ERICA MILENA DE CASTRO RIBEIRO DESENVOLVIMENTO DE

ERICA MILENA DE CASTRO RIBEIRO
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA DE DIAGNÓSTICO DE DENGUE
UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DE OURO
Ouro Preto, MG
Março (2015)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA DE DIAGNÓSTICO DE DENGUE
UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DE OURO
AUTOR: Erica Milena de Castro Ribeiro
ORIENTADOR: Prof. Dr. Breno de Mello Silva
Dissertação submetida ao programa de PósGraduação do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Biotecnologia, área de
concentração: Biotecnologia aplicada a
saúde humana e animal.
Ouro Preto, MG
Março (2015)
Ribeiro, E.M.C.
Catalogação
ii
Ribeiro, E.M.C.
Catalogação
iii
Ribeiro, E.M.C
Laboratório/Auxílio
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos –
ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
iv
Ribeiro, E.M.C.
Epígrafe
"Somos feitos de uma estranha mistura de ácidos nucleicos e de memórias, de sonhos e
de proteínas, de células e de palavras."
François Jacob
v
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Eva e Walter agradeço por todo esforço, carinho e dedicação de sempre.
E aos meus irmãos Thiago e Lorena pelo apoio, incentivo e torcida.
Ao Prof. Dr. Breno de Mello Silva, pela oportunidade e orientação durante o
desenvolvimento do mestrado.
À toda equipe do LBTM, em especial a Ana Claudia, Cyntia, Paola e Zé pelo
companherismo, ajuda e incentivo.
Aos laboratórios do NUPEB, pela permissão e ajuda no uso de diversos equipamentos.
À Universidade Federal de Ouro Preto por todas as oportunidades oferecidas.
Aos professores Luiz Orlando Ladeira e Cristiano Fantini Leite e aos alunos
Anderson Caires de Jesus e Alice Freitas Versiani pela parceria e conhecimento
compartilhado.
À CAPES pelo apoio financeiro.
À todos aqueles que, de alguma forma, auxiliaram para o desenvolvimento e conclusão
deste trabalho.
vi
RESUMO
A Dengue é transmitida pelo mosquito Aedes Aegypti e é causada pelo Dengue
vírus da família Flaviviridae. É conhecida como a arbovirose mais importante da
atualidade, colocando aproximadamente metade da população mundial em áreas de
risco iminente de transmissão. A ausência de vacinas eficazes e tratamentos específicos
pra Dengue tornam necessário um diagnóstico precoce e preciso para esta doença,
possibilitando assim, a clínica adequada e oportunas intervenções para prevenir a
morbidade grave e a mortalidade. Neste contexto, novos materiais com propriedades
químicas e físicas peculiares, tais como nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido
utilizadas como biomarcadores. Estas nanopartículas têm propriedades físico-químicas
únicas, tal como a oscilação coletiva dos elétrons chamada de ressonância plasmônica,
que podem ser facilmente ajustadas. Assim, a detecção de biomoléculas como proteínas
e anticorpos ligados às AuNPs pode ser feita a partir do seu espectro de absorção. Dessa
forma, o objetivo deste estudo foi desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de
funcionalização de nanopartículas com anticorpos específicos anti-DENV e antiflavivirus e a ligação dos mesmos aos antígenos. Para isso, imunoglobulinas foram
purificadas por coluna de afinidade e, inicialmente, as nanopartículas de ouro (AuNPs)
foram testadas para determinação da melhor concentração de uso dos reagentes:
cisteamina (0,5mM) e polietilenoimina (0,3%) e de anticorpos (0,4µg/ml) a serem
utilizados. Os resultados foram analisados através da leitura de sua ressonância de
plasmon em espectrômetro de varredura UV-Vis e um deslocamento no comprimento
de onda foi observado a cada funcionalização, se comparado com AuNPs não
funcionalizados e caracterizados anteriormente. Quando as AuNPs foram incubadas em
solução com Dengue virus foi possível observar um forte deslocamento nos primeiros
minutos de contato. Mas quando incubados com Mayaro virus (Alfavirus) o
deslocamento foi observado apenas na presença de alta concentração do vírus, que não é
encontrada em amostras naturais, demonstrando a especificidade dos anticorpos
utilizados. Assim, sugere-se que as nanopartículas de ouro podem ser utilizadas para um
diagnóstico de baixo custo de produção e ser ainda mais rápido, preciso e prático que as
técnicas já existentes.
vii
Detection of Dengue from Gold Nanoparticles
Dengue is transmitted by the Aedes aegypti and it’s caused by Dengue virus of the
Flaviviridae family. It is known as the most important arboviral in present, with about
half of the population in areas of imminent risk of transmission. The absence of
effective vaccines and specific treatments to Dengue means an early and accurate
diagnosis of this disease is necessary, enabling appropriate and premature clinical
interventions to prevent serious morbidity and mortality. In this context, new materials
with unique chemical and physical properties, such as gold nanoparticles (AuNPs) have
been used as biomarkers. These nanoparticles have unique physicochemical properties,
such as collective oscillation of electrons, classified as a surface plasmon resonance
(SPR) which can be easily adjusted. Thus, the detection of biomolecules such as
proteins and antibodies bound to the AuNPs can be made from its absorption spectrum.
Therefore, the aim of this study was to develop and analyze the effectiveness of
functionalization methodologies of nanoparticles with anti-DENV and anti-flavivirus
specific antibodies and its connection to the antigens. For this, immunoglobulins were
purified by affinity column and initially the gold nanoparticles (AuNPs) were tested to
determine the best concentrations use of reagents: cysteamine (0.5mM) and
polyethyleneimine (0.3%) and antibodies (0,4μg / ml) to be used. The results were
analyzed by reading a plasmon resonance scanning UV-Vis spectrometer and a shift in
wavelength was observed in every functionalization when compared with nonfunctionalized AuNPs and previously characterized. When the AuNPs were incubated
in solution containing the Dengue virus a strong shift was observed within the first
minutes of contact. However, when incubated with Mayaro virus (Alphavirus)
displacement was observed only in the presence of high concentration of virus, which is
not found in natural samples, demonstrating the specificity of the antibodies used. Thus,
it is suggested that the gold nanoparticles can be used for a diagnosis of low production
cost and be faster, more accurate and convenient than the existing techniques.
viii
SUMÁRIO
Resumo .................................................................................................................................. VI
Abstract ................................................................................................................................. VII
Lista de figuras .....................................................................................................................
X
Lista de tabelas ....................................................................................................................... XI
1.
INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 2
1.1
A Dengue .......................................................................................................................... 2
1.1.1 Gênero Flavivirus ............................................................................................................. 2
1.1.2 Dengue virus ..................................................................................................................... 2
1.1.3. O vetor .............................................................................................................................. 7
1.1.4. Epidemiologia .................................................................................................................. 8
1.1.5. Manifestações clínicas .................................................................................................... 10
1.1.6. Diagnóstico da dengue .................................................................................................... 11
1.2
Nanotecnologia ............................................................................................................... 16
1.2.1 Nanopartículas de ouro ................................................................................................... 16
1.2.2 Ressonância de Plasmon de superfície localizada e outras propriedades ópticas .......... 18
1.2.3 Bioconjugação ................................................................................................................ 20
1.2.4 Toxicidade celular e Biocompatibilidade ....................................................................... 22
1.3
Biossensoramento .............................................................................................................23
1.3.1 Sensores baseados em Ressonância plasmônica de superfície (SPR) ............................ 23
2.
JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 25
3.
OBJETIVOS ................................................................................................................... 28
3.1
Objetivo Geral ................................................................................................................ 28
3.2
Objetivos Específicos ..................................................................................................... 28
4.
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 30
4.1
Células ............................................................................................................................ 30
4.2
Vírus ............................................................................................................................... 30
4.3
Imunoglobulinas ............................................................................................................. 31
4.3.1 Indução da produção ....................................................................................................... 31
4.3.2 Concentração (Viva Spin®) ............................................................................................. 32
4.3.3 Purificação ...................................................................................................................... 32
4.3.4 Quantificação .................................................................................................................. 32
4.3.5 Verificação da eficiência da purificação ........................................................................ 33
ix
4.4
Nanopartículas de Ouro .................................................................................................. 34
4.4.1 Biofuncionalização ......................................................................................................... 34
4.4.2 Ligação com Cisteamina ................................................................................................ 35
4.4.3 Ligação com Polietilenoimina (PEI) .............................................................................. 35
4.4.4 Imunoglobulinas ............................................................................................................. 36
4.4.5 Ensaios com DENV ........................................................................................................ 36
4.4.6. Análise em UV-Vis ........................................................................................................ 37
4.4.7. Tratamento dos dados ..................................................................................................... 37
4.4.8. Leitura de Potencial Zeta ................................................................................................ 37
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 39
5.1
Purificação de anticorpos monoclonais por coluna de afinidade ................................... 39
5.2
Análise da concentração de ligante ................................................................................ 40
5.3
Definição da concentração de anticorpos ....................................................................... 42
5.4
Determinação do tempo de detecção .............................................................................. 46
5.5
Análise de sensibilidade e especificidade ..........................................................................48
6.
CONCLUSÕES .............................................................................................................. 54
7.
PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 56
8.
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 57
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura da partícula viral de Dengue vírus..................................................................3
Figura 2. Ciclo de multiplicação de DENV.................................................................................. 5
Figura 3. Evidencia Global, risco e ônus da dengue em 2010…………………………………10
Figura 4. A estrutura da proteína E de dengue........................................................................... 14
Figura 5. Propriedades ópticas de nanobastões de ouro ajustadas por alteração na relação de
aspecto.......................................................................................................................................... 19
Figura 6. Métodos de bioconjugação de nanopartículas de ouro................................................ 21
Figura 7. Cisteamina. Fórmula química...................................................................................... 35
Figura 8. Polietilenoimina. Fórmula química..............................................................................36
Figura 9. SDS-PAGE 12% de imunoglobulinas purificadas em coluna de afinidade.............. 39
Figura 10. Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de cisteamina...................... 41
Figura 11. Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de polietilenoimina............. 42
Figura 12.
Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de anti-flavivirus
na
presença de cisteamina................................................................................................................. 43
Figura 13. Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de anti-flavivirus na presença
de polietilenoimina....................................................................................................................... 44
Figura 14. Potencial Zeta (mV) para as diferentes concentrações de anti-flavivirus................. 45
Figura 15. Espectroscopia de UV-Vis da análise de tempo de detecção do Dengue vírus........ 47
Figura 16. Análise da variação de deslocamento para diferentes tempos de detecção de Dengue
vírus.............................................................................................................................................. 48
Figura 17. Espectroscopia de UV-Vis da análise da sensibilidade de detecção do Dengue
vírus.............................................................................................................................................. 50
Figura 18. Espectroscopia de UV-Vis da análise da sensibilidade de detecção do Mayaro
vírus.............................................................................................................................................. 51
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para a
diferentes concentrações de anit-flavivirus..................................................................... 45
Tabela 2. Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para a
análise de tempo de detecção de Dengue vírus............................................................... 47
Tabela 3. Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para análise
de sensibilidade de detecção de Dengue vírus. ............................................................... 50
Tabela 4. Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para análise
de sensibilidade de detecção de Mayaro virus................................................................ 52
xii
I. INTRODUÇÃO
1.
INTRODUÇÃO
1.1
A Dengue
.
1.1.1 Gênero Flavivirus
Inicialmente, com base em métodos tradicionais de classificação, os Flavivirus
eram classificados como Alphavirus na família Togaviridae. Posteriormente, por
estudos do genoma, estrutura, ciclo e replicação virais, foram identificados como
suficientemente distintos e então, reclassificados como da família Flaviviridae
(SOLOMON; MALLEWA, 2001).
Todos os membros do gênero Flavivirus compartilham sítios antigênicos comuns,
o que originalmente formaram a base para a sua classificação. Entretanto, por testes que
utilizam anticorpos monoclonais é possível distinguir vírus individuais bem como
subgrupos de vírus intimamente relacionados (KNIPE; HOWLEY, 2001).
Além disso, neste gênero inclui aproximadamente 70 vírus diferentes e grande
parte deles é transmitido para humanos por artrópodes, infectando uma variedade de
hospedeiro através da picada do mosquito ou carrapatos (COOK et al., 2012). Os vírus
podem causar uma grande variedade de doenças e, por isso, alguns são de grande
importância e muito conhecidos como, Dengue virus (DENV), encefalite japonesa
(JEV), vírus do oeste do Nilo (WNV) e febre amarela (YFV) (MACKENZIE;
GUBLER; PETERSEN, 2004).
1.1.2
Dengue virus
O DENV é uma partícula esférica de aproximadamente 50nm de diâmetro
(SMITH et al., 1970) e, assim como o vírus da Febre amarela e Oeste do Nilo, é
membro do grupo sorológico da família Flaviviridae e gênero Flavivirus. É um vírus
envelopado e que possui quatro sorotipos estreitamente relacionados e antigenicamente
distintos denominados de acordo com a ordem de descoberta DENV 1-4 (ZANOTRO et
al., 1996; PUBLIC et al., 1989) e em outubro de 2013 foi anunciado um novo sorotipo
circulante denominado então de DENV 5 (NORMILE, 2013).
2
No gênero Flavivirus, os vírus possuem genoma de RNA fita-simples senso
positivo de 11 kilobases (Kb), contento um única janela aberta de leitura, que codifica
uma poliproteína que posteriormente é clivada em 3 proteínas estruturais – C
(capsídeo),
prM (membrana) e E (envelope). A proteína C de DENV com
aproximadamente 11 KDa desempenha papel importante na encapsidação do genoma
viral (MA et al., 2004). A proteína prM (19 KDa) é uma glicoproteína muito importante
no processo de maturação viral. A proteína E possui tamanho aproximado a 60 KDa e é
responsável pela indução de anticorpos neutralizantes e por promover a adsorção e
entrada do vírus nas células (REY et al., 1995; MODIS et al., 2005; GROMOWSKI et
al 2008) (Figura 1).
Proteína E
(dímero)
Proteína
M
Proteína C
ssRNA (+)
Figura 1. Estrutura da partícula viral de Dengue vírus. A partícula viral é composta por três proteína
estruturais: proteína de envelope (E) disposta em dímeros; a proteína associada à membrana (M) e a
proteína do nucleocapsídeo (C). O genoma de RNA fita-simples de polaridade positiva se encontra dentro
do nucleocapsídeo. Fonte: adaptado de http:// http://viralzone.expasy.org/
Além disso, a poliproteína é também clivada em 7 proteínas não estruturais –
NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 –, as quais estão associadas,
principalmente, à replicação do vírus, à expressão das proteínas virais e a virulência dos
sorotipos (Chambers et al., 1990; PUGACHEV et al., 2003). A proteína NS1 tem
grande importância por ser altamente conservada e circular em altos níveis no sangue de
pacientes infectados durante a fase aguda da doença, o que parece contribuir com a
patofisiologia da doença (ALCON et al., 2002).
3
A partir do momento que um vírus infecta uma célula hospedeira permissiva temse o início do ciclo de multiplicação viral. Os virions penetram na célula através da
interação da proteína de envelope com receptores da superfície das células do
hospedeiro. Tal proteína é responsável tanto pela ligação ao receptor da célula
hospedeira quanto pela fusão das membranas viral – hospedeiro (HEINZ; ALLISON,
2000). A interação pode ser mediada por moléculas de heparan-sulfato, que parecem
agir como co-receptores, receptor para manose, entre outros (YAPING CHEN et. al.,
1997). Além disso, o vírus pode também ser reconhecido por receptor DC-SING
(YANG et al., 2012) ou ainda, por FcƴR, um importante receptor expresso em células
dendríticas responsáveis pela identificação de anticorpos na segunda infecção (GREEN
S., 2006).
Após ser reconhecido, o vírus é internalizado através da endocitose mediada por
clatrina (ISHAK; TOVEY; HOWARD, 1988). E, no endossoma, o pH baixo induz uma
mudança conformacional irreversivelmente mais estável na proteína E (HERNANDEZ;
HOFFMAN; WOLFSBERG, 1996), que catalisa a fusão das membranas lipídicas do
envelope viral com a membrana endossomal, liberando o genoma viral em um processo
denominado, desnudamento (BRESSANELLI et al., 2004; CLYDE; KYLE; HARRIS,
2006b). Então, o RNA viral, por ser senso positivo e semelhante a um RNA mensageiro,
é traduzido e a poliproteína processada em dez proteínas (estruturais e não-estruturais)
(REY et al., 1995).
Seguindo vias metabólicas da célula hospedeira, e com auxilio das proteínas não
estruturais, o RNA, agora senso negativo, é replicado (MACKENZIE; KHROMYKH;
WESTAWAY, 2001) e as novas moléculas são envoltas pelas proteínas estruturais.
Estas partículas imaturas possuem heterodímeros de proteína E e um precursor da
proteína M (prM) e utilizam a via secretora da célula hospedeira e migram para o
aparelho de Golgi. Nele encontram um ambiente de baixo pH, que auxilia na clivagem
mediada por uma protease celular de prM para M, culminando na maturação do vírus
(HEINZ; ALLISON, 2000; ELSHUBER et al., 2003). As partículas virais são então
liberadas por exocitose capazes de infectar novas células (Figura 2) (STIASNY;
HEINZ, 2006).
4
A Adsorção
Liberação de
G vírus
maduro.
F Maturação
Fusão e
B Desnudamento
E Montagem
C
Síntese e processamento
D Replicação do RNA
Figura 2. Ciclo de multiplicação de DENV. A. Os vírus se ligam aos receptores na superfície da célula e
são endocitados. B. Devido ao baixo pH dentro dos endossomas, ocorre a fusão de membranas viralcelular mediada por proteínas virais, resultando na liberação do RNA viral em um processo chamado de
desnudamento. C. O genoma viral é traduzido em uma única poliproteína que é processada por proteases
do vírus e da célula hospedeira. D. O RNA é replicado por proteínas não-estruturais do próprio vírus. E.
A montagem do vírus ocorre na membrana do Reticulo endoplasmático, no qual a proteína do capsídeo e
o RNA viral são envolvidos por glicoproteínas e pela membrana da organela para formar partículas virais
imaturas. F. Partículas virais imaturas utilizam a via secretora da célula hospedeira e sob o baixo pH do
Complexo de Golgi a proteína precursora prM é clivada em proteína M, completando a maturação do
vírus. Os vírus maduros são então liberados das células por exocitose. Os números indicados nas caixas
coloridas referem-se ao valor de pH dos respectivos compartimentos. Imagem adaptada de PERERA,
2009.
Os eventos iniciais que ocorrem logo após a inoculação do DENV na pele humana
ainda não estão completamente definidos, incluindo as respostas imunes no local de
inoculação e o impacto da cepa ou subtipo do vírus infectante, ambos os quais poderiam
5
potencialmente determinar o sucesso do hospedeiro na depuração viral (ST JOHN;
ABRAHAM; GUBLER, 2013).
Já se sabe, entretanto, que células dendríticas imaturas são mais permissivas a
infecção por DENV se comparado a outros leucócitos e a infecção destas células induz a
maturação das mesmas mediada por TNF-α (“Interferon alfa”) (MAROVICH et al.,
2001). Já células dendríticas da pele humana (Células de Langerhans) foram
demonstradas como células alvo para a infecção por DENV (WU et al., 2000), que
posteriormente migram para os linfonodos para drenagem, no qual o vírus pode ser
transmitido ou transferido para outras células. Além disso, quando infectadas podem
induzir a proliferação das células T CD4+ (CHASE et al. 2011).
Além disso, células NK (“Natural Killers”), principais componentes da resposta
inata do sistema imune, parecem ser ativadas durante a fase aguda da Dengue e serem
responsáveis pela produção de citocinas. Dentre estas, podemos citar IFN-ƴ
(“Interferon gamma”), a qual tem papel importante na redução da replicação viral, uma
vez que ativa macrófagos, células dendríticas e neutrófilos, e no aumento da resposta
imune adaptativa (PETITDEMANGE et al., 2014).
Na existência de anticorpos neutralizantes adquiridos em uma infecção anterior, o
vírus tem acesso a outras células imunes (monócitos e macrófagos) e a doença pode
evoluir para suas formas mais graves (Dengue hemorrágica e síndrome do choque da
dengue) (MAROVICH et al., 2001). Isso porque anticorpos produzidos para combater
um sorotipo serão sempre protetores contra este sorotipo, entretanto, apenas serão
eficientes no combate a outros sorotipos no início da infecção (GUY; ALMOND, 2008).
Depois disso, os anticorpos subneutralizam as partículas virais, fazendo com que sejam
reconhecidos por células fagocitárias e como não estão neutralizados aumentam a
infecção. Tal fenômeno é conhecido como intensificação dependente de anticorpos (do
inglês, “antibody dependent enhancement” ADE) (CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006a).
A maioria dos anticorpos neutralizantes contra os vírus do gênero flavivirus são
dirigidos contra a proteína E, domínios II e III, principalmente (COLOMBAGE et al.,
1998). Anticorpos IgM específicos para DENV podem aparecer com aproximadamente
3 dias e se tornam mais presentes no quinto dia após infecção (ALCON et al., 2002) e
os níveis no sangue deste anticorpo continuam a aumentar por mais alguns dias e pode
6
persistir por meses (6 meses em infecção primária e 4 meses em infecção secundária)
(PRINCE; MATUD, 2011).
O IgG por sua vez, pode ser detectado após 10 dias do início da primeira infecção,
mas pode aumentar rapidamente no sangue na segunda infecção, podendo ser utilizado
no diagnóstico para diferenciar entre infecções primária e secundária quando comparado
com níveis de IgM (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009; HUNSPERGER et
al., 2009).
1.1.3.
O vetor
Os mosquitos geralmente passam pela fase aquática em estágio imaturo e fase
terrestre na fase adulta, que é a fase em que ocorrem o acasalamento, alimentação de
sangue e oviposição. Para os mosquitos vetores de doenças estes eventos ocorrem
principalmente próximos ao hospedeiro (HIGA, 2011). A Dengue tem o mosquito
Aedes como vetor. Este mosquito é do gênero Stegomyia que inclui algumas espécies
como, Ae. aegypti, Ae. albopictus e Ae. polynesiensis. Entretanto, os dois primeiros são
responsáveis pela maior parte da transmissão da dengue, segundo dados
epidemiológicos (RIGAU-PÉREZ et al., 1998).
O Ae. aegypti foi pela primeira vez confirmado como vetor da Dengue em um
estudo realizado em 1916 (CLELAND et al., 1918) e sua dispersão foi desencadeada do
século XVII ao século XIX através de barcos com retenção de água contendo larvas
(HIGA, 2011). Ele é antropofílico, vive em habitats urbanos e, ao contrário dos demais
mosquitos, é um alimentador diurno e o mosquito fêmea pica várias pessoas durante
cada período de alimentação. Sua preferência por seres humanos como hospedeiros é
um fator importante para a transmissão (PONLAWAT; HARRINGTON, 2005;
SUWONKERD et al., 2006). O Ae. albopictus, por sua vez, apesar de ser um vetor
secundário da dengue foi o principal responsável por disseminar a dengue para regiões
mais frias. Isso porque, ele é tolerante a temperaturas abaixo de zero, possui capacidade
de hibernação e de se abrigar em micro-habitat (KNIPE; HOWLEY, 2001).
Por serem importantes disseminadores de doenças os mosquitos vetores são
geralmente alvo de estudos em métodos pelos quais poderiam ter reprodução impedida
ou destruída e proteção contra suas mordidas (CHRISTOPHERS, 1960). E várias
7
estratégias têm sido desenvolvidas com a finalidade de combater o vetor e controlar a
Dengue. Entre elas inclui mosquitos machos geneticamente modificados com gene letal
que é passado a sua progênie (CARVALHO et al., 2014), vetores infectados com a
bactéria Wolbachia pipientis, que pode interferir na replicação do vírus e na capacidade
do vetor de transmitir a doença (MOREIRA et al., 2009), entre outras que buscam
entender como a infecção e disseminação do vírus pelo mosquito ocorrem.
Em 1976, foi demonstrado que infecção do mosquito fêmea ocorre após picada e
subsequente ingestão de sangue de uma pessoa infectada com o vírus, mas tal infecção
não causa efeito direto sobre o vetor. O vírus percorre o organismo do mosquito e ao
chegar ao intestino médio, se liga a receptores de células do epitélio, nas quais se replica
e então, é liberado para a hemocele. A partir dai o vírus é capaz de infectar outros
tecidos como, glândula salivar e trato genital. Após o intervalo de 7-10 dias pósinfecção o mosquito se torna infectante e disseminador eficiente do DENV. No
momento da picada, o vírus é liberado na saliva do vetor causando a infecção do
hospedeiro. Além disso, o vírus presente no trato genital pode infectar os ovos,
resultando em novos mosquitos já infectantes (GUBLER; ROSEN, 1976; PUTNAM;
SCOTT, 1995; ROSEN, 1987; CARRINGTON; SIMMONS, 2014).
1.1.4.
Epidemiologia
A dengue é uma infecção transmitida por mosquitos urbanos encontrados em
regiões tropicais e subtropicais ao redor do mundo, motivos pelos quais esta doença é
encontrada em tais regiões. Sua primeira epidemia foi registrada em 1885, na Austrália
(CLELAND et al., 1918) e, nos últimos anos, a transmissão tem aumentado
principalmente nas zonas urbanas, tornando-se uma das principais preocupações de
saúde pública internacional. A OMS estima que atualmente possa haver 50-100.000.000
infecções por dengue em todo o mundo a cada ano (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2014).
Para doenças transmitidas por mosquitos, uma temperatura elevada dentro de um
intervalo de sobrevivência dos vetores melhora a reprodução e alonga o período anual
de procriação dos mesmos (HAWLEY, 1988; BESERRA et al., 2009), além de que o
período de incubação do vírus pode ser reduzido (ROHANI et al., 2009). Em
8
consequência disso, nos últimos 50 anos, mudanças demográficas e sociais
influenciadas pelo aquecimento global e alterações climáticas, tais como crescimento da
população mundial e urbanização desordenada, têm sido associadas a fatores
responsáveis pelo aumento da dengue como um problema mundial de saúde publica.
Além disso, urbanização não planejada associada com habitações precárias,
superlotação e danos em redes de água e esgoto contribuíram para a criação de um
ambiente propicio para o aumento da transmissão de doenças transmitidas por
mosquitos em centro urbanos de regiões tropicais (PAULA; FONSECA, 2004).
Entre os anos de 1980 e 1994 houve um aumento da incidência de Dengue nas
Américas, sendo as infecções causadas pelos sorotipos DENV1, DENV2 E DENV4 e
somente no final de 1994 houve o registro de infecção por DENV3 (GUBLER, 1998).
No Brasil, a disseminação do Aedes aegypti foi o principal fator responsável pelo
aumento de casos da doença no país. Até o ano 2000, as infecções registradas eram
causadas por DENV1 e 2, mas em dezembro deste ano e novembro de 2001 o DENV3
foi detectado (BARBOSA DA SILVA et al., 2002).
Um estudo realizado em 2010 se baseou na evidencia de risco de dengue e nas
estimativas de infecções em todo o mundo com base na população deste ano. Nele foi
previsto que as maiores zonas de risco eram nas Américas e Ásia, com 13,3 e 66,8
milhões de infecções aparentes e 40,5 e 204,4 milhões de infecções inaparente de
dengue, respectivamente. Na África, a qual apresentou 15,7 milhões de infecções
aparentes e 48,4 de infecções inaparente de dengue, a distribuição não se mostrou
uniforme, principalmente devido à falta de registros de ocorrência da doença em áreas
mais pobres. Entretanto, em comparação com o que já foi sugerido anteriormente, a
Dengue está muito mais difundida neste continente e isso pode ser explicado pela
condição precária de infraestrutura de algumas regiões e temperatura adequada para a
transmissão da doença (Figura 3) (BRADY et al., 2012; BHATT et al., 2013).
9
Probabilidade
de ocorrência
Figura 3. Evidencia Global, risco e ônus da dengue em 2010. As áreas com uma elevada probabilidade
de ocorrência de dengue são mostradas em vermelho e áreas com baixa probabilidade em verde.
Adaptado de BHATT et al., 2013.
E ainda, nos últimos anos já se teve registros de casos com DENV-5, um novo
sorotipo de DENV, o que pode resultar em novos desafios no controle da doença. Isso
porque, apesar de até agora somente um surto em 2007 foi registrado, podem surgir
novos surtos e o sorotipo pode ocupar novas áreas e espalhar ainda mais a doença. Além
de que, o desenvolvimento de uma vacina que consiga proteger contra mais um sorotipo
de forma simultânea com os demais se tornou ainda mais complicado (MUSTAFA et
al., 2014).
1.1.5.
Manifestações clínicas
A Dengue é uma doença causada por cinco sorotipos diferentes e o DENV após
ser transmitido pela picada do mosquito passa por um período de incubação de 4-7 dias
no organismo do hospedeiro. Durante este período a Dengue pode se manifestar de
forma assintomática e, mais comumente, de forma sintomática, o que depende da cepa
do vírus, idade e condição imunológica do indivíduo (SINGHI; KISSOON; BANSAL,
2007). Além disso, a proteína NS1 circula em altos níveis na circulação de pacientes
10
durante a fase aguda da doença, o que sugere que esta proteína pode estar envolvida na
fisiopatologia da infecção do DENV (ALCON et al., 2002).
As manifestações sintomáticas incluem Dengue clássica (DC), Febre hemorrágica
da Dengue (FHD) e Síndrome do Choque da Dengue (SCD) (MC BRIDE;
BIELEFELDT-OHMANN, 2000). A Dengue clássica pode causar sintomas como febre,
calafrios, dor de cabeça, nos olhos, no corpo e nas articulações, além de náuseas,
vómitos, ou erupções cutâneas (COBRA et al., 1995). Por outro lado, a dengue
hemorrágica é caracterizada, principalmente, por febre alta e hemorragia, podendo
agravar para falência do sistema circulatório. Em alguns casos ainda mais graves, pode
ocorrer o extravasamento do plasma sanguíneo, resultando no chamado síndrome do
choque da dengue (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997).
Dengue hemorrágica e Síndrome do choque da dengue ocorrem mais comumente
em infecção secundária por um sorotipo diferente (KALAYANAROOJ et al., 1997).
Tal fato pode ser explicado em parte pelo fenômeno conhecido como ADE, um
complexo imunopatológico desencadeado por infecção sucessiva com diferentes
sorotipos virais (HOLMES; BURCH, 2000). Entretanto, formas mais graves também
podem ocorrer em pacientes com infecção primária (THEIN et al., 1997). Além disso, a
infecção por dengue é geralmente considerada como uma doença pediátrica, mas além
de ser um problema crescente, tende a ser mais grave em adultos (TANTAWICHIEN,
2012).
Até o momento nenhuma vacina efetiva ou tratamento específico contra dengue
vírus foram desenvolvidos (JOUAN et al., 2001). A opção terapêutica mais utilizada
para minimizar os sintomas é a reposição de líquidos tanto para adultos quanto para
crianças (TANTAWICHIEN, 2012). Por isso, torna-se necessário o controle do vetor
bem como o desenvolvimento de métodos que promovam um diagnóstico precoce e
preciso da dengue (TANG; OOI, 2012).
1.1.6.
Diagnóstico da dengue
O diagnóstico clínico da dengue é realizado pela análise dos sintomas comuns da
doença, como febre alta acompanhada de náusea e dores atrás dos olhos e nas
articulações. Entretanto, não são sintomas específicos da dengue, o que limita a
11
detecção específica da doença (TANG; OOI, 2012). Dessa maneira para se confirmar a
infecção por DENV deve se utilizar o diagnóstico laboratorial, que deve ser sensível
independentemente do estágio da infecção. Este diagnóstico pode ser dividido em
métodos diretos e indiretos (SHU; HUANG, 2004).
Os métodos diretos são caracterizados pelo isolamento do vírus, detecção do
genoma viral e de antígenos. Eles são mais específicos com relação à detecção dos
patógenos, mas geralmente não são simples de serem realizados e necessitam de
equipamentos específicos e mão-de-obra especializada. Já os métodos indiretos se
baseiam na detecção de anticorpos específicos, os quais são de fácil detecção,
entretanto, não possuem a especificidade dos métodos diretos (PEELING et al., 2010).
O vírus é encontrado no soro ou plasma do individuo aproximadamente do
segundo ao sétimo dia pós-infecção, correspondendo ao período de febre (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 1997). Em mosquitos o vírus pode ser isolado a uma taxa
de 71,5 – 84,2% para os quatro sorotipos (JARMAN et al., 2011). Para detecção do
vírus ou RNA viral em humanos ou mosquistos, métodos como RT-PCR (LANCIOTTI
et al., 1992) e ELISA (CONTROL et al., 1991) são muito utilizados. Entretanto, são
metodologias caras, que necessitam de treinamento específico, dependem da integridade
da amostra e podem não prover diagnóstico rápido. Por isso, não são utilizados na rotina
de laboratório (VAUGHN et al., 1994; KB et al., 2011).
A resposta humoral contra o DENV consiste em anticorpos dirigidos
principalmente contra as proteínas virais prM, E e NS1. A detecção destes anticorpos,
mais especificamente IgM e IgG, é o método mais utilizado na rotina de laboratórios
para a detecção de Dengue (PAULA; FONSECA, 2004). Existem disponíveis no
mercado alguns testes para o diagnóstico de dengue, os quais utilizam principalmente o
formato de ELISA e, alguns destes kits podem detectar IgM e/ou IgG e ainda, distinguir
simultaneamente uma infecção primária de uma infecção secundária. Todavia não
podem ser detectados nos primeiros dias de infecção, tornando-os inviáveis para um
diagnóstico rápido (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009; HUNSPERGER et
al., 2009).
Embora a maioria dos testes para detectar a infecção pelo DENV atualmente
comercializados no Brasil apresente um bom desempenho, o uso de partículas virais
inativadas como antígeno pode gerar reatividade cruzada com anticorpos gerados contra
12
outros Flavivirus. Na tentativa de contornar esses problemas, a utilização de anticorpos
monoclonais contra epítopos específicos do DENV tem se tornado uma alternativa
viável para a inclusão em kits diagnósticos que utilizam como antígeno partículas
nativas ou proteínas recombinantes (GROEN et al., 2000). Diversos clones produtores
de anticorpos anti-dengue já foram obtidos e caracterizados por imunização de animais
com partículas virais nativas ou proteínas recombinantes (FALCONAR; YOUNG,
1991; PUPO-ANTUNEZ et al., 2001).
Os antígenos como NS1 e proteína E podem ser detectados em diagnóstico de
dengue. Vários estudos apontam que altos níveis circulantes da proteína NS1 são
coincidentes com picos de viremia (YOUNG et al., 2000), sendo encontrada no plasma
de pacientes com primeira ou segunda infecção por dengue do primeiro ao sétimo dia
após o aparecimento dos sintomas e em níveis máximos do terceiro ao quinto dia de
infecção (LIBRATY et al., 2002).
Após sua síntese, NS1 se dimeriza e se associa às membranas celulares, tanto
intracitoplasmáticas, como na membrana externa onde ela permanece como a única
proteína viral em células infectadas. Em células de mamíferos NS1 também é secretada
para o meio extracelular como monômeros, dímeros ou como hexâmeros. Além disso,
NS1 produz uma resposta humoral muito forte e, por isso, muitos estudos têm sido
direcionados em usar a detecção desta proteína para fazer um diagnóstico precoce da
infecção pelo vírus da dengue (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009).
Já a proteína do Envelope (proteína E) de Flavivirus está presente na superfície do
vírus como homodímero e é uma proteína de fusão. Estas proteínas mudam de
conformação de maneira irreversível ao se fusionarem com membranas do hospedeiro e
podem ser divididas em duas classes: Classe I e Classe II (KLENK; GARTEN, 1994).
Na classe I as proteínas são ativadas por clivagem proteolítica (KLENK;
GARTEN, 1994). Enquanto na classe II as proteínas são estruturalmente conservadas e
induzidas por baixo pH (HERNANDEZ; HOFFMAN; WOLFSBERG, 1996). E é nesta
classe que se classifica a proteína E (KANAI et al., 2006), que possui cerca de 500
aminoácidos, dos quais 400 aminoácidos da porção N-terminal formam o ectodomínio
(MODIS et al., 2003). Este pode ser dividido em três domínios estruturais (Figura 4)
que possuem importantes funções na ligação a receptores, na entrada e na montagem
dos vírus (PIERSON et al., 2007; HERNANDEZ; HOFFMAN; WOLFSBERG, 1996).
13
Figura 4. A estrutura da proteína E de dengue. Subunidades individuais de proteína E composta por
três domínios beta-barril denominados: I (EDI; vermelho), II (EDII; amarelo) e III (EDIII; azul), com a
proteína nativa formando uma cauda de homodímero que se encontra sobre a superfície do vírus.
Adaptado de WAHALA et al., 2012.
O domínio I pode ser responsável pelo rearranjo da conformação da proteína
necessário para que a fusão ocorra (MUKHOPADHYAY et al., 2005) e o domínio II
parece
promover
a
fusão
entre
membranas
virais
e
do
hospedeiro
(MUKHOPADHYAY, et al., 2003). O domínio III, por sua vez, fica saliente a partir da
superfície facilitando a sua ligação a receptores celulares (MUKHOPADHYAY et al.,
2005). Além disso, este domínio parece apresentar epítopos predominantemente
subcomplexo e específicos, que induzem principalmente anticorpos neutralizantes
(OLIPHANT et al., 2007).
Muitos dos anticorpos grupo-específicos para dengue são dirigidos tanto contra a
proteína E quanto contra proteína prM (CHEN et al., 2007). E, várias estratégias têm
sido desenhadas para produzir anticorpos monoclonais capazes de reconhecer diferentes
sorotipos do DENV, de forma simultânea, através da detecção de antígenos contendo
regiões conservadas entre os diferentes sorotipos de DENV (CLEMENTI et al., 2012).
O fato é que a utilização de anticorpos monoclonais para confecção de kits para o
diagnóstico da dengue pode levar a um aumento da especificidade da reação,
consequentemente melhorando a qualidade de kits destinados para a detecção desta
doença.
Uma vez que não existem vacinas e/ou terapias antivirais específicas contra a
dengue, a principal forma de se reduzir a mortalidade causada pela infecção é o
14
diagnóstico. E, com isso, há a necessidade de testes específicos, de baixo custo que
possam ser utilizados para investigações de gestão clínica, de vigilância e de surtos, e
ainda, que possam permitir a intervenção precoce para o tratamento de pacientes, como
a hidratação contribuindo para reduzir a gravidade da doença, e prevenir ou controlar
epidemias (PEELING et al., 2010).
Além disso, com a recente co-circulação do Chikungunya virus (CHIKV) e
DENV a dificuldade de uma detecção específica e precoce foi aumentada e se faz ainda
mais necessário um diagnóstico clínico diferenciado daqueles já existentes. Isso porque
CHIKV é um vírus que causa uma doença – Chikungunya- com sintomas semelhantes
ao da Dengue, com maior proporção de casos sintomáticos, menor tempo de incubação,
maior período de viremia e é ainda transmitida pelo mesmo mosquito vetor
(DONALISIO; FREITAS, 2015).
O progresso está sendo feito na prevenção primária, com várias vacinas
candidatas, bem como na adoção de melhorias nas medidas de controle de vetores.
Além disso, novas técnicas para a detecção precoce de doença grave, tais como o uso de
biomarcadores tem o potencial para diminuir a morbidade e mortalidade. As recentes
tecnologias desenvolvidas para a detecção rápida oferecem a promessa de diagnósticos
aprimorados para gestão de casos e detecção precoce de surtos de dengue (PEELING et
al., 2010).
15
1.2
Nanotecnologia
A utilização de materiais em escala nanométrica (0,1 – 100nm) é denominada de
Nanotecnologia (NIOSI; REID, 2007). De acordo com Iniciativa Nacional de
Nanotecnologia dos EUA, nanotecnologia é definida como qualquer tecnologia
associada à criação de imagens, de medida, modelagem ou manipulação da matéria em
nanoescala (NATIONAL SCIENCE AND TECHNOLOGY COUNCIL, 2000).
A nanotecnologia tem sido amplamente utilizada na biotecnologia principalmente
devido ao fato de que as nanopartículas se assemelham em tamanho a várias
biomoléculas comuns e este tamanho é controlado com precisão durante a síntese das
mesmas. Além disso, é possível controlar a forma das partículas, como nanoesferas,
nanocristais, nanoconchas e nanobastões, e fazer modificações na camada superficial
para atingir uma melhor solubilidade aquosa bem como biocompatibilidade (WEST;
HALAS, 2000). A nanobiotecnologia poderia então, ser amplamente utilizada na
medicina, produtos farmacêuticos, diagnóstico e processos industriais e agricultura
(HULLMANN, 2007).
1.2.1
Nanopartículas de ouro
Nanopartículas de ouro (AuNPs) são as nanopartículas metálicas mais estáveis
que se tem conhecimento (DANIEL; ASTRUC, 2004) e possuem propriedades,
incluindo propriedades opticas, magnéticas, eletrônicas e estruturais, que propiciam sua
utilização em muitas aplicações biológicas. (PISSUWAN; VALENZUELA; CORTIE,
2008). A utilização destas nanopartículas poderia facilmente tornar-se a próxima
geração de ferramentas de diagnóstico, uma vez que elas mostram grande sensibilidade
e especificidade que podem substituir os métodos moleculares convencionais, tais como
PCR (LIZ-MARZÁN, 2006).
Existem vários métodos para síntese de AuNPs com estruturas diferentes e apesar
do material original ser de alto custo, é geralmente utilizado em concentrações muito
baixas e se tornam econômicos. (WILSON, 2008). As partículas com forma esférica
(nanoesferas) e em forma de bastão (nanobastões ou “nanorods”) são as mais estudadas
para aplicações biológicas. As nanoesferas foram relatadas pela primeira vez por
16
Faraday em 1857 e são geralmente sintetizadas utilizando método de redução de citrato.
Neste, partículas esféricas são produzidas com diâmetros ≥10 nm e envolve a redução
aquosa de ácido cloroáurico (HAuCl4) por citrato de sódio (FARADAY, 1857; AUSTIN
et al., 2014).
Existem duas abordagens gerais para a síntese de nanobastões – mediadas por
semente e crescimento sem sementes. O primeiro relato de nanobastões sintetizados
com qualidade utilizou uma abordagem eletroquímica que foi precursora do processo
mediado por sementes, inicialmente descrito por Murphy e colaboradores. em 2001
(VIGDERMAN; KHANAL; ZUBAREV, 2012; NIKHIK R. JANA, 2001). A síntese
sem semente utiliza uma solução de crescimento com ácido clorídrico para manter o pH
ácido e NaBH4 para a formação das sementes e crescimento das partículas de ouro
(AUSTIN et al., 2014).
No método mediado por semente os nanobastões são preparados por adição de
nanoesferas (“sementes”) cobertas de citrato a uma solução de crescimento contendo
HAuCl2 em grandes quantidades, resultantes da redução de HAuCl4 por ácido ascórbico
na presença de surfactante brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) e íons de prata. O
CTAB é essencial para a síntese controlada em forma de bastões, uma vez que se liga
preferencialmente nas faces laterais das AuNPs (HUANG; NERETINA; EL-SAYED,
2009) e os íons de prata limitam o comprimento das nanopartículas por se ligarem na
superfície das mesmas na forma de AgBr, sendo o bromo proveniente do CTAB
(NIKHIK, 2001).
Uma vez preparadas, as nanopartículas são estáveis por longos períodos e podem
ser funcionalizadas com vários tipos de moléculas e biomoléculas e serem redissolvidas
em solventes orgânicos comuns sem sofrerem agregação irreversível (DANIEL;
ASTRUC, 2004). E depois, podem ser utilizadas em uma gama de aplicações biológicas
e biomédicas, dentre elas biosensoriamento, entrega de genes e drogas, diagnósticos e
terapia fototérmica (HUANG; NERETINA; EL-SAYED, 2009; NIIDOME et al., 2006).
17
1.2.2
Ressonância de Plasmon de superfície localizada e outras propriedades
ópticas
O tipo de movimento dos elétrons de uma matéria depende do tipo e forma do
material e do espaço acessível para os elétrons (grau de confinamento) e ainda, define as
propriedades físicas e químicas da mesma. Dessa forma, por causa da restrição de
movimento dos elétrons, um mesmo material em escala nanométrica apresenta
propriedades físico-químicas distintas daqueles em escala macrométrica.
As nanopartículas de metal nobre (ouro e prata) distinguem-se de outros materiais,
pois além de suas propriedades catalíticas, possuem propriedades ópticas únicas como,
uma amplitude de onda de luz aumentada que é facilmente visualizada por detecção
óptica (HUANG; NERETINA; EL-SAYED, 2009) e bandas de extinção distintas na
região do visível, ambas devido à ressonância de plasmon de superfície (SPR) mais
intensa (SCHMID, 1992; HUANG; EL-SAYED, 2010).
A SPR se caracteriza pela oscilação coletiva dos elétrons de condução das
partículas metálicas desencadeada pela exposição à luz (JENSEN et al., 2000). Tal
oscilação provoca a separação de cargas entre os elétrons livres, restaurando as forças
de Coulomb e assim, fazendo com que os elétrons oscilem para frente e para trás sobre a
superfície das partículas e o resultado é uma oscilação dipolo (HUANG; NERETINA;
EL-SAYED, 2009).
Além disso, a oscilação induz absorção de luz e o comprimento de onda
corresponde ao máximo de absorção da ressonância de plasmon de superfície, exibindo
uma forte banda da absorção de UV-Visível que pode ser detectada por espectroscopia
(HULTEEN et al., 1999). O sinal gerado pela SPR é de até 1.000.000 de vezes mais
sensível que tecnologias de sinalização por fluorescência utilizadas atualmente (JAIN,
2005). Ainda, SPR depende do tamanho, da forma e propriedades dielétricas das
nanopartículas metálicas (JENSEN et al., 2000).
Nanopartículas em formato esférico apresentam uma banda de SPR na região do
visível muito forte, se comparado com outras formas e materiais (CREIGHTON;
EADON, 1991). Já nas partículas com formato de bastão, devido à anisotropia da
forma, a oscilação pode ocorrer em dois sentidos, dependendo da polarização da luz
18
incidente, eixos curtos e eixos longos. O eixo curto induz uma banda de absorção no
comprimento de onda semelhante ao das nanoesferas e é denominada como banda
transversal (HUANG; EL-SAYED, 2010).
Já a banda longitudinal é resultado da banda de absorção induzida pelo eixo longo
em um comprimento de onda mais forte e ainda, é dependente e sensível à relação de
aspecto (comprimento/largura) da partícula, ao contrário do que acontece com a banda
transversal. Com o aumento da relação de aspecto, que pode ser determinada tanto pela
modificação de tamanho da nanopartícula quanto pela ligação de moléculas em sua
superfície, a cor do ouro em solução é alterada do azul para o vermelho (Figura 5A) e o
comprimento de onda de ressonância de plasmon é deslocada (Figura 5B)
(EL-
SAYED, 1999; JAIN et al., 2008; CHANG; LEE; WANG, 1997; HUANG; ELSAYED, 2010). Por isso, faz com que nanobastões tenham qualidade maior em
detecção que nanoesferas (JAIN et al., 2006).
B
Extinção (a.u.)
A
Comprimento de onde (nm)
Figura 5. Propriedades ópticas de nanobastões de ouro ajustadas por alteração na relação de
aspecto. Nanopartículas de ouro com relação de aspecto diferente apresentam cores diferentes (A) e
deslocamento no comprimento de onda de ressonância de plasmon (B). FONTE: HUANG; EL-SAYED,
2010.
19
1.2.3
Bioconjugação
A superfície de AuNPs pode ser modificada de tal modo que o CTAB é
substituído ou coberto por moléculas compatíveis conhecidos. Com isso, a posição do
pico longitudinal pode ser deslocada para a região do infravermelho próximo, quando a
proporção de aspecto das partículas é aumentada (WILSON, 2008). E, segundo ElSayed e colaboradores. em 2009, a funcionalização de biomoléculas em nanobastões de
ouro pode ser realizada por quatro diferentes métodos. São eles: adsorção eletrostática,
interação direta de ligante, revestimento de superfície e o uso de um ligante
biofuncional (Figura 6) (HUANG; NERETINA; EL-SAYED, 2009).
Na adsorção eletrostática, proteínas, por exemplo, são carregadas negativamente e
colocadas em um pH abaixo de seu ponto isoelétrico, assim ocorre uma atração
eletrostática entre a superfície do ouro e a proteína e então, a consequente adsorção.
Esta é uma abordagem simples, pois não requer reação química (Figura 6A). Já na
interação direta de ligante, parte do CTAB é retirada e moléculas se ligam diretamente
ao ouro. Uma forma para que isso aconteça é adicionar um grupo tiol (-SH) em uma
extremidade destas moléculas (Lipídeos e DNA), uma vez que a ligação metal-enxofre é
muito forte (Figura 6B) (AUBIN-TAM; HAMAD-SCHIFFERLI, 2008; HUANG;
NERETINA; EL-SAYED, 2009).
Uma terceira metodologia seria funcionalizar nanobastões com moléculas
poliméricas ou não que reagem naturalmente com biomoléculas específicas por
adsorção eletrostática (Figura 6C). E por último, a utilização de uma molécula
biofuncional é realizada principalmente para moléculas, como proteínas e anticorpos,
em que não é possível acrescentar um grupo tiol para a ligação direta na nanopartícula.
Nesta abordagem há a ligação covalente da biomolécula ao ligante anteriormente ligado
à nanopartícula. Várias moléculas podem ser utilizadas como ligantes e devem ser
selecionadas de acordo com a biomolécula a ser funcionalizada, uma vez que uma
extremidade do ligante se liga a AuNPs, geralmente por um grupo tiol, e a outra à
biomolécula. Portanto, a extremidade que não interage com a nanopartícula deve ser
compatível com a porção a ser ligada da molécula biológica para que a mesma não
20
perca sua atividade ou especificidade com antígenos, por exemplo (Figura 5D)
(AUBIN-TAM; HAMAD-SCHIFFERLI, 2008).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 6. Métodos de bioconjugação de nanopartículas de ouro. (A) Adsorção eletrostática; (B)
Interação direta de ligante; (C) Revestimento de superfície e; (D) Ligante biofuncional. Adaptado de
AUBIN-TAM et. al, 2008.
Com a ressonância de plasmon de superfície das nanopartículas é possível
monitorar a adsorção de moléculas pequenas (JUNG et al., 1998), ligação receptorligante, ligação de antígenos a anticorpos, interação DNA-proteína (FREY et al., 1995)
e então, utilizar destas abordagens para o desenvolvimento de sistemas de
biosensoramento (HALL, 2001).
21
1.2.4
Toxicidade celular e Biocompatibilidade
A nanotecnologia tem sido incorporada em diversas abordagens devido suas
propriedades físicas únicas. E, por causa desta ampla utilização, há uma preocupação
iminente quanto aos danos que possam causar a saúde e os impactos ao meio ambiente
(GRANMAYEH RAD; ABBASI; AFZALI, 2011). Isto, principalmente para aquelas
exploradas em certas aplicações, como alta reatividade da superfície e a capacidade de
atravessar membranas celulares. Acredita-se que, dificilmente as nanopartículas serão
introduzidas no organismo humano em quantidade suficiente para causar efeito tóxico,
mas que alguns possam ser inalados constantemente em local de trabalho. Dessa forma,
medidas de prevenção contra exposição humana e ambiental constante devem ser
tomadas e controladas (DOWLING et al., 2004).
Entretanto, apesar das suas características únicas, a utilização dos nanobastões de
ouro no campo das ciências biológicas pode ser reduzida devido à presença do brometo
citotóxico hexadeciltrimetilamônio (CTAB), um detergente catiônico usado como
agente estabilizador durante a síntese das partículas pode ser tóxico às células humanas
quando livres (CHANG; LEE; WANG, 1997; HUANG; NERETINA; EL-SAYED,
2009). Uma alternativa para reduzir a citotoxicidade do CTAB, seria lavar as
nanopartículas de ouro em solução por centrifugação (CONNOR et al., 2005) ou, já que
a falta do CTAB pode resultar em agregação das partículas, estabilizá-los em condições
biocompatíveis funcionalizando-os com fosfatidilcolina (TAKAHASHI et al., 2006).
22
1.3
Biosensoramento
Técnicas de detecção foram aperfeiçoadas ao longo do tempo devido à
necessidade de um diagnostico rápido e que pudesse ser empregado na rotina de
laboratório de todo o mundo. Vários métodos de detecção por biosensoriamento já
foram desenvolvidos, dentre eles os mais utilizados e que são baseados em marcadores
são fluorescência, quimiluminescência e radioativo. Entretanto, estas metodologias
ainda possuem um alto custo e necessitam de treinamento especializado. Por isso, os
biossensores livres de marcadores deverão se tornar os mais estudados e utilizados por
serem de fácil manipulação, maior sensibilidade e estabilidade e serem passíveis de
miniaturização (SANG et al., 2015).
Um dos principais desafios enfrentados no desenvolvimento de sensores
bioanalíticos é melhorar a eficiência e sensibilidade, pelas quais biomoléculas de baixo
massa molecular são detectadas em baixas concentrações em um fluido biológico
complexo. O sinal do sensor é geralmente proporcional à cobertura da superfície, o que
tipicamente é diretamente dependente da afinidade da interação e concentração de
grandes quantidades de moléculas alvo. Quanto menor for a afinidade ou a
concentração, menor se torna a superfície de cobertura. Portanto, é fundamental que os
sensores sejam suficientemente sensíveis para detectar a baixa cobertura de
biomoléculas alvo adsorvidas (proteínas, peptídeos, DNA e RNA) dentro de um curto
prazo e pequenos volumes de amostras (ERIK REIMHULT AND FREDRIK HOOK,
2015). Uma alternativa para isso seria o desenvolvimento de sensores baseados em
propriedades físico-químicas de nanometais.
1.3.1 Sensores baseados em Ressonância plasmônica de superfície (SPR)
A ressonância de plasmon é considerada uma das ferramentas mais importantes de
biosensoriamento, uma vez que com ela é possível transformar a informação de
reconhecimento biológico em sinais de deslocamento de comprimento de onda de forma
precisa, sensível e em tempo real (JAIN, 2005; ZHAO et al., 2014). Um estudo
realizado em 2014 demonstrou que o método de biosensoriamento por SPR é melhor
que outros sensores ópticos. Isso porque nele é possível analisar a interação das
23
moléculas funcionalizadas no ouro com moléculas em solução sem que seja necessário
qualquer tipo de marcação molecular além de reduzir tempo de análise e preparo das
amostras (OLARU et al., 2015).
Metais nobres possuem propriedades ópticas únicas, que podem ser detectadas por
várias tecnologias como, absorção óptica, fluorescência, dispersão Raman, força
atômica e magnética e condutividade elétrica. Uma importante propriedade única do
ouro é a forte ressonância de plasmon, com isso as nanopartículas de ouro se tornam
excelente alternativa para o biosensoriamento (JAIN, 2005; ZHAO et al., 2014;
OLARU et al., 2015).
Além disso, as nanopartículas são facilmente funcionalizadas com moléculas de
reconhecimento (como anticorpos, antígenos, oligonucleotídeos, etc.) por métodos que
levam a conjugados altamente estáveis (WILSON, 2008). Uma das várias aplicações de
biossensores é baseadas na mudança no comprimento de onda devido a mudanças nas
propriedades dielétricas das partículas (SPR) resultante da ligação de moléculas
biológicas, tais como anticorpos, à nanopartículas de ouro (NATH et. al., 2004).
Muitos biossensores baseados em SPR já foram estudados e desenvolvidos para a
detecção de várias doenças, como por exemplo, a detecção da Síndrome da mancha
branca em crustáceos utilizando DNA funcionalizado às AuNPs (SEETANG-NUN et
al., 2012) e até mesmo de detecção de DENV através da ligação de DNAzyme às
AuNPs (CARTER et al., 2013). Em 2011 um estudo desenvolveu um imunossensor
promissor capaz de detectar o antígeno carcinoembrionário que é biomarcador de câncer
(ALTINTAS et al., 2011).
Os imunossensores são baseados em anticorpos policlonais ou monoclonais, que
são geralmente utilizados em ensaios imunológicos, pois são capazes de identificar e até
quantificar proteínas específicas em soluções repletas de outras proteínas, componentes
celulares, entre outros. A partir disso, também podem ser utilizados na identificação de
doenças (MILSTEIN, 1975; CRUZ et. al., 2002) como biossensores baseados na
detecção da interação especifica de anticorpos com antígenos (HAMMOCK, 1995). E o
principal motivo de se utilizar imunorreações é pelo fato de serem altamente sensíveis e
seletivas (PRICE, 1998).
24
II. JUSTIFICATIVA
2.
JUSTIFICATIVA
A dengue é conhecida como a arbovirose mais importante da atualidade,
colocando aproximadamente metade da população mundial em áreas de risco iminente
de transmissão. Uma vez que a transmissão dos diferentes sorotipos do DENV pode
ocasionar manifestações clínicas que variam de infecção assintomática até casos graves
e potencialmente fatais. Uma forma de evitar a morbidade e mortalidade causadas seria
o controle do vetor e diagnóstico precoce e específico, que se tornam ainda mais
necessários devido a circulação de Chikungunia vírus, o qual é transmitido pelo mesmo
mosquito vetor e causador da doença de sintomatologia semelhante a Dengue, a Febre
Chikungunia.
O diagnóstico definitivo da infecção pelo DENV depende do isolamento viral, da
detecção de antígenos virais ou RNA em soro ou tecidos, ou da detecção de anticorpos
específicos no soro dos pacientes. Destes, os métodos imunoenzimáticos frequentes na
rotina clínica para se confirmar uma infecção recente pelo DENV, principalmente em
razão de sua alta sensibilidade e rapidez. Porém, métodos sorológicos apresentam
limitações: dependem do fim do período da resposta imunológica para que o diagnóstico
seja concluído e apresentam sensibilidade diminuída em relação à possibilidade de
identificação do sorotipo infectante, já que ocorrem reações cruzadas entre os diferentes
sorotipos do DENV. Além disso, para amostras de mosquitos a detecção de DENV é
possível apenas com biologia molecular, isolamento de vírus em cultura e testes em
validação baseados em cromatografia ou ELISA lateral.
Portanto, uma tecnologia de biossensor acoplada com o uso de nanopartículas
metálicas oferece benefícios comparados aos métodos tradicionais com relação ao
tempo de análise, sensibilidade e simplicidade de manipulação. A partir disso, este
trabalho propõe desenvolver e analisar a eficácia de metodologias de funcionalização de
nanopartículas de ouro com anticorpos específicos anti-DENV e anti-flavivirus e a
ligação dos mesmos aos antígenos. Logo, poderá ser implementado um novo método de
diagnóstico de baixo custo de produção e ser ainda mais rápido, preciso e prático que as
técnicas já existentes. E ainda contribuir para estudos de vigilância da virologia em
mosquitos.
26
III. OBJETIVOS
3.
OBJETIVOS
3.1
Objetivo Geral
Desenvolver e avaliar a eficácia de um sistema de detecção de Dengue vírus
baseado em ressonância plasmônica utilizando nanopartículas de ouro.
3.2
Objetivos Específicos
1.
Expandir e titular DENV 1 e DENV 2;
2.
Purificar anticorpos monoclonais em coluna de afinidade, a partir de sobrenadante
de célula;
3.
Estabelecer
a
melhor
concentração
de
anticorpos
monoclonais
para
funcionalização de nanopartículas de ouro;
4.
Analisar a capacidade de detecção de Dengue virus por nanopartículas de ouro.
28
IV MATERIAIS E MÉTODOS
4.
MATERIAIS E MÉTODOS
4.1
Células
Células de linhagem C6/36 de mosquito Aedes albopictus foram propagadas em
meio Leibovitz´s L15 (Cultilab, Campinas, SP), suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB - Cultilab, Campinas, SP), 2,5 μg/mL de anfotericina B (Cultilab,
Campinas, SP) e 100U/50 µg/mL de penicilina/Streptomicina (Sigma, Campinas, SP.
Brasil) em B.O.D. à 28ºC, para as passagens do vírus.
Os Hibridomas da linhagem 3H5-1 (ATCC® HB-46TM) e D1-4G2-4-15 (ATCC®
HB-112TM) foram propagadas em meio RPMI 1640 (Sigma, Campinas, SP.),
suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,05 mM de 2-Mercaptoetanol (GE
Healthcare Life Sciences), 100U/50 µg/mL de penicilina/estreptomicina (Sigma,
Campinas, SP. Brasil), 1mM de HEPES (Sigma, Campinas, SP.) e 2,7 g/L Bicarbonato
de sódio e mantidas em estufa a 37°C e 5% de CO2.
4.2
Vírus
4.2.1
Expansão viral
Estirpes de DENV foram propagadas, a fim de aumentar o título do vírus e o
volume da reserva de vírus. Para isso, 300 µL de suspensão de vírus foram adicionados
a 3700 µL de meio em um tubo de centrífuga (tipo Falcon®) de 12 mL estéril. O meio
da garrafa (75cm2) de cultivo de célula contendo células C6/36 foi retirado e a mesma
lavada com Tampão Fosfato (PBS) 1X (NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4) e a solução
anteriormente preparada de 4 mL contendo o vírus adicionado à garrafa. Esta foi então
incubada em estufa (B.O.D; 25ºC) por 1 hora e após, este tempo completou-se o volume
do frasco para 5 mL com meio de cultivo. A incubação em estufa foi mantida até que a
formação de sincícios, forma diferenciada das células decorrente de citopatogenicidade,
fosse observada (3-4 dias pós-infecção). O sobrenadante celular foi recolhido por
30
centrifugação a 4.000 x g por 10 minutos a 4°C. Por fim, O sobrenadante foi distribuído
em alíquotas de 100 µL e armazenado a -70°C.
4.2.2
Titulação viral
Placas de 6 poços com concentração de 1x106 células LLCMK2/poço foram
incubadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB Cultilab, Campinas, SP), 2,5 μg/mL de anfotericina B (Cultilab, Campinas, SP) e
100U/50 µg/mL de penicilina/Streptomicina (Sigma, Campinas, SP. Brasil) por 24
horas em estufa B.O.D 37°C e 5% de CO2. Após este tempo, o vírus a ser titulado foi
diluído em série de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7. Os poços das placas foram
então lavados com PBS e 250 µl da diluição acrescentados ao poço correspondente. Ao
término de 1 hora de incubação em estufa os poços foram novamente lavados com PBS
e acrescentados de meio de cultura contendo carboxi-metil-celulose 1,5%. A placa foi
novamente incubada em estufa por 7 dias. A titulação foi revelada com formol 10% e
0,5mL de cristal violeta (diluição 1:50 - em água). Com a completa coração das placas,
o título de infectividade é expresso pelo número de Unidades Formadoras de Placas/ml.
UFP/ml = número de focos contados X recíproca de diluição
Volume inoculado (ml)
4.3
Imunoglobulinas
4.3.1
Indução da produção
Para induzir os Hibridomas a produzirem anticorpos anti-flavivirus (D1-4G2-415/ATCC® HB-112TM) e anti- DENV2 (3H5-1/ ATCC® HB-46TM) a cultura de células
foi mantida em garrafas de 175 cm2 com 20 mL de meio RPMI a 2% de soro fetal
bovino por 2-4 dias, até que o meio se apresentasse altamente metabolizado. Depois
31
deste tempo, as células foram centrifugadas a 210 x g por 10 minutos e o sobrenadante
armazenado a -20°C.
4.3.2
Concentração (Viva Spin®)
O sobrenadante coletado a partir da cultura de Hibridomas após a indução da
produção de imunoglobulinas foram centrifugados em tubos Viva Spin® (GE Healthcare
Life Sciences), a fim de concentrar os anticorpos produzidos e eliminar impurezas
provenientes do metabolismo celular e de meio de cultura. As amostras foram
centrifugadas a 4000 x g por 40 minutos em Viva Spin® 20 – 100000 MWCO (GE
Healthcare Life Sciences), uma vez que imunoglobulinas possuem tamanho aproximado
de 150 KDa, e depois, lavadas com PBS 1X (NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4).
4.3.3
Purificação
As imunoglobulinas foram purificadas com a utilização de Coluna HiTrap
ProteinG HP (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com o fabricante. Foi utilizado
Tampão de ligação com Fosfato de sódio a 20 mM (pH 7,0), Tampão de Eluição com
Glicina-HCl a 100mM (pH 2,7) e Tampão de Neutralização com Tris-HCl a 1M (pH
9,0).
Após a purificação as frações coletadas se encontram com excesso de sal devido
os tampões utilizados. Desta forma, o purificado coletado foi novamente centrifugado
em tubos Viva Spin® (GE Healthcare Life Sciences). As amostras foram centrifugadas a
4000 x g por 20 minutos em Viva Spin® 20 – 100000 MWCO (GE Healthcare Life
Sciences), uma vez que imunoglobulinas possuem tamanho aproximado de 150 KDa, e
lavadas um vez com PBS 1X (NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4). Ao final foram
ressuspendidas em PBS e mantidas a -20°C.
4.3.4
Quantificação
Agora, as amostras purificadas e livres de sal foram quantificadas por Dye
Concentrate Reagente (Bio-Rad Protein Assay). Uma curva de calibração foi construída
32
empregando-se o BSA como padrão. Para isso utilizou-se a faixa de concentração de
0,05 mg/mL a 0,5 mg/mL de BSA, a 10 µL de cada concentração foi adicionado 200 µL
do reagente diluído em água (1:4), e o mesmo foi feito para as amostras a serem
quantificadas. A absorbância foi medida em espectrofotômetro UV-Vis (UV-1800,
SHIMADZU) a 595 nm e o cálculo de concentração das amostras foi feito com base na
equação da reta obtida na curva padrão realizada.
4.3.5
Verificação da eficiência da purificação
Para confirmar a integridade das imunoglobulinas após a purificação foi realizada
uma eletroforese em gel de poliacrilamida de 0,7 mm de espessura contendo dodecil
sulfato de sódio (SDS), conhecido como SDS-PAGE.
O gel é composto por duas fases: gel de empilhamento (ou de concentração) e gel
de separação. Este gel foi feito a 12% adicionando água ultra pura (2,46 mL), tampão
Tris-HCl 1,5M a um pH 8,8 (1,75 mL), Acrilamida/Bis 30% (2,33 mL), SDS 20% (8,75
µL), 70 µL de persulfato de amônio a 10% (APS – Vetec, Rio de Janeiro, RJ) e 7 µL de
TEMED (BioAgency, São Paulo, SP). Após leve agitação, a mistura foi distribuída
entre placas do kit Mini-Protean® (Bio-Rad) até a completa polimerização. Já o gel de
empilhamento, que é necessário para o alinhamento das proteínas em um mesmo nível
no gel de eletroforese, foi feito a 5% adicionando água ultra pura (2,34 mL), tampão
Tris-HCl 0,5M a um pH 6,8 (1ml), Acrilamida/Bis 30% (1,86 mL), SDS 20% (6,4 µL),
APS 10% (40 µL) e TEMED (4 µL). Esta mistura foi então, aplicada sobre o gel de
separação. O pente para a formação das canaletas foi encaixado entre as placas e
deixou-se a temperatura ambiente até a completa polimerização, aproximadamente 30
minutos. Após este tempo, o gel foi colocado em cuba do kit Mini-Protean® (Bio-Rad) e
submerso em tampão de corrida (0,25M Tris-HCl; 1,9M Glicina; 1% SDS).
As amostras a serem analisadas foram aquecidas a 100ºC por 10 minutos
juntamente com o tampão de amostra tampão de amostra (Tris-HCl 0,125M pH 6,8;
SDS 4%; glicerol 20%, azul de bromofenol 0,002%) e aplicadas no gel. A cuba foi
conectada a uma fonte e aplicada uma voltagem de 60V até as bandas se alinharem no
33
limite entre as duas fases do gel. Em seguida foi aplicado 120V para o restante da
eletroforese.
Após a eletroforese, o gel foi transferido para um recipiente contendo solução
fixadora (40% metanol; 10% ácido acético e 50% de água ultra pura) e mantido sob
agitação por no mínimo 40 minutos. O gel foi corado com a solução de Comassie Blue
(1,2g de Comassie Blue®, 300 mL de metanol, 60ml de ácido acético e 240ml de água
ultra pura) durante 15 minutos sob agitação. Por último, o gel foi descorado com a
solução descorante (10% metanol; 7% ácido acético; 83% de água ultra pura) por
aproximadamente 2 horas. A visualização das bandas foi realizada por comparação com
o padrão de peso molecular para proteínas (Bio-Rad).
4.4
Nanopartículas de Ouro
4.4.1
Biofuncionalização
As nanopartículas de ouro foram sintetizadas por método mediado por semente e
cedidas pelo Laboratório de Nanomateriais do Departamento de Física da Universidade
Federal de Minas Gerais em colaboração com o Prof. Dr. Luiz Orlando Ladeira.
Nesta síntese foi utilizada ácido cloroáurico (HAuCl4) 0,1mM e Cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB) sob agitação por 1 hora em banho térmico a
40°C para a formação das primeiras partículas. Então, adiciona-se uma solução de
crescimento, contendo 0,2M de ácido cloroáurico e CTAB, e 0,2M de ácido ascórbico
até que ocorra a mudança de cor da solução de dourado para transparente. Após, uma
solução de nitrato de prata (AgNO3) em banho térmico a 30°C por até 48 horas,
controlando assim o tamanho de crescimento dos nanobastões. Por fim, os nanobastões
são purificadas, retirando o excesso de CTAB por centrifugação a 5600 g por 15
minutos, e caracterizados por microscopia.
Biomoléculas foram funcionalizadas em nanopartículas de ouro por intermédio de
reagentes ligantes como cisteamina e polietilenoimina. Isso deve ser realizado para que
o grupo tiol ou resíduo amina de uma das extremidades dos reagentes se ligue ao ouro e
o grupo amina (-NH2) da outra extremidade se ligue covalentemente ao grupo carboxila
(-COOH) da porção C-terminal do anticorpo. Para que ocorra a ligação dos radicais
34
carboxilas com os aminas é necessário uma reação de amidação por diimida. Por isso, é
utilizado cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida (EDAC) como
agente acoplante e N-hidroxisuccinimida (NHS) como agente estabilizante, o qual
converte os ácidos carboxílicos em ésteres ativos, que em seguida interagem com os
grupos amina dos reagentes ligantes.
4.4.2
Ligação com Cisteamina
A ligação de cisteamina (HSCH2CH2NH2) foi realizada para que fosse possível a
funcionalização dos anticorpos. Para isso, 250 µL de solução de nanopartículas foram
centrifugados a 4000g por 10 minutos, ressuspendidos em 250 µL de cisteamina (0,5
mM em água ultra pura) e incubados a temperatura ambiente por ultrasonicação por 30
minutos, para desestabilização do CTAB presente na superfície das nanopartículas.
Após, nanopartículas ligadas a cisteamina foram centrifugadas a 4000g por 10 minutos
e ressuspendidas em 250 µL contendo anticorpo previamente preparado.
Figura 7 Cisteamina. Fórmula química.
4.4.3
Ligação com Polietilenoimina (PEI)
Para que fosse possível a funcionalização dos anticorpos foi realizada a ligação de
polietilenoimina ((C2H5N)n), o qual é capaz de mediar a ligação eletrostática
nanobastão-anticorpo devido aos vários grupos amina reativos (ZAPP et al., 2014). Para
isso, 250 µL de solução de nanopartículas foram centrifugados a 4000g por 10 minutos,
ressuspendidos em 250 µL de polietilenoimin (0,3% em água ultra pura) e incubados a
temperatura ambiente por ultrasonicação por 30 minutos, para desestabilização do
CTAB presente na superfície das nanopartículas. Após, a solução foi novamente
35
centrifugada a 4000g por 10 minutos e ressuspendidas em 250 µL de anticorpo
previamente preparado.
Figura 8 Polietilenoimina. Fórmula química.
4.4.4
Imunoglobulinas
Afim de testar a capacidade de detecção das nanopartículas de ouro, estas foram
incubadas com diferentes concentrações (50, 10, 2, 0,4 e 0,08 µg/mL) de anticorpos. A
solução de imunoglobulina foi previamente preparada de modo que a concentração
correspondente de anticorpo foi adicionado 30mM EDAC/HNS (0,4M:0,1M) e Tampão
fosfato (PBS1X, pH 7,4, NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 em água ultra pura) para um
volume final de 250 µL e depois, incubada por 30 minutos a 4°C. Por fim, a reação de
nanopartículas funcionalizadas com cisteamina/polietilenoimina e anticorpos foi
realizada por uma hora a temperatura ambiente em banho ultrassônico. Ao final deste
tempo foram novamente centrifugadas a 4000 g por 10 minutos e ressuspendidos em
100µl de PBS e 100µl de solução com vírus.
4.4.5
Ensaios com DENV
Para analisar a sensibilidade de detecção uma diluição com diferentes valores de
Unidades formadoras de placas (UFP) de Dengue vírus foi realizada em PBS para um
36
volume final de 100 µL e depois adicionada à concentração definida de anticorpo ligada
às nanopartículas. A reação ocorreu em temperatura ambiente por 30 minutos.
4.4.6.
Análise em UV-Vis
Para a análise das reações, os espectros foram medidos em espectrômetro UV-Vis
(UV-1800, SHIMADZU), no qual é possível detectar as alterações dos elétrons de
superfície resultantes da ligação anticorpos-antígenos, por deslocamento do espectro
gerado.
4.4.7.
Tratamento dos dados
Os dados resultantes da leitura em espectrômetro UV-Vis foram normalizados
utilizando PeakFit v4 e os gráficos foram gerados em GraphPad Prism.
4.4.8.
Leitura de Potencial Zeta
Nanopartículas de ouro funcionalizadas com anticorpos foram também analisadas
por leitura de Potencial Zeta, com o qual é possível medir a estabilidade e a ligação de
moléculas nas partículas. Para as leituras 10 µL de amostra, ressuspendida em PBS,
foram diluídos em 1,5 mL de água ultra pura e então, aplicados em cubetas específicas.
As medidas foram feitas utilizando Zetasizer (NanoSeries – Malvern) no laboratório
multiusuários da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto.
37
V RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1
Purificação de anticorpos monoclonais por coluna de afinidade
Após a indução de hibridomas para a produção de imunoglobulinas, o
sobrenadante coletado foi purificado em coluna de afinidade. Para verificar a pureza das
amostras, foi realizado um SDS-PAGE a 12% e aplicado aproximadamente 8µg de
proteína (FIGURA 9). As imunoglobulinas da classe IgG tem tamanho aproximado de
150 KDa, sendo duas cadeias pesadas de 50KDa e duas cadeias leves de 25KDa
(STRANFORD, 2009). Dessa maneira, as bandas destacadas (50 e 25KDa), sob
condição
desnaturante,
representam
as
duas
cadeias
(pesada
e
leve)
das
imunoglobulinas purificadas. A ausência de demais bandas demonstra a eficiência da
purificação.
A
PMM
AF
B
50 KDa
50 KDa
25 KDa
25 KDa
PMM
AD2
Figura 9 SDS-PAGE 12% de imunoglobulinas purificadas em coluna de afinidade. Amostras de
sobrenadante de célula foram purificadas em coluna de afinidade. As bandas em destaque representam
as cadeias pesada (50KDa) e leve (25KDa) dos anticorpos, sob condição desnaturante. (A) Anticorpo
anti-flavivirus (AF) e (B) anti-denv2 (AD2). PMM: padrão de massa molecular.
39
5.2
Análise da concentração de ligante
As AuNPs se ligam facilmente a várias moléculas, mas no caso de proteína não
tioladas, como os anticorpos a serem utilizados, é necessário a ligação de um reagente
que atue como intermediário da ligação nanobastões-anticorpos. Para isso então,
primeiramente foi determinada a melhor concentração de ligante para ser funcionalizado
com nanobastões de ouro, incubando várias concentrações (0,01; 0,1; 0,5 e 1mM) de
cisteamina aos mesmos (Figura 10).
Já foi visto que pode ocorrer uma modificação na intensidade da extinção devido a
alteração na concentração de partículas, muitas vezes causado pelos processos de
centrifugação e lavagem da amostra. No entanto, mudança no comprimento de onda das
bandas de plasmon é determinada pela modificação nas propriedades dielétricas das
nanopartículas, ou seja, nestes casos, o deslocamento ocorre quando há a ligação
covalente do reagente à nanopartícula de ouro (YU; IRUDAYARAJ, 2007). Por isso,
podemos sugerir que os deslocamentos apresentados nos resultados representam a
ligação das moléculas às AuNPs.
É possível observar que com as concentrações de 0,01mM (Figura 10A), 0,1 mM
(Figura 10B) e 0,5mM (Figura 10C) o perfil do espectro se manteve e houve
deslocamento. Entretanto, quando as AuNPs foram incubadas com 1mM de cisteamina
parece ter ocorrido aglomeração, sugerido pela mudança do perfil do espectro se
comparado com AuNPs puras (vermelho). Uma vez que esta aglomeração pode impedir
a posterior ligação dos anticorpos, definimos que a concentração a ser utilizada seria de
0,5mM, a qual apresentou deslocamento sem perfil de aglomeração.
40
A
B
C
D
Figura 10 Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de cisteamina. (A) Espectro
resultante da ligação de 0,01 mM de cisteamina às AuNPs com um deslocamento de 13 nm. (B) Ligação
de 0,1 mM com 31 nm de deslocamento. (C) Ligação de 0,5 mM com 13 nm de deslocamento. (D)
Ligação de 1 mM com 24 nm de deslocamento. Linha vermelha (AuNPs): nanopartículas puras. Linha
azul: diferentes concentrações de cisteamina ligadas às nanopartículas.
A definição da concentração também foi realizada com
o reagente
Polietilenoimina (PEI) (Figura 11). Pela análise dos espectros apresentados foi
verificado que três das quatro concentrações testadas apresentaram perfil de
aglomeração das nanopartículas, o que poderia prejudicar a ligação dos anticorpos e
subsequente detecção do vírus. Tais concentrações variam entre: 0,05%, 0,1% e 0,2%
(Figura 11A - C). Dessa forma, selecionamos para os posteriores procedimentos de
ligação do anticorpo a concentração de 0,3% de PEI (Figura 11D).
41
A
B
C
D
Figura 11 Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de polietilenoimina. (A) Espectro
resultante da ligação de 0,05% de PEI às AuNPs com um deslocamento de 90 nm. (B) Ligação de 0,1%
com 90 nm de deslocamento. (C) Ligação de 0,2% com 62 nm de deslocamento. (D) Ligação de 0,3% com
32 nm de deslocamento. Linha vermelha (AuNPs): nanopartículas puras. Linha azul: diferentes
concentrações de polietilenoimina ligadas às nanopartículas
5.3 Definição da concentração de anticorpos
Após a definição da concentração do ligante a ser utilizada foi necessário
determinar a concentração ideal de anticorpo. Para tanto, várias concentrações (50; 10;
2; 0,4 e 0,08µg/ml) de anti-flavivirus, específico para os vírus do gênero Flavivirus,
foram incubadas às AuNPs funcionalizadas com 0,5mM de cisteamina (Figura 13).
42
A
B
Figura 12 Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de anti-flavivirus na presença de
cisteamina. (A) Espectro de AuNPs puras (vermelho) e ligação de 0,5 mM de cisteamina às AuNPs
(Azul) com um deslocamento de 37 nm. (B) Ligação de várias concentrações (50; 10; 2; 0,4 e 0,08µg/ml)
do anticorpo às AuNPs funcionalizadas com 0,5mM de cisteamina (Controle) sem nenhum
deslocamento.
Foi possível observar que a ligação de cisteamina às nanopartículas manteve o
deslocamento visto anteriormente (Figura 13A), mas a ligação dos anticorpos não
mostrou qualquer deslocamento em nenhuma das concentrações testadas (Figura 13B),
demonstrando que não houve ligação e então, não seria eficiente na detecção quando
incubadas com vírus. Por isso, a cisteamina não foi considerada um bom ligante para
um sistema de biossensor.
O mesmo foi feito com AuNPs funcionalizadas com 0,3% de PEI (Figura 14). E, a
partir, das figuras apresentadas (Figura 14B-F) e da Tabela 1 podemos sugerir que a
melhor concentração a ser utilizada para a ligação às AuNPs/PEI é de 0,4µg/ml. Isto
porque, apresentou o maior valor de deslocamento de bandas de ressonância em relação
ao controle (AuNPs – PEI), se comparado com as demais concentrações. Com as
maiores concentrações (10µg/ml e 50µg/ml) não obtivemos um maior deslocamento,
como era esperado, e uma explicação para tal poderia ser o fato do excesso de anticorpo
resultar no impedimento da ligação por competição.
43
A
B
C
D
E
F
Figura 13 Espectroscopia de UV-Vis da análise de concentração de anti-flavivirus na presença de
polietilenoimina. (A) Espectro de AuNPs puras (vermelho) e ligação de 0,3% de polietilenoimina às
AuNPs (Azul) com um deslocamento de 32 nm. (B) Ligação de 0,08 µg/ml. (C) Ligação de 0,4 µg/ml.
(D) Ligação de 2 µg/ml. (E) Ligação de 10 µg/ml. (F) Ligação de 50 µg./ml Linha azul (Controle):
AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina.
44
Tabela 1 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para a diferentes
concentrações de anit-flavivirus.
Controle/
Concentração
Comprimento
de onda
Deslocamento
(nm)
Controle
748
-
0,08 µg/ml
724
24
0,40 µg/ml
716
32
2,00 µg/ml
742
6
10,0 µg/ml
730
18
50,0 µg/ml
754
6
Além da leitura em UV-Vis as amostras de AuNPs ligadas a cisteamina ou
polietilenoimina e às várias concentrações de anticorpos foram submetidas a leitura de
Potencial Zeta (Figura 12). Este consiste em uma medida tanto da estabilidade quanto
da ligação de moléculas nas partículas, na qual, os valores mais negativos ou positivos
estão associados com a solução mais estável, uma vez que a repulsão entre as partículas
reduz a agregação das partículas (CHUMAKOVA et al., 2008).
A
B
Figura 14 Potencial Zeta (mV) para as diferentes concentrações de anti-flavivirus. (A) Ligação de
anticorpo em várias concentrações às AuNPs funcionalizadas a Cisteamina (Controle). (B) Ligação de
várias concentrações de anticorpo às AuNPs funcionalizadas a PEI (Controle). AuNP representa as
nanopartículas puras.(n= 10-14 para cada reação).
45
Os nanobastões de ouro são sintetizados com CTAB, uma molécula carregada
positivamente que confere estabilidade às AuNPs, mas após a ligação de outras
moléculas na superfície das nanopartículas parte deste CTAB é retirado. Quando isso
ocorre a medida do potencial zeta deve ser reduzida, uma vez que perde a estabilidade
oferecida pelo CTAB, entretanto, este valor deve ser diferente de zero. No caso de
moléculas carregadas positivamente o valor de potencial zeta continua positivo, mas se
for negativamente o valor se torna negativo (LIOPO et al., 2012).
A Figura 12A representa a medida de potencial zeta da funcionalização de
AuNPs/Cisteamina ao anticorpo, ocorreu redução dos valores indicando que houve a
ligação das nanopartículas ao anticorpo, mas o mesmo não pôde ser observado na
amostra controle (AuNP-Cisteamina). É um resultado que não corrobora aquele obtido
por espectroscopia e uma explicação para isso é que as imunoglobulinas tenham sido
adsorvidas na superfície da nanopartícula e não ligadas covalentemente. Isso porque, a
leitura de espectro de ressonância de plasmon possui maior sensibilidade que potencial
zeta. Já na Figura 12B está representada a funcionalização de anticorpo com
nanopartículas ligadas a PEI e este resultado, entretanto, corrobora com o encontrado na
leitura em UV-Vis. Os valores de potencial zeta da amostra controle e das amostras com
anticorpos foram reduzidos, mas se mantiveram positivo, sugerindo que os anticorpos se
ligam de forma estável ao PEI.
5.4
Determinação do tempo de detecção
Para estabelecer o tempo que o sistema é capaz de detectar o vírus, foi feito um
ensaio, mostrado na figura 15, em que 5000 UFP/ml foram adicionados às AuNPs-PEI.
Logo após a adição do vírus foi realizada a primeira leitura em espectrofotômetro
(Tempo 0), na qual já pôde ser observado um deslocamento de 18 nm (Tabela 2),
indicando a alta sensibilidade do biossensor proposto.
As leituras seguintes ao Tempo 0 foram feitas de dois em dois minutos até
alcançar 10 minutos, depois de cinco em cinco até os 30 minutos e de dez em dez até 60
minutos (Figura 16). O deslocamento aumentou proporcionalmente ao tempo de
incubação, como pode ser visto tanto na figura 16 quanto na tabela 2. No entanto, 30
minutos de incubação foi considerado um tempo suficientemente satisfatório, uma vez
46
que apresentou apenas 8 nm de diferença no deslocamento se comparado com a leitura
de 60 minutos. Se comparado a técnicas já existente, as quais geralmente requerem um
maior tempo de detecção, o ensaio o neste trabalho mostrou-se eficiente com um
resultado em curto prazo. Portanto, no que refere ao tempo necessário para realização
do teste, este sistema apresenta bons atributos para uma detecção rápida para Dengue.
B
A
Figura 15 Espectroscopia de UV-Vis da análise de tempo de detecção do Dengue vírus. (A) Espectro
de detecção de vírus nos diferentes tempos testados: 2 em 2 minutos até 10 minutos e de 5 em 5 minutos
até 1 hora. (B) Espectro da detecção do vírus nos quatro principais tempos (0, 15, 30 e 60 minutos). Linha
azul (Controle): AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina e 0,4µg /ml de anti-flavivirus.
Tempo 0: leitura imediatamente após a adição do vírus. Para cada amostra foi adicionado 5000UFP/ml do
DENV1.
Tabela 2 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para a análise de tempo
de detecção de Dengue vírus.
Controle/
Tempo
Comprimento
de onda
Deslocamento
(nm)
Controle
765
-
Tempo 0
783
18
15 minutos
806
41
30 minutos
820
55
60 minutos
828
63
47
Figura 16 Análise da variação de deslocamento para diferentes tempos de detecção de Dengue vírus.
Tempo de detecção de vírus nos diferentes tempos testados: 2 em 2 minutos até 10 minutos e de 5 em 5
minutos até 30 minutos e 10 em 10 até 1 hora. Tempo 0: leitura imediatamente após a adição do vírus.
Para cada amostra foi adicionado 5000UFP/ml do DENV1.
5.5
Análise de sensibilidade e especificidade
Um biossensor sensível tem que ser capaz de detectar pequenas quantidades de
moléculas. Por isso, foi feito um ensaio em que várias concentrações de vírus, expressas
em Unidades Formadoras de Placa (UFP), foram incubadas às AuNPs funcionalizadas a
0,3% de PEI e 0,4µg/ml de anti-flavivirus (Figura 17).
Como pode ser observado na figura 17 e tabela 3 com 50 UFP/ml (10 UFP) um
pequeno deslocamento de 4 nm ocorreu, mas se torna mais evidente com 500 UFP/ml
(100 UFP), apresentando um deslocamento de 18 nm. Mais evidente ainda com as
maiores concentrações, 5000 UFP/ml e 50000 UFP/ml, como era esperado. O
deslocamento em baixas concentrações de vírus, mesmo que pequeno, pode indicar que
o método é sensível para a detecção de DENV1.
Além deste, foi realizado um ensaio em que as AuNPs funcionalizadas com PEI e
anticorpo anti-flavivirus foram incubadas com diferentes concentrações de Mayaro
vírus (MV), um vírus do gênero Alphavirus e família Togaviridae (TESH et al., 1999).
Uma vez que o anticorpo utilizado é específico para o gênero Flavivirus a ausência de
deslocamento após a incubação com vírus de outro gênero, como MV sugere a
especificidade do biossensor. A figura 18 e a tabela 4 mostram este resultado, nas quais
48
se observa que não houve detecção do MV em quatro das cinco concentrações testadas,
já que não ocorreu deslocamento em relação ao controle. Um deslocamento de 14 nm
ocorreu apenas na presença de alta concentração (500000 UFP/ml) de MV, a qual,
entretanto, não é encontrada em amostra biológica natural.
Desse modo, sugerimos que o biossensor pode ser rápido, sensível e específico
para a detecção de Flavivirus. Mas apesar de promissores, os resultados apresentados
são preliminares e o processo de funcionalização deve ser aperfeiçoado, com, por
exemplo, a utilização de outros ligantes que poderiam promover ligações ainda mais
estáveis. E ainda, serão necessários novos ensaios para validar a funcionalidade do
biossensor, utilizando amostras de sangue e de mosquitos macerados, os quais poderão
ser fatores limitantes, visto que a presença de outras proteínas inespecíficas nestas
amostras poderia dificultar a detecção eficiente do vírus.
Os resultados obtidos neste trabalho podem ainda ser utilizados como base para
outras aplicações. Ensaios de aglomeração podem ser realizados de modo que
nanobastões e principalmente nanoesferas se aglomerem na presença do antígeno,
podendo resultar no alargamento do pico de ressonância ou mesmo na mudança de cor
da solução (NIETZOLD; LISDAT, 2012). Além disso, técnicas como microfluidica
(HAN; LI; SEONG, 2013) e SERS (STUART et al., 2005) poderiam ser associadas a
ressonância de plasmon para facilitar e tornar a detecção ainda mais eficiente.
49
A
B
C
D
Figura 17 Espectroscopia de UV-Vis da análise da sensibilidade de detecção do Dengue vírus..
Espectro de detecção de DENV 1 nas diferentes concentrações (A) 10 UFP (50 UFP/ml). (B) 100 UFP
(500 UFP/ml). (C) 1000 UFP (5000 UFP/ml) e (D) 10000 UFP (50000 UFP/ml). Linha azul (Controle):
AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina e 0,4µg/ml de anti-flavivirus.
Tabela 3 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica para análise de
sensibilidade de detecção de Dengue vírus.
Controle/
Concentração
Comprimento
de onda
Deslocamento
(nm)
Controle
760
-
10 UFP
764
4
100 UFP
778
18
1000 UFP
815
55
10.000 UFP
810
50
50
A
B
C
D
E
Figura 18 Espectroscopia de UV-Vis da análise da sensibilidade de detecção do Mayaro vírus.
Espectro de detecção de Mayaro virus nas diferentes concentrações (A) 10 UFP (50 UFP/ml). (B) 100
UFP (500 UFP/ml). (C) 1000 UFP (5000 UFP/ml), (D) 10000 UFP (50000 UFP/ml) e (E) 100000
(500000 UFP/ml). Linha azul (Controle): AuNPs funcionalizadas com 0,3% de polietilenoimina e
0,4µg/ml de anti-flavivirus.
51
Tabela 4
Tabela 4 Variação de deslocamento de bandas de ressonância plasmônica da análise da
sensibilidade de detecção do Mayaro vírus.
Controle/
Concentração
Comprimento
de onda
Deslocamento
(nm)
Controle
760
-
10 UFP
760
0
100 UFP
760
0
1000 UFP
760
0
10.000 UFP
760
0
100.000 UFP
774
14
52
VI. CONCLUSÕES
6.
CONCLUSÕES
Foi possível obter e purificar as imunoglobulinas com os métodos empregados
para que pudessem ser utilizadas na funcionalização em nanopartículas de ouro. Além
disso, a ligação de polietilenoimina às AuNPs foi bem sucedida, sendo possível a
ligação das imunoglobulinas na concentração determinada.
Por fim, as nanopartículas de ouro funcionalizadas com polietilenoimina e antiflavivirus foram capazes de detectar partículas virais nos primeiros minutos de
incubação com DENV1 e em baixas concentrações. O mesmo não foi observado quando
as mesmas foram incubadas com MV, para o qual o anticorpo não é específico.
Portanto, a partir dos ensaios realizados e dos resultados alcançados sugerimos que o
biossensor proposto é rápido, sensível para a detecção de DENV1 e específico para a
detecção de Flavivirus.
54
VII. PERSPECTIVAS
7.
PERSPECTIVAS
1.
Funcionalizar nanopartículas de ouro com anti-DENV2 e testar a sensibilidade na
presença de diferentes concentrações de DENV2;
2.
Funcionalizar nanopartículas de ouro com PEG tiolado (SH-PEG), a fim de
aumentar a estabilidade das AuNPs funcionalizadas;
3.
Testar a capacidade e a especificidade de detecção de diferentes sorotipos de
DENV a partir de AuNPs funcionalizadas com imunoglobulinas específicas para cada
sorotipo;
4.
Testar a sensibilidade do biossensor para detecção de DENV em macerado de
mosquitos e plasma de pacientes infectados com DENV;
5.
Funcionalizar nanoesferas para testar a capacidade de agregação na presença de
DENV e viabilizar o desenvolvimento de um sistema de detecção baseado em
colorimetria.
56
VIII. REFERÊNCIAS
8.
REFERÊNCIAS
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