Tatiana Marlene Galvez Sánchez - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
TATIANA MARLENE GALVEZ SANCHEZ
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DAS PROTEINAS DE
FUSÃO CMX E ECMX NO TESTE DE MANTOUX PARA O
DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE.
Goiânia
2017
TATIANA MARLENE GALVEZ SANCHEZ
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DAS PROTEINAS DE
FUSÃO CMX E ECMX NO TESTE DE MANTOUX PARA O
DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título
de Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Orientador:
Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis
Goiânia
2017
i
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Tatiana Marlene Galvez Sánchez
Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis
Membros:
1. Dra. Ana Paula Junqueira-Kipnis
2. Dra. Menira Borges de Lima Dias e Souza
3. Dra. Samira Bührer-Sékula
Bolsista da Organização dos Estados Americanos (OEA)
Data: 20/03/2017
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, quem o tempo todo me deu o que eu precisava no tempo certo, e quem
neste tempo longe de casa me aprimorou em relação à fé, amor e paciência. Sei que o
pai e o filho Jesus Cristo vivem, e estiveram do meu lado me aperfeiçoando com amor.
À minha família, por ter me dado apoio em todas minhas escolhas e pela
confiança que sempre tiveram em mim. Marlene, minha mãe, como a pessoa que mais
me conhece, conseguiu me acalmar e dar forças, mesmo e não sabendo exatamente
minhas dificuldades. Lembrei muitas vezes do seu sorriso e bom ânimo, lembrei muito
dos conselhos e da sua frase “dê tempo ao tempo”, e que mente e coração para as
pessoas que sonhamos demais têm que manter seu equilíbrio. Wilson, meu pai, que
mesmo na ausência dele, sinto até hoje os grandes ensinamentos de amor, fortaleza e
coragem que demonstrou durante a vida. O orgulho e confiança que ele sentia por mim
não me fez desistir. Gherson, meu irmãozinho de convívio, às vezes, era tão complicado
nos suportarmos, mas é tanto amor envolvido entre a gente (risos) que senti muita
saudade dele estar por perto para fazer as coisas mais simples. O tempo passou por nós
e posso ver como você amadureceu na minha ausência. Gianfranco e Genesis, também
meus irmãozinhos, saibam que são um presente para mim, pensar em vocês me faz ser
um melhor exemplo de irmã maior (mais velha).
A toda minha família, tios, primos e sobrinhos, são muito importantes para mim,
e agradeço a todos pelos bons desejos, sei que de longe eles torciam por mim.
Especialmente as minhas vovozinhas, Lola e Olga, elas sempre me faziam saber que
oravam por mim, tanta saudade de escutar suas histórias e ver o quão sábias vocês são,
aprendi muito mais a valorizá-las. Também aos meus amigos, que são quase parte da
minha família, adoro saber que tenho um espaço para que eu possa expressar a minha
simplicidade. Obrigada ao Brato, Círculo e Tikis; se já cresci eu sei, mas ainda cada
letra do nome desses grupos significa alguém muito importante para mim.
À minha orientadora Ana Paula, uma pessoa que respeito e admiro como ser
humano e profissional, saiba que você é um exemplo para mim e que sou muito grata
por tê-la como orientadora. A oportunidade de trabalhar no grupo me ensinou princípios
e valores que com certeza são necessários para tudo na vida. Aquele estresse gostoso e
viradas de noites tentando fazer o melhor possível para surpreendê-la sem sucesso
foram ótimos (risos). Levo-me a sensação de sempre querer ir por mais.
iii
Ao Professor André Kipnis, uma pessoa que também admiro demais, sempre
pronto para ajudar. Obrigada pelo apoio desde que cheguei ao laboratório, pela
paciência e pelas dicas microbiológicas que me sentia à vontade de consultar. As coisas
complexas conseguiam ser muito simples.
Aos meus colegas do laboratório, cada um foi essencial na minha sobrevivência
em equilíbrio aqui. Adeliane, muito obrigada por me acolher e me ensinar muitas coisas
tanto na vida pessoal como profissional. Cresci muito no convívio ao seu lado, o mesmo
temperamento, ou explode ou se junta, quase explodi (risos), mas terminamos juntando
a fórmula, gosto da senhorita e saiba que sua amizade é muito valiosa para mim. Bruno,
algumas vezes falei que você é como meu irmãozinho brasileiro, e é assim mesmo.
Você me acolheu com muito carinho desde o início até sem falar a mesma língua,
puxou-me nos momentos de desânimo e era aquela cumplicidade nos momentos de
vamos sorrir, porque se o mundo vai acabar, pois que acabe mesmo (risos). Danilo, eu
conheci você um pouco depois e sempre consegue tirar um sorriso de mim, você é meu
exemplo de paciência e calma antes de eu conhecer que existia a caixinha do rancor
(risos). Eni, pessoa que gosto demais, até deu aula de Português para mim, sua
simplicidade e humildade para ver as coisas são qualidades que levo sempre presentes,
obrigada por tudo e sucesso sempre, mulher. Fábio, obrigada por me ensinar mais do
perfeccionismo e do saber escutar, sei que adora meu Espanhol e gostaria de falar a
minha língua (risos). Lázaro, foi muito bom sentir-me à vontade de perguntar qualquer
coisa até da “inmortalidad de um cangrejo” se essa era minha dúvida. Obrigada pelas
intermináveis dicas de tudo, de política, filmes, ciência e comidas, é claro, sobretudo
gordicies (aquelas épocas em que eu ia atrás de tudo que poderia ser comido, risos).
Moninha, você é uma alma muito nobre, até quando fica brava, está pronta para ajudar e
compartilhar suas experiências de laboratório e de vida, obrigada pelos abraços e as
caretas de luz que me deram conforto nos momentos difíceis. Rayanni, minha pequena
representante do imenso ânimo, obrigada por tudo, você é muito prestativa e carinhosa,
você consegue me transmitir muita coisa boa, menina. Rogério, você ganhou meu
carinho aos poucos, obrigada por me escutar tanto e não pensar ou fingir que já
enlouqueci. Obrigada por matar minhas curiosidades microbiológicas e pelo ânimo em
cada escolha. Obrigada aos pequenos do laboratório (de carinho); Aline, Estefani,
Frederick, Ítalo, Micaela, Stella, Thaís, Vanessa e Vitor; vocês são o grande motivo para
os mais velhos continuarem, desculpem por não dar o tempo que vocês precisam.
Também houve pessoas que nos visitaram, Anisa, Sofia, Matias e Kenyi, foi muito bom
iv
ter vocês um tempo conosco, cada um com uma cultura diferente nos obrigando a falar
inglês ou espanhol (sim). Todos foram muito importantes para meu aprendizado de
conhecimentos e convivência, tudo ajudou muito a me conhecer e melhorar meu caráter,
levarei cada um de vocês no meu coração.
Professora Samira, foi um prazer ter trabalhado como parte de sua equipe. Sou
muito grata pela oportunidade e confiança, a qual me ajudou muito a confiar mais em
mim. Algo que levo presente é o ato de sonhar e trabalhar por aquilo, mesmo que
tenhamos que começar novamente. Obrigada Prof. Marcelo Mendonça, as discussões e
as dicas ótimas de como solucionar problemas nos experimentos me motivaram muito.
João Pedro, Dienny e Ernandez, obrigada por me acolher e me fazer sentir em casa
durante esse tempo de trabalho, vocês são ótimos.
Tenho gratidão pelos colegas, que desde o Perú me apoiaram. Segundo, meu
professor e amigo, que sempre está ao meu lado me motivando a crescer e amar a
pesquisa, aquele jeito de ser feliz e relaxado com milhões de coisas para fazer me dá um
tanto de esperança (risos). Junto ao Antonio, que não me deixaram desistir e voltar ao
Peru antes de acabar o mestrado. Obrigada Claudia, Silver, Lourdes, por ser meu porto
seguro de empolgados pela pesquisa; ter vocês por perto me dá ânimos para continuar.
Aos meus colegas bolsistas com os quais compartilhei as primeiras experiências
de experimentar o primeiro RU, as palavras constrangedoras em Espanhol mal faladas
em Português e as risadas do que acontecia frequentemente, como passear demais ao
pegar o ônibus errado (risos). Muitos deles eram parte da minha aula de Português para
estrangeiros, foi uma troca cultural excelente. Muito obrigada Andrés, Francisco, Juan
Carlos, Leda, Oscar e Stefan.
A todas as pessoas que fora do laboratório me apoiaram aqui no Brasil. Lucio,
meu amigo cultural, obrigada por me receber em Goiânia e por todo o apoio até me
acostumar a caminhar por mim mesma. Graças a ele conheci os mexicanos: Fernanda e
Marujos. Fernanda, você foi minha pessoa aqui, só Deus para colocar você no meu
caminho, não pude ter melhor companhia, sua alegria, ânimos e consolo me mantiveram
enquanto ia me acostumando com a minha nova vida. Quando meus amigos mexicanos
voltaram para casa, tive a sorte de encontrar a Karen. Karen, nossas diferenças na forma
de viver nos acrescentaram muito como pessoas. Você é um ser-humaninho lindo que
quer ajudar ao mundo todo, obrigada por me ensinar a perceber mais o que acontece ao
nosso redor, a amar, a não ter pré-conceitos, a ter uma vez mais paciência e a sorrir
igual retardada (risos), adoro você e sua família. Novamente, separação e começo. Adel
v
e Grazi, obrigada por me acolher na casa de vocês. Grazi, obrigada pelas correções do
meu portunhol. Seu bom espírito e jeito alegre de ver a vida foi contagiante, obrigada
pelas conversas nada a ver (risos), horas de seriados e karaokê, comidinhas e árduas
sessões de corrida. Só tenho uma coisa a te dizer: “Igual” (Com carinho, o gato de botas
(risos)).
E é claro, também conheci mais pessoas importantes nesse caminho. Muito
obrigada Gustavo, você ajudou muito no meu crescimento fazendo de mim uma melhor
pessoa. À família do Gustavo, que me fizeram sentir em casa o tempo todo, obrigada
pelo carinho, especialmente a tia Idoninha e Deniza. À família Bringel, que me acolheu
muitas vezes como parte da sua família. Outros amigos que Deus me deu a graça de
conhecer, obrigada Bruna, Dayanne, Edvaldo, Guido, Ingrid, Kênia, León, Myke, Sara,
Renata, Simone e Wilton.
À família Palhacia, que me deu um lugarzinho no grupo para fazer algo que sempre
sonhei em fazer, palhaçadas (risos). Tenho muito a agradecer a cada um de vocês, com
quem consegui conhecer esse mundo lindo de ser uma palhaça, onde nossa essência se
mistura com a inocência das crianças em algo que só dá para sentir e não explicar.
Aos professores do IPTSP, cada um de vocês é um exemplo para mim, admiro o
fato de vocês ensinarem e fazer pesquisa, espero ter resgatado o melhor de cada um de
vocês.
A cada componente da minha banca de qualificação. Obrigada Prof. Samira,
Simone e Mara, por dar-se o tempo de revisar meu trabalho. Cada aporte de vocês foi
muito valioso para melhorá-lo. E à minha banca de defesa, Prof. Samira, Menira,
Juliana e Mara; obrigada por ter aceitado o convite de participação, com certeza vão
acrescentar além do mais nesse trabalho.
Ao corpo técnico e administrativo do IPTSP, eles me apoiaram como parte das
suas responsabilidades e com um sorriso gigante que melhorou muito de meus dias.
Muitíssimo obrigada pelos seus atos de gentileza o tempo todo.
À Universidad Nacional Mayor de San Marcos, que me deu a formação base de
“Tecnólogo Médico” no meu país. Além disso, agradeço também à Universidade
Federal de Goiás, que deu continuidade à minha formação. À Organização dos Estados
Americanos (OEA), que mediante o Grupo Coimbra de Universidades Brasileiras
(GCUB), deram-me a oportunidade, assim como a milhares de estudantes dos países
membros de fazer um programa de pós-graduação de relevância social.
vi
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ............................................................................... ix
SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................. xii
RESUMO .......................................................................................................................xv
ABSTRACT ................................................................................................................. xvi
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA .......................................................1
1.1 Epidemiologia ..........................................................................................................1
1.2 Tuberculose humana ................................................................................................2
1.2.1 Resposta imune .................................................................................................3
1.3 Diagnóstico de TB ...................................................................................................8
1.3.1 Microscopia .....................................................................................................10
1.3.2 Cultura .............................................................................................................11
1.3.3 Ensaio XPERT MTB/RIF® (CEPHEID, USA) .............................................12
1.3.4 Ensaio de fluxo lateral para lipoarabinomanana (LF-LAM)...........................12
1.3.5 Ensaio de liberação de interferon-gamma (IGRA) .........................................13
1.3.6 Prova tuberculínica .........................................................................................14
1.4 Tuberculose murina ...............................................................................................18
1.4.1 Avaliação da reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em modelo
murino ......................................................................................................................20
1.5 Desenvolvimento de testes cutâneos para o diagnóstico de TB ...........................21
1.6 Proteínas de fusão rCMX e rECMX .....................................................................23
2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................27
3 OBJETIVOS ................................................................................................................29
3.1 Objetivo geral.........................................................................................................29
3.2 Objetivos específicos .............................................................................................29
4 METODOLOGIA.........................................................................................................30
vii
4.1 Delineamento do estudo ........................................................................................30
4.2 Produção de proteínas rCMX e rECMX ...............................................................31
4.3 Animais utilizados ................................................................................................34
4.4 Infecção experimental ...........................................................................................34
4.5 Avaliação da resposta imune celular específica anti-rCMX e anti-rECMX em
células de baço, pulmões e linfonodos drenantes de camundongos infectados com
Mtb ............................................................................................................................. 34
4.6 Citometria de fluxo ...............................................................................................35
4.7 Prova da infecção com Mycobacterium Tuberculosis H37RV .............................36
4.8 Teste cutâneo pela Técnica de Mantoux ...............................................................36
4.9 Análise estatística ..................................................................................................37
5 RESULTADOS ...........................................................................................................38
5.1 Resposta imune celular anti-rCMX e anti-rECMX em células do baço, pulmões e
linfonodos drenantes de camundongos infectados com Mtb ......................................38
5.2 Reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos infectados
com Mtb ......................................................................................................................47
6 DISCUSSÃO ...............................................................................................................51
7 CONCLUSÕES ...........................................................................................................55
REFERÊNCIAS .............................................................................................................56
ANEXOS ........................................................................................................................68
viii
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 - Sensibilidade e especificidade de diferentes testes de diagnóstico para
Tuberculose, a partir de revisões sistemáticas usando casos de TB pulmonar
confirmados por cultura como teste de referência .............................................................9
Quadro 2 - Causas dos resultados falsos negativos da prova tuberculínica ..................17
Tabela 1 - Valores da média para cada resposta imune celular específica no baço,
pulmões e linfonodos drenantes (LNDs) de camundongos infectados com Mtb ...........39
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação do desenvolvimento do granuloma na Tuberculose humana.. 3
Figura 2 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB ativa ..............................8
Figura 3 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB latente em indivíduos de
grupos de risco ..................................................................................................................9
Figura 4 - Resposta de hipersensibilidade do tipo tardia em humanos .........................16
Figura 5 - Delineamento do estudo ...............................................................................30
Figura 6 - Esquema de purificação de proteínas mediante cromatografia de afinidade 33
Figura 7 - Gel SDS-PAGE das proteínas rCMX e rECMX ..........................................33
Figura 8A - Estratégia de separação de populações celulares do baço de camundongos
infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv .....................................................40
Figura 8B - Estratégia de separação de populações celulares dos pulmões de
camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv .............................41
Figura 8C - Estratégia de separação de populações celulares dos linfonodos drenantes
de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis H37R ...........................42
Figura 9 - Resposta imune celular induzida no baço após 45 dias da infecção com Mtb
em camundongos BALB/c ..............................................................................................44
Figura 10 - Resposta imune celular induzida nos pulmões, após 45 dias da infecção
com Mtb em camundongos BALB/c ..............................................................................45
Figura 11 - Resposta imune celular induzida nos linfonodos drenantes após 45 dias da
infecção com Mtb em camundongos BALB/c ...............................................................46
Figura 12 - Leitura da espessura do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados
com Mtb H37Rv após o teste cutâneo ............................................................................47
Figura 13 - Leitura do inchaço do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados
com Mtb H37Rv após o teste cutâneo ............................................................................48
Figura 14 - Leituras de Δ Espessura (14A) e Δ Inchaço (14B) ao longo do tempo ......49
Figura 15 - Observação macroscópica do baço e carga bacilar nos pulmões de
camundongos infectados com Mtb .................................................................................50
x
LISTA DE ANEXOS
Anexo I – Parecer do Comitê de Ética
Anexo II – Comprovante de submissão do artigo
xi
SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
Ag
Antígeno
APC
Célula apresentadora de antígeno
BAAR
Bacilo ácido-álcool resistente
BCG
Bacillus Calmette-Guérin
CLR
Receptor de lectina tipo C (do inglês: “C type lectin receptor”)
ConA
Concavalina A
DCs
Células dendríticas
DTH
Hipersensibilidade do tipo tardia
Fcγ
Receptor Fcγ
FSC
Tamanho (do inglês: “Forward scatter”)
γδ
Células gamma-delta
HIV
Vírus de imunodeficiência humana
IFN-γ
Interferon-gamma
IGRA
Ensaio de liberação de Interferon-gamma (do inglês: “Interferon gamma
release assay”)
IL-1α
Interleucina-1α
IL-1β
Interleucina-1β
IL-6
Interleucina-6
IL-12
Interleucina-12
IL-17
Interleucina-17
IL-23
Interleucina-23
IPTG
Isopropiltiogalactosídeo (do inglês: “Isopropyl-beta-Dthiogaloctopyranoside”)
IPTSP
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
xii
KO
Nocaute (Do inglês: “Knock out”)
kDa
Quilodalton
LF-LAM
Do inglês: “Lateral flow urine lipoarabinomannan assay”
MAIT
Células T invariantes associadas à mucosa
MCP-1
Proteína quimiotática de monócitos 1 (do inglês: “Monocyte
Chemoattractant Protein-1”)
MHC
Molécula de histocompatibilidade
MMR
Receptor de manose do macrófago (do inglês: “Macrophage mannose
receptor”)
MNT
Micobactérias não causadoras de Tuberculose
Mɸs
Macrófagos
Mtb
Mycobacterium tuberculosis
NK
Célula exterminadora natural (do inglês: “natural killer”)
NO
Óxido nítrico
NOS-2
Óxido nítrico sintase
LAM
Lipoarabinomanana
LB
Luria-Bertani
LNDs
Linfonodos drenantes
LNMDs
Linfonodos drenantes mediastinais
LPS
Lipopolissacarídeo
LT
Linfócito
OMS
Organização Mundial da Saúde
OADC
Ácido oleico albumina dextrose catalase
PAMPs
Padrões moleculares associados a patógenos (do inglês: “Pathogenassociated molecular patterns”)
PBMC
Células mononucleares do sangue periférico (do inglês: “Peripheral
blood mononuclear cells”)
xiii
PBS
Tampão fosfato salina
PCR
Reação em cadeia da polimerase
PDIM
Ftiocerol dimicoserato (do inglês: “Pthiocerol dimycocerosate”)
PGL
Glicolipídeo fenólico
PPD
Derivado proteico purificado (do inglês: “Purified protein derivative”)
PRRs
Receptores de reconhecimento padrão (do inglês: “Pattern recognition
receptors”)
PT
Prova tuberculínica
RNI
Radicais intermediários do nitrogênio
SBCAL
Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
SSC
Granulosidade (do inglês: “side scatter”)
TB
Tuberculose
TGF-β
Fator de crescimento transformador beta
Th
Célula T auxiliar ou helper
Th1
Célula T auxiliar subtipo 1
Th17
Célula T auxiliar subtipo 17
TLRs
Receptores semelhantes à Toll (do inglês: “Toll like receptors”)
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
Treg
T reguladora
UFC
Unidades formadoras de colônias
UFG
Universidade Federal de Goiás
VCAM-1
Molécula de adesão intercelular-1 (do inglês: “Vascular cell adhesion
molecule 1”)
WT
Camundongos com genótipo original (do inglês: “Wild type”)
xiv
RESUMO
A prova tuberculínica (PT) é um teste cutâneo que identifica a exposição prévia ao M.
tuberculosis (Mtb), mediante a inoculação via intradérmica do derivado protéico
purificado (PPD) de Mtb, o que resulta em uma reação de hipersensibilidade do tipo
tardia (DTH). O ensaio de liberação de IFN-γ (IGRA) foi indicado para substituir a PT.
O IGRA usa os antígenos ausentes na BCG e algumas micobactérias não causadoras de
TB (MNT), ESAT-6 e CFP-10. Porém, apresenta falta de reprodutibilidade e alto custo
quando usado em populações endêmicas para TB. Diante disso, o desenvolvimento de
novos testes de diagnóstico é necessário. Nosso grupo desenvolveu proteínas de fusão
que são reconhecidas por linfócitos gerados pela infecção com Mtb. Assim, o trabalho
propõe avaliar a utilização das proteínas rCMX e rECMX no desenvolvimento de um
teste cutâneo de diagnóstico para tuberculose. Camundongos BALB/c foram infectados
com Mtb H37Rv. Após 45 dias, a infecção induziu linfócitos T CD4+ e CD8+ produtores
de IFN-γ específicos para rCMX e rECMX no baço, pulmões e linfonodos drenantes.
Enquanto ao teste cutâneo realizado 45 dias após a infecção, a leitura de
espessura/inchaço ≥ PPD 2UT (controle positivo) indicou uma reação de DTH positiva.
Avaliando a espessura 24h após o inóculo, rCMX 25µg (0.37±0.02) e rECMX 15-25µg
(0.38±0.03/0,62±0,12) induziram reação de DTH positiva. As 48h, rCMX 25µg
(0.28±0.03) e rECMX 25µg (0.5±0.04) também apresentaram reação positiva. Enquanto
o inchaço as 24h, só a rECMX apresentou DTH positiva. Em conclusão, este trabalho
mostra que as proteínas rCMX e rECMX são reconhecidas pela resposta celular de
camundongos infectados com Mtb, e quando usadas no teste cutâneo induziram reação
de DTH positiva comparável e até superior ao PPD convencional. Dessa forma, é
recomendada a avaliação das proteínas de fusão em outros modelos animais e
posteriormente em humanos.
Palavras-chave: Tuberculose (TB), Prova tuberculínica (PT), Hipersensibilidade do
tipo tardia (DTH).
xv
ABSTRACT
Tuberculin skin test (TST) identifies a previous exposed to M. tuberculosis (Mtb) using
an intradermal inoculation of purified protein derivates (PPD) that result in a delayed
hypersensitivity reaction (DTH). Interferon-gamma release assay (IGRA) was suggested
to replace TST. The IGRA uses antigens, ESAT-6 and CFP-10, absent in all BCG
strains and some non tuberculous mycobacteria (NTM). However, reproducibility and
high cost were limitations for endemic countries. For this reason, the development of
new diagnose test for latent TB is necessary. Fusion proteins developed by our group
has been recognized by the immune response generated by the infection with
Mycobacterium tuberculosis. Thus the aim of this work was to evaluate the capacity of
CMX or ECMX to be used in a Skin test for tuberculosis. BALB/c mice infected with
Mtb were euthanized forty-five days after infection. Spleens, lungs and draining lymph
nodes of infected mice were processed and evaluated by flow cytometry Both CD4 and
CD8 IFN+ cells were able to recognize rCMX and rECMX. The skin test followed an
evaluation of thickness/swelling ≥ PPD 2UT (positive control) to consider positive
DTH. Based on thickness, at 24 h, rCMX 25µg (0.37±0.02) and rECMX 15-25µg
(0.38±0.03/0,62±0,12) induced a positive DTH response. At 48h, rCMX 25µg
(0.28±0.03) and rECMX 25µg (0.5±0.04) induced also a positive DTH reaction. In
conclusion, fusion proteins rCMX and rECMX are recognized by infected mice with
Mtb and skin test using rECMX 25µg induced better DTH response that of conventional
PPD.
Keywords: Tuberculosis (TB), tuberculin skin test (TST), delayed hypersensitivity
reaction (DTH).
xvi
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Aspectos gerais da tuberculose
Diferentes doenças têm surgido como resultado da evolução do homem, sendo
erradicadas, controladas ou ainda se mantendo como um problema de saúde global.
Este é o caso da Tuberculose (TB), que em 2015, registrou 10,4 milhões de casos
novos no mundo, sendo destes 56% homens, 34% mulheres e 10% crianças;
provocando 1,4 milhões de mortes (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016).
Estima-se que 11% do total de casos novos são HIV positivos, um indicador
epidemiológico importante, porque a infecção por esse vírus aumenta em 80 a 100
vezes a probabilidade de reativar uma infecção latente de TB (PARSONS et al., 2011;
WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016).
A nova estratégia da Organização Mundial da Saúde “END TB”, estabelecida
para o período 2016-2035, tem como meta reduzir as mortes por TB em até 95% e a
incidência em até 90%. Assim, o processo de controle da infecção pode incluir desde a
prevenção, diagnóstico, e o tratamento da doença. Na Região das Américas em 2015,
foram notificados 230 519 casos, sendo 85% de TB pulmonar, dos quais apenas 77%
de casos foram confirmados bacteriologicamente. Além do mais, na Região das
Américas, quando os pacientes são tratados, o 77% exibe sucesso no tratamento em
HIV negativos, uma porcentagem menor em comparação ao sucesso do tratamento na
Região do Mediterrâneo Oriental (82%) e Pacífico Ocidental (93%) (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2016).
O Brasil pertence ao grupo BRICS, denominação da OMS que inclui os países:
Brazil, Federação Russa, India, China e Africa do Sul; os quais em conjunto são
responsáveis por cerca do 50% de casos de TB no mundo. Assim também, está dentro
dos 30 países com mais alta incidência de TB e dos 9 países com mais alta carga de
casos de co-infecção com HIV. Estima-se que ocorreram em 2015, 84 000 novos casos
de TB e 7 700 mortes ocasionadas pela doença. Além disso, do total de casos
notificados, 52% acometeu homens, 24% mulheres e 8,1% crianças (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2016). Em Goiás, foram identificados 986 novos casos
para todas as formas de TB, contando assim com uma incidência de 14,3/100 000
habitantes em 2015 (GOIÁS, 2016).
1
1.2 Tuberculose humana
Tuberculose (TB) humana, conhecida como a peste branca, foi uma das
principais causas de morte no final do século XIX e início do século XX e continua
sendo, porque apesar de ser uma doença curável e evitável, foi uma das dez principais
causas de mortes por doenças infecciosas no mundo em 2015 (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2016). A infecção é causada principalmente pelo Mycobacterium
tuberculosis (Mtb), e em menor frequência pelo M. africanus. Quando se apresenta
como zoonose, tanto M. bovis como M. caprae também causam doença em humanos.
O gênero bacteriano se caracteriza por ser um bacilo álcool-ácido resistente de
crescimento lento, aeróbio e intracelular facultativo (PAI, 2016; SMITH, 2003).
A transmissão do bacilo ocorre a partir de adultos infectados com TB ativa ao
liberar micobactérias contidas em gotículas de saliva ao tossir ou espirrar, ocasionando
principalmente TB pulmonar (CADENA; FLYNN; FORTUNE, 2016). No entanto,
15% dos pacientes podem apresentar TB extrapulmonar, a qual frequentemente afeta
pleura, linfonodos, fígado, baço, ossos e articulações, coração, cérebro, sistema
geniturinário, meninges, peritônio ou pele (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2013). As manifestações clínicas da TB pulmonar podem incluir tosse, expectoração,
hemoptise, febre, sudorese noturna, anorexia e perda de peso quando não há controle
da infecção. Quando o paciente não apresenta sintomas, mas há confirmação pelo
diagnóstico laboratorial, são descritas como TB subclínica (DAMÁSIO, 2011; PAI et
al., 2016).
Logo após o contato primário com Mtb, cerca de 90% das pessoas conseguem
controlar a infecção mantendo-a como TB latente. Acredita-se que um terço da
população mundial apresenta TB latente (PAI et al., 2016). A cepa dormente da TB
latente se caracteriza pela incapacidade parcial ou total de replicar-se em cultura e pela
baixa atividade metabólica (LIPWORTH et al., 2016). Na população com TB latente,
o risco de progressão para TB ativa está entre o 5-15% em adultos, sendo o risco
maior em crianças; 30-40% em menores de um ano de idade, 24% entre 1-5 anos e
15% em adolescentes (PICCINI et al., 2014).
2
1.2.1 Resposta imune
A resposta imune do hospedeiro vai determinar o desenvolvimento da doença
(Figura 1). As primeiras células do sistema imune ao entrar em contato com os bacilos
são os Mφs alveolares, quando eles são transmitidos pela via aérea. Diferentes
mecanismos acontecem como parte da imunidade inata até a chegada de células
apresentadoras de antígenos (APCs) como monócitos e células dendríticas (DCs) até
os linfonodos drenantes (LNDs). Nos LNDs ocorre a ativação de linfócitos, os quais
são parte do sistema imune adaptativo (PAI et al., 2016).
Figura 1 - Representação do desenvolvimento do granuloma na Tuberculose humana. Na infecção
latente (a) depois da transmissão do Mycobacterium tuberculosis por via aerossol, os bacilos têm o
contato primário com os macrófagos alveolares, os quais funcionam como APCs associados a
monócitos e células dendríticas que ao migrar para os linfonodos drenantes (LNDs) ativam linfócitos.
Os linfócitos e as células ativadas retornam ao pulmão formando o granuloma que é composto por
linfócitos (L), APCs infectadas. Na infecção ativa (b), o sistema imune é incapaz de manter o
granuloma e os bacilos podem ser espalhados via linfática e por via aérea. Adaptado de Pai et al. (2016).
No início como parte da imunidade inata, após a interação dos bacilos com os
Mφs alveolares é promovida uma resposta pró-inflamatória (ERNST, 2012). Os
fagócitos profissionais podem endocitar bacilos opsonizados (complemento C3) ou
não opsonizados. Esses fagócitos contêm na membrana diferentes receptores de
reconhecimento padrão (PRRs), os quais têm como ligantes padrões moleculares
associados a patógenos (PAMPs), que são componentes da própria micobactéria
3
(ERNST, 2012; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002). Os
receptores semelhantes a Toll (TLR) são os receptores mais importantes. O TLR2 liga
lipoproteínas, o TLR4 liga glicoproteínas ou endotoxinas e o TLR9 pode ligar o DNA
bacteriano. Outros receptores como o TLR1 e o TLR6 associados ao TLR2 também
participam no reconhecimento dos bacilos. Dessa forma, os TLRs que conseguem
reconhecer seus ligantes mediante a via MyD88 promovem a liberação de citocinas
pró-inflamatórias como IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-α (ERNST, 2012; SAARAV;
SINGH; SHARMA, 2014; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002).
Uma vez que os Mφs são infectados, eles podem eliminar os bacilos pela indução de
necrose ou apoptose (O’GARRA et al., 2013). A forma dos Mφs agirem frente aos
bacilos depende da sua plasticidade em ser ativados em Mφs de tipo M1 ou de tipo
M2. Na defesa do hospedeiro e após a indução da resposta inflamatória, prevalecem os
Mφs de tipo M1 (MILLS, 2012). Eles também denominados de via clássica,
aumentam a produção de óxido nítrico sintase (NOS-2), que produz óxido nítrico
(NO) e radicais intermediários do nitrogênio (RNI) com função bactericida
(DAMÁSIO, 2011; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002). Em
contrapartida, segundo o microambiente de citocinas, os Mφs de tipo M2 cumprem
uma função anti-inflamatória ao inibir o NO mantido pela liberação de TGF-β
(MILLS, 2012). Outras células envolvidas na resposta imune inata são os neutrófilos,
os quais cumprem uma função protetora. Mediante à apoptose de neutrófilos
infectados, os bacilos podem ser capturados pelas DCs que promoveram a ativação de
LT CD4. Em pacientes com TB ativa se observa neutrofilia possivelmente pelo
excesso de sinalização de IFN tipo I (O’GARRA et al., 2013). Por sua parte, as células
NK têm uma função citolítica. Elas reconhecem os ácidos micólicos da membrana do
bacilo e liberam IFN-γ e TNF-α (CADENA; FLYNN; FORTUNE, 2016). Os
receptores envolvidos nessa função poderiam ser os NKp46 e NKG2D, os quais
dependente do TLR-2 conseguem a lise de Mφs e monócitos infectados com Mtb
(VANKAYALAPATI et al., 2005).
As células T invariantes associadas à mucosa (MAIT) se assemelham aos LT e
até são considerados uma subpopulação de LT CD8. As MAITs estão em aumento no
líquido broncoalveolar de indivíduos com TB ativa, quando comparados com
indivíduos saudáveis. Em vez de um MHC convencional, as MAITs possuem uma
molécula associada ao MHC I (MR1), o qual se liga aos metabolitos derivados de
riboflavina que podem ser produtos de bactérias ou fungos. Independente ou não do
4
MR1, as MAITs podem induzir lise de células epiteliais infectadas com Mtb (função
citotóxica) semelhante aos LT CD8, ou produzem IFN-γ promovendo a liberação de
IL-12 pelas DCs e consequentemente a diferenciação de LT Th1 (GOLD; NAPIER;
LEWINSOHN, 2015; NAPIER et al., 2015).
Os Mφs e demais células fagocíticas geram citocinas pró-inflamatórias como
IL-12, IL-18, IL-23 e IL-27 induzindo a produção de IFN-γ. Enquanto o TNF-α
promove a ativação clássica de Mφs e formação do granuloma (GUILLIAMS;
LAMBRECHT; HAMMAD, 2013; VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER
MEER, 2002). Entre as citocinas anti-inflamatórias os Mφs liberam IL-10 como
inibidor do IFN-γ, TNF-α e IL-12. Os monócitos e DCs liberam o TGF-β com função
sinérgica a IL-10; e IL-4 como supressor de produção de IFN-γ (DAMÁSIO, 2011;
VAN CREVEL; OTTENHOFF; VAN DER MEER, 2002).
Uma vez que o sistema imune inato monta uma resposta, e a estimulação
antigénica passa a ser crônica, é formado o granuloma de Gohn, uma estrutura
organizada de células imunes. Os bacilos induzem os Mφs infectados a produzirem
quimiocinas, que atraem um fluxo de DCs, neutrófilos, NKs, linfócitos gamma delta e
mais Mφs aos pulmões levando a formação do granuloma primário ou sólido
(CADENA; FLYNN; FORTUNE, 2016; EHLERS; SCHAIBLE, 2012). Logo, a
imunidade adaptativa é alertada e o granuloma na fase ativa da doença apresenta uma
região necrótica acelular envolvida por células inflamatórias e por linfócitos T (LT) e
B (LB), e eventualmente com tecido fibroso na periferia (granuloma caseoso)
(FLYNN; CHAN; LIN, 2011). A partir dessa fase, o granuloma é denominado de
cavitário, o qual apresenta dano tecidual irreversível, necrótico e com cavitações. Caso
o granuloma não evolua para a fase caseosa e cavitária o Mtb se mantém em fase
latente (poucos bacilos) e a doença se denomina TB latente (KIRAN et al., 2016).
Durante o desenvolvimento da doença, o granuloma é a patologia clássica. Os três
tipos descritos como granuloma primário ou clássico, caseoso e cavitário podem ser
observados na TB ativa e latente. Na sua forma primária e caseosa, o granuloma
parece apresentar uma função protetora pois matem os bacilos em Mφs, evitando sua
disseminação, porém sem capacidade de eliminá-los. No entanto, quando o granuloma
encontrasse na fase cavitária facilita a disseminação dos bacilos que são eliminados
(FLYNN; CHAN; LIN, 2011).
A formação do granuloma depende da resposta adaptativa e principalmente de
uma resposta do tipo Th1. As APCs capturam os antígenos que poderiam ser
5
transportados do interior dos Mφs infectados até o citosol mediante vesículas de
membrana (JURKOSHEK et al., 2016). Logo, as APCs são atraídas pelo fluxo de
quimiocinas aos LNDs drenantes, onde acontece a apresentação de antígenos para
linfócitos virgens. A via de apresentação de antígenos para patógenos intracelulares
como o Mtb, acontece principalmente a través do MHC de classe II para ativar LT
CD4. Mas pode acontecer através do MHC de classe I (apresentação cruzada) para
ativar LT CD8, quando os antígenos contidos em vesículas apoptóticas são
reconhecidos. Os LT CD8 auxiliam aos LT CD4 ao liberar IFN-γ que ativa Mφs pela
via clássica (DAMÁSIO, 2011; O’GARRA et al., 2013). A diferenciação dos subtipos
de LT vai depender do microambiente de quimiocinas.
Entre os LT CD4, a subpopulação Th1 é a mais importante, dessa forma os
defeitos na produção de suas citocinas aumenta o risco de progressão da doença (DA
SILVA et al., 2015; DOMINGO-GONZALEZ et al., 2016). Os LT Th1 são capazes de
liberar IFN-γ, TNF-α e/ou IL-2. O IFN-γ promove a função bactericida dos Mφs.
Outras células como os LT CD8, NKs, γδ também são fonte de IFN-γ (DA SILVA et
al., 2015). O TNF-α age sinergicamente com o IFN-γ otimizando a função bactericida
dos Mφs, além de auxiliar na manutenção do granuloma (DA SILVA et al., 2015;
DOMINGO-GONZALEZ et al., 2016).
A subpopulação Th17 também é importante na função protetora na TB.
Quando os Mφs ativados promovem a liberação de IL-6 e TGF-β, ativam o fator de
transcrição STAT-3 (DA SILVA et al., 2015), e estimulam a liberação de IL-23 pelos
LT CD4, acabam induzindo a diferenciação da subpopulação Th17 produtoras de IL22 e IL-17. A IL-22 induz peptídeos antimicrobianos e inibe o crescimento intracelular
de bacilos de Mtb nos Mφs (DOMINGO-GONZALEZ et al., 2016). A IL-17 induz
citocinas pró-inflamatórias como G-SCF, IL-6 e IL-8, que promove a granulopoiese e
assim o recrutamento de neutrófilos e inflamação (CRUZ et al., 2006; LUO et al.,
2016) no local de infecção e intervêm positivamente na formação do granuloma
(JASENOSKY et al., 2015). Além disso, a IL-17 acelera o recrutamento de células
produtoras de IFN-γ até os pulmões após o gradiente de CXCL-9,10 e 11 (O’GARRA
et al., 2013). Já foi demonstrado no sangue periférico de pacientes com TB níveis
maiores de Th17 e aumento de IL-17 no plasma, em comparação controles saudáveis
(CHEN et al., 2010; JURADO et al., LUO et al., 2016).
Os LT CD8 também produzem TNF-α e IL-2, além do IFN-γ. A principal
função dos LT CD8 é de caráter citotóxico, mediante a ação de grânulos pela indução
6
de apoptose. Os grânulos contem perforinas, granulisinas e granzimas. As perforinas e
as granulisinas podem lisar diretamente células infectadas com o bacilo e tem sido
encontradas em células do granuloma. Enquanto as granzimas ativam as caspases e
ativam os mecanismos de apoptose da célula infectada pelo Mtb. A indução de
apoptose também acontece pela ativação da via do Fas-Fas ligante (LIN; FLYNN,
2015). Em pacientes com TB ativa a atividade citotóxica esta diminuída
(JASENOSKY et al., 2015; SILVA et al., 2014), em pacientes com co-infecção de
HIV-TB os LT CD8 são importantes fontes de IFN-γ (WANG, F. et al., 2016).
As subpopulações de LT que liberam mais de duas citocinas de perfis diversos
são chamadas de polifuncionais (IFN-γ/TNF-α ou IFN-γ/IL-2), a qual apresenta maior
eficácia que as subpopulações que liberam só uma citocina e poderiam estar
associadas à proteção (WILKINSON; WILKINSON, 2010). Depois de uma resposta
pró-inflamatória exacerbada, LT reguladores (Treg) começam a atuar. As Treg estão
em altos níveis no sangue periférico de pacientes com TB ativa e está associada com a
carga bacilar aumentada e a multidroga-resistência (SINGH et al., 2012). Enquanto
nos casos de TB latente, as Treg estão diminuídas (DA SILVA et al., 2015).
Os LB nas infecções na maioria das vezes cumprem a função de proteção,
mediante a produção de anticorpos, produção de citocinas ou pelo fato de agir como
APCs para ativar LT virgens. Porém, na TB a função não está bem elucidada (DU
PLESSIS; WALZL; LOXTON, 2016). Em pacientes com TB, observam-se agregados
de LB semelhante a folículos nos pulmões (O’GARRA et al., 2013) e também se tem
descrito a diferença entre o padrão de anticorpos de pacientes com TB ativa e latente.
Os anticorpos isolados de pacientes com TB latente conseguiram melhorar a resposta
de Mφs infectados com Mtb. Essa característica foi devido ao diferente padrão de
glicosilação, quando comparados com os anticorpos isolados de pacientes com TB
ativa (LU et al., 2016).
7
1.3 Diagnóstico de TB
O diagnóstico de TB está centrado na identificação de TB ativa na sua forma
pulmonar. A triagem para TB ativa é antecedida ao uso de testes de diagnóstico de
laboratório. Na triagem, são considerados a identificação de tosse por duas semanas,
algum sintoma compatível com TB ativa (perda de peso, hemoptise, febre
intermitente) ou raios X de tórax (Figura 2). Os algoritmos de diagnóstico que
acompanham os resultados positivos da triagem são a microscopia de escarro ou os
testes
rápidos
moleculares
recomendados
pela
OMS
(WORLD
HEALTH
ORGANIZATION, 2015a).
Figura 2 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB ativa. Adaptado e traduzido de World
Health Organization (2015a).
O diagnóstico da TB latente está centrado nas populações de risco, as quais são
os prisioneiros, idosos, imigrantes de países com alta incidência de TB, contatos de
pacientes com TB e usuários de drogas ilícitas. As populações de risco devem seguir
um algoritmo diferente ao da procura de TB ativa (Figura 3). Primeiro se utiliza a
mesma triagem utilizada para TB ativa, se o indivíduo não apresenta algum resultado
positivo, os testes diagnósticos recomendados são a PT (Prova tuberculínica) ou o
IGRA (Ensaio de liberação de IFN-γ) (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2015a). Ambos estão baseados na resposta imune frente ao patógeno, porém têm baixa
8
sensibilidade para indivíduos HIV positivos e não diferenciam entre uma infecção
recente ou antiga, ou se a pessoa é re-infectada ou re-exposta (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2016).
Figura 3 - Algoritmo de diagnóstico para identificação de TB latente em indivíduos de grupos de
risco. Adaptado e traduzido de World Health Organization (2015a).
Para identificar TB ativa os testes de diagnóstico são desenvolvidos
considerando a cultura de escarro para crescimento de micobactérias como teste de
referência. A eleição de um teste de diagnóstico muitas vezes considera os dados de
sensibilidade e especificidade (Quadro 1) (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2015b). Porém, ao ser aplicado na realidade, outros fatores epidemiológicos e sociais
influenciam nessa escolha.
Quadro 1 - Sensibilidade e especificidade de diferentes testes de diagnóstico para Tuberculose, a
partir de revisões sistemáticas usando casos de TB pulmonar confirmados por cultura como teste
de referência.
a
Valores de Sensibilidade e Especificidade obtidos de diversas revisões sistemáticas em % (95% de
intervalo de confiança).
b
Refere-se à microscopia de luz convencional usada para examinar escarro com coloração de ZiehlNeelsen. Microscopia de fluorescência, incluindo microscopia com diodos emitindo luz geralmente tem
uma sensibilidade maior que a microscopia de luz convencional.
Fonte: Adaptado e traduzido de World Health Organization (2015b).
9
1.3.1 Microscopia.
A microscopia identifica a presença de micobactérias álcool-ácido resistentes.
Como a TB ativa se desenvolve principalmente nos pulmões, coleta-se amostras de
escarro (SINGHAL; MYNEEDU, 2015). Utiliza-se a coloração de Ziehl-Neelsen, uma
coloração que aproveita as características de álcool-ácido resistência das micobactérias
(ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD, 2008a). Um resultado
positivo é definido pela identificação de ao menos um bacilo álcool-ácido resistente
(BAAR) em pelo menos 100 campos de leitura no microscópio de luz convencional
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Em uma amostra de escarro podem
ser identificados 104 ou 105 bacilos por mL, e isso se dá quando as condições de coleta
são ótimas (SINGHAL; MYNEEDU, 2015). Atualmente, a OMS recomenda a coleta
de duas amostras de escarro como parte do algoritmo diagnóstico de TB ativa
(CUDAHY; SHENOI, 2016), que seria suficiente para identificar 95-98% dos casos
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015c). Dessa forma, a sensibilidade da
microscopia de luz convencional é de 61% e a especificidade de 98% (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2015b). No entanto, a sensibilidade do teste varia (2080%) segundo as condições de coleta de amostras, o processamento e a leitura delas
(PARSONS et al., 2011).
A microscopia possui como vantagens ser uma ferramenta de diagnóstico
rápido em casos com suspeita de TB, ser de fácil execução e de baixo custo
(SINGHAL; MYNEEDU, 2015; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015c).
Contudo, também apresenta desvantagens. Quando os pacientes são pauci-bacilíferos a
sensibilidade diminui, o que acontece em pacientes HIV positivos (PAI et al., 2016;
WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015b) e pacientes pediátricos. Nessa última
população com menos de 12 anos, sendo recomendado uma amostra de aspirado
gástrico (SINGHAL; MYNEEDU, 2015; WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2015c). Além disso, a informação da microscopia não permite diferençar o complexo
Mycobacterium tuberculosis de outras micobactérias como as não causadoras de
tuberculose (MNT) e não fornece informações do perfil de resistência bacteriana
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015c).
10
1.3.2 Cultura
A cultura é o teste de referência para identificar casos de TB (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2015b) mediante o processo de crescimento das
micobactérias, a partir de amostras de escarro ou outras em meios sólidos ou líquidos.
Quando as amostras são de locais não estéreis do corpo, como a amostra de escarro, é
necessária a digestão, homogeneização, descontaminação e concentração das amostras,
com o objetivo de evitar o crescimento de flora contaminante (ORGANIZACIÓN
PANAMERICANA DE LA SALUD, 2008b; PARSONS et al., 2011). Depois desses
procedimentos, o concentrado da amostra é inoculado no meio sólido e submetido à
incubação de 37°C por até oito semanas. Os meios sólidos mais utilizados são os
meios a base de ovo, Löwenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh. A leitura no início até o
terceiro dia é realizado para identificar possíveis contaminações e garantir a absorção
da amostra pelo meio de cultura. Na primeira semana e nas semanas consecutivas é
realizada a leitura visual das colônias isoladas. Por último, o registro de resultados
inclui o resultado: contaminado, negativo ou positivo com a quantificação de colônias
(+ 20 a 100 colônias, ++ mais de 100 colônias e +++ quando as colônias são
incontáveis). Além da quantificação, é preciso descrever a morfologia das colônias e a
pigmentação que possuem (ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD,
2008b). Outra forma de cultura utiliza meios líquidos que acrescentam indicadores de
crescimento radioativos ou fluorométricos (CUDAHY; SHENOI, 2016). A
sensibilidade com esses meios de cultura aumenta em 10% e a leitura deixa de ser
visual para ser realizada mediante equipamentos automatizados (BACTEC e MB Bact)
(CUDAHY; SHENOI, 2016; ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD,
2008b). Por ser o método de referência, a cultura tem a vantagem de fornecer um
resultado definitivo. E ela consegue identificar 102 bacilos/mL de amostra (CUDAHY;
SHENOI, 2016) e sua sensibilidade pode aumentar em 30 a 50% quando se associa ao
teste de álcool ácido resistência e avaliação em microscópio. Nas culturas positivas, as
colônias isoladas podem ser utilizadas para conhecer o perfil de resistência das cepas
do Mtb (CUDAHY; SHENOI, 2016). Porém, a limitação principal da cultura é o
tempo de até 12 semanas para obter o resultado (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2016). Além desta desvantagem, a cultura precisa de um
laboratório equipado, pessoal treinado e um sistema de transporte de amostras que
assegure a viabilidade das bactérias (PARSONS et al., 2011; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2015b, 2015c).
11
1.3.3 Ensaio Xpert MTB/RIF® (Cepheid, USA)
O ensaio Xpert MTB/RIF® é o único teste molecular de diagnostico rápido
recomendado pela OMS desde 2011, para identificar TB e resistência à rifampicina
(CUDAHY; SHENOI, 2016; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Esse
ensaio se baseia na amplificação de ácidos nucléicos por reação em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real. A amostra de escarro é processada de maneira
automatizada, o DNA da amostra é amplificado e a resistência à rifampicina detectada
em cerca de 2 horas. O teste identifica o complexo Mycobacterium tuberculosis e
também o gene rpoB associado à resistência a rifampicina (BRASIL,2011; CUDAHY;
SHENOI, 2016). Quando foi avaliada a sensibilidade e especificidade em diferentes
revisões sistemáticas, encontrou-se uma sensibilidade de 92% (70-100) e
especificidade de 99% (91-100) quando comparadas com o teste de referência, a
cultura (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015b). Esse ensaio quando testado
em população pediátrica pode ser usado em amostras de lavado gástrico e apresentou
melhores resultados que a microscopia de escarro das crianças (DETJEN et al., 2015).
Esse teste também auxiliou no diagnóstico de indivíduos paucibacilares (CUDAHY;
SHENOI, 2016), mas essas vantagens dependem da população estudada (GELETA et
al., 2015). As reações cruzadas são mínimas tendo sido reportadas em 0,6% dos casos
(CUDAHY; SHENOI, 2016). Entre as limitações está o alto custo e o fato de
identificar apenas resistência a rifampicina, sendo necessário mais avaliações e
culturas para avaliação de susceptibilidade a outras drogas (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2016). Apesar de ter sido recomendado pela OMS, após alguns
testes clínicos, o Xpert TB/RIF não demonstrou nenhuma vantagem aos ensaios
originais ou demonstrou alteração nos parâmetros finais de identificação, tratamento e
controle da tuberculose (BOYLES, 2017).
1.3.4 Ensaio de fluxo lateral para lipoarabinomanana (LF-LAM)
O ensaio de LF-LAM é um teste rápido de fluxo lateral que reconhece o
antígeno lipoarabinomanana (LAM), um lipopolissacarídeo da membrana do Mtb. O
LAM é liberado por bactérias ativas metabolicamente e os rins podem filtrá-lo,
podendo aparecer na urina do paciente com TB ativa. Em 2015, a OMS recomendou o
uso do LF-LAM em pacientes HIV positivos com sinais ou sintomas de TB e com a
contagem de LT CD4 ≤ 100 células/μL. Assim como também em pacientes HIV
positivos com doença grave independentemente da contagem dos LT CD4 (PETER et
12
al., 2016; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015d). As vantagens do teste são:
o uso de uma amostra não invasiva como a urina, menor risco de contaminação
quando comparado com a amostra de escarro, e não precisar de pessoal treinado para
fazê-lo. Essas características facilitam o uso do teste na triagem, como em casos de
pessoas HIV positivo (PETER et al., 2016). Entretanto, o uso do teste é limitado às
populações HIV positivas, e ainda não se tem informação suficiente para seu uso em
outras populações.
1.3.5 Ensaio de liberação de interferon-gamma (IGRA)
Para identificar TB latente, a OMS disponibiliza dois testes, o ensaio de
liberação de interferon-gamma (IGRA) e a prova tuberculínica (PT). Ambos
identificam a exposição prévia ao Mtb mediante uma resposta celular específica
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Recentemente, quando avaliado em
contatos de pacientes com TB ativa, o IGRA e a PT, apresentaram resultados similares
na identificação de TB latente (SHARMA et al., 2017). Para realizar o IGRA, uma
amostra de sangue periférico é coletada, e o componente celular é separado e
estimulado com antígenos micobacterianos para avaliar a liberação de IFN-γ por essas
células (GONZÁLEZ-MARTÍN et al., 2010; WHITWORTH et al., 2013). Diferentes
versões do IGRA têm sido desenvolvidas, podendo ser usados antígenos
micobacterianos da região genética RD1 (ESAT-6 e CFP-10) associados ou não com
antígenos da região genética RD11 (TB7.7/RV2654) (GANGULY; SIDDIQUI;
SHARMA, 2008). O primeiro a ser utilizado incluía os antígenos ESAT-6 e CFP-10
usando a técnica de ELISA, e foi denominado QuantiFERON-TB (Cellestis Inc.
Victoria, Australia), aprovado pela FDA em 2001. Com o mesmo princípio, mas
usando a técnica de ELISPOT, foi implementado o TSPOT.TB (Oxford Immunotec,
Oxford, UK), aprovado na Europa em 2004. O QuantiFERON Gold incrementou um
terceiro antígeno, o TB7.7 (Rv 2654), o qual foi melhorado para seu uso em tubo de
coleta, estando disponível desde 2007 como QuantiFERON Gold In-Tube (QFT-GIT)
(WHITWORTH et al., 2013). Entre as vantagens do teste, está o aumento de
especificidade para o reconhecimento de TB latente. Os antígenos micobacterianos
utilizados no IGRA estão presentes no complexo Mtb, mas ausentes na vacina BCG e
algumas MNTs (GANGULY; SIDDIQUI; SHARMA, 2008). O IGRA quando
comparado a PT, requer só uma visita do paciente e os resultados estão liberados entre
24 e 48 horas. Entre as desvantagens descritas para o IGRA, a coleta de amostras de
13
sangue por exemplo pode influenciar diretamente o resultado. O QFT-GIT possui
tubos controles, dos quais no caso de usar primeiro o controle positivo na coleta pode
ocorrer contaminação do controle negativo ou da amostra do paciente. Além disso, o
QFT-GIT apresentou maior resposta quando a coleta de amostra foi durante a tarde em
comparação a coleta pela manhã (BANAEI; GAUR; PAI, 2016). Outra desvantagem
seria a falta de reprodutibilidade por exemplo a reversão de positivo para negativo, e
no caso de indivíduos negativos, a conversão após o contato com paciente com TB
ativa ser mais demorada do que os resultados obtidos com a PT (4-22 semanas)
(JONES-LÓPEZ et al., 2015; RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2014). Resultados falsos
positivos podem ocorrer quando o IGRA é realizado 24 horas após de realizar a PT
(efeito booster) ou por produtos microbianos do próprio indivíduo que podem modular
a resposta ex vivo (BANAEI; GAUR; PAI, 2016). Além disso, esse teste requer
laboratório com infraestrutura complexa e com pessoal treinado, isso junto ao seu alto
custo faz que não seja recomendado para substituir a PT em populações de renda baixa
ou
média
(GONZÁLEZ-MARTÍN
et
al.,
2010;
WORLD
HEALTH
ORGANIZATION, 2015b, 2015c). Também é descrito sua limitação em populações
com alta incidência de TB e HIV. O IGRA pode gerar até 8,6% de resultados
indeterminados em população com alta incidência de TB, o que aumenta quando o
indivíduo é HIV positivo com baixa contagem de LT CD4 (ONI et al., 2012).
1.3.6 Prova tuberculínica
O teste utiliza principalmente a técnica de Mantoux para identificar exposição
prévia ao Mtb, gerando uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) ou tipo
IV (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2006). A técnica consiste em injetar PPD
(derivado proteico purificado, do inglês: "purified protein derivate") via intradérmica
no antebraço do indivíduo com suspeita de TB latente. Depois de 48-72 horas se
realiza a avaliação da reação de DTH, representada pela induração e eritema formado
no local de inoculação do PPD. A leitura do diâmetro transversal da induração define o
caso de TB latente. Na população de baixo risco um diâmetro >5 mm é suficiente,
enquanto em população de alto risco precisa de um diâmetro >10 mm para ser
considerado positivo (BRASIL,2015).
O PPD vem sendo usado há muito tempo. Em 1890, Robert Koch utilizou o
filtrado da cultura de Mtb como tratamento da infecção, o qual foi descontinuado
devido aos vários efeitos colaterais (HUEBNER; SCHEIN, 1993). Já em 1926, Seibert
14
isolou as proteínas cristalizadas desse filtrado da cultura, identificando a sua
composição em proteínas e polissacarídeos, o que hoje corresponde ao PPD
(DANIEL, 2009). Em 1930, o PPD começou a ser usado na triagem diagnóstica de
indivíduos com Mtb (HUEBNER; SCHEIN, 1993). O método original para a obtenção
do PPD consistia na cultura de Mtb em meio glicerinado com carne e inativação por
calor a 100°C, e foi denominado OT (Old Tuberculin). Logo com agentes
desnaturantes e de precipitação como o sulfato de amônia, se chegou ao PPD-S
(DANIEL, 2009), o qual em 1952 foi adotado como o PPD de referência internacional
pela OMS (HUEBNER; SCHEIN, 1993). O conteúdo do PPD não era específico
quando começou a ser utilizado no diagnóstico, e desde então foram utilizadas
diversas técnicas de identificação, desde eletroforese de proteínas até espectrometria
de massas. As diferentes preparações do PPD utilizadas em humanos são o PPD-S2,
PPD-RT-23, PPD IC-65 e PPD-CT68. Em 2012, foi mostrado que o PPD-S2 contém
principalmente proteínas de choque térmico (Rv0350/DnaK, Rv0440/GroEL e
Rv3418/GroES e Rv0652) (CHO et al., 2012). Pouco tempo depois, identificaram-se
265 proteínas no PPD-CT68, das quais 142 proteínas foram comuns com o PPD-S2,
incluindo as proteínas de choque térmico mencionadas (PRASAD et al., 2013).
O PPD consegue induzir uma reação de DTH, a qual é uma resposta de tipo
celular (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2006). Após a inoculação do antígeno na
epiderme, as células de Langerhans que são as DCs do local, são ativadas e respondem
frente à lesão liberando citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α). Tanto as células
de Langerhans ativadas como outras DCs fazem fagocitose dos antígenos mediante um
gradiente de quimiocinas (CCL21:CCR7) e migram pelos vasos linfáticos até os
órgãos linfóides secundários. Nestes órgãos, as APCs conseguem apresentar os
antígenos aos LT de memória (SCHEIBLHOFER; THALHAMER; WEISS, 2013), os
quais são ativados e migram ao local de dano, a derme. Ao mesmo tempo, outras
citocinas pró-inflamatórias são liberadas pelos mastócitos, fibroblastos e DCs (Figura
4) (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2008).
As células recrutadas no local de inoculação começam a aparecer após poucas
horas (6 h). No início os neutrófilos são recrutados, logo os Mφs ativados e os
linfócitos (VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2006). A induração é causada
principalmente pelo infiltrado linfocitário e não pelo edema inflamatório na pele. Entre
os linfócitos se reconhece a predominância dos LT CD4+ com fenótipo de memória
(CD45RO+), mas também inclui os LT CD8+ (proporção LT CD4:CD8 = 2:1) e de
15
forma infrequente os LB (AKBAR et al., 2013; GIBBS et al., 1984; SARRAZIN et al.,
2009). Dentre os LT CD4+, as Treg têm sido estudadas na DTH por ser um fator de
variabilidade na resposta da PT. Existem trabalhos mostrando que LT CD4+ de
memória e Treg apresentam cinética similar para o local de inoculação
(VUKMANOVIC-STEJIC et al., 2008). Em pacientes HIV positivo e idosos os níveis
de Treg aumentam e este fato pode influenciar diretamente a reação de DTH
independente da contagem de LT CD4 totais (SARRAZIN et al., 2009). Foi mostrado
que um dos motivos da diminuição da PT em pacientes idosos é a expressão diminuída
de moléculas de adesão (E-seletina e VCAM-1) nas células do endotélio (AGIUS et
al., 2009) e de marcadores de proliferação (Ki67) e ativação (CD69) nos LT CD4+ em
geral (AKBAR et al., 2013).
Figura 4 - Resposta de hipersensibilidade do tipo tardia em humanos. Adaptado de
VUKMANOVIC-STEJIC et al. (2016).
Atualmente, a produção das formulações do PPD tem sido restrita e substituída
pelo IGRA para identificar casos de TB latente. Entre as vantagens da PT temos que é
um teste de alta sensibilidade, de fácil execução e utiliza o reagente PPD de baixo
16
custo. As desvantagens são a necessidade de duas visitas uma para a aplicação e outra
para a leitura do teste, além de apresentar baixa especificidade. Os resultados falsos
negativos estão associados a uma baixa resposta celular do indivíduo por diferentes
causas (Quadro 2). Enquanto, os falsos positivos podem ser consequências da
vacinação com BCG (se utilizado em crianças até os cinco anos de idade) (SEDDON
et al., 2016), exposição repetida ao PPD ou exposição a MNTs (GONZÁLEZMARTÍN et al., HUEBNER; SCHEIN, 1993). Essa falta de especificidade se deve
possivelmente às proteínas de choque térmico que estão mais abundantemente no
conteúdo do PPD (CHO et al., 2012; PRASAD et al., 2013; WIKER; HARBOE,
1992). Contudo, ainda se sugere o uso da PT na triagem de TB latente em populações
com alta prevalência e com história de vacinação pelo BCG (FERREIRA et al., 2015),
e em populações com renda baixa e média (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2015b).
Quadro 2 - Causas dos resultados falsos negativos da prova tuberculínica.
Fonte: Adaptado e traduzido de Gonzáles-Martin et al. (2010).
17
1.4 Tuberculose murina
Um modelo animal bem aceito para o estudo da resposta imune é o modelo
murino, pois a pesar da resposta ao estímulo frente ao Mtb diferir dos humanos, é
possível controlar muitas variáveis, facilitando assim a interpretação dos resultados
(COOPER, 2015). Em 1947 Pierce e colaboradores avaliaram a sobrevivência a
infecção por Mtb em 22 linhagens diferentes de camundongos e classificou as
linhagens que não sobrevivia mais que 150 dias após a infecção como susceptíveis
(CBA/J e DBA/2) e que sobreviviam mais que 300 dias, como resistentes (BALB/c e
C57BL/6) (BEAMER; TURNER, 2005; SÉRGIO et al., 2015). Os camundongos
desenvolvem uma fase aguda e crônica da infecção diferente dos humanos que
apresentam a forma ativa e a latente da doença. Na fase aguda, a infecção se estabelece
nos pulmões com altas taxas de replicação (duas semanas após a infecção) (MOGUES
et al., 2001; TSAI et al., 2006). As primeiras células do sistema imune que entram em
contato com o bacilo são os Mφs alveolares, que agem como fagócitos e APCs
(BEAMER; TURNER, 2005). Primeiro, os Mφs podem facilitar o crescimento das
micobactérias até ele ser ativado por outros mecanismos do ambiente. Segundo, os
Mφs podem induzir mecanismos de eliminação como formação do fagolisossomo,
liberação de moléculas reativas de oxigênio e RNI, limitação do uso do ferro ou
apoptose (LEEMANS et al., 2005). Durante a fase aguda, as micobactérias se replicam
nos Mφs alveolares, estabelecendo a formação do granuloma pulmonar com
predomínio de neutrófilos e Mφs (TSAI et al., 2006). Enquanto isso acontece, as DCs
migratórias podem reconhecer Ags e cumprir a função de APCs nos pulmões, o que
acontece raramente, ou transportar os Ags até os linfonodos drenantes mediastinais
(LNMDs) conduzidas pela expressão de CCR7 nas células desses órgãos linfóides
(OLMOS; STUKES; ERNST, 2010). Ao atingir os LNMDs, as DCs residentes não
infectadas capturam os antígenos do ambiente extracelular para também cumprir a
função de APC (SRIVASTAVA; ERNST, 2014; WOLF et al., 2007). Assim, as DCs
tanto nos pulmões como nos LNMDs são as principais APCs, expressando níveis mais
altos de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 em comparação aos Mφs
alveolares e intersticiais (WOLF et al., 2007). Entre 4-27 semanas após adquirir a
infecção, o camundongo desenvolve a fase crônica apresentando o granuloma com
predomínio de LT e não mais de neutrófilos e Mφs (TSAI et al., 2006). Durante esta
fase, o transporte de antígenos dos pulmões aos LNMD pelas DCs diminui (WOLF et
al., 2007), assim como a taxa de replicação e morte de micobactérias (GILL et al.,
18
2009; MCDANIEL et al., 2016). Nos camundongos resistentes, a fase crônica se
caracteriza pelo controle da infecção por até dois anos, e a partir desse período a
resposta de LT CD4 diminui e se observa a progressão da doença (BEAMER;
TURNER, 2005).
O Mtb como patógeno intracelular promove principalmente uma resposta de
tipo Th1 (como em humanos) para resolver a infecção tanto na fase aguda como na
fase crônica (TSAI et al., 2006). A apresentação de antígenos ocorre e como
consequência os LT CD4 aparecem nos LNMDs entre 7-14 dias após a infecção com o
pico entre 21-28 dias (GALLEGOS; PAMER; GLICKMAN, 2008; WOLF et al.,
2007), o que confirma o aumento de IL-2, IFN-γ e TNF-α, citocinas liberadas pelos
LT CD4. A IL-12 é a citocina responsável pela polarização Th1, o subtipo de LT CD4,
a mais importante na resposta imune celular induzida contra o Mtb.
A subpopulação Th1 é a fonte principal de IFN-γ e TNF-α, os quais agem nos
Mφs, promovendo sua função microbicida (LADEL et al., 1997). Camundongos IFN-γ
KO (nocaute, do inglês “Knock out”) infectados com dose de Mtb subletal via aerossol
e via endovenosa, apresentam múltiplas áreas necróticas no baço, pulmões, fígado e
rins; pouco recrutamento de neutrófilos e Mφs em granuloma não organizado; maior
carga bacilar e ausência de síntese de NOS2 (necessário na função microbicida dos
Mφs). De forma similar, é possível perceber que o IFN-γ age melhor em Mφs com alta
carga bacilar, provocando necrose e apoptose (LEE; KORNFELD, 2010), e quando se
apresentam deficiências na produção de IFN-γ, observa-se um aumento da
susceptibilidade a infecção por Mtb (LYADOVA; PANTELEEV, 2015). O que não
acontece no camundongo WT (camundongos com genótipo original, do inglês “Wild
type”), que consegue controlar a infecção, demonstrando a função protetora do IFN-γ
(COOPER et al., 1993; FREMOND et al., 2005; PEARL et al., 2001). Cabe mencionar
que o IFN-γ, ao invés de protetor poder ser letal se for produzido em excesso, como
foi demonstrado em camundongos PD-1 KO, um inibidor da produção de IFN-γ
(SAKAI et al., 2016). Do mesmo modo, o TNF-α exerce função protetora.
Camundongos TNF KO ou WT com tratamento anti-TNF apresentaram maior
susceptibilidade a infecção por Mtb. O TNF-α de membrana age na fase aguda junto
ao IFN-γ, aumentando a atividade microbicida dos Mφs (aumento de NOS2) e
participando na resposta pró-inflamatória, recrutando células para formar o granuloma
(FREMOND et al., 2005; SAUNDERS; BRISCOE; BRITTON, 2004). Enquanto na
19
fase crônica tanto TNF de membrana e solúvel participam no controle da infecção
(FREMOND et al., 2005).
A subpopulação Th17 também apresenta um perfil protetor na infecção por
Mtb. As citocinas IL-6, IL-21 e IL-23 ativam o fator de transcrição STAT 3, que induz
a expressão de ROR-γt, o qual aumenta a expressão do receptor do IL-23 e polariza o
perfil de LT CD4 na subpopulação Th17 (LYADOVA; PANTELEEV, 2015). Th17
não são a principal fonte da citocina IL-17, podendo ser produzida pelas células γδ.
Além da IL-17 (IL-17A), também é produzida IL-17F, IL-21 e IL-22. Em geral, a
subpopulação Th17 tem a função de recrutar neutrófilos que podem ajudar aos Mφs na
eliminação de bacilos ou na formação do granuloma (KHADER et al., 2007;
LYADOVA; PANTELEEV, 2015; TORRADO; COOPER, 2011).
1.4.1 Avaliação da reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em
modelo murino
A avaliação da reação de DTH em camundongos se realiza mediante um teste
cutâneo com o objetivo de identificar a exposição prévia a um antígeno. A aplicação
mais conhecida de um teste cutâneo é a prova tuberculínica (PT) a qual utiliza a
técnica de Mantoux. O teste cutâneo apresenta duas fases: uma primeira fase de
sensibilização e uma segunda fase de elicitação. A fase de sensibilização consiste no
contato primário com o antígeno (microrganismos, proteínas ou haptenos) por
diferentes vias de inoculação segundo o objetivo do estudo. A fase de elicitação
consiste na inoculação do antígeno ao qual se teve exposição prévia na fase de
sensibilização (ALLEN, 2013). Ao término dessas duas fases, a reação de DTH gerada
se avalia pela leitura, com ajuda de um paquímetro em milímetros (mm), do inchaço
no local de inoculação (ALLEN, 2013; FAQI, 2013; PAIS et al., 1998). A nível
imunológico na fase de sensibilização o antígeno injetado na derme é reconhecido
pelas APCs do local, as células de Langerhans na sua maioria por ser uma inoculação
de tipo intradérmica, as quais processam e apresentam esses antígenos aos LT
residentes nos linfonodos drenantes (AKBAR et al., 2013; SMITHEY et al., 2015). Os
LT de memória ou efetores devido a infecção ativa migram cerca de 24-72 horas para
o local de entrada do antígeno (injeção intradérmica). Na fase de elicitação, os LT de
memória reconhecem o antígeno e conseguem responder com produção de citocinas e
recrutamento de células, que irão formar a induração (SMITHEY et al., 2015).
20
O modelo animal mais utilizado na avaliação da resposta de DTH para
tuberculose é a cobaia. Entre as desvantagens se podem mencionar o risco de choque
tuberculínico (KUBICA; DUNBAR; KIM, 1973; REECE et al., 2005). O choque
tuberculínico se caracteriza pelos níveis elevados de TNF-α dentro das 24 horas após a
elicitação de resposta, o que pode provocar letargia, diminuição da temperatura e até a
morte (REECE et al., 2005). Os camundongos apresentam as vantagens de serem
menores, ocupar menos espaço, não gerar úlceras após a inoculação do PPD e ter-se
ampla informação sobre aspectos imunológicos que podem ser facilmente associados a
resposta de DTH observada em humanos (FAQI, 2013; KUBICA; DUNBAR; KIM,
1973). Diante dessas características, o teste cutâneo mediante a técnica de Mantoux
continua a ser usado no camundongo principalmente para conferir ou complementar a
avaliação de respostas de tipo Th1 (OBIEGLO et al., 2016; REECE et al., 2005;
WANG Y. et al., 2016). Porém os locais de inoculação, via intradérmica, que podem
ser realizados no coxim plantar ou no pavilhão da orelha apresentam dificuldades de
inoculação. As duas vias de inoculação necessitam de uma pessoa treinada para evitar
grande variabilidade na técnica, além da necessidade de anestesia quando o pavilhão
da orelha for o local de escolha (ALLEN, 2013).
1.5 Desenvolvimento de testes cutâneos para o diagnóstico de Tuberculose
A procura de biomarcadores mais específicos e econômicos no diagnóstico de
TB latente continua sendo relevante (ARINAMINPATHY; DOWDY, 2015).
Considerando que a PT induz uma reação de DTH, os antígenos do bacilo que possam
estar envolvidos na imunidade celular podem ser promissores para substituir o PPD, o
reagente usado na PT (MÅLEN; SØFTELAND; WIKER, 2008).
Tendo em vista os problemas de especificidade da PT com o uso do PPD
quando os indivíduos são vacinados com a BCG ou apresentam exposição a MNTs, os
antígenos candidatos promissores são aqueles ausentes tanto na BCG como nas MNTs.
O ESAT-6, é um dos antígenos mais importantes na virulência das micobactérias,
localizado na região de diferenciação (RD) 1, o qual na forma de proteína
recombinante conseguiu induzir uma reação de DTH positiva comparável ao PPD em
cobaias (MORADI et al., 2015). No mesmo modelo, quando usado o ESAT-6
associado ao CFP-10, observou-se associação indireta do tamanho da induração e a
sobrevivência dos animais, quanto menor a induração maior a sobrevida
(WELDINGH; ANDERSEN, 2008). Porém, o uso do CFP-10 de forma individual
21
apresentou a desvantagem de provocar choque tuberculínico sem desenvolver a reação
de DTH (REECE et al., 2005).
Outra fonte importante de candidatos para substituir o PPD, são os antígenos
do próprio PPD. Cho e colaboradores, identificaram o conteúdo do PPD em nível
proteômico, observando algumas proteínas de forma abundante, as chaperonas DnaK,
GroEL2, GroES e HspX (CHO et al., 2012). Essas proteínas de forma individual e em
coquetel foram aplicadas em teste cutâneo em cobaias. Como foi possível observar que
de forma individual não conseguiu induzir DTH, as proteínas foram utilizadas em
coquetel. Assim, os coqueteis DnaK+GroEL2+Rv0009 e DnaK+GroEL2+Rv0685
induziram uma reação de DTH comparável ao PPD (YANG et al., 2011). Assim
também, diferentes antígenos em coquetel vêm sendo avaliados. Usando o coquetel de
CFP-10+ESAT-6+MPT64 para o teste cutâneo em cobaias infectadas com Mtb
inativado
(STAVRI
et
al.,
2012)
ou
10+TB10.3+TB10.4+MTSP11+MPT70+MPT83
o
coquetel
(MALAGHINI
ESAT-6+CFPet
al.,
2011),
observa-se uma reação de DTH similar ou melhor que a gerada pelo PPD, o que não
foi observado quando as proteínas recombinantes foram usadas individualmente
(MALAGHINI et al., 2011; STAVRI et al., 2012). Além disso, o uso de coquetel a
partir de peptídeos (P1+P8) de uma proteína como o ESAT-6, também apresentaram
vantagens frente ao uso da proteína recombinante de forma individual (ELHAY;
OETTINGER; ANDERSEN, 1998).
Além de aplicar a PT nos humanos, para os bovinos o teste cutâneo é parte da
triagem básica de diagnóstico de M. bovis, e algumas proteínas avaliadas apresentam
semelhança genética ao M. tuberculosis, o que pode ser de utilidade na avaliação de
novas formulações de um PPD em humanos. O uso de CFP-10+ESAT-6+TB10.4 e
CFP-10+ESAT-6+Rv3872+MPT63, apresentaram uma reação de DTH específica
(XIN et al., 2013). Outros dois coquetéis (C1: ESAT-6+CFP-10+MPB83 e C2: ESAT6+CFP-10+MPB83+TB10.3+HspX+MPB70) avaliados no teste cutâneo em cobaias e
gado, apresentaram melhor resultado com adição de antígenos imunodominantes do
PPD-B (CFP2, FixB, PepA). Dessa forma, para o reconhecimento de infecção por M.
bovis em bovinos, o C1 obteve uma reação de DTH específica, e quando acrescentado
o FixB, além de específico apresentou maior sensibilidade quando comparado ao PPD
convencional (MON et al., 2014). Diante da vantagem do uso de proteínas em
coquetel,
também
foi
produzida
uma
proteína
de
fusão
(ESAT-6_CFP-
22
10_Rv3615c_Rv3020c) em beads, o que aumentou a sensibilidade do teste para
bovinos infectados com M. bovis (PARLANE et al., 2016).
Concluindo, as proteínas recombinantes são de produção fácil, qualidade
controlada (CASAL et al., 2012; MALAGHINI et al., 2011) e apresentam a
possibilidade de aumentar sua sensibilidade (PARLANE et al., 2016).
1.6 Proteínas de fusão rCMX e rECMX
As proteínas de fusão rCMX e rECMX, foram construídas previamente por
nosso grupo, a parceria do Laboratório de Imunopatologia e Doenças Infecciosas, e
Laboratório de Bacteriologia Molecular. Ambos do Instituto de Medicina Tropical e
Saúde Pública (IPTSP), UFG.
A rCMX foi produzida a partir de sequências do Ag85C (Rv0129c), MPT51
(Rv3803c) e a sequência completa do HspX (Rv2031c), as quais foram amplificadas
do genoma do Mtb H37Rv para obtenção da proteína de fusão de ~32 kDa (DE
SOUSA et al., 2012).
O complexo Ag85 é uma família de três proteínas (Ag85A, Ag85B e Ag85C),
as quais são as proteínas mais abundantes na cultura do Mtb, essenciais na
sobrevivência do bacilo nos Mφs, consideradas como um importante fator de
virulência (HUYGEN, 2014; SUNDAR et al., 2015). Estas proteínas possuem
atividade micolil transferase, e são responsáveis pela formação da trealose dimicolato
(TDM) e trealose monomicolato (TMM), glicolipídeos da parede do Mtb que não são
sintetizados pelo hospedeiro (HUYGEN, 2014; WIKER; HARBOE, 1992). Foi
proposto que o complexo Ag85 é reconhecido pela lectina ligadora de manose (MBL)
e mais fortemente por ficolinas (tipo 1 e 3) (ŚWIERZKO et al., 2016), e se liga a
domínios de elastina e tropoelastina (componentes do tecido pulmonar) o que
facilitaria a entrada do bacilo (KUO et al., 2013). Além disso, observa-se a interação
do complexo Ag85 com a proteína HupB, a qual está presente na cultura anaeróbica de
Mtb e na TB latente (SUNDAR et al., 2015).
O MPT-51 ou Ag85D, é 40% idêntico ao complexo Ag85, e se caracteriza por
estar em maior quantidade no complexo Mycobacterium, incluindo o Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae e Mycobacterium avium. O
antígeno, pode estar envolvido na ligação de hidratos de carbono e fibronectina
(WILSON et al., 2004) e na reciclagem de trealose (SUNDAR et al., 2015). Quando
usado em diagnóstico, o MPT51 consegue ser reconhecido por anticorpos IgM de
23
pacientes com TB ativa em população endêmica (MELO CARDOSO ALMEIDA et
al., 2008).
O HspX ou Rv2031c, é induzido em condições de estrese como: hipóxia, altas
concentrações de óxido nítrico, baixa concentração de ferro, baixo pH, etc. O gene
HspX que codifica a proteína, está entre os 48 genes mais abundantes expressos na
fase de latência da TB (SINGH; SARAAV; SHARMA, 2014; SMITH, 2003). A partir
de analise in silico, o HspX agiria como chaperona interagindo com a proteína DnaK
(Rv0350), ambas participando na manutenção da estrutura do Mtb em condições de
estresse (MUSHTAQ et al., 2015).
Diante da importância de cada proteína utilizada na construção da rCMX. De
Sousa e colaboradores (2012) avaliaram a imunogenicidade da proteína in vivo.
Quando camundongos BALB/c foram imunizados com a rCMX e CpG DNA em
lipossomas, foi possível observar que a rCMX conseguiu induzir mais LT CD4+IFN-γ+
e TNF-α+, em comparação ao grupo controle salina. Além disso, os camundongos
imunizados apresentaram anticorpos IgG específicos para rCMX. Da mesma forma, a
rCMX, usada em ELISA, conseguiu discriminar pacientes com TB ativa de controles
saudáveis, a partir dos níveis de anticorpos IgG (Sensibilidade:
92,45%,
Especificidade: 71,79%) e IgM (Sensibilidade: 80%, Especificidade: 61,54%)(DE
SOUSA et al., 2012). Tendo em vista que a rCMX induziu uma resposta celular e
humoral específica, foi proposto seu uso em diferentes modelos vacinais. Quando a
rCMX foi expressa por M. smegmatis, uma micobactéria de crescimento rápido
denominou mc2-CMX. Em camundongos vacinados com a mc2-CMX, foi induzida
uma resposta humoral IgG2a e IgG1 maior em comparação ao controle salina. Assim
também, as células do baço e pulmões de camundongos vacinados, foram capazes de
induzir mais LT CD4+ e LT CD8+ produtores de IFN-γ, IL-17, TNF-α e IL-12, em
comparação ao grupo controle salina (JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2013). Ante a
resposta humoral e celular induzidas com a mc2-CMX, esse modelo vacinal foi
comparado com a BCG, onde a mc2-CMX apresentou redução na lesão pulmonar e
inflamação provocada pela infecção, tanto quanto a BCG (OLIVEIRA et al., 2016).
No entanto, a vacina mc2-CMX quando aplicada em bovinos, não foi capaz de induzir
LT CD4+ específicos para rCMX e provocou hiperplasia folicular nos linfonodos
cervicais, mas não interferiu com a PT (ALVES et al., 2014). Outra forma de melhorar
o uso da rCMX em um modelo vacinal, consistiu na construção de uma BCG
recombinante, a rBCG-CMX. Da Costa e colaboradores (2014), avaliaram Mφs
24
peritoneais infectados com a rBCG-CMX in vitro, os quais apresentaram maior
quantidade de bacilos fagocitados que os infectados com BCG, mas níveis de óxido
nítrico similares entre ambos. Após 30 dias da imunização, a rBCG-CMX induziu
maior número de LT CD4+IFN-γ+ e IL-17+, que a BCG. Além disso, conseguiu a
redução da extensão das lesões pulmonares e carga bacilar em comparação aos
vacinados com BCG (DA COSTA et al., 2014). Para melhorar o entendimento da
resposta imune inata induzida frente a rBCG-CMX, Mφs de diferentes tipos
(pulmonares, peritoneais, alveolares e derivados de medula óssea de camundongos),
foram estimuladas com os antígenos que compõem a rCMX, a rBCG-CMX e a BCG
como controle. Reconhecendo que os Mφs têm função pró-inflamatória (M1) ao
produzir oxido nítrico (NO), ou anti-inflamatória (M2) ao produzir ureia. Se observou
que todos os tipos de Mφs produziram elevados níveis de NO e ureia frente a rCMX,
elevados níveis de ureia (M2) frente a rBCG-CMX e elevados níveis de NO (M1)
quando utilizada a BCG como controle (DA COSTA et al., 2016). Da análise dos
modelos vacinais utilizando rCMX, Oliveira e colaboradores observaram que células
pulmonares de camundongos infectados reconhecem a proteína recombinante
(OLIVEIRA et al., 2016), fato importante para seu uso na indução de DTH em nosso
estudo.
Outra proteína promissora desenvolvida por nosso grupo é a rECMX,
produzida a partir da ligação da rCMX (Ag85C_MPT51_HspX) e a sequência
completa da ESAT-6 com o intuito de melhorar a imunogenicidade. O gene que
codifica a ESAT-6 foi fusionada a rCMX mediante clonagem heteróloga, de gene
inserido em plasmídeo pET23a e expresso em células competentes de E.coli
BL21(DE3)(pLysS) (BEILNER, 2015; patente depositada).
A ESAT-6, é uma proteína codificada pelo gene ESAT-6, o qual está
localizado na região de diferenciação 1 (RD1) e está presente em cepas do
Mycobacterium como M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M.
marinum, M. szulgai e M. flavescens (GANGULY; SIDDIQUI; SHARMA, 2008). O
gene produz o fator de virulência mais importante para o Mtb, a proteína de 6 kDa
(ESAT-6), a qual interage com linfócitos, Mφs e DCs. Assim, na fase inicial da TB, a
ESAT-6 é o alvo mais importante da resposta imune celular em humanos e
camundongos (BRODIN et al., 2004). Em 90% dos pacientes com TB ativa e em
todos aqueles com escarro positivo, foi identificado a ESAT-6 de forma intracelular
(POULAKIS et al., 2015). E ao ser utilizada como estímulo de DCs do sangue
25
periférico, a ESAT-6, favoreceu a produção de IL-23 e IL-1β induzindo um perfil de
resposta Th17 (WANG et al., 2012). Já em modelo murino, observa-se a interação da
ESAT-6 e os Mφs derivados de medula óssea induzindo a produção de MCP-1, a qual
é importante na patogenia da TB, isso de forma dose dependente e melhorada na
presença de IL-4 (MA et al., 2016).
Diante da capacidade imunogênica da rCMX e rECMX, e as limitações da
prova tuberculínica, o estudo visa a possibilidade de avaliar essas proteínas
recombinantes em camundongos infectados com Mtb na sua capacidade de induzir
uma resposta imune celular específica que possa ser utilizada na reação de
hipersensibilidade do tipo tardia observada na prova tuberculínica.
26
2 JUSTIFICATIVA
A doença infectocontagiosa que causa mais mortes no mundo é a Tuberculose,
superando ao HIV (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). As pessoas
saudáveis conseguem conter a infecção, e cerca de 90-95% mantém a doença na sua
forma de latência consequentemente somente 5-10% dos indivíduos desenvolvem a
doença na sua forma ativa (PAI et al., 2016; PICCINI et al., 2014). Cerca de 1/3 da
população mundial apresenta TB latente, portanto a identificação e o tratamento
preventivo de indivíduos com TB latente são cruciais para o controle da tuberculose.
Por muitos anos, a PT foi utilizada na identificação dos casos de TB latente. No
entanto, a OMS sugeriu a descontinuidade de seu uso devido aos diversos resultados
falsos positivos em indivíduos vacinados com BCG a menos de 5-10 anos (SEDDON
et al., 2016) ou indivíduos expostos a MNTs. E também pelo fato de apresentar
resultados falsos negativos quando utilizada em indivíduos imunossuprimidos
(GONZÁLEZ-MARTÍN et al., 2010). O IGRA (ensaio de liberação de IFN-γ)
melhorou a falta de especificidade da PT utilizando os antígenos ESAT-6 e CFP-10, os
quais estão ausentes na vacina BCG e em algumas MNT (GANGULY; SIDDIQUI;
SHARMA, 2008; WHITWORTH et al., 2013). Entretanto, o alto custo e maior
complexidade para a sua realização, limita seu uso. Desde que o IGRA foi aprovado
para uso comercial, em 2011, outras limitações vêm sendo observadas. Observa-se por
exemplo: falta de reprodutibilidade entre as diferentes versões do IGRA, tempo maior
de conversão de negativo para positivo em comparação a PT, alguns casos de reversão
de positivo a negativo, e a limitação de uso em populações com alta incidência de TB
(JONES-LÓPEZ et al., 2015; RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2014).
Nosso grupo construiu duas proteínas com antígenos imunodominantes do
Mtb, a rCMX (Ag85C_MPT-51_HspX) (DE SOUSA et al., 2012) e a rECMX (ESAT6_rCMX) (BEILNER, 2015). A rCMX vêm sendo avaliada como parte de
formulações vacinais assim como em ensaios de ELISA indireto para o diagnóstico de
TB ativa (DA COSTA et al., 2014; DE SOUSA et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2016).
Durante as avaliações, observou-se que tanto os animais infectados com Mtb quanto o
soro de indivíduos com tuberculose ativa apresentavam linfócitos ou anticorpos
capazes de reconhecer a proteína de fusão recombinante, indicando que a mesma
poderia ser utilizada no diagnóstico da TB (OLIVEIRA et al., 2016). No caso da
rECMX que contêm a rCMX ligada a proteína ESAT-6 (BEILNER, 2015), acredita-se
27
que o reconhecimento pelas células e moléculas do sistema imune também ocorreriam
e portanto poderia melhorar a resposta obtida pela rCMX. Neste trabalho
hipotetizamos que as proteínas recombinantes rCMX e rECMX poderiam ser
utilizadas em teste cutâneo para o diagnóstico de Tuberculose.
28
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
 Avaliar a resposta imune celular específica anti-rCMX e anti-rECMX, e
sua capacidade de gerar uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia
(DTH) em camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis.
3.2 Objetivos específicos
 Avaliar a resposta imune celular específica anti-rCMX nos pulmões,
baço e linfonodos drenantes de camundongos BALB/c infectados com
Mycobacterium tuberculosis.
 Avaliar a resposta imune celular específica anti-rECMX nos pulmões,
baço e linfonodos drenantes de camundongos BALB/c infectados com
Mycobacterium tuberculosis.
 Avaliar a capacidade da proteína rCMX de gerar uma reação de
hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos BALB/c
infectados Mycobacterium tuberculosis.
 Avaliar a capacidade da proteína rECMX de gerar uma reação de
hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos BALB/c
infectados Mycobacterium tuberculosis.
29
4 METODOLOGIA
4.1 Delineamento do estudo
O estudo utilizou 42 animais distribuídos em grupos de 6 animais cada, com
repetição dos experimentos sendo um total de 84 animais. Em um primeiro momento,
12 animais foram divididos em um grupo salina e infecção (I). Após 45 dias da
infecção (I), os baços, pulmões e linfonodos drenantes foram coletados para avaliação
da resposta imune celular por citometria de fluxo. Em um segundo momento, 30
animais foram utilizados (infecção II). O grupo PPD - controle negativo não foi
infectado com Mtb, enquanto os outros grupos foram infectados. No dia 45 após a
infecção se realizou o teste cutâneo nos grupos: PPD – controle negativo, PPD 2 UT controle positivo, rCMX (25µg), rECMX (15µg) e rECMX (25µg). Cada
denominação do grupo referiu-se ao antígeno a ser avaliado e as concentrações
utilizadas foram otimizadas em base a experimentos anteriores. A leitura da espessura
e inchaço induzidos no coxim plantar, foi realizada 24 e 48 horas depois do início do
teste cutâneo. Nos dias 1 e 47 após a infecção (II), três camundongos infectados foram
utilizados para avaliar a carga bacilar nos pulmões (contagem de UFC = unidades
formadoras de colônia). E o baço de um camundongo representativo por grupo foi
coletado para observação macroscópica (Figura 5).
Figura 5 - Delineamento do estudo. Camundongos BALB/c (n=42) entre 6-8 semanas de idade foram
utilizados. A avaliação da resposta imune celular foi feita 45 dias após a infecção (I) mediante
citometria de fluxo de células do baço, pulmões e linfonodos drenantes (LNDs). O teste cutâneo foi
realizado 45 dias após a infecção (II) com leitura da reação as 24 e 48 horas. Nesse último ponto, aos 47
dias após a infecção se comprovou a carga bacilar nos pulmões de camundongos infectados mediante a
contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em condições similares ao 1° dia após infecção. O
baço de um camundongo por grupo experimental foi coletado para observação macroscópica. O
experimento foi repetido duas vezes.
30
4.2 Produção de proteínas rCMX e rECMX
As proteínas rCMX e rECMX utilizadas no estudo foram produzidas
previamente por nosso grupo no Laboratório de Bacteriologia Molecular e
Imunopatologia das Doenças Infecciosas, IPTSP. Para este estudo, a partir de DNA
plasmidial, as proteínas foram produzidas em grande escala. A proteína rCMX está
composta pela sequência parcial dos antígenos imunodominantes do Ag85C e MPT51, e a sequência completa do antígeno HspX (DE SOUSA et al., 2012). Enquanto, a
rECMX foi produzida pela adição da sequência codificante do gene ESAT-6 a rCMX
(BEILNER, 2015).
Transformação. A partir do DNA plasmidial codificante para rCMX e
rECMX, a produção dessas proteínas começou pelo processo de transformação. A
transformação bacteriana consiste na inserção do DNA plasmidial em E.coli
competentes, nesse caso mediante eletroporação. Para cada proteína foi realizado um
sistema de transformação. Primeiro, as cubetas do eletroporador foram esterilizados
com álcool 70% e exposição à luz UV antes do uso. Foi utilizada uma cubeta para
cada sistema de transformação, o qual consistiu em 2 µL de DNA plasmidial
codificante da proteína rCMX (Ag85C_MPT-51_HspX) ou rECMX (ESAT-6_CMX)
no vetor de expressão pET23a (Novagen/Biosciences), inseridos em 50 µL de células
competentes de E.coli BL21 (DE3) pLysS. O método de eletroporação de pulsação
(Bio-Rad®) foi realizado nas condições de 2,5KV, 25 µF e 1000Ω. Esse método
permitiu a entrada do DNA plasmidial nas células competentes. Logo, para
restabelecer as membranas destas células, cada sistema de transformação foi inoculado
em 1 mL de meio SOC (extrato de levadura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mM, KCl 2,5
mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, Glicose 20 mM) foi incubado a 37°C durante 1
h sob agitação. Após a incubação, para obter as colônias expressando as proteínas
rCMX ou rECMX, 100 µL de cada sistema transformante foi plaqueado em duplicata
em meio LB (Luria-Bertani) com cloranfenicol (20 µg/mL) e ampicilina (100 µg/mL),
e incubados a 37°C durante 18 h.
Indução da expressão das proteínas recombinantes com IPTG (Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside). Os transformantes isolados foram selecionados para
prosseguir com a indução com IPTG. Foram preparadas duas placas de meio LB para
cada sistema de transformação, seguindo a ordem de uma gride. Uma placa com meio
LB e antibióticos (cloranfenicol 20 µg/mL e ampicilina 100 µg/mL) e a outra com
meio LB, antibióticos e IPTG (400 µM). O IPTG foi utilizado para induzir a máxima
31
expressão e produção da proteína de cada sistema transformante. Sendo que uma
colônia representa um clone de um sistema transformante, dez colônias isoladas foram
selecionadas e inoculadas em um spot na placa sem IPTG e no spot correspondente na
placa com IPTG. As placas foram incubadas a 37°C durante 18 h.
Preparação do pré-inóculo. Foram escolhidas as colônias da placa sem IPTG
correspondentes às colônias que conseguiram a maior produção de proteína na placa
induzida com IPTG. Para o pré-inóculo, a colônia escolhida foi ressuspendida em
meio LB em caldo com antibióticos (cloranfenicol 20 µg/mL e ampicilina 100
µg/mL), seguido por incubação a 37°C durante 18-24 h sob agitação.
Indução com IPTG. A indução à grande escala foi feita em meio 2YT (1.6%
triptona de peptona, 1% extrato de levadura e 0.5% NaCl) com antibióticos
(cloranfenicol 20 µg/mL e ampicilina 100 µg/mL). Foi colocado 5 mL do pré-inóculo
em 500 mL de meio LB com antibióticos incubados a 37°C sob agitação até o
crescimento bacteriano atingir uma O.D.600 de 0.4-0.6. Após essa incubação,
acrescentou-se o IPTG (400 µM) e se incubou novamente a 37°C durante 4 h sob
agitação.
Coleta da proteína. Os 500 mL de meio LB contendo as bactérias produtoras
das proteínas induzidas, foram centrifugados continuamente em alíquotas de 50 mL.
Cada centrifugação a 5000 rpm durante 10 minutos a 4°C foi repetida até obter um
sedimento único, contendo o concentrado de proteínas. Assim, o sobrenadante foi
descartado e o sedimento armazenado a -20°C até a purificação.
Purificação de proteínas rCMX e rECMX. A purificação das proteínas foi
feita em condições desnaturantes, usando cromatografia de afinidade (Ni-NTA Protein
Purification System – QIAGEM). O tampão de desnaturação (100 mM NaH2PO4, 10
mM Tris base, 8 M ureia), foi utilizado a diferentes pH, com o objetivo de reter a
proteína de interesse pela captura da cauda de histidina, através das partículas de
níquel da coluna de purificação. O tampão de desnaturação com pH 8.0 foi utilizado
como tampão de lise, com pH 6.3 como tampão de lavagem e com pH 4.5 como
tampão de eluição. O pH foi aferido a temperatura ambiente no momento de uso. A
partir do sedimento contendo a proteína de interesse, foram acrescentados 10 mL de
tampão de lise a cada 15 minutos sob agitação durante 2 h, seguida por uma
centrifugação a 10.000 g durante 45 minutos a 22°C. O sobrenadante passou pela
coluna de purificação para obter o filtrado do lisado, logo adicionou-se 4 mL de
tampão de lavagem para obter o filtrado da lavagem 1, mais 4 mL de tampão de
32
lavagem para obter o filtrado da lavagem 2, mais 1 mL de tampão de eluição para
obter o filtrado da eluição 1, e por último, mais 1 mL de tampão de eluição para obter
o filtrado da eluição 2 (Figura 6).
Figura 6 - Esquema de purificação de proteínas mediante cromatografia de afinidade. A proteína
produzida ressuspendida em tampão de desnaturação é o lisado, o qual passa pela coluna de purificação
para obter o filtrado do lisado. O tampão de lavagem (LG) é adicionado duas vezes (lavagem 1 e 2),
seguido pela adição do tampão de eluição (E) por duas vezes (eluição 1 e 2).
A coluna de purificação foi armazenada com metanol 30% a 4°C, e cada
filtrado obtido foi armazenado a -20°C. A fim de conferir a purificação da proteína de
interesse, todas as frações da purificação foram submetidas à corrida eletroforética em
gel de poliacrilamida e duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A partir do filtrado da
eluição 1 (maior concentração da proteína), a concentração das proteínas foi
determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad® Protein Assay) usando albumina
bovina sérica (BSA) como referência. Além disso, realizou-se uma corrida
eletroforética para conferir os pesos moleculares das proteínas rCMX (32 kDa) e
rECMX (42 kDa), utilizando um marcador de peso molecular de 10-225 kDa
(Promega) (Figura 7).
Figura 7 - Gel SDS-PAGE das proteínas rCMX e rECMX. Na primeira coluna se observa o
marcador de peso molecular de 225 kDa, do lado direito dela a proteína rCMX de 32 kDa e na última
coluna a proteína rECMX de 42 kDa.
33
4.3 Animais utilizados
Para o estudo foram utilizados 84 camundongos BALB/c entre 6-8 semanas de
idade, fornecidos pelo Biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
(IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG). Os animais foram mantidos em
micro-isoladores, em condições ad libitum, sob ciclos de luz/escuridão de 12 h, a
temperatura de 20-26°C e humidade relativa de 40-60%. As condições de manutenção
seguiram as orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório (SBCAL/COBEA). O protocolo para este trabalho é parte do projeto
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de
Goiás, com número CEUA 229/11.
4.4 Infecção experimental
A cepa de Mtb foi fornecida pela Universidade Estadual do Colorado
(Colorado State University, Fort Collins, Colorado, Estados Unidos), a qual foi
mantida no meio de cultura Middlebrook 7H9 suplementado com OADC e Tween 80
a 0.05% até a fase de crescimento logarítmico. Alíquotas a -80°C foram armazenadas,
para um mês depois ser plaqueadas em meio de cultura Middlebrook 7H11
suplementado com OADC, e quantificadas. No dia da infecção, o inóculo foi diluído
em PBS-Tween 80 a 0.05%, na concentração indicada (106 UFC/mL). Os animais
foram infectados por via endovenosa por meio do plexo retro orbital com 106 UFC/mL
de suspensão de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, contendo assim 105
UFC/animal. A infecção foi realizada em dois momentos. A infecção I para os grupos
salina e infecção com o objetivo de avaliar a resposta imune celular específica antirCMX e anti-rECMX. E a infecção II para os grupos experimentais submetidos ao
teste cutâneo. Após a infecção, sob o nível de biossegurança três (BL3), os animais
foram mantidos em microisoladores acoplados a rack ventilada.
4.5 Avaliação da resposta imune celular específica anti-rCMX e antirECMX em células de baços, pulmões e linfonodos drenantes de
camundongos infectados com Mtb.
Para avaliar a resposta imune celular específica, após 45 dias da infecção I,
dois grupos, salina e infecção, foram comparados. Os seis animais de cada grupo
foram eutanasiados por deslocamento cervical para coletar o baço, pulmões e
linfonodos drenantes (LNDs). Para obter a suspensão celular do baço, foi feito o
34
homogenato do órgão com meio RPMI (Gibco®, Life Technologies, USA) com ajuda
de uma seringa sob uma peneira de nylon de 70 µm (Corning®). Acrescentou-se uma
solução de lise de eritrócitos (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3) e as células foram
ressuspendidas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de
piruvato (Sigma®, São Paulo), 1% de L-glutamina (LGC Biotecnologia), 1%
penicilina e estreptomicina, e 1% de aminoácidos não essenciais (Sigma®, São Paulo).
Os LNDs seguiram o mesmo processamento das células do baço sem o uso da solução
de lise. Enquanto, os pulmões foram processados em forma de homogenato submetido
à digestão com colagenase III (30 µg/mL, Sigma-Aldrich®) e DNAse IV 1% (30
µg/mL, Sigma-Aldrich®) a 37°C durante 30 minutos, para depois seguir o mesmo
processamento do baço. As suspensões celulares dos órgãos processados foram
submetidas ao teste de viabilidade celular com Trypan blue e ajustadas a 1x106
células/mL.
4.6 Citometria de fluxo
A citometria de fluxo foi realizada para identificar as populações de LT CD4+ e
CD8+ produtores de IFN-γ anti-rCMX e anti-rECMX em camundongos infectados
com Mtb. Depois do processamento dos órgãos, 200 μL de suspensão celular foram
distribuídos em placa de cultura celular de 96 poços (Kasvi K12-096) por cada órgão
coletado. As células foram cultivadas sem estímulo (controle negativo), com ConA a
25 µg/mL (controle positivo), ou com os estímulos rCMX e rECMX (10 µg/mL). Para
promover a estimulação antigênica se acrescentou anti-CD3 (eBioscience®; clone
17A2) e anti-CD28 (eBioscience®; clone 37.51). Logo, as placas foram incubadas a
37°C em estufa de CO2 a 5% durante 4 h. Após este período, foi acrescentado
monensina como inibidor de transporte de proteínas (3 μM; BD Bioscience®), e as
placas foram novamente incubadas durante 6 h. As células foram tratadas com PBSazida sódica 0.1% a temperatura ambiente por 30 minutos. Ao término, as placas
foram centrifugadas e as células foram marcadas com anticorpos anti-CD4 FITC (BD
PharmingenTM, clone RM4-5) e anti-CD8a PE (eBioscience®; clone 53-6.7) por 30
minutos. Continuou-se com a permeabilização das células com Perm Fix/Perm Wash
(BD PharMingenTM) e a lavagem com PBS-azida sódica 0,1%. Para identificar a
liberação de IFN-γ as células foram marcadas intracelularmente com anti-IFN-γ APC
(eBioscience®; clone XMG1.2) e anti-IL17 PercP-Cy TM (BD PharMingenTM),
durante 30 minutos. Todas as aquisições foram realizadas com 50.000 eventos por
35
amostra no citômetro de fluxo BD Biosciences FACSVerse (Laboratório Multiusuário
de Cultivo Celular PPGCA/EVZ/UFG) e os dados foram analisados com o software
FlowJo_V10. A análise dos LT gerados após a estimulação antigênica foi selecionada
em base nas características de tamanho (FSC, do inglês "forward scatter") e
granulosidade (SSC, do inglês "side scatter").
4.7 Prova da infecção com Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Para avaliar a reação de DTH, foi feita a infecção (II), a qual foi comprovada
um dia após a infecção. Três camundongos escolhidos aleatoriamente foram
eutanasiados por deslocamento cervical e coletaram-se os pulmões, os quais foram
processados em PBS-Tween 80 a 0.05% para obter o homogenato do tecido. O
homogenato foi plaqueado em meio de cultura Middlebrook 7H11 suplementado com
OADC, e incubado em atmosfera úmida de CO2 5% a 37°C durante 21 dias. Ao
término da incubação, as unidades formadoras de colônias (UFC) foram
contabilizadas. No dia 47 após a infecção, além de realizar o homogenato do tecido
pulmonar, coletou-se o baço de um camundongo representativo por grupo
experimental para observação macroscópica indicativa de infecção.
4.8 Teste cutâneo pela técnica de Mantoux
Depois de 45 dias da infecção (II), deu-se início ao teste cutâneo mediante a
técnica de Mantoux para avaliar a reação de DTH em camundongos infectados com
Mtb. Como controle negativo, um grupo não foi infectado, mas recebeu PPD RT 23
SSI a 2 UT/mL (Statens Serum Institute- Lote n° 1497A) e como controle positivo, um
dos grupos infectados recebeu o mesmo PPD. Os grupos experimentais, que também
foram infectados com Mtb, receberam como antígenos a rCMX 25 µg, rECMX 15 µg
ou a rECMX 25 µg. O teste cutâneo apresenta duas fases: uma primeira fase de
sensibilização considerada como a infecção com Mtb, e uma segunda fase de
elicitação, onde se procura após a inoculação intradérmica de antígenos que
apresentaram previa exposição, uma reação de DTH. A técnica de Mantoux consiste
na inoculação intradérmica de 100 µL do antígeno. No camundongo, a inoculação foi
realizada com uma seringa de tuberculina de 1 mL e agulha de 26 G, no coxim plantar.
O coxim plantar esquerdo recebeu a inoculação do antígeno (PPD, rCMX ou rECMX)
e o coxim plantar direito recebeu a inoculação de PBS. Assim, para avaliar a reação de
DTH, para cada camundongo a diferença entre a leitura entre o coxim plantar esquerdo
36
e direito (Δ), foi realizada para os parâmetros de espessura e inchaço. Essas leituras
foram realizadas com um paquímetro de 15 mm (ZAAS Precision, Paquímetro
analógico 6”) após 24 e 48 horas da inoculação, por duas pessoas diferentes. A reação
de DTH positiva foi definida quando a diferença (Δ) da espessura ou inchaço resultou
maior ou igual ao resultado obtido pelo controle positivo PPD 2 UT.
4.9 Análise estatística
Os resultados da citometria de fluxo após a análise no programa FlowJo,
seguiram a análise no programa GraphPad Prism mediante o teste T Student com pós
teste de Mann-Whitney-Wilconxon para avaliar a heterogeneidade dos dados.
Enquanto, os resultados obtidos a partir do teste cutâneo foram tabulados no programa
Excel e analisados no programa GraphPad Prism. Cada dado foi apresentado pelo
valor ± desvio padrão, seguido pela análise de variança (ANOVA) não paramétrico
com comparações múltiplas e pós-teste de Kruskal-Wallis.
37
5 RESULTADOS
5.1 Resposta imune celular anti-rCMX e anti-rECMX em células do baço,
pulmões e linfonodos drenantes de camundongos infectados com Mtb.
As proteínas rCMX e rECMX foram construídas com sequências parciais ou
completas de antígenos imunodominantes do Mycobacterium tuberculosis. Como
nosso objetivo era avaliar a capacidade dessas proteínas na geração de reação de DTH,
nos perguntamos primeiro se os camundongos infectados com Mtb poderiam
reconhecer de forma específica as proteínas rCMX e rECMX. Após 45 dias de
infecção, os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical para
obtenção do baço, pulmões e linfonodos drenantes. Os órgãos foram processados para
cultura celular e posterior avaliação por citometria de fluxo.
Os valores da média e desvio padrão para cada resposta imune celular
específica são apresentados na Tabela 1. A estratégia de separação de populações
celulares para elaborar os resultados apresentados se baseou no tamanho (FSC, do
inglês "forward scatter") e granulosidade (SSC, do inglês "side scatter"). Dessa forma,
foi selecionada primeiro a população de linfócitos entre 50-100 K de tamanho e 0-50
K de granulosidade, seguida pelas subpopulações com marcação extracelular antiCD4+ e anti-CD8+, e a partir de cada uma delas foram consideradas as marcações
intracelulares anti-IFN-γ+ e anti-IL-17+. A estratégia de separação de populações
celulares é mostrada para as células do baço (Figura 8A), pulmões (Figura 8B) e
linfonodos
drenantes
(Figura
8C).
38
Tabela 1 - Valores da média para cada resposta imune celular específica no baço, pulmões e linfonodos drenantes (LNDs) de camundongos infectados com Mtb.
Valores da média ± desvio padrão para os resultados obtidos por citometria de fluxo de subpopulações de linfócitos T CD4 +IFN-γ+, CD8+IFN-γ+, CD4+IL17+ e CD8+IL17+.
São apresentados os valores para o grupo salina e infecção (I) e a diferença significativa entre ambos (*p<0.05).
39
Figura 8A - Estratégia de separação de populações celulares do baço de camundongos infectados
com Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Após a seleção de linfócitos por tamanho (FSC, do inglês
"forward scatter") e granulosidade (SSC, do inglês “side scatter”), se apresenta a seleção de LT CD4+ e
CD8+. Seguida pelas subpopulações produtoras de IFN-γ+ e IL-17+ de uma amostra representativa da
cultura in vitro sem estímulo (salina) e com estímulo (rCMX e rECMX).
40
Figura 8B - Estratégia de separação de populações celulares dos pulmões de camundongos
infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Após a seleção de linfócitos por tamanho e
granulosidade, se apresenta a seleção de LT CD4+ e CD8+. Seguida pelas subpopulações produtoras de
IL-17+ e IFN-γ+ de uma amostra representativa da cultura in vitro sem estímulo (salina) e com estímulo
(rCMX e rECMX).
41
Figura 8C - Estratégia de separação de populações celulares dos linfonodos drenantes de
camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Após a seleção de linfócitos por
tamanho e granulosidade, se apresenta a seleção de LT CD4 + e CD8+. Seguida pelas subpopulações
produtoras de IL-17+ e IFN-γ+ de uma amostra representativa da cultura in vitro sem estímulo (salina) e
com estímulo (rCMX e rECMX).
42
Após a análise foi possível observar que nas células do baço de camundongos
infectados houveram mais LT CD4+IFN-γ+, LT CD8+IFN-γ+ e LT CD8+IL17+ antirCMX, que nas células do grupo salina (Figura 9A, B, D; *p<0.05), no entanto, não
houve aumento dos LT CD4+IL17+ neste órgão (Figura 9 C). As respostas específicas
para rECMX dos linfócitos T CD4+IFN-γ+, T CD4+IL17+ e T CD8+IL17+ também
foram maiores quando comparadas ao grupo salina (Figura 9 E, G, H; *p<0.05), no
entanto diferente da resposta específica ao rCMX os LT CD8+IFN-γ+ anti-rECMX não
estavam aumentados (Figura 9F).
43
Figura 9 - Resposta imune celular induzida no baço após 45 dias da infecção com Mtb em
camundongos BALB/c. Após eutanásia dos camundongos, o baço foi processado e cultivado com a
proteína rCMX 10 µg (A, B, C e D) e rECMX 10 µg (E, F, G, H) para avaliação de linfócitos T (LT)
CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ+ e IL17+. Foram utilizados seis animais por grupo experimental.
Diferença significativa, *p<0.05.
Para avaliar a resposta imune celular anti-rCMX e anti-rECMX, além de
avaliar os órgãos linfóides secundários, uma forma de conferir a resposta efetora dos
LT ativados foi avaliar os pulmões por ser o órgão alvo da infecção. A Figura 10
apresenta a resposta imune celular nos pulmões de animais infectados. Pode ser
44
observado que todas as subpopulações de linfócitos avaliados induzidos pela infecção
com Mtb foram capazes de reconhecer especificamente rCMX e rECMX (LT
CD4+IFN-γ+, LT CD8+IFN-γ+, LT CD4+IL17+ e LT CD8+IL17+; Figura 10; *p<0.05).
Figura 10 - Resposta imune celular induzida nos pulmões, após 45 dias da infecção com Mtb em
camundongos BALB/c. Após eutanásia dos camundongos, os pulmões foram processados e cultivados
com a proteína rCMX 10 µg (A, B, C e D) e rECMX 10 µg (E, F, G, H) para avaliação de linfócitos T
(LT) CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ+ e IL17+. Foram utilizados seis animais por grupo
experimental. Diferença significativa, *p<0,05.
45
A resposta específica dos linfócitos dos linfonodos drenantes estão mostrados
na figura 11. Como pode ser observado os LT CD4+IFN-γ+, LT CD8+IFN-γ+ e LT
CD4+IL17+ apresentam resposta anti-rCMX e anti-rECMX (*p<0.05).
Figura 11 - Resposta imune celular induzida nos linfonodos drenantes após 45 dias da infecção
com Mtb em camundongos BALB/c. Após eutanásia dos camundongos, os linfonodos drenantes
(LNDs) foram processados e cultivados com a proteína rCMX 10 µg (A, B, C e D) e rECMX 10 µg (E,
F, G, H) para avaliação de linfócitos T (LT) CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ+ e IL17+. Foram
utilizados seis animais por grupo experimental. Diferença significativa, *p<0.05.
46
5.2 Reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em camundongos
infectados com Mtb.
Uma vez que comprovamos que as proteínas rCMX e rECMX podem ser
reconhecidas pelo sistema imune de camundongos infectados com Mtb, verificamos se
essas proteínas recombinantes tinham capacidade de induzir uma reação de DTH
positiva similar ou melhor que o PPD convencional. Camundongos BALB/c foram
infectados com Mtb e 45 dias depois, iniciou-se o teste cutâneo mediante a técnica de
Mantoux. A figura 12A apresenta a diferença da espessura registrada 24 h após o teste
cutâneo. Apesar de o controle positivo PPD 2UT (animais infectados e realizados o
teste cutâneo; DTH = 0.27±0.02) não ter sido diferente do controle negativo PPD
(animais não infectados e realizados o teste cutâneo; DTH = 0.26±0.02), todos os
animais injetados intradérmicamente com rCMX (25µg; DTH = 0.37±0.02), rECMX
(15µg; DTH = 0.38±0.03) e rECMX (25µg; DTH = 0.62±0.12) induziram uma reação
de DTH positiva. Como mostrado na figura 12, a rECMX quando utilizada a 25µg por
injeção apresentou melhor desempenho na indução de DTH (*p<0.05).
Figura 12 - Leitura da espessura do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados com Mtb
H37Rv após o teste cutâneo. Os dados representam a diferença (Δ) de leitura da espessura entre o
coxim plantar esquerdo (antígeno) e direito (PBS) para cada animal. Uma reação de hipersensibilidade
do tipo tardia (DTH) foi considerada positiva quando a Δ de leitura resultou maior ou igual ao controle
positivo (PPD 2UT). Segundo o antígeno recebido no teste cutâneo, o grupo controle negativo se define
como PPD e os grupos experimentais como rCMX 25 µg, rECMX 15 µg e rECMX 25 µg. 12A. Leitura
da Δ Espessura 24 h após o teste cutâneo. 12B. Leitura da Δ Espessura 48 h após o teste cutâneo. Foram
utilizados seis animais por grupo em dois experimentos independentes. Diferença significativa
(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0,0001).
Já a Figura 12B, apresenta a diferença da espessura registrada 48 h após o teste
cutâneo, em que a leitura do controle positivo PPD 2UT (DTH = 0.23±0.01) foi maior
que o controle negativo PPD (DTH = 0.07±0.01), mesmo assim sem diferença
47
significativa. Nesse ponto, os melhores resultados foram obtidos pelos grupos rCMX
(25µg; DTH = 0.28±0.03) e rECMX (25µg; DTH = 0.5±0.04), os quais mantiveram a
reação de DTH positiva observada às 24 h (*p<0.05).
A Figura 13 apresenta a leitura da diferença (Δ) do inchaço 24 e 48 h após o
teste cutâneo. Na Figura 13A é possível observar que a Δ Inchaço depois de 24h, não
apresentou diferença significativa entre os grupos, no entanto a rECMX (25µg, DTH =
0.71±0.1) induziu uma reação de DTH positiva maior ao controle positivo PPD 2 UT
(0.54±0.04). Na leitura da Δ Inchaço 48h após o teste cutâneo (Figura 13B), foi
possível observar diferença significativa entre os grupos controle negativo PPD (DTH
= 0.05±0) e positivo PPD 2UT (DTH = 0.55±0.05). Quarenta e oito horas após a
injeção intradérmica de rECMX observa-se reação DTH positiva para todas as
concentrações utilizadas.
Figura 13 - Leitura do inchaço do coxim plantar de camundongos BALB/c infectados com Mtb
H37Rv após o teste cutâneo. Os dados representam a diferença (Δ) de leitura do inchaço entre o coxim
plantar esquerdo (antígeno) e direito (PBS) para cada animal. Uma reação de hipersensibilidade do tipo
tardia (DTH) foi considerada positiva quando a Δ de leitura resultou maior ou igual ao controle positivo
(PPD 2UT). Segundo o antígeno recebido no teste cutâneo, o grupo controle negativo se define como
PPD e os grupos experimentais como rCMX 25 µg, rECMX 15 µg e rECMX 25 µg. 13A. Leitura da Δ
Inchaço 24 h depois do teste cutâneo. 13B. Leitura da Δ Inchaço 48 h depois do teste cutâneo. Foram
utilizados seis animais por grupo em dois experimentos independentes. Diferença significativa
(*p<0.05, ***p<0.001).
48
Quando analisamos a resposta ao longo do tempo observamos que a rECMX
(25µg) induziu uma reação de DTH positiva melhor que os controles e demais grupos
experimentais (Figura 14).
Figura 14 - Leituras de Δ Espessura (14A) e Δ Inchaço (14B) ao longo do tempo. Os grupos se
definem de forma similar aos dados fonte como: controle negativo PPD, controle positivo PPD 2UT, e
grupos experimentais rCMX 25 µg, rECMX 15 µg e rECMX 25 µg.
49
No final do teste cutâneo, um animal representativo de cada grupo
experimental foi eutanasiado para comprovar a infecção a partir da observação
macroscópica do baço, os quais apresentaram esplenomegalia nos grupos infectados
(PPD 2UT, rCMX (25µg), rECMX (15µg) e rECMX (25µg) em comparação ao grupo
controle negativo sem infecção (Figura 15A). Outra forma de comprovar a infecção foi
a partir da carga bacilar encontrada nos pulmões de camundongos infectados no 1° dia
e no 47° após a infecção (Figura 15B).
Figura 15 - Observação macroscópica do baço e carga bacilar nos pulmões de camundongos
infectados com Mtb. No final do teste cutâneo, um camundongo representativo de cada grupo
experimental foi eutanasiado e o baço coletado. 15A. Observa-se de esquerda à direita os grupos:
controle negativo PPD (sem infecção), controle positivo PPD 2UT, rCMX 25µg, rECMX 15µg e
rECMX 25µg. 15B. Os pulmões de camundongos infectados foram coletados no 1° dia e no 47° dia
após a infecção com Mtb. A carga bacilar é apresentada em Log10.
50
6 DISCUSSÃO
A técnica de Mantoux é uma técnica de imunorreação, que avalia a
hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) frente à inoculação intradérmica de um
antígeno. A aplicação mais conhecida é a prova tuberculínica (PT), que junto ao ensaio
de liberação de IFN-γ (IGRA), são os dois únicos testes disponíveis na identificação
de TB latente. Neste estudo, avaliamos se a infecção com Mtb induz uma resposta
celular capaz de reconhecer as duas proteínas recombinantes construídas por nosso
grupo, a rCMX (Ag85C_MPT-51_HspX) (DE SOUSA et al., 2012) e a rECMX
(ESAT-6_CMX) (BEILNER, 2015), para sua avaliação posterior na capacidade de
gerar uma reação de DTH positiva. Certamente, os camundongos infectados com Mtb
conseguiram responder ante as proteínas recombinantes, que quando usadas no teste
cutâneo, induziram uma reação de DTH positiva comparável, e no caso da rECMX,
melhor que o PPD convencional.
Sabendo que o diagnóstico de TB latente não possui um teste de referência, o
uso do IGRA foi recomendado para substituir ou auxiliar a PT. Todavia, diversas
questões foram originadas sobre as desvantagens do IGRA e a concordância entre
esses dois testes. Assim, observa-se discordância TST/IGRA (15-21%) em contatos de
TB ativa (JONES-LÓPEZ et al., 2015; RIBEIRO-RODRIGUES et al., 2014), o tempo
mais demorado para obter um resultado de IGRA (4-22 semanas) positivo em
comparação a PT (2-12 semanas), problemas de reprodutibilidade e casos de reversão
de positivo para negativo. No início, o uso do IGRA foi justificado por melhorar a
especificidade em comparação a PT, dessa forma, indivíduos vacinados com BCG
recentemente ou expostos a micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) não
seriam parte dos resultados falsos positivos. Porém, o alto custo do IGRA e a
complexidade necessária para realizá-lo, limitou seu uso em populações de renda alta.
Consequentemente, as avaliações do IGRA eram limitadas em populações com rendas
baixa e média, onde se apresenta alta incidência de TB. Atualmente, se sabe que o
IGRA não supera a sensibilidade da PT nestas populações (AUGUSTE et al., 2016;
JONES-LÓPEZ et al., 2015), e ainda a PT poderia ser utilizado nesses casos
(SHARMA et al., 2017). No entanto, o PPD já não é produzido comercialmente e
antígenos que possam substituí-lo vem sendo avaliados, sendo o único que atingiu
ensaios clínicos em humanos, o antígeno composto por ESAT-6 e CFP-10
(AGGERBECK et al., 2013).
51
A resposta celular anti-rCMX e anti-rECMX gerada pela infecção de
camundongos com Mtb foram avaliadas em baço, pulmões e linfonodos drenantes.
Ressaltando a importância das subpopulações Th1 e Th17 ao serem encontradas na
resposta em humanos e camundongos frente ao Mtb (BEAMER; TURNER, 2005;
O’GARRA et al., 2013; SERBINA; FLYNN, 1999). Apesar das proteínas
recombinantes não serem produzidas naturalmente pelo Mtb, tanto a rCMX como a
rECMX, foram reconhecidas pelo sistema imune de camundongos infectados com
Mtb. Esse resultado era esperado, uma vez que os antígenos liberados pelo Mtb são
importantes na geração de resposta imune celular, como acontece com os componentes
da rCMX, o complexo Ag85C e o MPT-51 são abundantes na cultura do Mtb
(HUYGEN, 2014; SUNDAR et al., 2015) e o HspX o mais abundante na fase de
latência (SINGH; SARAAV; SHARMA, 2014; SMITH, 2003). Além disso, Oliveira e
colaboradores (2016) observaram que células pulmonares de camundongos infectados
com Mtb reconheceram a rCMX (OLIVEIRA et al., 2016).
Já no caso da rECMX, podemos ressaltar que houve mais linfócitos CD4 e
principalmente CD8 produtores de IFN-γ específicos para rECMX, em comparação a
rCMX (Figura 10). Entre as duas proteínas recombinantes, a diferença está na
presença do antígeno ESAT-6, o qual tem sido reconhecido por células pulmonares de
camundongos infectados com Mtb (JUNG et al., 2005) e além do mais esse antígeno
está presente em todas as fases da TB (WINSLOW et al., 2008), esses fatos
explicariam a maior resposta obtida de células específicas para rECMX em
comparação à rCMX. Uma vez que as proteínas recombinantes foram reconhecidas em
nosso modelo murino de infecção com Mtb, pensando na aplicação delas em um teste
cutâneo para humanos, já alguns componentes das proteínas, como HspX e MPT-51,
têm sido reconhecidas por linfócitos de pacientes com TB (SILVA et al., 2014b;
DEENADAYALAN et al., 2013).
A resposta celular específica para rCMX e rECMX foi encontrada de forma
significativa em nosso estudo. Quando o teste cutâneo avaliou a reação de DTH
mediante a leitura da espessura e do inchaço no local de inoculação, as proteínas
recombinantes, induziram uma reação de DTH positiva comparável ao PPD. Assim, a
resposta celular obtida concorda com a reação de DTH, a qual se caracteriza pelo
recrutamento de células e de citocinas pró-inflamatórias liberadas no local de
inoculação, principalmente de linfócitos Th1 IFN-γ+ (VUKMANOVIC-STEJIC et al.,
2006). A reação de DTH positiva ocorre entre 24-48 horas após o teste cutâneo como
52
foi apresentado por outros autores (ALLEN, 2013; OBIEGLO et al., 2016). Já a forma
de avaliação precisa ser esclarecida. A espessura utiliza-se na avaliação de inflamação
diante diversos agentes como lesão por Leishmania (DE LIMA et al., 2014) ou artrite
reumatoide induzida (JUNG et al., 2015), mas também foi utilizado para avaliar a
reação de DTH (FEUERER et al., 2006). Outros autores, não diferenciam entre a
espessura e o inchaço (SMITH; WHITE, 2010). Já o inchaço, avaliado de forma
individual, considera-se como o líquido liberado pela reação de DTH (PONTON,
1983) e é o padrão de leitura para a maioria das avaliações de reação de DTH induzida
em coxim plantar de camundongos (GHOSH; GUPTA; ORTIZ-ORTIZ, 2000;
SMITHEY et al., 2015).
Da mesma forma, nossos resultados sugerem que a melhor avaliação ocorre a
partir da leitura do inchaço, uma vez que a resposta de DTH positiva induzida pela
rCMX e rECMX é mantida ao longo do tempo de avaliação (24-48 h após o teste
cutâneo). Além disso, observou-se que 48 h após o teste cutâneo já é possível
diferençar de forma significativa o resultado obtido entre os camundongos não
infectados que receberam o PPD (controle negativo) e os camundongos infectados que
também receberam PPD (controle positivo) (Figura 13).
Como apresentado na Figura 14, a reação de DTH positiva induzida pela
rECMX (25µg) supera o PPD 2UT (controle positivo), nas formas de avaliação de
espessura e inchaço, ao longo do tempo (24-48 h). Além disso, esses dados sugerem
que a rECMX apresenta uma resposta dose-dependente. Quando a ESAT-6 foi
utilizada para estimular Mφs derivados de medula óssea de camundongos, observou-se
a produção de MCP-1 de forma dose-dependente com o máximo de resposta 24 h após
a estimulação e uma diminuição significativa às 48h (MA et al., 2016). No entanto, a
resposta dose-dependente não é definitiva e pode ser independente da concentração
(DISIS et al., 2004). Sendo ou não dose-dependente, não poderíamos ter certeza da
concentração ótima em nosso modelo sem um teste de potência que possa avaliá-la. O
teste de potência avalia a concentração ótima do antígeno a diferentes diluições
quando comparado ao reagente de referência (PPD), como é frequentemente utilizado
em outros modelos animais, como cobaias (MON et al., 2014; MORADI et al., 2015).
As limitações encontradas no estudo relacionam-se ao modelo animal utilizado
na avaliação da reação de DTH, desde o lugar de aplicação, o volume do antígeno e a
leitura da espessura ou inchaço (FAQI, 2013; KUBICA; DUNBAR; KIM, 1973). O
protocolo de avaliação da reação de DTH em camundongos utiliza o mesmo antígeno
53
na sensibilização e elicitação da resposta (ALLEN, 2013), diferente de nosso modelo,
onde a infecção por via endovenosa com Mtb representou a sensibilização e o teste
cutâneo intradérmico, a elicitação da resposta. Por esse motivo, para reproduzir em
nosso modelo, a reposta em humanos, foi avaliado o teste cutâneo 45 dias após a
infecção, como já foi realizado em camundongos para avaliação de linfócitos de
memória tipo CD4 para KLH/OVA ou CD8 para poxvírus (SMITHEY et al., 2015).
O coxim plantar de camundongos é um dos locais recomendados para avaliar a
reação de DTH. O volume recomendado a ser utilizado em inoculações via
intradérmica em camundongos é de até 50 µL (ALLEN, 2013), volume que foi maior
no caso do estudo para conseguir avaliar de forma comparativa os grupos
experimentais e o PPD convencional. Enquanto à leitura, esta varia entre espessura e
inchaço, às vezes, sem ter diferença entre um ou outro parâmetro (GHOSH; GUPTA;
ORTIZ-ORTIZ, 2000; SMITH; WHITE, 2010; SMITHEY et al., 2015). Por esse
motivo, foram avaliadas a espessura e o inchaço, por duas pessoas diferentes. As
concentrações utilizadas de antígenos variam amplamente desde 1 µg/mL até 1 mg/mL
(MARASSI et al., 2011; MON et al., 2014). No caso do camundongo, é limitado
avaliar a concentração certa a utilizar, devido a quantidade de animais que seriam
necessários. A diferença de outros modelos de animais, onde mais de uma reação de
DTH pode ser avaliada.
O uso de proteínas recombinantes tem a vantagem de uma produção controlada
e de qualidade em comparação ao PPD (MALAGHINI et al., 2011; STAVRI et al.,
2012). Como perspectivas, outros sistemas de produção dessas proteínas
recombinantes podem ser avaliados, a concentração pode ser otimizada e a eficácia
testada em outros modelos animais. Dessa forma, as proteínas recombinantes, rCMX e
rECMX, são propostas como candidatas para substituir o PPD, principalmente usando
a rECMX a 25 µg, diante da sua capacidade de induzir uma reação de DTH positiva,
maior que a observada com o PPD convencional.
54
7 CONCLUSÕES
As proteínas rCMX e rECMX, foram reconhecidas por células do baço,
pulmões e linfonodos drenantes de camundongos BALB/c infectados com
Mycobacterium tuberculosis, e quando utilizadas no teste cutâneo, conseguiram
induzir uma resposta de DTH positiva comparável ao PPD, e superior ao PPD quando
usada a rECMX 25µg. Indicando que as proteínas recombinantes avaliadas, poderiam
ser candidatas na substituição do PPD da Prova Tuberculínica animal ou humana.
55
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67
ANEXOS
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética
68
69
70
71
72
Anexo 2 – Comprovante do artigo a ser submetido
Artigo - Development of recombinant fusion proteins to substitute PPD in the
tuberculin skin test
Autores - Tatiana Marlene Galvez Sánchez1, Adeliane Castro da Costa1, Monalisa
Martins Trentini 1, André Kipnis 2 and Ana Paula Junqueira Kipnis 1,2
Submissão - Journal Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.
We present the manuscript entitled “Development of recombinant fusion proteins to
replace PPD in the tuberculin skin test” with interest to publicate as basic research in
Journal Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.
Considering latent TB responsible of transmission focus of TB disease, to identify
these 1/3 of the population is relevant but limited in diagnosis with only TST and
IGRA as commercial test. We believe that an improvement on TST based on antigens
of Mtb could be favorable to apply this test in low income populations where high TB
burden is present and limited to IGRA. For this reason, this work evaluated
recombinant fusion proteins containing immunodominant antigens of Mtb in the aim
of generate a new TST in murine model.
We also declare that this information is part of original research without previous
publication and agreement with all authors.
73
Running title: Recombinant proteins CMX/ECMX in mice skin test
Title: Development of recombinant fusion proteins to substitute PPD in the
tuberculin skin test
Tatiana Marlene Galvez Sánchez1, Adeliane Castro da Costa1, Monalisa Martins
Trentini 1, André Kipnis 2 and Ana Paula Junqueira Kipnis 1,2
1
Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas, Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil.
2
Laboratório de Bacteriologia Molecular, Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil.
*Corresponding address: Rua 235, S/N. Laboratório de Imunopatologia das Doenças
Infecciosas, sala 325. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Universidade
Federal de Goiás. Setor Universitário, Goiânia- Goiás, Brazil. CEP 74605-050. Phone:
+556232096174; Fax: +55 62 32096363; E-mail: [email protected].
BACKGROUND: Latent tuberculosis infection (LTBI) could be identified by
tuberculin skin test (TST) or interferon gamma release (IGRA) assay, both with
limitations and lack of gold standar reference to be compared. OBJECTIVES: We
propose to evaluate the fusion proteins rCMX and rECMX in a tuberculin skin test
using the murine model of infection. METHODS: First, we evaluated if T
lymphocytes from BALB/c mice infected with Mycobacterium tuberculosis (Mtb) was
able to recognize the recombinant fusion proteins rCMX and rECMX. Second, we
evaluated the capacity of these recombinant fusion proteins to induce delayed
hypersensitivity (DTH) response in mice infected with Mtb. FINDINGS: CD4+IFN-γ+
and CD8+IFN-γ+ T lymphocytes of spleens, lungs and draining lymph nodes from
infected mice recognized specifically rCMX and rECMX. Skin test performed by
Mantoux technique using rCMX and rECMX, in the footpad, showed a positive DTH
response from infected mice when compared to the response elicited to unifected mice
that received PPD 2UT. The best results were obtained using 25 µg of rECMX at 24 h
and 15-25 µg of rECMX at 48 h pos skin test from footpad swelling evaluation.
MAIN CONCLUSIONS: These findings suggest that rCMX and rECMX could be
further tested as a component of the tuberculosis skin test.
Key words: Skin test, Delayed hypersensitivity, Mycobacterium tuberculosis, animal
model.
Sponsorships: This study received financial support from CNPq - Projeto Universal
(Edital MCT/CNPq Nº 14/2011) and Ana Paula Junqueira-Kipnis received a
productivity fellow from CNPq.
74