Técnicas de isolamento de micro-organismos

Farmácia Noturno 2013
Produção de energia por
micro-organismos
Fernanda Abreu
[email protected]
Introdução
• Micro-organismos estão em toda parte
• Especialmente procariotos
– Apresentam grande diversidade metabólica
• Utilização de nutrientes diversos
• Diferentes mecanismos de obtenção de energia
Fontes de energia utilizadas pelos
seres vivos
LUZ
Substâncias químicas
Processos de obtenção de energia
• São caracterizados por reações de oxidação e
redução;
• Uma substância doa elétrons e outra recebe;
• Quando a substância que doa elétrons é :
– Inorgânica: organismo é litotrófico
– Orgânica: organismo é organotrófico
Tipos de processos de obtenção de
energia
Produção de energia por micro-organismos
• Como a célula armazena energia?
– Através de ligações químicas nas moléculas, isto é,
energia química.
– A variação de energia livre (Δ G ) ocorre nas diversas
reações celulares.
– Definição de energia livre (G): energia disponível para
realizar trabalho.
• Δ G negativo = liberação de energia, processos catabólicos
• Δ G negativo = consumo de energia, processos anabólicos
Produção de energia por micro-organismos
• Moléculas carreadoras de energia na célula:
– Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+)
• E sua forma fosforilada NADP+
• Transportam prótons e elétrons
– Adenosina trifosfato (ATP)
Processos de síntese de ATP
• São chamados de fosforilação:
– Adição de fosfato a ADP
ADP + Pi + Energia  ATP
30,5 kJ/mol
• Processos de síntese de ATP
– Fosforilação ao nível do substrato;
– Fosforilação por transporte de elétrons;
– Fosforilação por força íon-motiva.
1. Fosforilação ao nível do substrato
• É o processo no qual o grupo fosfato de um
composto químico é removido e adicionado
diretamente ao ADP.
Fosfoenolpiruvato  Pirivato + Pi
ΔG = -61,9 kJ/mol
ADP + Pi  ATP
ΔG = +30,5 kJ/mol
________________________________________________
Fosfoenolpiruvato + ADP  Piruvato + ATP
ΔG = -31,4 kJ/mol
- Ocorre em vias de degradação da glicose e no metabolismo fermentativo
2. Fosforilação por transporte de elétrons
• Síntese de ATP ocorre em membrana celular.
– Mitocôndrias e cloroplastos: eucariotos
– Membrana plasmática: procariotos
• Elétrons transferidos de compostos químicos a
carreadores
(NAD+
e
NADP+)
são
transportados através de diferentes proteínas
carreadoras na membrana até o aceptor final.
2. Fosforilação por transporte de elétrons
• Composto químico: perde elétrons, sendo
este o doador de elétrons, e, por isso, sofre
oxidação. (reação de oxidação)
• Composto químico: recebe elétrons, sendo
este o aceptor de eletrons, e, por isso, sofre
redução (reação de redução).
Litotrófico X Organotrófico
Respiração aeróbica X anaeróbica
2. Fosforilação por
transporte de elétrons
• Tendência
da
substância em
doar ou receber
elétrons
-Essa tendência é chamada de potencial de
redução (E).
-E é definido como a voltagem necessária para
remover elétrons de uma substância
-Quanto mais negativo, maior a probabilidade de a
substância doar elétrons.
ΔG = -nFΔE
2. Fosforilação por transporte de elétrons
• Componentes da cadeia transportadora de
elétrons em procariotos:
– Flavoproteínas: FMN - flavina mononucleotídeo
FAD - adenina dinucleotídeo
– Quinonas: coenzima Q:
ubiquinona (aeróbicas, eucariotos)
menaquinona (anaeróbicas)
*metabolismo facultativo tem as duas
– Ptns ferro-enxofre: contém arranjos de no iguais de Fe e S
– Citocromos: ptns com grupo prostético heme
2. Fosforilação por transporte de elétrons
Potencial de redução
Fosforilação oxidativa: respiração aeróbica
2. Fosforilação por transporte de elétrons
2. Fosforilação por transporte de elétrons
• Transporte de prótons através da membrana
forma um gradiente eletroquímico;
• Energia do gradiente é utilizada na síntese de
ATP pela ATPase ou ATP sintase.
F0  ptns a,b, c
2. Fosforilação por transporte de elétrons
• Força próton-motiva é
utilizada em outros
processos
dependentes de
energia:
– No transporte de
substâncias;
– Rotação do flagelo
Força “sódio-motiva”: bactérias marinhas
3. Fosforilação por força íon-motiva
• Outras formas de obtenção de gradiente
eletroquímico:
– Excreção de produtos finais do metabolismo
– Antiporte de compostos;
– Reações de descarboxilação;
– Oxidação extracitoplasmática;
Resumo dos processos de síntese de
ATP em procariotos
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Fonte de energia: compostos orgânicos
• Principal composto orgânico utilizado: glicose
• Utilizada nos processos:
– Respiração: aeróbica
anaeróbica
– Fermentação
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração aeróbica:
– Processo em que ocorre a oxidação completa da
substância orgânica utilizando o O2 como aceptor
final de elétrons.
C6H12O6 + 6O2  6CO2 + 6H2O
- Processo complexo dividido em 3 partes:
- Vias Glicolíticas
- Ciclo de Kerbs
- Fosforilação Oxidativa
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração aeróbica:
- Vias Glicolíticas: clivagem da glicose
- Via Embden-Meyerhof
- Entner-Doudoroff
- Via das Pentoses-fosfato
- Ciclo de Krebs
- Fosforilação Oxidativa
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração aeróbica:
- Vias Glicolíticas: clivagem da glicose
- Via Embden-Meyerhof (eucariotos e procariotos)
Glicose  2 ATP + 2 NADH + 2H+ + 2 Piruvato
- Entner-Doudoroff
Glicose  ATP + NADPH + H+ + NADH + H+ + 2 Piruvato
- Via das Pentoses-fosfato
Glicose  ATP + 2 NADPH + 2H+ + CO2 + Pentose-fosfato
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração aeróbica:
– Vias Glicolíticas: clivagem da glicose
Via Embden-Meyerhof
Entner-Doudoroff
Via das Pentoses-fosfato
Intermediário em comum:
Gliceraldeído 3-fosfato
Convertido em
Piruvato
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração aeróbica:
- Ciclo de Krebs:
- Segunda etapa da respiração de procariotos e
eucariotos
- Ciclo dos ácidos tricarboxílicos ou ciclo do ácido cítrico
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração aeróbica:
- Fosforilação Oxidativa:
- Última etapa da respiração
- Quando ocorre a síntese de ATP por meio de fosforilação por
transporte de elétrons
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Resumo da respiração
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Respiração anaeróbica:
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Fermentação:
– Oxidação parcial do composto orgânico.
– É um metabolismo anaeróbico: ocorre na ausência de O2.
– O aceptor de elétrons é a própria molécula orgânica.
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Fermentação:
– Metanogênese: ocorre em ambientes onde
bactérias liberam substratos orgânicos como
acetato, que são fermentados por arqueas,
gerando CH4.
– Processo é considerado fermentação, pois o
acetato não é completamente oxidado a CO2.
– Metanogênise acetoclástica e metilotrófica
(metanol).
Metabolismo Quimiorganotrófico
• Comparação respiração X fermentação
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Procariotos são os únicos capazes de utilizar compostos inorgânicos como
fonte de energia.
• É um processo de baixo rendimento energético e por isso grandes
quantidades de compostos inorgânico são oxidadas.
• Ex.: Rio Tinto- bactérias oxidantes de Fe2+
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Bactérias oxidantes de ferro
Rusticianina: ptn periplasmática
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Outros metabolismos quimiolitotróficos e seu rendimento energético
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Outros metabolismos quimiolitotróficos e seu rendimento energético
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Metanogênese:
– Grupo de procariotos que utiliza H2 como doador
de elétrons e CO2 como aceptor.
– Metanogênese:
4H2 + CO2  CH4 + 2H2O
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Nitrificação:
– Oxidação da amônia a
nitrato.
– Ocorre em 2 etapas:
- Amônia  Nitrito:
Nitrosomonas
amônia mo-oxigenase: NH3  hidroxilamina
:hidroxilamina oxirredutase: hidroxilamina 
nitrito
- Nitrito  Nitrato:
Nitrospira
nitrito oxirredutase
Processo aeróbico
Metabolismo Quimiolitotrófico
• Anamox:
– Reação de oxidação anaeróbica da amônia.
– Realizada por um grupo específico de bactérias.
Planctomyces- possuem compartimentos envoltos
por membrana
NH4+ + NO2-  N2 + 2H2O
ΔG = -357 kJ
Aceptor final de elétrons
Metabolismo Fototrófico
+ Fotolitotroficos: compostos inorgânicos como doadores de elétrons
+ Fotoorganotróficos: compostos orgânicos como doadores de elétrons
Metabolismo Fototrófico
• Bactérias Fototróficas: Cianobactérias,
bactérias verdes, púrpuras e heliobactérias.
proclorófitas,
• Componentes funcionais para realização da fotossíntese:
– Pigmentos capazes de captar luz;
– Cadeia transportadora de eletrons;
– ATPase.
• Absorção de fóton por uma molécula:
– Molécula no estado excitado: elétron move-se para orbital
superior.
– Essa forma é instável. Pode ocorrer emissão de luz, calor ou o
elétron pode ser transferido para outra molécula.
Metabolismo Fototrófico
Metabolismo Fototrófico
Principais pigmentos de fotossíntese em bactérias :
1. Clorofilas (fotossíntese oxigênica)*
2. Bacterioclorofilas (fotossíntese anoxigênica)*
3. Carotenoides
4. Ficobilinas
* Espectro de absorção específico
Metabolismo Fotototrófico
1. Clorofilas:
Chl a 680 e 430 nm; 480 carotenoide
Bchla 870, 805, 590, 360 nm; 525 e 475 carotenoide
Metabolismo Fototrófico
Metabolismo Fototrófico
Coexistência
1. Clorofilas:
• Técnica fundamental para estudo dos microorganismos do ambiente
• Sergei Winogradsky
– Coluna de Winogradsky
– Ecossistema artificial
•
•
•
•
Lodo orgânico
Substratos (fonte de C)
Carbonato de cálcio
Sulfato de cálcio
Metabolismo Fototrófico
1. Clorofilas: Organização dos pigmentos na célula;
está associadas a ptns, formando complexos
• Centros de reação:
- Moléculas de pigmento que participam
diretamente da conversão de energia
luminosa em ATP.
• Pigmentos antena:
- Molécula de clorofila/bacterioclorofila
encontradas ao redor do CR que absorvem a
luz e a condizem para o CR.
Metabolismo Fototrófico
1. Clorofilas:
• Organização de pigmentos na célula
- Invaginações da membrana citoplasmática
- Na própria membrana;
- Estruturas especializadas envoltas por não unidade de
membrana - CLOROSSOMOS
Bactérias verdes
sulfurosas
Clorossomo: estrutura
altamente eficiente na
captação o de luz.
Metabolismo Fototrófico
2. Carotenoides:
-
Pigmento acessório amplamente distribuído;
-
São hidrofóbicos, sensíveis a luz e firmemente associados à
membrana.
-
Geralmente amarelos, vermelhos, marrons ou verdes.
-
Estão associados à clorofila ou bacterioclorofila nos complexos
fotossintéticos, mas não atuam diretamente na síntese de ATP.
-
Atuam na captação e transferência de luz para o CR.
-
Atuam como foto-protetores: dissipam espécies tóxicas de
oxigênio e absorvem luz que seria prejudicial.
Metabolismo Fototrófico
2. Ficobilina e ficobilissomos:
-
Pigmento acessório presente em cianobactérias;
Pigmento antena;
Podem ser vermelhos ou azuis: absorvem luz em
diferentes λ
Formam agregados: ficobilossomos
Atuam na captação e
transferência de luz para o CR
Fotossíntese oxigênica
Mecanismo de síntese de ATP: Fotofosforilação acíclica
ferredoxina
Fotossíntese anoxigênica
• Encontrada em bactérias púrpura sulfurosa, verde não
sulfurosas e sulfurosas e heliobactérias.
• Aparato fotossintético organizado em vesículas membranosas
(cromatóforos) ou pilhas de membranas (lamelas).
Fotossíntese anoxigênica
Mecanismo de síntese de ATP: Fotofosforilação cíclica
P870: CR
Aula Prática
26/08/2013
Prática 5
Observação microscópica de micro-organismos
do ambiente
Técnicas de isolamento de micro-organismos:
esgotamento
Obtenção de cultura pura
Prática 5
• Observação microscópica dos micro-organismos do
ambiente.
• Preparação a fresco:
– Flambar a alça de platina
– Colocar a solução salina estéril na lâmina utilizando a alça e
respeitando as manobras assépticas; **** Se for cultura líquida
não é necessário.
– Flambar a alça de platina;
– Colocar uma porção da cultura suspensão bacteriana em uma
lâmina utilizando a alça e respeitando as manobras assépticas
– Cobrir com a lamínula.
– Adicionar uma pequena gota de óleo de imersão e observar com
objetiva de imersão (100 X).
Prática 5
• Técnicas de isolamento de micro-organismos:
Esgotamento
– MEIO DE CULTURA:
Material nutriente preparado no laboratório
para o crescimento de microrganismos. Os
microrganismos que crescem e se multiplicam
nos meios de cultura são denominados
cultura.
Prática 5
• Técnicas de isolamento de micro-organismos: Esgotamento
- MEIO DE CULTURA:
Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de
microrganismos. Os microrganismos que crescem e se multiplicam nos
meios de cultura são denominados cultura.
- Fatores Necessários para o Crescimento
Os fatores necessários para o crescimento bacteriano podem ser divididos
em duas categorias principais:
1. Fatores físicos: temperatura, pH, pressão osmótica.
2. Fatores químicos: água, fonte de carbono, nitrogênio, minerais,
oxigênio e fatores orgânicos de crescimento.
Prática 5
• Tipos de meio
– Seletivo: componentes adicionados inibem crescimento de
determinados micro-organismos.
Ex.: utilização de cicloheximida para inibição de eucariotos em
enriquecimento de procariotos; ou antibióticos como ampicilina no
sentido contrário.
– Diferencial: adição de componentes que resultam no crescimento
diferenciado que permite a distinção de tipos de bactérias.
Ex.: utilização de indicadores de pH como bromocresol, na identificação
de bactérias produtoras de ácido.
– Enriquecimento: meio com componentes que permitem o
crescimento de tipos específicos enquanto inibem o crescimento da
microbiota contaminante.
Prática 5
Técnicas de isolamento de micro-organismos: Esgotamento
Método de Semeadura por Esgotamento
- A maioria dos materiais infecciosos ou provenientes de solo,
água ou mesmo alimentos possui uma grande variedade de
microrganismos. Como separar?
- Semeadura em meios sólidos e observação do formato
das diferentes colônias, coloração das colônias, etc... .
Prática 5
Técnicas de isolamento de micro-organismos:
Esgotamento
- Semeadura por esgotamento :
Largamente empregado para isolamento de
microrganismos presentes em grandes números
relativos à população microbiana.
Prática 5
Técnicas de isolamento de micro-organismos:
Esgotamento
• Proceder da seguinte maneira:
– realizar o maior número de estrias possíveis.
– Não perfurar o meio.
– Não voltar com a alça sobre as estrias.
– Utilizar pequena quantidade de material para
semear.
Prática 5
• OBJETIVOS DA PRÁTICA
– Mostrar ao aluno os métodos de obtenção de
cultura pura.
– Treinar o aluno na execução da técnica de
isolamento.
Prática 5
Técnica de isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido).
• Utilizar uma suspensão mista de bactérias (Serratia + Micrococcus) a ser
distribuída pelo professor.
• Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão mista de
bactérias. Semeá-la sobre a superfície de um meio sólido (ágar-simples)
em placa. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o
esquema da figura abaixo, na seqüência (método de esgotamento).
– Primeira operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça em zigzag .
– Segunda operação: mudar a direção do estriamento para a 2a região da placa
sem tocar nas estrias do primeiro plaqueamento.
– Terceira operação: mudar a direção do estriamento para a 2a região da placa
sem tocar nas estrias do segundo plaqueamento.
• Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37o C por no mínimo 24 horas.