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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: _____02____/____2015___ a _____07____/_____2015_____ (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Variabilidade genética de genes imunorrelevantes em populações amazônicas: Aplicações médicas e bioantropológicas. Nome do Orientador: Eduardo José Melo dos Santos Titulação do Orientador: Doutorado Faculdade: Biomedicina Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Genética Humana e Médica Título do Plano de Trabalho: Associação de polimorfismos do gene HLA-DPB1 com a Dengue. Nome do Bolsista: André Luiz Teles e Silva Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/ CNPq 1 1. INTRODUÇÃO: A Dengue é a arbovirose mais importante no contexto de infecção de humanos (Fonseca BAL., 2002). É transmitida principalmente por meio da picada do mosquito Aedes aegypti, apesar de haver outra espécie, Aedes albopictus, que é responsável por alguns surtos em países asiáticos (Rodhain F, Rosen L., 1997) e, mas recentemente pela transmissão de outros vírus como o Chikungunya e Zika. É uma doença sazonal, ocorrendo com maior freqüência em períodos quentes e de alta umidade, tais condições favorecem a proliferação do mosquito (Dias LBA, 2010). A exposição ao vírus da dengue (DENV) envolve uma variedade de respostas imunológicas controladas geneticamente. Estes incluem a ativação das células T, B e células Natural Killers (NK), assim como a produção de anticorpos e uma variedade de citosinas, que juntas podem servir como fator de proteção ou serem prejudiciais ao indivíduo expostos ao DENV (Rotchman, 2004)). Os sintomas vão desde a Dengue relativamente branda, Febre da Dengue (FD), a quadros mais graves como a Febre da Dengue Hemorrágica (FDH) e Síndrome do Choque da Dengue (SCD) (Organização Mundial da Saúde, OMS, 1997). No entanto, uma proporção significativa de infecções DENV são subclínicas (Endy et al., 2.002), o que pode ser devido à exposição a uma cepa menos patogênica (Leitmeyer et al. 1.999), ou uma capacidade geneticamente determinada do hospedeiro para eliminar o vírus antes dos sintomas clínicos poderem surgir (Rotchman, 2004). Por outro lado, a imunidade parcial de reação cruzada para sorotipos DENV inéditas contribui para a doença grave, em alguns indivíduos submetidos a infecções secundárias (Rotchman, 2006). Assim, uma interação complexa entre as variantes genéticas de DENV e a resposta imune do hospedeiro é susceptível de determinar o resultado de infecções primárias e secundárias. Os alelos HLA diferem tanto qualitativa como quantitativamente, na sua capacidade para apresentar peptídeos e, portanto, influenciar as respostas imunes geradas (K. Alagarasu et al.,2013). Estudos realizados em Cuba, Brasil, Tailandia, Vietnã, Srilanka, populações Malaias e Venezuela sugeriram a associação de vários alelos de HLA de classe I e alelos HLA de classe II com FD ou FDH (Loke H, et al., 2001; Stephens HÁ, et al., 2002; LaFleur C, et al., 2002; de la C Sierra B, et al.,2007; Nguyen TP, et al,2008; Falcon-Lezama JA, et al.,2009; Appanna R, et al., 2010; Malavige GN, et al., 2011; Fernandez-Mestrem M, et al., 2009). 2 2. JUSTIFICATIVA: A dengue é uma doença emergente, causada pela infecção de variantes sorológicas do Vírus da Dengue (DENV), a partir da transmissão por mosquitos do gênero Aedes, cuja distribuição global é comparável com a do vetor da malária. Estima-se que cerca de três bilhões de pessoas estejam morando em áreas de riscos para transmissão epidêmica, e, portanto, a morbidade e mortalidade associadas a essa grave infecção são considerados sérios problemas de saúde pública em países de regiões tropicais e subtropicais. A infecção por DENV pode ser assintomática ou se manifestar em duas formas clínicas da doença: Dengue Clássica (DC) caracterizada principalmente por febre alta de início abrupto, cefaléia, mialgia, artralgia, dor retro orbitária, desconforto abdominal e usualmente exantema (Martina et al., 2009); e Febre Hemorrágica por Dengue (FHD), que pode eventualmente progredir para choque hipovolêmico chamado Síndrome do Choque por Dengue (SCD), cujos sintomas são caracterizados por quadros hemorrágicos como petéquias, epistaxe e sangramento gengival, associados a achados laboratoriais tais como leucopenia e trombocitopenia, coagulopatia, aumento na fragilidade capilar (Ministério da Saúde). Até agora, a dengue é a doença viral mais importante transmitida por artrópode em humanos, com uma estimativa de cem milhões de casos e mais de quinhentos casos ocorrem todo ano (Navarro-Sanchez et al., 2005). A primeira epidemia de dengue no Brasil foi registrada em 1980, depois se tornou endêmica e espalhou-se para todo o país. Durante as últimas duas décadas a incidência aumentou gradualmente e têm recentemente se tornado alarmante, sobretudo desde a introdução de outros sorotipos virais (Azeredo et al., 2005). Quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) são reconhecidos e são transmitidos para os humanos pelo mosquito Aedes. Sua classificação taxonômica o encaixa no gênero flavirírus da família Flaviviridae. O vírus é composto de três proteínas estruturais, designadas C (proteína cerne), M (membrana protéica) e E (envelope protéico) (Navarro-Sanchez et al., 2005). 3 Os alvos primários do DV durante uma infecção natural são células de linhagem fagocítica mononuclear (monócitos, macrófagos e células dendríticas), incluindo queratinócitos e células de Langerhans residentes na pele (Jessie et al., 2004; Wu et al., 2000; Limon-Flores et al., 2005). As células infectadas migram então para os linfonodos que recrutam monócitos e macrófagos que são infectados e disseminam a infecção pelo sistema linfático. Sendo assim, muitas células da linhagem mononuclear são infectadas (Martina et al., 2009). Os efeitos da infecção de diferentes células pelo DV têm sido abordados em vários estudos, dentre eles destacam-se as alterações de expressão gênica. Os estudos iniciais descrevendo o perfil de expressão gênica reportaram um grande número de genes superexpressos associados à infecção pelo DENV, porém com baixa reprodutibilidade. Este fato é compreensível em vista da heterogeneidade de métodos usados e do tipo de estudo (in vitro, usando linhagens celulares, ou in vivo usando pacientes infectados). Um dos principais resultados presente na maioria dos estudos é a alteração na expressão de genes relacionados à resposta imune inata, mais especificamente à via do interferon (IFN) tipo I, onde vários genes cuja expressão é induzida por interferon tiveram sua regulação alterada (Ekkapongpisit et al., 2007; Fink et al 2007; Chen et al., 2008; Warke et al 2008; Becerra et al., 2009; Simmons et al 2007; Kruif et al 2008; Ubol et al., 2008). A importância das células NK na infecção por DENV também é indiscutível, não só pela sua estreita relação com a via do interferon, mas também pelo seu papel no combate a infecções virais de uma maneira geral. A atividade destas células é regulada por um delicado equilíbrio entre receptores estimulatórios e inibitórios de sua superfície, que respondem a uma gama de ligantes, dentre os quais se destacam moléculas HLA (do inglês Human Leucocyte Antigen - Antígeno Leucocitário Humano) de classe I. De fato, estas moléculas foram reportadas como super-expressas em linhagens humanas K562 e THP-1, sugerindo que o aumento da concentração destes ligantes resultaria em um maior estimulo de receptores inibitórios com baixa afinidade aos ligantes, resultando em uma baixa sensibilidade a lise pelas células NK (Hershkovitz et al., 2008). Outro estudo in vitro em células de tecidos musculares em cultivo primário também detectou um aumento na expressão de moléculas HLA de classe I, porém este aumento foi observado apenas nas células não infectadas vizinhas às células infectadas, as quais não 4 apresentaram aumento na expressão de HLA de classe I, configurando um possível mecanismo de escape da lise por células NK in vivo (Warke et al., 2008). Estruturas moleculares reconhecidas por receptores do sistema imune são denominados epitopos (Murphy, 2011). Os epitopos que se ligam, e são apresentados no contexto de classe I e moléculas MHC classe II são normalmente reconhecidos por células T CD8 + e CD4 +, respectivamente. A ligação de um péptido à molécula MHC é um dos passos mais seletivos na via clássica I do MHC de processamento do antigénio (Assarsson, 2007). A afinidade com um epitopo que se liga à molécula de MHC desempenha um papel importante na determinação da sua imunogenicidade (Sette, 1994), e interações de elevada afinidade de MHC de epitopos tendem a ser associados com a resposta imunitária mais elevada. No entanto, ao mesmo tempo de ligação do MHC é necessária para o reconhecimento pelas células T, não é por si só suficiente para definir a imunogenicidade. De fato, o reconhecimento parece ser influenciado por vários outros fatores, tais como a abundância de proteínas, de processamento de antigenos, imunodominância e a presença de um repertório de células T adequado. Estudos desenvolvidos em diferentes populações identificaram associação entre as diferentes manifestações clínicas de Dengue com diversos genes, dentre eles HLA, pertencentes a um complexo gênico conhecido como Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Nessa região estão localizados mais de 200 genes, dos quais pelo menos 40% estejam envolvidos com o sistema imune (Consortium, 1999). Os produtos dos genes HLA estão envolvidos na apresentação de antígenos próprios e não próprios aos linfócitos T. Os genes HLA de classe I (HLA-A, -B e -C são os mais conhecidos), que são expressos em todas as células nucleadas humanas, apresentam antígenos processados pela via endógena a células TCD8+, enquanto que os genes HLA de classe II (os mais comumente estudados são: HLA-DRB1, -DQB1 e -DPB1), expressos principalmente em células apresentadoras de antígeno (APC), são responsáveis pela apresentação de peptídeos, processados pela via celular exógena, às células TCD4+. Esse sistema de processamento e apresentação de antígenos é fundamental para a identificação e desencadeamento da resposta imunológica à antígenos não próprios e/ou patogênicos (Stern et al. 1994; Snustad e Simmons 2001; Abbas 2000). Os perfis alélicos de genes HLA determinam o repertorio de peptídeos que são apresentados às células T e que conduzem a diferença de expressão de citocinas que 5 induzirão a um tipo específico de resposta imunológica e, portanto, podem influenciar na expressão clinica de algumas doenças, inclusive a Dengue. Um estudo realizado por (S. Paul et al, 2014), que utilizou peptídeos de 9 a 10 aminoácidos derivados das proteínas produzidas pelo Vírus Dengue, para demostram que existe uma relação direta entra a afinidade dos peptídeos e a molécula HLA-B, variando de acordo com o alelo deste gene, e a subsequente resposta imunológica, na qual quanto maior a afinidade mais eficiente a resposta imunológica. Estudos desenvolvidos em diversas populações relatam associação de genótipos ou alelos de HLA de classes I e II tanto com FHD quanto com SCD. Para genes HLA de classe II os estudos são pouco congruentes na determinação de um alelo ou linhagem específicas associadas às formas clinicas de Dengue. Alagarasu et al., (2013) identificaram uma associação do genótipo HLA-DRB1*07/*15 com FHD em pacientes cubanos, mas não conseguiram detectar associação com nenhuma manifestação clinica e HLA-DQB1. Já no estudo de LaFleur et al. (2002), observou-se o efeito protetor de alelos da linhagem HLA-DRB1*04 no desenvolvimento de FHD. Malavige et al (2011) observaram em pacientes do Sri Lanka a associação do alelo HLA-DRB1*08:01 com os quadros de SCD. Os alelos HLA-DRB1*15 mostrou-se associado com FHD em pacientes venezuelanos (Nguyen et al., 2008), enquanto que para pacientes vietnamitas com um quadro de SCD, o alelo associado foi o HLA-DRB1 09:01. Os estudos desenvolvidos usando genes HLA de classe I também não encontram congruência entre seus resultados. Sierra et al. (2007) encontraram os alelos HLA-A*31 e HLAB*15 em alta frequência em pacientes com um quadro sintomático de Dengue. Nguyen et al. (2008) observaram alta frequência de HLA-A*24 em pacientes com FHD e SCD do Vietnã. Em 2009, Falcón-Lezama et al. (2009) verificaram que a presença do alelo HLA-B*35 estava negativamente associado com as manifestações sintomáticas de Dengue. Monteiro et al. (2012), estudando populações brasileiras, observaram uma maior frequência de HLA-A*01 em pacientes com FHD. Os diversos estudos que buscam associação entre os genes HLA e as diferentes manifestações de Dengue demonstram falta de concordância entre os resultados. Isso sugere que o papel de genes HLA na suscetibilidade a esta doença infecciosa ainda é desconhecida, 6 provavelmente pelo numero escasso de estudos e pela utilização de metodologias diferentes na detecção dos alelos e identificação de polimorfismos. O gene HLA-DPB1 apresenta 550 alelos, segundo a última atualização no site IMGT/HLA (disponível em https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html), porém poucos são os estudos envolvendo a associação deste gene com a Dengue e suas variações clínicas. 3. OBJETIVOS O presente trabalho possui como objetivo investigar a associação de polimorfismos de genes HLA clássicos de classe II com a infecção pelo vírus da Dengue (DENV). Mais especificamente: a) descrever a variabilidade do gene HLA –DPB1 nas amostras estudadas; b) associar os polimorfismos com a suscetibilidade ao desenvolvimento da Dengue. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1- Amostras Estudadas Foram investigados 57 indivíduos, acima de 18 anos, classificados em dois grupos de acordo com critérios sorológicos e clínicos estipulados pela OMS e pelo MS. O primeiro grupo denominado de grupo controle foi constituído de 7 indivíduos todos residentes em Belém há mais de cinco anos, que relataram nunca terem sido acometidos pela dengue ou que possuíam sorologia negativa para anticorpos IgG e IgM. Os 36 restantes constituem o grupo amostral de pacientes com DC. Os pacientes com DC foram diagnosticados de acordo com sintomatologia clínica e sorologia indicativa de Dengue, confirmada por testes confirmatórios. 7 As amostras de sangue foram processadas e tiveram o DNA isolado no Laboratório de Genética Humana e Médica, coordenado pelo Professor Eduardo José Melo dos Santos durante projetos anteriores. O sequenciamento do exon 2 foi feito em colaboração com a Universidade de São Paulo, em um projeto desenvolvido com o Prof. Dr. Diogo Meyer durante o doutorado de Maria Helena Thomaz Maia. Os cromatogramas gerados na USP foram analisados por esse projeto e os resultados das análises compõem esse relatório. 4.2- Edição de sequências e determinação dos haplótipos e alelos de HLA 1° Etapa – Análise dos cromatogramas O éxon 2 do gene HLA-DPB1 de 57 amostras (9 assintomáticos e 48 sintomáticos) foram analisados com o auxílio do programa HLA SBT uType versão 6.0 (Figura 1). Figura 1. Análise do éxon 2 do gene DPB1 realizado pela ferramenta HLA SBT uType versão 6.0. 8 2° Etapa: Análise das Ambiguidades. A resolução das ambiguidades presentes na análise do éxon 2 do gene DPB1, foram resolvidas com o auxílio da planilha de ambiguidades do IMGT/HLA (planilha versão 3.20.0 http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html) foram identificadas as ambiguidades com sequencias idênticas no éxon 2 (exemplo: 04:01:01/126:01 = 04:01:01G), o que possibilitou a resolução do genótipo. Para as ambiguidades fora do éxon 2, não é possível resolver sem que outro éxon seja sequenciado. Portanto, para as amostras com esse tipo de ambiguidade, não foi possível identificar o genótipo 4.3 Análise estatística As frequências dos alelos observados foram calculadas por contagem direta e a análise de distribuição dos perfis entre amostra assintomático e os sintomáticos para Dengue clássica foram feitas utilizando Teste exato de Fisher. Valores de Odds Ratio (OR), com intervalo de confiança (IC) de 95%, foram estimados para todos os fatores onde as frequências diferiram significantemente entre controles e pacientes. Todos os testes estatísticos realizados foram feitos utilizando o software BioEstat 2009 5.8.3.0 5. RESULTADOS Do total de 57 amostras analisadas, para apenas 20 indivíduos foi possível inferir os genótipos sem ambiguidade, ou seja, de maneira direta. Para os outros 37 indivíduos que apresentaram ambiguidade no éxon 2, foram necessárias analises adicionais (resultado visto na tabela 1). Após a resolução das ambiguidades, o número de amostras caiu de 57 para 43 amostras. 9 ID Resultado Final 1 04:01:01G + 04:01:01G 04:01:01 + 04:01:01 2 04:02:01G + 04:02:01G 04:02 + 04:02 3 4 5 6 7 8 9 03:01:01G + 03:01:01G 03:01:01G + 79:01 03:01:01G + 03:01:01G 02:01:02 + 04:02:01G 04:02:01G + 115:01 04:01:01G + 51:01 04:02:01G + 02:01:02 03:01:01 + 03:01:01 03:01:01 + 79:01 03:01:01 + 61:01N 02:01:02 + 04:02 04:02 + 115:01 04:01:01 + 51:01 02:01:02 + 04:02 1 2 3 4 5 6 7 8 Resultado Final ***** ***** ***** ***** ***** ***** ***** ******* 01:01:01 + 04:01:01 01:01:01 + 17:01 04:02 + 14:01 04:01:01 + 04:02 02:01:02 + 20:01:01 01:01:01 + 03:01:01 03:01:01 + 04:02 01:01:01 + 04:02 ID Tabela 1. Tipos de Ambiguidades Ambiguidades dentro do exon 2 de HLA-DPB1 Combinação de alelos heterozigotos ambíguos 126:01 + 04:01:01 + 126:01 126:01 105:01 + 04:02 + 105:01 105:01 03:01:01 + 104:01 03:01:01 + 124:01 104:01 + 104:01 79:01 + 104:01 79:01 + 124:01 20:01:01 + 61:01N 20:01:02 + 61:01N 61:01N + 78:01 02:01:02 + 105:01 105:01 + 115:01 51:01 + 126:01 02:01:02 + 105:01 Ambiguidades fora do exon 2 de HLA-DPB1 Combinação de alelos heterozigotos ambíguos 01:01:01 + 126:01 39:01 + 90:01 09:01 + 89:01 14:01 + 105:01 35:01:01 + 59:01 45:01 + 80:01 04:01:01 + 105:01 04:02 + 126:01 23:01 + 126:01 04:02 + 06:01 06:01 + 105:01 93:01 + 108:01 01:01:01 + 104:01 01:01:01 + 124:01 26:01:02 + 50:01 03:01:01 + 105:01 04:02 + 104:01 04:02 + 124:01 01:01:01 + 105:01 23:01 + 122:01 75:01 + 89:01 n 2 6 104:01 + *124:01 61:01N + 104:01 9 1 1 1 1 1 1 n 57:01 + 129:01 23:01 + 51:01 20:01:01 + 75:01 10 1 1 1 5 1 2 1 1 Das 43 amostras analisadas 36 amostras são sintomáticas e 7 amostras assintomáticas com a presença de 19 e 7 alelos nas populações, respectivamente. A descrição dos alelos genotipados e suas frequências foram descritas nas tabelas 2 e 3. Tabela 2. Frequência alélica das amostras assintomáticas ALELO Frequência (n) Frequência (%) HLA-DPB1 03:01 3 0,213 04:01 3 0,213 01:01 2 0,142 04:02 2 0,142 17:01 2 0,142 51:01 1 0,071 79:01 1 0,071 Total 14 0,994 Tabela 3. Frequências alélicas das amostras sintomáticas ALELO HLA-DPB1 03:01 04:02 01:01 05:01 14:01 17:01 02:01 11:01 06:01 10:01 04:01 09:01 16:01 113:01 115:01 129:01 51:01 79:01 Frequência (n) 18 13 6 6 6 6 4 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 Frequência (%) 0,235 0,1703 0,0786 0,0786 0,0786 0,0786 0,0524 0,0393 0,0262 0,0262 0,0262 0,0131 0,0131 0,0131 0,0131 0,0131 0,0131 0,0131 11 93:01 1 0,0131 Total 76 0,9948 No presente estudo foram detectados 19 alelos do gene HLA-DPB1 na genotipagem de 43 indivíduos. Tanto no grupo de assintomáticos quanto no de sintomáticos para infecção pelo DENV, o alelo mais frequente foi o DRB1*03:01 (0,244) conforme mostrado na Tabela 1. Porém, a alta frequência deste alelo pode ser devido ao tamanho amostral reduzido e ao fato de ser um alelo comum em nossa população e não a um alelo predisponente a suscetibilidade a Dengue, como mostram os dados coletados através do Banco de dados Allele Frequence (Tabela 4) Tabela 4. Frequência alélica total das amostras Alelo DPB1*03:01 DPB1*04:02 DPB1*01:01 DPB1*17:01 DPB1*05:01 DPB1*14:01 DPB1*04:01 DPB1*02:01 DPB1*11:01 DPB1*06:01 DPB1*09:01 DPB1*10:01 DPB1*113:01 DPB1*115:01 DPB1*129:01 DPB1*16:01 DPB1*51:01 DPB1*79:01 DPB1*93:01 Dados deste Estudo Frequência Frequência Relativa Absoluta 0,24419 21 0,17442 15 0,09302 8 0,0814 7 0,06977 6 0,06977 6 0,05814 5 0,04651 4 0,03488 3 0,02326 2 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 0,01163 1 Dados do Allele Frequencies* Média e intervalo das Média e intervalo Frequências 1 Frequências 2 0,065 (0,008-0,485) 0,039 (0,008 – 0,071) 0,176 (0,01 – 0,72) 0,523 ( 0,423 – 0,7) 0,078 (0,001 – 0,559) 0,01 0,033 (0,006 – 0,28) 0,031 0,247 (0,005 – 0,8) 0,063 (0,051 – 0,075) 0,033 (0,003 – 0,462) 0,232 (0,051 – 0,462) 0,212 (0,008 - 0,516) 0,078 ( 0,011- 0,163) 0,140 (0,006 – 0,55) 0,040 (0,01 – 0,071) 0,020 (0,002 – 0,082) 0,01 0,014 (0,003 – 0,052) ----0,020 (0,002 – 0,11) ----0,016 (0,003 – 0,065) ----0,008 --------------------0,009 (0,002 – 0,035) ----0,007 (0,002 – 0,014) ----0,005 ----0,01 ----- das *Dados das frequências alélicas dos alelos do gene HLA-DPB1 nas populações mundiais obtidos através do site http://www.allelefrequencies.net/.m. 1 – Dados da população mundial; 2- Dados das populações da América do Sul Além disso, a amostra encontra-se em desequilíbrio de Hardy-Weinberg com um desvio significativo para excesso de homozigotos (Het. Obs= 0,27; Het. Esp= 0,86; p. Valor= 0,000). O desequilíbrio de Hardy-Weinberg apresentado pelas amostras pode ter sido influenciado pela presença de alelos nulos circulantes na população. Alelos nulos de HLA, são caracterizados pela falta de um produto detectável sorologicamente, devido a sua baixa ou 12 ausente expressão. Em análises moleculares que utilizam técnicas de amplificação gênica através de primers e sondas como forma de genotipagem, a presença de alelos nulos ou novos se torna um fator limitante da técnica, pois é necessária uma sequência específica conhecida do genoma para que ocorra a hibridização de primers e sondas com o DNA. Uma amostra que seja heterozigota para o gene HLA-DPB1, na qual um alelo é conhecido e o outro é um alelo nulo ou novo, o resultado é um falso homozigoto o que causa um viés na análise de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Análise populacional como forma de detecção de possíveis alelos nulos e novos circulante, poderia ser usada para desenvolvimento de primers, desta forma sanando a limitação da técnica. Há a possibilidade de resolução com a realização de amplificação baseada em sequenciamento das regiões dos éxons 2, 3 e 4 além dos sítios de splicing da região intrônica (HLA classe I) e éxon 2 e dos sítios de splicing da região intrônica (HLA classe II) (Elsner H. A, 2004). 5.1 Diferenças entre os subgrupos de pacientes infectados por DENV. Quando as frequências alélicas foram comparadas entre assintomáticos e sintomáticos, não foram observadas diferenças significativas (dados não mostrados). Isso significa que as distribuições das frequências alélicas dos subgrupos não diferem entre si. Porém, essa comparação deve ser considerada com parcimônia, uma vez que tamanho amostral é bastante limitado. Poucos trabalhos na literatura associam HLA-DPB1 e DENV em populações. O grupo de Vejbaesya em 2009, realizou um estudo na população asiática, associando Fator de Necrose Tumoral (TNF), gene da alfa-linfotoxina (LTA) e HLA com a forma severa da Dengue, no qual não foi possível associar o HLA-DPB1 com o quadro clínico dos pacientes com Dengue. O Alelo DPB1*05:01 apresentou maior frequência no grupo amostral estudado, mas os autores atribuíram esse achado ao fato de o alelo ser comum na população estudada. Sobre a magnitude das diferenças entre os outros subgrupos: o tamanho amostral é muito reduzido, o que causa viés no resultado. O importante é que a análise de diferenciação 13 entre os grupos não se mostrou significante e isso reforça a necessidade de aumentar o tamanho amostral para que possamos chegar a um resultado conclusivo sobre a infecção por Vírus Dengue. 5.2 Características dos alelos mais frequentes. O alelo DPB1*03:01 é amplamente distribuído dentre todos os subgrupos DENV, este alelo é característico de populações europeias em alta frequência e também é descrito nas populações ameríndias (allelefrequencies.net.). Estudos apontam este alelo como predisponente a suscetibilidade para Esclerose Múltipla (Filder J. et al, 2010), assim como um alelo protetor para Linfoma Folicular (Skibola C.F, 2012), porém não há relatos de associação com infecções por arboviroses. O alelo DPB1*04:02 apresenta frequência altíssima nas Américas e alto a nível mundial, está presente dentre os subgrupos DENV (allelefrequencies.net.). O alelo DPB1*01:01 apresentam altíssima frequência em populações americanas e subsaarianas e baixa frequência nas populações europeias (allelefrequencies.net.). Este alelo foi apontado como alelo protetor contra a evolução para Linfoma de Hodgkin em pacientes portares do Vírus Epstein-Barr em uma população do norte do Reino Unido (Johnson P.C, 2015). O alelo DPB1*17:01 apresenta baixa frequência mundial e altíssima frequência nas populações subsaarianas (allelefrequencies.net.). Em recente estudo, constatou-se que este alelo se mostrou consideravelmente protetor contra a Síndrome Posner-Schlossman em uma população chinesa. DPB1*09:01, 10:01, 113:01, 16:01, 51:01, 79:01 e 93:01 estes alelos não apresentam discrição em populações ameríndias e as suas frequências a nível mundial são baixas (allelefrequencies.net.). DPB1*115:01 e 129:01 estes alelos não apresentam discrição em populações ameríndias nem em outras populações mundiais (allelefrequencies.net.). 14 O nosso trabalho buscou descrever a variabilidade do gene HLA-DPB1 e investigar a associação dos polimorfismos deste gene com a suscetibilidade ao desenvolvimento da Dengue. Porém, nossas analises mostraram que o gene HLA-DPB1 não é suficientemente determinante para a infecção. Os sorotipos / genótipos circulantes de DENV na população estudada pode ter influenciado no resultado. O tamanho amostral também pode ter influenciado no resultado obtido. Um estudo com um número amostral maior poderia revelar características entre os subgrupos DENV que possam estar sendo imperceptíveis. 6. CONCLUSÃO O presente trabalho não observou associação de polimorfismos do gene HLA-DPB1 com a infecção por DENV. No entanto, foram genotipados 57 indivíduos e o alelo mais frequente nos subgrupos de assintomáticos e sintomáticos foi o DPB1*03:01. Não foi detectada associação entre os polimorfismos dos genes HLA-DPB1 e infecção por DENV. 7. CONSIDERAÇÕES O objetivo inicial deste trabalho era a investigação da associação do polimorfismo dos éxon 2 e 3 do gene HLA-B com a suscetibilidade e evolução da Dengue em pacientes. No entanto, devido ao número reduzido de amostras de pacientes e a alta taxa de polimorfismo do gene HLA-B, atualmente cerca de 3,977 alelos foram descritos (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html), optou-se pela alteração no objetivo do trabalho, no qual investigamos a associação do gene HLA-DPB1, que apresenta número menor de polimorfismos (550 alelos. Com a mudança do objetivo de trabalho, justificado no item ¨Dificuldades¨, utilizamos os dados de sequenciamento do éxon 2 do gene HLA-DPB1 dos mesmos pacientes que seriam utilizados na proposta de trabalho inicial, gerados em colaboração com a Universidade de São Paulo, em um projeto desenvolvido com o Prof. Dr. Diogo Meyer durante o doutorado de Maria Helena Thomaz Maia. Os cromatogramas gerados na USP foram analisados por mim e os resultados das análises compõem esse relatório. 15 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas (2000), Imunologia Celular e Molecular. Elsevier, Rio de Janeiro. 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Considero sua atuação EXCELENTE. DATA : ______/_________/________ _________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR ____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO 19
