APE-1 - UFRN

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
Thalita Santana Conceição
IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS APE-1 E XRCC-1 EM CARCINOMA
EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL
Natal/RN
2016
Thalita Santana Conceição
IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS APE-1 E XRCC-1 EM CARCINOMA
EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós Graduação em Patologia Oral
da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como parte dos
requisitos para obtenção do Título de
Mestre em Patologia Oral.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Roseana de
Almeida Freitas
Natal/RN
2016
3
DEDICATÓRIA
4
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais,
Antônio Henrique e Osmalinda, por seu
amor, dedicação e apoio e por serem meus
maiores incentivadores.
5
AGRADECIMENTOS
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, acima de tudo, por me proporcionar discernimento, sabedoria e determinação para seguir em
frente.
Ao meu pai, Antônio Henrique, por sempre ter me incentivado nos estudos e por nunca ter deixado
de oferecer todo o apoio necessário à minha formação pessoal e profissional. Muito obrigada por
sempre acreditar em mim.
À minha mãe, Osmalinda, por estar ao meu lado em todos os momentos, por me ajudar sempre que
precisei e por todos os conselhos e palavras sábias. Sem você, eu não teria conseguido!
Ao meu namorado e amor da minha vida, Thiago, por todo amor, carinho, respeito, paciência e
compreensão ao longo desses (quase) dez anos. Muito obrigada por estar presente nos melhores
momentos dessa jornada e nunca se ausentar nos dias ruins. Obrigada por ouvir minhas reclamações,
dúvidas e anseios e por sempre me apoiar em todas as decisões.
À minha orientadora, Profª Drª Roseana de Almeida Freitas, por ter me guiado nesse caminho com
muita sabedoria. Muito obrigada pela paciência, dedicação, compreensão e por todas as conversas e
conselhos. Você é um exemplo de competência e profissionalismo que pretendo levar para toda vida.
À minha eterna orientadora, Profª Drª Maria Carmen Fontoura Nogueira da Cruz, por ter me
escolhido como bolsista na graduação e ter feito eu me apaixonar pela Patologia Oral. Eu jamais
teria chegado até aqui se não fosse a experiência maravilhosa que eu tive no curso de Odontologia
como sua aluna. Muito obrigada pela sua amizade e por sempre estar presente.
À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Profª Drª Lélia Batista de
Souza, a quem admiro muito por seu amor e dedicação à docência e ao programa. Agradeço
imensamente por todas as oportunidades e por compartilhar seu conhecimento conosco, através de
ensinamentos que levarei para sempre.
Ao Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, por nos inspirar todos os dias com sua gentileza, disposição e amor
à profissão. Agradeço também pelas correções sugeridas no exame de Qualificação deste trabalho.
A todos os professores do programa de Pós-Graduação em Patologia Oral com quem tive o prazer de
conviver e aprender ao longo desses dois anos. À Profª Drª Éricka Janine Dantas da Silveira, por
seu exemplo de entusiasmo e dedicação, por todas as oportunidades e trabalhos desenvolvidos sob
sua orientação, por todos seus ensinamentos na Clínica de Estomatologia e fora dela e também pelas
correções sugeridas no exame de Qualificação deste trabalho. Às demais professoras da Clínica de
Estomatologia, Profª Drª Ana Myriam Costa de Medeiros e Profª Drª Patrícia Teixeira de Oliveira,
pelos momentos de grande aprendizado vividos na disciplina e clínica. À Profª Drª Márcia Cristina
da Costa Miguel, por compartilhar seu vasto conhecimento conosco e por todos os momentos de
descontração. À Profª Drª Hébel Cavalcanti Galvão, por todo o incentivo e por ser essa pessoa
maravilhosa. Ao Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel, por seu exemplo de profissionalismo
e por todos os ensinamentos e conselhos na disciplina de Patologia Periapical. À Profª Drª Lélia
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Maria Guedes Queiroz, por toda paciência e dedicação. Ao Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes
Costa, pelo seu exemplo de dedicação e incentivo. Ao Prof. Carlos Augusto Galvão Barbosa, por
compartilhar seu conhecimento conosco e nos ensinar além da Patologia.
Aos professores das disciplinas de Bioestatística, Prof. Dr. Kênio Costa Lima e Prof. Dr. Ângelo
Roncalli, que me fizeram ver o mundo da bioestatística com novos olhos e foram fundamentais para
o meu desenvolvimento pessoal e profissional e para a análise estatística desta pesquisa.
Aos amigos do “AP das Atipias”, Jefferson, Leorik e Mara. Vocês foram os melhores companheiros
que alguém poderia ter. Muito obrigada por todos os momentos compartilhados, todas as brigas,
todos os abraços, todos os conselhos, todos os Bodegas. Vocês foram fundamentais para o meu
crescimento pessoal e hoje posso dizer que são muito mais que amigos, são meus irmãos de coração e
nós sempre seremos uma família, mesmo que estejamos separados. Amo vocês!
Aos amigos da “Disciplina de Arquivologia”, Mestra Melka, Luiz Arthur, Marianna e Rodrigo.
Vocês tornaram a coleta de dados deste trabalho muito mais fácil e prazerosa. Muito obrigada por
todas as idas à LIGA e todos os conhecimentos compartilhados. Melka, minha irmã patológica, sem
você esse trabalho não seria o mesmo. Agradeço muitíssimo todo o seu esforço, organização e ajuda,
além de todos os momentos juntas. Você é uma pessoa iluminada e sempre será minha referência de
dedicação. Pode contar comigo sempre! Luiz Arthur, obrigada por ter sido meu companheiro de
todas as horas e por sempre me mostrar o lado bom da vida! Marianna, obrigada por ser essa grande
amiga e meu maior exemplo de competência! Rodrigo, agradeço por todos os momentos de estudo e
por ter compartilhado seu conhecimento comigo sempre que pode, muito obrigada também por todos
os momentos de descontração.
Aos demais amigos da turma de Mestrado, que foram minha família em Natal. Amanda, obrigada
pela amizade e por ser exemplo de força de vontade. Angélica, muito obrigada por ser minha
parceira e companheira de muay thai (“hoje tem!”), além da pessoa mais divertida que eu já conheci!
Hugo, agradeço imensamente por ter você em minha vida; obrigada por nos recepcionar da melhor
forma, graças a você minha estadia em Natal foi maravilhosa! Eduardo, obrigada por compartilhar
um pouco da sua sabedoria e sempre me ensinar e me ajudar quando precisei. Patrícia, agradeço você
por ser essa pessoa doce e agradável e por estar sempre disponível.
À Maria Luiza, minha “soul sister”, pelas excelentes conversas, pelos conselhos e por me ajudar na
análise estatística e interpretação dos resultados deste trabalho.
Aos doutorandos, Ana Luisa, Andréia, Clarissa, Denise, Edilmar, Jadson, Jamile, Laudenice,
Laura, Luciana, Marcelo, Natália, Rafaella, Roseane, Salomão, Tiago e Viviane que me ajudaram
muito em todos os aspectos do mestrado.
Aos funcionários da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, em especial Najara, Michelle e
Eduardo, não tenho palavras para dizer o quanto vocês foram fundamentais para a realização deste
trabalho. Muito obrigada por tudo!
8
Aos funcionários e colaboradores do PPgPO, Gracinha, Hévio, Idel, Lourdinha, Patrícia, Ricardo e
Sandrinha, muito obrigada pela disponibilidade e auxílio.
Aos familiares e amigos que estão sempre ao meu lado, me incentivam e torcem por mim, muito
obrigada!
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro que possibilitou a
realização desta pesquisa.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), pela qualidade de seus serviços e por
todas as oportunidades de aprendizado e crescimento profissional.
“Eis o meu segredo. É muito simples: só se vê bem com o coração. O essencial é invisível aos olhos.”
(Antoine de Saint-Exupéry)
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Invictus
Dentro da noite que me rodeia
Negra como um poço de lado a lado
Agradeço aos deuses que existem
por minha alma indomável.
Sob as garras cruéis das circunstâncias
eu não tremo e nem me desespero
Sob os duros golpes do acaso
Minha cabeça sangra, mas continua erguida.
Mais além deste lugar de lágrimas e ira,
Jazem os horrores da sombra.
Mas a ameaça dos anos,
Me encontra e me encontrará, sem medo.
Não importa quão estreito o portão
Quão repleta de castigo a sentença,
Eu sou o mestre do meu destino,
Eu sou o capitão da minha alma.
William Ernest Henley
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RESUMO
11
RESUMO
Os sistemas de reparo do DNA desempenham um papel crítico na proteção do genoma
humano contra danos causados por agentes cancerígenos presentes no ambiente. Alterações
em genes de reparo de DNA podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de tumores e de
resistência das células malignas a agentes quimioterapêuticos. A principal via de reparo de
danos oxidativos do DNA é a via de reparo por excisão de bases. O objetivo deste estudo foi
investigar a imunoexpressão da APE-1 e XRCC-1, que são proteínas envolvidas no reparo do
DNA por excisão de bases, e sua associação com parâmetros clínicos e histopatológicos em
carcinoma epidermoide de língua oral (CELO), a fim de investigar um possível valor
prognóstico para essas proteínas. A expressão imuno-histoquímica de APE-1 e XRCC-1 foi
avaliada de forma semi-quantitativa em 50 casos de CELO. Os dados clínicos foram coletados
no prontuário médico de cada paciente e a gradação histopatológica foi efetuada para cada
caso. A análise estatística com os testes de Qui-quadrado e Exato de Fisher foi realizada para
determinar a associação entre as expressões das proteínas e características clínico-patológicas;
adotou-se um valor de significância de p<0,05. APE-1 foi altamente expressa no núcleo e no
citoplasma em 56% dos casos. XRCC-1 mostrou alta expressão apenas no núcleo em 60% dos
casos. A alta expressão de XRCC-1 foi significativamente associada aos estádios clínicos I e
II (p = 0,02). Ambas as proteínas não foram associadas a outros parâmetros clínicos ou
gradação histopatológica. Por fim, nossos resultados demonstraram que as proteínas de reparo
do DNA por excisão de bases APE-1 e XRCC-1 estão positivamente expressas em CELO, no
entanto, não estão relacionadas com parâmetros clínicos e histológicos, exceto a associação de
XRCC-1 com melhor estadiamento clínico. Os resultados deste experimento indicam que a
expressão imuno-histoquímica dessas proteínas não possui associação com parâmetros
prognósticos nesta neoplasia.
Palavras-chave: Câncer oral; Reparo do DNA; Prognóstico; Imuno-histoquímica.
12
ABSTRACT
13
ABSTRACT
DNA repair systems play a critical role in protecting the human genome from damage caused
by carcinogens present in the environment. Mutations in DNA repair genes may be
responsible for tumor development and resistance of malignant cells to chemotherapeutic
agents. The major pathway for oxidative DNA damage repair is the base excision repair
pathway. The objective of this study was to investigate the immunoexpression of APE-1 and
XRCC-1, which are proteins involved in DNA base excision repair and its association with
clinical and histopathological parameters in oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC),
in order to investigate a possible prognostic value for those proteins. The expression of APE-1
and XRCC-1 was evaluated semi-quantitatively by immunohistochemistry in 50 OTSCC
cases. Clinical data was collected from patients’ medical charts and histopathological grading
was performed for each case. Statistical analysis (Chi-square and Fisher’s exact tests;
significance of 5%) was performed to determine the association between protein expressions
and clinico-pathological characteristics. APE-1 was highly expressed in nucleus and
cytoplasm in 56% of cases. XRCC-1 showed overexpression only in nucleus in 60% of cases.
High expression of XRCC-1 was significantly associated to clinical stages I and II (P=0.02).
Both proteins were not associated to other clinical parameters or histopathological grading.
Our findings demonstrate that DNA base excision repair proteins APE-1 and XRCC-1 are
upregulated in OTSCC, however, they are not related to clinical and histologic parameters,
except for XRCC-1 association to better clinical staging. Our results indicate that the
immunohistochemical expression of these proteins has no association with prognostic
parameters in this tumor.
Key words: Oral cancer; DNA repair; Prognosis; Immunohistochemistry.
14
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
15
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Reparo do DNA por excisão de bases.
26
Quadro 1
Avaliação histopatológica de risco proposta por BRANDWEIN-GENSLER et
al., 2005.
36
Quadro 2
Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de
incubação dos anticorpos primários.
38
Quadro 3
Variáveis dependentes elencadas para os testes estatísticos.
39
Quadro 4
Variáveis independentes elencadas para os testes estatísticos.
40
Figura 2
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo invasão perineural em pequenos
fascículos nervosos.
46
Figura 3
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo infiltrado linfocitário contínuo.
46
Figura 4
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo pior padrão de invasão tipo 4 e
escasso infiltrado linfocitário.
47
Figura 5
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão positiva de
APE-1 >50% no front de invasão tumoral.
51
Figura 6
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão citoplasmática
de APE-1.
51
Figura 7
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão nuclear e
citoplasmática de APE-1.
52
Figura 8
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão positiva de
XRCC-1 >50% no front de invasão tumoral.
52
Figura 9
Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo alta imunoexpressão de XRCC1.
53
Figura 10
Distribuição relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de
acordo com a imunoexpressão de APE-1 e a presença de metástase linfonodal, a
presença de recidiva locoregional e o desfecho em cinco anos de
acompanhamento.
56
Figura 11
Distribuição relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de
acordo com a imunoexpressão de XRCC-1 e a presença de metástase linfonodal,
a presença de recidiva locoregional e o desfecho em cinco anos de
acompanhamento.
56
16
LISTA DE TABELAS
17
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Parâmetros clínicos e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral estudados. Natal –RN, 2016
43
Tabela 2
Parâmetros clínicos de seguimento dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral estudados. Natal –RN, 2016
44
Tabela 3
Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise histopalógica dos
casos de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por
Brandwein-Gensler et al. (2005). Natal – RN, 2016
45
Tabela 4
Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise da imunoreatividade
das proteínas de reparo do DNA (APE-1 e XRCC-1) no núcleo e citoplasma das
células do front de invasão tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral.
Natal – RN, 2016
49
Tabela 5
Distribuição absoluta e relativa da imunoreatividade nuclear ou citoplasmática
da proteína APE-1 nas células do front de invasão tumoral de carcinoma
epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
49
Tabela 6
Distribuição absoluta e relativa da imunoreatividade nuclear ou citoplasmática
da proteína XRCC-1 nas células do front de invasão tumoral de carcinoma
epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
50
Tabela 7
Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua
oral, de acordo com a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (APE-1
e XRCC-1), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase linfonodal, o
tratamento, a presença de recidiva locoregional e o desfecho em cinco anos de
acompanhamento. Natal – RN, 2016
55
Tabela 8
Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua
oral de acordo com a expressão das proteínas de reparo do DNA (XRCC-1 e
APE-1). Natal – RN, 2016.
57
Tabela 9
Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua
oral de acordo com a gradação de malignidade recomendada por BrandweinGensler et al. (2005) e a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (APE1 e XRCC-1). Natal – RN, 2016.
59
18
LISTA DE ABREVIATURAS
19
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

APE-1
AP – endonuclease apurínica/apurimidínica

ATP
Adenosina tri-fosfato

CE
Carcinoma epidermoide

CEO
Carcinoma epidermoide oral

CELO
Carcinoma epidermoide de língua oral

CECP
Carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço

CEP/LNRCC
Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Riograndense Contra o
Câncer.

BER
Via de reparo do DNA por excisão de bases.

DNA
Do
inglês,
deoxyribonucleic
acid,
traduzido
como
ácido
desoxirribonucleico.

EROs
Espécies reativas de oxigênio

HPV
Do inglês, human papillomavirus, traduzido como papiloma vírus
humano.

INCA
Instituto Nacional do Câncer

NER
Via de reparo do DNA por excisão de nucleotídeos

mtDNA
DNA mitocondrial

MMR
Via de reparo do DNA por reparo de mal emparelhamento, do inglês
mismatch repair

OMS
Organização Mundial de Saúde

PCR
Reação de Polimerase em Cadeia

TNM
Do inglês, tumor-node-metastasis, refere-se ao sistema de estadiamento
clínico, que avalia: tamanho do tumor primário (T), envolvimento de
linfonodos regionais (N) e envolvimento por metastases à distância (M).

SGHM
Sistemas de gradação histopatológica de malignidade

XRCC-1
X-ray repair cross-complementing group 1
20
SUMÁRIO
21
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 16
2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 19
2.1 CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL......................................................................................... 19
2.2 REPARO DO DNA ......................................................................................................................... 23
2.2.1 Reparo do DNA por Excisão de Bases (BASE EXCISION REPAIR – BER) ..................... 24
2.2.2 APE-1 (AP- endonuclease apurínica/apurimidínica) ......................................................... 26
2.2.3 XRCC-1 (X-ray repair cross-complementing group 1) .......................................................... 29
3. PROPOSIÇÃO ........................................................................................................... 33
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 35
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ......................................................................................................... 35
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ............................................................................................. 35
4.3 POPULAÇÃO ....................................................................................................................... 35
4.4.1 Critérios de inclusão.......................................................................................................... 35
4.4.2 Critérios de exclusão ......................................................................................................... 35
4.5 ESTUDO CLÍNICO ........................................................................................................................ 36
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO ........................................................................................................... 36
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ............................................................................................ 37
4.7.1 Método imuno-histoquímico.............................................................................................. 37
4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico ................................................................................ 38
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................................. 39
5. RESULTADOS .......................................................................................................... 42
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ......................................................................................... 42
5.2 RESULTADOS DA ANÁLISE MORFOLÓGICA ........................................................................ 45
5.3 RESULTADOS DA ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA ......................................................... 48
5.4 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 54
6. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 61
7. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 68
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 70
APÊNDICES .................................................................................................................. 75
ANEXOS ........................................................................................................................ 77
15
INTRODUÇÃO
16
1. INTRODUÇÃO
O carcinoma epidermoide oral (CEO) é um sério problema de saúde pública, uma vez
que corresponde a mais de 90% de todas as neoplasias malignas da cavidade oral e
aproximadamente 38% dos tumores malignos de cabeça e pescoço. O sítio intra-oral mais
acometido por este tipo de câncer é a língua e, apesar dos avanços no tratamento, o seu
prognóstico ainda é pobre, com taxa de sobrevida estimada de 40% em cinco anos (MOORE
et al., 2000; NEVILLE et al., 2009; THIAGARAJAN et al., 2014).
A carcinogênese oral é um processo multifatorial, tendo sido relacionada
principalmente à exposição à carcinógenos, como tabaco e álcool, e também ao acúmulo de
alterações genéticas. Essas alterações incluem modificações nas funções normais de protooncogenes e genes supressores de tumor que afetam o ciclo celular, a diferenciação,
proliferação e morte celulares, imunidade celular e reparo do DNA (ALBERTS et al., 2010;
THIAGARAJAN et al., 2014).
Tendo em vista a sua origem multifatorial e que o câncer é uma doença genética
resultante da interação de diversos genes com o meio ambiente, pesquisadores têm
investigado o papel de proteínas transcritas por esses genes que possam atuar como
biomarcadores de prognóstico do CEO, de forma a elucidar seu comportamento e ajudar no
desenvolvimento de futuros alvos terapêuticos (FARNEBO et al., 2015; HSIA et al., 2015;
HUANG et al., 2005).
Recentemente, tem sido observado que um importante mecanismo genético do corpo
humano está relacionado à carcinogênese. Este mecanismo é o reparo do DNA, que evita que
células que sofreram mutação entrem no ciclo celular e continuem a se reproduzir (ALBERTS
et al., 2010). Esse sistema de reparo desempenha um papel importante na proteção do genoma
humano contra danos causados por carcinógenos presentes no meio-ambiente, tendo sido
descritos mais de 130 genes com ações em diferentes vias, como o reparo por excisão de
nucleotídeos e por excisão de bases (FARNEBO et al., 2015).
A via de reparo por excisão de bases (BER) vem sendo descrita como a principal via
deste sistema, tendo como principais proteínas atuantes a APE-1 e XRCC-1 (MAHJABEEN
17
et al., 2014). Estudos recentes demonstraram que a expressão dessas proteínas encontra-se
desregulada em diversos tipos de cânceres, incluindo o carcinoma epidermoide de cabeça e
pescoço, podendo estar relacionada a um pior prognóstico (HSIA et al., 2015).
Considerando o exposto e a constante busca por biomarcadores moleculares que
possam prever o prognóstico destas lesões, este estudo teve como objetivo investigar a
associação entre a imunoexpressão das proteínas APE-1 e XRCC-1 e os parâmetros
prognósticos e gradação histológica de malignidade, em uma série de casos de carcinoma
epidermoide de língua oral (CELO).
18
REVISÃO DA LITERATURA
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL
Dentre todas as neoplasias malignas, aproximadamente 5% ocorrem na região de
cabeça e pescoço e cerca da metade acomete especificamente a cavidade oral. Mais de 90%
dos tumores malignos nesta localização são representados pelo CEO, também denominado
carcinoma de células escamosas ou carcinoma espinocelular. Esta lesão consiste em uma
neoplasia maligna que se origina no epitélio de revestimento (JOHNSON; JAYASEKARA;
AMARASINGHE, 2011; NEVILLE et al., 2009).
O carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) é uma neoplasia relativamente
comum, apresentando uma incidência mundial de 500.000 novos casos por ano (JOHNSON;
JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011). No Brasil, a estimativa do Instituto Nacional do
Câncer (INCA) para o ano de 2014, previu o surgimento de 14.290 novos casos de cânceres
primários em cavidade oral (lábios, mucosa bucal, gengivas, palato duro, língua e assoalho),
com um risco estimado de 11 novos casos a cada 100 mil homens e 4 a cada 100 mil mulheres
(INCA, 2014).
O CEO é uma doença que acomete principalmente indivíduos do sexo masculino após
a quinta década de vida. A idade média de apresentação do CEO é da 5ª ao início da 6ª década
em populações asiáticas, em comparação às 7ª e 8ª décadas na população da América do
Norte (JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011). Entretanto, um aumento
alarmante na incidência de câncer oral entre pacientes jovens tem sido reportada em várias
partes do mundo, com estudos sugerindo que 4 a 6% desses cânceres ocorram em pacientes
com menos de 40 anos (SABA et al., 2011; THIAGARAJAN et al., 2014).
Diversos fatores de risco estão envolvidos no desenvolvimento do CEO. Não existe
consenso entre os pesquisadores quanto a um agente ou fator causador isolado, que esteja
claramente definido ou aceito. Sabe-se, no entanto, que tanto fatores extrínsecos quanto
intrínsecos podem atuar no desenvolvimento e progressão dessa neoplasia. Dentre os fatores
intrínsecos citam-se as alterações genéticas, deficiências nutricionais e imunossupressão; e os
fatores extrínsecos incluem raios solares, fumo, álcool e alguns vírus, como o papilomavírus
humano (HPV) (JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011; NEVILLE et al.,
2009).
20
Embora saiba-se que fatores extrínsecos, como o fumo e o álcool sejam fatores
etiológicos bem estabelecidos, apenas um pequeno número de usuários desses produtos
desenvolve o câncer oral. Este fato desperta a possibilidade de um possível envolvimento de
outros fatores agindo de forma sinérgica. Portanto, pesquisadores afirmam que a
carcinogênese oral está intimamente associada aos fatores intrínsecos, que podem
desencadear alterações genéticas acumulativas, que refletem a suscetibilidade e a tendência do
genoma para adquirir múltiplas alterações, conduzindo ao desequilíbrio no ciclo celular,
incluindo divisão, diferenciação e morte das células (BARNES et al., 2005; NAGPAL; DAS,
2003; NEVILLE et al., 2009).
Esta neoplasia ocorre principalmente na língua, podendo afetar outros sítios como
assoalho, mucosa jugal, lábios, gengiva e palato. A apresentação clínica do CEO é variável, já
que
esta
lesão
pode
apresentar-se
com
aspectos
leucoplásicos,
eritroplásicos,
eritroleucoplásicos, exibindo ou não ulcerações, com crescimento exofítico, endofítico ou
verrucoso (NEVILLE et al., 2009). Essas lesões em geral são assintomáticas, mas em alguns
casos podem se tornar dolorosas em decorrência de trauma ou da infiltração tumoral e
inflamação em casos mais avançados (BARNES et al., 2005; NEVILLE et al., 2009).
Novas pesquisas afirmam haver uma relação entre a localização anatômica e o
prognóstico dos pacientes com CEO. Segundo os autores, os carcinomas epidermoides de
língua costumam ser lesões mais agressivas, infiltrativas, menos diferenciadas, com elevado
potencial metastático e prognóstico desfavorável, enquanto as lesões em outras localizações,
tais como o lábio, apresentam melhor prognóstico, diferenciação histopatológica e baixa
frequência de metástases (ALMANGUSH et al., 2015; RIKARDSEN et al., 2014;
THIAGARAJAN et al., 2014).
O sistema de estadiamento clínico de tumores (TNM) tem sido utilizado como
padrão internacional para classificar as neoplasias malignas em estádios e estimar tanto a
resposta clínica à terapia quanto a sobrevida dos pacientes (SOBIN; WITTEKIND, 2002;
LINDENBLATT et al., 2012). Este sistema baseia-se na avaliação de três componentes da
doença: T – tamanho/ extensão do tumor primário; N – metástases em linfonodos regionais; e
M – metástases à distância (SOBIN; WITTEKIND, 2002; WITTEKIND et al., 2002). No
entanto, alguns casos de carcinomas de células escamosas, diagnosticados em estádios iniciais
e tratados corretamente, evoluem com recorrências locais e disseminação mestastática,
determinando, por fim, o óbito do paciente. Tais constatações têm suscitado a busca por
21
outros fatores prognósticos capazes de suplementar o sistema TNM (LINDENBLATT et al.,
2012).
Ao exame histopatológico, o CEO caracteriza-se por uma proliferação de células
epiteliais malignas exibindo pleomorfismo celular e nuclear, figuras de mitoses típicas e
atípicas, podendo produzir pérolas córneas. Essas células podem se arranjar formando cordões
ou ninhos celulares de proporções variadas, dispondo-se com bordas ou trabéculas sólidas
bem delimitadas ou infiltrativas, ou ainda em pequenos grupos, cordões celulares infiltrativos
e células isoladas vastamente dispersas no tecido conjuntivo estromal. O estroma tumoral
pode apresentar-se infiltrado por células inflamatórias linfoplasmocitárias em variadas
intensidades, ou mesmo ser caracterizado por sua ausência. Por vezes, as células tumorais
podem ser encontradas invadindo pequenas ou grande estruturas nervosas (BARNES et al.,
2005; BRANDWEIN-GENSLER et al., 2010; NEVILLE et al., 2009).
Levando em consideração essas características microscópicas, os sistemas de gradação
histopatológica de malignidade (SGHM) para os CEOs surgiram com o intuito de fornecer
conhecimentos adicionais que pudessem explicar o comportamento biológico discrepante de
tumores com características clínicas semelhantes. Esse conjunto de informações contribuiria
para uma melhor determinação do prognóstico e sobrevida dos pacientes, através do
delineamento do tratamento adequado para cada caso (LINDENBLATT et al., 2009).
O estudo de Broders (1920) foi o primeiro a propor um método para gradação do
carcinoma epidermoide oral. Com base no grau de diferenciação das células neoplásicas, este
autor classificou os tumores em: grau I (até 25% das células indiferenciadas), grau II (25% 50% das células indiferenciadas), grau III (50% - 75% das células indiferenciadas) e grau IV
(75% - 100% das células indiferenciadas). De acordo com este sistema, tumores com grau I
ou II apresentam baixas taxas de recorrência e metástase, ao passo que as lesões com grau III
ou IV exibem maior tendência ao desenvolvimento de metástase.
Embora a classificação proposta por Broders (1920) tenha constituído um marco para
o início da elaboração dos SGHM, estudos posteriores encontraram um alto índice de
discordância entre os examinadores e uma falta de associação entre este sistema e o
prognóstico dos carcinomas de células escamosas orais (LOURENÇO et al., 2007).
Tais constatações levaram ao desenvolvimento de vários outros SGHM para o
carcinoma epidermoide oral, como os de Lund et al. (1975), Anneroth e Hansen (1984) e
22
Anneroth, Batsakis e Luna (1987). Por analisarem não apenas as características das células
tumorais, mas também aspectos relacionados ao hospedeiro, os SGHM propostos por
Anneroth e Hansen (1984) e Anneroth, Batsakis e Luna (1987) se destacaram em relação aos
demais.
Posteriormente, Bryne et al. (1989) sugeriram uma modificação no sistema descrito
por Anneroth, Batsakis e Luna (1987), caracterizada pela gradação apenas da área mais
invasiva do tumor, posteriormente denominada front de invasão. Alguns anos mais tarde, esse
autores preconizaram a utilização de um SGHM para carcinomas epidermoides orais baseado
na avaliação de 4 parâmetros no front de invasão tumoral: grau de ceratinização, padrão de
invasão, pleomorfismo nuclear e infiltrado inflamatório. Neste SGHM, são atribuídos escores
de 1 a 4 para cada um dos parâmetros morfológicos analisados (BRYNE et al., 1992). Para
Bryne et al. (1998), as características morfológicas no front de invasão poderiam refletir
melhor o prognóstico destes tumores, já que vários eventos moleculares importantes ocorrem
na interface tumor-hospedeiro, como aumento da proliferação celular, perdas e ganhos de
moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas e angiogênese.
Em 2005, a Organização Mundial de Saúde (OMS) propôs um sistema de gradação
histológica fundamentado no grau de diferenciação celular, classificando os espécimes de
CEO em três categorias. Conforme este método, as lesões bem diferenciadas exibem
arquitetura tecidual semelhante a um padrão normal de epitélio escamoso. Já as lesões
moderadamente diferenciadas apresentam certo grau de pleomorfismo nuclear, atividade
mitótica e ceratinização discreta. Em contraparte, as lesões pouco diferenciadas, caracterizamse pelo predomínio de células imaturas, numerosas mitoses típicas e atípicas e mínima
ceratinização (BARNES et al., 2005).
Tendo em vista que os sistemas de gradação supracitados não vinham apresentando
correlações significantes e consistentes com o prognóstico e sobrevida dos pacientes com
câncer de cabeça e pescoço e oral, especificamente, Brandwein-Gensler et al. (2005)
propuseram um novo modelo de gradação, o qual denominaram Avaliação de Risco
Histopatológico. Este modelo foi capaz de predizer a recorrência local e sobrevida geral de
um grupo de pacientes com CEO de cavidade oral e orofaringe. Segundo os autores, uma
categoria de risco é determinada pelo exame de espécimes primários provenientes de
ressecção, nos quais quantifica-se 3 variáveis histológicas significantes: (1) pior padrão de
invasão tumoral no front de invasão, (2) invasão perineural, (3) resposta linfocítica do
23
hospedeiro no front de invasão tumoral. Esse modelo classifica os pacientes em grupos de
baixo, intermediário e alto risco. Em 2010, a mesma equipe validou esse modelo em uma
nova coorte de pacientes (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005).
O tratamento do CEO requer a excisão cirúrgica da lesão com margens de segurança,
compreendendo tecido sadio. Em casos mais avançados da doença, a terapêutica cirúrgica
pode ser associada à radio e/ou quimioterapia, de forma a reduzir o volume tumoral, sendo
que em alguns casos esta é a única terapia viável, pois o tamanho do tumor pode inviabilizar a
intervenção cirúrgica (NEVILLE et al., 2009).
2.2 REPARO DO DNA
A manutenção da estabilidade genética de um organismo requer mecanismos que
corrijam as diversas lesões que ocorrem continuamente no DNA. Grande parte dessas lesões é
temporária, pois são corrigidas por um conjunto de processos chamados de reparo do DNA.
As bases do DNA podem ser danificadas por metabólitos reativos produzidos pelas células
(como as espécies reativas do oxigênio), pela exposição a produtos químicos ambientais ou
pela radiação ultravioleta do sol. Caso não corrigidas, essas alterações resultam na deleção de
um ou mais pares de bases ou na substituição de um par de bases na cadeia-filha de DNA,
levando à propagação de mutações para as gerações celulares subsequentes (ALBERTS et al.,
2010).
Os mecanismos de reparo do DNA são variados e complexos, envolvendo
aproximadamente 150 genes. Esses mecanismos são subdivididos em cinco grupos principais:
reparo de excisão de base (BER, do inglês base excision repair), reparo de excisão de
nucleotídeo (NER, nucleotide excision repair), reparo de mal emparelhamento (MMR,
mismatch repair), reparo de quebra de dupla fita (recombinação homóloga e junção terminal
não homóloga) e reparo direto (exclusivo de organismos procariotos e eucariotos não
placentários) (ALBERTS et al., 2010; SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000; WOOD;
MITCHELL; LINDAHL, 2005).
O DNA pode ser danificado por diversos eventos mutagênicos decorrentes da
exposição a agentes químicos (carcinógenos, como o tabaco), físicos (ex.: radiação ionizante)
ou biológicos (ex.: microrganismos, como o vírus HPV); entretanto, acredita-se que alguns
danos surjam de forma espontânea (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000). O acúmulo de
danos ao DNA aumenta a probabilidade de mutação, podendo impedir ou parar a transcrição e
24
replicação, desregulando o ciclo celular, promovendo crescimento autônomo e o
desenvolvimento de mecanismos de invasão. Portanto, os sistemas de reparo do DNA que
podem corrigir a sequência do DNA possuem a habilidade de manter a integridade do genoma
e prevenir a carcinogênese (ALBERTS et al., 2010; NAGOYA et al., 2014; SCULLY;
FIELD; TANZAWA, 2000).
Defeitos em genes humanos que normalmente atuam na correção de pares de bases
pareados incorretamente no DNA podem causar uma predisposição herdada a determinados
tipos de câncer, refletindo uma taxa de mutações aumentada (ALBERTS et al., 2010). As
consequências da capacidade reduzida de reparo do DNA nos humanos têm sido
demonstradas em associação a diversas doenças, como o xeroderma pigmentoso, na qual os
indivíduos afetados apresentam uma sensibilidade extrema à radiação ultravioleta, pois são
incapazes de reparar determinados fotoprodutos do DNA, o que leva a uma suscetibilidade
aumentada a determinados tipos de câncer (ALBERTS et al., 2010; NEVILLE et al., 2009).
Recentemente, novos estudos têm demonstrado a presença de proteínas dos genes do
reparo do DNA em carcinomas de pulmão, ovário, mama, bexiga, estômago e de cabeça e
pescoço. A maioria dos achados indica que essas proteínas estão desreguladas nesses tipos de
câncer, estando associadas a um maior grau de malignidade, presença de metástases e menor
sobrevida (ABDEG et al., 2011; BIANCHINO et al., 2011; FARNEBO et al., 2013; HUANG
et al., 2013; LIU et al., 2011; MAHJABEEN et al., 2014; MIAO et al., 2012; NAGOYA et
al., 2014; SAKANO et al., 2013; UPPAL, 2014; WANG et al., 2010).
2.2.1 Reparo do DNA por Excisão De Bases (BASE EXCISION REPAIR – BER)
A via BER é uma das principais vias envolvidas na resposta a danos provocados por
estresse oxidativo, desaminação e alquilação. Tal via age por meio de mecanismos de
eliminação de bases nitrogenadas danificadas (oxidadas ou alquiladas) ou até mesmo
erroneamente utilizadas. Ela também é responsável por reparar quebras de DNA fita simples
provocadas por espécies reativas de oxigênio (EROs) (KROKAN et al., 2000; ROBERTSON
et al., 2009).
Para o seu correto funcionamento, a via BER requer a função das seguintes proteínas:
DNA glicosilase, AP endonuclease, AP DNA liase, DNA polimerase e DNA ligase. Essas
proteínas agem em conjunto para remover as bases de DNA lesadas e substituí-las pela base
correta (KROKAN et al., 2000; ROBERTSON et al., 2009; WOOD; MITCHELL;
25
LINDAHL, 2005). O primeiro passo do reparo por excisão de base inicia-se com o
reconhecimento da base danificada por uma DNA glicosilase. Em seguida, essa glicosilase
catalisa a clivagem de uma ligação N-glicosílica, removendo efetivamente a base danificada e
criando um sítio apurínico ou apirimidínico (sítio AP). A dupla fita de DNA é clivada por
uma DNA AP endonuclease ou uma DNA AP liase. A atividade da AP endonuclease cria uma
fita simples de DNA de extremidade 5’, contrastando com a extremidade livre 3’ resultante da
atividade da DNA AP liase. Esta nova extremidade livre é processada pela AP endonuclease,
criando uma lacuna para um único nucleotídeo no DNA. Este espaço gerado contém nas
extremidades grupamentos 3’- hidroxila e 5’-fosfato, que são substratos para as enzimas
subsequentes. Em seguida, uma DNA polimerase preenche o espaço com o nucleotídeo
correto. Finalmente, uma DNA ligase completa o processo de reparo, reestabelecendo a
integridade do DNA (Figura 1) (ALBERTS et al., 2010; ROBERTSON et al., 2009).
O processo descrito acima, no qual apenas uma base danificada é retirada e um
nucleotídeo é reposto na molécula de DNA, é chamada de “via curta do BER”, do inglês
short-patch BER. Na “via longa do BER”, do inglês long-patch BER, podem ser reparados de
2 a 8 nucleotídeos; nessa via a enzima APE-1 catalisa a formação de uma extremidade 5’ no
sítio AP. Entretanto, o mecanismo pelo qual o organismo prossegue com a via longa ou curta
do BER ainda não foi desvendado. Estudos sugerem que a mudança da via curta para a via
longa do BER depende da concentração relativa de ATP próximo ao sítio AP, o que é
aparentemente modulado pela LIG3 e por outra proteína da via BER, a XRCC1. Foi
demonstrado que a via longa do BER ocorre mais frequentemente em baixas concentrações de
ATP, enquanto a via curta do BER aparentemente é preferencial em altas concentrações de
ATP (ROBERTSON et al., 2009; WOOD; MITCHELL; LINDAHL, 2005).
26
Figura 1. Reparo do DNA por excisão de bases.
Fonte: Biologia Molecular da Célula (ALBERTS et al., 2010)
2.2.2 APE-1 (AP- endonuclease apurínica/apurimidínica)
Já se sabe que diferentes agentes químicos e físicos, dentre eles as EROs, podem
provocar diversas lesões de base no genoma celular de mamíferos. Essas lesões, se não
reparadas devidamente, podem dar origem a uma variedade de lesões (incluindo o câncer),
bem como ao processo de envelhecimento humano. A BER é a via mais utilizada para lidar
27
com lesões de base única. Essa via também está envolvida no reparo de quebras de fitasimples do DNA induzidas por radicais livres. Uma das enzimas-chave na via BER em
mamíferos é a APE-1 (ALBERTS et al., 2010; TELL et al., 2009).
A APE-1 é uma proteína multifuncional que processa o reparo do DNA e atividades
regulatórias transcricionais, exercendo um papel pleiotrópico no controle da resposta celular
ao estresse oxidativo. Essa é a principal endonuclease apurínica/apurimidínica em células
eucarióticas, que desenvolve uma função central na via de reparo por excisão de bases de
muitas lesões no DNA, incluindo presença de uracilas, alquilações, oxidações, sítios abásicos
e quebras de fitas simples de DNA. Possui também atividade transcricional direta ou indireta
agindo ela mesma ou modulando a expressão de genes amplamente ativados, como AP-1 e
NF-κB, e fatores de transcrição específicos, como TTF-1, Pax-5, Egr-1, p53, HIF-1α e CREB
em diferentes sistemas celulares (TELL et al., 2009).
Como visto anteriormente, as reações básicas de via BER requerem a atividade
coordenada de diversas enzimas, incluindo: a) uma DNA glicosilase capaz de excisar uma
base modificada específica; b) uma AP-endonuclease, como a APE-1, que cliva a ligação
fosfodiéster 5’, gerando terminações 3’OH e 5’dRP; c) uma atividade exonuclease (βpolimerase, FEN, APE1); d) uma DNA polimerase (β-polimerase, XRCC1 ou δ ⁄ ε-polimerase
como PCNA; e, finalmente, uma atividade de ligação (DNA ligase I e III, XRCC1)
(ALBERTS et al., 2010; TELL et al., 2009).
A necessidade da APE-1 para a sobrevivência celular e sua frequente superexpressão
em células tumorais sugere um papel fundamental dessa proteína na prevenção de morte
celular e no controle da proliferação celular (TELL et al., 2005). Estudos genéticos
demonstraram a importância da APE-1 para a viabilidade celular a partir de ratos knockout
para essa proteína, nos quais observou-se alta letalidade pós-implantação embrional nos dias
E5 a E9 (LUDWIG et al., 1998).
Elevada expressão ou alterada distribuição intracelular de APE-1 tem sido
demonstrada em diversos carcinomas, incluindo em colo do útero, ovário, próstata, trato
gastro-esofágico, pâncreas, cabeça e pescoço e pulmão. Além disso, níveis elevados de APE-1
em câncer de pulmão, ovário, osteossarcoma e ependimoma pediátrico são indicadores de
desfechos clínicos sombrios e resistência à radioterapia e quimioterapia (HSIA et al., 2015).
Existe crescente evidência de que APE-1 possui valor prognóstico e está relacionada à
28
agressividade em diversos tumores. Pesquisadores acreditam que células cancerígenas ricas
em APE-1 possam conferir resistência terapêutica e influenciar negativamente o prognóstico
dos pacientes (HSIA et al., 2015; MAHJABEEN et al., 2014; NAGOYA et al., 2014).
Estudos vem demonstrando que a heterogeneidade no padrão de expressão da APE-1
está relacionada a diferentes condições patológicas que variam de desordens metabólicas a
diferenciativas, incluindo o câncer e doenças neurodegenerativas. Diferentes tipos de tumores
humanos foram caracterizados por alterações na expressão celular de APE-1 em relação ao
tecido não tumoral (HSIA et al., 2015; KAKOLYRIS et al., 1998; TELL et al., 2009).
Geralmente, a localização da APE-1 é eminentemente nuclear, entretanto, em diversos
carcinomas uma marcação nuclear, citoplasmática e nuclear/citoplasmática pode ser
observada. Essa distribuição peculiar pode se correlacionar com a agressividade e prognóstico
do tumor (HSIA et al., 2015).
Em estudo imuno-histoquímico com 146 CEOs, Hsia et al. (2015) detectaram elevada
imunoexpressão nuclear (com fraca expressão citoplasmática) de APE-1 em 52,73% dos
casos, o que foi correlacionado com a presença de metástase linfonodal e tamanho do tumor,
estando também significativamente associada a um pior prognóstico e resposta ao tratamento
reduzida. Os autores concluíram que a APE-1 está envolvida na progressão do câncer oral,
podendo servir como um marcador prognóstico em potencial.
Mahjabeen et al. (2014) também encontraram elevada imunoexpressão de APE-1 em
50 casos de CEs de cabeça e pescoço. Em seu estudo, 18% dos casos apresentaram
imunoexpressão fraca, 37% moderada e 45% intensa. Os autores consideraram positivos
apenas os casos com mais de 10% de células imunomarcadas, observando marcação tanto
nuclear quanto citoplasmática. A intensa expressão da proteína APE-1 foi significativamente
associada a um pior grau de malignidade. Os autores sugerem que as proteínas da via BER
podem ser biomarcadores úteis para o prognóstico e classificação molecular de CEs de cabeça
e pescoço.
Outro estudo detectou imunoexpressão nuclear de APE-1 em 92,3% dos 65 casos de
carcinoma esofágico estudados. Os autores não observaram a expressão desta proteína em
amostras normais de tecido esofágico (NAGOYA et al., 2014).
29
Elevados níveis séricos de APE-1 foram detectados em pacientes com câncer de
bexiga em comparação a um grupo controle, por meio do ensaio de imunoadsorção
enzimática (ELISA). Esses níveis foram associados com estadiamento clínico, invasão
muscular e recorrência. Os autores acreditam que a detecção sorológica de APE-1 é um
possível biomarcador biológico para os carcinomas de bexiga (SHIN et al., 2015).
Elevada imunoexpressão nuclear de APE-1 também foi relatada em estudo com 239
casos de câncer de mama. Nesse estudo, foram observados 177 casos com elevada expressão
de APE-1 e apenas 62 casos com baixa expressão. A elevada imunoexpressão mostrou uma
tendência à associação com pior prognóstico, em relação à sobrevida livre de doença.
Entretanto, não houve diferença significante na sobrevida global entre os casos com alta ou
baixa expressão dessa proteína. Os autores não observaram associação com outros fatores
prognósticos, mas concluíram que a proteína estudada pode ter valor prognóstico para o
câncer de mama (WOO et al., 2014).
Para casos de câncer do trato gastrointestinal também foi relatada elevada expressão
de APE-1. Neste estudo, observou-se que 86,9% de 107 casos de carcinomas gástricos
apresentaram imunoexpressão nuclear e citoplasmática positiva (>10% de células marcadas) e
que esta expressão esteve significativamente associada com profundidade de invasão,
metástase linfonodal, subtipo histopatológico, sobrevida global e tamanho do tumor. Os
autores concluíram que a imunoexpressão de APE-1 é um fator de risco e biomarcador
prognóstico para câncer do trato gastrointestinal (QING et al., 2015).
2.2.3 XRCC-1 (X-ray repair cross-complementing group 1)
Inicialmente clonada em 1990, a XRCC-1 pertence ao grupo das proteínas scaffold (do
inglês, andaime), que são reguladoras cruciais em diversas vias de sinalização. Tais proteínas
não tem suas funções totalmente definidas, entretanto, sabe-se que regulam a transdução de
sinal e ajudam a localizar componentes da via de sinalização, organizando-os em complexos.
Aparentemente, XRCC-1 não possui ação enzimática, entretanto, atua no suporte a outros
fatores de reparo, interagindo com a maioria dos componentes da BER por via curta,
coordenando principalmente a função de enzimas que dão início à via, como MPG, OGG1
and NEIL2. XRCC-1 também interage como diversas outras proteínas envolvidas no reparo
do DNA pela via BER, incluindo DNA ligase IIIa, DNA polimerase b, APE1, kinase/fofatase
30
polinucleotídea e polimerases poli(ADP-ribose) 1 e 2 (PARP-1 e 2) (ALMEIDA; SOBOL,
2007; BREM; HALL, 2005).
Nos últimos anos, estudos moleculares têm investigado possíveis associações entre
alterações no gene XRCC-1 e risco para câncer. Primeiramente, foi
demonstrado que
camundongos deficientes em XRCC-1 resultam em letalidade embrional e que essa proteína é
essencial para o reparo do DNA; mostrou-se também que níveis reduzidos de XRCC-1 inibem
parcialmente uma nova ligação do DNA, provocando instabilidade genética, que é
considerada propícia para a carcinogênese (BREM; HALL, 2005).
Novas evidências indicam que os genes do reparo do DNA podem determinar
susceptibilidade individual para o câncer de cabeça e pescoço. Polimorfismos nos genes de
reparo que codificam enzimas podem aumentar ou diminuir a capacidade de reparo do DNA
(WU et al., 2014). Estudos in vitro e in vivo demonstraram que XRCC-1 participa diretamente
no reparo de quebras de fita simples do DNA ou indiretamente durante a via BER. A perda de
XRCC-1 resulta na diminuição da estabilidade genética, aumentando a frequência de
translocações e deleções cromossômicas espontâneas ou induzidas (HUANG et al., 2005;
RAMACHANDRAN et al., 2006).
Em estudo realizado com pacientes com CECP observou-se, através de técnica imunohistoquímica, uma subregulação de XRCC-1 em tecido tumoral quando comparado ao
controle positivo. Essa subregulação foi maior em tumores pobremente diferenciados, com
resultados semelhantes aos observados para carcinomas de pulmão e de estômago e também
em meduloblastoma. Os autores também observaram correlação inversa entre a
imunoexpressão de XRCC-1 e APE1 (MAHJABEEN et al., 2014). Entretanto, outro estudo
com 137 casos de CECP, demonstrou alta expressão de XRCC-1 em 77 casos, a qual esteve
associada a pior sobrevida global e pior sobrevida livre de doença. Os autores concluíram que
uma alta imunoexpressão de XRCC-1 está relacionada a pior sobrevida, especialmente em
pacientes em tratamento com quimio e radioterapia (ANG et al., 2011).
Um estudo de 2004 com pacientes com carcinoma epidermoide de laringe divididos
em dois grupos de acordo com a sensibilidade ao tratamento radioterápico (radiosensitivos e
radioresistentes) observou elevada expressão nuclear de XRCC-1 em 63% dos pacientes
radioresistentes (p<0,001) e em 43% dos radiosensitivos. Os autores concluíram que essa
proteína é capaz de prever a não responsividade do tratamento radioterápico (NIX et al.,
2004).
31
Uma subregulação de XRCC-1 foi observada no processo de carcinogênese do trato
gastrointestinal através de imuno-histoquímica e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). Os
autores observaram menor expressão dessa proteína em pacientes com câncer gástrico
pobremente diferenciado. Também relataram que tecidos saudáveis apresentavam uma maior
expressão de XRCC-1 quando comparados aos casos de câncer gástrico (WANG et al., 2010).
Em casos de carcinoma de bexiga também foi relatada uma baixa imunoexpressão de
XRCC-1. Sendo que, em um estudo com 157 casos, a maior expressão desta proteína
mostrou-se significativamente relacionada a uma melhor taxa de sobrevida doença-específica.
Nesse estudo, os autores não observaram associação estatística entre a expressão de XRCC-1
e APE1 (SAKANO et al., 2013).
A expressão de XRCC-1 através de PCR também foi avaliada em 172 casos de
carcinoma epidermoide esofágico em 2015. Os autores observaram que uma alta expressão
desta proteína foi correlacionada a uma maior média de sobrevida global em todos os
pacientes, mas não esteve correlacionada a taxa de resposta do tratamento com cisplatina ou
docetaxel. A XRCC-1 foi considerada um fator de prognóstico independente para pacientes
com câncer de esôfago (WEI et al., 2015).
Em estudo com 195 casos de carcinoma de ovário, 48% dos casos demonstraram
elevada expressão de XRCC-1, a qual esteve relacionada a um maior estágio clínico e
resistência ao tratamento com platina. A superexpressão dessa proteína também foi
relacionada a uma diminuição da sobrevida e a progressão da doença (ABDEL-FATAH et al.,
2013).
32
PROPOSIÇÃO
33
3. PROPOSIÇÃO
O presente estudo se propôs a avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas
do reparo do DNA APE-1 e XRCC-1 e investigar sua relação com parâmetros clínicos e
histopatológicos em carcinoma epidermoide de língua oral, visando contribuir para a melhor
elucidação do papel dessas proteínas no desenvolvimento desta neoplasia.
34
MATERIAL E MÉTODOS
35
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Este trabalho foi submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Liga NorteRiograndense Contra o Câncer (CEP/LNRCC), tendo sido aprovado conforme parecer de
número 838.556 (ANEXO 1).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O estudo consistiu em uma pesquisa de caráter observacional, com corte transversal,
caracterizada pela observação, análise, registro e quantificação das proteínas APE-1 e XRCC1, por meio de imuno-histoquímica, em carcinomas epidermoides de língua oral.
4.3 POPULAÇÃO
Para a realização desta pesquisa, foram utilizados casos de carcinoma epidermoide de
língua oral arquivados entre 2000 e 2010 no serviço de Anatomia Patológica da Liga NorteRiograndense Contra o Câncer.
4.4 AMOSTRA
A seleção da amostra se deu de forma intencional e não probabilística, compreendendo
todos os casos de carcinoma epidermoide de língua oral que se adequassem aos critérios de
inclusão e exclusão.
4.4.1 Critérios de inclusão
 Espécimes diagnosticados histopatologicamente como carcinoma epidermoide de
língua oral;

Apenas os casos de carcinoma epidermoide de língua oral provenientes de ressecção
cirúrgica, os quais possibilitaram a avaliação do front de invasão tumoral.

Casos cujos blocos em parafina apresentassem quantidade suficiente de material para
realização de estudo imuno-histoquímico;

Casos cujos prontuários apresentassem todos os dados necessários para a realização do
estudo clínico.
4.4.2 Critérios de exclusão
 Casos de carcinoma epidermoide localizados em terço posterior de língua, já que esses
se encaixam na categoria de carcinoma epidermoide de orofaringe.
36
4.5 ESTUDO CLÍNICO
A partir dos prontuários dos pacientes, foram obtidas informações clínicas referentes
ao sexo, idade, data de início do tratamento, tipo de tratamento recebido, estadiamento
clínico, presença de metástase linfonodal, metástase à distância, recidiva e desfecho. Estes
dados foram transcritos para uma ficha específica elaborada para o estudo (Apêndice A).
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO
A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi submetida
a cortes com 5m de espessura. Em sequência, estes cortes teciduais foram estendidos em
lâminas de vidro e submetidos à coloração de rotina da hematoxilina e eosina. As lâminas
foram escaneadas (3D HISTECH) e dois examinadores previamente treinados realizaram a
análise da gradação histopatológica de malignidade dos espécimes, no front de invasão
tumoral, de acordo com o sistema proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) (Quadro 1).
Quadro 1. Avaliação histopatológica de risco proposta por BRANDWEIN-GENSLER et al.,
2005.
Variável
Histopatológica
Invasão perineural
Infiltrado
inflamatório
Pior padrão de
invasão
Pontuação de risco
(soma dos pontos)
0
1 ou 2
3a9
Avaliação Histopatológica de Risco
Valores atribuídos
0
1
3
Nenhum
Pequenos nervos
Grandes nervos (>1mm)
Contínuo
Grandes agregados
Nenhum
1 – “Pushing border”
(contínuo)
2 – “Finger-like”
(Projeções
digitiformes)
3 – Grandes ilhas,
com mais de 15
células
Risco de recorrência
local
Baixo
Intermediário
Alto
4 – Pequenas ilhas 5 – Ilhas satélites, com
tumorais, com menos >1mm de distância do
de 15 células em cada fronte de invasão tumoral.
Probabilidade de
sobrevida total
Boa
Intermediária
Pobre
Indicação para
radioterapia adjuvante
Não
Não
Sempre
37
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.7.1 Método imuno-histoquímico
Toda amostra selecionada, incluída em parafina, foi submetida a cortes histológicos de
3µm de espessura, que foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e
desengorduradas, preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltrietoxysilano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Os cortes histológicos foram corados pelo
método da imunoperoxidase através da técnica do polímero de dextrano, utilizando-se
anticorpos anti-APE1 e anti-XRCC1 (Quadro 2), e a diaminobenzidina como cromógeno, de
acordo com protocolo descrito a seguir:
1. Submeteu-se as lâminas à solução de Trilogy 1:100 na Pascal pelo tempo estabelecido
pelo fabricante;
2. Lavagem em água corrente por 5 minutos e 2 passagens em água destilada;
3. Incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos cada, em solução de peróxido de
hidrogênio 10 volumes, para bloqueio da peroxidase endógena;
4. Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada;
5. Incubação com a proteína Block por 5 minutos, seguida por duas passagens em
solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
6. Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 2) diluídos em solução
diluente Diamond (Cell Marque; Rocklin CA, USA);
7. Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
8. Incubação com solução amplificadora (HiDef, Cell Marque; Rocklin CA, USA)
durante 15 minutos - TA;
9. Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
10. Incubação com o anticorpo polimerizado à peroxidase (HiDef, Cell Marque; Rocklin
CA, USA) durante 15 minutos, à temperatura ambiente;
11. Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;
12. Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrato, Dako
North America, Carpinteria, CA, USA), durante 7 minutos – TA;
13. Lavagem em água corrente por 10 minutos;
14. Duas passagens em água destilada;
15. Contracoloração com hematoxilina de Mayer por 5 minutos - TA;
16. Lavagem em água corrente – 5 minutos;
38
17. Duas passagens em água destilada;
18. Desidratação em cadeia ascendente de etanóis. Álcool etílico 80°GL (2 minutos) TA;
álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA; álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA; álcool
etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
19. Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);
20. Montagem da lamínula em resina Permount ® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA).
Quadro 2. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de
incubação dos anticorpos primários.
Especificidade
Clone
Fabricante
Diluição
Recuperação Antigênica
Incubação
Anti-APE-1
Ab3722
Abcam
1:500
Trilogy, Pascal 121 oC, 30
Overnight
minutos
Anti-XRCC-1
33-2-5
Lab Vision
1:2000
Trilogy, Pascal 121 oC, 30
Overnight
minutos
4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico
A intensidade das reações imuno-histoquímicas foi avaliada por dois avaliadores
independentes previamente treinados, sem conhecimento dos dados clínicos, em microscopia
de luz, de forma semi-quantitativa. Foram consideradas positivas aquelas células que
exibiram coloração acastanhada no núcleo e citoplasma, independente da intensidade de
marcação (fraca, moderada ou forte). Foi, então, realizada uma análise descritiva do padrão da
reação nas células imunomarcadas, de forma individual (núcleo, citoplasma ou ambos).
A metodologia semi-quantitativa para análise foi adaptada daquelas propostas por
Hsia et al. (2015) e Mahjabeen et al. (2014). As células foram avaliadas no front de invasão
tumoral e os casos foram estratificados em expressão negativa (0-10% de células
imunomarcadas), baixa (11-50% de células imunomarcadas) e alta (>50% de células
imunomarcadas). Para análise estatística, as células que apresentaram expressão negativa e
baixa foram agrupadas na categoria baixa expressão (≤50% de células imunomarcadas) e as
que apresentaram >50% de células imunomarcadas, na categoria alta imunoexpressão.
39
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após a coleta dos dados, os mesmos foram organizados em um banco de dados
informatizado com o auxílio do programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) na versão 20.0 e submetidos inicialmente à análise descritiva. As variáveis
qualitativas foram apresentadas na forma de frequências absolutas e relativas. Posteriormente,
para avaliar a associação entre as variáveis e a gradação dos carcinomas de células escamosas
de língua, tais dados foram submetidos aos testes estatísticos Qui-quadrado de Pearson e Exato
de Fisher. Foi adotado nível de significância de 5% para todos os testes, sendo considerados
significativos os valores de p ≤ 0,05.
Quadro 3. Variáveis dependentes elencadas para os testes estatísticos.
Variável
Descrição
Categoria
Classificação
Imunomarcação das células
neoplásicas para XRCC-1
12-
Baixa
Alta
Nominal
ordinal
Imunomarcação das células
neoplásicas para APE-1
12-
Baixa
Alta
Nominal
ordinal
40
Quadro 4. Variáveis independentes elencadas para os testes estatísticos.
Variável
Descrição
Categoria
Classificação
1 – sim
Metástase linfonodal Classificação dos caso segundo a
presença de metástase linfonodal no
2 – não
início do tratamento
Nominal
mutuamente
exclusiva
1 – sim
Nominal
mutuamente
exclusiva
Presença de recidiva Presença de recidiva loco regional
durante acompanhamento de 60
loco regional
meses após o início de tratamento
Desfecho
2 – não
Estado da doença após
acompanhamento em 60 meses
1-Óbito, por
câncer
Nominal
mutuamente
exclusiva
2-Em
progressão
3-Remissão
Análise morfológica
segundo BrandweinGensler et al 2005
1-Alto Risco
Nominal ordinal
2-Risco
Intermediário
3-Baixo Risco
Estadiamento clínico Sistema clínico de estadiamento do
tumor, o valor considerado foi aquele
registrado após a primeira ressecção
cirúrgica e avaliação histopatológica.
999- não
identificado no
prontuário
1- I e II
2- III e IV
Nominal ordinal
41
RESULTADOS
42
5. RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra desta pesquisa foi constituída por 51 casos de carcinoma epidermoide de
língua oral diagnosticados entre janeiro de 2001 e dezembro de 2010 nos hospitais da Liga
Norte Riograndense Contra o Câncer – Natal/RN. Durante esse período foram diagnosticados
282 casos de CELO, dos quais 138 (47,16%) foram tratados por ressecção cirúrgica do tumor.
Seguindo os critérios de inclusão estabelecidos para este estudo, foram eliminados os casos
nos quais o material biológico armazenado em blocos de parafina era insuficiente para análise
(n=8) e também aqueles cujos blocos não foram encontrados no arquivo (n=56). Foram
incluídos apenas os casos que possuíam registro de cinco anos de seguimento ou registro de
óbito, para fins de análise do desfecho.
A idade dos pacientes variou de 25 a 95 anos, com média de 62,2 e desvio padrão de
14,8 anos. Sendo que 54,9% (n=28) desses pacientes possuíam idade superior a 60 anos. Dos
51 casos estudados, 33 (64,7%) corresponderam a pacientes do gênero masculino e 18
(35,3%) a pacientes do gênero feminino. Quarenta e um pacientes (80,4%) eram tabagistas e
32 (67,2%) etilistas (Tabela 1).
Quanto ao estágio do tumor, 58,8% (n= 30) dos pacientes foram classificados em grau
III ou IV. Nenhum paciente apresentou metástase a distância (M) no momento do diagnóstico
(Tabela 1). Vinte e seis (51%) dos pacientes apresentaram metástase linfonodal comprovada
por exame histopatológico, sendo que desses pacientes, apenas um (3,8%) desenvolveu
metástase durante o tratamento. A maioria dos pacientes foi submetida a tratamento cirúrgico
e radioterápico ou cirúrgico e quimioterápico (39,2%) ou às três modalidades combinadas
(39,2%) (Tabela 2).
Dezoito pacientes (35,3%) apresentaram recidiva loco-regional, apenas quatro
apresentaram novo tumor primário e também quatro (7,8%) pacientes desenvolveram
metástase a distância. Em relação ao desfecho, 52,9%(n=27) dos pacientes foram à óbito
(Tabela 2).
43
Tabela 1 - Parâmetros clínicos e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de língua
oral estudados. Natal –RN, 2016
Parâmetro
Gênero
Masculino
Feminino
n(%)
33 (64,7)
18 (35,3)
Idade
10 a 40 anos
41 a 59 anos
60 a 74 anos
> 75 anos
2 (3,9)
21 (41,2)
21 (41,2)
7 (13,7)
Idade
Até 60 anos
> 60 anos
23 (45,1)
28 (54,9)
Tabagismo
Não
Sim
Não informado
6 (11,8)
41 (80,4)
4 (7,8)
Etilismo
Não
Sim
Não informado
10 (19,6)
32 (62,7)
9 (17,6)
Tamanho do tumor (T)
T1
T2
T3
T4
Não informado
9 (17,6)
23 (45,1)
14 (27,5)
4 (7,8)
1 (2,0)
Comprometimento de linfonodos (N)
N0
N1
N2
Não informado
27 (52,9)
13 (25,5)
10 (19,6)
1 (2,0)
Estágio do tumor*
I ou II
III ou IV
Não informado
Total
Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal-RN.
20 (39,2)
30 (58,8)
1 (2,0)
51(100,0)
44
Tabela 2 - Parâmetros clínicos de seguimento dos casos de carcinoma epidermoide de língua
oral estudados. Natal –RN, 2016
Parâmetro
Metástase linfonodal
(comprovação histopatológica)
Ausente
Presente
n (%)
25 (49,0)
26 (51,0)
Etapa do comprometimento linfonodal
Início do tratamento
Durante o tratamento
25 (96,2)
1 (3,8)
Tratamento
Cirurgia
Cirurgia e radioterapia ou cirurgia e quimioterapia
Cirurgia, radioterapia e quimioterapia
Tratamento prévio a cirurgia
10 (19,6)
20 (39,2)
20 (39,2)
1 (2,0)
Presença de novo tumor primário
Não houve
Carcinoma epidermoide
Outro subtipo histológico
47 (92,2)
3 (5,9)
1 (2,0)
Recidiva locoregional
Não
Sim
33 (64,7)
18 (35,3)
Número de recidiva locoregional
1
Mais de 1
17 (94,4)
1 (5,6)
Metástase à distância
Não
Sim
47 (92,2)
4 (7,8)
Desfecho
Remissão
Óbito
Doença em progressão
Total
Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal-RN.
23 (45,1)
27 (52,9)
1 (2,0)
51(100,0)
45
5.2 RESULTADOS DA ANÁLISE MORFOLÓGICA
Após a gradação de todos os casos seguindo o modelo histopatológico de análise de
risco proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005), verificou-se que em 35 casos (68,6%)
houve invasão perineural em nervos pequenos (<1mm) (Figura 2). O infiltrado inflamatório
mostrou-se contínuo na maioria dos casos (54,9%) (Figura 3). O pior padrão de invasão
predominante foi o tipo 4 (no qual as células invadem em ninhos com menos de 15 células),
compreendendo 38 casos (74,5%) (Figura 4). Ao final da análise de risco, observou-se
predominância dos casos pertencentes ao grupo de risco intermediário (60,8%) (Tabela 3).
Tabela 3 - Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise histopalógica dos casos
de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al.
(2005). Natal – RN, 2016
Parâmetro
Invasão perineural
n (%)
Não há
Em nervos pequenos
16 (31,4)
35 (68,6)
Infiltrado linfocitário
Contínuo
Em placas
Pouco ou nenhum
28 (54,9)
11 (21,6)
12 (23,5)
Pior padrão de invasão
Padrão 1, 2 ou 3
Padrão 4
Padrão 5
10 (19,6)
38 (74,5)
3 (5,9)
Gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler
Baixo risco
Risco intermediário
Alto risco
1 (2,0)
31 (60,8)
19 (37,3)
Total
Fonte: Elaboração própria.
51(100,0)
46
Figura 2 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo invasão perineural em pequenos
fascículos nervosos (HE; Barra = 100μm).
Figura 3 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo infiltrado linfocitário contínuo
(HE; Barra = 500μm).
47
Figura 4 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo pior padrão de invasão tipo 4 e
escasso infiltrado linfocitário (HE; Barra = 100μm).
48
5.3 RESULTADOS DA ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
Para análise imuno-histoquímica foi feita uma análise descritiva do padrão de
marcação nuclear e citoplasmático das proteínas APE-1 e XRCC-1 nas células do front de
invasão tumoral. Observou-se uma fraca intensidade de imunoexpressão nuclear de APE-1 em
64,7% dos casos estudados e de XRCC-1 em 70,6% dos casos. Em relação a intensidade
citoplasmática, a maioria dos casos (86,3%) também apresentou intensidade fraca de APE-1;
já os casos imunomarcados com XRCC-1 não apresentaram positividade citoplasmática
(Tabela 4).
Quanto à análise semi-quantitativa de células imunomarcadas para APE-1, observouse expressão apenas nuclear em menos de 10% das células do front em 52,9% dos casos; em
relação a expressão apenas citoplasmática dessa proteína, a maioria dos casos (56,9%)
também apresentou menos de 10% das células imunomarcadas. Entretanto, quando analisada
a imuno-positividade independente da localização nuclear ou citoplasmática observou-se que
56% dos casos estudados exibiram mais de 50% das células do front de invasão positivas para
a proteína APE-1 (Tabela 4 e Figuras 5, 6 e 7).
No total, 30% do casos estudados
apresentaram imunoexpressão considerada negativa (≤10% de células positivas), 26%
imunoexpressão somente nuclear, 24% somente citoplasmática e 20% imunoexpressão em
núcleo e citoplasma (Tabela 5).
Na análise semi-quantitativa da XRCC-1, observou-se que a maioria dos casos
estudados (60,8%) apresentou expressão nuclear positiva dessa proteína em mais de 50% das
células do front de invasão (Figuras 8 e 9). Todos os casos exibiram apenas imunomarcação
nuclear de XRCC-1 e, observou-se também, que apenas 15,7% dos casos apresentaram menos
de
10%
das
células
imunomarcadas
(Tabelas
5
e
6).
49
Tabela 4 - Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise da imunoreatividade das
proteínas de reparo do DNA (APE-1 e XRCC-1) no núcleo e citoplasma das células do front
de invasão tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016
Parâmetros
Intensidade nuclear de APE-1
Negativa ou fraca
Moderada
Forte
Expressão nuclear de APE-1
Até 10%
11% a 50%
>50%
Intensidade citoplasmática de APE-1
Negativa ou fraca
Moderada
Forte
Expressão citoplasmática de APE-1
Até 10%
11% a 50%
>50%
Expressão nuclear ou citoplasmática de APE-1
Até 10%
11% a 50%
>50%
Intensidade nuclear de XRCC-1
Negativa ou fraca
Moderada
Forte
Expressão nuclear de XRCC-1
Até 10%
11% a 50%
>50%
Total
Fonte: Elaboração própria.
n (%)
33 (64,7)
7 (13,7)
11 (21,6)
27 (52,9)
9 (17,6)
15 (29,4)
44 (86,3)
6 (11,8)
1 (2,0)
29 (56,9)
5 (9,8)
17 (33,3)
15 (30,0)
7 (14,0)
29 (56,0)
36 (70,6)
11 (21,6)
4 (7,8)
8 (15,7)
12 (23,5)
31 (60,8)
51(100,0)
Tabela 5 - Distribuição absoluta e relativa da imunoreatividade nuclear ou citoplasmática da
proteína APE-1 nas células do front de invasão tumoral de carcinoma epidermoide de língua
oral. Natal – RN, 2016
Imunoreatividade nuclear ou citoplasmática de APE-1
Negativa (≤10%)
Apenas nuclear
Apenas citoplasmática
Nuclear e citoplasmática
Total
Fonte: Elaboração própria.
n (%)
15 (30,0)
14 (26,0)
12 (24,0)
10 (20,0)
51(100,0)
50
Tabela 6 - Distribuição absoluta e relativa da imunoreatividade nuclear ou citoplasmática da
proteína XRCC-1 nas células do front de invasão tumoral de carcinoma epidermoide de
língua oral. Natal – RN, 2016
Imunoreatividade nuclear ou citoplasmática de XRCC-1
Negativa (≤10%)
Apenas nuclear
Apenas citoplasmática
Nuclear e citoplasmática
Total
Fonte: Elaboração própria.
n (%)
8 (15,7)
43 (84,3)
0 (0,0)
0 (0,0)
51(100,0)
51
Figura 5 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão positiva de APE1 >50% no front de invasão tumoral (HiDef; Barra = 1000μm).
Figura 6 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão citoplasmática de
APE-1 (HiDef; Barra = 100μm).
52
Figura 7 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão nuclear e
citoplasmática de APE-1 (HiDef; Barra = 50μm).
Figura 8 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo imunoexpressão positiva de
XRCC-1 >50% no front de invasão tumoral (HiDef; Barra = 200μm).
53
Figura 9 – Carcinoma epidermoide de língua oral exibindo alta imunoexpressão de XRCC-1
(HiDef; Barra = 50μm).
54
5.4 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA
Com o intuito de avaliar a possível associação estatística entre a imunoexpressão das
proteínas APE-1 e XRCC-1 e as variáveis clínicas e histopatológicas estudadas, utilizou-se o
teste estatístico paramétrico de Qui-quadrado de Pearson e, quando necessário, o teste nãoparamétrico Exato de Fisher.
Em relação ao estadiamento clínico, observou-se alta imunoexpressão de APE-1 tanto
no grupo com estádio I e II, como no grupo III e IV, não havendo associação estatística entre
as variáveis (p=0,78). Já para a XRCC-1 observou-se que a maioria dos casos com estádio I e
II (78,9%) apresentou alta imunoexpressão dessas proteínas, enquanto mais da metade dos
casos com pior estádio (III e IV) apresentaram baixa imunoexpressão (53,3%), sendo esta
associação estatisticamente significativa (p=0,02) (Tabela 7).
Quanto à presença de metástase no momento do diagnóstico, observou-se maior
imunoexpressão de APE-1 nos casos com metástase (65,4%) e maior expressão de XRCC-1
nos casos sem metástase (66,7%), entretanto não foi observada associação estatisticamente
significativa entre essas variáveis (p=0,16 e p=0,35, respectivamente) (Tabela 7 e Figuras 10
e 11).
Em relação ao parâmetro recidiva loco-regional, observou-se distribuição semelhante
da imunoexpressão alta e baixa de APE-1 para os casos com ou sem recidiva, não havendo
associação estatística (p=0,77). Para a proteína XRCC-1, observou-se maior imunoexpressão
nos casos que apresentaram recidiva (70,6%), entretanto, não foi observada associação
estatisticamente significativa (p=0,27) (Tabela 7 e Figura 11).
Observando a variável desfecho, notou-se alta imunoexpressão de APE-1 e XRCC-1
nos casos que foram à óbito (61,5% e 57,7%, respectivamente); entretanto, não houve
associação estatística entre as variáveis (p=0,41 e p=0,76, respectivamente) (Tabela 7 e
Figuras 10 e 11).
Quando comparada a distribuição dos casos de CELO de acordo com a
imunoexpressão das proteínas APE-1 e XRCC-1 observou-se distribuição semelhante para os
grupos baixa e alta expressão, sendo que ambas proteínas apresentaram alta expressão na
maioria dos casos; contudo, não houve associação estatística entre essas variáveis (p=0,64).
(Tabela 8).
55
Tabela 7 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de acordo com a imunoexpressão das proteínas
de reparo do DNA (APE-1 e XRCC-1), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase linfonodal, o tratamento, a presença de recidiva
locoregional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2016
Parâmetro
APE-1
Total
p
XRCC1
Baixo
Total
p
Baixo
Alto
Alto
9(47,4)
13(43,3)
10(52,6)
17(56,7)
19(100)
30(100)
0,78#
4(21,1)
16(53,3)
15(78,9)
14(46,7)
19(100)
30100)
0,02#
13(54,2)
9(34,6)
11(45,8)
17(65,4)
24(100)
26(100)
0,16#
8(33,3)
12(46,2)
16(66,7)
14(53,8)
24(100)
26(100)
0,35#
15(45,5)
7(41,2)
18(54,4)
10(58,8)
33(100)
17(100)
0,77#
15(45,5)
5(29,4)
19(54,4)
12(70,6)
33(100)
17(100)
0,27#
12(50,0)
10(38,5)
12(50,0)
16(61,5)
24(100)
26(100)
0,41#
9(37,5)
11(42,3)
15(62,5)
15(57,7)
24(100)
26(100)
0,76#
Estadiamento
I ou II
III ou IV
Metástase
Ausente
Presente
Recidiva locoregional
Ausente
Presente
Desfecho
Remissão
Óbito
Legenda: # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher;
Fonte: Elaboração própria.
56
Figura 10- Distribuição relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de
acordo com a imunoexpressão de APE-1 e a presença de metástase linfonodal, a
presença de recidiva locoregional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento.
Natal – RN, 2016
APE-1
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Sem
Com
Sem
Metastase Metastase Recidiva
Baixo
Com
Remissão
Recidiva
Óbito
Alto
Fonte: Elaboração própria.
Figura 11- Distribuição relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de
acordo com a imunoexpressão de XRCC-1 e a presença de metástase linfonodal, a
presença de recidiva locoregional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento.
Natal – RN, 2016
XRCC-1
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Sem
Com
Sem
Com Remissão
Metastase Metastase Recidiva Recidiva
Baixo
Fonte: Elaboração própria.
Alto
Óbito
57
Tabela 8 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de
língua oral de acordo com a expressão das proteínas de reparo do DNA (XRCC-1 e
APE-1). Natal – RN, 2016.
XRCC-1
APE-1
Baixa
Alta
Total
Legenda: # Qui-Quadrado;
Fonte: Elaboração própria
Baixa
Alta
8(36,4)
12(42,9)
14(63,6)
16(57,1)
20(40,0)
30(60,0)
Total
p
22(100)
28(100)
0,64#
58
Em relação a distribuição dos casos de CELO segundo o sistema de gradação
histopatológica de malignidade proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) e a
imunoexpressão das proteínas APE-1 e XRCC-1 verificou-se o seguinte (Tabela 9):

Imunoexpressão semelhante de ambas proteínas em casos com e sem
invasão perineural, não havendo associação estatística (p=0,55 e p=0,32,
respectivamente).

Distribuição semelhante das proteínas nos casos com diferentes tipos de
infiltrado inflamatório, não se observando associação estatística.

Casos com pior padrão de invasão 1, 2 ou 3 apresentaram
imunoexpressão semelhante das proteínas, enquanto a maioria dos casos
com pior padrão tipo 4 apresentaram alta imunoexpressão de APE-1 e
XRCC-1 (59,5% em ambos); apenas 3 casos apresentaram pior padrão de
invasão tipo 5 e para esses casos houve baixa imunoexpressão de APE-1
e alta imunoexpressão de XRCC-1, entretanto, não se observou
associação estatisticamente significativa.

A
análise
de
risco
mostrou
que
tanto
os
casos
de
risco
baixo/intermediário quanto os de alto risco tiveram alta imunoexpressão
das duas proteínas, não havendo associação estatística.
59
Tabela 9 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral de acordo com a gradação de malignidade
recomendada por Brandwein-Gensler et al. (2005) e a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (APE-1 e XRCC-1). Natal – RN, 2016.
Parâmetro
APE-1
Total
Baixo
Alto
8(50,0)
14(41,2)
8(50,0)
20(58,8)
16(100)
34(100)
13(48,1)
3(27,3)
6(50,0)
14(51,9)
8(72,7)
6(50,0)
27(100)
11(100)
12(100)
4(40,0)
15(40,5)
3(100,0)
6(60,0)
22(59,5)
0(0,0)
10(100)
37(100)
3(100)
13(41,9)
9(47,4)
18(58,1)
10(52,6)
31(100)
19(100)
p
XRCC1
Total
p
Baixo
Alto
8(50,0)
12(35,3)
8(50,0)
22(64,7)
16(100)
34(100)
9(33,3)
7(63,6)
4(33,3)
18(66,7)
4(36,4)
8(66,7)
27(100)
11(100)
12(100)
0,14†
5(50,0)
15(40,5)
0(0,0)
5(50,0)
22(59,5)
3(100)
10(100)
37(100)
3(100)
0,41†
0,70#
14(45,2)
6(31,6)
17(54,8)
13(68,4)
31(100)
19(100)
0,34#
Invasão Perineural
Ausente
Pequenos nervos
0,55#
0,32#
Infiltrado Linfocitário
Continuo
Em placa
Fraco
0,44†
0,22†
Pior padrão de invasão
1 ou 2 ou 3
4
5
Análise de risco
Risco baixo/intermediário
Alto Risco
Legenda: # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher;
Fonte: Elaboração própria.
60
DISCUSSÃO
61
6. DISCUSSÃO
Apesar de todos os avanços científicos e tecnológicos a respeito do CEO, a
imprevisibilidade em seu quadro evolutivo caracterizada pelos altos índices de mortalidade e
diferentes respostas do tumor diante de protocolos terapêuticos por vezes equivalentes, traz à
tona o importante papel que as características genéticas do organismo hospedeiro exercem na
etiopatogênese e no comportamento biológico desta neoplasia (JOHNSON; JAYASEKARA;
AMARASINGHE, 2011). Sob esta perspectiva, pesquisadores têm investigado potenciais
marcadores biológicos que sejam capazes de elucidar o comportamento e predizer o
prognóstico desse tipo de câncer, de forma a colaborar no desenvolvimento de alvos
terapêuticos e na escolha do tratamento (HSIA et al., 2015; MAHJABEEN et al., 2014;
SØLAND; BRUSEVOLD, 2013).
Dentre os diversos marcadores biológicos em potencial, destacam-se os genes de
reparo do DNA e suas proteínas correspondentes, que estão envolvidos na correção de danos
provocados por agentes carcinogênicos, como álcool, tabaco e radiação ultravioleta. Os
mecanismos envolvidos no reparo do DNA são de interesse para as pesquisas com câncer pelo
fato de que mutações nos genes de reparo podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de
tumores e pelo desenvolvimento de resistência das células malignas a agentes quimioterápicos
(KROKAN et al., 2000; ROBERTSON et al., 2009; ZHAO; USDIN, 2015).
Recentemente, a expressão de proteínas associadas ao reparo do DNA, incluindo APE1 e XRCC-1 tem sido demonstrada em diversos tipos de câncer, incluindo os carcinomas de
colo do útero, ovário, próstata, trato gastro-esofágico, pâncreas, bexiga e cabeça e pescoço,
além de casos de câncer de pulmão, osteossarcoma e ependimoma pediátrico (FARNEBO et
al., 2015; HSIA et al., 2015; HUANG et al., 2013; LI et al., 2014; MAHJABEEN et al., 2014;
SEIWERT et al., 2014; SHIN et al., 2015; WOO et al., 2014).
Baseado nesses conhecimentos, este estudo se propôs a investigar a imunoexpressão
das proteínas envolvidas no reparo do DNA por excisão de bases APE-1 e XRCC-1 e a sua
associação com parâmetros clínicos e histopatológicos em uma série de casos de CELO, a fim
de investigar um possível valor prognóstico para essas proteínas.
A amostra selecionada para este estudo consistiu em 51 casos de CELO
diagnosticados e tratados na Liga Norte-Riograndense contra o Câncer. Destes casos, 64,7%
correspondiam a pacientes do sexo masculino, com 54,9% dos casos representados por
62
pacientes com idade superior a 60 anos. A maioria dos pacientes era tabagista (80,4%) e
etilista (62,7%). Estes dados mostram que o perfil demográfico da amostra se assemelha aos
dados epidemiológicos apresentados para o CEO ao longo dos anos (JOHNSON;
JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011; MALEKI et al., 2015; MOORE et al., 2000).
A língua é o sítio intra-oral mais acometido pelo CEO, apresentando alta morbidade e
mortalidade, e por isso foi escolhida como alvo deste estudo. Em um período de dez anos,
foram diagnosticados 282 casos de CELO na LIGA, sendo que nos 51 casos que constituíram
a amostra estudada a maioria dos pacientes apresentava no momento do diagnóstico tamanho
do tumor T2 ou T3 (72,6%) e 45,1% desses pacientes apresentava comprometimento
linfonodal (N clínico), perfazendo um total de 30 pacientes (58,8%) com pior estágio clínico
(III ou IV). Quanto à evolução clínica dos pacientes, observou-se que 51% apresentaram
metástase linfonodal comprovada por meio de exame histopatológico (N patológico),
enquanto que 35,3% desenvolveram recidiva loco-regional durante o tratamento. Pouco mais
da metade desses pacientes (52,9%) foi a óbito. Este elevado número de pacientes com
tumores em estágio avançado e prognóstico ruim provavelmente ocorre por conta do
diagnóstico tardio do câncer de boca, devido a fatores observados previamente por Johnson,
Jayasekara e Amaransighe (2011) e Moore (2000), como sua gama de apresentações clínicas e
ausência de sintomatologia dolorosa, que dificultam a identificação precoce tanto pelo
paciente, quanto por profissionais da área de saúde.
Em relação à análise das proteínas selecionadas para este estudo, seguiu-se as
metodologias adaptadas das recomendadas por Hsia et al. (2015) e Mahjabeen et al. (2014),
que preconizam a avaliação independente do local de imunomarcação na célula para a
proteína APE-1 e apenas nuclear para XRCC-1. Para a quantificação, esta marcação foi
dividida em baixa (<50% de células positivas) e alta (≥50% de células positivas).
Seguindo
esta
metodologia,
observou-se
elevada
imunomarcação
nuclear/citoplasmática de APE-1 em 56% dos casos estudados. Esses dados corroboram os
encontrados por Hsia et al. (2015) em estudo com 146 casos de CEO, que observaram elevada
expressão imuno-histoquímica de APE-1 em 52,73% de sua amostra. Mahjabeen et al. (2014)
também observaram superexpressão imuno-histoquímica dessa proteína em 50 casos de
CECP. Também de forma consistente com nossos achados, Koukourakis et al. (2001)
demonstraram elevada marcação imuno-histoquímica nuclear e citoplasmática em 95
pacientes com CECP localmente agressivos, incluindo 10 casos de CEO.
63
Apesar de existirem poucos estudos avaliando a expressão de APE-1 em carcinomas
da região de cabeça e pescoço, percebe-se um padrão variável na expressão imunohistoquímica dessa proteína. Essas diferenças podem ser exemplificadas comparando dois
estudos que utilizaram diferentes anticorpos monoclonais de APE-1 do mesmo fabricante. O
estudo de Souza et al. (2011) mostrou imunoexpressão da proteína exclusivamente no núcleo
de 27 casos de CE de lábio (clone 2104, Abcam), enquanto o estudo de Tarjan et al. (2011)
demonstrou expressão apenas citoplasmática em 34 casos de CELO (clone 194-50, Abcam).
Em contrapartida, nosso estudo utilizou um terceiro anticorpo monoclonal (clone 3722,
Abcam), para o qual foi observada imunomarcação tanto nuclear quanto citoplasmática e, por
vezes, ambas. Acredita-se que esta discrepância na distribuição celular de APE-1 esteja
relacionada a diferenças nos anticorpos, metodologia e tamanho da amostra.
Tell et al. (2005) afirmam que a mudança de localização da proteína APE-1 nos
compartimentos celulares mediante diferentes estímulos pode variar de acordo com o tipo
celular e estágios da doença, sendo que a resposta a esses estímulos pode geralmente
promover o movimento intracelular da proteína do núcleo para o citoplasma, fazendo com que
ela esteja superexpressa em células com metabolismo elevados e altas taxa proliferativas.
Alguns pesquisadores relatam que a APE-1 citoplasmática presente no DNA mitocondrial
também pode estar envolvida na via BER nesta organela; já que devido à fosforilação
oxidativa, a mitocôndria produz grandes quantidades de EROs, fazendo com que o DNA
mitocondrial (mtDNA) também seja susceptível a mutações (CHATTOPADHYAY et al.,
2006; TELL et al., 2005). Bapat, Fishel e Kelley (2009) e Tell et al. (2009) acreditam ainda
que esta proteína também pode estar relacionada à regulação de atividades redox no
citoplasma.
Evidências crescentes sugerem que elevados níveis de APE-1 estão relacionados com
agressividade de diferentes tumores, possuindo valor prognóstico (HSIA et al., 2015; LI et al.,
2014; NAGOYA et al., 2014; QING et al., 2015; SHIN et al., 2015; WOO et al., 2014;
KOUKOURAKIS et al., 2001). Visando investigar este possível valor prognóstico, realizouse testes estatísticos para determinar a associação entre a imunoexpressão de APE-1 e os
parâmetros clínicos e histopatológicos dos casos estudados. Em relação aos parâmetros
clínicos, observou-se alta expressão de APE-1 nos casos com metástase linfonodal e naqueles
que foram a óbito; entretanto, não foi observada associação estatisticamente significativa.
Esses resultados corroboram os encontrados por Mahjabeen et al. (2014), que também não
demonstraram associação entre a expressão de APE-1 e os parâmetros estágio clínico,
64
tamanho do tumor e estado nodal. Hsia et al. (2015) observaram associação estatística apenas
para o parâmetro estado nodal.
Ao se testar alguma associação da imunoexpressão da APE-1 e a classificação dos
casos segundo o sistema de gradação histopatológica proposto por Brandwein-Gensler et al.
(2005), não se observou associação estatística significante entre os parâmetros estudados e a
expressão da proteína APE-1. Esses achados assemelham-se aos encontrados por Hsia et al.
(2015) e Souza et al. (2011), que também não observaram associação entre a expressão da
APE-1 e casos de CEO e CEL definidos pela OMS (2005) como bem, moderadamente ou
pobremente diferenciados, respectivamente. Por sua vez, no estudo de Mahjabeen et al.
(2014), os casos de CECP estudados demonstraram maior expressão da APE-1 em casos
pobremente diferenciados (p<0,05). Essas diferenças podem se dar por conta dos diversos
fatores etiológicos que estão envolvidos na patogênese de tumores de sítios anatômicos, o que
pode influenciar na sua evolução e prognóstico.
Estudos com outros tipos de câncer também tentaram determinar o valor prognóstico
da APE-1. Woo et al. (2014) observaram elevada imunoexpressão nuclear dessa proteína em
casos de câncer de mama, mostrando uma tendência à associação com pior prognóstico, em
relação à sobrevida livre de doença. Entretanto, esses autores também não observaram
associação com outros fatores prognósticos. Já Qing et al. (2015) observaram que para casos
de câncer do trato gastrointestinal a elevada expressão de APE-1 esteve significativamente
associada com profundidade de invasão, metástase linfonodal, subtipo histopatológico,
sobrevida global e tamanho do tumor.
A inegável superexpressão da APE-1 em neoplasias malignas foi ressaltada neste
estudo e nos citados previamente. Segundo Hsia et al. (2015) e Mahjabeen et al. (2014), a alta
expressão desta proteína pode estar realmente envolvida com a progressão tumoral ou mesmo
possa conferir resistência terapêutica às células tumorais e, por isso, influenciar
negativamente o prognóstico dos pacientes com câncer. O fato de não observarmos associação
estatística entre essa expressão e os parâmetros clínicos pode estar relacionado a
características intrínsecas da amostra, assim como tamanho amostral. Os resultados para os
parâmetros histopatológicos desse e outros estudos mostram que esta proteína provavelmente
não está relacionada a um pior grau histopatológico de malignidade, entretanto, diferenças
metodológicas nos sistemas de gradação utilizados prejudicam essa comparação. Enquanto o
sistema proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) faz uma análise do risco
65
histopatológico, o sistema mais utilizado por outros estudos (OMS, 2005) determina apenas o
grau de diferenciação do tumor, sendo uma análise mais subjetiva.
A análise da XRCC-1 demonstrou alta expressão nuclear desta proteína em 60,8% dos
casos de CELO estudados, sendo que em nenhum caso foi observada expressão
citoplasmática. Esses resultados corroboram os encontrados por Ang et al. (2011) para 138
casos de CECP (incluindo 57 CEOs), dos quais 55,8% apresentaram alta imunoexpressão de
XRCC-1. Em estudo com pacientes com carcinoma epidermoide de laringe, Nix et al. (2004)
observaram elevada expressão nuclear de XRCC-1 em 63% dos casos resistentes ao
tratamento radioterápico, enquanto apenas 43% dos casos radiosensíveis apresentaram
elevada expressão da proteína. Entretanto, o estudo de Mahjabeen et al. (2014) demonstrou
expressão tanto nuclear quanto citoplasmática da XRCC-1 em 50 casos de CECP (incluindo
14 casos de CEO); os autores observaram baixa expressão da proteína na maioria dos casos.
Resultados variados na expressão da XRCC-1 também foram demonstrados em câncer
gástrico e de bexiga por Sakano et al. (2013) e Wang et al. (2010). Assim como para a APE-1,
estes resultados podem ter sido influenciados pelo clone do anticorpo utilizado, também como
pelas características amostrais, incluindo tumores de origens diversas.
No intuito de avaliar o possível valor prognóstico da XRCC-1, realizou-se testes
estatísticos de associação entre a expressão desta proteína e os parâmetros clínicos e
histopatológicos.
Observou-se
associação
estatisticamente
significativa
entre
a
imunoexpressão da XRCC-1 e o estágio clínico, sendo que a maioria dos casos com estágio I
e II (78,9%) apresentou alta imunoexpressão dessa proteína, enquanto mais da metade dos
casos (53,3%) com estágio clínico avançado (III e IV) apresentaram baixa imunoexpressão
(p=0,02). Mahjabeen et al. (2014) também demonstraram alta expressão de XRCC-1 nos
casos com estágio I e II (p<0,001). Ang et al. (2011) não encontraram associação entre esses
parâmetros, mas demonstraram que a alta expressão de XRCC-1 esteve relacionada a uma
menor sobrevida.
A elevada imunoexpressão de XRCC-1 identificada em diversas neoplasias malignas
pode estar relacionada a distintos desfechos. Abdel-Fatah et al. (2013) identificaram que a
superexpressão de XRCC-1 está associada a piores desfechos em carcinoma de ovário.
Entretanto, estudos realizados em carcinoma de bexiga (SAKANO et al., 2013), de esôfago
(WEI et al., 2015) e de colo uterino (BAJPAI et al., 2013) demonstraram que a
superexpressão de XRCC-1 está relacionada a melhores parâmetros clínicos, morfológicos e
66
de seguimento destas neoplasias. Estes resultados sugerem que a alta expressão de XRCC-1
pode ser indicativa de melhores parâmetros clínicos, o que indicaria que essa proteína poderia
estar desempenhando seu papel normalmente e atuando na proteção do indivíduo. Entretanto,
esta proteína também pode exercer efeito reparativo em células tumorais, promovendo a
progressão com desenvolvimento de resistência terapêutica. Devido a esses resultados
conflitantes, novas investigações em CELO são necessárias.
Assim como os autores citados previamente (ANG et al., 2011; MAHJABEEN et al.,
2014), não se encontrou associação estatística com outros parâmetros clínicos, como recidiva
e desfecho. Para os parâmetros histopatológicos, também não foram encontradas associações
significativas, diferindo do encontrado por Mahjabeen et al. (2014), que observaram
associação entre a subexpressão de XRCC-1 e casos pobremente diferenciados de CECP.
Esses resultados sugerem que a XRCC-1, mesmo estando comprovadamente expressa
em casos de CECPs e CELOs, não possui associação com parâmetros prognósticos nesses
tipos de neoplasias. Isso pode ocorrer devido aos diferentes papéis que esta proteína pode
assumir no reparo do DNA de cada indivíduo, já que sua superexpressão pode estar
relacionada tanto à proteção do paciente, quanto à capacidade das células de resistirem ao
tratamento.
As proteínas XRCC-1 e APE-1 permitem e facilitam o processo de reparo do DNA e
são, portanto, especialmente importantes em pacientes sob tratamento quimio e radioterápico.
A radiação ionizante ativa o processo de morte celular ao induzir danos ao DNA, como danos
às bases nitrogenadas, quebra de fita simples, quebra de fita dupla e recombinações entre as
fitas de DNA. Por sua vez, a quimioterapia, particularmente a baseada no uso da platina,
provoca ligação do fármaco ao DNA, formando adutos que distorcem a estrutura do mesmo,
causando danos e morte celular. A combinação da quimioterapia com a radiação aumenta o
efeito citotóxico geral da radioterapia ao induzir mais danos ao DNA e prejudicar o seu
reparo. Esse reparo é até certo ponto processado pelos complexos enzimáticos da via BER.
Portanto, uma alta expressão de suas principais proteínas pode aumentar a capacidade das
células tumorais de reparar o seu DNA, provocando resistência ao tratamento, conforme
relato de Ang et al. (2011).
Não obstante, outras proteínas envolvidas no reparo do DNA também podem
influenciar o desfecho dos tratamentos e requerem consideração. A PARP-1 e OGG1, por
exemplo, participam do reparo pela via BER e são necessárias para a estabilidade da XRCC-1
67
(MAHJABEEN et al., 2014; WOOD; MITCHELL; LINDAHL, 2005). Proteínas participantes
de outras vias de reparo do DNA, como ERCC1, ERCC2, XPC, XPD, XPF também já foram
demonstradas em câncer oral e de cabeça e pescoço e podem estar relacionadas à progressão
da doença (BAJPAI et al., 2013; FARNEBO et al., 2015).
Este estudo possui a limitação de ser um estudo retrospectivo e, por isso, teve seu
tamanho amostral influenciado por diferentes fatores como a coleta de blocos de material
parafinado suficientes para estudo imuno-histoquímico e de informações clínicas bem
documentadas, que mostrassem um acompanhamento de no mínimo cinco anos dos pacientes
vivos. Entretanto, essas restrições somadas ao fato de se trabalhar com um único sítio
anatômico, permitiram que se traçasse um perfil fidedigno da amostra e que fosse possível
avaliar o desfecho da doença.
Finalmente, nossos resultados mostraram que a alta imunoexpressão das proteínas do
reparo do DNA APE-1 e XRCC-1 não está associada de forma significante aos parâmetros
clínicos e histopatológicos nos casos de câncer de língua oral estudados; não podendo,
portanto, serem utilizadas como marcadores prognósticos independentes. Todavia, acredita-se
que a desregulação dessas e outras proteínas envolvidas na via BER participem na iniciação e
progressão do câncer. Estudos adicionais, envolvendo diferentes técnicas, são necessários
para explorar na sua totalidade os mecanismos moleculares que contribuem para a
desregulação desses genes e suas proteínas e elucidar o seu papel no câncer oral.
68
7. CONCLUSÃO
Com base nos resultados desta pesquisa, pode-se concluir que:
1. A imunoexpressão da proteína XRCC-1 não apresentou associação significativa com os
parâmetros clínicos metástase, recidiva e desfecho ou com parâmetros de gradação
histopatológica.
No
entanto,
a
alta
imunoexpressão
dessa
proteína
mostrou-se
significativamente associada a um melhor estadiamento clínico em carcinoma epidermoide de
língua oral.
2. A imunoexpressão da proteína APE-1 não apresentou associação significativa com os
parâmetros clínicos e histopatológicos estudados em carcinoma epidermoide de língua oral.
3. A alta imunoexpressão das proteínas APE-1 e XRCC-1 observada em carcinoma
epidermoide de língua oral sugere sua importância no desenvolvimento e progressão desta
doença; no entanto, os resultados deste experimento indicam que a expressão imunohistoquímica dessas proteínas não está associada aos parâmetros prognósticos estudados nesta
neoplasia.
69
REFERÊNCIAS
70
REFERÊNCIAS
ABDEG, S. R. et al. Association between polymorphisms of XRCC1 , p53 and MDR1 genes ,
the expression of their protein products and prognostic significance in human breast cancer.
Medical Science Monitor, v. 17, n. 12, p. 354–363, 2011.
ABDEL-FATAH, T. et al. Clinicopathological and functional significance of XRCC1
expression in ovarian cancer. International Journal of Cancer, v. 132, n. 12, p. 2778–2786,
2013.
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 5a. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.
ALMANGUSH, A. et al. A simple novel prognostic model for early stage oral tongue cancer.
International Journal of Oral Maxillofacial Surgery, n. October 2014, p. 143–150, 2015.
ALMEIDA, K. H.; SOBOL, R. W. A unified view of base excision repair: lesion-dependent
protein complexes regulated by post-translational modification. DNA Repair (Amst)., v. 6, n.
6, p. 695–711, 2007.
ANNEROTH, G.; BATSAKIS, J.; LUNA, M. Review of the literature and a recommended
system of malignancy grading in oral squamous cell carcinoma. Scandinavian Journal of
Dental Research, v.95, n.3, p.229-249, 1987.
ANG, M.-K. et al. High XRCC1 protein expression is associated with poorer survival in
patients with head and neck squamous cell carcinoma. Clinical cancer research : an official
journal of the American Association for Cancer Research, v. 17, n. 20, p. 6542–52, 2011.
BAJPAI, D. et al. Decreased expression of DNA repair genes (XRCC1, ERCC1, ERCC2, and
ERCC4) in squamous intraepithelial lesion and invasive squamous cell carcinoma of the
cervix. Molecular and Cellular Biochemistry, v. 377, n. 1-2, p. 45–53, 2013.
BAPAT, A.; FISHEL, M. L.; KELLEY, M. R. Going ape as an approach to cancer
therapeutics. Antioxid. Redox Signaling, v. 11, n. 3, p. 651–668, 2009.
BARNES, L. et al. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and
Genetics of Head and Neck Tumours. Lyon: IARC Press, 2005.
BIANCHINO, G. et al. Genes and Cancer Risk in a Southern Italian Population : A Case –
Control Study. Anticancer Research, v. 1366, n. 31, p. 1359–1365, 2011.
BRANDWEIN-GENSLER, M. et al. Oral Squamous Cell Carcinoma - Histologic risk
assessment, but not margin status, is strongly predictive of local disease-free and overall
survival. American journal of surgical pathology, v. 29, n. 2, p. 167–178, 2005.
BRANDWEIN-GENSLER, M. et al. Validation of the histologic risk model in a new cohort
of patients with head and neck squamous cell carcinoma. The American journal of surgical
pathology, v. 34, n. 5, p. 676–688, 2010.
BREM, R.; HALL, J. XRCC1 is required for DNA single-strand break repair in human cells.
Nucleic Acids Research, v. 33, n. 8, p. 2512–2520, 2005.
BRODERS, A.C. Squamous-cell epithelioma of the lip: a study of five hundred and thirtyseven cases. Journal of American Medical Association, v.6, p.656-64, 1920.
BRYNE, M. et al. New malignancy grading is a better prognostic indicator than
Broders´grading in oral squamous cell carcinomas. Journal of Oral Pathology and
Medicine, v.18, p.432-437, 1989.
BRYNE, M. et al. Malignancy grading of the deep invasive margins of oral squamous cell
carcinomas has high prognostic value. Journal of Pathology, v.166, n.4, p.375-81, 1992.
71
BRYNE, M. Is the invasive front of an oral carcinoma the most important area for the
prognostication? Oral Diseases, v.4, n.2, p.70-77, 1998.
CHATTOPADHYAY, R. et al. Identification and characterization of mitochondrial abasic
(AP)-endonuclease in mammalian cells. Nucleic acids research, v. 34, n. 7, p. 2067–76,
2006.
FARNEBO, L. et al. Strong expression of survivin is associated with positive response to
radiotherapy and improved overall survival in head and neck squamous cell carcinoma
patients. International Journal of Cancer, v. 133, n. 8, p. 1994–2003, 2013.
FARNEBO, L. et al. DNA repair genes XPC, XPD, XRCC1, and XRCC3 are associated with
risk and survival of squamous cell carcinoma of the head and neck. DNA Repair, v. 31, p.
64–72, 2015.
HSIA, K.-T. et al. The impact of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1/redox factor-1
(APE1/Ref-1) on treatment response and survival in oral squamous cell carcinoma. Head and
Neck, v. 1, n. [IN PRESS], 2015.
HUANG, M. Y. et al. Predictive value of ERCC1, ERCC2, and XRCC1 overexpression for
stage III colorectal cancer patients receiving FOLFOX-4 adjuvant chemotherapy. Journal of
Surgical Oncology, v. 108, n. 7, p. 457–464, 2013.
HUANG, W. Y. et al. Selected genetic polymorphisms in MGMT, XRCC1, XPD, and
XRCC3 and risk of head and neck cancer: A pooled analysis. Cancer Epidemiology
Biomarkers and Prevention, v. 14, n. 7, p. 1747–1753, 2005.
JOHNSON, N. W.; JAYASEKARA, P.; AMARASINGHE, A A H. K. Squamous cell
carcinoma and precursor lesions of the oral cavity: epidemiology and aetiology.
Periodontology 2000, v. 57, n. 1, p. 19–37, 2011.
KAKOLYRIS, S. et al. Expression and subcellular localization of human AP endonuclease 1
(HAP1/Ref-1) protein: A basis for its role in human disease. Histopathology, v. 33, n. 6, p.
561–569, 1998.
KOUKOURAKIS, M. et al. Nuclear Expression of Human Apurinic / Apyrimidinic
Endonuclease ( Hap1 / Ref-1 ) in Head-and-Neck Cancer Is Associated With Resistance To
Chemoradiotherapy and Poor Outcome. Int J Radiation Oncology Biol Phys, v. 50, n. 1, p.
27–36, 2001.
KROKAN, H. E. et al. Base excision repair of DNA in mammalian cells. FEBS letters, v.
476, n. 1-2, p. 73–77, 2000.
LI, Z. et al. Predictive value of APE1, BRCA1, ERCC1 and TUBB3 expression in patients
with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) receiving first-line platinum-paclitaxel
chemotherapy. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, n. 10, p. 777–786, 2014.
LINDENBLATT, C. R. et al. Associação da classificação da OMS e da AHR com fatores
clínico-patológicos do câncer de boca. Revista Brasileira de Odontologia, v. 1, n. 66, p. 65–
70, 2009.
LINDENBLATT, R. D. C. R. et al. Oral squamous cell carcinoma grading systems--analysis
of the best survival predictor. Journal of oral pathology & medicine, v. 41, n. 1, p. 34–9,
2012.
LIU, W. et al. Molecular analysis of DNA repair gene methylation and protein expression
during chemical-induced rat lung carcinogenesis. Biochemical and biophysical research
communications, v. 408, n. 4, p. 595–601, 2011.
72
LOURENÇO, S.Q.C. et al. Classificações histopatológicas para o carcinoma de células
escamosas da cavidade oral: revisão de sistemas propostos. Revista Brasileira de
Cancerologia v. 53, p. 325-33, 2007.
LUDWIG, D. L. et al. A murine AP-endonuclease gene-targeted deficiency with postimplantation embryonic progression and ionizing radiation sensitivity. Mutation Research DNA Repair, v. 409, n. 1, p. 17–29, 1998.
MAHJABEEN, I. et al. Deregulation of base excision repair gene expression and enhanced
proliferation in head and neck squamous cell carcinoma. Tumour biology : the journal of
the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, v. 1, p. 5971–
5983, 2014.
MALEKI, D. et al. Epidemiology of Oral Cancer in Iran : a Systematic Review. Asian Pacific
journal of cancer prevention, v. 16, p. 5427–5432, 2015.
MIAO, J. et al. Prediction value of XRCC 1 gene polymorphism on the survival of ovarian
canMiao, J., Zhang, X., Tang, Q.-L., Wang, X.-Y., & Kai, L. (2012). Prediction value of
XRCC 1 gene polymorphism on the survival of ovarian cancer treated by adjuvant
chemotherapy. As. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP, v. 13, n. 10, p.
5007–10, 2012.
MOORE, S. R. et al. The epidemiology of tongue cancer: a review of global incidence. Oral
diseases, v. 6, n. 2, p. 75–84, 2000.
NAGOYA, H. et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis
and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues.
American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology, v. 306, n. 3, p.
G183–90, 2014.
NAGPAL, J. K.; DAS, B. R. Oral cancer: reviewing the present understanding of its
molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral
Oncology, v. 39, n. 3, p. 213–221, 2003.
NEVILLE, B. W. et al. Patologia Oral e Maxilofacial. 3a. ed. Rio de Janeiro: Elsevier Ltd,
2009.
NIX, P. et al. Expression of XRCC 1 and ERCC 1 proteins in radioresistant and radiosensitive
laryngeal cancer. Cancer therapy, v. 2, p. 47–53, 2004.
QING, Y. et al. Upregulation of PD-L1 and APE1 is associated with tumorigenesis and poor
prognosis of gastric cancer. Drug design, development and therapy, v. 9, p. 901–909, 2015.
RAMACHANDRAN, S. et al. Single nucleotide polymorphisms of DNA repair genes
XRCC1 and XPD and its molecular mapping in Indian oral cancer. Oral Oncology, v. 42, n.
4, p. 350–362, 2006.
RIKARDSEN, O. G. et al. Clinicopathological characteristics of oral squamous cell
carcinoma in Northern Norway: a retrospective study. BMC oral health, v. 14, p. 103, 2014.
ROBERTSON, A. B. et al. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and
Molecular Life Sciences, v. 66, n. 6, p. 981–993, 2009.
SABA, N. F. et al. Gender and ethnic disparities in incidence and survival of squamous cell
carcinoma of the oral tongue, base of tongue, and tonsils: A surveillance, epidemiology and
end results program-based analysis. Oncology, v. 81, n. 1, p. 12–20, 2011.
SAKANO, S. et al. ERCC1 and XRCC1 expression predicts survival in bladder cancer
patients receiving combined trimodality therapy. Molecular and clinical oncology, p. 403–
410, 2013.
73
SCULLY, C.; FIELD, J. K.; TANZAWA, H. Genetic aberrations in oral or head and neck
squamous cell carcinoma (SCCHN): 1. Carcinogen metabolism, DNA repair and cell cycle
control. Oral Oncology, v. 36, n. 3, p. 256–263, 2000.
SEIWERT, T. Y. et al. DNA repair biomarkers XPF and phospho-MAPKAP kinase 2
correlate with clinical outcome in advanced head and neck cancer. PLoS ONE, v. 9, n. 7, p.
5–12, 2014.
SHIN, J. H. et al. APE1 / Ref-1 as a Serological Biomarker for the Detection of. Cancer
Research Treatment, n. [epub ahead of print], p. 1–11, 2015.
SØLAND, T. M.; BRUSEVOLD, I. J. Prognostic molecular markers in cancer - quo vadis?
Histopathology, v. 63, n. 3, p. 297–308, 2013.
SOUZA, L. R. et al. Immunohistochemical analysis of p53, APE1, hMSH2 and ERCC1
proteins in actinic cheilitis and lip squamous cell carcinoma. Histopathology, v. 58, n. 3, p.
352–360, 2011.
TARJAN, G. et al. Part II. Initial molecular and cellular characterization of high nitric oxideadapted human tongue squamous cell carcinoma cell lines. Tumour biology : the journal of
the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, v. 32, n. 1, p.
87–98, 2011.
TELL, G. et al. The intracellular localization of APE1/Ref-1: more than a passive
phenomenon? Antioxidants & redox signaling, v. 7, n. 3-4, p. 367–384, 2005.
TELL, G. et al. The many functions of APE1/Ref-1: not only a DNA repair enzyme.
Antioxidants & redox signaling, v. 11, n. 3, p. 601–620, 2009.
THAKUR, S. et al. A review on protein – protein interaction network of APE1 / Ref-1 and its
associated biological functions. Cell Biochemistry and Function, n. 33, p. 101–112, 2015.
THIAGARAJAN, S. et al. Predictors of prognosis for squamous cell carcinoma of oral
tongue. Journal of Surgical Oncology, v. 109, n. 7, p. 639–644, 2014.
UPPAL, V. XRCC-1 Gene Polymorphism (Arg399Gln) and Susceptibility to Development of
Lung Cancer in Cohort of North Indian Population: A Pilot Study. Journal of Clinical and
Diagnostic Research, p. 17–20, 2014.
WANG, P. et al. XRCC1 downregulated through promoter hypermethylation is involved in
human gastric carcinogenesis. Journal of Digestive Diseases, v. 11, n. 6, p. 343–351, 2010.
WANG, S. et al. Prognostic and Predictive Role of JWA and XRCC1 Expressions in Gastric
Cancer. Clinical Cancer Research, v. 18, n. 10, p. 2987–2996, 2012.
WEI, B. et al. Effects of JWA, XRCC1 and BRCA1 mRNA expression on molecular staging
for personalized therapy in patients with advanced esophageal squamous cell carcinoma.
BMC Cancer, v. 15, n. 1, p. 331, 2015.
WOO, J. et al. Prognostic value of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1)
expression in breast cancer. PLoS ONE, v. 9, n. 6, p. 1–7, 2014.
WOOD, R. D.; MITCHELL, M.; LINDAHL, T. Human DNA repair genes, 2005. Mutation
research, v. 577, n. 1-2, p. 275–283, 2005.
WU, W. et al. Association of x-ray repair cross-complementing group 1 Arg194Trp,
Arg399Gln and Arg280His polymorphisms with head and neck cancer susceptibility: A metaanalysis. PLoS ONE, v. 9, n. 1, 2014.
ZHAO, X.-N.; USDIN, K. The Repeat Expansion Diseases: the dark side of DNA repair? (IN
PRESS) DNA Repair, 2015.
74
APÊNDICES
75
APÊNDICES
Apêndice 1 - Ficha para coleta de dados clínicos
Ficha para anotação:
Data: ____/____/_______
Nº do prontuário:____________
Nº na Patologia:______________
Coleta de informações do prontuário
Nome:_______________________________________________
Gênero: ______Idade:______ Data de nascimento: ___/____/________
Localização:_____________
Estadiamento: T______ N_______ M _______
Data da biópsia excisional: ____/_____/______
Data do início do tratamento: ____/_____/______
Tratamento recebido: (
) {[1-cirurgia; 2-radioterapia; 3-quimioterapia], mais de um
tratamento, colocar os nº correspondentes}
Metástase linfonodo: (
) ____/____/_______
Metástase à distância: (
)
Recidiva Local (
) ____/____/_______
Data de diagnóstico de Metástase: ____/____/_______
Estado da doença: (
)
Data do último seguimento ( ) ou data do óbito _____/_____/_____
Estado da doença: [1-remissão completa, 2-remissão parcial, 3-doença estável, 4-doença
Metástase linfonodo: [1-sim, 2-não]
Metástase à distância: [1-sim, 2-não]
Outras informações
Bebe?
Sim ( )
Não: (
)
Quantidade dose/dia: ______________ Por quanto tempo:____________
Fuma?
Sim ( )
Não: (
)
Quantidade cigarro/dia: _____________ Por quanto tempo:___________
76
ANEXOS
77
ANEXOS
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Riograndense Contra o
Câncer
78