prevalência da leucose enzoótica bovina na região norte

PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO
NORTE FLUMINENSE
ILIANI BIANCHI
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES- RJ
ABRIL - 2003
PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO
NORTE FLUMINENSE
ILIANI BIANCHI
Tese apresentada ao Centro de Ciências
e
Tecnologias
Agropecuárias
da
Universidade
Estadual
do
Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título
de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
ABRIL - 2003
PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO
NORTE FLUMINENSE
ILIANI BIANCHI
Tese apresentada ao Centro de Ciências
e
Tecnologias
Agropecuárias
da
Universidade
Estadual
do
Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título
de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em
de
de
Comissão examinadora:
Prof. Cláudio de Moraes Andrade (Doutor, Microbiologia) - UFRRJ
Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho (Doutor, Anatomia Patológica) - UENF
Prof a. Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira (Doutora, Microbiologia) - UENF
Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor, Microbiologia) – UENF
(Orientador)
“ Só existem dois dias no ano em
que nada pode ser feito. Um se chama
ontem e o outro se chama amanhã,
portanto, hoje é o dia certo para amar,
acreditar, fazer e, principalmente,
viver.”
Dalai Lama
ii
Dedico esta tese a vocês duas, que
são tudo na minha vida: Carmorina,
que é a melhor mãe do mundo, e
Ivânea, que é mais que uma irmã.
iii
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a você, meu Deus, que sempre esteve junto de mim para
me defender, dentro de mim para me conservar, à minha frente para me guiar , ao
meu lado para me defender, atrás de mim para me guardar e acima de mim para
me abençoar. Muito obrigada!
Ao Professor Carlos, pela verdadeira orientação, dedicação, paciência e
grande amizade. Você é mais que um orientador, é um irmão.
À Professora Sílvia, pelos momentos de alegria e pela coorientação.
Ao Professor Cláudio de Moraes Andrade, pela grande ajuda com seu livro
de técnicas de laboratório e pela sua presença na banca de defesa.
Aos Professores Friederike Luise Mayen, Eulógio Carlos Queiróz de
Carvalho (que me orientou desde a graduação e por quem tenho grande
admiração), Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira e aos demais Professores do
Laboratório de Sanidade Animal.
Ao grande Professor Pedro Paulo Abílio Diniz, que sempre foi um modelo a
ser seguido.
Um agradecimento especial à FUNDENOR (Eduardo e Ângela) e à
COOPERLEITE (Ramiro) pelo envio de materiais.
Ao amigo Lério, pela grande e importantíssima colaboração, agradeço do
fundo do coração.
À equipe de Virologia: André, Dirlei, Raquel, Cleuber e Luiz Fernando.
ii
Ao Marcelo Sales, que me ajudou e me aturou durante este trabalho de
pesquisa. Obrigada pela ajuda nas saídas a campo.
À mamãe, que, sempre, mesmo de longe, sentia tudo o que eu estava
sentindo, nas horas tristes e alegres. Obrigada pelas milhares de orações que
sempre fez para mim quando lhe pedia.
À minha irmã, pelo carinho e preocupação que sempre teve comigo. Tenho
muito orgulho de ter uma irmã assim como você, com tanta disposição e garra
para trabalhar e ajudar a nossa família.
Aos meus irmãos: Inácio, Ildeberto e Ildefonso, por acreditarem, confiarem
em mim e, principalmente, pelos “irmãotrocínios”. Amo vocês! À Clarice, por cuidar
do meu irmão Ildeberto, e por me dar um sobrinho (Alexandre), que, mesmo nos
poucos encontros, me oferece muitos sorrisos.
Ao meu pai, que, mesmo distante, sei que torce por mim.
À Giselda, minha irmã preta, pelos choros que se transformaram em
gargalhadas e vice-versa nesses dois anos. A sua amizade me fazia continuar.
Às duas melhores amigas que alguém já pôde ter: Viviane e Gigi, gosto
muito de vocês.
Aos amigos(as) Lígia, Francimar, Isabel, Lara, Karime, Verônica, Claudia e
Euler, pelo companheirismo nas festas, encontros para lanchar ou apenas “trocar
informações importantíssimas e urgentes”.
Ao grande amigo “Dudu” (Eduardo), que sempre foi meu apoio,
principalmente nas horas difíceis.
Ao Léo (Leonardo), Gina e Luciana que sempre estiveram dispostos a me
ajudar. Vocês sempre estavam (e estão) me dando aquela força.
Aos Pós-Graduandos do Sanidade Animal: Adriana, Alessa, Ana Bárbara,
Ana Paula, Bianca, Cristiane, Flávia, Francimara, Guilherme, Jorgeamado,
Ricardo (Jagatá), Ricardo e Príscila.
Aos funcionários da Biblioteca, Coordenação Acadêmica e Coordenação da
Pós-Graduação. E àqueles que me ajudaram direta e/ou indiretamente e não
foram citados, minhas desculpas.
Ao apoio financeiro da FENORTE/UENF.
iii
BIOGRAFIA
ILIANI BIANCHI, filha de David Bianchi e Carmorina Bonfá, nasceu em 27
de maio de 1976, na cidade de Linhares – Espírito Santo.
Em março de 1995, entrou para a Graduação em Medicina Veterinária na
Universidade Estadual do Norte Fluminense, onde colou grau em janeiro de 2000.
Foi adimitida em março de 2001 no Curso de Pós-Graduação em Produção
Animal, Mestrado, Sanidade Animal, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa
de tese para conclusão do curso em abril de 2003.
iv
CONTEÚDO
RESUMO..................................................................................................................xi
ABSTRACT.............................................................................................................xiii
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................1
2. OBJETIVOS...................................................................................................3
3. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................4
3.1.
Histórico...............................................................................................4
3.2.
Etiologia e propriedades gerais do vírus.............................................5
3.3.
Epizootiologia......................................................................................6
3.4.
Patogenia.............................................................................................7
3.5.
Manifestações clínicas.........................................................................8
3.6.
Diagnóstico..........................................................................................8
3.7.
Prevenção e controle.........................................................................10
3.8.
Importância econômica e sanitária....................................................10
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................12
4.1.
Animais..............................................................................................12
4.2.
Detecção de anticorpos anti-vírus da leucose bovina.......................12
4.3.
Análise estatística..............................................................................13
5. RESULTADOS.............................................................................................14
6. DISCUSSÃO................................................................................................18
v
7. CONCLUSÕES............................................................................................21
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................23
9. APÊNDICES..................................................................................................30
9.1. Apêndice A – Ficha da propriedade..................................................30
9.2. Apêndice B – Ficha dos animais........................................................31
9.3. Apêndice C – Tampão de borato......................................................31
vi
LISTA DE TABELAS
Quadro 1. Prevalência do vírus da leucose bovina em diferentes Estados do
Brasil.........................................................................................................................5
Tabela 1. Prevalência da infecção pelo vírus da leucose bovina determinada pelo
teste de imunodifusão em gel de ágar, por idade dos animais na Região Norte
Fluminense.............................................................................................................15
Tabela 2. Prevalência dos animais infectados com o vírus da leucose bovina de
acordo com a faixa etária........................................................................................16
Tabela 3. Prevalência da leucose enzoótica bovina de acordo com o tipo de
exploração do rebanho, nas 18 propriedades analisadas na Região Norte
Fluminense.............................................................................................................17
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Teste de imunodifusão em gel de ágar com indicação das amostras
positivas (em verde)................................................................................................13
Gráfico 1. Número de animais soropositivos e soronegativos para o vírus da
leucose enzoótica bovina na Região Norte Fluminense, de um total de 734 animais
analisados...............................................................................................................14
Gráfico 2. Prevalência do vírus da leucose enzoótica bovina por idade na Região
Norte Fluminense....................................................................................................15
Gráfico 3. Prevalência da leucose enzoótica bovina por faixa etária na Região
Norte Fluminense....................................................................................................16
Gráfico 4. Percentual de propriedades positivas e negativas frente ao vírus da
leucose bovina, em um total de 18 propriedades analisadas na Região Norte
Fluminense.............................................................................................................17
Gráfico 5. Prevalência da leucose enzoótica bovina em diferentes Regiões do
Brasil.......................................................................................................................19
viii
RESUMO
BIANCHI, I., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro;
abril de 2003; Prevalência da Leucose Enzoótica Bovina na Região Norte
Fluminense; Professor Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos.
De distribuição mundial, a Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma doença
causada por um retrovírus, subfamília Orthoretrovirinae e gênero Deltaretrovírus,
que causa grandes perdas econômicas na pecuária bovina. Entretanto, na Região
Norte Fluminense, a verdadeira situação do rebanho frente ao vírus da leucose
bovina (VLB) é desconhecida. Para determinar a prevalência do VLB na região,
foram testadas 734 amostras de soro sanguíneo bovino, utilizando-se o teste de
imunodifusão em gel de ágar (IDGA) utilizando com animais variando de 1 a 15
anos de idade. Das 734 amostras analisadas, 127 (17,30%) foram positivas ao
vírus da leucose enzoótica bovina. A estratificação dos animais estudados em três
faixas etárias demonstrou uma maior prevalência entre os de 11 a 15 anos
(27,78%) seguidos pelos de 6 a 10 anos (19,68%) e pelos de 1 a 5 anos (11,01%).
Esses
resultados
demonstram
que
a
prevalência
tende
a
aumentar
proporcionalmente com a idade. Dos 18 rebanhos examinados, 14 foram positivos
e apenas 4 foram negativos. Com os valores encontrados, podemos observar que
o VLB está presente e disseminado na região Norte Fluminense. Dessa forma, é
ix
extremamente necessária a implantação de medidas profiláticas visando ao
controle e/ou eliminação da doença na região, minimizando, assim, as perdas
econômicas associadas.
Palavras-chave: Leucose Enzoótica Bovina, Prevalência e Retrovírus.
x
ABSTRACT
BIANCHI, I., Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro; march of 2003; Prevalence of Bovine Enzootic
Leukosis in the Fluminense North Region; Guiding: Carlos Eurico
Pires Ferreira Travassos.
Worldwide in distribution, Enzootic Bovine Leukosis (EBL) is one disease
caused by a retrovirus of the Orthoretrovirinae subfamilie and
Deltaretrovirus genus when caused economic losses to the livestock
industry. However in the North Fluminense Region the true situation
of the herd front bovine leukosis virus (BLV) is unknown. For
determining the prevalence of BLV in region 734 bovine blood
samples were tested, bovine of one to fifteen-year-olds, through
the agar-gel immunodiffusion test (AGID). Out of the 734 sample
analyzed 127/734 (17,30%) were positive the BVL. The animals
were stratified into three different age groups, showed a prevalence
of the 27,78% between from 11 to 15-year-olds, 19,68% between
from 6 to 10-year-olds and 11,01% between from 1 to 5-year-olds.
These results showed that the prevalence tends to increase
proportionally as the years go by. Out of the 18 herds examined 14
(77,78%) were positive and only 4 were negative. These results
showed that the BVL is widely spread within the North Fluminense
Region and implanting control measures is extremely necessary.
Key words: Bovine Enzootic Leukosis, Prevalence and Retrovirus.
xi
12
1. INTRODUCÃO
A Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma enfermidade infecto-contagiosa
causada por um vírus da família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero
Deltaretrovirus. Um vírus RNA, envelopado, que mede de 80 a 120nm de diâmetro e
que infecta preferencialmente os linfócitos B.
A doença se manifesta de duas formas: linfocitose persistente e/ou
linfossarcoma em bovinos adultos. Na linfocitose, o animal tem um aumento do
número absoluto de linfócitos e essa leucocitose ocorre em 29% dos animais
infectados com o Vírus da Leucose Bovina (VLB). O linfossarcoma ocorre em
apenas 5% dos animais infectados com o VLB e seus sinais clínicos são variáveis,
dependendo da localização dos tumores no organismo dos animais. Os linfonodos
superficiais, em geral, apresentam-se aumentados de tamanho.
O VLB acomete, naturalmente, bovinos, bubalinos, ovinos e capivaras, e,
experimentalmente, caprinos, coelhos, chipanzés, cervídeos, gatos e suínos.
A LEB ocorre, principalmente, em rebanho leiteiro com mais de quatro anos
de idade. Essa observação pode estar relacionada a uma demorada soroconversão
em alguns animais e também ao manejo nesse tipo de exploração.
A infecção pelo VLB está distribuída mundialmente. No Brasil, a leucose já foi
relatada em várias regiões e sua prevalência varia de região para região.
A principal via de transmissão é a horizontal, através de agulhas e
instrumentos cirúrgicos contaminados com sangue. A vertical ou transplacentária
ocorre em menores proporções.
12
13
Uma vez infectados, os bovinos se tornam fonte de disseminação do VLB por
toda sua vida.
A LEB é responsável por importantes perdas econômicas como: queda na
produção leiteira, aumento do intervalo entre partos e ainda restrições quanto às
exportações e importações de bovinos afetados.
O diagnóstico da LEB é feito por imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e
“enzime-linked
immunosorbent
assay”
(ELISA).
O
teste
diagnóstico
oficial
recomendado pela OIE (“Office International des Epizooties”) é o IDGA.
Não existe tratamento para a LEB, porém medidas de profilaxia sanitária
podem ser aplicadas, visando ao controle do VLB em plantéis afetados. Entretanto,
para que medidas preventivas sejam introduzidas, é necessário saber a condição
sorológica do rebanho frente à leucose enzoótica bovina.
13
14
2. OBJETIVOS
Este projeto de pesquisa tem como objetivos determinar a prevalência da
LEB na região Norte Fluminense, utilizando o teste de IDGA.
Contribuir para a pecuária bovina da Região Norte Fluminense, realizando
trabalho de extensão, orientando os produtores sobre como realizar um bom manejo
dos seus animais para controlar a LEB, minimizando, assim, as perdas econômicas
associadas.
14
15
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Histórico
O primeiro relato publicado da LEB foi feito na Alemanha por LEISEREING
(1871) apud OLSON e MILLER, 1987. O agente só foi descoberto por MILLER et al.,
1969, através do isolamento e identificação por microscopia eletrônica.
No Brasil, a doença foi citada, pela primeira vez, em 1943 por RANGEL e
MACHADO apud BIRGEL JUNIOR et al., 1995, e LEITE et al., 2001. Mas o primeiro
diagnóstico clínico da doença foi publicado por MERKT et al., 1959, apud LEITE et
al., 2001.
ALENCAR FILHO et al., 1982, apud BIRGEL JUNIOR et al., 1995,
demonstraram a presença do vírus nas células linfocitárias, através da microscopia
eletrônica, porém, o isolamento do vírus foi descrito, pela primeira vez no Brasil, por
ANGELO et al. (1985).
O VLB está distribuído mundialmente (ONUMA et al., 1989; JONHSON e
KANEEN, 1991) e a sua introdução na América do Sul, provavelmente, se deu
através da importação de bovinos contaminados vindos da Europa e dos EUA
(BRAGA et al., 1998b).
A prevalência do VLB varia de um país para outro e até mesmo entre as
regiões e/ou estados de um mesmo país, como acontece no Brasil (BRAGA et al.,
1998b, MODENA et al., 1984; ABREU et al., 1990; BIRGEL JÚNIOR et al., 1995 e
MORAES et al., 1996), como demonstrado no quadro 1.
15
16
Local
Prevalência
Autor
Acre
9,72%
ABREU et al., 1990
Bahia
16,1%
TÁVORA et al., 1990
Ceará
9,15%
ABREU, 1993
Goiás
35,67%
ANDRADE e ALMEIDA, 1991
Minas Gerais
70,87%
LEITE et al., 1984
Pará
49,8%
MOLNÁR et al., 1999
Paraná
18,33
KANTEK et al., 1982
Pernambuco
13,85%
MELO, 1991
Rio de Janeiro
53,25%
ROMERO e ROWE, 1981
Rio de Janeiro
26,94%
CUNHA et al., 1982
Rio Grande do Sul
12,0%
MORAES et al., 1996
Rondônia
23,02%
ABREU et al., 1990
São Paulo
16,23%
ARITA et al., 1992
Quadro 1. Prevalência do vírus da leucose bovina em diferentes Estados do Brasil.
3.2. Etiologia e propriedades gerais
A LEB é causada por um vírus que, segundo o “International Commitee on
Taxonomy of Viruses” (ICTV), está classificado na família Retroviridae, subfamília
Orthoretrovirinae, gênero Deltaretrovirus.
O termo retro vem de reverso e é derivado da enzima transcriptase reversa
encontrada no virion de todos os membros da família Retroviridae (BRAGA et al.,
1998a e MURPHY et al., 1999). Esta enzima é responsável pela retrotranscrição de
DNA de fita dupla a partir de RNA do vírus. O provírus DNA se integra pela ação da
enzima integrase ao DNA cromossômico dos linfócitos B, causando a infecção
(OLIVEIRA, 2000).
O retrovírus é um vírus envelopado, a partícula viral completa mede de 80 a
120 nm, possui genoma diplóide formado por duas fitas idênticas de RNA simples,
de polaridade positiva, inseridas num capsídeo de simetria icosaédrica (MURPHY et
al., 1999).
16
17
O envelope viral possui projeções que são glicoproteínas de superfície
responsáveis pela interação do vírus com a superfície dos linfócitos (FAVA, 1995 e
BRAGA et al., 1998a). Dentre as principais proteínas virais, se destacam as gp51 e
p24 (FAVA, 1995; BRAGA et al., 1998a e OLIVEIRA, 2000).
Os retrovírus são inativados por solventes e detergentes lipídicos, como
álcool, clorofórmio e éter. São também inativados a 56º C por 30 minutos e não
resistem a ciclos repetidos de congelamento e descongelamentos (FENNER et al.,
1993). Os retrovírus tendem a ser mais resistentes a raios ultravioletas e radiações
X do que os outros vírus, provavelmente devido ao seu genoma diplóide (FENNER
et al., 1993).
3.3. Epizootiologia
No Brasil, a LEB já foi demonstrada em vários Estados, entre eles: Acre,
Bahia, Ceará, Goiás, Pará, Paraná, Pernambuco, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul,
Roraima e São Paulo (GARCIA LIMA, 1980; KANTEK et al., 1982; MODENA et al.,
1983, LEITE et al., 1984 e BIRGEL JUNIOR et al., 1995).
Acredita-se que a entrada do vírus da leucose bovina no Brasil se deu através
de animais importados, o que continua acontecendo até hoje, como demonstraram
BRAGA et al., 1998.
O percentual de animais reagentes tende a aumentar proporcionalmente com
a idade, como demonstraram BIRGEL JUNIOR et al., 1995, variando de 24,6% em
animais de um a dois anos para 86,2% em animais com mais de seis anos de idade.
Uma maior prevalência da LEB tem sido observada em rebanho leiteiro,
principalmente nos altamente tecnificados com regime de criação intensiva. Isso se
deve ao maior contato entre os animais e à grande utilização de aparelhos e
equipamentos, que podem estar contaminados com sangue (principal fonte de
infecção), facilitando a disseminação da doença (LORENTZ e STRAUB, 1987 apud
FAVA, 1995 e VAN DER LAAN et al., 1999).
Qualquer espécime biológico que contenha linfócitos infectados pode
contaminar o animal. O sangue é a via mais comum de infecção, seguida pelo
colostro e pelo leite (OLIVEIRA et al., 1999).
17
18
A idade média dos animais que desenvolvem o linfossarcoma é de cinco anos
e acomete mais o gado leiteiro devido ao tipo de manejo (OLIVEIRA et al., 1999).
Não há relatos na literatura que correlacionam a LEB a variáveis como idade,
sexo e raça.
3.4. Patogenia
Existem duas formas de transmissão do vírus da leucose bovina, a horizontal e a
vertical (BRAGA et al., 1998a).
A transmissão vertical pode ocorrer em vacas prenhes com o feto ainda no
útero ou no canal do parto (MOULTON, 1990 e JAIN, 1993). O colostro e o leite
também são vias de transmissão vertical (STRAUB et al., 1987 apud FAVA, 1995 e
BIRGEL et al., 1982)
A transmissão horizontal é mais freqüente (OLIVEIRA et al., 1994, BRAGA et
al., 1998a) e ocorre principalmente por fômites contaminados com sangue, como:
agulhas, seringas, luvas, instrumentos cirúrgicos, tatuadores e material utilizado para
descorna (FAVA, 1995).
Alguns autores aceitam a hipótese da contaminação pelo sêmen (LUCAS et
al., 1980). Provavelmente, essa contaminação ocorre devido à presença de linfócitos
infectados no fluido seminal, fato que ocorre muito nas doenças do trato genital
(THURMOND e BURRIDGE, 1982 apud BRAGA et al., 1998a). A LEB também pode
ser transmitida via inseto hematófago (BIRGEL JUNIOR et al., 1995; BRAGA et al.,
1998b e VAN DER LANN et al., 1999). A premunição contra anaplasma e babesia
também é uma via de disseminação do vírus quando os animais doadores estão
infectados (FLORES et al., 1992, VAN DER LANN et al., 1999).
A LEB é uma doença infecciosa de caráter crônico. Após a infecção pela LEB,
os animais podem levar de três a vinte e quatro meses para que ocorra
soroconversão (BIRGEL, 1982). Uma vez infectado, o animal torna-se fonte de
infecção por toda sua vida.
O vírus da LEB tem afinidade por linfócitos B. Uma vez infectados, esses
linfócitos se infiltram nos tecidos linfóides do organismo do animal, produzindo,
assim, o linfossarcoma (BRAGA et al., 1998a). Segundo SCHWARTZ et al. (1994), o
18
19
vírus da leucose enzoótica bovina também é capaz de infectar, em menores
proporções, linfócitos T, monócitos e granulócitos.
3.5. Manifestações clínicas
A maioria dos animais infectados não apresenta sinais clínicos característicos
(VAN DER LAAN et al., 1999), entretanto, alguns animais podem desenvolver uma
linfocitose persistente. As manifestações clínicas, decorrentes do linfossarcoma, vão
depender da sua localização e a metástase pode comprometer vários órgãos
(OLIVEIRA et al., 1999).
Entre os animais clinicamente afetados, o principal sinal clínico observado é o
aumento no tamanho dos linfonodos periféricos. Outras observações que têm sido
relacionadas com a LEB em plantéis afetados são: perda de peso,diminuição na
produção de leite, exoftalmia e anorexia (COELHO et al., 1998). Em alguns casos,
pode
ocorrer
pico
febril.
O
animal
tem
aumento
dos
linfonodos
com
comprometimento do coração, abomaso e intestino (OLIVEIRA et al., 1999).
O curso da doença pode levar de algumas semanas a vários meses
(OLIVEIRA et al., 1999) e a principal causa das mortes é a insuficiência cardíaca
(JAIN, 1993).
Uma vez contaminados, os animais tornam-se fonte de infecção permanente
(VAN DER LAAN et al., 1999).
3.6. Diagnóstico
Até recentemente, o diagnóstico da LEB era feito através das manifestações
clínicas baseando-se na presença do linfossarcoma e no aumento dos linfonodos.
Posteriormente, com a observação das alterações hematológicas caracterizadas
pela linfocitose, que ocorria na linfocitose persistente e no linfossarcoma, GÖTZE et
al., 1954 apud FAVA, 1995, elaboraram uma chave leucométrica visando ao
diagnóstico precoce da LEB, para, com isso, combatê-la sistemicamente. Depois do
isolamento do vírus por MILLER et al., 1969, começaram as buscas por métodos
diagnósticos mais eficazes para a LEB.
19
20
Hoje, existem vários métodos diagnósticos: leucograma (GARCIA et al.,
1991), citologia (OLIVEIRA et al., 1999), histopatologia (COELHO et al., 1998),
radioimunoensaio (RIE), fixação de complemento (FC) (MILLER E VAN DER
MAATEN, 1974 apud FAVA, 1995), imunofluorescência (IF) (GARCIA LIMA, 1980),
ELISA (SIMARD et al., 2000a) e IDGA (SIMARD et al., 2000b).
A avaliação do leucograma não é muito utilizada. Apesar dessa técnica ser capaz de
identificar uma linfocitose persistente, é preciso diferenciá-la de duas outras
linfocitoses: aquela decorrente da passagem de linfócitos neoplásicos atípicos para o
sangue, processo que acorre num linfossarcoma, e das linfocitoses transitórias não
relacionadas ao vírus da leucose bovina. Para o diagnóstico da linfocitose persistente,
temos que ter contagem de linfócitos em pelo menos duas amostras com intervalo
mínimo de três meses entre elas (OLIVEIRA et al., 1999).
O exame citológico é um método auxiliar para o diagnóstico da LEB. Ele é
capaz de diferenciar um processo inflamatório de um processo neoplásico.
Entretanto, é necessário que a massa neoplásica esteja instalada ou que os
linfonodos estejam aumentados. Estes são os locais onde serão colhidos os
materiais para a realização do exame (OLIVEIRA et al., 1999).
O diagnóstico também pode ser feito por histopatologia. Em Uberlândia-MG,
foi encontrada uma prevalência de 5,22% em animais abatidos com aumento dos
linfonodos (COELHO et al., 1998).
O RIE, que tem como fundamento a detecção de anticorpos, é um teste mais
sensível, mas utiliza equipamentos altamente especializados, o que o torna
dispendioso (MILLER E VAN DER MAATEN, 1974 apud FAVA, 1995).
Dentre as técnicas disponíveis, a OIE recomenda o IDGA e o ELISA para o
diagnóstico da LEB.
O teste de IDGA tem uma sensibilidade menor que o ELISA, mas é o teste
padrão adotado pela OIE, devido a sua simplicidade, praticidade e por suas
vantagens econômicas. Este teste já foi utilizado com sucesso em programas de
eliminação da doença em alguns países (OLIVEIRA et al., 1999).
O IDGA detecta a presença de anticorpos, para as principais glicoproteínas
do envelope viral, que é indicativo de infecção. O teste de imunodifusão foi
desenvolvido por MILLER e OLSON (1972) apud FAVA, 1995. Eles utilizaram como
antígeno o polipeptídeo p24, que depois foi substituído pela glicoproteína gp51
20
21
porque foi demonstrado que os animais infectados pelo VLB desenvolvem títulos de
anticorpos mais elevados contra a gp51 (FAVA, 1995).
3.7. Prevenção e controle
Mundialmente, as medidas de controle da LEB estão baseadas na
identificação e eliminação de animais soropositivos.
Entretanto, a atitude a ser tomada num programa de controle depende da
prevalência encontrada. A eliminação dos animais é viável quando a prevalência de
soropositivos encontrada for baixa. Quando a prevalência for alta, deve-se separar
os animais soropositivos dos animais soronegativos e mantê-los distantes o
suficiente para evitar a possibilidade de transmissão do vírus via insetos
hematófagos. É extremamente necessário ter cuidado nas práticas de manejo da
fazenda, manipulando-se primeiro os animais soronegativos e depois
os
soropositivos, podendo, assim, controlar e/ou eliminar o VLB no rebanho (BRAGA et
al., 1998a).
3.8. Importância econômica e sanitária
Nos últimos anos, a importância econômica da leucose vem aumentando
(VAN DER LAAN et al., 1999).
Apesar da LEB, na maioria das vezes, afetar os animais de uma maneira
subclínica, as perdas econômicas relacionadas à leucose num plantel afetado são
elevadas. Tem sido demonstrada uma queda significativa na produção de leite
(BRENNER et al., 1989), restrições de comercialização no mercado internacional
(JOHNSON e KANEENE, 1991 e BRAGA et al., 1997), aumento do intervalo entre
os partos (BRENNER et al., 1989 e HEALD et al., 1992) e mortalidade dos animais
(BRAGA et al., 1997).
Muitos países exigem o teste sorológico negativo para a importação dos
animais, inclusive o Brasil, mas não temos um programa oficial de controle da
doença (BRAGA et al., 1997).
21
22
No Brasil, observou-se uma diminuição da produção leiteira em 11%
(D’ANGELINO et al., 1998) nos animais soropositivos para o VLB.
Nos EUA, DA et al. (1993) estimaram uma perda econômica financeira de 86 milhões
de dólares por ano, levando em conta fatores como diminuição da produção de leite e
de gordura do leite em animais soropositivos por três anos consecutivos e que
apresentavam linfocitose persistente.
Além das perdas econômicas, uma outra questão que vem sendo objeto de
estudos na virologia atual é o risco em potencial de transmissão do vírus a humanos
e outros animais, nos quais a doença não ocorre naturalmente, já que as partículas
virais têm sido encontradas no leite (OLIVEIRA, 2000), alimento básico na dieta de
humanos e animais.
22
23
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram colhidas 734 amostras de sangue bovino, provenientes de 18
propriedades localizadas na Região Norte Fluminense. O sangue foi colhido por
punção da veia jugular ou da veia intramamária em tubos “vacutiner” de 10mL. No
Laboratório de Sanidade Animal (LSA-CCTA/UENF), as amostras de sangue foram
mantidas à temperatura ambiente até a dessoragem completa, em seguida
centrifugadas a 600 x g por 5 minutos e os soros obtidos foram armazenados em
“eppendorf” e congelados a –20º C até a realização do teste sorológico. Todos os
animais foram protocolados em fichas individuais com informações sobre: idade,
sexo, raça e manejo realizado na propriedade (Apêndices A e B).
4.2. Detecção de anticorpos anti-vírus da leucose bovina
O teste sorológico utilizado foi o imunodifusão em gel de ágar (IDGA), que
consiste na verificação de anticorpos no soro.
Foi utilizado um Kit comercial proveniente da Sanofi/França, que consta de
soro controle positivo e antígeno gp51.
Usamos gel de ágar noble a 1,2% com tampão borato pH 8,6 (Apêndice C),
que foi distribuído em placas de Petri de 90mm de diâmetro. Em cada placa foram
23
24
cortados quatro rosetas, com um cortador próprio. Essas rosetas têm um poço
central e seis poços laterais. No poço central, foram depositados 32µL do antígeno,
nos dois poços da extremidade superior e inferior foram depositados 73µL do soro
controle positivo, nos outros quatro poços foram depositados 73µL dos soros a
serem testados e cada poço correspondendo a um animal (Figura 1).
Após esse procedimento, as placas foram mantidas em temperatura ambiente
a ± 25º C e, em seguida, feitas leituras com 24, 48 e 72 horas pós inoculação.
Foram consideradas positivas as amostras que formaram uma linha de
precipitação entre o antígeno e o soro testado (Figura 1) e negativa as amostras que
não formaram a linha de precipitação.
- antígeno
- soro amostra
- soro controle
Figura 1: Teste de imunodifusão em gel de ágar com indicação das amostras
positivas (em verde).
4.3. Análise estatística
A prevalência foi calculada através de uma binominal com intervalo de confiança
de 95%.
24
25
5. RESULTADOS
Das 734 amostras analisadas pelo teste de IDGA, 127 foram soropositivas ao
VLB, demonstrando uma prevalência de 17,30% ± 1,4 no rebanho leiteiro da região
(Gráfico1).
127
Número de
animais
soropositivos
Número de
animais
soronegativos
607
Gráfico 1: Número de animais soropositivos e soronegativos para o vírus da
leucose bovina na Região Norte Fluminense, de 734 animais analisados.
A idade dos animais analisados variou de 1 a 15 anos, a maior prevalência
encontrada foi entre o grupo de animais com 13 anos. Os valores encontrados em
todas as idades estão demonstrados na tabela 1 e no gráfico 2.
25
26
Tabela 1: Prevalência da infecção pelo vírus da leucose bovina determinada pelo
imunodifusão em gel de ágar, por idade dos animais na Região Norte Fluminense.
Idade (anos)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Total
Total de animais
analisados
7
8
38
99
66
169
80
171
11
67
10
2
3
1
2
734
Nº animais
positivos
0
1
1
9
13
38
10
36
2
12
3
0
2
0
0
127
1 ano
2 anos
3 anos
4 anos
5 anos
6 anos
7 anos
8 anos
9 anos
10 anos
11 anos
12 anos
13 anos
14 anos
15 anos
70
Prevalência (%)
60
50
40
30
20
10
0
Prevalência
%
0,00
12,50
2,63
9,09
9,00
22,48
12,50
21,05
18,18
17,91
30,00
0,00
66,66
0,00
0,00
17,30
Idade (anos)
Gráfico 2: Prevalência do vírus da leucose bovina por idade na Região
Norte Fluminense.
De acordo com a faixa etária, encontramos uma maior
prevalência nos animais de 11-15 anos (27,78%), seguida pelos
26
27
animais de 06-10 anos (19,68%) e pelos de 1-05 anos (11,01%)
(Tabela 2 e Gráfico 3).
Tabela 2: Prevalência dos animais de acordo com a faixa etária.
Faixa
Etária
Total de animais
1-5 anos
218
24
11,01
6-10 anos
498
98
19,68
11-15 anos
18
5
27,78
Total de animais
Prevalência (%)
positivos
11,01%
1-5 anos
6-10 anos
27,78%
11-15 anos
19,68%
Gráfico 3: Prevalência da leucose enzoótica bovina por faixa etária na Região Norte
Fluminense.
Para determinar o status das propriedades analisadas, foi considerada
positiva aquelas que apresentaram ao menos um animal soropositivo. Das dezoito
propriedades analisadas, quatorze foram consideradas positivas e apenas quatro
foram negativas (Gráfico 4).
27
28
22,22%
Propriedades
positivas
Propriedades
negativas
77,78%
Gráfico 4: Percentual de propriedades positivas e negativas frente ao vírus da
leucose bovina, em um total de 18 propriedades analisadas na Região Norte
Fluminense.
Dentre essas dezoito propriedades, 5 são de exploração exclusivamente de
corte, 10 são de exploração exclusivamente leiteira e 3 são de exploração mista.
Encontramos uma prevalência de 40%, 90% e 100%, respectivamente (Tabela 3).
Tabela 3: Prevalência da leucose enzoótica bovina de acordo com o tipo
de exploração do rebanho nas 18 propriedades analisadas na região Norte
Fluminense.
N° de
N° de
N° de
Prevalência
Propriedades
Propriedades
Propriedades
(%)
Positivas
Negativas
CORTE
5
2
3
40
LEITE
10
9
1
90
MISTA
3
3
0
100
28
29
6. DISCUSSÃO
Alguns pontos devem ser destacados e discutidos quando se fala de LEB,
como: a variação da prevalência de acordo com as regiões, com a idade do animal,
com o tipo de manejo e de exploração da propriedade.
Comparando a prevalência encontrada em nosso trabalho de pesquisa
(Gráfico 1), que foi de 17,30%, com os valores encontrados por outros autores em
diferentes Regiões do Brasil, podemos observar como a prevalência varia de um
Estado para outro. O valor encontrado (17,30%) foi maior que aqueles descritos por
ABREU, 1990 no Acre (9,72%); por TÁVORA et al., 1990 na Bahia (16,1%); por
ABREU et al., 1993 no Ceará (9,15%); por MELO, 1991 em Pernambuco (13,85%) e
por MORAES et al., 1996 no Rio Grande do Sul (12,00%). Em contrapartida, foi
menor que aqueles encontrados por ANDRADE E ALMEIDA, 1991 em Goiás
(35,67%); por LEITE et al., 1984 em Minas Gerais (70,87%); por MOLNÁR et al.,
1999 no Pará (49,8%); por ABREU et al., 1990 em Rondônia (23,02%); por BIRGEL
JUNIOR et al., 1995 em São Paulo (49,2%) e por ROMERO e ROWE, 1981 e
CUNHA et al., 1982 no Estado do Rio de Janeiro (53,25% e 26,94%
respectivamente) (Gráfico 3).
Essa variação da prevalência nos diferentes Estados provavelmente se dá
devido à grande diversificação no tipo de manejo e exploração adotado pelas
propriedades.
29
30
Prevalência (%)
80
70
AC – Acre
60
RG – Rio Grande do Sul
PE – Pernambuco
50
BA – Bahia
40
NF – Norte Fluminense
30
RO – Rondônia
RJ – Rio de Janeiro
20
GO – Goiás
10
SP – São Paulo
PA – Pará
0
CE
AC
RG
PE
BA
NF
RO
RJ
RJ
GO
SP
PA
MG
MG – Minas Gerais
Gráfico 5: Prevalência da leucose enzoótica bovina em diferentes
Estados do Brasil e na Região Norte Fluminense.
Observamos que a soropositividade para o VLB tende a aumentar conforme
aumenta a idade dos animais (Gráfico 2). Os valores encontrados neste trabalho
estão de acordo com os de ROMERO e ROWE, 1981, KANTEK et al., 1982,
BIRGEL et al., 1983, TÁVORA, 1990, ANDRADE E ALMEIDA, 1991, MELO,
1991, FLORES et al., 1992, ABREU, 1993, BIRGEL JUNIOR, 1995, OLIVEIRA et
al., 1997. Para uma melhor visualização desses resultados, dividimos os animais em 3
classes de faixas etárias (Tabela 2). A primeira com animais de 1-5 anos de idade, a
segunda com animais de 6-10 anos de idade e a terceira com animais de 11-15 anos
de idade. Encontramos uma prevalência de 11,00%, 19,68% e 27,77%,
respectivamente (Gráfico 3).
Esse aumento da prevalência não está relacionado a uma maior
susceptibilidade dos animais adultos ao VLB, mas provavelmente, a um maior
número de exposição sofrida pelos animais, principalmente às formas de
transmissão horizontal do vírus, tais como: vacinações, procedimento cirúrgicos,
contato entre os animais. Além disso, outra possibilidade que deve ser considerada,
em alguns casos, é uma demorada soroconversão de alguns animais.
Ao
analisarmos
a
situação
de
cada
propriedade
frente
ao
VLB,
separadamente, observamos a situação preocupante da doença na região. Das 18
propriedades analisadas, 14 (77,78%) apresentavam ao menos um animal
soropositivo (Gráfico 4).
30
31
Considerando o tipo de exploração das propriedades rurais, observamos uma
prevalência de 40% naquelas com exploração exclusiva de corte, 90% nas de
exploração exclusiva leiteira e 100% nas propriedades com exploração mista
(Tabela 3). Esses resultados revelaram um fato curioso, já que a maior prevalência
encontrada foi nas propriedades de exploração mista e não, como esperado,
naquelas exclusivamente leiteiras. Esse fato pode ser explicado pelo fato de que,
nessas propriedades, o manejo utilizado é o mesmo dos animais de exploração
leiteira, os animais para corte e para leite são vacinados e manejados todos juntos,
favorecendo, assim, a disseminação do VLB entre os animais.
A prevalência encontrada nos animais de exploração leiteira pode estar
relacionada ao manejo realizado nesse tipo de exploração, onde há um maior risco
de transmissão do VLB via colostro, vacinações, drogas injetáveis e maior contato
entre os animais. Nossos resultados estão de acordo com os resultados encontrados
na literatura, observando-se uma maior prevalência da LEB, no Brasil, em Minas
Gerais , onde a pecuária leiteira é predominante. LEITE et al., 1984, encontrou uma
prevalência de 70,87%.
31
32
7. CONCLUSÕES
•
A leucose enzoótica bovina está presente no rebanho bovino da região
Norte Fluminense – RJ;
•
O vírus da leucose bovina está presente na maioria das propriedades na
Região Norte Fluminense;
•
A leucose enzoótica bovina tem uma maior prevalência nos rebanhos de
exploração leiteira que nos de corte;
•
Com a prevalência encontrada de 17,30%, é viável a implantação de
medidas profiláticas, no intuito de controlar e/ou eliminar a leucose
enzoótica bovina na Região;
•
Para adotarmos medidas profiláticas para a leucose enzoótica bovina, é
necessário um trabalho de extensão, conscientizando-se os produtores
que,
apesar
da
leucose
enzoótica
bovina
ser
uma
doença
predominantemente subclínica, causa grandes perdas econômicas;
•
A identificação de animais soropositivos é o primeiro passo para a
introdução de medidas de controle da leucose enzoótica bovina.
Entretanto, não existe disponibilidade de kits de diagnóstico sorológico no
Brasil, o que dificulta muito a introdução de medidas profiláticas. Dessa
forma, fica clara a necessidade da produção de kits nacionais ou da
liberação da importação de kits comerciais já existentes;
•
É extremamente importante um levantamento geral no Estado do Rio de
Janeiro, já que os resultados conhecidos são parciais e estão defasados
32
33
(1981 e 1982). Avaliando-se, assim, a situação da doença no Estado,
tornar-se-ia possível a adoção de medidas profiláticas mais adequadas,
visando ao controle e à eliminação da leucose enzoótica bovina.
33
34
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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SIMARD, C., RICHARDSON, S., DIXON, P., KOMAL, J. (2000b) Agar gel
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TÁVORA, J.P.F. (1990) Prevalência da Infecção pelo Vírus da Leucose Bovina em
Rebanhos Leiteiros Criados na Região do Pólo Itabuna, Estado da Bahia. Tese
(Mestrado em Patologia Bovina) - São Paulo-SP, Faculdade de Medicina
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VAN DER LAAN, C.W., VIDOR, T., BRAGA, F.M., HALFEN, D., HÜBNER, DE O.
(1999) Leucose enzoótica bovina em bovinos produtores de leite importados do
Uruguay. Pesquisa Agropecuária Gaúcha, 5(1): 139-141.
40
41
9. APÊNDICES
9.1. Apêndice A - Ficha da propriedade
Data:..................................................N.º da Fazenda:...................................................
Propriedade:...................................................................................................................
Localidade:.....................................................................................................................
Gado de corte ( )
Gado de leite ( ) Quantidade de leite/dia:..........Separação do bezerro (idade):..........
Tipo de manejo
Criação extensiva ( )
Criação semi-extensiva( )
Alimentação Ração ( )
Pasto ( )
Outros ( )
Água.....................................................................................................................
Inseminação artificial ( )
Monta natural ( )
Vacina sim ( ) não ( )
Quais
Tratamento contra endoparasitas sim ( ) não ( )
Tratamento contra ectoparasitas sim ( ) não ( )
Compra animais adultos ( ) ou pequenos ( )
Procedência dos animais:..............................................................................................
Quarentena: sim ( ) não ( )
Quantos animais tem na propriedade:...........................................................................
Outras espécies: sim ( ) não ( )
Quais:.............................................................................................................................
Comercialização: matadouro ( ) vende para outros proprietários ( )
Observações:.................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
Resultados:.....................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
9.2. Apêndice B - Ficha dos animais
Data:............................................................N.º da Ficha:..............................................
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Propriedade:...................................................................................................................
Localidade:.....................................................................................................................
Identificação do animal:..................................................................................................
Raça:......................................Cor:.....................................Idade:..................................
Sexo: ( )macho ( )fêmea
Gado de corte ( )
Gado de leite ( ) Quantidade de leite/dia:............Separação do bezerro (idade):.......
Estado geral do animal:..................................................................................................
Animal vacinado: sim ( ) não ( ) Quais vacinas:.........................................................
Tratamento contra endoparasitas sim ( ) não ( )
Tratamento contra ectoparasitas sim ( ) não ( )
Obs.: MS-mestiça, H-holandesa, M-meses, A-anos, P-preta, B-branca, C-castanha, R-raiva, Brbrucelose, Ma-manqueira
9.3. Apêndice C – Tampão de borato
NaOH (hidróxido de sódio) ...................................2g
H3BO3 (ácido bórico)............................................9g
H2O (água miliq) ..........................................1000mL
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