GH-LCS - Protocolos Laboratoriais - 2013
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Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana GENÉTICA HUMANA LICENCIATURA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE PROTOCOLOS LABORATORIAIS 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 1 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO – ESFREGAÇO BUCAL Citogene Buccal Kit § Esfregar 10 vezes a mucosa bucal com 2 escovas § Mergulhar as escovas 10 vezes em 400 µL de Cell Lysis Solution num microtubo de 1,5 mL § Ter o cuidado de escorrer bem as escovas para não perder líquido § Incubar durante 15’ a 65°C § Arrefecer a amostra § Adicionar 100 µL de Protein Precipitation Solution ao lisado celular § Agitar no vortex durante 20’’ para homogeneizar completamente § Colocar a amostra em gelo durante 5’ § Centrifugar durante 5’ a 12.000xg. O precipitado de proteínas deve apresentar-se acastanhado e consistente § Transferir o sobrenadante para microtubo de 1,5 mL e adicionar 450 µL de Isopropanol e 1 µL de Glicogénio (opcional) § Misturar a amostra cuidadosamente 50 vezes e manter o tubo à temperatura ambiente durante pelo menos 5’ § Centrifugar durante 10’ a 12.000xg § Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado ao ar durante 10-15’ § Adicionar 50 µL de DNA Hydration Solution COLHEITA DE DNA PARA PCR DIRECTO § Esfregar a mucosa bucal com uma zaragatoa estéril § Mergulhar em microtubo contendo 1 mL de soro fisológico estéril § Centrifugar durante 5’ a 12.000xg e retirar o sobrenadante § Ressuspender as células em 50 µL de H2O 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 2 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA § A partir da solução de DNA obtida, efectuar uma diluição de 1:50 em H2O. § Ler as absorvências em 280 e 260 nm contra um branco de H2O. § Calcular a concentração de DNA na solução obtida utilizando a seguinte fórmula: Concentração de DNA (µg / mL) = A260 x FD x 50 § Avaliar a qualidade da solução de DNA obtida por cálculo das razões de absorvência: A 260/A280 A280 Absorvência em 280 nm A260 Absorvência em 260 nm FD Factor de diluição 50 1 U de absorvência a 260 nm corresponde a uma solução de DNA com a concentração de 50 µg/mL A260 / A280 → 1,8 – 2,0 Controlo da integridade do DNA por electroforese em gel de agarose 1% (50 mL) § Pesar 0,5 g de agarose para matraz de 100 mL § Adicionar 50 mL de TBE 1X § Fundir a agarose no micro-ondas § Deixar arrefecer até ± 60°C § Adicionar brometo de etídio (10 mg/mL) para concentração final de 0,5 µg/mL § Verter no molde e colocar o pente para a formação dos poços § Após formação do gel colocá-lo na tina de electroforese e cobrir com tampão TBE 1X § Aplicar a mistura da solução de DNA com tampão de deposição (10 µL + 5 µL, respectivamente) em paralelo com um marcador de MM (λ DNA x HindIII) § Migrar a 80 - 100V durante 1-2 h § Visualizar o resultado por observação no ultravioleta e fotografar o gel 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 3 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana AMPLIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO DNA POR PCR Polymerase Chain Reaction Gene alvo: Tas2R38 (receptor do gosto tipo 2, membro 38) Primers : PTC_Fw CCT TCG TTT TCT TGG TGA ATT TTT GGG ATG TAG TGA AGA GGC GG PTC_Rev AGG TTG GCT TGG TTT GCA ATC ATC Dimensão esperada do fragmento a amplificar: 221 Meio de reacção § Num microtubo de 500 µL adicionar os seguintes reagentes: Concentração das soluções Concentração stock pretendida Água destilada estéril Tampão FlexiBuffern (5 X) 1x 1,5 mM Primer F (10 µM) 400 nM Primer R (10 µM) 400 nM MgCl2 (25 mM) 1,5 mM DNA genómico extraído de epitélio bucal Volume total amostras ------ dNTP Mix (100 mM) DNA Polimerase (5 U/µL) x ___ Volume para 1 amostra µ L 1 U / 25 µL ~ 400 ng 5 ---- 50,0 ------ Condições da reacção de PCR Temperatura Tempo Nº de Ciclos 95ºC 7 min 1 95ºC 30 seg 58ºC 30 seg 72ºC 30 seg 72ºC 7 min 1 4ºC ∞ ∞ 30 § Cobrir com 30 µL de parafina líquida (opcional, depende do tipo de termociclador) § Colocar os microtubos no termociclador e iniciar os ciclos de amplificação § No final retirar a fase aquosa inferior para novo microtubo e controlar a reacção em gel de agarose 2% (5 µL de produto de PCR), aplicando em paralelo um marcador de MM (pBR322 xMspI ou 100 bp ladder). 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 4 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana DETECÇÃO DE MUTAÇÕES/POLIMORFISMOS POR ENSAIOS DE RESTRIÇÃO PCR / RFLP § Determinação de perfil genético por hidrólise com enzima de restrição HaeIII (isolada da bactéria Haemophilus aegyptius) Enzima HaeIII 5’..GG↓CC.. 3’ Sequência-alvo 3’..CC↑GG.. 5’ Concentração 10 U / µl Por amostra H 2O x __ tubos µL µL µL (1x) µL µL (8 U) µL Produto de PCR 20 µL µL Volume Final 25 µL µL Tampão (10x) HaeIII (10 U/µL) § Incubar, no mínimo, 2h a 37ºC. § Parar a reacção por adição de 5 µL de solução de deposição (Nota: contém EDTA). § Analisar o produto da hidrólise em gel de agarose a 3%. 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 5 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DE DNA POR SSCP Single Strand Conformation Polymorphism Gel de poliacrilamida 8% (2 geis – 15 mL) § Acrilamida / bisacrilamida (37,5:1) 2,9 mL § TBE 10X 1,4 mL § EDTA 0,5M pH8,0 56 µL § Glicerol 700 µL § Água Milli Q 9,0 mL § Persulfato amónio 10% 100 µL § TEMED 10 µL Preparação da amostra § 15 µL produto PCR + 22 µL mix EDTA/SDS/LB Bleu § Homogeneizar § Desnaturar a 95°C durante 5 min § Colocar em gelo durante 5 min § Aplicar 15 µL no gel LB Bleu Formamida 19 mL Azul bromofenol 10 mg Xileno cianol 10 mg EDTA 0,5M pH8,0 800 µL EDTA/SDS 10X SDS 20% EDTA 0,5M pH8,0 500 µL 2 mL LB Bleu /EDTA/SDS 20 µL LB Bleu + 2 µL EDTA/SDS 10X Electroforese § Migração a 150 V durante 1-2 horas 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 6 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana Coloração com nitrato de prata (DNA Silver Staining kit – GE Healthcare) § Colocar o gel em tina e cobrir com solução de fixação 1X durante 10’. Retirar § Adicionar solução de coloração 1X e deixar 15’ em contacto ao abrigo da luz, agitando de vez em quando. Retirar § Lavar com água Milli Q durante 1’. Retirar § Adicionar solução revelação 1X. Agitar suavemente até aparecimento das bandas § Parar a reacção por adição de solução de paragem e preservação 1X e deixar actuar durante 15’ § Colocar o gel entre folhas de papel celofane e secar no secador de géis Solução de fixação 5X Ácido benzeno-sulfónico 3,0% (p/v) em etanol 24% (v/v) Solução de coloração 5X Nitrato prata 1,0% (p/v) Ácido benzeno-sulfónico 0,35% (p/v) Solução de carbonato sódio 5X Carbonato sódio 12,5% (p/v) Formaldeído 37% Formaldeído 37% (p/v) em água Tiossulfato de sódio 2% Tiossulfato sódio 2% (p/v) em água Solução de revelação 1X Carbonato sódio 5X 25 mL Tiossulfato sódio 2% 125 µL Formaldeído 37% 500 µL Água 100 mL Solução de paragem e preservação 5X Ácido acético 5% (v/v) Acetato sódio 25% (p/v) Glicerol 50% (v/v) 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 7 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS DE PCR EasySpin PCR Purification Kit Princípio O Kit EasySpin utiliza uma membrana de gel de sílica a qual adsorve seletivamente fragmentos de DNA mediante a utilização de tampões de ligação especialmente concebidos para esse efeito. Nucleótidos, oligonucleótidos, enzimas, óleo mineral e outras impurezas não aderem à membrana. § Transferir o produto de PCR para um microtubo de 1,5 mL e adicionar 3 volumes de Binding Buffer I § Transferir esta mistura para a coluna EasySpin e incubar 2 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a 10.000 rpm durante 2 minutos § Remover o líquido obtido pela centrifugação no tubo. Adicionar 500 µL de Wash Solution à coluna e centrifugar a 10.000 rpm durante 2 minutos § Repetir o procedimento de lavagem do ponto anterior. Centrifugar um minuto extra a 10.000 rpm a fim de remover todos os vestígios de solução de lavagem § Transferir a coluna para um novo microtubo de 1.5 mL e adicionar 30 – 50 µL de Elution Buffer. Incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar durante 2 minutos (10.000 rpm). § Guardar o DNA purificado a -20ºC Nota: É muito importante adicionar o Elution Buffer na parte central da coluna. A incubação da coluna a temperaturas mais elevadas (37 – 50ºC) poderá aumentar o rendimento do DNA purificado. Aquecimento prévio do Elution Buffer (55ºC – 80ºC) poderá também aumentar a eficiência do procedimento 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 8 Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana REGISTO DA SENSIBILIDADE GUSTATIVA À FENILTIOCARBAMIDA (PTC) § Com um cotonete limpo embeber nas diferentes soluções e registar com os símbolos “0”, “+”, “++” ou “+++”, de modo a identificar facilmente a sua sensibilidade gustativa. § Entre cada solução lavar a boca com água Taster / Soluçãoà A B C D E F G H I J nonTaster Nome e nº 3º Ano - 1º Semestre 2013 / 2014 9
