ocorrência, distribuição e diagnose de viroses associadas à
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL ADELMO MARTINS RODRIGUES OCORRÊNCIA, DISTRIBUIÇÃO E DIAGNOSE DE VIROSES ASSOCIADAS À CULTURA DA MELANCIA NO ESTADO DO TOCANTINS. GURUPI - TO AGOSTO DE 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL ADELMO MARTINS RODRIGUES Engenheiro Agrônomo OCORRÊNCIA, DISTRIBUIÇÃO E DIAGNOSE DE VIROSES ASSOCIADAS À CULTURA DA MELANCIA NO ESTADO DO TOCANTINS. Projeto de Dissertação apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins no Campus Universitário de Gurupi, como parte das exigências do Regimento do Programa. Orientador: Dsc. Raimundo Wagner de Souza Aguiar GURUPI-TO AGOSTO DE 2011 Dissertação de Mestrado realizada junto ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins sob orientação do professor e pesquisador Dr. Raimundo Wagner de Sousa Aguiar e co-orientação do professor e pesquisador Dr. Tatsuya Nagata da Universidade de Brasília. Apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Banca examinadora: _______________________________________________ Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar (Orientador) Universidade Federal do Tocantins (UFT) _______________________________________________ Dr. Tatsuya Nagata Universidade de Brasília (UnB) _______________________________________________ Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento Universidade Federal do Tocantins (UFT) _______________________________________________ Dr. Rodrigo Robeiro Fidelis Universidade Federal do Tocantins (UFT) GURUPI-TO AGOSTO DE 2011 “Nós existimos em primeiro lugar, para as pessoas queridas de cujo bem-estar e sorrisos dependem a sua e a nossa felicidade, depois, para todos os seres, nossos semelhantes, que não conhecemos pessoalmente, mas os quais estão ligados pelos laços de simpatia e fraternidade humana” Albert Einstein. Ao meu pequenino João Pedrico. DEDICO i AGRADECIMENTOS Meus sinceros Agradecimentos... Aos meus pais, Ademar e Linda, que sempre uniram esforços em prol da minha formação acadêmica e souberam dar força e incentivo nos momentos que mais precisei, sempre compreendendo minhas ausências, e também pacientes em ouvir todas as lamentações nos momentos de estresse e ansiedade, confortando-me sempre com palavras de incentivo. Aos meus irmãos Ademar Segundo e Alércia que sempre estiveram do meu lado incentivando-me e apoiando-me. A pessoinha de Sâmela Taisa, que me suporta por vários anos, sempre compreendendo minhas ausências, e junto com minha família ouvindo minhas lamentações, me agüentando nos momentos de estresse, me surpreendendo sempre com palavras de incentivo. Ha..., não poderia deixar de comentar as inúmeras cobranças pelos mais variados motivos. A todos meus amigos, que foram capazes de compreender as minhas ausências e compartilhar muitos momentos felizes. Ao PhD. Tatsuya Nagata, Mirtes Freitas, Renato Rezende, pelos ensinamentos e conselhos preciosos, incentivo, auxílio e presteza. A vocês toda minha consideração e admiração. Ao Laboratório de Virologia Vegetal da Universidade de Brasília e a EMBRAPA-CNPH pelo espaço cedido para o desenvolvimento de alguns experimentos A todos os funcionários do laboratório de Entomologia, em especial, Douglas, Suetônio e Mariela. A todos os colegas que me acompanharam durante o mestrado, em especial, Márcio Akio e Marielle Peres, pela amizade e apoio durante todo o curso. Aos professores do curo de Pós-Graduação em Produção Vegetal, pelos ensinamentos, em especial ao. Dsc. Raimundo Wagner, que vem me acompanhando desde a graduação, me orientando e abrindo minha mente para os mais diversos temas. A todos que de alguma forma contribuíram para o êxito deste trabalho, minha sincera gratidão. ii SUMÁRIO Dedicatória..............................................................................................................................i Agradecimento.......................................................................................................................ii RESUMO..............................................................................................................................iii ABSTRACT..........................................................................................................................iv 1. CAPITULO I: INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................10 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................11 2.1 Cultura da Melancia.............................................................................................11 2.2 Características da planta......................................................................................11 2.3 Melancia no mundo...............................................................................................12 2.4 Melancia no Brasil.................................................................................................13 2.5 Problemas fitossanitários......................................................................................13 2.5.1 Aspectos gerais dos vírus.....................................................................13 2.5.2 Aspectos da família Potyviridae e Gênero Potyvírus........................14 2.5.3 Aspectos da família Bunyaviridae e Gênero Tospovírus..................21 2.6 Principais viroses Associadas a cultura da melancia.........................................24 2.6.1 PRSV-W................................................................................................24 2.6.2 ZYMV...................................................................................................25 2.6.3 WMV.....................................................................................................25 2.6.4 CMV......................................................................................................26 2.6.5 ZLCV....................................................................................................27 2.7 Identificação das viroses.......................................................................................27 2.7.1 Testes sorológicos.................................................................................27 2.7.1.1 Testes de ELISA.......................................................................27 2.7.1.1.1 DAS-ELISA............................................................28 2.7.1.1.2 ELISA-Indireto......................................................28 2.7.1.1.3 Dot-ELISA..............................................................29 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…............…………………………………..……30 CAPITULO II: Distribuição e diagnose de vírus associados a cultura da melancia no estado do Tocantins. RESUMO.....................................................................................................................51 Distribution and diagnosis of viruses associated with watermelon crop in the state of Tocantins. ABSTRACT.................................................................................................................52 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................53 2. MATERIAL e MÉTODOS..............................................................................................54 2.1 Obtenção das Plantas e Inoculação............................................................................54 2.2 Identificação Sorológica dos Isolados........................................................................55 2.3 Análise Sintomatológica das Viroses.........................................................................57 2.4 Análise Estatística.......................................................................................................57 3. RESULTADOS..................................................................................................................57 4. DISCUSSÃO......................................................................................................................61 5. CONCLUSÃO...................................................................................................................63 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................64 CAPITULO III: Identificação de Viroses Associadas à Cultura da Melancia por meio de RT-PCR do tipo multiplex. RESUMO ....................................................................................................................68 Identification of Virus Associated with Culture of Watermelon in the State of Tocantins through the techniques of multiplex RT-PCR. ABSTRACT.................................................................................................................69 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................70 2. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................71 2.1. Vírus ...........................................................................................................................71 2.2. Extração de RNA Total.............................................................................................72 2.3. Confecção de cDNA...................................................................................................72 2.4. Reação de RT-PCR do tipo monoplex.....................................................................73 2.5. Otimização para Reação de RT-PCR do tipo Duplex e Triplex............................73 2.6. Análise do RT- PCR em gel de agarose...................................................................73 2.7. Análise das Seqüências e oligonucleotídeos.............................................................74 3. RESULTADOS..................................................................................................................74 4. DISCUSSÃO......................................................................................................................81 5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................84 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................85 RESUMO Perdas econômicas são relatadas em cucurbitáceas, estas, quase sempre estão associadas à infecção por vírus. Além da redução direta na produtividade da planta, as viroses podem reduzir o aspecto morfológico do fruto, depreciando seu valor comercial. Os vírus que infectam a cultura da melancia no Brasil são de difícil diagnóstico visual, todos produzem sintomas foliares semelhantes, podendo ocorrer em infecções simples ou mistas. O objetivo deste trabalho foi identificar as viroses associadas a cultura de melancia nas regiões produtoras do estado do Tocantins. A identificação dessas viroses foi realizada pelo método sorológico Dot-Elisa com anticorpos específicos, seguida pelo método de RT-PCR do tipo multiplex para os Potyvirus: Watermelon mosaic virus type- 2 (WMV-2); Papaya ringspot virus tipo Watermelon (PRSV-W); Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) e Cucumber mosaic virus (CMV); e o Tospovirus: Zucchini Lethal chlorosis virus (ZLCV). Foram coletadas 752 amostras de plantas com sintomas de vírus em todas as regiões produtoras de melancia. Entre a ocorrência das viroses por região observou-se que PRSV-W foi predominante em 31% das amostras obtidas em Formoso do Araguaia e menos de 30% foram positivas para WMV, ZLCV, CMV e ZYMV. Nas amostras obtidas no município da Lagoa da Confusão houve predominância de WMV com 26,4%, seguido por PRSV-W e ZLCV com 22% e 8,1%, respectivamente. O vírus PRSV-W apresentou 12,5% de infecção nas amostras na região de Gurupi, seguido de ZLCV (12%) e ZYMV (10,4%) e WMV com 12%, não diferindo estatisticamente entre si, apenas CMV com 11,2% de amostras infectadas se mostrou em outro grupo. No município de Porto Nacional foram identificados CMV (14,7%), ZLCV (13,8%) e PRSV-W (10,3%), sendo ZYMV e WMV encontrados em um subgrupo com 8,4% e 9,2% de infeção, respectivamente. As infecções mistas de maior ocorrência foram entre PRSV-W+WMV, PRSV-W+ZLCV e ZLCV+WMV, num total de 142 amostras. Os produtos amplificados foram de 644 pb (CMV), 535 pb (WMV-2), 398 pb (PRSV-W), 244 pb (ZLCV) e 214pb (ZYMV). As detecções múltiplas de vírus desenvolvidas neste trabalho podem reduzir o custo e trabalho na detecção e diferenciação dos vírus. Os oligonucleotídeos desenvolvidos permitem a rápida detecção e diferenciação isolada de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV presentes nos cultivos de melancia no estado do Tocantins. De modo geral, estes resultados permitem subsídios para o programa de melhoramento de resistência a viroses na cultura da melancia no estado do Tocantins, considerando os cinco tipos de vírus identificados e sua distribuição espacial por região. iii ABSTRACT Economic losses are reported in cucurbits, they almost always are associated with virus infection. In addition to the direct reduction in plant productivity, the viruses can reduce the morphological aspect of the fruit, and depreciate its commercial value. Viruses that infect the watermelon crop in Brazil are difficult to diagnose visual, all produce similar symptoms in leaves and may occur in single or mixed infections. The objective of this work was to identify the viruses associated with the culture of watermelon production areas of the state of Tocantins. The identification of these viruses was performed by serological Dot-ELISA with specific antibodies, followed by multiplex RT-PCR for Potyvirus: Watermelon mosaic virus (WMV); Papaya ringspot virus type-W (PRSV- W), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) and Cucumber mosaic virus (CMV), and the Tospovirus: Zucchini Lethal chlorosis virus (ZLCV). We collected 752 samples of plants with symptoms of virus in all producing regions of watermelon. Between the occurrence of viruses by region showed that PRSV-W was predominant in 31% of the samples obtained in Formoso do Araguaia and less than 30% were positive for WMV, ZLCV, CMV and ZYMV. The samples obtained in the region of Lagoa da Confusão WMV was predominated with 26.4% followed by PRSV-W and ZLCV with 22% and 8.1% respectively. The virus PRSV-W showed 12.5% of the samples in the region of Gurupi, followed by ZLCV (12%) and ZYMV (10.4%) and WMV with 12%, not statistically different from each other, only CMV with 11,2% of infected samples was shown in another group. In the region of Porto Nacional CMV were identified (14.7%), ZLCV (13.8%) and PRSV-W (10.3%), ZYMV and WMV was found in a subgroup with 8.4% and 9.2 % of infection, respectively. Mixed infections occurred more frequently between PRSV-W + WMV, PRSV-W + ZLCV and ZLCV + WMV, a total of 142 samples. The amplified products were 644 bp (CMV), 535 bp (WMV-2), 398 bp (PRSV-W), 244 bp (ZLCV) and 214pb (ZYMV). The multiple detections of viruses developed in this work can reduce the cost and work in the detection and differentiation of the virus. The oligonucleotides designed to allow rapid detection and differentiation isolated from PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV and ZLCV present in watermelon crops in the state of Tocantins. Overall, these results allow subsidies for the breeding program for resistance to viruses in watermelon crop in the state of Tocantins, considering the five virus types identified and their spatial distribution by region. iv CAPITULO I: 1. INTRODUÇÃO GERAL A melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai], pertence à família das cucurbitáceas, é constituída de aproximadamente 118 gêneros e 825 espécies. Tem como centro de origem o continente africano, onde sua forma selvagem é encontrada em muitos locais de clima tropical e subtropical. É uma planta anual, de crescimento rasteiro, com ramificações que podem chegar a 5 m de comprimento, sendo cultivada em vários países (DOORENBOS & KASSAM, 1994). Segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) a produção mundial de frutas em 2008 foi de cerca 705,9 milhões de toneladas. Deste total o Brasil produziu cerca de 41 milhões de toneladas, apresentanto 5,8% da produção mundial. Em 2010 a produção de melancia foi estimada em 98,4 milhões de toneladas, que corresponde a 13,9% do total de frutos produzidos, ficando atrás apenas da cultura da banana (FAO, 2008). No Brasil, a melancia é considerada a quarta olerícola em volume produzido, sendo superada em produção apenas pelo tomate, batata e cebola (FAO, 2008). É uma cultura cultivada em quase todos os estados brasileiros, com destaque para os estados do Rio Grande do Sul (28,5%), Bahia (12%), Goiás (9,8%), São Paulo (7,6%); Tocantins (6,9%), Rio Grande do Norte (4,8%) e Pernambuco (4,5%) (IBGE, 2008). Em 2010 a área cultivada com melancia no Tocantins foi de 6,8 mil hectares, com produção de 174 mil toneladas, gerando uma receita de R$ 42 milhões, gerando cerca 1.853 empregos diretos (SEAGRO, 2011). Sua produção é quase que totalmente destinada ao consumo interno, além de ser uma atividade agrícola rentável, o cultivo da melancia tem grande importância social, tendo muita necessidade de mão-de-obra na realização das diversas práticas culturais (LOPES, 1991; SANTOS et al., 2005). A cultura da melancia, assim como a maioria das culturas, pode ser acometida por dezenas de patógenos, que causam os mais diversos sintomas. Além das doenças bióticas, existem as abióticas, que também podem causar destruição total da cultura, caso não sejam adotadas medidas preventivas (YUKI et al., 2000; SANTOS et al., 2005). Os genótipos de melancia utilizados nos cultivos, com algumas exceções, foram desenvolvidos para condições diferentes daquelas existentes no Brasil e enfrentam sérios problemas com a ocorrência de pragas e doenças, em particular as viroses ocasionadas por vírus do gênero Potyvirus (SILVEIRA et al., 2005). A ocorrência de viroses em curcubitáceas cultivadas é dinâmica, 10 podendo variar em função da espécie de vírus e suas estirpes, da população e migração dos vetores, das espécies e cultivares vegetais cultivadas e das condições climáticas (LIMA & VIEIRA, 1992; MOURA et al., 2001). A ocorrência de viroses é o principal problema no cultivo da melancia em condições tropicais, assim como na maioria das curcubitáceas. As viroses de importância econômica para a cultura da melancia são os potyvirus: Papaya ringspot virus – Strain w (PRSV-W) (ALBUQUERQUE et al., 1972), Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV) (CANER et al., 1992; VEGA et al., 1992; VEJA, REZENDE & YUKI, 1995), Watermelon mosaic virus – 2 (WMV-2) (SÁ & KITAJIMA, 1991) e o tospovirus Zucchini lethal chlorotics virus (ZLCV). As plantas acometidas com viroses apresentam baixa qualidade de frutos (LIMA; FERNANDES & MENDES, 1980; PAVAN; CARVALHO & FERNANDES, 1989; YUKI, 1990; LIMA & VIEIRA, 1992). A ocorrência de PRSV-W e ZYMV têm predominado na cultura da melancia nos principais Estados produtores (YUKI et al., 2000). O objetivo geral deste trabalho foi identificar a distribuição, ocorrência e confeccionar um kit de identificação rápida através de RT-PCR para os vírus presentes na cultura da melancia no Estado do Tocantins. 2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Cultura da Melancia 2.2 Características da planta A melancia é classificada taxonomicamente como pertencente ao Reino Vegetal, Divisão Magnoliophyta (Spermatophyta), Subdivisão Angiospermae, Classe Magnoliopsida (ou Campanulales), Subclasse Dilleniidae (ou Dicotiledonae), Superordem Violanae, Ordem Violales (Cucurbitales), Família Cucurbitaceae, Subfamília Cucurbitoideae, Tribo Benincaseae, Subtribo Benincasinae, Gênero Citrullus (ALMEIDA, 2003; SILVA, 2005). A planta é herbácea de ciclo anual, com crescimento rasteiro, com ramas alcançcando 5 a 6 m. O caule é fino, angular, provido de pêlos e gavinhas ramificadas. O sistema radicular é extenso e mais profundo do que o das demais curcubitáceas, com a maioria das raízes entre 50 a 60 cm de profundidade. O florescimento é monóico, todavia menos de 5% são andromonóicas (FONTES, 2005). O fruto é globular ou alongado (FILGUEIRA, 2003), as sementes são de cor cinza a preto imersas no tecido placental, principal parte comestível do 11 fruto, de coloração vermelha devido à presença de licopeno ou amarelada devido à presença de carotenos e xantofilas (FONTES, 2005). Embora todas as espécies de Citrullus Schrad Ex Eckl & Zeyh sejam consideradas originárias da África, a origem exata da melancia cultivada não é bem definida. Uma hipótese é que seja derivada de C. colocynthis (L.) Schrad, espécie perene e endêmica do referido continente. Outra hipótese é de que tenha sido originada a partir da domesticação dentro de populações silvestres de C. lanatus var. citroides (Bailey) Mansf., comum na África Central, onde é cultivada a mais de 5000 anos e sua forma selvagem é encontrada em muitos locais de clima tropical e subtropical (TESSARIOLI NETO & GROPPO, 1992). Uma terceira hipótese ainda é que a introdução da cultura no país ocorreu no século XVII por escravos africanos, principalmente das tribos Sudanesa e Banto. Vale salientar que as amostras africanas encontraram excelentes condições climáticas para o seu desenvolvimento e que as mesmas entraram no Brasil desde o Rio de Janeiro até o Maranhão e, em seguida, avançou para o interior do nordeste brasileiro à medida que o mesmo ia sendo ocupado (SALDANHA, 1989; CASTELLANNE & CORTEZ, 1995). Cultivada pelos egípcios há cerca de 2.000 anos a.c., dada à diversidade de formas silvestres, é mais aceito, atualmente, que o gênero Citrullus seja de origem africana. A cultura foi introduzida na China no século X. Por volta do século X o seu cultivo era documentado na Córdoba árabe e no século XIII já era cultivada em diversas regiões da Europa. A cultura foi introduzida na América no século XVI, cujo período coincide com a escravatura (FONTES, 2005). 2.3 Melancia no mundo A família Cucurbitaceae possui aproximadamente 118 gêneros e 825 espécies, a maioria possui alto valor econômico e nutricional, além da importância social devido à geração de empregos que proporciona (BEZERRA JÚNIOR, 2007). A melancia é uma das olerícolas mais apreciadas em todo o mundo, suas propriedades refrescantes e diuréticas, associadas ao sabor agradável e ao baixo teor calórico, fazem da fruta uma excelente alternativa para o consumo diário (TRENTIN et al., 2008). É a principal cucurbitácea cultivada no mundo (GUNER & WEHNER, 2008). Com produção mundial estimada em 98,4 milhões de toneladas, sendo os principais produtores a China, Turquia, Irã, Brasil, Estados Unidos, Egito e Rússia (FAO, 2010). 12 Atualmente, a melancia é uma das principais frutas em volume de produção mundial e também está entre as dez principais hortífrutícolas mais exportadas, com 1,7 milhões de toneladas por ano. Entre os maiores importadores de melancia está os Estados Unidos, Canadá, Alemanha, Polônia e França, que importam mais de 49% das importações mundial. Entre os países exportadores, o México é o principal exportador, seguido pela Espanha e Hungria (ARAÚJO, 2009). 2.4 Melancia no Brasil A melancia ocupa o terceiro lugar em produção e em área plantada no Brasil, com 1.719.392 toneladas e uma área cultivada de 81.281 hectares, sendo superada em volume de produção pela laranja e banana com 18.313.717 e 6.583.564 toneladas, respectivamente. As principais regiões produtoras em 2006 foram: Sul (34,77%), Nordeste (28,80%) e Norte (13,65%). Nesse mesmo ano, os estados de maior produção na região Nordeste foram: Bahia, Rio Grande do Norte e Pernambuco (IBGE, 2008). O Tocantins alcançou o segundo lugar na produção nacional, chegando a colher 174 mil toneladas, seno o maior produtor da região norte (SEAGRO, 2011). A melancia tem-se destacado como uma das principais espécies olerícolas cultivadas no País, mas, apesar de sua importância, ainda são escassos os trabalhos com essa olerícola, haja vista que poucos esforços têm sido dedicados ao estudo de fatores condicionantes de seu rendimento e qualidade (FIGUEIREDO et al., 2009). O Tocantins está efetivando tentativas de exportação, mas essas experiências estão esbarrando em um alto custo com transporte (AGRIANUAL, 2007). 2.5 Problemas Fitossanitários 2.5.1 Aspectos Gerais dos Vírus Os vírus são nucleoproteínas que têm capacidade de causar doenças. Replicam-se em células vivas, sendo parasitas celulares obrigatórios. Induzem as células do hospedeiro a realizar sua replicação (AGRIOS, 1997). Causam danos pela interferência na maquinaria celular durante seu processo de replicação, diminuindo a síntese protéica essenciais para o desenvolvimento normal da planta. A replicação de uma partícula viral consiste basicamente de quatro etapas distintas: a penetração na célula hospedeira, a liberação ou desnudamento do 13 ácido nucléico, a síntese de ácido nucléico e proteínas virais, e a maturação ou acoplamento desses dois componentes, dando origem a uma nova partícula viral (BEDENDO, 1995). Os genomas virais são compostos por RNA ou DNA, de fita dupla ou simples, dependendo do vírus. Não possuem membrana plasmática, citoplasma com ribossomos e enzimas necessárias para a síntese de proteína e produção de energia. Os genes virais codificam a informação para a produção de enzimas envolvidas na replicação do ácido nucléico e na síntese de proteínas. A disseminação de virose em plantas está associada a fatores bióticos e abióticos, que influenciam diretamente na população dos vetores (MOURA, 2003; SANTOS et al., 2005). Desse modo, a incidência de viroses em curcubitáceas cultivadas é dinâmica, podendo variar em função da espécie de vírus e suas estirpes, do reservatório do vírus, da população e migração dos vetores, das espécies e cultivares vegetais cultivadas e das condições climáticas (MOURA et al., 2001). Desse modo, alem da redução direta na produção da planta, o vírus reduz o tamanho e aspecto morfológico do fruto, depreciando completamente seu valor comercial. 2.5.2 Aspectos da família Potyviridae e Gênero Potyvírus A família Potyviridae está organizada em seis gêneros (Bymovírus, Ipomovírus, Macluravírus, Potyvírus, Rymovírus e Tritimovírus), que se diferem na organização, números de componentes de seu genoma e na espécie de inseto vetor (BERGER et al., 2005). Constituindo a maior e mais importante família de virus de plantas, com cerca de 20% dos vírus descritos (FAUQUET et al., 2005). O gênero potyvírus, com 111 espécies descritas, é o que forma o grupo mais numeroso de fitovírus. Coletivamente, em razão de seu grande número, os potyvírus formam o gênero mais importante do ponto de vista econômico. Alguns Potyvirus são igualmente importantes, como por exemplo, o vírus do mosaico comum do feijoeiro (Bean common mosaic virus – BCMV), vírus do mosaico da alface (Lettuce mosaic virus – LMV), o vírus do empedramento da ameixa (Plum pox virus – PPV), o vírus da mancha anelar do mamoeiro (Papaya ringspot vírus – PRSV) e o mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV). Essas espécies infectam uma grande variedade de culturas agrícolas, incluindo leguminosas, solanáceas, gramíneas entre outras (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999). 14 O gênero potyvírus, cujos insetos vetores são afídeos, agrupa vírus cujo genoma é composto de uma única molécula de RNA de fita simples, senso positivo, com aproximadamente 10.000 nucleotídeos. O RNA viral produz uma proteína codificada pelo próprio vírus conhecida como proteína de origem viral (Viral protein Genome-linked, VPg), ligada covalentemente „a extremidade 5‟ e uma cauda poli-A ligada a extremidade 3‟ do RNA que está envolvida na proteção contra exonucleases, codificada pelo próprio vírus (BERGER et al., 2005). A região 3‟ não-traduzível (3‟NTR) apresenta uma variabilidade de seqüência e tamanho (variando de 163 a 475 nucleotídeos) (SHUKLA et al., 1994). A seqüência da 3‟ NTR é importante para o reconhecimento do RNA viral pelo complexo replicativo, contendo elementos em cis essenciais para a replicação (HALDEMAN-CAHILL, DAROS & CARRINGTON, 1998; ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999; HULL, 2002). O genoma é envolvido pelo capsídeo, de formato alongado e flexuoso, constituído por aproximadamente 2.200 cópias de uma proteína capsidial com massa molecular em torno de 34 kDa (SHUKLA et al., 1991). Os genomas de diversos potyvírus já foram totalmente seqüenciados. Em todos os potyvírus seqüenciados até então, o genoma é localizado entre duas regiões não-traduzidas (5‟ NTR e 3‟ NTR), com capacidade para codificar uma proteína com aproximadamente 350 kDa (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999). Esta proteína é processada através de enzimas (proteinases) contidas na própria poliproteína (P1, HC-Pro e NIa), surgindo daí as proteínas necessárias para a infecção viral (Figura1) (CARRINGTON et al., 1989; PRUSS et al., 1997; SHUKLA et al., 1994; HULL, 2002). 15 Figura 1. Representação esquemática da organização do genoma de um potyvírus. O RNA viral possui uma proteína viral (VPg) ligada à sua extremidade 5‟ e uma cauda poli A em sua extremidade 3‟. A única fase aberta de leitura dá origem a uma poliproteína que sofre autoproteólise gerando diferentes intermediários e, finalmente, 8 proteínas virais (P1, HC-Pro, p3, CI,6k2, NIa, NIb e CP). Adaptado de Shukla et al. (1994). As proteínas produzidas in vivo a partir do RNA de um Potyvirus, observa-se doze proteínas, cuja soma dos pesos moleculares ultrapassa 600 kDa. A quantidade relativa de cada uma dessas proteínas varia ao longo do tempo. Uma análise mais detalhada das proteínas virais revela que, na verdade, a ORF é traduzida como uma única proteína, que sofre autoproteólise, gerando cada uma das proteínas virais (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999). A maioria das proteínas virais tem pelo menos uma função estabelecida (Tabela 1). Na verdade, muitas dessas proteínas têm mais de uma função. Sendo as proteínas P1, HC-Pro (Helper Component-Proteinase), P3, CI, 6K2, VPg-Pro (NIa) NIb de inclusão nuclear estão envolvidas na replicação do RNA. A estratégia de replicação e expressão gênica dos Potyvirus é extremamente danosa a célula hospedeira, implicando em um grande dreno de metabólitos para produção das proteínas virais, que são na prática desperdiçados pelo vírus. As infecções por Potyvirus são freqüentemente severas, com sintomas características de mosaico e deformações foliares no hospedeiro (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999). 16 Tabela 1. Funções associadas às regiões não traduzídas e à proteínas dos potyvírus. Reproduzido de Krause-Sakate, 2001 e atualizado por Hasan, H., 2004. Proteínas ou Região 5'NTR P1 HC-Pro P3 e PIPO CL 6k1 e 6K2 NIa (ProVPg) NIb CP 3'NTR Funções Referências Promotor da tradução Promotor da replicação do RNA viral Competitividade e adaptação viral Local de início do encapsidamento Carrington & Freed, 1990 Carrington & Freed, 1990 Simón-Buela, Guo & García, 1997 Wu & Shaw, 1998 Verchot, Koonin & Carrington, Protease 1991 Fator acessório para a replicação do genoma viral Verchot & Carrington, 1995 Transmissão por afídeos Thornbury et al., 1985 Protease Carrington, Freed & Sanders, 1989 Cronin et al., 1995; Yelina et al., Movimento à longa distância 2002 Fator acessório para a replicação do genoma viral Kasschau & Carrington, 1998 Cronin et al., 1995; Rojas et Movimento célula-a-célula al.,1997; Kasschau, Cronin & Carrington, 1997 Transmissão por semente Johansen et al., 1996 Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau & Inibição da resposta de defesa da planta Carrington, 1998; Mallory et al., 2001; Lakatos et al., 2006 Sinergismo viral Pruss et al., 1997 Determinante de sintomatologia Sáenz et al., 2001 Klein et al., 1994; Chung et al., 2008; Wei et al., 2010; Wen & Fator auxiliar para replicação do genoma viral Hajimorad, 2010. Replicação (Helicase, ATPase) Laín et al., 1991 Determinante de sintomatologia Chu et al., 1997 Movimento célula-a-célula Carrington, Jensen & Shaad, 1998 Restrepo-Hartwig & Carrington, Manter o complexo de replicação ancorado à membrana 1994; Schaad, Jensen & Carrington, plasmática 1997 Replicação viral Mérits et al., 2002 Protease (Pro) Carrington & Dougherty, 1987 Iniciador para a replicação do RNA viral (Vpg) Schaad et al., 1996 RNA polymerase dependente de RNA Hong & Hunt, 1996 Allison, Johnston & Dougherty, Encapsidação do genoma 1986; Varrelmann & Maiss, 2000 Transmissão por afídeos Atreya, Atreya & Pirone, 1991 Dolja et al., 1995; Fedorkin et al., Movimento célula-a-célula 2001 Movimento a longa distância Dolja et al., 1994; Dolja et al., 1995 Mahajan, Dolja & Carrington, Replicação 1996; Determinante de sintomatologia Haldeman-Cahill et al., 1998 Mahajan, Dolja & Carrington, Promotor de replicação do RNA viral 1996; Haldeman-Cahill et al., 1998 Determinante de sintomatologia Rodriguez-Cerezo & Shaw, 1991 Fator acessório à replicação Mahajan, Dolja & Carrington, 1996 17 Uma característica marcante de proteínas produzidas por Potyvirus é sua natureza multifuncional com formação de inclusãoes citoplásticas cilíndricas (CI) as quais se desenvolvem durante a infecção viral nas células vegetais infectadas (Figura 2) (EDWARDON, 1966). Estas inclusões são de agregados estáveis da proteína CL produzidas pelo próprio vírus durante a infecção (HULL et al., 2002; FAUQUET et al., 2005). As proteínas possuem funções, sendo que algumas têm até quatro funções definidas. A proteína HC-Pro, por exemplo, é um produto gênico bastante estudado, à qual já foi atribuído o maior numero de funções. Ela catalisa a proteólise de seu terminal carboxílico, separando-se da proteína P3 (CARRINGTON; FREED & OH, 1990). Está envolvida na clivagem de poliproteínas, na transmissão por afídeos (RACCAH; HUET & BLANC, 2001), em processos relacionados com a replicação do RNA viral (LEGRAVE et al., 1996) no movimento célulaa-célula (ROJAS et al., 1997) e a longa distância (CRONIN et al., 1995; YELINA et al., 2002), no processo de inibição sobre o mecanismo de defesa da planta, baseado no silenciamento gênico pós-transcricional (KASSCHAU; CRONIN & CARRINGTON, 1997; MALLORY et al., 2001; LAKATOS et al., 2006) . Para tanto, HC-Pro deve interagir com diversas outras proteínas virais juntamente com o hospedeiro. Por exemplo, para a transmissão por afídeos, existem evidências diretas de interação com a capa protéica. Para a replicação viral, devem existir interações com várias proteínas, entre elas: CI, VPg-Pro e NIb (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999). 18 Figura 2. Corte transversal mostrando as alterações morfológicas da proteína de inclusão citoplasmática em uma infecção viral, formando estrutiras espirais. A seta indica vírions presentes nas proximidades destas inclusões (LUCINDA et al., 2008). Segundo o último relatório do ICTV (International Comitte of Taxonomic of Virus), os critérios de demarcação de espécies para o gênero Potyvirus estão baseados na seqüência do genoma, na gama de hospedeiros, na patogenicidade e citopatologia, no modo de transmissão e propriedade antigênicas. Considera-se, no entanto, que o método mais eficiente para a classificação seja a comparação da seqüência de aminoácidos da poliproteína e proteína capsidal na ausência da seqüência de nucleotídeos de todo o genoma (BERGER et al., 2005). A seqüência de nucleotídeos da 3‟NTR também pode ser utilizada na classificação (ADAMS et al., 2005). De um modo geral, espécies distintas apresentam identidade de até 53% para as seqüências de aminoácidos da CP, enquanto estirpes de um mesmo vírus apresentam de 83 a 99% de identidade. Para que duas espécies sejam consideradas distintas, a seqüência de aminoácidos da proteína capsidal deve ser inferior a 80%, já para a seqüência de nucleotídeos de todo o genoma, espécies distintas apresentam identidade inferior a 85%(ADAMS et al., 2005). 19 Os Potyvirus são transmitidos, de maneira não persistente, não circulativa, causado por diversas espécies de afídeos (pulgões), em especial pelos vetores Aphis gossypii (Glover) e Myzus persicae (Sulzer) (Figura 3) (KUROZAWA & PAVAN, 1997; ZAMBOLIM & ZERBINI JÚNIOR, 2000; ZAMBOLIM & ZAMBOLIM, 2002). Usualmente, o inseto é capaz de permanecer virulífero por um curto período de tempo. Ao migrar para uma planta sadia e realizar nova picada de prova, a transmissão é efetivada. Os vírus não-persistentes não se multiplicam no inseto vetor e não são transmitidos para sua progênie (COSTA, 2002; HULL, 2002). Figura 3. Transmissão do tipo não persistente de Potyvirus em um inseto vetor mediada pela proteína Help component (HC-Pro) que interage com uma proteína capsidial (CP) do capsídeo do virion e com um sítio de ligação do estilete do inseto. Reproduzido de James & Bryce, 2006. Cerca de 15 gêneros e 24 espécies de fitovírus sao transmitidos por afídeos e tem sua relação vírus-vetor do tipo não persistente e não circulativa (PURCIFULL, EDWARDSON & HIEBERT 1984; CARRINGTON et al. 2006). Entre os vetores mais eficientes estão Aphis gossypii (Glover) e o Myzus persicae (Sulzer) (GALLO et al., 2002). A dificuldade de 20 controle dessa doença por meio do combate aos insetos vetores ou através de práticas culturais que minimizem a incidência do vírus, fazem com que, outras alternativas de controle sejam buscadas (YUKI, 1990; SUMMERS et al., 1995). 1.2.3. Aspectos da família Bunyaviridae e Gênero Tospovírus O gênero Tospovirus (família Bunyaviridae) apresenta uma ampla distribuição mundial, podendo infectar mais de 1050 espécies de plantas em 92 famílias botânicas (FAUQUET et al., 2005, PETERS, 1998). Por um longo tempo, o gênero foi considerado monotípico, consistindo apenas de TSWV. No entanto, a descoberta de um segundo tospovírus, Impatiens necrotic spot virus (INSV) (LAW & MOYER, 1990), foi seguido pela descrição de um número crescente de tospovírus em diferentes partes do mundo. Dentro da moderna taxonomia de vírus, várias espécies de tospovírus têm sido propostas (PRINS & GOLDBACH, 1998). 21 Tabela 2. Distribuição geográfica das espécies de tospovírus conhecidos em diferentes continentes. Reproduzido de Pappu, Jones & Jain (2009). África Ásia GRSV CaCV INSV CSNV IYSV CCSV TSWV GBNVa INSV IYSV MYSV PBNVa PSMV PYSV TSWV TYRVa TZSV WBNV WSMoV Australia CaCV INSV IYSV TSWV Europa CSNV INSV IYSV PoRSV TSWV America do Norte INSV IYSV MSMV TSWV America do Sul e Caribe CSNV GRSV INSV IYSV PCFV TCSV TSWV ZLCV Capsicum chlorosis virus (CaCV); Calla lily chlorotic spot virus (CCSV); Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV); Groundnut ringspot virus (GRSV); Groundnut bud necrosis virus (GBNV); Impatiens necrotic spot virus (INSV); Iris yellow spot virus (IYSV); Melon severe mosaic virus (MSMV); Melon yellowspot virus (MYSV); Peanut chlorotic fanspot virus (PCFV); Polygonum ringspot virus (PoRSV); Physalis silver mottle virus (PSMV); Peanut yellow spot virus (PYSV); Tomato chlorotic spot virus (TCSV); Tomato spotted wilt virus (TSWV); Tomato yellow fruit ring virus (TYFRV); Tomato zonate spot virus (TZSV); Watermelon bud necrosis virus (WBNV); Watermelon silver mottle virus (WSMV) e Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV). a Tomato fruit yellow ring virus (TFYRV) é considerado como um isolado do vírus Tomato yellow ring virus (TYRV). Groundnut bud necrosis virus (GBNV) é também conhecido como Peanut bud necrosis virus (PBNV). * Dois potenciais novos tospovírus australianos ainda estao sendo caracterizados, de uma orquídea e outro de Bossiaea eriocarpa não estão incluídos na lista acima. No Brasil, já foram relatadas além de Tomato spotted wilt virus (TSWV) as espécies Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV) (REZENDE et al., 1996; BEZERRA et al., 1999). Na natureza, os tospovírus são transmitidos por tripes (ULLMAN, SHERWOOD & GERMAN, 1997; WHITFIELD, ULLMAN & GERMAN, 2005; LEBAS & OCHOACORONA, 2007; PAPPU, 2008; TSOMPANA & MOYER, 2008), que desempenham um papel crítico na sua epidemiologia. Apresentam um considerável grau de diversidade biológica. Descritores para essa diversidade incluem variantes dos sintomas, patogenicidade e variantes na virulência (QIU et al., 1998; MANDAL et al., 2006), as diferenças na especificidade de tripes e transmissibilidade (ULLMAN SHERWOOD & GERMAN, 1997; 22 WHITFIELD, ULLMAN & GERMAN, 2005), e capacidade de quebrar a resistência da planta hospedeira (ROGGERO, MASENGA & TAVELLA, 2002;. MARGARIA, CIUFFO, & TURINA, 2004; CIUFFO et al., 2005; PERSLEY, THOMAS, & SHARMAN, 2006). O ciclo de vida dos Tospovirus é composto pelas seguintes fases: ovo, primeiro ínstar e segundo ínstar, pré-pulpa, pupa e inseto adulto. Os adultos que se alimentam em plantas infectadas com tospovirus não se tornam virulíferos. A aquisição viral somente acontece em estádios larvais e a transmissão só é observada no final do estádio de segundo ínstar, mas é realizada com maior freqüência pelos adultos virulíferos (MORTIZ, KUMM & MOUND, 2004). A infecção é apresentada de maneira sistêmica, circulativa e propagativa em muitas plantas cultivadas. No entanto, outros tospovírus, como CaCV e o IYSV, apresentam dificuldades de se moverem sistemicamente e tendem a permanecer localizadas (JONES & SHARMAN, 2005; SMITH, JONES & WYLIE, 2006). São transmissíveis mecanicamente com graus variados de dificuldade, porém, não existe evidência de transmissão por semente. Estudos mostraram que o vírus foi encontrado na casca de semente de amendoim (hypogeae de Arachis), mas não no embrião (PAPPU et al., 1997). Os tospovírus causam perdas significativas no rendimento e qualidade dos produtos vegetais de leguminosas e culturas ornamentais em muitas partes do mundo (MUMFORD, BARKER, & WOOD, 1996; PAPPU, 1997; PEARCE, 2005; PERSLEY, THOMAS, & SHARMAN, 2006). Infecção nas fases iniciais de crescimento das culturas muitas vezes resulta em uma diminuição substancial no estande de plantas levando a perdas de rendimento considerável, infecção em fases posteriores ainda pode causar perdas significativas no rendimento e qualidade dos produtos (CULBREATH, TODD & BROWN, 2003). Plantas de pimenta e tomate quando infectadas com Tospovirus diminuem o rendimento dos frutos, desenvolvendo marcas visíveis na superfície, tornando-se inviáveis para o comercio (LATHAM & JONES, 1996, 1997). Estudos na America do sul demonstraram que ZLCV é transmissível apenas por Frankliniella zucchini, e não por Thrips tabaci (REZENDE et al., 1997). Várias revisões e boletins informativos de extensão em diferentes aspectos de tospovírus e vetores tripes têm sido publicados nos últimos anos (MOUND, 2001; ADKINS, & BAKER, 2005; JONES, 2004, 2005; WHITFIELD, ULLMAN, & GERMAN, 2005;. BROWN et al., 2005.; PERSLEY, THOMAS & SHARMAN, 2006; LEBAS & OCHOA-CORONA, de 2007; PAPPU, 2008; TSOMPANA & MOYER, 2008). 23 Jones (2005) proporcionou uma abrangente relato histórico da maior diversidade de Tospovírus em diferentes partes do mundo. Esta revisão apresenta um resumo do status atual da epidemia de Tospovírus em várias culturas em diferentes continentes (África, Ásia, Europa, América do Norte e Central, América do Sul), e uma visão geral dos progressos feitos no entendimento de sua epidemiologia, visando assim desenvolver uma melhor gestão de programas para reduzir o seu impacto. 2.6 Principais viroses associadas a cultura da melancia A cultura da melancia pode ser infectada por patógenos, que causam os mais diversos sintomas. Além das doenças bióticas, existem as abióticas, que também podem causar destruição total da cultura, caso não sejam adotadas medidas preventivas (SANTOS et al., 2005). Poucos são os dados disponíveis sobre a incidência desses vírus nas regiões produtoras de melancia no Brasil, porém os dados existentes mostram a predominância dos Potyvirus. 2.6.1 Papaya ringspot virus – Strain Watermelon (PRSV-W) Há evidencias que o PRSV se originou na região da Índia subcontinental. Este vírus é classificado em duas estirpes, a estirpe papaya e a estirpe watermelon, que possuem vírions que não podem ser diferenciados por testes sorológicos, mas que diferem quanto às espécies que infectam melão e melancia, respectivamente (BATESON et al., 2002; FAUQUET et al., 2005). Encontra-se distribuído na Américas do Sul, América Central, Estados Unidos, México, Oriente médio, Austrália, China, França, Alemanha, Índia, África do Sul e Itália (PURCIFUL et al., 1996). A estirpe W, Watermelon (PRSV-W) infecta sistematicamente espécies da família cucurbitaceae, constituindo fator de importância econômica para estas culturas no Brasil (BONILHA, 2007). O PRSV-W é muito comum em países tropicais e subtropicais, sendo considerado como limitante para diversas cucurbitáceas, principalmente quando a infecção ocorre no início do ciclo (ZAMBOLIM & DUSI, 1995; LUIS-ARTEAGA et al., 1998). Segundo Giampan & Rezende (2001), PRSV-W predomina nas principais espécies de cucurbitáceas cultivadas no Estado de São Paulo. Segundo Yuki et al. (2000), este é o principal vírus também nos Estados do Pará, Rio Grande do Norte, Mato Grosso, Minas Gerais, Ceará e Distrito Federal. No Brasil, espécies selvagens de cucurbitáceas ocorrem 24 quase que em todas as regiões e durante praticamente todas as épocas, podendo desta maneira servir de hospedeiro para o vírus. (YUKI et al., 2000). 2.6.2 Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) O ZYMV foi isolado pela primeira vez na Itália em 1973, descrito em 1981, e então identificado em todos os continentes em menos de uma década. Economicamente é um dos mais importantes vírus de cucurbitáceas. Uma imensa variabilidade biológica tem sido observada entre os isolados ZYMV, sobre a gama de hospedeiros, sintomatologia e transmissibilidade. A sobrevivência do ZYMV em áreas onde cucurbitáceas não são cultivadas ao longo do ano continua a ser elucidado, porque poucos hospedeiros naturais foram identificados até agora. O controle parcial de ZYMV pode ser conseguido através da limitação de transmissão do vírus por pulgões, através de práticas culturais. No entanto, a alta variabilidade biológica do ZYMV justifica uma avaliação cuidadosa da implantação de estratégias de controle genético, a fim de aumentar a sua durabilidade (DESBIEZ & LECOQ, 1997). Considerado um importante patógeno de plantas dos últimos 20 anos, o ZYMV tem sido relatado em vários países além do Brasil: Argélia, Austrália, Egito, França, Alemanha, Israel, Itália, Japão, Jordânia, Líbano, Marrocos, Espanha, Formosa, Turquia, Reino Unido, EUA e Cingapura (BÜCHEN-OSMOND & PURCIFUL, 1996; WONG; CHONG; CHONG, 1994). Pode ser encontrado principalmente nas espécies de cucurbitáceas, incluindo as principais espécies cultivadas e há relatos de infecção de algumas outras espécies de famílias de dicotiledôneas (MAHGOUB et al., 1997). Causam sintomas do tipo mosaico nas diferentes espécies de cucurbitáceas. Induz mal formação foliar, deformação e escurecimento dos frutos (LISA & LECOQ, 1984; PROVVIDENTI et al., 1984; NAMETH et al., 1985; LECOQ, LEMAIRE & WIPF-SCHEIBEL, 1991). 2.6.3 Watermelon mosaic virus (WMV) O WMV possui ampla gama de hospedeiras, com 178 espécies de plantas dentro de 27 famílias, incluindo cucurbitáceas e algumas espécies de leguminosas, malváceas, quenopodiáceas e ornamentais (SHUKLA et al., 1994). Plantas infectadas com WMV exibem sintomas de mosqueado, mosaico, bolhosidades e deformações do limbo foliar. A qualidade e a quantidade de produção dos frutos podem ser reduzidas (OLIVEIRA et al., 2000). A 25 disseminação do vírus no campo é realizada com muita eficiência por mais de 38 espécies de afídeos em 19 gêneros de maneira não-persistente, sendo seus principais vetores Myzus persicae Sulzer, 1776 e Aphis spp. (FAUQUET et al., 2005). O controle químico dos insetos vetores não apresenta resultados satisfatórios no combate a doença. Conseqüentemente, a forma de controle mais eficiente para WMV-2 consiste em desenvolver cultivares resistentes, mediante introdução de genes capazes de conferir resistência em cultivares comerciais suscetíveis. 2.6.4 Cucumber mosaic virus (CMV) O CMV foi descrito pela primeira vez por Doolittle em 1916, pertence ao gênero Cucumovirus, apresenta distribuição cosmopolita e diferentes graus de virulência (DIAS, 2004). Pode ser transmitido na natureza por várias espécies de afídios, apresentando com estes uma relação do tipo não persistente (BRIOSO, 1986). Os isolados de CMV podem ser classificados em dois subgrupos, CMV I e CMV II por métodos biológicos, sorológicos e moleculares, de acordo com características moleculares e hospedeiros diferenciais que infectam (PALUKAITIS et al., 1992). De modo geral o CMV-I, mais termotolerante, predomina em regiões tropicais e subtropicais e o CMV-II é mais prevalente em regiões temperadas (BOARI, 1998). As partículas virais são isométricas, com 28 a 30 nm de diâmetro, contendo ssRNA tripartido (VAN REGENMORTEL et al., 2000). Ocorre em cucurbitáceas, principalmente, em regiões temperadas, onde a doença é mais severa. No Brasil não possui grande importância devido a sua baixa ocorrência em regiões produtoras. Todas as cucurbitáceas são suscetíveis ao vírus (VIANA et al., 2001). Apresenta uma ampla gama de hospedeiros incluindo muitas espécies daninhas e plantas cultivadas (EMBRAPA, 2007). Em hortaliças, na maioria das vezes, a transmissão do CMV isoladamente é mais eficiente do que em mistura com outros vírus, tanto através de aquisição simultânea como seqüencial. O vírus possui um amplo círculo de hospedeiros e é transmitido mecanicamente por sementes e por afídeos. Mais de 60 espécies de afídeos transmitem o CMV de maneira não persistente, destacando-se as espécies Myzus persicae e Macrosiphum euphorbiae (VIANA et al., 2001). 26 2.6.5 Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) É causado pelo vírus da clorose letal da abobrinha, classificado na família Bunyaviridade no gênero Tospovirus. O ZLCV é transmitido em condições naturais por uma nova espécie de tripes descrita no Brasil e denominada de Frankliniella zucchini. É importante salientar que a relação vetor/vírus é do tipo circulativa-propagativa e, portanto, multiplica-se no inseto vetor. Esse vírus tem sido encontrado, nos últimos anos, com alta freqüência em plantios de diferentes espécies de cucurbitáceas, estando em alguns casos, associado a severos danos na produção (REZENDE et al., 1997; YUKI et al., 2000; STANGARLIN et al., 2001; GIANPAN, 2003; EMBRAPA, 2007). Os sintomas causados pelo ZLCV começam com uma coloração verde clara em todas as folhas. Em seguida, as folhas mais novas tornam-se cloróticas, com bordos encurvados para cima. As folhas são mais espessas do que aquelas de plantas sadias. Algumas folhas basais mostram necroses sistêmicas. Plantas infectadas definham e morrem em pouco tempo, especialmente quando a infecção ocorre antes do florescimento. Após o florescimento exibem quase os mesmos sintomas, mas não morrem, porém tornam-se atrofiadas e têm sua produção drasticamente reduzida (REZENDE et al., 1996). 2.7.1 Identificação das Viroses 2.7.1.1 Testes ELISA Embora numerosas variantes de testes ELISA tenham sido experimentadas e publicadas por diversos autores (CLARK e ADAMS, 1977; FIELD et al., 1980; ZANZINGER & TAVANTZIS, 1982a e 1982b; CONVERSE e MARTIN, 1990; ARAMBURU et al., 1991; FOX, 1993; GARNSEY e CAMBRA, 1993), existem duas técnicas base em que se apoiam todas as outras (CONVERSE e MARTIN, 1990): Técnicas diretas - O marcador enzimático encontra-se diretamente ligado ao anticorpo usado para detectar o antígeno em questão, dos quais os mais comuns são o DAS-ELISA (double antibody sandwish) e o dot-ELISA ou DIBA. Técnicas indiretas - Neste caso, a enzima é acoplada não ao anticorpo usado na detecção do antígeno, mas a um segundo anticorpo, específico para o primeiro. Destas técnicas, sobressaem o ID-ELISA (ELISA indireto) e o ID-DIBA. 27 Enquanto muitos testes serológicos dependem da avaliação de um precipitado antígeno-anticorpo, nos testes ELISA ocorre uma alteração de cor, que pode ser lida eletronicamente com um espectrofotômetro ou, mais grosseiramente, avaliada a olho nú (FOX, 1993). 2.7.1.1.1 DAS-ELISA Esta é a forma mais simples dos testes ELISA usada na detecção de fitopatógenos, desde a sua descrição por Clark e Adams (1977). Trata-se de um teste direto, que tem como fase sólida placas de poliestireno com 96 alvéolos. A placa é inicialmente revestida com anticorpos específicos para o antígeno a detectar, sendo posteriormente adicionada a amostra a testar. Os antígenos específicos para os anticorpos ligam-se a eles e todas as moléculas não específicas são removidas por lavagem. Ao antígeno assim ligado, é adicionada uma solução de anticorpos conjugados com enzima, sendo esta associação detectada pela adição de um substrato (CONVERSE & MARTIN, 1990; GARNSEY & CAMBRA, 1993). 2.7.1.1.2 ELISA-indireto Este teste coincide em quase todas as fases com o DAS-ELISA. E ntretanto, nesta técnica, após a colocação do antígeno segue-se a adição do anticorpo específico para o antígeno e só posteriormente é adicionada a enzima conjugada a um anticorpo específico para aquele anticorpo intermédio (anticorpos de uma espécie são antígenos quando injetados num animal de outra espécie). Por exemplo, as imunoglobulinas do coelho podem ser injetadas num outro animal, como a cabra, para criar anticorpos cabra anti-coelho (GAR - goat antirabbit). Estes anticorpos são úteis na detecção de anticorpos de coelhos, que por sua vez são preparados para detectar o antígeno (CONVERSE & MARTIN, 1990; GARNSEY & CAMBRAS, 1993). Esta técnica, embora envolva uma fase adicional, é mais sensível, e permite também o uso de conjugados anticorpo-enzima comercialmente preparados, evitando-se desta forma a necessidade de preparação de um conjugado específico para cada antígeno (GARNSEY & CAMBRAS, 1993). 28 2.7.1.1.3 Dot-ELISA Durante muitos anos, os testes ELISA em placas alveoladas foram o método de escolha na detecção de vírus, pelas suas inúmeras características. No entanto, as reações usadas em placas alveoladas podem ser transpostas para membranas com algumas vantagens (FOX, 1993). Trabalhos realizados por Powell (1987a e 1987b) demonstraram a elevada fiabilidade das técnicas DIBA, assim como a sua maior rapidez e acessibilidade em relação ao preço relativo dos materiais. Hsu (1996), por sua vez, demonstrou, em testes realizados com TSWV (Tomato spotted wilt virus), uma sensibilidade destes testes oito vezes superior à dos ELISA em placa. Uma grande desvantagem em relação aos testes em placas alveoladas deve-se ao fato de os resultados serem mais dificilmente quantificados, razão pela qual os DIBA são usados particularmente no diagnóstico de rotina para detecção de positivos vs negativos (POWELL, 1987a). Relativamente ao suporte físico destes testes, e embora a bibliografia se refira com maior freqüência ao uso de membranas de nitrocelulose, Hammond e Jordan (1990) defendem que membranas de nylon, também usadas com a mesma finalidade, apresentam maior capacidade de ligação às proteínas, assim como maior resistência ao manuseamento. Estas técnicas, também designadas por “dot-blot immunoassay” ou dot-ELISA, seguem o mesmo princípio dos testes em placas de poliestireno. No entanto, a enzima ao reagir com o substrato solúvel, forma um produto colorido insolúvel que precipita no local da reação, indicando assim quais das amostras contêm o antígeno em causa (HAMMOND & JORDAN, 1990). Os protocolos para estas técnicas encontram-se descritos por Powell (1987b), Serwood, Sanborn & keyser (1987) e Hu et al.(1991). 29 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, M. J.; ANTONIW, J. F. & FAUQUET, C. M. Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae. Arch Virology. v. 150, p. 459-479, 2005. ADKINS, S. & BAKER, C.A. Tomato spotted wilt virus identified in desert rose in Florida. Plant Disease. v. 89, p. 526. 2005. AGRIANUAL: Anuário da agricultura brasileira. FNP Consultoria & Agroinformativos. São Paulo. p. 544, 2007. AGRIOS, G. N. Plant Pathology. San Diego. Academic Press. 4 ed. p. 635. 1997. ALBUQUERQUE, F. C.; IKEDA, H. & COSTA, A. S. Ocorrência do vírus do mosaico da melancia (Citrullus vulgaris Schrad.) em plantações de melão (Cucumis melo L.) na região de Belém-PA. Revista de Olericultura, v. 12, p. 94, 1972. ALLISON, R.; JOHNSTON, R. E. & DOUGHERTY, W. G. 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Nas amostras obtidas no município da Lagoa da Confusão houve predominância de WMV com 26,4%, seguido por PRSV-W e ZLCV com 22% e 8,1%, respectivamente. O vírus PRSV-W apresentou 12,5% de infecção nas amostras na região de Gurupi, seguido de ZLCV (12%) e ZYMV (10,4%) e WMV com 12%, não diferindo estatisticamente entre si, apenas CMV com 11,2% de amostras infectadas se mostrou em outro grupo. No município de Porto Nacional foram identificados CMV (14,7%), ZLCV (13,8%) e PRSV-W (10,3%), sendo ZYMV e WMV encontrados em um subgrupo com 8,4% e 9,2% de infeção, respectivamente. As infecções mistas de maior ocorrência foram entre PRSV-W+WMV, PRSV-W+ZLCV e ZLCV+WMV, num total de 142 amostras. De modo geral, estes resultados permitem subsídios para o programa de melhoramento de resistência a viroses na cultura da melancia no estado do Tocantins, considerando os cinco tipos de vírus identificados e sua distribuição espacial por região. Palavras chaves: Citrullus lanatus, diagnose, viroses, Dot-Elisa. 51 Distribution and diagnosis of viruses asociated with watermelon crop in the state of Tocantins. ABSTRACT This study aimed to survey on the distribution and makes the diagnosis of virus associated with culture of watermelon production areas of the state of Tocantins. We collected 752 samples of plants with symptoms of virus in all producing regions of watermelon. The identification was made by serologic method of Dot-ELISA with polyclonal antibodies to PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV and ZLCV. Between the occurrences of viruses by region showed that PRSV-W was predominant in 31% of the samples obtained in Formoso do Araguaia, differing by the Tukey test of other viruses, and less than 30% were positive for WMV, ZLCV, CMV and ZYMV. The samples obtained in the municipality of Lagoa da Confusão WMV was predominated with 26.4% followed by PRSV-W and ZLCV with 22% and 8.1%, respectively. The virus PRSV-W infection showed 12.5% of the samples in the region of Gurupi, followed by ZLCV (12%) and ZYMV (10.4%) and WMV with 12%, not statistically different from each other, with only 11, 2% of CMV infected samples was shown in another group. In the municipality of Porto Nacional CMV were identified (14.7%), ZLCV (13.8%) and PRSV-W (10.3%), ZYMV and WMV was found in a subgroup with 8.4% and 9.2 % of infection, respectively. Mixed infections occurred more frequently between PRSVW + WMV, PRSV-W + ZLCV and WMV + ZLCV, a total of 142 samples. Overall, these results allow subsides for the breeding program for resistance to viruses in watermelon crop in the state of Tocantins, considering the five virus types identified and their spatial distribution by region. Keywords: Citrullus lanatus, diagnosis, viruses, Dot-Elisa. 52 1. INTRODUÇÃO A melancia (Citanatus lanatus) é infectada por diversas espécies de vírus da família Potyviridae afentando diretamente seu desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, ocasionando perdas significativas em diversas regiões produtoras do Brasil. Dentre os tipos de potyvirus que infectam a cultura está o vírus da mancha anelar do mamoeiro - estirpe melancia “PRSV-W” (Papaya ringspot vírus- Strain watermelon) (REZENDE & PACHECO, 1997; OLIVEIRA et al.; 2000; MOURA et al.; 2001), mosaico amarelo da abobrinha “ZYMV” (Zucchini yellow mosaic virus) (VEGA et al. 1995; OLIVEIRA et al.; 2000; MOURA et al.; 2001), mosaico do pepino “CMV” (Cucumber mosaic virus) (EIRAS, COLARICCIO & CHAVES, 2001), mosaico da melancia “WMV” (Watermelon mosaic virus), (SÁ & KITAJIMA, 1991; OLIVEIRA et al.; 2000) e um tospovirus conhecido como Clorose letal da abobrinha de moita “ZLCV” (Zucchini Lethal chlorosis virus) (GIAMPAN, REZENDE & PIEDADE, 2009). Sendo os potyvirus transmitidos de maneira não persistente pelo afídeo e o tospovirus de maneira semi-persitente pelo inseto vetor tripes (VEGA et al., 1992). As perdas econômicas ocasionadas por vírus variam em função do tipo de vírus presente e do tipo de infecção (simples ou mista) na cultura. No Brasil, existem diferentes tipos de vírus predominantes nas regiões produtoras de cucurbitáceas, sendo a dispersão associada a populações de insetos vetores (MOURA, 2003; SANTOS et al., 2005). A incidência de viroses é dinâmica, podendo variar em função da espécie do vírus, seus hospedeiros, da migração e espécies dos vetores (MOURA et al., 2001). Desse modo, além da redução direta na produção, os vírus influenciam diretamente no aspecto morfológico do fruto, depreciando o seu valor comercial. A área cultivada de melancia no Estado do Tocantins em 2010 foi de 6,8 mil hectares, com produção de 174 mil toneladas de frutos, obtendo uma receita de 42 milhões de reais (SEAGRO, 2011). Estudos sobre a ocorrência e os tipos de vírus nas principais regiões produtoras são incipientes, pela grande importância econômica e social da cultura no Estado. A identificação dos principais vírus no sistema de cultivo de melancia proporcionará suporte para futuros estudos de melhoramento genético da melancia, visando obtenção de cultivares resistentes aos vírus, além do estabelecimento de manejo integrado de viroses nas regiões produtoras. Para isso faz-se necessário o levantamento dos principais vírus presentes nos sistema de cultivo de melancia no Estado do Tocantins. 53 O presente trabalho teve como objetivo a identificação sorológica e distribuição parcial dos vírus presentes nos campos de produção de melancia no Estado do Tocantins. 2. MATERIAL e MÉTODOS Este trabalho foi desenvolvido com isolados de quatro regiões produtoras de melancia do Estado do Tocantins (Gurupi, Formoso do Araguaia, Porto Nacional e Lagoa da Confusão), cultivados com melancia. A identificação dos vírus foi realizada no Laboratório de Manejo Integrado de Pragas do Campus Universitário de Gurupi – Universidade Federal do Tocantins (UFT), de Janeiro de 2009 a Janeiro de 2011. 2.1. Obtenção das plantas e inoculação Foram obtidas 752 amostras de plantas de melancia com sintomas de viroses. Sendo 265 amostras do município de Formoso do Araguaia, 232 da Lagoa da Confusão, 150 de Gurupi e 105 de Porto Nacional. Todas as amostras foram inoculadas e mantidas em plantas de Cucurbita pepo, Nicotina benthamiana e Datura stramonium. A inoculação, foi realizada de acordo com Nascimento et al. (2011) com adição do tampão de fosfato potássio (K2HPO4) 0,01 M, pH 7,0 e 0,1 % de sulfito de sódio (Na2SO3), por fricção da suspensão viral sobre as folhas cotiledonares, previamente polvilhadas com o abrasivo Carbureto de silício (carborundum), 400 mesh. Após, retirou-se, via lavagem, o excesso de abrasivo. Para cada espécie de vírus fram realizadas duas inoculações, sendo a segunda realizada três dias após a primeira (Figura 1). 54 Figura 1. Mapa do Estado de Tocantins indicando as quatro principais regiões produtoras onde foram coletadas amostras de melancia com sintoma de viroses. Os números no mapa representam: 1-Região de Porto Nacional; 2-Região de Lagoa da Confusão; 3-Região de Formoso do Araguaia; 4-Região de Gurupi. 2.2. Identificação sorológica dos isolados A identificação dos vírus presentes foi realizada pelo teste sorológico de Dot-ELISA ou DIBA, com anti-soros específicos para os vírus WMV-2, CMV, ZYMV, PRSV-W e ZLCV. As amostras foram maceradas e preparadas de acordo com os procedimentos realizados por Banttari & Goodwin (1985) na proporção de 1g de folha para 1000µl de tampão ½ PBS (NaH2PO4H2O, 0,08M; K2HPO4, 0,02M; NaCl, 1,40M; KCl, 0,02M; pH 7,4). Posteriormente foram pipetados 4µl da solução e distribuídos em membrana de nitrocelulose. Contudo os controles positivos e negativos. Em seguida a membrana ficou a temperatura ambiente por 30 minutos para secar. O bloqueio foi realizado com uma solução de ½ PBS acrescido de 3% de leite em pó “Molico®”, deixando a membrana em agitação por 3 horas a 60 RPM. As membranas foram colocadas em meio contendo anti-soros policlonais específicos para CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV e ZLCV, cedidos gentilmente pela Dra. 55 Mirtes Freitas Lima (EMBRAPA-CNPH). O conjugado geral utilizado “Goat anti-rabbit IgG Alkaline Phosphatase Conjugate, SIGMA” foi diluído na proporção de 1:30.000µl de ½ PBS. Para revelação foram utilizadas pastilhas de BCIP/NBT (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/Nitro blue tetrazolium) SIGMA FAST™, de acordo com o protocolo do fabricante. Todos os resultados obtidos das amostras foram comparados com as plantas controle (Plantas sadias e com sintomas dos respectivos vírus). Figura 2. Identificação de WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV em ensaios de DotElisa utilizando anticorpos policlonais. Sendo 1A, 1B, 1C, 1D e 1E extrato de plantas sadias. Plantas controle positivos WMV-2 (2A), ZYMV (2B), PRSV-W (2C), CMV (2D) e ZLCV (2E), respectivamente. WMV-2 (3A), ZYMV (3B), PRSV-W (3C), CMV (3D) e ZLCV (3E), respectivamente, coletadas nas regiões produtoras do estado do Tocantins. 2.3. Análise sintomatológica das viroses A determinação dos tipos de sintomas apresentado pelos víruss coletadas nos campus de produção de melancia cv. Crimson sweet, foi realizada em casa de vegetação presente no Campus Universitário de Gurupi. As inoculações mecânicas foram realizadas na fase cotiledonar, sendo a primeira no estádio de quatro folhas definitivas e a segunda inoculação após três dias da primeira inoculação, na presença de solução tampão fosfato monobásico dibásico 0,01 M, pH 7,0 e sulfito de sódio. Após a inoculação, as plantas foram mantidas em casa de vegetação até o aparecimento dos sintomas das viroses devidamente identificadas no item anterior. Os sintomas apresentados pelas respectivas infecções virais foi determinado de acordo com o sistema de classificação de severidade utilizado por Oliveira et al. (2000), onde existiam: folhas sem sintomas; poucas folhas com leve mosaico nos bordos; maioria das 56 folhas com mosaico; poucas bolhas; maioria das folhas com mosaico; muitas bolhas e/ou folhas com leves deformações e mosaico intenso e folhas com deformações severas. Toda a sintomatologia apresentada pelos vírus em infecções simples e mistas foram avaliadas e tabuladas com as respectivas características. 2.4. Analise estatística A ocorrência dos vírus representativas de cada região produtora de melancia do estado do Tocantins foi realizada através de contagem de amostras positivas realizada pelo teste sorológico de Dot-Elisa, sendo determinadas pela formula %V= (PS – PN) /T x 100, Sendo que, %V = porcentagem de vírus por região, PS= Planta com sintomas, PN= Plantas sem sintomas, T= total de plantas por regiões produtoras. Todos dados de porcentagem foram obtidos utilizado o programa SIGMA PLOT. 3. RESULTADOS Em Formoso do Araguaia verificou-se a predominância do PRSV-W, sendo representativo em 31% das amostras, diferindo estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade dos demais vírus, e menos de 30% foram positivas para WMV, ZLCV, CMV e ZYMV com 10,7%, 9,4% e 4,5%, 4,5%, respectivamente. (Figura 3A). Nas amostras obtidas no município da Lagoa da Confusão houve predominância de WMV com 26,4%, seguido por PRSV-W e ZLCV com 22% e 8,1%, respectivamente, os quais diferiram estatisticamente de ZYMV e CMV pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, não apresentando infecções (Figura 3B). O vírus PRSV-W apresentou 12,5% de infecção das amostras na região de Gurupi, seguido de ZLCV (12%) e ZYMV (10,4%) e WMV com 12%, não diferindo estatisticamente entre si, apenas CMV com 11,2% de amostras com infecção se mostrou em outro grupo (Figura 3C). No município de Porto Nacional foram identificados CMV (14,7%), ZLCV (13,8%) e PRSV-W (10,3%), sendo ZYMV e WMV encontrados em um subgrupo com 8,4% e 9,2% de infeção, respectivamente (Figura 3D). A ocorrência de plantas sem infecção foi constatada em todas as regiões, em Formoso do Araguaia foi observado 27 plantas, representando um total de 18,3%, para região de Lagoa da Confusão 19 plantas sem infecção diferindo significativamente dos grupos infecciosos com 30,5%, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, em Gurupi o grupo de 14 plantas sem 57 infecção representou 25,8%, apresentando-se como um grupo superior aos demais de acordo com o teste de Tukey e Porto Nacional foram observadas 11 plantas se infecção, representando um total de 10,1%, constituindo um subgrupo (Figura 3). A C B D Figura 3. Ocorrência de vírus em plantas de melancia de quatro regiões produtoras do Estado do Tocantins, sendo elas: A – Formoso do Araguaia, B – Lagoa da Confusão, C– Gurupi e D – Porto Nacional e PRSV – W (Papaya ringspot virus – Strain watermelon), ZYMV (Zucchini yellow mosaic vírus), ZLCV (Zucchini lethal chlorosis virus), WMV (Watermelon mosaic virus) e CMV (Cucumber mosaic vírus). A ocorrência de infecção mista foi mais expressiva em Porto Nacional, apresentando um total de 51 amostras positivas, representando o maior grupo de infecção mista por planta, com 33,4% de acordo com o teste de Tukey a 5% de probabilidade, seguido pelas regiões de Formoso do Araguaia com 49 amostras representando 21,4% e Gurupi com 19 amostras representando um total de 16,1% (Figura 3 e Tabela 1). As associações entre os vírus mais expressivas ocorreram entre PRSV-W+WMV e PRSV-W+ZLCV, apresentando 31 e 26 amostras positivas para o teste sorológico. 58 Tabela 1. Número de infecções mistas com as respectivas associações virais encontradas nas regiões produtoras de melancia nos municípios de Formoso do Araguaia, Lagoa da Confusão, Gurupi e Porto Nacional. Número de Infecções Mistas Regiões Produtoras Média PR+ZY PR+ZL PR+C PR+W ZY+ZL ZY+C ZY+W ZL+C ZL+W C+W Formoso do Araguaia 49 4 8 6 8 3 1 3 5 7 4 Lagoa da confusão 23 - 9 - 10 - - - - 4 - Gurupi 19 1 4 2 6 - - 3 - 2 1 Porto Nacional 51 4 5 11 7 2 1 2 6 7 6 TOTAL 142 9 26 19 31 5 2 7 11 20 11 * PR= PRSV-W, ZY= ZYMV, ZL= ZLCV, C= CMV, W= WMV. *Média de 3 avaliações entre os anos de 2009 e 2011. Os sintomas das plantas infectadas diferiram em função dos vírus e suas associações (Tabela 2). Os sintomas observados nas infecções por vírus variaram desde mosaico leve, subdesenvolvimento das plantas, estreitamento foliar e enrolamento foliar à mosaico severo, bolhosidade, bolhas franzidas, cordão de sapato e deformação foliar, chegando a necroses (Tabela 2 e Figura 4). Além disso, foram observadas alterações na formação e no desenvolvimento dos frutos, redução no peso e alteração na coloração de frutos obtidos de plantas cometidas com vírus (Figura 4). 59 Tabela 2. Sintomas observados em plantas de melancia com Papaya ringspot vírus – Strain watermelon (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Cucumber mosaic virus (CMV) em infecções isoladas ou em infecção mista. Vírus/Infecções Mistas Sintomatologia* CMV M, Sd, Et, Ef ZYMV M, Bl WMV M, Bf, Et, Cs, Df PRSV-W M, Et, Bl, Ef, Es ZLCV M, Sd, Df, Ne PRSV-W+ZYMV M, Bl, Ef, Sd PRSV-W+ZLCV M, Sd, Ne, Es, Et PRSV-W+CMV M, Sd PRSV-W+WMV M, Bl, Df, Ne ZYMV+ZLCV M, Df, Bl, Ne ZYMV+CMV M, Df, Et ZYMV+WMV M, Df , Bl, Et ZLCV+CMV M, Sd, Df, Ef ZLCV+WMV M, Bl, Sd, Df, Ne CMV+WMV M, Bl, Sd, Et, Es Planta Sadia S/S * Bf: bordas franzidas; Bl: bolhosidade; Es: esporão; Et: estreitamento foliar; Cs: cordão de sapato; Df: deformação foliar; Ef: enrolamento foliar; Ne: Necrose; M: mosaico; Sd: subdesenvolvimento; S/S: sem sintomas. 60 Figura 4. Sintomas de infecção viral ocorridos em amostras de plantas de melancia obtidas nas principais regiões produtoras no estado do Tocantins. Sendo: A- folhas com sintomas de mosaico e anéis cloróticos; B- folhas com sintomas de bolhosidade, deformação foliar, um leve mosaico nas partes baixeiras e subdesenvolvimento; C- folhas com leves sintomas de mosaico, deformação foliar e bordas franzidas D- Folhas com sintomas de mosaico severo, bolhosidade, enrolamento foliar, bordas franzidas, deformação foliar seguido de necrose; E- Fruto de melancia sadia; F- Fruto de melancia com sintomas de inanição; G- Fruto de melancia com sintomas de inanição e deformação da casca; HFruto de melancia com sintomas de inanição, deformação do formato e pontuações cloróticas. 4. DISCUSSÃO O PRSV-W é o vírus predominante nas regiões produtoras de melancia do Estado do Tocantins, no entanto, observa-se a presença de WMV, ZYMV, PRSV-W, CMV e ZLCV entre as amostras obtidas em menor ocorrência. A variação da ocorrência de viroses em diferentes regiões produtoras de cucurbitáceas no Brasil é altamente diferenciada conforme descrito na literatura. Os vírus PRSV-W, ZLCV, ZYMV, CMV e SqMV teve ocorrência predominantes em todas as amostras de melancia do Mato Grosso do Sul (STANGARLIN, DIAS & REZENDE, 2000; STANGARLIN et al., 2001). No estado do Maranhão, a predominância foi do PRSV-W em campos de produção de cucurbitáceas, seguido por WMV, CMV, SqMV e ZYMV, respectivamente (MOURA et al., 2001). Segundo YUKI et al. (2000) no Estado de São Paulo o PRSV-W foi predominante, seguido por ZYMV, ZLCV, CMV e WMV, respectivamente. 61 Conforme observado neste trabalho, existe uma alta ocorrência de infecções mistas entre PRSV-W e WMV, sendo menos expressivo para ZYMV+ZLCV e ZLCV+CMV. A infecções mistas em condições naturais, podem estar associadas aos diversos tipos de vírus encontrados, neste caso, os menos favorecidos foram ZYMV, CMV e ZLCV (Tabela 1). De modo geral, casos de mudança no tipo de vírus tem sido freqüentemente encontrada e associada a infecções mistas, indicando um papel ecológico importante na manutenção das virose nos sistema de cultivo (SANCHEZ-CAMPOS et al., 1999; DAVINO et al., 2006; GOMEZ et al., 2009). Diferenças na interação entre vírus já foram relatados em condições laboratoriais e de campo. Isso ocorre provavelmente devido as condições fisiológicas ou na concentração do vírus (GAL-ON & SHIBOLETH, 2006). A identificação correta dos vírus presentes nas regiões produtoras de melancia no Estado do Tocantins, permite a compreensão dos vírus e o desenvolvimento de estratégias de controle das viroses, especialmente para o desenvolviemnto de plantas resistentes as víroses. Estudos recentes mostram que os vírus de RNA possuem altas taxas de evolução e adaptação (GIBBS et al., 2010). Por exemplo, ZYMV foi relacionado com WMV, sendo estimado ter evoluído muito rapidamente deste vírus, uma vez mostrado ter um ancestral comum. Embora ZYMV tenha sido identificado pela primeira em 1970, este vírus tornou-se rapidamente uma epidemia mundial (DESBIEZ & LECOQ, 1997; SIMMONS, HOLMES & STEPHENSON, 2008). O estudo das viroses permitirão a identificação de possíveis mutações e recombinações ocorridas entre os vírus dominantes nos cultivos de curcubitáceas, onde se encontra os eventos principais de variabilidade nos vírus de RNA, enquanto a deriva genética e seleção são importantes na evolução dos vírus (GARCIA-ARENAL & FRAILE, 2003). Outro fator importante está na identificação de novos vírus, onde muitas vezes por meio de atividades humanas, são introduzidos em regiões isentas de certas estirpes ( NAGATA et al., 2007). Várias alterações de vírus têm sido relatados nos últimos anos, incluindo vírus sendo transmitidos de forma não persistente (AMAKU et al., 2010), transmitidos mecanicamente (GOMEZ et al., 2009). Begomovírus transmitido por mosca branca (DAVINO et al., 2006; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2007). Conforme observado desde o ano 2000 para WMV no sudeste da França (DESBIEZ et al., 2009) é um exemplo adicional onde a introdução viral passa a ser bem adaptadas ao ambiente e rapidamente os vírus existentes são substituídos por aqueles introduzidos (SAX & BROWN, 2008; FABRE et al., 2010). 62 Vários parâmetros podem ser atribuidos para a rápida mudança das espécies de vírus de uma determinada região. A eficiência na transmissão pelo inseto vetor aumentando a propagação do vírus. Um exemplo disto é o caso de TYLCD “Tomato yellow leaf curl virus” que foi substituído pelo TYLCV-S “Tomato yellow leaf curl Sardinia virus” em poucos anos no sul da Espanha, provavelmente devido à sua melhor transmissão pelos biótipos locais do vetor Bemisia tabaci, e sua capacidade de infectar feijão (Phaseolus vulgaris) constituindo uma importante fonte potencial de inóculo para culturas de tomate (SANCHEZ-CAMPOS et al., 1999). A diferença na ocorrência de PRSV-W, ZYMV, WMV, CMV e ZLCV podem estarem associadas às hospedeiras alternativas, que pode favorecer um determinado tipo de vírus. A seletividade da planta hospedeira esta na capacidade do vírus replicar e translocar pelos plasmodemos (ZAMBOLIM & ZAMBOLIM, 2002). De fato, o hospedeiro têm sido relatado como um processo importante na manutenção viral, na transmissão vetorial e/ou multiplicação de vírus, que depende da adaptação ao hospedeiro, e de suas interações com o inseto vetor (MARTIN & ELENA, 2009). Estes resultados sugerem que existem uma competição direta entre os vírus PRSV-W, ZYMV, WMV, CMV e ZLCV, tanto em infecção simples como em infecções mistas, podendo estar favorecendo a predominância de PRSV-W, possivelmente por apresentar melhor adequação nas infecções mistas. Isto é significativo, uma vez que infecções mistas são muito freqüentes em campos após o plantio (FABRE et al., 2010). Desta forma, este estudo permitiu identificar a distribuição dos vírus PRSV-W, ZYMV, WMV, CMV e ZLCV nas regiões produtoras de melancia no Estado do Tocantins. Tais informações poderão, por exemplo, ajudar no estudo do melhoramento genético para a obtenção de cultivares comerciais de melancia resistentes ou tolerantesas viroses identificadas, a fim de garatir a produtividade da melancia no Estado do Tocantins. 5. CONCLUSÃO O vírus PRSV-W foi predominante nas regiões produtoras de melancia no Estado do Tocantins, onde também foram encontrados ZYMV, WMV, CMV e ZLCV. A ocorrência de infecção mista foi predominante para PRSV-W+WMV e PRSVW+ZLCV, porém infecções do tipo ZYMV+ZLCV e ZLCV+CMV foram menos expressivas nas amostras analisadas. 63 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMAKU, M.; BURATTINI, M. N.; COUNTINHO, F. A. B. & MASSAD, E. Modeling the competition between viruses in a complex plant–pathogen system. Phytopathology. v. 100, p. 1042-1047. 2010. ANDERSON, P. K.; CUNNINGHAM, A. A.; PATEL, N. G.; MORALES, F. J.; EPSTEIN, P. R. & DASZAK, P. Emerging infectious diseases of plants: pathogen pollution, climate change and agrotechnology drivers. Trends in Ecologycal and Evolution. v. 19, p. 535-544. 2004. BANTTARI, E. E. & GOODWIN, P. H. Detection of potato viruses S, X and Y by EnzymeLinked Immunosorbent Assay on Nitrocellulose Membrane (Dot-ELISA). Plant Disease. v. 69, p. 202-205, 1985. CRUZ, C. D. Programa Genes: Análise multivariada e simulação. Editora UFV. Viçosa (MG), p. 175. 2006. DAVINO, S.; NAPOLI, C.; DAVINO, M. & ACCOTTO, G. P. 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Plant Disease, St. Paul, v.84, n.5, p.516-520, 2000. 67 CAPITULO III: Identificação de viroses associadas à cultura da melancia por meio de RT-PCR do tipo multiplex. RESUMO Potyvírus e tospovírus infectam naturalmente melancia, podendo ocorrer em infecções mistas, dificultando o diagnostico em multiplas infecções. O trabalho teve objetivo de identificar e diferenciar WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV pelo método de RT-PCR multiplex. Os oligonucleotídeos confeccionados para detectar e diferenciar os vírus WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV foram obtidos a partir das regiões conservadas dos genomas dos vírus, permitindo assim a amplificação das regiões conservadas em reação de RT-PCR, a partir dos cDNA obtidos. Os produtos amplificados foram de 644 pb (CMV), 535 pb (WMV-2), 398 pb (PRSV-W), 244 pb (ZLCV) e 214pb (ZYMV). Nas reações do tipo duplex as combinações dos oligonucleotideos foi possível diferenciar os vírus WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV. Em todas as reações os oligonucleotidicos utilizados não apresentaram amplificações inespecíficas. Para reações tipo triplex obteve-se somente a amplificação de 535 pb correspondente ao vírus WMV-2, isto pode estar relacionado com a otimização da reação de PCR, a competição e/ou sobreposição entre os oligonucleotídeos na detecção dos vírus em estudos. As detecções múltiplas de vírus desenvolvidas neste trabalho podem reduzir o custo e trabalho na detecção e diferenciação dos vírus. Os oligonucleotídeos desenvolvidos permitem a rápida detecção e diferenciação isolada de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV presentes nos cultivos de melancia no estado do Tocantins. Palavra chave: Melancia, RT-PCR, potyvírus, tospovírus. 68 Identification of Viruses Associated with the Watermelon crops by multiplex RT-PCR. ABSTRACT Watermelon infecting naturally potyvirus and tospovirus can occur in mixed infections, difficulting the diagnosis of multiple infections. Thus, this study was to identify and differentiate WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV and ZLCV by multiplex RT-PCR. The oligonucleotides prepared to detect and differentiate viruses WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV and ZLCV were obtained from the conserved regions of the genomes of viruses, allowing the amplification of conserved regions in RT-PCR reaction from the cDNA obtained. The amplified products were 644 bp (CMV), 535 bp (WMV-2), 398 bp (PRSV-W), 244 bp (ZLCV) and 214pb (ZYMV). In the reactions of the type combinations of the duplex oligonucleotides was possible to differentiate viruses WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV and ZLCV. In all reactions the oligonucleotides used did not show nonspecific amplifications. For triplex type reactions were obtained only the amplification of 535 bp corresponding to WMV2 virus, this may be related to the optimization of the PCR reaction, competition and / or overlap between the oligonucleotides in the detection of viruses in studies. The multiple detections of viruses developed in this work can reduce the cost and work in the detection and differentiation of viruses. The oligonucleotides designed to allow rapid detection and differentiation isolated from PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV and ZLCV presnet in watermelon crops in the state of Tocantins. Keywords: Watermelon, RT-PCR, Potyvirus, Tospovirus. 69 1. INTRODUÇÃO As viroses são consideradas umas das principais causas de perdas na cultura da melancia, podendo reduzir substancialmente a produtividade, tanto quantitativa como qualitativamente. Os vírus da família potyvírus e tospovírus possuem RNA simples, com genoma de aproximadamente de 10 kb (VAN POELWIDJK, 1993; LUCINDA, 2010). O RNA dos potyvírus produzem uma proteína codificada pelo próprio vírus conhecida como VPg (Viral protein Genome-linked), ligada covalentemente à extremidade 5‟ e uma cauda poli-A ligada a extremidade 3‟ do RNA que está envolvida na proteção do RNA contra exonucleases da célula hospedeira (BERGER et al., 2005). O genoma destes vírus são envolvidos por capsídeos, de formato alongado e flexuoso, constituído por aproximadamente 2.200 cópias de uma proteína capsidial com massa molecular em torno de 34 kDa (SHUKLA et al., 1991). Estes vírus apresentam ampla distribuição mundial, cosntituindo problemas sérios para a produção de curcubitáceas em diversos sistemas de cultivos. As infecções podem ocorrer de forma simples ou mistas (PAPPU, JONES & JAIN, 2009; LUCINDA, 2010). Como forma de controle, o uso de variedades resistentes é o método mais eficiente, mesmo com o uso rotineiro de medidas preventivas de controle, a ocorrências de surtos viróticos sempre é uma problemáticas nas lavouras de melancia (DIVER, KUEPPER & BORN, 1999; BETTIOL et al., 2004). A sintomatologia das infecções virais são muito parecidas e de difícil diagnóstico, além disso, infecções mistas apresentam sintomas diferenciados, aliando outros problemas na identificação dos vírus presentes em infecções naturais (WILSON, 2001). Os vírus que infectam cucurbitáceas são de difícil diagnóstico, principalmente potyvírus como Watermelon mosaic virus (WMV), Papaya ringspot virus – strain Watermelon (PRSV-W), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Cucumber mosaic virus (CMV) e o tospovírus Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), todos produzindo sintomas de mosaico nas folhas quando encontrados em infecções simples. Estes vírus são geralmente diferenciados por testes sorológicos do tipo ELISA “enzyme-linked immunosorbent assay”, embora os anticorpos sejam dirigidos contra a região central conservada do CP, eles podem apresentar reações cruzadas (SHUKLA et al., 1989). Procedimentos que permitem a detecção simultânea e/ou identificação de diferentes vírus são desejáveis para o diagnóstico de rotina na identificação dos vírus de cucurbitáceas, pois requerem menos tempo, trabalho e custos. Vários sistemas multiplex foram 70 desenvolvidos para a detecção de múltiplos vírus (POZO & TENORIO, 1999; NIE & SINGH, 2000; VARGA & JAMES, 2005; ROY et al., 2005; HASSAN, MYRTA & POLAK, 2006; RIGOTTI & GUGERLI, 2007; ELIZAQUÍVEL & AZNAR, 2008; WEI T. et al., 2009; XIE Y. et al., 2009; SHUM & PAUL, 2009; JAROSOVA & KUNDU, 2010; WINTERMANTEL & HLADKY, 2010; BAI, SHI & NAGARAJA, 2010; KUWABARA et al., 2010; SENAPIN et al., 2010). O diagnóstico baseado em transcriptitase reversa de reação em cadeia polimerase (RT-PCR), tem permitido a vantagem de analisar a variação genética nos genomas dos vírus (WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV), essas características são alvo de diferenciação e identificação dos vírus mesmo em infecções cruzadas. Conforme resultados descritos na literatura, a identificação de vírus utilizando RT-PCR com primers específicos tem sido amplamente utilizada para detectar vírus associados a diferentes culturas de importância enconomica no mundo (NIE & SINGH, 2000; BOONHAM et al., 2002; VARGA & JAMES, 2005; HASSAN, MYRTA & POLAK, 2006; AGINDOTAN, SHIEL & BERGER, 2007; RIGOTTI & GUGERLI, 2007; ELIZAQUÍVEL & AZNAR, 2008; XIE Y. et al., 2009; JAROSOVA & KUNDU, 2010; WINTERMANTEL & HLADKY, 2010; KUWABARA et al., 2010). O trabalho tem o objetivo efetuar a identificação simples e múltipla pelo método de RT-PCR des fitoviroses associadas à cultura da melancia no Estado do Tocantins. 2. MATERIAL e MÉTODOS Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Manejo Integrado de Pragas do Campus Universitário de Gurupi – Universidade Federal do Tocantins (UFT), de Janeiro de 2009 a Janeiro de 2011. 2.1. Vírus Os vírus Papaya ringspot virus – strain Watermelon (PRSV-W), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Watermelon mosaic virus (WMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) foram obtidos juntamente a Embrapa CNPH e Universidade de Brasília (UnB), cedidos gentilmente pela Dra Mirtes Lima e Dr. Tatsuya Nagata. Todos os vírus foram mantidos em casa de vegetação em Cucurbita pepo, Nicotina benthamiana e Datura stramonion por inoculação mecânica, com adição do tampão de fosfato 71 potássio (K2HPO4) 0,01 M, pH 7,0 e 0,1 % de sulfito de sódio (Na2SO3), por fricção suspensão viral sobre as folhas cotiledonares, previamente polvilhadas com pó abrasivo Carbureto de silício (carborundum), 400 mesh. Para cada espécie de vírus foram realizadas duas inoculações, sendo a segunda realizada três dias após a primeira. 2.2. Extração de RNA total A extração do RNA total de folhas das plantas de melancia com sintomas dos vírus PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV foi realizada utilizando-se o produto Plant RNA Purification Reagent (Invitrogen life technologies, USA), de acordo com o protocolo do fabricante. Foram macerados 100 mg de tecido em nitrogênio líquido e transferidos para tubos de microcentrífuga, juntamente com 500 μL do reagente gelado (4° C) e homogeneizados em vórtex. Em seguida, os tubos foram deixados à temperatura ambiente por cinco minutos. Após esse período, o material foi submetido à centrifugação por dois minutos, à temperatura ambiente, com velocidade de 12.000 RPM, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Na seqüência foram adicionados 300 μL de clorofórmio e os tubos foram submetidos à inversão por 5 minutos. Para separar as fases, as amostras foram submetidas à centrifugação de 12.000 RPM, durante dez minutos, à temperatura de 4° C, e a fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo. Em seguida, foi adicionado um volume equivalente à fase aquosa de isopropanol gelado e homogeinizados em vórtex, durante cinco segundos. As amostras foram mantidas à temperatura ambiente por dez minutos e posteriormente submetida à centrifugação por dez minutos a 4° C e 12.000 RPM. O sobrenadante foi descartado, e o pellet foi lavado com 1 mL de etanol 75% gelado e os tubos foram submetidos à centrifugação por 1 minuto à temperatura ambiente (12.000 RPM). O líquido residual foi pipetado e o RNA foi ressuspendido em 20 μL de água Milli-Q autoclavada. As amostras foram armazenadas a -20° C e utilizadas na confecção do cDNA. 2.3. Confecção do cDNA O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir do RNA total extraído das folhas das plantas infectadas com os vírus em estudos, nos procedimentos descritos no item anterior. Na confecção do cDNA foi realizada os seguintes procedimentos, inicialmente 3µl de suspensão de RNA total, diluído em água “Milli-Q” previamente tratada com 0,1% de dietil pirocarbonato (DEPC), foram misturados com 1µl do oligonucleotídeo randômico 72 (NNNNNNN) (20mM). Posteriormente, foram adicionados 1µl de dNTP‟s (10mM) e 12µl de água “Milli-Q” tratada com DEPC. Essa solução foi aquecida a 65ºC por 5 minutos e mantida imersa em gelo por 3 minutos. Em seguida foram adicionados 5µl do tampão 5X de enzima transcriptase reversa, 2µl de ditiotreitol (DTT) 0,1M e 200 unidades da enzima M-MLV (Invitrogem), e incubada a 37ºC por 50 minutos, após foi inativada a enzimas a 70ºC por 15 minutos e mantida a 4 oC. O cDNA sintetizado foi utilizado em uma reação de PCR, separadamente para cada fragmento do genoma a ser amplificado. 2.4. Reação de RT-PCR do tipo monoplex A partir da confecção do cDNA foram realizadas reações de PCR, utilizando os oligonucletídeos desenvolvidos para detecção dos vírus (PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CMV e ZLCV). Além do cDNA, foram utilizados 0.4 µM de cada oligonucleotídeos específicos para cada vírus (Tabela 1), 10 µM de cada dNTP, 2,5 μL de tampão de Taq DNA polimerase, 2mM MgCl2 e 1U de Taq polimerase (Invitrogen) em um volume total de 25 μL. A amplificação dos fragmentos para a detecção dos vírus foi realizada de acordo com os seguintes passos: 94 oC/5 min em seguida por 35 ciclos em 95 oC/30 s, 52 oC/1,30 s, 72 oC/4 min e a extensão final de 72oC/8 min. Os oligonucleotídeos PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CMV e ZLCV anelam-se na região 5' do genoma de cada vírus (figura 1). 2.5. Otimização para reação de RT-PCR do tipo duplex e triplex Algumas modificações foram realizadas a fim de aperfeiçoar a amplificação para a reação de RT-PCR de dois e três vírus simultâneos. A quantidade de cDNA foi alterada para 0,8µl, foram utilizados 0,5 µM de cada oligonucleotídeos específicos para cada vírus, 2,0µl na concentração de 2,5 µM de cada dNTP, 1,0µl na concentração de 50mM de MgCl2, em um volume total de 25 μL. 2.6. Análise do RT- PCR em gel de agarose Foram retirados 5µl da reação de RT-PCR ou PCR para análise em gel de agarose a 1% em tampão TBE (0,1 M de ácido bórico, 0,02 mM EDTA pH 8,3). Utilizou-se o marcador 1kb Ladder da Invitrogen. O gel foi corado em uma solução de Brometo de Etídio (0,1 μL/ mL) a eletroforese a 80V., e assim, visualizado em transiluminador de luz UV( Molecular Imange LPIX-Locus Biotecnologia®). 73 2.7. Análise das seqüências e oligonucleotídeos Foram obtidas seqüencias correspondente aos genomas dos vírus PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV depositadas no GenBank e mantindas pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI), para confecções dos oligonucleotídeos específicos para cada um dos vírus (Tabela 2). As seqüências foram alinhadas utilizando as facilidades do programa de alinhamento multiplo de seqüencias CLUSTAL W (HIGGINS & SHARP, 1988 e 1989). A partir do alinhamento verificou-se as regiões conservadas em cada genoma dos vírus em estudo. A partir destas observações foi possível determinar as regiões dos genomas a ser amplificadas pelos oligonucleotídeos desenvolvidos para cada um dos vírus (Figura 1). A partir da determinação das seqüências dos oligonucleotídeos verificou-se a uniformidade da temperatura de anelamento nas reações de PCR. 3. RESULTADOS As seqüências utilizadas na confecção dos oligonucleotídeos foram obtidas a partir das regiões conservadas daz seqüências de WMV, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV, depositadas GenBank, e posteriormente foram confeccionados as seqüências dos oligonucleotídeos específicos para os vírus em estudos (Tabela 1). Além disso, verificaram-se as regiões conservadas do genoma que melhor permitia a diferenciação entre os vírus, de acordo com os fragmentos a serem amplificados em reações de RT-PCR. As regiões dos genomas mais conservadas para desenvolver os oligonucleotideos dos vírus PRSV-W, ZYMV e WMV corresponde a região da capa protéica (Figura 1). 74 Tabela 1. Listas de acessos das seqüências utilizadas na confecção dos oligonucletotídeos utilizados nas reações de RT-PCR para identificação de WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV. Vírus WMV Referência das seqüências Número de acessos Desbiez, C. & Lecoq, H., 2004. NC006262 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2004. AY437609 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660588 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660584 Ali, A.; Natsuaki, T. & Okuda, S., 2006. AB218280 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660579 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660590 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660578 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660589 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660582 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660587 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660580 Wu, Y. F. et al., (submetido em 2006). DQ399708 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660586 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660583 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660581 Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008. EU660585 Choi, S. et al., 2007. AB369278 Liao, Y. C. et al., (submetido em 2005). DQ340771 Sohn, S. et al., 2007. AB369277 Liao, Y. C. et al., (submetido em 2005). DQ340770 Liao, Y. C. et al., (submetido em 2005). DQ340769 Liu, F. L. et al., (submetido em 2001) e Wang, J. J. & Yeh, S. D (Submetido em 2002). AY027810 X97251 Wang, J. J. & Yeh, S. D, 1997. Chen, K. C. et al., (submetido em 2008). 75 EU882728 PRSV-W Charoensilp, G. et al., (submetido em 2002). AY162218 Lu, Y. W. et al., 2008. EF183499 Attasart, P. et al., 2002. AY010722 Wang, J. J.; Bau, H. & Yeh, S., 1994. NC_001785 Wang, J. J.; Bau, H. & Yeh, S., 1994. X67673 Guan, P. et al., (submetido em 2007). EU126128 Noa-Carrazana, J. C.; Gonzalez-de-Leon, D. & Silva-Rosales, L., 2007. Inoue-Nagata, A. K. et al., 2007. DQ374153 Inoue-Nagata, A. K. et al., 2007. DQ374152 Mangrauthia, S. K.; Parameswari, B.; Jain, R. K. & Praveen, S., 2008. Parameswari, B.; Mangrauthia, S. K.; Praveen, S. & Jain, R. K., 2007. EU475877 EF017707 Lopez, C.; Aramburu, J.; Galipienso, L. & Nuez, F., 2007. AM183116 Roossinck, M. J.; Zhang, L. & Hellwald, K. H., 1999. AF127977 Owen, J. et al., 1990. NC001440 Owen, J. et al., 1990. D10538. Owen, J. et al., 1990. D10539 Sulistyowati, E. et al., (submetido em 2003). Hayakawa, T.; Mizukami, M.; Nakajima, M. & Suzuki, M., 1989. 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Oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas reações de RT-PCR para detecção do tospovirus (ZLCV) e dos potyvirus (WMV, ZYMV, CMV, PRSV-W). Primer Forward (Senso) Reverse (Anti-senso) Tamanho esperado (Pb) Temperatura de anelamento (ºC) PRSV 5'TGGGTTATGATGGATGGGGA3' 5'ATACCCAGGAGAGAGTGCAT3' 398 55,5 - 55,1 ZYMV 5'CATACATGCCGAGGTATGGTTT3' 5'GTGTGCCGTTCAGTGTCTT3' 214 55,0 - 55,6 WMV 5'TTRTTGTTGAATGCTGTCCT3' 5'GCTGCACAAATTGCCTCAG3' 535 52,6 - 55,1 CMV 5'ACTNTTAACCACCCAACCTT3' 5'TTAGCCGTAAGCTGGATGGA3' 644 53,6 - 55,8 ZLCV 5'GAGTTTCACTGTAATGTTCCATAGC3 ' 5'AGYTTTGAGATGATCAGTGTTGT3' 244 53,9 - 52,5 *Nucleotídeos em posições degeneradas são representados por uma única letra do código. R = A e G, Y= C e T; B = C, G e T, D = A, G e T, N = G, A, C e T. Os oligonucleotídeos desenvolvidos para a diferenciação rápida de WMV, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV, foram desenhados com iniciadores degenerados e universais. E embora a seqüência dos oligonucleotídeos tenha tamanhos variados para cada vírus analisados, que permite analisar a detecção e diferenciação dos vírus (Tabela 2 e Figura 1 e 2). A análise dos oligonucleotídeos foi necessária para eliminar e/ou minimizar as amplificações não-específicas que podem ocorrer em amplificações com duplos e triplos cDNA‟s. Conforme os resultados obtidos, todos os oligonucletídeos apresentaram amplificação de fragmentos específicos para o vírus que foram desenvolvidos. 77 Figura 1. Representação esquemática da organização genômica de um Potyvirus, mostrando suas proteínas. Os números abaixo do genoma indicam o início de cada região, adaptado de Lucinda et al., 2010. Figura 2. Posição e direção dos oligonucleotídicos usados para identificação e detecção de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV por RT-PCR e tamanho esperado dos fragmentos amplificados (bp) correspondentes a região do genoma a ser amplificado. Os oligonucletídeos desenhados para identificação de PRSV-W foi confirmado, com o produto específico amplificado de aproximadamente 398 pb (Figura 3), idêntico ao previsto durante o desenvolvimento do primer. Além do mais, diferiu dos demais produtos amplificados de WMV, ZYMV, CMV e ZLVC, confirmando a alta especificidade para 78 PRSV-W. Enquanto os primers desenhados para CMV e WMV apresentaram amplificações de produtos idênticos a região do genoma analisados com 644 e 535pb, respectivamente, sendo específicos para detecção e diferenciação dos vírus correspondentes (Figura 3). Figura 3. Reação de RT-PCR com oligonucleotídeos desenvolvidos para detecção e diferenciação dos vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV. A figura de gel de agarose a 0,8% mostra: M. Marcador molecular de 1Kb Ladder; 1.CMV; 2.WMV; 3.PRSV-W; 4.ZLCV; 5.ZYMV. Os oligonucleotídeos desenvolvidos para identificação de ZYMV e ZLCV apresentaram os fragmentos esperados (Figura 3). No entanto, não permitiu diferenciar os produtos amplificados em gel de agarose 0,8%. Neste caso, os oligonucleotídeos desenvolvidos apresentaram especificidade para os vírus ZYMV e ZLCV, mas não permitiram uma diferenciação dos produtos amplificados na reação de RT-PCR (214 e 244 pb), Não possibilitando a detecção e diferenciação entre os vírus quando visualisados juntos (Figura 4, nº 4 e 5). Desta forma, observa-se que os oligonucleotídeos desenvolvidos para CMV, WMV e PRSV-W foram melhores na detecção e diferenciação dos vírus em gel de agarose 0,8% (Figura 4, nº 1, 2 e 3). 79 Na reação de RT-PCR utilizando combinações duplas (duplex) de oligonucleotídeos para detecção e diferenciação dos vírus em estudos, houve aplicação dos fragmentos esperados para todas as combinações utilizadas (Figura 4). PRSV-W e WMV-2 apresentaram a aplificação dos fragmentos de tamanho esperado, ficando bem distinto a detecção e a diferenciação dos vírus. O mesmo foi observado para a combinação dos oligonucleotídeos de WMV + ZYMV, PRSV-W + WMV, ZLCV + WMV, CMV + PRSV-W, CMV + ZYMV e PRSV-W com ZLCV, sendo possível a identificação e diferenciação. Os oligonucleotídeos desenhados para detecção de ZYMV e ZLCV não permitiram uma diferenciação dos produtos amplificados em reação de duplex, devido a proximidade do número de pares de bases dos mesmos (Figura 4, nº 1, 3, 4 e 6 ). Figura 4. Reação de RT-PCR com oligonucleotídeos desenvolvidos para detecção e diferenciação dos vírus PRSV-W, ZYMV, WMV-2, CMV e ZLCV em reação duplex e triplex. A figura mostra um gel de agarose a 0,8%, onde: M. Marcador molecular de 1Kb Ladder; 1. WMV + ZLCV; 2. WMV + PRSV-W; 3.WMV + ZYMV; 4.PRSV-W + ZYMV; 5.CMV + PRSV-W; 6.PRSV-W + ZLCV; 7.WMV + ZYMV + PRSV-W; 8. WMV + CMV + ZLCV e 9. WMV- + CMV + PRSV-W. 80 Nas reações realizadas de Triplex, ou seja, na combinação de três pares de oligonucleotídeos em reação direta de RT-PCR houve aplificação somente do WMV-2 (Figura 4, nº 7, 8 e 9). Neste caso, verifica-se a necessidade de realizar uma melhor otimização da reação de RT-PCR para triplex. O fato da amplificação dos oligonucletídeos relacionados a WMV-2 podem estar associadas a competição e sobreposição entre os oligonucleotídeos, diminuindo assim a possibilidade de amplificação dos fragmentos esperados para detecção dos vírus em estudos. 4. DISCUSSÃO A cultura da melancia é acometida por um complexo viral que influência diretamente sua produtividade. Vários destes patogenos possui seus genomas completo ou parcialmente seqüênciados e estão disponíveis no GenBank. Os vírus WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV são comumente encontrados infectando cucurbitáceas em diferentes áreas de cultivos (YUKI et al., 2000; STANGARLIN, DIAS & REZENDE, 2000; STANGARLIN et al., 2001; MOURA et al., 2001). A ocorrência simultânea dessas viroses dificulta a identificação por meio da sintomatologia, principalmente em infecções multiplas de ocorrência natural (FABRE et al., 2005). O desenvolvimento de um oligonucleotídeos para a detecção e diferenciação eficaz de WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV, torna-se viável devido a ocorrência natural destes vírus em infecções multiplas. A amplificação específica de vírus alvo é dependente dos oligonucleotídeos desenvolvidos para as regiões do genoma analisadas (PAYAN et al., 2007). As seqüências genômicas são diversas, portanto, oligonucleotídeos devem ser projetados para reconhecer as regiões conservadas de cada vírus durante as reações do tipo duplex, triplex e multiplex, permitindo assim, a detecção simultânea dos vírus (AUSUBEL, 1995; FAYADANDRÉ, 2010). Os oligonucleotídeos utilizados neste estudo têm o potencial de detectar e diferenciar todos os vírus alvos que atacam a cultura da melancia no estado do Tocantins. Os resultados revelaram que os oligonucleotídeos utilizados foram capazes de detectar e diferenciar os vírus pelos produtos amplificados durante o RT-PCR tipo duplex. Para os vírus ZYMV e ZLCV não foi possível uma identificação visual, devido ao tamanho dos fragmentos serem muito proximos uns dos outros (214 e 244pb), respectivamente. Isso pode ter ocorrido devido a escolha das regiões conservadas dos genomas apresentarem 81 aproximadamente o mesmo tamanho. Os fragmentos de PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV-2 e ZLCV poderiam ser melhor amplificados, otimizando-se as concentrações do primers. Nas reações de RT-PCR do tipo Triplex, houve somente a amplificação de WMV-2. A interação entre o par de iniciadores WMV-2 e outros pares de oligonucleotídeos correspondentes para os demais vírus não apresentaram amplificação dos fragmentos esperados. A falta de amplificação dos fragmentos de DNA esperados para os vírus na reação de Triplex pode esta associado a falta de otimização das reações de RT-PCR do tipo Triplex. A concentração de oligonucleotídeos, dNTP‟s, Clorteto de magnésio, entre outros produtos na reação de RT-PCR podem influenciar na reação e nos produtos a ser amplificados, logo, existe a necessidade de uma otimização usando concentrações mais oportunas dos resgentes citados acima para uma melhor amplificação dos oligonucleotídeos (KARSAI et al., 2002; AREZI et al., 2003). Inúmeras otimizações já foram realizadas pela variação metódica de cada parâmetro de teste em condições normais de RT-PCR do tipo Multiplex sendo descritas por Henegariu et al. (1997), Lekanne Deprez et al. (2002) e Arezi et al. (2003). Estas condições incluíram vários “hot-start” de enzimas como DNA polimerase, Taq DNA polimerase Platinum® (alta fidelidade), DNA polimerase Platinum da Invitrogen, e DNA polimerase iTaqTM da BioRad (Mississauga, Ontario). Também foram avaliados por Karsai et al. (2002) tampões como PCR Karsai, Tampão de PCR 10X de alta fidelidade da Invitrogen, Tampão de amplificação 10X da Invitrogen, e Tampão de PCR 10X iTaqTM da BioRad. Concentrações de oligonucleotídeos em ambos os passos de RT; concentração de cDNA na reação de PCR (diluições de 1:3, 1:4, 1:5 e 1:6 em H2O estéril duplamente destilada); MgCl2 contra MgSO4; e duas etapas de PCR (desnaturação a 95 ºC por 15s à 3 min, com extensão a 55-60 ºC durante 10-60 s) versus três etapas PCR (desnaturação a 95 ºC por 15s à 3 min, anelamento a 55-60 ºC durante 20-30s, e extensão a 72 ºC durante 20-30s). Onde os melhores resultados foram obtidos a uma temperatura de anelamento de 55 ºC com 35 ciclos. Estudos mostraram que em reações de PCR do tipo multiplex, as concentrações de dNTP‟s e magnésio podem ser aceitáveis quando nenhum componente é excessivamente concentrado. Além disso, baixas concentrações de dNTP (50 M) pode reduzir o rendimento dos produtos amplificados, enquanto altas concentrações pode inibir a amplificação, possivelmente devido a o seqüestro de íons de magnésio (HENEGARIU et al., 1997), impedindo que ele seja utilizado pela Taq polimerase (INNIS & GELFAND, 1990). 82 Geralmente é conveniente aumentar MgCl2 em uma reação como os níveis de dNTP‟s são aumentadas para evitar seqüestro de íons Mg2+. No entanto, aumentar as concentrações de MgCl2 tende a diminui a especificidade de uma reação. Conseqüentemente, as concentrações de MgCl2 equilibradas, podem influenciar na concentração padrão de dNTP‟s e do tampão da Taq polymerase. Para facilidade de operação, reações de multiplex que contém 200mM de dNTP‟s e 1,5 µM MgCl2, foram eficazes na amplificação dos produtos desejados e sem amplificação de seqüências não-alvos (WINTERMANTEL & HLADKY, 2010). Diversos estudos de multiplex foram desenvolvidos para identificação e diferenciação simultânea de fitoviroses em citrus Badnavirus [Citrus yellow mosaic virus (CYMV)], Capillovirus [Citrus tatter leaf virus (CTLV)], Closterovirus [Citrus tristeza virus (CTV)], Ilarvirus [Citrus leaf rugose virus (CLRV), Citrus variegation virus (CVV)], Mandarivirus [Indian citrus ringspot virus (ICRSV)] e Ophiovirus [Citrus psorosis virus (CPsV)]. (MINAFRA & HADIDI, 1994; NEMICHOV et al., 1995; SINGH et al., 1996; JACOBI et al., 1998; GRIECO & GALLITELLI, 1999; RUSSO et al., 1999; JAMES, 1999; SAADE et al., 2000; SHARMAN et al., 2000; BERTOLINI et al., 2001; ITO, IEKI & OZAKI, 2002; MENZEL et al., 2002; RAGOZZINO, FAGGIOLI & BARBA, 2004; ROY et al., 2005). Diferentes reações de Multiplex RT-PCR foram desenvolvidos para identificar potyvírus como para PYV (Potato virus Y ) em batata e Sugarcane mosaic virus (SCMV), Sorghum mosaic virus (SrMV) e Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) em cana de açucar (RIGOTTI & GUGERLI, 2007, SEIFERS et al., 2000; SCHENCK, 2001; XU et al., 2005; CHATENET et al., 2005; GEMECHU et al., 2006; AHMAD et al., 2006; VISWANATHAN et al., 2008). Além de potyvírus as reações de multiplex foram eficientes na diferenciação de tospovirus como descrito por Tsuda et al. (1994), Kawano et al. (1999) e Matsuura et al. (2002) para Tomato spotted wilt virus (TSWV), Watermelon silver mottle virus (WSMoV) em melancia e espinafre da New Zealand (IWAKI et al., 1984; TABA et al., 2000); Melon yellow spot virus (MYSV) em melão e abobora (MUMFORD, BARKER & WOOD, 1996; KATO, HANADA &KAMEYA-IWAKI, 1999; TAKEUCHI et al., 2001; CHU et al., 2001; NICHOL et al., 2005). A detecção de vírus por técnicas rápidas e confiáveis ainda é uma das tarefas mais exigentes em virologia vegetal. O panorama atual da cultura da melancia no Brasil e no mundo revela a necessidade de medidas preventivas de controle. O desenvolvimento de uma metodologia de indexação eficiente, sensível e rápida, permitiria a pronta identificação de plantas infectadas com estirpes virais já existentes no território nacional. Conseqüentemente, 83 tal medida diminuiria a possibilidade de perdas na produtividade da cultura da melancia em função de infecção viral simples ou mistas. 5. CONCLUSÃO Os oligonucleotídeos desenvolvidos neste trabalho permitem a rápida detecção e diferenciação isolada de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV presentes nos cultivos de melancia no estado do Tocantins. A especificidade dos oligonucleotídeos permite desenvolver estudos epidemiológicos, de distribuições espacial e temporal dos vírus em estudo. 84 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALI, A.; NATSUAKI, T. & OKUDA, S. 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