Lilian Wunsch Rocha

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-HIPERALGÉSICO DE
CHALCONAS BIOATIVAS FRENTE A DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTAIS DE DOR PERSISTENTE EM CAMUNDONGOS
LILIAN WÜNSCH ROCHA
Itajaí - 2011
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
LILIAN WÜNSCH ROCHA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-HIPERALGÉSICO DE
CHALCONAS BIOATIVAS FRENTE A DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTAIS DE DOR PERSISTENTE EM CAMUNDONGOS
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª. Dra. Nara Lins Meira
Quintão
Co-orientador: Profª. Dra. Kathryn Ana
Bortolini Simão da Silva
Itajaí, Fevereiro de 2012
Àquela que é minha inspiração constante:
Minha orientadora.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais por terem me dado a vida. Agradeço especialmente à minha mãe
pelas palavras de incentivo e por todos os sacrifícios feitos por ela para que eu me
tornasse uma pessoa melhor. Te amo!
À minha orientadora, que esteve sempre presente nos momentos em que mais
precisei. Pelo seu carinho, respeito, amizade, confiança, generosidade e
conhecimentos a mim conferidos. Obrigada pela oportunidade de trabalhar e
aprender contigo. Minha gratidão será eterna e espero um dia chegar a ser 10% da
grande profissional que és.
À professora Tânia Mari Bellé Bresolin e ao professor Valdir Cechinel Filho, pela
confiança, pela oportunidade de cursar disciplinas em horário de trabalho, além do
apoio financeiro sem o qual a realização deste sonho seria impossível.
À professora Fátima de Campos-Buzzi pelos compostos, pela amizade e pelas
importantes contribuições a este trabalho.
À minha co-orientadora, que chegou de mansinho e conquistou meu carinho e
amizade. Obrigada pelos conhecimentos transmitidos, pelas contribuições a este
trabalho, pelos cuidados com a minha saúde e pela “feirinha”. Sua história de vida
me dá forças para continuar perseguindo meu sonho.
Ao professor Rilton Alves de Freitas, pelos conhecimentos relacionados ao cultivo
celular e por me instigar a querer dar o melhor de mim.
À professora Márcia Maria de Souza, pelas contribuições ao trabalho.
Às minhas queridas amigas Ju Bagatini e Ju Nunes, por estarem presentes em toda
essa trajetória, me ouvindo, consolando, ajudando e tornando meus dias mais
alegres e felizes. Obrigada pela amizade sincera construída. Amo vocês!
Às minhas amigas Gi e Nicole, pelas palavras de incentivo, pela amizade e pelos
artiguinhos lindos.
Aos meus colegas do mestrado pelas discussões, risadas, conhecimentos
compartilhados e pelos “A”s que conquistamos juntos.
Aos demais professores do programa, pelos ensinamentos, críticas e elogios sempre
pertinentes.
Ao professor Thiago Mattar Cunha, por ter se disponibilizado a participar da
banca, certamente seus conhecimentos engrandecerão este trabalho.
“Suba o primeiro degrau com fé.
Não é necessário que você veja toda a escada.
Apenas dê o primeiro passo. ”
(Martin Luther King)
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-HIPERALGÉSICO DE
CHALCONAS BIOATIVAS FRENTE A DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTAIS DE DOR PERSISTENTE EM CAMUNDONGOS
Lilian Wünsch Rocha
Fevereiro/2012
Orientadora: Nara Lins Meira Quintão, Dra.
Co-orientador: Kathryn Ana Bortolini Simão da Silva, Dra.
Área de Concentração: Farmacologia Autonômica.
Número de Páginas: 95
As chalconas são moléculas que vêm sendo amplamente estudadas pela comunidade
científica e que já apresentam atividade farmacológica comprovada, tais como antiinflamatória,
antitumoral, antibacteriana, antioxidante, entre outras. A proposta deste estudo foi contribuir para a
validação da possível atividade anti-hiperalgésica de duas chalconas, (2E)-1-(4-aminofenil)-3-(4nitrofenil)prop-2-en-1-ona – ANCh, e N-{4-[(2E)-3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil}acetamida - AcANCh,
frente a diferentes modelos de dor persistente em camundongos, além de tentar identificar seu
mecanismo de ação, bem como possíveis efeitos indesejáveis. Para tal, foram utilizados
camundongos C57BL/6 machos e fêmeos (20-30g, n=6). Para verificar a atividade anti-hiperalgésica
dos compostos, foram utilizados os modelos de hiperalgesia induzidos por carragenina (300 µg/pata),
Adjuvante completo de Freund (CFA) (20 µL/pata), lipopolissacarídeo (LPS) (100 ng/pata), bradicinina
(BK) (500 ng/pata), prostaglandina E2 (PGE2) (3 nmol/pata), epinefrina (100 ng/pata), fator de necrose
tumoral α (TNF-α) (40 pg/pata), interleucina 1 β (IL1-β) (20 pg/pata), quimiocina derivada de
queratinócito (KC) (20 pg/pata), ligação parcial do nervo ciático (LPNC) e dor induzida por células
5
tumorais (B16F10, 2x10 céls). A sensibilidade mecânica foi avaliada por meio de filamentos de Von
Frey (0,6g). Foram também realizados os testes bioquímicos, como a dosagem da citocina IL1-β e
avaliação da migração de neutrófilos através da quantificação da enzima mieloperoxidase (MPO).
Finalmente, foram realizados testes a fim de verificar os possíveis efeitos indesejáveis relacionados
ao tratamento, como a atividade locomotora, placa quente e temperatura corporal. O composto ANCh
foi eficaz em reduzir a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina com inibições de 40 ± 4 %, 43
± 3 % e 36 ± 4 % nas doses de 1,11, 3,72 e 11,18 µmol/kg, respectivamente. Resultados
semelhantes foram encontrados para o composto AcANCh (35 ± 8 %, 36 ± 7 % e 45 ± 9 %), nas
doses de 0,96, 3,22 e 9,66 µmol/kg, respectivamente. Na hiperalgesia induzida pelo CFA (20 µL/pata)
os compostos ANCh e AcANCh também foram significativamente ativos quando administrados
preventivamente (18 ± 5% e 19 ± 7%, respectivamente nas maiores doses) ou de forma curativa (44 ±
9 %, 43 ± 2 %, 41 ± 1 % para ANCh e 13 ± 5 %, 24 ± 6 % e 36 ± 6 % para AcANCh). Resultados mais
expressivos foram encontrados para o modelo de dor neuropática induzida pela ligação parcial do
nervo ciático (LPNC), onde as porcentagens de inibição foram de 31 ± 7 %, 43 ± 7 % e 66 ± 8 % para
ANCh e 25 ± 6 %, 39 ± 5 % e 60 ± 4 % para AcANCh. No modelo de dor neoplásica, os compostos
também foram efetivos em inibir a hiperalgesia mecânica, com inibições de 13 ± 8 %, 18 ± 5 % e 52 ±
6 % para ANCh e 8 ± 3 %, 25 ± 7 % e 28 ± 8 % para AcANCh. ANCh e AcANCh foram eficazes
também em reduzir a frequência de resposta de retirada da pata nos modelos de dor induzida por IL-
1β (42 ± 5 % e 42 ± 7 %, respectivamente nas maiores doses) TNF-α (43 ± 11 % e 39 ± 11 %,
respectivamente nas maiores doses) e epinefrina (46 ± 8 % e 40 ± 7 % nas maiores doses).
Contrariamente aos resultados já apresentados, na dor induzida por LPS, BK e KC os compostos não
apresentaram atividade. Avaliando a capacidade destas chalconas em inibir a produção da citocina
IL-1β, observou-se que ambas foram efetivas (49 ± 4 % e 64 ± 2 %, respectivamente). Ademais,
somente o composto ANCh foi eficaz em inibir a migração de neutrófilos com inibição de 67 ± 4 % e a
hiperalgesia induzida pela PGE2 (59 ± 4 %) na dose de 11,18 µmol/kg . Com relação aos efeitos
indesejáveis relacionados ao tratamento, os compostos não provocaram alterações nos animais,
sugerindo, juntamente com os demais resultados, que ambos os compostos testados podem ser uma
interessante alternativa para o tratamento de processos dolorosos crônicos.
Palavras-chave: Chalconas. Dor. Hiperalgesia. Neuropatia.
8
EVALUATION OF THE ANTIHYPERALGESIC POTENTIAL OF
BIOACTIVE CHALCONES ON SEVERAL MODELS OF CHRONIC
PAIN IN MICE
Lilian Wünsch Rocha
February/2012
Supervisor: Nara Lins Meira Quintão, PhD.
Co-supervisor: Kathryn Ana Bortolini Simão da Silva, PhD.
Area of Concentration: Autonomic Pharmacology.
Number de Pages: 95
Chalcones are molecules that have been widely studied by the scientific community, which
has already proven its pharmacological activities; such has anti-inflammatory, antitumor, antibacterial,
antioxidant activities, among others. The purpose of this study was to contribute to the validation of the
potential anti-hyperalgesic activity of two chalcones, (2E)-1-(4-aminophenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2en-1-one – ANCh and N-{4-[(2E)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enoil]phenyl}acetamide - AcANCh, compared
using different models of persistent pain in mice, and try to identify their mechanism of action and
possible side effects. C57BL/6 mice male and female (20-30g, n=6) mice were used. To verify the
anti-hyperalgesic activity of the compounds, the following models were used: carrageenan (300
µg/paw), CFA (20 µL/paw), LPS (100 ng/paw), BK (500 ng/paw), PGE2 (3 nmol/paw), epinephrine (100
ng/paw), TNF-α (40 pg/paw), IL1-β (20 pg/paw), KC (20 pg/paw), partial sciatic nerve ligation (PSNL)
and pain induced by tumor cells (B16F10, 2x105 cells). The mechanical sensitivity was assessed using
Von Frey hairs (0,6g). Biochemical tests were also carried out, such as the determination of cytokine
IL-1β and assessment of neutrophil migration by quantification of the myeloperoxidase enzyme. ANCh
was effective in reducing mechanical hyperalgesia induced using the carrageenan model, with
inhibition of 40 ± 4%, 43 ± 3% and 36 ± 4% at doses of 1.11, 3.72, 11.18 µmol/kg, respectively .
Similar results were found for AcANCh (35 ± 8%, 36 ± 7 and 45 ± 9%) at doses of 0.96, 3.22 and 9.66
µmol/kg, respectively. In hyperalgesia induced by CFA (20 mL/paw), ANCh and AcANCh were also
significantly active when administered in prevention (18 ± 5% and 19 ± 7%, respectively at higher
doses) or healing (44 ± 9%, 43 ± 2% , 41 ± 1% for ANCh and 13 ± 5%, 24 ± 6% and 36 ± 6% for
AcANCh). More significant results were found using the model of neuropathic pain induced by partial
sciatic nerve ligation (PSNL), where the percentages of inhibition were 31 ± 7%, 43 ± 7% and 66 ± 8%
for ANCh and 25 ± 6 %, 39 ± 5% and 60 ± 4% for AcANCh. In the neoplasic pain model, the
compounds were also effective in inhibiting mechanical hyperalgesia, with inhibitions of 13 ± 8%, 18 ±
5% and 52 ± 6% for ANCh and 8 ± 3%, 25 ± 7% and 28 ± 8 % for AcANCh. ANCh and AcANCh were
also effective in reducing the frequency of paw withdrawal response in models of pain induced by IL1β (42 ± 5% and 42 ± 7%, respectively, at the highest doses), TNF-α (43 ± 11% and 39 ± 11 %,
respectively, at the highest doses) and epinephrine (46 ± 8% and 40 ± 7%, at the highest doses).
Contrary to previous results using pain induced models, LPS, BK and KC showed no activity.
Assessing the capacity of chalcones to inhibit the production of IL-1β, we observed that both were
effective (49 ± 4% and 64 ± 2%, respectively). Moreover, only ANCh was effective in inhibiting
neutrophil migration, with an inhibition of 67 ± 4% and hyperalgesia induced by PGE2 (59 ± 4%) at
9
dose of 11.18 µmol/kg. In order to verify possible undesired events related to treatment, compounds
caused no changes in animals, suggesting, along with the other results, that both compounds tested
can be an interesting alternative for the treatment of chronic painful processes.
Key Words: Chalcones. Pain. Hyperalgesia. Neuropathy.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Organização laminar do corno dorsal da medula espinhal . ....................... 21
Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de transmissão e percepção
do processo doloroso ........................................................................................ 23
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo de sensibilização dos
nociceptores por células cancerígenas . ............................................................ 30
Figura 4. Representação esquemática da estrutura geral das chalconas.. ............... 34
Figura 5. Esquema da rota de síntese das chalconas avaliadas. .............................. 41
Figura 6. Inoculação intraplantar das células de melanoma murino B16F10. .......... 46
Figura 7. Representação da estimulação mecânica na pata do camundongo
utilizando-se o monofilamento de Von Frey 0,6g. ............................................. 47
Figura 8. Efeito anti-hiperalgésico da chalcona ANCh sobre a hiperalgesia mecânica
induzida pela injeção i.pl. de carragenina . ........................................................ 52
Figura 9. Efeito anti-hiperalgésico da chalcona AcANCh sobre a hiperalgesia
mecânica induzida pela injeção i.pl. de carragenina . ........................................ 53
Figura 10. Efeito anti-hiperalgésico das chalconas ANCh e AcANCh sobre a
hiperalgesia mecânica induzida pela injeção i.pl. de CFA ................................. 54
Figura 11. Efeito anti-hiperalgésico da chalcona ANCh sobre a hiperalgesia
mecânica induzida pela injeção i.pl. de CFA . .................................................... 56
Figura 12. Efeito anti-hiperalgésico da chalcona AcANCh sobre a hiperalgesia
mecânica induzida pela injeção i.pl. de CFA . .................................................... 57
Figura 13. Efeito anti-hiperalgésico das chalconas ANCh e AcANCh sobre a
hiperalgesia mecânica induzida pela injeção i.pl. de LPS . ................................ 58
Figura 14. Efeito anti-hiperalgésico das chalconas ANCh e AcANCh sobre a
hiperalgesia mecânica induzida pela LPNC . ..................................................... 60
Figura 15. Efeito anti-hiperalgésico das chalconas ANCh e AcANCh sobre a
hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes álgicos ........................ 61
11
Figura 16. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada nos
grupos controle, os quais receberam a injeção i.pl. de diferentes concentrações
da linhagem celular B16F10 ou meio de cultura utilizado como veículo para as
células.. .............................................................................................................. 62
Figura 17. Representação da medida das patas injetadas com células B16F10 no
aparelho Pletismômetro, onde o volume expresso em microlitros é dado como a
diferença entre as patas posteriores direita e a esquerda. ................................. 63
Figura 18. Volume da pata dos animais, avaliado do 3º ao 28º dia após a injeção i.pl.
das células tumorais........................................................................................... 64
Figura 19. Efeito anti-hiperalgésico da chalcona ANCh sobre a hiperalgesia
mecânica induzida pela injeção i.pl. de B16F10 (2x105 cél.). ............................ 65
Figura 20. Efeito anti-hiperalgésico da chalcona AcANCh sobre a hiperalgesia
mecânica induzida pela injeção i.pl. de B16F10 (2x105 cél.) . ........................... 66
Figura 21. Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre os níveis de IL-1β 4 horas
após injeção i.pl. de carragenina (300 μg/pata). ................................................ 67
Figura 22. Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a atividade da
mieloperoxidase 6 horas após injeção i.pl. de carragenina (300 μg/pata).......... 68
Figura 23. Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a atividade locomotora dos
animais.. ............................................................................................................. 68
Figura 24. Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a latência de resposta dos
animais.. ............................................................................................................. 69
Figura 25. Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a temperatura corporal dos
animais. .............................................................................................................. 69
12
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES- Antiinflamatório não esteroidal
AcANCh- N-{4-[(2E)-3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil}acetamida
AMPA- Ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico
ANCh - (2E)-1-(4-aminofenil)-3-(4-nitrofenil)prop-2-en-1-ona
ANOVA- Análise de variância
ATP- Trifosfato de adenosina
AUC- Área sob a curva
BDNF- Fator neurotrófico derivado do cérebro
BK- Bradicinina
cAMP- Monofosfato de Adenosina Cíclico
CCD- Cromatografia em camada delgada
CFA- Adjuvante completo de Freund
CGRP- Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX-2- Ciclooxigenase 2
CRP- Proteína C reativa
CXCL/1- Ligante de quimiocina 1
DMSO- Dimetilssulfóxido
DRG- Gânglio da raiz dorsal
EPM- Erro padrão da média
ERK- Proteína quinase regulada por sinal extracelular
FDA- Food and Drug Administration
GABA- Ácido aminobutírico
GDNF- Fator neurotrófico derivado da glia
IASP- Associação Internacional para o Estudo da Dor
IL- Interleucina
i.p.- Intraperitonial
i.pl.- Intraplantar
JNK- Proteína quinase N-terminal c-Jun
KC- Quimiocina derivada de queratinócito
5-LOX- Lipoxigenase 5
LPNC- Ligação parcial do nervo ciático
LPS- Lipopolissacarídeo
13
MAPK- Proteína quinase ativada por mitógeno
MCP-1- Proteína quimiotáxica de monócitos 1
MMP-9- Matriz metaloproteinase 9
MPO- Mieloperoxidase
NF-ĸB- Fator Nuclear ĸB
NGF- Fator de crescimento neural
NK- do inglês “Natural Killer”
NKA- Neurocinina A
NMDA- N-metil-D-aspartato
NO- Óxido nítrico
NOS- Óxido nítrico sintase
PAF- Fator ativador de plaquetas
PBS- Salina tampão fosfato
PGE2- Prostaglandina E2
PKA- Proteína quinase A
PKC- Proteína quinase C
RNS- Espécie reativa de nitrogênio
ROS- Espécie reativa de oxigênio
s.c- Subcutâneo
SC- Sistema complemento
SNC- Sistema nervoso central
SNP- Sistema nervoso periférico
SP- Substância P
TGF-β- Fator de transformação de crescimento β
TLR4- Receptor toll like tipo 4
TrkA- Receptor tirosina quinase A
TNF-α- Fator de necrose tumoral α
TRP- Receptor potencial transitório
TRPV1- Receptor de Potencial Transitório Vanilóide Tipo 1
VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular
v.o- Via oral
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 18
2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 18
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 18
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 19
3.1 Dor Crônica ......................................................................................................... 23
3.2 A dor inflamatória ................................................................................................ 24
3.3 A dor neuropática ................................................................................................ 25
3.4 A dor do câncer ................................................................................................... 28
3.5 Tratando a dor ..................................................................................................... 31
3.6 Chalconas ........................................................................................................... 33
3.6.1 Propriedades Biológicas ................................................................................... 34
3.6.2 Dos compostos em estudo ............................................................................... 38
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 41
4.1 Substâncias e Reagentes.................................................................................... 41
4.2 Obtenção dos Compostos ................................................................................... 41
4.3 Análise “In silico” ................................................................................................. 42
4.3.1 Regra dos cinco de Lipinski .............................................................................. 42
4.4 Ensaios in vivo .................................................................................................... 42
4.4.1 Animais............................................................................................................. 42
4.4.2 Avaliação da Atividade Anti-hiperalgésica ........................................................ 43
4.4.2.1 Hiperalgesia mecânica induzida pela Carragenina........................................ 43
4.4.2.2 Hiperalgesia mecânica induzida pelo adjuvante completo de Freund (CFA) 43
4.4.2.3 Hiperalgesia mecânica induzida por LPS ...................................................... 44
4.4.2.4 Hiperalgesia mecânica induzida pela ligação parcial do nervo ciático (LPNC)
.................................................................................................................................. 44
4.4.2.5 Hiperalgesia mecânica induzida por BK, CXCL1/KC, TNF-α, IL1-β, PGE2 e
epinefrina................................................................................................................... 45
4.4.2.6 Hiperalgesia mecânica induzida por células tumorais B16F10 ..................... 45
4.4.2.6.1 Cultivo Celular ............................................................................................ 45
4.4.2.6.2 Indução da hiperalgesia ............................................................................. 46
15
4.4.3 Análise do limiar mecânico através do filamento de von Frey .......................... 46
4.5 Ensaios bioquímicos............................................................................................ 47
4.5.1 Dosagem de citocina ........................................................................................ 47
4.5.2 Medida da atividade da mieloperoxidase ......................................................... 48
4.6 Avaliação dos possíveis efeitos indesejáveis do tratamento com as chalconas . 48
4.6.1 Atividade locomotora (campo aberto) ............................................................... 48
4.6.2 Placa Quente .................................................................................................... 49
4.6.3 Avaliação da Temperatura Corporal ................................................................. 49
4.7 Análise estatística ............................................................................................... 50
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 51
5.1 Análise “in silico” ................................................................................................. 51
5.2 Ensaios in vivo .................................................................................................... 52
5.2.1 Hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina ........................................... 52
5.2.2 Hiperalgesia mecânica induzida pelo CFA ....................................................... 54
5.2.3 Hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS ....................................................... 58
5.2.4 Hiperalgesia induzida pela ligação parcial do nervo ciático (LPNC)................. 58
5.2.5 Hiperalgesia mecânica induzida por IL1-β, TNF-α, CXCL1/KC, epinefrina, BK e
PGE2 ......................................................................................................................... 61
5.2.6 Padronização experimental .............................................................................. 61
5.2.7 Hiperalgesia induzida por B16F10.................................................................... 64
5.2.8 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre os níveis de IL-1β .................... 67
5.2.9 Medida da atividade da mieloperoxidase ......................................................... 67
5.2.10 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a atividade locomotora (campo
aberto) ....................................................................................................................... 68
5.2.11 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a latência de resposta dos
animais na Placa Quente .......................................................................................... 69
5.2.12 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a temperatura corporal dos
animais ...................................................................................................................... 69
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 71
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 83
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 85
16
1 INTRODUÇÃO
A dor crônica tem aumentado em prevalência em todo o mundo e a
Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), relatou que uma em cada
cinco pessoas sofre de dor moderada a grave, e uma em cada três são incapazes de
manter um estilo de vida adequado. Além disso, a maioria das pessoas que sofrem
deste tipo de dor são incapazes de realizar exercícios, dormir normalmente,
relacionar-se socialmente, e executar tarefas do dia-a-dia como caminhar ou dirigir
um carro (ABU-SAAD, 2010).
A nocicepção envolve interações complexas de estruturas do sistema nervoso
central (SNC) e periférico (SNP), se estendendo pela pele, vísceras e tecidos
musculoesqueléticos até o córtex cerebral. A caracterização detalhada dos
mecanismos que sustentam a excitabilidade do nociceptor já são bem conhecidos e
a identificação de vários canais iônicos, receptores e moléculas de sinalização de
segundos mensageiros contribuíram muito no desenvolvimento de intervenções
terapêuticas eficazes para o tratamento da dor, porém as mesmas ainda apresentam
consideráveis efeitos advérsos (RIEDEL; NEECK, 2001; GOLD; GEBHART, 2010).
A comunidade científica tem realizado incessantes pesquisas a fim de
desenvolver novos fármacos eficazes contra algumas patologias ainda sem
tratamento adequado, como é o caso da dor crônica. A síntese orgânica tem
contribuído significativamente neste aspecto, tendo grande importância por realizar
as modificações químicas necessárias para transformar a estrutura química de uma
substância em outra de melhor perfil terapêutico, além de diminuir o tempo e o custo
da produção de medicamentos, o que favorece a indústria farmacêutica.
(BARREIRO, 1991; MENEGATTI; FRAGA; BARREIRO, 2001; CECHINEL FILHO;
CAMPOS; CORRÊA, 2001; CORREIA; COSTA; FERREIRA, 2002).
Nos últimos anos houve um crescente interesse dos pesquisadores por
pequenas moléculas bioativas, como as chalconas. Estas moléculas ocorrem
naturalmente e são precursoras da biossíntese dos flavonoides em plantas
superiores. Pelo fato de apresentarem estruturas químicas relativamente simples, a
síntese destas moléculas em laboratório permitiu um grande avanço nos estudos
com essa classe de compostos (NI; MENG; SIROSKI, 2004; CAMPOS-BUZZI et al.,
2007; ROMAGNOLI et al.; 2009). Hoje se sabe que as chalconas, tanto de origem
17
natural
quanto
sintética,
são
moléculas
muito
versáteis
fisiologicamente,
apresentando diferentes atividades biológicas já comprovadas como antineoplásica
(HSU et al., 2006; MODZELEWSKA et al., 2006; SAXENA et al., 2007), antiinflamatória (FURUSAWA et al., 2009), antinociceptiva (CAMPOS-BUZZI et. al.
2007; SANTOS et. al., 2001; SANTOS et al., 2008), antiangiogênica (MOJZIZ et al.,
2008; PILATOVA et al., 2010), antibacteriana (SIVACUMAR et al., 2010),
antimalárica (BHATTACHARYA et al., 2009), antifúngica (LÓPEZ et al., 2001),
antiprotozoárica (NIELSEN et al., 1998), antipigmentar (SEO et al., 2010), entre
outras.
Sem sombra de dúvidas, a dor crônica é um problema de saúde pública que
necessita da atenção dos pesquisadores para a busca de fármacos mais eficazes e
com efeitos colaterais reduzidos, que possam prover uma melhor qualidade de vida
para os pacientes. Considerando o fato de existirem evidências farmacológicas
demonstrando o vasto potencial terapêutico das chalconas, o presente trabalho teve
como objetivo avaliar o potencial anti-hiperalgésico de duas chalconas sintéticas em
diferentes modelos animais de dor persistente, visto que sua ação anti-nociceptiva
em modelos agudos de dor já foi comprovada (CAMPOS-BUZZI et. al., 2007;
CAMPOS-BUZZI, 2007).
18
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito anti-hiperalgésico de duas chalconas sintéticas, ANCh e
AcANCh, frente a diferentes modelos experimentais de dor persistente em
camundongos.
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar o efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a hiperalgesia mecânica
induzida pela injeção i.pl. de carragenina;
• Avaliar o efeito dos tratamentos preventivo e curativo com os compostos ANCh e
AcANCh frente ao modelo de hiperalgesia mecânica induzida pela injeção i.pl. de
adjuvante completo de Freund (CFA);
• Verificar o efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a hiperalgesia mecânica
induzida pela injeção i.pl. de lipopolissacarídeo (LPS);
• Avaliar o efeito dos compostos ANCh e AcANCh frente a hiperalgesia mecânica
persistente induzida pela ligação parcial do nervo ciático (LPNC);
• Avaliar o efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a hiperalgesia mecânica
induzida por citocinas (IL-1β, TNF-α), quimiocina (CXCL1/KC), epinefrina, bradicinina
(BK) e prostaglandina E2 (PGE2);
• Analisar o efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a hipersensibilidade
mecânica induzida por melanoma em camundongos;
• Verificar o papel da citocina IL-1β e da migração de neutrófilos no possível efeito
anti – hiperalgésico dos compostos ANCh e AcANCh;
• Estimar a capacidade de absorção e de permeabilidade de acordo com os
parâmetros estipulados na regra dos 5 de Lipinski.
• Investigar o possível envolvimento de efeitos centrais relacionados com o
tratamento com os compostos ANCh e AcANCh.
19
3 REVISÃO DA LITERATURA
Ao longo de bilhões de anos, as mais variadas formas de vida se
estabeleceram no planeta Terra. A evolução dos seres vivos ao longo dos séculos e
a origem da vida são temas de grandes discussões ainda nos dias de hoje.
Cientistas tentam explicar como distintos ambientes passaram a abrigar e a fornecer
as condições necessárias para a manutenção de determinadas espécies e como os
seres vivos conseguiram se adaptar e evoluir ao longo dos anos. O que já se sabe é
que os recursos fornecidos pelo planeta são limitados e que para poderem
sobreviver, as espécies precisam competir por água, alimento e nichos ecológicos.
Dentro deste paradigma, Charles Darwin, em 1859, publicou seu livro A Teoria das
Espécies, no qual relatou: “Quando refletimos sobre esta luta universal, podemos
consolar-nos com a certeza de que os seres vivos vigorosos, sadios e afortunados
sobreviverão e se multiplicarão.” (DARWIN, 1859, p. 91).
Vários mecanismos fisiológicos foram desenvolvidos pelos animais ao longo
do processo de seleção natural para que pudessem permanecer vigorosos e sadios,
os quais foram também os responsáveis por conferir às espécies a capacidade de
adaptação, sobrevivência e evolução ao longo dos tempos. Um dos mecanismos de
proteção desenvolvidos foi a sensação de dor, o qual ocupa lugar de destaque, pois
constitui um instrumento que possibilita a detecção dos estímulos físicos e químicos
nocivos, estabelece situações com limiares específicos e organizados, além de
sensibilizar sistemas que protegem o indivíduo contra futuras lesões. Através de
vários mecanismos, promove ao indivíduo a consciência de que sua integridade
física está sendo ameaçada ou que ocorre alguma disfunção no seu organismo
(WOOLF; SALTER, 2000; TEIXEIRA, 2009; FERREIRA et al., 2009).
O processo doloroso pode ser caracterizado como uma experiência complexa
de percepção, que envolve tanto eventos centrais quanto periféricos e que pode ser
modulado a diversos níveis. Atualmente, a IASP a define como sendo uma sensação
ou experiência emocional desagradável, associada com dano tecidual real ou
potencial, ou descrita nos termos de tal dano (LOESER; TREEDE, 2008; MOFFAT;
RAE, 2011). Do ponto de vista neurobiológico, a dor pode ser compreendida como:
(1) Sistema fisiológico e protetor de alerta, essencial para detectar e minimizar o
contato com estímulos nocivos (dor nociceptiva); (2) Sistema adaptativo e protetor
20
que é acionado quando há lesão tecidual e consequente liberação de células do
sistema imune neste local, levando a um aumento da sensibilidade sensorial (dor
inflamatória); ou (3) Processo resultante do funcionamento anormal do SNC (dor
patológica). A dor patológica pode ocorrer devido a danos no SNC e SNP, dando
origem à dor neuropática, entretanto, também ocorre em condições em que não há
danos ou inflamação (dor disfuncional), como é o caso da fibromialgia, síndrome do
intestino irritável, cistite intersticial, entre outras (WOOLF, 2010).
A dor nociceptiva, também conhecida como fisiológica, não é considerada um
problema clínico, mas desempenha um importante papel em manter a integridade do
organismo. Contudo, a incapacidade de perceber a dor nociceptiva, pode resultar
em auto-mutilações, fraturas ósseas, amputações, cicatrizes múltiplas e até em
morte prematura (WOOLF, 2010). As células responsáveis por codificar estímulos
potencialmente nocivos são os neurônios nociceptivos localizados no SNP.
Diferentes estímulos podem ativar os nociceptores, que são terminações nervosas
periféricas dos neurônios nociceptivos e agem como um receptor sensorial, os quais
estão localizados por todo o corpo, inervando a pele, músculos, articulações e
órgãos internos (JULIUS; BASBAUM, 2001; LOESER; TREEDE, 2008; DUBIN;
PATAPOUTIAN, 2010).
Os neurônios sensoriais, ou aferentes primários, podem ser classificados
pelos seus alvos periféricos (por exemplo, existem aferentes viscerais, articulares e
cutâneos), pela sua velocidade de condução (a qual é relacionada com o tamanho e
mielinização da fibra), propriedade de resposta (incluindo a modalidade sensorial e a
intensidade do estímulo necessário para ativá-los) e o fenótipo neuroquímico (como
a expressão de peptídeos) (TODD, 2010). De acordo com sua função na transdução
de informações sensoriais nas terminações aferentes primárias, antes da sua
transmissão à medula espinhal, podem ser classificados em três classes: fibras de
pequeno diâmetro, amielinizadas e com velocidade de condução de 2 m/s (fibras C);
fibras de médio diâmetro, discretamente mielinizadas e com velocidade de condução
de 25 a 50 m/s (fibras A-δ); ou fibras de grande diâmetro, intensamente mielinizadas
e com elevada velocidade de condução (fibras A-α e A-β), responsáveis pela
informação proprioceptiva (toque e pressão) (JULIUS; BASBAUM, 2001; BASBAUM
et al., 2009; TEIXEIRA, 2009).
Os nociceptores polimodais (ativados por uma variedade de estímulos
químicos, mecânicos e térmicos) e as fibras amielinizadas (tipo C) de pequeno e
21
médio diâmetro, representam a maior parte dos nociceptores. As fibras sensoriais do
tipo C merecem destaque, pois apresentam capacidade de respostas distintas
conforme o tipo de estímulo. Além disso, as fibras C têm caráter polimodal e podem
ser divididas em duas classes: uma população peptidérgica, ou seja, capaz de
liberar os neuropeptídeos substância P (SP), neurocinina A e o peptídeo relacionado
ao gene da calcitonina (CGRP), além de expressar os receptores do tipo tirosina
quinase (TrkA) para o fator de crescimento neural (NGF); ou ainda como uma
população não-peptidérgica, que responde às neurotrofinas neurturina, artemina e
ao fator neurotrófico derivado da glia (GDNF) (COSTIGAN; WOOLF, 2000; JULIUS;
BASBAUM, 2001; GOLD; GEBHART, 2010).
Os aferentes primários, que inervam a pele e os tecidos mais profundos do
corpo, transmitem informações sensoriais que são percebidas pelos neurônios do
corno dorsal da medula espinhal. Estes aferentes primários terminam com um
padrão específico de distribuição na medula que é determinado pela sua modalidade
sensorial e pela região do corpo que inervam. Em geral, fibras que apresentam baixo
limiar de ativação se estendem desde a lâmina III até a lâmina V, conforme ilustrado
na figura 1. Já as fibras nociceptivas e termoreceptoras Aδ e C inervam a lâmina I e
II (TODD, 2010).
Figura 1. Organização laminar do corno dorsal da medula espinhal. a Substância cinzenta da
medula espinhal dividida em uma série de lâminas paralelas de acordo com as variações de
densidade e tamanho dos neurônios marcados com anticorpo. b São demonstradas as terminações
centrais dos principais tipos de aferentes primários. Fonte: Adaptado de TODD, 2010.
22
A ativação dos nociceptores requer que um determinado estímulo (como por
exemplo, temperaturas extremas (> ~ 40 – 45 °C ou < ~ 15 °C), pressão intensa e
produtos químicos) despolarize os terminais periféricos com suficiente amplitude e
duração (Fig. 2). Estes estímulos intensos alteram as propriedades de condutância
da membrana e a atividade da bomba eletromagnética dos nociceptores,
deflagrando potenciais de geração que, quando somados, desencadeiam os
potenciais de ação.
Estes estímulos são convertidos em atividade elétrica pelo
receptor potencial transitório (TRP) e pelos canais purinérgicos. Os canais de sódio
amplificam essa atividade, dissipando os potenciais de ação. Este estágio do
processamento doloroso é conhecido como transdução. Em seguida, ocorre a
transmissão direta de estímulos do nociceptor aferente primário (fibras A-δ e C) para
o corno dorsal da medula espinhal, ascendendo pelo trato espinotalâmico lateral até
o tálamo lateral (implicado no processamento dos aspectos sensoriais e
discriminativos da dor), ou através do trato espinoparabraquial até o tálamo medial e
sistema límbico. E, finalmente no córtex o estímulo é reconhecido como doloroso, ou
seja, ocorre a percepção da dor (HOLDEN; PIZZI, 2003; TEIXEIRA, 2009; DUBIN;
PATAPOUTIAN, 2010; KUNER, 2010; MOFFAT; RAE, 2011).
Embora não haja absoluta clareza anatômica acerca dos sistemas de
transferência nociceptiva, duas dimensões da dor podem ser distinguidas: o
componente sensorial-discriminativo da nocicepção, que ocorre no tálamo, e o
afetivo-cognitivo, percebido pelo córtex. A percepção e a detecção de estímulos
nocivos dependem de sua intensidade, localização, duração e qualidade da dor (que
compreende a relação entre a atenção e memória da dor, a capacidade de enfrentar
e suportar a dor e sua racionalização). Todos estes componentes têm
representações diferentes de indivíduo para indivíduo (RIEDEL; NEECK, 2001).
A função de um nociceptor é substancialmente modificada em resposta a um
dano tecidual, inflamação ou lesão nervosa. A excitabilidade, a transmissão e o
limiar de um nociceptor podem ser alterados promovendo hipersensibilidade e dor
espontânea. Estas mudanças tanto podem ocorrer nos terminais periféricos e no
local da lesão axonal, quanto nas propriedades da membrana. Algumas destas
modificações são rápidas, entretanto outras necessitam de transporte retrógrado no
corpo celular, ativação de cascatas de transdução de sinal, mudanças na
transcrição, além do transporte de proteínas. Mas, os nociceptores não são os
únicos gatilhos da dor; fibras sensoriais de baixo limiar, que somente produzem
23
sensações inócuas como leve toque, começam então a produzir dor, uma mudança
substancial na especificidade funcional do sistema nervoso (SCHOLZ; WOOLF,
2002).
Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de transmissão e percepção do processo
doloroso. Estímulos nocivos são percebidos pelas fibras sensoriais e enviados ao corno dorsal da
medula espinhal, de onde ascendem para o tálamo e córtex, onde serão reconhecidos como estímulo
doloroso. Fonte: Adaptado de KUNER, 2010.
3.1 Dor Crônica
A noção de que a dor aguda é um fenômeno diferente da dor crônica é
amplamente aceita por médicos e pela comunidade científica. Experiências clínicas
sugerem que diferenças entre estes dois tipos de dor não são arbitrárias e que pode
haver uma transição de estados de dor aguda para crônica. Quando o papel
reparador e protetor da dor cessa, ela deixa de ser fisiológica, pois quando se torna
exagerada e espontânea é sinal de que ocorreram mudanças caracterizadas como
24
plasticidade mal adaptativa (SCHOLZ; WOOLF, 2002; REICHLING; LEVINE, 2009).
Muitos mecanismos podem contribuir para o desenvolvimento e manutenção da dor
crônica, são eles: 1) Sensibilidade aumentada devido à perda de um nervo; 2)
Remoção de influências inibitórias; 3) Eficácia aumentada de sinapses previamente
inefetivas; 4) Hiperexcitabilidade espinhal e/ou dos neurônios talâmicos; 5)
Desenvolvimento de canais de íons anormais que alteram as propriedades da
membrana das células; 6) Alterações na distribuição e atividade dos transportadores
que levam a um aumento no glutamato extracelular; 7) Plasticidade de receptores ou
transmissores (HULSEBOSCH et al., 2009).
Embora o conhecimento acerca dos circuitos estabelecidos na medula
espinhal sejam ainda limitados, recentes estudos começam a revelar algumas das
conexões sinápticas existentes entre aferentes primários, interneurônios, bem como
receptores e canais iônicos expressos nos diferentes componentes destes circuitos.
Maiores informações deste tipo podem ajudar a identificar novos alvos moleculares
de fármacos para combater a dor, bem como identificar mudanças que ocorrem em
estados de dor crônica (TODD, 2010).
3.2 A dor inflamatória
A inflamação é a resposta primária a uma infecção ou lesão no organismo e
possui o importante papel de remover o material prejudicial (ou o agente) e promover
a reparação tecidual. É caracterizada pela liberação de uma série de mediadores
que regulam o aumento da permeabilidade vascular e o recrutamento de leucócitos
para o local da lesão (RODRIGUEZ-VITA; LAWRENCE, 2010). Alguns desses
mediadores, incluindo as quimiocinas, podem ativar diretamente ou modificar a
atividade dos nociceptores, contribuindo para a hipersensibilidade dolorosa e dor
espontânea (FERREIRA, 1993; ABBADIE, 2005; FERREIRA et. al., 2009).
Todos os mediadores químicos liberados a partir de células do sistema imune
ou das células lesionadas, tais como: aminas bioativas, eicosanóides, citocinas,
quimiocinas e fatores de crescimento dão origem à uma “sopa inflamatória” no sítio
da lesão (RODRIGUEZ-VITA; LAWRENCE, 2010). Em muitos casos, estes
mediadores se ligam a receptores acoplados a proteína G na membrana celular e
ativam sistemas de segundos mensageiros, os quais resultam na ativação de
proteínas quinases que tem a habilidade de fosforilar canais iônicos e receptores.
25
Todas estas ações resultam na diminuição do limiar de ativação celular (JENSEN,
2008).
As fibras sensoriais são ativadas pelos mediadores inflamatórios de vários
modos: Alguns mediadores ativam diretamente os canais de Ca ++ e despolarizam os
neurônios desencadeando potenciais de ação, ou, alguns receptores ativam vias
intracelulares e influenciam a sensibilidade neuronal e a excitabilidade indiretamente
(TEIXEIRA, 2009).
As alterações sensoriais que ocorrem devido ao processo inflamatório em
geral são todas reversíveis e a sensibilidade de todo o sistema será restaurada
quando a inflamação cessar (JENSEN, 2008).
Quando ocorre inflamação prolongada, lesão nervosa ou anormalidades
teciduais, os nociceptores são sensibilizados e passam então a promover dor
persistente (TEIXEIRA, 2009).
3.3 A dor neuropática
A dor neuropática se refere a uma síndrome dolorosa específica,
caracterizada por dor e anormalidades sensoriais em locais do corpo que
apresentam perda da representação sensorial ou da inervação periférica normal no
SNC (JENSEN; FINNERUP, 2009). Diversos fatores podem causar danos ao SNC
ou SNP, incluindo exposição a toxinas, infecção, vírus, doenças metabólicas,
deficiências nutricionais, trauma (cirúrgico e não cirúrgico), etc., que levam a uma
resposta aguda, que é caracterizada por dor nociceptiva, inflamação e restrição da
função normal.
Frequentemente, seguida a fase aguda, ocorre um período de diminuição da
inflamação e da dor, reparo tecidual e retorno a função normal. Entretanto, em 7 a
18% da população em geral, a dor persiste após a lesão, resultando em um estado
de dor neuropática crônica. Os sintomas da dor neuropática são, com frequência,
severamente
debilitantes,
como
alodínia
(dor
resultante
de
um
estímulo
normalmente não nocivo), hiperalgesia (resposta aumentada a um estímulo
doloroso), dor espontânea, bem como debilidades comportamentais (insônia e
depressão) (PASERO, 2004; AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010).
A dor neuropática é desencadeada por lesões no sistema nervoso
somatosensorial que alteram sua estrutura e o seu funcionamento. As dores
26
espontâneas e a resposta a estímulos nocivos e inócuos, que ocorriam antes da
lesão do sistema nervoso, tornam-se patologicamente amplificadas. Múltiplas
alterações amplamente distribuídas no SNC contribuem para o estado de doença
neuronal. Estas alterações incluem: geração ectópica de potenciais de ação,
facilitação e desinibição da transmissão sináptica, perda da conectividade sináptica
e/ou formação de novos circuitos sinápticos e interações neuroimunes (COSTIGAN;
SCHOLZ; WOOLF, 2009).
Após uma lesão no SNP, mediadores químicos (noradrenalina, histamina, BK,
prostaglandinas, citocinas, serotonina, neuropeptídeos) são liberados pelas células
lesionadas e por células inflamatórias e agem sensibilizando os nociceptores para
novos circuitos sinápticos. No gânglio da raiz dorsal (DRG) e nas fibras nervosas dos
nociceptores lesionados, ocorrem mudanças no número e na localização de canais
iônicos, especialmente canais de Na+. Como resultado, o limiar de despolarização é
diminuído e podem acontecer as descargas espontâneas, conhecidas como
ectópicas. Consequentemente, a resposta dos nociceptores a estímulos térmicos e
mecânicos é aumentada, fenômeno conhecido como sensibilização periférica.
Existem também evidências de que os mecanoceptores próximos aos axônios
danificados também se tornam altamente sensíveis a um estímulo aplicado
(PASERO, 2004; D’MELLO; DICKENSON, 2008).
A liberação de taquicininas (SP, e neurocinina A) e neurotransmissores
(glutamato, CGRP e ácido aminobutírico (GABA))é decorrente de mecanismos
centrais, os quais promovem hiperexcitabilidade dos neurônios centrais. A liberação
prolongada e a ligação destas substâncias aos receptores neurais ativam os
receptores do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), que causam um aumento nos níveis
de cálcio intracelular. Elevados níveis de Ca2+ intraneurais estimulam a oxido nítrico
sintase (NOS) e a produção de óxido nítrico (NO). Desta forma, o limiar de ativação
é diminuído, a resposta ao estímulo se torna aumentada em magnitude e duração, e
o tamanho do campo receptivo aumenta. Estas mudanças resultam em um
fenômeno conhecido como “wind-up” (RIEDEL; NECK, 2001; PASERO, 2004).
Resumidamente, a hiperexcitabilidade neural é responsável por modificações
em nível molecular, celular e clínico. Em nível molecular ocorre a formação de novos
canais e receptores, aumento e/ou diminuição na expressão de certos receptores,
além da indução de novos genes. Já em nível celular, gera descargas espontâneas
nos
nociceptores,
limiar
reduzido
para
despolarizar
os
corpos
celulares,
27
recrutamento de receptores silenciosos, mudanças nos fenótipos celulares e, como
consequência disso, alterações secundárias na medula e no cérebro. As
manifestações clínicas decorrentes destes aspectos incluem dores exageradas e
prolongadas, além de uma propagação extraterritorial da dor para tecidos nãodanificados (JENSEN; FINNERUP, 2009).
Os mecanismos centrais também contribuem no processo de diminuição da
inibição
central,
o
qual
ocorre
quando
as
vias
inibitórias/modulatórias
(downregulation dos neurotransmissores GABA e glicina e dos receptores inibitórios
pré-sinapticos GABA e opioide) são perdidas ou suprimidas. A diminuição da inibição
central pode resultar de uma atividade dependente da morte celular dos
interneurônios inibitórios do corno dorsal da medula espinhal. A sensibilização
central e a redução da inibição central, juntamente com alterações periféricas,
contribuem para a alodínia (dor proveniente de um estímulo que normalmente não
provoca dor), característica marcante dos estados de dor neuropática (COSTIGAN;
WOOLF, 2000; PASERO, 2004).
Além de todos os mecanismos envolvidos na geração e manutenção da dor
neuropática, as células da glia também estão implicadas neste processo.
Fisiologicamente modulam a atividade neuronal, através da liberação e recaptação
de neurotransmissores, além de prover suporte físico e nutricional. As células de
Schwann são a glia dos nervos periféricos, entretanto, quando ocorre lesão nervosa,
adquirem a habilidade de proliferar, migrar e secretar numerosos mediadores que
contribuem para a degeneração walleriana e regeneração nervosa. Adicionalmente,
algumas horas após uma lesão no nervo periférico, as células de Schwann ativadas
começam a secretar outros mediadores, incluindo citocinas pró-inflamatórias, PGE2,
fator de necrose tumoral α (TNF-α), ATP e quimiocinas como a proteína quimiotáxica
de monócitos 1 (MCP-1) e o fator inibitório de leucemia (LIF), que promovem
continuada neuroinflamação através do recrutamento de macrófagos. Sob condições
normais as células de Schwann liberam fatores tróficos.
Após um dano nervoso, ocorre um aumento na liberação de substâncias
relacionadas à dor como NGF-β e o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
Desta forma, parecem contribuir significativamente para a dor neuropática, através
da sensibilização e ativação dos axônios dos nociceptores (SOMMER; KRESS,
2004; AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010).
A dor neuropática é de difícil tratamento como pode ser percebido pelos
28
diversos mecanismos envolvidos em sua gênese. Danos nervosos podem promover
ainda a ativação do sistema β-endorfinérgico no cérebro. A liberação de β-endorfinas
pode ativar continuamente os receptores µ-opioides, culminando na diminuição da
expressão destes receptores. Assim, a utilização de fármacos agonistas opioides
representa uma alternativa limitada para o tratamento da dor neuropática, com isso,
outras classes de medicamentos devem ser utilizadas e a busca por novos fármacos
para o tratamento para este tipo de dor deve ser constante (NIIKURA et al., 2010).
3.4 A dor do câncer
O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo
responsável por 13% do total de mortes em 2007, ou seja, 7.900.000 casos (OMS,
2010). Os avanços na detecção e nas terapias utilizadas para o tratamento do
câncer estão aumentando a expectativa de vida dos pacientes, porém, o impacto
negativo que a dor do câncer causa sobre a qualidade de vida dos mesmos é
extremamente intenso e não pode ser subestimado (MANTYH et al., 2002).
A experiência dolorosa é um dos mais comuns e angustiantes sintomas
experimentados por pacientes oncológicos e, embora os processos físicos que dão
origem ao sentimento final de dor possam ser descritos, o significado global da dor
como sensação desagradável é único para cada indivíduo (PACHARINSAK; BEITZ,
2008; MOFFAT; RAE, 2011). Sendo a dor um sintoma subjetivo e pessoal, sua
severidade não é diretamente proporcional à quantidade de tecido lesionado, logo,
sua percepção pode ser influenciada por diversos fatores, como fadiga, depressão,
raiva, medo e sentimentos de falta de esperança e amparo (BRASIL, 2001). Quando
não curada, pode perturbar e interferir nas atividades diárias, qualidade de vida e
humor (PACHARINSAK; BEITZ, 2008).
Para muitos pacientes, a dor é o primeiro sinal do câncer. Sua frequência e
intensidade tende a aumentar durante os estágios avançados da doença. De fato, de
75 a 95% dos pacientes com câncer metastático ou avançado experimentarão dor
moderada a severa (MANTYH et al., 2002). A intensidade da dor varia entre os
pacientes, e é dependente do tipo de câncer, de sua localização e da sensibilidade
do paciente à dor (PACHARINSAK; BEITZ, 2008).
A dor sentida por pacientes oncológicos é principalmente decorrente de
invasões ósseas, viscerais e no sistema nervoso periférico, provocadas pelo próprio
29
tumor com incidência de 46 a 92%. Fatores relacionados ao câncer, como espasmo
muscular, constipação intestinal e escaras de decúbito representam 12 a 29%, além
da dor associada ao tratamento (dor pós-operatória, dor pós-quimioterápica e dor
pós-radioterápica) (BRASIL, 2001).
Os mecanismos que promovem a progressão tumoral e o desenvolvimento do
processo doloroso são extremamente complexos e diferem para cada tipo de câncer.
A primeira indicação de uma possível ligação entre inflamação e câncer foi sugerida
no século XIX, com a descoberta da presença de leucócitos próximos a tumores
(Fig. 3) (GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010).
Somente na última década têm sido obtidas claras evidências de que o
microambiente inflamatório é um componente essencial para todos os tumores.
Hoje já se sabe que a inflamação crônica possui um papel crítico na proliferação,
angiogênese, invasão, metástase e supressão da apoptose. Os principais
responsáveis por estas ações são as citocinas TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18,
quimiocinas, metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9), fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF), ciclooxigenase 2 (COX-2) e lipoxigenase 5 (5-LOX). A expressão
de todos estes produtos é principalmente regulada pelo fator de transcrição NF-ĸB,
que é constitutivamente ativo em muitos tumores e induzido por carcinógenos,
promotores tumorais, proteínas virais carcinogênicas e agentes quimioterapêuticos
(GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010).
Cabe ressaltar que várias células do sistema imune inato (monócitos,
eosinófilos, células dendríticas, células NK, mastócitos, neutrófilos, entre outras),
geram espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS),
as quais danificam o DNA, levando à ativação de oncogenes e/ou inativação de
genes supressores de crescimento (KUNDU; SURH, 2008).
Já as células do sistema imune, como macrófagos, neutrófilos e células T,
participam ativamente na secreção de moléculas que sensibilizam ou excitam
diretamente os neurônios aferentes primários (como prostaglandinas, TNF-α,
endotelinas, IL-1, IL-6, fator de crescimento epidermal, fator de crescimento derivado
de plaquetas e fator de transformação de crescimento β (TGF-β)) (MANTYH et al.,
2002; AGGARWAL et. al., 2006).
Além da participação do sistema imune na geração da dor inflamatória, o
crescimento da massa tumoral promove a compressão de nervos periféricos ao
tumor, gerando a dor neuropática (GAO et al., 2009). No entanto, de 25-35 % dos
30
pacientes com tumor sólido de mama, ovário e pulmão, que utilizam quimioterapia
combinada com paclitaxel, relatam, além de dor neuropática periférica, dor muscular
de moderada a severa, ocasionada pelo tratamento (FORSYTH et al., 1997; HIDAKA
et al., 2009).
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo de sensibilização dos nociceptores por
células cancerígenas. Além das células tumorais, o tumor é formado por células inflamatórias e vasos
sanguíneos que estão freqüentemente próximos aos nociceptores aferentes primários. As células
tumorais e as células inflamatórias liberam uma variedade de produtos, como ATP, BK, H +, NGF,
prostaglandinas e VEGF que excitam ou sensibilizam os nociceptores. Estímulos dolorosos são
detectados pelos nociceptores e são transmitidos para os neurônios da medula espinhal. Os sinais
são então transmitidos para centros superiores no cérebro. Os sinais de dor associada ao câncer
podem ascender até o cérebro por duas principais vias: o trato espinotalâmico e pelo trato póssináptico da coluna dorsal. A ativação dos nociceptores resulta na liberação de neurotransmissores
como CGRP, endotelina, histamina, glutamato e SP. A ativação do nociceptor também causa a
liberação de prostaglandinas dos terminais periféricos das fibras sensoriais os quais podem induzir
extravasamento plasmático, recrutamento e ativação de células imunes e vasodilatação. Adaptado de
MANTYH et. al., 2002.
Devido à complexidade da doença, o tratamento para a dor dos pacientes
com câncer inclui o uso de diferentes classes de medicamentos, como opioides,
antiinflamatórios não-esteroidais (AINES), anestésicos locais, antidepressivos e
anticonvulsivantes, o que muitas vezes é uma terapia paliativa que tem por objetivo
controlar a dor de um tumor incurável e melhorar a qualidade de vida
(PACHARINSAK; BEITZ, 2008). O principal fármaco utilizado para aliviar a dor de
31
pacientes terminais é a morfina, pois alivia com eficácia a dor do câncer, embora
provoque efeitos adversos tais como sedação, náusea, constipação, retenção
urinária, euforia e diminuição da capacidade de concentração, quando administrada
em altas doses (LEVY, 1996; VALLEJO; BARKIN; WANG, 2011).
Desta forma,
tratamentos com maior eficácia e reduzidos efeitos adversos para a dor oncológica
se fazem necessários (PACHARINSAK; BEITZ, 2008).
Desde 1999, novos modelos animais têm sido desenvolvidos com o intuito de
demonstrar os distintos aspectos neuroquímicos e farmacológicos que envolvem a
dor do câncer. Modelos de dor de câncer ósseo, de pele e de dor oncológica
neuropática já sugerem que os componentes associados à dor são de origem
inflamatória, neuropática e tumorigênica (ASAI et al., 2005).
Sasamura et al. (2002) estudaram o efeito analgésico da morfina frente à
supressão do crescimento tumoral e metástase, em modelo animal de inoculação
ortotópica de células B16-BL6 em camundongos C57BL/6. Com base nos resultados
obtidos, os autores sugerem a existência de duas fases de hiperalgesia. Na fase
inicial, em torno de 8 dias após inoculação, a dor estaria relacionada à inflamação
induzida pelo tumor, incluindo a produção de prostaglandinas. Os autores chegaram
a essa conclusão devido às altas doses utilizadas do fármaco diclofenaco, que inibiu
a hiperalgesia somente até o 8º dia. A hiperalgesia térmica foi aparente entre o 7º e
o 11º dia. A fase tardia, considerada do 16º ao 20º dia após a inoculação, é
caracterizada por metástase. Os fatores de crescimento e citocinas relacionados à
metástase seriam responsáveis pela dor tardia. Tanto o diclofenaco quanto a
morfina, inibiram a fase inicial da dor, entretanto, não foram capazes de inibir a fase
tardia, o que demonstra a severidade da dor em estágios avançados. Na fase tardia
se soma a dor neuropática, resultado do crescimento exponencial do tumor a partir
da fase inicial. O melhor entendimento da fase tardia será de grande valia para o
desenvolvimento de melhores tratamentos.
3.5 Tratando a dor
Um diagnóstico sensível e específico se torna necessário para revelar o
processo patológico responsável pela sensação dolorosa em cada indivíduo. Para
que o diagnóstico seja bem feito, deve-se levar em conta o histórico do paciente,
exames e investigações profundas a fim de selecionar o tratamento adequado para
32
cada tipo de dor (WOOLF; MANNION, 1999). Como a transmissão dolorosa envolve
diferentes receptores, além da participação do SNC e do SNP, frequentemente o
tratamento é multimodal, visando otimizar o controle da dor e limitar os efeitos
adversos. Os fármacos mais comumente utilizados no gerenciamento da dor
incluem:
AINES,
anestésicos locais,
opioides,
antidepressivos tricíclicos e
anticonvulsivantes (MOFFAT; RAE, 2011).
Os AINES são fármacos responsáveis por reduzir a transmissão do processo
doloroso, através da redução de determinada cascata inflamatória. Geralmente estes
agentes oferecem alívio suave da dor e efeitos adversos potencialmente graves
como hipertensão e úlcera gástrica, além de um risco aumentado a eventos
cardiovasculares (para a classe de inibidores seletivos da ciclooxigenase-2). Apesar
de possuírem ação antiinflamatória, antipirética e analgésica, sua utilidade
permanece limitada, pois o alívio da dor envolve mecanismos adicionais a estes,
como eventos centrais e periféricos (LYNCH, 2008; MOFFAT; RAE, 2011). Alguns
AINES apresentam formulações de uso tópico, as quais dispensam doses
terapêuticas através da penetração nos tecidos, reduzindo os efeitos adversos
sistêmicos, diminuindo a taxa de circulação da substância na corrente sanguínea
(ZILTENER; LEAL; FOURNIER, 2010).
Os opioides representam os medicamentos de primeira linha para pacientes
com dor neuropática, dor neuropática devido ao câncer e exacerbações da dor
neuropática. Apresentam seus efeitos analgésicos por: 1) inibir o influxo de cálcio na
membrana pré-sináptica, inibindo a liberação de substância P, 2) hiperpolarizar as
células pré-sinápticas pelo aumento do efluxo de potássio, impedindo que as
informações aferentes nociceptivas se espalhem para os neurônios adjacentes, e 3)
modular centralmente a informação nociceptiva no sistema límbico. Os efeitos
adversos desta classe de medicamentos, como constipação, náusea e sedação são
bastante marcantes, mas podem ser reduzidos utilizando-se doses menores e
associações com fármacos adjuvantes. Embora os efeitos adversos desencorajem
sua utilização, os opioides ainda são os fármacos de escolha para dores intensas
(DWORKIN et. al., 2010; VALLEJO; BARKIN; WANG, 2011).
Os antidepressivos tricíclicos e inibidores seletivos da recaptação de
noradrenalina e serotonina, são eficazes no tratamento da depressão, uma
comorbidade comum aos pacientes com dor crônica, porém sua eficácia terapêutica
tem sido relatada também em pacientes não-deprimidos. Estes fármacos mantêm os
33
níveis de monoaminas nas vias descendentes, além de aumentar as concentrações
de opioides endógenos por vias indiretas. Não apresentam custo elevado, porém
seus efeitos adversos são comuns e incluem boca seca, constipação e retenção
urinária (DWORKIN et. al., 2010; MOFFAT; RAE, 2011).
Os anticonvulsivantes apresentam indicações precisas em determinados
quadros de dor neuropática devido à sua capacidade de prolongar o período
refratário efetivo das fibras nervosas, limitar o disparo de alta freqüência e aumentar
a inibição sináptica central (OLIVEIRA, 2009). Agem globalmente na transmissão
sináptica por interferir nas funções dos canais de sódio ou cálcio, reduzindo a
excitabilidade dos neurônios sensibilizados (MOFFAT; RAE, 2011). A Gabapentina é
o anticonvulsivante mais utilizado para o tratamento de dor crônica nos Estados
Unidos por apresentar poucos efeitos adversos, tais como dor de cabeça, sedação,
fadiga e vertigem, os quais são mais freqüentes em idosos (FITZGERALD,
ROMERO, SABERSKI, 1998).
De 1960 até o ano de 2009, 59 novos fármacos para a tratamento da dor
foram desenvolvidos, sendo que 39 deles foram especificamente desenvolvidos
como analgésicos e os 20 restantes para outras patologias, porém a eficácia para o
tratamento da dor foi mais tarde comprovada pelo Food and Drug Administration
(FDA). Embora tenha havido uma melhora no entendimento dos mecanismos
envolvidos no processo doloroso, o sucesso no desenvolvimento de novos fármacos
infelizmente ainda é limitado e se torna uma necessidade (KISSIN, 2009).
3.6 Chalconas
Chalconas são compostos químicos nomeados como 1,3-difenil-2-propen-1ona e definidas quimicamente como cetonas α,β-insaturadas, onde se tem tanto a
carbonila quanto a porção olefínica conjugadas e ligadas a grupamentos aromáticos,
conforme demonstrado na figura 4 (SATYANARAYANA; RAO, 1993).
As chalconas são moléculas frequentemente encontradas em frutas (maçã),
vegetais (tomates, batatas, brotos de feijão) ou especiarias (alcaçuz). São
precursoras imediatas da via de biossíntese de flavonoides em plantas superiores e
também desempenham um papel muito importante na defesa contra patógenos e
insetos e na atração de polinizadores (MOJZIS et al., 2008; BATOVSKA;
TODOROVA, 2010; ORLIKOVA et al., 2011). Podem ser encontradas em diferentes
34
órgãos vegetais, sobretudo nas flores, onde contribuem significativamente na
pigmentação da corola. Uma característica marcante do grupo é a presença de
coloração amarela que passa a vermelha em meio alcalino. A cor amarela nas flores
das plantas se deve também à presença de carotenos, mas especialmente em
algumas famílias - como Asteraceae, Acanthaceae, Gerneriacea e Liliaceae - as
chalconas têm participação especial (ZUANAZZI; MONTANHA, 2007).
Figura 4. Representação esquemática da estrutura geral das chalconas. Fonte: Adaptado a partir
de PADHYE et al., 2009.
O


3.6.1 Propriedades Biológicas
As estruturas simples, juntamente com a facilidade de síntese das chalconas,
tornaram-se grandes atrativos para estudos de relação estrutura-atividade. Diversos
substituintes têm sido sintetizados para avaliar a relação dos grupos funcionais
quanto à atividade biológica. Desta forma, chalconas de ocorrência tanto natural
quanto sintética têm apresentado promissoras atividades biológicas. Estes
compostos também demonstram perfis seguros, e recentemente muitos avanços nas
pesquisas foram alcançados (NI; MENG; SIROSKI, 2004; CAMPOS-BUZZI et al.,
2007; ROMAGNOLI et al.; 2009).
Pesquisas que avaliam a propriedade antitumoral das chalconas foram
realizadas por Romagnoli et al. (2009). Os autores obtiveram, através de síntese
orgânica, duas séries de chalconas α-bromoacriloilamido. De todas as chalconas
híbridas testadas, 8 delas (estruturas representadas pelos nos (1) e (2)) foram
capazes de inibir a proliferação de células tumorais de leucemia murino e humano,
carcinoma mamário murino e carcinoma de cervix humano. Esta atividade parece
estar relacionada com a indução da apoptose através da via intrínseca, mediada
pelo envolvimento da mitocôndria e ativação da caspase-3. Porém, mais estudos
para esclarecer detalhes sobre os mecanismos moleculares de ação destes
35
compostos são necessários.
O
O
Ar
NH
Br
Ar = 4-Br-C6H5; 4-OCH2CH3-C6H5; 2-tienil
(1)
O
O
Ar
NH
Br
Ar = C6H5; 4-OCH3-C6H4; 2-OCH3-C6H4;
2,3-(OCH3)2-C6H3;2,3,4-(OCH3)3-C6H2
(2)
Também com relação à atividade antitumoral, Saxena et al. (2007) realizaram
a síntese de chalconas derivadas de estradiol. Ao todo, 13 chalconas e derivados
foram sintetizados, sendo que os compostos (3) e (4) apresentaram resultados muito
promissores em relação à linhagem tumoral MCF-7 (células de câncer de mama
humano dependentes de hormônio). Ademais, não apresentaram citotoxicidade para
eritrócitos, porém o mecanismo de ação dos compostos não foi avaliado.
O
OH
H3CO
H3CO
H3CO
(3)
36
O
OH
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO
(4)
Cabe
destacar
também
o
estudo
realizado
por
pesquisadores
da
Universidade Federal de Santa Catarina, publicado por Navarini et al. (2009), no
qual foi realizado a síntese de 13 hidroxichalconas por condensação aldólica. As
mesmas foram avaliadas frente à toxicidade para células B16F10 (melanoma
murino), sendo que três delas ((5), (6) e (7)) reduziram mais de 50% a viabilidade
celular das células tumorais. Os resultados referentes ao possível mecanismo de
ação sugerem que as moléculas testadas promoveram morte celular por apoptose e
induziram a depleção de glutationa e ATP mitocondrial. Estes efeitos foram
relacionados pelos autores com a conformação dos compostos e com número de
grupamentos hidroxil.
R1
O
OH
R2
O
COOH
Br
(5) R1=H; R2= OH
H3CO
OCH 3
(6) R1=OH; R2= H
(7)
Além dos dados já expostos, Orlikova et al. (2011) publicaram uma revisão
bastante completa demonstrando o grande potencial de chalconas provenientes da
dieta humana como agentes quimiopreventivos e quimioterapêuticos, uma vez que
atuam efetivamente em cada passo da carcinogênese, incluindo iniciação, promoção
e progressão. Assim, os autores sugerem que estas moléculas e seus derivados
podem ser considerados como potenciais agentes anticancer.
Diversos estudos têm demonstrado atividade antiinflamatória para as
chalconas, nos quais os compostos testados foram capazes de inibir a produção de
37
NO através de down-regulation e/ou inibição de iNOS (KIM et al., 2007; CHIARADIA
et al., 2008). Tran et al. (2009) realizaram a síntese de várias chalconas (2’hidroxichalconas) com diferentes substituintes no anel B. Dentre as 18 chalconas
sintetizadas, 6 delas (8) demonstraram atividade inibitória potencial contra a
produção de PGE2 na linhagem celular RAW 264,7 (macrófago murino) estimulada
pelo LPS, com porcentagens de inibição acima de 90% e CI 50 entre 3,8 - 6,2 µM.
O
R4
OH
R1
R3
R2
R = 4-benziloxi; 3,4-dibenziloxi; 3-benziloxi,4-OCH3;
2,3-(OCH3)2; 2,4-(OCH3)2; 3,4,5-(OCH3)3
(8)
Além da atividade antiinflamatória de diversas classes de chalconas por
diversos mecanismos, estas moléculas também demonstram efeito antinociceptivo
agudo. Campos-Buzzi et al. (2006) realizaram a síntese de 17 chalconas e as
avaliaram farmacologicamente frente a dor induzida por ácido acético, onde a
maioria dos compostos testados foram mais eficazes que a aspirina, fármaco
analgésico utilizados como controle positivo. O composto (9) merece destaque, pois
foi capaz de reduzir as contorções abdominais em 92,2% quando administrado por
via i.p.
OH
H3CO
O
COOH
OCH 3
(9)
Corrêa et. al. (2001) avaliaram o potencial antinociceptivo de uma série de 11
chalconas, sendo que duas delas (10) apresentaram inibições acima de 90% no
teste da formalina. Os autores sugerem que a adição de grupos substituintes
contendo o átomo cloro no anel A foram os responsáveis pela ação farmacológica.
38
O
R1
R2
R = 4-Cl; 3,4-Cl2
(10)
Corrêa et al. (2008) realizaram a síntese de três séries de chalconas e as
avaliaram farmacologicamente frente ao teste de dor aguda induzida pelo ácido
acético. Os compostos (11), (12) e (13) foram os mais efetivos e os autores também
sugerem que a ação farmacológica ocorreu devido aos substituintes do anel A.
O
O
Cl
Cl
Cl
N
Cl
(11)
O
(12)
OH
Cl
Cl
(13)
Conforme demonstrado, as chalconas representam uma classe de moléculas
que vem sendo extensivamente estudadas e que apresentam atividade comprovada
nas mais diversas áreas, além das anteriormente citadas, como antiviral,
antimicrobiana,
antifúngica,
antioxidante,
anti-leishmania,
antiproliferativa,
antiulcerogênica, antihistamínica, anti-HIV e como inibidoras de tirosina quinase
(SAXENA et al., 2007; TRAN et al., 2009; BATOVSKA; TODOROVA. 2010).
3.6.2 Dos compostos em estudo
Campos-Buzzi (2007) sintetizou várias séries de chalconas e as avaliou
farmacologicamente. O composto (2E)-1-(4-aminofenil)-3-(4-nitrofenil)prop-2-en-1-
39
ona (ANCh) (14) foi o que apresentou resultados mais promissores dentro da série
de amino-chalconas. No teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético, esta chalcona apresentou inibição de 96,3 ± 1,1% para a dose de 10 mg/kg
(i.p). Dentro deste aspecto, o composto foi avaliado em outras doses, onde se
obteve o valor de DI50 de 1,27 (0,78 – 2,01) µmol/kg. No teste da formalina, o
composto ANCh apresentou inibição significativa somente na segunda fase, com
inibição de 68,2% na dose de 10 mg/kg. Com o objetivo de melhor avaliar a ação do
composto frente a dor neurogênica, foi realizado o teste da capsaicina, no qual o
composto foi eficaz apresentando inibição de 50,7% também na dose de 10 mg/kg.
Para completar a bateria de testes, foi realizado o teste da placa quente com o
intuito de avaliar a possível influência do composto na via opioide, o qual não
apresentou resultados significativos para este teste.
(14)
A chalcona N-{4-[(2E)-3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil}acetamida (AcANCh)
(5) também foi sintetizada e avaliada quanto ao seu potencial antinociceptivo agudo
(CAMPOS-BUZZI et al., 2007). O composto apresentou porcentagem de inibição
frente às contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, com inibição de 94,1 ±
2,5% para a dose de 10 mg/kg. Desta forma, foi realizada uma curva dose-resposta
para o mesmo teste, onde foi encontrada uma DI 50 de 1,22 (0,83 – 1,80) µmol/kg.
Além disso, o composto foi capaz de reduzir a segunda fase (inflamatória) da dor
induzida pela formalina, com inibição de 60,8%. Ainda na dose de 10 mg/kg, o
composto reduziu significativamente a dor induzida pela capsaicina, com inibição de
69.6%, sugerindo um possível envolvimento com o antagonismo dos receptores
vaniloides. No teste da placa quente, o composto não apresentou resultados
significativos, sugerindo que o mesmo não atua pela via opioide.
40
(15)
Com base nos promissores resultados apresentados por estes dois
compostos, os mesmos foram os escolhidos para aprofundar os estudos frente a
diferentes modelos de dor persistente em camundongos.
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Substâncias e Reagentes
Para realização do estudo foram utilizados: Soro Bovino Fetal e Meio MEM
(Gibco BRL, NY, USA), L-glutamina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA), penicilina e
estreptomicina (Gibco BRL, NY, USA), Éter Dietílico P.A, cloreto de sódio, cloreto de
potássio (Merck & Co., Inc.), Gabapentina (Neurontin®; Park-Davis, Brasil); ʎCarragenina, CFA, salina tampão fosfato (PBS), Lipopolissacarídeo de E. coli (LPS),
PGE2, BK, Epinefrina (todos Sigma Chemical Company, St Louis, MO, E.U.A),
Morfina (Dimorf® , Cristália), Hidrato de Cloral (Vetec; Brasil), Tween 80 (Merck,
Alemanha).
4.2 Obtenção dos Compostos
As amino e amido-chalconas - (2E)-1-(4-aminofenil)-3-(4-nitrofenil)prop-2en-1-ona
(ANCh)
e
N-{4-[(2E)-3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil}acetamida
(AcANCh) – utilizadas neste trabalho foram sintetizadas por Daniele Regina Sonza,
de acordo com a reação clássica, segundo uma derivação do método geral de
condensação aldólica de Claisen-Schmidt (Figura 5) utilizando metanol, NaOH, 4nitrobenzaldeído, e
respectivamente, a p-aminoacetofenona e a N-(4-acetilfenil)
acetamida (SATYANARAYANA et al., 2004). Todas as reações foram monitoradas
através da cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando como eluente
hexano/acetato de etila (70:30) (CAMPOS-BUZZI, 2007; CAMPOS-BUZZI et al.,
2007).
Figura 5. Esquema da rota de síntese das chalconas avaliadas.
O
O
CH3
H
+
O
R
NH
R = H (G4); COCH3 (A6)
O
+
N
O
R = H (ANCh); COCH3 (AcANCh)
metanol
NaOH
agitação
t. amb.
R
NH
+
N
O
-
O
42
4.3 Análise “In silico”
4.3.1 Regra dos cinco de Lipinski
Foram
realizados
cálculos
teóricos
computacionais
para
estimar
a
solubilidade e permeabilidade dos compostos sintetizados. Os valores do peso
molecular (PM), Log P, aceptores de ligação hidrogênio (N + O) e doadores de
ligação hidrogênio (NH + OH) foram obtidos a partir do programa free molinspiration
on line, através do JME Editor, cortesia de Peter Ertl da Novartis, disponível no site:
http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties. Foram analisados: a massa molar,
a qual não deve exceder a 500 g/mol; o log P, cujo valor limite é 5; e os grupos
doadores (NH + OH) e aceptores (N + O) de ligação hidrogênio, cujas somatórias
não devem ultrapassar a 5 e 10, respectivamente (LIPINSKI et al., 2001).
4.4 Ensaios in vivo
4.4.1 Animais
Foram utilizados camundongos C57/BL6 machos e fêmeos pesando entre
25 e 35 gramas, todos provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do
Itajaí (UNIVALI). Os animais foram mantidos em temperatura controlada de 22 ±
1ºC, em ciclo claro/escuro de 12 horas, recebendo água e ração ad libitum. Os
animais permaneceram no laboratório durante um período de adaptação de pelo
menos 1 hora antes da realização dos testes, que foram executados entre 8 e 17
horas (ZIMMERMANN, 1983). Os protocolos experimentais foram previamente
submetidos à apreciação do Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade
do Vale do Itajaí (UNIVALI) e aprovados sob parecer 017P1/10. Os modelos
contaram com 5 grupos de animais (n=6): um grupo controle negativo que recebeu o
veículo utilizado para diluição dos compostos (PBS + 1 gota de Tween 80), um
controle positivo com fármaco padrão quando adequado, e três doses para cada
uma das chalconas a serem testadas, sendo utilizado um número mínimo de animais
para demonstrar efeitos consistentes para os tratamentos.
43
4.4.2 Avaliação da Atividade Anti-hiperalgésica
4.4.2.1 Hiperalgesia mecânica induzida pela Carragenina
Para realização deste modelo os animais foram pré-tratados com ANCh (1,11,
3,72 ou 11,18 µmol/kg), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg), Indometacina (13,97
µmol/kg) ou veículo (10 mL/kg), 30 min para a via intraperitoneal ou 1 hora para a via
oral, antes da injeção de 50 µL de ʎ- Carragenina (300 µg/pata). Os animais foram
avaliados quanto à hiperalgesia mecânica através do monofilamento de Von Frey 0,6
g, nos intervalos de 1, 3, 4, 6, 24 e 48 horas após a injeção intraplantar de
carragenina (DE CAMPOS et. al., 1996; BORTOLANZA et. al., 2002).
4.4.2.2 Hiperalgesia mecânica induzida pelo adjuvante completo de Freund
(CFA)
Para a indução da resposta inflamatória persistente, os camundongos
receberam uma injeção i.pl. de 20 μL de CFA (1 mg/mL de bacilo de Mycobacterium
tuberculosis inativado por calor, cada mililitro (mL) de veículo contém 0,85 mL de
óleo de parafina + 0,15 mL de monooleato de 61 manida) na superfície plantar da
pata direita posterior (CAO et. al., 1998; FERREIRA et. al., 2001; QUINTÃO et al.,
2005). A hiperalgesia mecânica foi avaliada utilizando o monofilamento de von Frey
0,6g. Para avaliar o efeito preventivo sobre a hiperalgesia mecânica, diferentes
grupos de animais foram previamente tratados com os compostos ANCh (1,11, 3,72
ou 11,18 µmol/kg, i.p), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg, i.p) ou veículo (10
mL/kg). Como controle positivo foi utilizada a Gabapentina (408,80 μmol/kg, v.o.),
fármaco anticonvulsivante utilizado na clínica nos dias atuais para o tratamento de
dor crônica. Após 30 minutos (ou 1h para a Gabapentina) os animais receberam
uma injeção intraplantar de CFA, e a hiperalgesia mecânica foi avaliada em
diferentes intervalos de tempo (1, 3, 4 e 6h).
Com o intuito de verificar o efeito curativo dos compostos, os animais
receberam uma injeção intraplantar de CFA, e após 24h os mesmos foram tratados
com o os compostos ANCh (1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg, i.p), AcANCh (0,96, 3,22
ou 9,66 µmol/kg, i.p), Gabapentina (408,80 μmol/kg, v.o.) ou o veículo, 1 vez ao dia,
durante 5 dias consecutivos, e a hiperalgesia mecânica foi avaliada 4h após a
44
administração diária. A fim de investigar a extensão do efeito anti-hiperalgésico dos
compostos, o tratamento foi interrompido 5 dias após a primeira administração,
porém a avaliação da hiperalgesia mecânica continuou até a ausência do efeito dos
compostos. Quando a hiperalgesia dos grupos que receberam o tratamento com os
compostos se igualou a do controle, os animais foram novamente tratados para
avaliar uma possível tolerância dos compostos.
4.4.2.3 Hiperalgesia mecânica induzida por LPS
Para induzir a hiperalgesia inflamatória, os animais receberam uma injeção
intraplantar de LPS (100 ng/pata) após terem sido pré-tratados com ANCh (1,11,
3,72 ou 11,18 µmol/kg, i.p), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg, i.p) ou veículo. Os
animais foram avaliados através do monofilamento de Von Frey 0,6 g, nos intervalos
de 1, 3, 4, 6, 24 e 48 horas após a injeção intraplantar de LPS.
4.4.2.4 Hiperalgesia mecânica induzida pela ligação parcial do nervo ciático
(LPNC)
Inicialmente os animais foram anestesiados com hidrato de cloral 7% (8
mL/kg; i.p.). Em seguida, foi realizada uma pequena incisão na coxa do animal, e o
nervo ciático foi exposto próximo à trifurcação ciática. Foi realizada uma amarria de
aproximadamente 1/3 a 1/2 da porção dorsal do nervo ciático com fio de sutura 8.0
(Brasuture, Brasil). O procedimento utilizado foi similar ao descrito para ratos por
Seltzer et al. (1990) e modificado para camundongos por Malmberg e Basbaum
(1998). Em um grupo de animais, falso- operados, o nervo ciático foi exposto sem
realizar amarração. No 5º dia após a cirurgia, os animais operados foram tratados
com ANCh (1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg, i.p), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg,
i.p) ou Gabapentina (408,80 μmol/kg, v.o.) e os falso-operados com o veículo (10
mL/kg) 1 vez ao dia, durante 5 dias consecutivos, e a hiperalgesia mecânica foi
avaliada 4h após a administração diária com o monofilamento de von Frey 0,6 g. A
fim de investigar a extensão do efeito anti-hiperalgésico dos compostos, o
tratamento foi interrompido 5 dias após a primeira administração, porém a avaliação
da hiperalgesia mecânica continuou até a ausência do efeito dos compostos.
Quando a hiperalgesia dos grupos que receberam o tratamento com os compostos
45
se igualou a do controle, os animais foram novamente tratados para avaliar uma
possível tolerância dos compostos.
4.4.2.5 Hiperalgesia mecânica induzida por BK, CXCL1/KC, TNF-α, IL1-β, PGE2
e epinefrina
Neste modelo os animais foram pré-tratados com os compostos ANCh (1,11,
3,72 ou 11,18 µmol/kg, i.p), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg, i.p) ou veículo (10
mL/kg) e após 30 minutos receberam injeção intraplantar de 50 µL de BK (500
ng/pata), CXCL1/KC (20 pg/pata), IL1-β (20 pg/pata), TNF-α (40 pg/pata), PGE2 (3
nmol/pata) ou epinefrina (100 ng/pata). A hiperalgesia foi avaliada 3 horas após o
estímulo inflamatório, exceto para epinefrina onde a avaliação foi realizada após 30
minutos. Quando a BK foi utilizada, os animais foram pré-tratados com o inibidor da
enzima conversora da angiotensina I, o Captopril (5 mg/kg, s.c.), 60 minutos antes
dos experimentos para prevenir sua degradação (DE CAMPOS et al., 1997).
4.4.2.6 Hiperalgesia mecânica induzida por células tumorais B16F10
4.4.2.6.1 Cultivo Celular
Foram utilizadas células B16F10, melanócitos provenientes de melanoma de
pele de camundongos (Mus musculus C57BL/6J) obtidas do Banco de Células do
Rio de Janeiro (BCRJ). As células foram cultivadas em meio mínimo de essencial
MEM (Gibco-BRL) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco) a 10% já estéril,
inativado e filtrado em fluxo laminar, e 1% de mistura de antibióticos (Gibco 15640)
sendo 5 mg/mL de penicilina, 5 mg/mL de estreptomicina e 10 mg/mL de neomicina,
além de antifúngico (Gibco) 250 μg/mL e 2 mM de L-glutamina (Ajinomotto). A Lglutamina utilizada para suplementação do meio foi preparada numa solução 100x
concentrada, (200 mM). O meio de cultura MEM foi trocado a cada 2 dias até uma
confluência de 80-90% das células na garrafa, sendo então realizado o
procedimento de tripsinização.
Resumidamente, as células foram lavadas com
tampão salino fosfato 0,1 M pH 7,4 (PBS). Posteriormente foi adicionado 1 mL de
tripsina (0,25% tripsina,0.038% EDTA) seguido de incubação em estufa a 37ºC, 5%
de CO2, por no máximo 10 minutos. A tripsina foi inativada com meio MEM contendo
46
10% de soro fetal bovino e íons Mg ++ e Ca++, seguido de transferência das células
para um tubo falcon de 15 mL, centrifugação a 1000 g por 10 min a 10 oC, descarte
do sobrenadante e ressuspensão em meio MEM suplementado.
4.4.2.6.2 Indução da hiperalgesia
Para indução do tumor, os animais receberam 30 µL de uma solução
contendo 2 x 105 células da linhagem B16F10, por via intraplantar, conforme descrito
por Sasamura et. al. (2002) (figura 6). Após 7 dias, os animais foram tratados com os
compostos ANCh (1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg, i.p), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66
µmol/kg, i.p), veículo (10 mL/kg), ou com controle positivo Morfina (3,5 µmol/kg, s.c.)
e foram avaliados após 1, 3, 4 e 6 horas, recebendo um novo tratamento com os
compostos nas mesmas doses ao final da avaliação (12 x 12 h). Do 8o ao 26o dia, os
animais foram novamente tratados, 2 vezes ao dia, e a avaliação da hiperalgesia se
deu 4 horas após o tratamento.
Figura 6. Inoculação intraplantar das células de melanoma murino B16F10. Fonte: Própria.
4.4.3 Análise do limiar mecânico através do filamento de von Frey
Para avaliar a hiperalgesia mecânica, os mesmos foram colocados
individualmente em compartimentos de acrílico transparente individuais (9 x 7 x 11
cm) localizados em uma plataforma de arame elevada, para permitir o acesso à
superfície ventral das patas traseiras (Figura 7). Os animais foram aclimatizados por,
no mínimo 1 hora antes dos testes comportamentais. A frequência de resposta de
retirada da pata foi obtida através de 10 aplicações (duração de 1 s cada) do
47
filamento de von Frey 0,6 g (VFH, Stoelting, Chicago, USA). Este aparato consiste
de um filamento de nylon e produz em média 15 % de frequência de retirada da
pata, sendo considerado um valor adequado para a avaliação da hiperalgesia
mecânica (BORTOLANZA et. al., 2002). Os estímulos foram realizados no centro da
superfície plantar da pata traseira direita do animal. O limiar mecânico foi avaliado
em diferentes tempos de acordo com o modelo.
Figura 7. Representação da estimulação mecânica na pata do camundongo utilizando-se o
monofilamento de Von Frey 0,6g. Fonte: Própria.
4.5 Ensaios bioquímicos
4.5.1 Dosagem de citocina
Os níveis de IL-1β foram avaliados de acordo com Francischi et al. (2000). Os
animais foram sacrificados 4 horas após a injeção intraplantar de carragenina (300
µg/pata) e a pele da pata traseira foi coletada. Os tecidos foram homogeneizados
em salina tamponada com fosfato (PBS; pH=7,4; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,5 mM, filtrado a 0,2 µm) contendo NaCl 0,4 M, PMSF
0,1 mM, EDTA 10 mM, 0,05% de Tween 20, 0,5% de BSA, Cloreto de Benzetônio
0,1 mM e 2 µg/mL de aprotinina. Os homogenatos foram centrifugados a 6900 RPM,
por 10 min a 4ºC. Os níveis de IL-1β foram mensurados através dos Kits de ELISA,
de acordo com as recomendações do fabricante R & D Systems®, (Minneapolis,
USA). A absorbância foi medida usando um leitor de microplacas a 450 nm e 550 nm
e os resultados foram expressos em pg/mg de tecido.
48
4.5.2 Medida da atividade da mieloperoxidase
O recrutamento de neutrófilos foi quantificado indiretamente através da
determinação da atividade da MPO, segundo o método descrito por Souza et al.
(2000) e Cunha et. al. (2004) com pequenas modificações. Os animais receberam
uma injeção intraplantar de carragenina (300 µg/pata) e foram sacrificados após 6
horas, tendo o tecido subcutâneo das patas traseiras coletado, congelado em
nitrogênio líquido e armazenado a - 20 ºC. Os tecidos foram homogeneizados a 5 %
(peso/volume) em tampão EDTA/NaCl/NaPO4 (pH 4,7), e centrifugados a 10.000 g,
por 15 minutos a 4ºC. O precipitado resultante foi ressuspendido em tampão 1
gelado (pH 7,4; NaCl 0,1 M, NaPO4 0,02 M e EDTA 0,015 M). Adicionou-se então
NaCl 0,2 % gelado e, após 30 s, NaCl 1,6 % contendo glicose 5 % (gelado). A
solução foi centrifugada a 10.000 g, por 15 min a 4 ºC. O precipitado formado foi
ressuspendido em tampão 2 gelado (pH 5,4; NaPO4 0,05 M e hexadeciltrimetilamônio – H-TAB 0,5 %) e as amostras obtidas foram congeladas e
descongeladas 3 vezes em nitrogênio líquido. Após o último descongelamento, as
amostras foram centrifugadas novamente a 10.000 g, por 15 minutos a 4 ºC, e 25 μL
do sobrenadante foram utilizados para o ensaio de MPO. A reação enzimática foi
realizada na presença de tetrametilbenzidina (TMB; 1,6 mM), fosfato de sódio
(NaPO4; 80 mM) e peróxido de hidrogênio (H2O2; 0,3 mM). A absorbância foi medida
em 650 nm, e os resultados foram expressos em densidade óptica (DO) por mg de
tecido.
4.6 Avaliação dos possíveis efeitos indesejáveis do tratamento com as
chalconas
4.6.1 Atividade locomotora (campo aberto)
O teste do campo aberto permite uma avaliação da atividade estimulante ou
depressora de um determinado composto no SNC, conforme descrito por Sielgel
(1946). O equipamento do campo aberto consiste em uma arena circular de acrílico
transparente com 60 cm de diâmetro e 50 cm de altura, com um piso dividido em 12
49
quadrantes. O número de cruzamentos realizado com as quatro patas foi
quantificado durante uma sessão de 6 minutos. Os animais foram tratados por via
intraperitoneal com os compostos ANCh (1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg), AcANCh
(0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg) ou veículo (10 mL/kg) e, por via subcutânea, receberam
controle positivo Morfina (17,52 µmol/kg). Após 30 minutos do tratamento, a
atividade locomotora dos animais foi avaliada.
4.6.2 Placa Quente
O teste da placa quente foi utilizado para mensurar a latência de resposta dos
animais frente à sensibilidade térmica, como descrito por Woolfe and MacDonald
(1944). Os animais foram pré-selecionados, 24 horas antes do teste, para verificação
do limiar nociceptivo. Para realização do teste, os animais foram tratados com ANCh
(1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg), AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg), morfina (17,52
µmol/kg) ou veículo (10 mL/kg) e 30 minutos após foram submetidos à avaliação. Os
camundongos foram então colocados sobre uma placa quente previamente
aquecida a 56 ± 1 oC. O tempo em segundos que cada animal levou para lamber,
morder ou levantar as patas foi considerado indicativo da latência de resposta. O
tempo máximo permitido aos animais para permanecerem sobre a placa foi de 30
segundos para evitar danos teciduais causados pelo aquecimento. A máxima
porcentagem de efeito (% MPE) foi calculada com base na seguinte equação:
4.6.3 Avaliação da Temperatura Corporal
A temperatura corporal dos animais foi mensurada 30 minutos após o
tratamento com os compostos ANCh (1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg), AcANCh (0,96,
3,22 ou 9,66 µmol/kg) ou veículo (10 mL/kg), através da inserção de um termômetro
digital lubrificado com glicerina em uma profundidade de 2 cm no reto dos animais
por aproximadamente 50 segundos, até que a temperatura estabilizasse.
50
4.7 Análise estatística
Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média
(EPM, 95%), exceto os valores das DI50 (doses da droga que produziram a resposta
em 50% em relação ao grupo controle), que são apresentadas como a média
geométrica acompanhada de seus respectivos limites de confiança, em nível de
95%. As porcentagens de inibição foram citadas como a média ± o erro padrão da
média da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas obtidas para
cada experimento individual em relação ao grupo controle correspondente. A análise
estatística dos dados foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de
duas vias seguida pelo teste de Bonferroni, de análise de variância (ANOVA) de uma
via seguida pelos testes de Dunnett ou Newman-Keuls, ou através do teste t de
Student, quando apropriado. Valores de p menores que 0,05 (P < 0,05) foram
considerados como indicativos de significância. Todas as análises citadas acima
foram realizadas utilizando o programa GraphPad PRISM®.
51
5 RESULTADOS
5.1 Análise “in silico”
Os resultados apresentados na tabela 1 demonstram que os compostos em
estudo não violam nenhum dos parâmetros sugeridos por Lipinski para que as
moléculas
apresentem
solubilidade
e
permeabilidade
adequadas
quando
administrados por via oral.
Tabela 1. Previsão teórica da solubilidade e permeabilidade das chalconas segundo
a “regra dos cinco” de Lipinski.
O
R
o
N de
Estrutura
NO 2
LogP*
PM
N
Átomos
.
o
N.
N de
b
OHNH
c
TPSA
Ligações
o
N de
Violações
Rotáveis
O
N
a
H2N
20
2,846
268,272
5
2
4
88,918
0
23
2,989 310,309
6
1
5
91,993
0
O
H3C
NH
Nota: *Método preditivo para logP desenvolvido por Molinspiration (milogP2.2 –
Novembro 2005).
a
Somatório das ligações aceptoras de hidrogênio (N e O).
b
Somatório das ligações doadoras de hidrogênio (NH e OH).
c
Área de superfície polar.
52
5.2 Ensaios in vivo
5.2.1 Hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina
Analisando os dados demonstrados na figura 8, pode-se observar que a
injeção i.pl. de carragenina promove hiperalgesia mecânica acentuada nos animais,
a qual pode ser avaliada a partir de uma hora após sua administração. O composto
ANCh (1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg), quando administrado intraperitonealmente, foi
capaz de reduzir significativamente a hiperalgesia mecânica induzida pela
carragenina, com inibição de 40 ± 4%, 43 ± 4% e 36 ± 4%, respectivamente (Fig. 8,
A e B). A Indometacina, fármaco utilizado como controle positivo, também reduziu a
hiperalgesia, com inibição de 62 ± 4% até a sexta hora.
Figura 8. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com ANCh (1,11-11,18 µmol/kg) (A e B, i.p) (C e D, v.o) em diferentes intervalos
de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ±
E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar de
retirada da pata, onde *p<0,05 e **p<0,01 (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni ou
seguido do teste de Dunnett). B: limiar basal. # Quando comparado com o limiar mecânico de retirada
basal (p<0,001).
+ ANCh (1,11  mol/kg, i.p)
+ ANCh (3,72  mol/kg, i.p)
+ ANCh (11,18  mol/kg, i.p)
Carragenina (300 g/pata)
+ Indometacina (13,97  mol/kg, i. p)
A
B
Carragenina (300 g/pata)
+ Indometacina ( 13,97  mol/kg, i. p)
#
400
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
100
50
25
**
300
B 1
3
4
6
24
**
100
B
48
C
Tempo (h)
+ Indometacina (13,97 mol/kg, v.o)
D
3,72 11,18
I
Carragenina (300 g/pata)
+ Indometacina ( 13,97  mol/kg, v.o)
100
#
400
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
1,11
ANCh
( mol/kg, i.p)
+ ANCh (1,11 mol/kg, v.o)
+ ANCh (3,72 mol/kg, v.o)
+ ANCh (11,18 mol/kg, v.o)
Carragenina (300 g/pata)
C
**
200
0
0
**
50
25
*
300
**
200
100
0
0
B 1
3
4
Tempo (h)
6
24
48
**
B
C
1,11
3,72 11,18
ANCh
(mol/kg, v.o)
I
53
Com base nos resultados obtidos na análise in silico acerca da solubilidade e
permeabilidade dos compostos, foi realizado o teste da carragenina com tratamento
por via oral. O composto ANCh reduziu significativamente a hiperalgesia na dose de
11,18 µmol/kg quando comparado ao grupo controle, com inibição de 60 ± 5%. Na
dose de 3,72 µmol/kg, também houve inibição, porém menos expressiva: 25 ± 7%
(Fig. 8 C e D).
Com relação ao composto AcANCh, todas as doses foram efetivas quando
administradas intraperitonealmente. As inibições foram de 35 ± 8% para a dose de
0,96 µmol/kg, 37 ± 7% para a dose de 3,22 µmol/kg e 46 ± 9% para a dose de 9,66
µmol/kg (Fig. 9 A e B). Entretanto, quando administrado por via oral, somente a dose
de 9,66 µmol/kg reduziu a hiperalgesia significativamente, com inibição de 29 ± 4%
(Fig. 9, C e D).
Figura 9. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg) (A e B, i.p) (C e D, v.o) em diferentes
intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como
a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do
limiar de retirada da pata, onde **p<0,01 (ANOVA de duas vias seguido do teste de Bonferroni ou do
teste de Dunnett). B: limiar basal. # Quando comparado com o limiar mecânico de retirada basal
(p<0,001).
A
+ AcANCh (0,96  mol/kg, i.p)
+ AcANCh (3,22  mol/kg, i.p)
+ AcANCh (9,66  mol/kg, i.p)
Carragenina (300 g/pata)
+ Indometacina (13,97  mol/kg, i. p)
B
Carragenina (300 g/pata)
+ Indometacina ( 13,97  mol/kg, i.p)
#
400
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
100
50
25
**
300
B 1
3
4
6
24
**
100
B
48
C
Tempo (h)
+ AcANCh (0,96 mol/kg, v.o)
+ AcANCh (3,22 mol/kg, v.o)
+ AcANCh (9,66 mol/kg, v.o)
+ Indometacina (13,97 mol/kg, v.o)
D
3,22
9,66
I
Carragenina (300 g/pata)
+ Indometacina ( 13,97  mol/kg, v .o)
100
#
400
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
0,96
AcANCh
(mol/kg, i.p)
Carragenina (300 g/pata)
C
**
200
0
0
**
50
25
0
B 1
3
4
6
Tempo (h)
24
48
**
300
**
200
100
0
B
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, v.o)
I
54
5.2.2 Hiperalgesia mecânica induzida pelo CFA
A injeção i.pl. de CFA reduziu significativamente o limiar de sensibilidade
mecânica dos animais quando comparado aos valores basais obtidos antes do teste,
como pode ser observado na fig. 10 (p < 0,001). Os compostos ANCh (11,18
µmol/kg, i.p) ou AcANCh (9,66 µmol/kg, i.p), quando administrados preventivamente,
ou seja, antes da injeção de CFA, foram capazes de reduzir significativamente o
surgimento da resposta hiperalgésica, com inibição de 18 ± 5% e 19 ± 7%,
respectivamente. O fármaco utilizado como controle positivo neste modelo foi a
Gabapentina, a qual apresentou inibição de 45 ± 8%.
Figura 10. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com ANCh (11,18 µmol/kg, i.p) (A e B) e AcANCh (9,66 µmol/kg, i.p) (C e D) em
diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µl/pata). Os dados são expressos como
a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do
limiar de retirada da pata, onde *p <0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ANOVA de duas vias seguido pelo
teste de Bonferroni (A e C) ou seguidos do teste de Newman-Kels (B e D). B: limiar basal. # Quando
comparado com o limiar mecânico de retirada basal (p<0,001).
CFA (20 L/pata)
A
CFA (20 L/pata)
 Gabapentina (40880 mol/kg, v.o)
+ ANCh (11,18  mol/kg, i.p)
B
+ ANCh (11,18 mol/kg, i. p)
+ Gabapentina (408,80 mol/kg, v. o)
#
400
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
100
50
25
*
***
300
200
100
0
0
B
1
3
4
6
B
C
Tempo (h)
CFA (20 L/pata)
+ AcANCh (9 ,66  mol/kg, i.p)
C
CFA (20 L/pata)
 Gabapentina (40880 mol/kg, v.o)
+ AcANCh (9,66  mol/kg, i.p)
D
+ Gabapentina (408,80 mol/kg, v. o)
#
400
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
100
50
25
0
B
1
3
Tempo (h)
4
6
*
***
300
200
100
0
B
C
55
A fim de avaliar o efeito curativo dos compostos em estudo, os animais
receberam a injeção i.pl. de CFA (20 µL/pata), e após 24 horas o tratamento foi
iniciado. A fig. 11 demonstra os resultados obtidos com o composto ANCh, através
da avaliação na pata ipsilateral (A, B e C) e na pata contralateral (D e E).
Na pata ipsilateral a inibição da hiperalgesia mecânica pelo composto ANCh
foi de 44 ± 2% para a dose de 1,11 µmol/kg, 44 ± 2% para a dose de 3,72 µmol/kg e
41 ± 2% para a dose de 11,18 µmol/kg, da primeira até a sexta hora. A inibição
promovida pelo fármaco controle gabapentina foi de 49 ± 6%, semelhante aos
resultados obtidos com o composto. O tratamento crônico com o composto ANCh
manteve as porcentagens de inibição com valores elevados para todas as doses. Do
segundo ao sexto dia, as inibições foram de 42 ± 6%, 32 ± 4% e 49 ± 2% nas doses
de 1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg, respectivamente. Após a interrupção do tratamento,
observou-se que o efeito anti-hiperalgésico voltou assim que o tratamento foi
retomado, sugerindo que o composto não promove tolerância.
Na pata contralateral, a porcentagem de inibição foi calculada do sexto ao
nono dia após a injeção intraplantar de CFA, período em que o tratamento com o
composto ANCh inibiu de forma significativa a frequência de resposta de retirada da
pata dos animais, como se pode observar na figura 11 (D e E). Somente a dose
11,18 µmol/kg foi capaz de inibir a sensibilização mecânica com inibição de 30 ± 9%.
Diferentemente do que foi descrito anteriormente para o composto ANCh, o
tratamento com o composto AcANCh foi efetivo somente na dose intermediária (3,22
µmol/kg), com inibição de 23 ± 7% e na maior dose (9,66 µmol/kg), com inibição de
36 ± 6%, quando analisado da primeira até a sexta hora na pata contralateral (Fig.
12, A e B). Já do segundo ao sexto dia, somente a dose de 9,66 µmol/kg foi efetiva,
com inibição de 20 ± 4%.
O que se observa na pata contralateral dos animais tratados com AcANCh, é
que somente a dose de 9,66 µmol/kg foi capaz de inibir a hiperalgesia mecânica,
com inibição de 18 ± 4% (Fig. 12, D e E). A gabapentina promoveu inibição de 36 ±
2%.
56
Figura 11. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com ANCh (1,11-11,18 µmol/kg,
i.p) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µL/pata). (A, B e C) Avaliação da pata ipsilateral. (D e E) Avaliação da pata
contralateral. Os dados são expressos como a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar de
retirada da pata, onde **p<0,01. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni (A e D) ou seguidos do teste de Dunnett (B, C e E). B: limiar basal. . #
Quando comparado com o limiar mecânico de retirada basal (p<0,001).
+ ANCh (1,11  mol/kg, i.p)
+ ANCh (3,72  mol/kg, i.p)
+ ANCh (11,18  mol/kg, i.p)
CFA (20 L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v.o)
B
C
500
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
#
600
#
400
75
50
25
B 1
3
4
6 2
300
**
**
**
**
200
100
3
Tempo (h)
4
5
6
7
8
0
9
B
C
Tempo (d)
D
 Gabapentina (408  80  mol/kg, v.o)
1,11
3,72
11,18
CFA (20 L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v .o)
#
500
75
AUC (6 - 9 d)
400
25
**
**
11,18
G
300
200
100
Trat. 1x dia
Trat. 1x dia
0
0
B1
3
4
Tempo (h)
6 2
3
4
5
6
Tempo (d)
7
8
9
300
**
**
**
200
B
C
1,11
3,72
B
C
1,11
3,72 11,18
ANCh
( mol/kg, i.p)
E
100
50
**
0
G
ANCh
(mol/kg, i.p)
 ANCh (1  11  mol/kg, i.p)
 ANCh (3  72  mol/kg, i.p)
 ANCh (11  18  mol/kg, i.p)
CFA (20 L/pata)
400
100
Trat. 1x dia
Trat. 1x dia
0
Frequência de Resposta (%)
CFA (20 L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v.o)
CFA (20 L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v .o)
100
AUC (2 - 6 d)
A
ANCh
(mol/kg, i.p)
G
57
Figura 12. Frequência de resposta de retirada da pata traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg, i.p) em
diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µL/pata). (A, B e C) Avaliação da pata ipsilateral. (D e E) Avaliação da pata contralateral. Os
dados são expressos como a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar de retirada da pata,
onde **p<0,01. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni (A e D) ou seguidos do teste de Dunnett (B, C e E). B: limiar basal. . # Quando
comparado com o limiar mecânico de retirada basal (p<0,001).
+ AcANCh (0,96  mol/kg, i.p)
 AcANCh (3 22  mol/kg, i.p)
 AcANCh (9 66  mol/kg, i.p)
CFA (20 L/pata)
A
+ Gabape ntina (408,80  mol/kg, v .o)
B
C
CFA (20  L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v.o)
75
25
Trat. 1x dia
**
200
**
100
3
4
6 2
3
Tempo (h)
4
5
6
7
8
C
Tempo (d)
D
+ Gabape ntina (408,80  mol/kg, v .o)
0,96
3,22
9,66
G
AcANCh
(mol/kg, i.p)
 AcANCh (0 96  mol/kg, i.p)
+ AcANCh (3,22  mol/kg, i.p)
+ AcANCh (9,66  mol/kg, i.p)
CFA (20 L/pata)
CFA (20  L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v.o)
500
#
*
400
AUC (6 - 9 d)
Frequência de Resposta (%)
100
50
25
**
300
200
100
Trat. 1x dia
Trat. 1x dia
0
0
B 1
3
4
Tempo (h)
6 2
3
4
5
6
Tempo (d)
7
8
9
200
B
C
0,96
3,22
AcANCh
(mol/kg, i.p)
9,66
B
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, i.p)
E
75
**
300
0
B
9
400
100
0
B 1
*
500
*
300
Trat. 1x dia
0
#
600
AUC (2 - 6 d)
50
CFA (20 L/pata)
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v.o)
#
400
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
100
G
G
58
5.2.3 Hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS
Os resultados apresentados na fig. 13 nos permitem visualizar que, os
compostos ANCh (1,11-11,18 µmol/kg) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg), quando
administrados intraperitonealmente, não foram capazes de inibir a hiperalgesia
mecânica induzida pelo LPS nos animais.
Figura 13. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com ANCh (1,11-11,18 µmol/kg, i.p) (A) ou AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg, i.p) (B)
em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata). Os dados são expressos
como a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de
Bonferroni. B: Limiar basal.
A
B
+ ANCh (1,11  mol/kg, i.p)
+ ANCh (3,72  mol/kg, i.p)
+ ANCh (11,18  mol /kg, i.p)
LPS (100 ng/pata)
LPS (100 ng/pata)
100
Frequência de Resposta (%)
Frequência de Resposta (%)
100
+ AcANCh (0,96  mol /kg, i.p)
+ AcANCh (3,22  mol /kg, i.p)
+ AcANCh (9,66  mol /kg, i.p)
75
50
25
0
75
50
25
0
B 1
3
4
6
Tempo (h)
24
48
B 1
3
4
6
24
48
Tempo (h)
5.2.4 Hiperalgesia induzida pela ligação parcial do nervo ciático (LPNC)
A dor neuropática é induzida neste modelo pela LPNC. A ligação parcial do
nervo promove redução do limiar basal em resposta à estimulação pelo
monofilamento de Von Frey 0,6 g quando comparado com o grupo falso operado. A
fig. 14, demonstra que o composto ANCh (1,11-11,18 µmol/kg, i.p), foi capaz de
reverter de forma significativa a sensibilização mecânica dos animais com inibições
de 31 ± 7%, 43 ± 7% e 66 ± 8%, respectivamente quando analisados da primeira até
a sexta hora. O efeito foi dependente da dose, com DI 50 de 9,12 (7,27 – 11,44)
µmol/kg. Avaliando o efeito referente ao tratamento crônico com o composto ANCh
(do 2o ao 6o dia), pode-se observar que o mesmo também foi dose-dependente, com
inibições de 21 ± 3% para a dose de 1,11 µmol/kg, 42 ± 3% para a dose de 3,72
µmol/kg e 60 ± 4% para a dose de 11,18 µmol/kg, com DI50 de 10,71 (9,36 – 12,27)
59
µmol/kg. Já o composto AcANCh (0,96, 3,22 ou 9,66 µmol/kg) promoveu inibições de
26 ± 6%, 39 ± 5% e 72 ± 5%, respectivamente (1a até a 6 a hora). O efeito crônico do
tratamento (2o ao 6o dia) gerou inibições de 29 ± 6%, 42 ± 9% e 67 ± 4% para as
mesmas doses e DI50 de 7,59 (6,52 – 8,84) µmol/kg.
60
Figura 14. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com ANCh (1,11-11,18 µmol/kg,
i.p) (A, B e C) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg, i.p) (D, E e F) em diferentes intervalos de tempo após a cirurgia de LPNC. Os dados são expressos como a
média ± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01.
ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni (A e D) ou seguidos do teste de Dunnett (B, C, E e F). B: limiar basal. # Quando comparado com o
limiar mecânico de retirada basal (p<0,001).
+ ANCh (1,11 mol/kg, i.p)
+ ANCh (3,72 mol/kg, i.p)
+ ANCh (11,18 mol/kg, i.p)
LPNC
+ Gabapentina (408,80 mol/kg, v.o)
Falso-Operado
B
0
4
6 2
3
Tempo (h)
4
**
100
5
6
7
8
Falso-Operado
E
C
3,72 11,18
B
G
AUC (1 - 6 h)
50
25
F
0
3
3,72 11,18
G
4
5
6
Tempo (d)
7
8
9
LPNC
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v .o)
600
**
300
**
200
**
100
**
500
400
**
300
**
**
9,66
G
200
100
0
6 2
1,11
#
#
Trat. 1x dia
Trat. 1x dia
4
C
ANCh
( mol/kg, i.p)
*
3
**
200
0
1,11
LPNC
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v .o)
400
75
Tempo (h)
**
300
ANCh
(mol/kg, i.p)
100
B1
**
400
100
B
9
*
 AcANCh (0  96 mol/kg, i.p)
+ AcANCh (3,22 mol/kg, i.p)
+ AcANCh (9,66 mol/kg, i.p)
+ Gabapentina (408,80 mol/kg, v.o)
Frequência de Resposta (%)
**
200
Tempo (d)
LPNC
D
300
0
3
**
Trat. 1x dia
Trat. 1x dia
B1
500
*
AUC (2 - 6 d)
25
#
600
400
50
LPNC
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v.o)
C
LPNC
+ Gabapentina (408,80  mol/kg, v .o)
#
75
AUC (1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
100
AUC (2 - 6 d)
A
B
C
0
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, i.p)
G
B
C
0,96
3,22
AcANCh
(mol/kg, i.p)
61
5.2.5 Hiperalgesia mecânica induzida por IL1-β, TNF-α, CXCL1/KC, epinefrina,
BK e PGE2
A figura 15 ilustra a Frequência de resposta dos animais tratados com a dose
mais efetiva de ambos os compostos e do grupo controle frente à hiperalgesia
mecânica induzida por diferentes agentes flogísticos, avaliados 3 horas após a
injeção i.pl. O composto ANCh (A) reverteu a hiperalgesia induzida por IL1-β, TNF-α,
Epinefrina e PGE2, com inibições de 42 ± 5%, 43 ± 11%, 46 ± 8% e 59 ± 4%,
respectivamente. O composto AcANCh (B) apresentou resultados semelhantes,
tendo porcentagem de inibição de 42 ± 8% para IL1-β, 39 ± 11% para o TNF-α e 40
± 7% para a epinefrina, porém o mesmo não foi capaz de reduzir a Frequência de
resposta dos animais frente a PGE2.
Figura 3. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e
em animais tratados com ANCh (11,18 µmol/kg, i.p) (A) e AcANCh (9,66 µmol/kg, i.p) (B), 3 horas
após a injeção do agente álgico (Exceto epinefrina – 30 min.). Os dados são expressos como a média
± E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar
de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 (Teste t de Student). B: limiar basal. #
Quando comparado com o limiar mecânico de retirada basal (p<0,001).
A
#
#
#
#
#
#
75
***
50
***
*
***
25
0
B
IL1-
TNF-
KC
EP
BK
AcANCh (9,66  mol/kg, i.p)
100
PGE 2
Frequência de Resposta (%)
Frequência de Resposta (%)
B
ANCh (11,18  mol/kg, i.p)
100
#
#
#
#
#
#
75
**
50
**
*
25
0
B
IL1- TNF-
KC
EP
BK
PGE2
5.2.6 Padronização experimental
A hiperalgesia mecânica induzida por células tumorais se trata de um modelo
experimental nunca antes realizado em nossa Universidade, desta forma, avaliou-se
o padrão de resposta dos animais frente a duas concentrações de células injetadas
na superfície plantar direita traseira. A escolha das concentrações celulares foi
realizada com base na literatura (SASAMURA et. al., 2002; GAO et al. 2009; FUJITA
62
et. al., 2010). A figura 16 demonstra a frequência de resposta de retirada da pata,
avaliada a partir do terceiro dia de inoculação das células tumorais. Nesta primeira
etapa experimental os animais não receberam nenhum tipo de tratamento.
Figura 16. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada nos grupos
controle, os quais receberam a injeção i.pl. de diferentes concentrações da linhagem celular B16F10
ou meio de cultura utilizado como veículo para as células.
Frequência de Resposta (%)
2X105 células B16F10
6X105 células B16F10
Meio de cultura
100
75
50
25
0
3 4 5 6 7
10 12 14
17
22
28
Tempo (dias após a inoculação)
Pode-se observar na fig. 16 que a resposta nociceptiva dos animais se torna
acentuada a partir do 5o dia após a inoculação das células tumorais, permanecendo
praticamente inalterada até o 14o dia quando atinge o valor máximo. Cabe também
ressaltar que o padrão de resposta das duas concentrações foi muito semelhante e
não apresentou diferença estatística. Devido à debilidade dos animais que
receberam a concentração de 6x105 células tumorais, a avaliação foi interrompida no
22o dia.
Para compreender o perfil da progressão tumoral apresentado pelos animais
injetados com as duas concentrações celulares, foi utilizado o pletismômetro (Ugo
Basile, Italy). Este equipamento é utilizado para mensurar o volume do edema
gerado na pata injetada por diferentes agentes flogísticos em modelos de
inflamação. Desta forma, o volume tumoral foi calculado como a diferença entre a
pata direita (injetada) e a pata esquerda (normal), conforme demonstrado na figura
17. O valor encontrado é expresso em microlitros.
63
Figura 17. Representação da medida das patas injetadas com células B16F10 no aparelho
Pletismômetro, onde o volume expresso em microlitros é dado como a diferença entre as patas
posteriores direita e a esquerda.
Pata Direita
(Injetada)
Pata Esquerda
(Normal)
Os mesmos animais utilizados para avaliar a hiperalgesia mecânica foram
avaliados quanto ao perfil do desenvolvimento do tumor sólido na pata. Como se
pode observar na fig. 18, os animais que receberam a injeção intraplantar de 6x10 5
células B16F10 demonstraram um crescimento tumoral muito rápido, atingindo o
tamanho máximo em 22 dias após a inoculação. Já os animais que receberam a
menor concentração de células tiveram um perfil mais linear de crescimento. Com
base nestes dados e pelo fato de não haver diferença ente a resposta nociceptiva
dos animais, a concentração de 2x105 foi a escolhida para a realização dos demais
experimentos. A figura 18 também demonstra que é a partir do 14º dia de inoculação
que o tumor sólido começa a atingir um volume mensurável no pletismômetro,
justamente no dia em que a nocicepção também atinge seu ponto máximo, conforme
demonstrado anteriormente na fig. 16.
64
Figura 48. Volume da pata dos animais, avaliado do 3º ao 28º dia após a injeção i.pl. das células
tumorais.
2X105 células B16F10
6X105 células B16F10
Meio de cultura
 Volume da Pata (l)
500
400
300
200
100
0
3 4 5 6 7
10 12 14
17
22
28
Tempo (dias após a inoculação)
5.2.7 Hiperalgesia induzida por B16F10
Os resultados expressos na fig. 19 demonstram a avaliação do efeito antihiperalgésico do composto ANCh em camundongos machos e fêmeos a fim de
verificar uma possível diferença de resposta em decorrência do sexo.
Todos os animais apresentaram sensibilização mecânica sete dias após a
inoculação das células tumorais da linhagem B16F10, tanto machos quanto fêmeos.
No experimento realizado com machos (A, B e C), o composto ANCh foi efetivo
somente na dose de 11,18 µmol/kg, com inibições de 52 ± 6% (1a - 6a h) e 59 ± 4%
(9o ao 21o dia). Com os camundongos fêmeos (D, E e F) o resultado foi expressivo
em todas as doses, com inibições de 18 ± 3%, 28 ± 4% e 34 ± 4% para as doses de
1,11, 3,72 ou 11,18 µmol/kg, respectivamente (1a - 6a h). Do 9o ao 21o dia a inibição
foi significativa apenas nas doses de 3,72 µmol/kg (15 ± 5%) e 11,18 µmol/kg (38 ±
3%).
A figura 20 demonstra os resultados encontrados com o composto AcANCh
realizados também com machos (A, B e C) e fêmeos (D, E e F). Dentre todas as
análises estatísticas realizadas, pode-se observar que os resultados obtidos com o
composto AcANch foram efetivos somente da 1 a até a 6 a hora em camundongos
machos, com inibições de 44 ± 5%, 39 ± 6% e 39 ± 1% para as doses de 0,96, 3,22
e 9,66 µmol/kg, respectivamente.
65
Figura 19. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com ANCh (1,11-11,18 µmol/kg,
i.p) em diferentes intervalos de tempo após a injeção de B16F10 (2x105 cél.) (A, B e C) Machos (D, E e F) Fêmeos. Os dados são expressos como a média ±
E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01. ANOVA de
duas vias seguido pelo teste de Bonferroni (A e D) ou seguidos do teste de Dunnett (B, C, E e F). B: limiar basal. # Quando comparado com o limiar
mecânico de retirada basal (p<0,001).
B16F10 (2x10 5 cél./30 L)
+ Morfina (3,50 mol/kg, s.c)
+ Meio de Cultura (30 L)
A
+ ANCh (1,11  mol/kg, i.p)
B
+ ANCh (3,72  mol/kg, i.p)
C
5
B16F10 (2x10 células)
+ ANCh (11,18  mol/kg, i.p)
#
#
800
50
25
300
*
200
*
100
AUC (9 - 21 d)
75
AUC (1 - 6 h)
600
**
**
400
200
Trat. 2x dia
0
B 1
3
4
6
8 9 10 11 12 13
Tempo (h),
7 dias após a inoculação.
21
25
B
C
1,11
M eio de Cultura (30 L)
3,72 11,18
0
M
B
C
ANCh
( mol/kg, i.p)
Dias após a inoculação
B16F10 (2x105 cél./30 L))
+ M orfina (3,50  mol/kg, s.c)
D
16
+ ANCh (1,11  mol/kg, i.p)
+ ANCh (3,72  mol/kg, i.p)
+ ANCh (11,18  mol/kg, i.p)
E
B16F10 (2x10 5 células)
 Morfina (350 mol/kg, s.c)
#
400
AUC (1 - 6 h)
M
B16F10 (2x105 células)
 Morfina (350 mol/kg, s.c)
#
1000
75
25
3,72 11,18
F
100
50
1,11
ANCh
(mol/kg, i.p)
*
*
300
**
**
**
200
100
AUC (9 - 21 d)
Frequência de Resposta (%)
400
0
Frequência de Resposta (%)
B16F10 (2x10 5 células)
 Morfina (350 mol/kg, s.c)
 Morfina (350 mol/kg, s.c)
100
750
**
**
500
250
Trat. 2x dia
0
B 1
3
4
Tempo (h),
7 dias após a inoculação.
6
8 9 10 11 12 13
16
21
Dias após a inoculação
25
0
B
C
1,11
3,72
11,18
ANCh
( mol/kg, i.p)
0
M
B
C
1,11
3,72 11,18
ANCh
(mol/kg, i.p)
M
66
Figura 20. Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg,
i.p) em diferentes intervalos de tempo após a injeção de B16F10 (2x105 cél.) (A, B e C) Machos (D, E e F) Fêmeos. Os dados são expressos como a média ±
E.P.M. de 4 – 6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significante do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01. ANOVA de
duas vias seguido pelo teste de Bonferroni (A e D) ou seguidos do teste de Dunnett (B, C, E e F). B: limiar basal. # Quando comparado com o limiar
mecânico de retirada basal (p<0,001).
A
B16F10 (2x10 5 cél./30 L)
+ M orfina (3,50  mol/kg, i.p)
+ AcANCh (0,96  mol/kg, i.p)
M eio de Cultura (30 L)
+ AcANCh (9,66  mol/kg, i.p)
B
+ AcANCh (3,22  mol/kg, i.p)
C
50
25
800
300
**
**
**
**
200
100
AUC (9 - 21 d)
AUC ( 1 - 6 h)
Frequência de Resposta (%)
#
#
400
75
600
400
200
Trat. 2x dia
0
B 1
3
4
6
8 9 10 11 12 13
D
16
21
0
0
25
B
C
0,96
Dias após a inoculação
Tempo (h),
7 dias após a inoculação.
3,22
9,66
B
M
C
B16F10 (2x105 cél./30 L)
+ Morfina (3,50 mol/kg, s.c)
+ AcANCh (0,96  mol/kg, i.p)
Meio de Cultura (30 L)
+ AcANCh (9,66  mol/kg, i.p)
E
+ AcANCh (3,22  mol/kg, i.p)
400
25
9,66
M
B16F10 (2x10 5 células)
+ Morfina (3,50 mol/kg, s.c)
#
1000
#
300
AUC (9 - 21 d)
AUC (1 - 6 h)
50
3,22
F
B16F10 (2x105 células)
+ Morfina (3,50 mol/kg, s.c)
75
0,96
AcANCh
(mol/kg, i.p)
AcANCh
(mol/kg, i.p)
100
Frequência de Resposta (%)
B16F10 (2x10 5 células)
+ Morfina (3,50 mol/kg, s.c)
B16F10 (2x10 5 células)
+ Morfina (3,50 mol/kg, s.c)
100
200
100
*
750
500
250
Trat. 2x dia
0
B 1
3
4
Tempo (h),
7 dias após a inoculação.
6
8 9 10 11 12 13
16
21
Dias após a inoculação
25
0
B
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, i.p)
0
M
B
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
( mol/kg, i.p)
M
67
5.2.8 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre os níveis de IL-1β
O tratamento com os compostos ANCh (3,72, 11,18 ou 37,37 µmol/kg, i.p)
(Fig. 21, A) e AcANCh (3,22, 9,66 e 32,22 µmol/kg, i.p) (Fig. 21, B) reduziram, de
forma significativa, os níveis de IL1-β induzidos pela injeção i.pl de carragenina (300
µg/pata) na pele da pata dos camundongos. As porcentagens de inibição do
composto ANCh foram de 57 ± 3%, 49 ± 5% e 71 ± 5%. Os resultados obtidos com o
composto AcANCh foram dose-dependentes, com inibição de 56 ± 4%, 63 ± 2% e 86
± 2% para as doses de 3,22, 9,66 e 32,22 µmol/kg, respectivamente. A DI50 foi de
10,25 (9,39 – 11,18) µmol/kg.
Figura 21. Efeito dos compostos ANCh (3,72-37,27 µmol/kg, i.p) (A) e AcANCh (3,22-32,22
µmol/kg, i.p) (B) sobre os níveis de IL-1β 4 horas após injeção i.pl. de carragenina (300 μg/pata). Os
dados são expressos como a média ± E.P.M. de 4 animais em cada grupo. ANOVA seguido do teste
de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas comparadas com o grupo controle (**p<0,01).
A
B
Carragenina (300 g/pata)
Salina (0,9%)
Carragenina (300 g/pata)
Salina (0,9%)
2.5
2.0
1.5
1.0
**
**
**
**
0.5
0.0
S
C
3,72
11,18
Níveis de IL-1 
(pg/mg tecido)
Níveis de IL-1 
(pg/mg tecido)
2.5
37,27
2.0
1.5
1.0
**
**
**
0.5
**
0.0
S
ANCh
(mol/kg, i.p)
C
3,22
9,66
32,22
AcANCh
(mol/kg, i.p)
5.2.9 Medida da atividade da mieloperoxidase
Os resultados referentes ao ensaio bioquímico que avalia a atividade da
enzima mieloperoxidase podem ser observados na fig. 22. O composto ANCh foi
capaz de inibir a atividade da MPO somente na dose de 11,18 µmol/kg, com inibição
de 66 ± 4%, embora pareça exercer uma atividade dependente da dose. O resultado
encontrado com o composto foi tão eficaz quanto o demonstrado pelo fármaco
padrão utilizado como controle, a Indometacina, o qual apresentou inibição de 47 ±
7%. Já o composto AcANCh não foi capaz de influenciar significativamente a
atividade da enzima em nenhuma das três doses testadas.
68
Figura 22. Efeito dos compostos ANCh (1,11-11,18 µmol/kg, i.p) (A) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg,
i.p) (B) sobre a atividade da mieloperoxidase 6 horas após injeção i.pl. de carragenina (300 μg/pata).
Os dados são expressos como a média ± E.P.M. de 4 animais em cada grupo. ANOVA seguido do
teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas comparadas com o grupo controle
(*p<0,05 e **p<0,01).
A
2.0
1.5
*
1.0
**
0.0
**
2.0
1.5
C
1,11
*
1.0
0.5
0.0
S
Carragenina (300 g/pata)
Salina (50 L/pata)
+ Indometacina (13,97 mol/kg, i.p)
2.5
MPO (D.O/mg/tecido)
MPO (D.O/mg/tecido)
2.5
0.5
B
Carragenina (300 g/pata)
Salina (50 L/pata)
+ Indometacina (13,97 mol/kg, i.p)
3,72 11,18
**
S
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
( mol/kg, i.p)
ANCh
(mol/kg, i.p)
5.2.10 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a atividade locomotora
(campo aberto)
A fim de verificar a possível efeito sedativo ou relaxante muscular dos
compostos testados, foi realizado o teste do campo aberto. Os resultados
apresentados na figura 23 demonstram que nenhuma das doses dos compostos
testados ANCh (A) e AcANCh (B) foram capazes de afetar, de maneira significativa,
a atividade locomotora dos animais 30 minutos após o tratamento, como ocorreu
com o tratamento com o controle positivo Morfina (17,52 µmol/kg).
Figura 23. Efeito dos compostos ANCh (1,11-11,18 µmol/kg, i.p) (A) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg,
i.p) (B) sobre a atividade locomotora dos animais. Os dados são expressos como a média ± E.P.M de
6 animais em cada grupo. ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças
significativas comparadas com o grupo controle (**p<0,01).
A
B
Morfina (17,52 mol/kg, s.c)
250
**
200
150
100
50
0
C
1,11
3,72
11,18
ANCh
(mol/kg, i.p)
Número de Cruzamentos
Número de Cruzamentos
Controle
Controle
Morfina (17,52  mol/kg, s.c)
**
200
150
100
50
0
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, i.p)
69
5.2.11 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a latência de resposta dos
animais na Placa Quente
Pode-se observar na fig. 24, que ambos os compostos testados (ANCh e
AcANCh) não foram capazes de alterar a latência de resposta dos animais no teste
da placa quente quando comparados com o grupo controle. O fármaco padrão
Morfina, na dose de 17,52 µmol/kg, promoveu um aumento no tempo de
permanência dos animais na placa aquecida, ou seja, foi capaz de alterar a latência
de resposta dos mesmos.
Figura 24. Efeito dos compostos ANCh (1,11-11,18 µmol/kg, i.p) (A) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg,
i.p) (B) sobre a latência de resposta dos animais. Os dados são expressos como a média ± E.P.M. de
4-6 animais em cada grupo. ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças
significativas comparadas com o grupo controle (**p<0,01).
A
B
Controle
Morfina (17,52 mol /kg, s.c)
30
Controle
Morfina (17,52 mol/kg, s.c)
30
**
**
20
% MPEs
% MPEs
20
10
0
10
0
C
1,11
3,72
11,18
-10
-10
ANCh
(mol/kg, i.p)
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, i.p)
5.2.12 Efeito dos compostos ANCh e AcANCh sobre a temperatura corporal
dos animais
Conforme ilustrado na fig. 25, o tratamento com os compostos ANCh (1,1111,18 µmol/kg, i.p) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg) não produziu alterações na
temperatura corporal dos animais quando comparados com o grupo controle. O
fármaco morfina, utilizado como controle em diversos experimentos, também não
produziu alteração na temperatura corpórea dos animais na dose testada.
Figura 25. Efeito dos compostos ANCh (1,11-11,18 µmol/kg, i.p) (A) e AcANCh (0,96-9,66 µmol/kg,
i.p) (B) sobre a temperatura retal dos animais. Os dados são expressos como a média ± E.P.M. de 6
70
animais em cada grupo. ANOVA seguido do teste de Dunnett.
A
Controle
Morfina (17 52 mol/kg, s.c)
30
20
10
0
Controle
Morfina (1752 mol/kg, s.c)
40
Temperatura Retal (  C)
Temperatura Retal (  C)
40
B
30
20
10
0
C
1,11
3,72
11,18
ANCh
(mol/kg, i.p)
M
C
0,96
3,22
9,66
AcANCh
(mol/kg, i.p)
M
71
6 Discussão
A incidência de dor crônica está estimada entre 20 a 25% em todo o mundo.
Para muitos pacientes, múltiplos aspectos de suas vidas podem ser alterados,
incluindo a saúde física, emocional e espiritual, bem como a habilidade de trabalhar
e relacionar-se familiar e socialmente. Poucos pacientes que possuem este tipo de
dor obtêm alívio completo a partir dos fármacos disponíveis, sendo que metade
deles relata alívio inadequado. A ineficiência dos tratamentos está relacionada com
o fato de que um mesmo mecanismo pode ser responsável por diferentes sintomas
em um mesmo paciente. Além disso, o mesmo sintoma pode advir de mecanismos
distintos em dois indivíduos diferentes. Dentro deste contexto, os pacientes
desprendem meses ou anos para encontrar o tratamento farmacológico que irá
prover o máximo alívio com efeitos adversos toleráveis. Considerando a
complexidade do processo doloroso crônico, possivelmente nunca teremos um
tratamento único e ideal para todos os pacientes. Por isso, a busca por novas
terapias adjuvantes deve ser incessante (WOOLF; MANNION, 1999; ARNSTEIN,
2004; GOLD; GEBHART, 2010).
Com o intuito de contribuir com a busca de novas moléculas com atividades
terapêuticas no tratamento da dor crônica, o efeito anti-hiperalgésico dos compostos
ANCh e AcANCh foi avaliado frente a modelos de dor persistente de origem
inflamatória, neuropática e neoplásica.
O primeiro modelo utilizado para avaliar a inibição da dor de origem
inflamatória foi a hiperalgesia induzida pela carragenina. A carragenina é um agente
flogístico utilizado para induzir inflamação não específica, através da ativação da
resposta imune inata. É bastante conhecida por induzir exudação inflamatória aguda
e edema de pata, além de lesões em vasos sanguíneos e liberação de cininas
(NACIFE et. al., 2004; REICHLING; LEVINE, 2009). Por estes motivos, têm sido
muito utilizada para investigar a atividade anti-inflamatória e anti-hiperalgésica de
novas substâncias (SAMMONS et. al., 2000).
A injeção i.pl. de carragenina em roedores está associada com uma
hiperalgesia aguda, que é detectada como uma diminuição do limiar de retirada da
pata em resposta a um estímulo mecânico aplicado no local da injeção (NACIFE et.
al., 2004). A resposta imune desencadeada pela carragenina envolve a ativação de
72
macrófagos residentes, mastócitos e células endoteliais, responsáveis pela liberação
de citocinas proinflamatórias (incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6) e mediadores (por
exemplo, óxido nítrico), os quais contribuem para o desenvolvimento da hiperalgesia
mecânica e térmica (OMOTE et. al., 2001).
Os neutrófilos são as primeiras células recrutadas da circulação para a pata
inflamada e apresentam índices elevados 1,5 a 3 horas após a injeção i.pl.. Tem sido
relatado em diversos trabalhos que a hiperalgesia máxima é atingida 4 horas após a
injeção i.pl. de carragenina através dos chamados mediadores finais da inflamação,
como por exemplo, as prostaglandinas (SAMMONS et. al., 2000; NACIFE et. al.,
2004; FECHO et. al., 2007; REICHLING; LEVINE, 2009).
Os resultados obtidos através da avaliação dos compostos em estudo,
quando administrados por via i.p, frente a este modelo, demonstram inibição
significativa, principalmente até a terceira hora de administração para ambos
compostos. Ribeiro et. al. (2000) sugerem que a cascata liberada pela carragenina
pode ser considerada bifásica, sendo que a primeira fase estaria sendo
desencadeada principalmente por citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-8) e a segunda fase
pelo aumento de prostanóides e radicais livres. Sugere-se então, que os compostos
possam estar influenciando na fase aguda da inflamação gerada pela carragenina.
A diminuição do limiar de retirada da pata pelos animais neste modelo é
caracterizada pela liberação de vários mediadores inflamatórios, tais como os
metabólitos do ácido araquidônico (PGE2), produtos originados de mastócitos como
histamina (que pode liberar SP e CGRP), SP, BK, (IL-1β, TNF-α e IL-6 já citados
anteriormente), NGF, além de fatores de transcrição como o NF-ĸB (MILLAN, 1999;
SAMMONS et. al., 2000; CUNHA et al., 2005; REICHLING; LEVINE, 2009). Cunha
et al. (2005) ressaltam ainda que a hiperalgesia induzida pela carragenina em
camundongos depende de duas citocinas chaves, TNF-α e KC. Ambas atuam
através da liberação de IL-1β e da produção de prostanóides pela própria citocina IL1β. Com base nestes dados, sugere-se um mecanismo de ação amplo dos
compostos visto que a carragenina é um agente inflamatório utilizado primariamente
na avaliação da atividade anti-hiperalgésica. Talvez os mesmos possam interferir
nas diferentes vias responsáveis pela sinalização da dor de origem inflamatória,
incluindo a ação de citocinas e a sensibilização periférica de neurônios sensoriais.
Os resultados obtidos através do pré-tratamento dos camundongos por via
oral com o composto ANCh foram ainda mais significativos do que quando
73
administrado por via i.p., sugerindo que possivelmente a metabolização hepática
pela qual o composto é submetido quando administrado por via oral pode estar
sendo crucial para sua ação. Em contrapartida, o composto AcANCh apresentou
resultados menos significativos quando administrado por via oral. Vale ressaltar que
a dose utilizada em ambos os tratamentos (i.p e v.o) foi a mesma, e somente a dose
de 9,66 µmol/kg foi significativa para o composto AcANCh. Não se pode descartar a
hipótese de que com o aumento da dose essa inibição seja maior.
Por outro lado, quando avaliados no modelo do LPS, os compostos não foram
capazes de inibir a hiperalgesia em nenhuma das doses testadas. O LPS é um
componente importante da membrana externa de bactérias Gram-negativas e um
dos iniciadores microbianos mais potentes da inflamação. É capaz de provocar
ativação e lesões em diversas células, o que acaba alterando a fisiologia das
mesmas (NACIFE et. al., 2004).
Os mecanismos moleculares de ativação de macrófagos pelo LPS envolvem
diversas quinases, como a PKC, PKA e três classes de proteínas quinase ativadas
por mitógeno (MAPK): ERK1, ERK2, JNK e P38 MAPK. Além das quinases, quando
o LPS se liga aos receptores toll like tipo 4 (TLR4), através de uma cascata de
sinalização, gera a ativação do fator de transcrição nuclear (NFĸB), que promove a
ativação da transcrição de genes para diversos mediadores da resposta
imunológica. O LPS também é capaz de induzir a produção de
citocinas pró-
inflamatórias, como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12 por monócitos e macrófagos. Os
macrófagos também secretam, em resposta ao LPS, uma grande variedade de
outros mediadores da resposta biológica, incluindo fator ativador de plaquetas (PAF),
prostaglandinas, enzimas e radicais livres, como o NO. A produção dessas citocinas
inflamatórias contribui para o controle eficiente do crescimento e disseminação de
patógenos invasores ao organismo (FUJIHARA et. al., 2003).
Como já mencionado anteriormente, a hiperalgesia induzida pela injeção i.pl.
de LPS tem relação com as citocinas IL-1β e TNF-α. Entretanto, neste modelo,
parece que a hiperalgesia mediada por citocinas é independente de prostanóides,
sugerindo um efeito direto da IL-1β, embora outros mediadores primários possam
participar (por exemplo, aminas simpáticas, leucotrienos, e ou endotelinas) (CUNHA
et al., 2005).
Conforme os resultados apresentados anteriormente com a realização deste
modelo, pode-se sugerir que os compostos ANCh e AcANCh não interferem na
74
cascata de sinalização intracelular ativada pela ligação do LPS aos receptores TLR4,
possivelmente pelo fato deste agente flogístico ser capaz de ativar duas vias
nucleares de transcrição de genes independentes, o que demonstra a complexidade
de sua ação.
O Mycobacterium tuberculosis inativado por calor (CFA), quando injetado na
pata de roedores, produz inflamação persistente, caracterizada pelo recrutamento de
células inflamatórias, e consequente liberação de mediadores inflamatórios, edema,
bem como nocicepção marcada e prolongada (WOOLF; MANNION, 1999). Neste
modelo de hiperalgesia inflamatória, a liberação da citocina TNF-α induz a secreção
de IL-1β, as quais juntas estimulam a produção de NGF. Acredita-se que este fator
de crescimento seja um dos principais mediadores envolvidos no mecanismo de
hiperalgesia induzido pelo CFA (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al., 2005).
A fim de verificar o efeito do tratamento profilático com os compostos, os
animais foram pré-tratados com ANCh e AcANCh somente na dose em que os
resultados foram mais significativos para os demais modelos realizados. O
tratamento com os compostos inibiu significativamente a hiperalgesia induzida pelo
CFA até três horas após sua administração.
Embora o CFA produza uma resposta inflamatória marcante dentro de poucas
horas após sua injeção i.pl., é um agente utilizado para avaliar a dor persistente,
pois age tanto na sensibilização dos neurônios periféricos (por possuir uma ação
direta, sem a participação de prostanóides) quanto através da sensibilização central
dos neurônios da medula espinhal (WOOLF et al., 1997; SAMAD et. al., 2001). No
entanto, parece que a sua hiperalgesia é pelo menos em parte mediada por
leucotrienos e aminas simpáticas (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al., 2005). As
alterações centrais que podem ser promovidas pelo CFA envolvem modificações
teciduais nas lâminas superficiais (I e II) e profundas (V e VI) da medula que
recebem os estímulos nocivos (WOOLF; MANNION, 1999; MANJAVACHI et. al.,
2010; DA SILVA, 2011).
Os efeitos apresentados pelos compostos foram mais significativos através do
tratamento crônico do que com o tratamento preventivo, especialmente para o
composto ANCh. Após 5 dias de tratamento crônico foi realizada a interrupção da
administração dos compostos. O efeito relacionado ao tratamento não perdurou,
porém quando o tratamento foi retomado, novamente houve inibição da hiperalgesia
sugerindo não haver tolerância relacionada ao tratamento.
75
Ressalta-se que o efeito do tratamento avaliado na pata contralateral não foi
marcante, sugerindo que os compostos podem estar agindo somente a nível
periférico e, com a diminuição dos estímulos que ascendem até o SNC, pode estar
ocorrendo uma diminuição da sensibilização central (MILLAN, 1999), ou seja, uma
ação central indireta, o que explicaria a pequena inibição somente na maior dose.
A dor aguda e a dor crônica diferem não somente por suas durações, mas
pela capacidade do organismo em restaurar o sítio da lesão, reparar os disparos
aferentes e o processamento central normal (LOESER, 2000). Estes eventos são
dependentes da intensidade e duração do estímulo, e sendo este persistente, mais
difícil torna-se seu tratamento (WOOLF; SALTER, 2000).
A utilização de modelos animais para estudar a dor neuropática baseados em
procedimentos cirúrgicos data por volta de 1980. Desde então, vários modelos tem
sido desenvolvidos e adaptados para camundongos (MOGIL, 2009). O modelo de
ligação parcial do nervo ciático tem ajudado a identificar os mecanismos envolvidos
na dor neuropática. Estes mecanismos incluem: a excitabilidade ectópica dos
neurônios sensoriais como resultado de uma expressão aumentada e da
redistribuição dos canais de sódio; expressão alterada de genes pelos neurônios
sensoriais e sensibilização dos neurônios no corno dorsal da medula espinhal. A dor
neuropática induzida pela LPNC é caracterizada por uma dor profunda e
intermitente, bem como pela constante hiperexitabilidade dos neurônios, além de
estar relacionada com outros mecanismos ainda não conhecidos (COSTIGAN;
SCHOLZ; WOOLF, 2009). Sabe-se também que os receptores B1 e B2 são super
expressos no DRG após a LPNC, o que contribui consequentemente com a
hiperalgesia e alodinia (SHOLZ; WOOLF, 2002; MOALEM; TRACEY, 2006).
A neuropatia envolve um número muito grande de alterações nos nervos
lesionados, tanto em termos de atividade, quanto nas propriedades e capacidade de
transmissão do impulso nervoso. A patogênese da dor neuropática não está
simplesmente confinada a mudanças na atividade do sistema neuronal, mas envolve
também interações entre neurônios, células imune inflamatórias, células da glia,
além de citocinas e quimiocinas derivadas de células do sistema imune. A ativação
do sistema complemento (SC) é essencial para a defesa do organismo contra
patógenos, entretanto, sua ativação inapropriada pode causar severos danos
teciduais (D’MELLO; DICKENSON, 2008; AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010). Em
um estudo realizado por Li et. al. (2007), foi encontrado um aumento na deposição
76
de C3, indicando a ativação do sistema complemento 6 horas após a LPNC. Além
disso, a inibição da ativação do SC levou a uma inibição da deposição de C3, que
não somente atenua a dor após 4 semanas, mas foi associada com a diminuição na
infiltração de macrófagos e células T no local da lesão nervosa. Uma lesão nervosa
periférica provoca reação do sistema imune em diferentes localizações anatômicas
incluindo o nervo danificado, o DRG, a medula espinhal e sítios supra-espinhais
associados com as vias da dor. Outros estudos demonstraram que a ativação do SC
também foi identificada no DRG após lesão nervosa periférica. De fato, o SC está
envolvido na regeneração e remielinização dos neurônios, e também na fase tardia
de ativação das células do sistema imune que liberam os mediadores inflamatórios
responsáveis pelo aumento da sensibilidade à dor (AUSTIN; MOALEM-TAYLOR,
2010).
Os mastócitos são importantes iniciadores e efetores da imunidade inata e
estão residentes em muitos tecidos, incluindo nervos. Não se sabe exatamente
como os mastócitos são ativados após uma lesão nervosa, porém os mesmos
liberam mediadores como histamina, serotonina, proteases, prostaglandinas e
citocinas. Vários destes mediadores são capazes de ativar diretamente nociceptores
e promover a quimiotaxia dos neutrófilos que contribuem para a liberação de
agentes inflamatórios e álgicos adicionais (AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010).
Além dos mastócitos, os macrófagos desempenham um papel central na
regeneração de nervos centrais e periféricos, pois participam da degeneração
walleriana, fagocitando células de Schwann mortas e axônios axotomizados. Desta
forma, secretam também no local da lesão mediadores potenciais da hiperalgesia
como TNF-α, IL-1β e IL-6, ROS e prostaglandinas. Além disso, a COX-2 é super
regulada em macrófagos localizados próximo à lesão, contribuindo para a formação
de mais mediadores (AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010).
Tendo em vista a complexidade dos mecanismos envolvidos na dor
neuropática, destaca-se a importante ação dos compostos frente à hiperalgesia
induzida pela ligação parcial do nervo ciático. O efeito promovido pelo tratamento
dos animais foi extremamente significativo para ambos os compostos, além de ter
sido dose dependente. A gabapentina, fármaco utilizado como tratamento de
primeira linha para a dor neuropática e originalmente designada como um análogo
do GABA, promove sua ação por interagir com a subunidade α2δ de canais de Ca2+
dependentes de voltagem, inibindo assim o influxo deste íon (D’MELLO;
77
DICKENSON, 2008). O efeito dos compostos ANCh e AcANCh foi bastante
semelhante ao apresentado pela gabapentina nos experimentos realizados,
destacando a importância de investigações mais profundas acerca dos mecanismos
de ação destes compostos, pois os mesmos se mostram como moléculas bastante
promissoras para o tratamento de dores persistentes.
Conforme já mencionado, a dor neuropática é desenvolvida principalmente
por uma lesão nervosa. Os neutrófilos são as células do sistema imune que
participam de estágios iniciais seguidos deste tipo de lesão. Os neutrófilos podem
produzir ou facilitar a produção de mediadores inflamatórios, incluindo enzimas de
degradação, radicais livres, metaloproteinases, liberação de superóxido e outras
espécies reativas de oxigênio. Adicionalmente, liberam citocinas tais como TNF-α,
IL1-β, IL-2 e IL-6. O recrutamento destas células é mediado pelo NGF-β, CXCL/1,
leucotrieno B4 e MCP-1 (CUNHA et. al., 2008; AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010).
A dosagem dos níveis enzima MPO no local da lesão (pata) nos dá uma
medida indireta da migração de neutrófilos para este local. O fato do composto
ANCh ter sido capaz de inibir de forma significativa a migração de neutrófilos, pode
ser um dos mecanismos pelos quais este composto esteja agindo para reduzir tanto
a dor neuropática quanto inflamatória, pois as citocinas que seriam liberadas
subsequentemente deixam de ser liberadas, reduzindo a excitabilidade dos
neurônios.
As citocinas são pequenas moléculas constitutivamente expressas na
superfície celular de forma precursora e são clivadas para uma ação rápida.
Estabelecem comunicação entre o sistema imune e o sistema nervoso, agindo em
concentrações hormonais através de receptores de alta afinidade. Produzem efeitos
endócrinos, parácrinos e autócrinos e difundem-se somente em pequenas
distâncias. Os efeitos álgicos de citocinas pró-inflamatórias são freqüentemente
indiretos, através da expressão de outros mediadores como NO e PGE 2, os quais
sensibilizam os nociceptores (SOMMER; SCHÄFERS, 2004; AUSTIN; MOALEMTAYLOR, 2010). Estudos demonstram que a injeção i.pl. de IL-1β e de TNF-α reduz
o limiar mecânico nociceptivo, promovendo rápida hipersensibilidade à dor,
associada com descargas espontâneas transitórias, em um processo dependente de
prostaglandinas (SOMMER; KRESS, 2004).
A liberação imediata de IL-1β no sítio da lesão parece estar mediada por uma
proteína sensível a cálcio, a calpaína, que é ativada pelo influxo deste íon após a
78
lesão. Sob condições inflamatórias, a IL-1β pode ser liberada por muitos tipos
celulares, como células mononucleares, fibroblastos, sinoviócitos, células de
Schwann e células endoteliais. A ação pró-nociceptiva da IL-1β pode ser mediada
por uma complexa cascata de sinalização e pela produção de segundos
mensageiros, como NO, BK e prostaglandinas. A longa exposição dos aferentes
primários a IL-1β induz a liberação de SP. Tem sido demonstrado que a
excitabilidade neuronal provocada por esta citocina está relacionada com o aumento
do influxo de íons não seletivos e de cálcio, além do efluxo de potássio (SOMMER;
KRESS, 2004; SOMMER; SCHÄFERS, 2004).
Adicionalmente, nos neurônios da medula, a IL-1β aumenta as correntes
induzidas pelos receptores NMDA e AMPA e também diminui correntes inibitórias
espontâneas do GABA e glicina. Acredita-se também que a hiperalgesia gerada pela
IL-1β está relacionada com o aumento de NGF (potente degranulador de mastócitos)
em nervos inflamados. Já a injeção i.pl. de TNF-α induz alodinia mecânica e
hiperalgesia térmica. O TNF-α exerce seus efeitos através da ativação de dois
receptores, o receptor de TNF 1 (TNFR1) e o receptor de TNF 2 (TNFR2) e induz a
produção de IL-1β, IL-6 e IL-8. Esta cascata de citocinas finalmente resulta na
ativação da liberação de prostanóides dependentes de COX-2 e a liberação de
catecolaminas pelas fibras aferentes (SOMMER; KRESS, 2004; SOMMER;
SCHÄFERS, 2004; MOALEM; TRACEY, 2006; AUSTIN; MOALEM-TAYLOR, 2010).
Com relação às quimiocinas, que são pequenas citocinas (8-10 kDa) que regulam o
recrutamento e a migração de leucócitos para o tecido inflamado, a KC promove
hiperalgesia por meio da via da citocina IL-1β e prostaglandinas e também por
estimular a liberação de aminas simpáticas (BAGGIOLINI, 2001; CUNHA, 2005;
MANJAVACHI et al., 2010).
Os compostos ANCh e AcANCh foram capazes de inibir a hiperalgesia
induzida pelas citocinas IL-1β e TNF-α, em contrapartida não interferiram na via
ativada pela quimiocina KC, possivelmente por não serem capazes de inibir a
liberação de aminas simpáticas.
Dentre os vários mecanismos já citados aqui e relacionados ao processo
doloroso, a PGE2 é um contribuinte importante para a sensibilidade à dor durante a
inflamação. Sua produção requer a atividade de pelo menos uma das duas
isoformas da COX, a COX-1 que é expressa constitutivamente ou a COX-2 que é a
isoforma induzida, sendo particularmente relevante para a inflamação. Os AINES
79
mais clássicos bloqueiam a COX-1 e COX-2 em graus semelhantes, enquanto os
antiinflamatórios mais recentemente desenvolvidos "Coxibes" são seletivos para a
COX-2. Embora esses medicamentos geralmente proporcionam alívio excelente da
dor inflamatória, seu uso a longo prazo é freqüentemente associado com efeitos
colaterais. AINEs tradicionais causam ulcerações do trato gastrointestinal superior, e
o uso de inibidores seletivos da COX-2 está associado com um risco aumentado de
eventos cardiovasculares (JOHANSSON; NARUMIYA; ZEILHOFER, 2011). A PGE2
exerce seus efeitos através de quatro receptores acoplados à proteína G ancorados
por diferentes genes e chamados de EP1, EP2, EP3 e EP4 e tem um papel
importante no aumento da permeabilidade vascular e na geração de febre, além da
hiperalgesia
(CHIZZOLINI;
BREMBILLA,
2009).
Embora
a
aplicação
de
prostaglandinas não seja usualmente dolorosa, altos níveis de PGE 2 podem
contribuir para os mecanismos excitatórios através da supressão da condutância de
íons de K+, e um aumento na condutância de íons de Na +e Ca2+. Estas ações levam
a um aumento na liberação de neuropeptídeos pelas fibras C (MILLAN, 1999;
ZEILHOFER, 2007). A hiperalgesia mecânica induzida pela PGE 2 é normalmente
mediada pela ativação de cAMP, que ativa a proteína quinase A (PKA), segundo
mensageiro da cascata de sinalização em aferentes nociceptivos primários. Além
disso, aumenta a excitabilidade dos neurônios do DRG através do aumento da
liberação de glutamato (JULIUS; BASBAUM, 2001; CHEN; LEVINE, 2005;
REICHLING; LEVINE, 2009).
Os resultados obtidos com as chalconas sobre a hiperalgesia induzida pela
PGE2 permitem sugerir que o composto AcANCh talvez tenha uma via de ação mais
seletiva, uma vez que não interferiu neste modelo, diferentemente do composto
ANCh, que apresentou resultados significativos também para este modelo.
Outro agente pro-inflamatório utilizado para tentar mapear o mecanismo de
ação das chalconas em estudo foi a BK. A injeção i.pl. de BK promove uma imediata
e intensa hipersensibilidade dolorosa nos animais através da sensibilização das
fibras C e Aδ, além de potenciar a transmissão sináptica glutamatérgica na medula
espinhal. A BK está envolvida em muitas funções fisiológicas como a regulação da
pressão arterial e eventos patológicos como inflamação e dor, sendo formada por
ação enzimática em condições fisiológicas (FUJITA et. al., 2010). Dois receptores
acoplados à proteína G estão envolvidos na hiperalgesia inflamatória gerado por
este peptídeo: B1 e B2. A BK age principalmente nos receptores B2, que são
80
constitutivos e estão presentes nos neurônios sensoriais e na micróglia. Através
destes receptores, ativa a PKC, que regula canais iônicos e conseqüentemente a
excitabilidade neuronal. A ativação das fibras sensoriais pela BK em camundongos
não depende da liberação de citocinas, a mesma age diretamente na liberação de
prostanóides e de aminas simpaticomiméticas, além de também causar a liberação
de neuropeptídeos como SP, CGRP e neurocinina A (NKA) (MILLAN, 1999; RIEDEL;
NEECK, 2001; CUNHA et al., 2005; MOALEM; TRACEY, 2006).
Os compostos estudados não reduziram a hiperalgesia induzida pela injeção
i.pl. de BK, sugerindo que os compostos não agem pela via percorrida por este
agente álgico.
Contrariamente
aos
resultados
demonstrados
pelos
compostos
na
hiperalgesia induzida pela BK, ANCh e AcANCh foram eficazes em reduzir a
hiperalgesia induzida pela epinefrina. A administração local de epinefrina induz
hiperalgesia transitória térmica e mecânica e exibe seus efeitos por se ligar com alta
afinidade aos receptores β1- e β2-adrenérgicos e com baixa afinidade aos
receptores α-adrenérgicos. A epinefrina ativa a cascata de segundos mensageiros
envolvendo cAMP e PKA, os quais consequentemente reduzem o limiar do
nociceptor e aumentam a excitabilidade neuronal. Além disso, a cascata produzida
pela epinefrina também está envolvida com a ativação da PKCε e da ERK (CHEN;
LEVINE, 2005; MANJAVACHI et. al., 2010; WANG et. al., 2011). Os resultados
encontrados sugerem que os compostos podem estar agindo através da via
adrenérgica, uma vez que foram eficazes em inibir a hiperalgesia induzida pela
epinefrina.
Resultados significativos também foram encontrados para o modelo de dor
neoplásica, induzida por células de melanoma murino (B16F10). Devido ao fato de
haver poucos artigos na literatura citando a utilização deste modelo, foi realizada
uma padronização a fim de escolher a melhor concentração celular para ser injetada
nos animais e promover hiperalgesia. Nossos resultados vão de encontro com os
dados mencionados por Sasamura et. al. (2002), quando o mesmo relata que o
processo doloroso se torna intenso a partir do sétimo dia após a injeção i.pl. de
células de melanoma, intensificando-se com o passar dos dias. De posse destas
informações e dos dados relacionados à progressão tumoral, a hiperalgesia
mecânica foi avaliada em camundongos machos e fêmeos, sendo que a resposta
81
frente ao tratamento com os compostos ANCh e AcANCh foi bastante semelhante
em ambos os sexos.
A inoculação de células de melanoma na pata traseira induz dor espontânea
(comportamento de lamber a pata), hiperalgesia térmica e alodinia/hiperalgesia
mecânica, sugerindo que a massa tumoral libera agentes álgicos. Estudos com
animais de laboratório têm demonstrado que a dor aumenta o crescimento e/ou a
metástase dos tumores. Desta forma, o alívio da dor é importante não somente para
a qualidade de vida, mas também para melhorar a terapia do câncer (SASAMURA et
al., 2002; FUJITA, 2010).
A dor relacionada ao câncer é muitas vezes referida como um mecanismo
doloroso misto, já que raramente se apresenta como uma síndrome puramente
neuropática, visceral ou somática, mas sim como um mecanismo complexo com
componentes inflamatórios, neuropáticos ou isquêmicos, freqüentemente em vários
sítios (URCH; DICKENSON, 2008).
Laird et. al. (2011) afirmam que a dor é o sintoma mais comum em paciente
com câncer, enquanto que a inflamação está implicada no desenvolvimento e na
progressão tumoral. Desta forma, a relação entre dor e inflamação é de grande
interesse. Entretanto, é um desafio examinar porque vários fatores podem afetar
essas variáveis. Sabe-se que diversas citocinas relacionadas à inflamação e ao
processo doloroso estão presentes em níveis elevados no plasma de pacientes
oncológicos, como IL-1β, TNF-α, IL-8, mas principalmente a IL-6 (KAI et. al., 2005).
Já foi demonstrado em modelos animais que a administração de IL-6 promove
alodinia e hiperalgesia térmica (DELEO et. al., 1996). Esta citocina controla a
produção de uma proteína plasmática de fase aguda produzida no fígado, a proteína
C reativa (CRP). As concentrações desta proteína aumentam drasticamente durante
a inflamação e a mesma é utilizada como medida indireta de IL-6. Estudos clínicos
realizados por Lair et. al. (2011) sugerem a forte relação entre câncer, inflamação e
o processo doloroso, bem como a influência da IL-6 neste processo.
Nosso estudo não avaliou a ação dos compostos ANCh e AcANCh frente a
ação ou liberação da citocina IL-6, porém seria de grande importância a posse
destes resultados para melhor compreender os mecanismos de ação dos compostos
frente ao modelo de dor neoplásica.
A morfina é o fármaco recomendado pela OMS como analgésico de escolha
para o tratamento efetivo da dor moderada a severa causada pelo câncer
82
(SAKURADA, KOMATSU, SAKURADA, 2005). Além da morfina, outros agonistas µopioides são freqüentemente utilizados para o tratamento de dor do câncer, bem
como de outras dores severas como pós-traumática ou pós-cirúrgica. Entretanto os
µ-agonistas também apresentam uma constelação de efeitos colaterais (entre as
principais estão a depressão respiratória, náusea, constipação crônica e retenção
urinária), além de tolerância e dependência (SAKURADA, KOMATSU, SAKURADA,
2005; NIIKURA et al., 2010).
A busca incessante por moléculas ativas farmacologicamente e que não
sejam capazes de influenciar de forma negativa a fisiologia dos sistemas corporais é
um denominador comum a pesquisadores do mundo inteiro. A pesquisa realizada
com os compostos ANCh e AcANCh neste trabalho contribuem muito neste aspecto,
pois vão de encontro aos resultados anteriormente obtidos relacionados à atividade
anti-hiperalgésica aguda (CAMPOS-BUZZI et. al., 2007; CAMPOS-BUZZI, 2007),
validando assim a atividade farmacológica dos compostos.
Com relação aos possíveis efeitos colaterais investigados, os animais
tratados com os compostos ANCh e AcANCh não demonstraram alterações nos
limiares de nocicepção térmica e mecânica em nenhuma das doses avaliadas.
Destaca-se também que não foram observadas alterações na atividade locomotora
dos animais, quando avaliados no teste do campo aberto. Estes dados, juntamente
com o fato dos compostos não terem sido capazes de causar hipotermia nos animais
quando avaliados 30 minutos após o tratamento, são suficientes para sugerir que os
compostos ANCh e AcANCh não afetam vias funcionais importantes do SNC.
Estudos toxicológicos subseqüentes fazem-se necessários para confirmar a
segurança terapêutica destes compostos.
83
7 Conclusão
A realização de diferentes modelos experimentais de dor persistente ao longo
deste trabalho forneceu resultados bastante significativos que validam a atividade
anti-hiperalgésica dos compostos testados e nos permitem sugerir um possível
mecanismo de ação para os mesmos.
A literatura nos diz que a ativação das fibras nociceptivas pode ser alcançada
direta ou indiretamente através da ação de diferentes mediadores, conforme citado
ao longo da revisão bibliográfica. Os resultados obtidos sugerem que os compostos
testados podem estar agindo através da inibição de alguns destes mediadores que
irão, ao longo do processo inflamatório, gerar a sensibilização dos nociceptores. A
dosagem dos níveis de IL-1β demonstrou que ambos os compostos foram capazes
de reduzir os níveis desta citocina no local da lesão, sugerindo uma possível ação
dos mesmos na expressão/liberação de IL-1β, ou até mesmo em outras citocinas
que são capazes de estimular sua liberação, como o TNF-α, porém mais estudos
são necessários para confirmar esta hipótese.
Os demais dados obtidos nos levam a crer que possivelmente os compostos
também possam estar agindo em cascatas de sinalização intracelulares, inibindo a
ação de proteínas quinases, principalmente a PKA ou até mesmo de outros
segundos mensageiros intracelulares como AMPc.
O fato dos compostos terem inibido a hiperalgesia induzida pela epinefrina
nos levam a pensar em uma possível interferência também na via adrenérgica. Além
disso, reduzindo os níveis de MPO podemos sugerir uma possível ação através da
interferência na expressão de moléculas de adesão endoteliais, responsáveis pela
migração celular.
Pode-se concluir então que possivelmente a ação dos compostos está sendo
indireta, inibindo mediadores ou moléculas liberadas primariamente após uma lesão
tecidual e não uma ação em canais iônicos, por exemplo, responsáveis por
desencadear diretamente o potencial de ação e a ativação da fibra nociceptiva.
Assim, os compostos ANCh e AcANCh parecem ser promissores para o
desenvolvimento de novos fármacos analgésicos para o tratamento da dor crônica,
tendo bastante relevância por também terem sido biodisponíveis por via oral, o que
os torna muito atrativos para a indústria farmacêutica. Entretanto, estudos mais
84
detalhados devem ser realizados com o intuito de verificar o exato mecanismo de
ação e as características farmacocinéticas das chalconas testadas.
85
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