FAVERO, M.E., VINOLO, M.A.R., ROGERO, M.M., DAGLI, M.L.Z., ARANA-CHAVEZ, V.E.,
BOROJEVIC, R.; BORELLI, P., 2007. Protein-energy malnutrition alters histological and ultrastructural characteristics
of the bone marrow and decreases haematopoiesis in adult mice. HistolHistopathol. 22, 6, 651-60.
[7] WHITE, E. S; BARALLE, F. E; MURO, A. F., 2008. New insights into form and function of fibronectin splice variants.
J. Pathol, 216, 1-14.
[8] YANG, R. S; TANG, C. H; LING, Q. D; LIU, S. H; FU, W. M., 2002. Regulation of fibronectin fibrillogenesis by
protein kinases in cultured rat osteoblasts. Mol Pharmacol, 61, 1163 – 1173.
STATUS DE FERRO EM RATOS ALIMENTADOS COM RAÇÕES HIPERLIPÍDICAS
Eduardo Henrique Szpak Gaievski1, Alexandre Rodrigues Lobo1, Lilian Rose Marques de Sá2, Ana Lina
de Carvalho Cunha Sales1, Célia Colli1
1 Laboratório
de Minerais em Alimentos e Nutrição, Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental, Faculdade de
Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo
2
Laboratório de Gastroenterologia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo
RESUMO
O presente estudo piloto foi delineado com o objetivo de avaliar os efeitos do consumo de uma
ração hiperlipídica (HL) (60% de energia proveniente dos de lipídeos [óleo de soja e banha suína];
Harlan Teklad Laboratories, WI, USA) no status de ferro em ratos Wistar em crescimento. O consumo de
ração e o ganho de peso corporal foram monitorados diariamente. No 18º dia, realizou-se um teste
intraperitoneal de tolerância à insulina nos animais em jejum de 12h. Fezes foram coletadas para
avaliação do índice de absorção aparente de minerais (entre os dias 20 e 24). No momento da eutanásia,
tecidos foram coletados para determinação da adiposidade (peso dos depósitos de gordura,
concentração de lipídeos na carcaça, histologia) e para determinação do conteúdo de minerais por
EAA. Não foram observadas diferenças no peso corporal, na adiposidade, na concentração de Hb e no
conteúdo hepático de Fe após 24 dias de ensaio. No entanto, observou-se moderada esteatose hepática
e infiltração de macrófagos no tecido adiposo branco epididimal e aumento no conteúdo de Fe no baço
dos animais hiperlipídicos. Além disso, observou-se maior excreção fecal de lipídeos e menor absorção
aparente de Fe no grupo HL, condição que pode ter sido influenciada por interações entre os nutrientes
no lúmen intestinal. Por outro lado, a redistribuição compartimental do Fe, observada nos animais
alimentados com a ração HL, pode ser uma tentativa de manter a homeostase desse mineral em
condições de estresse (como é o caso de situações de consumo excessivo de lipídeos).
INTRODUÇÃO
A obesidade é condição influenciada por fatores genéticos e ambientais e caracteriza-se pela
expansão do tecido adiposo (TA) (hipertrofia e hiperplasia dos adipócitos) como resultado de um
desequilíbrio energético positivo [1]. Na obesidade, o aumento de macrófagos ativados no TA é
precedido pela síntese de moléculas de adesão nas células endoteliais e pela migração de monócitos do
sangue para o TA [4]. A ativação de macrófagos em estados pró-inflamatórios resulta em alterações
morfológicas e funcionais que intensificam a resistência do hospedeiro à infecção. Além disso, o
aumento na produção de citocinas (IL-1, TNF-α, IL-6) por essas células afeta a atividade biossintética
do hepatócito, resultando em alterações associadas com a resposta de fase aguda [2]. Estudos têm
demonstrado que citocinas (TNF-α, IL-6) e hormônios (hormônio tireoidiano, insulina e estrógeno)
influenciam os níveis de ferritina (uma proteína de fase aguda), como uma estratégia de defesa do
organismo de reduzir a disponibilidade de Fe para agentes patogênicos [2]. Esse quadro é
acompanhado por hipoferremia e alterações hematológicas frequentemente observadas em situações de
anemia de doença crônica (ou anemia da inflamação) [5]. Deste modo, o presente estudo piloto
apresenta como proposta investigar o status e biodisponibilidade de Fe em ratos alimentados com
rações hiperlipídicas, modelo sistematicamente utilizado em estudos de obesidade experimental.
MATERIAL E MÉTODOS
O projeto foi aprovado em 2009 pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da
FCF/USP (Protocolo No. 250). Ratos (Rattus novergicus, var. albinus) machos, recém-desmamados, da
linhagem Wistar Hannover, provenientes do Biotério de Produção e Experimentação da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas e do Instituto de Química da USP, foram mantidos em gaiolas semimetabólicas
individuais, de aço inoxidável, em ambiente com temperatura e umidade controladas (22°C; 55%,
respectivamente), com ciclos de claro/escuro de 12 h. Rações experimentais, semipurificadas e
peletizadas, baseadas na formulação descrita pela empresa Harlan Teklab Laboratories (Madison, WI,
EUA) para ratos em crescimento, foram adquiridas por importação e acondicionadas na câmara fria
(~4°C) da FCF da USP. As rações do grupo controle (CON) foram elaboradas com aproximadamente
2% de óleo de soja e 2% de gordura suína (banha), de acordo com a formulação TD.06416
(aproximadamente 10% de calorias provenientes de lipídeos). A ração hiperlipídica (TD.06414) foi
elaborada com 30 g/kg de lipídeos na forma de óleo de soja, suplementada com 310 g/kg na forma de
banha (aproximadamente 60% de calorias provenientes de lipídeos). Após 7 dias de adaptação, os
animais foram distribuídos em dois grupos experimentais (CON e HL). Ração e água (desmineralizada)
foram oferecidas ad libitum. O consumo foi registrado e calculado diariamente considerando a oferta e a
sobra de ração; o peso corporal foi verificado e registrado a cada dois dias. Com a finalidade de analisar
a capacidade de o animal converter a energia consumida em peso corporal, foi calculada a eficiência
alimentar (EA), dividindo-se o ganho total de peso corporal dos animais (g) pela energia total ingerida
(Kcal). Os animais sofreram eutanásia após anestesia por injeção intraperitoneal com solução de
anestésicos (xilazina, 25 mg/kg; quetamina, 10 mg/kg; 1:2).
Os depósitos de tecido adiposo (TA) (epididimal e retroperitonial) foram coletados, e os pesos
utilizados para calcular o índice de adiposidade (%): (TA epididimal + TA retroperitonial) × 100/peso
corporal. A concentração de Fe foi determinada, nas fezes, fígado e baço, por espectrofotometria de
absorção atômica (EAA; AAnalyst 100, Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA) após digestão úmida
(HNO3:H2O2, 5:1; v/v) em amostras previamente secas (105°C, 12 h) utilizando uma lâmpada de
catodo oco a 248,3 nm e fenda de 0,2 mm. A absorção aparente de ferro e de lipídeos (totais) foi
calculada como: ingestão – excreção fecal) × 100/ingestão. A hemoglobina foi analisada nas amostras
de sangue usando-se o reagente de Drabkin e a leitura realizada em espectrofotômetro à 545 nm [2].
Após a eutanásia, os ratos foram necropsiados para exame macroscópico de órgãos, e fragmentos do
fígado e do tecido adiposo epididimal e retroperitoneal foram coletados e fixados em solução
tamponada de formalina 10%. Após fixação de 24 h, os fragmentos foram processados segundo técnica
padrão e incluídos em parafina. Os blocos de parafina foram seccionados em cortes de 5 µm. O exame
histológico das lâminas foi realizado em microscopia de luz, com aumentos de 40, 100 e 400x.
RESULTADOS
Não foram observadas diferenças no peso corporal, na adiposidade, na concentração de Hb e
no conteúdo hepático de Fe após 24 dias de ensaio. No entanto, observou-se moderada esteatose
hepática e infiltração de macrófagos no tecido adiposo branco epididimal (Figura 1) e aumento no
conteúdo de Fe no baço dos animais hiperlipídicos (Figura 2). Além disso, observou-se maior excreção
fecal de lipídeos (30,5 ± 3,5 e 126,2 ± 34,3 mg/dia para os grupos CON e HL, respectivamente) e
menor absorção aparente de Fe no grupo HL (Figura 2), condição que pode ter sido influenciada por
interações entre os nutrientes no lúmen intestinal.
Figura 1: Consumo de ração (A,B), ganho de peso (C) e índice de adiposidade (D) de ratos alimentados
com rações controle e hiperlipídicas por 24 dias. Resultados expressos como média ± desvio padrão (n
= 6). Valores considerados significativamente diferentes quando P < 0,05 (Teste t Student). Cortes
histológicos do tecido adiposo epididimal. Em CON, adipócitos de tamanho regular com um único
vacúolo no citoplasma. Em HL, adipócitos com múltiplos vacúolos no citoplasma (seta) e macrófago
(seta menor). Hematoxilina e eosina, 400x. VCL = veia centro lobular.
Figura 2: Concentração de hemoglobina (A), Fe no fígado (B) e baço (C) e absorção aparente de Fe (D)
de ratos alimentados com rações controle e hiperlipídicas por 24 dias. Resultados expressos como
média ± desvio padrão (n = 6). Valores considerados significativamente diferentes quando P < 0,05
(Teste t Student).
CONCLUSÃO
A redistribuição compartimental do Fe, observada nos animais alimentados com a ração HL,
pode ser uma tentativa de manter a homeostase desse mineral em condições de estresse (como é o caso
de situações de consumo excessivo de lipídeos).
AGRADECIMENTOS
FAPESP
REFERÊNCIAS
[1] ALBEIRT, K.G.; ZIMMET, P.; SHAW, J., 2005. The metabolic syndrome – a new worldwide definition. Lancet. 366,
1059-1062.
[2] DRABKIN, D.L., AUSTIN, J.H., 1935. Spectrophotometric studies. II. Preparations from washed blood cells: nitric
oxide hemoglobin and sulphemoglobin. J. Biol. Chem. 112, 51-65.
[3] RASO, G.M.; IRACE, C.; ESPOSITO, E., et al., 2009. Ovariectomy and estrogen treatment modulate iron metabolism
in rat adipose tissue. Biochem. Pharmacol. doi: 10.1016/j.bcp.2009.05.034.
[4] SHOELSON, S.E.; HERRERO, L.; NAAZ, A., 2007. Obesity, inflammation, and insulin resistance. Gastroenterology.
132, 2169-2180.
[5] WEISS, G., 2009. Iron metabolism in the anemia of chronic disease. Biochim. Biophys. Acta. 1790, 682-693.
O PAPEL DO GUARANÁ E DE SEUS PRINCIPAIS PRINCÍPIOS ATIVOS NA RESPOSTA
IMUNE ADAPTATIVA
Caniceiro, B.D.1; Latorre, A.O.1; Carvalho, L.R.2; Górniak, S.L.1
1Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP; 2Instituto de Botânica de São Paulo
RESUMO
Paullinia cupana, popularmente conhecida como guaraná, é uma planta medicinal que apresenta,
entre outros efeitos, propriedades quimiopreventiva e antitumoral. Entretanto, não existem relatos na
literatura sobre seus efeitos no sistema imune. Assim, neste estudo foram avaliadas as respostas celular
e humoral de camundongos tratados com guaraná e seus principais princípios ativos, cafeína e
catequina, sendo observada a diminuição de ambas as respostas nos animais tratados com a planta,
catequina e a associação dos princípios ativos. Portanto, os resultados aqui expostos demonstram, pela
primeira vez, que a ingestão de guaraná, devido a ação da catequina, reduz a imunidade adaptativa,
através da diminuição das respostas celular e humoral. Além disso, sugere-se a utilização desta planta no
tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, caracterizadas por uma resposta exacerbada do
sistema imune.
INTRODUÇÃO
Paullinia cupana, popularmente conhecida como guaraná, é uma planta medicinal brasileira que
apresenta como principais constituintes químicos a cafeína e a catequina [3]. Apresenta efeitos
quimiopreventivo e antitumoral agindo, principalmente, na redução da proliferação celular do tumor
[4]. No entanto, ainda são desconhecidos os efeitos do guaraná e de seus principais princípios ativos
sobre o sistema imune.
O sistema imune, por sua vez, apresenta importante papel não só no combate ao câncer, mas
também no controle de infecções [1]. Desta forma, qualquer alteração nas células que compõem este
sistema prejudica sua habilidade de reconhecimento e desenvolvimento de uma resposta protetora
eficaz, tornando assim o indivíduo suscetível às doenças oportunistas e tumores [2].
Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da administração do pó das
sementes de guaraná (chamado agora somente de guaraná) e seus principais princípios ativos, cafeína e
catequina, sobre o sistema imune de camundongos adultos.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e tratamentos
Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6 separados em 5 grupos: Co, G,
CF, CT e FT e tratados por gavage durante 15 dias com 2000 mg/kg de guaraná (G), 134,4 mg/kg de
cafeína (CF), 93,2 mg/kg catequina (CT) ou a associação de ambos os princípios ativos (grupo FT). Já
os camundongos do grupo Co receberam apenas água pelo mesmo período e via de administração. Ao
término do tratamento procederam-se os experimentos abaixo descritos para avaliação do sistema
imune.
Avaliação da hipersensibilidade do tipo tardia (DTH)
Os camundongos foram sensibilizados com 60 µL contendo 1x108 eritrócitos de carneiro
(SRBC) suspensos na proporção de 1:1 de PBS e Adjuvante completo de Freund (FCA), por via
subcutânea (sc), na base da cauda. Sete dias após a sensibilização foi mensurado o diâmetro da pata
esquerda de todos os camundongos, sendo considerado como tempo zero e, em seguida, foram
desafiados na mesma pata com 20 µL contendo 1x108 SRBC em PBS. Após 24, 48 e 72 horas foi
medido o aumento de volume, através de nova mensuração da pata esquerda destes camundongos. O
cálculo do aumento absoluto foi feito subtraindo-se o diâmetro da pata medido nos intervalos acima
citados do valor do diâmetro medido a 0h, e o resultado foi expresso em mm.
Avaliação da proliferação de linfócitos T antígeno-específica
Para avaliação da proliferação de linfócitos T antígeno-específica foi utilizado o protocolo
proposto por [5]. Primeiramente foi induzida a resposta imune celular através da imunização dos
camundongos com 100 µL de anatoxina tetânica (AT) [50 LF/mL] diluída 1:1 em PBS e FCA, por via
sc. Sete dias após a imunização, estes camundongos foram eutanasiados para coleta do baço e formação
de uma suspensão celular. As hemácias presentes nesta suspensão foram lisadas com solução de lise e
os esplenócitos foram mantidos por duas horas em estufa (37ºC, 5% CO2 e atmosfera humidificada)
para separação das células não-aderentes (NA) e aderentes (AD). Em seguida, as células foram cocultivadas na proporção de 30:1 (NA:AD), ou seja 1,93x105 NA para 6,5x103 AD, na presença ou não
de AT (20LF/poço). Por fim, as placas foram mantidas em estufa por 72 horas, sendo realizada a
aquisição das células por citômetria de fluxo (FACS Calibur). O resultado foi expresso através do índice
de proliferação que é determinado pela relação entre a % de linfócitos estimulados e a % de linfócitos
basais.
Titulação de anticorpos pela técnica de Hemaglutinação
Os camundongos foram imunizados com 5x108 SRBC em 200 µL de PBS, por via
intraperitoneal (ip), e após sete dias procedeu-se a entánasia para coleta do soro que foi utilizado para
análise da hemaglutinação. Para tal, realizou-se uma diluição seriada de 1:2 com o soro de um
camundongo não imunizado com SRBC em placas de 96 wells de fundo em U previamente acrescidas
de salina, que foi utilizado como controle negativo. Em seguida, diluiu-se o soro dos camundongos
imunizados nos poços seguintes e então, foi acrescentado 25 µL de SRBC [9x108 hemácias/mL] em
cada poço. Por fim, as placas foram incubadas em estufa (37º, 5% CO2 e atmosfera humidificada) por
1h, sendo o título de anticorpos determinado como aquele em que a hemaglutinação foi semelhante ao
do controle negativo e também às diluições subseqüentes.
RESULTADOS
Para avaliarmos a resposta imune celular em camundongos tratados com o guaraná e seus
princípios ativos foram empregados os testes de DTH e proliferação de linfócitos T antígenoespecífica.
Em relação à reação de DTH, pode-se observar que, após 48 horas do desafio com os SRBC, os
camundongos tratados com a catequina apresentaram diminuição do edema da pata que foi mantida até
72 horas após a aplicação do mesmo. Neste tempo, também foi observada a redução deste parâmetro
nos animais tratados com guaraná (Tabela 1).
Tabela 1 – Avaliação da resposta de DTH de camundongos tratados com guaraná - G - (2000
mg/kg), cafeína - CF - (134,4 mg/kg), catequina - CT - (93,2 mg/kg) e cafeína +
catequina - FT - (134,4 mg/kg + 93,2 mg/kg), por via oral, durante 15 dias
Co
G
CF
CT
FT
24 horas
0,29 ± 0,07
0,30 ± 0,08
0,34 ± 0,06
0,30 ± 0,07
0,32 ± 0,08
48 horas
0,24 ± 0,08
0,24 ± 0,10
0,27 ± 0,13
0,19 ± 0,11
0,27 ± 0,11
72 horas
0,14 ± 0,06
0,11 ± 0,08
0,15 ± 0,08
0,12 ± 0,11
0,15 ± 0,13
Tempo
Grupos
Quanto à proliferação de linfócitos T antígeno-específica, verificou-se que camundongos
tratados com guaraná, catequina e a associação dos princípios ativos apresentaram redução significante
deste parâmetro, conforme figura 1.
índice de proliferação
2.0
1.5
*
*
*
1.0
0.5
0.0
Co
G
CF
CT
FT
Figura 1 – Avaliação da proliferação de linfócitos T antígeno- específica de camundongos tratados
com guaraná - G - (2000 mg/kg), cafeína - CF - (134,4 mg/kg), catequina - CT - (93,2
mg/kg) e cafeína + catequina - FT - (134,4 mg/kg + 93,2 mg/kg), por via oral,
durante 15 dias. *p<0,01 pós-teste Dunnett
Por fim, foi avaliada a resposta imune humoral através da técnica de hemaglutinação que mede
o nível de anticorpos presente no soro de camundongos previamente imunizados com um antígeno
específico (neste caso os SRBC), sendo observada redução significante deste parâmetro nos
camundongos pertencentes aos grupos CT e FT (Figura 2).
15
*
*
CT
FT
log2
10
5
0
Co
G
CF
Figura 2 – Avaliação do título de anticorpos de camundongos tratados com guaraná - G - (2000
mg/kg), cafeína - CF - (134,4 mg/kg), catequina - CT - (93,2 mg/kg) e cafeína +
catequina - FT - (134,4 mg/kg + 93,2 mg/kg), por via oral, durante 15 dias. *p<0,01
pós-teste Dunnett
CONCLUSÃO
Estes resultados mostram pela primeira vez que o guaraná, devido à catequina, diminui a
resposta imune celular e humoral em camundongos sadios. Por este motivo, sugere-se a utilização desta
planta no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, caracterizadas por uma resposta
exacerbada do sistema imune, principalmente dos linfócitos T.
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus amigos da pós-graduação: Thaísa, Marcos e Sheila que de alguma forma
contribuíram com este trabalho e à FAPESP (processo: 09/12117-4) pelo financiamento deste estudo.
REFERÊNCIAS
[1] Abbas, A.K., Litchman, A.H., Pillai, S., 2007. Cellular and Molecular Immunology. Saunders Elsevier, Philadelphia.
[2] Coico, R., Sunshine, G., and Benjamini, E., 2003. Immunology: A Short Course. Wiley & Sons, New York.
[3] Espinola, E.B.; Dias, R.F.; Mattei, R.; Carlini, E.A., 1997. Pharmacological activity of Guaraná (Paullinia cupana Mart.) in
laboratory animals. Journal of Ethnopharmacology, 55, 223-229.
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em modelos experimentais in vivo e in vitro. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo.
[5] Latorre, A.O; Furlan, M.S; Sakai, M.; Fukumasu, H.; Hueza, I.M.; Haraguchi, M.; Górniak, S.L., 2009.
Immunomodulatory Effects of Pteridium aquilinum on Natural Killer Cell Activity and Select Parts of the Cellular
Immune Response of Mice. Journal of Immunotoxicology, 6, 104-114.
PROTOCOLO PARA AVALIAÇÃO DE ANTI-HELMÍNTICOS: PARÂMETROS
HEMATOLÓGICOS EM POEDEIRAS COMERCIAIS
Laís Damasio dos Santos1, Silvana Lima Gorniak2, Andreia Mauruto Chernaki Leffer2
1Faculdade
2Faculdade
de Engenharia de Alimentos e Zootecnia (FZEA/USP);
de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Patologia (FMVZ/USP)
RESUMO
Com a crescente demanda por alimentos seguros (sem contaminantes), o emprego de antihelmínticos e outros medicamentos em avicultura tem se tornado cada vez mais restrito. Desta forma,
para registro de novos produtos ou revalidação daqueles já registrados, se faz necessário a avaliação de
diferentes parâmetros de qualidade e segurança, que inclui a avaliação da inocuidade desses fármacos.
A inocuidade de medicamentos pode ser estimada em testes clínico-patológicos de hematologia,
bioquímica e urinálise. Apesar do uso corrente de anti-helmínticos em avicultura, não há protocolos
específicos para avaliação da inocuidade desses medicamentos em galinhas poedeiras. Esses protocolos,
uma vez desenvolvidos, serão de extrema utilidade para a indústria farmacêutica quando do
desenvolvimento de novos produtos, bem como a órgãos governamentais, no tocante a registro de
novos produtos. O presente trabalho tem por finalidade apresentar a utilização da patologia clinica
(hematologia) para auxilio na avaliação e monitoramento dos efeitos do albendazole em poedeiras
comerciais.
INTRODUÇÃO
O desempenho zootécnico de poedeiras comerciais pode ser afetado por uma série de fatores
que podem estar relacionados ao insuficiente manejo sanitário dos animais. De fato, devido à
necessidade de normatização de ações sanitárias relacionadas ao setor avícola, no ano de 1994 o
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) instituiu o Programa Nacional de
Sanidade Avícola (PNSA), face à importância da produção avícola no cenário nacional e internacional.
O Brasil está entre os cinco maiores produtores de ovos do mundo, cuja produtividade é
inferior apenas à China, EUA, Índia e Japão [6]. No ano de 2005, foram produzidos 58,8 milhões de
toneladas de ovos e estima-se que em 2015 esta produção possa chegar a 70,9 milhões de toneladas [1].
As endoparasitoses representam sérios riscos sanitários em aviários de postura comercial, onde
as galinhas são criadas em regimes de confinamento, e que é agravado pelo longo período de vida
produtiva desses animais (até 70 semanas). O grau e severidade da infestação por helmintos pode
causar queda na postura, anemia e até morte dos animais.
Os endoparasitos que comumente causam infestações em poedeiras são: Ascaris spp., Capillaria
spp., Heterakis spp., e Syngamus trachea (Nematoda), além dos cestódeos Davainea proglotina e Raillietina
tetragona [2].
A intervenção de anti-helmínticos em aves é comumente realizada com piperazina, levamisol ou
oxifendazol, via água de bebida. Os benzimidazóis são os anti-helmínticos mais utilizados para controle
de nematódeos intestinais em aves, sendo os imidotiazóis indicados em caso de resistência cruzada
neste grupo de medicamentos [2].
O objetivo do presente estudo foi verificar a inocuidade do albendazol em poedeiras
comerciais, mediante avaliação dos parâmetros hematológicos.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado no Centro de Pesquisa em Toxicologia Veterinária (CEPTOX) do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo, Campus de Pirassununga, SP.
Poedeiras da linhagem Dekalb White , com aproximadamente um ano de idade, obtidas de
criações comerciais foram alojadas em gaiolas de 100 x 45 x 45 cm, divididas em quatro partes de 23 x
45 x 45 cm, providas de comedouros tipo calha e bebedouros nipple, abastecidos de água e ração
comercial ad libitum.
As aves foram pesadas imediatamente antes do tratamento. Foram utilizados três tratamentos
com 15 aves por grupo. Os grupos foram tratados com albendazol (Ricobendazole 10), administrado
por gavagem, nas doses de 0 (grupo controle), 10,0 e 20 mg/kg/PV. A escolha das doses foi feita com
base em prévios estudos, onde os autores relatam ser a eficácia superior a 90% [5].
Vinte e quatro horas após a administração do medicamento, foi realizada a colheita de sangue
mediante punção da veia ulnar superficial, na quantidade de 2 mL para realização do hemograma
completo (contagem total de eritrócitos e leucócitos em câmara de câmara de Neubauer) e
determinação do hematócrito, dosagem da concentração de hemoglobina, além da confecção de
esfregaços sanguíneos para contagem diferencial de leucócitos [3]. As amostras de sangue foram
acondicionadas em tubos contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA),
homogeneizadas, refrigeradas e processadas em no máximo 24 horas. Os esfregaços sanguíneos foram
realizados no momento da colheita de sangue.
Os resultados foram submetidos à análise de variância, com comparação entre tratamentos pelo
teste t de Student utilizando o programa GraphPad Prism 3 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
RESULTADOS
Não foram observadas diferenças significantes (p<0,05) nos parâmetros hematológicos entre os
dados dos animais provenientes dos grupos tratados e controle. Foi observado, em todas as aves dos
diferentes grupos, um discreto aumento nos valores de hematócrito, bem como nos níveis de
heterófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos, além no decréscimo no número de linfócitos (Tabela 1).
As alterações observadas parecem não estar relacionadas ao emprego do albendazol, e sim ao
grau de parasitismo das aves em estudo. As aves apresentavam infestações mistas por ectoparasitas
(Dermanyssus spp., Ornithonyssus sylviarum e Menacanthus spp.) e endoparasitas (Heterakis spp.) (dados não
publicados). De fato, valores de hematócrito inferiores a 35% podem indicar anemia a qual pode
ocorrer pelo parasitismo por ácaros hematófagos, assim como o aumento no número de basófilos
acompanhado de eosinofilia está associado a estresse e parasitismo interno e externo [4].
Tabela 1. Valores hematológicos (média ± DP) para poedeiras comerciais tratadas com albendazol
(Ricobendazol).
Parâmetros
VR
0.0 (controle)
1.0
2.0
Eritrócitos (x106/µL)
2,5 – 3,5
2,6 ± 0,6
2,5 ± 0,3
2,8 ± 0,2
Hematócrito (%)
35 – 55
29,2 ± 3,6
30,3 ± 1,8
29,4 ± 2,3
Hemoglobina (g/dL)
8,6 – 15,2
8,3 ± 2,2
8,3 ± 0,6
7,8 ± 0,7
VCM (fl ou x10-15)
90 – 140
112,4 ± 15,6
122,6 ± 16,9
117,9 ± 26,1
CHCM (%)
26 – 35
29,2 ± 6,9
27,2 ± 2,5
26,7 ± 3,2
Leucócitos (x103/µL)
7,9 – 24,3
16,0 ±61,9
13,0 ± 65,3
12,9±71,0
Heterófilos
25,5 – 38,0
37,6 ± 10,7
40,5 ± 7,9
38,7 ± 10,6
Linfócitos
56,8 – 69,5
48 ± 9,5
46,3 ± 9,8
42,9 ± 10,6
Eosinófilos
0 – 0,8
2,1 ± 1,8
1,9 ± 1,4
3,3 ± 2,3
Basófilos
0 – 0,6
5,4 ± 2,0
5,1 ± 3,4
5,8 ± 2,6
Monócitos
3,2 – 5,0
6,8 ± 4,8
6,1 ± 4,9
9,3 ± 7,1
VR= Valores de referência para Gallus gallus domesticus; VCM= Volume corpuscular médio; CHCM=
Hemoglobina corpuscular média; fL= fentolitros; dL= decilitros.
CONCLUSÃO
A partir dos resultados é possível inferir que o albendazol foi inócuo às aves nas doses
estudadas.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Iniciação Científica da USP, RUSP (Institucional) e à Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). À Leonila Ester Raspantini e Paulo Cesar Raspantini, pelo
suporte técnico.
REFERÊNCIAS
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AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS NUCLEADAS DO
INFILTRADO OSTEOGÊNICO CENTRIFUGADO E NÃO CENTRIFUGADO
RETIRADAS DA MEDULA ÓSSEA DA CRISTA ILÍACA CANINA
Gomes, J. S.1; Ferrigno, C. R. A.2; Lopes, R. S.1; Cunha, O.1
1 Laboratório
2
de Ortopedia e Traumatologia Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP
Prof. Dr. do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP
INTRODUÇÃO
Apesar do desenvolvimento da tecnologia médica e do melhor manejo ortopédico das fraturas
nos últimos anos, algumas destas ainda consolidam irregularmente, outras demoram muito para
consolidar e algumas resultam em pseudo-artroses [7].
Embora atualmente o emprego de enxerto ósseo autólogo seja considerado a técnica padrão
para se estimular a consolidação óssea, várias complicações estão associadas a este procedimento,
incluindo danos ao sítio doador, cicatrizes dolorosas, hematomas, infecção, claudicação e suprimento
limitado [10;14;20]. Estes problemas deram origem a várias linhas de pesquisa utilizando técnicas de
engenharia tecidual que têm apresentado resultados promissores.
No âmbito da ortopedia veterinária, as opções de engenharia tecidual incluem métodos para
captura e transplante de células indiferenciadas precursoras de osteoblastos, de plasma rico em
plaquetas, de proteína morfogenética óssea e introdução local ou sistêmica de hormônios peptídeos e
fatores de crescimento [6;8;9;15;18].
Apesar de eficaz, a cultura e o transplante de células indiferenciadas de medula óssea são
procedimentos complexos, caros e que envolvem uma metodologia dividida em três etapas: obtenção
das células, desenvolvimento da cultura e implantação [11].
Como alternativa, a administração direta de aspirados de medula óssea no local de interesse tem
sido pesquisada clínica e experimentalmente na medicina veterinária, buscando estimular a consolidação
de fraturas, tratar pseudo-artroses e preencher defeitos ósseos adquiridos por trauma ou ressecções
ósseas cirúrgicas [1;2;3;5;12;13;16;17]. Entretanto a quantidade relativamente pequena em relação às
células nucleadas da medula (1:100000) tem direcionado as pesquisas para seu isolamento, purificação e
concentração, uma vez que a formação óssea está diretamente relacionada ao número de células tronco
no foco de lesão óssea [2;4].
Visando a viabilidade econômica na rotina clínica e o aumento do número de células
mesenquimais indiferenciadas no foco de lesão óssea, o objetivo deste estudo foi comparar a
concentração de células nucleadas do infiltrado osteogênico centrifugado e não-centrifugado da medula
óssea da crista ilíaca canina. Além de comprovar que o método da centrifugação não reduzia a
viabilidade celular do infiltrado da medula óssea. Para tais objetivos utilizou-se o método de
centrifugação descrito por Connolly et al (1995).
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo envolveu a utilização de vinte cães, pesando entre 10 e 30 kg, com faixa etária de 2
a 5 anos.
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos, um grupo denominado de
centrifugado onde o aspirado de medula óssea foi centrifugado e o outro de controle onde o aspirado
da medula óssea não foi centrifugado.
Para ambos os grupos foram coletados 5 ml de medula óssea da crista ilíaca de cada animal com
agulha do tipo Illinois® e seringa previamente embebidos em solução de heparina a 1:1000. Após a
coleta, o material foi enviado ao laboratório em banho de gelo para análise.
No caso do grupo centrifugado, foi utilizado para análise somente o material sedimentado no
tubo após a centrifugação (1500 rpm a 20ºC, durante 10 minutos), o “buffy-coat”, enquanto que para o
grupo controle utilizou-se o aspirado em sua forma original.
Amostras de 50 microlitros do concentrado de células tronco, dos grupos centrifugado e
controle, foram diluídas em PBS 0,1 molar, pH 7,4 na proporção de 1:20 cada. Na seqüência foi feita a
diluição com azul de tripano 0,1% a 1:20 cada, para a contagem das células e realização do teste de
viabilidade celular. O preparo de cada grupo foi colocado na câmara de Neubauer, preenchendo-a
completamente e deixando-a em repouso por 5 minutos em câmara úmida. O número de células
nucleadas, do grupo centrifugado e controle, foi então contado nos quatro quadrados laterais,
separando-se a contagem em células viáveis e inviáveis, ou seja, células mortas.
O cálculo do número de células e da viabilidade celular foi realizado de acordo com seguintes
fórmulas:
Nº de células por ml = (nº de cél. viáveis + nº de cél. mortas) x 1.000.000
Viabilidade celular (%) = células viáveis x 100 / (células viáveis + células mortas)
Os resultados do presente projeto foram analisados estatisticamente através do teste T não
pareado, também conhecido como teste “T-Student” utilizado para amostras independentes. Para todas
as categorias analisadas considerou-se um intervalo de confiança de 95% e, conseqüentemente, um
índice de confiança de 0,05.
RESULTADOS
Através do método de centrifugação descrito por Conolly et al (1995) foi possível constatar uma
maior concentração de células nucleadas no centrifugado osteogênico do que no aspirado na sua forma
original. O número médio de células nucleadas nos aspirados de medula óssea foi de 1,44 x 107 células
por mililitro, enquanto que os aspirados após centrifugação apresentaram um número médio de 15,4 x
107 células nucleadas por mililitro.
Em seu estudo com coelhos, Connolly et al (1995) obtiveram um número médio de 0,2 x 107
células por mililitro no aspirado não centrifugado e 0,36 x 107 células por mililitro após centrifugação
simples. Já Vaz (2006) obteve em seu estudo, também com coelhos, uma concentração de células
nucleadas em média três vezes maior no centrifugado osteogênico do que no aspirado em sua forma
original. Estes autores [2;19] tiveram um aumento médio de 2,4 vezes a concentração de células
nucleadas após centrifugação, enquanto que o presente estudo alcançou um aumento de 10,69 vezes.
Concordamos que essas diferenças encontradas se devem mais ao modelo experimental utilizado em
nosso estudo, do que a outros fatores.
Pelo teste de viabilidade celular, confirmamos que as células permaneciam viáveis após a
centrifugação, excluindo a possibilidade de lesão ou morte celular causada pelo método utilizado. A
média de viabilidade celular que encontramos foi de 91,5% no grupo controle e de 95,38% no grupo
centrifugado. Apesar da proximidade desses valores, nos levando a crer que a diferença desses grupos
não era importante, a análise estatística demonstrou que havia diferença significativa entre os dois
grupos, assim como Connolly (1995) e Vaz (2006) relataram em seus estudos. Mostrando-nos a
influência da centrifugação no aumento do número de células nucleadas viáveis do aspirado de medula
óssea.
Os resultados demonstram que além das vantagens na utilização de células tronco
mesenquimais em transplantes autólogos [3], acreditamos que este método é um processo rápido, de
baixa complexidade e fácil reprodução que não demanda equipamentos caros e mão de obra
especializada, além de possuir um baixo preço de custo.
CONCLUSÃO
A concentração de células nucleadas do infiltrado osteogênico centrifugado é maior do que a
concentração do infiltrado osteogênico não-centrifugado da medula óssea da crista ilíaca canina. E o
método da centrifugação não reduz a viabilidade celular.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte
financeiro, à Profa. Dra. Alice Maria Melville Paiva Della Libera por disponibilizar o Laboratório de
Imunodiagnóstico para análise das amostras, à Cláudia Regina Stricagnolo pela ajuda ao longo das
análises e ao Prof. Dr. Cassio Ricardo Auada Ferrigno pela orientação.
REFERÊNCIAS
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AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DE CÃES COM RUPTURA DE LIGAMENTO CRUZADO
CRANIAL SUBMETIDOS À TÉCNICA CIRÚRGICA DE AVANÇO DA TUBEROSIDADE
TIBIAL (TTA) ASSOCIADA OU NÃO À ENXERTO ESPONJOSO AUTÓGENO
Gomes, J. S.1; Ferrigno, C. R. A.2; Ferreira, M. P.1; Cunha, O.1
1 Laboratório
de Ortopedia e Traumatologia Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
de São Paulo.
2
Prof. Dr. do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
INTRODUÇÃO
A ruptura do ligamento cruzado cranial (RLCCr) é uma das principais causas de claudicação em
cães [14] principalmente nas raças de porte grande ou gigante e em cães obesos [18;20], sendo a maior
responsável pela doença articular degenerativa na articulação fêmorotíbiopatelar [19]. A insuficiência do
ligamento cruzado cranial pode ter origem traumática ou degenerativa, estando normalmente associada
ao envelhecimento, às anormalidades de conformação e às artropatias imunomediadas [16].
A maioria dos cães com RLCCr tem indicação de tratamento cirúrgico objetivando promover a
estabilidade do joelho, retardar a osteoartrose secundária e prevenir lesão meniscal [18]. Múltiplas
técnicas foram descritas com objetivo de mimetizar a função do ligamento [16], sendo divididas em
intraarticulares e extraarticulares [17], porém estas técnicas apresentam alta incidência de complicações
[7;12]. Nas últimas décadas foram desenvolvidas técnicas que evitam a movimentação anormal do
joelho por conseguir estabilidade dinâmica através da alteração da geometria óssea, denominadas
osteotomias corretivas [14].
Dentre as técnicas de osteotomia utilizadas em cães encontram-se a osteotomia de nivelamento
do platô tibial, osteotomia tibial em cunha, ostectomia tibial proximal, osteotomia tibial tripla e a
osteotomia para avanço da tuberosidade tibial (TTA), sendo esta última a técnica mais recente a ser
descrita [14].
As principais complicações observadas após a TTA são luxação de patela, infecção, fratura da
tuberosidade tibial e falha do implante [1;3;6;8;10;11;13]. Para diminuir a chance de ocorrer falha do
implante e quebra da tuberosidade tibial, pode-se colocar enxerto ósseo esponjoso no intervalo
resultante da osteotomia, acelerando a consolidação [15]. Em contrapartida, a coleta do enxerto
aumenta a morbidade cirúrgica, com maior tempo de cirurgia e fragiliza a tíbia, predispondo à fraturas
[4].
Estes fatos motivaram a elaboração deste projeto, com a finalidade de avaliar radiograficamente
o tempo para a consolidação óssea de cães da rotina da clínica cirúrgica do Hospital Veterinário da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (HOVET - FMVZ -
USP) com ruptura de ligamento cruzado cranial submetidos à técnica cirúrgica de avanço da
tuberosidade tíbia associada ou não à enxerto esponjoso autógeno.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo envolve a avaliação de 30 cães provenientes da rotina clínico cirúrgica do HOVET
- FMVZ - USP com ruptura de ligamento cruzado cranial unilateral ou bilateral comprovada em exame
clínico (teste de gaveta e compressão tibial positivos) com peso mínimo de 20kg, machos ou fêmeas e
com idades variadas submetidos à técnica cirúrgica de TTA associada (15 cães) ou não (15 cães) à
enxerto esponjoso autógeno coletado da própria tíbia.
Está sendo realizada avaliação radiográfica aos 30, 60 e 90 dias de pós-operatório, ou até o
tempo necessário para a consolidação da osteotomia (120, 150, 180 dias ou mais), em duas projeções
(crânio-caudal e médio-lateral) e classificando o grau de consolidação em 0, 25, 50, 75 ou 100%.
Após constatação clínica da ruptura de ligamento cruzado cranial o cão é submetido a avaliação
radiográfica do membro acometido na projeção médio-lateral em duas posições, primeiro com as
articulações femoro-tibio-patelar e tíbio-tarsal flexionadas em ângulo de 90º e a segunda com 134º de
angulação entre o fêmur e a tíbia e 90º entre a tíbia e o tarso, onde é possível avaliar o ângulo de
inclinação do platô tibial (APT). Apenas aqueles animais com APT de até 25º foram incluídos no
projeto. A seguir o proprietário é informado da necessidade de intervenção cirúrgica, sendo exposto à
ele a técnica de TTA e a possibilidade de inclusão no projeto, esclarecendo os benefícios, riscos e
responsabilidades desta inclusão. Após consentimento escrito do proprietário, o animal é encaminhado
para procedimento cirúrgico de TTA, podendo, por sorteio, ser incluído no grupo A, no qual os
animais são submetidos à cirurgia de TTA associada à enxerto esponjoso autógeno ou no grupo B, no
qual os animais são submetidos à cirurgia de TTA sem utilização de enxerto esponjoso autógeno.
Uma análise do tempo necessário para consolidação da crista da tíbia em dias é obtida através
da avaliação cega dos exames radiográficos mensais, realizada por Médico Veterinário Ortopedista
desconhecedor à qual grupo e animal pertence cada exame radiográfico.
RESULTADOS
Até o presente momento, o estudo avaliou 28 cães de raças variadas, sendo 7 machos e 21
fêmeas, com idade média de 5,2 anos e média de peso de 33,7 Kg. Dezesseis cães apresentavam RLCCr
no membro direito e 12 no esquerdo, com tempo médio de ruptura de 5,5 meses. Em 15 desses
animais a tuberosidade tibial avançou 12mm e em 13 deles avançou 9mm.
Na avaliação radiográfica de 15 cães com RLCCr submetidos à TTA associada à enxerto
esponjoso autógeno, com 30 dias de pós-operatório, 20% dos cães apresentaram 100% de
consolidação, com 60 dias foram 93,33% e com 90 dias de pós-operatório 100% apresentaram
consolidação total da osteotomia corroborando com os resultados de Bisgard et al. (2011) que também
encontraram consolidação precoce da crista da tíbia em TTA após colocação de enxerto esponjoso
autógeno.
Na avaliação radiográfica de 13 cães com RLCCr submetidos à TTA sem a associação de
enxerto esponjoso autógeno, com 30 dias de pós-operatório, 0% dos cães apresentaram 100% de
consolidação, com 60 dias foram 30,75%, com 90 dias, 53,84%, com 120 dias, 69,23%, com 150 dias,
84,61%, com 180 dias, 92,30% e somente com 210 dias de pós-operatório 100% apresentaram
consolidação total da osteotomia.
Embora tenha sido afirmado não haver diferença na consolidação em cirurgias de TTA com e
sem enxerto autógeno [9], esta firmação foi contestada de forma veemente por experiência pessoal [5],
em estudo prospectivo [2] e pelos resultados observados até o momento neste estudo clínico cirúrgico,
no qual a consolidação óssea ocorre em menor tempo no grupo com enxerto esponjoso.
A divergência de resultados se deve em parte pelo sistema subjetivo de classificação da
consolidação óssea, uma limitação comum quando do uso de avaliação radiográfica [2;5;9]. Acreditamos
que a utilização de métodos que pudessem quantificar a cicatrização óssea, ou seja, a quantidade de
osso formado no intervalo da osteotomia, eliminariam esse viés.
A técnica de TTA é originalmente descrita envolvendo a colocação de enxerto esponjoso
autógeno no intervalo da osteotomia [15]. Apesar das potenciais limitações, desvantagens e
complicações associadas à sua obtenção e utilização [1;3;6;8;10;11;13], a técnica é considerada como o
"padrão ouro" devido às suas propriedades de osteogênese, osteoindução e osteocondução [13], sendo
capaz de acelar a cicatrização óssea como demonstrado nos casos avaliados deste estudo.
CONCLUSÃO
Com os dados obtidos até o momento é possível concluir que o tempo para a consolidação
óssea de cães com ruptura de ligamento cruzado cranial (RLCCr) submetidos à técnica cirúrgica de
avanço da tuberosidade tibial (TTA) é menor quando se associa enxerto esponjoso autógeno.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro
e ao Prof. Dr. Cassio Ricardo Auada Ferrigno pela orientação.
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PROPOSTA DE MODELO PARA A AVALIAÇÃO DE DESREGULADORES
ENDÓCRINOS EM RUMINANTES. ESTUDO DA TOXICIDADE REPRODUTIVA DA
IPOMOEA CARNEA EM CAPRINOS MACHOS ADULTOS
Pavanelli, E. L.1 ;Gotardo, A.T.1; Arruda, R. P2. Carvalho, H. F.2;
Lemes, K. M.2; Gorniak, S. L.1
1Centro
de Pesquisa em Toxicologia Veterinária (CEPTOX), Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, Brasil.
2Departamento
de Reprodução, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brasil.
RESUMO
A Ipomoea carnea (IC) é uma planta tóxica encontrada no Brasil [1] e tem como princípio ativo
tóxico a suainsonina. Sabe-se que esta age sobre diferentes órgãos e sistemas inclusive promovendo
alterações endócrinas [2]. Neste sentido, a presente pesquisa tem como objetivo avaliar toxicidade
reprodutiva da IC em machos adultos e estabelecer um protocolo para avaliação de diferentes
desreguladores endócrinos em ruminantes.
Caprinos machos adultos foram divididos em 3 grupos: IC (n=6), receberam a planta na dose
de 5g/kg/dia; BPA (n=6) receberam Bisfenol A na dose de 25 mg/kg/dia; C (n=5) controle. A cada
mês, foi coletado sêmen dos animais para avaliação andrológica. Quinzenalmente todos os animais
foram pesados para controle do ganho de peso e ajuste das doses.
Não houve alterações estatisticamente significantes nas variáveis: consistência testicular,
concentração espermática, defeitos menores e peso. Já, a análise estatística empregada permitiu detectar
alterações na variável perímetro escrotal, ao longo do tempo, em todos os animais, porém sem efeito de
tratamento. Por outro lado, foi observado aumento estatisticamente significante (P<0,05) na
freqüência de defeitos maiores nos espermatozóides do grupo de animais que ingeriram a planta aos
60 dias de tratamento.
O BPA tem demonstrado em vários experimentos in vivo e in vitro agir como uma substância
desreguladora endócrina. No entanto, o grupo BPA não demonstrou diferença significante nos
parâmetros andrológicos avaliados.
Sabe-se que defeitos maiores são aqueles relacionados com espermatogênese anormal, portanto,
um aumento da freqüência destes defeitos, conseqüentemente levará a diminuição da fertilidade. O
modelo aqui proposto permitiu visualizar alterações sutis na esfera reprodutiva dos machos. Sendo esta,
traduzida por um aumento da contagem de defeitos maiores. Portanto, a presente metodologia para
avaliação de desreguladores endócrinos foi eficiente, já que a mesma constatou alterações importantes
no trato reprodutivo masculino, permitindo tomadas de decisão melhores direcionadas quanto a
exposição dos animais a essas e outras possíveis plantas ou/e substâncias prejudicias ao trato
reprodutor masculino.
INTRODUÇÃO
A Ipomoea carnea (IC) é uma planta tóxica de grande importância na criação animal, encontrada
em vários países tropicais, incluindo-se o Brasil [1]. O fato da IC conservar-se verde durante a seca a
torna extremamente importante do ponto de vista toxicológico, uma vez que esta passa a ser fonte de
matéria verde para bovinos, ovinos e, particularmente, caprinos quando há escassez de alimento [3].
Esta planta tem como principal componente tóxico um alcalóide indolizidínico, a suainsonina (SW), um
potente inibidor da α-manosidase lisossomal, sendo que tal efeito produz o acúmulo lisossômico de
oligossacarídeos não processados completamente, perda de função celular e morte celular. Além desta
alteração, a SW também inibe a manosidase II do complexo de Golgi, levando a alterações na síntese,
no processamento e no transporte de glicoproteínas, resultando em disfunção na adesão celular às
moléculas, hormônios e vários receptores de membrana; portanto a toxicidade da SW compromete a
fisiologia de diferentes órgãos e sistemas, inclusive promovendo alterações endócrinas [4]. Assim, o
presente estudo tem como objetivo propor um protocolo para avaliação de diferentes desreguladores
endócrinos (DE) em ruminantes, avaliando os efeitos da IC sobre a fertilidade de bodes adultos jovens.
Para tal, também foi introduzido neste estudo um grupo “controle positivo” o qual recebeu o BisfenolA, uma substância sabidamente DE [5].
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados caprinos machos adultos, da raça Pardo Alpina, divididos em três grupos, nos
quais os animais receberam, por via oral, a planta na dose de 5g/kg/dia - IC (n=6); Bisfenol A na dose
de 25 mg/kg/dia BPA (n=6), e os caprinos do grupo controle, que receberam somente ração e
forrageira (Saccharum officinarum) - CO (n=5), durante o período experimental que foi de 120 dias.
Quinzenalmente, todos os animais foram pesados e clinicamente avaliados. Mensalmente, foram
mensurados o perímetro escrotal, a consistência testicular e foi coletado o sêmen dos animais pelo
método de eletroejaculação para monitoramento dos seus perfis espermáticos através da avaliação
volume, concentração, motilidade, vigor e turbilhonamento, avaliação de funcionalidade de membrana
espermática (HOST) utilizando o teste de resistência osmótico descrito por Fonseca et al. (2001) [6],
morfologia espermática e avaliação computadorizada da motilidade espermática (CASA). Nesta última,
analisaram-se os seguintes parâmetros: motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade
curvilínea (VCL), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade média da trajetória (VAP), amplitude
de deslocamento lateral da cabeça (ALH), freqüência de batimento flagelar cruzado (BCF),
retilinearidade (STR) e linearidade (LIN).
RESULTADOS
Não houve alterações estatisticamente significantes nas variáveis: consistência testicular,
concentração espermática e defeitos menores. Por outro lado, foi observado aumento estatisticamente
significante (P<0,05) na freqüência de defeitos maiores nos espermatozóides do grupo de animais
que ingeriram a planta aos 60 dias de tratamento.
CONCLUSÃO
Atualmente, os estudos concentram-se na avaliação da interferência dos desreguladores
endócrinos durante o período pré-natal e pós-natal inicial em roedores. Porém, uma busca na
literatura revela não haver pesquisas envolvendo avaliação de desreguladores endócrinos em
herbívoros ruminantes, os quais muito provavelmente são expostos constantemente a substâncias
que potencialmente podem promover tal efeito, especialmente aqueles utilizados em larga escala na
agricultura que acabam se tornando contaminantes ambientais como, por exemplo, os herbicidas [7].
Desta forma é de fundamental importância estudos que elucidem os efeitos e potenciais tóxicos
reprodutivos de tais agentes nestas espécies animais.
Até o presente momento, os resultados obtidos aqui neste estudo, mostram claramente que a I.
carnea promove alterações reprodutivas em machos, sendo esta alteração traduzida principalmente pelo
aumento no número de alterações espermáticas. Da mesma forma, os resultados apontam uma possível
tendência de diminuição do potencial reprodutivo de machos expostos ao BPA, neste sentido, pode-se
levantar a hipótese de que exposições durante um período de tempo maior resultariam em alterações
ainda maiores. Desta forma pode-se sugerir que o protocolo aqui proposto para a avaliação de DE em
ruminantes é bastante sensível para detectar alterações espermáticas, e que a I. carnea promove
alterações de morfologia espermática de caprinos em fase de crescimento, fazendo com estes animais
possam vir a desenvolver grandes transtornos na esfera reprodutiva tornem-se. No entanto, ao
contrário do que vem sendo descrito para roedores, o BPA não promoveu alterações nos caprinos,
quanto aos parâmetros andrológicos avaliados.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao Paulo Cesar Fabricio Raspantini, Leonila Ester Reinert Raspantini, Estevão
Belloni, Marco Antonio Faustino dos Santos e Adilson Baladore pelo auxílio e cuidado com os animais.
Este trabalho teve o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa- FAPESP- (Processo nº
2010/12378-0).
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NEUROTRANSMISSÃO GABAÉRGICA E AUSÊNCIA DOS EFEITOS DO FIPRONIL NA
EREÇÃO PENIANA DE RATOS INDUZIDA POR APOMORFINA
Carone, F.R.1; Spinosa, H.S.2
1Bolsista
de Iniciação Científica da FAPESP 2Departamento de Patologia - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo
RESUMO
O fipronil é um praguicida que possui como mecanismo de ação o bloqueio do receptor do
ácido gama-aminobutírico (GABA), neurotransmissor presente tanto em insetos como em vertebrados.
Uma das inúmeras funções do GABA é a regulação do comportamento sexual de mamíferos. No
presente estudo avaliaram-se os efeitos desse praguicida na ereção peniana de ratos. A fim de excluir
um possível comprometimento motor prejudicando o comportamento sexual, avaliou-se também a
coordenação motora dos ratos. Os ratos foram distribuídos em grupo um controle e três experimentais;
aqueles do grupo controle receberam, por gavage, 1 ml/kg de água e os dos grupos experimentais
receberam pela mesma via 0,1; 1,0 e 10 mg/kg de fipronil, uma hora antes das observações. Os
resultados mostraram que essas doses de fipronil não interferem na coordenação motora dos animais e
também não foram capazes de alterar a latência para a primeira ereção e no número de ereções.
Considerando que receptores GABAB parecem ter papel mais relevante no controle da ereção peniana,
sugere-se que o fipronil tenha pouca atuação nesses receptores.
INTRODUÇÃO
No Brasil o fipronil é encontrado em produtos veterinários para o controle de pulgas e
carrapatos de cães e gatos (Fiprolex®, Frontline®), e como inseticida e acaricida para bovinos (Topline
por-on®); na agricultura é empregado como inseticida, formicida e cupinicida em várias culturas e
também em pastagens (Blitz®, Klap®, Regent®, Standak®). Acredita-se que o fipronil bloqueie, de
forma não competitiva, o receptor do ácido gama-aminobutírico (GABA) ao fixar-se no interior do
canal de cloro deste receptor, inibindo o fluxo celular de íons e, assim, causando a morte do parasito
por hiperexcitação [1].
No Sistema Nervoso Central (SNC) dos vertebrados os receptores do GABA são de três tipos:
GABAA, GABAB e GABAC; suas distinções são baseadas nas diferenças em suas subunidades,
propriedades e perfis farmacológicos [2]. Alguns estudos têm sugerido que tanto os receptores GABAA
quanto os receptores GABAB estão envolvidos como o controle do comportamento sexual [3, 4].
Considerando que o fipronil bloqueia os canais de cloreto ligados ao GABA e que a
neurotransmissão GABAérgica está envolvida com o comportamento sexual dos machos, neste
trabalho avaliaram-se os efeitos desse praguicida na ereção peniana induzida por apomorfina, em ratos.
Avaliou-se também a coordenação motora dos animais, visto que uma interferência na função motora
pode levar ao prejuízo no comportamento sexual.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados ratos machos Wistar, os quais foram distribuídos em quatro grupos iguais
(N=10): um controle e três experimentais. Os animais do grupo controle receberam, por gavage, 1
ml/kg de água; os animais dos grupos experimentais receberam pela mesma via 0,1; 1,0 e 10 mg/kg de
fipronil, todos administrados uma hora antes das observações comportamentais.
A coordenação motora foi avaliada na trave elevada, conforme descrito por Rodrigues Alves et
al. [5]. Sucintamente, cada rato foi treinado diariamente por no mínimo 17 dias ininterruptos, a
caminhar sobre a trave elevada (suspensa a 20 cm do chão, feita de madeira medindo 18 mm de largura,
18 mm de espessura e 2 m de comprimento, com uma plataforma de 10 cm2 em cada uma de suas
extremidades). Foi empregado, como reforço positivo para a cada travessia realizada, um grão de milho
colocado em cada uma das plataformas. A coordenação motora na trave foi avaliada pela observação da
posição da pata do membro pélvico do animal, atribuindo-se um escore para cada passo dado ao longo
de cada travessia, conforme apresentado na Tabela 1. Os passos foram avaliados somente quando o
animal percorria o trecho central de 1 metro da trave. Foi permitido que cada rato fizesse 4 travessias,
sendo atribuído como escore o valor da mediana dos passos dados durante este percurso.
Tabela 1. Escores para avaliação da coordenação motora.
O desempenho sexual foi avaliado conforme descrito por Rodrigues-Alves [6], em uma caixa de
vidro (30 x 30 x 30 cm), com auxílio de espelhos, visando favorecer a observação do animal. A indução
da ereção peniana foi feita pela administração de 80 g/kg apomorfina, por via subcutânea, dez
minutos antes da observação. Como a apomorfina nessa dose induz bocejo, foi avaliado também o
número de bocejos. Foram anotados, durante 60 minutos, além do número de bocejos, a latência para
primeira ereção (em segundos) e o número de ereções penianas.
Foi utilizado o programa estatístico GraphPad Prism 5.00® (GraphPad Software, Inc., San
Diego, CA, USA) para a análise dos dados. As diferenças foram consideradas significantes quando
p<0,05.
RESULTADOS
A Tabela 2 mostra os efeitos do fipronil na coordenação motora dos ratos. O teste de Kruskal
Wallys mostrou não haver diferenças significantes nas medianas dos animais dos diferentes grupos (p =
0,5029), indicando que o fipronil não interferiu na coordenação motora dos animais observados na
trave elevada.
Tabela 2 - Medianas, com os respectivos limites, dos escores da coordenação motora avaliada na trave
elevada em ratos tratados com diferentes doses de fipronil; p > 0,05, teste de Kruskal Wallys. (N=10
por grupo).
A Figura 1 ilustra o número de passos de ratos tratados com diferentes doses de fipronil, uma
hora antes da observação. A ANOVA mostrou haver diferença entre as médias dos grupos (p= 0,0134)
e o teste de múltiplas comparações de Bonferroni mostrou aumento no números de passos dos ratos
do grupo tratado com 10 mg/kg de fipronil, em relação aos animais do grupo controle.
Nº de passos
40
*
30
20
10
10
1
0,
1
C
on
tr
ol
e
0
Dose
Figura 1 - Médias e respectivos desvios padrões do número de passos na trave levada de ratos tratados
com diferentes doses de fipronil; *p < 0,05, ANOVA seguida pelo teste de comparações múltiplas de
Bonferroni. (N=10 por grupo)
A Figura 2 mostra a latência para a primeira ereção e o número de ereções de ratos do grupo
controle e daqueles tratados com diferentes doses de fipronil, uma hora antes da observação. A
ANOVA mostrou não haver diferenças significantes entre os grupos, tanto em relação à latência para a
primeira ereção (p = 0,1774), quanto em relação ao número de ereções (p = 0,5933); esses dados
indicam que o fipronil não interferiu em parâmetros da ereção peniana dos animais.
Figura 2 – Latência para a 1ª ereção (em segundos) e número de ereções induzida por apomorfina em
ratos tratados com diferentes doses de doses de fipronil. São apresentadas as médias e respectivos
desvios padrões; p > 0,05, ANOVA. (N=10 por grupo).
A Figura 3 mostra o número de bocejos induzidos pela administração de apomorfina em ratos
do grupo controle e daqueles tratados com diferentes doses de fipronil, uma hora antes da observação.
A ANOVA mostrou não haver diferenças significantes entre as médias dos animais dos diferentes
grupos (p = 0,9451), indicando que o fipronil não interferiu no número de bocejos dos animais.
Figura 3 – Número de bocejos induzidos por apomorfina em ratos tratados com diferentes doses de
doses de fipronil. São apresentadas as médias e respectivos desvios padrões; p > 0,05, ANOVA. (N=10
por grupo)
CONCLUSÃO
No presente trabalho observou-se que as diferentes doses de fipronil não promovem alterações
na coordenação motora dos animais e apenas a maior dose foi capaz de aumentar o número de passos
na trave elevada. Esses achados corroboram aqueles obtidos por Martins [7] que observou que 1 e 10
mg/kg de fipronil não causaram alterações na atividade motora medida no campo aberto, enquanto as
doses de 30 e 100 mg/kg reduziram a velocidade média e a distância percorrida nesse aparelho.
Excluída interferência na atividade motora causada pela administração do fipronil, o que
poderia prejudicar o desempenho sexual, foi avaliada a ereção peniana dos ratos tratados com fipronil.
Observou-se a ausência de diferenças significantes entre os grupos, tanto na latência e no número de
ereções induzidas pela apomorfina, como no número de bocejos, o qual reflete a ação da apomorfina
em receptores dopaminérgicos centrais [8].
Leipheimer e Sachs [9] demonstraram que a administração sistêmica de baclofen (agonista do
receptor GABAB) promoveu diminuição dose-dependente da proporção de ratos exibindo ereções no
teste do reflexo peniano, enquanto a administração sistêmica de THIP ou bicuculina (antagonista do
receptor GABAA) não afetaram o reflexo peniano. Estes resultados podem ser resultado de uma maior
influência dos receptores GABAB na ereção peniana. Meisel e Sachs (1994) [10 apud 6] descreveram o
comportamento sexual de machos de diferentes espécies, tais como macaco, cão, gato e homem,
relatando que os reflexos de ereção peniana são inibidos pela estimulação de receptores GABAB,
enquanto que os receptores GABAA não apresentam influência neste reflexo. Desta forma, no presente
trabalho, a ausência de efeitos do fipronil na ereção peniana pode indicar pouca atuação em receptores
GABAB.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pela bolsa de Iniciação
Científica (processo Nº: 2011/00047-1).
REFERÊNCIAS
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Centro de Pesquisas em Toxicologia Veterinária (CEPTOX), Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia-USP
RESUMO
Introdução: Leucaena leucocephala é uma leguminosa utilizada para alimentação de ruminantes, no
entanto, essa planta pode causar intoxicação em ruminantes e não ruminantes. Os efeitos adversos são
atribuídos principalmente à mimosina (MI) que é um agente antimitótico, análogo ao aminoácido
tirosina, e devido a estas características, tem sido estudadas as suas propriedades antiproliferativas em
células cancerosas. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar a hematotoxicidade da MI em ratos
machos adultos (Wistar). Métodos: Ratos machos adultos (Wistar) foram divididos em quatro grupos e
tratados durante vinte e oito dias: CO (controle, n=6); MI15(15mg/kg de mimosina, n=7); MI25
(25mg/kg de mimosina, n=7); MI45 (45mg/kg de mimosina, n=6). O estado clínico dos animais, o
consumo de ração total e o ganho de peso total foram avaliados a cada três dias. No vigésimo nono dia
foram avaliados: o hemograma, o peso relativo de timo e baço e a celularidade do baço. Resultados: A
ANOVA seguida do teste de Dunnet mostrou que o consumo de ração, o ganho de peso e os números
de eritrócitos, leucócitos e plaquetas não foram estatisticamente diferentes nos grupos tratados com MI
quando comparados com o grupo CO, no entanto houve uma redução de 29% e 19%,
respectivamente, no número de leucócitos naqueles animais pertencentes ao grupo MI25 (3,55 x103
leucócitos/mm3) e MI45 (4,10 x103 leucócitos/mm3) em
relação ao grupo CO (5,03 x103
leucócitos/mm3). Conclusão: Embora tenha sido verificada redução no número de leucócitos, pode-se
sugerir, pelos dados aqui apresentados, que a MI não possui efeito hematotóxico.
INTRODUÇÃO
Plantas da família Leguminosae, como as dos gêneros Mimosa e Leucaena, muitas vezes, são
utilizadas para alimentação de ruminantes, principalmente na estação seca. Leucaena leucocephala é uma
espécie originária da América Central, porém atualmente encontra-se difundida por todo o mundo.
Esta planta é altamente nutritiva, apresentando boa palatabilidade e digestibilidade para ruminantes [6].
No entanto, essa planta pode causar intoxicação em ruminantes e não ruminantes [2][6][8]. Os efeitos
adversos são atribuídos principalmente à mimosina (MI), um aminoácido não protéico, análogo ao
aminoácido tirosina, antimitótico, depilatório [1] e inibe o ciclo celular na fase G1 [3]. Devido a estas
características, tem sido estudadas as suas propriedades antiproliferativas por meio, principalmente, de
estudos in vitro que mostraram o efeito antimitótico da MI em células tumorais uterinas de humanos [9],
bem como o bloqueio da replicação do DNA em células cancerosas do ovário de hamster [4]. Assim,
há uma perspectiva para o uso da MI como antitumoral, porém existe a necessidade de realização de
testes que melhor avaliam a sua toxicidade, em vista de um uso terapêutico seguro. Dessa forma, o
objetivo desse trabalho foi o de avaliar a hematotoxicidade da MI em ratos machos adultos (Wistar).
MATERIAL E MÉTODOS
A mimosina, obtida da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) foi dissolvida em tampão Tris, pH
8,9, então o pH foi ajustado para 7,2 com HCl 1 N. Antes da administração, esta solução foi diluída em
solução salina para atingir a concentração necessária. Ratos machos adultos (Wistar) foram colocados
em gaiolas individuais e divididos em quatro grupos sendo um grupo CO (controle, n=6) que recebeu
solução salina tamponada 0,9%, com o pH ajustado para 7,2 e os demais grupos que receberam as
diferentes doses de mimosina diariamente durante 28 dias, por via oral pela técnica de gavage. Os
grupos que receberam mimosina foram denominados: MI15(15mg/kg de mimosina, n=7); MI25
(25mg/kg de mimosina, n=7); MI45 (45mg/kg de mimosina, n=6). Os animais foram avaliados
clinicamente e pesados a cada três dias. No 29º dia de experimento, os ratos foram anestesiados com
xilazina/quetamina (5,0mg/kg e 50mg/kg, respectivamente) para a coleta de sangue da veia hepática e
retirada de timo e baço. Foram avaliados o consumo de ração total, ganho de peso total, número de
eritrócitos, leucócitos e plaquetas do sangue, o peso relativo de timo e baço e a celularidade do baço. As
avaliações hematológicas, bem como a celularidade do baço foram realizadas através do aparelho
Animal Blood Counter (Horiba®).
RESULTADOS
A avaliação clínica dos ratos não revelou qualquer alteração em relação a alopecia nos animais
tratados com a MI em relação aos animais do grupo CO. A ANOVA seguida do teste de Dunnet
(p<0,05) mostrou que o consumo de ração total (tabela 1), o ganho de peso total (figura 2) e os
números de eritrócitos (figura 3), leucócitos (figura 1) e plaquetas, bem como os pesos relativos de timo
e baço e a celularidade de baço, não foram estatisticamente diferentes nos grupos tratados com MI
quando comparados com o grupo CO, no entanto houve uma redução de 29% e 19%,
respectivamente, no número de leucócitos naqueles animais pertencentes ao grupo MI25 (3,55 x103
leucócitos/mm3) e MI45 (4,1 x103 leucócitos/mm3) em
relação ao grupo CO (5,03 x103
leucócitos/mm3), porém dentro do padrão da normalidade para a espécie.
(n=6)
657,33
Consumo
de ração
total (g)
(n=7)
(n=7)
651,43
653,00
(n=6)
661,50
±
±
±
31,57
47,93
32,16
±
p<0,05 versus grupo controle; ANOVA seguida do teste19,38
6
Leucócitos x 10 3 /mm 3
Tabela 1: Consumo de ração total (g) dos animais que foram
submetidos aos diferentes tratamentos. São mostrados a média
e os respectivos desvios
CO padrões.
MI 15
MI 25
MI 45
n=6
n=7
n=7
4
n=7
2
Figura0 1: Número de leucócitos dos
CO
MI 15
MI 25
MI 45
animais que
foram
submetidos
aos
diferentes tratamentos. p<0,05 versus
grupo controle; ANOVA seguida do teste
de Dunnett.
10
80
n=6
n=7
60
n=7
n=7
40
20
0
CO
MI 15
MI 25
MI 45
Figura 2: Ganho de peso dos animais que foram
submetidos aos diferentes tratamentos. p<0,05 versus
grupo controle; ANOVA seguida do teste de Dunnett.
Hemáciasx 10 3 /mm 3
Ganho de Peso total (g)
de Dunnett.
8
n=6
n=7
n=7
n=7
CO
MI 15
MI 25
MI 45
6
4
2
0
Figura3: Número de hemácias dos animais que
foram submetidos aos diferentes tratamentos.
p<0,05 versus grupo controle; ANOVA seguida
do teste de Dunnett.
CONCLUSÕES
A MI é um agente antimitótico [7] e essa característica poderia inibir a proliferação das células
troncos multipotenciais da medula óssea o que levaria a uma diminuição nas linhagens linfóide e
eritróide [5], porém a contagem dos eritrócitos não revelou qualquer alteração nesse parâmetro e
mesmo que tenha havido uma diminuição no número de leucócitos, estes estavam dentro do padrão de
normalidade para ratos. Sabe-se que doses tóxicas de MI causam alopecia, diminuição no consumo de
ração e no ganho de peso dos animais [6], o que não foi verificado nesse estudo. Portanto, os dados
aqui apresentados permitem sugerir que as doses de MI testadas não possuem efeitos hematotóxicos,
porém outros protocolos serão realizados para verificar se, de fato, a MI pode ser bem tolerada, com
vistas à sua utilização como antitumoral.
AGRADECIMENTOS
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho
Nacional de Pesquisa (CNPQ) pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
[1] HAMMOND, A.C., 1995. Leucaena toxicosis and its control in ruminants. J. Anim. Sci. 73, 1487-1492.
[2] HEGARTY, M.P., SCHINCKEL, P.G., COURT, R.D., 1964. Reaction of sheep to the consumption of Leucaena glauca
Benth and to its toxic principle mimosine. Aust. J. Agric. Res. 33, 152-153.
[3] LALANDE, M., HANAUSKE-ABEL, H.M., 1990. A new compound which reversibly arrests T lymphocyte cell cycle
near the G1/S boundary. Exp. Cell Res. 188, 117–121.
[4] MOSCA, P. J., DIJKWEL, P.A., HAMLIN, J.L., 1992. The plant amino acid mimosine may inhibit initiation at origins of
replication in Chinese hamster cells . Mol. Cell. Biol. 12, 4375–4383.
[5] OWA, T et al., 2001. Cell cycle regulation in the G1 phase: a promising target for the development of new
chemotherapeutic anticancer agents. Curr. Med. Chem. 8, 1487-1503.
[6] RADOSTITS, O.M., BLOOD, D.C, GAY, C.C., 2000. Veterinary Medicine. Bailliere Tindal, London.
[7] REIS, P. J., TUNKS, D. A., HEGARTY, M. P., 1975. Fate of mimosine administered orally to sheep and its
effectiveness as a defleecing agent. Aust. J. Biol. Sci. 28, 495.
[8] TOKARNIA C.H, DÖBEREINER J., PEIXOTO P.V., 2000. Plantas Tóxicas do Brasil. Helianthus, Rio de Janeiro.
[9] ZALATNAI, A., 2005. P-glycoporotein expression is induced in human pancreatic xenografts during treatment with a
cell cyclo regulator, mimosine. Pathology Oncology Research. 11, 164-169.
DETECÇÃO DE GFAP E VIMENTINA NA ENCEFALITE INDUZIDA PELA INFEÇÃO
POR HERPESVIRUS EQUINO TIPO 1 EM ENCÉFALOS DE CAMUNDONGOS.
Baskerville, E. B.; Mori, C.M.C.; Siqueira, A.; Maiorka, P. C.
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP.
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO
O herpes vírus eqüino é um patógeno de suma importância, sendo capaz de causar danos
significativos aos plantéis, o que o torna uma ameaça potencial, sob o ponto de vista econômico, à
criação mundial de cavalos uma vez que sua distribuição é cosmopolita. Animais infectados apresentam
sintomatologia aguda, manifestada por, entre outros sintomas, febre e encefalite. A enfermidade é
extremamente contagiosa e sabe-se que o sistema nervoso central possui características morfológicas
únicas e, além disso, a injúria a esse tecido gera padrões de resposta específicos. A expressão de
vimentina e de GFAP vem sendo utilizada para detecção da reatividade e possível participação de
astrócitos nos processos degenerativos e inflamatórios do SNC. Sabe-se que o aumento na expressão
de vimentina pode ser interpretado como ativação ou degeneração de astrócitos. Ademais, a proteína
GFAP é um marcador específico de astrócitos e sua evidenciação indica ativação dos mesmos,
podendo
ser
mensurada
através
de
imunohistoquímica.
Diante disso, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a resposta do SNC à infecção pelas
diferentes estirpes de herpes vírus eqüino através da expressão das proteínas GFAP e vimentina.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados camundongos, fêmeas de aproximadamente 8 semanas de idade, das linhagens
BALB/c e C57BL/6.. Durante todo o experimento os animais foram mantidos em mini-isoladores
medindo 20x32x21 cm (422 cm2), com cama de maravalha de pinus autoclavada, trocadas
semanalmente. Água filtrada e autoclavada e ração comercial foram oferecidas ad libitum. As condições
de alojamento e manejo, bem como os procedimentos experimentais adotados estão de acordo com a
as recomendações internacionais (NRC, 2010). Esses animais foram o divididos em 4 grupos que
continham 9 animais de cada linhagem. Dois subgrupos de cada grupo foram inoculados com estirpes
diferentes do herpes vírus eqüino conforme ilustrado na tabela abaixo. As necropsias foram feitas no
segundo dia pós-inoculação (DPI) e outros animais foram eutanasiados no terceiro dia pós-inoculação
quando os mesmos já apresentavam sintomas neurológicos bem evidentes.
Número de animais
Estirpe
Dias
pós- por linhagem
inoculação
A9/92
A4/72
A3/97
Controle
3º DPI
5 animais
2º DPI
4 animais
3º DPI
5 animais
2º DPI
4 animais
3º DPI
5 animais
2º DPI
4 animais
5 animais BALB/c, 4 animais C57BL/6
Tabela 1. Número de animais por grupo e os dias pós-inoculação da realização das necropsias.
Os animais foram inoculados por via intranasal com 25µl de meio MEM de Eagle contendo a
suspensão de vírus com as estirpes A4/72, A9/92 e A3/97, respectivamente. Os animais do grupo
controle foram inoculados apenas com o meio de cultura. Para este procedimento, utilizou-se anestesia
inalatória com isofluorano. Fragmentos dos órgãos internos (encéfalo, fígado, pulmão, baço, e timo)
foram colhidos e fixados em metacarn para posterior confecção de lâminas coradas por hematoxilina e
eosina (HE). Cortes na espessura de 3 a 4 mm foram fixados em lâminas previamente tratadas com
silano e, posteriormente, desparafinizados.
RESULTADOS:
Conforme descrito por Mori et. al (2011)1,os animais inoculados com as estirpes de A9/92 e
A4/72 apresentaram sinais clínicos de encefalopatia. Os sinais envolviam perda de peso, pelos eriçados,
postura curvada, dispnéia, desidratação e letargia majoritariamente apresentados entre o segundo e o
terceiro dia pós-inoculação. Posteriormente os animais apresentaram hipersensibilidade, andar em
círculos, convulsões, perda de equilíbrio e hiper salivação. Os animais C57BL/6 apresentaram sintomas
neurológicos mais exacerbados e ainda mostraram paralisia espástica da cauda. A necropsia dos
camundongos inoculados com as estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1, que apresentaram manifestações
clínicas no 3º d.p.i., revelou alterações macroscópicas em diferentes órgãos, tais como: edema
pulmonar, esplenomegalia, aumento dos linfonodos submandibulares e mesentérico e hemorragia em
meninges.
Nos camundongos inoculados com a estirpe A3/97, bem como em todos os animais
sacrificados no 2º dpi não foram observadas alterações macroscópicas nos órgãos internos.
Além dos sintomas, a patogenia do vírus também foi avaliada através da degeneração
astrocitária que é comumente vista em regiões onde há tecido danificado2. A ativação de astrócitos ou
astrogliose é um componente evidente da resposta inflamatória e um indicador de injúria no sistema
nervoso. Astrócitos marcados para GFAP eram facilmente identificados nos tecidos de animais
infectados com o Herpes Vírus Equino. Os astrócitos foram caracterizados principalmente por terem
núcleos grandes, nucléolos e citoplasma evidentes e o corpo celular intensamente corado. As marcações
para Vimentina nos mesmos camundongos com encefalite no terceiro dia pós-inoculação foram menos
evidentes quando comparado com marcações de GFAP. Essas células marcadas eram mais facilmente
encontradas na região de bulbo olfatório estendendo-se até a superfície ventral do encéfalo.
Figura 1: A) Marcação de vimentina em encéfalo de camundongo C57-BL inoculado com o vírus
A4/72 no 3oDPI.B) Marcação de vimentina em encéfalo de camundongo C57-BL inoculado com o
vírus A9/92 no 3oDPI C) Marcação de GFAP em encéfalo de camundongo BALB/c inoculado com
vírus A3/97 no 3oDPI. D) Marcação de GFAP em encéfalo de camundongo C57/BL inoculado com
vírus A3/97 no 3oDPI.
CONCLUSÃO:
Conclui-se que há diferença nas manifestações clinicas dos animais inoculados com as estirpes
brasileiras de Herpes Vírus Equino do tipo 1 e que dentre elas, a A3/97 é a mais atenuada apresentando
mais sintomas no sistema respiratório. Encontrou-se marcação para GFAP e Vimentina nos encéfalos
de todo os animais inoculados com estirpes do Herpes Vírus Equino do tipo 1 Sendo que as marcações
para Vimentina eram menos freqüente quando comparada com o GFAP em região de bulbo olfatório.
AGRADECIMENTOS
À Fapesp, pelo processo 2010/11896-7. E ao Grupo de Pesquisa em Neuropatologia da
FMVZ-USP, coordenado pelo Prof. Dr. Paulo César Maiorka.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Mori C, Mori E, Favaro L, et al. Equid Herpesvirus Type-1 Exhibits Neurotropism and Neurovirulence in a Mouse
Model. Journal of Comparative Pathology 2011.
[2] Panickar KS, Norenberg MD. Astrocytes in cerebral ischemic injury: morphological and general considerations. Glia
2005; 50:287-298.
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL TERAPEUTICO DO CANABIDIOL EM UM MODELO
MURINO DE INFLAMAÇÃO AGUDA PULMONAR INDUZIDA POR LPS
Almeida, V. I1, Ribeiro, A. 1, Ferraz-de-Paula, V. 1, Pinheiro, M.L. 1, Akamine, A. T. 1, Quinteiro-Filho,
W. M. 1, Gomes, P. F. 1, Costola-de-Souza, C. 1, Hallak, J.E. 2, Zuardi, A.W. 2, Crippa, J.A. 2,
Palermo-Neto, J. 1
1Grupo
de Pesquisa em Neuroimunomodulação, Depertamento de Patologia, Faculdade de Zootecnia e Medicina
Veterinária, Universidade de São Paulo; 2Departamento de Neurociência e Comportamento, Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
RESUMO
O Sistema Endocanabinóide, responsável pela resposta aos canabinóides, vem sendo descrito
como capaz de regular uma série de processos fisiológicos, em especial aqueles ligados ao
comportamento, à atividade neuro-endócrina e à resposta imune. De fato, analisaram-se muitos
aspectos da ação dos canabinóides sobre o comportamento e sobre a modificação da resposta imune
inata ou adquirida. No entanto, a leitura dos trabalhos que têm sido publicados sobre este assunto
desde a descoberta do sistema endocanabinóide mostra uma tendência a uma visão setorizada das
abordagens experimentais que se fazem dos efeitos dessas substâncias, seja no SNC ou no SI. O
canabidiol (CBD) apresenta um imenso potencial terapêutico, seja pelos efeitos que produz no SNC
como pelos que desencadeia no SI, especialmente na chamada imunidade inata. Assim, diversos
trabalhos têm demonstrado um potencial terapêutico do canabidiol no tratamento de doenças
neurodegenerativas, esquizofrenia e distúrbios de ansiedade. Ainda, vem sendo demonstrado que o
canabidiol apresenta um potente efeito anti-inflamatório, por diminuir diversos parâmetros da atividade
imune inata. Desta forma, levando-se em conta as evidências de ações do CBD tanto no SNC como no
SI, pareceu-nos relevante avaliar, dentro de uma perspectiva neuroimune, o potencial efeito terapêutico
deste fármaco em um modelo de inflamação aguda pulmonar induzida pela instilação intra-nasal de
lipopolissacarideo (LPS).
INTRODUÇÃO
O objetivo do trabalho é avaliar o potencial efeito terapêutico do canabidiol em um modelo
murino de inflamação aguda pulmonar, induzido pela administração intranasal de LPS. Utilizando um
modelo de inflamação aguda pulmonar:
Avaliar os efeitos do canabidiol sobre a distribuição celular no LBA, no sangue e na medula
óssea 1 e 2 dias apos a indução da inflamação.
MATERIAIS E MÉTODOS
Cerca de trinta camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: 2 grupos controles
(PBS+veiculo e LPS+veiculo) e 2 grupos experimentais (LPS+ CBD 20mg/kg e LPS+ CBD
80mg/kg), para cada avaliação (24h ou 48h após a indução da inflamação), sendo tratados conforme
ilustrado na representação esquemática abaixo:
Um e dois dias após a instilação intranasal de LPS os animais foram anestesiados, sendo
coletados o LBA, o sangue e a medula óssea. A contagem total do LBA e do sangue, e a contagem total
de células da medula.
RESULTADOS
Os resultados obtidos estão ilustrados nas figuras abaixo:
LBA 24h
LBA 48h
15
*p<0.05 em relação aos demais grupos
**p<0.05 em relação aos demais grupos
e não diferem entre si
0
B
D
80
20
LP
S+
C
80
C
B
D
20
LP
S+
C
B
D
LP
S+
LP
S+
Ve
ic
Sa
l+
Ve
ic
0
5
B
D
**
10
LP
S+
C
**
ei
c
20
*
10
LP
S+
V
30
Sa
l+
Ve
ic
*
nº de células x 105
nº de células x 105
40
*p<0.05 em relação aos demais grupos
Figura 1 - Número de células contados do lavado broncoalveolar de camundongos instilados com salina
ou LPS por via intranasal, nos diferentes grupos citados
WBC 48h
6
Nº de células x 103 mm3
4
2
5
4
3
2
1
B
D
20
LP
S+
C
B
D
LP
S+
C
Sa
l
ei
c
c
+V
ei
80
B
D
20
LP
S+
C
BD
LP
S+
C
LP
S+
Ve
ic
Sa
l+
Ve
ic
80
0
0
LP
S+
V
Nº de células x 103 mm3
WBC 24h
Figura 2 - Número de leucócitos no sangue de camundongos instilados com salina ou LPS por via
intranasal, nos diferentes grupos citados
Medula 24h
Medula 48h
50
20
10
D
BD
20
80
0
LP
S+
C
B
80
BD
20
LP
S+
C
D
B
LP
S+
C
LP
S+
Ve
ic
Sa
l+
Ve
ic
0
30
LP
S+
C
20
40
LP
S+
Ve
ic
40
Sa
l+
Ve
ic
nº de células x 106
nº de células x 106
60
Figura 3 - Número de células da medula óssea de camundongos instilados com salina ou LPS por via
intranasal, nos diferentes grupos citados
DISCUSSÃO
Os resultados do tratamento terapêutico com o canabidiol em um modelo murino de
inflamação aguda pulmonar revelaram um potencial efeito anti-inflamatório para o fármaco. Foram
observados valores estatisticamente menores do número de células inflamatórias totais no LBA, nos
grupos tratados com as doses de 20mg/kg e 80mg/kg de CBD, em relação ao grupo controle
inflamado (LPS + veículo), 24 horas e 48 horas após a indução da inflamação.
201
Foi possível observar migração de células da medula para o foco inflamatório como mostram os dados
da figura 1. Observou-se nesta figura um aumento do número de células caracterizando-se a inflamação
induzida pelo LPS. No grupo LPS+veículo observou-se uma tendência de redução do número total de
células em relação ao grupo salina+veículo, sugerindo este fato possível migração de células da medula
óssea para o sangue e deste para o pulmão, isto é, parece ter ocorrido um aumento da demanda de
células para o foco inflamatório (pulmão). O tratamento com canabidiol (LPS+CBD 20 e LPS+CBD
80) reverteu parcialmente este efeito, pois ocorreu uma diminuição do número total de células
inflamatórias no pulmão, e houve uma pequena tendência para aumento do número total de células na
medula dos animais tratados em relação ao LPS+veículo, assim, parece que a migração de células para o
foco inflamatório foi de alguma forma inibida pelo tratamento.
Dados de literatura apontam mecanismos relacionados a atividade anti-inflamatória do CBD.
Em nosso laboratório o aluno de doutorado do departamento de patologia (VPT) Alison Ribeiro
demonstrou em seu projeto que o tratamento profilático, isto é, animais tratados primeiramente com
CBD antes da indução do LPS, no mesmo modelo murino de inflamação aguda pulmonar, diminuiu a
distribuição celular para LBA em animais tratados com a dose de 20mg/kg de CBD, assim como
produziu diminuição da atividade dos leucócitos avaliados pela mieloperoxidase (MPO). Também
observou menor concentração de citocinas IL-6 e TNF, e quimiocinas MIP-2 e MCP-1. Por fim,
demonstrou-se que o mecanismo anti-inflamatório do CBD, nesse modelo, estão relacionados ao
receptor de adenosina A2A. Embora ainda não tenhamos demonstrado, é bastante razoável sugerir que
em nosso delineamento experimental também venhamos a observar diminuição na atividade de MPO e
da produção de citocinas/quimiocinas (amostras coletadas, ainda a serem analisadas); ainda,
acreditamos que esses efeitos por nós descritos estejam relacionados à ativação do receptor de
adenosina A2A.
O CBD é um inibidor competitivo do transportador de nucleotídio ENT1, essa inibição
aumenta a oferta de adenosina, gerando uma diminuição da atividade dos leucócitos. Esse efeito do
composto ativo é revertido quando os animais são tratados com antagonistas do A2A, ou quando
camundongos são nocaute para o gene desse receptor [1].
O mecanismo relacionado à diminuição da migração de leucócitos ao tecido inflamado pode
estar relacionado à diminuição de produção de moléculas de adesão e diminuição da vasodilatação de
micro vasos, no foco inflamatório. Esses resultados foram obtidos em um modelo de encefalite
ocasionado por sepse induzido por LPS intravascular em camundongos [2].
AGRADECIMENTOS
202
Agradeço, ao Profº Dr. João Palermo Neto, por ter me acolhido e oferecido a oportunidade de
fazer Iniciação Científica no grupo de Neuroimunomodulação.
Aos que hoje são mais que colegas de trabalho, Alison Ribeiro, Viviane Ferraz, Milena Lobão,
desde quando entrei no grupo me ensinaram muito além das técnicas de laboratório, serão meus
eternos professores. Wanderley Quinteiro Filho, Poliana Ferrreira e Carolina Costola, pela colaboração
no trabalho realizado, sem o apoio dessas pessoas nenhum resultado seria obtido. E Adriana Tiemi,
pelo ombro amigo que esteve sempre disponível em todos os momentos durante essa jornada.
A FAPESP (09/51886-3) pelo suporte financeiro.
REFERÊNCIAS
[1] Carrier, E. J., Auchampach, J. A., Hillard, C. J. Inhibition of an equilibrative nucleoside transporter by cannabidiol: A
mechanism of cannabinoid immunosuppression. PNAS, v. 103, May, p. 7895-7900. 2005.
[2] Ruiz-Valdepeñas., L., Martínez-Orgado, J. A., Benito, C., Millán, Á., Tolón, M. A., Romero, J. Cannabidiol reduces
lipopolysaccharide-induced vascular changes and inflammation in the mouse brain: an intravital microscopy study. Journal
of Neuroinflammation, Jan, p. 1-9. 2011.
APLICAÇÃO DA INTERAÇÃO HUMANO-COMPUTADOR NO DESENVOLVIMENTO
DE INTERFACES GRÁFICAS DESTINADAS A DALTÔNICOS
Garcia, F. E. A. S. ¹ Luque, L.¹ Pereira, E. S.¹ Cunha, G. J.¹
¹ Faculdade de Tecnologia de Mogi das Cruzes
E-mail: [email protected]
RESUMO
A presente pesquisa surgiu da dificuldade encontrada por portadores de daltonismo no uso de
meios computacionais em seu cotidiano. O indivíduo daltônico é incapaz de distinguir uma ou mais
cores do espectro visível e em um mundo no qual a Internet vem ganhando cada vez mais espaço. Por
esta razão, é de vital importância que os desenvolvedores de software (designers) projetem interfaces
gráficas que garantam a satisfação de um usuário em potencial. A cor, sendo um dos elementos mais
importante de uma aplicação, merece uma atenção especial. Uma combinação imprópria de cores pode
gerar frustração por parte do usuário, ainda mais se tal indivíduo for daltônico. É nesse momento que
conceitos como usabilidade e acessibilidade se tornam “ferramentas poderosas”, podendo ser aplicadas
no desenvolvimento de uma boa interface. Através da aplicação de um questionário e tratamento
estatístico, conseguiu-se quantificar as melhores cores que devem ser utilizadas no desenvolvimento de
uma interface gráfica que atenda às necessidades dos daltônicos, sem dificultar aquelas de usuários de
203
visão normal. O trabalho também propõe a utilização de um Farol das Cores, contribuindo com a
identificação das cores que os daltônicos têm mais dificuldades em distinguir.
INTRODUÇÃO
A popularização dos computadores e da Internet começou a partir da década de 90 e, desde
então, as interfaces vêm ganhando cada vez mais espaço nessa nova era digital. Para um software ser
bem aceito em uma comunidade, a sua interface deve ser bem projetada, atender todas as suas
necessidades, garantindo sempre a satisfação do usuário [4]. As cores escolhidas irão influenciar em
suas ações e produtividade, porém, quando o tal usuário for daltônico sua produtividade pode ser
afetada, dependendo da combinação escolhida.
Acredita-se que cerca de 10% da população mundial masculina sofra de daltonismo, doença que
impede seu portador de distinguir uma ou mais cores. De todos os casos diagnosticados, 98% dos
portadores são homens, enquanto os outros 2% são representados pelas mulheres [5]. Já no Brasil o
daltonismo está presente em cerca de 10% dos homens e 1% das mulheres [6]. O daltonismo afeta as
células cone localizadas na retina, sendo assim, não possui graus, mas sim tipos que podem ser
definidos como: Monocromatismo (ausência total na percepção das cores); Dicromatismo (ausência de
um tipo de cone) e Tricomatisto Anômalo (mutação nos pigmentos dos fotorreceptores) [1]. Esta
temática é pouco abordada no meio acadêmico e os estudos e soluções na área são escassos. Neste
contexto, este trabalho propõe uma solução alternativa para a implementação de interfaces agradáveis
aos daltônicos.
MATERIAL E MÉTODOS
Levantamentos de Dados Estatísticos Referentes aos Portadores de Daltonismo
O levantamento inicial de dados para a fundamentação teórica foi desenvolvida com a ajuda de
ferramentas como o Google Acadêmico e o Scielo. Um levantamento para complementar os dados já
adquiridos será desenvolvido em Novembro no Instituto de Psicologia da USP (IP/USP) e no Núcleo
de Oftalmologia da Faculdade de Medicina da USP (Oftalmologia/ USP).
Desenvolvimento e Aplicação do Questionário
O objetivo do questionário é identificar quais são as cores que os daltônicos têm mais
dificuldade em distinguir e comparar a utilização de cores em duas interfaces gráficas (Facebook e
Orkut), quantificando as sensações que essa combinação desperta em seus usuários. Por fim o
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entrevistado irá listar, em sua opinião, a melhor combinação de cores para a elaboração de uma
interface.
A primeira versão do questionário, chamada de Questionário Piloto, foi desenvolvida e aplicada
em uma amostra de 30 usuários, focando informações como escolha e identificação de cores, sensações
transmitidas pelas cores. Especificamente para daltônicos verificou-se a dificuldade de identificação de
cores e como essa dificuldade afeta seu dia a dia. A segunda versão do questionário, adaptado de Neiva
[5], será aplicada em três grupos distintos: comunidade de daltônicos na Espanha, a Associación Daltónicos
No Anónimos; grupo de daltônicos no Brasil e grupo de indivíduos com visão normal no Brasil.
Amostragem e Análise Estatística
A pesquisa utilizou o método de Amostras Aleatórias Simples dando preferência por uma
análise baseada nas medidas de tendência central utilizando média aritmética, mediana, variância, desvio
padrão e o coeficiente de variação [2].
Criação do Farol das Cores
A partir do Questionário Piloto foi concebida a primeira versão do Farol das cores, adaptado da
técnica de Traffic Light Labelling [3]. Baseado na utilização de um semáforo para classificar as cores que
os daltônicos têm mais dificuldade para distinguir, o sinal vermelho indica as cores que o indivíduo tem
mais dificuldade, o sinal amarelo dificuldade razoável e o verde pouca ou nenhuma dificuldade.
RESULTADOS
Com a aplicação do Questionário Piloto em um grupo de trinta usuários, dos quais quatro eram
daltônicos, foram coletados os dados apresentados nas Figuras 01, 02, 03, 04 e 05.
Figura 01. Porcentagem de homens e mulheres entrevistados.
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Figura 02. Cores que os daltônicos têm mais dificuldade em identificar.
Figura 03. Farol das Cores (Versão Piloto).
Figura 04. Sensações transmitidas pela combinação de cores utilizadas nas interfaces
selecionadas para o estudo.
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Figura 05. Melhores combinações de cores.
CONCLUSÕES
Através da aplicação do Questionário Piloto, tratamento estatístico e concepção do Farol das
Cores, concluiu-se que os daltônicos têm mais dificuldade em identificar o vermelho e o verde, seguido
pelo azul, roxo e lilás.
Com relação às cores utilizadas nas interfaces selecionadas para o estudo (Facebook e Orkut),
foi constatado que as combinações de cores utilizadas nessas interfaces transmitem a seus usuários
sensações de calma, tranqüilidade e satisfação.
Para desenvolver uma interface agradável tanto para daltônicos quanto para os usuários de visão
normal deve ser utilizada preferencialmente a combinação branco, azul e preto.
Esta pesquisa será ampliada pela aplicação de novo questionário em três grupos de indivíduos:
comunidade de daltônicos na Espanha, grupo de daltônicos no Brasil e grupo de indivíduos com visão
normal no Brasil. Além de ampliar a amostragem de estudo, esse questionário visa também quantificar
as limitações enfrentadas pelos daltônicos e como essas limitações afetam em seu psicológico e relações
interpessoais.
REFERÊNCIAS
[1] Lee, J., 2008. Uma Ferramenta Adaptativa Para Facilitar a Visualização de Imagens Para Pessoas Portadoras de
Daltonismo. Universidade de Pernambuco.
[2] Leveni, D. M. et al., 2008. Estatística: Teoria e Aplicações. 5a. edição. LTC. Rio de Janeiro, 752p.
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[3] Longo-Silva, G., Toloni M. H. A., Taddei J. A. A. Carrazedo. 2010. Traffic light labelling: traduzindo a rotulagem de
alimentos. Rev. Nutr. [serial on the Internet].
[4] Martins, A.C., 2007. Projeto de Interfaces Gráficas para Web. Universidade Federal de Juiz de Fora, Minas Gerias.
[5] Neiva, M., 2008. Sistema de Identificação da Cor Para Indivíduos Daltônicos: Aplicação aos Produtos de Vestuário.
Universidade do Minho, Portugal.
[6] Vespucci, K., 2009. Daltônicos ao Volante.
ASSOCIAÇÃO NUTRIGENÉTICA DO RECEPTOR NR1I3 COM A EFICIÊNCIA
ALIMENTAR EM BOVINOS MACHOS DA RAÇA NELORE
Pâmela A. Alexandre1, Soraya Silva1, Miguel H. A. Santana1, Rodrigo C. Gomes1, Saulo L. Silva2, Paulo
R. Leme2, Flavio V. Meirelles1; José B. S. Ferraz1, Heidge Fukumasu1
1Departamento
de Ciências Básicas; Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, USP 2Departamento de Zootecnia;
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, USP
RESUMO
Diversas vias metabólicas são reguladas por fatores de transcrição específicos que mediam as
interações nutrientes X genes em mamíferos. Dentre estes, o receptor NR1I3 foi recentemente
caracterizado como um regulador central do metabolismo energético, regulando gliconeogênese,
cetogênese e lipogênese. Desta forma, objetivou-se avaliar a presença de polimorfismos de nucleotídeo
único (SNP) no gene NR1I3 em bovinos Nelore e suas possíveis associações com a eficiência
alimentar. Do total de 168 animais avaliados para eficiência alimentar, os 24 mais eficientes e os 25
menos eficientes foram selecionados para extração de DNA. Amplificou-se o gene NR1I3 por PCR, os
produtos foram sequenciados e os SNPs encontrados foram avaliados quanto à sua localização e
associação com características fenotípicas. Foram encontrados 23 SNPs sendo 1 na região anterior ao
primeiro éxon, 8 em éxons, 12 em íntrons e 2 após o último éxon. Os SNPs exônicos estavam
distribuídos em regiões distintas do mRNA do receptor NR1I3. Foi detectada a presença de um SNP
na região 5’UTR, 2 SNPs sinônimos na região proteica entre o domínio de ligação ao DNA e a região
do domínio ligação de ligantes (LBD) e 5 SNPs, sendo 4 sinônimos e 1 não-sinônimo, na região do
LBD. Quando relacionados ao consumo alimentar residual, sete SNPs associaram com a característica
(p<0,05). A avaliação nutrigenética do receptor NR1I3 demonstrou ser de grande relevância para o
melhoramento genético de animais de produção, bem como para o estudo das vias metabólicas e
desvios patológicos, envolvidos nos fenômenos de apetite e lipogênese de animais.
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