BIO-FLASH ® BIO-FLASH® anti-HBc

BIO-FLASH ®
®
LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
BIO-FLASH anti-HBc
3000-8578
100 testes
BIO-FLASH anti-HBc é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos totalmente automatizado
para a determinação qualitativa de anticorpos totais contra o antígeno core (anti-HBc) do vírus da hepatite
B em soro ou plasma humano com o instrumento BIO-FLASH.
Sumário
A hepatite B é uma infecção hepática produzida pelo vírus da hepatite B (HBV), que representa um importante
problema de saúde global. O vírus provoca uma série de doenças hepáticas, variando de hepatite aguda e
crônica a cirrose e câncer primário de fígado. As doenças causadas pelo HBV têm uma distribuição mundial.
Estima-se que aproximadamente um terço da população mundial tenha sido infectado com HBV. Destes, cerca
de 350 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas e em risco de desenvolver doenças graves e de
morte, principalmente por cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. A infecção pelo HBV varia
consideravelmente em diferentes áreas geográficas, e a prevalência crônica do HBV pode variar de 0,2 a 15%.
Os principais modos de transmissão do HBV são a exposição perinatal a uma mãe infectada, horizontal,
parenteral e sexual, e as taxas relativas destes modos variam em todo o mundo. A transmissão parenteral e a
sexual são predominantes em países industrializados, enquanto que a transmissão horizontal e a perinatal
predominam nos países em desenvolvimento.1,2
Durante a infecção viral aparecem vários marcadores sorológicos. Um desses marcadores é o anti-HBc. O
antígeno core da hepatite B (HBcAg) é um componente interno do vírus da hepatite B , que é antigenicamente
distinto do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg). O sistema antígeno-anticorpo HBcAg/anti-HBc foi
descrito em 1971 por Almeida et al.3 O anti-HBc geralmente pode ser detectado no sangue logo após a detecção
de HBsAg e antes do início da hepatite clinicamente manifesta. Na hepatite B aguda com recuperação, o
anti-HBc é o único marcador sorológico de infecção no período entre o desaparecimento do HBsAg e o
aparecimento de anti-HBs. Os anticorpos anti-HBc podem persistir por toda a vida, enquanto que os anticorpos
anti-HBs podem tornar-se negativos em alguns pacientes. Na hepatite B crônica, o anti-HBc é detectado
juntamente com o HBsAg, mas em alguns indivíduos este antígeno pode se tornar indetectável. As doações de
sangue tomadas quando o anti-HBc é o único marcador sorológico do HBV podem ser infecciosas4 e tem sido
sugerido que a triagem para anti-HBc, além da triagem HBsAg, poderia reduzir ainda mais a incidência de
hepatite B pós-transfusão.5 De fato, a triagem para anti-HBc de doações de sangue é obrigatória em vários
países.
A determinação de anti-HBc, HBsAg e anti-HBs é recomendada no caso de pacientes imunodeprimidos, como
portadores de HIV e no caso de indivíduos imunossuprimidos devido a um maior risco de reativação da hepatite
B. Por outro lado, a análise de anti-HBc também deve ser realizada em qualquer pessoa antes da aplicação da
vacina contra hepatite B para saber o estado imunológico, a fim de vacinar apenas os indivíduos negativos para
anti-HBc.
Princípio
Quando as micropartículas paramagnéticas e o tampão de ensaio de BIO-FLASH anti-HBc são misturadas e
incubadas com a amostra, se esta apresenta anticorpos específicos anti-HBc, estes se combinam com o antígeno
HBc que recobre as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da
amostra, se adiciona um traçador que consiste em um anticorpo IgG de coelho anti-HBc marcado com isoluminol
que pode unir-se ao antígeno HBc que recobre as micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação
magnética e lavagem, se adicionam os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do
BIO-FLASH mede a luz emitida como unidades relativas de luz (URL) que são inversamente proporcionais à
concentração de anti-HBc da amostra.
O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC)
para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no
instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit
separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica
para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos
calibradores.
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Esquema da reação:
Ativadores
(Triggers)
URL
Partícula magnética
Amostra
Traçador
Emissão de luz
Componentes
Cartucho de reagentes
O kit BIO-FLASH anti-HBc contém um cartucho de reagentes para 100 determinações (REF 3000-8578).
Nota: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE 000762992-0001)
Composição do cartucho de reagentes:
O cartucho está composto por 4 frascos que contêm:
A.
1 frasco cilíndrico de suspensão de
micropartículas recobertas com antígeno HBc
recombinante. Contém < 0,1% de azida
sódica.
B.
1 frasco de tampão de ensaio.
C.
1 frasco opaco de traçador que consiste em um
anticorpo IgG de coelho anti-HBc marcado com
isoluminol. Contém < 0,1% de azida sódica.
D.
1 frasco vazio.
Preparação
Veja a figura seguinte.
Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las
para voltar a ressuspendê-las.
•
Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de
espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas).
•
Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o
cartucho até que as micropartículas se ressuspendam totalmente.
•
Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado, NÃO
UTILIZE O CARTUCHO.
•
Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e
retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte.
•
Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa
perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma
vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto.
•
Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento. Uma vez carregado o
cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos periódicos.
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Precauções
Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO.
Uso exclusivo para profissionais.
A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente
explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água.
ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO.
Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante.
Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos.
Coleta e conservação das amostras
Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (EDTA, Li-heparina,
Na-heparina, Na-citrato e ACD). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. As amostras
não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Nas
diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte, o processamento e
a conservação das amostras.
Soro
As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8°C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem
ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. As amostras podem congelar-se/descongelar-se no
máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso
contrário, elimine-as todas antes da análise.
Plasma
As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8°C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo,
devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. Descongelar o plasma a 37°C. Descongelar as
amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas
amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise.
Volume de amostra
O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH anti-HBc varia em função do tipo
de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 100 µL mais o volume morto, que é de 200 µL se é
utilizada a copa de amostra recomendada (REF 3000-8209).
Outros materiais
Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado.
REF 3000-8579
BIO-FLASH anti-HBc Calibrators (Calibradores)
REF 3000-8580
BIO-FLASH anti-HBc Controls (Controles)
Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação.
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Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio
BIO-FLASH anti-HBc está incluída nos códigos de barras dos tubos.
Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos.
Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes
de processar amostras, calibradores ou controles:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas)
Nota: O desenho das cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE 000762984-0001).
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Ativadores)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema)
Instrumento / realização do ensaio
No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio.
Rastreabilidade de calibradores e controles
Os resultados são expressos em UA/mL e foram estabelecidos por meio de múltiplos ensaios com o instrumento
BIO-FLASH utilizando lotes específicos de reagentes e padrões internos referenciados ao standard anti-HBc IgG do
Instituto Paul Ehrlich (HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc).
Calibração
O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de reagentes.
No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é específica para
cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os resultados dos controles
saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento.
Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT.
Controle de qualidade
Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar dois níveis de controles. Os
controles BIO-FLASH anti-HBc negativo e positivo foram desenhados para tal programa. Os controles devem ser
analisados ao menos cada 24 horas por dia de utilização. Assegure-se de que os resultados dos controles se
encontram dentro dos limites de aceitação já que, se não for assim, pode ser indicativo de resultados não válidos,
ante os quais o usuário deverá tomar medidas corretivas. Neste caso, verifique todos os resultados obtidos desde
a última comprovação de controle de qualidade aceitável do analito em questão. Pode ser necessário re-calibrar o
instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação. Para a identificação e resolução
de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al.7
Conservação e estabilidade
Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do
cartucho se forem conservados a 2-8°C em posição vertical.
Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8°C é de
8 semanas.
Interpretação de resultados
A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL), por interpolação na Curva de
Calibração de Trabalho guardada. Os resultados obtidos com o BIO-FLASH anti-HBc são expressos como UA/mL
(Unidades arbitrárias/mL). Como o ensaio é qualitativo, o valor numérico do resultado só é indicativo da quantidade de
anticorpo presente.
A determinação de anti-HBc utilizando o ensaio BIO-FLASH anti-HBc é interpretada como segue:
•
•
•
As amostras com resultado < 0,90 UA/mL são consideradas não reativas (negativas).
As amostras com resultado ≥ 0,90 e < 1,00 UA/mL são consideradas indeterminadas (zona cinza).
As amostras com resultado ≥ 1,00 UA/mL são consideradas reativas (positivas).
Amostras com resultado inicialmente reativo ou indeterminado devem ser re-analisadas por duplicado. Se na
repetição ambos os valores são inferiores a 0,9, a interpretação final do ensaio é de resultado negativo para
anticorpos anti-HBc. Se algum dos resultados é positivo ou indeterminado, a amostra deve ser investigada com
um teste adicional e os resultados usados em conjunto com outros dados, como por exemplo, sintomas e história
clínica. Um resultado repetidamente positivo é indicativo de infecção pelo HBV. As amostras com uma
concentração superior a 12,00 UA/mL são reportadas como > 12,00.
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Limitações
O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar uma infecção por HBV. Portanto, os
resultados de BIO-FLASH anti-HBc devem ser utilizados em conjunção com outros dados como, por exemplo, a
sintomatologia, a historia clínica, os resultados de outras provas, e toda a informação adicional relevante. Um
resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por HBV. Como em todos os ensaios
imunológicos sensíveis, existe a possibilidade de obter resultados positivos que não se repitam.
Resultados esperados
O anticorpo anti-HBc é o marcador mais freqüente de infecção pelo vírus da hepatite B, pois ele é encontrado
em infecção aguda, crônica ou passada. A prevalência de anti-HBc e de outros marcadores de infecção por
hepatite B varia amplamente no mundo, desde alta (70-95%, África, Ásia e Pacífico Ocidental) a intermediária
(20-55%, Sul e Leste da Europa) e baixa (4-6%, Europa Ocidental, América do Norte e partes da América do
2
Sul). A implementação dos programas de imunização deveria diminuir a incidência de infecção pelo HBV.
Características funcionais
NOTA: os seguintes dados são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a
estes dados.
Especificidade
A avaliação de especificidade foi baseada em testar amostras de soro de doadores de sangue não selecionados,
incluindo doadores de primeira vez e de pacientes internados. Foram testadas em total 5097 amostras frescas de
soro, não selecionadas, provenientes de dois bancos de sangue, 3536 das quais eram do Centro EFS Atlantique
de Tours (França) e 1561 do Centro EFS Nord de France de Lille (França).
As amostras "repetidamente reativas" foram re-analisadas usando outro teste comercial. Então a especificidade foi
calculada, obtendo-se os resultados mostrados na tabela a seguinte:
Amostras
testadas
Doadores de sangue
Pacientes hospitalizados
n
5097
210
RR
Inicialmente
Repetidamente
RR
positivas Especificidade
reativas
reativas (RR) indeterminadas
confirmadas
(IR)
%
n
n
n
n
31
13
5
3
99,9
28
25
0
25
100
Sensibilidade
Um painel de amostras comprovadamente positivas para anti-HBc de origem variada foi testado com o
BIO-FLASH anti-HBc em comparação com métodos comerciais de EIA e CLIA disponíveis para anti-HBc. Este
painel incluía 28 amostras frescas do mesmo dia (≤ 1 dia depois da coleta). Os resultados de sensibilidade são
mostrados na tabela seguinte:
Amostras Amostras
Sensibilidade
Método de referência testadas reativas
%
n
n
EIA método
403
400
100
CLIA método
205
205
100
No caso das 403 amostras avaliadas versus o método EIA, duas amostras saíram em zona cinza com o
BIO- FLASH e outra com o método de referência. Por essa razão, essas amostras não foram consideradas para o
cálculo de sensibilidade.
Sensibilidade para soroconversão
Foram realizados estudos adicionais de sensibilidade pela análise de 3 painéis de soroconversão para hepatite B.
Os resultados obtidos com o BIO- FLASH anti-HBc foram concordantes com os dos outros métodos comerciais
para todas as amostras.
Precisão
A precisão intra-ensaio e a total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as
diretrizes CLSI EP05-A2. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte:
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Controle negativo
Controle positivo
Cerca do valor de corte
Média (UA/mL)
0,28
2,12
1,09
Intra-ensaio
0,077 SD
4,3% CV
5,0% CV
Total
0,094 SD
5,8% CV
7,3% CV
Reprodutibilidade
A repetibilidade entre réplicas, entre lotes e entre instrumentos foi avaliada utilizando 50 amostras. Os resultados
estão resumidos na tabela seguinte:
Réplica 2 vs. Réplica 1
Lote 2 vs. Lote 1
Instrumento 2 vs. Instrumento 1
n
50
50
50
Co-negatividade
100%
100%
100%
Co-positividade
100%
100%
100%
Interferências
Estudos segundo as diretrizes CLSI EP7-A2 demonstraram que as seguintes substâncias potencialmente
interferentes não alteram os resultados de BIO-FLASH anti-HBc:
Substância potencialmente interferente
Hemoglobina
Bilirrubina indireta
Bilirrubina direta
Triglicérides
Fator reumatóide
HAMA (anticorpo humano anti-murino)
Concentração
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1300 mg/dL
800 UI/mL
1 µg/mL
% Interferência
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reatividade cruzada
Foram analisadas com o ensaio BIO-FLASH anti-HBc um total de 111 amostras positivas para condições com
potencial de produzir reação cruzada e de mulheres grávidas. Considera-se que ocorre uma reação cruzada
quando o diagnóstico muda de positivo a negativo ou vice-versa. As amostras reativas foram comparadas com um
ensaio de referência para avaliar a concordância entre os ensaios. Os resultados estão resumidos na tabela
seguinte:
Reação cruzada potencial
ANA (anticorpos anti-nucleares)
anti-CMV (citomegalovírus)
anti-E. coli
anti-EBV (vírus Epstein-Barr)
anti-HAV-IgG (vírus da hepatite A)
anti-HAV-IgM (vírus da hepatite A)
anti-HDV IgG (vírus da hepatite delta)
anti-HEV (vírus da hepatite E)
anti-HIV (vírus da imunodeficiência humana)
anti-HSV (vírus herpes simplex)
anti-rubéola
anti-toxoplasma
anti-VZV (vírus da varicela zoster)
IgG elevada
IgM elevada
Mononucleose
Grávidas
Grávidas (multíparas)
RF (fator reumatóide)
RPR (reagina plasmática rápida)
Concordância
5/5
6/6
12/12
4/4
6/6
5/5
5/5
4/4
7/7
5/5
10/10
4/4
5/5
5/5
4/4
4/4
7/7
5/5
5/5
3/3
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Limite de detecção e sensibilidade analítica
O limite de detecção (LD), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, se situa em 0,39 UA/mL.
A sensibilidade analítica obtida foi de 0,74 PEI U/mL. Foi determinada por interpolação do valor de corte na reta de
regressão obtida ao provar diluições seriadas do standard anti-HBc do Instituto Paul Ehrlich (HBc Reference
Material 82, IgG-anti-HBc). De acordo com estudos internos com o BIO-FLASH anti-HBc, 1,00 PEI-U/mL é
equivalente a cerca de 1,4 UI/mL do primeiro padrão internacional para anti-HBc (código NIBSC 95/522).
Efeito de prozona
O BIO-FLASH anti-HBc é um ensaio de inibição de dois passos. O protocolo do teste inclui uma etapa de
lavagem após a incubação da amostra, o que elimina o efeito de prozona. Experimentalmente não foi observado
nenhum efeito de prozona com uma amostra tão elevada quanto 160,00 UA/mL.
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