análise da eficiência de protocolos de extração de dna em ipês com

ANÁLISE DA EFICIÊNCIA DE PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA EM IPÊS
COM O USO DE MARCADOR MOLECULAR, RAPD.
Maria Fernanda da Costa Gomes (bolsista do PIBIC - UFPI), Sérgio Emílio dos Santos
Valente (Orientador Depto. de Biologia – UFPI)
Resumo: O gênero Tabebuia compreende cerca de 100 espécies, conhecidas popularmente como
ipês. São árvores com interesse econômico e madeireiro, por isso é de suma importância estudos
moleculares envolvendo espécies desse gênero (GENTRY, 1992). O conhecimento da distribuição da
diversidade genética em populações naturais é de fundamental importância, dessa forma, o objetivo
deste trabalho é avaliar a eficiência de protocolos de extração de DNA de ipês, coletados no Parque
Nacional de Sete Cidades e em Teresina, Piauí, por meio de marcador molecular, RAPD
(Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso), a fim de comprovar uma metodologia apta a ser
utilizada em estudos de diversidade genética com essas espécies. Extraiu-se o DNA por meio dos
protocolos de Romano e Brasileiro (1998), Khanuja et al. (1999) e Kit Promega, com a quantificação
sendo realizada em espectrofotômetro NanoDrop 2000. Todos os protocolos testados resultaram em
boas quantidades de DNA. Assim, selecionou-se as melhores amostras obtidas observando o grau de
pureza do DNA para a realização da PCR com 4 primers de RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado
ao Acaso). O DNA amplificado foi analisado em Gel de agarose a 1,5%. Após resultados obtidos
conclui-se que tanto os protocolos de extração tradicionais (CTAB), Romano e Brasileiro (1998) e
Khanuja et al. (1999); como o Kit Promega resultaram em DNA viável para amplificação podendo ser
utilizados em estudos de diversidade genética de ipês com o uso de marcadores moleculares do tipo
RAPD.
Palavras-chave: Extração de DNA; Ipês; RAPD.
Introdução
O Parque Nacional de Sete Cidades (PNSC), com área de 62,21 km2, foi criado em 1961
com o objetivo de proteger a diversidade dos recursos hídricos, vegetacionais e paisagísticos
ocorrentes na área (IBDF, 1979). Algumas espécies do gênero Tabebuia são endêmicas do Parque
Nacional de Sete Cidades. Muitas das espécies desse gênero são nativas do Brasil, conhecidas
popularmente como ipês (Lorenzi, 1992) e possuem interesse econômico madeireiro e medicinal
(GENTRY, 1992).
O conhecimento da distribuição da diversidade genética em populações naturais é de
fundamental importância, dessa forma, o objetivo deste trabalho é avaliar a eficiência de protocolos
de extração de DNA de ipês, Ipê do Cerrado - Tabebuia ochracea; Ipê Roxo - Tabebuia impetiginosa
(coletadas no PNSC) e Ipê Amarelo - Tabebuia serratifolia e Tabebuia sp. (coletadas em Teresina-PI),
por meio de marcador molecular, RAPD, a fim de comprovar uma metodologia apta a ser utilizada em
estudos de diversidade genética com essas espécies.
Metodologia
Na primeira etapa do trabalho, definiu-se o protocolo de extração de DNA mais eficiente para
cada espécie de ipê estudada.
As amostras de tecido foliar foram coletadas no PNSC, Ipê do Cerrado - Tabebuia ochracea,
coordenadas S 04º 05 807' W 041º 42 162', tipo de vegetação campo; Ipê Roxo - Tabebuia
impetiginosa, coordenadas S 04º 07 560' W 041º 42 577', tipo de vegetação cerrado sensu stricto; e no
CCA (Centro de Ciências Agrárias) – Teresina, UFPI (Universidade Federal do Piauí), Ipê Amarelo Tabebuia serratifolia e Tabebuia sp. As amostras do PNSC foram coletadas em sílica gel ou nitrogênio
líquido; as coletadas em Teresina foram acondicionadas em isopor® com gelo, sendo todas
transportadas para o Laboratório de Biologia Molecular, localizado no CCA da mesma instituição, onde
foram conduzidas as extrações, utilizando-se os protocolos descritos por Romano e Brasileiro (1998),
Khanuja et al. (1999) e Kit Promega. A quantificação do DNA foi feita por meio de espectrofotômetro,
NanoDrop® 2000.
Após a quantificação, observou a quantidade de DNA obtida e as relações de pureza do
material, elencando-se as melhores amostras para a realização da PCR com o uso do marcador
molecular, RAPD.
Foram avaliados 04 primers RAPD, UBC – 247, 549, 556, 691; desenhados pela University of
Britsh Columbia os quais foram testados nas amostras de DNA com os valores mais próximos do
padrão de pureza. Para cada um dos primers foi realizada Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em
volume final de 10µL contendo os seguintes componentes: 1μ de tampão de PCR; 1,5μl de MgCl2; 1μl
de dNTP; 1,5μl de primer, 0,2ul de Taq DNA polimerase; 1,0µL de DNA genômico (10 ng) e água
ultrapura 3,8 µL.
Resultados e Discussão
Todos os protocolos testados resultaram em DNA de quantidade suficiente para o
desenvolvimento de técnicas com o uso de marcadores moleculares. Entretanto, com exceção de uma
(Ipê Amarelo, Kit Promega – A260/280 = 1,93), todas as amostras ficaram abaixo dos padrões
limítrofes nas razões A260/280 e A260/230, indicando contaminação.
Após a análise dos resultados parciais selecionou-se as seguintes amostras para a realização
dos testes de PCR com os primers de RAPD: Ipê do Cerrado Romano e Brasileiro (1998) 01 com
concentração de 76,2 ng/μl de DNA, relação A260/280 - 1,45 e A260/230 – 0,59; Ipê Roxo Romano e
Brasileiro (1998) 01 com concentração 80,2ng/μl, A260/280 – 1,64 e A260/230 – 0,84; Tabebuia sp.
Khanuja et al. (1999) 01, concentração – 154,0 ng/μl, A260/280 – 1,79 e A260/230 – 1,11; e Ipê
Amarelo Kit Promega 01, concentração 99,5 ng/μl, A260/280 – 1,93 e A260/230 – 1,42.
Observa-se que os protocolos de extração tradicionais (CTAB) mostraram-se eficientes para
a obtenção de DNA de ipês no uso de marcador molecular, RAPD, apresentando um padrão de bandas
visível assim como o DNA obtido por meio do Kit Promega (Figura 01), apesar de serem bem menos
onerosos. Dessa forma, sugere-se a utilização dos protocolos descritos por Romano e Brasileiro (1998)
e Khanuja et al. (1999) e a otimização do protocolo de PCR para análise de diversidade genética das
plantas do gênero Tabebuia.
UBC – 247
L
IC IR
T
UBC – 549
IA IC IR T
UBC – 556
IA IC IR T IA
UBC – 691
IC IR
T
IA
Figura 01 . Perfil eletroforético do DNA amplificado de plantas do gênero Tabebuia, em gel de agarose a 1,5%, com a presença
do marcador de DNA Ladder (L). PCR do DNA de IC = Ipê do Cerrado, IR = Ipê Roxo, T = Tabebuia sp., IA = Ipê Amarelo.
Conclusão
Com base nos resultados obtidos e nas condições em que se realizou o presente trabalho,
conclui-se que tanto os protocolos de extração tradicionais (CTAB), Romano e Brasileiro (1998) e
Khanuja et al. (1999); como o Kit Promega resultaram em DNA viável para amplificação podendo ser
utilizados em estudos de diversidade genética de ipês com o uso de marcadores moleculares do tipo
RAPD.
Apoio
PIBIC – UFPI e Cnpq.
Referências bibliográficas
GENTRY, A. H. Flowering phenology and diversity in tropical Bignoniaceae. Biotropica. 6: 64-68, 1974.
IBDF. Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal. 1979. Plano de manejo: Parque Nacional de
Sete Cidades. M.A/Fundação Brasileira para a Conservação da Natureza (FBCN), Brasília.
KHANUJA, S. P. S. et al. Rapid is olation of DNA from dry and fresh samples of plants producing large
amounts of secondarity metabolites and essential oils. Plant Molecular Biology Reporter. v. 17, p. 1 –
7, 1999.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do
Brasil. São Paulo: Plantarum, 1992. 367 p.
ROMANO, E. & BRASILEIRO, A.C. 1998. Extração de DNA de tecidos vegetais. In: Brasileiro, A.C.M.
& Carneiro, V.T.C. Manual de transformação genética de plantas. 1998. Brasília. EMBRAPASPI/EMBRAPA- CENARGEN.