ANÁLISE MITOCONDRIAL DE POPULAÇÕES DE Eufriesea violacea DE DOIS REMANESCENTES DE MATA ATLÂNTICA Paula Naomi Matsumoto; Wilson Frantine-Silva, Silvia Helena Sofia; email: [email protected] Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Biologia Geral/ CCB. Área e sub-área do conhecimento: Genética/ Genética Animal Palavras-chave: Floresta Estacional Semidecidual, abelhas das orquídeas, Euglossini Resumo Eufriesea violacea (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) é uma espécie de abelha endêmica da Mata Atlântica e aparentemente sensível ao desmatamento. Este estudo analisou a diversidade e estrutura genética de populações desta espécie de dois fragmentos de Mata Atlântica do estado do Paraná: Parque Estadual Mata dos Godoy (680 ha), município de Londrina, e Fazenda Monte Alegre (217 ha), em Telêmaco Borba. As análises moleculares foram realizadas com base em um segmento de 404 pb do gene mitocondrial citocromo b, de 61 machos de E. violacea. Foram detectados nove sítios variáveis e parcimoniamente informativos, e 16 haplótipos diferentes. As análises, com base no DNA mitocondrial revelaram uma estruturação genética muito alta populações estudadas ( = 38,7; p<0,0001). Os resultados obtidos refletem, em parte, o comportamento filopátrico das fêmeas da espécie estudada. Introdução Endêmica à Mata Atlântica, Eufriesea violacea (Blanchard, 1840) é uma espécie de abelha aparentemente sensível à fragmentação e perda de habitats (SOFIA; SUZUKI, 2004; GIANGARELLI et al., 2009). Pertence à tribo Euglossini, que reúne mais de 200 espécies de abelhas neotropicais, popularmente conhecidas como abelhas das orquídeas (DRESSLER, 1982). Resultados de um estudo genético, realizado com base no genoma nuclear (marcadores microssatélites) de machos de E. violacea, revelaram níveis de diferenciação genética variando de baixo a moderado entre as populações amostradas desta espécie, ao longo de uma ampla extensão geográfica (FREIRIA et al., 2012). 1 Um fator limitante ao conhecimento mais completo da genética de populações de diferentes espécies de Euglossini relaciona-se à dificuldade de se amostrar fêmeas na natureza em número suficiente para análises populacionais. Neste caso, uma estratégia adicional ao estudo de machos, que são organismos haploides, enquanto as fêmeas são diploides (COOK; CROZIER,1995), envolve o acesso ao genoma mitocondrial, com origem exclusivamente materna em machos e fêmeas de abelhas. Assim, este trabalho analisou uma região do gene mitocondrial citocromo b (cit b) de E. violacea, visando contribuir com informações adicionais sobre a estrutura e diversidade genética de populações desta espécie. Materiais e métodos As amostras de E. violacea foram as mesmas analisadas por FREIRIA et al. (2012), em dois remanescentes de Mata Atlântica do estado do Paraná: 1) Parque Estadual Mata dos Godoy (PEMG), com 680 ha, localizado em Londrina; 2) Fazenda Monte Alegre (FMA), com 217 ha, situada em Telêmaco Borba. Os dois fragmentos constituem remanescentes de Floresta Estadual Semidecidual e estão separados por cerca de 200 km (detalhes em FREIRIA et al., 2012). O DNA foi isolado conforme Freiria et al. (2012), utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. As análises envolveram 32 machos do PEMG e 29 da FMA, totalizando 61 indivíduos analisados. Para a amplificação do segmento do gene cit b, foram utilizados os os primers CB-J-10612 e CB-N-11367 (SIMON et al., 1994). As reações de amplificação foram realizadas com um volume final de 15 µL, contendo: 1 µL de DNA (20 ng), 1,5 µL 1x buffer (10x); 3 mM de MgCl2 (2,25 µL); 0,5µM de cada primer (0,375 µL); 200 µM de dNTP (1,2 µL); 0,4 µL de Taq DNA polimerase (Invitrogen). Após amplificação, as amostras foram purificadas com a enzima (ExoProStar GE Helthcare) e analisadas em sequenciador automático ABI Prism 3500 xl (Applied Biosystems). As sequências foram editadas e alinhadas no programa MEGA 6.0 (TAMURA et al., 2013) e analisadas nos programas DnaSP 5.0 (LIBRADO; ROZAS 2009) e PopArt V1.7 (LEIGH; BRYANT, 2015). Resultados e discussão Após alinhamento e edição manual, um fragmento de 404 pb do gene cit b foi analisado, revelando nove sítios variáveis e parcimoniamente informativos. Foi identificado, um total de 16 haplótipos, dos quais apenas o haplótipo H7 foi compartilhado entre as amostras das duas áreas (Figura 1). 2 Figura 1: Área de amostragem e frequência relativa dos haplótipos. As diferentes cores nos gráficos de pizza representam as frequências dos diferentes haplótipos nas duas localidades Fazenda Monte Alegre (Klabin) e Parque Estadual Mata dos Godoy (Godoy). As áreas em verde escuro representam os remanescentes florestais de Mata Atlântica segundo o Atlas dos Remanescentes Florestais de 2008 (fonte: Fundação SOS Mata Atlântica). Mapa gerado com o software Quantum GIS (Qgis Org. 2016) disponível em: http://www.qgis.org. Uma alta diversidade haplotípica total foi detectada (Hd = 0,897), em contraste à baixa diversidade nucleotídica ( = 0,00879). Separadamente, as duas áreas (PEMG e FMA) apresentaram valores semelhantes de Hd, respectivamente 0,873 e 0,749, com baixos valores de ≤0,003). A análise de variância molecular (AMOVA) demonstrou que as populações retêm um expressivo nível de diversidade genética contido entre as populações (~40%), corroborando o alto nível de estruturação encontrado ( = 38,7; p<0,0001). Enquanto os resultados de marcadores microssatélites disponíveis na literatura revelaram uma estruturação genética baixa nas duas populações estudadas (FREIRIA et al., 2012), as análises realizadas no presente estudo revelaram uma estruturação genética bem mais acentuada entre estas populações. Pode-se atribuir as diferenças encontradas entre estes dois estudos, tanto às diferenças inerentes à natureza destes marcadores (isto é, mitocondrial e microssatélites) (AVISE, 2004), quanto ao reconhecido comportamento filopátrico das fêmeas de Euglossini, bem como ao comportamento de elevada dispersão dos machos (LÓPEZ-URIBE et al., 2014). Dentre os Euglossini, as fêmeas exibem um comportamento reconhecidamente filopátrico (AUGUSTO; GARÓFALO, 2004), enquanto os machos por não terem uma ligação aos seus ninhos de origem (DODSON et al., 1969), têm sido considerados, em termos de fluxo gênico, como o sexo dispersor (LÓPEZ-URIBE et al., 2014). 3 Conclusão Os resultados obtidos parecem refletir em grande parte o comportamento filopátrico das fêmeas da espécie estudada. Agradecimentos Ao CNPq pela bolsa de Iniciação Científica de P. N. Matsumoto. Referências AUGUSTO, S.C., GARÓFALO, C.A. Nesting biology and social structure of Euglossa (Euglossa) townsendi Cockerell (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Insectes Sociaux, v. 51, p. 400–409, 2004. AVISE, J.C. Molecular Markers, Natural History and Evolution. 2a. ed., Sinauer: Sunderland, 2004. COOK, J.M.; CROZIER, R.H. Sex determination and population biology of the Hymenoptera. Trends in Ecology and Evolution, v. 10, p. 281–286, 1995. DODSON, C. H. et al. 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