levar pra casa

INTRODUÇÃO
Organismos procariontes, tais como as bactérias, possuem a
características de sofrer com pequenas
variações do meio ambiente. Sendo assim, esses organismos necessitam de
um maior poder de
regulação de seu metabolismo, em prol de uma melhor adaptação às
variações do meio. Muito dessa
regulação é feita a nível da transcrição de genes por proteinas,
aproveitando-se do fato de que
algumas proteínas importantes podem ser controladas por alterações
alostéricas e ligações
covalentes reversíveis.
Uma etapa importante no controle de processos celulares é a expressão
gênica. Como algumas
proteínas podem variar sua quantidade na célula se houver variação no
meio onde o organismo se
encontra?
Com um certo conhecimento é correto pensar que o primeiro passo é
bloquear a transcrição desta
proteína, num processo chamado regulação da transcrição gênica. Em
bactérias, muitos genes estão
em complexos chamados OPERONS, e nestes complexos normalmente existe uma
proteína repressora
e uma ativadora da transcrição de vários genes que, atuando em
"parceria", determinam certas
características.
Esta aula virtual apresentará três operons de uma bactéria muito
conhecida chamada E coli:
Operon
lactose),
Operon
triptofano)
Operon
arabinose).
lac (controlador da síntese das enzimas metabolizadoras de
trp (controle da síntese das enzimas sintetizadoras de
e
ara (controlador da síntese das enzimas metabolizadoras da
O fago lambda também será discutido por suas características únicas de
regulação gênica e controle
de seu ciclo vital.
Essa aula também vai discutir a estrutura de proteínas controladoras que
se ligam ao DNA, dando
ênfase ao domínio hélice-volta-hélice.
Controle da expressão gênica em procariontes
OPERON LAC
No metabolismo da lactose por E. coli são necessárias duas enzimas que
fazem parte de um operon
chamado lac. A primeira enzima é a BETA-GALACTOSIDASE. Ela é capaz de
clivar a lactose em
glicose e galactose que assim servirão como fonte de carbono para a
célula (ver figura abaixo). A
beta-galactosidase é dita uma enzima indutível, ou seja, sua expressão
varia com as necessidades
celulares:
Caso a bactéria esteja crescendo em meio rico em lactose, sua
expressão será alta;
Caso a fonte de carbono seja outro carboidrato, sua expressão será
reduzida.
A outra enzima do operon é a PERMEASE, que, como seu próprio nome
indica, é a enzima
responsável pelo transporte de lactose do meio extracelular para o
meio intracelular através
da membrana bacteriana (a lactose, como a maioria dos carboidratos,
não é capaz de
atravessar a bicamada lipidica sem uma proteína carreadora).
Existe ainda no operon lac uma outra enzima: Tiogalactosídeo
Transacetilase. Seu papel in vivo
ainda é incerto, mas in vitro é capaz de transferir uma acetila do
acetil CoA para a hidroxila
do carbono 6 de um tiogalactosídeo.
Um importante indício de que a indução ocorreria no metabolismo da
lactose foi o aumento
observado de b-galactosidase quando se tinha um aumento de permease
e tranacetilase.
Isto foi facilmente compreendido com modelos mutantes que mostravam
que as 3 enzimas são
codificadas por 3 genes contíguos (ver figura abaixo), onde:
z - beta-galactosidase; y - permease; a transacetilase
O RNAm do operon lac é dito policistrônico ou poligênico pois possui
informação para
codificar as 3 proteínas: beta-galactosidase, permease e
transacetilase (rever figura acima).
Depois da descoberta destes 3 genes, descobriu-se um mutante que
possuia os genes para
expressar as 3 proteínas, mas não o fazia. Jacob e Monod deduziram
que "a taxa de síntese
destas proteínas é normalmente governada por um elemento comum
diferente dos genes que
especificam sua estrutura". A este gene deu-se o nome de regulador
(gene i), sendo que os
mutantes constitutivos possuem genótipo i-z+y+a+ e os selvagens
i+z+y+a+.
O gene i é capaz de codificar um repressor que está faltando ou está
inativado nos organismos
com o gene i-.
Através de estudos usando bactérias parcialmente diplóides, através
do fator sexual (F'),
observou-se que uma bactéria que possui o genoma i+z- e o fator F'iz+ não é capaz de
metabolizar a lactose, ou seja, o repressor (produto do gene i) é
difundível.
Existe no opreron lac uma região promotora (p), que é o local onde a
RNA polimerase se liga
para começar a transcrição. Juntamente com o operador (o) formam os
locais de controle do
operon. Na presença do produto do gene i o operon é incapaz de ser
codificado pois o
repressor está ligado ao operador.
O isopropil-b-D-galactosídeo (IPTG) é um indutor artificial do
operon lac. Foi através de
estudos com esta substância que se descobriu o repressor lac, que na
ausência do indutor
liga-se ao operador e bloqueia a transcrição (veja as figuras
abaixo).
O repressor é uma proteína tetrâmera com subunidades idênticas (de
37Kd), cada uma com um
ponto de ligação ao indutor. Através de cristalografia (ver fguras
abaixo) descobriu-se que
esta proteína possui eixos bilaterais, como seria esperado de uma
proteína que se liga ao DNA.
"O repressor encontra o operador se difundindo ao longo da molécula
de DNA (uma procura
unidimensional) e não o encontrando a partir do meio aquoso (uma
procura tridimensional".
Já é sabido que se a glicose estiver no meio de cultura da E coli,
ela será preferencialmente
usada como fonte de energia, isto é, enzimas utilizadas no
metabolismo dos outros carboidratos
serão pouco ou nada expressas. Este efeito é chamado repressão por
catabólito.
Mas como se dá essa repressão?
Um fato importante é que a glicose abaixa a concentração do AMP
cíclico em E coli. Através de
estudos com AMPc exogeno, concluiu-se que "AMPc estimula o início da
transcrição de muitos
operons indutíveis" sendo, portanto, um sinalizador tanto em
bactérias quanto em mamíferos.
Mas como se dá essa modulação da transcrição via AMPc?
Em bactérias, o AMPc liga-se ao CAP (catabolite gene activator
protein - proteína ativadora
de genes por catabólitos), uma proteína dimérica com 2 subunidades
idênticas de 22Kd. Cada
subunidade possui um domínio de ligação ao DNA e ao AMPc (ver figura
abaixo). Somente o
complexo CAP-AMPc é capaz de estimular a transcrição e se ligar a
determinados promotores.
No operon lac, CAP se liga próximo a a região que se liga a RNA
polimerase.
CAP exibe simetria bilateral que se ajusta à seu ponto de ligação do
DNA. O repressor se liga
em um região "a frente" da RNA polimerase, portanto não bloqueia a
sua ligação mas impede
sua progressão. CAP também estimula a transcrição do operon lac por
possuir uma região de
ligação a RNA polimerase quando está ligado ao DNA. Ele também é
capaz de girar o DNA em
94 graus. Especificamente, 2 temas hélice-alça-hélice do dímero se
inserem em sulcos maiores
sucessivos da dupla hélice de DNA. Dois giros de 43 graus
correspodem pela maior parte do
giro para a direita do eixo do DNA. As ligações do CAP e da RNA
polimerase se reforçam
mutualmente porque inclinam o DNA no mesmo sentido (uma visão geral
pode ser vista no
modelo cristalográfico abaixo).
Os operons catabólitos indutíveis foram colocados sobre controle
duplo, pois possuem
promotores de ligação acima da região do operon (provavelmente
enfraquecido durante a
evolução) para tornar operons dependentes de uma proteína auxiliar
que inicia eficientemente a
transcrição. O indutor específico atua em um só operon enquanto que
o complexo CAP-AMPc é
capaz de afetar muitos.
Operons controlados em conjunto pelo AMPc são membros de um circuito
regulador global,
dentre eles: genes heat-shock (que são ativados por uma subunidade
sigma diferente da RNA
polimerase quando há altas temperaturas) e genes SOS (que codificam
enzimas de reparo após
dano no DNA).
OPERON ARA
O operon da arabinose é formado por 3 genes:
ara A (que codifica a isomerase),
ara B (que codifica ribulocinase)
e ara D (que codifica ribulose 5-fosfato epimerase).
Também possui um gene regulador ara C, que codifica proteína C,
e uma região
controladora com 2 operadores (ara O1 e ara O2), um sítio de
ligação para CAP e outro
regulador (ara I).
Assim como a lactose, a arabinose não é utilizada diretamente
como fonte de carbono, ou
seja, ela precisará ser modificada a xilose 5 fosfato para ser
utilizada no metabolismo.
O operon ara também está sobre controle duplo: é preciso a
presença do complexo
CAP-AMPc e a ligação da arabinose à proteína C para que a
transcrição seja eficiente.
A proteína C é um regulador negativo para o seu próprio gene
(ara C). A transcrição de
ara C é em sentido oposto a ara B, ara A e ara D, e é
controlada por ara O1.
Bem, e daí?
Bom, a proteína C só é transcrita quando há baixa concentração
de CAP-AMPc e dela
própria. Mas quando há alta concentração de proteína C e baixa
concentração de
CAP-AMPc a transcrição pára, pois a proteína C liga-se a ara
O1, exercendo uma
auto-regulação.
Se a proteína C se ligar ao araO2 ocorre um bloqueio na
tanscrição de ara B, ara A e ara
D, pois ela é capaz de formar uma alça no DNA e se ligar a ara
I, impedindo a passagem
da RNA polimerase. Isto não ocorre quando há CAP-AMPc ou
arabinose ( que liga-se à
proteína mudando sua conformação), que são reguladores
positivos (nesse caso, o RNAm
para proteína C não é formado porque ela está ligada a araO1).
Note que o operon ara é bastante rico em regulação:
Uma proteína pode regular sua própria síntese, reprimindo
a transcrição de seu
gene.
A ligação de uma molécula sinalizadora a uma proteína pode
transformá-la de
inibitória para ativatória já que se liga a pontos
diferentes no DNA.
Os pontos reguladores no DNA para ligação de proteínas não
precisam ser contíguos
aos genes contolados por eles. O DNA é facilmente dobrado
pela ligação de
proteínas ou complexos. Estas alças são bastante comuns na
regulação gênica em
eucariontes.
AS alterações provocadas pelas moléculas sinalizadoras são
facilmente retidas,
respondendo a variações nos níveis metabólicos
Controle da expressão gênica em procariontes
OPERON TRP
O operon trp possui 5 enzimas capazes de transformar corismato em
triptofano. Como bactérias são
seres procariontes (sem a membrana nuclear), a tradução começa antes do
término da transcrição.
O RNAm do trp é rapidamente sintetizado e seu tempo de vida é curto após
ter sido totalmente
transcrito, respondendo à variações do meio quanto a concentração de trp
quase que imediatamente.
Isto é possivel porque o repressor trp, um dímero com 107 aminoácidos, é
codificado pelo gene trp
que está longe do operon trp. Somente quando o repressor está ligado ao
triptofano torna-se capaz
de se ligar fortemente ao operador, que possui simetria bilateral.
O operador se superpõe ao promotor para o início de transcrição, ou seja,
o repressor está ligado ao
operador impede alostericamente que a RNA polimerase se ligue
eficientemente ao promotor trp
impedindo a transcrição.
O repressor possui uma estrutura dimérica onde cada dímero possui 3
domínios: Um central amino
terminal e duas cabeças flexíveis para leitura de DNA (carboxiterminal). O tema
hélice-alça-hélice volta a estar presente em cada subunidade.
É interessante que o repressor sem o trp é incapaz de se ligar ao DNA
pois sua região de ligação
está separada de 26A, mas quando o trp se liga, ele é capaz de aumentar
em 8A a abertura
possibilitando a ligação do complexo a 2 sulcos maiores adjacentes no
DNA, além de ajudar na
estabilização da estrutura.
Controle da expressão gênica em procariontes
ATENUAÇÃO
Você já ouviu falar em Atenuação?
Pois é, um pesquisador chamado Charles Yanofsky e seus colaboradores
chamou de atenuação um novo
mecanismo de controle da expressão gênica que ele descobriu enquanto
estudava o operon do
triptofano
Charles observou que alguns mutantes que continham deleções entre o
operador e o gene para a
primeira enzima do operon (trpE) apresentaram aumento da produção do mRNA
de trp. Além disso, o
mRNA de trp revelou uma sequência líder de 162 nucleotídeos antes do
códon iniciador de trpE e as
deleções anteriormente observadas foram mapeadas dentro dessa sequência
líder cerca de 30 a 60
nucleotídeos antes do códon iniciador de trpE. A importante observação
sequinte, foi que não
mutantes produziam um transcrito que consistia apenas dos 130
nucleotídeos da sequência líder
quando a quantidade de triptofano era alta, mas produziam um mRNA de 7 Kb
quando a quantidade
de triptofano era baixa na célula.
Dessa forma, Yanofsky concluiu que a transcrição do operon trp deve ser
regulada por um ponto
regulador de término (atenuador), situado entre o operador e a primeira
enzima.
Esse atenuador contém uma sequência rica em GC sequida de uma rica em AT
e cada uma dessas
regiõesexibe um eixo de simetria bilateral. Além disso, o transcrito
líder termina com uma série de
"U"s.
Agora provavelmente você deve estar se fazendo aquela velha pergunta: E
DAÍ?
Pois bem, vamos ao sentido de tudo isso.
Como vocês sabem, estamos estudando procariontes. Uma característica
importante desses seres é a
ausência de compartimentalização nas células, ou seja, não existe
separação das estruturas celulares
por membranas. Sendo assim, o DNA procariótico está solto no citoplasma
permitindo que os
processos de transcrição e tradução ocorram simultaneamente. A atenuação
faz uso desse rígido
acoplamento entre esses dois processos para controlar a expressão gênica.
Como?
Bem, um importante indício para responder essa pergunta foi a descoberta
de que parte do mRNA
líder é traduzido. Esse peptídeo líder de 14 aminoácidos possui códons
para triptofano nas posições
10 e 11 que exercem um papel muito significativo na regulação. Quando o
triptofano é abundante,
esse peptídeo completo é sintetizado permitindo a formação de uma alça
que pára a transcrição.
Entretanto, quando hà pouco triptofano, o ribossomo pára nos códons UGG
repetidos devido à
escasses de triptofanil-tRNA. O ribossomo parado altera a estrutura do
mRNA de modo que RNA
polimerase que o transcreve continua além do ponto atenuador.
É importante relembrar que esse efeito só é possível porque a transcrição
e a tradução estão bem
acopladas. O ribossomo que traduz o mRNA líder de trp está logo atrás da
molécula de Rna
polimerase que está transcrevendo o molde de DNA.
Vários outros operons para a biossíntese de aminoácidos em E. coli são
hoje conhecidos como tendo
atenuadores. O peptídeo líder de cada um deles contém uma abundância de
aminoácidos do tipo
controlado pelo operon. Por exemplo, o operon de treonina codifica
enzimas que sintetizam tanto
treonina quanto isoleusina. O peptídeo líder contém 8 treoninas e 4
isoleucinas em uma sequências de
16 aminoácidos. Sete fenilalaninas estão presentes no líder de 15
aminoácidos do operon da
fenilalanina. Ainda mais marcantesão as sete histidinas em fila
encontradas no peptídeo líder do
operon de histidina.
FAGO LAMBDA
O fago lambda é capaz de desenvolver ciclos no interior da célula: a via
líticae a via lisogênica.
Quando o fago lambda entra na via lisogênica, seu DNA fica covalentemente
inserido no DNA da
célula hospedeira em um ponto específico. Assim, o prófago (estágio em
que os DNAs ficam ligados)
se replica como parte do cromossomo hospedeiro em uma bactéria
lisogênica, e suas funções líticas
ficam dormentes mas não perdidas, ou seja, o fago lambda pode voltar a
desenvolver a via lítica, por
exemplo através de agentes que danificam DNA do hospedeiro.
Existem três estágios de expressão gênica na via lítica: inicialimediato, inicial-retardado e tardio.
O estágio inicial imediato possui dois operadores: Ol e Or (l-left e rright). O transcrito da
esquerda forma a proteína N. Na ausência desta proteína os transcritos
iniciais-imediatos param,
portanto ela permite uma maior expressão dos genes lambda ativando o
estágio inicial-retardado.
No estágio inicial-retardado é que são feitas as proteínas para a
replicação do DNA lambda e para
a recombinação. Neste estágio também é transcrito um gen que forma a
proteína Q, que é outro
regulador da expressão gênica em fago lambda. Esta proteína impede o
témino da transcrição.
A via lisogênica também possui três estágios: estabelecimento, manutenção
e liberação. O primeiro
necessita da integração dos DNAAs (viral e hospedeiro) e a inativação da
via lítica.
Kaiser demostrou que só o gen cI é expresso no prófago que é capaz de
codificar o repressor lambda
que se liga aos operadores Ol e Or.
O repressor em Ol impede a transcrição para a esquerda dos genes
iniciais-imediatos, ou seja, a
proteína N não é sintetizada e a via lítica é bloqueada.
Ao se ligar em OR impede a tanscrição dos genes cro e Q. De fato só o gen
cI é transcrito.
O gen cI que codifica o repressor está entre Ol e Or, e cada um destes
operadores possui 3 regiões
com diferentes afinidades para se ligar ao repressor.
O ponto de ligação mais forte para o repressor em Ol quanto em Or é o
mais próximo do início do
primeiro gen estrutural do operon, Ol1e Or1, respectivamente. O promotor
para o gen N fica dentro
de Ol1, e o promotor para o gen cro fica dentro de Or1. Como no operon da
arabinose, a ligação do
repressor a estes operadores bloqueia a ligação da RNA polimerase ao
promotor correspondente, e
portanto a transcrição do gene N (transcrito à esquerda) e a do gene cro
(transcrito à direita) não
são iniciadas. Por outro lado, a transcrição do próprio gen cI não é
bloqueada pela ligação do
repressor a estes pontos de alta afinidade.
O que controla o nível do repressor??? SUA PRÓPRIA SÍNTESE!!!
As diferentes afinidades de Or1, Or2 e Or3 pelo repressor constituem o
papel central de sua alto
regulção. Em baixos níveis de repressor, o Or1 está preenchido o que
bloqueia a transcrição do gen
cro e outros que ficam à dirreita. Uma molécula de repressor ligada a Or1
favorece a ligação de
outra a Or2, o que aumenta a transcrição do gen cI e leva à produção de
mais repressores. ã medida
que a concentração de repressorres aumenta, Or3 fica ocupado.
O fago lambda tira proveito de uma proteólise ativada para mudar sue
ciclo de lisoênico para lítico,
de modo que possa escapar de um meio que já não é mais tão seguro. Este
comportamento deve-se a
uma fina integração entre algumas proteínas e operadores.