TRANSMISSÃO TRANSOVARIANA DOS VÍRUS DENGUE POR

TRANSMISSÃO TRANSOVARIANA DOS VÍRUS
DENGUE POR Aedes aegypti, NA CIDADE DE
FORTALEZA, CEARÁ, BRASIL
TRANSOVARIAL TRANSMISSION OF DENGUE VIRUSES BY AEDES
AEGYPTI IN FORTALEZA CITY, STATE OF CEARÁ, BRAZIL
Maria Izabel Florindo Guedes, Víctor Emanuel Pessoa Martins, Uiara Ferreira Francelino
Freitas, Maria das Graças da Silva Guerreiro
Resumo
Larvas de Aedes aegypti, provenientes dos mais diversos bairros de Fortaleza, apresentaram uma elevada taxa de infecção por
vírus dengue. Um pool de macerado de larvas, submetidos a ELISA indireto, apresentou reatividade para os 3 sorotipos testados
(den-1, den-2 e den-3). Por meio do teste de Eletroforese (SDS-PAGE), foram observadas frações protéicas em larvas infectadas,
as quais correspondem às proteínas do vírus dengue. Apenas duas pequenas proteínas foram reconhecidas por anticorpos antiden1 específicos, por meio da técnica de Western blotting. Os resultados desse trabalho sugerem que quando os ovos do mosquito
permanecem por muito tempo no ambiente, as chances da ocorrência da transmissão vertical dos vírus dengue aumentam.
Pavras-chave: vírus dengue, Aedes aegypti, transmissão vertical, Western Blotting
Abstract
Aedes aegypti larvae from several boroughs of Fortaleza City presented a high viral infection rate by dengue virus. A crushed
larvae pool showed reactivity for three tested dengue serotypes (den-1, den-2, den-3) in indirect ELISA test. By electrophoresis
(SDS-PAGE) test it was observed protein fractions in infected larvae that are correspondent to dengue virus protein. Only two
small proteins were specifically recognized by specific antibodies for serotype 1 in Western blotting. The results of this work
suggest that when mosquito eggs stay in the environment for a long period of time, the chances for vertical transmission increases.
Key-words: dengue virus, Aedes aegypti mosquitoes, vertical transmission, Western Blotting
Universidade Estadual do Ceará, Departamento de Nutrição e Enfermagem, Laboratório
de Bioquímica Humana
1. INTRODUÇÃO
As viroses representam posição de destaque no cenário mundial, uma vez que são
apontadas como importantes causadoras de doenças em seres humanos. Desta forma, pesquisas
que visam o seu controle, compreensão de seus mecanismos efetores e veículos de transmissão
são de extrema relevância para a saúde pública (OMS, 2001).
No cenário nacional e atual das infecções de etiologia viral tem-se empreendido muitos
esforços, tanto de cunho econômico quanto de recursos humanos, no combate à dengue, uma
flavivirose causada pelos vírus dengue (Martinez-Torres, 1990).
Pertencentes à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus (Gubler, 1998), os vírus dengue
apresentam-se como agentes esféricos, com 40-50nm de diâmetro, envolvidos por um envelope
lipoprotéico e cujo material genético é representado por uma única molécula de RNA de
polaridade positiva (Guzmán, 2002).
Os vírus dengue são transmitidos ao homem por meio da picada de mosquitos-fêmeas do
gênero Aedes (transmissão horizontal), sendo o Aedes aegypti o principal vetor (Teixeira et al.,
1999). Uma vez infectados, esses mosquitos podem transmitir os vírus à sua progênie
(transmissão transovariana ou vertical) (Tesh et al., 1979) (Khin, 1983).
Um dos grandes mistérios acerca da epidemiologia do dengue é quanto à persistência do
vírus na natureza durante e entre períodos epidêmicos. Ainda não foi totalmente entendido o
mecanismo pelo qual o vírus é mantido na natureza durante a ausência de hospedeiros
vertebrados ou quando as condições climáticas são desfavoráveis para a atividade do mosquito.
Considerando-se a peridomiciliaridade dos hábitos do Aedes aegypti, a potencial
ocorrência natural da transmissão transovariana dos vírus dengue ao longo de suas gerações e a
baixa incidência dos casos de dengue nas populações humanas nos períodos interepidêmicos, o
presente estudo tem como objetivo verificar a ocorrência natural desse tipo de transmissão em
Aedes aegypti, na cidade de Fortaleza, Ceará.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Virus: Os sorotipos 1, 2 e 3 do vírus do dengue, utilizados no presente trabalho, foram obtidos da
Seção de Arboviroses do Instituto Evandro Chagas, Belém, Brasil, sob a forma liofilizada,
acondicionados em ampolas. A quantidade de proteínas virais presente nas ampolas foi estimada
seguindo-se a metodologia descrita por Bradford (1976).
Larvas: As larvas de Aedes aegypti (4o estágio) foram provenientes de mosquitos originados de
ovos coletados em diversos bairros da Região Metropolitana de Fortaleza, no Estado do Ceará
Brasil, no período compreendido entre os meses de junho a dezembro de 2003. Codornas
(Nothura maculosa) mantidas em gaiolas, livres de contato com insetos transmissores de viroses,
serviram como fonte de repasto sangüíneo para os mosquitos, três vezes por semana. Para tanto,
as codornas foram colocadas em sacos de tela de nylon pendurados no teto das gaiolas. Os
mosquitos foram mantidos no Laboratório de Entomologia do Núcleo de Controle de Endemias
da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará (NUEND - SESA/CE), sob condições de temperatura
e umidade relativa do ar variando, respectivamente, de 25-30 oC e 80-85%. Tais mosquitos não
foram submetidos a quaisquer tratamentos de infecção artificial com os sorotipos do vírus da
dengue.
Larvas da cepa Rockfeller, oriundas do Departamento de Saúde Comunitária da Universidade
Federal do Ceará, foram utilizadas como controle negativo em todos os testes, dada às suas
baixas taxas de infecção pelos vírus dengue (Rosen et al., 1983).
Amostras: Uma população de aproximadamente 1600 larvas foi aleatoriamente selecionada para
ser submetida aos testes de ELISA, eletroforese e Western Blotting, para averiguação da presença
de antígenos virais.
ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay): As placas foram sensibilizadas com antígenos
dos sorotipos 1, 2 e 3 do vírus dengue (controle positivo), numa quantidade de 5g/poço. Os
demais poços foram sensibilizados, individualmente, com 100L de um pool do macerado de 20
larvas de Ae. aegypti e da cepa Rockfeller. As larvas foram maceradas em tampão PBS (NaCl,
KH2PO4, Na2HPO4.12H2O e KCl), pH 7,2, e submetidas a uma centrifugação a 3.000 g, por 15
minutos, a 4o C. Foram utilizados anticorpos policlonais específicos aos sorotipos 1, 2 e 3, na
diluição de 1:40, obtidos de soros hiperimunes de coelhos imunizados pela via subcutânea com
os respectivos sorotipos virais. Como anticorpo secundário, utilizou-se IgG de cabra anti-IgG de
coelho ligada à peroxidase, de acordo com (Koraka et al., 2002).
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE): As amostras foram submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida, de acordo com o método descrito por Laemmli (1979), e
corada com nitrato de prata, em consonância com a metodologia descrita por Blun et al., (1987).
O conteúdo protéico das amostras teve seu peso molecular estimado de acordo com proteínas
padrão (fosforilase b - 97KDa; transferrina – 80KDa; albumina bovina sérica – 66KDa;
ovalbumina – 45KDa; inibidor de tripsina – 21 KDa; lisozima – 15KDa; aprotinina).
Western Blotting: A fim de se precisar a ocorrência de antígenos dos vírus dengue nas amostras
de larvas utilizadas, o material foi submetido ao teste de Western Blotting, de acordo com
TOWBIN et al. (1979).
3. RESULTADOS
O teor de proteínas virais contido nas ampolas foi de 9,1mg/mL, 16,07mg/mL e
15,76mg/mL, respectivamente para os sorotipos 1, 2 e 3 do dengue.
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram uma elevada taxa de infecção viral
nas larvas de mosquitos Ae. aegypti. Das 1600 larvas utilizadas, 320 pools apresentaram
positividade para os três sorotipos testados (den-1, den-2 e den-3) em ELISA indireto, como
mostram os resultados apresentados na Figura 1. Para tal, foram considerados positivos os
resultados cuja média das absorbâncias foi igual ou superior a 50% da média das absorbâncias
observadas com o controle positivo.
0,5
0,4
Abs
0,3
0,2
0,1
0,0
Rockfeller
Den 1
Den 2
Den 3
Larvae
Larvae
Larvae
Fig. 1: ELISA realizadocom larvas de Aedes aegypti, revelado com anticorpos obtidos de soro
hiperimune de coelhos.
O perfil eletroforético em SDS_PAGE das proteínas dos sorotipos 1, 2 e 3 do vírus da
dengue revela a migração de 10 frações
com massas moleculares estimados em
aproximadamente 97, 80, 66, 45, 21 e 15 KDa correspondentes às proteínas do vírus da dengue.
A presença de frações protéicas correspondentes às proteínas virais foi observada nos
sobrenadantes dos macerados das amostras testadas e nos macerados não centrifugados.
Nenhuma fração protéica correspondente ao vírus foi observada no sobrenadante e nos
macerados das larvas da cepa Rockfeller, como mostram os resultados da Figura 2.
Proteínas presentes nas larvas foram especificamente reconhecidas por anticorpos
específicos para os vírus da dengue, através do teste de Western blotting como mostra a Figura 3.
1
10
2
3
4
5
6
7
8
9
10
97KD
a
80KD
aa
66KD
aa
45KD
aa
21KD
aa
15KD
aDa
Fig. 2: Perfil eletroforético (SDS-PAGE) das subunidades protéicas dos sorotipos 1, 2 e 3 do vírus dengue, pool de
macerado de larvas de Ae. aegypti infectadas e larvas da cepa Rockfeller. Pesos moleculares padrão (linha 1);
sorotipos dos vírus 1, 2 e 3 (linhas, 2, 3 e 4, respectivamente); extrato total de larvas da cepa Rockfeller (linha 5);
sobrenadante do macerado de larvas da cepa Rockfeller (linha 6); extrato total de larvas infectadas de Ae. aegypti
(linhas 7e 8) e sobrenadante de larvas infectadas de Ae. Aegypti (linhas 9 e 10).
Fig. 3: Western blotting de frações protéicas presentes no extrato total de larvas infectadas de Ae.
aegypti, reconhecidas por anticorpos anti-den1 específicos, produzidos em coelhos. O extrato das
larvas foi submetido à eletroforese (SDS-PAGE), e transferido para uma membrana de nitrocelulose,
sendo as proteínas reveladas com anti-IgG ligada à peroxidase. Sorotipos 1 e 2 do vírus dengue
(linhas 1 e 2, respectivamente); extrato total de larvas infectadas de Ae. aegypti (linhas 3, 4, 5 e 6), e
extrato das larvas da cepa Rockfeller (linha 7).
4. DISCUSSÃO
Embora vários autores já terem demonstrado a transmissão transovariana com mosquitos
artificialmente infectados com o vírus da dengue, o estudo de tipo de transmissão em mosquitos
naturalmente infectados merece especial atenção, uma vez que vários fatores podem interferir
neste fenômeno. JOSHI et al., (2002) observaram uma alta taxa de mortalidade e diminuição da
fertilidade em mosquitos infectados com o sorotipo-2 do vírus da dengue.
O presente trabalho mostra que a presença do vírus nas larvas Ae. aegypti é mantida por
várias gerações em condições naturais. Larvas provenientes de mosquitos originados de ovos
coletados no meio ambiente apresentaram elevada taxa de infecção em teste de ELISA indireto.
Quando se compara os resultados obtidos com as placas sensibilizadas com os sorotipos 1, 2 e 3
do vírus da dengue (5g de prot. Viral /poço) com os resultados obtidos com as larvas pode ser
observado que houve uma forte reação (FIGURA 1). Por outro lado, nenhuma reação pôde ser
observada com os extratos obtidos das larvas da cepa Rockfeller não infectadas. Embora os
resultados tenham sido positivos para os três sorotipos testados, não podemos afirmar qual o
sorotipo predominante, devido ao forte relacionamento sorológico existente entre eles. Vários
relatos têm sido realizados mostrando a possibilidade de transmissão transovariana do vírus da
dengue, embora este fenômeno não tenha recebido merecida atenção devido à baixa sensibilidade
dos testes. Assim sendo, procuramos adaptar métodos como a eletroforese e Western blotting,
que pudesse possibilitar a confirmação dos resultados. Conforme é mostrado na figura 2, o
sobrenadante e o extrato total do macerado de pool de larvas infectadas, mostra a migração de
frações protéicas com pesos moleculares correspondentes aos das proteínas do vírus da dengue.
Porém, as frações protéicas apresentadas no extrato do macerado do pool de larvas Rockfeller
não infectadas apresentaram pesos moleculares diferentes, não correspondentes às proteínas do
vírus. Este resultado sugere a possibilidade de comprovação da presença do vírus nas larvas
infectadas. Embora somente duas pequenas frações protéicas terem sido especificamente
reconhecidas por anticorpos específicos para o sorotipo dengue-1 em teste de Western blotting,
pode-se considerar que este método pode ser melhorado e tornar-se uma ferramenta eficiente para
esclarecer o fenômeno da transmissão transovariana.
O clima tropical favorece a proliferação do mosquito em nossa região, devido às altas
temperatura e umidade relativa do ar. Os resultados deste trabalho mostram elevadas taxas de
infecção, com larvas de mosquitos originados de ovos coletados no campo, nos meses de junho a
dezembro de 2003, um ano caracterizado por baixa pluviosidade em nosso Estado. Isto sugere
que quando os ovos permanecem no meio ambiente por um período prolongado, cria condições
que favorece a replicação do vírus no embrião quiescente e a possibilidade de transmissão para
seus descendentes. Assim sendo, quando iniciado o novo período de chuvas, os ovos presentes no
meio ambiente têm condições de eclodir, dando origem a mosquitos infectados com uma
concentração de vírus que possibilita a transmissão aos hospedeiros humanos, potencializando a
incidência da doença e conseqüentemente as epidemias, conforme boletins de vigilância
epidemiológica da dengue, durante o ano de 2003.
O ano de 2004 tem sido marcado por período chuvoso anormal em Fortaleza;
coincidentemente, foi o período com menos incidência de dengue em toda a região. Este fato
mostra que neste ano, devido à grande quantidade de chuvas, os ovos tiveram condições de
eclodir, mas não tiveram o tempo suficiente para a proliferação do vírus, contribuindo assim, para
a diminuição dos casos de dengue. Resultados semelhantes foram observados em Jodhpur no
Estado de Rajasthan na Índia por JOSHI et al. (1996) que relataram uma eleva taxa de
transmissão do sorotipo dengue-3 de mosquitos coletados no meio ambiente. MOURYA et al.
(2001) atribuíram este fato a permanência dos ovos no meio ambiente por um período
prolongado.
A compreensão do fenômeno da transmissão transovariana pode esclarecer como ocorre a
permanência do vírus na natureza, criando condições para o desenvolvimento de métodos
preventivos de acordo com as estações inerentes a cada área geográfica afetada por epidemias.
Mais trabalhos são necessários serem desenvolvidos levando em conta as características
climáticas de cada região.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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