Estudo do potencial cicatrizante, antimicrobiano e

0
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
ESCOLA DE ENFERMAGEM E FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM
MESTRADO EM ENFERMAGEM
JIRLIANE MARTINS DOS SANTOS
ESTUDO DO POTENCIAL CICATRIZANTE, ANTIMICROBIANO E
ANTIEDEMATOGÊNICO DA Musa paradisíaca L.
MACEIÓ – AL
2012
1
JIRLIANE MARTINS DOS SANTOS
ESTUDO DO POTENCIAL CICATRIZANTE, ANTIMICROBIANO E
ANTIEDEMATOGÊNICO DA Musa paradisíaca L.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Enfermagem da Universidade
Federal de Alagoas como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Enfermagem.
Orientadora: Profª. Dra. Eliane Aparecida
Campesatto
Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Lysete de
Assis Bastos
MACEIÓ – AL
2012
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico Bibliotecário
Bibliotecária: Fabiana Camargo dos Santos
S237e
Santos, Jirliane Martins dos.
Estudo do potencial cicatrizante, antimicrobiano e antiedematogênico da Musa
paradisíaca L. / Jirliane Martins dos Santos. – 2012.
99 f. : il., graf., tab.
Orientadora: Eliane Aparecida Campesatto.
Co-orientadora: Maria Lysete de Assis Bastos.
Dissertação (Mestrado em Enfermagem) – Universidade Federal de Alagoas.
Escola de Enfermagem e Farmácia. Maceió, 2012.
Bibliografia: f. 72-83.
Apêndices: f. 84-94.
Anexos: f. 95-99.
1. Bananeira. 2. Cicatrização. 3. Enfermagem – Pesquisa. 4. Antimicrobianos. 5.
Viabilidade celular. I. Título.
CDU: 616-083:615.322
3
AGRADECIMENTOS
Ao Senhor Jesus, que me deu uma nova forma de vida. Por ser meu sustento e
bálsamo, minha rocha firme, meu refúgio.
A minha mãe, por me dar a vida e me ajudar nos cuidados com o Ben nessa fase. Ao
meu pai que se estivesse aqui também vibraria por essa conquista.
Ao meu companheiro Akauê Basili, pelo incentivo, pelas sugestões, pelo consolo,
pela compreensão e por todo amor.
Ao meu pequenino Benjamim, por me confortar com seu sorriso, delicadeza e
ternura.
À Profa. Dra. Eliane Aparecida Campesatto pela orientação e auxílio na elaboração
deste estudo.
À Profa. Dra. Maria Lysete de Assis Bastos pela co-orientação e pelo incentivo na
realização de uma pesquisa experimental na Enfermagem.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Enfermagem, pelas aulas e
idealizações compartilhadas com a primeira turma de mestrado em Enfermagem/UFAL, bem
como aos meus colegas de turma pelas discussões e pelos estudos compartilhados.
Aos Professores doutores Lucia Maria Conserva, Magna Suzana, Antonio Euzébio
Goulart de Sant'Ana e João Xavier pela permissão no uso dos laboratórios.
Ao Prof. Ms. Pedro Aquino do Instituto de Química e Biotecnologia pelo apoio na
liofilização e sugestões.
Às Doutorandas: Regina Sales, Thaís Tenório, Patrícia Sarmento e Lorenna por
compartilharem o conhecimento técnico-científico em pesquisa experimental e vivências em
farmacognosia e fitoterapia.
Ao Prof. Ms. Jésu Costa Ferreira Júnior e ao enfermeiro mestrando Jayran Almeida
pela colaboração e pelas sugestões nos experimentos, bem como todos do Instituto de
Química e Biotecnologia, pelas trocas de experiências.
Ao Prof Ms. Valter Alvino pelos detalhes de Microbiologia e pela colaboração nos
ensaios de perfuração em ágar.
Aos doutorandos Aline Cavalcante, Yolanda Karla, Walfrido Bispo Jr e Anderson
pelo apoio nos ensaios de citotoxicidade e edema de orelha e aos demais colegas do LaFI.
Às mestrandas Cristiane Tavares e Kátia Mayumi pela parceria e amizade nessa
jornada árdua da pesquisa básica e aos demais colegas do LpTF pela colaboração nos testes.
4
À Maria de Fátima Maia Sarmento, do setor de Histologia do ICBS, pela confecção
das lâminas para a avaliação microscópica das lesões.
Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Simões Houly, da Faculdade de Medicina – Famed/Ufal,
pela contribuição na análise histológica das feridas.
A Capes pela concessão da bolsa de estudos.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente no decorrer desta pesquisa.
5
O coração do entendido adquire
conhecimento, e o ouvido dos sábios
busca a sabedoria.
Provérbios 18.15
6
RESUMO
Este estudo é uma pesquisa pré-clínica sobre o uso da bananeira (Musa paradisíaca L.), cujo
objetivo principal foi avaliar o potencial antimicrobiano, antiedematogênico, cicatrizante e
viabilidade celular dos extratos das folhas e do pseudocaule da bananeira Musa paradisíaca
L. Os extratos foram enumerados de acordo com a parte da planta utilizada, Musa 1 (extrato
etanólico da folha), Musa 2 (extrato aquoso da folha), Musa 3 (extrato etanólico do
pseudocaule) e Musa 4 (extrato aquoso do pseudocaule). Os testes in vitro realizados foram de
viabilidade celular pelo método MTT - [brometo de 3 – (4,5 – dimetiltiazol – 2 – il)
tetrazólio] e antimicrobiano por disco-difusão e perfuração em ágar. Para os testes in vivo
foram utilizados 36 ratos Wistar no experimento de cicatrização e 36 camundongos Swis no
edema de orelha induzido por capsaicina, disponibilizados pelo Biotério Central de Criação da
Universidade Federal de Alagoas, e manipulados de acordo com normas estabelecidas pela
Comissão de Ética para Utilização de Animais de Laboratório. Constatou-se nos testes
antimicrobianos frente às bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, e ao fungo Candida albicans, que os extratos brutos etanólicos e aquosos da
Musa paradisíaca L. não inibem o crescimento microbiano. O teste de viabilidade celular foi
realizado nas concentrações de 100, 200, 1000 e 2000 µg/mL e mostrou que os extratos na
concentração de 200 µg/mL não induzem toxicidade celular em macrófagos da linhagem J774
e nas demais concentrações há variação de citotoxicidade nos extratos. Os extratos também
foram testados em experimentos in vivo a fim de avaliar o potencial cicatrizante e
antiedematogênico das folhas e pseudocaule da bananeira. Verificou-se que não há inibição
significativa na formação de edema de orelha induzido por capsaicina, indicando que os
extratos não tem ação anti-inflamatória local. Quanto à cicatrização de feridas limpas,
verificou-se que os extratos tem ação cicatrizante induzindo a epitelização da ferida melhor
que o controle positivo.
Palavras-chaves: Bananeira. Cicatrização. Pesquisa em Enfermagem. Antimicrobianos.
Viabilidade celular.
7
ABSTRACT
This study is a preclinical research on the use of banana (Musa paradisiacal L.), whose main
objective was to evaluate the antimicrobial potential, antiedematogenic, healing and cell
viability of the extracts of the leaves and pseudostem of Musa paradisiacal L. Extracts were
listed according to the plant part used, Musa 1 (ethanol extract of the leaf), Musa 2 (aqueous
extract of the leaf), Musa 3 (ethanol extract pseudostem) and Musa 4 (aqueous extract
pseudostem). In vitro tests were conducted cell viability by MTT method - [bromide 3 - (4,5 dimethylthiazol - 2 - yl) tetrazolium] and for antimicrobial disk diffusion and agar drilling.
For in vivo tests were used 36 Wistar rats in the experiment healing and 36 mice in Swis ear
edema induced by capsaicin, provided by the Central Animal Laboratory Creation of Federal
University of Alagoas, and handled in accordance with standards established by the
Commission on Ethics Use of Laboratory Animals. It was found in testing antibiotics on the
bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and the yeast
Candida albicans, the ethanol and aqueous extracts of Musa paradisiacal L. do not inhibit
microbial growth. The test was conducted cell viability at concentrations of 100, 200, 1000
and 2000 µg/mL, and showed that extracts at a concentration of 200 µg/mL did not induce
cell toxicity in J774 macrophage lineage and in other concentrations there is a variation of
cytotoxicity in extracts. The extracts were also tested in vivo experiments to evaluate the
potential healing and antiedematogenic leaves and pseudostem of banana. It was found that no
significant inhibition of ear edema formation induced by capsaicin, indicating that the extract
has anti-inflammatory site. As for the healing of wounds clean, it was found that the extracts
have healing action inducing epithelialization of the wound better than the positive control.
Keywords: Banana. Wound healing. Nursing Research. Antimicrobials. Cell viability.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Morfologia da Bananeira.................................................................................. 24
Figura 2 – Estrutura química do flavonoide leucocianidina..............................................
25
Figura 3 – Estrutura química e molecular da Capsaicina (8-metil-N-vanílico-6-nonenamide)....................................................................................................................
33
Figura 4 – Fluxograma das etapas de preparação do Extrato etanólico – Musa 1 e 3.......
37
Figura 5 – Partes da bananeira coletadas. A – folha. B – Pseudocaule (círculo
vermelho)........................................................................................................... 38
Figura 6 – Nomenclatura dos extratos de acordo com a parte da bananeira (Musa
paradisíaca L.), método de secagem das amostras e solventes
utilizados........................................................................................................... 38
Figura 7 – Esquema mostrando a quantidade de inóculo microbiano e os meios de
cultura utilizados............................................................................................... 39
Figura 8 – Esquema do teste de perfuração em ágar.........................................................
41
Figura 9 – Redução do MTT a formazan pelas células vivas............................................
40
Figura 10 – Aplicação da capsaicina (A). Corte da orelha para pesar (B)......................... 41
Figura 11 – Conversão do sal de tetrazólio (amarelo) em cristais de formazan (azul)
pela ação da enzima Succinato desidrogenase..................................................
Figura 12 – Efeitos dos extratos nas concentrações 2000, 1000, 200 e 100 µg/mL
através do ensaio de MTT em células da linhagem J774 (48 hs). Os dados
representam a média e o erro padrão da média. * (p<0,05), **(p<0,01) e
***(p<0,001).....................................................................................................
47
48
Figura 13 – Efeito dos extratos etanólicos e aquosos da folha e pseudocaule da Musa
paradisíaca L. e indometacina (0,2 mg /orelha) sobre a formação do edema
de orelha induzido por capsaicina..................................................................... 49
Figura 14 – Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários em planta.......................................................................................
50
Figura 15 – Peso Médio dos animais subgrupo 1..............................................................
51
Figura 16 – Peso Médio dos animais subgrupo 2..............................................................
51
Figura 17 – Peso Médio dos animais subgrupo 3..............................................................
52
9
Figura 18 – Tamanho da lesão subgrupo 1........................................................................
53
Figura 19 – Tamanho da lesão subgrupo2.........................................................................
53
Figura 20 – Acompanhamento do tamanho médio da lesão durante o experimento.........
54
Figura 21 – Temperatura média dos animais..................................................................... 55
Figura 22 – Progressão da cicatrização das lesões de acordo com o tratamento utilizado 61
Figura 23 – Fotomicrografias das lesões do Grupo Experimental 01 (Musa 2) com
progressão da cicatrização de acordo com o dia de biópsia (D3 – 1 a 3 / D7 –
5 e 4 / D14 – 6 a 9). 1 – A: angiogênese, 1 – B: hiperemia e aumento do
fluxo sanguíneo, 2 – C: infiltrado inflamatório, 2 – D: rede de fibrina, 3 – E:
proliferação fibroblástica, 4 – F: reepitelização parcial, 4 – G: hiperplasia
epitelial, 5 – H: proliferação fibroblástica (reforço da cicatriz), 6 – I:
hiperplasia epitelial acentuada, 7 – J: Fibrina, 7 – K: infiltrado inflamatório,
8 – L: neoformação vascular intensa, 9 – M: fibras colágenas. Coloração HE,
aumento
4X
e
10X
nas
fotomicrografias
3
e
5......................................................................................................................... 68
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Análise macroscópica das lesões no D3 e porcentagem dos achados.
Maceió, 2012.................................................................................................... 56
Tabela 2 – Análise macroscópica das lesões no D7 e porcentagem dos achados.
Maceió, 2012..................................................................................................... 58
Tabela 3 – Análise macroscópica das lesões no D14 e porcentagem dos achados.
Maceió, 2012..................................................................................................... 60
Tabela 4 – Análise microscópica das lesões no D3 comparando os grupos e as
intensidades dos achados. Maceió, 2012........................................................... 63
Tabela 5 – Análise microscópica das lesões no D7 comparando os grupos e as
intensidades dos achados. Maceió, 2012........................................................... 65
Tabela 6 – Análise microscópica das lesões no D14 comparando os grupos e as
intensidades dos achados. Maceió, 2012.......................................................... 67
11
LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
OMS
Organização Mundial de Saúde
PNPIC
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
PNPMF
Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
Sus
Sistema Único de Saúde
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
Cobea
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
Ufal
Universidade Federal de Alagoas
IMA
Instituto do Meio Ambiente
MTT
[brometo de 3 – (4,5 – dimetiltiazol – 2 – il) tetrazólio]
EtOH
Etanol
ATCC
American Type Cell Collection
CCCD
Coleção de Culturas Cefar Diagnóstica
SST
Solução Salina Tamponada
UFC
Unidade Formadora de Colônia
DMSO
Dimetilsufóxido
NaCl
Cloreto de Sódio
DMEM
Meio Dulbecco Modificado por Eagle
Tween 80
Monooleato de Sorbitan Etoxilado 20 EO
PMN
Células polimorfonucleares
TRPV1
Receptor vaniloide
CIM
Concentração Inibitória Mínima
FNT
Fator de Necrose Tumoral
HE
Hematoxilina-eosina
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................
14
2 OBJETIVOS...................................................................................................................
19
3 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................
21
3.1 Plantas medicinais.........................................................................................................
22
3.2 Espécie estudada...........................................................................................................
23
3.3 Atividade antimicrobiana.............................................................................................
26
3.3.1 Micro-organismos estudados........................................................................................
27
3.4 Feridas e cicatrização.....................................................................................................
30
3.5 Inflamação tópica...........................................................................................................
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................
34
4.1 Tipo de estudo.................................................................................................................
35
4.2 Locais dos experimentos................................................................................................
35
4.3 Aspectos éticos................................................................................................................
35
4.4 Coleta e identificação do material vegetal...................................................................
36
4.5 Preparação dos extratos brutos...................................................................................
36
4.6 Nomenclatura dos extratos...........................................................................................
38
4.7 Ensaios antimicrobianos in vitro..................................................................................
39
4.8 Ensaio de viabilidade celular.......................................................................................
41
4.9 Ensaio para avaliação do potencial cicatrizante........................................................
42
4.10 Ensaio para avaliação da atividade antiedematogênica..........................................
43
4.11 Animais..........................................................................................................................
44
4.12 Administração dos extratos.........................................................................................
44
4.13 Análise estatística..........................................................................................................
44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................
45
5.1 Avaliação dos testes antimicrobianos..........................................................................
46
5.2 Avaliação do teste de viabilidade celular.....................................................................
47
5.3 Avaliação da atividade antiedematogênica.................................................................
49
5.4 Avaliação da cicatrização de feridas limpas em ratos...............................................
50
5.4.1 Observação clínica........................................................................................................
51
5.4.1.1 Peso.............................................................................................................................
51
5.4.1.2 Tamanho da lesão.......................................................................................................
52
13
5.4.1.1 Temperatura................................................................................................................
54
5.4.2 Avaliação macroscópica das lesões............................................................................
55
5.4.2.1 Primeira biópsia (subgrupo 1)....................................................................................
55
5.4.2.2 Segunda biópsia (subgrupo 2)....................................................................................
57
5.4.2.3 Terceira biópsia (subgrupo 3)....................................................................................
59
5.4.3 Avaliação microscópica das lesões.............................................................................
61
5.4.3.1 Primeira biópsia..........................................................................................................
62
5.4.3.2 Segunda biópsia..........................................................................................................
64
5.4.3.3 Terceira biópsia..........................................................................................................
66
6 CONCLUSÃO..................................................................................................................
69
REFERÊNCIAS....................................................................................................................
72
APÊNDICE
Apêndice A
Artigo publicado: Evaluation of Biological Activity of Musa spp (Banana):
Integrative Literature Review
ANEXOS
Anexo A
Anexo B
Anexo C
Anexo D
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
Declaração de registro da espécie vegetal no IMA
Protocolo de Observação Clínica e Avaliação Macroscópica das Lesões
Protocolo de Avaliação Microscópica das Lesões
14
1
INTRODUÇÃO
15
As plantas medicinais muitas vezes são o único recurso terapêutico de diversas
comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão
antigo quanto a espécie humana1. As primeiras civilizações perceberam que algumas plantas
continham substâncias as quais utilizadas no combate às doenças revelaram empiricamente
seu poder curativo2.
Avanços no meio técnico-científico vêm trazendo novos tratamentos e cura das
doenças por meio de medicamentos sintéticos, além disso, o estudo das plantas medicinais
vem sendo incentivado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), com o objetivo de avaliar
cientificamente os benefícios da utilização de medicamentos fitoterápicos e de conhecer os
riscos de seu uso indevido3.
Se o usuário tiver o cuidado de conhecer os riscos e benefícios no uso de plantas
medicinais, elas podem ser favoráveis à saúde humana. Foi criada, no Brasil, a Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) para o Sistema Único de Saúde
(SUS), instituída pela Portaria do Ministério da Saúde (MS) nº 971, de 03 de maio de 2006,
com o intuito de auxiliar a população na utilização de fitoterápicos4.
Neste mesmo ano instituiu-se a Política Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos, por meio do Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, que visa a “garantir à
população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos,
promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da
indústria nacional”, dentre seus objetivos específicos encontra-se o de “ampliar as opções
terapêuticas aos usuários do SUS, com garantia de acesso a plantas medicinais, a fitoterápicos
e a serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da
integralidade da atenção à saúde”5.
Posteriormente a Portaria interministerial nº 2960, de 9 de dezembro de 2008, aprova
o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) e cria o Comitê
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que se propõe por meio de diversas
estratégias atingir o objetivo geral da Política Nacional de Plantas medicinais e fitoterápicos,
tais como o de desenvolver instrumentos de fomento à pesquisa, desenvolvimento de
tecnologias e inovações em plantas medicinais e fitoterápicas, nas diversas fases da cadeia
produtiva, bem como proporcionar comunicação, formação técnico-científica e capacitação e
inserir plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à Fitoterapia no Sus, com
segurança, eficácia e qualidade, em consonância com as diretrizes da Política Nacional de
Práticas Integrativas e Complementares no Sus6.
16
Neste contexto há crescimento das pesquisas relacionadas com o uso de plantas
medicinais buscando cada vez mais o crescimento e o aperfeiçoamento de técnicas e recursos
humanos especializados que possam colaborar com estudos para a descoberta de fármacos
capazes de contribuir para o tratamento e a cura de doenças que acometem a população
atendida pelo serviço público de saúde6.
Os cursos de Enfermagem no Brasil possuem disciplinas com ênfase nos aspectos
comportamentais e de relações humanas, usualmente estudadas em pesquisas qualitativas.
Isso de certa forma tem impedido o avanço da categoria nas pesquisas básicas, que necessitam
de conhecimento técnico-científico prioritariamente nas ciências de base, como por exemplo,
fisiologia, biologia e farmacologia7. Em contrapartida, grupos têm demonstrado interesse e
tentado consolidar a Enfermagem em pesquisas experimentais, com vistas em estudos que
utilizem plantas medicinais no tratamento de feridas8,9.
O enfermeiro desempenha papel relevante na avaliação dos produtos disponíveis no
mercado para tratamentos de feridas, por deter de conhecimento científico para tal, bem como
acompanha a evolução da ferida, orienta e executa o curativo, assim como, por deter domínio
da técnica10. Sendo este profissional habilitado cientificamente na avaliação de feridas, pode
ingressar no ramo das pesquisas básicas, a fim de participar na descoberta de novas opções no
tratamento de feridas.
A ferida consiste em interrupção na continuidade de um tecido corpóreo provocado
por algum trauma, ou ainda ser desencadeada por uma afecção que acione as defesas do
organismo11. A cicatrização é evento complexo de reações e interações entre células e
mediadores bioquímicos, que visa a reparar a área lesada. De modo geral, uma ferida
infectada cicatriza-se por segunda intenção, em processo mais demorado e suscetível a
complicações, apresentando contração tecidual diminuída, principalmente se associada a
morbidades clínicas (hipertensão, diabetes, imunodepressão, etc.). Seu número tem crescido
muito com o aumento da expectativa de vida da população, levando a significativo aumento
no custo dos tratamentos12.
O desenvolvimento de produtos menos elaborados quimicamente, como os
fitoterápicos, podem apresentar grande economia para os cofres públicos em relação aos
tratamentos convencionais com medicamentos laboratoriais, portanto as terapêuticas com
drogas vegetais devem ser pesquisadas e divulgadas12.
As plantas medicinais têm sido utilizadas no tratamento de feridas em diversas
situações de forma empírica. Em busca de estudos científicos sobre o uso delas nesta
terapêutica, poucas são as evidências científicas que as correlacionem com a cicatrização8.
17
Estes achados reforçam a importância da investigação por meio de estudos
experimentais que possam contribuir na validação de possíveis fitoterápicos. Pesquisas
realizadas em alguns países têm demonstrado o potencial antimicrobiano e cicatrizante de
diversos extratos, óleos essenciais e substâncias extraídas de plantas13-7.
Exemplo disso é um estudo realizado no Paquistão, que utilizou a planta nativa
Berberis liceu, que foram testadas as atividades de cicatrização pelo uso dos extratos aquoso e
metanólico da raiz, avaliando o reparo das feridas em ratos. Após a aplicação de ambos os
extratos, observaram que a área de epitelização foi aumentada, seguida por aumento na
contração da ferida, resistência à ruptura da pele e presença de tecido de granulação. Os
estudos do tecido de granulação também indicaram que houve aumento na formação de
colágeno nos ratos tratados com o extrato, em comparação com os animais do grupo controle.
O extrato metanólico foi mais eficaz que o extrato aquoso, mas ambos apresentaram
resultados significativos em comparação com o controle18.
Outro estudo, realizado na Austrália, investigou dois produtos derivados do Lavandula
x allardii, o mel e o óleo essencial, que têm influência benéfica na cura de feridas excisionais
em ratos comparando-os com o Medihoney® (mel de Capillano Ltda, Brisbane), um mel
terapêutico devidamente registrado. Quatro feridas de 8 milímetros foram feitas
cirurgicamente na superfície dorsal de cada rato e aplicados às feridas mel ou óleo essencial
duas vezes por dia por 4 dias. A cura da ferida foi analisada pela contração da ferida e pelo
volume do capilar em 05 e 12 dias. Embora nenhuma diferença estatística significativa na
contração da ferida fosse observada para o óleo essencial ou o mel, em relação ao grupo
controle não tratado, ambos os méis foram mostrados por reduzirem o volume capilar no local
da ferida no 12º dia sem a diferença entre os méis. Constatou-se assim, que esses produtos
têm efeitos benéficos em feridas não infectadas19.
Um produto utilizado timidamente em pesquisas é a banana verde, mais
especificamente seu mesocarpo (parte interna da casca) na forma de farinha, utilizado na Índia
para tratamento de pacientes com úlcera péptica20. O extrato de banana verde não só aumenta
a densidade da mucosa, como também a incorporação de timidina ao DNA das células,
demonstrando seu efeito sobre a multiplicação celular21.
Estudo in vivo com ratos Wistar, mostrou que o extrato do epicarpo dos frutos da
Musa sapientum
var.
paradisiacal (banana maçã) numa preparação tópica apresentou
propriedade antimicrobiana e cicatrizante22. Entretanto, a utilização da bananeira (Musa
paradisíaca L.), em suas diversas partes, na cicatrização de feridas por segunda intenção, seu
18
potencial antimicrobiano, sua citotoxicidade e atividade antiedematogênica ainda não é bem
estabelecida8.
A bananeira (Musa spp.) é originária do Sudeste asiático e existem indícios do seu
cultivo desde 5000 a. C. ou até mesmo 8000 a. C. Nos séculos XV e XVI, colonizadores
portugueses começaram a plantação sistemática de bananais nas ilhas atlânticas, no Brasil e
na costa ocidental africana. Economicamente, é de grande importância nos países tropicais e
cultivada o ano todo23. Seu fruto é apreciado pela facilidade de aquisição, de consumo e por
ser fonte de vitaminas, minerais, carboidratos, fibras, lipídios, proteínas e energia.
O interesse por esta pesquisa surgiu do acompanhamento de puérperas que
utilizavam a parte interna (mesocarpo) da casca da banana como tratamento para fissuras
mamilares. Após realização de uma revisão integrativa verificou-se escassez de pesquisas
publicadas sobre a atividade biológica da bananeira contra doenças. Entretanto, evidenciou-se
que essa espécie vegetal possui atividade antimicrobiana, cicatrizante, antioxidante e antihelmíntica8.
Assim, faz-se necessário estudo pré-clínico utilizando extratos de partes desta planta
herbácea, especificamente a cultivada em Alagoas, a fim de identificar seu potencial
terapêutico, além de subsidiar a realização de pesquisas clínicas para validação de possível
fitoterápico. Estudos com esta planta podem corroborar ou refutar seus efeitos em
tratamentos, levando a diferentes abordagens por meio de novas descobertas.
19
2
OBJETIVOS
20
Objetivo Geral
Avaliar o potencial antimicrobiano, antiedematogênico, cicatrizante e viabilidade
celular dos extratos das folhas e do pseudocaule da bananeira Musa paradisíaca L.
Objetivos específicos
Classificar a atividade antimicrobiana in vitro dos extratos da espécie vegetal
abordada, frente às bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, e ao fungo Candida albicans;
Investigar a viabilidade celular dos extratos;
Avaliar a atividade cicatrizante e antiedematogênica in vivo.
21
3
REVISÃO DE LITERATURA
22
3.1 Plantas medicinais
Desde os tempos imemoráveis, os homens buscam na natureza recursos para
melhorar suas próprias condições de vida, aumentando suas chances de sobrevivência24. As
primeiras civilizações perceberam que algumas plantas continham, em suas essências,
compostos que ao serem experimentados no combate às doenças revelaram empiricamente
seu poder curativo2.
O uso de plantas medicinais vem desde as tribos primitivas, em que as mulheres se
encarregavam de extrair das plantas determinada substância para utilizá-la na cura das
doenças, além delas surgiram os curandeiros, que conheciam as melhores ervas e seus
respectivos tratamentos25.
As antigas civilizações têm suas próprias referências históricas acerca das plantas
medicinais e, muito antes de aparecer qualquer forma de escrita, o homem já as utilizava e,
entre estas, algumas como alimento e outras como medicação26. A primeira referência escrita
sobre o uso de plantas medicinais é encontrada na obra Pen Ts’ao (“A Grande Fitoterapia”),
do imperador chinês Shen Nung, do período 2838-2698 a.C, que descreve 365 ervas
medicinais e venenos que eram usados sob inspiração taoísta de Pan Ku, considerado deus da
criação27-8.
“No Brasil, a história da utilização de plantas, no tratamento de doenças, apresenta
influências da cultura africana, indígena e europeia”29:2000. Os africanos trouxeram plantas
medicinais e as utilizavam inclusive em rituais religiosos. Os índios utilizavam plantas
medicinais locais, conhecimento que foi transmitido e aprimorado de geração em geração por
intermédio dos Pajés. Já os europeus que chegaram ao Brasil se depararam com estes
conhecimentos, e passaram a utilizá-los com a ajuda dos índios que chamavam de “guias” 26.
Com isso os europeus ampliaram seu contato com a flora medicinal brasileira e a utilizaram
terapeuticamente, além do alimento24.
Até o século XX, fazia-se grande uso das plantas medicinais para a cura de doenças,
sendo esta prática tradição que foi sendo transmitida ao longo dos tempos. Utilizavam na
forma de chás, emplastos, sucos, dentre outras. A partir daí as plantas começaram a ser
estudadas, considerando suas substâncias ativas isoladas, surgindo fármacos como a atropina,
extraída da Atropa beladona L. (Solanaceae), a morfina da Papaver somniferum L.
(Papaveraceae), a quinina da Cinchona spp. (Rubiaceae), e a artemisinina da Artemisia annua
L. (Asteraceae) 26,30.
23
Mesmo com o incentivo da indústria farmacêutica para a utilização de medicamentos
industrializados, grande parte da população ainda se utiliza de plantas medicinais para cuidar
da saúde, como o uso das plantas medicinais, empregada para aliviar ou mesmo curar algumas
enfermidades. Vê-se a influência que as mudanças econômicas, políticas e sociais causam na
saúde das pessoas e nos modelos de cuidado. “O uso terapêutico de recursos naturais
utilizados no cuidado humano, que antes estava situado às margens das instituições de saúde,
hoje tenta legitimar-se nesse meio dominado pelas práticas alopáticas”2:2011.
O mundo tem vivenciado novas tendências, preocupando-se com a biodiversidade e
o desenvolvimento sustentável, mesmo assim apenas “17% das plantas do planeta foram
estudadas quanto ao seu emprego medicinal e, na maioria dos casos, sem grande
aprofundamento nos aspectos fitoquímicos e farmacológicos”31:2006, o que incentivou mais
estudos sobre as plantas medicinais brasileiras, desvelando-as como alvo de pesquisas.
Algumas universidades brasileiras têm buscado validar solidamente seus estudos
comprovando essa realidade atual24. Apesar disso, só 8% das espécies vegetais brasileiras
foram estudadas na descoberta de compostos bioativos32.
O desenvolvimento de pesquisas visando ao uso das plantas para fins terapêuticos é
recomendado pela OMS, proporcionando outras formas de cuidar em saúde para os menos
favorecidos. Esta iniciativa garante alternativa para o tratamento de doenças, principalmente
em países em desenvolvimento, em atenção aos cuidados primários com a saúde3,14-5.
“Associados a essa expansão, as plantas medicinais deixaram de ser vistas simplesmente
como um recurso da medicina popular, constituindo-se matéria-prima para indústrias de
produtos farmacêuticos”33:2001.
Sabendo-se da importância do estudo científico de plantas utilizadas na medicina
popular, oriundas do Nordeste brasileiro, esta pesquisa estudou uma espécie vegetal
conhecida como bananeira, Musa paradisíaca L. (banana prata).
3.2 Espécie estudada
As bananeiras são plantas gigantes, herbáceas perenes, pertencentes ao gênero Musa
da Família Musaceae, Ordem Scitaminea, desenvolvem-se bem em áreas tropicais e
subtropicais úmidas34. A morfologia desta planta (Figura 1) constitui-se de um verdadeiro
caule que é um rizoma subterrâneo; a parte superior é composta exclusivamente por folhas
cujas bainhas, robustas e superpostas formam um pseudotronco, atingindo de 4 a 6m de
altura; no interior desse pseudocaule percorre um tecido resistente que tem origem no rizoma
24
e vai formar o pedúnculo da inflorescência. O fruto é do tipo baga desenvolvida sem a
fertilização (partenocárpico)35.
Figura 1 – Morfologia da Bananeira.
Fonte: Castro et al, 2008.
O gênero Musa possui aproximadamente 40 espécies, entre elas: Musa paradisíaca,
Musa sapientum, Musa corniculata e Musa cavendishi. Estudos genéticos vieram comprovar
que os nomes acima representam híbridos e não espécies no senso biológico do termo36. A
classificação proposta por eles para o gênero Musa, hoje adotado em todo o mundo, é baseada
no número de cromossomos, dividindo-se em dois grupos: com 10 cromossomos e com 11
cromossomos.
Todas as espécies comestíveis conhecidas têm origem biespecífica, resultaram do
cruzamento entre duas espécies selvagens, Musa acuminata Colla e Musa balbisina Colla, de
modo que cada cultivo pode conter combinações variadas de genoma completo dessas
espécies. Esses genomas são denominados pelas letras A (Musa acuminata) e B (Musa
balbisiana), cujas combinações resultam grupos diploides (AA, BB e AB), triploides (AAA,
AAB e ABB) e tetraploides (AAAA, AAAB, AABB, ABBB). Em razão disso o nome
científico correto de uma variedade qualquer de banana torna-se meio complicado35,38.
25
A bananeira utilizada neste estudo, Musa paradisíaca L. (AAB), culturalmente mais
antiga e importante na alimentação de milhões de pessoas do mundo inteiro. Tanto a sua
região de origem como a sua classificação botânica ainda é assunto para muita discussão.
Contudo há unanimidade de opiniões por uma origem na Ásia onde é cultivada há mais de
quatro mil anos23, 38-9.
Algumas espécies vegetais sintetizam substâncias de defesa, quando são agredidas
por bactérias, fungos, parasitas, vírus ou outros agentes. Estes compostos são produtos dos
seus metabolismos secundários, tendo composição química muito variada, como terpenoides
(monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos e saponinas), compostos fenólicos (fenóis simples,
taninos, dibenzofuranos e flavonoides), compostos nitrogenados (alcaloides, polipeptídeos
cíclicos, glicosídeos), cumarina e cânfora15, 40-1.
Os principais constituintes químicos da Musa são esteroides, flavonoides e taninos42.
O componente ativo encontrado na casca de bananas verdes foi extraído e identificado como
um flavonoide leucocianidina (Figura 2)43. Outro autor inclui além dos taninos, eugenol,
tiramina, compostos fenólicos, antocianinas, sais minerais e vitaminas A, C, B1, B2, B5;
serotonina, levarterenol, dopamina (fruto maduro e casca); alcaloides, ferro, e cita dois
esteroides, o beta-sitosterol e o estigmasterol44.
Figura 2 – Estrutura química do flavonoide leucocianidina.
Fonte: http://www.darapri.it/immagini/nuove_mie/degustazione/app_sostanzeresponsabilicolore.htm
Devido à presença desses compostos, a banana possui relato etnobotânico de
utilização in natura ou cozida para diarreias, utilizadas em diversas formas de preparo, como
por exemplo, na forma de farinha, para tratamento de pacientes com úlcera péptica na Índia, e
de ratos com úlceras induzidas por aspirina7,45-6. Além disso, há um estudo que aplicou
topicamente um extrato do epicarpo da Musa sapientum var. paradisiacal (banana maçã) em
ratos Wistar, comprovando seu potencial antimicrobiano e cicatrizante22.
26
Um estudo utilizando o gel da casca da banana verde (Musa sapientum) teve como
objetivo determinar a concentração ótima desse gel para o tratamento de feridas em ratos. Os
resultados foram promissores constatando epitelização parcial e contração da ferida em todos
os grupos. Entretanto, apenas o gel a 4% resultou em melhor cicatrização em comparação
com outras concentrações do gel47.
Outra pesquisa avaliou a atividade antimicrobiana da casca da banana (Musa
paradisíaca) e das raízes do Cocos nucifera frente a alguns tipos de bactérias e fungos.
Ambos os extratos das plantas, extraídos em diclorometano e metanol, apresentaram efeito
inibitório sobre os organismos testados, porém, o extrato de Musa paradisíaca produziu zonas
mais amplas de inibição contra Candida spp. do que o extrato bruto da outra espécie
estudada48.
3.3 Atividade antimicrobiana
O corpo humano tem três barreiras defensivas contra germes invasores: naturais (pele
e mucosas das vias aéreas superiores, digestivas e urogenitais), imunidade inata e imunidade
adaptativa49. No entanto, estes mecanismos podem ter sua ação diminuída ou prejudicada, de
modo que são necessárias outras armas que ajudem esses mecanismos de defesa na destruição
do micro-organismo invasor, em geral, utilizam-se os antimicrobianos.
Os antimicrobianos são drogas que têm a capacidade de inibir o crescimento de
micro-organismos (bactérias, fungos e vírus), indicados apenas para o tratamento de doenças
infecciosas, uma das causas mais frequentes de morbimortalidade em qualquer especialidade
médica50.
A falta de saneamento básico, as dificuldades da população de acesso aos serviços de
saúde, entre outros fatores, influenciam a ocorrência de doenças nos países em
desenvolvimento. Com isso, as pessoas utilizam as plantas medicinais como recurso
terapêutico e outros. É a partir desse uso popular que as pesquisas vêm se consolidando em
busca de novas plantas com atividade antimicrobiana51.
O Brasil sendo um país com grande biodiversidade é palco de pesquisas com a
finalidade de encontrar novos agentes antimicrobianos em sua flora52. As plantas são usadas
na forma de extratos, infusões ou emplastos para tratar infecções comuns, embora não haja
evidência científica comprovando a eficácia destes53.
Para a realização de pesquisa básica com plantas medicinais, existem métodos
capazes de avaliar se um extrato vegetal tem atividade antimicrobiana ou não, estudos
27
determinam qual o melhor método a ser usado. Os mais conhecidos incluem método de
difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição, destes os dois métodos mais
utilizados são: difusão em ágar através das técnicas do disco, poço (perfuração em ágar) ou
template e diluição em caldo.
Esses testes de avaliação antibacteriana e antifúgica são
padronizados pela NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e
desenvolvidos para analisar agentes antimicrobianos convencionais54.
O uso de plantas como antimicrobianos tem sido investigado por diferentes grupos.
Estudo verificou a atividade antimicrobiana de oito espécies vegetais, avaliando as mesmas
frente as bactérias S. aureus, E. coli e P. aeruginosa16. Outro estudo avaliou a atividade
antimicrobiana de extratos secos de Artemisia absinthium L. (losna), Mentha pulegium L.
(poejo), Punica granatum L. (romã), Xanthosema violaceum Schott (taioba) e Syzygium
cuminii L. (jambolão), realizando teste de difusão em ágar, com 15 micro-organismos,
utilizando discos impregnados com as dispersões aquosas dos extratos vegetais51.
Pesquisa realizada com 17 espécies de árvores nativas do Brasil avaliou as atividades
antimicrobianas de extratos hidroalcoólicos, obtidos a partir delas utilizando o método da
difusão em ágar, frente a 10 diferentes micro-organismos, isolados de inóculos obtidos de
focos de infecções clínicas14.
A melhoria nas condições de vida associadas às ações de saneamento ambiental, e
com o advento dos antibióticos e das vacinas desde o século XIX, acreditava-se que havia
recursos para definitivamente controlar as infecções. No entanto, dados comprovam que se
está longe da diminuição ou fim destas55. Isso reforça a importância de pesquisas que
busquem plantas com ação antimicrobiana como recurso atual a fim de diminuir o surgimento
de infecções.
3.3.1
Micro-organismos estudados
A alta prevalência de infecções justifica a preocupação na busca de recursos que
permitam o desenvolvimento de novos métodos de controles específicos para determinadas
doenças16. Outro ponto levado em consideração é o surgimento de micro-organismos
resistentes e de infecções oportunistas fatais, associadas a aids, quimioterapia antineoplásica e
transplantes55-6.
O principal problema que se enfrenta com as bactérias patogênicas são as que
possuem resistência à maioria dos antimicrobianos, muitas vezes devido ao uso como única
medida e comumente pelos tratamentos incompletos. Entretanto, o uso excessivo por diversos
28
anos de compostos antimicrobianos se apresenta como fator principal para o surgimento do
fenômeno de resistência57.
Medidas inovadoras são sugeridas para resolver o problema da resistência das
bactérias, sendo uma delas a procura de novos antimicrobianos a partir de espécies vegetais58.
Pesquisas idealizadas neste contexto, visando a busca de novas perspectivas para o tratamento
de infecções, inclusive para o tratamento de feridas contaminadas, vêm por meio de uma
variedade de tecnologias, dentre elas a pesquisa básica.
Das várias espécies de bactérias que foram identificadas como causadoras de
infecções, encontram-se Staphylococcus aureus, uma bactéria Gram-positiva geralmente mais
sensível aos antibióticos do que bactérias Gram-negativas como a Escherichia coli e a
Pseudomonas aeruginosa, embora alguns antibióticos atuem apenas em bactérias Gramnegativas. Estas três espécies são alvos de grandes pesquisas, amplamente estudadas por sua
patogenicidade, responsáveis por diversos tipos de infecções59-60. Este estudo buscou
identificar a atividade antimicrobiana da folha e pseudocaule da bananeira, por meio das
bactérias usualmente utilizadas e do fungo Candida albicans, descritos a seguir.
Tendo em vista que o Staphylococcus aureus faça parte da microbiota normal do
corpo humano, é uma bactéria com patogenicidade, pois atua amplamente em diversas
infecções, sendo elas localizadas, geralmente superficiais, até algumas disseminadas, com
elevada gravidade55, o que justifica o crescimento do uso desta bactéria em pesquisas.
As infecções estafilocócicas podem ser classificadas em superficiais, que acometem
a pele e tecido subcutâneo, geralmente proveniente de contaminação da bactéria na própria
pele e mucosas, que resultam em abcessos cutâneos e infecções de feridas; e profundas que
são decorrentes de bacteremias, que surgem a partir desses focos de infecções superficiais,
com exceção da pneumonia por aspiração55.
O
Staphylococcus
aureus
é
uma
bactéria
Gram-positiva
da
família
Staphylococcaceae, pode ser encontrado em várias partes do corpo, como fossas nasais,
garganta, trato intestinal e pele. As infecções causadas por este micro-organismo podem se
originar pela contaminação do próprio indivíduo (infecções endógenas), ou por amostras
adquiridas de outros doentes ou de portadores sadios (infecções exógenas). A transmissão
ocorre por contato direto ou indireto55.
A Pseudomonas aeruginosa é o bacilo Gram-negativo não-fermentador mais
frequente em estudo nos laboratórios de microbiologia clínica, está presente nos mais diversos
ambientes, inclusive nos hospitalares. Considerada patógeno oportunista, por ser um dos
maiores agentes de infecções hospitalares. Sua importância clínica está na difícil erradicação
29
da infecção e contínuos fracassos terapêuticos, assim como a resistência natural e adquirida a
muitos antibióticos55.
Dificilmente este micro-organismo poderia causar infecção em indivíduo sadio,
geralmente a infecção instala-se em organismo no qual a primeira linha de defesa imunológica
esteja comprometida, como numa interrupção das barreiras cutaneomucosas, como também
numa imunodepressão fisiológica ou terapêutica55.
É comumente encontrada nas infecções de feridas, principalmente em pacientes com
longos períodos de internação e imunocomprometidos, a Pseudomonas aeruginosa tem
afinidade por ambientes úmidos, isso é um dos motivos de sua ocorrência prevalente nas
infecções hospitalares, sendo encontrada principalmente em pacientes queimados, em casos
de pneumonia, infecção urinária, infecção de feridas cirúrgicas e bacteremias55.
Já a Escherichia coli está inserida no grupo das enterobacteriáceas, bactéria
heterogênea e complexa, classificada em três grandes grupos: cepas comensais, que habitam o
intestino humano, as enteropatogênicas, que causam infecções de diferentes mecanismos e o
grupo das cepas patogênicas extra-intestinais capazes de causar diversos tipos de infecção, ou
simplesmente separa-se este micro-organismo como causador de infecções intestinais e extraintestinais, essas últimas podem ser localizadas ou sistêmicas. As infecções localizadas mais
frequentes são as das vias urinárias, dos pulmões, do sistema nervoso central, da pele e do
tecido celular subcutâneo (feridas) 55.
Observa-se que apesar de diferentes especificidades, essas três bactérias citadas
anteriormente destacam-se por colonizar feridas, principalmente as consideradas crônicas. Em
decorrência de sua constante exposição ao meio externo, a pele está sujeita a contaminação
microbiana, isso ocorre devido os micro-organismos terem afinidade por meios úmidos,
considera-se assim a ferida um ambiente propício à proliferação desses germes.
Outro agente de infecção é a Candida albicans, apesar de não ser comumente
encontrada em feridas faz-se necessária sua inclusão no estudo por estar na microbiota normal
do indivíduo, ser um fungo usualmente estudado e, além disso, responsável por diversos tipos
de micoses superficiais, podendo acometer a pele, mucosas ou tecidos mais profundos61.
Doenças ocasionadas por fungos podem estar associadas com doenças alérgicas,
doenças toxigênicas e doenças infecciosas, estas últimas conhecidas por micoses, em que o
agente possui propriedade de agir como patógeno primário ou oportunista55. Espécies de
Candida são reconhecidas como as leveduras mais usualmente envolvidas na etiologia de
infecções micóticas. A candidíase caracteriza-se como a infecção fúngica mais comum, sendo
Candida albicans seu agente etiológico mais frequente62.
30
Esta espécie é um fungo Gram-positivo, da família Saccharomycetaceae, é
considerado um polimorfo oportunista ou patogênico61. É amplamente estudado com relação
aos fatores de virulência. Além das infecções fúngicas que podem acometer os indivíduos
sadios, as micoses oportunistas atingem pacientes imunocomprometidos, inclusive associadas
a doenças de base como diabetes e câncer55.
3.4 Feridas e cicatrização
As feridas são interrupções da integridade cutâneo-mucosa e resultam dos
desequilíbrios e agravos da saúde das pessoas. Pode ocorrer em maior ou em menor extensão,
causada por trauma físico, químico, mecânico ou biológico, inclusive uma afecção clínica.
Elas podem impedir ou dificultar aspectos básicos da vida como a locomoção, a convivência e
as relações interpessoais, entre outros63-5.
De acordo com a intensidade do trauma, as feridas podem ser classificadas como
superficiais ou profundas, etiologicamente em agudas e crônicas. As feridas cirúrgicas são
feridas agudas intencionais, e podem cicatrizar por primeira intenção. Algumas feridas
cirúrgicas são deixadas abertas para cicatrizarem por segunda intenção, geralmente a fim de
permitir a drenagem de material infectado66. Na ocorrência de lesões acidentais ou cirúrgicas
os seres vivos têm a capacidade de reparação tecidual, fenômeno de grande importância para
sua sobrevivência.
Entende-se por cicatrização dos tecidos e órgãos como processo biológico complexo
essencial para manter a integridade do organismo, ainda não esclarecido totalmente. Procurase há muito tempo verificar a ação de substâncias químicas e/ou de procedimentos que
pudessem acelerar a cicatrização, tanto numa ferida limpa, como numa contaminada ou
infectada. Entretanto, algumas ações tiveram resultados ineficientes ou mesmo retardaram o
processo cicatricial67-8.
A cicatrização é determinada por mecanismos complexos coordenados e
desencadeados pelo organismo, que tem como objetivo a reconstituição completa da estrutura
e da funcionalidade do tecido comprometido. As feridas podem ser classificadas de acordo
com o comprometimento tecidual como: feridas de espessura parcial e de espessura total.
Cada uma destas tem processo único de cicatrização11.
A ferida de espessura total cicatriza-se em processo mais demorado e compreende
três fases: inflamatória, fibroblástica e de remodelamento. A fase inflamatória consiste em
31
respostas vascular e celular, responsáveis pelo controle do sangramento e pela remoção de
micro-organismos, material inorgânico e tecidos desvitalizados. A fase fibroblástica,
proliferativa ou reconstrutiva ocorre até a epitelização total da ferida. Após esse momento
ocorre o processo de migração de células endoteliais da periferia para o centro da lesão dando
origem ao tecido de granulação. Já na fase de maturação ou remodelamento há uma
reorganização das fibras de colágeno e substituição das fibras do tipo III, mais inferiores,
pelas do tipo I, culminando na formação do tecido cicatricial11.
Há ainda outra classificação que a cicatrização pode apresentar, baseada na perda
tecidual: cicatrização por primeira intenção, em que ocorre fechamento primário da ferida,
pois as bordas da ferida são aproximadas e suturadas, como ocorre nas feridas operatórias; e a
cicatrização por segunda intenção, em que há um fechamento secundário, a lesão cicatriza-se
mais lentamente sem a aproximação mecânica das bordas. Por serem mais extensas têm mais
probabilidade de infeccionar11.
Diversos fatores podem interferir na cicatrização: sistêmicos, como idade, condição
nutricional, má vascularização, uso de medicamentos, doenças de base e tabagismo; ou locais,
como infecção local, agentes tópicos, presença de tecido necrótico, suprimento sanguíneo
inadequado para a ferida e o tipo de cobertura utilizada11.
O enfermeiro tem papel relevante na busca por alternativas na cicatrização de feridas.
Sabendo-se que o tratamento envolve procedimentos de alta complexidade técnica, este
profissional da saúde precisa tomar decisões imediatas, para tal deve estar em constante
aperfeiçoamento científico tanto na área de dermatologia como na estomaterapia11, além de
incentivar a investigação de novas formas de cuidar pelo uso de plantas.
Uma pesquisa tem comprovado a ação cicatrizante do Orbignya phalerata, esta
espécie tem efeito favorável por meio do extrato aquoso do mesocarpo do babaçu em nível
microscópico no processo de cicatrização, nas variáveis mononucleares e fibras colágenas, em
todos os dias e entre os grupos69. Outro estudo usou o extrato hidro-alcoólico de Aroeira
(Schinus terebinthifolius Raddi) que mostrou efeito cicatrizante favorável nas cistotomias em
ratos70. Um estudo morfológico do efeito da sulfadiazina de prata, do extrato de ipê-roxo e do
extrato de barbatimão na cicatrização de feridas cutâneas mostrou que todos os extratos
favoreceram ao processo de cicatrização quando comparados com o grupo controle tratado
com solução salina a 0,9%71.
32
3.5 Inflamação tópica
Após a ocorrência de determinada agressão tecidual, o organismo responde por meio
do processo inflamatório, momento em que o corpo apresenta meios para combater os agentes
invasivos. Mediadores químicos são liberados durante o processo inflamatório, estes
promovem uma série de eventos no local da lesão ou do estímulo flogístico. Numa reação
inflamatória acontecem diferentes estágios nos quais envolvem alterações hemodinâmicas
importantes, como a vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade
vascular, a marginação leucocitária e posteriormente a migração destas células,
principalmente os leucócitos polimorfonucleares (PMN) aos tecidos perivasculares.
Clinicamente a resposta inflamatória apresenta-se por meio de quatro sinais clássicos: calor,
eritema, dor e edema, que ocorre devido o aumento da quantidade de líquido no meio
extracelular72-3.
O edema ocorre como resposta ao estímulo flogístico, caracterizando uma
inflamação cutânea. Assim, para avaliar a atividade antiedematogênica da Musa paradisíaca
L. realizou-se o edema de orelha induzido pela capsaicina (trans-8-metil-N-vanilil-6nonenamida), uma molécula ativa responsável pela ardência da pimenta vermelha, do gênero
Capsicum (Figura 3). Sua importância no estudo de neuropeptídios na pele deve-se a sua
capacidade de despolarizar fibras C ou A-delta, ligando-se a um receptor denominado
vaniloide (TRPV1), que abre canais iônicos gerando um influxo de cálcio na fibra nervosa,
induzindo resposta inflamatória neurogênica por produzir a degranulação de mastócito no
tecido conectivo da pele, com consequente produção de vasodilatação reflexa, extravasamento
de plasma, sensibilização nociceptiva e eritema, com isso o edema se estabelece em poucos
minutos74.
Definindo-se inflamação neurogênica na pele observa-se fenômeno de vasodilatação
arteriolar originado pelas fibras nervosas locais, com aumento do fluxo sanguíneo e
consequente edema por extravasamento de plasma da vênula pós-capilar. Vê-se a formação de
uma pápula com eritema durante uma análise clínica. Essa reação ocorre pela presença local
de neuropeptídios, que são liberados por duas subpopulações de fibras nervosas cutâneas,
assim chamadas peptidérgicas: as fibras do tipo C (aferentes não mielinizados ou nociceptores
polimodais C) e, em menor quantidade, as fibras A-delta (pequenas fibras mielinizadas). Estas
duas fibras associadas desempenham o papel autonômico e de nocicepção na pele75.
33
Figura 3 – Estrutura química e molecular da Capsaicina (8-metil-N-vanílico-6-Nonenamide).
Fonte: http://www.mdig.com.br/index.php?itemid=15684
Os processos inflamatórios agudos são melhores compreendidos devido a participação
da inervação nos processos cutâneos, tendo como sinais e sintomas mais característicos dor
e/ou prurido acompanhados de eritema e edema. A inflamação neurogênica, geralmente, é
desencadeada por qualquer dano tecidual ou estímulo doloroso. Diversas situações são
capazes de ativar nervos sensoriais na pele, como estímulos diretos (calor, isquemia, eventos
mecânicos, aumento da concentração de íons potássio por lise celular, baixo pH e estimulação
elétrica), mediadores inflamatórios liberados no local ou trazidos à pele pela circulação
sistêmica (como a histamina, metabólitos do ácido araquidônico, bradicinina e serotonina),
alérgenos e extratos de plantas, como a capsaicina75.
Em contrapartida, para que ocorra a inibição do extravasamento de plasma e
vasodilatação neurogênicos pode ocorrer bloqueio da condução nervosa (anestésicos locais),
bloqueio de receptores da capsaicina (com capsazepina), depleção de neurotransmissores
(tratamento crônico com capsaicina ou análogos), entre outros mecanismos75.
As plantas medicinais contêm princípios ativos que podem agir bloqueando os
receptores vaniloides da capsaicina impedindo a formação do edema, consideradas assim
antiedematogênicas. Empiricamente, a bananeira é usada como anti-inflamatório, seus
metabólitos secundários como taninos e flavonoides, sugerem esta atividade. Além de
pesquisar a ação tópica da Musa paradisíaca L. na cicatrização, é pertinente verificar a ação
local dos extratos também quanto à atividade antiedematogênica.
34
4
MATERIAIS E MÉTODOS
35
4.1 Tipo de estudo
Pesquisa básica, delineada nos moldes de pesquisa quantitativa. A pesquisa do ponto
de vista da sua natureza pode ser caracterizada como pesquisa básica ou pesquisa avançada.
Este estudo objetiva gerar conhecimentos novos, úteis para o avanço da ciência sem aplicação
prática prevista, envolvendo verdades e interesses universais76.
Inserida nas ciências naturais, requer o uso do método experimental, assumindo a
forma de pesquisa experimental, pois determina um objeto de estudo, selecionam-se as
variáveis que seriam capazes de influenciá-lo, definem-se as formas de controle e de
observação dos efeitos que a variável produz no objeto76.
4.2 Locais dos experimentos
Os testes in vitro e in vivo foram realizados no Laboratório de Pesquisa em
Tratamento de Feridas da Escola de Enfermagem e Farmácia – LpTF /ESENFAR, coordenado
pela Profa. Dra. Mª Lysete de Assis Bastos, no Laboratório de Farmacologia e Imunidade do
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde – LaFI /ICBS, coordenado pelas Profas. Dras.
Eliane Aparecida Campesatto e Magna Suzana Alexandre Moreira, no Laboratório de
Pesquisa em Química dos Produtos Naturais – Fitoquímica, coordenado pela Profa. Dra.
Lúcia Maria Conserva do Instituto de Química e Biotecnologia – LPqPN – Fitoquímica /IQB,
no Laboratório de Pesquisa em Química dos Produtos Naturais, coordenado pelo Prof. Dr.
Antonio Euzébio Goulart de Sant'Ana do Instituto de Química e Biotecnologia – LPqPN
/IQB e no Laboratório de Tecnologia e Controle de Medicamentos da Escola de Enfermagem
e Farmácia, coordenado pelo Prof. Dr, João Xavier e cols. Todos da Universidade Federal de
Alagoas.
4.3 Aspectos éticos
O projeto desta pesquisa foi encaminhado ao Comitê de Ética e Pesquisa da
Universidade Federal de Alagoas, por se tratar de uma pesquisa que envolve animais, sendo
aprovado em 17/01/2012 com nº do processo 018726/2011-19 (Anexo A). Os protocolos
foram conduzidos respeitando-se os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA77.
36
A pesquisa pré-clínica é necessária visto que toda experimentação com seres humanos
deve ser, obrigatoriamente, precedida por experimentos com animais. Entretanto para utilizar
esses animais deve-se levar em consideração o princípio dos três Rs – reduction, replacement
e refinement, que são diretrizes básicas para experimentação animal, adotadas neste estudo.
O princípio da Redução (Reduction) visa a minimizar o número de animais utilizados
nos experimentos, em contrapartida o número de ratos, por exemplo, não pode ser tão
pequeno a ponto de não permitir detectar efeitos biologicamente e sem significado estatístico.
Substituição (Replacement) tem como base a substituição, quando possível, dos animais por
outras técnicas de experimentação. Já o Refinamento (refinement) assegura que o sofrimento
experimentado pelos animais durante a pesquisa seja o menor possível78.
4.4 Coleta e identificação do material vegetal
Foram coletadas amostras da Bananeira (Musa paradisíaca L.), folhas (455,66 g) e
pseudocaule (471,51 g) do plantio da Fazenda Caboje, propriedade do Sr. Manuel Bernadino
de Oliveira, no município de União dos Palmares, interior de Alagoas (S -09°09’46” e O 36°01’55”), em abril de 2012. Amostras das folhas, fruto e inflorescência foram devidamente
reconhecidas pela botânica Rosângela Pereira de Lyra Lemos do Instituto do Meio Ambiente
do Estado de Alagoas (IMA), as exsicatas encontram-se catalogadas no herbário do IMA com
nº de registro MAC 54.889 (Anexo B).
4.5 Preparação dos extratos brutos
As amostras coletadas (folhas e pseudocaule) foram divididas em duas partes: 255,66
g das folhas e 271,51 g do pseudocaule para confecção dos os extratos etanólicos e a massa
restante para turbolização, resultando em extratos aquosos. A secagem do primeiro material
vegetal foi realizada em estufa a 40 °C com ar circulante, depois de dessecadas foram
trituradas e submetidas a um processo de maceração a frio, método em que a extração da
matéria-prima vegetal é realizada em recipiente fechado, durante um período prolongado, sob
agitação ocasional remaceração, renovando-se o liquido extrator, que neste estudo utilizou-se
o álcool etílico (EtOH) a 98%41.
Procede-se em seguida a filtragem do material para ser concentrado em evaporador
rotativo a 40 ºC e mantido em temperatura ambiente e estufa banho-maria para evaporação do
37
solvente residual e obtenção do extrato etanólico. O resíduo vegetal foi extraído por mais três
vezes em períodos mais curtos e os filtrados concentrados da mesma maneira (Figura 4).
Figura 4 – Fluxograma das etapas de preparação do Extrato etanólico – Musa 1 e 3
Material vegetal
in natura
Extrato etanólico
Secagem
Maceração a frio
•Estufa a 40°
•EtOH a 98%
•Quadruplicata
Concentração em
evaporador
rotativo
Filtração
Fonte: Autor, 2012
A secagem das amostras restantes ocorreu por liofilização, processo de separação
baseado no fenômeno da sublimação. Este método torna-se vantajoso quando comparado com
o processo convencional de secagem, porque mantém a estrutura do material, a umidade é
removida a baixas temperaturas, além de aumentar a estabilidade do produto durante a
estocagem, como também minimiza as várias reações de degradação devido a fácil transição
de material hidratado para desidratado79.
Foram utilizados 200 g de cada parte (folhas e pseudocaule) da Musa Paradisíaca L.
triturados in natura (ainda verdes) e pesados em balança semi-analítica WTB 200,
posteriormente congelados em sacos plásticos e acondicionados num freezer por 72 horas.
Após congelamento foram colocados em frasco próprio e individual do Liofilizador Thermo
Savant (Micro Modulyo®), e mantidos durante 72 horas, até a total desidratação.
Após extração da água pelo liofilizador, procedeu-se a extração a frio pelo método de
turbolização ou turbo-extração, em que a extração ocorre concomitante com a redução da
partícula, que são trituradas em partículas menores num liquidificador41. O material vegetal
foi triturado junto com água destilada na concentração de 1:25 para as folhas e 1:30 para o
pseudocaule, obtendo-se uma solução extrativa aquosa. Depois se fez a filtração e
acondicionou-se em potes de 200 mL, congelando-os. Cada parte congelada foi liofilizada
restando apenas o pó seco, considerado assim o produto final como extrato aquoso das partes.
38
4.6 Nomenclatura dos extratos
As folhas coletadas foram utilizadas em sua forma completa considerando os limbos
e nervuras (“talos”) (Figura 5 A). Considera-se neste estudo pseudocaule como sendo a
junção do terço médio (superior) da planta, próximo às folhas, composto pela sobreposição
das bainhas das folhas (bainha foliar), e os pecíolos (Figura 5 B).
Figura 5 – Partes da bananeira coletadas. A – folha. B – Pseudocaule (círculo vermelho).
Limbo
A
B
Nervura
Bainha
Foliar
Pecíolo
Fontes: http://www.kedideiaslegais.com.br/index.php?action=produtos/catalogo&cat=22
http://www.todafruta.com.br/portal/icNoticiaAberta.asp?idNoticia=24576
As partes da bananeira utilizadas resultaram em quatro extratos enumerados de 1 a 4.
Para tal, foram distribuídas de acordo com o modo de secagem (estufa a 40 °C ou liofilização)
e o modo de extração a frio (maceração e turbolização), bem como a parte da planta e
solventes utilizados, como mostra a Figura 6.
Figura 6 – Nomenclatura dos extratos de acordo com a parte da bananeira (Musa paradisíaca L.),
método de secagem das amostras e solventes utilizados.
Nomenclatura
Material vegetal
Secagem
Solvente / Extração
Musa 1
Folhas
Estufa a 40 °C
EtOH a 98 %
(maceração)
Musa 2
Folhas
Liofilizador
Água destilada
(turbolização)
Musa 3
Pseudocaule
Estufa a 40 °C
EtOH a 98 %
(maceração)
Musa 4
Pseudocaule
Lioflizador
Água destilada
(turbolização)
Fonte: Autor, 2012
39
4.7 Ensaios antimicrobianos in vitro
As metodologias empregadas foram a técnica de difusão em disco e a técnica de
perfuração em ágar, utilizando-se antibióticos e antifúngicos padrão como controles positivos
e como meio de cultura o ágar Müeller-Hinton, semeado na superfície com os inóculos
bacterianos e o ágar Sabouraud Dextrose semeado com o fungo. O uso de dois ou mais
métodos para o estudo da atividade antimicrobiana permite obter melhores resultados79.
Figura 7 – Esquema mostrando a quantidade de inóculo microbiano e os meios de cultura utilizados
Fonte: Autor, 2012
Os extratos da espécie vegetal abordada foram testados frente às bactérias
Staphylococcus aureus (Cepa ATCC 25923), Escherichia coli (Cepa CCCD/ E008 e ATCC
25922), Pseudomonas aeruginosa (Cepa ATCC 27857), e ao fungo Candida albicans (Cepa
ATCC 10231 e CCCD/CC001).
No teste de difusão em disco o inóculo dos micro-organismos foi preparado na
concentração 108 UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia/mL) e semeado em placas de ágar
Müeller-Hinton para bactérias, e Sabouraud Dextrose para o fungo. As amostras testes foram
dissolvidas em etanol atingindo as concentrações de 50.000 µg/mL. Para tal, discos estéreis de
papel filtro de 6 mm de diâmetro foram impregnados com 20 µL da solução estoque dos
extratos brutos (1000 µg/disco).
Como controles positivos para o fungo utilizou-se discos de 6 mm de diâmetro
impregnados com 20 µL de miconazol (50 µg/disco)81. Nos ensaios com bactérias foram
usados discos padronizados de vancomicina (30 µg/disco), ceftriaxona (30 µg/disco) e de
ciprofloxacina (5 µg/disco)82. Em todos os ensaios, o controle negativo foi feito com discos
impregnados com o solvente etanol utilizado na solubilização das amostras.
40
Os experimentos foram realizados em triplicata, de acordo com o método de difusão
em disco descrito por Kirby-Bauer83. Os discos foram distribuídos na superfície das placas de
Petri semeadas com os micro-organismos. Após a difusão dos extratos, as placas foram
invertidas e incubadas a 35 °C por 24 horas para bactérias, e a 28 ºC durante 48 horas para o
fungo84.
A atividade inibitória das amostras foi avaliada pela formação de halo de inibição do
crescimento dos micro-organismos em torno dos discos, mensurado com auxílio de um
paquímetro. O halo de inibição induzido pelos materiais testados foi comparado com os
obtidos nos controles positivos. A percentagem de inibição do crescimento foi calculada de
acordo com a seguinte fórmula:
% de inibição = Média do Halo de inibição da amostra x 100
Média do Halo de inibição do controle
Na realização do teste de perfuração em ágar placas de Petri são forradas
superficialmente com o meio estéril (ágar Müeller-Hinton para bactéria ou Sabouraud
Dextrose para fungos), obtendo-se assim a camada-base. Nessas placas são colocadas cinco
ponteiras invertidas a fim de confeccionar os poços. Em seguida o inóculo microbiano é
preparado de acordo com a escala 0,5 de McFarland85. Em tubos de ensaio estéreis contendo
10 mL do meio de cultivo acrescenta-se 100 µL da solução microbiana, homogeneizando-os.
Verte-se todo o conteúdo dos tubos de ensaio nas placas de Petri com as cinco ponteiras de 7
mm invertidas em pontos equidistantes. Após endurecimento retira-se as ponteiras, ficando as
placas com cinco poços (Figura 8).
A amostra teste utilizada foi a 10%, preparada com 100 mg do extrato bruto
acrescido de 1 mL de SF a 0,9% e 2 gotas de cremofor, Coloca-se 50 µL desta amostra teste
dentro de cada poço previamente confeccionado. O controle negativo foi 1 mL de SF 0,9%
com 2 gotas de cremofor utilizados para solubilizar o extrato e como controle positivo os
antibióticos Ceftriaxona e Ciprofloxacina, e o antifúngico Miconazol. As placas de Petri
inoculadas e com as substâncias testadas foram incubadas em estufa a 36 ºC por 24 h para
bactérias e 28 ºC por 48 h para o fungo. Após este período medem-se as zonas de inibição
com o auxílio de paquímetro manual85.
41
Figura 8 – Esquema do teste de perfuração em ágar
Fonte: Autor, 2012
4.8 Ensaio de viabilidade celular
Foram plaqueados em placa de 96 cavidades, macrófagos da linhagem J774 na
densidade de 2 x 105 células por poço cultivados em meio DMEM suplementado com 10% de
soro fetal bovino. Cada cavidade recebeu 200 µL do meio com as células. As células foram
tratadas com os extratos nas concentrações de 2000, 1000, 200 e 100 µg/mL por 48 h e
mantidas em estufa a 5% de CO2 1 hora antes de adicionar o MTT, três poços foram lisados
com 2 µL de Triton 100X para comparação de morte celular. Após o período de incubação
total (48 h), o sobrenadante foi descartado e adicionado em cada cavidade 100 µL de uma
solução de MTT (500 µg/mL) e reincubadas por 1 hora em estufa a 37° C e a 5% de CO2.
Após esse período o sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi ressuspendido com 100
µL de DMSO.
Para a quantificação do sal de formazan reduzido, as placas foram lidas com o
auxílio de um leitor de microplacas no comprimento de onda 550 nm. Essa técnica tem a
capacidade de analisar a viabilidade celular e o estado metabólico da célula a partir da
redução do sal de tetrazólio (coloração amarela) a formazan (coloração azul escuro) (Figura
9), sendo bastante útil para avaliar citotoxidade86.
Figura 9 – Redução do MTT a formazan pelas células vivas.
Fonte: Mosmann, 1983
42
4.9 Ensaios para avaliação do potencial cicatrizante
O experimento foi realizado com 36 ratos machos e fêmeas (Ratus novergicus
albinus - linhagem Wistar), com idade de 8 a 16 semanas e peso corporal de 180 - 300 g,
distribuídos aleatoriamente pelo método probabilístico de escolhas aleatórias. Esses animais
foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Alagoas e os protocolos
conduzidos respeitando-se os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA77.
O procedimento cirúrgico e biópsia foram realizados sob anestesia geral induzida por
via intramuscular com 50 mg/Kg de ketamina a 10% e 10 mg/Kg de xilazina a 2%,
administrado 0,1 mL para cada 100 g de massa corpórea do animal87.
Na região dorsal de cada animal, após epilação manual dos pêlos e antissepsia com
clorexidina a 2 % e colocação de campo fenestrado, foi realizada uma lesão excisiva da pele
com retirada do tecido cutâneo, expondo a aponeurose, medindo aproximadamente 1,5 cm²,
por lâmina de bisturi nº 11, com técnicas estéreis.
Em cada tratamento, os animais foram acompanhados por um período de 15 dias
verificando se a ferida permanecia sem contaminação. Os extratos utilizados foram os
aquosos, na concentração de 5%
88-9
, incorporados a uma pomada base contendo lanolina e
vaselina fundidas (1:1).
Todas as feridas foram tratadas diariamente, lavadas com solução isotônica de
cloreto de sódio a 0,9%, aplicação de cobertura secundária de gaze seca e fixação com
ataduras de crepom e esparadrapo até o 4º dia de pós-operatório, diferenciando-se os
tratamentos dos grupos. Após aparecimento de crosta e/ou rede de fibrina as feridas não foram
mais cobertas, fazendo-se a limpeza com solução fisiológica e aplicação da respectiva pomada
(0,3 mL). Cada grupo composto por um n de 09 animais, posteriormente subdivididos em 3
grupos com 3 animais cada, foi tratado conforme descrição abaixo:
Experimental 01: pomada base contendo o extrato Musa 2;
Experimental 02: pomada base contendo o extrato Musa 4;
Controle positivo: pomada cicatrizante com dexpantenol (50 mg/g)90;
Controle negativo: pomada base (lanolina e vaselina).
Os dados coletados foram registrados em protocolos pré-estabelecidos. No 3º, 7º e
14º dia do experimento, os animais foram monitorados por meio dos seguintes parâmetros de
avaliação:
A. Observação clínica – aspecto geral, peso do animal e temperatura corpórea;
43
B. Análise macroscópica das feridas – a ocorrência de inflamação, tecido de granulação,
sangramento local, exsudato, extensão da crosta (total, parcial ou ausente), necrose, rede de
fibrina e mensuração do tamanho da lesão.
C. Análise microscópica das feridas – as feridas de três animais por grupo foram coletadas
no 3º, 7º e 14º dia de pós-operatório, acondicionadas em frascos devidamente identificados,
contendo 05 mL de formaldeído a 10% e posteriormente submetidos ao procedimento
histológico de rotina pela coloração da Hematoxilina-eosina (HE). As lâminas foram
analisadas de acordo com os seguintes parâmetros: rede de fibrina, hemorragia, hiperemia,
infiltrado
inflamatório,
grau
de
proliferação
vascular,
células
mononucleares
e
polimorfonucleares, fibroblastos, hiperplasia epitelial, reepitelização e fibras colágenas.
Foram atribuídos os escores: 0 (ausente), 1 a 25% (discreto), 25 a 50% (moderado) e acima de
50% (acentuado)91-2.
4.10 Ensaio para avaliação da atividade antiedematogênica
O teste utilizado para avaliar a atividade antiedematogênica foi o edema de orelha
induzido por capsaicina, com 36 camundongos da linhagem Swiss (entre 20 – 30 g) machos
ou fêmeas, adultos, com 6 a 8 semanas de idade. Este ensaio consistiu na administração local
(orelha direita) de 20 µL de uma solução de capsaicina diluída em acetona (12,5 mg/ml). Foi
administrada acetona na orelha contralateral como branco. Foram pesados 10 mg dos extratos
brutos solubilizados em 30 µL de Tween 80, 300 µL de etanol e 670 µL de acetona, ficando
numa concentração de 0,1%93, administrados topicamente 40 minutos antes do estímulo
flogístico (figura 10).
Figura 10 – Aplicação da capsaicina (A). Corte da orelha (B).
A
B
Fonte: Autor, 2012.
O ensaio caracteriza-se por uma resposta inflamatória aguda da orelha, com
desenvolvimento de edema. Os animais foram sacrificados 30 minutos após o estímulo e suas
orelhas pesadas numa balança analítica para obtenção do índice de inflamação94-6.
44
Os grupos foram subdivididos em: Grupo Experimental: seis camundongos para cada
extrato bruto na concentração de 0,1%, previamente solubilizados conforme descrição acima
(totalizando quatro grupos); Grupo Controle Positivo: seis camundongos – aplicação tópica de
indometacina (10 mg/mL) na orelha direita e; Grupo Controle Negativo: seis camundongos –
administração de capsaicina na orelha direita.
4.11 Animais
Os animais, ratos (Ratus novergicus albinus - linhagem Wistar) e camundongos (Mus
musculus – linhagem Swiss), foram acondicionados em ambiente climatizado (22 ± 2 ºC), sob
iluminação artificial, alternando para claro-escuro a cada 12 horas em gaiolas individuais,
identificadas, contendo forro de maravalha, com livre acesso a ração padrão e água ad libitum.
Antes do início dos experimentos, visando à identificação de variáveis que possam influenciar
nos resultados, os animais ficaram em quarentena.
4.12 Administração dos extratos
Os extratos foram administrados por via tópica tanto no ensaio de cicatrização
quanto no de edema de orelha induzido por capsaicina. Na cicatrização os extratos foram
administrados através de pomadas contendo os extratos incorporados a pomada base (lanolina
e vaselina fundidas) na concentração de 5%97. No ensaio de edema de orelha os extratos
foram solubilizados em Tween 80, etanol e acetona para facilitar a aplicação tópica.
4.13 Análise estatística
Os resultados do teste de viabilidade celular foram analisados num programa
estatístico submetidos ao teste T de Student e os dados expressos em gráfico. Os níveis de
significância entre os grupos no teste de edema de orelha induzido por capsaicina foram
submetidos à Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste de Dunnet. Parte dos
resultados do experimento de cicatrização foi submetido ao teste T de Student seguido do teste
de Mann-Whitney e outros analisados no Excel. Os valores foram considerados significativos
quando *p< 0,05. Os resultados expressos como média ± erro padrão da média.
45
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
46
5.1 Avaliação dos testes antimicrobianos
As partes da Musa paradisíaca L. estudadas (folhas e pseudocaule), em seus quatro
extratos, foram testados nas bactérias S. aureus, P. aeruginosa e E. coli e no fungo C.
albicans na concentração de 1.000 µg/disco no teste de difusão em disco e na concentração de
10 % no teste de perfuração em ágar. Entretanto todos os extratos não inibiram o crescimento
dos micro-organismos em ambos os testes, pois não apresentaram halo de inibição. Levandose em consideração a semelhança dos métodos utilizados, que tem como princípio a difusão
em ágar, só confirma a não atividade das amostras testadas.
A parte da bananeira que mostrou atividade antimicrobiana de acordo com alguns
autores é o fruto, especificamente sua casca utilizada ainda verde, de diferentes formas, além
de serem espécies de bananeira diferentes da estudada nesta pesquisa8, 22, 45-6,48.
Como os extratos não inibiram o crescimento bacteriano e antifúngico, não ocorreu
comparação do halo de inibição induzido pelas substâncias testadas com os obtidos nos
controles positivos, nem tão pouco a percentagem de inibição do crescimento foi calculada.
Também não foi realizada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), pois os extratos vegetais
não apresentaram atividade antimicrobiana das cepas utilizadas e não houve halos de inibição
iguais ou maiores que 9 mm nos ensaios de difusão em ágar para que fossem submetidos ao
teste de microdiluição em caldo para a determinação da CIM.
É importante entender as limitações do teste de difusão em meio de cultura sólido98,
utilizado neste estudo, já que as propriedades químicas dos produtos naturais avaliados podem
facilitar ou dificultar sua penetração no meio de cultura e, consequentemente, seu contato com
o micro-organismo, necessário para sua ação99. É imprescindível considerar a realização de
outros ensaios para determinação da atividade antimicrobiana dos extratos avaliados100.
“Diversos métodos laboratoriais podem ser empregados para predizer a sensibilidade in vitro
de bactérias aos agentes antimicrobianos”101:2003.
Devido à ausência de ação antimicrobiana da Musa paradisíaca L., novos estudos
podem ser realizados no intuito de testar essa planta frente a outras espécies de bactérias e
fungos, podendo também ser utilizados compostos isolados, frações do extrato e outras partes
da planta (casca do pseudocaule, raiz, fruto e seiva), analisando se haverá algum efeito sobre
o crescimento microbiano100.
47
5.2 Avaliação do teste de viabilidade celular
O teste de viabilidade celular utilizado neste estudo foi através do método MTT
[brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio]. O ensaio de MTT foi descrito
pela primeira vez por Mosmann (1983), e modificado por Denizot e Lang (1986), é um
método colorimétrico rápido estabelecido para determinar o número de células viáveis em
proliferação e estudos de citotoxicidade, baseado no teste de atividade mitocondrial das
células pela redução do MTT86,102.
Ocorre uma clivagem do sal de tetrazólio amarelo, MTT, para formar um produto de
formazan azul, solúvel pela ação da enzima succinato desidrogenase presente nas
mitocôndrias ativas (Figura 11). A quantidade de formazan produzido é diretamente
proporcional ao número de vida e não de células mortas presentes durante a exposição ao
MTT, assim, quanto mais escura a coloração ao final da reação, maior é a viabilidade celular.
A densidade óptica resultante do teste MTT é determinada em espectrofotômetro86,102-3.
Figura 11 Conversão do sal de tetrazólio (amarelo) em cristais de formazan (azul) pela ação da enzima
Succinato desidrogenase
Fonte: Autor, 2012
Este teste foi realizado com os quatro extratos da Musa paradisíaca L., nas
concentrações de 100, 200, 1000 e 2000 µg/mL, observou-se que a Musa 1 na concentração
de 2000 µg/mL induziu moderada toxicidade celular em macrófagos da linhagem J774 (p <
0,01), a Musa 2 e 3 na concentração de 1000 µg/mL induziram elevada toxicidade celular (p <
0,001) e a Musa 4 nas concentrações de 100 e 2000 µg/mL induziram baixa e elevada
toxicidade celular em macrófagos da linhagem J774 respectivamente (p < 0,05 e p < 0,001).
Não houve toxicidade estatisticamente significativa em todos os extratos na
concentração de 200 µg/mL, na concentração de 100 µg/mL os extratos Musa 1, 2 e 3
também não apresentaram toxicidade. Os extratos Musa 1 e 4 nas concentração de 1000
µg/mL e as Musas 2 e 3 na concentração de 2000 µg/mL também não induziram toxicidade
celular em macrófagos da linhagem J774, conforme mostra a Figura12.
48
Figura 12 – Efeitos dos extratos nas concentrações 2000, 1000, 200 e 100 µg/mL através do ensaio de
MTT em células da linhagem J774 (48 h). Os dados representam a média e o erro padrão da média. *
(p<0,05), **(p<0,01) e ***(p<0,001).
Fonte: Autor, 2012
A perda seletiva da permeabilidade celular, a redução da função mitocondrial e as
mudanças na morfologia e replicação celular são o que permeiam os testes de citotoxicidade
prioritariamente. As células respondem por meio de diferentes mecanismos bioquímicos à
presença de diversos compostos. A perda da função mitocondrial é uma das respostas mais
comuns e pode ser utilizada como sinal precoce de citotoxicidade104-5.
A toxicidade é um fator que limita a liberação e consumo de fármacos e, portanto, a
análise de toxicidade associada à atividade biológica de um composto é fundamental para
determinar sua aplicação estabelecendo-se o índice terapêutico106. Considerando a ética e os
custos financeiros, o uso de animais para estudos toxicológicos deve ser preservado, sendo
mais vantajoso o estudo in vitro de toxicidade. Esses ensaios fornecem informações sobre
diferentes funções ou compartimentos celulares107.
Diante da diversidade de comportamento dos extratos frente às diferentes
concentrações utilizadas, afirma-se que o mais sensato é utilizar a concentração de 200
µg/mL, visto que somente nesta os extratos se comportaram de forma equitativa não
induzindo toxicidade celular em macrófagos da linhagem J774.
49
5.3 Avaliação da atividade antiedematogênica
O estudo do edema de orelha foi um experimento descrito por Mantione e Rodriguez
em 1990, e posteriormente modificado por Merlos et al e Gàbor e Razga94-7. É utilizado nas
pesquisas com intuito de verificar atividade anti-inflamatória local e/ou antiedematogênica,
em que o edema é avaliado de acordo com a metodologia revisada por Hecker e Schmidt108.
Na avaliação da atividade antiedematogênica, considerada ação anti-inflamatória
tópica, o uso da capsaicina como agente flogístico induziu processo inflamatório local
caracterizado pela formação de edema tecidual. A figura 13 mostra que a indometacina
(controle positivo) apresentou atividade anti-inflamatória tópica (inibição de 58,33%), já os
extratos da Musa paradisíaca L. não inibiram a formação do edema, ou seja, possivelmente
não possuem ação anti-inflamatória, quando usados topicamente e na concentração de 5%. A
Musa 1 teve uma porcentagem de inibição do edema de 23,26% e a Musa 4 de 1,35%,
considerados não significativos estatisticamente.
Figura 13 – Efeito dos extratos etanólicos e aquosos da folha e pseudocaule da Musa paradisíaca L. e
indometacina (0,2 mg /orelha) sobre a formação do edema de orelha induzido por capsaicina
Fonte: Autor, 2012
A Musa paradisíaca possui fitoesteroides, em maior abundância o estigmasterol e o
beta-sitosterol, que apresentam ações biológicas semelhantes e possuem atividade
antimicrobiana e anti-inflamatória109. A inatividade dos extratos da folha e pseudocaule da
bananeira vem refutar este achado, pois o metabolismo secundário das plantas pode variar
consideravelmente dependendo de vários fatores, como sazonalidade, ritmo circadiano,
variações de temperatura, altitude, poluição atmosférica, indução por estímulos mecânicos ou
50
ataque de patógenos, idade, radiação ultravioleta, índice pluviométrico, entre outros,
conforme mostra a Figura 14110.
Figura 14 – Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos secundários em planta.
Fonte: Gobbo-Neto e Lopes, 2007
5.4 Avaliação da cicatrização de feridas limpas em ratos
Este ensaio foi realizado durante 15 dias conforme previsto. Todos os animais
recuperaram-se bem da anestesia, demonstrando bom estado geral e atividades física e
comportamental normais para a espécie. Três biópsias foram realizadas com sacrifício de 12
animais, sendo 3 por grupo. Os parâmetros analisados estão registrados em protocolos
próprios (Anexo C e D), tanto para a avaliação macroscópica quanto para a microscópica.
Após o aparecimento de rede de fibrina e / ou crosta aderida à ferida manteve-se a
lesão descoberta. Realizou-se limpeza das feridas com solução fisiológica a 0,9% para
retirada de sujidades e reaplicada a pomada correspondente ao grupo.
51
5.4.1
Observação clínica
5.4.1.1 Peso
Os animais foram pesados no dia da cirurgia (D0), e nos dias das biópsias (D3, D7 e
D14). A média dos pesos dos animais foi calculada em cada subgrupo de acordo com o dia da
biópsia. Observou-se que houve perda de peso dos animais do subgrupo 1 (primeira biópsia),
comparando o D0 com o D3, exceto os animais do grupo controle positivo que ganharam
peso, conforme a Figura 15. A variação de peso foi discreta, considerada estatisticamente não
significativa.
Figura 15 – Peso médio dos animais subgrupo 1
Fonte: Autor, 2012
O peso dos animais sacrificados do subgrupo 2 (segunda biópsia) foi comparado
entre o D3 e o D7, constatando-se que os animais praticamente mantiveram-se no mesmo
peso, como mostra a Figura 16. Apenas o Grupo Experimental 1 (GE1) teve discreta perda de
peso do 3º ao 7º dia de pós-operatório, os outros ganharam peso.
Apesar de ter essa
diferenciação entre os grupos, a análise estatística não foi considerada significativa.
Figura 16 – Peso médio dos animais subgrupo 2
Fonte: Autor, 2012
52
Os animais do subgrupo 3 (terceira biópsia) mantiveram-se com peso similar, como
mostra a Figura 17, havendo um ganho apenas do 7º ao 14º dia de pós-operatório, sendo mais
expressivo no Grupo Experimental 2 (GE2), porém sem significância estatística. A maioria
dos animais teve o mesmo padrão de perda e ganho de peso durante todo o experimento.
Figura 17 – Peso médio dos animais subgrupo 3
Fonte: Autor, 2012
A diminuição na massa corporal nos primeiros dias é comum, visto que após um
procedimento cirúrgico pode acontecer inapetência, além do incômodo gerado pelo ferimento
na região dorsal do animal, que poderia dificultar o acesso destes animais a ração. Outro
aspecto considerado é o próprio processo inflamatório, que produz citocinas inflamatórias e
Fator de Necrose Tumoral (FNT) que agem como mediadores da inflamação e da imunidade.
Uma elevação nos níveis séricos de FNT causa a perda de peso devido estimulação do
aumento dos níveis séricos de leptina, pelo FNT. “A leptina é uma proteína relacionada com a
sensação de saciedade, níveis aumentados desta proteína induzem o organismo ao gasto
energético e a uma diminuição no consumo de alimento, causando falta de apetite e perda de
peso”97,111:2006.
5.4.1.2 Tamanho da lesão
Durante o experimento mediu-se o tamanho das feridas com o auxílio de um
paquímetro, a fim de verificar a diminuição da lesão em cada grupo. Com relação aos
subgrupos 1 e 2, conforme mostra as Figuras 18 e 19, o tamanho médio das lesões não
tiveram diferença significativa comparando-se as feridas de cada subgrupo com os dias de
pós-operatório. A área da ferida do subgrupo 1, expresso na Figura 18, mostra aumento que
ocorre na ferida durante a fase inflamatória (D3), o mesmo aconteceu com os outros
subgrupos. As principais funções desta fase são ativar o sistema de coagulação, defender a
53
lesão de infecções, promover o desbridamento autolítico da lesão, e o controle central da
cicatrização112.
A fase inflamatória se inicia imediatamente após a lesão, com a liberação de
substâncias vasoconstritoras, principalmente tromboxana A2 e prostaglandinas, pelas
membranas celulares. O tecido epitelial lesado e as plaquetas, que tem papel fundamental na
cicatrização, estimulam a coagulação. Para que ocorra a hemostasia, as plaquetas liberam
grânulos que contêm diferentes fatores de crescimento, atraindo neutrófilos à ferida, ajudando
na coagulação113. “O coágulo é formado por colágeno, plaquetas e trombina, que servem de
reservatório proteico para síntese de citocinas e fatores de crescimento, aumentando seus
efeitos. Desta forma, a resposta inflamatória se inicia com vasodilatação e aumento da
permeabilidade vascular, promovendo a quimiotaxia (migração de neutrófilos para a
ferida)”114, o que justifica o aumento da área das lesões e o aumento da temperatura corporal
também nesta fase.
Figura 18 – Tamanho da lesão subgrupo 1
Tamanho da Lesão (cm)
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/vaselina
D0
3,21
2,85
2,3
2,66
D3
3,96
3,16
2,95
2,79
Fonte: Autor, 2012
Figura 19 – Tamanho da lesão subgrupo 2
Tamanho da Lesão (cm)
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/vaselina
D0
2,47
3,08
2,89
2,41
D3
2,45
2,56
3,37
3,28
D7
1,5
1,95
2,8
1,78
Fonte: Autor, 2012
54
O subgrupo 3 permaneceu até o final do experimento e a média da área das feridas
foram expressas na Figura 19. Analisando o tamanho das lesões dos animais verificou-se
similaridade entre os grupos experimentais, controle positivo e o controle negativo. No D3
houve aumento da área das lesões, correspondendo ao período da fase inflamatória ou
exsudativa que geralmente dura de quatro a cinco dias115. Nos dias subsequentes de
tratamento, a área das feridas foi regredindo indicando potencial cicatrizante das substâncias
utilizadas, destacando o extrato aquoso da folha da bananeira (Musa 2) que teve a menor área.
Figura 20 – Acompanhamento do tamanho médio da lesão durante o experimento
Tamanho das Lesões (cm)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
D0
D3
D7
D14
Musa 2
2,65
3,17
2,06
0,5
Musa 4
2,95
2,9
2,26
0,8
Dexpantenol
2,6
3,31
2,68
0,6
Lanolina/vaselina
2,78
3,09
2,16
0,6
Fonte: Autor, 2012
5.4.1.3 Temperatura
Durante o experimento verificou-se a temperatura retal dos ratos, que varia de 35,9 a
37,5 °C116, como parâmetro clínico do estado geral dos animais. De acordo com a Figura 21,
no D3 não houve diferença significativa entre a temperatura dos grupos experimental 1 (Musa
2) e controle positivo (dexpantenol). Também no terceiro dia de pós-operatório ocorreu
aumento da temperatura na maioria dos grupos, exceto no grupo controle negativo (lanolina e
vaselina) que a temperatura média mais alta foi no D7. O grupo experimental 2 (Musa 4) ao
final do experimento teve a menor temperatura média.
Apesar dos grupos terem diferenciações nos valores das temperaturas durante o
experimento, quando comparados entre si, não há divergência significativa, levando em
consideração a variação normal da temperatura dos ratos. O aumento da temperatura até o
terceiro dia ocorre devido alterações decorrentes da fase inflamatória descritas anteriormente.
55
Figura 21 – Temperatura média dos animais
38,5
38,0
Temperatura (°C)
37,5
37,0
Musa 2
36,5
Musa 4
36,0
Dexpantenol
35,5
Lanolina/vaselina
35,0
34,5
34,0
D0
D3
D7
D14
Fonte: Autor, 2012
5.4.2
Avaliação macroscópica das lesões
Os parâmetros foram analisados quanto à presença ou ausência de tecido de
granulação, inflamação, sangramento local, necrose, fibrina e exsudato e quanto à extensão da
crosta (total, parcial ou ausente). Nos dias destinados à biópsia preencheu-se o protocolo de
avaliação macroscópica (Anexo C) de todos os animais, entretanto apenas três animais de
cada grupo eram sacrificados para retirada da ferida e posterior análise microscópica.
5.4.2.1 Primeira biópsia (subgrupo 1)
No terceiro dia de pós-operatório (D3), doze animais foram sacrificados, sendo três
animais de cada grupo. Avaliou-se a ferida de acordo com os parâmetros descritos no
protocolo específico (Anexo C). A Tabela 1 mostra tais parâmetros e a porcentagem dos
achados por tipo de tratamento. Todos os animais não apresentaram inflamação, necrose ou
exsudato nas feridas.
Apenas 33,3% dos animais tratados com a Musa 2, o dexpantenol e a
lanolina/vaselina apresentaram sangramento, comprovado pela presença de coágulo na lesão.
Quanto ao tecido de granulação, apenas um animal do grupo experimental 02 (Musa 4) e
controle negativo apresentaram-no; 66,7% dos animais tratados com a Musa 4 apresentaram
crosta parcial comparado com a lanolina/vaselina que teve apenas 33,3%.
56
Ressalta-se que todos os ratos desta primeira biópsia apresentaram fibrina, sendo
que 66,7% dos tratados com a Musa 2 e a lanolina/vaselina tinham apenas parcial,
comparando com os da Musa 4 que agiu como o dexpantenol que teve 100% com fibrina
total.
Tabela 1 – Análise macroscópica das lesões no D3 e porcentagem dos achados. Maceió, 2012
D3 - Achados (%)
Ausente Presente
Granulação
Crosta
Fibrina
Inflamação
Sangramento/
Coágulo
Necrose
Exsudato
Parcial
Total
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
100
66,7
100
33,3
-
-
-
Lanolina/Vaselina
66,7
33,3
-
-
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
33,3
100
66,7
-
66,7
-
-
Lanolina/Vaselina
66,7
33,3
33,3
-
Musa 2
-
100
-
100
Musa 4
Dexpantenol
-
100
100
66,7
-
33,3
100
Lanolina/Vaselina
-
100
66,7
33,3
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
100
100
-
-
-
Lanolina/Vaselina
100
-
-
-
Musa 2
66,7
33,3
-
-
Musa 4
Dexpantenol
100
66,7
33,3
-
-
Lanolina/Vaselina
66,7
33,3
-
-
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/Vaselina
100
100
100
-
-
-
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/Vaselina
100
100
100
100
-
-
-
Fonte: Autor, 2012
57
De acordo com o descrito na Tabela 1 observa-se a predominância na formação de
fibrina nas feridas, característica da fase cicatricial neste período. Os animais tratados com a
Musa 2 (extrato aquoso da folha) e Musa 4 (extrato aquoso do pseudocaule) com formação de
fibrina parcial ou total, apresentaram-na com aspecto espesso. Comparando-se com o controle
positivo dois animais tiveram fibrina com aspecto espesso e um animal com aspecto discreto,
entretanto a maioria dos ratos do controle negativo apresentou fibrina parcial, de aspecto
discreto quanto a sua espessura.
A fibrina surge a partir das plaquetas que contêm a enzima tromboplastina,
responsável pelo início da formação da rede de fibrina. A tromboplastina, na presença de íons
de cálcio, transforma protrombina em trombina, que por sua vez transforma o fibrinogênio em
fibrina. Elas formam uma rede que retém células sanguíneas e plaquetas, formando o coágulo.
Assim a mesma tem sua ação na fase inflamatória, e o coágulo vai se retraindo durante o
processo de cicatrização112.
Os grupos tratados com a Musa paradisíaca L. formaram uma rede de fibrina mais
espessa o que pode dificultar o processo de cicatrização, pois o excesso de fibrina induz uma
maior formação de trombos, diminuindo a circulação no tecido, levando a morte celular.
5.4.2.2 Segunda biópsia (subgrupo 2)
Os doze animais do segundo subgrupo foram sacrificados no 7º dia de pósoperatório, e os achados da avaliação macroscópica descrita na Tabela 2. Os aspectos
analisados foram descritos no mesmo protocolo anterior. Todos os animais não apresentaram
sinais de inflamação, necrose, exsudato ou sangramento. Os animais dos grupos tratados com
os extratos aquosos da bananeira e com o dexpantenol não apresentaram tecido de granulação
(100%), identificado em apenas um animal do grupo controle negativo.
Com relação à presença de crosta e fibrina, as lesões dos grupos experimentais
apresentaram bordas irregulares com 100% de formação de espessa crosta aderida, enquanto
que os grupos controles apresentaram crosta e fibrina ainda parcial em alguns animais. A
formação da crosta em feridas não exsudativas favorece o processo de cicatrização. O seu
aparecimento é gerado por várias substâncias presentes nas plantas, como é o caso do
tanino117, metabólito secundário da bananeira, além desse possui também flavonoides e
esteroides que têm ação anti-inflamatória42.
58
Tabela 2 – Análise macroscópica das lesões no D7 e porcentagem dos achados. Maceió, 2012
D7 - Achados (%)
Ausente Presente
Parcial
Total
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
100
100
100
-
-
-
Lanolina/Vaselina
66,7
33,3
-
-
Musa 2
-
100
-
100
Musa 4
Dexpantenol
-
100
100
33,3
100
66,7
Lanolina/Vaselina
-
100
66,7
33,3
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
100
66,7
33,3
33,3
-
Lanolina/Vaselina
66,7
33,3
33,3
-
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
100
100
-
-
-
Lanolina/Vaselina
100
-
-
-
Musa 2
100
-
-
-
100
100
-
-
-
Sangramento/
Musa 4
Dexpantenol
Coágulo
Lanolina/Vaselina
100
-
-
Musa 2
100
-
-
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/Vaselina
100
100
100
-
-
100
100
100
100
-
Granulação
Crosta
Fibrina
Inflamação
Necrose
Musa 2
Exsudato
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/Vaselina
Fonte: Autor, 2012
-
-
59
5.4.2.3 Terceira biópsia (subgrupo 3)
Observou-se que durante o experimento alguns animais esfregavam a ferida na grade
da gaiola, na tentativa de coçá-la, nestes ratos houve a remoção mecânica de parte da crosta,
fazendo com que ocorresse o renovo da cicatrização, assim algumas lesões apresentaram na
avaliação macroscópica final presença de fibrina e crosta parcial, bem como tecido de
granulação. Conforme Tabela 3, as feridas de 100% dos animais não apresentaram sinais de
inflamação, necrose ou exsudato. Um animal de cada grupo, exceto o controle negativo,
apresentou tecido de granulação. Dos animais tratados com a Musa 2 (66,7%) apresentaram
crosta total moderada e 33,3% crosta parcial, da mesma forma que as feridas tratadas com o
dexpantenol.
Em contrapartida 33,3% dos animais tratados com a Musa 4 e com a lanolina /
vaselina não tinham mais crosta e 66,7% dos animais desses grupos apresentaram crosta total.
Com relação à presença de coágulo, foi detectado em 33,3% dos animais do grupo tratado
com dexpantenol provavelmente devido algum sangramento provocado. A maioria dos
animais não possuíam fibrina, apenas 33,3% dos animais do controle negativo apresentaramna.
As características das lesões dos animais deste subgrupo correspondem a transição da
fase inflamatória para a proliferativa. Inicia-se por volta do 4º dia após a lesão estendendo-se
até o término da segunda semana. Se a membrana basal for preservada a epitelização ocorre
precocemente, “as células epiteliais migram em direção superior, e as camadas normais da
epiderme são restauradas em três dias”. Caso a membrana basal seja lesada, haverá uma
proliferação das células epiteliais das bordas da ferida, a fim de restabelecer a barreira
protetora114.
Apesar de alguns animais removerem parte da crosta, os aspectos das lesões eram
satisfatórios e condizentes com esta fase. Teve redução do tamanho e diminuição do
espessamento das crostas e algumas já apresentaram sinais de epitelização mesmo que
discreta em todos os grupos. Os animais tratados com a Musa 2 e os tratados com o controle
positivo apresentaram 100% de crosta, sendo 66,7% com crosta total, comprovando uma
possível ação cicatrizante do extrato aquoso da folha da bananeira comparado com o
dexpantenol.
60
Tabela 3 – Análise macroscópica das lesões no D14 e porcentagem dos achados. Maceió, 2012
D14 - Achados (%)
Ausente Presente
Granulação
Crosta
Fibrina
Inflamação
Sangramento/
Coágulo
Necrose
Exsudato
Parcial
Total
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
66,7
66,7
66,7
33,3
33,3
33,3
-
-
Lanolina/Vaselina
100
-
-
-
Musa 2
-
100
33,3
66,7
Musa 4
Dexpantenol
33,3
-
66,7
100
33,3
66,7
66,7
Lanolina/Vaselina
33,3
66,7
-
66,7
Musa 2
100
-
Musa 4
Dexpantenol
100
100
-
-
-
Lanolina/Vaselina
66,7
33,3
-
33,3
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
100
100
-
-
-
Lanolina/Vaselina
100
-
-
-
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
100
66,7
33,3
-
-
Lanolina/Vaselina
100
-
-
-
Musa 2
100
-
-
-
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/Vaselina
100
100
100
-
-
-
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina/Vaselina
100
100
100
100
-
-
-
Fonte: Autor, 2012
-
61
A Figura 22 mostra a progressão da cicatrização das feridas nos diferentes grupos de
tratamento, cada sequência horizontal de fotos corresponde ao tratamento utilizado no
respectivo dia de avaliação macroscópica (D3, D7 e D14). Observa-se a presença de crosta,
fibrina e diminuição na área da lesão em todos os grupos.
Figura 22 – Progressão da cicatrização das lesões de acordo com o tratamento utilizado
D3
D7
D14
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina / Vaselina
Fonte: Autor, 2012
5.4.3
Avaliação microscópica das lesões
A avaliação microscópica foi realizada de acordo com parâmetros pré-estabelecidos
em protocolo próprio (Anexo D) pelo Dr. Ricardo Houly (laboratório histopatológico). As
lesões dos ratos foram retiradas em três dias diferentes, a fim de avaliar aspectos distintos das
lesões de acordo com a fase de cicatrização. Em cada dia de biópsia (D3, D7 e D14) foram
sacrificados três animais de cada grupo, totalizando doze. As peças foram fixadas em
formaldeído a 10%, posteriormente seguiu-se o procedimento histológico de rotina,
submetendo-as à inclusão em parafina e os cortes histológicos foram corados pela
hematoxilina-eosina (HE).
62
Os aspectos avaliados microscopicamente foram fibrina, hemorragia, hiperemia,
infiltrado
inflamatório,
grau
de
proliferação
vascular,
células
mononucleares
e
polimorfonucleares (PMN), fibroblastos, presença de hiperplasia epitelial, reepitelização total
ou parcial e fibras colágenas. Observados de acordo com os escores: ausente (0), discreto (1 a
25 %), moderado (25 a 50%) e acentuado (acima de 50%)89,90. Os parâmetros perpassam as
fases da cicatrização de forma complexa, interdependente e simultânea, ocorrendo de forma
dinâmica e sobreposta.
5.4.3.1 Primeira biópsia
Encontra-se comumente nas feridas em processo de cicatrização, principalmente na
fase inflamatória, proliferação vascular (angiogênese), proliferação fibroblástica e o infiltrado
inflamatório, assim considera-se que todas as feridas tiveram cicatrização satisfatória. O
processo inflamatório desencadeia a cicatrização e consiste em respostas vascular e celular,
responsáveis pelo controle do sangramento e pela remoção de micro-organismos, material
inorgânico e tecidos desvitalizados11.
Na avaliação histológica das feridas dos animais sacrificados no terceiro dia de pósoperatório (Tabela 4), observou-se que as lesões tratadas com a Musa 2 apresentaram melhor
aspecto nos cortes histológicos. Com relação aos grupos controle positivo e negativo, a
lanolina / vaselina cicatrizou melhor que o dexpantenol, inclusive com 100% das feridas com
fibras colágenas com escore discreto.
A rede de fibrina estava presente em todos os grupos, destacando-se os tratados com
a Musa 4 e o Dexpantenol (controle positivo) que apareceu em 100% das lesões. A fibrina é
formada por uma série de complexas reações bioquímicas de proteínas plasmáticas solúveis,
chamadas fatores de coagulação, que vão se associando aos vasos sanguíneos injuriados e às
plaquetas para promover hemostasia.
Após a formação da rede de fibrina, ocorre uma vasodilatação que aumenta o fluxo
sanguíneo local, além de uma marginação leucocitária caracterizada como infiltrado
inflamatório11. Assim, quanto à presença de hemorragia os grupos experimentais
apresentaram melhor desempenho comparado ao grupo controle positivo e com relação à
presença de infiltrado inflamatório, 66,7% dos ratos tiveram escore discreto e 33,3%, escore
moderado, diferente dos tratados com a pomada base que apresentaram escore moderado em
todos os animais.
63
Comparando os achados histológicos com a avaliação macroscópica do subgrupo 1,
verifica-se uma compatibilidade dos parâmetros analisados com o período da cicatrização. As
fibras colágenas estão presentes em apenas uma das lesões do grupo tratado com a Musa 4 e
com o dexpantenol e em todas as lesões tratadas com a lanolina e vaselina, demonstrando um
avanço da cicatrização para a fase proliferativa nestes animais.
Tabela 4 – Avaliação microscópica das lesões no D3 comparando os grupos e as intensidades dos
achados. Maceió, 2012.
Ausente
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina /
Vaselina
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Fibras colágenas
33,3
100
Escores (%)
Discreto Moderado
33,3
100
33,3
66,7
33,3
66,7
33,3
66,7
66,7
33,3
66,7
33,3
33,3
100
33,3
66,7
66,7
66,7
33,3
66,7
66,7
33,3
33,3
66,7
33,3
Fonte: Autor, 2012
33,3
66,7
66,7
66,7
66,7
66,7
33,3
66,7
33,3
66,7
66,7
66,7
100
100
33,3
66,7
33,3
33,3
100
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
100
33,3
100
33,3
Acentuado
64
5.4.3.2 Segunda biópsia
As lesões retiradas no sétimo dia de pós-operatório foram analisadas com os mesmos
parâmetros. Espera-se nesta etapa, apesar de não estar totalmente na fase reconstrutiva, uma
maior proliferação de fibroblastos e vascular, bem como a produção de fibras colágenas. Após
a “limpeza” feita pelos leucócitos, ocorre migração de células endoteliais da periferia para o
centro da ferida, observando hiperplasia endotelial. Essa proliferação celular forma o tecido
de granulação, proporcionando uma fina cobertura sobre a pele11.
Observando a tabela 5 verifica-se que todos os tratamentos mostram sinais de
cicatrização adequados, Neste subgrupo as feridas tratadas com os extratos aquosos da
bananeira mostraram avanço cicatricial, sendo mais acentuado na Musa 4, embora a lanolina e
vaselina também tenha apresentado bom desempenho.
Todas as feridas tratadas com a Musa 2 tiveram fibroblastos com escore discreto e
66,7% das lesões apresentaram infiltrado inflamatório, grau de proliferação vascular e células
PMN e mononucleares com escore moderado, ressalta-se a presença de reepitelização parcial
e hiperplasia epitelial em 33,3% dos animais. A Musa 4 teve 100% das feridas ainda com
hemorragia e hiperemia, entretanto 66,7% apresentaram infiltrado inflamatório acentuado
enquanto que o dexpantenol só 33,3% de infiltrado inflamatório em cada escore e 66,7% de
fibroblastos e fibras colágenas de forma discreta. O grupo tratado com lanolina e vaselina
apresentou hiperplasia epitelial discreta e fibroblastos moderado (66,7%), bem como 33,3%
de reepitelização total e fibras colágenas, mostrando um avanço mais expressivo da
cicatrização neste subgrupo.
Comparando com os achados macroscópicos, todas as feridas já apresentavam
crostas parciais ou totais, ocorrendo o fechamento da lesão na fase proliferativa. Nesta fase
dá-se a reepitelização, que se inicia horas após a lesão, com a movimentação das células
epiteliais vindas das margens como de apêndices epidérmicos localizados no centro da lesão;
o tecido de granulação composto por fibroplasia e angiogênese ocupam o tecido lesionado
cerca de quatro dias após a lesão. “Os fibroblastos produzem a nova matriz extracelular
necessária ao crescimento celular enquanto os novos vasos sanguíneos carreiam oxigênio e
nutrientes necessários ao metabolismo celular local”118:2009.
65
Tabela 5 – Avaliação microscópica das lesões no D7 comparando os grupos e as intensidades dos
achados. Maceió, 2012.
Ausente
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina /
Vaselina
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
66,7
66,7
100
Escores (%)
Discreto
Moderado
66,7
66,7
66,7
33,3
33,3
33,3
100
33,3
33,3(parcial)
33,3
33,3
33,3
66,7
66,7
66,7
33,3
66,7
100
100
33,3
33,3
66,7
33,3
66,7
66,7
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
33,3
100
100
33,3
33,3
33,3
33,3
100
100
33,3
33,3
Acentuado
33,3
33,3
100
66,7
33,3
33,3
33,3
66,7
33,3
66,7
33,3
66,7
66,7
100
66,7
33,3
100
33,3
66,7
66,7
Fonte: Autor, 2012
100
33,3
66,7
66,7
33,3(total)
33,3
66
5.4.3.3 Terceira biópsia
Os animais deste subgrupo foram tratados por 15 dias, fazendo maior percurso da
cicatrização. Macroscopicamente as lesões foram pequenas e sem diferença significativa, com
área entre 0,5 e 0,8 cm2. Não apresentavam características da fase de remodelagem, possuindo
ainda crostas totais ou parciais, embora menos espessas. Comparando esses dados com as
características histológicos das feridas confirmamos o aspecto encontrado e a redução da área
da ferida é justificável.
Nesta fase da proliferação ocorre a formação de tecido de granulação. As principais
células desta fase são os fibroblastos e as células endoteliais. Os fibroblastos dos tecidos
vizinhos migram para a ferida, porém precisam ser ativados para sair de seu estado de
quiescência por fatores de crescimento114.
De acordo com a Tabela 6, os tratamentos com os extratos aquosos da espécie
estudada agiram melhor nas feridas quando comparado com o dexpantenol, apesar de ter grau
de proliferação vascular acentuada em 66,7% dos ratos. A Musa 2 compara-se ao controle
positivo com relação a presença de fibras colágenas com escore discreto em 66,7% das feridas
e supera-o ao apresentar 33,3% de hiperplasia epitelial e angiogênese acentuada, além de
reepitelização parcial. Já os fibroblastos apareceram em 66,7% das feridas com escore
moderado.
A Musa 4 apresentou 100% das lesões com infiltrado inflamatório, células PMN e
mononucleares e fibras colágenas com escore discreto, além de fibroblastos com escore
moderado. A hiperplasia epitelial apareceu em 33,3% dos animais semelhante ao achado nas
lesões tratadas com lanolina / vaselina.
Há estudo sobre a utilização da casca e das folhas da bananeira para melhorar a
epitelização e aliviar a dor no tratamento de feridas crônicas, comprovando seu potencial
cicatrizante 47,119. Pesquisa sobre o uso de Musa sapientum var. paradisíaca baseou-se na
premissa de que, uma vez que a planta tem uma ação de cura quando usada para tratar úlceras
gástricas, poderia também ser usada para tratar feridas da pele. Utilizou-se técnicas que
permitiram a avaliação da contração da área da superfície da cicatriz e o tempo de epitelização
e suas propriedades antioxidantes. Os ratos foram tratados com extrato aquoso e alcoólico
de M. sapientum var. paradisíaca por um período de 21 dias. Os resultados foram satisfatórios
em relação às propriedades dos extratos, frente à ação cicatrizante, bem como no presente
estudo46.
67
Tabela 6 – Avaliação microscópica das lesões no D14 comparando os grupos e as intensidades dos
achados. Maceió, 2012.
Ausente
Musa 2
Musa 4
Dexpantenol
Lanolina /
Vaselina
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
Fibrina
Hemorragia
Hiperemia
Infiltrado Inflamatório
Grau de Proliferação Vascular
Células PMN e mononucleares
Fibroblastos
Hiperplasia epitelial
Reepitelização
Fibras colágenas
66,7
66,7
33,3
33,3
Escores (%)
Discreto
Moderado
100
33,3
66,7
33,3
66,7
66,7
33,3
Acentuado
33,3
66,7
33,3
33,3
66,7
33,3
66,7(parcial)
66,7
100
100
100
100
66,7
100
33,3
100
66,7
100
33,3
100
33,3
66,7
66,7
66,7
33,3
33,3
66,7
33,3
33,3
33,3
33,3
100
100
66,7
66,7
100
66,7
66,7
33,3
Fonte: Autor, 2012
66,7
66,7
33,3
66,7
33,3
33,3
33,3(parcial)
66,7
33,3
33,3
33,3
33,3
66,7
33,3
68
A Figura 23 mostra a progressão do processo cicatricial da ferida tratada com a Musa
2 (Grupo Experimental 01). O extrato aquoso da folha da bananeira apresentou processo de
cicatrização acelerado e mais organizado quando comparado aos demais grupos, visto que já
apresentou hiperplasia epitelial (4 – G), reepitelização parcial (4 – F) e proliferação
fibroblástica (5 – H) no D7, além de presença de fibras colágenas (9 – M) e hiperplasia
epitelial acentuada no D14 (6 – I).
Figura 23 – Fotomicrografias das lesões do Grupo Experimental 01 (Musa 2) com progressão da cicatrização de
acordo com o dia de biópsia (D3 – 1 a 3 / D7 – 4 e 5 / D14 – 6 a 9). 1 – A: angiogênese, 1 – B: hiperemia e
aumento do fluxo sanguíneo, 2 – C: infiltrado inflamatório, 2 – D: rede de fibrina, 3 – E: proliferação
fibroblástica, 4 – F: reepitelização parcial, 4 – G: hiperplasia epitelial, 5 – H: proliferação fibroblástica (reforço
da cicatriz), 6 – I: hiperplasia epitelial acentuada, 7 – J: Fibrina, 7 – K: infiltrado inflamatório, 8 – L:
neoformação vascular intensa, 9 – M: fibras colágenas. Coloração HE, aumento 4X e 10X nas fotomicrografias 3
e 5.
1
2
3
4
5
6
7
8
Fonte: Autor, 2012
9
69
6
CONCLUSÃO
70
Pesquisas envolvendo plantas medicinais são imprescindíveis para contribuir em
novas formas terapêuticas, principalmente na assistência de enfermagem no tratamento de
feridas. O enfermeiro tem papel relevante na busca de outras maneiras de cuidar, interagindo
de forma multiprofissional na investigação de possíveis fitoterápicos e aprimorando o
conhecimento científico, a fim de promover a melhoria do cuidado ao paciente. A pesquisa
experimental vem como desafio nesta iniciativa, mas ainda tem sido utilizada timidamente por
esta categoria.
Todas as técnicas descritas neste estudo já são utilizadas nos laboratórios em que se
realizaram os experimentos, entretanto esta pesquisa teve complexidade metodológica.
Durante os testes ocorreram percalços, o que permitiu contribuir para o aperfeiçoamento das
técnicas e a adaptação de protocolos, bem como novos direcionamentos na execução de
outros ensaios.
• Os quatro extratos vegetais da espécie estudada não apresentaram atividade
antimicrobiana contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, às Gram-negativas
Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli e ao fungo Candida albicans pelos métodos de
difusão em disco e perfuração em ágar.
• A não inibição antimicrobiana da Musa paradisíaca L., sugere a realização de
novos estudos com o intuito de testar essa planta contra outras espécies de bactérias e fungos,
podendo também ser utilizadas outras formas de extração das substâncias ativas e outras
partes da planta (casca do pseudocaule, raiz, fruto e seiva).
• Na avaliação da viabilidade celular pelo método MTT, verificou-se que não houve
toxicidade estatisticamente significativa em todos os extratos na concentração de 200 µg/mL.
Na concentração de 100 µg/mL os extratos Musa 1, 2 e 3 também não apresentaram
toxicidade. Os extratos Musa 1 e 4 nas concentração de 1000 µg/mL e as Musas 2 e 3 na
concentração de 2000 µg/mL também não induziram toxicidade celular em macrófagos da
linhagem J774.
• Devido à diversidade de atuação dos extratos nas diferentes concentrações,
sugere-se utilizar a concentração de 200 µg/mL em todos os testes utilizados tanto in vitro
como in vivo, a fim de garantir a possível ação terapêutica sem causar toxicidade.
• Todos os extratos trabalhados não apresentaram atividade anti-inflamatória tópica
de acordo com o teste de edema de orelha induzido por capsaicina, a Musa 1 inibiu apenas
23,26% do edema, enquanto que a Musa 4 inibiu apenas 1,35%. As Musas 2 e 3 não inibiram
o edema.
71
• Com relação ao potencial cicatrizante, todos os tratamentos utilizados, inclusive
os extratos aquosos da Musa paradisíaca L. apresentaram características semelhantes nas
fases da cicatrização com os grupos controle, mesmo com escores diferenciados.
• Analisando macroscopicamente, a Musa 2 conferiu área da lesão menor se
comparada com os demais grupos, embora a diferença não seja significativa entre as áreas
calculadas. Houve uma variação de 0,1 a 0,2 cm2 entre os tamanhos das lesões e a maioria das
feridas apresentaram crosta total ou parcial ao final do experimento. Os achados
macroscópicos
observados
neste
estudo
foram
compatíveis
com
os
analisados
histologicamente.
• Na análise microscópica das feridas, apesar de terem escores diferenciados a
depender do subgrupo da biópsia pertencente, as lesões tiveram aspectos semelhantes de
modo geral. O extrato aquoso da folha da bananeira (Musa 2) apresentou processo de
cicatrização acelerado e mais organizado quando comparado ao demais grupos.
• A Musa 4 também teve desempenho satisfatório. Apesar de um dos animais
tratado com a lanolina / vaselina apresentar reepitelização parcial no D14, de modo geral o
pseudocaule da bananeira superou-a, levando em consideração os demais parâmetros. O
dexpantenol foi a pomada cicatrizante padrão, utilizada como controle positivo, entretanto
neste experimento as outras substâncias superaram sua ação.
Com este estudo, deseja-se contribuir para a ampliação do conhecimento a respeito
do não potencial antimicrobiano e antiedematogênico, da concentração ideal utilizada pelos
extratos que permitem viabilidade celular, bem como do potencial cicatrizante existente nos
extratos aquosos da espécie estudada. Para isso, a divulgação dos resultados deste estudo em
periódicos científicos de grande circulação no meio acadêmico faz-se necessária.
72
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84
APÊNDICE
85
Apêndice A – Artigo publicado
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
ANEXOS
96
Anexo A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
97
Anexo B – Declaração de registro da espécie vegetal no IMA
98
Anexo C
PROTOCOLO DE OBSERVAÇÃO CLÍNICA E
AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DAS LESÕES
GRUPO: ________________________________
ANIMAL: ________ MACHO ( ) FÊMEA ( )
Critérios
Dias pós-operatório
D0 (26/10)
1 – Peso
2 – Temperatura
3 – Aspecto geral do animal
4 – Tamanho da Lesão
5 – Tecido de Granulação Ausente
Presente
6 – Extensão da crosta (total, parcial
ou ausente)
7 – Inflamação
Ausente
Presente
8 – Sangramento local
9 – Necrose
10 – Exsudato
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
11 – Fibrina
Ausente
Presente
(parcial
ou total)
3º (29/10)
7º (02/11) 14º (09/11)
99
Anexo D
PROTOCOLO DE AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA DAS
LESÕES
GRUPO: ____________________________________________________
ANIMAL: ________ MACHO ( ) FÊMEA ( )
Variáveis
Dias pós-operatório
3º (29/10)
7º (02/11)
14º (09/11)
1 – Fibrina
2 – Hemorragia
3 – Hiperemia
4 – Infiltrado inflamatório
5 – Grau de proliferação vascular
6
–
Células
mononucleares
e
polimorfonucleares
7 – Fibloblastos
8 – Hiperplasia epitelial
9 – Reepitelização
-
-
Total
-
-
Parcial
-
-
10 – Fibras colágenas
Escores:
Ausente (0)
Discreto (1 a 25%)
Moderado (25 a 50%)
Acentuado (acima de 50%)
3 e 7º DPO – Fibrina, hemorragia, hiperemia, infiltrado
inflamatório, grau de proliferação vascular, células e
mononucleares e polimorfonucleares e fibroblastos.
14ºDPO – Hiperplasia epitelial