Tecnicas para genotipagem ABO

Tecnicas para genotipagem ABO
y RFLP
y O polimorfismo de comprimento de fragmentos de
DNA (RFLP), obtido pelo tratamento do DNA com
enzima de restrição, consiste na digestão do produto
amplificado com uma ou mais endonucleases,
seguido de eletroforese para separação dos
fragmentos de acordo com o seu comprimento.
y O número de fragmentos obtidos corresponde ao
número de sítios de restrição reconhecidos pela(s)
enzima(s).
Bioline Consultoria
Tecnicas para genotipagem ABO
y PCR ALELO ESPECÍFICO
y Outra técnica amplamente utilizada é o PCR alelo
específico, onde cada amostra de DNA é submetida a
duas amplificações com o intuito de que o
polimorfismo do gene ABO seja detectado por meio
do uso de primers específicos para a seqüência
pesquisada, sendo considerada ³SRVLWLYD´ a reação
que apresentar o alelo pesquisado e ³QHJDWLYD´ a
reação que não apresentar o alelo em questão.
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Tecnicas para genotipagem ABO
y PCR ALELO ESPECÍFICO
y Esses primers são formulados de maneira que permitam a
amplificação de uma região pré-determinada do gene onde
se encontra a mutação do nucleotideo que se deseja
detectar, devendo possuir entre 19 e 21 pb, e permitir uma
hibridização diferencial baseada em uma única mudança de
base e fornecer uma especificidade elevada com o locus. Os
fragmentos obtidos após amplificação, deverão ser
separados e identificados por meio de eletroforese (50).
Esse tipo técnica pode ser utilizada em conjunto com o
RFLP, uma vez que é possível se criar sítios de clivagem
para determinadas enzimas, por meio do uso dos primers
durante as reações de amplificação
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Tecnicas para genotipagem ABO
y APLICAÇÕES CLÍNICAS
y Identificação de feto em risco de doença hemolitica
perinatal (DHPN)
y Determinação da presença
grupos sanguíneos em
transfundidos
y Determinação da presença
grupos sanguíneos em
falciforme
Bioline Consultoria
ou ausência de alelos de
pacientes recentemente
ou ausência de alelos de
pacientes com doença
Tecnicas para genotipagem ABO
y APLICAÇÕES CLÍNICAS
y Determinação de alelos de grupos sanguíneos em
pacientes
com
hemácias
recobertas
por
imunoglobulinas
y Resolução de discrepâncias de A,B e D
y Triagem de doadores de sangue antígeno-negativo
(Ag de alta freqüência)
y Situações em que genótipo e fenótipo são
discordantes
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DISCREPÂNCIAS NA FENOTIPAGEM ABO
Agradecimentos a Silvia Leão Bonifácio
Fenotipagem ABO
o que diz a portaria....
PORTARIA Nº 2.712, DE 12 DE NOVEMBRO DE 2013
Art. 175. Os testes pré-transfusionais incluirão:
I - para sangue total e concentrado de hemácias:
a) a tipagem ABO (direta e reversa) e RhD e pesquisa de anticorpos
antieritrocitários irregulares no sangue do receptor;
b) a retipagem ABO (direta) e RhD do componente sanguíneo;
Logo a tipagem ABO direta e
reversa são obrigatórias no
receptor
Fenotipagem ABO
o que diz a portaria....
PORTARIA Nº 2.712, DE 12 DE NOVEMBRO DE 2013
No Art. 176.
㼲 3º A tipagem ABO será realizada testando-se as hemácias com
reagentes anti-A, anti-B e anti-AB.
㼲 4º Na hipótese do 㼲 3º, caso sejam usados antissoros monoclonais, a
utilização do soro anti-AB não é obrigatória.
㼲 5º A tipagem reversa sempre será realizada, testando-se o soro
ou plasma com suspensão de hemácias conhecidas A1 e B e,
opcionalmente, A2 e O.
㼲 6º Nenhum resultado de tipagem ABO será concluído até a
resolução das discrepâncias entre a tipagem direta e reversa.
Por onde começar?
2TXHVmR³GLVFUHSkQFLDV´"
79
79
Resultados discrepantes
y Erros clericais (administrativos, de
escrita)
y Erros técnicos
y Erros da técnica
Causas gerais dos erros
81
Uso incorreto de reagentes:
BULAS!
Falha ao adicionar o reagente
Não identificação de tubos e
cartelas
Contaminação bacteriana de
reagentes
Validade dos reagentes
Problemas na armazenagem
Super / sub-centrifugação
Vidraria mal lavada
Equipamentos descalibrados
Discrepância de resultados
Como resolvê-las?
y Rever os detalhes operacionais:
y Rever detalhes da execução da técnica
y Rever registros
y Transcrição de resultados
y Verificar possível troca de amostras
y Qualidade da amostra:
{
Hemolisada, lipêmica, aglutinação espontânea.
{
Data da coleta!
O que são discrepâncias ABO?
83
y É quando ocorre incompatibilidade entre os
resultados observados na fenotipagem ABO
direta e reversa.
y Segundo a Portaria 2712:
y ³7RGDGLVFUHSkQFLD$%2GHYHVHU5(62/9,'$
DQWHVGDOLEHUDomRGRVUHVXOWDGRV´
Discrepâncias ABO
84
y Discrepâncias verdadeiras:
{
Ausência ou fraca reatividade dos anticorpos
{
Ausência ou fraca reatividade dos antígenos
{
Anormalidades protéicas ou plasmáticas
{
Presença de anticorpos irregulares
Discrepância ABO
Investigações preliminares
Repetir os testes : buscar os erros
Centrifugar a amostra
Lavar as hemácias
Rever as técnicas/ reagentes utilizados
Aumentar o tempo de incubação
Alterar a temperatura (4ºC ou 37oC)
Suspeita de troca de amostras
Coletar nova amostra
Reagentes novos (antisoros e reagentes de hemácias)
Discrepância ABO
Investigações preliminares
y Checar diagnóstico
y TAD/ PAI positivo?
y Transfusões anteriores
y Idade (R.N., idoso)
y Imunossupressão
y Doença de base
{
Roleaux (Não interfere em
gel)
Discrepância ABO
Técnicas complementares
9 Métodos mais sensíveis
9
Microplacas, tubo, gel-teste
9 Alteração temperatura do teste
9 Modificação da técnica
9
dobrar quantidade de soro/plasma
9
usar enzimas proteolíticas
9 Utilizar lectinas Anti-A1 e Anti-H
9 Adsorção e eluição
9 Estudo da saliva :
9
pesquisar estado secretor=Le(b+)
9 Análise do DNA
9
Dificílimaaaaaaa!!!!
Adsorção
Anti-A ou ²B
Mono+policlonal
ABO
?
+
88
Incubação
a TA ou
4oC
Eluição
Eluato ácido
Eluato a quente
Eluato Clorofórmio / Éter
A presença do Anti-a e/ou -B
no Eluato significa que
este anticorpo estava ligado
à membrana das hemácias
porque o Antígeno
estava presente
Id. Do ac do Eluato =
Anti-A e/ou-B
Ácido
89
Caso 1: FHB, 25/11/2014
Caso 1: Paciente, 35 anos, mieloma multiplo.
O que fazer?
Caso 1: Testes adicionais não resolveram,mas paciente ja foi
doador e a tipagem era ARh(D)-.
O que fazer agora?
Caso 2: Doador, 33 anos
Caso 2: Doador, 33 anos, PAI negativo em Liss
Coombs. O que fazer agora?
Caso 2: Doador, 33 anos, PAI positivo a frio
SUBGRUPO A?
ANTI-A1?
Outro ac?
Caso 3: ?????????
Caso 3: Doador de repetição, com 2 tipagens
anteriores discrepantes (A e O)
Que testes posso
realizar?
Caso 3: 2 tipagens anteriores discrepantes (A e O)
Como liberaram resultados discrepantes no mesmo serviço?
.... E o que fazer agora?
Caso 3: Doador de repetição, com 2 tipagens
anteriores discrepantes (A e O)
y Metodologia + sensível
y Incubação a 4oC
y Enzima proteolítica
y Adsorção-eluição
y TUDO NEGATIVO!
Caso 3: Doador de repetição, com 2 tipagens
anteriores discrepantes (A e O)
y Metodologia + sensível
y Incubação a 4oC
y Enzima proteolítica
y Adsorção-eluição
y TUDO NEGATIVO!
y Estado secretor: Le(b+)
{
E agora?