DISSERTAÇÃO Juciane Versão Final 17.06

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
Programa de Pós-Graduação em Entomologia
Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis
rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel &
Adler) (Diptera: Simuliidae)
Juciane Conceição da Silva
Manaus, Amazonas
Abril de 2014
i
Juciane Conceição da Silva
Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis
rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel &
Adler) (Diptera: Simuliidae)
Orientador: Dr. Jansen Fernandes de Medeiros
Coorientador: Dr. Felipe Arley Costa Pessoa
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Entomologia do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas, área de
concentração em Entomologia.
Manaus, Amazonas
Abril de 2014
ii
Banca Examinadora da Defesa Pública Presencial
TITULARES:
Dr. Wanderli Pedro Tadei
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Dr. Cristovão Alves da Costa
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes
Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazonas
SUPRENTES:
Dr. Wuelton Marcelo Monteiro
Fundação de Medicina Tropical
Dr. João Antonio Cyrino Zequi
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Dissertação defendida e aprovada em: 28/04/2014
iii
Ficha Catalográfica
S586
Silva, Juciane Conceição da
Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em
Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis
trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adle) (Diptera: Simuliidae) /
Juciane Conceição da Silva. --- Manaus: [s.n], 2014
Xv, 66f.: il. Color.
Dissertação (mestrado) ---INPA, Manaus, 2014.
Orientador: Jansen Fernandes -Medeiros
Co-orientador: Felipe Arley Costa Pessoa,
Área de concentração: Entomologia
1.
Microscopia óptica. 2. Simulídeos, 3. Hemócitos. I. Título
CDD 595.77
Sinopse:
Foram identificadas, caracterizadas e contabilizadas os tipos celulares do
sistema de defesa (hemócitos) nos diferentes estágios de vida, larva, pupa e adultos
das espécies Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis
trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adle). Foram identificados quatro tipos
celulares: prohemócitos, granulócitos, oenocitóide e plasmatócitos.
Palavras-chave: Microscopia óptica, Microscopia eletrônica de transmissão, células.
iv
Dedico
Aos meus pais, Terezinha e Francisco (in
Memoriam) e a meus irmãos, Janaina, Neto, Joene,
Joelma, Jarlene e Jaeliton.
A meu esposo Flávio por estar sempre ao meu
lado em todos os momentos e a minha filha Sarah
Leticia, minha fonte de inspiração.
v
Agradecimentos
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), ao Programa de PósGraduação em Entomologia, e aos professores do curso de mestrado que contribuíram para
a minha formação profissional durante essa jornada.
Ao Instituto Leônidas e Maria Deane pela estrutura laboratorial e logística
disponibilizada na realização desse trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal em Nível Superior, CAPES, pela
concessão da bolsa de mestrado.
Ao Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, pela estrutura laboratorial para
realização de uma parte desse trabalho.
Aos meus orientadores Dr. Jansen Fernandes Medeiros e Dr. Felipe Arley Costa
Pessoa pela orientação, pelos ensinamentos científicos, companheirismo, paciência e
principalmente por não medirem esforços para que fosse possível a realização desse
trabalho.
Aos Doutores Fábio Brayner e Luiz Alves que foram essenciais para obtenção dos
resultados desse trabalho, obrigada pela oportunidade de fazer estágio no laboratório de
Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE, pelos ensinamentos e a também pela
amizade. Serei eternamente grata por tudo.
À Dra. Claudia Maria Rios Velásquez pelos ensinamentos, disponibilidade de
tempo e valiosas sugestões durante a execução desse trabalho.
A meu esposo Flávio, pelo companheirismo, atenção, paciência e principalmente
por entender minha ausência em alguns momentos.
À minha filha Sarah Letícia, minha fonte de inspiração e de incentivo.
À minha família, minha mãe Terezinha e meus irmãos Janaina, Neto, Joene,
Joelma, Jarlene e Jaeliton, pelo amor e apoio em todos os momentos da minha vida.
vi
À Dra. Helena Araújo, pelo treinamento inicial que possibilitou a execução da
metodologia desse trabalho.
À Dra. Giselle Almeida Oliveira, pelas contribuições e valiosas sugestões durante
minha preparação para aula de qualificação.
Aos amigos mestrandos do laboratório EDTA, Antônio e Emanuelle, pela ajuda
nas coletas, pelo companheirismo, discussões científicas, é muito bom saber que sempre
posso contar com vocês.
À doutoranda Ana Paula Sampaio, pela ajuda no processamento de material e
por ter mim acolhido durante meu estágio no Laboratório de Biologia Celular e Molecular
da FIOCRUZ-PE. Obrigada amiga.
Ao amigo Rafael Padilha do laboratório de Microscopia eletrônica do LIKA, pelo
auxilio no processamento de material e na obtenção de imagens.
A toda equipe do laboratório de Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE,
em especial aos colegas Gabriel e Cássia pelo treinamento durante meu estágio.
Aos bolsistas de iniciação cientifica do Laboratório de Ecologia de Doenças
Transmissíveis na Amazônia, Jéssica, Eric, Jordan e Maria, pelo companheirismo e ajuda
nas coletas de campo e em especial a Jeane pelo auxilio e companhia no processamento de
material.
Aos técnicos do ILMD Patrícia Mello amizade e Diego Leite e Ricardo Motta,
pelo auxilio nas coletas de campo, pelos momentos de descontração e principalmente pela
amizade.
Aos amigos e companheiros de café, Vagner Bastos e Tatiane Becker, pela
companhia e ajuda na etapa de finalização do trabalho.
Aos colegas do ILMD, Mary, Katiane, Valdinete, Tatiane, George e Victor, pelas
palavras de incentivo e pela amizade.
vii
A toda turma de Entomologia 2012, pelos momentos de alegria e de
companheirismo durante essa jornada em especial ao amigo Leandro Leal, pelas discursões
cientifica e por sempre estar disposto a ajudar.
viii
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo
não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis”.
José de Alencar
ix
Resumo
Os simulídeos são insetos de interesse médico-veterinário por veicularem diferentes
organismos patogênicos aos homens e animais, entretanto pouco se conhece sobre o sistema
de defesa contra ação de patógenos nesses insetos. Os hemócitos são células do sistema imune
dos insetos e entre as principais funções desenvolvidas por essas células estão à fagocitose, a
encapsulação e a coagulação. Esse trabalho foi realizado com duas espécies de Simuliidae do
estado do Amazonas e teve como objetivos identificar e caracterizar os tipos de hemócitos
encontrados na hemolinfa de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. Os
simulídeos (larvas e pupas) foram coletados no município de Presidente Figueiredo, estado do
Amazonas. As células foram caracterizadas através da microscopia óptica e microscopia
eletrônica de transmissão. A contagem diferencial das células foi realizada através do
microscópio de luz em campo claro e para diferenciação celular foram consideradas
características morfológicas. Foram identificadas quatro tipos de células na hemolinfa de
larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense: prohemócitos, plasmatócitos,
granulócitos e oenocitóides. Os prohemócitos foram as menores células observadas, sendo
caracterizadas pela presença de um núcleo volumoso em relação ao citoplasma. Os
granulócitos são caracterizados pela presença grânulos, apresentando variação no tamanho e
na forma. Nessas células também foi observado um núcleo grande e excêntrico. Os
oenocitóides possuem núcleo pouco desenvolvido que geralmente está localizado na região
central. Os plasmatócitos observados apresentaram grandes projeções da membrana
citoplasmática e foi o tipo celular que apresentou maior variação morfológica. Em E.
rorotaense foi encontrado um maior número de plamatócitos no estágio de larva, granulócitos
em pupa e prohemócitos no adulto. Enquanto em E. trombetense os prohemócitos foi mais
abundantes no estágio de larva, os plasmatócitos em pupa, e plasmatócitos e granulócitos em
adultos. Esse estudo de caracterização celular pode ser utilizado como modelo para futuros
estudos em espécies de simulídeos vetoras.
x
Abstract
The black flies are insects of medical and veterinary importance due to transmit different
pathogens to humans and animals however, little is known about the action of defense system
of these insects against infection of these pathogens. The hemocytes are cells of
immunological system of insects and their functions are to realize phagocytosis, and participte
of coagulation process and encapsulation. The aims of this work were to identify and
characterize hemocyte types found in Ectemnaspis rorotaense and E. trombetense. The black
flies (larvae and pupae) were collected in Presidente Figueiredo municipality, Amazonas
state, Brazil. The cells were characterized by optical and transmission electron microscopy.
The differential count of cells was performed by light microscopy and to cell differentiation
was used morphological characters. The types of cells found in hemolymph were
prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids. The prohemocytes were smallest
cells observed and characterized by the presence of a large nuclei compared to the cytoplasm.
The granulocytes are characterized by the presence of granules with variation in size and
shape. This cells were observed large and eccentric nucleus. The oenocytoids have less
developed nucleus and located in the central region. The plasmatocytes showed many
morphological variations and large projections in cytoplasmatic membrane. In E. rorotaense
was found a large number of plasmatocytes, granulocytes and prohemocytes respectively in
stages of larvae, pupae, and adults. While in E. trombetense was found was found a large
number of prohemocytes, plasmatocytes respectively in larvae and pupae, and the same
amount of plasmatocytes and granulocytes in adults. This study cell characterization can be
used as a model for future studies on species of blackfly vectors.
xi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... XIV
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ XVII
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 18
FAMÍLIA SIMULIIDAE ............................................................................................................. 18
1.1. Características gerais e distribuição ........................................................................... 18
1.2. Biologia e ecologia ..................................................................................................... 18
1.3. Importância médica, veterinária e econômica dos Simuliidae ................................... 20
1.4. Estudos com Simuliidae na Amazônia ....................................................................... 21
1.5. Espécies Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense................................................... 22
1.6. Mecanismo de defesa dos insetos............................................................................... 24
1. 6. 1. Hemolinfa .............................................................................................................. 25
1. 6. 2. Hemócitos.............................................................................................................. 25
1. 6. 3. Estudos com hemócitos de insetos ........................................................................ 27
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 29
2. 1. Objetivo Geral ........................................................................................................... 29
2. 2. Objetivos específicos................................................................................................. 29
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 30
3. 1. Coleta de simulídeos ................................................................................................. 30
3. 2. Coleta de hemolinfa .................................................................................................. 32
3. 3. Microscopia de Luz ................................................................................................... 33
3. 4. Contagem diferencial de hemócitos .......................................................................... 34
3. 5. Microscopia Eletrônica de Transmissão ................................................................... 35
4. RESULTADOS .................................................................................................................... 37
CARACTERIZAÇÃO
MORFOLÓGICA
DOS
HEMÓCITOS
DE
ECTEMNASPIS
ROROTAENSE
E
ECTEMNASPIS TROMBETENSE. .................................................................................................. 37
Prohemócitos ..................................................................................................................... 37
Granulócitos ...................................................................................................................... 37
Oenocitóides ...................................................................................................................... 38
Plasmatócitos..................................................................................................................... 38
xii
CONTAGEM
DIFERENCIAL DOS HEMÓCITOS EM LARVAS, PUPAS E ADULTOS DE
ECTEMNASPIS
ROROTAENSE E DE ECTEMNASPIS TROMBETENSE....................................................................... 46
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 49
6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 55
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 56
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Locais de coleta de simulídeos das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis
trombetense. (A) Mapa do estado do Amazonas mostrando a localização do município de
Presidente Figueiredo . (B) Imagem de satélite mostrando a localização das áreas de coleta..30
Figura 2: Locais de coleta de larvas e pupas das espécies Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense. (a) Cachoeira da Naza no Km 6 e (b) Cachoeira do Sossego da
Pantera no Km 20, Município de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil. .......................... 31
Figura 3: Transporte e tratamento do material coletado em campo. (a) Armazenamento e
transporte de substratos com imaturos de simulídeos. (b) Frascos para separação individual
das pupas das espécies das duas espécies do estudo. (c) Adultos emergidos de Ectemnaspis.
rorotaense e Ectemnaspis trombetense. ................................................................................... 32
Figura 4: Procedimento para coleta de hemolinfa. (a) - Simulídeos adormecidos no gelo; (b) Sistema utilizado para perfusão da hemolinfa (1- Lupa estériomicroscopio, 2- Capilar de
vidro, 3- Suporte para capilar); (c) – Procedimento de coleta da hemolinfa em adulto de
simulídeo ( 1- Capilar inoculando anticoagulante, 2- Liberação de hemolinfa ). .................... 33
Figura 5: Procedimento para coloração das células e montagem das lâminas para microscopia
òptica. (a) - Kit Panótico® para coloração das lâminas. (b) - Lâminas de vidro coradas; (c) Microscópio òptico .................................................................................................................. 34
Figura 6: Procedimento para microscopia de transmissão. (a) - Emblocamento de material em
resina; (b) - Ultramicrometro, utilizado para realizar os cortes ultrafinos do material em
resina; (c) - Microscópio eletrônico de transmissão utilizado para obter as imagens das células
.................................................................................................................................................. 36
Figura 7: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis. rorotaense em microscopia óptica.
(A) Prohemócitos, com núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma; (B)
Granulócito apresentando forma irregular e com presença de grânulos no citoplasma (seta fina
vermelha); (C) Oenocitóide com um pequeno núcleo localizado centralmente (seta fina); (D)
Plasmatócito com visíveis extensões da membrana citoplasmática (seta grossa) e um núcleo
centralizado (seta fina).............................................................................................................. 39
xiv
Figura 8: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica.
(A) - Prohemócitos, exibindo um núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma,
(B) – Granulócito, com muitos grânulos presentes no citoplasma (seta vermelha) e núcleo
grande localizado centralmente (seta fina); (C) Oenocitóide com um núcleo pouco
desenvolvido (seta fina); (D) - Plasmatócito apresentando uma grande projeção da membrana
citoplasmatica (seta grossa). . ................................................................................................... 40
Figura 9: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia
eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V),
citoplasma com algumas mitocôndrias (m) e retículo endoplasmático (Re). (B) Granulócito
com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da
membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (ve). (C)
Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m),
vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo forma alongada e
projeções da membrana citoplasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias
(m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re). .................................................................. 41
Figura 10: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia
eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V),
citoplasma com pequena projeção da membrana (seta grande), algumas mitocôndrias (m) e
reticulo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo
(N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo endoplasmático
(Re), grânulos (G) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no
citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D)
Plasmatócito exibindo forma alongada, no citoplasma apresenta mitocôndrias (m), vesícula
(Ve) e retículo endoplasmático (Re). ........................................................................................ 42
Figura 11: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A-C) Prohemócitos apresentando
diferentes padrões de morfologia e em alguns foram observados indícios de divisão celular e a
presença de pequenas projeções da membrana citoplasmática. (D-F) Granulócitos
apresentando membrana plasmática irregular e com presença de visíveis grânulos. . ............. 43
xv
Figura 12: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense por microscopia óptica. (A-B) Oenocitóides com variações
morfológicas, células apresentando núcleo pouco desenvolvido, localizado centralmente ou
deslocado. (C-F) Plasmatócitos apresentaram maior variação morfológica, geralmente com
longas projeções da membrana citoplasmática, com núcleo localizado no centro, em algumas
células foi observado um núcleo deslocado. ........................................................................... 44
Figura 13: Diferenças morfológicas observadas em plasmatócitos de Ectemnaspis rorotaense
e E. trombetense por microscopia eletrônica de transmissão. (A) plasmatócito com forma
irregular e com projeções da membrana citoplasmática. (B) plasmatócito com forma mais
arredondada apresentando uma longa extensão da membrana citoplasmática. (C) plasmatócito
com pequenas projeções da membrana. (D) célula com forma mais alongada e com um grande
número de vacúolos no citoplasma........................................................................................... 45
Figura 14: Número de hemócitos encontrados em Ectemnaspis rorotaense, coletados na
cachoeira Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente
Figueiredo, estado do Amazonas. As letras maiúsculas e minúsculas nas barras indicam que
houve uma diferença significativa após o teste de Kruskal-Wallis seguido de StudentNewman-Keuls. ........................................................................................................................ 47
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos
encontrados em larvas, pupas e adultos da espécie Ectemnaspis rorotaense, coletados na
Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente
Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil. ................................................................................. 46
Tabela 2: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos
encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da
Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do
Amazonas, Brasil. ..................................................................................................................... 47
Tabela 3: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos
encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos na espécie Ectemnaspis trombetense,
coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de
Presidente Figueiredo, estado do Amazonas. ........................................................................... 48
Tabela 4: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos
encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da
Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do
Amazonas, Brasil. ..................................................................................................................... 48
xvii
1. INTRODUÇÃO
Família Simuliidae
1.1. Características gerais e distribuição
Os simulídeos são conhecidos popularmente no Brasil, como borrachudos ou
piuns. Pertencem à ordem Diptera, subordem Nematocera, infraordem Culicomorpha,
superfamília Simulioidea e família Simuliidae (Borkent 2012). Essa família está subdividida
nas subfamílias Parasimuliinae que tem distribuição no Neártico, e Simuliinae que é
cosmopolita (Adler e Crosskey 2014).
Dentre os dípteros, a família Simuliidae é uma das mais estudadas, com 2.163
espécies listadas no mundo, sendo 330 registradas para a região Neotropical. No Brasil são
conhecidas 90 espécies, das quais 25 são registradas para o estado do Amazonas (Adler e
Crosskey 2014).
1.2. Biologia e ecologia
Os simulídeos são insetos holometábolos passando durante seu ciclo de vida pelos
estágios de ovo, larva, pupa, que se desenvolvem em ambiente aquático, e adulto em ambiente
terreste (Crosskey 1990).
As fêmeas ovipositam sobre substratos submersos (pedras e vegetações) em rios,
igarapés, cachoeiras e corredeiras. Em cada postura são colocados em média de 100 a 600
ovos (Crosskey 1990). Esses são muito pequenos com cerca 100 a 400µm, forma ovóide e são
revestidos por uma massa gelatinosa, esse estágio dura em média cerca de quatro a cinco dias
em espécies neotropicais (Petry et al. 2006).
18
As larvas vivem fixas a diferentes substratos, como folhas, raízes, galhos, pedras e
objetos presos à correnteza, podendo ocupar ambientes antropizados ou preservados (Hamada
1989; Hamada e Adler 2001). Durante essa fase se alimentam de matéria orgânica, bactérias,
algas e zooplancton (Crosskey 1990; Shelley et al. 2010). As larvas passam por sete a nove
estádios dependendo da espécie e das condições ambientais (Crosskey 1990). A espécie
Psaroniocompsa incrustata (Lutz) passa por oito estádios larvais no nordeste brasileiro (Silva
et al. 2008).
As pupas dos simulídeos são coniformes, possuem um par de filamentos
brânquias projetadas na área do tórax, vivem aderidas aos substratos. Esse estágio dura entre
quatro a cinco dias em espécies na região neotropical. Após este período o adulto emerge
dentro de uma bolha que estoura ao entrar em contato com o ar (Coscarón e Coscarón - Arias
2007). Os estágios imaturos (larva e pupa) são importantes para determinação taxonômica do
grupo (Hamada e Adler 2001).
Os adultos possuem aproximadamente entre 2 a 4 mm de comprimento, antenas
curtas geralmente com 11 segmentos, aparelho bucal tipo sugador cortador de pele com uma
probóscide curta e robusta, tórax arqueado, asas largas e hialinas, pernas curtas, corpo
geralmente escuro ou negro e algumas vezes castanho - avermelhado ou amarelado (Coscarón
e Coscarón - Arias 2007; Shelley et al. 2010). São facilmente reconhecidos pelo tipo de
antenas, padrão de coloração do tórax e venação das asas (Adler e Currie 2009). Possuem
hábito diurno, em algumas espécies ambos os sexos utilizam néctar das flores, seiva de
plantas e sucos de frutas como fonte de alimento (Crosskey 1990; Medeiros et al. 2008). As
fêmeas de algumas espécies são hematófagas, podendo ser transmissoras de agentes
patogênicos para o homem e outros animais (Crosskey 1990).
19
1.3. Importância médica, veterinária e econômica dos Simuliidae
As fêmeas hematófagas de algumas espécies são vetores de diversos patógenos
como vírus, bactérias, protozoários e helmintos para humanos e outros animais (Crosskey
1990; Coscarón e Coscarón- Arias 2007).
Dentre os patógenos transmitidos ao homem destaca-se a filária Onchocerca
volvulus (Leuckart), causadora da oncocercose (cegueira dos rios), doença caracterizada pela
formação de nódulos subcutâneos, prurido, alterações na pele e, na forma mais grave, pode
levar a cegueira (Moraes et al. 1972; Moraes 1991). No Brasil é encontrada na área indígena
Yanomami, localizada ao norte do estado do Amazonas e Roraima (Moraes et al. 1974;
Moraes e Chaves 1974).
Também são transmissores da Mansonella ozzardi (Manson), agente etiológico da
mansonelose, que tem distribuição restrita em alguns países da América do Sul (Tavares
1981). No Brasil já foi encontrada nos estados do Amazonas, Mato Grosso, Roraima, Acre e
Rôndonia (Deane 1949; Oliveira 1963; D’Andretta et al. 1969; Adami et al. 2014; Velasques
2013).
Os simulídeos são considerados como possíveis agentes do Pênfigo Foliáceo ou
Fogo Selvagem, uma doença autoimune e endêmica caracterizada pela formação de bolha na
pele e lesões cutâneas (Zaitz et al. 2000). Acredita-se que essa doença seja desencadeada por
alergias a substâncias encontradas na saliva desses insetos (Diaz et al. 1989). Na região Norte
do Brasil esses insetos também foram apontados como causadores da Síndrome Hemorrágica
de Altamira (SHA), uma púrpura trombocitopênica caracterizada por hemorragias cutâneas, e,
em alguns casos, sangramento das mucosas. Essa síndrome é possivelmente causada pela
20
hipersensibilidade à secreção salivar, após a exposição a um grande número de picadas de
algumas espécies de simulídeos (Pinheiro et al. 1974; Costa-júnior et al. 1997).
Esses insetos também são causadores em alguns locais de sérios danos
econômicos no setor veterinário, uma vez que são transmissores de diversos patógenos aos
animais. Na América do Norte são apontados como transmissores do protozoário
Leucocytozoon Berestneff, que causa leucocitozoonose ou malária das aves, presente
principalmente em perus, frangos, patos e gansos. Também são vetores da oncocercose
bovina, uma infecção não patogênica causada por várias espécies de nematódeos do gênero
Onchocerca. Além disso, as picadas desses insetos podem causar reações alérgicas em alguns
animais, além do stress que consequentemente provoca a redução na produção de leite, da
carne bovina e de ovos em aves (Crosskey 1990). Na América Latina foram apontados como
prováveis vetores da Encefalite Equina, doença que pode afetar o homem de forma
circunstancial (Homan et al. 1985).
As picadas desses insetos muitas vezes além de incômodo podem causar reações
alérgicas no homem e consequentemente influenciar de forma negativa na economia e no
turismo dessas áreas afetadas (Crosskey 1990). Um exemplo é a espécie Chirostibia pertinax
(Kollar) que, no estado de São Paulo, causa prejuízos econômicos nos setores da pecuária e
turismo devido à sua abundância e voracidade (Araújo-Coutinho et al. 1988).
1.4. Estudos com Simuliidae na Amazônia
Devido a importância dos simulídeos e a sua participação no ciclo de transmissão
de diferentes agentes patogênicos para o homem, no estado do Amazonas vários estudos
foram realizados com esses insetos.
21
Até o presente seis espécie de simulídeos tem sido incriminada como vetoras de
filárias para o homem: Thyrsopelma guianense (Wilse), Notolepria exiguua (Roubaud),
Psaroniocompsa incrustata (Lutz), Cerqueirellum oyapockense (Floch e Abonnenc),
Cerqueirellum amazonicum (Goeldi) e Cerqueirellum argentiscutum (Cerqueira 1959;
Shelley e Shelley 1976; Shelley et al. 1980; Moraes et al. 1985; Shelley et al. 1997; PyDaniel et al. 2000).
Além dessas espécies, relativamente bem conhecidas, existem vários estudos com
outras espécies de simulídeos no estado do Amazonas, referentes à biologia (Hamada 1998),
ecologia (Hamada 1998; Medeiros et al. 2008), taxonomia clássica e molecular (Hamada e
Adler 1998; Hamada e Adler 2001; Velásquez et al. 2002; Scarpassa e Hamada 2003; PyDaniel et al. 2005; Alvan-Aguilar et al. 2005; Pessoa et al. 2008; Hamada et al. 2008;
Hamada et al. 2010; Crainey et al. 2014).
Estudos realizados por Hamada e Adler (2001) relataram abundância dos
simulídeos nos municípios de Presidente Figueiredo, Manacapuru, Careiro da Várzea, Novo
Airão e Itacoatiara, no estado do Amazonas, onde foram registradas onze espécies de
simulídeos. Ectemnaspis rorotaense (Floch e Abonnenc) e E. trombetense (Hamada, PyDaniel e Adler) fazem parte dessas espécies coletadas na região.
1.5. Espécies Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense
As espécies E. rorotaense e E. trombetense pertencem ao grupo de espécies
Perflavum (Adler e Crosskey 2013). A primeira espécie é encontrada na Guiana Francesa,
Guiana, Colômbia, Venezuela e o Brasil, onde é encontrada nos estados do Amapá,
Amazonas, Mato Grosso, Pará e Rondônia (Adler e Crosskey 2014).
22
Os adultos de E. rorotaense, possuem cerca de 2-2,5mm de comprimento,
apresentam um padrão de coloração amarelada. Em um estudo realizado na Serra das
Andorinhas no estado do Pará, foram registradas fêmeas de E. rorotaense atacando humanos
(Monteiro-Santos 2008). Nesse estágio são morfologicamente muito semelhantes às espécies
E. maroniense (Floch e Abonnenc) e E. suarezi (Ramírez Pérez, Rassi e Ramírez), nesse caso
sendo necessários os estágios imaturos (larva de ultimo estádio e pupa) para diferenciação das
espécies. As larvas de último instádio podem ser identificadas através da morfologia do
histoblasto blaquial. As pupas de E. rorotaense possuem entre 17 e 23 filamentos brânquias,
longos, finos e levemente pigmentados (Hamada e Adler 1998). As formas imaturas (larvas e
pupas) dessa espécie são encontradas em ambientes mais conservados como em áreas de
floresta, substratos tipo troncos, folhas secas e em decomposição. (Hamada e Adler 2001).
A espécie E. trombetense é registrada no Brasil e na Guiana Francesa. No Brasil a
espécie ocorre nos estados de Amazonas, Amapá, Pará e Roraima (Adler e Crosskey 2014).
Os adultos de E. trombetense possuem o corpo amarelado e medem cerca de 2-4,6mm de
comprimento. Na fase larval essa espécie pode ser diferenciada das demais espécies do grupo
Perflavum pela forma do histoblasto branquial das larvas maduras. Os estágios imaturos são
encontrados em ambientes de floresta, córregos e em locais com presença de cachoeiras
(Hamada e Adler 1998).
As pupas de E. trombetense
possuem forma de bota ou sapatiformes, e
apresentam coloração castanho escuro. Nessa fase podem ser reconhecidas pelo característico
padrão de seus filamentos branquiais que varia entre 160 e 250 filamentos (Hamada e Adler
1998).
Essas espécies são relativamente pouco estudadas, com apenas alguns trabalhos
realizados no estado do Amazonas, que abordaram a biologia e taxonomia. Ambas as espécies
23
são abundantes nos municípios próximos de Manaus (Hamada e Adler 1998; Hamada e Adler
2001; Scarpassa e Hamada 2003).
1.6. Mecanismo de defesa dos insetos
Os insetos desenvolveram um eficiente sistema de defesa contra ação de
patógenos. A cutícula externa, o revestimento quitinoso da traquéia, a armadura cibarial e a
matriz peritrófica no intestino médio constituem as primeiras barreiras físicas de defesa dos
insetos contra organismos invasores (Dunn 1986; Lemaitre e Hoffman 2007).
A armadura cibarial presente em algumas espécies de insetos constitui também
uma barreira física contra infecções, além de ser um fator indicativo da competência vetorial
(Mcgreevy et al. 1978; Shelley et al. 1997). Espécies de simulídeos com armadura cibarial
apresentam baixo índice de infecção por microfilarias (ex. C. oyapockense). Por outro lado,
foi observado que fêmeas de T. guianense que não possuem dentes grandes nessa estrutura
apresentaram maiores cargas de microfilarias, sugerindo que essa configuração morfológica
do cibário seja uma característica importante para as espécies vetoras da oncocercose (Shelley
et al. 1997).
Quando as barreiras físicas de defesa são rompidas pelos invasores, eles penetram
no interior dos insetos e entram em contato com a hemolinfa, ativando o sistema imune inato,
que por sua vez é composto por uma resposta imune humoral e outra celular. A imunidade
humoral é ativada por moléculas específicas do inseto que interagem com moléculas padrão
do patógeno e ativam receptores de membrana nas células do corpo gorduroso,
desencadeando cascatas de reações químicas que terminam na produção de moléculas efetoras
para combater o invasor. A imunidade celular é mediada por células que, uma vez ativadas,
24
participam dos processos de fagocitose, encapsulação e melanização (Lemaitre e Hoffman
2007).
1. 6. 1. Hemolinfa
A hemolinfa é um fluido aquoso que circula na hemocele e contém íons,
moléculas e células (hemócitos). Pode apresentar coloração clara ou mesmo incolor, podendo
também ser amarelada ou esverdeada, raramente vermelha. O volume pode variar de acordo
com o estágio da vida e com as condições fisiológicas do inseto, com cerca de 20 a 40% do
peso total nas larvas e entre 5 e 40 % do peso corporal das pupas e adultos de alguns insetos.
O plasma constitui a parte líquida da hemolinfa, onde também são encontradas muitas
substâncias dissolvidas, tais como sais, açúcares, proteínas e hormônios. Estas substâncias
podem variar entre insetos e entre diferentes fases da vida do mesmo inseto. A hemolinfa tem
a função de mediar todas as trocas químicas entre os tecidos dos insetos (Chapman 1998;
Triplehorn e Jonnson 2011; Gullan e Cranston 2007).
1. 6. 2. Hemócitos
Os hemócitos são as células do sistema imune dos insetos, alguns circulam
livremente na hemolinfa e outros podem ser encontrados aderidos aos tecidos. Variam em
quantidade de 1.000 a 100.000 por mm3 de hemolinfa, dependendo do estágio de vida do
inseto (Triplehorn e Jonnson 2011). Em estudos realizados com Drosophila Fállen, modelo
utilizado para estudos do sistema imune, foi mostrado que uma primeira população de
hemócitos é formada durante o estágio embrionário na mesoderma procefálica e uma segunda
população durante o estágio larval, no gânglio linfático, o órgão hematopoiético (Wood e
Jacinto 2007).
25
Os hemócitos podem apresentar formas diferentes quando expostos a diferentes
condições, o que tem tornado difícil uma classificação universal dessas células (Chapman
1998). São classificados em sete tipos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos,
oenocitóides, coagulócitos, adipohemócitos e esferulócitos (Gupta 1985). No entanto em uma
das classificações mais utilizadas para estas células, além dos tipos citados acima, são
adicionados mais dois tipos: podócitos e vermiformes, que são encontradas em poucos insetos
(Jones 1962).
Essas células desempenham importantes funções de defesa como fagocitose,
encapsulação e nodulação (Dunn 1986). A fagocitose é uma forma defesa contra vírus,
bactérias, fungos ou protozoários. Esse processo ocorre através do reconhecimento,
englobamento e destruição intracelular desses invasores. Os plasmatócitos e os granulócitos
são os principais tipos de hemócitos envolvidos nesse mecanismo de defesa na maioria dos
insetos (Ratcliffe et al. 1979). Em larvas de Drosophila os lamelócitos (= oenocitóides) são as
células responsáveis pela fagocitose de microorganismos e de células apoptóticas (Lemaitre e
Hoffaman 2007).
A encapsulação ocorre quando o agente invasor é muito grande para ser
fagocitado. Em larvas de Drosophila quando os lamelócitos circulantes na hemolinfa
reconhecem um invasor emitem sinais para que no gânglio linfático ocorra a diferenciação de
prohemócitos em lamelócitos. Essas células formam um revestimento (capsula) em torno do
invasor, desencadeando uma cascata de melanização e consequentemente a morte do invasor
(Lemaitre e Hoffman 2007).
A nodulação é muito semelhante ao processo de encapsulação, que é ativada
quando ocorre uma grande concentração de agentes invasores na hemolinfa, não sendo
possível eliminá-los por fagocitose (Ratcliffe et al. 1979). Além das funções mencionadas
26
acima, os hemócitos também auxiliam na coagulação da hemolinfa e no armazenamento e
distribuição de nutrientes (Gullan e Cranston 2007).
1. 6. 3. Estudos com hemócitos de insetos
O primeiro estudo que relata sobre hemócitos em invertebrados, segundo Jones
(1962) foi realizado por Swammerdam (1669). Posteriormente Cuenot (1896), fez uma prévia
observação sobre e função dessas células em diferentes espécies. No entanto foi Millara
(1947), quem classificou pela primeira vez essas células em quatro tipos. Desde então a
classificação dessas células vem sendo revista em vários estudos (Yeager 1945; Wigglesworth
1956; Jones 1962; Cunha et al. 1976; Gupta 1985; Lello et al. 1987; Berger e Slavícková
2008; Ghasemi et al. 2013).
Estudo da hemolinfa de gafanhotos adultos machos Tropidacris collaris (Stoll)
(Orthoptera, Romaleidae), através de microscopia de luz, mostraram os seguintes tipos de
células: prohemócitos, plasmatócitos, coagulócitos e granulócitos, com maior abundância de
plasmatócitos, que são importantes na fagocitose (Correia et al. 2005). Em larvas de Papilio
demoleus (Linnaeus) (Lepidoptera: Papilionidae), usando microscopia eletrônica de varredura
(MEV), foram identificados seis tipos de hemócitos: prohemócitos, plasmatócitos,
adiphoemócitos, granulócitos, enocitóides e esferulócitos, vermiformes e podócitos (Jalali e
Salehi 2008).
Brayner et al. (2005) caracterizaram, através de microscopia ótica e microscopia
eletrônica de transmissão, seis tipos de hemócitos em Culex quinquefasciatus: prohemócitos,
esferulócitos, adipohemócitos, oenocitóides, plasmatócitos e granulócitos. Em um estudo de
caracterização de hemócitos de fêmeas de Aedes aegypti (Linnaeus) e Aedes albopictus
(Skuse), utilizando microscópia de luz e MET, foram identificados seis tipos de hemócitos:
27
prohemócitos, adipohemócitos, granulócitos, plasmatócitos, oenocitóides e trombocitóides
(Araújo 2011).
Em Simuliidae Rubtsov (1959) foi o primeiro a descrever os tipos celulares
encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de simulídeos paleártico, que ultilizando
um sistema de classificação antiga, identificou os seguintes tipos celulares: oenocitos,
oenocitóides, hemócitos granulares, proleucócitos, macronucleócitos, micronucleócito,
hemócitos fusiformes, fagócitos, adipócitos. Luckhart (1992), utilizando microscopia ótica e
MEV identificou quatro tipos de hemócitos em Simulium vittatum [=Psilozia vittata]
(Zetterstedt): prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e esferulócitos. Posteriormente Cupp
et al. (1997), descreveu alterações no número e na morfologia em hemócitos de Simulium
vittatum [=Psilozia vittata] após infecção em laboratório com Onchocerca linealis.
Estudos sobre resposta imune em Simuliidae são escassos. A região amazônica é
área endêmica de filarioses transmitidas por simulídeos. Nenhum trabalho até o momento foi
desenvolvido sobre o tema na região Neotropical.
O presente trabalho caracterizou as células do sistema de defesa das espécies E.
rorotaense e E. trombetense, que apesar de não serem espécies reconhecidas como vetoras,
constituem, devido às facilidades de acesso aos criadouros, modelos para estudo de
hemócitos. Esse passo é importante para compreender a dinâmica de interação parasitahospedeiro e de conhecimento da biologia e fisiologia desses insetos.
28
2. OBJETIVOS
2. 1. Objetivo Geral
Realizar o estudo de caracterização e proporção de tipos celulares da hemolinfa de
Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense.
2. 2. Objetivos específicos
- Identificar os tipos de hemócitos em larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E.
trombetense.
- Descrever morfologicamente e ultra-estruturalmente os hemócitos presentes na hemolinfa
E. rorotaense e E. trombetense.
- Realizar a contagem diferencial dos hemócitos em larvas, pupas e adultos de E.
rorotaense e E. trombetense.
29
3. MATERIAL E MÉTODOS
3. 1. Coleta de simulídeos
As coletas dos simulídeos (larvas e pupas) foram realizadas no município de
Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil, localizado a aproximadamente 107 Km
da cidade de Manaus, com uma área territorial de 25.422 Km² e uma temperatura média de
28,5ºC (Figura 1a) (IBGE, 2013). As larvas e pupas foram coletadas no período de junho a
dezembro de 2013, em duas corredeiras na rodovia AM 240: Cachoeira da Naza no Km 6
(Figuras 1b, 2a) e Sossego da Pantera no Km 20 (Figuras 1b, 2b).
A
B
Figura 1: Locais de coleta de simulídeos das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis
trombetense. (A) Mapa do estado do Amazonas mostrando a localização do município de Presidente
Figueiredo (Fonte: IBGE). (B) Imagem de satélite mostrando a localização das áreas de coleta
(Fonte: GOOGLE MAPS).
30
Figura 2: Locais de coleta de larvas e pupas das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis
trombetense. (a) Cachoeira da Naza no Km 6 e (b) Cachoeira do Sossego da Pantera no Km 20,
Município de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil (Fonte: J. C. Silva).
As larvas e pupas de E. rorotaense e de E. trombetense foram coletadas de forma
manual através da remoção de substratos como, folhas verdes ou em decomposição, galhos e
raízes submersas. Posteriormente, os substratos foram colocados em sacos plásticos contendo
água do igarapé e acondicionados em caixas térmicas para manter a temperatura (Figura 3a),
em seguida, foram transportadas para o Laboratório de Ecologia de Doenças Transmissíveis
na Amazônia (EDTA) do Instituto Leônidas e Maria Deane Fiocruz – Amazônia – (ILMD),
localizados na cidade de Manaus, Amazonas.
As pupas maduras, caracterizadas por apresentarem aspecto geral mais escuro, foram
separadas individualmente em frascos e mantidas a 27oC para emergência dos adultos, que
variou entre um e quatro dias (Figuras 3b e 3c). Posteriormente os adultos recém-emergidos
foram identificados a nível específico segundo as chaves propostas por Hamada e Adler
(2001) e Coscaron e Coscaron-Arias (2007). Para identificação das espécies foram utilizados
caracteres morfológicos de larvas e pupas tais como: forma do histoblasto branquial, número
e forma dos filamentos branquiais, forma do casulo e tubérculos cefálicos. A nomenclatura
taxonômica utilizada seguiu a proposta de Py-Daniel e Sampaio (1994).
31
Figura 3: Transporte e tratamento do material coletado em campo. (a) Armazenamento e transporte de
substratos com imaturos de simulídeos. (b) Frascos para separação individual das pupas das espécies
das duas espécies do estudo. (c) Adultos emergidos de Ectemnaspis. rorotaense e Ectemnaspis
trombetense (Fonte: J. C. Silva).
3. 2. Coleta de hemolinfa
Para a coleta de hemolinfa de larvas, pupas e adultos recém-emergidos (um dia de
vida), os indivíduos foram adormecidos no gelo por cerca de 1 a 2 minutos (Figura 4a), e em
seguida foi realizado, com auxílio de um micro capilar de vidro acoplado a uma seringa
Hamilton, uma perfusão na região torácica do inseto, onde foram inoculados 4μl de
anticoagulante tampão de citrato (98 mM ClOH, 145 mM NaCl, 1,7 mM e EDTA e 41 mM de
Ácido Cítrico) (Figuras 4b e 4c), imediatamente a hemolinfa foi coletada com auxilio de uma
pipeta (Araújo et al. 2008). Após a coleta da hemolinfa, o material testemunho foi conservado
em álcool a 70% e devidamente etiquetado.
32
Figura 4: Procedimento para coleta de hemolinfa. (a) - Simulídeos adormecidos no gelo; (b) - Sistema
utilizado para perfusão da hemolinfa (1- Lupa estériomicroscopio, 2- Capilar de vidro, 3- Suporte para
capilar); (c) – Procedimento de coleta da hemolinfa em adulto de simulídeo (1- Capilar inoculando
anticoagulante, 2- Liberação de hemolinfa ). (Fonte: J. C. Silva).
3. 3. Microscopia de Luz
Após a coleta 10µl de hemolinfa foram colocadas individualmente em lâminas e
deixadas para secar por um período de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida as
células foram coradas com o Kit Panótico Rápido® (Laborclin), de acordo com o seguinte
protocolo: inicialmente as células foram fixadas com o Metanol por 10 minutos,
posteriormente foram imersas por um minuto na solução de xanteno 0,1% e por último imerso
por um minuto na substância na solução de tiazina 0,1%. Em seguida as lâminas foram
lavadas com água ultra pura e colocadas para secar à temperatura ambiente. Por fim, para
montagem permanente das células foram adicionados meio Entellan® (Merck) e lamínulas
(Figuras 5a e 5b). No total foram montadas 100 lâminas de E. rorotaense e 50 lâminas de E.
trombetense. Da primeira espécie foram selecionadas as 27 melhores lâminas e 19 lâminas
para a segunda espécie.
As lâminas foram analisadas em microscópio óptico em campo claro, modelo AX10
da ZEISS (Mager M2M) (Figura 5c). As células observadas foram fotografadas no aumento
de 100X, com câmera acoplada ao microscópio utilizando os programas: Auto Montage do
33
EDTA do ILMD – Fiocruz Amazônia e o programa ZEN pro 2012, do LIKA da Universidade
Federal de Pernambuco e editadas usando o programa Adobe Photoshop. Para caracterização
morfológica das células foram considerados: morfologia e o tamanho.
Figura 5: Procedimento para coloração das células e montagem das lâminas para microscopia óptica.
(a) - Kit Panótico® para coloração das lâminas. (b) - Lâminas de vidro coradas; (c) - Microscópio
óptico (Fonte: J. C. Silva).
3. 4. Contagem diferencial de hemócitos
Para a contagem diferencial dos hemócitos em E. rorotaense e E. trombetense, foi
realizada a coleta de hemolinfa como descrito anteriormente no item 3.2. A contagem das
células foi realizada através do microscópio de luz em campo claro, em aumento de 100X.
Foram utilizadas para diferenciação dos tipos celulares características morfológicas, como:
tamanho celular, tamanho do núcleo, projeções da membrana citoplasmática e presença de
grânulos (Brayner et al. 2005).
A contagem diferencial das células foi analisada por estatística descritiva (total,
média e desvio padrão) para todos os estágios (larva, pupa e adultos) e somente para os
adultos foi comparada através dos testes Kruskal-Wallis e a posteriori de Student-Newman-
34
Keuls, analisados ao nível de significância de 5% (Ayres et al. 2007). As análises foram feitas
no programa Bioestat.
3. 5. Microscopia Eletrônica de Transmissão
Foi coletada a hemolinfa de 200 adultos (machos e fêmeas) de Ectemnaspis
rorotaense e de 200 adultos (machos e fêmeas) de Ectemnaspis trombetense, posteriormente
colocada em microtubos de 1,5ml tratados com Sigmacote® (Sigma) 24 horas antes do uso
para evitar a adesão dos hemócitos na superfície interna dos mesmos (totalizando 4 pools
contendo a hemolinfa de 60 indivíduos para cada espécie). A cada microtubo, contendo pool
da hemolinfa foi adicionado fixador Karnovsky (glutaraldeido 2,5%, formaldeído 4,0% e
tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7.2), numa proporção de três partes de fixador
Karnovsky e uma parte de hemolinfa. Em cada microtubo foi reunida a hemolinfa de 60 a 100
indivíduos dependendo da quantidade de adultos emergidos por dia. A hemolinfa foi
centrifugada a 6000 rpm por 5 minutos, em seguida foi removido o excesso de fixador e a
hemolinfa foi lavada três vezes consecutivas com tampão de cacodilato de sódio 0,1M pH 7,4.
Em seguida as amostras foram pós – fixadas, com tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato
0,1 M, pH 7,2, à temperatura ambiente e protegidos da luminosidade por 2 horas.
Posteriormente foi centrifugado e retirado o excesso de ósmio e lavada novamente por três
vezes consecutivas com tampão de cocodilato. Na etapa seguinte, a amostra foi desidratada
com banhos de etanol em concentrações diferentes de 50%, 70%, 90% e três banhos a 100%.
Cada banho durou 30 minutos a temperatura ambiente. Após a desidratação as amostras foram
submetidas ao procedimento de infiltração e emblocamento (formação de blocos em resina)
com séries crescentes de resina Epon 812 (Electron Microscopy Sciences) (Figura 6a).
Posteriormente, com o auxílio de ultramicrótomo foram realizados cortes ultrafinos, em
seguida as amostras foram contrastadas com citrato de chumbo, por 5 a 10 minutos, e acetato
35
de Uranila a 5%, por 20 a 30 minutos (Figura 6b) (Brayner et al.2005; Brayner et al. 2007;
Araújo et al.2008).
As análises dos cortes foram feitas em microscópio eletrônico de transmissão
modelo Tecnai Spirit G1 Bio Twin da Fei Company, e as imagens foram obtidas por meio dos
seguintes programas: Microscope User Interface (Fey Company) e TEM Imagine and
Analysis, do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - Fiocruz Recife (Figura 6c).
Figura 6: Procedimento para microscopia de transmissão. (a) - Emblocamento de material em resina;
(b) - Ultramicrótomo, utilizado para realizar os cortes ultrafinos do material em resina; (c) Microscópio eletrônico de transmissão utilizado para obter as imagens das células (Fonte: J. C. Silva).
36
4. RESULTADOS
Caracterização morfológica dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense.
Através da microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão foram
identificados quatro tipos morfológicos de células na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de
E. rorotaense: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides (Figuras 7 e 9). Os
mesmos tipos celulares foram encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E.
trombetense (Figuras 8 e 10).
Prohemócitos
Os prohemócitos encontrados apresentam forma arredondada ou oval (Figuras
11A-C). São os menores tipos celulares observados na hemolinfa de E. rorotaense e E.
trombetense variando de 5 a 10µm. Esse tipo celular é caracterizado pela presença de um
núcleo volumoso em relação ao citoplasma, e em algumas dessas células foram visualizadas
pequenas projeções da membrana citoplasmática (Figuras 7A e 8A). Em imagens de
ultraestruturas foi observado no citoplasma a presença de poucas organelas, algumas
mitocôndrias e reticulo endoplasmático (Figura 9A e 10A). Também foram encontrados
agrupamentos com duas, três e quatro células (Figura 7A e 8A).
Granulócitos
Os granulócitos possuem forma arredondada e oval (11D – F), variando de 20 a
25 µm, podem apresentar projeções da membrana plasmática. Mesmo em microscopia óptica
foi possível visualizar grânulos no citoplasma dessas células (Figuras 7B e 8B). Através das
imagens de ultraestrutura foi possível identificar no citoplasma o retículo endoplasmático
rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e algumas vesículas. Esse tipo celular é
37
caracterizado pela presença de grânulos com variação no tamanho e forma. Também foi
observado um núcleo grande e geralmente excêntrico com ilhas de heterocromatina no seu
interior (Figuras 9B e 10B).
Oenocitóides
Os oenocitóides apresentam formato arredondado ou oval (12A – B), e em
algumas ocasiões possuem projeções da membrana citoplasmática, o tamanho varia entre 10 e
15µm. São caracterizados por possuírem um núcleo pouco desenvolvido, que geralmente está
localizado na região central (Figuras 7C e 8C). Em microscopia eletrônica apresentaram um
citoplasma homogêneo com presença de mitocôndrias, vesículas, ribossomos e retículo
endoplasmático rugoso (Figuras 9C e 10C).
Plasmatócitos
Os plasmatócitos observados apresentaram formas variadas (12C-F, 13A-D), com
tamanho entre 45 e 55µm. Este tipo celular caracteriza-se pelas grandes projeções da
membrana citoplasmática (Figuras 7D, 8D, 9D e 10D). Em imagens de ultraestrutura foi
identificado no citoplasma o retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi e vesículas
que podem estar preenchidas com substâncias amorfas ou vazias. O núcleo dessas células
geralmente é pequeno e excêntrico (Figuras 9D, 10D e 13A-D).
38
Figura 7: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia óptica. (A)
Prohemócitos, com núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma. (B) Granulócito
apresentando forma irregular e com presença de grânulos no citoplasma (seta fina vermelha). (C)
Oenocitóide com um pequeno núcleo localizado centralmente (seta fina). (D) Plasmatócito com
visíveis extensões da membrana citoplasmática (seta grossa) e um núcleo centralizado (seta fina).
Barra = 10µm.
39
Figura 8: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A) Prohemócitos, exibindo um núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma. (B) –
Granulócito, com muitos grânulos presentes no citoplasma (seta vermelha) e núcleo grande localizado
centralmente (seta fina). (C) Oenocitóide com um núcleo pouco desenvolvido (seta fina). (D) Plasmatócito apresentando uma grande projeção da membrana citoplasmatica (seta grossa). Barra = 10
µm.
40
Figura 9: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia eletrônica de
transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (N), citoplasma com algumas
mitocôndrias (m) e retículo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina
no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo
endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo
(N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D)
Plasmatócito exibindo forma alongada e projeções da membrana citoplasmática (seta grande), no
citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re).
41
Figura 10: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia eletrônica de
transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V), citoplasma com pequena
projeção da membrana (seta grande), algumas mitocôndrias (m) e reticulo endoplasmático (Re). (B)
Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da
membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (Ve). (C)
Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m),
vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo longa projeção da
membrana plasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e
retículo endoplasmático (Re).
42
Figura 11: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A-C) Prohemócitos apresentando diferentes padrões
de morfologia e em alguns foram observados indícios de divisão celular e a presença de pequenas
projeções da membrana citoplasmática. (D-F) Granulócitos apresentando membrana plasmática
irregular e com presença de visíveis grânulos. Barra = 10 µm.
43
Figura 12: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense por microscopia óptica. (A-B) Oenocitóides com variações morfológicas,
células apresentando núcleo pouco desenvolvido, localizado centralmente ou deslocado. (C-F)
Plasmatócitos apresentaram maior variação morfológica, geralmente com longas projeções da
membrana citoplasmática, com núcleo localizado no centro, em algumas células foi observado um
núcleo deslocado. Barra = 10 µm.
44
Figura 13: Diferenças morfológicas observadas em plasmatócitos de Ectemnaspis rorotaense e
Ectemnaspis trombetense por microscopia eletrônica de transmissão. (A) plasmatócito com forma
irregular e com projeções da membrana citoplasmática. (B) plasmatócito com forma mais arredondada
apresentando uma longa extensão da membrana citoplasmática. (C) plasmatócito com pequenas
projeções da membrana. (D) célula com forma mais alongada e com um grande número de vacúolos
no citoplasma
45
Contagem diferencial dos hemócitos em larvas, pupas e adultos de Ectemnaspis
rorotaense e de Ectemnaspis trombetense.
Em relação à contagem diferencial dos hemócitos, para a espécie E. rorotaense foi
encontrado um maior número de plamatócitos no estágio de larva, granulócitos em pupa e
prohemócitos no adulto (Tabela 1). No estágio adulto observou-se que prohemócitos
apresentaram maior número em relação a outras células apresentando diferença estatística
significativa (H = 7,9, gl = 3 p = 0,04) (Tabela 2). Com a análise a posteriori utilizando o teste
de Student-Newman-Keuls foi observada diferença significativa entre os prohemócitos,
oenócitos e granulócitos (p < 0,05) (Figura 14).
Tabela 1: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados em
larvas, pupas e adultos da espécie Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e
Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil.
Tipos de células
Larva
Pupa
Adultos
Prohemócitos
23
4,0 ± 6,4
16
190
9,5 ± 12,1
Plasmatócitos
34
53
83
5,6 ± 8,7
4,1 ± 5,6
Oenocitóides
8
1,3 ± 1,7
15
60
3,0 ± 3,7
Granulócitos
24
72
89
4,0 ± 3,7
4,4 ± 5,5
n larva = 6 lâminas, n pupa = 1, n adultos = 20
46
Tabela 2: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na
hemolinfa de adultos de Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da
Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil.
Prohemócito
Plasmatócito
Oenocitóide
Granulócito
190
83
60
89
Média e DP
9,5 ± 12,1
4,1 ± 5,6
3,0 ± 3,7
4,4 ± 5,5
Min - Máx
0 - 53
0 - 25
0 - 14
0 - 23
Total
n = 20 lâminas, DP = Desvio padrão, Min = Mínimo, Máx = Máximo.
Figura 14: Número de hemócitos encontrados em Ectemnaspis rorotaense, coletados na cachoeira da
Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do
Amazonas. As letras maiúsculas e minúsculas nas barras indicam que houve uma diferença
significativa após o teste de Kruskal-Wallis seguido de Student-Newman-Keuls.
Para a espécie E. trombetense foi observado um maior número de prohemócitos
no estágio de larva e de plasmatócitos em pupa, e plasmatócitos e granulócitos em adultos
47
(Tabela 3). Nos adultos embora o número de plasmátocitos e granulócitos tenham sido maior
em relação às outras células, não foi encontrado diferença significativa (H = 6,1, gl = 3 p =
0,10) (Tabela 4).
Tabela 3: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na
hemolinfa de larvas, pupas e adultos na espécie Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da
Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do
Amazonas.
Tipos de células
Larva
Pupa
Adultos
Prohemócitos
79
40
36
19,7 ± 22,6
10,0 ± 18,0
3,2 ± 3,3
7
170
110
1,7 ± 1,7
42,5 ± 72,3
10,0 ± 10,5
1
22
31
0,2 ± 0,5
5,5 ± 8,3
2,8 ± 4,1
37
146
110
9,2 ± 9,5
36,5 ± 51,4
10,0 ± 10,3
Plasmatócitos
Oenocitóides
Granulócitos
n larva = 4 lâminas, n pupa = 4, n adultos= 11
Tabela 4: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na
hemolinfa de adultos de Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego
da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil.
Prohemócito
Plasmatócito
Oenócitóide
Granulócito
36
110
31
110
Média e DP
3,2 ± 3,3
10,0 ± 10,5
2,8 ± 4,1
10,0 ± 10,3
Min - Máx
0 - 12
0 - 28
0 - 13
0 - 33
Total
n = 11 lâminas, DP = Desvio padrão, Min = Mínimo, Máx = Máximo.
48
5. DISCUSSÃO
Esse é o primeiro trabalho de caracterização celular de hemócitos para simulídeos
da região Neotropical. A terminologia utilizada para a nomenclatura de hemócitos ainda é
controversa. Existem diversas terminologias, que geram dúvidas, considerando que o mesmo
tipo celular pode assumir diferentes formas morfológicas (Joshi e Lambdin 1996). Nesse
trabalho foi utilizada a nomenclatura de Gupta (1991).
No presente estudo foram identificados e descritos quatro tipos morfológicos de
hemócitos na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense:
prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos. Esses tipos celulares foram
descritos em diferentes espécies de Diptera, ex. Anastrepha obliqua (Silva et al. 2002), Culex
quinquefasciatus (Brayner et al. 2005), Anopheles gambiae (Castillo et al. 2006), Aedes
aegypti (Castillo et al. 2006; Araújo et al. 2008; Koodalingam et al. 2014), Musca domestica
(Fernandes 2010) e Aedes albopictus (Araújo 2011). Segundo a revisão de Siddiqui e Al
Khalifa (2012) em Diptera são encontrados até sete tipos celulares, os prohemócitos,
granulócitos, oenocitóides, plasmatócitos, esferulócitos, coagulócitos e adipócitos. Esses
autores utilizaram a nomenclatura de Gupta (1985).
Nas duas espécies de Ectemnaspis estudadas nesse trabalho foram encontrados
tipos celulares similares. No que se refere à família Simuliidae, poucos trabalhos tem relatado
e descrito hemócitos. Rubtsov (1959) foi o primeiro a descrever os tipos celulares encontrados
na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de simulídeos paleártico, propondo os seguintes tipos
celulares: oenocitos, oenocitóides, hemócitos granulares, proleucócitos, macronucleócitos,
micronucleócito, hemócitos fusiformes, fagócitos, adipócitos e células derivadas da camada
interna do corpo gorduroso, todos derivados então do hemocitoblasto.
49
Posteriormente Luckhart et al. (1992), descreveram quatro tipos morfológicos de
hemócitos encontrados na hemolinfa de fêmeas adultas de Simullium vittatum [=Psilozia
vittata], simulídeo do neártico, prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e esferulócitos.
Comparando com resultados em Ectemnaspis, não foi encontrado o tipo denominado como
esferulócito, porém foi encontrado o tipo oenocitóide. Luckart e colaboradores utilizaram
microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura no seu trabalho, enquanto que para
esta dissertação foi utilizada a MET para identificação dos tipos celulares. A MET é
considerada o método mais adequado para caracterização de células (ex. Araújo et al. 2008;
Brayner et al. 2005). Posteriormente Cupp et al. (1997) observaram alterações em células
imaturas na hemolinfa de Simulium vittatum [=Psilozia vittata] após infecção em laboratório
com Onchocerca linealis, sendo verificado um aumento significativo da abundância das
células e dos tipos celulares em até 20 horas após a infecção, tendo uma queda geral da
abundância após esse período.
Os tipos mais comuns de hemócitos relatados na literatura foram os prohemócitos,
granulócitos, plasmatócitos, esferulócitos e oenocitóides. Esses tipos de hemócitos têm sido
descritos em insetos de várias ordens incluindo Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Blattaria,
Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera e Collembola (Jones 1962; Barraco at al. 1987; Ashida
et al. 1988; Lavine e Strand 2002; Correia at al. 2005; Ribeiro e Brehelin 2006). Também
foram encontrados no presente trabalho, exceto esferulócitos, e nos trabalhos de Luckhart et
al. (1992) e Cupp et al. (1997) com Simuliidae.
Araújo (2011) caracterizou os hemócitos de Aedes aegypti e Aedes albopictus
através de microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão e encontrou os mesmos
tipos celulares para as duas espécies: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos,
adipohemócitos, oenocitóides e trombocitóides. Dois tipos a mais do que os encontrados para
50
Ectemnaspis no presente estudo e Psilozia no trabalho de Luckhart et al. (1992). Segundo
Araújo (2011), não houve diferenças quanto aos tipos celulares entre as espécies estudadas,
apresentando apenas variações morfológicas. Castillo et al. (2009) também não encontraram
diferenças nos tipos de células de Anopheles gambiae e Aedes aegypti, registrando
prohemócitos, granulócitos e oenocitóides. Todos esses tipos celulares observados em Aedes e
Anopheles foram encontrados nas duas espécies de Ectemnaspis neste estudo. As famílias
Culicidae e Simuliidae pertencem à mesma infraordem, Culicomorpha, e portanto possuem
relações filogenéticas relativamente próximas (Borkent, 2012).
Os prohemócitos foram as células mais frequentemente encontradas na hemolinfa
de adultos de E. rorotaense. Entretanto, em outra espécie de simulídeo, P. vittata, os
plasmatócitos foram os tipos celulares mais representativos, seguidos por granulócitos
(Luckhart et al. 1992). Segundo Lemaitre e Hoffmann (2007), os prohemócitos são células –
troncas precursoras, que derivarão aos demais tipos de hemócitos. Alguns prohemócitos
observados neste trabalho mostraram indícios de que essas células estivessem em processo de
divisão celular (Figuras 7a e 8a). Provavelmente esse tipo celular foi encontrado em maior
número devido ao pouco tempo de emergência dos adultos, não desafiados ainda por
antígenos que desencadeassem o processo de diferenciação celular.
Plasmatócitos foram encontrados em ambas as espécies estudadas. Foram as
células que apresentaram maior variação morfológica, desde formas alongadas e
arredondadas, e com extensões citoplasmáticas (Figuras 13A-D). Características semelhantes
estas também foram descritas em outros estudos em diferentes espécies de insetos (ex. Joshi e
Lambdin, 1996; Silva et al. 2002; Han e Gupta 1988; Brayner et al. 2005). Os plasmatócitos e
os granulócitos foram os tipos celulares mais representativos em E. trombetense. Diversos
autores afirmaram que os plasmatócitos são as principais células envolvidas no processo de
51
fagocitose (ex. Falleiros et al. 1995; Falleiros et al. 2003; MacLaughlin e Allen, 1965; Joshi e
Lambdin, 1996). Araújo (2011) identificou em A. albopictus os hemócitos envolvidos no
processo de fagocitose, após a indução com partículas abióticas nesses insetos. Araújo
observou que os plasmatócitos junto com os granulócitos foram as células que responderam
ao estímulo.
Os oenocitóides identificados neste estudo são caracterizados por possuírem um
pequeno núcleo central. Quando visualizados em ultra-estrutura foi possível observar um
citoplasma com poucas organelas (Figura 9C e 10C). Descrições semelhantes dessas células
foram feitas em larvas de Cuterebridae (Lello et al. 1987), em larvas de Anastrepha obliqua
(Tephritidae), adultos de Culex quinquefasciatus (Brayner et al. 2005) e em adultos de A.
aegypti e A. albopictus (Araújo 2011). Tanto em E. rorotaense quanto em E. trombetense esse
tipo celular foi o menos representativo. Segundo Joshi e Lambdim 1996, os oenocitóides
também são conhecidos como células de cristal e foram caracterizados na hemolinfa de
Dactyolopius confusus (Cockerell), pela presença de muitos cristais no citoplasma. Em
lepidoptera da espécie Mythimna unipuncta, essas células foram registradas produzindo
enzimas fenoloxidase (Ribeiro et al. 1996).
Os granulócitos encontrados na hemolinfa das espécies em nosso estudo
apresentaram características que os tornam de fácil reconhecimento, tais como, expansões da
membrana plasmática e um citoplasma com presença de vários grânulos, que podem ser
visualizado mesmo em microscopia de luz. Esse tipo celular foi descrito em praticamente
todos os estudos de caracterização de hemócitos (Silva et al. 2002; Correia et al. 2005; Jalali e
Salehi 2008; Brayner et al. 2005; Negreiro et al. 2009; Fernandes 2010). Foi um dos tipos
celulares mais abundantes dentre as células de E. trombetense. Cupp et al. (1997) registraram
o aumento no número granulócitos nas primeiras 10 horas após infecção experimental de O.
52
linealis ou de perfusão sem microfilária em P. vittata, evidenciando intenso processo de
fagocitose. Araújo et al. (2008) e Hillyer et al. (2003) após desafiarem A. aegypti com
partículas de látex observaram que os granulócitos foram os principais tipos celulares
envolvidos na fagocitose.
Os resultados obtidos nesse trabalho indicaram que os mesmos tipos de hemócitos
foram encontrados em adultos, pupas e larvas em ambas as espécies. Castillo et al. (2006)
encontraram os mesmo tipos celulares em larvas, pupas e adultos tanto em A. aegypti como
em A. gambiae. Cunha et al. (1976) em estudos de caracterização celular de hemócitos em
vespas da espécie Polystes versicolor não encontraram diferenças significativas quanto ao
número de hemócitos nos diferentes estágios de vida, larva, pupas e adultos. Alguns autores
tem relacionado a presença de maior número desses tipos celulares em situações fisiológicas
diferentes (ex. Cunha et al. 1976, Ghasemi et al. 2013). Neste trabalho foram utilizadas larvas
de último estádio prestes a se transformarem em pupas e também pupas e adultos recém
emergidos. O processo de muda, assim como o deslocamento do igarapé para o laboratório,
pode estar fornecendo condições adversas para o inseto, estimulando o sistema imune para a
diferenciação e aumento das células de resposta imune. Por outro lado, as formas imaturas
desses insetos habitam em igarapés, onde estão em contato contínuo com grande quantidade
de microorganismos que podem infectá-los e, dessa forma, estimular a diferenciação e
aumento dos hemócitos como mecanismo de defesa. Em larvas de borboletas Ephestia
kuehniella Zell, quando expostas em condições de stress a elevadas temperaturas foi
observado um aumento significativo na população de plasmatócitos e de oenocitóides, em
contraste quando em baixas temperaturas ocorreu uma redução no numero total de hemócitos
Ghasemi et al.(2013). Cunha et al. (1976) em seu estudo associaram o aumento de
53
piasmatócitos (granulócitos) na hemolinfa de vespas com a presença de bactérias na
hemolinfa.
54
6. CONCLUSÕES

Os tipos celulares de larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense são:
prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos.

Não existe variação nos tipos de hemócitos de E. rorotaense e E. trombetense.

Os hemócitos variam em número nos diferentes estágios de vida das espécies estudadas.

Esse estudo poderá servir como modelo para futuros estudos relacionado à interação
parasito-hospedeiro.
55
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