Aline Debrassi

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA PARA APLICAÇÃO
COMO SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE INDOMETACINA
ALINE DEBRASSI
Itajaí - 2011
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ALINE DEBRASSI
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA PARA APLICAÇÃO
COMO SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE INDOMETACINA
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador:
Rodrigues
Itajaí, Julho de 2011
Prof.
Dr.
Clóvis
Antonio
D353s
Debrassi, Aline, 1987Síntese e caracterização de nanopartículas magnéticas de derivados
da quitosana para aplicação como sistemas de liberação de indometacina
[manuscrito] / Aline Debrassi . – Itajaí, 2011.
137 f. : il. (tab.).
Inclui lista de figuras, tabelas e abreviaturas.
Referências: p. 122-137.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
“Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues.”
1. Indometacina 2. Nanopartículas. 3. Quitosana. II. Título.
CDU: 615.03
Bibliotecária Eugenia Berlim 14/963
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA PARA APLICAÇÃO
COMO SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE INDOMETACINA
Aline Debrassi
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Orientador
__________________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Dr. Clóvis Antonio Rodrigues (UNIVALI)
Presidente
______________________________________
Dr. Valfredo Tadeu de Fávere (UFSC)
Membro
______________________________________
Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva (UNIVALI)
Membro
Itajaí (SC), 05, julho de 2011
Dedico esta dissertação àqueles que sempre
apoiaram minhas decisões profissionais.
“O riso é eterno,
A imaginação não tem idade
E os sonhos são para sempre”
(Walt Disney)
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS DE DERIVADOS DA QUITOSANA PARA APLICAÇÃO
COMO SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE INDOMETACINA
Aline Debrassi
Julho/2011
Orientador: Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias bioativas.
Número de Páginas: 136.
As partículas magnéticas têm sido objeto de estudo em diversas áreas, possuindo diferentes
aplicações, dentre elas na hipertermia induzida magneticamente e como sistemas de
liberação vetorizada de fármacos. Os óxidos de ferro, principalmente a magnetita (Fe3O4) e
a maguemita (!-Fe2O3), são os principais materiais magnéticos utilizados para aplicações
biomédicas devido à sua biocompatibilidade e estabilidade, além de apresentarem o
comportamento desejável de superparamagnetismo. A quitosana é um bom candidato para
o preparo de partículas magnéticas por suas características biocompatíveis. Dessa forma, o
objetivo do trabalho foi sintetizar partículas magnéticas de óxidos de ferro e derivados da
quitosana, caracterizá-las e utilizá-las para a vetorização de fármacos, empregando a
indometacina como modelo de fármaco hidrofóbico. As partículas foram preparadas com os
polímeros O-carboximetilquitosana e O-carboximetilquitosana-N-benzil através de duas
metodologias: formação in situ e incorporação. As nanopartículas foram caracterizadas
através das técnicas de determinação do teor de ferro, espectroscopia no infravermelho,
termogravimetria, calorimetria exploratória diferencial, microscopia eletrônica de varredura,
caracterização magnética e espectroscopia Mössbauer. Verificou-se que a metodologia in
situ produz, em geral, partículas menores, menos agregadas e com características de
superparamagnetismo mais intensas que as obtidas por incorporação. A indometacina foi
incorporada nas partículas magnéticas por duas metodologias: evaporação do solvente e
incorporação in situ, e as partículas contendo indometacina foram caracterizadas pelas
mesmas técnicas utilizadas para as nanopartículas sem o fármaco, além de microscopia
eletrônica de transmissão e da determinação do teor e da eficiência de incorporação da
indometacina. Verificou-se a manutenção das propriedades magnéticas das nanopartículas
após a incorporação do fármaco. As partículas apresentaram eficiência de incorporação
entre 33,7 e 86,2% para a metodologia de evaporação do solvente e entre 28,3 e 30,2%
para a incorporação in situ. Foi realizada a liberação in vitro da indometacina em fluido
corporal simulado pH 7,4 a 37 °C, observando-se um perfil semelhante para todas as
partículas, com uma liberação inicial rápida da indometacina seguida de posterior liberação
lenta e manutenção da quantidade de fármaco liberado. As partículas com a indometacina
incorporada por evaporação do solvente apresentaram entre 55 e 85% do fármaco liberado
em cinco horas, enquanto que as obtidas por incorporação in situ liberaram entre 65 e 80%.
O modelo matemático mais adequado para explicar a liberação da indometacina da maioria
das nanopartículas magnéticas foi o de Korsmeyer-Peppas, indicando mecanismo de
difusão Fickiana. Considerando a facilidade do preparo, o comportamento de
superparamagnetismo mais pronunciado, a eficiência de incorporação do fármaco e sua
liberação, as nanopartículas preparadas com a O-carboximetilquitosana pela metodologia de
formação in situ seguida de incorporação da indometacina por evaporação do solvente foi a
mais apropriada para futuros testes com fármacos antitumorais.
Palavras-chave: Indometacina. Magnetismo. Nanopartículas. Quitosana.
SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF MAGNETIC
NANOPARTICLES PREPARED WITH CHITOSAN DERIVATIVES FOR
TARGETED INDOMETHACIN DELIVERY
Aline Debrassi
July/2011
Advisor: Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.
Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances
Number of Pages: 136.
Magnetic nanoparticles have been applied for many areas, including for magnetically
induced hyperthermia and drug-targeted delivery. The iron oxides, especially magnetite
(Fe3O4) and maghemite (!-Fe2O3), are the main magnetic materials employed for biomedical
applications due to their biocompatibility and stability, besides the desirable
superparamagnetic behavior. Chitosan is a good candidate for preparing magnetic
nanoparticles with iron oxides due to the biocompatible characteristics. Therefore, the aim of
this work was synthesize magnetic nanoparticles with iron oxides and chitosan derivatives;
characterize them and applied the nanoparticles to magnetic drug targeting. Indomethacin
was chosen as model drug due to its hydrophobic characteristic. The nanoparticles were
prepared with O-carboxymethylchitosan and O-carboxymethylchitosan-N-benzyl through two
methods: in situ co-precipitation and incorporation. The nanoparticles were characterized by
determination of the iron content, infrared spectroscopy, thermogravimetric analysis,
differential scanning calorimetry, scanning electron microscopy, magnetic measurements,
and Mössbauer spectroscopy. The characterization techniques showed that the in situ
method yields, in general, smaller and less aggregated particles, with more intense
superparamagnetic behavior than the particles prepared by incorporation technique.
Indomethacin was incorporated on the particles through two methodologies: solvent
evaporation and in situ incorporation. The obtained nanoparticles were characterized by the
same techniques used to characterize the nanoparticles before the drug incorporation and,
additionally, by transmission electron microscopy and determination of the drug loading
content and efficiency. It was observed the maintenance of the magnetic properties of the
nanoparticles after the drug incorporation. The particles showed incorporation efficiency
between 33.7 and 86.2% for solvent evaporation method and between 28.3 and 30.2% for in
situ incorporation. The in vitro drug release study was performed in simulated body fluid pH
7.4 at 37 °C. All the nanoparticles presented similar behavior, with an initial fast release of
indomethacin followed by a slower release and maintenance of the percent released drug.
The materials obtained through solvent evaporation released between 55 and 85% of the
drug in five hours, whereas the materials obtained through in situ incorporation released
between 65 and 80%. Korsmeyer-Peppas was the best-fitted mathematical model for
explaining the drug release profile, indicating a Fickian diffusion mechanism. Considering the
facility of synthesis, the more pronounced superparamagnetism behavior, the drug loading
efficiency and its release, the nanoparticles prepared with O-carboxymethylchitosan by in
situ methodology followed by indomethacin incorporation through solvent evaporation
method were the best material for further tests with antitumor agents.
Keywords: Chitosan. Indomethacin. Magnetism. Nanoparticles.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Representação esquemática de nanopartículas magnéticas
multifuncionais com revestimento polimérico e possíveis
modificadores superficiais. Fonte: VEISEH; GUNN; ZHANG,
2010............................................................................................. 22
Figura 02
Curva de histerese magnética. Fonte: ALPHAMAG,
2010............................................................................................. 24
Figura 03
Representação esquemática da vetorização magnética de
fármacos. Fonte: CORCHERO; VILLAVERDE, 2009.................. 27
Figura 04
Esquema do sistema de captura magnética in vitro. Adaptado
de Xu et al. (2005)........................................................................ 28
Figura 05
Esquema do sistema de captura magnética in vivo. Adaptado
de Xu et al. (2005)........................................................................ 29
Figura 06
Estrutura do principal monômero da OCMQTS...........................
Figura 07
Estrutura do principal monômero da OCMQTS-Bz...................... 33
Figura 08
Estrutura química da indometacina.............................................. 39
Figura 09
Esquema da síntese da OCMQTS a partir da quitosana............. 50
Figura 10
Esquema da síntese do derivado OCMQTS-Bz a partir da
OCMQTS..................................................................................... 51
Figura 11
Mecanismo de reação da síntese da imina para a obtenção do
derivado OCMQTS-Bz................................................................. 52
Figura 12
Mecanismo de redução da imina utilizando o NaBH4 como
agente redutor.............................................................................. 52
Figura 13
Curva da titulação condutimétrica da OCMQTS. Massa de
amostra: 50 mg, temperatura: 25 ºC, titulante: NaOH 0,100
mol L-1.......................................................................................... 54
Figura 14
Espectros no infravermelho da OCMQTS na forma ácida e do
derivado OCMQTS-Bz................................................................. 55
Figura 15
Espectro de RMN 1H da OCMQTS em D2O/CD3COOD a
temperatura ambiente.................................................................. 57
Figura 16
Espectro de RMN 1H do derivado OCMQTS-Bz em
D2O/CD3COOD a temperatura ambiente..................................... 58
Figura 17
Partículas magnéticas inorgânicas dispersas em água (A) na
ausência e (B) na presença de um campo magnético externo.... 60
Figura 18
Difratograma de raios-X do material magnético inorgânico
(Fe3O4/!-Fe2O3)............................................................................ 63
Figura 19
Espectro no infravermelho do material magnético inorgânico
(Fe3O4/!-Fe2O3)............................................................................ 64
33
Figura 20
Curvas (verde) TG e (azul) DSC do material magnético
inorgânico (Fe3O4/!-Fe2O3).......................................................... 66
Figura 21
Micrografia eletrônica de varredura do material magnético
Fe3O4/!-Fe2O3 em aumento de 500x........................................... 67
Figura 22
Curvas de magnetização de dois lotes de Fe3O4/!-Fe2O3 à
temperatura ambiente. No detalhe, a expansão da parte central
da curva....................................................................................... 69
Figura 23
Partículas magnéticas inorgânicas dispersas em água na (A)
ausência e (B) na presença de um campo magnético externo
em aumento de 40x..................................................................... 70
Figura 24
Espectros Mössbauer do material Fe3O4/!-Fe2O3 a (A) 77 K e
(B) 300 K. As linhas coloridas representam as diferentes
espécies presentes no material................................................... 72
Figura 25
Espectros no infravermelho das partículas magnéticas
contendo polímero: (A) OC in situ, (B) OC-Bz in situ, (C) OC inc
1:1, (D) OC inc 2:1, (E) OC-Bz inc 1:1 e (F) OC-Bz inc 2:1......... 76
Figura 26
Curvas TG das partículas magnéticas: (verde) OC in situ,
(vermelho) OC-Bz in situ, (azul escuro) OC inc 1:1, (ocre) OC
inc 2:1, (roxo) OC-Bz inc 1:1 e (azul claro) OC-Bz inc 2:1........... 77
Figura 27
Curvas DSC das partículas magnéticas: (verde) OC in situ,
(vermelho) OC-Bz in situ, (azul escuro) OC inc 1:1, (ocre) OC
inc 2:1, (roxo) OC-Bz inc 1:1 e (azul claro) OC-Bz inc 2:1........... 79
Figura 28
Micrografias eletrônicas de varredura das partículas (A) OC in
situ e (B) OC-Bz in situ em aumento de 500x.............................. 80
Figura 29
Micrografias eletrônicas de varredura das partículas (A) OC inc
1:1, (B) OC inc 2:1, (C) OC-Bz inc 1:1 e (D) OC-Bz inc 2:1 em
aumento de 2000x........................................................................ 81
Figura 30
Curvas de magnetização dos materiais Fe3O4/!-Fe2O3, OC in
situ e OC-Bz in situ à temperatura ambiente. No detalhe, a
expansão da parte central da curva............................................. 82
Figura 31
Espectros Mössbauer da partícula OC in situ a (A) 77 K e (B)
300 K. As linhas coloridas representam as diferentes espécies
presentes no material................................................................... 86
Figura 32
Espectros Mössbauer da partícula OC inc 1:1 a (A) 77 K e (B)
300 K. As linhas coloridas representam as diferentes espécies
presentes no material................................................................... 87
Figura 33
Espectros no infravermelho dos materiais (A) Indometacina, (B)
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev, (C) OC in situ/INDev, (D) OC-Bz in
situ/INDev, (E) OC inc 1:1/INDev, (F) OC inc 2:1/INDev, (G)
OC-Bz inc 1:1/INDev e (H) OC-Bz inc 2:1/INDev......................... 94
Figura 34
Espectros no infravermelho dos materiais (A) OC 1:1/INDis, (B)
OC-Bz 1:1/INDis e (C) OC-Bz 2:1/INDis...................................... 95
Figura 35
Curvas TG da indometacina e das partículas magnéticas
contendo o fármaco incorporado pela metodologia de
evaporação do solvente: (verde) Indometacina, (vermelho)
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev, (azul escuro) OC in situ/INDev, (ocre)
OC-Bz in situ/INDev, (roxo) OC inc 1:1/INDev, (azul claro) OC
inc 2:1/INDev, (bordô) OC-Bz inc 1:1/INDev e (preto) OC-Bz inc
2:1/INDev...................................................................................... 96
Figura 36
Curvas DSC da indometacina e das partículas magnéticas
contendo o fármaco incorporado através da metodologia de
evaporação do solvente: (verde) Indometacina, (vermelho)
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev, (azul escuro) OC in situ/INDev, (ocre)
OC-Bz in situ/INDev, (roxo) OC inc 1:1/INDev, (azul claro) OC
inc 2:1/INDev, (bordô) OC-Bz inc 1:1/INDev e (preto) OC-Bz inc
2:1/INDev. No detalhe, a curva DSC da mistura física de
indometacina e Fe3O4/!-Fe2O3 (5,0%)......................................... 97
Figura 37
Curvas TG da indometacina e das partículas magnéticas
contendo o fármaco incorporado através da metodologia de
incorporação in situ: (verde) Indometacina, (vermelho) OC
1:1/INDis, (azul) OC-Bz 1:1/INDis e (ocre) OC-Bz 2:1/INDis....... 98
Figura 38
Curvas DSC da indometacina e das partículas magnéticas
contendo o fármaco incorporado através da metodologia de
incorporação in situ: (verde) Indometacina, (vermelho) OC
1:1/INDis, (azul) OC-Bz 1:1/INDis e (ocre) OC-Bz 2:1/INDis. No
detalhe, a curva DSC da mistura física de indometacina e
Fe3O4/!-Fe2O3 (5,0%)................................................................... 98
Figura 39
Micrografia eletrônica de varredura do material OC 1:1/INDis
em aumento de 3000x.................................................................. 99
Figura 40
Micrografias eletrônicas de varredura dos materiais (A) OC-Bz
1:1/INDis e (B) OC-Bz 2:1/INDis em aumento de 3000x.............. 100
Figura 41
Micrografias eletrônicas de transmissão dos materiais (A) OCBz in situ/INDev e (B) OC-Bz inc 2:1/INDev. Os detalhes
apresentam micrografias das partículas em aumento maior....... 101
Figura 42
Distribuição do tamanho de partícula das partículas (A) OC-Bz
in situ/INDev e (B) OC-Bz inc 2:1/INDev determinada a partir
das micrografias de TEM.............................................................. 102
Figura 43
Curvas de magnetização das partículas magnéticas Fe3O4/!Fe2O3 e OC-Bz inc 2:1 e dos materiais contendo indometacina
OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz 2:1/INDis. A escala do eixo y à
direita corresponde à partícula Fe3O4/!-Fe2O3 e à esquerda é
referente aos outros materiais...................................................... 103
Figura 44
Espectros Mössbauer do material OC-Bz in situ/INDev a (A) 77
K e (B) 300 K. As linhas coloridas representam as diferentes
espécies presentes no material.................................................... 105
Figura 45
Espectros Mössbauer do material OC-Bz inc 2:1/INDev a (A) 77
K e (B) 300 K. As linhas coloridas representam as diferentes
espécies presentes no material.................................................... 106
Figura 46
Espectros Mössbauer do material OC-Bz 2:1/INDis a (A) 77 K e
(B) 300 K. As linhas coloridas representam as diferentes
espécies presentes no material.................................................... 107
Figura 47
Perfis de dissolução e liberação da indometacina em FCS pH
7,4 a 37 °C incorporada nas partículas magnéticas pela
metodologia de evaporação do solvente. As linhas representam
apenas a tendência do processo e as barras de erro
representam o desvio padrão para a duplicata............................ 110
Figura 48
Perfis de liberação da indometacina em FCS pH 7,4 a 37 °C
presente nas partículas magnéticas obtidas pela metodologia
de incorporação in situ do fármaco. As linhas representam
apenas a tendência do processo e as barras de erro
representam o desvio padrão para a duplicata............................ 112
Figura 49
Modelos matemáticos aplicados para a liberação da
indometacina em FCS pH 7,4 a 37 °C das partículas Fe3O4/!Fe2O3/INDev, OC-Bz inc 1:1/INDev, OC-Bz inc 2:1/INDev e
OC-Bz in situ/INDev. (A) Ordem zero, (B) Primeira ordem, (C)
Higuchi, (D) Hixson-Crowell e (E) Korsmeyer-Peppas não
linear............................................................................................. 116
LISTA DE TABELAS
Tabela 01
Parâmetros hiperfinos de espectroscopia Mössbauer do
material Fe3O4/!-Fe2O3 a 77 e 300 K........................................... 73
Tabela 02
Partículas magnéticas sintetizadas de acordo com a
metodologia e os polímeros empregados.................................... 74
Tabela 03
Teor de ferro nas partículas magnéticas utilizando o método
espectrofotométrico da 1,10-fenantrolina..................................... 75
Tabela 04
Perda percentual de massa das partículas magnéticas através
de TG........................................................................................... 78
Tabela 05
Parâmetros magnéticos obtidos a partir da curva de
magnetização das partículas à temperatura ambiente................ 83
Tabela 06
Parâmetros hiperfinos de espectroscopia Mössbauer dos
materiais OC in situ e OC inc 1:1 a 77 e 300 K........................... 88
Tabela 07
Partículas magnéticas contendo indometacina de acordo com a
metodologia de incorporação do fármaco e proporção
polímero:material inorgânico........................................................ 89
Tabela 08
Teor e eficiência de incorporação do fármaco nas partículas
magnéticas obtidas pela incorporação da indometacina através
da metodologia de evaporação do solvente................................ 90
Tabela 09
Teor e eficiência de incorporação do fármaco nas partículas
magnéticas obtidas através da incorporação in situ da
indometacina................................................................................ 92
Tabela 10
Parâmetros magnéticos obtidos a partir da curva de
magnetização da OC-Bz inc 2:1 e dos materiais contendo
indometacina OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz 2:1/INDis à
temperatura ambiente.................................................................. 103
Tabela 11
Parâmetros hiperfinos de espectroscopia Mössbauer dos
materiais OC-Bz in situ/INDev, OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz
2:1/INDis a 77 e 300 K................................................................. 108
Tabela 12
Constantes de liberação e coeficientes de correlação das
equações matemáticas aplicadas na liberação da indometacina
contida nas partículas magnéticas. Destacados em negrito
estão os modelos que melhor se adequaram para cada
material......................................................................................... 117
LISTA DE ABREVIATURAS
AINEs: Anti-inflamatórios não esteroidais
b: Liberação inicial abrupta do modelo de Korsmeyer-Peppas
Bhf: Campo magnético hiperfino
COX: Ciclo-oxigenase
DSC: Calorimetria exploratória diferencial
emu: unidade eletromagnética
FCS: Fluido corporal simulado
Fe3O4/!-Fe2O3: Material magnético inorgânico composto por uma mistura de
magnetita e maguemita
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev: Material magnético inorgânico composto por uma mistura de
magnetita e maguemita com a indometacina incorporada pela metodologia de
evaporação do solvente
K0: Constante de liberação de ordem zero
K1: Constante de liberação de primeira ordem
KH: Constante de liberação de Higuchi
KHC: Constante de Hixson-Crowell
l: Tempo de latência
MEV: Microscopia eletrônica de varredura
mPEG-PCL: Metiléter de polietilenoglicol-poli(!-caprolactona)
n: Constante indicativo de mecanismo do modelo de Korsmeyer-Peppas
OCMQTS: O-carboximetilquitosana
OCMQTS-Bz: O-carboximetilquitosana-N-benzil
OC in situ: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana pela
metodologia in situ
OC in situ/INDev: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana
pela metodologia in situ e com a indometacina incorporada pela metodologia de
evaporação do solvente
OC inc 1:1: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana pela
metodologia de incorporação na proporção 1:1 (polímero:material magnético
inorgânico)
OC inc 1:1/INDev: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana
pela metodologia de incorporação na proporção 1:1 (polímero:material magnético
inorgânico) e com a indometacina incorporada pela metodologia de evaporação do
solvente
OC inc 2:1: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana pela
metodologia de incorporação na proporção 2:1 (polímero:material magnético
inorgânico)
OC inc 2:1/INDev: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana
pela metodologia de incorporação na proporção 2:1 (polímero:material magnético
inorgânico) e com a indometacina incorporada pela metodologia de evaporação do
solvente
OC 1:1/INDis: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana e
com o fármaco incorporado pela metodologia de incorporação in situ na proporção
1:1 (polímero:material magnético inorgânico) em única etapa
OC-Bz in situ: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana-Nbenzil pela metodologia in situ
OC-Bz
in
situ/INDev:
Partículas
magnéticas
preparadas
com
O-
carboximetilquitosana-N-benzil pela metodologia in situ e com a indometacina
incorporada pela metodologia de evaporação do solvente
OC-Bz inc 1:1: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana-Nbenzil pela metodologia de incorporação na proporção 1:1 (polímero:material
magnético inorgânico)
OC-Bz
inc
1:1/INDev:
Partículas
magnéticas
preparadas
com
O-
carboximetilquitosana-N-benzil pela metodologia de incorporação na proporção 1:1
(polímero:material magnético inorgânico) e com a indometacina incorporada pela
metodologia de evaporação do solvente
OC-Bz inc 2:1: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosana-Nbenzil pela metodologia de incorporação na proporção 2:1 (polímero:material
magnético inorgânico)
OC-Bz
inc
2:1/INDev:
Partículas
magnéticas
preparadas
com
O-
carboximetilquitosana-N-benzil pela metodologia de incorporação na proporção 2:1
(polímero:material magnético inorgânico) e com a indometacina incorporada pela
metodologia de evaporação do solvente
OC-Bz 1:1/INDis: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosanaN-benzil e com o fármaco incorporado pela metodologia de incorporação in situ na
proporção 1:1 (polímero:material magnético inorgânico) em única etapa
OC-Bz 2:1/INDis: Partículas magnéticas preparadas com O-carboximetilquitosanaN-benzil e com o fármaco incorporado pela metodologia de incorporação in situ na
proporção 2:1 (polímero:material magnético inorgânico) em única etapa
PEG: Polietilenoglicol
PLGA: Copolímero de ácido láctico e glicólico
Q0: Quantidade de fármaco liberada no tempo zero
Qinf: Quantidade de fármaco liberada no tempo infinito
Qt: Quantidade de fármaco liberada no tempo t
TEM: Microscopia eletrônica de transmissão
TG: Termogravimetria
RMN 1H: Ressonância magnética nuclear de 1H
XRD: Difração de raios-X
": Deslocamento isomérico
#: Desdobramento quadrupolar
!: Constante do modelo de Korsmeyer-Peppas
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 18
2 OBJETIVOS..................................................................................................... 20
2.1 Objetivo Geral............................................................................................... 20
2.2 Objetivos Específicos................................................................................. 20
3 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................... 21
3.1 Nanopartículas magnéticas....................................................................... 21
3.2 Partículas magnéticas na liberação de fármacos................................ 26
3.3 Partículas magnéticas de quitosana e derivados................................. 32
3.4 Indometacina................................................................................................ 39
4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 41
4.1 Síntese dos polímeros................................................................................ 41
4.1.1 Síntese da OCMQTS...................................................................................
41
4.1.2 Síntese da OCMQTS-Bz............................................................................... 41
4.2 Caracterização da OCMQTS e OCMQTS-Bz........................................... 42
4.2.1 Grau de carboximetilação........................................................................... 42
4.2.2 Ressonância magnética nuclear de 1H...................................................... 42
4.3 Preparação das partículas magnéticas.................................................. 43
4.3.1 Preparação do material magnético inorgânico (Fe3O4/! -Fe2O3).............. 43
4.3.2 Metodologia de formação das partículas magnéticas in situ.................. 43
4.3.3 Metodologia de obtenção das nanopartículas magnéticas por
incorporação......................................................................................................... 44
4.4 Incorporação da indometacina nas partículas magnéticas............... 44
4.4.1 Metodologia de evaporação do solvente................................................... 44
4.4.2 Metodologia de incorporação in situ do fármaco por reticulação do
polímero................................................................................................................. 44
4.5 Caracterização dos materiais preparados............................................. 45
4.5.1 Difração de raios-X (XRD)........................................................................... 45
4.5.2 Teor de ferro................................................................................................. 45
4.5.3 Espectroscopia no infravermelho.............................................................. 46
4.5.4 Análise térmica............................................................................................. 46
4.5.5 Análise morfológica..................................................................................... 46
4.5.6 Comportamento magnético........................................................................ 47
4.5.7 Espectroscopia Mössbauer........................................................................ 47
4.5.8 Teor e eficiência de incorporação.............................................................. 47
4.6 Liberação in vitro......................................................................................... 48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 50
5.1 Síntese dos polímeros................................................................................ 50
5.2 Caracterização da OCMQTS e OCMQTS-Bz........................................... 53
5.2.1 Grau de carboximetilação........................................................................... 53
5.2.2 Espectroscopia no infravermelho.............................................................. 54
5.2.3 Ressonância magnética nuclear de 1H...................................................... 56
5.3 Preparação e caracterização do material magnético inorgânico..... 59
5.3.1 Síntese do material magnético inorgânico................................................ 59
5.3.2 Difração de raios-X (XRD)........................................................................... 62
5.3.3 Espectroscopia no infravermelho.............................................................. 64
5.3.4 Análise térmica............................................................................................. 65
5.3.5 Análise morfológica..................................................................................... 66
5.3.6 Comportamento magnético........................................................................ 67
5.3.7 Espectroscopia Mössbauer........................................................................ 70
5.4 Preparação das partículas magnéticas contendo polímero.............. 73
5.5 Caracterização das partículas magnéticas contendo polímero........ 75
5.5.1 Teor de ferro................................................................................................. 75
5.5.2 Espectroscopia no infravermelho.............................................................. 76
5.5.3 Análise térmica............................................................................................. 77
5.5.4 Análise morfológica..................................................................................... 79
5.5.5 Comportamento magnético........................................................................ 81
5.5.6 Espectroscopia Mössbauer........................................................................ 85
5.6 Incorporação da indometacina e caracterização das partículas
contendo o fármaco........................................................................................... 89
5.6.1 Teor e eficiência de incorporação.............................................................. 89
5.6.2 Espectroscopia no infravermelho.............................................................. 93
5.6.3 Análise térmica............................................................................................. 96
5.6.4 Análise morfológica..................................................................................... 99
5.6.5 Comportamento magnético........................................................................ 102
5.6.6 Espectroscopia Mössbauer........................................................................ 104
5.7 Liberação in vitro......................................................................................... 109
5.8 Modelos cinéticos de liberação................................................................ 113
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS......................................................... 120
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 122
APÊNDICE A – AGRADECIMENTOS E PRODUÇÃO CIENTÍFICA... 134
18
1 INTRODUÇÃO
Nanopartículas magnéticas são estruturas amorfas ou semicristalinas com ao
menos uma dimensão entre 10 e 100 nm. Algumas de suas características, como
uniformidade de tamanho, área superficial, cinética de adsorção, biocompatibilidade
e superparamagnetismo podem ser alteradas de acordo com o processo de síntese,
permitindo
que
elas
sejam
preparadas
conforme
a
aplicação
desejada
(CORCHERO; VILLAVERDE, 2009).
As partículas magnéticas dispersíveis em água têm sido utilizadas
amplamente em diferentes processos biotecnológicos, como agentes de contraste
em ressonância magnética de imagem (TSAI et al., 2010), na separação magnética
para purificação de proteínas (CHIANG; CHEN; CHANG, 2008) e células (MAXWELL
et al., 2008), no tratamento de tumores através de técnicas de hipertermia induzida
magneticamente (ZHAO et al., 2009; PURUSHOTHAM; RAMANUJAN, 2010) e para
a vetorização de fármacos (ZÁVI"OVÁ et al., 2009; HUA et al., 2010; LIANG et al.,
2010).
Muitos materiais que apresentam importante comportamento magnético
contêm componentes tóxicos, como cobalto e níquel, sendo susceptíveis à oxidação
e consequentemente limitando suas aplicações biomédicas. No entanto, a magnetita
(Fe3O4) e a maguemita (!-Fe2O3) são adequadas para aplicações in vivo devido à
sua alta biocompatibilidade, não causando estresse oxidativo nem alterações em
enzimas hepáticas em modelos animais (JAIN et al., 2008; CORCHERO;
VILLAVERDE, 2009).
Os estudos de partículas magnéticas para a liberação de fármacos via
intravenosa têm procurado desenvolver nanopartículas biocompatíveis com células e
tecidos, com uma alta capacidade de encapsulação do ativo, estabilidade em
soluções aquosas, perfis de liberação adequados para a aplicação desejada e cujas
propriedades magnéticas se mantenham após o revestimento polimérico (ZHANG;
SRIVASTAVA; MISRA, 2007; WILSON et al., 2009; ZÁVI"OVÁ et al., 2009). Além
disso, para a vetorização magnética de fármacos é favorável que as partículas não
excedam 100 nm incluindo o revestimento e apresentem características hidrofílicas a
19
fim de evitar uma rápida remoção pelo sistema reticuloendotelial, permanecendo
mais tempo na circulação sanguínea (SHUBAYEV; PISANIC II; JIN, 2009).
A quitosana e seus derivados têm se mostrado bons candidatos para o
preparo de partículas magnéticas por suas características biocompatíveis e
biodegradáveis, possibilitando a aplicação dessas partículas na área farmacêutica,
médica, biotecnológica, entre outras (WILSON et al., 2009; KIM et al., 2009). A
utilização de polímeros anfifílicos para o preparo de nanopartículas magnéticas
empregadas na vetorização de fármacos hidrofóbicos é importante para que se
obtenha uma boa eficiência de incorporação decorrente da interação entre os grupos
hidrofóbicos do polímero e do fármaco, enquanto a porção hidrofílica permite a
dispersibilidade das partículas em fluidos aquosos, evitando a agregação das
mesmas.
Em trabalhos recentes desenvolvidos pelos pesquisadores do Núcleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí
(UNIVALI), o derivado anfifílico O-carboximetilquitosana-N-benzil não apresentou
citotoxicidade quando testado em células L929. Portanto, este polímero pode ser
uma opção adequada para o preparo de nanopartículas magnéticas para aplicações
biomédicas (ROSA, 2008).
Dessa forma, o trabalho tem como objetivo a obtenção e caracterização de
nanopartículas magnéticas de óxidos de ferro e derivados da quitosana para
aplicação na hipertermia induzida magneticamente e na vetorização de fármacos. As
partículas foram obtidas através de metodologias de formação dos óxidos de ferro in
situ com os polímeros e por incorporação posterior do polímero ao material
magnético inorgânico. A indometacina foi empregada como fármaco modelo devido à
sua característica hidrofóbica, comum à maioria dos agentes antitumorais, além de
ter demonstrado atividade quimiopreventiva contra células tumorais (OU et al., 2007;
QIN et al., 2009; ORIDO et al., 2010).
20
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Sintetizar e caracterizar nanopartículas magnéticas de óxidos de ferro e
derivados da quitosana para aplicação no tratamento de células tumorais por
hipertermia induzida magneticamente e na liberação vetorizada de fármacos.
2.2 Objetivos Específicos
- Sintetizar os derivados da quitosana O-carboximetilquitosana (OCMQTS) e
O-carboximetilquitosana-N-benzil (OCMQTS-Bz) e caracterizar os polímeros através
de titulação condutimétrica, espectroscopia no infravermelho e ressonância
magnética nuclear de 1H (RMN 1H).
- Sintetizar nanopartículas magnéticas de magnetita (Fe3O4) e maguemita (!Fe2O3) com os polímeros OCMQTS e OCMQTS-Bz através das metodologias de
formação das partículas in situ e por incorporação.
- Incorporar a indometacina nas partículas magnéticas através das
metodologias de evaporação do solvente e incorporação in situ do fármaco.
- Caracterizar os materiais obtidos através de quantificação de ferro, difração
de raios-X (XRD), espectroscopia no infravermelho, termogravimetria (TG),
calorimetria exploratória diferencial (DSC), microscopia eletrônica de varredura
(MEV), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), comportamento magnético e
espectroscopia Mössbauer.
- Determinar o perfil de liberação in vitro da indometacina a partir das
nanopartículas magnéticas em fluido corporal simulado (FCS).
- Aplicar modelos matemáticos a partir dos dados de liberação in vitro para
determinação do mecanismo de liberação da indometacina a partir das
nanopartículas magnéticas.
21
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Nanopartículas magnéticas
As nanopartículas magnéticas (partículas magnéticas com ao menos uma
dimensão entre 10 e 100 nm) têm sido objeto de diversos estudos para diferentes
aplicações tecnológicas, inclusive na área biomédica, podendo ter determinadas
características como tamanho, área superficial, biocompatibilidade e propriedades
magnéticas moduladas de forma que sejam adequadas para as aplicações a que se
destinam. Suas propriedades magnéticas permitem o controle da sua posição em
um determinado meio através do posicionamento de um campo magnético externo,
possibilitando diferentes aplicações, como na terapia antitumoral, através das
técnicas de hipertermia induzida magneticamente e liberação vetorizada de agentes
terapêuticos, em que há um acúmulo do material magnético numa determinada
região (CORCHERO; VILLAVERDE, 2009; BHARALI; MOUSA, 2010).
A Figura 01 representa esquematicamente uma nanopartícula magnética
multifuncional, com o núcleo magnético revestido por cadeias poliméricas, contendo
possíveis agentes de vetorização (peptídeos), de imagem (fluoróforos, componentes
radioativos e o próprio núcleo magnético) e terapêuticos (genes, substâncias
radioativas e fármacos).
22
Figura 01: Representação esquemática de nanopartículas magnéticas multifuncionais com
revestimento polimérico e possíveis modificadores superficiais. Fonte: VEISEH;
GUNN; ZHANG, 2010.
Em relação à classificação dos materiais quanto às suas propriedades
magnéticas, os principais são os diamagnéticos, ferromagnéticos, paramagnéticos e
superparamagnéticos. Nos materiais diamagnéticos, o momento magnético total de
todos os spins atômicos é zero quando não se aplica um campo magnético.
Entretanto estes materiais possuem efeitos magnéticos, pois há alteração do
movimento dos elétrons dos átomos por um campo magnético externo, resultando
na geração de spins de corrente adicionais e dipolos magnéticos induzidos. Dessa
forma, uma corrente é induzida no sentido oposto ao do campo magnético aplicado.
Seus valores de susceptibilidade magnética são negativos e praticamente
independentes da temperatura (BUSCHOW; BOER, 2004; YOUNG; FREEDMAN,
2004).
23
Os materiais ferromagnéticos apresentam fortes interações entre os
momentos magnéticos atômicos, com a produção de um alinhamento interno em
certas regiões, os chamados domínios magnéticos, que existem mesmo na ausência
de um campo magnético externo. Sem um campo magnético externo, as
magnetizações dos domínios são orientadas ao acaso e quando há um campo
magnético aplicado, os domínios tendem a se orientar paralelamente ao campo.
Com o aumento progressivo do campo magnético, atinge-se um ponto para o qual
todos os momentos magnéticos desses materiais estão alinhados com o campo
externo, situação chamada de magnetização de saturação. Após esse ponto, um
aumento do campo magnético externo não promove mais nenhum aumento da
magnetização. Nesses materiais, a relação entre a magnetização e o campo
magnético externo quando o campo aumenta pode ser diferente de quando diminui,
com os materiais mantendo grande parte da sua magnetização após a remoção do
campo externo, de forma que para haver remoção completa da magnetização é
necessário aplicar um campo magnético em sentido contrário. Esse comportamento
é chamado de histerese magnética e a curva da Figura 02 é conhecida como ciclo
de histerese. H é o campo magnético aplicado e B é a magnetização do material
(YOUNG; FREEDMAN, 2004).
Na curva de histerese (Figura 02), um campo magnético é aplicado e é
medida a magnetização do material. O ponto em que o aumento da intensidade do
campo magnético não promove aumento da magnetização do material é conhecido
como magnetização de saturação. O campo é então removido e o valor de
magnetização que permanece após a remoção do campo é a magnetização
remanescente. Para fechar o ciclo de histerese, aplica-se um campo magnético no
sentido inverso, sendo que o campo contrário necessário para que a magnetização
do material volte a ser nula é conhecido como coercividade (ALPHAMAG, 2010).
24
Figura 02: Curva de histerese magnética. Fonte: ALPHAMAG, 2010.
Nanopartículas magnéticas de óxidos de ferro, como a magnetita (Fe3O4) e a
maguemita (!-Fe2O3) têm a tendência de apresentar propriedades paramagnéticas
ou mais frequentemente superparamagnéticas. O comportamento paramagnético é
caracterizado pela fraca atração que um material sofre por campos magnéticos.
Quando esses materiais são submetidos a um campo magnético, este exerce um
torque sobre cada momento magnético, com tendência a alinhar esses momentos
com o campo aplicado, resultando numa pequena magnetização (YOUNG;
FREEDMAN, 2004).
Os materiais superparamagnéticos são atraídos por um campo magnético
externo, porém não retêm o magnetismo quando o campo magnético é removido,
diferindo dos outros materiais magnéticos por não permanecerem agregados após a
remoção
do
campo
(BERRY;
CURTIS,
2003).
Em
decorrência
deste
comportamento, não apresentam ciclo de histerese.
O tamanho das partículas magnéticas é fundamental para determinar o seu
comportamento magnético. Partículas pequenas se comportam como domínio único,
com
os
grupos
de
spins
posicionados
na
mesma
direção
e
atuando
cooperativamente. Por outro lado, partículas maiores demonstram comportamento
de multidomínio, que consiste em vários domínios únicos separados por paredes de
domínio, apresentando características ferromagnéticas (PHILIPPOVA et al., 2011).
25
As partículas de óxidos de ferro com comportamento superparamagnético
têm se mostrado adequadas para aplicações in vivo, pois são biocompatíveis, sendo
que o ferro em excesso é eliminado do organismo de forma eficiente, não causando
estresse oxidativo nem alterações importantes nos níveis de enzimas hepáticas em
ratos (JAIN et al., 2008; KUNZMANN et al., 2011).
Para aplicação biomédica as nanopartículas magnéticas precisam apresentar
algumas características importantes, como valores de susceptibilidade magnética
suficientemente altos, estabilidade química em condições fisiológicas e reduzida
toxicidade, além de facilidade de síntese e baixo custo para que seu preparo e
utilização sejam economicamente viáveis (FIGUEROLA et al., 2010).
As nanopartículas magnéticas empregadas em aplicações biomédicas
geralmente apresentam duas configurações estruturais distintas: (a) um núcleo
magnético inorgânico composto de óxidos de ferro (comumente magnetita,
maguemita ou uma mistura dos dois) revestido por um polímero biocompatível ou (b)
um polímero contendo o material magnético inorgânico precipitado nos seus poros.
O revestimento das partículas apresenta a função de proteger o material do
ambiente circundante, podendo também ser funcionalizado com grupos carboxílicos,
biotina, avidina, carbodi-imida, entre outros. Estes grupos podem servir de ponto de
ligação para fármacos, anticorpos ou genes ou mesmo aumentar sua solubilidade
em fluidos aquosos ou a afinidade das partículas pelo órgão alvo ou por
determinado tipo celular no caso de adsorção de células (MAHMOUDI et al., 2011;
OH; PARK, 2011).
Zhao, Qiu e Huang (2008) estudaram a interferência de diferentes parâmetros
nas características de partículas magnéticas para vetorização de fármacos
sintetizadas pelo método de coprecipitação de Fe3+ e Fe2+ em meio básico na
presença de um agente emulsificante. A caracterização das partículas foi realizada
por microscopia de transmissão eletrônica (forma e tamanho), cristalografia
(estrutura do cristal), espalhamento de luz dinâmico (distribuição do tamanho de
partícula), densidade magnética e resposta magnética. Os parâmetros estudados
foram o efeito do agente alcalinizante (NaOH e NH4OH), e do agente emulsificante
(Span$-80, Tween$-80 e PEG-4000), velocidade do gotejamento da solução
alcalinizante (6 a 8, 18 a 20 e 55 a 60 gotas por minuto), concentração de Fe3+ e
26
Fe2+ (0,010 a 0,030 mol L-1), temperatura da reação (30, 40, 50, 60 e 70 °C) e
quantidade de agente emulsificante (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g de PEG-4000).
Os resultados mostraram que as partículas preparadas com NH4OH
apresentaram diâmetro médio menor (11,6 nm) quando comparadas às obtidas com
NaOH como agente alcalinizante (24,3 nm), provavelmente pela liberação mais lenta
dos íons OH- do NH4OH, o que permite a obtenção de partículas menores. O
emulsificante foi utilizado para impedir a agregação das partículas, sendo que o
melhor resultado foi obtido com o PEG-4000, facilmente isolado após o preparo das
partículas. A velocidade de gotejamento da solução alcalinizante também se
mostrou como um parâmetro importante, sendo que uma menor velocidade permite
a formação de partículas com tamanho mais homogêneo. Em relação à
concentração de Fe3+ e Fe2+, verificou-se que o aumento da concentração promove
um aumento do diâmetro das partículas, sem grande diferença na resposta
magnética. A temperatura ideal encontrada foi 50 °C, considerando o diâmetro
médio obtido e a resposta magnética. Por fim, observou-se que a quantidade de
agente emulsificante também exerce influência no diâmetro médio das partículas
obtidas (ZHAO; QIU; HUANG, 2008).
3.2 Partículas magnéticas na liberação de fármacos
A vetorização de fármacos tem sido objeto de pesquisa frequente na área
farmacêutica com o objetivo de potencializar seus efeitos terapêuticos e/ou reduzir
sua toxicidade. A terapia antitumoral convencional é realizada com fármacos que
apresentam alta toxicidade decorrente da distribuição indiscriminada do fármaco no
organismo, atuando tanto nas células tumorais quanto nas saudáveis. Além disso,
estes fármacos apresentam baixa solubilidade em água, sendo necessária a
utilização de solventes e tensoativos para sua administração (PARK et al., 2010).
Diferentes estratégias têm sido propostas para promover a liberação de
agentes terapêuticos, como liberação pH dependente (ZHANG et al., 2009) e
sistemas de liberação como nanopartículas inorgânicas, materiais poliméricos
naturais e sintéticos, lipossomas, nanocristais, nanotubos, dendrímeros, entre outros
(FARAJI; WIPF, 2009; BHARALI; MOUSA, 2010). Dentre os polímeros de origem
27
natural, a quitosana e seus derivados têm sido frequentemente aplicados em
sistemas para a vetorização de fármacos (PARK et al., 2010).
Uma das formas de vetorização é através de sistemas magnéticos contendo a
substância
ativa
na
sua
superfície
ou
encapsulada,
representados
esquematicamente na Figura 03. Os carreadores magnéticos contendo o fármaco
são administrados via intravenosa e vetorizados para a área desejada com o auxílio
de um campo magnético externo. O fármaco presente nos sistemas é então liberado
diretamente no local afetado, sendo que a eficiência do carreador depende de vários
parâmetros, como as propriedades magnéticas dos sistemas, a intensidade do
campo magnético externo, o fluxo sanguíneo local e as características químicas dos
carreadores (PARK et al., 2010). Desse modo, buscam-se diferentes estruturas que
mantenham suas propriedades magnéticas após a incorporação do fármaco e
apresentem mecanismo de liberação adequado para a vetorização e liberação
modificada do ativo (GUPTA; GUPTA, 2005).
Figura 03: Representação esquemática da vetorização magnética de fármacos. Fonte:
CORCHERO; VILLAVERDE, 2009.
As propriedades superficiais das partículas magnéticas são fundamentais
para a vetorização adequada do fármaco. Partículas hidrofóbicas e com cargas
apresentam tempos curtos de circulação no organismo em decorrência da sua
agregação e da adsorção a proteínas plasmáticas, processo conhecido como
28
opsonização, facilitando seu reconhecimento pelo sistema reticuloendotelial e
promovendo a remoção das partículas da circulação sanguínea. Além disso,
partículas carregadas positivamente podem se ligar a células que não as célulasalvo com maior facilidade (VEISEH; GUNN; ZHANG, 2010).
Além das propriedades superficiais, o tamanho das partículas magnéticas
também pode determinar o seu tempo de circulação no organismo. Partículas muito
pequenas, com diâmetro médio menor que 10 nm, são rapidamente removidas da
circulação sanguínea por extravasamento e clearance renal, enquanto que
partículas com diâmetro maior que 200 nm são facilmente capturadas pelo baço e
removidas pelas células do sistema fagocitário. Dessa forma, o diâmetro ideal para
partículas magnéticas utilizadas na liberação vetorizada e na hipertermia induzida
magneticamente situa-se entre 10 e 100 nm (PHILIPPOVA et al., 2011).
Outro estudo de liberação magneticamente direcionada de fármacos foi
realizado por Xu e colaboradores (2005), com um sistema para avaliação do
direcionamento magnético das partículas in vitro e in vivo. No estudo in vitro (Figura
04), simulando a circulação humana, a captura das partículas foi influenciada pela
velocidade de fluxo do ferrofluido e intensidade do campo magnético.
Figura 04: Esquema do sistema de captura magnética in vitro. Adaptado de Xu et al. (2005).
O estudo in vivo foi realizado em ratos, com um magneto permanente no
formato de uma pirâmide em um dos lados a fim de reduzir a área alvo e permitir um
direcionamento mais eficiente (Figura 05). Após a injeção dos ferrofluidos, os
29
animais foram posicionados no magneto de forma a direcionar as partículas para o
rim, o órgão alvo (XU et al., 2005).
Figura 05: Esquema do sistema de captura magnética in vivo. Adaptado de Xu et al. (2005).
As imagens de ressonância mostraram que, quando aplicado o campo
magnético, parte das partículas foi para o rim, porém, não a quantidade esperada.
Muitas partículas foram fagocitadas pelo sistema reticuloendotelial e permaneceram
no fígado. Os pesquisadores atribuíram tal fato ao uso de partículas não revestidas,
sugerindo que o revestimento das partículas impediria ou retardaria em parte esse
processo fagocítico, permitindo uma concentração maior de partículas no órgão alvo
(XU et al., 2005).
Com o objetivo de estudar o comportamento de partículas magnéticas para a
liberação vetorizada de fármacos a partir de um implante, Avilés, Ebner e Ritter
(2008) desenvolveram um sistema de captura magnética experimental in vitro para
simular as condições fisiológicas. Este sistema consiste em um cilindro polimérico
poroso contendo as partículas magnéticas, dois magnetos permanentes localizados
acima e abaixo do cilindro, uma seringa para suprir a suspensão de partículas
contidas no cilindro, um tubo de fluxo com o polímero poroso encapsulado no seu
interior, uma bomba para controlar o fluxo através da matriz polimérica e um
recipiente coletor da suspensão no fim do sistema, semelhante ao apresentado na
30
Figura 04. O campo magnético aplicado foi variado pela alteração da distância entre
os dois magnetos permanentes para estudar a influência da sua variação na captura
magnética. Além disso, foram estudadas outras variáveis, como a velocidade de
fluxo, o conteúdo de Fe3O4 e a concentração de partículas. Conforme esperado, o
aumento do fluxo diminuiu a captura, enquanto uma concentração maior de
partículas e um conteúdo maior de Fe3O4 aumentaram a eficiência da captura. A
diminuição da intensidade do campo magnético externo reduziu a captura, porém
esta ainda foi significativa mesmo na menor intensidade estudada (38,0 T).
Gaihre e colaboradores (2009) sintetizaram partículas magnéticas de óxido de
ferro e as revestiram com gelatina para a aplicação como sistema de liberação do
fármaco antitumoral doxorrubicina, utilizado no tratamento de leucemias e linfomas.
Para a incorporação do fármaco foram empregados os métodos de adsorção direta
nas partículas prontas e de encapsulação por reticulação, sendo que este método
apresentou maior capacidade de incorporação. Além disso, a liberação do fármaco
mostrou-se pH dependente, com uma liberação consideravelmente maior em pH
ácido (4,0) do que em pH próximo à neutralidade (7,4).
Fluidos magnéticos contendo partículas modificadas com polietilenoglicol e
copolímero de ácido láctico e glicólico (PLGA) foram preparados para aplicação na
encapsulação do paclitaxel, outro fármaco antitumoral. Além disso, avaliou-se a
liberação do fármaco e a toxicidade in vivo. O estudo mostrou que os sistemas
apresentaram estabilidade, propriedades de superparamagnetismo e DL50 cerca de
três vezes mais alta que o paclitaxel puro (ZÁVI"OVÁ et al., 2009).
O paclitaxel também foi incorporado em nanopartículas magnéticas de um
derivado da polianilina para a terapia de carcinoma prostático. O sistema promoveu
aumento do tempo de meia vida do fármaco, reduzindo a dose necessária para sua
atividade em ensaios in vitro utilizando células de carcinoma prostático PC3 e
CWR22R (HUA et al., 2010).
Purushotham e Ramanujan (2010) prepararam e caracterizaram partículas de
Fe3O4 revestidas
com
poli-n-isopropilacrilamida
para
aplicá-las
tanto
para
hipertermia induzida magneticamente quanto para a liberação vetorizada de
doxorrubicina. Além da caracterização das partículas obtidas, foram estudados o
comportamento de aquecimento in vitro pela aplicação de um campo magnético
alternado, a liberação da doxorrubicina incorporada nas partículas sem e com um
31
campo magnético alternado, bem como a influência da temperatura na liberação do
fármaco. As partículas apresentaram liberação dependente da temperatura, sendo
que uma exposição inicial de uma hora a 37 °C resultou na liberação de 35,5% do
fármaco, o aumento da temperatura para 43 °C por uma hora promoveu a liberação
de 48,5% do mesmo e ao diminuir a temperatura para 24 °C por duas horas a
liberação caiu drasticamente. Os estudos de hipertermia in vitro mostraram que o
ferrofluido contendo 1 mg mL-1 das partículas incorporadas, quando aplicado um
campo magnético alternado de 4 kA m-1, atingiu 41 °C em quatro minutos, com a
possibilidade de manter a temperatura entre 41 e 47 °C por uma hora, período
relevante para a aplicação clínica. Dessa forma, as partículas desenvolvidas têm
potencial aplicação para a hipertermia induzida magneticamente e simultânea
liberação do fármaco, resultando num tratamento multimodal para o câncer.
Como a maioria dos fármacos antitumorais apresentam características
hidrofóbicas, alguns estudos são realizados empregando fármacos poucos solúveis
mais acessíveis como modelo. A indometacina, por exemplo, tem sido empregada
com essa finalidade em trabalhos envolvendo nanopartículas magnéticas para a
vetorização de fármacos (ZÁVI"OVÁ et al., 2007; RUTNAKORNPITUK et al., 2009).
Timko e colaboradores (2006) prepararam nanopartículas magnéticas de
ácido poliláctico contendo indometacina como fármaco modelo para a liberação
vetorizada através da técnica de nanoprecipitação. Também foram preparadas
partículas magnéticas revestidas com o polímero poli(D,L-lactídeo) e a indometacina
foi incorporada a esse sistema. Foi estudada a influência do pH na incorporação do
fármaco e sua liberação in vitro, obtendo-se partículas de diâmetro aproximado de
250 nm e liberação de 70% da indometacina nas primeiras cinco horas (ZÁVI"OVÁ
et al., 2007).
Kang e colaboradores (2008) também utilizaram a indometacina incorporada
em micropartículas magnéticas como modelo de fármaco hidrofóbico. Foram
preparadas partículas magnéticas com ácido poliláctico e PLGA através de uma
técnica envolvendo dióxido de carbono supercrítico. As micropartículas, com 2,35
µm de diâmetro médio, apresentaram superfície lisa e promoveram uma liberação
do fármaco controlada por difusão.
32
Outro
estudo
que
utilizou
a
indometacina
para
incorporação
em
nanopartículas magnéticas foi realizado por Guo e colaboradores (2010). Foram
preparadas nanopartículas magnéticas com diferentes combinações de copolímeros
em bloco. Estudos de liberação in vitro demonstraram que a liberação da
indometacina destes sistemas foi pH dependente, com maiores quantidades
percentuais de fármaco liberado em valores mais baixos de pH. Estes
pesquisadores incorporaram também o fármaco antitumoral clorambucil nestas
mesmas nanopartículas e verificaram semelhança no comportamento desses
sistemas quando comparados àqueles em que a indometacina foi utilizada como
fármaco modelo.
3.3 Partículas magnéticas de óxidos de ferro contendo quitosana e
derivados
A quitosana, obtida através da desacetilação da quitina, é um biopolímero que
tem sido frequentemente utilizado na área biomédica por suas características
biocompatíveis e biodegradáveis, podendo ser encontrado com diferentes valores de
massa molar média e graus de desacetilação. Por possuir grupos reativos, como
amino e hidroxila, vários derivados da quitosana com diferentes propriedades
químicas e biológicas têm sido sintetizados e caracterizados (LE TIEN et al., 2003;
GUO et al., 2005; DEBRASSI, 2008).
A OCMQTS (Figura 06) é um derivado da quitosana solúvel em água no qual
o grupamento o-hidroxila é substituído por um grupamento carboximetil através da
formação de uma ligação éter, conferindo ao polímero solubilidade tanto em pH
ácido quanto básico (ZHU et al., 2005). Sua segurança foi analisada por Ramesh,
Viswanatha e Tharanathan (2004) em ratos albinos através da avaliação de
alterações no peso corporal, peso dos órgãos vitais, parâmetros histopatológicos e
hematológicos, não demonstrando alterações significativas nas características
estudadas e sendo considerado biocompatível.
33
Figura 06: Estrutura do principal monômero da OCMQTS.
Um derivado da OCMQTS estudado para aplicações farmacêuticas é a
OCMQTS-Bz (Figura 07), no qual há a inserção de um grupamento benzil no
nitrogênio do monômero de OCMQTS, conferindo ao polímero características
anfifílicas.
Figura 07: Estrutura do principal monômero da OCMQTS-Bz.
Este derivado tem sido utilizado como auxiliar na dissolução de compostos
bioativos pouco solúveis, no preparo de esponjas para liberação de insulina e de
filmes poliméricos para aplicações farmacêuticas e em alimentos, por exemplo
(DEBRASSI, 2008; ROSA, 2008; BRESSAN, 2009; SANTOS, 2010).
As
nanopartículas
polissacarídeos
naturais
magnéticas
têm
sido
preparadas
amplamente
com
quitosana
utilizadas
em
e
outros
aplicações
biotecnológicas principalmente por suas características biocompatíveis e atóxicas
(DIAS et al., 2011). Dentre as aplicações das nanopartículas magnéticas, pode-se
citar seu uso como agente de contraste na ressonância magnética de imagem. Kim
e colaboradores (2005) prepararam ferrofluidos contendo nanopartículas revestidas
com ácido oleico em dispersões de quitosana. Estes ferrofluidos apresentaram boa
estabilidade e contrastes de ressonância magnética de imagem similares aos do
Resovist®, um produto para esta finalidade utilizado clinicamente.
34
Foi também preparado um ferrofluido de partículas magnéticas através do
revestimento in situ do óxido de ferro com a quitosana submetida à radiação gama
numa tentativa de aumentar o conteúdo de Fe3O4. Verificou-se que a metodologia
empregada pode aumentar o revestimento das nanopartículas magnéticas com
quitosana, obtendo-se um ferrofluido com um alto conteúdo de Fe3O4, o qual
apresenta um potencial uso como contraste na ressonância magnética de imagem
(TSAI et al., 2010).
Outra aplicação dessas nanopartículas é na separação de células e
macromoléculas, como proteínas. Wang e colaboradores (2008) prepararam
nanopartículas magnéticas com quitosana para essa aplicação e foi avaliada a
influência do pH no processo de adsorção, as propriedades cinéticas e a capacidade
de adsorção da albumina sérica bovina pelas nanopartículas. O estudo demonstrou
boa adsorção da proteína, com o equilíbrio atingido em 10 minutos, sendo um
processo bastante rápido.
Partículas magnéticas de quitosana e derivados também são empregadas em
biocatálise. Li e colaboradores (2008a) realizaram um estudo de adsorção da
enzima mandelato desidrogenase do Saccharomyces cerevisiae por partículas
magnéticas contendo quitosana, utilizadas posteriormente na síntese do ácido (R)mandélico, precursor de alguns fármacos, com manutenção da atividade catalítica
da enzima em 48,8%.
Foi também estudada a imobilização da enzima %-D-galactosidase do
Aspergillus oryzae com nanopartículas magnéticas de Fe3O4 e quitosana. A enzima
foi imobilizada nas partículas com glutaraldeído e apresentou atividade igual ou
superior à da enzima livre em uma faixa ampla de temperatura e pH, bem como boa
estabilidade e capacidade de reutilização (PAN et al., 2009).
Outra aplicação das partículas magnéticas é na produção de biossensores.
Zheng e colaboradores (2009) prepararam e caracterizaram filmes contendo
partículas magnéticas de Fe3O4 e quitosana com hemoglobina imobilizada para a
fabricação de um biossensor de H2O2, verificando que a imobilização da proteína
não altera sua estrutura secundária. A atividade catalítica do eletrodo revestido com
o filme foi analisada por voltametria cíclica e verificou-se que o filme pode gerar um
35
microambiente favorável para reações de oxirredução por promover reações de
transferência de elétrons, tendo potencial aplicação em biossensores e biocatálise.
Kaushik e colaboradores (2008) sintetizaram nanopartículas magnéticas com
quitosana para o preparo de um filme contendo glicose oxidase imobilizada através
de interações eletrostáticas e posteriormente aplicaram em um biossensor de
glicose. A enzima imobilizada apresentou excelente atividade catalítica da glicose e
as nanopartículas de Fe3O4 melhoraram a transferência de elétrons entre a glicose e
a superfície do eletrodo. Além disso, quando armazenado sob refrigeração a cerca
de 4 °C durante oito semanas, o eletrodo manteve em 80% sua atividade catalítica,
mostrando boa estabilidade.
Biossensores de glicose com nanopartículas de Fe3O4 e quitosana também
foram preparados por Yang e colaboradores (2009), utilizando um eletrodo de
platina posteriormente revestido com um filme de Nafion$. O biossensor foi utilizado
para a determinação de glicose em soro humano e os resultados foram comparados
com os obtidos através de um equipamento utilizado clinicamente em rotinas
clínicas de bioquímica, apresentando valores semelhantes.
As partículas magnéticas podem ainda ser aplicadas para a remoção de íons
e corantes no tratamento de efluentes. Foram preparadas nanopartículas
magnéticas de carboximetilquitosana ligadas covalentemente às partículas de Fe3O4
via ativação com carbodi-imida, aplicadas posteriormente na remoção de corantes
ácidos (CHANG; CHEN, 2005a). As mesmas partículas foram empregadas também
para a remoção de Cu(II), sendo que a adsorção requereu um tempo de contato de
apenas um minuto para que o equilíbrio fosse atingido (CHANG; CHEN, 2005b).
Partículas magnéticas de quitosana modificadas com etilenodiamina foram
utilizadas para remoção dos corantes laranja ácido 7 e 10. O adsorvente apresentou
distribuição de tamanho de partícula entre 15 e 40 nm, valor de saturação magnética
de 25,6 emu g-1 e capacidade máxima de adsorção de 1215 e 1017 mg g-1 para os
corantes laranja ácido 7 e 10, respectivamente (ZHOU et al., 2011).
Elwakeel (2010) sintetizou e caracterizou resinas de derivados da quitosana
reticulados com glutaraldeído na presença de Fe3O4 e as aplicou para remoção do
Cr(VI) pelo método em batelada. Os resultados mostraram que a resina do derivado
de cloreto de amônio quaternário foi eficiente para remoção do Cr(VI) em meio
36
básico, seguindo uma cinética de pseudo-segunda ordem, adsorção monocamada e
processo endotérmico, com possibilidade de regeneração da resina.
Lee e colaboradores (2005) prepararam um material embólico a partir de um
ferrofluido contendo partículas magnéticas de óxido de ferro e quitosana para
aplicação no tratamento de tumores por emboloterapia, processo no qual um vaso
sanguíneo é obstruído por um material. O objetivo desta técnica é diminuir a
quantidade de sangue que vai para o tumor, dificultando seu crescimento e
favorecendo sua destruição. No caso das partículas magnéticas, é possível ainda
verificar sua localização através da detecção por ressonância magnética de imagem
durante o procedimento médico. O material embólico preparado foi injetado na
artéria renal de coelhos através de um cateter e foram obtidas imagens de
ressonância magnética, mostrando que o material ocupou a artéria renal dos
animais como desejado, tendo potencial aplicação médica.
Os ferrofluidos magnéticos, compostos de partículas magnéticas dispersas
numa suspensão coloidal, também estão sendo estudados para seu uso no
tratamento de câncer através da hipertermia induzida magneticamente, técnica na
qual as partículas magnéticas são injetadas, direcionadas até os tumores e
posteriormente aquecidas com a aplicação de um campo magnético alternado. A
temperatura aplicada e a duração do aquecimento permitem a morte das células
tumorais ou as torna mais susceptíveis às técnicas de radioterapia ou quimioterapia
(THIESEN; JORDAN, 2008).
Donadel e colaboradores (2008) prepararam ferrofluidos contendo partículas
magnéticas de óxido de ferro revestidas com quitosana e atomizadas por spraydrying. Os ferrofluidos foram expostos a um campo magnético alternado para avaliar
suas propriedades de aquecimento. Através da técnica de difração de raios-X foram
encontrados picos característicos de Fe3O4 (55%) e !-Fe2O3 (45%), muito similares
em sua estrutura cristalina e em suas propriedades físicas. O processo de spraydrying gerou partículas esféricas e também foi possível perceber que o tipo de
material de revestimento apresenta um efeito significativo na morfologia das
partículas. A exposição ao campo magnético alternado proporcionou um
aquecimento de 1 °C em três minutos para as partículas preparadas na razão de
partículas magnéticas/quitosana de 1,6, sendo importante considerar que a redução
37
no tempo de aquecimento é fundamental para que as células saudáveis não sejam
afetadas durante o tratamento por hipertermia.
Huang e colaboradores (2010) também prepararam partículas magnéticas de
quitosana e óxidos de ferro por um método de spray-drying, obtendo partículas
esféricas com valores de saturação magnética de 16,22 a 27,91 emu g-1 e com 200
a 500 nm de diâmetro, sendo que uma proporção maior de polímero em relação ao
conteúdo de ferro promoveu aumento significativo do tamanho das partículas.
Também foram preparadas nanopartículas revestidas com quitosana através
de reticulação em suspensão e avaliadas para o uso em hipertermia localizada
através da aplicação de um campo magnético alternado. Após exposição por 29
minutos ao campo magnético alternado numa frequência de 80 kHz, as partículas
com quitosana atingiram uma temperatura de 53,7 °C, apresentando potencial
aplicação para esse tipo de tratamento (ZHAO et al., 2009).
Kim e colaboradores (2009) sintetizaram, caracterizaram e estudaram o
comportamento in vitro de partículas magnéticas sem revestimento e revestidas com
quitosana e amido para o tratamento de carcinoma de células escamosas através da
técnica de hipertermia induzida magneticamente. As partículas revestidas com
quitosana apresentaram biocompatibilidade in vitro e afinidade seletiva pelas células
tumorais, sendo um material promissor para essa aplicação.
Foram também preparados ferrogéis contendo nanopartículas de óxido de
ferro e quitosana e suas propriedades reológicas foram estudadas. Verificou-se que,
quando preparado com uma dispersão de quitosana muito viscosa, o gel formado
não apresenta propriedades magnéticas pela ausência da Fe3O4, provavelmente em
decorrência da formação de oxi-hidróxidos de Fe(III). Foi realizado um estudo prévio
de hipertermia induzida magneticamente com os ferrogéis, atingindo 43 °C em cinco
minutos quando submetidos a um campo magnético alternado, sendo potenciais
materiais para aplicação em hipertermia induzida magneticamente (HERNÁNDEZ et
al., 2009).
Para aplicação na liberação vetorizada de fármacos, foram preparadas
nanopartículas magnéticas de Fe3O4 com quitosana para a liberação do fármaco
antitumoral 5-fluorouracil. O teor de fármaco encontrado nas partículas foi de 13,4%
38
e a eficiência de incorporação foi de 25,8%, com uma liberação inicial de 48% em
cinco horas e de 68% em 30 horas (WANG et al., 2009).
Zhu e colaboradores (2009) também prepararam nanopartículas magnéticas
revestidas com quitosana através de um método de microemulsão reversa para a
vetorização do mesmo fármaco, com um teor de 16 a 23% e eficiência de
encapsulação do fármaco entre 60 e 92%. As partículas apresentaram uma
liberação lenta do agente antitumoral, com a liberação de 23% do fármaco nas
primeiras duas horas e prolongamento da liberação, atingindo 82% de 5-fluorouracil
liberado até 80 horas após a administração, caracterizando um possível sistema de
liberação prolongada.
A indometacina foi utilizada como fármaco modelo para incorporação em
nanopartículas magnéticas de octadecilcarboximetilquitosana quaternizada. Os
sistemas apresentaram características superparamagnéticas, monodispersas e com
partículas contendo de uma a três camadas lipídicas, dependendo do número de
etapas utilizadas no seu preparo, possibilitando a obtenção de uma camada por vez
de acordo com as características que se deseja para o sistema (LIANG et al., 2010).
Saboktakin e colaboradores (2010) sintetizaram hidrogéis contendo partículas
magnéticas revestidas com quitosana e sulfato de dextrana para a liberação
colônica, utilizando o ácido 5-aminossalicílico como fármaco modelo. Os sistemas
promoveram um retardo na liberação do ativo nos ensaios in vitro realizados,
demonstrando que a liberação da substância ocorreria principalmente no cólon.
Zhao e colaboradores (2005) sintetizaram nanopartículas magnéticas com
OCMQTS e 2-piridiltiol como grupo terminal na sua superfície, aplicando-as na
incorporação e liberação do metotrexato, fármaco utilizado no tratamento de câncer.
As partículas obtidas se mostraram estáveis e reprodutíveis e o carreamento do
fármaco no teste antitumoral in vitro foi eficiente, apresentando também liberação
sustentada do metotrexato.
Partículas magnéticas revestidas com quitosana também foram utilizadas
para a liberação de tacrina no cérebro para o tratamento de doença de Alzheimer.
Foi determinado o tamanho das partículas, o conteúdo de Fe3O4, a capacidade de
incorporação da tacrina e sua liberação in vitro e in vivo, com o posicionamento de
um campo magnético externo na cabeça dos animais. Houve um transporte
significativamente maior da tacrina para o cérebro dos animais com as
39
nanopartículas magnéticas quando comparado ao fármaco livre, possibilitando
diminuição da sua dose e consequentemente dos seus efeitos adversos (WILSON et
al., 2009).
Também foram preparadas nanopartículas magnéticas revestidas com um
copolímero de quitosana, polietilenoglicol e polietilenoimina para aplicação na
liberação gênica no tratamento de glioma, um tumor cerebral altamente letal. A
clorotoxina, utilizada no tratamento desse tumor, foi incorporada na superfície das
nanopartículas para aumentar a especificidade do vetor. As nanopartículas contendo
DNA e clorotoxina apresentaram diâmetro médio de 48,8 nm e uma maior
especificidade pelas células do glioma que as partículas sem a clorotoxina em
modelo in vivo (KIEVIT et al., 2010).
3.4 Indometacina
A indometacina (massa molecular: 357,79 g mol-1; pKa: 4,5), cuja estrutura
está representada na Figura 08, é um fármaco pertencente à classe dos antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) utilizado frequentemente no tratamento de
quadros de dor e inflamação. Atua na inibição das enzimas ciclo-oxigenases 1 e 2
(COX-1 e COX-2), inibindo a síntese endógena de prostanoides. Além do uso clínico
amplamente conhecido, há estudos reportando a ação da indometacina e de outros
AINEs na inibição do crescimento de alguns tipos de tumores e como indutores da
apoptose (KIM et al., 2004; OU et al., 2007; YOUNG et al., 2008; ORIDO et al.,
2010).
Figura 08: Estrutura química da indometacina.
40
O mecanismo de ação antineoplásico dos AINEs não está totalmente
esclarecido. Acredita-se, atualmente, que estejam envolvidos mecanismos COXdependentes e COX-independentes, pois foi demonstrada atividade antitumoral
dessa classe através de uma via independente da inibição da síntese de
prostaglandinas, com a modulação da atividade de quinases intracelulares
(LINCOVÁ et al., 2009).
Demonstrou-se que a indometacina diminui a expressão do receptor
prostanoide EP2 em células de câncer colorretal via down regulation, reduzindo
também a formação de AMP cíclico intracelular estimulada pela prostagladina PGE2
(FUJINO et al., 2007). Também foi demonstrada a apoptose induzida pela
indometacina em células de carcinoma renal através de uma via COX-independente
(OU et al., 2007). Além disso, a indometacina promoveu diminuição da captação de
ácido araquidônico, um precursor para a síntese de prostaglandinas pela COX-2, em
células tumorais do cólon (ORIDO et al., 2010).
Contudo, o mecanismo inicialmente conhecido envolve a COX-2, enzima
ausente na maioria dos tecidos normais e expressa como resposta a diferentes
estímulos inflamatórios, incluindo promotores tumorais. A COX-2 converte o ácido
araquidônico
da
membrana
citoplasmática
em
prostaglandina
H2
e
subsequentemente em prostaglandina E2, um mediador pró-carcinogênico primário
da inflamação que atua de forma autócrina e parácrina. A superexpressão da COX-2
ocorre em diferentes tipos de tumores malignos e está relacionada à resistência à
apoptose, ao aumento da angiogênese e à perda da inibição do crescimento celular
(YOUNG et al., 2008).
Foi demonstrada atividade da indometacina e de outros inibidores da COX-2
na inibição do crescimento e/ou na indução da apoptose de diferentes células
tumorais, como do cólon, bexiga, esôfago, estômago e da cavidade oral (KIM et al.,
2004; LINDBLAD; LAGERGREN; RODRÍGUEZ, 2005; KAPITANOVI# et al., 2006;
YOUNG et al., 2008; QIN et al., 2009). Devido a esses fatos, aliados à característica
hidrofóbica da molécula, a indometacina foi escolhida como fármaco-modelo para
incorporação nas partículas preparadas.
50
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese dos polímeros
Para a obtenção do derivado OCMQTS-Bz tendo a quitosana como polímero
de partida, inicialmente foi sintetizada a OCMQTS, posteriormente empregada para
o preparo do derivado anfifílico. A síntese da OCMQTS ocorre através da
substituição nucleofílica bimolecular (SN2), na qual o ataque do nucleófilo ao átomo
de carbono ligado ao cloro acontece simultaneamente à expulsão do grupo de saída
(Figura 09).
Figura 09: Esquema da síntese da OCMQTS a partir da quitosana.
As baixas temperaturas empregadas durante o processo de síntese têm como
objetivo direcionar a substituição para o grupamento hidroxila do carbono 6 do
monômero da quitosana, mantendo a amina livre para que esta possa
posteriormente reagir com o benzaldeído, formando o derivado OCMQTS-Bz
(ROSA, 2008).
A condição básica empregada é fundamental para o rompimento da estrutura
cristalina rígida do polímero, permitindo o acesso do ácido monocloroacético entre
as cadeias poliméricas, possibilitando assim a carboximetilação da quitosana
(CHEN; DU; ZENG, 2003). Devido a essa condição mantida no processo, a
OCMQTS foi obtida na forma salina, sendo uma pequena parte desta transformada
na forma ácida para a determinação do grau de carboximetilação através da
titulação condutimétrica.
O isopropanol é utilizado como principal meio para a reação de
carboximetilação devido à sua polaridade e estereoquímica, ideais para a
51
miscibilidade e o acesso do ácido monocloroacético aos centros de reação da
cadeia por favorecer mudanças na cristalinidade e no polimorfismo do polímero. Em
decorrência da sua baixa constante dielétrica, o isopropanol é um solvente ruim para
o NaOH, favorecendo uma alta concentração da base na superfície da quitosana e,
consequentemente,
um
maior
rompimento
da
sua
estrutura
cristalina
(PUSHPAMALAR et al., 2006).
O derivado OCMQTS-Bz foi obtido através de uma reação de aminação
redutiva (Figura 10).
Figura 10: Esquema da síntese do derivado OCMQTS-Bz a partir da OCMQTS.
Na síntese da OCMQTS-Bz, há a condensação entre o grupamento amino
livre da quitosana e o benzaldeído através do ataque nucleofílico da amina à
carbonila do aldeído e a posterior remoção de água, formando a imina, também
chamada de base de Schiff. A imina é então reduzida utilizando o NaBH4 como
agente redutor. O mecanismo de síntese e redução da imina para a obtenção do
derivado OCMQTS-Bz estão representados nas Figuras 11 e 12.
52
Figura 11: Mecanismo de reação da síntese da imina para a obtenção do derivado
OCMQTS-Bz.
Figura 12: Mecanismo de redução da imina utilizando o NaBH4 como agente redutor.
A reação entre a quitosana e diferentes aldeídos para a formação de bases
de Schiff, que podem ser posteriormente reduzidas a aminas é uma rota
frequentemente utilizada para a obtenção de novos derivados (GUO et al., 2005;
53
RABEA et al., 2005; SANTOS; DOCKAL; CAVALHEIRO, 2005; DEBRASSI, 2008;
SAJOMSANG et al., 2008; JIN; WANG; BAI, 2009; RABEA et al., 2009;
KOUTROUMANIS; AVGOUSTAKIS; BIKIARIS, 2010).
A síntese de derivados anfifílicos da OCMQTS através da formação de bases
de Schiff pode ser realizada em meio homogêneo ou heterogêneo, dependendo das
características desejadas para os derivados. O método heterogêneo apresenta a
desvantagem de produzir derivados insolúveis em soluções aquosas em decorrência
do aquecimento necessário para a síntese, enquanto que no método homogêneo
geralmente são formados produtos com características de solubilidade semelhantes
ao polímero de partida, porém requer uma grande quantidade de solvente orgânico
para a precipitação dos produtos (DEBRASSI, 2008). O derivado OCMQTS-Bz
utilizado para a síntese das nanopartículas magnéticas foi obtido pelo método
homogêneo para a manutenção das características de solubilidade da OCMQTS.
5.2 Caracterização da OCMQTS e OCMQTS-Bz
5.2.1 Grau de carboximetilação
A determinação do grau de carboximetilação dos derivados através da
titulação condutimétrica baseia-se na substituição dos íons com determinada
condutividade por outros com condutividade diferente (MUZZARELLI et al., 1982).
Através dos volumes correspondentes aos pontos de inflexão, obtidos através
da curva de titulação condutimétrica da OCMQTS na forma ácida utilizando solução
padrão de NaOH 0,100 mol L-1 como agente titulante (Figura 13) foi determinado o
grau de carboximetilação do derivado.
54
Figura 13: Curva da titulação condutimétrica da OCMQTS. Massa de amostra: 50 mg,
temperatura: 25 ºC, titulante: NaOH 0,100 mol L-1.
A curva de titulação condutimétrica da forma ácida da OCMQTS apresenta
dois pontos de inflexão, correspondente ao início e ao término da neutralização do
grupamento ácido carboxílico (CASU; GENNARO, 1975). O valor do segundo ponto
de inflexão é utilizado para o cálculo do grau de carboximetilação.
O grau de carboximetilação obtido foi de 44,31%. Este valor é alto quando
comparado a derivados carboximetilados da quitosana obtidos anteriormente
através do mesmo método de síntese, cujos valores de carboximetilação se situam
entre 20 e 30% (CHEN; PARK, 2003; ROSA, 2008; SANTOS, 2010). Esta diferença
reflete a necessidade de caracterização para cada lote de derivado sintetizado.
5.2.2 Espectroscopia no infravermelho
A técnica de espectroscopia no infravermelho é frequentemente empregada
como auxiliar na determinação de estruturas químicas principalmente na área de
produtos naturais e síntese orgânica. Baseia-se na absorção da radiação
eletromagnética em frequências correlacionadas à vibração de ligações químicas de
determinados grupos funcionais de uma molécula. A condição fundamental para que
haja absorção na região do infravermelho é a existência de uma alteração no
momento dipolar de um grupo ou uma molécula durante sua vibração. Tais
55
alterações permitem a interação da radiação incidente com a molécula, originando
os espectros (COATES, 2000).
Os espectros no infravermelho da OCMQTS na forma ácida e do derivado
OCMQTS-Bz são mostrados na Figura 14. No espectro da OCMQTS é possível
verificar a presença de uma banda na região de 1640 cm-1 (estiramento)
correspondente à carbonila e uma banda larga na região de 3500 cm-1 (estiramento)
relacionada à ligação O–H, ambas indicando a presença do grupamento ácido
carboxílico, confirmando a carboximetilação da quitosana. Esta banda está
provavelmente sobreposta à banda de N–H (estiramento), localizada na região de
3450 cm-1. Há também uma banda em 1560 cm-1 atribuída à deformação angular de
N–H dos grupamentos amino livres; em 1730 cm-1 correspondente ao dímero de
carboximetil (O=COH· · ·O=COH); em 1480 cm-1 (deformação) relativa ao
grupamento amino protonado (NH3+) e na região entre 1150 e 900 cm-1 (estiramento)
relativas às ligações glicosídicas C–O e C–O–C (ABREU; CAMPANA-FILHO, 2009;
LIU et al., 2009).
Figura 14: Espectros no infravermelho da OCMQTS na forma ácida e do derivado
OCMQTS-Bz.
O espectro do derivado OCMQTS-Bz apresenta as bandas correspondentes
ao grupamento ácido carboxílico, sendo que a banda relativa à carbonila, em
56
aproximadamente 1640 cm-1 encontra-se alargada e um conjunto de bandas em
aproximadamente 1450, 1350, 1010 e 980 cm-1 indicando a inserção do anel
aromático na estrutura do polímero (SAJOMSANG et al., 2008).
5.2.3 Ressonância magnética nuclear de 1H
A
espectroscopia
de
RMN
baseia-se
na
absorção
de
radiação
eletromagnética na região de radiofrequência em uma frequência relacionada às
características estruturais da molécula sob determinadas condições em um campo
magnético, dando origem a um espectro que é um registro gráfico das frequências
dos picos de absorção contra suas intensidades (SILVERSTEIN; BASSLER;
MORRILL, 1994).
Diferentes núcleos podem ser analisados através dessa técnica. Em geral, os
núcleos que têm número ímpar de prótons, como 1H, 14N, 19F e 31P ou número ímpar
de nêutrons, como
13
C, têm atividade magnética, pois apresentam número de spin
de $. Entretanto, quando o número de prótons e nêutrons são pares, como no 12C, o
núcleo não tem atividade magnética. Dessa forma, há técnicas de RMN cujo objetivo
é avaliar diferentes núcleos, sendo os mais comuns para elucidação estrutural de
compostos orgânicos os de 1H e 13C (VOLLHARDT; SCHORE, 2004).
Vários parâmetros são úteis em um espectro de RMN, principalmente em
RMN
1
H, como deslocamento químico do sinal, que indica a vizinhança do
hidrogênio analisado; sua multiplicidade, relacionada ao número de hidrogênios
vizinhos; a integração do sinal, correspondente ao número de hidrogênios
responsáveis por determinado sinal; e a constante de acoplamento, J, que é a
distância entre dois picos que compõem um sinal (SILVERSTEIN; BASSLER;
MORRILL, 1994; VOLLHARDT; SCHORE, 2004).
O espectro da OCMQTS (Figura 15) apresenta os seguintes sinais: em 1,03
ppm correspondente aos hidrogênios do grupo acetamida dos monômeros residuais
de quitina; em 3,06 ppm relativo ao hidrogênio ligado ao carbono C2 do anel
glucosamina; na região entre 3,49 e 4,08 ppm os sinais correspondentes aos
hidrogênios ligados aos carbonos C3, C4, C5 e C6 do anel e em aproximadamente
5,00 ppm os sinais do hidrogênio ligado ao carbono C1. Os sinais localizados em
57
1,92 e 2,08 ppm correspondem aos solventes CD3COOD e D2O respectivamente
(GOTTLIEB; KOTLYAR; NUDELMAN, 1997; ABREU; CAMPANA-FILHO, 2009).
Figura 15: Espectro de RMN 1H da OCMQTS em D2O/CD3COOD à temperatura ambiente.
O espectro do derivado OCMQTS-Bz (Figura 16) apresenta um sinal em 1,91
ppm correspondente aos hidrogênios do grupamento acetamida dos monômeros
residuais de quitina; em 3,03 ppm relativo ao hidrogênio ligado ao carbono C2 do
anel glucosamina; um grupo de sinais na região entre 3,60 e 3,76 ppm
correspondente aos hidrogênios ligados aos carbonos C3, C4, C5 e C6 desse
mesmo anel; outro grupo de sinais em aproximadamente 4,70 ppm correspondente
ao hidrogênio ligado ao carbono C1 e aos hidrogênios do carbono ligado ao oxigênio
do grupamento carboximetil e um sinal em 7,36 ppm relativo aos hidrogênios do anel
aromático, confirmando novamente a inserção desse grupamento na estrutura do
polímero.
58
Figura 16: Espectro de RMN 1H do derivado OCMQTS-Bz em D2O/CD3COOD à
temperatura ambiente.
Para a determinação do grau de substituição da OCMQTS-Bz foram
considerados os valores das integrais dos espectros (LIU et al., 2006). Este método
de determinação do grau de substituição baseia-se na relação entre o valor da
integral dos hidrogênios aromáticos (próximo a 7,0 ppm) e do hidrogênio ligado ao
C-2 do anel glicosídico (próximo a 3,0 ppm), conforme a Equação 4.
Equação 4
Onde:
AI 1HAr: integral dos prótons aromáticos;
AI 1H C2: integral dos prótons do C-2 do anel glicosídico e
N 1HAr: número de prótons do anel aromático.
59
O grau de substituição calculado a partir da área da integral dos sinais em
3,04 ppm (hidrogênio do C2) e 7,36 ppm (hidrogênios do anel aromático) do
espectro do derivado OCMQTS-Bz foi de 19,0%, baixo quando comparado ao
derivado preparado por Rosa (2008) utilizando a mesma relação molar de 1:1
(benzaldeído:monômero de glucosamina), o qual apresentou grau de substituição de
53%. Este mesmo autor mostrou que o grau de substituição de derivados obtidos
através da reação da OCMQTS com benzaldeído é diretamente dependente da
relação molar aldeído:monômero de glucosamina empregada, sendo que quanto
maior essa relação, maior é o grau de substituição obtido.
O grau de substituição de derivados da OCMQTS modificados com aldeídos
ou outros compostos carbonílicos depende de diferentes fatores, como o tipo de
composto carbonílico utilizado, o solvente, o método empregado (homogêneo ou
heterogêneo) e a temperatura de reação. Guo e colaboradores (2005) prepararam
bases de Schiff através da reação da OCMQTS com aldeídos aromáticos com grau
de substituição de 60%, mostrando que a presença de diferentes grupamentos
ligados ao anel aromático do aldeído não influenciou no grau de substituição dos
derivados. Em trabalho posterior, o mesmo grupo obteve derivados com graus de
substituição semelhantes, entre 51 e 60%, empregando os mesmos reagentes e
condições reacionais (GUO et al., 2006). Largura (2009) sintetizou derivados da
OCMQTS através da reação com cloreto de lauroíla, obtendo derivados com grau de
substituição de 19,84 e 22,27% quando utilizada a mesma proporção molar, valores
semelhantes ao encontrado neste estudo para a OCMQTS-Bz. Tan e Liu (2009)
prepararam derivados através da reação entre a OCMQTS e o ácido linoleico,
encontrando graus de substituição entre 1,8 e 2,6%.
5.3 Preparação e caracterização do material magnético inorgânico
5.3.1 Síntese do material magnético inorgânico
Diferentes técnicas têm sido empregadas para a síntese de Fe3O4, como
coprecipitação dos íons Fe3+ e Fe2+ em meio básico (MENG et al., 2005; LU et al.,
2010), utilizando reatores de micro-ondas (HONG; PAN; LI, 2006; ZHOU et al.,
60
2010), através de uma rota endotérmica em autoclave (ZHENG et al., 2006), por
decomposição térmica (MAITY et al., 2009), por transformação de fase induzida por
redução de !-Fe2O3 em atmosfera de CO (HAI et al., 2010), empregando &-Dglucose como agente redutor (LU et al., 2010), entre outros. A escolha da
metodologia adequada para a síntese é fundamental para a obtenção das partículas
com os tamanhos, formas e características magnéticas visadas, pois o método
empregado está muito relacionado às características físicas do material.
As partículas magnéticas inorgânicas, compostas por uma mistura de !-Fe2O3
e Fe3O4, foram obtidas através do método de coprecipitação dos íons férricos (Fe3+)
e ferrosos (Fe2+) em meio aquoso básico na razão de 2:1 (Fe3+:Fe2+) de acordo com
as Reações 01 e 02 (DONADEL et al., 2008; LU et al., 2010).
Reação 01
Reação 02
A Figura 17 representa as partículas magnéticas inorgânicas dispersas em
água na ausência e na presença de um campo magnético externo, confirmando
visualmente as propriedades magnéticas do material obtido.
Figura 17: Partículas magnéticas inorgânicas dispersas em água (A) na ausência e (B) na
presença de um campo magnético externo.
O mecanismo de formação da Fe3O4 sob as condições reacionais
empregadas não está comprovado, porém ocorre provavelmente conforme o
61
Esquema 01. Em valores de pH acima de 9,0, os íons Fe3+ e Fe2+ são convertidos
aos seus respectivos hidróxidos, que se cristalizam lentamente para formação da
Fe3O4 e de água. Se houver cristalização completa através de uma das duas rotas,
não são formados os produtos hidroxilados (A) e (B). Caso contrário, estes produtos
também estarão presentes no material magnético inorgânico (MENG et al., 2005).
Esquema 01: Mecanismo de formação da magnetita (Fe3O4) através do método de
coprecipitação dos íons Fe3+ e Fe2+ em meio aquoso básico. Rotas
propostas: (1) e (2). Produtos hidroxilados: (A) e (B). Fonte: MENG et al.,
2005.
A Fe3O4 é uma espécie mista de óxido de ferro (FeO-Fe2O3) cuja estrutura é
semelhante ao mineral espinélio (MgAl2O4), com distribuição catiônica invertida. Na
sua estrutura, metade dos íons Fe3+ são coordenados de forma tetraédrica (sítio A)
enquanto que íons Fe3+ restantes e todos os íons Fe2+ são coordenados de forma
octaédrica (sítio B). Cada sítio octaédrico apresenta seis íons O2- vizinhos nas
extremidades do octaedro, enquanto cada sítio tetraédrico apresenta quatro íons O2dispostos nas extremidades do octaedro. Suas propriedades magnéticas são
decorrentes da transferência de elétrons entre os íons Fe2+ e Fe3+ nos sítios
octaédricos (SANTANA; RAMOS; FABRIS, 2008; YAN et al., 2009).
De acordo com a teoria do magnetismo, a direção do momento magnético de
qualquer íon ocupando o mesmo tipo de posição é a mesma, porém a direção do
momento magnético do sítio A é contrária à do sítio B e o momento magnético total
é determinado pela soma dos vetores dos momentos magnéticos das duas espécies
iônicas. Dessa forma, o aumento do momento magnético total ocorre conforme o
conteúdo de Fe2+ (MENG et al., 2005).
62
A oxidação da Fe3O4 apresenta dois possíveis produtos: a !-Fe2O3, que
apresenta propriedades magnéticas, e a hematita (&-Fe2O3), não magnética,
dependendo das condições de síntese empregadas, do tamanho de partícula e do
tipo e quantidade de impurezas. Em altas temperaturas, o principal produto formado
é &-Fe2O3, enquanto que a !-Fe2O3 é obtida preferencialmente pela oxidação em
temperaturas mais baixas (CORREA et al., 2006). Nestes trabalho, o material
inorgânico foi sintetizado à temperatura ambiente, pois a intenção foi obter
nanopartículas magnéticas compostas por uma mistura de Fe3O4 e !-Fe2O3 e evitar
a formação de material não magnético. A !-Fe2O3 apresenta somente íons Fe3+
divididos igualmente entre sítios tetraédricos e octaédricos e apresenta menor
saturação magnética do que a magnetita.
5.3.2 Difração de raios-X (XRD)
A técnica de XRD é uma das mais importantes para a caracterização
estrutural de materiais inorgânicos devido à possibilidade de investigar a
microestrutura de sólidos e moléculas, incluindo as constantes e geometria da rede,
a orientação de cristais, entre outros. O fenômeno de difração em que se baseia a
técnica pode ser explicado pela excitação e vibração dos elétrons do átomo de um
determinado cristal na mesma frequência do feixe de raios-X incidente, difratando
esse feixe em ângulos específicos relacionados ao espaçamento entre planos
cristalinos (MONTES, 2009).
O difratograma de raios-X do material magnético inorgânico está apresentado
na Figura 18. Todos os picos encontrados podem ser atribuídos a Fe3O4 ou !-Fe2O3
através da comparação com dados presentes na literatura, entretanto a semelhança
entre seus picos padrões dificulta a separação precisa dessas duas fases em
amostras de óxidos de ferro (DUSZA et al., 2010).
63
Figura 18: Difratograma de raios-X do material magnético inorgânico (Fe3O4/!-Fe2O3).
Os principais picos atribuídos à Fe3O4 são correspondentes aos planos (220),
(311), (400), (422) e (440), enquanto que para a !-Fe2O3 os principais picos se
encontram em (222) e (533) (TRAN et al., 2010). Além disso, através da análise de
XRD foi possível verificar um predomínio de !-Fe2O3, estimando-se uma proporção
de 75±5% de !-Fe2O3 para 25±5% de Fe3O4. A partir dos dados de XRD foi estimado
também o tamanho de partícula de aproximadamente 15,6 nm para o material
Fe3O4/!-Fe2O3 (DUSZA et al., 2010). Uma mistura destes mesmos óxidos na
proporção de 55,0% de Fe3O4 e 45,0% de !-Fe2O3 foi obtida por Donadel e
colaboradores (2008) através da síntese do material sem atmosfera controlada e
posterior secagem a 170 °C. Para evitar a oxidação parcial da Fe3O4 a !-Fe2O3,
pode-se empregar fluxo de nitrogênio na reação com o objetivo de garantir
atmosfera inerte, sendo possível obter Fe3O4 pura. Esta estratégia foi utilizada por
Ozkaya e colaboradores (2009), entretanto os dados de XRD e comportamento
magnético do material indicaram a presença do produto oxidado.
64
5.3.3 Espectroscopia no infravermelho
O espectro no infravermelho do material magnético inorgânico está
apresentado na Figura 19. Podem ser observadas bandas características da mistura
de Fe3O4/!-Fe2O3 em 597, 790 e 890 cm-1, correspondentes à ligação Fe–O e duas
bandas em 1635 e 3420 cm-1, relativas à presença de umidade na amostra
(ALBORNOZ; SILEO; JACOBO, 2004). O grande número de bandas no espectro
indica a transição da Fe3O4 para um material com estrutura de menor simetria,
caracterizando a oxidação da Fe3O4 a !-Fe2O3 (MÜRBE; RECHTENBACH;
TÖPFER, 2008).
Figura 19: Espectro no infravermelho do material magnético inorgânico (Fe3O4/!-Fe2O3).
Além disso, a presença de duas bandas por volta de 886 cm-1 e 1156 cm-1
indica a presença de traços de &-FeOOH e !-FeOOH respectivamente, produtos
intermediários decorrentes da cristalização incompleta do material a Fe3O4 (RISTI#;
MUSI#, GODEC, 2006; %IC; RISTI#; MUSI#, 2010).
65
5.3.4 Análise térmica
As técnicas de análise térmica consistem na medida de uma propriedade
física de uma substância ou de seus produtos de reação, expressa direta ou
indiretamente em função da temperatura, enquanto essa amostra é submetida a
uma programação controlada de temperatura sob atmosfera especificada. Tais
técnicas têm adquirido maior aplicação em diversas áreas da ciência em estudos
relacionados à caracterização e estabilidade térmica de materiais, na definição da
vida útil de produtos através da avaliação dos mecanismos e da cinética de
decomposição térmica, para a otimização das condições de síntese de diferentes
materiais, na determinação do grau de pureza de fármacos e outras substâncias,
entre outros (MATOS; MERCURI; BARROS, 2009).
Na termogravimetria (TG), a amostra é submetida a uma programação
controlada de temperatura e a variação da massa da amostra é determinada em
função da temperatura ou do tempo. As curvas obtidas, denominadas curvas
termogravimétricas ou curvas TG, podem fornecer informações sobre a estabilidade
térmica e a composição da amostra ou de produtos de degradação intermediários
(MATOS et al., 2000).
A técnica de calorimetria exploratória diferencial (DSC), por sua vez, mede a
diferença de energia fornecida à substância e a um material de referência
termicamente inerte, em função da temperatura, enquanto ambas são submetidas a
uma programação controlada de temperatura. Possibilita a obtenção de dados
quantitativos em relação a alterações químicas e físicas da amostra, como mudança
do estado físico, transições de fase ou reações de decomposição, desidratação,
oxirredução, entre outros (MATOS; MERCURI; BARROS, 2009).
As curvas de TG e DSC do material magnético inorgânico são apresentadas
na Figura 20. Na curva TG é possível verificar uma perda de massa de 7,9% entre
30 e 300 °C, referente à perda de água presente na forma residual e de
cristalização, e a segunda em aproximadamente 515 °C, correspondente a transição
da !-Fe2O3 a &-Fe2O3 (LI et al., 2008b; ZHU et al., 2010).
66
Figura 20: Curvas (verde) TG e (azul) DSC do material magnético inorgânico (Fe3O4/Fe2O3).
A curva DSC apresenta um pico endotérmico em aproximadamente 100 ¡C e
um exotérmico entre 475 e 535 ¡C provavelmente correspondentes à perda de água
residual e à transição da -Fe2O3 a -Fe2O3, respectivamente, os mesmos eventos
citados anteriormente para a análise da curva TG (LI et al., 2008b; ZHU et al., 2010).
5.3.5 Análise morfológica
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é uma das técnicas mais
versáteis para caracterização microestrutural de materiais sólidos. A Figura 21
apresenta a micrografia do material magnético inorgânico em aumento de 500
vezes. Observa-se a formação de agregados de partículas com uma ampla
distribuição de tamanho, forma e superfície irregulares.
67
Figura 21: Micrografia eletrônica de varredura do material magnético Fe3O4/!-Fe2O3 em
aumento de 500x.
A agregação das partículas pode ser atribuída à sua elevada área e energia
superficial, reforçando a necessidade da adição de polímeros com características
hidrofílicas com o objetivo de reduzir essa agregação em fluidos aquosos.
Comportamento de agregação semelhante foi obtido com nanopartículas de Fe3O4
sem revestimento com diâmetro médio de 10 nm (HONG et al., 2008). Afkhami e
Moosavi (2010) prepararam nanopartículas de !-Fe2O3 utilizando agitação magnética
e ultrassom, sendo que a agitação ultrassônica permitiu uma melhor dispersão das
partículas, evitando a agregação, além de possibilitar a obtenção de partículas
menores.
5.3.6 Comportamento magnético
A análise do comportamento magnético das partículas preparadas é de
fundamental importância para determinar como estas irão se posicionar frente à
aplicação de determinado campo magnético. O comportamento desejado para a
aplicação das partículas magnéticas na vetorização de fármacos é o de
paramagnetismo ou superparamagnetismo, caracterizado pelo alinhamento dos
dipolos magnéticos do material apenas na presença de um campo magnético
68
externo, tendo seus dipolos novamente desorientados quando esse campo é
removido (FIGUEROLA et al., 2010).
As curvas de magnetização dos dois lotes de material magnético inorgânico
preparados através da mesma metodologia de coprecipitação em meio básico são
apresentadas na Figura 22. O lote (B) foi caracterizado através de todas as técnicas
citadas, enquanto o lote (C) foi caracterizado apenas quanto ao seu comportamento
magnético. É possível observar uma histerese muito pequena para ambos os lotes,
caracterizando o comportamento de paramagnetismo, ou seja, quando o campo
magnético externo é removido as partículas não retém o magnetismo. Entretanto há
diferença nos valores de saturação magnética, de 54,4 emu g-1 para o lote (B) e 60,8
emu g-1 para o lote (C). A saturação magnética ou magnetização de saturação de
um determinado material corresponde ao ponto em que o aumento da intensidade
do campo magnético aplicado não promove o aumento da magnetização do
material.
A magnetização remanescente, correspondente à magnetização do material
que permanece após a remoção do campo magnético, foi de 3,1 emu g-1 para o lote
(B) e 3,6 emu g-1 para o lote (C), aumentando à medida que o valor de saturação
magnética
aumenta.
Estes
resultados
confirmam
o
comportamento
de
paramagnetismo dos materiais, indicando que estes permanecem magnetizados
apenas na presença de um campo magnético externo. A coercividade, por sua vez,
é o campo magnético reverso necessário para que a magnetização retorne ao valor
nulo e foi de 25,7 Oe para o lote (B) e 26,5 Oe para o lote (C), também aumentando
à medida que a saturação magnética aumenta.
69
Figura 22: Curvas de magnetização de dois lotes de Fe3O4/!-Fe2O3 à temperatura ambiente.
No detalhe, a expansão da parte central da curva.
Estas diferenças reforçam a afirmação de que há uma mistura das duas
espécies de óxido de ferro (Fe3O4 e !-Fe2O3), visto que a Fe3O4 pura apresenta
saturação magnética de 92 emu g-1 e a !-Fe2O3 de 73 emu g-1 à temperatura
ambiente (SARAVANAN; ALAM; MATHUR, 2003). Considerando que os dois lotes
apresentaram saturação magnética inferior a 73 emu g-1, sugere-se ainda a
presença de possíveis intermediários resultantes da oxidação incompleta do
material. Devido a essa diferença entre lotes sintetizados pela mesma metodologia,
é importante caracterizar magneticamente todos os lotes de material sintetizado.
Yan e colaboradores (2009) obtiveram partículas de Fe3O4 com saturação
magnética de 87,7 emu g-1, próxima ao valor de saturação da Fe3O4 pura, indicando
a presença de uma pequena quantidade de subprodutos ou contaminantes. Por
outro lado, Lu e colaboradores (2010) obtiveram partículas magnéticas de óxidos de
ferro através de coprecipitação em meio básico com saturação magnética de 60,5
emu g-1 à temperatura ambiente, valor muito próximo ao encontrado neste trabalho.
A Figura 23 mostra o comportamento das partículas de Fe3O4/!-Fe2O3
dispersas em água na ausência e na presença de um campo magnético externo.
70
Figura 23: Partículas magnéticas inorgânicas dispersas em água na (A) ausência e (B) na
presença de um campo magnético externo em aumento de 40x.
Na ausência de campo magnético (Figura 23-A), é possível observar as
partículas dispersas aleatoriamente em agregados. A presença do campo (Figura
23-B) induz o posicionamento das partículas na direção do mesmo, confirmando
visualmente sua característica magnética. Pode-se ainda verificar que há
manutenção do comportamento de agregação observado na ausência do campo.
5.3.7 Espectroscopia Mössbauer
A espectroscopia Mössbauer é utilizada para analisar o comportamento das
propriedades de um núcleo atômico e do ambiente que o envolve, sendo
fundamental para elucidação estrutural de compostos contendo ferro. As interações
hiperfinas ou parâmetros hiperfinos caracterizam as interações eletromagnéticas
entre o núcleo e os elétrons em torno deste, possibilitando a obtenção de
informações sobre a geometria do centro metálico, seu estado de oxidação e suas
propriedades magnéticas.
As três principais interações hiperfinas são o deslocamento isomérico (), o
desdobramento quadrupolar () e o campo magnético hiperfino (Bhf). O
deslocamento isomérico fornece informações sobre a densidade eletrônica do
núcleo, podendo ser interpretado em relação à valência do íon analisado. É
resultante das interações eletrostáticas entre as cargas elétricas do núcleo e dos
elétrons do subnível s. O desdobramento quadrupolar é referente ao fato de que o
71
núcleo não é perfeitamente esférico, apresenta um desvio de simetria. O campo
magnético hiperfino é o campo magnético gerado pelos elétrons vizinhos ao núcleo
e sentido por ele, podendo ter origem dipolar, quando devido a elétrons vizinhos a
ele, ou de elétrons desemparelhados de próprio átomo (SILVA, 2006; PAULINO et
al., 2009; SCHETTINO JR, 2009).
Os espectros Mössbauer obtidos a baixas temperaturas permitem que a
energia de interação magnética seja mais relevante que a energia térmica,
possibilitando o registro de espectros com as seis linhas de transição (sexteto
magnético), cujo valor do Bhf é importante para a identificação das fases que
compõem os materiais (SCHETTINO JR, 2009).
Os espectros Mössbauer do material magnético Fe3O4/!-Fe2O3 a 77 e 300 K e
os seus parâmetros hiperfinos são apresentados na Figura 24 e na Tabela 01
respectivamente. São observados um sexteto e um dubleto relativos à presença de
Fe3O4 e !-Fe2O3, sendo que os valores de deslocamento isomérico de ambos os
componentes indicam a presença de íons Fe3+ (BERRY; SKINNER; THOMAS,
1998). O sexteto com linhas amplas pode ser atribuído ao Fe localizado tanto nos
sítios tetraédricos quanto octaédricos, entretanto sua determinação mais precisa
necessita da aplicação de um campo magnético externo na obtenção dos espectros.
O sexteto é indicativo do desdobramento do campo magnético hiperfino e o
dubleto próximo ao centro do espectro é referente ao ferro no estado paramagnético
ou superparamagnético. Espectros semelhantes compostos por um sexteto e um
dubleto foram obtidos por Pardoe e colaboradores (2001) na caracterização de
nanopartículas magnéticas de Fe3O4 e !-Fe2O3 sintetizadas na presença de dextrana
e álcool polivinílico.
72
Figura 24: Espectros Mössbauer do material Fe3O4/!-Fe2O3 a (A) 77 K e (B) 300 K.
As linhas coloridas representam as diferentes espécies presentes no
material.
73
Tabela 01: Parâmetros hiperfinos de espectroscopia Mössbauer do material Fe3O4/!-Fe2O3
a 77 e 300 K.
Temperatura
(K)
77
300
Razão das
" (mm s-1)
# (mm s-1)
Bhf (T)
0,46
0,00
44,7
92
0,44
0,68
50,2
8
0,33
0,00
39,6
72
0,33
0,64
0,0
28
espécies (%)
A intensidade relativa do componente referente ao dubleto diminui com a
diminuição da temperatura de obtenção dos espectros de 300 K para 77 K, como
esperado para processos termicamente ativados. A magnetita apresenta um sexteto
característico dos íons Fe coordenados de forma octaédrica com valência
intermediária Fe2,5+ com deslocamento isomérico de aproximadamente 0,67 mm s-1
e Bhf de aproximadamente 46 T (SCHMIDBAUER; KELLER, 2006). A ausência
desse sexteto nos espectros do material magnético preparado indica novamente que
a maguemita é a fase dominante na mistura de óxidos.
5.4 Preparação das partículas magnéticas contendo polímero
As partículas magnéticas contendo os polímeros foram sintetizadas através
de duas metodologias: formação das partículas in situ e por incorporação, com a
obtenção das partículas apresentadas na Tabela 02.
74
Tabela 02: Partículas magnéticas sintetizadas de acordo com a metodologia e os polímeros
empregados.
Código
Metodologia
Fe3O4/!-Fe2O3
Coprecipitação
Polímero empregado e proporção em
relação ao material inorgânico
(polímero:inorgânico)
*
OC in situ
Formação in situ
OCMQTS (0,5:1)
OC-Bz in situ
Formação in situ
OCMQTS-Bz (0,5:1)
OC inc 1:1
Incorporação
OCMQTS (1:1)
OC inc 2:1
Incorporação
OCMQTS (2:1)
OC-Bz inc 1:1
Incorporação
OCMQTS-Bz (1:1)
OC-Bz inc 2:1
Incorporação
OCMQTS-Bz (2:1)
* Apenas material inorgânico
A metodologia de formação in situ consiste na coprecipitação dos íons Fe3+ e
Fe2+ e do polímero, ocorrendo de forma semelhante ao apresentado no Esquema 01
e nas Reações 1 e 2, porém, com a concomitante precipitação da OCMQTS ou do
seu derivado OCMQTS-Bz. A metodologia de obtenção das partículas magnéticas
por incorporação, por sua vez, baseia-se na reticulação do polímero em emulsão
com glutaraldeído, utilizando material magnético inorgânico previamente preparado.
As duas metodologias empregadas possibilitam a obtenção de partículas
magnéticas com diferentes estruturas. No caso das partículas preparadas pela
metodologia de formação in situ, o material magnético se encontra precipitado
dentro dos poros do polímero, enquanto que as partículas preparadas pelo método
de incorporação apresentam um núcleo magnético inorgânico com um revestimento
polimérico (MAHMOUDI et al., 2011). Estas diferenças estruturais ocasionam
características distintas em relação a vários parâmetros, como agregação, tamanho
de partícula, comportamento magnético, eficiência de adsorção ou incorporação de
fármacos, entre outros.
75
5.5 Caracterização das partículas magnéticas contendo polímero
5.5.1 Teor de ferro
A quantidade de ferro presente nas partículas magnéticas está diretamente
relacionada ao conteúdo de material inorgânico das mesmas e, provavelmente, à
intensidade das suas propriedades magnéticas. O teor de ferro nas partículas foi
determinado espectrofotometricamente através do método da 1,10-fenantrolina e os
resultados obtidos encontram-se na Tabela 03.
Tabela 03: Teor de ferro nas partículas magnéticas utilizando o
método espectrofotométrico da 1,10-fenantrolina.
Partículas magnéticas
Teor de ferro (%)
Fe3O4/!-Fe2O3
49,80 ± 1,56
OC in situ
40,59 ± 1,31
OC-Bz in situ
37,14 ± 1,22
OC inc 1:1
27,20 ± 0,79
OC inc 2:1
18,44 ± 0,43
OC-Bz inc 1:1
35,19 ± 1,21
OC-Bz inc 2:1
23,40 ± 1,18
A quantidade de ferro presente nas partículas está relacionada com o método
de obtenção e a relação polímero:material inorgânico utilizada no processo de
síntese. Como esperado, o material inorgânico puro apresentou uma maior
quantidade de ferro quando comparado com as outras partículas. As partículas
obtidas através da metodologia de formação in situ apresentaram teor de ferro
superior ao das obtidas pelo método de incorporação devido à maior quantidade de
ferro empregada no processo de síntese in situ. Além disso, as partículas
preparadas com a relação 2:1 (polímero:material inorgânico) apresentaram teor mais
baixo de ferro que as preparadas a 1:1, como esperado, porém essa diminuição na
quantidade de ferro incorporado não foi proporcional à redução na quantidade de
ferro empregado na síntese das partículas.
76
5.5.2 Espectroscopia no infravermelho
Os espectros no infravermelho das partículas contendo polímero são
apresentados na Figura 25. Nos espectros (A) e (B), correspondentes às partículas
preparadas in situ com os polímeros OCMQTS e OCMQTS-Bz respectivamente,
podem ser observadas as bandas dos polímeros de partida em 1560, 1640, 1730 e
3500 cm-1 para a OCMQTS e o conjunto de bandas relativas ao anel aromático para
a OCMQTS-Bz. Os espectros (C), (D), (E) e (F), referentes às partículas preparadas
pela metodologia de incorporação por reticulação em emulsão, apresentam
principalmente as bandas relativas ao polímero de partida citadas anteriormente,
sendo que a presença do anel aromático do polímero OCMQTS-Bz nas partículas
(E) e (F) não é evidenciada nos espectros.
Figura 25: Espectros no infravermelho das partículas magnéticas contendo polímero: (A)
OC in situ, (B) OC-Bz in situ, (C) OC inc 1:1, (D) OC inc 2:1, (E) OC-Bz inc 1:1 e
(F) OC-Bz inc 2:1.
Os materiais preparados pela metodologia de formação in situ apresentam
maior quantidade de material magnético quando comparados às partículas obtidas
por incorporação, o que pode ser observado pelo teor mais alto de ferro e maior
intensidade das bandas correspondentes ao Fe3O4/!-Fe2O3, apresentados no
77
espectro da Figura 19 (página 64), principalmente a banda em aproximadamente
597 cm-1 (ligação Fe–O). Além disso, há a presença das bandas correspondentes
aos contaminantes -FeOOH e -FeOOH, indicando que a presença do polímero
não impediu a formação desses produtos intermediários.
5.5.3 Análise térmica
As curvas TG das partículas magnéticas obtidas com os polímeros e suas
perdas percentuais de massa são apresentadas na Figura 26 e na Tabela 04,
respectivamente.
São observados dois padrões de comportamento bastante distintos entre as
partículas preparadas pelas diferentes metodologias. As partículas obtidas através
da coprecipitação in situ apresentam um perfil de perda de massa semelhante ao
material magnético inorgânico, com uma pequena perda inicial de água até cerca de
110 ¡C, diferindo na posterior perda de massa pela degradação do polímero de, no
máximo, 16,1%.
Figura 26: Curvas TG das partículas magnéticas: (verde) OC in situ, (vermelho) OC-Bz in
situ, (azul escuro) OC inc 1:1, (ocre) OC inc 2:1, (roxo) OC-Bz inc 1:1 e (azul
claro) OC-Bz inc 2:1.
78
Tabela 04: Perda percentual de massa das partículas magnéticas através de TG.
Partículas
Faixa de temperatura (°C)
Perda de massa (%)
OC in situ
180 – 400
16,1
OC-Bz in situ
30 – 110 / 190 – 360
5,9 / 11,3
OC inc 1:1
30 – 110 / 220 – 370
7,9 / 22,1
OC inc 2:1
30 – 110 / 220 – 370
7,2 / 28,9
OC-Bz inc 1:1
30 – 110 / 190 – 360
8,9 / 29,6
OC-Bz inc 2:1
30 – 110 / 190 – 400
6,8 / 31,9
As partículas obtidas por incorporação apresentam uma perda maior de água,
entre 6,8 e 8,9% na faixa de 30 a 110 °C, e a posterior perda de massa pela
degradação do polímero, também maior que nos materiais obtidos pela metodologia
in situ, entre 22,1 e 31,9% na faixa de 190 ou 220 a 360, 370 ou 400 °C,
dependendo da partícula analisada. Além disso, é possível observar que, ao se
comparar as partículas preparadas com o mesmo polímero através dessa
metodologia, os materiais obtidos na proporção 2:1 (polímero:material inorgânico)
têm uma perda maior de massa referente à degradação polimérica, entretanto essa
perda não aparenta ser proporcional à quantidade de polímero. O comportamento de
perda de massa por degradação polimérica foi observado também por Li e
colaboradores (2008b) em partículas magnéticas de Fe3O4 e quitosana, com uma
perda percentual total de 62,2%.
As curvas DSC das partículas magnéticas contendo polímero são
apresentadas na Figura 27. Para todas as partículas há um pico endotérmico por
volta de 100 °C relativo à perda de água. Confirmando as diferenças observadas na
TG, foram obtidos dois perfis distintos para as partículas sintetizadas pelas
diferentes metodologias, sendo que as preparadas in situ possuem perfil mais
semelhante ao material exclusivamente inorgânico, com picos menores.
79
Figura 27: Curvas DSC das partículas magnéticas: (verde) OC in situ, (vermelho) OC-Bz in
situ, (azul escuro) OC inc 1:1, (ocre) OC inc 2:1, (roxo) OC-Bz inc 1:1 e (azul
claro) OC-Bz inc 2:1.
As curvas das partículas preparadas através da metodologia de incorporação
apresentam picos exotérmicos mais intensos por volta de 280 ¡C relativos à
degradação do polímero. Também não há um pico significativo referente à transição
da -Fe2O3 a -Fe2O3 na faixa de 500 ¡C, existente no material magnético
inorgânico. As partículas preparadas com o derivado OCMQTS por incorporação
apresentaram picos exotérmicos em aproximadamente 580 ¡C que podem ser
referentes ao deslocamento dessa transição para uma faixa de temperatura maior,
indicando que a presença do polímero aumenta a estabilidade térmica das partículas
(ZHU et al., 2010).
5.5.4 Análise morfológica
As micrografias em aumento de 500 vezes das partículas magnéticas
preparadas pela metodologia in situ são apresentadas na Figura 28. Apesar da
obtenção de partículas pequenas, ambos os materiais apresentam aglomerados de
partículas com superfície irregular, muito semelhantes ao material magnético
inorgânico.
80
Figura 28: Micrografias eletrônicas de varredura das partículas (A) OC in situ e (B) OC-Bz in
situ em aumento de 500x.
O comportamento de agregação pode ser explicado pela característica
magnética dos materiais e seu reduzido tamanho de partícula. Ma e colaboradores
(2007) também observaram agregação em partículas magnéticas com quitosana
preparadas por metodologia similar.
A Figura 29 apresenta as micrografias das partículas magnéticas preparadas
pela metodologia de incorporação em aumento de 2000 vezes. Da mesma forma
que as partículas preparadas in situ, estas apresentam superfície irregular e
formação de agregados.
81
Figura 29: Micrografias eletrônicas de varredura das partículas (A) OC inc 1:1, (B) OC inc
2:1, (C) OC-Bz inc 1:1 e (D) OC-Bz inc 2:1 em aumento de 2000x.
Não há diferença na superfície e no formato das partículas preparadas nas
diferentes proporções polímero:material magnético inorgânico, entretanto parece
haver menor agregação entre as partículas preparadas na proporção 2:1. Esta
menor agregação pode ser explicada pelas propriedades magnéticas menos
intensas dessas partículas, visto que apresentam uma maior quantidade de
polímero. Utilizando uma metodologia similar, Denkbas e colaboradores (2002)
prepararam microesferas magnéticas de quitosana com tamanho homogêneo,
superfície lisa e pouca agregação. Liang e colaboradores (2007) prepararam
partículas magnéticas revestidas com carboximetilquitosana e observaram que o
revestimento polimérico impediu as interações hidrofóbicas entre as partículas,
evitando a agregação.
5.5.5 Comportamento magnético
As curvas de magnetização dos materiais Fe3O4/!-Fe2O3, OC in situ e OC-Bz
in situ são apresentadas na Figura 30. É possível perceber que o preparo das
partículas com os polímeros reduziu consideravelmente a saturação magnética,
82
indicando a presença de uma quantidade considerável de material não magnético,
porém houve manutenção do comportamento de superparamagnetismo.
Figura 30: Curvas de magnetização dos materiais Fe3O4/!-Fe2O3, OC in situ e OCMQTS-Bz
in situ à temperatura ambiente. No detalhe, a expansão da parte central da
curva.
Os parâmetros magnéticos do material inorgânico e das partículas preparadas
com os polímeros são apresentados na Tabela 05. Todas as partículas preparadas
com polímero, independente da metodologia de preparo, apresentaram redução da
saturação magnética em comparação com as partículas compostas somente por
material inorgânico, indicando a presença de material polimérico (não magnético).
Os materiais obtidos através da metodologia in situ apresentaram saturação
magnética maior que os obtidos por incorporação, devido à maior quantidade de
material inorgânico em relação à quantidade de polímero. A partícula OC-Bz in situ,
dentre os materiais contendo polímero, foi a que apresentou o comportamento de
superparamagnetismo mais acentuado, pois além de uma saturação alta, tem baixa
magnetização remanescente e coercividade, indicando a desmagnetização do
material assim que o campo magnético é removido, sendo assim um bom candidato
para aplicações terapêuticas como na hipertermia induzida magneticamente e na
liberação vetorizada de agentes terapêuticos.
83
Tabela 05: Parâmetros magnéticos obtidos a partir da curva de magnetização das
partículas à temperatura ambiente.
Saturação
magnética
(emu g-1)
Magnetização
remanescente
(emu g-1)
Coercividade
(Oe)
54,4
3,1
25,7
60,8
3,6
26,5
OC in situ
32,8
2,8
41,3
OC-Bz in situ
34,2
0,5
5,1
OC inc 1:1
18,6
0,4
15,4
OC inc 2:1
20,0
ND
ND
OC-Bz inc 1:1
24,1
0,6
12,3
OC-Bz inc 2:1
18,4
1,3
32,3
Partículas
magnéticas
Fe3O4/!-Fe2O3
lote (B)
Fe3O4/!-Fe2O3
lote (C)
ND: não determinado
Todas as partículas apresentadas na Tabela 05 foram preparadas com o lote
(B) de Fe3O4/!-Fe2O3, exceto a OC inc 2:1, preparada com o lote (C). Isso explica
seu maior valor de saturação magnética quando comparada à OC inc 1:1 que,
apesar de conter uma quantidade menor de polímero em relação ao material
inorgânico, apresenta menor valor de saturação decorrente da menor saturação do
material magnético de partida. Entre as partículas OC-Bz inc 1:1 e OC-Bz inc 2:1,
ambos preparados a partir do lote (B) de Fe3O4/!-Fe2O3, é possível observar uma
saturação maior do material que contém menos polímero, conforme esperado.
O tamanho de partícula foi determinado por XRD para os materiais OC in situ
e OC inc 1:1, de 7 nm e 15,6 nm, respectivamente, indicando que a presença do
polímero durante a síntese do material magnético, como ocorre na metodologia in
situ, possibilita a obtenção de partículas menores por evitar a agregação. A faixa de
tamanho ideal para administração intravenosa é entre 10 e 100 nm, pois as
nanopartículas com estas dimensões permanecem mais tempo na circulação
sanguínea por evitar o sistema reticuloendotelial e, ao mesmo tempo, são pequenas
84
o suficiente para penetrar nos capilares dos tecidos em que o fármaco será liberado
(PHILIPPOVA et al., 2011).
Todos os materiais apresentaram menor saturação magnética e menor
diâmetro médio que as partículas preparadas por Liang e colaboradores (2010)
utilizando OCMQTS quaternizada e colesterol, com saturação magnética de 40 emu
g-1 e tamanho de 52,4 nm para as partículas com apenas uma camada de polímero
e colesterol.
Zhang e colaboradores (2010) prepararam partículas magnéticas de Fe3O4 e
quitosana com saturação magnética de cerca de 48,6 emu g-1 e com tamanho
mínimo de 58 nm, também maiores que as obtidas neste trabalho. Entretanto, as
partículas preparadas pela metodologia de incorporação apresentaram saturação
magnética semelhante às sintetizadas por Donadel e colaboradores (2008) com
Fe3O4 e quitosana, entre 16 e 22 emu g-1, dependendo da proporção de polímero e
material inorgânico utilizada. Além disso, os autores prepararam partículas de maior
diâmetro, entre 0,6 e 13 µm, e coercividade muito maior, entre 308 e 311 Oe,
indicando partículas com característica paramagnética menos pronunciada.
Em geral, a metodologia in situ permite a obtenção de nanopartículas
magnéticas menores e com características de superparamagnetismo mais
pronunciadas, enquanto que as nanopartículas preparadas pela metodologia de
incorporação apresentam diâmetro médio maior, porém com uma distribuição de
tamanho mais homogênea. Dessa forma, a escolha de determinada metodologia
para o preparo das nanopartículas magnéticas depende das características
necessárias para a aplicação desejada. A diferença nos valores de saturação
magnética das nanopartículas quando comparadas as duas metodologias de síntese
é devida provavelmente à maior quantidade de material inorgânico presente nos
materiais preparados in situ. Com a finalidade de verificar a influência da
metodologia de preparo das nanopartículas nos valores dos parâmetros magnéticos,
seria necessário realizar a síntese das nanopartículas pelo método de incorporação
na proporção 0,5:1 (polímero:material magnético inorgânico), pois esta é a
proporção utilizada no preparo das nanopartículas pela metodologia de formação in
situ.
85
5.5.6 Espectroscopia Mössbauer
A espectroscopia Mössbauer foi utilizada para a caracterização apenas das
partículas OC in situ e OC inc 1:1 a fim de verificar se a metodologia de síntese das
partículas
influenciaria
significativamente
na
distribuição
dos
componentes
magnéticos dos materiais. Os espectros Mössbauer das partículas OC in situ e OC
inc 1:1 a 77 e 300 K são apresentados nas Figuras 31 e 32, respectivamente. Os
parâmetros hiperfinos obtidos a partir dos espectros são apresentados na Tabela 06.
Os espectros Mössbauer de ambas as partículas são similares aos do
material magnético inorgânico, principalmente da partícula OC inc 1:1, como
esperado, pois na metodologia de incorporação o material magnético utilizado é
preparado previamente e posteriormente incorporado. Para ambas as partículas,
não há componentes adicionais nos espectros e os valores de parâmetros hiperfinos
são próximos aos da mistura de óxidos de ferro.
86
Figura 31: Espectros Mössbauer da partícula OC in situ a (A) 77 K e (B) 300 K. As linhas
coloridas representam as diferentes espécies presentes no material.
87
Figura 32: Espectros Mössbauer da partícula OC inc 1:1 a (A) 77 K e (B) 300 K. As linhas
coloridas representam as diferentes espécies presentes no material.
88
Tabela 06: Parâmetros hiperfinos de espectroscopia Mössbauer dos materiais OC in situ e
OC inc 1:1 a 77 e 300 K.
Temperatura
(K)
" (mm s-1)
# (mm s-1)
Razão das
Bhf (T)
espécies (%)
OC in situ
77
300
0,46
0,00
36,1
59
0,44
0,72
0,0
41
0,36
0,00
24,8
20
0,33
0,65
0,0
80
OC inc 1:1
77
300
0,45
0,00
47,1
93
0,47
0,85
0,0
7
0,33
0,00
37,1
59
0,34
0,62
0,0
41
A principal diferença entre os espectros das partículas analisadas é em
relação à razão dos dois componentes, como pode ser observado na Tabela 06.
Esta diferença pode ser decorrente dos diferentes tamanhos das partículas e/ou da
sua dispersão nas amostras estudadas. A maior evidência do dubleto nestes
espectros quando comparados aos do material magnético inorgânico indica que há
mais partículas no estado superparamagnético, indicando que a presença do
polímero permite uma melhor separação das partículas, facilitando sua transição
para o estado superparamagnético.
Comparando-se as partículas obtidas pelos diferentes métodos, verifica-se
que a metodologia de síntese in situ leva à formação de partículas com uma fração
superparamagnética mais significativa, indicando que a presença do polímero na
síntese do material magnético pode reduzir o tamanho das partículas ou a interação
entre estas. Morales e colaboradores (2008) prepararam partículas de magnetita e
maguemita em matrizes de alginato de cálcio cujos espectros também apresentaram
um
dubleto
indicativo
destes
óxidos
de
ferro
com
características
superparamagnéticas, obtendo partículas menores quando o material magnético foi
sintetizado na presença do polímero.
89
5.6 Incorporação da indometacina e caracterização das partículas
contendo o fármaco
5.6.1 Teor e eficiência de incorporação
Uma metodologia ideal de incorporação de substâncias biologicamente ativas
em partículas magnéticas para aplicações terapêuticas deve permitir a obtenção de
sistemas com teor adequado de fármaco empregando quantidades moderadas da
substância a ser incorporada, caracterizando, dessa forma, um processo com altos
valores de eficiência de incorporação. Além disso, é importante garantir que, caso
sejam empregados solventes ou outros reagentes tóxicos, os mesmos sejam
totalmente removidos após o processo de incorporação.
A incorporação da indometacina nas partículas magnéticas foi realizada
através de duas metodologias: evaporação do solvente e incorporação in situ do
fármaco e foram obtidos os lotes de nanopartículas apresentados na Tabela 07.
Tabela 07: Partículas magnéticas contendo indometacina de acordo com a metodologia de
incorporação do fármaco e proporção polímero:material inorgânico.
Lote
Metodologia
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev
Evaporação
Partículas* ou polímeros**
empregados e proporção
polímero:material inorgânico
Fe3O4/!-Fe2O3
OC in situ/INDev
Evaporação
OC in situ
OC-Bz in situ/INDev
Evaporação
OC-Bz in situ
OC inc 1:1/INDev
Evaporação
OC inc 1:1
OC inc 2:1/INDev
Evaporação
OC inc 2:1
OC-Bz inc 1:1/INDev
Evaporação
OC-Bz inc 1:1
OC-Bz inc 2:1/INDev
Evaporação
OC-Bz inc 2:1
OC 1:1/INDis
Incorporação in situ
OCMQTS (1:1)
OC-Bz 1:1/INDis
Incorporação in situ
OC-Bz (1:1)
OC-Bz 2:1/INDis
Incorporação in situ
OC-Bz (2:1)
* Quando empregada a metodologia de evaporação.
** Quando empregada a metodologia de incorporação in situ.
90
Para quantificação da indometacina contida nas partículas é importante que a
extração do fármaco do material seja completa, sendo fundamental a utilização de
um solvente ou sistema de solventes em que o fármaco apresente alta solubilidade.
O etanol foi utilizado como solvente por apresentar uma solubilidade adequada (1 g
de indometacina é solúvel em 30 mL de etanol) (GELONE; GENNARO, 2006) e o
procedimento foi repetido para garantir a completa extração do fármaco contido nas
partículas. Este procedimento foi empregado para calcular o teor de indometacina
nas partículas e a eficiência de incorporação do processo. Os resultados obtidos são
apresentados na Tabela 08.
Tabela 08: Teor e eficiência de incorporação do fármaco nas partículas magnéticas obtidas
pela incorporação da indometacina através da metodologia de evaporação do
solvente.
Partículas
Teor (%)
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev
3,4 ± 0,1
Eficiência de
incorporação (%)
33,8 ± 0,7
OC in situ/INDev
7,5 ± 0,5
86,2 ± 6,0
OC-Bz in situ/INDev
6,6 ± 0,2
72,2 ± 1,9
OC inc 1:1/INDev
3,0 ± 0,1
33,7 ± 0,9
OC inc 2:1/INDev
4,4 ± 0,1
50,0 ± 1,4
OC-Bz inc 1:1/INDev
6,6 ± 0,2
74,8 ± 2,8
OC-Bz inc 2:1/INDev
5,3 ± 0,2
60,8 ± 2,8
A metodologia de incorporação do fármaco por evaporação consiste na
adsorção simples da indometacina na superfície das partículas por agitação vigorosa
de uma dispersão das partículas com uma solução do fármaco, posterior
aquecimento até a evaporação do clorofórmio, separação do material e secagem a
vácuo das partículas. Um procedimento semelhante foi empregado na incorporação
da indometacina em nanopartículas magnéticas dispersíveis em água contendo
ácido oleico e revestidas com metiléter de polietilenoglicol-poli(!-caprolactona)
(mPEG-PCL), com a obtenção de valores de eficiência de incorporação entre 27 e
33%, mais baixos que os encontrados para as partículas magnéticas obtidas neste
trabalho em que a indometacina foi incorporada por evaporação, inclusive as
91
preparadas exclusivamente com material inorgânico. Entretanto, os sistemas obtidos
por eles apresentaram teor entre 36 e 57%, superior aos valores apresentados na
Tabela 08, provavelmente devido à maior quantidade de fármaco utilizado no
processo de incorporação (RUTNAKORNPITUK et al., 2009).
É possível observar que para as partículas em que a incorporação do fármaco
foi realizada pelo método de evaporação do solvente a presença do polímero
melhorou a eficiência do processo, com exceção da partícula OC inc 1:1/INDev, que
apresentou eficiência muito semelhante ao material Fe3O4/!-Fe2O3/INDev, em que a
partícula foi preparada apenas com material inorgânico.
As partículas preparadas in situ e com o fármaco incorporado por evaporação
do solvente (OC in situ/INDev e OC-Bz in situ/INDev) apresentaram, em geral, maior
eficiência de incorporação do fármaco quando comparados aos outros materiais.
As partículas preparadas através da metodologia de incorporação e com a
indometacina incorporada pela técnica de evaporação do solvente apresentaram
maior eficiência de incorporação quando obtidas a partir do derivado benzilado em
comparação com a OCMQTS. Os materiais obtidos a partir da OCMQTS
apresentaram
maior
eficiência
quando
foi
empregada
a
proporção
2:1
(polímero:material inorgânico), demonstrando que a presença de uma maior
quantidade desse polímero é importante para uma maior eficiência. Entretanto, as
partículas preparadas a partir do derivado OCMQTS-Bz apresentaram um
comportamento inverso, o que pode ser explicado pela maior interação entre as
partículas entre si do que entre as partículas e a indometacina. Este comportamento
está associado principalmente às interações hidrofóbicas, em decorrência da
elevada quantidade de polímero nas partículas preparadas na proporção 2:1.
A interação entre a indometacina e as partículas contendo polímero pode
ocorrer através de ligações de hidrogênio, formação de complexos entre o
grupamento amino protonado do polímero e o grupamento carboxilato do fármaco e,
no caso do derivado benzilado, interações hidrofóbicas (MI et al., 2002). Os maiores
valores de eficiência de incorporação obtidos para os materiais OC in situ/INDev e
OC-Bz in situ/INDev podem ser explicados pelo menor tamanho das partículas
preparadas pela metodologia de formação in situ e provavelmente pela interação
através da interação eletrostática entre os grupamentos NH3+ dos polímeros e COO-
92
da indometacina. Este efeito é mais pronunciado para as partículas preparadas com
a OCMQTS devido à maior quantidade de grupamentos NH2 livres para protonação
e complexação, visto que parte destes grupamentos estão substituídos com o radical
benzil no derivado OCMQTS-Bz. Esta forma de interação não ocorre para as
partículas preparadas através da metodologia de formação por incorporação devido
ao processo de reticulação dos grupamentos amino com o glutaraldeído, reduzindo
a interação entre as partículas e o fármaco.
A metodologia de incorporação in situ da indometacina, conhecida como
reticulação em emulsão, consiste na adição do fármaco durante o preparo das
partículas, diferentemente da técnica anteriormente descrita, na qual a incorporação
é realizada após a preparação das partículas e o fármaco se encontra apenas na
superfície do material. A incorporação in situ possibilita a deposição da indometacina
na superfície e no interior da camada polimérica, enquanto que na metodologia de
evaporação do solvente o fármaco encontra-se apenas depositado na superfície das
partículas. Os valores de teor e eficiência das partículas obtidas pela incorporação in
situ da indometacina são apresentados na Tabela 09.
Tabela 09: Teor e eficiência de incorporação do fármaco nas partículas magnéticas obtidas
através da incorporação in situ da indometacina.
Partículas
Teor (%)
OC 1:1/INDis
6,8 ± 0,4
Eficiência de
incorporação (%)
30,2 ± 1,7
OC-Bz 1:1/INDis
6,6 ± 0,1
28,3 ± 0,3
OC-Bz 2:1/INDis
3,4 ± 0,4
28,5 ± 3,5
Os materiais obtidos através dessa metodologia apresentaram eficiência de
incorporação reduzida quando comparados aos preparados por evaporação do
solvente em decorrência do maior volume de solução empregado durante o
processo, o que faz com que provavelmente uma quantidade maior de indometacina
permaneça em solução e não seja incorporada nas partículas. Os materiais
preparados na proporção 1:1 apresentaram teor semelhante aos obtidos por
evaporação do solvente apesar da diferença na eficiência, pois a quantidade de
indometacina utilizada no processo de incorporação in situ foi propositalmente maior,
93
visto que a redução da eficiência do processo era esperada. A inserção do
grupamento hidrofóbico no polímero empregado e a relação polímero:material
inorgânico não exerceram influência na eficiência do processo de incorporação por
esta metodologia, apenas o teor do material OC-Bz 2:1/INDis foi reduzido quando
comparado ao OC-Bz 1:1/INDis porque a relação entre a quantidade de fármaco e a
quantidade de material polimérico e inorgânico foi reduzida. Entretanto, a eficiência
de incorporação do fármaco para estes materiais foi muito semelhante.
Wilson e colaboradores (2009) prepararam partículas magnéticas de
quitosana contendo tacrina por uma metodologia semelhante para liberação
vetorizada no cérebro, obtendo valores muito superiores de eficiência de
incorporação do fármaco (entre 51 e 78%). Saravanan e colaboradores (2004)
prepararam microesferas magnéticas de gelatina e diclofenaco de sódio através da
metodologia de reticulação com glutaraldeído em emulsão, resultando numa
eficiência de incorporação de 89%.
Foram preparadas partículas magnéticas de OCMQTS quaternizada com
indometacina incorporada através de uma metodologia com formação de emulsão,
obtendo-se valores de eficiência de incorporação de até 95%, muito superiores aos
observados para os materiais preparados com a OCMQTS e a OCMQTS-Bz. Esta
maior eficiência de incorporação pode ser atribuída à formação de complexo entre a
porção carregada positivamente do polímero e a carboxila carregada negativamente
da indometacina (LIANG et al., 2010).
5.6.2 Espectroscopia no infravermelho
Os espectros no infravermelho da indometacina e das partículas magnéticas
com o fármaco incorporado pela metodologia de evaporação do solvente são
apresentados na Figura 33. As principais bandas no espectro da indometacina (A)
são em 753 cm-1, uma banda fraca correspondente à ligação C–Cl, e duas bandas
em 1717 e 1692 cm-1 referentes às carbonilas do fármaco (KANG et al., 2008; CHEN
et al., 2009).
94
Figura 33: Espectros no infravermelho dos materiais (A) Indometacina, (B) Fe3O4/!Fe2O3/INDev, (C) OC in situ/INDev, (D) OC-Bz in situ/INDev, (E) OC inc
1:1/INDev, (F) OC inc 2:1/INDev, (G) OC-Bz inc 1:1/INDev e (H) OC-Bz inc
2:1/INDev.
Os espectros das partículas magnéticas contendo o fármaco, de (B) a (H),
apresentam principalmente as bandas características das partículas utilizadas. As
bandas
características
das
carbonilas
da
indometacina
aparecem
apenas
fracamente nos materiais devido ao baixo teor de fármaco nas partículas e não são
evidenciadas nos espectros em decorrência da presença de bandas próprias dos
polímeros absorvendo em comprimentos de onda muito próximos. A banda
correspondente à ligação C–Cl, por sua vez, não é observada nos espectros de
nenhuma das partículas.
A Figura 34 apresenta os espectros dos materiais obtidos pela incorporação
in situ do fármaco através da técnica de reticulação em emulsão.
95
Figura 34: Espectros no infravermelho dos materiais (A) OC 1:1/INDis, (B) OC-Bz 1:1/INDis
e (C) OC-Bz 2:1/INDis.
As bandas relativas à indometacina também não são claramente observadas
nos espectros desses materiais devido ao baixo teor de fármaco. É possível
observar nos três espectros a presença das bandas referentes ao material
inorgânico anteriormente citadas. No espectro (A) do material OC 1:1/INDis, podem
ser observadas as bandas relativas à forma salina da OCMQTS em decorrência do
aumento do pH da dispersão polimérica no preparo do material, sendo o principal
diferencial a banda em 1598 cm-1, correspondente ao grupo –COONa (CHEN;
PARK, 2003). Os espectros (B) e (C) correspondem aos materiais preparados com a
OCMQTS-Bz
na
proporção
de
1:1
e
2:1
(polímero:material
inorgânico)
respectivamente. Nestes espectros, pode-se observar uma razão indicativa dessa
proporção polímero:material inorgânico entre a banda por volta de 1560 cm-1,
referente ao polímero utilizado, e a banda em 597 cm-1, referente ao material
magnético. O espectro (B) apresenta uma razão entre essas bandas de 1,3,
enquanto que essa razão no espectro (C) é de 2,6, confirmando a maior quantidade
de polímero nessa partícula.
96
5.6.3 Análise térmica
A Figura 35 apresenta as curvas TG da indometacina e das partículas
magnéticas com o fármaco incorporado através da técnica de evaporação do
solvente. Na curva TG do fármaco (verde), é possível observar a perda quase total
de massa da indometacina, indicando a sua degradação.
Figura 35: Curvas TG da indometacina e das partículas magnéticas contendo o fármaco
incorporado pela metodologia de evaporação do solvente: (verde) Indometacina,
(vermelho) Fe3O4/-Fe2O3/INDev, (azul escuro) OC in situ/INDev, (ocre) OC-Bz
in situ/INDev, (roxo) OC inc 1:1/INDev, (azul claro) OC inc 2:1/INDev, (bordô)
OC-Bz inc 1:1/INDev e (preto) OC-Bz inc 2:1/INDev.
Da mesma forma que para as partículas sem o fármaco, há uma pequena
perda inicial de massa entre 30 e 110 ¡C, referente à perda de água. Entre 220 e
400 ¡C há a perda de massa correspondente à degradação da indometacina
incorporada nas partículas, comprovando a sua presença nos materiais. Além disso,
também há perda total menor nas partículas magnéticas inorgânicas e nas
preparadas pela metodologia in situ.
As curvas DSC dos mesmos materiais e da mistura física de indometacina e
de material magnético inorgânico são apresentados na Figura 36. As curvas DSC da
indometacina e da mistura física apresentam um pico endotérmico em 162 ¡C
referente à degradação da forma cristalina do fármaco. Este pico não é encontrado
nas curvas DSC das partículas contendo o fármaco, indicando que a indometacina
está incorporada nos materiais em sua forma amorfa (XIN et al., 2010).
97
Figura 36: Curvas DSC da indometacina e das partículas magnéticas contendo o fármaco
incorporado através da metodologia de evaporação do solvente: (verde)
Indometacina, (vermelho) Fe3O4/-Fe2O3/INDev, (azul escuro) OC in situ/INDev,
(ocre) OC-Bz in situ/INDev, (roxo) OC inc 1:1/INDev, (azul claro) OC inc
2:1/INDev, (bordô) OC-Bz inc 1:1/INDev e (preto) OC-Bz inc 2:1/INDev. No
detalhe, a curva DSC da mistura física de indometacina e Fe3O4/-Fe2O3 (5,0%).
A Figura 37 apresenta as curvas TG da indometacina e dos materiais com o
fármaco incorporado através da técnica de incorporação in situ. Do mesmo modo
que para as partículas com o fármaco incorporado por evaporação do solvente, há a
perda referente à degradação da indometacina incorporada.
98
Figura 37: Curvas TG da indometacina e das partículas magnéticas contendo o fármaco
incorporado através da metodologia de incorporação in situ: (verde)
Indometacina, (vermelho) OC 1:1/INDis, (azul) OC-Bz 1:1/INDis e (ocre) OC-Bz
2:1/INDis.
As curvas DSC desses mesmos materiais e da mistura física de indometacina
e de material magnético inorgânico são apresentadas na Figura 38. Observa-se o
desaparecimento do pico relativo à forma cristalina da indometacina, indicando sua
incorporação nos materiais na sua forma amorfa.
Figura 38: Curvas DSC da indometacina e das partículas magnéticas contendo o fármaco
incorporado através da metodologia de incorporação in situ: (verde)
Indometacina, (vermelho) OC 1:1/INDis, (azul) OC-Bz 1:1/INDis e (ocre) OC-Bz
2:1/INDis. No detalhe, a curva DSC da mistura física de indometacina e Fe3O4/Fe2O3 (5,0%).
99
Tais resultados são semelhantes aos obtidos por Kang e colaboradores
(2008) para micropartículas poliméricas de ácido poliláctico e PLGA com
indometacina incorporada. O pico correspondente à degradação da forma cristalina
do fármaco também está ausente nas curvas DSC das micropartículas com o ativo,
indicando a incorporação da indometacina na sua forma amorfa.
5.6.4 Análise morfológica
Apenas os materiais com o fármaco preparados através da metodologia de
incorporação in situ da indometacina foram analisados por MEV, pois acredita-se
que as partículas com o fármaco incorporado pelo método de evaporação do
solvente não teriam sua superfície e seu tamanho significativamente alterados. A
micrografia da partícula OC 1:1/INDis está apresentada na Figura 39. É possível
observar um aglomerado de partículas com superfície irregular e a presença de
cristais de indometacina, indicando que pelo menos parte do fármaco não foi
efetivamente incorporada nas partículas, mas sim apenas depositada no material.
Figura 39: Micrografia eletrônica de varredura do material OC 1:1/INDis em aumento de
3000x.
As micrografias das partículas preparadas com o derivado benzilado pelo
mesmo método de incorporação do fármaco são apresentadas na Figura 40. Neste
caso, também é possível observar a presença de agregados de partículas,
100
entretanto não há a presença de cristais de fármaco, indicando que a indometacina
foi
efetivamente
incorporada
nas
partículas
independente
da
proporção
polímero:material magnético empregada. A melhor incorporação do fármaco nos
materiais preparados com a OCMQTS-Bz pode ser explicada pela presença do
grupamento aromático neste derivado, que permitiu maior interação entre a
indometacina e as partículas magnéticas.
Figura 40: Micrografias eletrônicas de varredura dos materiais (A) OC-Bz 1:1/INDis e (B)
OC-Bz 2:1/INDis em aumento de 3000x.
Wilson e colaboradores (2009) prepararam partículas magnéticas de
quitosana com tacrina através de uma metodologia semelhante, obtendo
micropartículas relativamente esféricas com tamanho de 5 ± 2 µm, caracterizando
uma distribuição de tamanho irregular.
A técnica de microscopia de transmissão eletrônica (TEM) foi utilizada para
caracterização de apenas dois materiais, OC-Bz in situ/INDev e OC-Bz inc
2:1/INDev, para verificar se a metodologia de preparo das partículas exerce
101
influência considerável na sua morfologia e no seu tamanho. A Figura 41 apresenta
as micrografias destes materiais em dois aumentos.
Figura 41: Micrografias eletrônicas de transmissão dos materiais (A) OC-Bz in situ/INDev e
(B) OC-Bz inc 2:1/INDev. Os detalhes apresentam micrografias das partículas
em aumento maior.
Na micrografia da OC-Bz in situ/INDev, observam-se partículas menos
agregadas e sem separação perceptível entre a parte magnética inorgânica e o
polímero, confirmando a coprecipitação do material magnético nos poros do
polímero. O material OC-Bz inc 2:1/INDev, por sua vez, apresenta-se mais agregado
e, no detalhe, observa-se o núcleo magnético mais escuro e compacto com o
revestimento polimérico, mais claro.
Através dessas micrografias foi possível avaliar também o diâmetro médio
das partículas e sua distribuição do tamanho, representada na Figura 42. O material
OC-Bz in situ/INDev apresenta partículas menores, principalmente entre 5 e 12 nm,
com diâmetro médio de 9,34 nm. As partículas OC-Bz inc 2:1/INDev apresentam
uma distribuição de tamanho mais homogênea, predominantemente entre 5 e 15
nm, com diâmetro médio de 12,94 nm. Estes resultados confirmam o menor
tamanho das partículas magnéticas preparadas pela metodologia in situ quando
comparadas às obtidas por incorporação, sugerindo-se que a presença do polímero
durante a síntese do material magnético pode impedir o crescimento das partículas.
102
Figura 42: Distribuição do tamanho de partícula das partículas (A) OC-Bz in situ/INDev e (B)
OC-Bz inc 2:1/INDev determinada a partir das micrografias de TEM.
Além disso, comparando-se com o tamanho obtido através da caracterização
do comportamento magnético, verificou-se que a incorporação do fármaco pela
metodologia de evaporação do solvente não resulta num aumento significativo do
tamanho das partículas.
5.6.5 Comportamento magnético
É de fundamental importância que as partículas magnéticas empregadas para
a liberação vetorizada de fármacos mantenham suas propriedades magnéticas após
a incorporação do ativo. O comportamento magnético dos materiais com a
indometacina incorporada foi avaliado apenas para as partículas OC-Bz inc
2:1/INDev e OC-Bz 2:1/INDis e está representado na Figura 43 com as curvas de
magnetização da partícula OC-Bz inc 2:1 e do material magnético inorgânico de
partida
utilizado
para
o
preparo
destas
partículas
para
comparação
do
comportamento. Os parâmetros magnéticos obtidos a partir das curvas de
magnetização são apresentados na Tabela 10.
103
Figura 43: Curvas de magnetização das partículas magnéticas Fe3O4/!-Fe2O3 e OC-Bz inc
2:1 e dos materiais contendo indometacina OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz
2:1/INDis. A escala do eixo y à direita corresponde à partícula Fe3O4/!-Fe2O3 e à
esquerda é referente aos outros materiais.
Tabela 10: Parâmetros magnéticos obtidos a partir da curva de magnetização da OC-Bz
inc 2:1 e dos materiais contendo indometacina OC-Bz inc 2:1/INDev e OCBz 2:1/INDis à temperatura ambiente.
Partículas
magnéticas
Saturação
magnética
(emu/g)
Magnetização
remanescente
(emu/g)
Coercividade
(Oe)
OC-Bz inc 2:1
18,4
1,3
32,3
OC-Bz inc 2:1/INDev
16,9
1,0
27,6
OC-Bz 2:1/INDis
16,3
0,9
24,6
Observa-se que, independente da metodologia utilizada para incorporação da
indometacina,
houve
pouca
alteração
nas
curvas
de
magnetização
e,
consequentemente, nos parâmetros magnéticos dos materiais contendo o fármaco
quando comparados à partícula magnética OC-Bz inc 2:1, com apenas uma redução
nos valores de todos os parâmetros. Assim, verifica-se que os materiais mantêm
suas características magnéticas mesmo após a incorporação do fármaco, o que é
adequado para sua aplicação na vetorização de agentes terapêuticos.
104
5.6.6 Espectroscopia Mössbauer
A caracterização por espectroscopia Mössbauer dos materiais magnéticos
contendo indometacina foi realizada apenas para as partículas OC-Bz in situ/INDev,
OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz 2:1/INDis para comparação entre as diferentes
metodologias de incorporação do fármaco e os espectros obtidos estão
apresentados nas Figuras 44, 45 e 46, respectivamente. Os parâmetros hiperfinos
referentes a estes mesmos materiais estão listados na Tabela 11.
Quando comparados aos espectros das partículas sem o fármaco, não foram
observadas diferenças significativas entre os padrões dos espectros.
105
Figura 44: Espectros Mössbauer do material OC-Bz in situ/INDev a (A) 77 K e (B) 300 K. As
linhas coloridas representam as diferentes espécies presentes no material.
106
Figura 45: Espectros Mössbauer do material OC-Bz inc 2:1/INDev a (A) 77 K e (B) 300 K.
As linhas coloridas representam as diferentes espécies presentes no material.
107
Figura 46: Espectros Mössbauer do material OC-Bz 2:1/INDis a (A) 77 K e (B) 300 K. As
linhas coloridas representam as diferentes espécies presentes no material.
108
Tabela 11: Parâmetros hiperfinos de espectroscopia Mössbauer dos materiais OC-Bz in
situ/INDev, OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz 2:1/INDis a 77 e 300 K.
Temperatura
(K)
" (mm s-1)
# (mm s-1)
Bhf (T)
Razão das
espécies (%)
OC-Bz in situ/INDev
77
300
0,43
0,01
45,2
73
0,40
0,77
0,0
27
0,27
0,01
34,0
53
0,33
0,67
0,0
47
OC-Bz inc 2:1/INDev
77
0,46
0,02
50,5
300
0,34
0,01
43,4
90
0,18
0,54
0,0
10
OC-Bz 2:1/INDis
77
0,46
0,01
50,5
300
0,34
0,02
43,7
87
0,40
0,55
0,0
13
As principais diferenças são novamente observadas entre os materiais OC-Bz
in situ/INDev e os outros dois materiais caracterizados por esta técnica, indicando
que a metodologia de incorporação do fármaco não exerce influência no padrão dos
espectros e confirmando que a metodologia de preparo das partículas interfere
nestas características. Os materiais OC-Bz inc 2:1/INDev e OC-Bz 2:1/INDis
apresentam espectros a 77 K compostos somente de sextetos característicos de
componentes magnéticos, enquanto que a 300 K os espectros apresentam 10% e
13% de ferro no estado superparamagnético, representado pelos dubletos. O
material OC-Bz in situ/INDev, por sua vez, apresenta uma proporção menor do
componente magnético, representado pelo sexteto, com uma diminuição de 73% a
77 K para 53% a 300 K, indicando que este material possui partículas menores e
menos aglomeradas que as partículas magnéticas sintetizadas na ausência de um
polímero.
109
5.7 Liberação in vitro
Estudos de liberação in vitro são fundamentais para determinar se a interação
entre o fármaco e o sistema utilizado, neste caso as partículas magnéticas, é
reversível, bem como para estimar a taxa de liberação do ativo e, dessa forma,
prever a quantidade de fármaco a ser liberado e o tempo que decorrerá para que
essa substância esteja disponível para ação no organismo.
Para a liberação magneticamente vetorizada é importante que a maior
quantidade do ativo seja liberada no local desejado, ou seja, a taxa de liberação
deve ser suficientemente lenta para que as partículas contendo o fármaco possam
atingir o sítio alvo e então liberar a substância. Entretanto, também não é desejado
que a liberação seja muito lenta, pois isso implicaria na manutenção do campo
magnético externo posicionado no local afetado durante um período de tempo muito
longo.
A Figura 47 apresenta o perfil de liberação em FCS da indometacina
incorporada nas partículas magnéticas através do método de evaporação do
solvente. Observa-se que todas as partículas proporcionaram uma liberação inicial
rápida até aproximadamente duas horas, provavelmente correspondente à presença
do fármaco apenas depositado na superfície das nanopartículas, seguida de uma
liberação lenta e manutenção da quantidade de fármaco liberado, com um
percentual de liberação entre 55% (OC inc 2:1/INDev) e 85% (Fe3O4/!-Fe2O3/INDev)
em cinco horas. É possível afirmar que há interação entre as partículas e o fármaco
pela diferença entre o perfil de dissolução da indometacina livre e da liberação da
substância incorporada nas partículas. Considerando que o tempo normal de
circulação sanguínea é de aproximadamente um minuto (SILVERTHORN, 2003), é
possível notar que todos os materiais apresentam um tempo adequado de liberação,
suficiente para que as partículas atinjam o local desejado para a ação.
Como esperado, o material Fe3O4/!-Fe2O3/INDev apresentou a maior
quantidade de indometacina liberada, indicando uma interação mais fraca entre o
material magnético inorgânico e o fármaco. Da mesma forma que observado na
eficiência de incorporação, o perfil de liberação do fármaco incorporado no material
OC inc 1:1/INDev demonstra uma baixa interação entre a indometacina e a partícula,
110
pois é o sistema contendo polímero que apresenta a eficiência de incorporação mais
baixa, liberação mais rápida de 50% do fármaco incorporado e o maior percentual de
fármaco liberado no período avaliado.
Figura 47: Perfis de dissolução e liberação da indometacina em FCS pH 7,4 a 37 °C
incorporada nas partículas magnéticas pela metodologia de evaporação do
solvente. As linhas representam apenas a tendência do processo e as barras de
erro representam o desvio padrão para a duplicata.
Entre as partículas preparadas in situ e com o fármaco incorporado por
evaporação do solvente, o material OC in situ/INDev liberou o fármaco mais
rapidamente que o OC-Bz in situ/INDev (50% do fármaco liberado em 90 e 160
minutos, respectivamente), apesar da maior eficiência de incorporação do primeiro.
Acredita-se que a interação fármaco-polímero nestes sistemas ocorra principalmente
através da interação entre os grupamentos NH3+ dos polímeros e COO- da
indometacina, como discutido anteriormente. Desse modo, sugere-se que esta
interação seja mais fraca que a hidrofóbica, proporcionando uma liberação mais
rápida do fármaco contido nas partículas preparadas com o derivado não benzilado.
Comparando-se as partículas obtidas por incorporação e com o fármaco
incorporado por evaporação do solvente, percebe-se uma grande diferença de
comportamento entre os materiais OC inc 1:1/INDev e OC inc 2:1/INDev. Como
pode ser observado pelos perfis, a maior quantidade de OCMQTS nas partículas
111
dificulta a liberação da indometacina, promovendo uma liberação mais lenta (50% do
fármaco liberado em 60 e 160 minutos, respectivamente) a partir das partículas
preparadas com maior quantidade de polímero. Entre os materiais OC-Bz inc
1:1/INDev e OC-Bz inc 2:1/INDev observa-se comportamento oposto, condizente
com os valores de eficiência de incorporação que indicam uma maior interação entre
o fármaco e as partículas obtidas com uma quantidade menor de OCMQTS-Bz. Este
comportamento reforça a afirmação de que há uma maior interação entre as
partículas OC-Bz inc 2:1 entre si que entre as partículas e a indometacina.
Guo e colaboradores (2010) incorporaram indometacina na sua forma sódica
em partículas poliméricas magnéticas através de metodologia similar e estudaram
sua liberação em meios com pH de 4,5 a 7,4. Foi observada uma liberação
percentual baixa em valores mais altos de pH (cerca de 20%), com o aumento da
quantidade liberada em valores de pH mais baixos.
Os perfis de liberação da indometacina incorporada nos materiais OC
1:1/INDis, OC-Bz 1:1/INDis e OC-Bz 2:1/INDis são mostrados na Figura 48. O
percentual de fármaco liberado em cinco horas foi semelhante aos materiais obtidos
por evaporação do solvente, permanecendo entre 65% (OC 1:1/INDis e OC-Bz
1:1/INDis) e 80% (OC-Bz 2:1/INDis). O material preparado com o derivado
OCMQTS-Bz em maior proporção apresentou liberação mais rápida de 50% do
fármaco quando comparado aos outros materiais obtidos pela mesma metodologia
(52, 110 e 142 minutos para as partículas OC-Bz 2:1/INDis, OC 1:1/INDis e OC-Bz
1:1/INDis, respectivamente), além de um maior percentual de liberação, o que
reforça a possibilidade de uma maior interação entre as cadeias do polímero do que
entre o polímero e o fármaco.
112
Figura 48: Perfis de dissolução e liberação da indometacina em FCS pH 7,4 a 37 °C
presente nas partículas magnéticas obtidas pela metodologia de incorporação in
situ do fármaco. As linhas representam apenas a tendência do processo e as
barras de erro representam o desvio padrão para a duplicata.
As partículas com a indometacina incorporada pela metodologia de
incorporação in situ preparadas na proporção 1:1 apresentaram um perfil e um
percentual de liberação de indometacina semelhante, indicando que para esta
metodologia de preparo a presença do grupamento hidrofóbico na cadeia polimérica
não exerce grande influência na incorporação do fármaco nem na sua liberação. O
material OC-Bz 2:1/INDis apresentou liberação de um maior percentual de
indometacina que as partículas preparadas na proporção 1:1, provavelmente devido
à maior interação entre as partículas entre si do que entre as partículas e o fármaco
pela grande quantidade do polímero, como discutido anteriormente.
Todas as partículas, exceto o material OC inc 2:1/INDev, apresentaram um
percentual de liberação de indometacina maior que partículas magnéticas
preparadas com mPEG-PCL e ácido oleico por Rutnakornpituk e colaboradores
(2009). Os sistemas preparados pelos autores apresentaram um percentual de
liberação entre 35% e 57%, dependendo do grau de hidrofobicidade do copolímero
empregado na síntese das partículas e observou-se que a característica
excessivamente hidrofóbica das partículas prejudicou a liberação do fármaco.
113
Liang e colaboradores (2010) estudaram a liberação da indometacina a partir
de partículas magnéticas de OCMQTS quaternizada. Apesar da alta eficiência de
incorporação obtida (até 95%), o máximo de fármaco liberado em meio com pH 7,4
foi de 28,9%.
Partículas magnéticas de quitosana contendo tacrina preparadas através de
metodologia semelhante à incorporação in situ apresentaram uma liberação rápida
do fármaco nas primeiras cinco horas seguida de uma liberação lenta, com
estabilização após 24 horas e liberação de 73 a 81% da tacrina incorporada
(WILSON et al., 2009).
Butoescu e colaboradores (2009) prepararam partículas magnéticas de PLGA
contendo dexametasona e obtiveram uma liberação lenta do fármaco, com uma
pequena quantidade liberada inicialmente (cerca de 20% nas primeiras horas) e
percentual de liberação superior a 80% após oito dias.
5.8 Modelos cinéticos de liberação
A modelagem matemática da liberação de fármacos permite obter
informações a respeito dos processos químicos e de transporte de massa envolvidos
no sistema de liberação, além de possibilitar a avaliação do efeito de determinados
parâmetros da forma farmacêutica, como geometria e teor de fármaco, no
mecanismo de liberação. Dessa forma, é possível otimizar um sistema para
obtenção do perfil de liberação desejado (ARIFIN; LEE; WANG, 2006).
O mecanismo de liberação de um fármaco pode ser influenciado por diversos
parâmetros como tipo de fármaco, seu polimorfismo, tamanho de partícula,
solubilidade e quantidade presente na forma farmacêutica ou no sistema de
liberação. Dentre os principais modelos matemáticos empregados, podem-se citar
as equações de ordem zero, primeira ordem, Higuchi, Hixson-Crowell e KorsmeyerPeppas (COSTA; LOBO, 2001).
O modelo de ordem zero pode ser aplicado para formas farmacêuticas que
não sofrem desagregação e liberam o fármaco lentamente, considerando que não
há alteração da área e não se estabelece um equilíbrio. É aplicado principalmente
114
para comprimidos matriciais ou revestidos e sistemas transdérmicos e osmóticos.
Pode ser representada pela Equação 5:
Equação 5
em que K0 é a constante de liberação de ordem zero, Q0 e Qt são as quantidades de
fármaco liberadas no tempo zero e no tempo t respectivamente (COSTA; LOBO,
2001).
A cinética de primeira ordem é utilizada para descrever principalmente
processos de absorção e eliminação de substâncias, sendo empregado também
para fármacos hidrossolúveis presentes em matrizes porosas, casos em que a
velocidade de liberação depende da quantidade de fármaco restante na forma
farmacêutica. É representada pela Equação 6:
Equação 6
em que K1 é a constante de liberação de primeira ordem, Q0 e Qt são as quantidades
de fármaco liberadas no tempo zero e no tempo t respectivamente (AGNES;
ORTEGA, 2003).
O modelo de Higuchi mais amplamente conhecido tem sido utilizado para
descrever a dissolução de fármacos de várias formas farmacêuticas de liberação
modificada, como sistemas transdérmicos e comprimidos matriciais contendo
fármacos hidrossolúveis. É representado pela Equação 7:
Equação 7
onde KH é a constante de liberação de Higuchi, Qt e Qinf são as quantidades
liberadas no tempo t e no infinito respectivamente (AGNES; ORTEGA, 2003).
O modelo de Hixson-Crowell é aplicado para formas farmacêuticas em que a
etapa limitante da liberação é a dissolução da substância, não a difusão que pode
ocorrer na matriz polimérica, considerando que o seu formato permanece o mesmo
durante todo o processo, apenas com uma diminuição proporcional do seu tamanho.
É representada pela Equação 8:
Equação 8
onde KHC é a constante de Hixson-Crowell e Qt é a quantidade liberada no tempo t
(COSTA; LOBO, 2001).
Outra equação frequentemente empregada é o modelo não linear de
Korsmeyer-Peppas, utilizado geralmente para analisar a liberação a partir de formas
115
farmacêuticas poliméricas em que o mecanismo de liberação é desconhecido ou
quando mais de um mecanismo está envolvido. É representado pela Equação 9:
Equação 9
em que Q(t-l) é a liberação fracional do fármaco, ! é a constante que incorpora
características estruturais e geométricas da forma farmacêutica, l é o tempo de
latência que marca o início da liberação, n é o expoente de liberação indicativo do
mecanismo de liberação do fármaco e b é a liberação abrupta inicial do fármaco.
Considerando o tempo de latência como zero, resume-se à Equação 10:
Qt Qinf = "t n + b
Equação 10
Para a determinação do valor de n utiliza-se apenas a porção da curva em
!
que Qt/Qinf<0,6. No caso de formas esféricas, o expoente n é indicativo dos
seguintes mecanismos: difusão Fickiana (n = 0,43), transporte anômalo ou difusão
não-Fickiana envolvendo uma possível combinação de mecanismos (0,43<n<0,85)
ou intumescimento polimérico (n = 0,85) (COSTA; LOBO, 2001; SIEPMANN;
SIEPMANN, 2008).
A representação gráfica dos modelos matemáticos para quatro dos materiais
obtidos é apresentada na Figura 49 e as constantes de liberação obtidas através dos
modelos com seus respectivos coeficientes de correlação (r) são apresentadas na
Tabela 12.
116
Figura 50: Modelos matemáticos aplicados para a liberação da indometacina em FCS pH 7,4
a 37 °C das partículas Fe3O4/!-Fe2O3/INDev, OC-Bz inc 1:1/INDev, OC-Bz inc
2:1/INDev e OC-Bz in situ/INDev. (A) Ordem zero, (B) Primeira ordem, (C)
Higuchi, (D) Hixson-Crowell e (E) Korsmeyer-Peppas não linear.
117
Tabela 12: Constantes de liberação e coeficientes de correlação das equações matemáticas aplicadas na liberação da indometacina contida
nas partículas magnéticas. Destacados em negrito estão os modelos que melhor se adequaram para cada material.
Ordem zero
Materiais
r
K0
-1
(min )
Primeira ordem
r
K1
-1
(min )
Higuchi
r
Hixson-Crowell
KH
-1/2
(min
)
r
Korsmeyer-Peppas
KHC
-1/3
(min
)
r
!
(min-1)
n
Fe3O4/!-Fe2O3/INDev
0,8727
0,141
0,8176
9,64x10-4
0,9651
5,18x10-2
0,9645
1,05x10-3
0,9693
8,63x10-2
0,43
OC in situ/INDev
0,8888
0,164
0,8057
1,64x10-3
0,9604
5,78x10-2
0,9269
1,07x10-3
0,9987
2,74x10-1
0,70
OC-Bz in situ/INDev
0,9375
0,108
0,8556
1,01x10-3
0,9767
4,06x10-2
0,9885
7,21x10-4
0,9724
7,69x10-2
0,44
OC inc 1:1/INDev
0,9198
0,138
0,8422
1,16x10-3
0,9812
4,20x10-2
0,9638
7,77x10-4
0,9958
1,05x10-1
0,40
OC inc 2:1/INDev
0,9764
0,142
0,9092
1,61x10-3
0,9914
4,72x10-2
0,9896
6,98x10-4
0,9904
6,06x10-2
0,40
OC-Bz inc 1:1/INDev
0,9246
0,204
0,8100
2,67x10-3
0,9962
7,24x10-2
0,9481
8,68x10-4
0,9873
1,23x10-1
0,43
OC-Bz inc 2:1/INDev
0,9210
0,220
0,8063
2,35x10-3
0,9864
6,40x10-2
0,9586
9,92x10-4
0,9905
9,94x10-2
0,43
OC 1:1/INDis
0,9284
0,145
0,8361
1,62x10-3
0,9793
4,93x10-2
0,9571
6,73x10-4
0,9905
6,71x10-2
0,50
OC-Bz 1:1/INDis
0,9716
0,160
0,9116
1,82x10-3
0,9981
5,21x10-2
0,9868
6,95x10-4
0,9974
1,30x10-1
0,34
OC-Bz 2:1/INDis
0,9813
0,244
0,9583
1,94x10-3
0,9855
5,28x10-2
0,9891
1,07x10-3
0,9721
1,92x10-1
0,30
118
Através dos valores dos coeficientes de correlação, o modelo matemático que
melhor explicou o processo de liberação da indometacina para o maior número de
partículas foi a equação de Korsmeyer-Peppas. Outros modelos com boa correlação
foram as equações de Higuchi e Hixson-Crowell. Observa-se que mesmo para as
partículas em que o melhor modelo não foi o de Korsmeyer-Peppas, a correlação
para este modelo foi alta. Além disso, para o maior número de partículas o expoente
n encontra-se entre 0,40 e 0,44, valores próximos de 0,43, indicando que a cinética
de liberação segue a difusão Fickiana, mesmo mecanismo explicado pelo modelo de
Higuchi. Para os casos em que n = 0,70 (OC in situ/INDev) e n = 0,50 (OC
1:1/INDis), sugere-se que a liberação ocorre por uma combinação de mecanismos
que pode incluir a difusão e o intumescimento da polímero presente na partícula
contendo o fármaco (SIEPMANN; SIEPMANN, 2008).
Resultado semelhante ao encontrado neste trabalho foi obtido para liberação
de tacrina contida em micropartículas magnéticas de quitosana, em que se
encontrou boa correlação para o modelo cinético de Higuchi e, ao aplicar o modelo
de Korsmeyer-Peppas, foram obtidos valores do expoente n condizentes com o
mecanismo de difusão Fickiana explicado pela equação de Higuchi (WILSON et al.,
2009).
O modelo de Higuchi também foi aplicado para avaliação do mecanismo de
liberação
da
indometacina
contida
em
partículas
magnéticas
de
PLGA,
demonstrando boa correlação e indicando que o processo ocorre também através da
difusão (CHATTOPADHYAY; GUPTA, 2002).
Závi!ová e colaboradores (2007) aplicaram modelos matemáticos no perfil de
dissolução da indometacina a partir de nanopartículas poliméricas magnéticas para
verificar se o mecanismo de liberação predominante era por dissolução ou difusão. A
melhor correlação foi obtida para o modelo de dissolução, principalmente no início
do processo.
A liberação da indometacina em tampão fosfato pH 7,2 a partir de partículas
magnéticas de metilmetacrilato e 2,3-epoxipropil metacrilato foi avaliada através dos
modelos matemáticos de Higuchi e Korsmeyer-Peppas. A melhor correlação
também foi obtida para o modelo de Korsmeyer-Peppas, entretanto o valor de n
indicou uma combinação de mecanismos que inclui a difusão Fickiana (NITA;
CHIRIAC; NISTOR, 2010).
119
Hu e colaboradores (2007) avaliaram a liberação de vitamina B12 como
substância modelo a partir de ferroesponjas magnéticas de gelatina na ausência e
na presença de um campo magnético externo. Houve a liberação de uma
quantidade relativamente pequena (cerca de 25% do conteúdo) na presença do
campo magnético quando comparada à liberação sem a aplicação do campo (40%)
durante seis horas, indicando que o campo magnético proporciona uma liberação
mais lenta do ativo, com uma velocidade de liberação inversamente proporcional à
força do campo aplicado. Foi aplicada uma equação equivalente à de KorsmeyerPeppas para determinação do mecanismo de liberação e os valores do expoente n
também indicou o predomínio da difusão Fickiana.
Comportamento inverso foi observado para a liberação de doxorrubicina a
partir de partículas magnéticas de ácido polimetacrílico e ferrita de níquel, em que a
aplicação do campo aumenta a quantidade de fármaco liberado e a velocidade de
liberação (RANA et al., 2007).
O modelo de Korsmeyer-Peppas também foi considerado o mais adequado
para explicar a liberação de diclofenaco de sódio a partir de microesferas
magnéticas de gelatina, entretanto a liberação no sistema estudado foi considerada
como difusão não-Fickiana, pois os valores do expoente n se encontraram entre os
valores limítrofes (SARAVANAN et al., 2004).
Butoescu e colaboradores (2009) avaliaram a liberação de dexametasona a
partir de micropartículas magnéticas de PLGA preparadas para vetorização intraarticular, propondo um modelo matemático semiempírico para explicar o processo.
Considerando
a
facilidade
do
preparo,
o
comportamento
de
superparamagnetismo mais pronunciado, os altos valores de eficiência de
incorporação do fármaco e o seu perfil de liberação, as nanopartículas preparadas
com o polímero OCMQTS pela metodologia de formação in situ seguida de
incorporação da indometacina por evaporação do solvente demonstraram ser o
material mais apropriado para futuros testes em modelos in vivo e com fármacos
antitumorais.
120
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os derivados OCMQTS e OCMQTS-Bz foram sintetizados com êxito,
conforme demonstrado nos espectros no infravermelho e de RMN
1
H, e
apresentaram grau de carboximetilação e N-substituição de 44,31% e 19,0%,
calculados através de titulação condutimétria e RMN 1H respectivamente.
O material magnético inorgânico, sintetizado pela coprecipitação dos ions Fe3+
e Fe2+, apresentou-se como uma mistura dos óxidos de ferro Fe3O4 e !-Fe2O3, com
predomínio da maguemita (aproximadamente 75%), tamanho médio de partícula de
aproximadamente 15,6 nm, comportamento de paramagnetismo e agregação das
partículas.
As partículas foram preparadas através de duas metodologias: coprecipitação
in situ e por incorporação. As partículas obtidas in situ apresentaram maior teor de
ferro, menor diâmetro médio, menor agregação, valores mais elevados de saturação
magnética e comportamento superparamagnético mais pronunciado quando
comparadas às obtidas por incorporação.
A indometacina, utilizada como fármaco hidrofóbico modelo, foi incorporada
às partículas magnéticas através de duas metodologias: evaporação do solvente e
incorporação in situ. A metodologia de evaporação do solvente promoveu, no geral,
valores mais elevados de eficiência de incorporação (entre 33,7% e 86,2%) do que a
incorporação in situ (entre 28,3% e 30,2%).
Dentre os materiais em que a indometacina foi incorporada por evaporação
do solvente, a partícula que apresentou maior eficiência de incorporação foi a OC in
situ, provavelmente devido aos grupos amino protonados do polímero que interagem
com o grupamento carboxilato do fármaco, além das outras interações que também
ocorrem para as outras partículas contendo polímero.
A inserção do grupamento benzil no polímero promoveu o aumento da
eficiência de incorporação da indometacina apenas para as partículas obtidas por
incorporação e com o fármaco incorporado por evaporação do solvente. Nos
materiais obtidos pela técnica de incorporação in situ da indometacina, a presença
do grupamento aromático do polímero não exerceu influência na eficiência de
incorporação do fármaco.
121
As
partículas
magnéticas
contendo
indometacina
não
apresentaram
diferenças significativas em relação ao seu comportamento magnético, mantendo as
características das partículas de partida.
Os estudos de liberação in vitro da indometacina em fluido corporal simulado
pH 7,4 a 37 °C demonstraram que a interação do fármaco com as partículas não é
permanente, apresentando um percentual de liberação entre 55% e 85% em cinco
horas. Todos os materiais apresentaram uma liberação inicial rápida, com posterior
liberação lenta e manutenção do percentual de indometacina liberada.
Dentre os modelos matemáticos aplicados para determinar o mecanismo de
liberação, o mais adequado foi o modelo de Korsmeyer-Peppas, com um valor de
expoente n de aproximadamente 0,43 para a maioria dos sistemas, indicando que a
liberação da indometacina contida nas partículas magnéticas ocorre principalmente
por difusão Fickiana.
Considerando
a
facilidade
do
preparo,
o
comportamento
de
superparamagnetismo mais pronunciado, a eficiência de incorporação do fármaco e
sua liberação, o material OC in situ/INDev demonstrou ser o mais apropriado para
futuros testes com fármacos antitumorais.
Em estudos realizados por pesquisadores do NIQFAR, as nanopartículas
magnéticas preparadas e caracterizadas neste trabalho não apresentaram
citotoxicidade contra células L929, podendo ser adequadas para posteriores estudos
in vivo.
Além disso, têm sido realizados estudos envolvendo a biodistribuição em
ratos de algumas nanopartículas preparadas neste trabalho e planeja-se avaliar a
vetorização in vivo da indometacina a partir dos materiais magnéticos em modelo de
artrite em ratos. Posteriormente, pretende-se incorporar compostos com atividade
antitumoral de origem natural ou sintética nas nanopartículas magnéticas que
apresentaram melhores resultados com a finalidade de vetorizar a liberação dessas
moléculas em modelos animais através do posicionamento de um campo magnético
externo.
122
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APÊNDICE A – AGRADECIMENTOS E PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Agradecimentos
• O projeto foi financiado pela bolsa de mestrado fornecida pela CAPES.
• Os experimentos de XRD, comportamento magnético e TEM foram realizados
pelos pesquisadores do Instituto de Física da Academia Polonesa de
Ciências, coordenados pela professora Anna !lawska-Waniewska.
• Os experimentos de espectroscopia Mössbauer foram realizados pelo
pesquisador Jean Marc Greneche do Laboratório de Física do Estado
Condensado da Universidade do Maine, na França.
Produção científica relacionada ao projeto
• Artigos
DUSZA, A.; WOJTYNIAK, M.; NEDELKO, N.; !LAWSKA-WANIEWSKA, A.;
GRENECHE, J. M.; RODRIGUES, C. A.; BÜRGER, C.; STRINGARI, C.; DEBRASSI,
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DEBRASSI, A.; BÜRGER, C.; RODRIGUES, C. A.; NEDELKO, N.; !LAWSKAWANIEWSKA, A.; D"U#EWSKI, P.; SOBCZAK, K.; GRENECHE, J. M. Synthesis,
characterization and in vitro drug release of magnetic O-carboxymethylchitosan-Nbenzyl nanoparticles loaded with indomethacin. Acta Biomater., v. 7, p. 3078-3085,
2011.
• Resumos
NEDELKO, N.; SLAWSKA-WANIEWSKA, A.; GRENECHE, J.; MALINKIEWICZ, K.;
DLUZEWSKI, P.; SOBCZAK, K.; KRZYZEWSKI, A.; RODRIGUES, C. A.;
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DUSZA, A.; WOJTYNIAK, M.; NEDELKO, N.; SLAWSKA-WANIEWSKA, A.;
BURGER, C.; RODRIGUES, C. A.; STRINGARI, C.; DEBRASSI, A. Magnetic
behavior of O-carboxymethylchitosan bounded iron oxide particles. In: Self-organized
nanomagnets 2009 European Workshop, 2009, Aussois. Self-organized
nanomagnets 2009 European Workshop - Posters, 2009. p. 59-59.
DUSZA, A.; WOJTYNIAK, M.; NEDELKO, N.; SLAWSKA-WANIEWSKA, A.;
GRENECHE, J.; RODRIGUES, C. A.; BURGER, C.; STRINGARI, C.; DEBRASSI, A.
Magnetic properties of O-carboxymethylchitosan bounded iron oxide particle. In: 19th
Soft Magnetic Materials Conference, 2009, Turin. Abstracts, 2009. v. 1. p. E3-04-E304.
Produção científica no período de duração do mestrado
• Artigos
DEBRASSI, A.; RODRIGUES, C. A. Adsorption of cationic dyes from aqueous
solution by termite feces, a non-conventional adsorbent. Clean Soil Air Water, v. 39,
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DEBRASSI, A.; LARGURA, M. C. T.; RODRIGUES, C. A. Adsorção do corante
vermelho congo por derivados da O-carboximetilquitosana hidrofobicamente
modificados. Quím. Nova, v. 34, p. 764-770, 2011.
136
LARGURA, M. C. T.; DEBRASSI, A.; SANTOS, H. H.; MARQUES, A. T.;
RODRIGUES, C. A. Adsorption of Rhodamine B onto O-Carboxymethylchitosan-NLauryl. Sep. Sci. Technol., v. 45, p. 1490-1498, 2010.
• Resumos
DEBRASSI, A.; CORRÊA, A. F.; RODRIGUES, C. A.; NEDELKO, N.; SLAWSKAWANIEWSKA, A. Remoção de corantes catiônicos de efluentes têxteis por partículas
magnéticas de O-carboximetilquitosana-N-benzil. In: 34ª Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2011, Florianópolis. 34ª Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2011.
DEBRASSI, A.; DEMARCHI, C. A.; RODRIGUES, C. A.; NEDELKO, N.; SLAWSKAWANIEWSKA, A. Adsorção do corante Vermelho Remazol 133 em partículas
magnéticas de N-laurilquitosana. In: 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2011, Florianópolis. 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2011.
BACCARIN, T.; DEBRASSI, A.; GONSALVES, A. E.; CAMARGO, S. S.; COSTA, P.;
MALHEIROS, A.; SOUZA, M. M.; LUCINDA, R. M. Avaliação da atividade
antinociceptiva in vivo do extrato hidroalcoólico de Rapanea ferruginea Mez. In: V
Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais, 2010, Itajaí. V Simpósio
Iberoamericano de Plantas Medicinais, 2010.
DEBRASSI, A.; DEMARCHI, C. A.; CORREA, A.; RODRIGUES, C. A. Cinética de
adsorção de Cr(VI) em resíduos de folhas e frutos de Rapanea ferruginea: novos
adsorventes de baixo custo. In: XVIII Encontro de Química da Região Sul, 2010,
Curitiba. XVIII Encontro de Química da Região Sul, 2010.