genotoxidade da triancinolona e do nitrado de prata em linfocitos

GENOTOXIDADE
DA TRIANCINOLONA
E DO NITRADO DE PRATA
EM LINFOCITOS UTILIZANDO
O TESTE COMETA*
CLAUDIO CARLOS DA SILVA, APARECIDO DIVINO
DA CRUZ
Resumo: este estudo trata-se da avaliação da genotoxidade induzida
pela preparação medicinal do acetonido de triancinolona e o nitrato de prata
em linfócitos T utilizando o ensaio cometa. A triancinolona tem grande poder antiinflamatório, enquanto que o nitrato de prata que pode ser utilizado
como cauterizador para eliminação de tumorações epidérmicas.
estudos, Goiânia, v.
. 339,
39, n.
n. 1,
2, p.
p. 83-87,
155-163,
jan./mar.
abr./jun.
2012.
2012.
Palavras-chave: Mutagênese. Ensaio Cometa. Triancinolona. Nitrato de
Prata.
O s estudos dos processos pelos quais as células sofrem mutações,
tanto espontaneamente como por indução devido à exposição aos
agentes ambientais, datam do início do século XX. Os resultados
desses estudos coincidiram com uma época em que a comunidade científica
procurava entender quais os grupos de agentes, presentes no ambiente, poderiam causar danos genéticos, e se essas alterações poderiam, eventualmente, causar efeitos adversos à saúde humana. Neste período foram levantadas
também, as questões a respeito das relações entre mutágenos e carcinógenos,
bem como aos efeitos mutagênicos causados por estes em células germinativas. Para enfrentar esse desafio, bioensaios toxicogenéticos começaram a ser
desenvolvidos desde o mais simples aos mais sofisticados. Atualmente, novas ferramentas genéticas estão disponíveis para o estudo de genotoxicidade
e mutagenicidade, incluindo o uso de animais transgênicos, bem como o uso
de marcadores moleculares, microarranjos, estudos genômicos, proteômicos
e de bioinformática (RIBEIRO et al., 2003).
Os agentes mutagênicos são responsáveis por alterações na sequência do DNA.
Podem influenciar no número e no surgimento de mutações associadas ao desenvolvimento de neoplasias. Uma célula poderá acumular mutações que, se em número
elevado, poderão determinar a perda do controle de sua divisão, participando assim,
dos mecanismos de iniciação e/ou promoção do câncer (MOTA, 2007).
Quando as alterações decorridas na estrutura do material genético ocorrem por processos celulares normais, as mutações são conhecidas como espontâneas, e pela
exposição do organismo aos agentes químicos, físicos ou biológicos, as mutações são
denominadas induzidas (POERSCH, 2005).
Dentre os agentes físicos com atividade mutagênica, podem-se destacar as radiações ionizantes e o calor, entre os biológicos temos as infecções virais, enquanto que
os agentes químicos destacam-se os alimentos contendo conservantes. Os hábitos pessoais, como o tabagismo e alcoolismo, assim como tratamentos quimioterápicos
e radioterapia são considerados importantes fatores de risco ao aumento da taxa de
mutação induzida (POERSCH, 2005; POÇA, 2005).
O teste cometa é considerado como um biomarcador de danos no genoma que tem
como finalidade identificar lesões ocorridas no material genético de forma espontânea
ou induzidas pela exposição aos agentes químicos, físicos e biológicos, sendo que as
alterações no DNA, em geral, são deletérias aos organismos e podem levar a consequências severas e irreversíveis para a saúde (BICKHAM et al., 2000; MARTINEZ,
CÓLUS, 2002).
O ensaio cometa foi desenvolvido por Sing et al. (1988) e visa detectar quebras simples e/ou duplas e sítios álcali-lábeis nas moléculas de DNA, que são induzidas
por agentes alquilantes, intercalantes e oxidantes (SILVA et al., 2003).
Na técnica do ensaio cometa as células utilizadas são individualizadas em agarose
com baixo ponto de fusão e gotejadas sobre uma camada de agarose com ponto de fusão normal, em uma lâmina de microscopia, posteriormente submetidas à lise, depois
à eletroforese e coradas com brometo de etídio ou nitrato de prata. O resultado é observado ao microscópio óptico de fluorescência ou de luz branca, respectivamente. As
células que não apresentam DNA danificado mantêm o núcleo intacto e arredondado.
Enquanto que, células com DNA resultante de quebras simples ou múltiplas, o DNA
migra para fora do núcleo, formando uma cauda, similar a um cometa, correspondendo
à desestruturação nuclear. A extensão do DNA na cauda do cometa está relacionada
com o grau do dano ocorrido na célula (FAIRBAIRN et al.,1995).
As vantagens de se empregar a técnica do cometa incluem: (1) a coleta de dados
em nível de células individuais; (2) o uso de uma pequena quantidade de células para
análise; (3) possibilidade de aplicação em qualquer população de células eucarióticas
isoladas (TICE; VASQUEZ, 1999).
Na avaliação do dano são considerados principalmente o tamanho da cauda em
relação ao núcleo e/ou a porcentagem de DNA na cauda do cometa (LEE; STEINERT, 2003). São classificados como classe 0, quando nenhum dano ocorre, até a
estudos, Goiânia, . 39, n. 2, p. 155-163, abr./jun. 2012.
ENSAIO COMETA NA AVALIAÇÃO GENOTÓXICA
classe 4 com o máximo de dano. Esta análise pode ser feita visualmente com o auxílio
da microscopia ou com a utilização de softwares específicos para a análise dos cometas
(BENINCÁ, 2006).
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TRIANCINOLONA E NITRATO DE PRATA NO TRATAMENTO DE HEMANGIOMAS
O tratamento de hemangiomas, tumor benigno vascular, que acomete crianças e
adultos, tem se mostrado bastante variável, sendo utilizados inúmeras formas,
procedimentos e medicamentos, dentre eles está a corticoterapia sistêmica, modalidade
geralmente aplicada aos tumores em maior grau de desenvolvimento e tamanho que
ameaçam os órgãos próximos. Acredita-se que os corticóides promovam a interrupção
do crescimento e/ou induzam a redução dos hemangiomas por seu efeito vasoconstrictor
e inibidor da angiogênese. Por essa razão, os melhores resultados são observados quando o tratamento é instituído na fase proliferativa do tumor, ou seja, durante o primeiro
ano de vida. A dose preconizada é de dois a 3mg/kg/dia de prednisona ou prednisolona
por via oral em tomada única, matinal. A via parenteral pode ser utilizada, quando há
impedimento da via oral, com hidrocortisona ou a metilprednisolona em doses equivalentes. Doses maiores, eventualmente empregadas em casos mais graves, implicam
considerável aumento dos efeitos colaterais (GONTIJO et al., 2003).
O acetonido de triancinolona, ou simplesmente triancinolona, é utilizado há anos em
vários campos da medicina, principalmente em dermatologia, otorrinolaringologia e
reumatologia. Pesquisas indicam que o fármaco alia propriedades terapêuticas potentes,
possibilidades múltiplas de administração e preço baixo. Como todo corticosteróide, a
triancinolona (C21H27FO6) tem grande poder antiinflamatório.
Também é um medicamento de depósito, isto é, tem meia-vida longa e, dependendo
do veículo ao qual estiver associada, pode fazer efeito por semanas no tecido onde foi
injetada. Uma das características mais importantes da droga é seu efeito estabilizador da
micro-circulação da região onde atua, reduzindo o extravasamento líquido por capilares
anormais e, provavelmente, reduzindo o processo de neovascularização, manifestação
clínica importante de algumas de doenças como os hemangiomas (UNIVERSOVISUAL, 2009).
O nitrato de prata é um composto químico de fórmula molecular AgNO3,
comercialmente, costuma chamar-se também de cáustico lunar, ainda que para
uso como reagente analítico em grau de pureza de 99,8% ponderal. Em medicina pode
ser utilizado como cauterizador para eliminação de ligeiras tumorações epidérmicas.
Apresenta amplo emprego na ciência analítica e na técnica, na indústria e na medicina
(LIDE, 2008).
A terapia conjunta da triancinolona com o nitrato de prata para o tratamento de
hemangiomas tem apresentado bons resultados considerando a regressão desses tumores, porém não há estudos suficientes para comprovar essa eficácia quando utilizados
de forma associada, sobretudo, nenhuma evidência da ação mutagênica e/ou citotóxica
desses compostos Os corticóides indicados ao uso intralesionais sofre controversa, e
como argumento os que se opõem seu emprego dizem que o efeito da droga é possivelmente sistêmico, e não local. Essa hipótese fundamenta-se em relatos de regressão de
hemangiomas à distância da lesão infiltrada e na ocorrência de supressão supra-renal
(GONTIJO et al., 2003).
O objetivo desse estudo é avaliar danos genômicos em linfócitos T, células do
sangue periférico humano, expostos a triancinolona combinada com o nitrato de prata,
terapia utilizada durante o tratamento de hemangiomas, utilizando o ensaio cometa
como sistema teste.
MATERIAL E METODOS
Preparo Medicinal
Foram misturados 1,0mL de acetato de triancinolona (40mg) com 1,0mL de nitrato
de prata (0,5%). Esta associação contém ingredientes ativos orgânicos constituídos por
sistemas de anéis de ciclopenta[ ]hidrofenantreno. Seus derivados apresentam esteróides
substituídos na posição 17 beta por uma cadeia de dois átomos de carbono. Esta preparação medicinal associa também substâncias ativas inorgânicas, como metais pesados e
derivados. A Tabela 01 apresenta os volumes da associação medicamentosa utilizados nas
suspensões celulares de linfócitos T do sangue periférico heparinizado para a avaliação
do dano genotóxico induzido pela ação dos ingredientes ativos orgânicos e substâncias
ativas inorgânicas da preparação medicinal. A Tabela 02 indica as condições de exposição das suspensões celulares. Foram realizadas cinco exposições, em duplicatas,
denominadas: Controle Negativo - CN, Teste 01, Teste 02, Teste 03 e Teste 04, para as
doses de 8,0µ g/mL, 20,0µ g/mL, 32,0µ g/mL e 40,0µ g/mL, respectivamente.
Tabela 1: Medicação, apresentação volumes e doses finais utilizadas na exposição
de linfócitos T do sangue periférico
Apresentação
Acetato de
Triancinolona
40mg
Nitrato de Prata 0,5%
(mL)
5,0
12,5
20,0
25,0
8,0
20,0
32,0
40,0
Dose final
(µ L/mL)
1,0
1,0
Tabela 2: Condições de exposição dos linfócitos T à associação da triancinolona (40mg) com o nitrato
de prata (0,5%)
Componentes do
Meio
Meio RPMI 1640
L-Glutamina
Volume (mL)
Concentração
Celular
Temperatura de
incubação (oC)
Tempo de
Exposição (horas)
10.000
37
3
4,5
1,0
Soro Fetal Bovino 1,0
estudos, Goiânia, . 39, n. 2, p. 155-163, abr./jun. 2012.
Medicamento
Volumes da cultura celular (µ L)
Volume
Ensaio Cometa
O protocolo utilizado foi proposto por Singh e colaboradores (1988), com modificações de acordo com os seguintes procedimentos: Aproximadamente, 10 L de cada
suspensão celular (linfócitos T expostos às diferentes doses da preparação medicinal de
triancinolona e nitrato de prata) foram embebidos em 120 L de agarose Law Melting
Paint - 0,75%. Essa mistura foi colocada em lâmina de vidro com cobertura de agarose
Narmal Melting Paint - 1,5%. Depois da solidificação em geladeira, as células foram
lisadas com uma solução de lise (pH 10) contendo 2,5 NaCl, 100mM EDTA, 10mM
de Tris, 1% Tween 80 e 10% DMSO, por aver night. Após a lise, as lâminas foram
colocadas em uma cuba de eletroforese horizontal. Para permitir o desenrolamento
do DNA, as lâminas ficaram incubadas por 25 minutos em tampão alcalino, feito no
momento do uso, contendo 300mM NaOH e 1mM EDTA, pH > 13, a 4ºC. As lâminas
foram submetidas uma corrente elétrica de 300mA e 25V, durante 25 minutos. Ao final
da corrida as lâminas foram neutralizadas com 0.4M de Tris (pH = 7.5). Posteriormente, as lâminas foram coradas com 20µ L de uma solução de brometo de etídeo (20µ g/
mL) cobertas com lamínula, protegida da luz, sendo armazenadas em câmara úmida na
geladeira até o momento da análise.
Análise dos Cometas na Avaliação dos Danos ao DNA
estudos, Goiânia, . 339, n. 2, p. 155-163, abr./jun. 2012.
As lâminas foram analisadas sob microscopia de epifluorescência, utilizando conjunto de filtros de excitação 515-560nm e filtro de barreira 590nm, para fluorescência
vermelha. Os núcleos foram visualizados utilizando objetivas de 40X e 60X e a imagem
fluorescente foi capturada utilizando o software ISIS® (Metasystems Carparatian, Alemanha). Na determinação dos danos ao DNA, os núcleos foram classificados de acordo
com a forma dos núcleos e o comprimento da cauda observada. As células analisadas
receberam escores de 0 a 4, conforme apresentado a Figura 01.
S core 0
S core 1
ID i = N C o x S core
S core 2
S core 3
S core 4
ID T =
ID i
Figura 1: Classes de Cometas e seus respectivos scares na determinação dos Danos no DNA.
Legenda: IDi = Índice de dano individual; NCo = Número de Cometas Observados; IDT = Índice de dano
Total; IDi Somatório dos índices de danos individuais. Classificação segundo Kobayashi et al. (1995).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O ensaio cometa permitiu a detecção de danos genômicos ocorridos no núcleo
dos linfócitos T expostos às diferentes doses da preparação medicinal de acetonido de triancinolona (40mg) e Nitrato de prata (0,5%). A Tabela 03 apresenta
os grupos, os tipos de tratamento e o número de núcleos analisados com os seus
respectivos scores.
O índice de dano no genoma observado no núcleo dos linfócitos T que constituem
o controle negativo foi de 40 unidades arbitrárias (UArb), não sendo observado nenhum
cometa com dano máximo, apresentando uma média de dano de 10UArb.
A dose de 8,0µ g/mL (41Uarb) não apresentou diferença no Índice de Dano Total
quando comparada ao grupo controle negativo (p = 0,5). Para a dose de 20,0µ g/mL
(61Uarb) indicou uma diferença superior a 50% em relação ao controle negativo (p
= 0,07). A dose de 32,0µ g/mL (66UArb) apresentou um IDT de 70% acima quando
comparada ao controle negativo (p = 0,04).
Para a dose 40,0µ g/mL (61Uarb) índice de dano reduziu devido ao menor número
de cometas com scares menores, porém foi a única dose que apresentou cometas com
scare 4, significando alta citotoxicidade do produto testado.
Tabela 3: Grupos, tratamentos e número de células avaliadas pelo Teste Cometa de Linfócitos T
expostos às diferentes doses de triancinolona e nitrato de prata (0,5%)
Numero de células com danos no DNA
Grupos
Doses
(µ g/mL)
Scores
0
1
2
3
4
Total Média ± DP
0
24
29
4
1
0
55 11.6±13.8
8,0
20
24
7
1
0
52 10.4±11.0
20,0
12
27
14
2
0
55 11.0±10.8
32,0
5
33
12
3
0
53 10.6±13.8
40,0
12
29
7
2
3
53 10.6±11.0
73
142
44
93
3
268 54.2±56.6
Negativo
Tratamentos
Total
A Tabela 04 apresenta os Índices de Danos Individuais (IDi) e Totais (IDT), enquanto que a Figura 02 evidencia os resultados dos índices de Danos Totais decorrentes da análise dos cometas obtidos a partir da exposição de linfócitos T às diferentes
doses da preparação medicinal testada. A Figura 03 relaciona os núcleos dos linfócitos
com os seus respectivos scares utilizados na avaliação dos danos genotóxicos devido à
exposição às diferentes dosagens do acetonido de triancinolona (40mg) associado ao
nitrato de prata (0,5%).
estudos, Goiânia, . 39, n. 2, p. 155-163, abr./jun. 2012.
Controle
estudos, Goiânia, . 339, n. 2, p. 155-163, abr./jun. 2012.
Figura 2: Classes dos cometas e seus respectivos scares utilizados na determinação dos danos genômicos
Legenda: (a) Aspectos nucleares observados na microscopia óptica de fluorescência utilizando filtro
®
Texas Red e (b) Espectro de análise dos cometas utilizando o Software CametScare versão 1.5. IDi
= Índice de dano individual; NCom = Número de Cometas Observados; IDT = Índice de dano Total.
O desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas tem sido enfocado, com o
objetivo de se obter uma redução dos efeitos adversos ao uso de corticóides, possibilitando o tratamento de lesões de difícil acesso cirúrgico e refratário às modalidades
terapêuticas utilizadas rotineiramente. Os melhores resultados têm sido obtidos com
o interferan-alfa. Vários autores relatam a sua eficácia, baseado nas suas propriedades
antiangiogênicas (FONSECA et al., 2008).
A associação da triancinolona com nitrato de prata no tratamento de hemangiomas e
linfohemangiomas por infiltração intralesional em crianças, deve ser considerada capaz
de potencializar a ação desses dois produtos e que quando injetado dentro da lesão,
promove uma rápida redução da massa turnoral evitando a sua proliferação e impedindo
com isso o seu crescimento, evoluindo para a cura. Essa preparação medicinal vem
solucionar um problema sério de patologias que causam deformidades severas em que
o paciente é excluído do convívio social (UNIVERSOVISUAL, 2009).
Neste sentido, a ação da preparação medicinal de triancinolona combinada com o
nitrato de prata, no tratamento de hemangiomas deve ser cuidadosamente avaliada. Os
nossos resultados evidenciam uma ação genotóxica destes produtos em linfócitos T do
sangue periférico utilizando doses de 32µ g/mL e 40µ g/mL enquanto que as doses
terapêuticas giram em torno 20mg/mL. Adicionalmente, com tratamento sistêmico
devemos nos preocupar com possíveis lesões hepática e/ou renais, principalmente
lesões no genoma das células desses órgãos.
CONCLUSÃO
O tratamento de hemangiomas tem se mostrado bastante variável, sendo
utilizadas inúmeras formas de procedimentos e medicamentos, dentre eles a corticoterapia sistêmica. Esta modalidade geralmente é aplicada aos tumores em maior
grau de desenvolvimento e tamanho que ameaçam os órgãos próximos.
O tratamento com a preparação medicinal de triancinolona (40mg) e o nitrato de
prata (0,5%) vem sendo uma alternativa terapêutica nos tratamentos de hemangiomas,
no entanto, são necessários estudos adicionais que comprovem seu efeito não-genotóxico
nas células.
Os linfócitos T expostos às diferentes doses da mistura medicinal apresentaram
um aumento de 40% (p < 0,05) na média dos índices de danos no genoma (57,3UArb)
quando comparados com o controle negativo (40UArb).
As diversas doses da preparação medicinal resultante da combinação entre Acetonido
de Triancinolona (40mg) e nitrato de prata (0,5%), apresentam ação genotóxica, sendo
capaz de influenciar no número e no aparecimento de mutações, que são consideradas
importantes eventos na iniciação e promoção tumoral.
Abstract: this study deals with the assessment of genotoxicity induced by the medical
preparation of triamcinolone acetonide and silver nitrate in T lymphocytes using the
comet assay. The triancinolone has anti-inflammatory power, while the silver nitrate
which may be used for disposal of seared skin tumor.
Keywords: Mutagenesis. Comet Assay. Triancinolone. Silver Nitrate.
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* Recebido em: 02.03.2012.
Aprovado em: 12.03.2012.
CLAUDIO CARLOS DA SILVA
APARECIDO DIVINO DA CRUZ
Programa de Pós-Graduação Lata Sensu em Genética – Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa /
Universidade Católica de Goiás. Núcleo de Pesquisas Replicon – Departamento de Biologia / Universidade Católica de Goiás. LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular / LACEN
– Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovani Cysneiros – SES/GO.