Análise de imagens para avaliação da morfologia interna de

Análise de imagens para avaliação da morfologia interna de sementes
de espécies ornamentais
RESUMO
Atualmente técnicas de análise de imagens tem se destacado na área de Tecnologia
de Sementes, especialmente o teste de raios X. O objetivo deste trabalho foi verificar
a possibilidade da utilização da técnica de raios X para a análise da morfologia
interna de sementes de espécies ornamentais. Para tanto, sementes de três lotes de
Petunia hybrida, quatro lotes de Rudbeckia hirta, três lotes de Tagetes sp., três lotes
de Stokesia laevis e quatro lotes de Oenothera sp foram submetidas ao teste de
raios X e as imagens geradas foram utilizadas para análise da morfologia das
sementes. A análise das imagens obtidas no teste de raios X permitiu a visualização
da morfologia interna das sementes de todas as espécies analisadas. Foi possível
identificar danos que não são passíveis de identificação a olho nu, portanto não
detectáveis na maioria dos testes utilizados em análise de sementes. Foram
identificadas sementes cheias e vazias, sementes com diferenças no tamanho do
embrião, sementes com tecidos escurecidos provocados possivelmente pelo
processo de deterioração e sementes com danos mecânicos. A análise de raios X
permite a análise da morfologia interna de sementes de Petunia hybrida, Rudbeckia
hirta, Tagetes sp., Stokesia laevis e Oenothera sp.
Palavras-chave: raios X, embrião, danos
ABSTRACT
Image analysis are improving Seed Technology techniques, specially the X-ray test.
The objective of this study was investigate the possibility of X-ray technique for
ornamental species seed morphology analyze . For this purpose, seeds of three lots
of Petunia hybrida, four lots of Rudbeckia hirta, three lots of Tagetes sp., three lots of
Stokesia laevis and four lots of Oenothera sp were tested with X-ray and the images
generated were used for seed morphology analysis. X-ray image analysis allowed
visualization of internal morphology of seeds of all species. It was possible identify
damages which can not be detected by human eye, thus are not detectable in the
majority of tests used for seed testing. Was possible identified full and empty seeds,
seeds with different embryo size, seeds with stained tissue possibly caused by seed
deterioration process and mechanical damage. X-ray analysis allows internal
morphology seeds analyze for Petunia hybrida, Rudbeckia hirta, Tagetes sp.
Stokesia laevis and Oenothera sp seeds.
Key words: X-ray, embryo, damage.
1 INTRODUÇÃO
Atualmente técnicas de análise de imagens tem se destacado na área de
Tecnologia de Sementes. Dentre estas, destaca-se o teste de raios X, o qual
consiste na análise radiográfica da estrutura interna das sementes, por meio de sua
exposição a uma fonte de baixa energia de raios X e um filme fotossensível. Ao
atravessarem as sementes e atingirem o filme, os raios permitem a formação de
uma imagem caracterizada por diferentes níveis de cinza.
O princípio do teste de raios X é definido pela absorção de radiação em
diferentes quantidades pelos tecidos das sementes, em função de sua estrutura,
composição e densidade, além do período de exposição à radiação (ISTA, 2011). É
um teste relativamente rápido e está padronizado nas Regras Internacionais para
Análise de Sementes (ISTA, 2011) e sugerido nas Regras Brasileiras de Análise de
Sementes (BRASIL, 2009). Embora os raios X sejam potencialmente nocivos às
sementes, a baixa dose absorvida durante essa análise não causa mutações
genéticas e não afeta a germinação das sementes (SIMAK e GUSTAFSSON, 1953).
Após a obtenção das imagens de raios X, estas podem ser processadas por
sistemas automatizados para se estudar uma série de aspectos como tamanho e
formato do embrião, endosperma, densidade dos tecidos, entre outros. Esse tipo de
análise é muito interessante, pois técnicas de processamento de imagens digitais
propiciam uma sensibilidade maior de análise permitindo a aquisição de
características que seriam humanamente impossíveis de serem observadas
(CARVALHO, 2010).
O teste de raios X ainda traz a vantagem de não ser um método destrutivo,
possibilitando a realização de testes fisiológicos com as sementes e, desse modo,
pode permitir o estabelecimento de relações de causa e efeito (CICERO e
BANZATTO JUNIOR, 2003).
Este teste tem sido utilizado com sucesso para muitas espécies,
possibilitando a identificação de danos causados por insetos em sementes de
Eugenia pleurantha (MASSETTO et al., 2007) e defeitos internos em sementes de
ipê (OLIVEIRA et al., 2004).
Possibilitou a identificação de danos mecânicos em sementes de milho doce
(GOMES JUNIOR et al., 2012), soja (PINTO et al., 2009), milho (CICERO e
BANZATTO JUNIOR, 2003) e arroz (MENEZES et al., 2012).
Além disto, o teste de raios X permitiu a caracterização morfológica de
embriões de Tecoma stans (SOCOLOSWSKY e CICERO, 2008), avaliação da
morfologia interna de sementes de ipê roxo (AMARAL et al., 2011), Platypodium
elegans (SOUZA et al., 2008) e aquênios de arnica (MELO et al., 2009), avaliação
da estrutura e o estádio de desenvolvimento de embriões de sementes de acerola
(NASSIF e CICERO, 2006) e determinação da pureza de sementes de aveia
(CRAVIOTTO et al, 2002).
Para espécies de plantas ornamentais, ainda são poucos os trabalhos de
pesquisa que indicam procedimentos adequados para a análise de sementes.
Considerando-se que estas espécies são comercializadas com alto valor agregado é
fundamental o desenvolvimento de metodologias que permitam a avaliação rápida e
precisa de características das sementes que estão associadas com a qualidade,
como a morfologia.
O objetivo deste trabalho foi verificar a possibilidade da utilização da técnica
de raios X de sementes para a análise da morfologia interna de sementes de
espécies ornamentais.
2 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi conduzida no Laboratório do Centro de Germoplasma de
Plantas Ornamentais (OPGC) da Ohio State University, em Columbus, Ohio,
Estados Unidos da América. Foram utilizadas sementes de três lotes de Petunia
hybrida, quatro lotes de Rudbeckia hirta, três lotes de Tagetes sp., três lotes de
Stokesia laevis e quatro lotes de Oenothera sp do banco de germoplasma do
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América (USDA).
Foram utilizadas 4 repetições de 25 sementes para cada lote, as quais foram
distribuídas sobre fita adesiva dupla face em lâmina plástica transparente, sendo a
mesma colocada no interior de um equipamento digital de raios X, Faxitron modelo
MX-20 DC-12 acoplado a um computador e submetidas à radiação por 20 segundos
à 20 KV.
Em seguida, as imagens geradas foram salvas no disco rígido do computador
para posterior análise
A análise de imagens foi realizada de forma visual, avaliando-se cada
semente individualmente.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise das imagens obtidas no teste de raios X permitiu a visualização da
morfologia interna das sementes de todas as espécies analisadas, como pode ser
observado nas Figuras 1 a 5.
Na Figura 1 são ilustrados exemplos de sementes de Petunia hybrida.
Observa-se diferenças na área interna das sementes ocupada pelos tecidos, sendo
as áreas escuras aquelas com ausência de tecidos, o que também ocorreu para
sementes de Tagetes sp (Figura 2); sementes com maiores áreas livres podem ter
redução da germinação, pois possuem menor quantidade de reservas armazenadas,
que são a fonte inicial de energia para o processo de germinação. Pesquisas com
sementes de pimentão verificaram que o aumento das áreas sem tecido embrionário
afetou negativamente a germinação (DELL’ÁQUILA, 2007; GAGLIARDI e MARCOS
FILHO, 2011).
Para sementes de Rudbeckia hirta, além das diferenças de área interna livre,
foi possível identificar manchas escurecidas que possivelmente representam tecidos
deteriorados (Figura 3), como por exemplo nas sementes 3B a 3E; possivelmente
essas sementes possuem baixo potencial fisiológico, pois com o avanço do
processo de deterioração reduz-se o vigor das sementes, tanto pelo consumo das
reservas necessárias ao processo de germinação, como pela redução da
longevidade, da capacidade de reorganização das membranas celulares e dos
processos reparatórios essenciais na reativação do metabolismo rumo à
germinação. Marchi (2010) trabalhando com sementes de amendoim verificou que
sempre que as sementes apresentavam manchas escurecidas associadas com
tecidos deteriorados houve prejuízo à germinação.
Outro aspecto que a análise de raios X permitiu detectar foi a presença de
danos mecânicos, como por exemplo na semente 3E, a qual apresenta uma fissura.
O uso da técnica de raios X para detecção de danos mecânicos em sementes
permite rapidez na obtenção das informações e além disso não destrói a semente,
permitindo que a mesma seja utilizada posteriormente (BINO et al., 1993). Para
sementes de mamona, Kobori et al. (2012) verificaram que sementes com defeitos
no embrião e parcialmente cheias frequentemente resultaram em sementes mortas
no teste de germinação. Para sementes de arroz, Menezes et al. (2012) verificaram
que mesmo fissuras não severas afetaram a germinação das sementes, resultando
em plântulas anormais ou normais fracas; os mesmos autores ressaltam que
provavelmente houve redução ou interrupção da translocação de nutrientes para o
embrião.
Para Stokesia laevis foi possível verificar diferenças no tamanho do embrião
de sementes do mesmo lote, presença de sementes vazias e com manchas
escurecidas. Na Figura 4A é apresentado um exemplo de semente bem formada e
sem danos, que possivelmente terá maior potencial fisiológico comparada a outras
sementes com danos, como por exemplo as sementes 4B e 4D, as quais possuem
manchas indicativas de deterioração dos tecidos; foi possível identificar também
sementes vazias na amostra, como aquela ilustrada no exemplo da Figura 4E. O uso
da análise de raios X pode permitir a rápida identificação de sementes com defeitos
e propiciar a posterior separação e eliminação destas sementes, o que pode
contribuir para a agilidade e eficiência do processo de beneficiamento de sementes,
possibilitando refinamento da qualidade dos lotes.
Para sementes de Oenothera sp também foi possível observar diferenças de
tamanho do embrião, presença de danos mecânicos e tecidos deteriorados. Nas
sementes 5C, 5E, 5F e 5H foram identificadas fissuras, que podem ser
caracterizadas como dano mecânico, as quais podem prejudicar a germinação,
como ocorreu em outras pesquisas com sementes milho doce (GOMES JUNIOR et
al., 2012), soja (PINTO et al., 2009), milho (CICERO e BANZATTO JUNIOR, 2003) e
arroz (MENEZES et al., 2012).
Em relação ao tamanho do embrião de sementes de Oenothera sp observouse diferenças entre sementes de um mesmo lote; um exemplo são as sementes 5A
e
5D. Embriões
menores
possivelmente
possuem
menor capacidade
de
desenvolvimento, pois apresentam menor quantidade de reservas para os processos
iniciais de germinação.
Outra característica observada em sementes de Oenothera sp foi presença
de manchas escurecidas, como exemplo na Figura 5B, possivelmente em
decorrência de deterioração.
Considerando-se os resultados obtidos nesta pesquisa para todas as
espécies avaliadas, é possível inferir que a análise das imagens de raios X permitiu
a análise da morfologia interna das sementes, a identificação de danos, os quais não
são passíveis de identificação à olho nu, portanto não detectáveis na maioria dos
testes utilizados em análise de sementes, constituindo-se em técnica importante.
A rápida avaliação da morfologia da semente por meio da técnica de raios X
pode contribuir para estudos de caracterização de espécies ainda não estudadas,
pode auxiliar no beneficiamento de Sementes, permitindo que se faça descarte de
sementes indesejáveis, com danos, antes do processamento; além disso, este tipo
de análise possibilita avaliar o efeito de tratamentos como o condicionamento
fisiológico, que alteram a morfologia das sementes, avaliação da embebição em
sementes, relacionando a absorção de água com o aumento do volume das
sementes, estudo da densidade dos tecidos das sementes e sua influência no
potencial fisiológico, entre outros. Empresas produtoras de sementes na Europa já
utilizam o teste de raios X, que futuramente poderá tornar-se realidade no Brasil,
considerando que o setor de sementes cresce a cada ano e o nível de exigência dos
produtores e consumidores também.
4 CONCLUSÃO
A análise de raios X permite a análise da morfologia interna de sementes de
Petunia hybrida, Rudbeckia hirta, Tagetes sp., Stokesia laevis, Coreopsis tinct e
Oenothera sp.
5 REFERÊNCIAS
AMARAL, J.B.; MARTINS, L. FORTI, V.A.; et al. Teste de raios X para avaliação do
potencial fisiológico de sementes de ipê roxo. Revista Brasileira de Sementes, v.
33, n. 4, p. 601 - 607, 2011.
BINO, R.J.; AARTSE, J.W.; VAN DER BURG, W.J.. Non destructive X-ray of
Arabidopsis embryo mutants. Seed Science Research, v.3, p. 167- 170, 1993.
Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2009. Regras
Brasileiras para análise de sementes. Brasília, SDA/Mapa/ACS. 399 p.
CARVALHO, M.L.M. Utilização da análise de imagem - conceitos, metodologias e
usos. Informativo Abrates, v. 20, n..3, p.45-47, 2010.
CICERO, S.M.; BANZATTO JUNIOR, H.L. Avaliação do relacionamento entre danos
mecânicos e vigor, em sementes de milho, por meio da análise de imagens. Revista
Brasileira de Sementes, Pelotas, v. 25, n.1, p. 29-36, 2009.
CRAVIOTTO, R.M.; YOLDJIAN, A.M.; SALINAS, A.R.; et al. Description of pure seed
fraction of oat through usual evaluations and radiographic images. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v.37, n.8, p.1183-1188, 2002.
DELL’AQUILA, A. Pepper seed germination assessed by combined X-radiography
and computer-aided imaging analysis. Biologia Plantarum, v. 51, p. 777-781, 2007.
GAGLIARDI, B.; MARCOS FILHO, J. Relationship between germination and bell
pepper seed structure assessed by the X-ray test. Scientia Agricola, v.68, n.4,
p.411-416, 2011.
GOMES JUNIOR, F.G.; CICERO, S.M. X-Ray analysis to assess mechanical
damage in sweet corn seeds. Revista Brasileira de Sementes, v. 34, n. 1, p. 078 085, 2012.
ISTA. International Rules For Seed Testing Association, Zurich. 2011.
KOBORI, N.N.; CICERO, S.M.; MEDINA, P.F. Teste de raios X na avaliação da
qualidade de sementes de mamona. Revista Brasileira de Sementes, v. 34, n.1, p.
125 - 133, 2012.
MARCHI, J.L. Avaliação da qualidade de sementes de amendoim tratadas com
fungicida e inseticida, incluindo a análise de imagens. 2010. 89p. Tese de
Doutorado- Escola Superior de Agricultura ‘’Luiz de Queiroz’’’, Universidade de São
Paulo, Piracicaba, 2010.
MASSETO, T.E.; DAVIDE, A.C.; SILVA, E.A.A.; et al. Avaliação da qualidade de
sementes de Eugenia pleurantha (myrtaceae) pelo teste de raios X. Revista
Brasileira de Sementes, v. 29, n. 3, p.151-155, 2007.
MELO, P.R.B.; OLIVEIRA, J.A.; CARVALHO, M.L.M.; et al. Aplicação do teste de
raios X no estudo da morfologia interna e da qualidade fisiológica de aquênios de
Arnica (Lychnophora pinaster Mart.). Revista Brasileira de Sementes, v. 31, n. 2,
p.146-154, 2009.
MENEZES, N.L.; GARCIA, D.C.; BAHRY, C.A.; et al. Teste de condutividade elétrica
em sementes de aveia preta. Revista Brasileira de Sementes, v.29, n.2, p. 138142, 2007.
NASSIF, D.S.P.; CICERO, S.M. Avaliação de sementes de acerola por meio de raios
X. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 28, n. 3, p. 542-545, 2006.
OLIVEIRA, L.M.; CARVALHO, M.L.M.; GUIMARÃES, R.M.; et al. Avaliação da
qualidade de sementes de Tabebuia serratifolia Vahl Nich. e T. impetiginosa (Martius
ex A. P. de Candolle) Standley pelo teste de raios X. Revista Brasileira de
Sementes, v.26, n.2 p.138 – 143, 2004.
PINTO, T.L.F.; MARCOS FILHO, J.; FORTI, V.A.; et al. Avaliação da viabilidade de
sementes de pinhão manso pelos testes de tetrazólio e de raios X. Revista
Brasileira de Sementes, v. 31, n. 2, p.195-2001, 2009.
SIMAK, M.; GUSTAFSSON, A. X-ray photography and sensitivity in forest three
species. Hereditas, v.39, p. 458-468, 1953.
SOCOLOWSKI, F.; CICERO, S.M. Caracterização morfológica de embriões por
imagens de raios x e relação com a massa e a qualidade fisiológica de sementes de
Tecoma stans L. juss. ex kunth (Bignoniaceae). Revista Brasileira de Sementes, v.
30, n.2, p.200-208, 2008.
SOUZA, L.A.; REIS, D.N.; SANTOS, J.P.; et al. Uso de raios-x na avaliação da
qualidade de sementes de Platypodium elegans Vog. Revista Ciência Agronômica,
v. 39, n. 2, p. 343-347, 2008.
Figura 1. Sementes de Petunia hybrida, lote 1, com diferenças de espaço livre na
área interna indicadas pelas setas em vermelho.
Figura 2. Sementes de Rudbeckya hirta, lote 2; espaço livre na área interna da
semente indicado pela seta em vermelho (A), manchas escuras indicativas de
deterioração dos tecidos (B, C, D e E).
Figura 3. Sementes de Tagetes sp, lote 1, com diferenças de espaço livre na área
interna.
Figura 4. Sementes de Stokesia laevis; semente bem formada e sem danos (A),
sementes com manchas escurecidas indicando tecidos deteriorados indicados pela
seta em vermelho (B e D) e semente vazia (E).
Figura 5. Sementes de Oenothera sp, com embrião de tamanho reduzido (A),
tecidos escurecidos pela deterioração (B e G), fissuras e danos mecânicos (C, E, F e
H) e semente bem formada sem danos (D).