22/03/2010 Disciplina Biologia Celular Profª Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva Curso de Biotecnologia FISMA / FEA Aula 2: Tecnologia da Biologia Celular Parte I Bio Cel Profª Cristina 1 22/03/2010 Tamanho das céls e seus componentes Unidades de medidas utilizadas 2 22/03/2010 1- Confecção de cortes para microscopia • Ao natural • Preservadas – Fixação: • • • • • Evita Autólise e Proliferação bactérias Propicia endurecimento celular Aumenta afinidade a corantes e contrastes FORMOL e GLUTARALDEÍDO TETRÓXIDO DE ÓSMIO e GLUTARALDEÍDO 3 22/03/2010 – Microtomia • Inclusão • Corte espessura 1 a 6 μm • Corantes – Organelas transparentes – Corantes Básicos : • • • • grupamento cromóforo catiônico (+ carga positiva) Afinidade por ácidos (aniônicos – carga negativa) DNA e RNA são basófilas Ex: azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina 4 22/03/2010 – Corantes Ácidos : • • • • grupamento cromóforo aniônico (: – carga negativa) Afinidade por bases (catiônicos: + carga positiva) Proteínas são acidófilas Ex: Eosina, Fucsina ácida e Orange G 5 22/03/2010 2- Microscópio Óptico ou de Luz s 6 22/03/2010 • Sinônimos para o microscópio óptico: – Microscópio Comum – Microscópio de Luz – Microscópio Fotónico – Microscópio de Campo Claro 7 22/03/2010 • Porção mecânica • Porção óptica – Sistema óptico de observação – Sistema óptico de iluminação O Princípio de funcionamento: – Condensador: projeta cone luz material em observação – Cone de luz atravessa o objeto e atinge a objetiva – Objetiva: projeta imagem aumentada no plano focal da ocular – Ocular – novamente aumenta o objeto 8 22/03/2010 9 22/03/2010 Para uma leitura mais detalhada de como ocorre a formação da imagem no olho, consulte: • MARQUES, G. C., UETA, N. Ótica da visão. Disponível em: http://efisica.if.usp.br/otica/basico/visao/olho/ 10 22/03/2010 • Ampliação do microscópio = aumento da objetiva X aumento da ocular • Poder de resolução: – capacidade de separar detalhes • É medido pelo Limite de resolução – Menor distância que deve existir entre dois pontos, para que eles apareçam individualizados • O que determina a riqueza dos detalhes: Poder de resolução Compr. onda objetiva ou Ampliação ?????? 11 22/03/2010 Outros Microscópios Ópticos • • • • Microscópio de Polarização Microscópio de Contraste de Fase Microscópio Confocal Microscópio de Fluorescência 12 22/03/2010 Polarização • Foco de luz polarizado • Estruturas e substâncias celulares dividem o foco de luz em 2 (planos perpendiculares) = estruturas anisotrópica e são birrefrinfgentes - apresentam índice de refração diferentes conforme a incidência da luz • Estruturas isotrópicas – não modificam o plano de polarização da luz Em planos • Prismas: polarizador (condensador) perpendiculares permitem a • analisador (objetiva) visualização apenas das estruturas birrefringentes 13 22/03/2010 reflexão refração Contraste de Fase • Transforma as diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade luminosa. • Fase escura (positiva) e fase clara (negativa) • Estudo de células vivas 14 22/03/2010 Comparações • A) Microscópio óptico comum, B) Contraste de fase POSITIVO, C) Microscopia interferencial segundo Normasky, D) Contraste de fase NEGATIVO Contraste de fase + Luz polarizada Confocal • Células isoladas e cortes de tecidos – espessura superior ao plano de foco do microscópio óptico • Na prática- com o movimento do micromético um plano entra em foco enquanto os demais saem de foco = PERDA DE NITIDEZ • No confocal: varredura por feixe de laser, ponto a ponto = “CORTE ÓPTICO “ – Resultado: apenas aquela fatia fará parte da formação da imagem = maior nitidez 15 22/03/2010 Confocal 16 22/03/2010 Fluorescência 2-Microscópio Eletrônico • Transmissão • Varredura • • • • Melhor resolução Células não vivas Preparativos Eletrodensidade 17 22/03/2010 18 22/03/2010 19 22/03/2010 • Imagens, esquemas e fotos retirados da internet, através do site: http://images.google.com.br/imghp?hl=pt-BR&tab=wi Para estudar: • Junqueira, L.C., Carneiro, J. Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan. 8ª ed. 2005. – Capítulo 2, p.19-26 20