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ORIGINAL/ORIGINAL
Propriedades Glicostáticas em Eritrócitos
de Ratas Tratadas com Tamoxifeno
Glucostatic Properties in Erythrocytes from
Female Rats Treated with Tamoxifen
Carlos Alberto da Silva*
Professor do Programa de Mestrado em
Fisioterapia Universidade Metodista de
Piracicaba (Unimep)
Piracicaba/SP
Adriano Cesar Rocco Pardi
Mestre em Fisioterapia
Universidade Metodista de Piracicaba
(Unimep)
Piracicaba/SP
Carolina Barbosa Ribeiro
Mestre em Fisioterapia
Universidade Metodista de Piracicaba
(Unimep)
Piracicaba/SP
Eder João de Arruda
Mestre em Fisioterapia
Universidade Metodista de Piracicaba
(Unimep)
Piracicaba/SP
Maria T. M. Severi
Doutoranda do Departamento de Fisioterapia
da Universidade Federal de São Carlos
(UFSCar)
São Carlos/SP
Luciano Júlio Chingui
Doutorando do Departamento de Fisioterapia
da Universidade Federal de São Carlos
(UFSCar)
São Carlos/SP
*Correspondências:
Universidade Metodista de Piracicaba
Faculdade de Ciências da Saúde – PPG-FT
Rodovia do Açúcar, 7.000, km 156
Campus Taquaral – Piracicaba
CEP 13400-901
[email protected]
Sáude em Revista
Eritrócitos de Ratas Tratadas com Tamoxifeno
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RESUMO: O tamoxifeno é um fármaco que tem sido amplamente usado na
quimioprevenção de câncer de mama, no entanto pouco se sabe sobre os
possíveis efeitos nos eritrócitos. Utilizou-se neste estudo ratas Wistar com idade
de 3 a 4 meses, que foram divididas em dois grupos denominados controle e
tratadas com tamoxifeno, n=6. Após anestesia (pentobarbital sódico 40 mg/kg,
ip), coletou-se sangue com seringas heparinizadas da artéria e veia femurais,
porta e supra-hepática. As amostras passaram por avaliação da glicemia em
fitas de glicoteste, concentração de hemoglobina por meio de kit laboratorial
e glicogênio por meio de micrométodo enzimático. Coletou-se uma segunda
alíquota de sangue da veia renal, direcionando-a para avaliação das propriedades
glicostáticas in vitro. Na análise estatística utilizou-se a Análise de Variância
(ANOVA) e teste de Tukey, p<0,05. Observou-se que in vivo os eritrócitos
normais modificam suas reservas glicogênicas de acordo com a mudança na
glicemia, atingindo um diferencial de 33% entre as femurais e entre veia porta
e supra-hepática, mobilizando durante sua passagem pelos capilares periféricos
e aumentando durante sua passagem pelo fígado. As observações in vivo foram
reiteradas in vitro. Notou-se que a capacidade glicostática foi comprometida na
presença do tamoxifeno, concluindo-se que ele inibiu as funções glicostáticas dos
eritrócitos, possivelmente por modificar funções enzimáticas e/ou estruturais.
Palavras-chave ERITRÓCITOS; TAMOXIFENO; GLICOGÊNIO; RATAS.
ABSTRACT Tamoxifen is a drug that has been widely used in chemoprevention
of breast cancer, yet little is known about the possible effects on erythrocytes.
Wistar rats (3-4 months) were divided into two groups namely: control and
treated with tamoxifen, n = 6. After anesthesia (sodium pentobarbital 40 mg /
kg, ip) blood was collected with heparinized syringes from the femoral artery
and vein and the portal vein and supra-hepatic being directed to evaluation of
blood glucose with the use of tapes used in glicotest, hemoglobin concentration
through laboratory application kit and glycogen reserves through microenzymatic method. A second aliquot of blood was collected from the renal vein
and directed toward evaluating the properties glucostatic in vitro. Statistical
analysis used ANOVA and Tukey test, p <0.05. In vivo erythrocytes change
their normal glycogen reserves in accordance with the change in blood glucose
achieved a 33% differential between the femoral vein and artery and between
hepatic vein and supravena mobilizing during its passage through the capillaries
and increasing peripheral during its passage through the liver. The observations
in vivo were repeated in vitro. It was also observed that the capacity glucostatic
was compromised in the presence of tamoxifen. Tamoxifen inhibits the functions
of erythrocyte glucostatic properties by modifying enzymatic functions and / or
structural.
Keywords ERYTHROCYTES; TAMOXIFEN; GLYCOGEN; FEMALE RATS.
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Introdução
A manutenção da homeostasia energética depende da integridade funcional
dos principais reservatórios de substratos
metabolizáveis, bem como do suprimento
adequado de acordo com a demanda.1
Diversos cientistas têm utilizado eritrócitos como modelos celulares para
avaliação da atividade de receptores de
insulina, uma vez que as características
funcionais desses receptores são similares
às observadas em outros tecidos.2, 3 Cabe
ressaltar que esse modelo também é utilizado na análise de resistência insulínica
gerada em alguns estados patológicos ou
tratamentos farmacológicos. 4, 5, 6
Além de os tecidos que classicamente participam do ajuste glicêmico, como o
fígado, foi demonstrado que os eritrócitos
absorvem e incorporam glicose nos reservatórios de glicogênio quando a glicemia
está elevada, liberando-a em caso de hipoglicemia. Como as reservas de glicogênio
superam as necessidades metabólicas das
hemácias, sugeriu-se que estas contribuam
de maneira importante para um sistema
fino de distribuição de glicose.7
O metabolismo de glicogênio em eritrócitos normais foi avaliado utilizando
como parâmetro a incorporação de glicose radioativa a reservatórios de glicogênio,
sendo observada a taxa de síntese de 0,04
-1
± 0,01 µmol.gHb .h sob normoglicemia, os
eritrócitos humanos utilizam 1 a 2 µmoles
de glicose.ml células.h., o que equivale a 12
mil vezes ao requerido para a manutenção
da atividade metabólica.8
Guarner e Alvarez-Buylla9 constataram
uma diferença arteriovenosa no conteúdo
de glicogênio eritrocitário em ratos e sugeriram que as hemácias estariam distri-
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buindo glicose aos tecidos e participariam
efetivamente da regulação glicêmica. Essa
função glicostática dos eritrócitos foi descrita em pesquisas com ratos submetidos a
diferentes condições experimentais, como
no estresse e atividade física.10
Sabe-se que o tamoxifeno é um agente antiestrogênico comumente utilizado
no tratamento do câncer de mama e, mais
recentemente, na quimioprevenção em
mulheres com elevado risco de desenvolvimento desse tipo de câncer. Sua prescrição se dá na terapia adjuvante sistêmica,
que ocorre geralmente após o tratamento
cirúrgico ou quimioterápico convencional.
Nota-se considerável índice de prescrição
do fármaco tamoxifeno no tratamento de
doenças benignas da mama, tais como: alterações fibrocísticas, mastalgia intensa e
fibroadenoma. Visto sua capacidade em
prevenir a ligação do estrógeno ao tecido
alvo, os resultados têm sido bastante satisfatórios até então.11
Na literatura observam-se diferentes
efeitos relacionados ao tratamento com
tamoxifeno. Dessa forma, destaca-se a capacidade em promover redução na concentração plasmática de colesterol total, bem
como o da lipoproteína de baixa densidade
(LDL).12 Por outro lado, tem sido descrito
o desenvolvimento de hipertrigliceridemia
devido à capacidade da molécula em elevar
a síntese hepática e reduzir o catabolismo
de LDL, o que resulta na diminuição da
atividade das enzimas lipase lipoproteica e
lipase triglicéride hepática.13, 14 Com referência à relação entre a ação bloqueadora
de receptores estrogênicos pelo tamoxifeno
e a secreção de insulina, é sabido que o estrógeno é um dos secretagogos da insulina,
de modo que o quimioterápico interfere na
modulação do processo secretório e pode
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modificar o perfil do metabolismo de carboidratos.15, 16
Especificamente no que se refere às relações entre os eritrócitos e o tamoxifeno
foi avaliado o comportamento osmótico
dos eritrócitos na presença de tamoxifeno
e foi constatado elevação na fragilidade seguida de maior índice de hemólise.17
Baseando-se no fato de o tratamento
com tamoxifeno promover modificações
estruturais nos eritrócitos, o objetivo deste
estudo foi avaliar se o tratamento promove
mudança no comportamento glicostático.
Material e Métodos
Utilizou-se ratas Wistar com idade variando de 3 a 4 meses, alimentadas com
ração e água ad libitum, mantidas em ambiente com temperatura constante de aproximadamente 23±2 oC e ciclo claro/escuro
de 12 horas. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da
UFSCar, sob o Protocolo nº. 011/2006.
Os animais foram divididos em dois
grupos experimentais (n=6), denominados
controle e tratado. Para o grupo tratado,
utilizou-se tamoxifeno via intraperitoneal,
na dose de 1 mg/kg, durante 15 dias, sempre
pela manhã, das 8 às 10 horas, com base no
hábito alimentar da espécie. Após anestesia
com pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip),
os animais foram laparotomizados e uma
alíquota de sangue foi coletada pela veia
renal e encaminhada para determinação da
concentração de hemoglobina por meio de
kit colorimétrico de aplicação laboratorial.
A escolha do anestésico tiopental justifica-se, pois essa formulação não promove modificação no metabolismo.18
Para amostragem e avaliação da concentração de glicogênio em eritrócitos in
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Eritrócitos de Ratas Tratadas com Tamoxifeno
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vivo, empregou-se o seguinte procedimento:
após dez minutos de anestesia, amostras de
sangue foram coletadas da artéria e veia femurais, veia porta e supra-hepática, sendo centrifugadas sob refrigeração a 3.000 rpm durante
dez minutos, o plasma foi retirado e condicionado separadamente em tubos sob gelo. A determinação da glicemia foi realizada por meio
de fitas usadas em glicoteste. Os eritrócitos
remanescentes foram lavados duas vezes com
solução salina 0,9% gelada, descartando-se a
camada superficial em que se encontravam os
leucócitos, procedimento comparável com os
métodos usados para preparar eritrócitos para
estudos metabólicos. Uma alíquota de 20 µl
dos eritrócitos destinou-se à avaliação da hemoglobina e 200 µl de eritrócitos foram usados na avaliação do conteúdo de glicogênio.
Para a avaliação in vitro, os animais foram
anestesiados para que o sangue fosse coletado
da veia renal e condicionado em um recipiente sob gelo, formando um pool de células. O
sangue coletado foi transferido para um tubo
de ensaio, para que fosse centrifugado durante dez minutos a 2.500 rpm. Após a centrifugação, descartou-se uma camada superficial
para a retirada dos leucócitos.19 A seguir, alíquotas de 0,5 mL seguiram em tubos de ensaio
a fim de serem incubadas durante 15 minutos
a 37 ºC , na presença de diferentes concentrações de glicose. Para a incubação dos eritrócitos, os tubos de ensaio contendo os eritrócitos
foram acondicionados em suportes metálicos
e parcialmente submersos em banho-maria a
37 ºC durante 15 minutos. No procedimento
utilizado para extração e determinação do glicogênio dos eritrócitos, empregou-se o método de Farquarson,20 que expressa o conteúdo
em µg.g/hemoglobina, com precisão do método que é de 0,1 µg de glicogênio. Na análise
estatística das diferenças arteriovenosa e veias
porta e supra-hepática, foi utilizada a ANOVA seguida do teste de Tukey com p<0,05. As
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relações entre o conteúdo eritrocitário de
glicogênio e as variações da glicemia foram
calculadas por meio da correlação.
Resultados
Inicialmente foi avaliada a concentração de glicogênio em eritrócitos e a correlação com a glicemia em diferentes setores do
leito vascular. A Tabela 1 mostra os valores
da glicemia e da concentração de glicogênio
eritrocitário em quatro setores do leito vascular: artéria e veia femurais e veias porta e
supra-hepática de ratas, estando os animais
alimentados. A glicemia medida nas femurais revela uma diferença arteriovenosa de
44%, sendo maiores os valores obtidos no
ramo arterial. Essa diferença correspondeu
à utilização de glicose no membro posterior
das ratas. Também como esperado, houve
diferença entre as glicemias da veia porta
e da supra-hepática, sendo 66% maior a
concentração nesta última, em virtude da
liberação de glicose pelo fígado.
Para avaliar se os eritrócitos participam na homeostasia da glicose como armazenadores e transportadores de glicose,
o conteúdo de glicogênio foi quantificado
no sangue coletado nos quatro setores do
leito vascular. As reservas eritrocitárias de
glicogênio variaram conforme a região de
coleta, registrando-se diferença de 33%
tanto entre a artéria e a veia femurais quanto entre a veia porta e a supra-hepática. A
diferença arteriovenosa observada pode
estar relacionada à mobilização do glicogênio dos eritrócitos em condições em que a
glicemia diminuiu (veia femural). A mesma diferença foi observada na avaliação do
perfil veia porta/supra-hepática, sendo verificada maior concentração plasmática de
glicose no ramo vascular que sai do fígado
(Tabela 1).
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Tabela 1. Concentração eritrocitária de glicogênio
-1
(µg.g Hb) e glicose plasmática (mg.dL) em diferentes setores do leito vascular de ratas controle e
tratadas durante 15 dias com tamoxifeno (10 mg/
kg). Os valores correspondem à média ± epm, n=6.
*p<0,05 na comparação entre a artéria e veia femurais e # p<0,05 na comparação entre a veia porta e a
supra-hepática.
Glicogênio
(µg/g -1Hb)
Glicemia (mg/
dL)
30,16 ± 1,0*
69,17 ± 1,8*
Grupo controle
Veia femural
Artéria femural
40,12 ± 0,1
99,89 ± 1,2
Veia porta
34,06 ± 0,4#
72,11 ± 2,2 #
Veia supra-hepática
45,39 ± 1,1
120,13 ± 1,3
Veia femural
9,78 ± 0,5
60,11 ± 1,2*
Artéria femural
10,17 ± 0,3
72,46 ± 1,0
Veia porta
10,19 ± 0,2
69,16 ± 2,2#
Veia supra-hepática
12,21 ± 0,9
82,19 ± 3,3
Grupo tamoxifeno
A seguir, o estudo foi direcionado à
análise do grupo tratado com tamoxifeno. Nessa etapa foi possível verificar um
comportamento similar ao do grupo controle, sendo observada diferença glicêmica
de 30% tanto entre as femurais quanto no
circuito hepático. Na análise do conteúdo
de glicogênio nas femurais, foram observados valores significativamente menores
atingindo 67% e 74% na veia e artéria,
não existindo diferença estatística entre os
compartimentos.
No circuito hepático, foram observadas
também menores reservas atingindo 70%
e 73%, respectivamente na veia porta e supra-hepática, e da mesma forma sem diferença estatística entre os compartimentos,
indicando comprometimento na capacidade de carga de glicose e síntese de glicogênio nos eritrócitos nesse ínterim.
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É importante ressaltar que in vivo somente no grupo controle a concentração de glicogênio avaliada nos setores do leito vascular
mostrou alta correlação com a glicemia.
In vitro, em concentrações crescentes de
glicose, os eritrócitos aumentaram de maneira diretamente proporcional às suas reservas de glicogênio, com correlação elevada (r = 0,94). Todavia, houve ainda necessidade de demonstrar que os eritrócitos liberavam glicose à medida que a concentração
da hexose no meio se reduzia. Eritrócitos
inicialmente incubados na presença de 240
-1
mg.dL de glicose acumularam glicogênio
e, posteriormente, reduziram o seu conteúdo, ao serem novamente incubados em
concentrações mais baixas de glicose (r =
0,83), como mostra a Tabela 2.
Tabela 2. Efeito da concentração de glicose sobre a
-1
concentração de glicogênio (µg.g Hb) de eritrócitos
de ratas in vitro. O conteúdo de glicogênio foi determinado em eritrócitos após incubação em solução
salina (NaCl 0,9%) durante 15 minutos a 37 ºC. No
grupo descarga os eritrócitos foram inicialmente in-1
cubados na presença de 240 mg.dL de glicose e, em
seguida, reincubados em soluções com outras concentrações de glicose; n = 6, *p<0,05 comparado à
ausência de glicose.
Carga
Descarga
Glicogênio
(µg.g-1Hb)
Glicose
(mg/
dL)
Glicogênio
(µg.g-1Hb)
NIHIL
0,50 ± 0,05
240
39,72 ± 0,9*
40
9,01 ± 1,5*
200
30,60 ± 0,5*
80
11,92 ± 0,7*
160
24,79 ± 0,6*
120
22,14 ± 0,3*
120
18,10 ± 0,8*
160
26,75 ± 0,4*
80
9,39 ± 0,2*
200
37,61 ± 0,2*
40
8,91 ± 0,1*
240
44,67 ± 0,8*
NIHIL
0,55 ± 0,2
Glicose
(mg/dL)
Na avaliação das funções glicostáticas
dos eritrócitos de ratas tratadas com tamoSáude em Revista
Eritrócitos de Ratas Tratadas com Tamoxifeno
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xifeno in vitro, observou-se a ausência da
dinâmica constatada no grupo não tratado,
indicando supressão da função glicostática
(vide Tabela 3).
Tabela 3. Efeito in vitro da concentração de glicose
-1
sobre a concentração de glicogênio (µg.g Hb) de
eritrócitos de ratas tratadas com tamoxifeno (10
mg/kg). O conteúdo de glicogênio foi determinado
em eritrócitos, após incubação em solução salina
(NaCl 0,9%) durante 15 minutos a 37 ºC, n = 6,
*p<0,05 comparado à ausência de glicose.
Glicose (mg/dL)
Glicogênio (µg.g-1Hb)
NIHIL
0,48 ± 0,03
40
0,88 ± 0,04 *
80
1,27 ± 0,1 *
120
1,87 ± 0,1 *
160
3,05 ± 0,1 *
200
3,78 ± 0,08 *
240
3,69 ± 0,2 *
Discussão
A manutenção da normoglicemia depende da integração entre os sistemas nervoso e endócrino, os quais regulam a dinâmica de mobilização e armazenamento das
reservas glicogênicas.1 Na década de 70, foi
demonstrada, nos eritrócitos, a presença
das enzimas glicogênio sintetase, amiloglicosidase e fosforilase, as quais contribuem
para a formação do reservatório de glicogênio e sua mobilização.8
O interesse pela compreensão dos mecanismos que colaboram na manutenção
de níveis normoglicêmicos incentivou a investigação da participação dos eritrócitos,
considerando que seus reservatórios de glicogênio poderiam desempenhar importante função na distribuição de glicose.7, 9
Essa função dos eritrócitos tem sido relegada a um plano secundário, em virtude
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do grande reservatório de glicogênio do fígado e a rapidez com que ele é mobilizado e reconstituído em indivíduos normais,
no entanto os eritrócitos são considerados
reservatórios de glicogênio de fácil acesso,
permitindo várias amostragens em estudos
de longa duração, sem provocar grande estresse na coleta.
Com o intuito de avaliar as reservas eritrocitárias de glicogênio em ratos normais,
foram examinados eritrócitos de diversos setores do leito vascular e observado diferença
na concentração de glicogênio dos eritrócitos coletados na artéria e na veia femurais,
a qual foi significativamente maior no ramo
arterial. A diferença arteriovenosa periférica
sugere que os eritrócitos possam liberar glicose durante o trânsito pelos capilares.22
Observou-se também que, após os eritrócitos passarem pelo interior do fígado, a
concentração de glicogênio aumentou, sugerindo que tenham captado glicose no interior desse órgão. Tal diferença é paralela à
ocorrida na glicemia, sendo as concentrações
de glicose plasmática na veia supra-hepática
maiores do que na veia porta. As observações acima estão de acordo com outros estudos que demonstraram in vivo que, quando
a glicemia se eleva, os eritrócitos captam glicose, estocando-a na forma de glicogênio e
liberando-a quando a glicemia é reduzida.7, 9
O perfil de mobilização das reservas
eritrocitárias de glicogênio também ocorre
na atividade física, na qual as necessidades
energéticas são maiores, e os eritrócitos participam do fornecimento de glicose para as
células, possivelmente no trânsito capilar.10
Silva e Gonçalves22 demonstraram o
comprometimento na formação das reservas eritrocitárias de glicogênio no diabetes
mellitus e que essa função é passível de recuperação com a utilização de fármacos indutores enzimáticos.
32
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No que se refere à atividade metabólica
eritrocitária, tem sido descrito que o conteúdo de glicose intraeritrocitários supera as
necessidades metabólicas em 12 mil vezes,
sugerindo que essas células transportem
glicose pela corrente sanguínea.8, 10
No presente estudo, verificou-se diferença na concentração eritrocitária de
glicogênio nas femurais, considerando-se
o baixo consumo de glicose pelos eritrócitos. A disparidade no conteúdo eritrocitário de glicogênio sugere ter havido liberação de glicose, e não a utilização dela pelos
eritrócitos. Também as diferenças arteriovenosas entre as veias porta e supra-hepática estão de acordo com a proposta de envolvimento dos eritrócitos na distribuição
de glicose.
Para constituírem importante fonte de
glicose, os eritrócitos devem armazenar
glicogênio em razão das variações da glicemia. A forte correlação entre a glicemia e
a concentração de glicogênio eritrocitária
(r = 0,794), encontrada nos diferentes setores vasculares, sugeriu que o conteúdo de
glicogênio nos eritrócitos depende da concentração plasmática de glicose.
Outro estudo merecedor de destaque é
o de Silva e Guirro23 no qual onde foi demonstrado que no músculo esquelético
desnervado, o perfil de distribuição periférica de glicose pelos eritrócitos não foi
modificado, sugerindo que a dinâmica glicostática dos eritrócitos seja mantida ainda
que o tecido esteja lesado.
Dentre os inúmeros benefícios metabólicos ligados ao tratamento com tamoxifeno, tem sido descrita a diminuição
das concentrações séricas de colesterol em
pacientes acometidos de diabetes mellitus,
indicando um efeito favorável na sua utilização no tratamento de distúrbios lipídicos
em mulheres diabéticas.21
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Recentes estudos indicam que o tamoxifeno, ao promover alterações no metabolismo lipídico, possa comprometer a integridade da membrana eritrocitária, uma vez
que já foi demonstrado o desenvolvimento
de anemia hemolítica em pacientes sob tratamento com esse quimioterápico.17, 24
Nesse sentido, este estudo em sua vertente in vivo e in vitro demonstra que os eritrócitos de ratas tratadas com tamoxifeno
perdem a função glicostática, não exibindo
a capacidade de modificar suas reservas de
acordo com a mudança na glicemia, fato
que pode estar fundamentado na capacidade que o fármaco tem em promover modificações tanto na estrutura da membra-
na dos eritrócitos quanto no citoesqueleto,
comprometendo as funções eritrocitárias e
mudando a estabilidade mecânica, tornando-os mais frágeis.25
Conclusão
Os resultados demonstram que eritrócitos de ratas tratadas com tamoxifeno
perdem as propriedades glicostáticas, o que
compromete a função de distribuição de
glicose no ínterim dos capilares periféricos
e no trânsito pelo leito hepático. Possivelmente, esse fato esteja ligado à citotoxicidade do quimioterápico.
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Submetido: 29/3/2010
Aprovado: 9/8/2010
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