Análise multiparamétrica por citometria de fluxo do

Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Vencedor 2010
Análise multiparamétrica por citometria de fluxo do desenvolvimento de linfócitos B in
vivo: papel dos receptores do tipo Toll
Alberto Felix da Nobrega
Abstract: We have previously shown that LPS promotes B cell maturation in vitro, suggesting that
TLR4 signaling can act as an accessory stimulus in B cell development, complementary to the BAFF
physiological pathway. The main goal of this project is to understand the role of TLR in B cell
development in vivot. To investigate if physiological TLR activation (in the absence of exogenous
stimuli) has an impact in B cell development, mixed bone marrow irradiation chimeras were
constructed, using bone marrow donors that differ in the CD45 allotypes. Using multicolor, nine
parameters flow cytometry, we analyzed the frequency of wild type and myd88 deficient cells in
different bone marrow and spleen B cell compartments. In addition, we followed, by BrdU intracellular
staining, the kinetics of B cell maturation of wild type and TLR unresponsive cells. We observed that
the absence of myd88 does not impair B cell maturation in vivo, although a selective impact in B cell
repertoire has not been ruled out. We propose that TLR signaling may be relevant to B cell
development in the presence of exogeneous ligands, which are often systemically present in the
organism during the outcome of infectious diseases.
Tanto no homem como no camundongo, a linfopoiese B é iniciada a partir de uma população
de células-tronco hematopoiética multipotente presente na medula óssea ou fígado fetal. Os estágios
mais precoces do desenvolvimento da linhagem B compreendem células que permanecem com os
loci de imunoglobulina (Ig) na sua configuração germinativa (B220lowCD43-/+CD19-/+HSA/+IgMneg). Durante o avanço da maturação, as células precursoras B rearranjam as cadeias leve e
pesada da Ig, expressando o receptor de célula B (BCR ou IgM de superfície) na superfície da célula
B imatura. A subpopulação de células B imaturas é capaz de entrar em contato com os antígenos
expostos em seu microambiente através do BCR e subdivide-se em dois grupos: os linfócitos B
imaturos propriamente ditos, apresentando baixos níveis de expressão de IgM na membrana
(B220lowAA4.1+IgMlowCD23neg), e os linfócitos B de transição, que possuem níveis elevados de
IgM na superfície celular (B220int AA4.1+ IgMhigh CD23neg/+) (CARSETTI e col., 1995). A etapa
final da maturação B conduz a célula a adquirir fenótipos característicos de uma das categorias de
linfócitos B maduros: linfócitos B foliculares (FO – B220high AA4.1- IgMlow CD23+ CD21neg),
linfócitos B de zona marginal (MZ – B220high AA4.1- IgMhigh CD23neg CD21high) e linfócitos B1a
ou B1b (B220low CD5+) (MELCHERS & ROLINK, 1999). Devido à existência de numerosas etapas
no desenvolvimento dos linfócitos B, caracterizadas por diversas alterações na expressão de
moléculas de superfície, a citometria de fluxo multicolor vem desempenhando um papel central como
metodologia para o estudo, tanto in vitro como in vivo, deste processo.
Processos infecciosos podem ter efeitos deletérios de longa duração na hematopoiese, e a
ação direta de produtos microbianos, como o LPS, ligante de TLR4, sobre precursores mielóides e
linfóides precoces é capaz de modular a mielopoiese e linfopoiese (NAGAI e col., 2006). Nosso grupo
vem se dedicando ao estudo dos efeitos de ligantes de TLRs sobre a linfopoiese B no modelo
experimental murino, uma vez que os papéis desses receptores no processo de maturação B são
ainda muito pouco conhecidos. Nosso grupo realizou um trabalho pioneiro, caracterizando o efeito do
LPS sobre a diferenciação de precursores mais tardios e de linfócitos B imaturos (HAYASHI e col.,
2005), sugerindo que o TLR4 possa atuar na maturação e seleção categórica das células B. Mais
recentemente, estudamos de forma extensa o efeito da ativação de TLR4 na diferenciação de células
B imaturas e transicionais, comparando o mesmo com a ação do BAFF. Nesse trabalho,
caracterizamos uma similaridade notável entre os dois sistemas, sustentando a noção de que a
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sinalização pelo receptor TLR4 pode suprir em grande parte as funções do BAFF/BAFF-R na
diferenciação de células B(HAYASHI e col., 2010).
O idiotipo do BCR é um fator determinante na maturação das células B. As células B imaturas
adquirem, pela primeira vez, a capacidade de interagir com os antígenos presentes no
microambiente. E é de fato neste compartimento de linfócitos B que acontece um dos principais
mecanismos de tolerância central, a edição de receptores, em que ocorre um novo rearranjo da
cadeia leve, alterando a especificidade da Ig e o escape da seleção clonal (MELAMED e col., 1998;
SANDEL & MONROE, 1999). Esse mecanismo é induzido quando a célula é confrontada com
autoantígenos de alta ou baixa avidez e trabalhos recentes sugerem um papel da via de sinalização
do NF-κB nesse processo (DERUDDER e col., 2009; ISNARDI e col., 2008; SIEBENLIST e col.,
2005). A deleção das vias clássica e alternativa do NF-κB em linfócitos B inibe a geração de células
λ+ na medula óssea, sugerindo que essa via de sinalização seja essencial para a
geração/sobrevivência das células que editam a cadeia λ do BCR (DERUDDER e col., 2009).
Estudos com pacientes que possuem mutações nas moléculas IRAK-4 , MyD88 e UNC-93B,
envolvidas na sinalização via TLRs, demonstraram que a deficiência dessas vias geram mais células
B autoreativas na periferia, sugerindo que mecanismos de tolerância central, como a edição de
receptores, encontram-se ineficientes (ISNARDI e col., 2008).
Os resultados descritos acima sustentam a importância do nosso projeto que tem como
objetivo principal estudar o papel dos receptores TLRs no desenvolvimento de linfócitos B in vivo, em
especial nos compartimentos envolvidos com os mecanismos de tolerância central. Para isso,
comparamos a maturação in vivo dos linfócitos B na presença ou ausência da sinalização via TLRs
em modelos utilizando quimeras de competição a fim de avaliar se a incapacidade de resposta via
TLR pode conferir vantagem competitiva no desenvolvimento de linfócitos B.
Nesse modelo, camundongos receptores (F1 B6xB6.SJL,CD45.1+CD45.2+) irradiados são
reconstituídos com misturas (1:9 e 9:1) de células de medula óssea de doadores selvagens (B6.SJL,
CD45.1+) e nocautes para a molécula adaptadora MyD88 (myd88-/-, CD45.2+). A reconstituição da
medula óssea de animais saudáveis nos permitiu investigar um possível papel fisiológico de TLRs no
desenvolvimento da linhagem B, uma vez que diversos autores vêm sugerido a interação de
receptores TLRs com ligantes endógenos (RIFKIN e col., 2005). Após 50 dias da reconstituição,
utilizando citometria de fluxo multicolor (7 cores em cada marcação, Pacific Blue, FITC, PE, PECy5.5, PE-Cy7, APC, APC-Cy7), analisamos o percentual de células responsivas (B6.SJL,CD45.1+)
e não-responsivas (myd88-/-, CD45.2+) a TLRs em cada estágio de desenvolvimento de linfócitos B
na medula óssea (diferentes estágio de precursores B, células B imaturas, de transição e maduras) e
no baço (células B de transição, FO e MZ) desses animais. Avaliamos, também, a proporção das
células doadoras em células-tronco hematopoiéticas (Lin-c-Kit+Sca-1+), bem como em outras
linhagens presentes na medula óssea (granulócitos, linfócitos T e células NK). Para avaliarmos se a
ausência ou presença da sinalização via TLR resulta em diferenças na cinética de geração de
linfócitos B, administramos o análogo de timidina BrdU i.p. uma única vez, por diferentes períodos
antes do sacrifício (12h, 24h, 48h, 72h ou 96h), e acompanhamos as células que incorporaram BrdU
na fase de precursores em proliferação. Através da citometria de fluxo multicolor (7 cores em cada
marcação), cada compartimento de células B foi avaliado quanto a frequência de células BrdU+
dentro de cada população competidora (CD45.1+ ou CD45.2+), nos permitindo avaliar se a
deficiência na sinalização via TLRs resultou em alterações da velocidade de entrada e saída de
células nos diferentes compartimentos. Nós pudemos observar que a ausência da sinalização via
MyD88 não conferiu vantagens ou desvantagens competitivas na entrada dos diversos
compartimentos de linfócitos B da medula óssea e do baço. Sugerindo que a sinalização fisiológica
via TLRs parece não ser capaz de modular o desenvolvimento de linfócitos B, podendo sugerir que
essa via module a maturação B, exclusivamente, durante contextos infecciosos.
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