Estudo epidemiológico e molecular da infecção pelo - IPTSP

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
MÁRCIA ALVES DIAS DE MATOS
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO
VÍRUS DA HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE
COMUNIDADE ISOLADA NO ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS)
Orientadora:
Profª Drª Regina Maria Bringel Martins
Tese de Doutorado
Goiânia-GO
2007
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MÁRCIA ALVES DIAS DE MATOS
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO
VÍRUS DA HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE
COMUNIDADE ISOLADA NO ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS)
Orientadora:
Profª Drª Regina Maria Bringel Martins
Tese submetida ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical/ Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás, como requisito
parcial para obtenção do Grau de Doutor em
Medicina Tropical na área de concentração de
Microbiologia.
Este trabalho foi realizado com auxilio financeiro do CNPq, processo nº
4773319/2003-3
Goiânia-GO
2007
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações
Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG
a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG,
sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme
permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de
divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
11. Identificação do material bibliográfico:
[] Dissertação
[X] Tese
12. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a):
Márcia Alves Dias de Matos
CPF:
87952793187
E-mail:
[email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página?
[x] Sim
[ ] Não
Vínculo Empregatício do autor
Agência de fomento:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Sigla:
CNPq
Tecnológico
País:
Brasil
UF:
GO
CNPJ:
Título:
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM
AFRO-DESCENDENTES DE COMUNIDADE ISOLADA NO ESTADO DE GOIÁS
(KALUNGAS)
Palavras-chave:
Hepatite B; Prevalência; Aspectos Moleculares;Afro-descendentes
Título em outra língua:
EPIDEMIOLOGICAL AND MOLECULAR STUDY OF HEPATITIS B VIRUS
INFECTION IN AFRO-DESCENDANTS FROM ISOLATED COMMUNITY IN
GOIÁS STATE (KALUNGAS)
Palavras-chave em outra língua:
Hepatitis B; Prevalence; Afro-Descendants; Molecular aspects
Área de concentração:
Microbiologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
18/12/2007
Programa de Pós-Graduação:
Medicina Tropical
Orientador(a):
Regina Maria Bringel Martins
CPF:
215655031-04
E-mail:
[email protected]
3. Informações de acesso ao documento:
Liberação para disponibilização?1
[ ] total
[ x ] parcial
Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões:
[x] Capítulos. Especifique:Introdução e Materiais e Métodos
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________________________________________
Assinatura do (a) autor (a)
1
Data: ____ / ____ / _____
Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Matos, Márcia Alves Dias de.
M433e
Estudo epidemiológico e molecular da infecção
pelo vírus da hepatite B em Afro-descendentes de
comunidade isolada no Estado de Goiás (Kalungas)
/ Márcia Alves Dias de Matos. - Goiânia, 2007.
xv, 132 f. : il.
Orientadora: Profª Drª Regina Maria Bringel
Martins.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de
Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública, 2007.
Bibliografia :f. 74-106
Inclui índices de tabelas, de quadro e de figuras.
Anexos.
1. Hepatite B – Afro-descendentes (Kalungas)
– Goiás 2. Hepatite B – Aspectos moleculares
3. Epidemiologia molecular I. Martins, Regina Maria
Bringel II. Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública III. Título.
CDU:616.36-002(817.3)
Dedico este trabalho a toda população Kalunga,
pessoas as quais devo o meu respeito e aprendizado;
Aos meus avós por me ensinarem as melhores
lições da vida;
Aos meus queridos pais, Bernardina e Delfino, pela
grandeza na dedicação e renúncias na luta pela educação
dos filhos;
Aos meus irmãos, Maysa, Delciron e Lázaro pela
presença constante em minha vida;
Ao meu esposo Marcos pelo incentivo, carinho,
dedicação e companhia nas longas horas de estudo;
A professora Regina, pelo carinho, orientação e
oportunidade de crescimento.
Agradecimentos
Por muitas vezes cometi a falha de não agradecer pelas bênçãos que me
foram concedidas. Também várias foram as vezes que me espantei quando percebi
as dádivas recebidas, sem que eu ao menos houvesse solicitado. Então compreendi
que havia “Alguém” cuidando e traçando o meu destino. Assim, agradeço
primeiramente a Deus por projetar mais essa vitória em minha vida e por mostrar o
seu amor, muitas vezes de forma misteriosa, mas não menos extraordinária.
Obrigada Senhor por colocar pessoas especiais em meu caminho, que foram
importantes na concretização deste sonho:
•
À Professora Drª Regina Maria Bringel Martins. Acredito que as palavras
jamais conseguirão expressar a minha gratidão! Mesmo assim, agradeço
pelos sete anos de orientação, carinho, dedicação e oportunidade de
crescimento. Sua competência e disciplina foram fundamentais na realização
deste trabalho.
•
À Professora Drª Sheila Araújo Teles, pela ajuda na coleta das amostras e
análise dos dados, pelas palavras que tanto me incentivaram na vida pessoal
e profissional. És um exemplo de competência e profissionalismo.
•
À Professora Drª Megmar Aparecida dos Santos Carneiro, minha “irmã mais
velha” por sempre me ajudar a solucionar problemas, pelo exemplo de
professora, mãe e esposa dedicada. A sua amizade e companheirismo
jamais serão esquecidos.
•
À Professora Drª Ana Rita Coimbra Motta de Castro, pela ajuda desde o
início deste estudo, bem como na coleta das amostras, além de sempre
dispensar atenção e apoio. Sua ajuda foi essencial para a realização deste
trabalho
•
À Professora, amiga e doutoranda Carmem Luci Rodrigues Lopes, a grande
responsável por me direcionar à iniciação científica, fato que norteou a minha
caminhada rumo ao objetivo de concluir a pós-graduação. Sua serenidade e
solidariedade são grandes virtudes que não esquecerei.
•
Às amigas do Laboratório de Virologia: Renata C. Ferreira, Nádia Rúbia S.
Reis, Aline G. Koslowsky, Nara Rúbia Freitas, Laura B. Nascimento, Viviane
R. Tavares. Obrigada por vivermos como uma família, pela atenção em
momentos de doença, por compartilhar as risadas em momentos de
descontração, por tantos “almoços felizes” e até pelas “broncas” quando
foram necessárias. Obrigada também pela ajuda na coleta das amostras.
Jamais conseguirei retribuir a tudo que fizeram por mim.
•
À amiga Adriane da Silveira Gomes, por todo o tempo que esteve ao meu
lado no Laboratório de Virologia. Além de me presentear com o bom humor
de sempre, foi seguindo o seu exemplo que aprendi mais sobre
perseverança e lutar pelos meus sonhos.
•
Ao biomédico e amigo, Ágabo Macedo Costa e Silva, pela sua importante
ajuda nos testes moleculares, pelos conselhos e palavras de incentivo.
•
Às amigas e bolsistas de Iniciação Científica: Thaís A. Marinho e Thamíris A.
Marinho, pelo apoio e incentivo durante a realização deste trabalho.
•
À Drª. Selma Gomes Andrade e ao doutorando Francisco F.C. A. Mello da
Fundação Oswaldo Cruz, pela receptividade e apoio na realização do
seqüenciamento.
•
Aos integrantes do NUCLAIDS (FEN/UFG): Michelle Dias da Silva Oliveira e
Marcos André de Matos, pela valiosa ajuda na coleta das amostras.
•
Aos amigos da Casa do Estudante Universitário da UFG, local que me
acolheu em toda a minha formação acadêmica e grande parte da pósgraduação, possibilitando a realização dos meus objetivos.
•
A todos os funcionários da Secretaria Municipal de Cavalcante, pela
receptividade e apoio imprescindível durante a coleta das amostras.
•
A todos os professores e funcionários do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública, que me ensinaram e acolheram com tanto carinho, em
especial àqueles que participaram da banca de qualificação: André Kipnis,
Divina Cardoso, Fabíola Fiaccadori, Joaquim Caetano e Maria do Rosário.
•
Aos funcionários e professores da Faculdade de Enfermagem, em especial
aos professores Marcelo Medeiros, que primeiramente me ensinou o valor da
pesquisa científica e Maria Alves Barbosa que me acolheu no PET
(FEN/UFG) estimulando o ingresso à Iniciação Científica.
•
Às enfermeiras do Hospital de Doenças Tropicais: Ana Maria e Agda pela
compreensão e por organizar uma escala de trabalho em dias que não
atrapalhasse a conclusão do doutorado.
•
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo apoio financeiro.
NÃO SEI (Cora Coralina)
Não sei...
Se a vida é curta ou longa demais pra nós,
mas sei que nada do que vivemos tem sentido,
se não tocamos o coração das pessoas.
Muitas vezes basta ser:
Colo que acolhe, Braço que envolve, Palavra
que conforta, Silêncio que respeita, Alegria
que contagia, Lágrima que corre, Olhar que
acaricia, Desejo que sacia, Amor que promove.
E isso não é coisa de outro mundo, é o que dá
sentido à vida.
É o que faz com que ela não seja nem curta,
nem longa demais, mas que seja intensa,
verdadeira e pura... Enquanto durar.
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS..................................................................................................x
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................xii
ÍNDICE DE QUADROS..............................................................................................xiii
RESUMO...................................................................................................................xiv
SUMMARY.................................................................................................................xv
1. INTRODUÇÃO………………………………………………….………..…….....……..01
1.1 Histórico……………………..........………………….….............................01
1.2 Classificação e estrutura do vírus da hepatite B..............……..………...03
1.2.1 Classificação..........................................................................03
1.2.2 Características biológicas.......................................................03
1.2.3 Organização genômica do HBV.............................................05
Fase de leitura aberta Pré-S/S..............................................06
Fase de leitura aberta Pré-C/C..............................................06
Fase de leitura aberta P........................................................07
Fase de leitura aberta X........................................................08
1.3 Variabilidade Antigênica e Genética do HBV..........................................08
1.3.1 Subtipos.................................................................................08
1.3.2 Genótipos..............................................................................10
Subgenótipos........................................................................13
1.3.3
Mutações
HBV..............................................14
no
genoma
do
Mutações na região S............................................................14
Mutações
Core....................................15
na
região
Pré-Core
e
Mutações na região X............................................................17
Mutações na região P............................................................17
1.4 Replicação do vírus da hepatite B............................................................17
1.5 Aspectos clínicos e tratamento da hepatite B.......................................... 19
1.6 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HBV........................................ 23
1.7 Epidemiologia da infecção pelo HBV....................................................... 26
1.7.1 Transmissão do HBV.................................................... 26
1.7.2 Prevalência da infecção pelo HBV................................ 28
1.7.3 Distribuição dos subtipos e genótipos............................33
1.8
Prevenção
e
controle
B...........................................................35
da
hepatite
1.9 Os afro-descendentes no Brasil e a comunidade Kalunga.......................38
1.10 Justificativa..............................................................................................43
2. OBJETIVOS...........................................................................................................44
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................45
3.1 População estudada..................................................................................45
3.2 Entrevista e coleta de sangue...................................................................45
3.3 Testes Sorológicos....................................................................................46
3.3.1
Detecção
HBsAg................................................46
3.3.2
Detecção
Total....................................47
do
do
anti-HBc
3.3.3 Detecção de anti-HBs............................................47
3.3.4 Detecção do HBeAg e anti-HBe.............................48
3.4 Detecção e genotipagem do HBV.............................................................49
3.4.1
Extração
DNA......................................................49
do
HBV
3.4.2 Reação em cadeia da polimerase.....................................49
3.4.3 Eletroforese em gel de agarose........................................50
3.4.4 Genotipagem por RFLP....................................................51
3.5 Sequenciamento da região Pré-S/S..........................................................51
3.5.1 Amplificação das amostras para a região Pré-S/S...........51
3.5.2 Purificação do DNA...........................................................52
3.5.3 Sequenciamento e análise da região Pré-S/S..................53
3.6 Processamento e análise dos dados.........................................................54
4. RESULTADOS.......................................................................................................55
4.1 Características da população estudada...............................55
4.2
Marcadores
moleculares................................57
sorológicos
e
4.3 Fatores de risco associados à infecção pelo HBV...............59
4.4 Prevalência de infecção oculta pelo HBV............................62
4.5
Análise
filogenética
S/S.................................62
da
região
Pré-
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................64
6. CONCLUSÕES......................................................................................................73
7. REFÊRENCIAS......................................................................................................74
ANEXOS..................................................................................................................107
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Representação esquemática da estrutura do vírus da hepatite B...........04
FIGURA
2.
Micrografia
eletrônica
do
virion
e
partículas
subvirais
não
infecciosas..................................................................................................................04
FIGURA 3. Genoma do HBV com as quatro regiões de leitura aberta (ORF): pré-S/S,
pré-C/C, P e X............................................................................................................05
FIGURA 4. Organização da HBV polimerase ..........................................................08
FIGURA 5. Determinante “a” e subdeterminantes d ou y e w ou r, com os subtipos
sorológicos do HBV....................................................................................................10
FIGURA 6. Árvore filogenética com os oito genótipos do HBV (A-H)........................11
FIGURA 7. Representação esquemática do ciclo replicativo HBV............................19
FIGURA 8. Perfil sorológico da hepatite B aguda .....................................................25
FIGURA 9. Perfil sorológico da hepatite B crônica....................................................25
FIGURA 10. Distribuição geográfica mundial da hepatite B crônica..........................32
FIGURA 11. Rota dos escravos ao Brasil – Origem comunidade Kalunga...............39
FIGURA 12. Povo Kalunga.......................................................................................41
FIGURA 13. Casa Kalunga feita de adobe e palha...................................................41
FIGURA 14. Cozinha Kalunga, com fogão a lenha....................................................41
FIGURA 15. Escola Kalunga feita com adobe e palha .............................................42
FIGURA 16. Mulheres Kalunga trabalhando em artesanato......................................42
FIGURA 17. Kalungas no preparo da farinha de mandioca.......................................42
FIGURA 18. Figura 18 - Sanfoneiro em festa Kalunga..............................................42
FIGURA 19. Crianças da comunidade Kalunga ........................................................42
FIGURA 20. Prevalência para os marcadores anti-HBs e anti-HBc de acordo com
faixa etária da comunidade Kalunga, Goiás...............................................................58
FIGURA 21. Árvore filogenética da região pré-S/S do HBV .....................................63
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA 1. Características dos 878 afro-descendentes estudados da comunidade
Kalunga do Estado de Goiás......................................................................................56
TABELA 2. Prevalência dos marcadores sorológicos para o vírus da hepatite B nos
878 indivíduos da comunidade kalunga.....................................................................57
TABELA 3. Características sorológicas e moleculares das 16 amostras HBsAg
positivas......................................................................................................................59
TABELA 4. Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo HBV
em indivíduos da comunidade
Kalunga......................................................................60
TABELA 5. Análise multivariada dos fatores de risco associados à infecção pelo
HBV em indivíduos da comunidade Kalunga.............................................................61
TABELA 6. Características de risco relatadas pelos cinco indivíduos que
apresentaram infecção oculta pelo HBV na comunidade Kalunga............................62
ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1. Resíduos de aminoácidos que especificam os determinantes do
HBsAg........................................................................................................................09
Quadro 2. Correlação dos genótipos e subtipos do HBV..........................................12
Quadro 3. Estudos sobre a prevalência da infecção pelo vírus da hepatite B
realizados em Goiás. .................................................................................................31
Quadro
4.
Primers
utilizados
na
amplificação
da
região
Pré-S/S
e
sequenciamento.........................................................................................................53
RESUMO
A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) apresenta distribuição mundial. Na África,
é altamente endêmica, sendo a maioria dos indivíduos infectada durante a infância.
Embora o Brasil seja considerado um país de endemicidade intermediária, taxas
variadas de prevalência têm sido encontradas nas cinco regiões geográficas e
mesmo dentro de uma mesma região. Este estudo teve como objetivo investigar o
perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo HBV na população Kalunga em
Goiás, Brasil Central, que é considerada a maior comunidade afro-descendente
isolada no Brasil. Um total de 878 indivíduos foi entrevistado sobre características
sócio-demográficas, fatores de risco e vacinação contra hepatite B. Amostras
sanguíneas foram coletadas de todos os participantes e os soros triados para
detecção dos marcadores HBsAg, anti-HBc total e anti-HBs por ensaio
imunoenzimático. As amostras HBsAg positivas foram submetidos à detecção dos
marcadores HBeAg e anti-HBe. O DNA viral foi detectado nas amostras HBsAg e
anti-HBc reagentes pela reação da polimerase em cadeia, sendo as amostras HBV
DNA positivas genotipadas pela análise do polimorfismo de comprimento dos
fragmentos de restrição (RFLP) e sequenciamento da região Pré-S/S. A prevalência
global da infecção pelo HBV foi de 35,4% (IC 95% 32,3-38,7), sendo de 1,8% (IC
95% 1,1-3,0) para o HBsAg. A análise multivariada mostrou que aumento da idade,
gênero masculino, analfabetismo e história de múltiplos parceiros sexuais foram
fatores associados a esta infecção. Em 301 (34,3%) indivíduos, verificou-se
positividade isolada ao marcador anti-HBs, sugerindo imunidade ao HBV. O HBV
DNA foi detectado em 75% (12/16) das amostras HBsAg reagentes, em 100% (2/2)
das HBeAg e 83,3% (10/12) das anti-HBe positivas. Um índice de 1,7% (5/295) para
infecção oculta pelo HBV foi encontrado nos indivíduos anti-HBc reagentes. Todas
as amostras genotipadas por RFLP foram do genótipo A. O sequenciamento da
região Pré-S/S confirmou a circulação do genótipo A (subgenótipo Aa) nesta
comunidade. Os achados epidemiológicos indicam que medidas preventivas, como
programas de educação em saúde e de vacinação contra hepatite B, são
necessárias para o controle da infecção pelo HBV nesta população. Além disso, os
resultados moleculares sugerem que o genótipo A, subgenótipo Aa foi introduzido no
Brasil durante o tráfico de escravos da África.
SUMMARY
Hepatitis B virus (HBV) infection occurs throughout the world. In Africa, this infection
is highly endemic, with the majority of individuals becoming infected during
childhood.
Although Brazil has been globally considered a country of HBV
intermediate endemicity, variable rates have been found in all five Brazilian regions
and even inside the same region. This study aimed to investigate the epidemiological
and molecular profile of the HBV infection among the Kalunga population in Goiás,
Central Brazil, which is considered the largest Afro-Brazilian isolated community. A
total of 878 individuals were interviewed about sociodemographic characteristics, risk
factors and HBV vaccination. Blood samples were collected from all participants and
serum samples were screened by enzyme-linked immunosorbent assay for the
presence of HBsAg, anti-HBc and anti-HBs serological markers. HBsAg-positive
samples were submitted to HBeAg and anti-HBe detection. HBsAg and anti-HBc
positive samples were tested for HBV DNA detection by polymerase chain reaction
and genotyping by subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP)
analysis and nucleotide sequencing of preS/S region. The overall prevalence of HBV
infection was 35.4% (95% CI: 32.3-38.7). HBsAg carrier rate was 1.8% (95% CI: 1.13.0). Multivariate analysis of risk factors showed that increased age, male gender,
illiteracy and history of multiple sexual partners were associated with this infection.
Isolated anti-HBs was found in 301 (34.3%) individuals who were immune for
hepatitis B. HBV DNA was detected in 75% (12/16) of the HBsAg positive samples,
in 100% (2/2) of the HBeAg and in 83.3% (10/12) of the anti-HBe positive samples.
An occult HBV infection rate of 1.7% (5/295) was found among anti-HBc positive
individuals. All genotyped isolates belonged to genotype A by RFLP analysis.
Nucleotide sequencing of preS/S region confirmed the circulation of genotype A
(subgenotype Aa) in this community. The epidemiological findings indicate that
preventive measures, such as additional health education and HBV vaccination
programs, are needed to control HBV infection in this population. In addition, the
molecular results suggest the introduction of genotype A, subgenotype Aa in Brazil
from Africa during the slave trade.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
O termo hepatites virais é convencionalmente utilizado para designar as
doenças ocasionadas por um grupo de vírus hepatotrópicos. A história das
hepatites virais remonta desde períodos anteriores a Era Cristã. Existem relatos
de surtos de icterícia na Babilônia, há mais de 2500 anos. Hipócrates descreveu
a icterícia epidêmica em 400 A.C. (Freitas 2003).
Inicialmente, muitos surtos de icterícia coincidiam com épocas de guerras.
Assim, o surgimento do termo “doença de soldado” foi amplamente associado
com epidemias em Flandres, em 1743 (durante a guerra de Sucessão Austríaca),
no Egito, em 1798 (durante a batalha de Napoleão), e em Paris, em 1870,
durante a guerra Franco-Prussiana (Kuntz & Kuntz 2002, Freitas 2003).
Entretanto, foi a partir de 1883 que se observou casos de icterícia de longo
período de incubação (geralmente de 2 a 6 meses). Esses episódios ocorreram
em Bremen, na Alemanha, envolvendo trabalhadores de um estaleiro naval que
receberam doses de uma vacina contra varíola. Tal vacina havia sido preparada
com linfa humana. De 1289 trabalhadores que receberam essa vacina, 191
desenvolveram a doença. A partir desses eventos, houve a primeira especulação
sobre um possível agente de transmissão parenteral ocasionando icterícia.
Provavelmente, esse seria, então, o primeiro relato de epidemia por hepatite B
(Lürman 1885).
Em 1909, ocorreram outros casos de icterícia, após administração de uma
medicação utilizada para tratamento de sífilis por via endovenosa (Bigger 1943).
Casos semelhantes ocorreram em 1922, com a administração da insulina no
tratamento de diabetes (Flaum et al. 1926). Porém, somente fatos ocorridos na
década de 40 elucidaram a hipótese da transmissão parenteral do agente
envolvido com a infecção, pois em 1942, 28.585 soldados americanos
apresentaram icterícia após receber vacina contra febre amarela, sendo que 62
faleceram em decorrência dessa doença (Krugman 1989). Além disso,
investigações mostraram o risco de hepatite associado ao uso de plasma
humano fresco, seco ou sangue total (Beeson 1943, Morgan & Williamson 1943).
MacCallum denominou, em 1947, os agentes causadores da icterícia
epidêmica, nomeando-os de “vírus da hepatite A” (HAV) e “ vírus da hepatite B”
(HBV). O primeiro era referente à icterícia infecciosa, com período de incubação
curto (18 a 37 dias), e o segundo à icterícia sérica, de período de incubação
longo (50 a 180 dias). Tais termos foram aprovados pelo Comitê de Hepatites
Virais da Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1977, e continuam sendo
utilizados até os dias de hoje (ICTV 2006).
Em 1965, o geneticista Baruch Blumberg e seus colaboradores, realizando
pesquisa sobre características polimórficas herdadas em diferentes partes do
mundo, observaram que em uma amostra de soro de um aborígene australiano
havia um antígeno que reagia com o soro de dois hemofílicos politransfundidos, e
o denominaram antígeno Austrália (Au) (Blumberg et al. 1965). Esse antígeno
também foi encontrado em pacientes com leucemia e síndrome de Down
(Blumberg et al. 1967, Sutnick et al. 1968).
Mais tarde, estudos de Prince (1968) e Levene & Blumberg (1969)
evidenciaram a associação do antígeno Austrália e a infecção pelo vírus da
hepatite B. Em 1970, um pesquisador australiano, identificou o vírus da hepatite
B (HBV), com cerca de 42 nm de diâmetro, que foi denominado de partícula de
Dane (termo que faz referência ao nome do próprio pesquisador). Ainda, verificou
que essa partícula era constituída por um invólucro externo, que correspondia ao
antígeno Austrália. Atualmente, esse antígeno é designado como antígeno de
superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) (Dane et al. 1970).
1.2 Classificação e Estrutura do Vírus da Hepatite B
1.2.1 Classificação
O HBV pertence à família Hepadnaviridae, a qual inclui uma variedade de
vírus aviários e de mamíferos que compartilham características similares, como
organização genética, órgão de tropismo e a estratégia de replicação. Os vírus
dessa
família
que
infectam
mamíferos
estão
agrupados
no
gênero
Orthohepadnavirus, e os que infectam aves no gênero Avihepadnavirus (ICTV
2006).
Como exemplos de vírus do gênero Avihepadnavirus, tem-se: DHBV (Duck
hepatitis B virus), HHBV (Heron hepatitis B virus), STHBV (Storks hepatitis B virus).
Esses vírus foram identificados como agentes de infecção em patos, garças e
cegonhas, respectivamente (Mason 1980, Zhou 1980, Sprengel et al. 1988, Pult et
al. 2001). No gênero Orthohepadnavirus, são encontrados o HBV (Hepatitis B virus),
WHV (Woodchuck hepatitis virus), GSHV (Ground squirrel hepatitis virus), WMHBV
(Woolly monkey hepatitis B virus) e ASHV (Artic ground squirrel hepatitis virus), que
infectam humanos, marmotas, esquilo de faias, macacos e esquilo do Ártico,
respectivamente (Summers et al. 1978, Marion et al. 1980, Seeger et al. 1984,
Lanford et al. 1998, Kidd-Ljunggren et al. 2002, Robertson & Margolis 2002).
1.2.2 Características Biológicas
A partícula completa do vírus da hepatite B (vírion ou partícula de Dane), com
40-42 nm de diâmetro, apresenta externamente o envelope viral, constituído
principalmente pelo antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), e
internamente, o nucleocapsídeo ou core, que mede cerca de 27 nm de diâmetro
(Figura 1). Essa estrutura possui simetria icosaédrica, sendo formada pelo antígeno
do core (HBcAg) e pelo genoma viral (DNA), que encontra-se associado à enzima
DNA polimerase/transcriptase reversa (Tiollais et al. 1985, Befeler & Bisceglie 2000).
Figura 1 – Representação esquemática da estrutura do vírus da hepatite B
Fonte:
http://www.rit.edu/~japfaa/infectious.html (modificada)
No soro de indivíduos infectados pelo HBV, podem, ainda, ser observadas
partículas subvirais, não-infecciosas, que são formadas, principalmente, pelo HBsAg
(Figura 2). Tais partículas podem apresentar-se nas formas tubular ou esférica, com
diâmetro de 22 nm (Hollinger 1996b, Jilbert & Mason 2002, Khouri & Santos 2004).
Figura 2 – Micrografia eletrônica do virion e partículas subvirais não infecciosas
Fonte: http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk/Images/Safrica/hbv3b.jpg
1.2.3 Organização Genômica do HBV
O genoma do HBV é extremamente compacto, sendo um dos menores dentre
os genomas de vírus que infectam o homem (Rapicetta et al. 2002). É constituído
por uma molécula de DNA circular de fita parcialmente dupla. A fita incompleta é de
polaridade positiva. Já a fita completa tem polaridade negativa, sendo complementar
ao RNA mensageiro viral e contém 3200 pares de base (bp) que estão organizados
em quatro regiões de leitura aberta (Open Reading Frame - ORF): Pré-S/S, Pré-C/C,
P e X (detalhadas a seguir) (Figura 3). O genoma possui quatro promotores (Pré-S1,
Pré-S2/S, core e X), que atuam regulando a atividade gênica. Além disso, próximo à
extremidade de ambas as fitas, estão presentes seqüências pequenas de 11
nucleotídeos que são diretamente repetidas (Direct Repeats - DR) designados de
DR1 e DR2. Tais seqüências são importantes na iniciação da replicação do HBV
(Tiollais et al. 1985, Seeger et al. 1986, Ganem & Varmus 1987, Kao & Chen 2002,
Locarnini 2004, Locarnini & Omata 2006).
Figura 3 – Genoma do HBV com as quatro regiões de leitura aberta (ORF): pré-S/S,
pré-C/C, P e X.
Fonte: http://www.drthuthuy.com/images/genotype02.jpg (modificado)
Fase de leitura aberta Pré-S/S
Na ORF pré-S/S, há três códons de iniciação. Dessa forma, a leitura a partir
do códon de iniciação Pré-S1 seguida de Pré-S2 e S resulta na formação da
proteína grande (L - “large”) que contém 368 aminoácidos (aa). A proteína de
tamanho intermediário (M - “middle” 281 aa) é codificada pela região Pré-S2 e S. A
menor proteína (S - “small” 226 aa) é sintetizada a partir do códon localizado no
início da região S. Assim, todas possuem o mesmo códon de terminação localizado
ao final da região S (Figura 3). As três proteínas se distribuem de forma irregular,
sendo que as partículas subvirais do HBV são quase que na sua totalidade
constituídas pela proteína S, com quantidades variáveis da proteína M. A proteína L
está presente em menor porção, ou mesmo ausente nessas partículas (Heermann et
al. 1984, Seeger & Mason 2000, François et al. 2001, Kao & Chen 2002).
Nos vírions, há predominância da proteína L, que contém os sítios de ligação
do HBV aos receptores celulares específicos (Neurath et al. 1986, Klingmuller &
Schaller 1993). A proteína M também tem importância na adsorção do HBV (Thung
& Gerber 1984). A proteína S é o constituinte do HBsAg, sendo capaz de induzir
anticorpos específicos (anti-HBs), com atividade neutralizante e protetora. Por essa
característica, o HBsAg é utilizado no desenvolvimento de vacinas. Além disso, a
caracterização antigênica do mesmo tem propiciado a classificação do HBV em
diferentes subtipos que serão comentados adiante (Grob 1998, Kidd-Ljunggren et al.
2002).
Fase de leitura aberta Pré-C/C
A região Pré-C/C codifica as proteínas HBeAg e HBcAg, que possuem
propriedades antigênicas distintas. A tradução a partir do códon de iniciação
localizado na região Pré-C dá origem a um produto que é translocado para o retículo
endoplasmático, onde é clivado, resultando na formação de uma proteína solúvel
(HBeAg ou antígeno e) (Garcia et al. 1988). O HBeAg não é incorporado aos vírions,
sendo então secretado pelos hepatócitos e liberado na circulação sanguínea. Esse
antígeno está associado com alta infecciosidade (Hatzakis et al. 2006).
O HBcAg é codificado a partir do códon de iniciação da região C. Esse
antígeno é importante na composição do nucleocapsídeo viral, no qual 180
monômeros dessa proteína se organizam, formando a partícula icosaédrica (Nassal
& Schaller 1996). O HBcAg está presente no tecido hepático de pacientes infectados
pelo HBV, não sendo detectado no soro. Entretanto esse antígeno é capaz de
induzir a produção de anticorpos (anti-HBc), independentemente de células T,
podendo ser detectáveis no soro, nas frações IgM ou IgG (Milich & Mclachalam
1986, Oubinã 1996).
Fase de leitura aberta P
A ORF P codifica uma enzima com atividade de DNA polimerase,
transcriptase reversa e ribonuclease (RNAse). Essa ORF sobrepõe as demais
regiões e engloba cerca de 3/4 do genoma do HBV. A polimerase viral pode ser
dividida em quatro regiões, representadas na Figura 4: (i) domínio amino-terminal,
que atua como proteína terminal ou primase, sendo importante para o início da
síntese da fita de DNA de polaridade negativa, (ii) região “espaçadora”, que parece
não ter função específica, (iii) domínio de transcriptase reversa, que contém sete
motivos denominados de A a G e (iv) domínio carboxi-terminal (ou C), que exibe
atividade de RNAse H (Ngui et al. 1999, Seeger & Mason 2000, Sablon & Shapiro
2005).
A polimerase viral possui o motivo YMDD (Tirosina-Metionina-AspartatoAspartato), que é parte do sítio ativo do domínio C, presente também na
transcriptase reversa. O uso prolongado de antivirais análogos de nucleosídeos,
principalmente a lamivudina, está freqüentemente associado ao desenvolvimento de
mutações na polimerase do HBV, causando resistência à esse antiviral (Lai et al.
2003a, Craxi et al. 2006).
Transcriptase reversa
NH2
Proteína terminal
1
Região
espaçadora
183
Ribonuclease H
YMDD
349
692
(rt1)
843aa
(rt344)
Domínio catalítico
I (G)
rt1
II (F)
A
B
C
D
COOH
E
rt344
Figura 4 - Organização da HBV polimerase
Fonte: Kay & Zoulim (2007) (modificado)
Fase de leitura aberta X
O gene X é encontrado apenas em vírus que infectam mamíferos e codifica
um polipeptídeo (HBx) de aproximadamente 154 aminoácidos. Embora sua função
ainda não esteja claramente definida, sabe-se que HBx é uma proteína reguladora
que pode ativar a transcrição de alguns genes virais e celulares (Feitelson & Duan
1997, Seeger & Mason 2000). Além disso, alguns estudos realizados com animais
transgênicos relataram a associação entre a expressão do gene X e o aparecimento
de câncer hepático (Rapicetta et al. 2002, Robertson & Margolis 2002, Cougot et al.
2005).
1.3 Variabilidade Antigênica e Genética do HBV
1.3.1 Subtipos
A heterogeneidade do antígeno de superfície do HBV foi verificada logo após
a sua identificação, no início da década de 70, quando Le Bouvier descreveu a
presença de dois determinantes antigênicos mutuamente exclusivos d e y.
Posteriormente, em 1972, Bancroft et al. descreveram dois determinantes adicionais,
denominados w e r.
Naquele mesmo ano, o estudo realizado por Le Bouvier, utilizando a técnica
de imunodifusão, mostrou que o envelope glicoproteico do HBV contém um epítopo
grupo-específico, presente em todos os subtipos, denominado de determinante
comum “a”. Até aquele momento, então, sabia-se que cada amostra do HBV poderia
ser classificada em quatro grupos de subtipos principais: adw, adr, ayw ou ayr (Le
Bouvier 1972).
Em 1983, Courocé-Pauty et al. realizaram um grande estudo envolvendo
5337 soros de portadores crônicos do HBV provenientes de vários países. Esse
estudo contribuiu para a identificação dos nove subtipos sorológicos do HBV,
conhecidos como adw2, adw4, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adrq+, adrq- e ayr (Figura
5).
Com a realização de estudos moleculares, ficou estabelecido que os
subdeterminantes são especificados por mutações pontuais no gene S, nos
nucleotídeos 365 e 479, resultando em substituições, respectivamente, nos
aminoácidos na posição 122 (lisina para arginina), que determinam os subtipos d ou
y, e na posição 160 (w ou r). As alterações no aminoácido 127 estão associadas a
subespecificidades do subdeterminante w (w1-w4) (Quadro 1) (Magnius & Norder
1995, Kidd-Ljunggren et al. 2002, Kramvis et al. 2005). Ainda, outras mudanças em
aminoácidos nas posições 144, 145, 158, 159, 177 e 178 estão relacionadas aos
demais determinantes (Okamoto et al. 1987b, Okamoto et al. 1989, Norder et al.
1992a).
Quadro 1 - Resíduos de aminoácidos que especificam os determinantes do HBsAg
Posição
Aminoácido
Especificidade
Posição 160
Lisina
d
Lisina
dw
Arginina
dr
122
Arginina
y
yw
yr
127
Prolina
w1-w2
Treonina
w3
Leucina
w4
Figura 5 - Determinante “a” e subdeterminantes d ou y e w ou r, com os
subtipos sorológicos do HBV
A identificação dos subtipos pode ser uma ferramenta útil na compreensão
epidemiológica da infecção pelo vírus da hepatite B numa determinada população,
podendo inclusive, em alguns casos, ajudar a estabelecer rotas e mecanismos de
transmissão (Kidd-Ljunggren et al. 2002).
1.3.2 Genótipos
Okamoto et al. (1998) sugeriram que a heterogeneidade do HBV poderia ter
uma organização em grupos genômicos, uma vez que a análise da seqüência
completa de nucleotídeos de 18 amostras do vírus permitiu verificar a existência de
quatro grupos que apresentavam uma divergência de mais de 8% entre eles, sendo
esses designados de genótipos A, B C e D. Um grau de divergência na seqüência
genômica completa ≥ 8% ou no gene S >4% é utilizado para a definição dos
genótipos do HBV (Okamoto et al. 1988, Norder et al. 1992a,b, 1994).
Posteriormente, Norder et al., comparando a região S, encontraram mais dois
genótipos (E e F) (Norder et al. 1992b, 1994). No ano de 1993, no Brasil, foi
identificada uma amostra pertencente ao genótipo F, subtipo adw4, que apresentava
uma divergência na seqüência genômica de 15%, sendo considerada a maior
divergência relatada entre isolados do HBV em humanos (Naumann et al. 1993).
Nesses últimos sete anos, mais dois genótipos foram descritos. Stuyver et al.
(2000) identificaram o genótipo G, em amostras de doadores de sangue da França e
Estados Unidos, e Arauz-Ruiz et al. (2002) o genótipo H, em amostras de indivíduos
provenientes do Nicarágua e Estados Unidos. Dessa forma, até o presente
momento, o HBV pode ser classificado em oito genótipos principais, que são
denominados em ordem alfabética de A-H (Figura 6).
Figura 6 – Árvore filogenética com os oito genótipos do HBV (A-H)
Fonte: Kramvis et al. 2005 (modificada)
Os genótipos e subtipos do HBV apresentam uma certa correlação (Quadro
2). De forma geral, isolados adw são encontrados nos genótipos A, B, F, G e H,
enquanto que os do genótipo C correspondem aos subtipos adr e ayr. Já nos
genótipos D e E, geralmente são encontrados isolados ayw (Kao 2002, Miyakawa &
Mizokami 2003).
Quadro 2 - Correlação dos genótipos e subtipos do HBV
Genótipo
A
B
C
D
E
F
G
H
Subtipo
adw2, ayw1
adw2, ayw1
adrq+, adrq-,ayr
ayw2, ayw3
ayw4
adw4, adw2,ayw4
adw2
adw4
Re-infecção e infecção simultânea com diferentes genótipos do HBV têm sido
descritas (Kramvis 2005, Schaefer 2005). A infecção com genótipo G parece ser
comumente associada à infecção com genótipo A (Kato et al. 2002a). Também já
foram observadas recombinações entre os genótipos A/D, B/C e A/C (Bollyky et al.
1996, Hannoun et al. 2000, Morozov et al. 2000, Owiredu et al. 2001, Jeantet et al.
2002, Sugauchi et al. 2002).
Assim como os subtipos, o estudo dos genótipos do HBV pode ser útil para
traçar rotas de transmissão desse vírus. Além disso, os genótipos podem influenciar
a progressão da doença hepática, bem como a resposta à terapia antiviral em
pacientes com hepatite B (Miyakawa & Mizokami 2003, Echavarria 2005, Günther
2006).
Subgenótipos
O termo “subgenótipo” é usado quando há divergência nucleotídica de 4 a 8%
dentro de um mesmo grupamento genotípico. Para designar esses subgrupos,
muitas vezes, são usados sufixos (letras alfabéticas), geralmente indicando o local
de origem da amostra. Entretanto, alguns autores defendem que a utilização de
números cardinais proporciona uma melhor identificação (Kramvis et al. 2005).
Em 1997, Bowyer et al., ao realizarem a análise filogenética da região Pré-S2
e S em amostras da África do Sul, identificaram o subgenótipo A1 (também
conhecido como A’ ou Aa), sendo que o sufixo “a” indica amostras oriundas da África
e Ásia. O subgenótipo A2, A-A’ ou Ae é referente as amostras de origem européia.
Mais recentemente, Kurbanov et al. (2005) identificaram o subgenótipo A3 ou Ac
(amostras provenientes de Camarões) (Bowyer et al. 1997, Sugauchi et al. 2004a,
Kurbanov et al. 2005).
Similarmente, o genótipo B pode ser classificado em cinco subgrupos: Bj ou
B1, Ba ou B2, B3, B4 e B5 (Sugauchi et al. 2002, 2003a, 2004b, Norder et al. 2004,
Nagasaki et al. 2006, Sakamoto et al.,2006). Em 2004, um estudo envolvendo
análise filogenética, realizado por Huy et al., classificou o genótipo C em C1 e C2.
Além desses, já foram descritos os subgenótipos C3, C4 e C5 (Huy et al. 2004,
Norder et al. 2004, Günther 2006, Sakamoto et al. 2006).
Para o genótipo D, já foram observados cinco subgenótipos (D1-D5) (Norder
et al. 2004, Banerjee et al. 2006, De Maddalena et al. 2007). Em relação ao genótipo
F, inicialmente, Mbayed et al. (2001) propuseram quatro subgenótipos, que foram
previamente nomeados de clusters (I-IV). Entretanto, posteriormente, o cluster I foi
designado de subgenótipo F1, e os cluters II e IV compreendem o subgenótipo F2. O
cluster III, atualmente, corresponde ao genótipo H (Norder et al. 2004, Kato et al.
2005). Além desses, já foram identificados os subgenótipos F3 e F4 (Devesa et al.
2004, Huy et al. 2006).
1.3.3 Mutações no genoma do HBV
Os termos mutantes e variantes são usados para descrever todos os vírus
geneticamente heterogêneos, independentemente do mecanismo causal (François
et al. 2001). É estabelecido que os diferentes genótipos do HBV são considerados
como formas estáveis do vírus, os quais resultam de alterações selecionadas por
muitos anos, pela pressão seletiva da população. Já os mutantes surgem em
indivíduos sob uso de medicações, ou naturalmente na hepatite B crônica, induzidos
pela pressão imune (Weber 2005).
O genoma do HBV tem alta taxa de mutações, presentes em todos os genes
virais e elementos regulatórios, sendo 10 vezes maior que outros vírus DNA e
aproximadamente 104 vezes mais freqüente que no genoma humano. Entretanto, as
taxas de substituições dos nucleotídeos podem variar de acordo com o estágio da
doença. Considerando a evolução natural, na infecção crônica, essas taxas são de
aproximadamente 1,4 x 10-5 a 3,2 x 10-5 substituições/sítio/ano. Já em
transplantados, são mais elevadas, podendo ocorrer até 100 vezes mais (Okamoto
et al. 1987a, Sterneck et al. 1997, Mizokami & Orito 1999, Lim et al. 2006).
Mutações na região S
Mutações no gene S foram primeiramente descritas há cerca de 17 anos atrás
(Carman et al. 1990). Atualmente, são encontradas mutações nas regiões Pré-S1/2
e S, sendo caracterizadas pela positividade simultânea dos marcadores HBsAg e
anti-HBs ou HBsAg negativo e anti-HBs positivo. Essas situações ocorrem
principalmente em portadores crônicos do HBV (Blum et al. 1997, Khouri & Santos
2004).
Muitos isolados apresentam mutação no gene S, reconhecida pela troca de
uma glicina por arginina no códon 145 (G145R), sendo essa a mais frequentemente
documentada (Weber 2005, Hatzakis et al. 2006). Esse mutante torna-se estável no
decorrer do tempo, sendo capaz de replicar-se em altos títulos por muitos anos
(Carman et al. 1990). Além disso, pode ser transmitido horizontalmente, uma vez
que persiste em leucócitos no sangue periférico de portadores assintomáticos do
HBV (Chakravarty & Varadarajan 2000). Ainda, a mutação G145R em combinação
com inserção no determinante “a” entre os aminoácidos 122 e 123 do
HBsAg
parece estar relacionada com hepatite fulminante (Carman et al. 1995).
Há outras mutações descritas para o gene S, sendo que algumas delas
alteram os aminoácidos nas posições 120, 123, 124, 126, 129, 131, 133 e 141. Na
região Pré-S, há também uma substituição de aspartato pela alanina no resíduo 144
(SD144A) (Seddigh-Tonekaboni et al. 2000).
Tais alterações podem resultar em reativação da doença em portadores
crônicos, falha na detecção do HBsAg e evasão à resposta imune protetora (antiHBs), podendo, assim, prejudicar a terapia baseada na utilização de anticorpos
específicos na supressão da infecção em indivíduos transplantados (Carman et al.
1990, Blum 1993). Além disso, mutações na região S podem ter implicação
epidemiológica, pois, a dificuldade de detecção sorológica do HBsAg facilita a
disseminação do HBV por transfusão sanguínea, principalmente em locais de alta
prevalência e que não adotam técnicas moleculares para triagem de doadores
(Chang 2006, Fang 2006, Lelie & Heaton 2006, Liu et al. 2006a).
Mutações na região Pré-core e Core
Assim como nas mutações do gene S, o surgimento de variantes da região
Pré-core e core também está geralmente associado à infecção crônica. Casos de
mutações pré-core foram descritos pela primeira vez na Itália, em que mostravam
ausência de marcador HBeAg, embora permanecessem detectáveis o HBsAg, antiHBe, anti-HBc e o DNA viral (Brunetto et al. 1990).
Essas mutações estão relacionadas com aumento da gravidade da doença
hepática crônica e hepatite B fulminante, sendo prevalentes em regiões como a Ásia
e Mediterrâneo, onde os genótipos B, C e D são predominantes. Por outro lado, são
raras na América do Norte e Europa, onde o genótipo A é comumente encontrado
(Rodriguez-Frias et al. 1995, Lindh 1997, Dai et al. 2001, Hadziyannis &
Vassilopoulos 2001, Shiraki et al. 2002, Hatzakis et al. 2006).
As mutações que produzem um códon de parada na região Pré-core são
geralmente pontuais, havendo a substituição de um único nucleotídeo (nt). Algumas
delas tem sido descritas no nt 1762 (A→T), 1764 (G→A), 1835 (A→C), 1896 (G→A)
e 1899 (G→A), sendo responsáveis pela redução da expressão do HBeAg. Dessas,
a mutação no códon 28 (G1896→A) é a mais comum, resultando na interrupção da
síntese do HBeAg. Contudo, o impacto dessa mutação na história natural da
hepatite B e o seu papel na patogênese da doença hepática permanece
desconhecido. Mutações nas posições 1817, 1874 e 1897 também causam
alterações na síntese do HBeAg, bem como aquelas nos nucleotídeos 1814, 1815 e
1816 (Brunetto et al. 1989, Carman et al. 1989, Protzer et al. 1996, Dai et al. 2001,
Dumps et al. 2001, Hadziyannis & Vassilopoulos 2001, Locarnini et al. 2003).
A mutação resultante da alteração da guanina (G) na posição 1896 por
adenina (A) confere um aumento na estabilidade da estrutura secundária do sinal de
encapsidação, sendo a mesma observada nos genótipos que possuem o
nucleotídeo T na posição 1858 (B, D, E e em alguns isolados dos genótipos C e F)
(Bonino & Brunetto 2003, Yoo et al. 2003). Apesar dessa mutação estar associada
ao aumento da gravidade da doença hepática, tendo em vista sua detecção em
pacientes com doença hepática ativa ou hepatite fulminante, foi detectada também
em portadores assintomáticos HBeAg negativos (Yoo et al. 2003).
A ocorrência de positividade concomitante para HBsAg, anti-HBe e HBV DNA
podem ser especialmente associadas a mutação dupla (1762 A→T e 1764 G→A)
que afeta o promotor basal do core (BCP). Essa mutação foi primeiramente descrita
em pacientes japoneses (Okamoto et al. 1994, Sato et al. 1995), sendo encontrada
mais frequentemente nos genótipos A e H (que apresentam citosina no nt 1858) e
também nos subgenótipos Ba e Bj (Chan et al. 1999, Sugauchi et al. 2003a). Além
disso, estão relacionadas à cirrose hepática, hepatocarcinoma e reativação da
replicação do HBV (Takahashi et al. 1995, Baumert et al. 1996, Gerner et al. 1999,
Tong et al. 2005).
Mutações na região X
Alguns mutantes do HBV apresentam deleções na região X, sendo
geralmente associados à diminuição da expressão do HBsAg, o que dificulta a
detecção desse marcador por testes sorológicos e até mesmo por técnicas
moleculares, se direcionadas à região deletada. Esses mutantes foram inicialmente
encontrados em casos de hepatite pós-transfusional em crianças talassêmicas
politransfundidas (Feitelson et al. 1994), pacientes em hemodiálise nos Estados
Unidos (Feitelson et al. 1995) e no Japão (Uchida et al. 1994). Ainda no Japão,
Fukuda et al. (1996) e Moriyama et al. (1997) encontraram deleções em
nucleotídeos
na
região
X,
nas
posições
(1763-1770)
e
(1753-1772),
respectivamente.
Mutações na região P
Os estudos de mutações envolvendo a região da polimerase, basicamente
estão relacionados ao tratamento da hepatite B. O uso prolongado de antivirais,
principalmente a lamivudina (3TC ou 2’-3’-dideoxi-3’-tiacitidina), está freqüentemente
associado ao desenvolvimento de mutações, causando resistência a esse antiviral.
Como referido, essas mutações estão relacionadas à alterações na transcriptase
reversa, na seqüência YMDD (tirosina-metionina-aspartato-aspartato) (Craxi et al.
2006).
1.4 Replicação do Vírus da Hepatite B
Apesar de ser bem estabelecido que os hepatócitos são o sítio primário da
replicação do HBV, ainda não estão bem esclarecidos os mecanismos dos eventos
iniciais desse ciclo replicativo, como a adsorção, penetração, desnudamento e
liberação do genoma viral dentro do núcleo da célula (Seeger & Mason 2000,
Ganem & Schneider 2001, Locarnini & Omata 2006). Entretanto, há algumas
evidências que indicam a participação das proteínas L, M e S na ligação da partícula
viral aos receptores celulares (Neurath et al. 1986, Pontisso et al. 1989).
Após a adsorção, o vírus perde seu envelope e o core é transportado ao
núcleo celular, onde o HBV DNA é liberado e se converte, por ação da DNA
polimerase viral, a uma forma circular covalentemente fechada (cccDNA – covalently
closed circular). A RNA polimerase II celular transcreve o genoma do HBV a partir do
cccDNA em RNAs pré-genômico e subgenômico, sendo que todos eles são
capeados na extremidade 5’ e compartilham o mesmo sinal de poliadenilação
(AATAAA) na extremidade 3’ (Seeger & Mason 2000, Gonçales 2002, Ganem &
Prince 2004, Locarnini 2004, Locarnini & Omata 2006).
Em seguida, as moléculas de RNAm viral são transportadas para o
citoplasma e traduzidas em proteínas do core, polimerase e X. Logo após essa
tradução, o RNA pré-genômico é encapsidado dentro das partículas do core
(HBcAg), juntamente com a polimerase viral. Essa encapsidação parece ser
resultado da interação da polimerase, proteínas do capsídeo e de um sinal de
encapsidação
(ε),
localizado
na
extremidade
5’
do
RNA
pré-genômico
(Bartenschlager & Schaller 1992, Ganem 1996, Seeger & Mason 2000, Ganem &
Schneider 2001, Ganem & Prince 2004, Locarnini 2004, , Locarnini & Omata 2006).
No interior do nucleocapsídeo, há a transcrição reversa do RNA pré-genômico
em DNA, com a síntese da fita de DNA de polaridade negativa, e posteriormente, há
formação da fita de polaridade positiva, que permanece incompleta. A partir daí, o
nucleocapsídeo adquire o envelope lipoprotéico no retículo endoplasmático ou
complexo de golgi e, finalmente, a partícula viral completa é liberada da célula
hepática.
Curiosamente,
algumas
moléculas
de
DNA,
voltam
ao
núcleo,
possibilitando uma espécie de reservatório intranuclear, podendo ser convertidas em
cccDNA (Gerelsaikhan et al. 1996, Seeger & Mason 2000, Ganem & Prince 2004). O
ciclo replicativo do HBV está esquematizado, resumidamente, na Figura 7.
Figura 7 – Representação esquemática do ciclo replicativo HBV
Fonte: (http://www.infekt.ch/updown/images/hbv_cycl.gif)
1.5 Aspectos Clínicos e Tratamento da Hepatite B
A hepatite B pode se manifestar como uma doença aguda autolimitada ou em
formas graves, como a hepatite fulminante. A evolução da hepatite B aguda inclui
quatro fases: período de incubação, prodrômica (pré-ictérica), ictérica e de
convalescência (Focaccia 2002). O período de incubação é de 45 a 180 dias,
dependendo de fatores como idade do paciente, modo de transmissão, porta de
entrada e resposta imune do hospedeiro (Befeler & Di Bisceglie 2000, Juszczyk
2000).
Logo após o período de incubação, ocorre a fase prodrômica, na qual o
indivíduo apresenta sinais e sintomas inespecíficos, incluindo mal-estar, febre baixa,
anorexia, mialgia, náusea, vômito e dor abdominal. Em seguida, além desses, pode
surgir a icterícia (fase sintomática), que é uma importante manifestação clínica das
hepatites virais, sendo resultado do aumento dos níveis de bilirrubina no sangue,
causando uma coloração escurecida da urina (colúria), descoloração das fezes
(acolia fecal) e uma coloração amarelada das mucosas da conjuntiva, esclerótida e
pele. A fase ictérica dura cerca de três a quatro semanas. Entretanto, a infecção
aguda pelo HBV, geralmente, é assintomática em crianças, estando a icterícia
presente em apenas 5-15% delas com 1-5 anos de idade. Já em adultos, está
presente em 30 a 50% dos casos. Por último, o período de convalescença é
marcado pela eliminação viral e melhora da sintomatologia clínica, com duração de
20 a 30 dias (Befeler & Di Bisceglie 2000, Gonçales 2002).
Na progressão para o estado de portador crônico do HBV, o organismo do
indivíduo não consegue eliminar o vírus e o HBsAg permanece detectável por mais
de 6 meses. O risco de evolução para a cronicidade varia conforme a idade. Dessa
forma, quando a infecção é adquirida no período neonatal, cerca de 90% dos casos
evoluem para a cronicidade. Em crianças com idade de 1 a 5 anos, esse índice é de
25% a 50%, e em adultos de 6% a 10% (Mahoney 1999, Befeler & Di Bisceglie
2000). A hepatite B crônica pode ainda resultar em cirrose hepática, sendo essa
considerada a causa mais comum de carcinoma hepatocelular no mundo (Liaw et al.
2004).
O impacto dos genótipos do HBV no curso natural da infecção e na resposta
ao tratamento tem sido estudado nos últimos anos. A infecção pelo genótipo A está
associada a índices maiores de remissão espontânea e desenvolvimento de formas
mais leves da doença (Sánchez-Tapias et al. 2002, Thakur et al. 2002). Os
infectados com o genótipo C podem desenvolver doença hepática mais grave e com
maior freqüência do que aqueles com genótipo B ou D. Alguns estudos
demonstraram a associação entre o genótipo C e carcinoma hepatocelular (Kao et
al. 2000, Orito et al. 2001, Chan et al. 2003, Nakayoshi et al. 2003, Duong et al.
2004, Yu et al. 2005). Além disso, um estudo realizado com pacientes infectados
com genótipo F na Espanha, sugere que esse genótipo pode ser associado à maior
freqüência de falência hepática e morte (Sanchéz-Tapias et al. 2002).
Em relação aos subgenótipos, diferenças clínicas e virológicas entre Aa e Ae
foram relatadas. A infecção pelo Aa está associada à ausência do antígeno e
(HBeAg) e níveis baixos do HBV DNA no soro. Esse perfil tem sido associado a alta
incidência de hepatocarcinoma induzido pela infecção pelo vírus da hepatite B na
África, onde o genótipo A, subgenótipo Aa é predominante (Kramvis et al. 1997,
1998, Kew et al. 2005).
Diferenças na resposta à terapia antiviral e na prevalência do HBeAg em
portadores crônicos do HBV infectados com Bj e Ba já foram relatadas (Akuta et al.
2003, Sugauchi et al. 2003a). Entretanto, não foram verificadas diferenças
virológicas importantes entre esses dois subgenótipos, e o fato de ser portador de
Ba ou Bj parece não afetar a gravidade da doença (Kobayashi et al. 2005).
O ideal na terapêutica da hepatite B seria a eliminação do
vírus do
organismo. Contudo, com a complexidade dessa infecção (como a persistência do
cccDNA) e limitações da terapia existente, o alvo do tratamento é a supressão da
replicação viral, visando a remissão da doença hepática, normalização dos níveis de
ALT e conseqüentemente a redução do risco de desenvolvimento de cirrose e
carcinoma hepatocelular (Alberti et al. 2002, Conjeevaran & Lok 2003, Lai et al.
2003b, Pawlotsky 2006, Zoulim 2006).
Não há necessidade do uso de antivirais na hepatite B aguda. E em casos de
hepatite fulminante, a conduta recomendável é o transplante hepático (De Franchis
et al. 2003). Sendo assim, o tratamento é indicado em casos em que os níveis de
ALT permanecem altos, na persistência do HBsAg ou HBV DNA por mais de seis
meses, ou, ainda, quando a biópsia hepática sugere hepatite B crônica (Hoofnagle &
Di Bisceglie 1997, Pawlotsky 2003, Sanchez-Quijano 2006).
Os principais agentes antivirais aprovados, ou em desenvolvimento,
pertencem a duas categorias, dependendo do mecanismo de ação, os moduladores
do sistema imune, como interferon alfa (INFα), e os inibidores da polimerase, que
são análogos de nucleosídeos, como por exemplo a lamivudina e o adefovir dipivoxil
(Zoulim 2006). Atualmente, existem cinco fármacos aprovados pelo FDA (Food and
Drug Administrtion) para o tratamento da infecção crônica para o HBV: interferon
alfa-2b (aprovado em 1992), lamivudina (1998), adefovir dipivoxil (2002),
peginterferon alfa-2a (2005) e entecavir (2005) (Krastev 2006, Sanchez-Quijano
2006, Zoulim 2006). Ainda, novos fármacos em fase de licenciamento ou em teste,
vêm sendo estudados, como clevudina e telbivudina. Além disso, a emtricitabina
(FTC) e o tenofovir têm mostrado atividade antiviral em infecção pelo HIV e HBV
(Craxi 2006, Krastev 2006).
No Brasil, o Ministério da Saúde oferece gratuitamente o interferon alfa e
lamivudina, para o tratamento da infecção crônica pelo HBV. A taxa de resposta ao
INFα é baixa e está associada ao aparecimento de eventos adversos importantes
(resfriados, perda de peso, alopecia, trombocitopenia, leucopenia, alterações
tireoidianas e neuropsiquiátricas, dentre outros). Além disso, a injeção subcutânea é
a única via de administração dessa medicação. Essas características podem ser
agravantes e interferir nos índices de adesão dos pacientes ao tratamento (Brasil
2005).
A lamivudina tem a vantagem da administração por via oral e possui um
mecanismo de ação que visa inibir a replicação viral, através do bloqueio da
atividade da polimerase/transcriptase reversa, resultando em diminuição significativa
nos níveis séricos do DNA viral (Clarke & Bloor 2002, Conjeevaran & Lok 2003,
Zoulim 2006). O uso adequado da lamivudina reflete em decréscimo dos níveis da
carga viral, manutenção de baixos níveis de HBeAg, com ou sem a detecção do antiHBe, normalização dos níveis de ALT e uma melhora hepática com comprovação
histológica (Clarke & Bloor 2002, Conjeevaran & Lok 2003, Zoulim 2006). Entretanto,
o inconveniente do uso prolongado da lamivudina é o desenvolvimento de
resistência, que ocorre em cerca de 70% dos pacientes quando utilizada por um
tempo superior a quatro anos (Conjeevaram & Lok 2003, Lai et al. 2003a, Lok et al.
2003).
O adefovir dipivoxil tem mostrado ser efetivo no tratamento de indivíduos que
apresentam essa resistência. O seu uso em associação à lamivudina demonstrou
uma adequada supressão de mutantes do HBV resistentes à lamivudina
(Conjeevaram & Lok 2003, Craxi et al. 2006, Krastev 2006).
Diferenças entre os genótipos podem influenciar no tratamento antiviral.
Pacientes infectados com genótipo C ou D apresentam uma menor resposta ao
interferon do que aqueles infectados com genótipos A ou B (Kao et al. 2002,
Janssen et al. 2005). Isso é devido a ocorrência de mais mutações na região do
promotor basal do core dos genótipos C e D, em relação aos genótipos A e B.
Estudos sobre interferência dos genótipos na resposta à lamivudina ainda são raros.
Contudo, Zollner et al. (2001 e 2004) mostraram que há um maior risco de
desenvolvimento de resistência à lamivudina no genótipo A, se comparado ao
genótipo D.
1. 6 Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo HBV
O diagnóstico dessa infecção deve englobar achados bioquímicos (níveis de
alanina aminotransferase-ALT e de aspartato aminotransferase – AST), assim como
a detecção dos marcadores sorológicos específicos, que incluem a pesquisa de
antígenos (HBsAg e HBeAg), dos seus respectivos anticorpos (anti-HBs e anti-HBe)
e do anti-HBc (IgM e Total) (Hollinger 1996b). Os antígenos e anticorpos podem ser
detectados empregando-se ensaio imunoenzimático (ELISA) ou radioimunoensaio
(RIE) (Hollinger 1996b, Mahoney 1999, Badur & Akgun 2001).
O HBsAg é o primeiro marcador sorológico encontrado no soro de pacientes
infectados pelo HBV (Figura 8), podendo ser detectado antes mesmo do
aparecimento de sintomas, como a icterícia. Surge, geralmente, até a sexta semana
após a exposição ao vírus. Na recuperação da infecção, há um declínio nos títulos
desse antígeno dentro de um período de quatro a seis semanas, e a partir daí ocorre
o surgimento de anticorpos específicos (anti-HBs), sendo esse último, indicador de
recuperação clínica e imunidade ao HBV (Ferreira 2000, Badur & Akgun 2001).
O HBcAg induz a formação de anticorpos anti-HBc IgM, que surgem por volta
da sexta semana, desaparecendo até o sexto mês de infecção. Esses anticorpos
são considerados como marcador de infecção aguda. Posteriormente, o marcador
anti-HBc total pode permanecer detectável por toda a vida, sendo considerado
marcador de exposição ao HBV (Badur & Akgun 2001).
O HBeAg é outro antígeno importante que surge na fase aguda, persistindo
por um tempo de três a seis semanas, desaparecendo após a resolução da infecção.
Por outro lado, pode permanecer por vários meses ou anos, durante a infecção
crônica e está associado à elevada replicação viral nos hepatócitos e infecciosidade.
Em resposta ao HBeAg, surgem anticorpos anti-HBe, que estão associados a
diminuição ou ausência de replicação viral. O aparecimento desses anticorpos ainda
na infecção aguda pode indicar uma possível resolução espontânea da infecção
(Hollinger 1996b, Ferreira 2000, Badur & Akgun 2001).
A infecção crônica pelo vírus da hepatite B é definida pela persistência do
HBsAg por um período maior ou igual a seis meses, podendo ainda ser detectados
os marcadores anti-HBc total, HBeAg ou anti-HBe no soro (Hollinger 1996b, Befeler
& Di Bisceglie 2000) (Figura 9).
Mais recentemente, a hepatite B tem sido diagnosticada pela detecção do
DNA viral empregando-se técnicas moleculares, como a reação da polimerase em
cadeia (PCR) (Hollinger 1996b, Ferreira 2000, Badur & Akgun 2001). O HBV DNA
pode ser encontrado no soro de indivíduos com infecção aguda ou crônica, sendo
associado à replicação do vírus. O seu desaparecimento na fase aguda indica
resolução espontânea da infecção. Já na infecção crônica, os níveis de DNA no soro
estão
relacionados
à
dinâmica
de
seu
curso
com
as
seguintes
fases:
imunotolerância (altos níveis de replicação viral), imunoliberação (baixos níveis de
HBV DNA) e “latência clínica” (níveis muito baixos ou indetectáveis de DNA) (De
Franchis et al. 2003, Pawlotsky 2003). A análise quantitativa do HBV DNA (carga
viral) tem sido utilizada no monitoramento da resposta à terapia antiviral (Hollinger
1996b, Mahoney 1999, Lok 2000).
Sintomas
anti-HBe
HBeAg
anti-HBc Total
Título
Título
0
4
anti-HBs
anti-HBc IgM
HBsAg
8
12
16
20
24
28
Semanas
Semanas após
após aa exposição
exposição
32
36
52
100
Figura 8 – Perfil sorológico da hepatite B aguda
Fonte: CDC - www.cdc.gov/hcidod/diseases/hepatitis/slideset (modificado)
Aguda
(6 semanas)
Crônica
(Anos)
HBeAg
anti-HBe
HBsAg
anti-HBc Total
Título
Título
anti-HBc IgM
0
4 8 12 16 20 24 28 32 36
Semanas
Semanas após
após aa exposição
exposição
52
Anos
Figura 9 – Perfil sorológico da hepatite B crônica
Fonte: CDC - www.cdc.gov/hcidod/diseases/hepatitis/slideset (modificado)
A hepatite B oculta, também conhecida como infecção “silenciosa” ou
“latente”, é definida pela presença do HBV DNA no soro e/ou no fígado, com
concomitante ausência do marcador HBsAg. Geralmente, o HBV é encontrado no
soro numa concentração menor que 104-105cópias/ml, sendo significantemente
inferior que naqueles indivíduos que são HBsAg positivos (Hu 2002, Kao 2002,
Chemin & Trepo 2005, Hou et al. 2005, Prati et al. 2006). Sendo assim, o HBV DNA
pode ser detectado em pacientes HBsAg negativos com anti-HBs detectável,
naqueles que são anti-HBc isolados, assim como na ausência de todos os
marcadores sorológicos (Nalpas et al. 1985, Tanaka et al. 1990, Fukuda et al. 1999,
Chemin et al. 2001).
Na determinação dos genótipos do HBV, diferentes metodologias são
utilizadas como o sequenciamento do genoma completo ou da região pré-S/S, que é
considerado o método padrão, porém o seu emprego, principalmente em larga
escala, tem sido dificultado pela sua complexidade e também por ser considerado
mais dispendioso (Naito et al.2001, Zeng et al. 2004). Assim, outros métodos têm
sido mais utilizados, como a PCR com primers genótipo-específicos (Repp et al.
1993, Kato et al. 2001, Naito et al. 2001), ou PCR com posterior análise do
polimorfismo de comprimento dos
fragmentos de restrição (RFLP) (Lindh et al.
1998, Mizokami et al. 1999, De Castro et al. 2000, Araújo et al. 2004, Zeng et al.
2004). Esses são métodos de execução mais simples, entretanto, estão sujeitos a
dificuldade de interpretação, em especial, quando há infecção com mais de um
genótipo (Kato et al. 2002b). A genotipagem pode ainda ser realizada por
hibridização reversa dos produtos da PCR (LiPA-Line Probe Assay), que parece ter
melhor sensibilidade na dectecção de infecções mistas (Osiowy & Giles 2003), PCR
em tempo real (pela análise da curva de anelamento) (Yeh et al.2004, Liu et al.
2006b, Wang et al.2007), pela utilização de “chips” com oligonucleotídeos (Vernet &
Tran 2005, Song et al. 2006, Wang et al.2007,Tang et al. 2007) e por ELISA com
anticorpos monoclonais (Usuda 1999, Usuda 2000).
1.7 Epidemiologia da Infecção pelo HBV
1.7.1 Transmissão do HBV
As principais formas de transmissão do vírus da hepatite B são as vias
parenteral/percutânea, sexual, vertical (mãe-filho) e horizontal (intrafamiliar). O HBV
é encontrado em diversos fluidos corpóreos de indivíduos infectados, mas apenas o
sangue, sêmem e saliva têm demonstrado ser infeciosos (Alter 2003). A presença do
HBsAg já foi verificada na saliva, sêmem, leite materno, urina, secreções
pancreáticas, biliares e vaginal, lágrima, líquidos menstrual, pleural e nasofaringeano
(Boxall et al. 1974, Heathcote et al. 1974, Villarejos et al. 1974, Irwin et al. 1975,
Hoefs et al. 1980, Davison et al. 1987, Hollinger 1996b, Befeler & Di Bisceglie 2000,
Knutsson & Kidd-Ljunggren 2000, Maddrey 2000). Um estudo recente, realizado por
Kidd-Ljunggren et al. (2006), mostrou a presença de altos títulos do HBV DNA na
saliva e no fluido nasofaringeano e, de títulos mais baixos, nas lágrimas de
indivíduos cronicamente infectados. Ainda não há evidências de detecção do HBV
nas fezes, e segundo Grabow et al.(1975), isso provavelmente se deve à inativação
da partícula viral na mucosa, ou por ação da microbiota intestinal. Ainda, de acordo
com Bond et al. (1981), o HBV permanece estável por mais de sete dias em
superfície de ambientes, podendo levar à disseminação do vírus por contato com
objetos inanimados.
A transmissão desse agente pode ocorrer pela exposição perinatal, por
relações sexuais, transplante de órgãos e tecidos, bem como através da exposição
ao sangue ou derivados e fluidos corpóreos, seja em transfusões sanguíneas,
procedimentos médico invasivos, acidentes ocupacionais, pelo compartilhamento de
seringas e agulhas pelos usuários de drogas injetáveis e ainda na realização de
acupuntura e tatuagem de forma inadequada (Alter 2003).
Em regiões de alta prevalência, a transmissão do HBV acontece
principalmente na infância, podendo ocorrer no período perinatal, pela exposição do
recém-nascido ao sangue ou líquido aminiótico, durante a passagem pelo canal
vaginal (Lavanchy 2004). Ainda, pode ocorrer pela via horizontal, pelo contato
contínuo com familiares portadores do vírus, nos primeiros anos de vida,
principalmente
em
ambientes
densamente
habitados,
com
condições
socioeconômicas e de higiene precárias (Krugmam & Giles 1970, Margolis et al.
1991, Zampino et al. 2002, Doganci et al. 2005, Chang et al. 2007). Apesar do modo
preciso e da dinâmica da transmissão horizontal do vírus da hepatite B não estarem
totalmente esclarecidos, sugere-se que este agente pode ser transmitido por contato
direto ou indireto entre os membros de um ambiente domiciliar, envolvendo lesões
em mucosas ou no tecido percutâneo (Bernier et al. 1982, Chakravarty et al. 2005).
Além disso, fatores como o compartilhamento de objetos de higiene pessoal, copos,
talheres, balas e doces, tamanho da família, presença de mais de um portador do
HBsAg no ambiente domiciliar, status de replicação do portador e origem étnica têm
sido considerados importantes nesta forma de disseminação da hepatite B
(Szmuness et al. 1975, Kim et al. 1993, Martinson et al. 1998, Zhevachevsky et al.
2000, Doganci et al. 2005).
Os índices de transmissão do HBV de mães infectadas aos neonatos são
dependentes do status dos marcadores HBsAg e HBeAg nas gestantes. Dessa
forma, em mulheres HBsAg +/HBeAg +, a transmissão ocorre em 70-90%. Já em
mulheres HBsAg+/HBeAg -, esse índice varia de 5 a 20%. A transmissão vertical
pode ocorrer principalmente no último trimestre de gestação em caso de uma
infecção aguda pelo HBV nesse período. Porém, esse percentual é menor, caso a
mãe seja portadora crônica, ou se infecte nos primeiros meses da gestação
(Hollinger 1996b, Chakravarty et al. 2005, Hou et al. 2005).
Em regiões de baixa prevalência, a infecção pelo HBV ocorre principalmente
em indivíduos na fase adulta, muitas vezes influenciada por fatores ambientais e
comportamentais, como o uso de drogas injetáveis, relações sexuais com múltiplos
parceiros (homossexuais e heterossexuais) e realização de procedimentos invasivos
sejam eles para fins terapêuticos ou não (cirurgias, transfusões sanguíneas, uso de
piercing, tatuagem, acupuntura, dentre outros) (Hollinger 1996b, Regan et al. 2000,
Alter 2003).
1.7.2 Prevalência da infecção pelo HBV
A hepatite B é uma das doenças infecciosas mais freqüentes no mundo.
Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), dois bilhões de
pessoas foram infectadas pelo HBV e cerca de 400 milhões encontram-se
cronicamente infectadas. A cada ano, cerca de 430.000 casos de câncer hepático
são causados por hepatites virais, sendo que quase 60% desses estão associados à
infecção pelo HBV. Além disso, estima-se que mais de um milhão de pessoas
morrem ao ano, por complicações hepáticas devido à infecção por esse vírus
(Maddrey 2000, Kao & Chen 2002, Alter 2003, Lai et al. 2003b, Lavanchy 2004).
A prevalência global da infecção crônica pelo HBV varia bastante nas
diferentes regiões geográficas, assim como em diferentes subgrupos populacionais.
Considerando-se a prevalência para o HBsAg, observa-se três categorias de
endemicidade (alta, intermediária e baixa) (Figura 10). Em áreas de alta
endemicidade, a prevalência é superior ou igual a 8%. Índices de 2 a 7% definem as
áreas de endemicidade intermediária e, em áreas de baixa endemicidade, a
prevalência para o HBsAg é menor que 2% (Lavanchy 2004, WHO 2004).
Dessa forma, regiões como África sub-Sahariana, sudeste asiático, Alasca,
Bacia Amazônica, parte da China, do Oriente Médio e Ilhas do Pacífico são
consideradas de alta endemicidade. Nesses locais, o risco do indivíduo adquirir a
infecção durante a vida é superior a 60% e ocorrem principalmente no período
perinatal ou na infância, apresentando, portanto, maiores chances de evolução para
a cronicidade. Estima-se que aproximadamente 3/4 dos pacientes com infecção
crônica em todo o mundo vivem nesses locais (André 2000, Lai et al. 2003b).
A endemicidade intermediária é observada no leste e sul europeu, Oriente
Médio, parte central da Ásia, Japão, Israel, norte da África, Rússia, Tailândia, Coréia
e em parte das Américas do Sul e Central. Nesses locais, a possibilidade de um
indivíduo adquirir infecção pelo HBV durante a vida varia de 20 a 60%, podendo
ocorrer nas diversas faixas etárias. As vias de transmissão são semelhantes àquelas
das regiões de alta endemicidade, sendo a via perinatal menos freqüente (Mahoney
1999, André 2000).
Baixa endemicidade é verificada, principalmente, em áreas desenvolvidas, em
que a chance de um indivíduo adquirir infecção pelo HBV durante a vida é menor
que 20%. Nestes locais, a transmissão envolve principalmente populações de alto
risco (usuários de drogas injetáveis, homossexuais, pacientes em hemodiálise,
heterossexuais com múltiplos parceiros sexuais, contactantes de pacientes
cronicamente
infectados,
dentre
outros).
Encontram-se
nesse
perfil
de
endemicidade, regiões como a América do Norte, parte da América do Sul, Europa
Ocidental e Austrália (Mast et al. 1999, Margolis et al. 1991, André 2000, Tanaka
2000, Alter 2003).
Em relação a América do Sul, a prevalência para o HBsAg é mais alta na
Bacia Amazônica e regiões adjacentes (Colômbia, Peru e Venezuela). A prevalência
diminui à medida em que se aumenta a distância desses locais, sendo baixa no
Chile, Uruguai, Paraguai e Argentina (Custer et al. 2004). Embora, o Brasil seja
considerado como de endemicidade intermediária, é possível observar variação na
prevalência para o HBsAg entre as regiões e dentro das mesmas (Souto 1999,
Tanaka 2000, Chávez et al. 2003).
Na Região Centro-Oeste, Martelli et al.(1999) verificaram em doadores de
sangue um índice de positividade para o marcador anti-HBc de 10,7%. Os estudos
realizados em Goiânia-Goiás, em diferentes grupos populacionais, mostraram uma
variação na prevalência global de 5,9% a 63,4% e uma prevalência para o HBsAg
variando de 0 a 14,5%. Esses estudos estão listados no Quadro 3. Ferreira et al.
(2006b), ao estudarem todos os pacientes em hemodiálise no Estado de Goiás
(n=1095), encontraram uma prevalência global de 29,8% para o HBV e de 2,4% para
o HBsAg.
Quadro 3 - Estudos sobre a prevalência da infecção pelo vírus da hepatite B
realizados em Goiânia -Goiás.
Prevalência
Referência
População
N
Cardoso et al. 1990
Feminina
475
-
6,1
Martelli et al. 1990
Prisioneiros
201
-
26,4
Martelli et al. 1990
Primodoadores
1033
-
12,8
Rosa et al. 1992
Pacientes com hanseníase em
tratamento ambulatorial
83
4,8
16,9
Rosa et al. 1992
Pacientes com
institucionalizados
171
8,8
50,5
Azevedo et al. 1994
Profissionais da área da saúde
625
2,3
23,4
hanseníase
HBsAg (%)
Global (%)
Porto et al. 1994
Meninos de/na rua
496
2
13,5
Cardoso et al. 1996
Gestantes
1459
0,5
7,5
Borges et al. 1997
Pacientes em diálise
175
13,7
63,4
Teles et al. 1998
Pacientes em hemodiálise
282
12
56,7
Bastos 2000
Pacientes com doenças
falciformes
63
0
12,7
Lopes et al. 2001
Profissionais de hemodiálise
152
0,7
24,3
Silva et al. 2002
Indivíduos com suspeita clínica
de hepatite
1396
14,5
50,7
Teles et al. 2002
Pacientes em hemodiálise
5,8
-
Carneiro & Daher 2003
Anestesiologistas
90
0
8,9
Costa 2004
Idosos residentes em asilos
195
0,5
32,3
Souza et al. 2004b
Portadores de doença mental
433
1,6
22,4
Tavares et al. 2004
Hemofílicos
102
1,1
43,7
Silva et al. 2005b
Profissionais de laboratório
648
0,7
24,1
Ferreira et al. 2006b
Pacientes em hemodiálise
2,4
-
Oliveira et al. 2006
Adolescentes
0,6
5,9
664
Figura 10 – Distribuição geográfica mundial da hepatite B crônica
Fonte: http://www.oeaz.at/zeitung/3aktuell/2005/08/bilder/8-oeaz-hepatitis-b-karte.jpg
(modificado)
Apesar do início dos estudos sobre infecção oculta pelo HBV ser
relativamente recente, houve um aumento considerável no número de publicações
sobre esse assunto, nos últimos anos. A infecção oculta não está restrita às áreas
de alta endemicidade e tem sido verificada em diferentes grupos populacionais. A
taxa de prevalência desse tipo de infecção em indivíduos com doença hepática
criptogênica varia de 20 a 30% na Europa. Já em portadores da hepatite C, varia de
20% na França a cerca de 80% no Japão (Chemin & Trepo 2005).
Em populações com alto risco para adquirir infecção pelo HBV por via
parenteral, índices elevados de 45% em usuários de drogas de Baltimore
(Torbenson et al. 2004) e 51 % em hemofílicos do Japão foram encontrados (Toyoda
et al. 2004). Estudos realizados com hemodialisados na Itália, Canadá, Grécia e
Turquia encontraram prevalências com variação de 0% a 36,4% (Besisik et al. 2003,
Minuk et al. 2004, Fabrizi et al. 2005, Goral et al. 2006, Kanbay et al. 2006, Siagris et
al. 2006).
Em pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), a
prevalência da infecção oculta varia de 0 a 89%, conforme estudos realizados no
Brasil (5% e 16%)(Gonçales et al. 2003, Santos et al. 2003), França (0,6%, 35% e
37%) (Neau et al. 2005, Piroth et al. 2000, Wagner et al. 2004), Espanha (0%)
(Nunez et al. 2002), Itália e México (20%) (Filippini et al. 2006, Torres-Baranda et al.
2006), África do Sul (22%) (Mphahlele et al. 2006), Países Baixos (4%) (Pogany et
al. 2005) e Suíça (89%) (Hofer et al. 1998).
Já em doadores de sangue, a prevalência para infecção oculta varia de 0 a
7,7% de acordo com estudos realizados na Alemanha (Henning et al. 2002, Jilg et
al. 2001), Estados Unidos (Kleinman et al. 2003) e Venezuela (Gutiérrez et al. 1999).
No Brasil, investigações realizadas com esse grupo mostraram prevalência de 2,7%
em Recife (Arraes et al. 2003), 3,3% no Rio Grande do Sul (Silva et al. 2005a) e
índices variando de 0 a 4% em São Paulo (Almeida Neto et al. 2001 e Gonçales Jr.
et al. 2003).
Entretanto, há autores que advertem que a determinação de prevalência da
infecção oculta pelo HBV ainda necessita ser realizada com cautela, pois, a mesma
pode sofrer influência do método utilizado na investigação. É importante ressaltar
que os testes laboratoriais diferem quanto à sensibilidade e especificidade. Além
disso, ainda são poucos os estudos que retratam a infecção oculta em indivíduos
aparentemente saudáveis, como por exemplo doadores de sangue e população em
geral, principalmente em países subdesenvolvidos onde esse tipo de infecção
parece ser mais freqüente (Allain 2004, Chemin & Trepo 2005).
1.7.3 Distribuição dos Subtipos e Genótipos
Em relação à distribuição mundial, o subtipo ayw1 é mais encontrado no
Vietnã, ayw2 (Mediterrâneo, África central e Grécia), ayw3 (Índia, Antilhas, Américas
do Norte e Sul), ayw4 (África Ocidental), ayr (Vietnã), adrq (Polinésia Francesa),
adrq+ (Sul e Leste Asiático), adw2 (centro e norte Europeu, leste da África do Sul) e
adw4 (Polinésia Francesa, Arquipélago de Marquesa e Argentina)
(Couroucé-Pauty et al.1983, Norder et al. 2004).
No ano de 1987, Gaspar & Yoshida publicaram um estudo, em que mostrava
que os subtipos ayw2, ayw3, ayw4, adw2 e adw4 circulavam no Brasil, com a
predominância do adw4 e adw2 na Região Norte, adw2 no Nordeste, ayw3 e ayw2
no Sul, adw2 e ayw3 no Sudeste e adw2 na Região Centro-Oeste. Em 2001, todos
esses subtipos foram encontrados em garimpeiros no Estado de Mato Grosso (com
exceção do ayw4) (Souto et al. 2001a). Em afro-descendentes de comunidades
isoladas de Mato Grosso do Sul, o subtipo adw2 foi predominante, seguido por ayw2
(Motta-Castro et al. 2003).
Em Goiânia-GO, Silva et al. (2002), ao subtiparem amostras de indivíduos
com evidência sorológica de hepatite B, encontraram os subtipos adw2 (62,7%),
ayw3 (23,5%), ayw2 (9,8%) e adw4 (3,9%). Semelhantemente, Souza et al. (2004b)
verificaram uma maior freqüência do subtipo adw2 (60%), seguido por adw4 (20%) e
ayw3 (20%) em portadores de problemas mentais. No entanto, esse último subtipo
foi dominante em hemodialisados (58,3%), seguido por adw2 (38,9%) e adw4 (2,8%)
(Teles et al. 2002).
O genótipo A é freqüentemente encontrado nos Estados Unidos, na parte
central da África, África do Sul, Índia, noroeste da Europa, Hong Kong e Filipinas. O
genótipo B é prevalente no Japão, Taiwan, Indonésia, Vietnã e China. O genótipo C
tem distribuição geográfica semelhante a do genótipo B, sendo também encontrado
nas Ilhas do Pacífico. Apesar de apresentar uma distribuição mundial, o genótipo D
tem maior prevalência na região do Mediterrâneo, Índia e Estados Unidos. Já o
genótipo E, parece ser restrito à África Ocidental. O genótipo F é prevalente nas
Américas Central e do Sul e Polinésia. O genótipo G circula nos Estados Unidos e
Europa. Finalmente, o genótipo H é mais encontrado nas Américas do Sul e Central
(Magnius & Norder 1995, Bowyer et al. 1997, Stuyver et al. 2000, Arauz-Ruiz et al.
2002, Kao 2002, Echavarria et al. 2005, Günther 2006).
Estudos realizados no Brasil, em diferentes grupos populacionais, mostraram
a circulação dos genótipos A, B, C, D e F. Entretanto, há predominância dos
genótipos A, D e F, enquanto os genótipos B e C foram observados em uma baixa
freqüência na cidade de São Paulo e no Estado do Paraná (Moraes et al. 1996, De
Casto et al. 2001, Bertolini 2002, Teles et al. 2002, Araújo et al. 2004, Conde et al.
2004, Carrilho et al. 2004, Sitnik et al. 2004, Oliveira 2005, Motta-Castro et al. 2005,
Ferreira et al. 2006b).
1.8 Prevenção e Controle da Hepatite B
Algumas medidas foram estabelecidas para prevenção e controle da
transmissão do HBV. Elas incluem, vacinação, profilaxia pós-exposição ou durante o
parto, triagem do HBsAg em gestantes, dentre outras (Brasil 1989, Brasil 1993,
Kupek 2001). Além disso, os bancos de sangue realizam a triagem sorológica dos
doadores para o marcador HBsAg em todo o mundo. Adicionalmente em alguns
países, é realizada a triagem para o marcador anti-HBc, o que tem contribuído para
a redução da hepatite B pós-transfusional, entretanto o risco de transmissão
permanece em portadores assintomáticos HBsAg negativos (Regan 2000, Hou et al.
2005, Brasil 1989, 1993). Mais recentemente, está ocorrendo a inserção gradativa
de técnicas moleculares na triagem desses doadores em países desenvolvidos
(Gessoni et al. 2005, Weber 2005, Fang 2006, Liu et al. 2006a).
A primeira vacina contra o HBV foi licenciada em 1981 e era derivada de
plasma humano de portadores crônicos do HBV (Heptavax-B). No entanto, a
possibilidade de ocorrer transmissão de outros patógenos veiculados pelo plasma,
bem como o avanço da engenharia genética, levaram ao desenvolvimento de
vacinas recombinantes de segunda geração, mais seguras, compostas de HBsAg
(Engerix-B, Recombivax e outras). Ambas apresentam uma boa imunogenicidade,
sendo que 90% dos indivíduos imunocompetentes vacinados desenvolvem
imunidade adequada (títulos ≥10 mUI/mL). Todas as vacinas recombinantes
licenciadas contém hidróxido de alumínio como adjuvante (Assad & Francis 2000,
Kao & Chen 2002, Shouval 2003).
A inclusão de vacina contra hepatite B em diversos países ocorreu a partir de
1991, seguindo a recomendação da OMS. Essa intervenção protege os indivíduos
em mais de 95% do desenvolvimento da infecção crônica e, conseqüentemente, de
cirrose e hepatocarcinoma associados a esse vírus (Lavanchy 2004, WHO 2004). A
imunização efetiva de crianças contra o HBV tem demonstrado ser uma ferramenta
eficiente para a redução das taxas de prevalência e incidência dessa infecção em
diversos locais, como Estados Unidos, Itália, Holanda e África do Sul (Lin et al. 2003,
Tsebe et al. 2001, CDC 2004, Da Villa et al. 2007, Van Houdt et al. 2007). Além
disso, em Taiwan e Alaska, países considerados previamente como hiperedêmicos,
sucesso na adoção dessa medida foi verificado (Harpaz et al. 2000, Ni et al. 2001).
Em Taiwan, por exemplo, oito anos após o início da imunização universal, houve
redução de cinco vezes no percentual de crianças HBsAg positivas (Wong & Tsang
1994), ocorrendo, ainda, diminuição significativa nos índices de mortalidade por
hepatocarcinoma em crianças naquele país, entre 1984 (época do início da
vacinação) e 1993 (Lee & Ko 1997). Todos esses estudos, não só ilustram o impacto
dessa importante medida de prevenção, como também encorajam todos os países a
adotar e manter a imunização na lista das prioridades no que se refere a Saúde
Pública.
O Brasil seguiu essa recomendação, implantando, inicialmente, a imunização
em áreas de endemicidade elevada (Amazônia Legal, Paraná, Santa Catarina e
Espírito Santo). Posteriormente, a vacina foi oferecida a grupos que apresentavam
alto risco de exposição ao HBV, como hemodialisados, profissionais de saúde,
profissionais do sexo, homossexuais, dentre outros. Na década de 90, foi adicionada
ao calendário nacional de imunização, a vacina para crianças menores de um ano e,
no ano de 2001, a vacina passou a ser oferecida para indivíduos até os 20 anos de
idade (Brasil 2003, 2005).
O esquema vacinal recomendado é de três doses, sendo 0, 1 e 6 meses, ou
seja, com intervalos de um mês entre as duas primeiras doses e de cinco meses
entre a 2ª e 3ª dose. A portaria do Ministério da Saúde (MS no.597 08/04/2004)
estabelece que essa vacina seja administrada no músculo vasto lateral da coxa
direita em crianças menores de dois anos e, a partir dessa idade, no músculo
deltóide (Brasil 2004). Cerca de 10% dos indivíduos vacinados não desenvolvem
títulos de anti-HBs suficientes para conferir proteção ao HBV. Fatores como
estocagem inadequada da vacina, predisposição genética, sexo masculino,
tabagismo, idade acima de 40 anos, obesidade, imunodeficiência, desnutrição, bem
como o local de administração da vacina, podem ser associados à ausência de
resposta vacinal (Assad & Francis 2000, Kao & chen 2002, Shouval 2003).
No Brasil, uma vacina recombinante é produzida no Instituto Butantan (São
Paulo), denominada Butang®. Sua imunogenicidade têm sido maior quando
administrada em indivíduos com idade inferior a 30 anos (Martins et al. 2004). Um
estudo realizado com crianças recém-nascidas em Campo Mourão-Paraná mostrou
que essa vacina é altamente imunogênica, desenvolvendo resposta protetora em
todas as crianças, inclusive as prematuras, vacinadas com três doses de 10 µg (0, 1
e 6 meses) (Isolani et al. 2006). A boa imunogenicidade da vacina também foi
comprovada em adolescentes de Goiânia-Goiás, vacinados com três doses de 20 µg
(0, 1 e 6 meses) (Oliveira et al. 2006).
A imunoglobulina hiperimune específica (HBIG) confere proteção passiva,
sendo empregada em casos de exposição ao HBV, seja em situações de acidente
com material contaminado, abuso sexual, contato sexual com parceiro portador ou
ainda em neonatos quando a mãe é HBsAg reagente (Perrillo et al. 1984, Brasil
2005).
Esforços para efetivar a prevenção e controle da transmissão do HBV em
ambientes hospitalares têm sido observados em programas de educação
continuada, que estimulam a adesão às medidas de biossegurança. Esses
programas reforçam o uso de equipamentos de proteção individual (EPI), prevenção
de injúrias com materiais pérfuro-cortantes contaminados, uso de técnicas
adequadas para esterilização/desinfecção de materiais, preparo de medicações em
área exclusiva e em doses individuais. Além desses cuidados, no ambiente
hemodialítico, tem sido realizado o isolamento de pacientes HBsAg reagentes em
máquinas
e
salas
exclusivas.
O
conjunto
dessas
medidas
contribuiu
substancialmente para a redução da incidência da hepatite B nos locais em que
foram implementadas (Brasil 1996, 2005, Mast et al. 1999).
1.9 Os afro-descendentes no Brasil e a comunidade Kalunga
Os africanos chegaram ao Brasil em meados do século XVI, trazidos como
forma de mão-de-obra escrava para trabalhar em plantações de cana de açúcar e,
mais adiante, nas minas de ouro, diamantes e plantações de café. Estima-se que
cerca de 3,5 milhões de africanos vieram para o Brasil entre o período de 1551 e
1850 (Alves-Silva 2000).
Por muito tempo, os escravos foram forçados a viver de forma desumana.
Assim, revoltados contra essas condições, se articularam, tentando buscar o direito
de serem livres e montaram esconderijos nos locais mais afastados, de difícil
acesso, longe dos possíveis ataques. Tais locais foram considerados unidades de
resistência e foram chamados de “quilombos” (Silva 2003). O movimento de
formação dos quilombos, registra-se como um longo fato histórico que se iniciou em
1630, só terminando em 1888, após a abolição da escravatura (Baiocchi 1999).
Atualmente, mais de 1000 comunidades são reconhecidas como remanescentes de
quilombos no Brasil, segundo registros da Fundação Palmares, e são considerados
locais onde vivem afro-descendentes que preservam a história e tradição do seu
povo.
Em 2003, Silva detectou aproximadamente 100 comunidades negras no
Brasil Central e considerou que 50 delas eram remanescentes de quilombos.
Entretanto, a que mais se destaca, por ser considerada a maior comunidade isolada
de afro-descendentes do Brasil, é a comunidade Kalunga, situada no Estado de
Goiás. Acredita-se que esses indivíduos têm procedência, em sua maioria, do
Congo, Angola e Moçambique (Figura 11) (Baiocchi 1999).
ÁFRICA
SUDANESES
BRASIL
Guiné
Portuguesa
Costa do
Marfim
Costa do
Ouro
Costa dos
Escravos
Golgo da
Guiné
CONGO
BANTU
Tocantins
Bahia
Mato
Grosso
Mato
Grosso do
Sul
ANGOLA
Moçambique
Minas
Gerais
Figura 11 - Rota dos escravos ao Brasil – Origem comunidade Kalunga (Baiocchi,
1999)
A comunidade Kalunga foi formada através dos processos migratórios, vindos
das minas de Goyaz e das minas de Tocantins no século XVIII, em que os afrodescendentes agruparam-se nas terras localizadas nos municípios de Cavalcante,
Monte Alegre e Teresina de Goiás, às margens do Rio Paranã, entre as serras do
Vão de Almas, Vão do Moleque, Contenda e Ribeirão dos Bois. Os Kalungas só
foram descobertos em 1982, por ocasião de estudos antropológicos, apoiados pela
Universidade Federal de Goiás (Baiocchi 1984). Em 1991, a região habitada por
esse povo foi reconhecida como sítio histórico e patrimônio cultural, totalizando uma
área de 237.000 hectares. Assim, os Kalungas permanecem praticamente isolados
cultural e geograficamente, até os dias de hoje.
Estima-se que a população total seja constituída por aproximadamente 3.000
indivíduos. Os solos da região são variáveis, aptos para a agricultura principalmente,
às margens do Rio Paranã, seus afluentes e vãos de serras. A área agricultável
corresponde a 30% dos 237.000 hectares, sendo a vegetação predominantemente
do cerrado (Baiocchi 1999).
A preservação dos Kalungas, como comunidade isolada, até os dias de hoje,
deve-se a vários fatores, dentre eles o difícil acesso à região e sua capacidade de
resistência, como a prática da agricultura de subsistência, praticada sem auxílio de
máquinas e com a participação de toda a família (mulheres, homens e crianças). Os
alimentos mais comuns no plantio são o arroz, mandioca, feijão e milho. A mandioca
parece ter um importante valor naquele local, pois serve tanto para o consumo como
também para o comércio, sendo a farinha usada para adquirir sal, tecidos, café,
querosene, panelas e outros produtos em comércios locais e regionais (Baiocchi
1999, Ministério da Educação 2001).
Além disso, a estrutura alimentar é incrementada com a caça, pesca, criação
de gado e porcos, bem como o plantio de alimentos nas proximidades das casas,
como hortas (manjericão, coentro, e pimentas) e frutas (banana, mamão, melancia,
abacaxi, dentre outras) (Baiocchi 1986, 1999, Silva, 2003).
No geral, o modo de vida dos Kalungas é bastante simples. As casas têm
poucos cômodos (sala, cozinha e quartos), sendo feitas de adobe e, na preparação
do telhado, são utilizadas palhas e madeira da própria região. O chão é feito de terra
batida, os móveis se resumem a bancos, camas, armários de cozinha e o cozimento
de alimentos é realizado no fogão a lenha. Os banhos, assim como a lavagem dos
utensílios domésticos, como panelas e pratos, se dão nos rios. Não há banheiros
nas casas, energia elétrica, água encanada e nem rede de esgotos. A taxa de
natalidade é considerada alta, caracterizando a população com uma grande
concentração de crianças. O índice de analfabetismo é elevado e, apesar de já
existirem escolas construídas com o apoio do Governo Federal, ainda são
encontradas escolas de palha, com recursos didáticos escassos e situadas em
locais onde as crianças muitas vezes têm que caminhar por muito tempo sob o sol
para estudar (Baiocchi 1999, Ministério da Educação 2001, Silva 2003).
No entanto, apesar de todas as aparentes dificuldades, os Kalungas são
considerados um povo festivo e religioso. Ao longo do ano, várias festas são
realizadas e todas elas fazem alusões comemorativas a santos ou elementos
católico-romanos ou africanos. Essas festas são eventos sociais, em que
comparecem grupos de todas as idades. Para algumas festas, inclusive, há o
deslocamento da família inteira, que viajam por muitas horas ou até dias, a pé ou
montados a cavalos, até chegarem aos locais das festividades, onde existem
espécies de ranchos construídos com a finalidade de abrigar as famílias, bem como
cozinhas, locais para danças e capelas para os rituais.
Figura 12 - Povo Kalunga
http://photos1.blogger.com/x/blogger/4879/4291/1600/829055/32.jpg
Figura 13 - Casa Kalunga feita de adobe e palha
http://www.ecoviagem.com.br/ecoviagembrasil/aventura/giro-pela-america/os-kalungas.asp
Figura 14 - Cozinha Kalunga, com fogão a lenha
Figura 15 - Escola Kalunga feita com adobe e palha
http://www.unb.br/acs/bcopauta/arquitetura5.htm
Figura 16 - Mulheres Kalunga
trabalhando em artesanato
http://www.brasiloeste.com.br/fotosma
t/kalunga_01.jpg
Figura 17 - Kalungas no preparo da farinha de mandioca
http://www.labcom.ubi.pt/agoranet/04/cantia-aline-bolonileonardo-quilombo-kalunga.pdf
Figura 18 - Sanfoneiro em festa Kalunga
http://photos1.blogger.com/x/blogger/4879/4291/1600/466839/Sanfoneir
o.jpg
Figura 19 - Crianças da comunidade Kalunga
www.photografos.com.br/users/marciocabral/normal_1349
27_photo.jpg
1.10 Justificativa
Apesar de terem se passado mais de três décadas da identificação do agente
etiológico da hepatite B e de todos os estudos subseqüentes contribuírem para o
conhecimento desta infecção, inclusive viabilizando vacinação específica, a hepatite
viral do tipo B persiste como um problema de saúde pública mundial, sendo ainda
associada a muitos casos de cirrose, hepatocarcinoma e a alta mortalidade
(Maddrey 2000, Kao & Chen 2002, Alter 2003, Lai et al. 2003b, Lavanchy 2004).
Estudos epidemiológicos sobre a infecção pelo HBV têm mostrado uma ampla
variação nos níveis de endemicidade em todo o mundo, sendo a África considerada
uma região de alta endemicidade, que possui um grande número de portadores
crônicos da hepatite B e um elevado risco para óbitos como conseqüências desta
infecção (Miller et al. 1998, André 2000, Mulders et al. 2004).
A população brasileira é altamente miscigenada, caracterizada principalmente
pela mistura entre três grupos étnicos: ameríndios, europeus (portugueses) e
africanos. Estima-se que, do total de imigrantes que chegaram ao Brasil (15001972), 40% eram da África (Alves-Silva et al. 2000, Oliveira et al. 2002). Atualmente
em nosso País, 1000 comunidades estão oficialmente identificadas como
remanescentes de quilombos e poucos são os estudos sobre a infecção pelo HBV
nesta população (Motta-Castro et al. 2003, Motta-Castro et al. 2005).
A investigação epidemiológica e molecular da infecção pela hepatite B tem se
estendido a diversos grupos populacionais na Região Centro-Oeste. No entanto,
ainda são inexistentes, no Estado de Goiás, estudos de prevalência abrangendo
populações rurais, principalmente aquelas que apresentam diferenças em sua
composição, bem como características culturais e raciais específicas. Levando em
consideração esses aspectos, este foi o primeiro estudo realizado com a proposta
de traçar o perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo vírus da hepatite B em
afro-descendentes que vivem em comunidade isolada em nosso Estado. Acredita-se
que estas informações sejam valiosas para elaboração ou re-estruturação de
estratégias específicas de prevenção e controle da hepatite B na população
estudada.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
♦ Estudar o perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo vírus da
hepatite B na população isolada de afro-descendentes no Estado de Goiás
(Kalungas), visando proporcionar informações para subsidiar medidas de
controle e prevenção da hepatite B na comunidade estudada.
2.2 Objetivos específicos
♦ Estimar a prevalência da infecção pelo HBV na comunidade Kalunga em
Goiás;
♦ Analisar os principais fatores de risco associados a esta infecção;
♦ Detectar o DNA viral e os marcadores HBeAg e anti-HBe nas amostras
HBsAg reagentes;
♦ Verificar o índice de infecção oculta pelo HBV na população estudada;
♦ Caracterizar
os
isolados
do
HBV,
identificando
os
genótipos
e
subgenótipos virais.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 População estudada
Este é um estudo observacional, analítico, de corte transversal, que foi realizado
em afro-descendentes de comunidade isolada no Estado de Goiás (Kalungas). Esta
população reside em uma área de aproximadamente 237 mil hectares, nos
municípios de Cavalcante, Teresina de Goiás e Monte Alegre. Os Kalungas vivem
isolados nos vãos entre serras às margens de rios, formando os núcleos de Vão de
Almas, Vão do Muleque e Engenho. Atualmente a população total é constituída de
aproximadamente 3.000 habitantes.
Para obter a prevalência estimada da infecção pelo HBV em torno de 30%,
com uma precisão de 5%, seria necessário estudar o mínimo de 691 indivíduos,
considerando um poder estatístico de 80% (β=20%) e um nível de significância de
95% (α=0,05). Desta forma, esta investigação contou com a participação de 878
afro-descendentes.
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da
Universidade Federal de Goiás.
3.2 Entrevista e coleta de sangue
Em maio de 2004, foi realizada uma visita à comunidade Kalunga, afim de
conhecer a realidade do local e a população a ser estudada. Na oportunidade,
realizou-se a divulgação do estudo e agendamento das entrevistas, bem como das
coletas de sangue, para o mês de julho de 2004, em escolas e centros comunitários.
Após informação prévia sobre os objetivos e metodologia da pesquisa, os
indivíduos consentiram em participar da investigação por meio da assinatura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, ou da coleta de impressão digital dos
indivíduos analfabetos. Para indivíduos menores de idade, o referido termo foi
autorizado pelos pais ou responsáveis. Em seguida, os mesmos foram submetidos à
entrevista utilizando-se um questionário padrão (em anexo), que abordava questões
sobre características sócio-demográficas, fatores de risco relacionados à infecção
pelo HBV, antecedentes sobre hepatite/icterícia e vacinação contra hepatite B.
A amostra de sangue de cada participante (10 mL) foi obtida por punção da
veia cubital e foram centrifugadas a 3000 rpm, em temperatura ambiente, durante 10
minutos. O sobrenadante (soro) foi separado em duas alíquotas, identificadas com o
número do registro de cada participante. Os soros foram estocados em freezer a 20°C (no Hospital Municipal de Cavalcante) e transportados para o Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG),
onde foram armazenados nas mesmas condições, até a realização dos testes
sorológicos e moleculares.
3.3 Testes sorológicos
Os testes sorológicos foram realizados através do ensaio imunoenzimático
(ELISA), empregando-se kits comerciais. Inicialmente, todas as amostras foram
testadas para a detecção dos marcadores HBsAg, anti-HBc e anti-HBs. Em seguida,
as amostras que foram reagentes ao HBsAg foram testadas para detecção do
HBeAg e anti-HBe.
3.3.1 Detecção do HBsAg
Para a detecção do marcador HBsAg foram empregados reagentes
comerciais (Hepanostika HBsAg Uni-Form II, Biomérieux-Holanda). Este teste
consiste em um ensaio imunoenzimático (ELISA) baseado no princípio de sandwich
em uma única etapa. Em uma microplaca sensibilizada com anticorpos anti-HBs
monoclonais e contendo uma esfera de conjugado (anti-HBs marcado com
peroxidase), foram adicionados as amostras e controles em suas respectivas
câmaras. Após este procedimento, a placa foi incubada e, posteriormente, lavada
com
tampão
fostato.
Em
seguida,
o
substrato/cromógeno
(tetrametilbenzidina/peróxido de uréia) foi adicionado. Após nova incubação, a
reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico a 1N.
Após o término da reação, a leitura espectrofotométrica foi realizada em filtro
simples (450 nm), onde foram consideradas positivas as amostras que
apresentaram absorbâncias maiores ou iguais ao valor do cut-off, obtido através da
soma (CNx+0,050), onde CNx é a média das absorbâncias dos controles negativos.
3.3.2 Detecção do anti-HBc total
A detecção do marcador anti-HBc Total foi realizada com reagentes
comerciais (Hepanostika anti-HBc Uni-Form, Biomérieux-Holanda). O princípio da
reação era baseado em inibição competitiva. Cada câmara da placa era revestida
com antígeno core do vírus da hepatite B (HBcAg). O conjugado era constituído de
anticorpos anti-HBc humano interligado à enzima peroxidase.
As amostras em teste e os controles foram incubados juntamente com o
conjugado durante 90 minutos a 37ºC e, em seguida, a placa foi lavada com o
tampão fosfato. Posteriormente, foi adicionada a solução substrato/cromógeno
(tetrametilbenzidina/peróxido de uréia) e incubou-se por 30 minutos. Finalmente, a
reação foi interrompida com ácido sulfúrico a 1N e a leitura espectrofotométrica
realizada em leitora de microplaca com uso de filtro simples (450 nm).
O valor do cut-off foi obtido pela fórmula: 0,25 (CNx + 3CPx) onde “CNx” é
igual ao valor médio das absorbâncias dos controles negativos e “CPx” ao dos
controles positivos. Assim, foram consideradas amostras positivas, aquelas que
apresentaram absorbância menor ou igual ao valor do cut-off.
3.3.3 Detecção de anti-HBs
A detecção de anticorpos anti-HBs foi realizada através do método
imunoenzimático direto (tipo sandwich) em microplacas sensibilizadas com HBsAg
(ad e ay). As amostras e controles foram adicionados às suas respectivas câmaras.
A placa foi incubada e, em seguida, lavada. Após a adição do conjugado (HBsAg
marcado com peroxidase), a placa foi incubada novamente. Realizada a lavagem, a
mistura substrato/cromógeno foi adicionada, sendo a placa novamente incubada.
Então, a reação foi bloqueada pela ação de ácido sulfúrico, e a leitura realizada em
filtro duplo (450 nm e 620nm).
O cut-off foi definido por (CNx + 0,040), onde “CNx” é igual a média das
absorbâncias dos controles negativos. Os resultados foram obtidos através da razão
entre a absorbância da amostra e o valor do cut-off. As amostras com relação
absorbância/cut-off ≥ 1,0 foram consideradas positivas; com relação absorbância/
cut-off ≤ 0,9 foram negativas e, quando esta razão foi igual a 0,9 as mesmas foram
indeterminadas.
3.3.4 Detecção do HBeAg e anti-HBe
O teste ELISA Hepanostika HBeAg é baseado no princípio sandwich e, para a
detecção do anti-HBe, numa modificação da inibição do sandwich.
No ensaio para HBeAg, adicionou-se as amostras e controles na microplaca
sensibilizada com anticorpos anti-HBe humano. Em seguida, realizou-se a
incubação e a lavagem. O conjugado (anti-HBe humano ligado à peroxidase) foi
acrescentado. Após a segunda incubação e a lavagem, a reação foi revelada pela
adição do substrato/cromógeno (peróxido de uréia e TMB). A reação foi
interrompida, sendo considerada positiva a leitura espectrofotométrica (filtro 450 nm)
que mostrou absorbância maior ou igual ao cut-off, definido de acordo com as
instruções do fabricante como a soma das médias das absorbâncias dos controles
negativo e positivo x 0,5.
Para detecção do anti-HBe, em microplaca sensibilizada com anti-HBe, foram
adicionadas as amostras e controles, juntamente com uma solução contendo
HBeAg. Após a incubação, os procedimentos foram os mesmos utilizados para
detecção do HBeAg, porém foram consideradas positivas as amostras que
apresentaram absorbância menor que a do cut-off, obtido conforme a descrição
acima.
3.4 Detecção e genotipagem do HBV DNA
3.4.1 Extração do HBV DNA
As amostras HBsAg reagentes (n=16), bem como amostras positivas para o
anti-HBc (n=295) foram submetidas à extração do ácido nucléico viral, realizada em
duas etapas, conforme Niel et al. (1994). Resumidamente, a primeira consistiu na
adição de 250 µL do soro em 80 µL de solução de lise, sendo esta composta por
solução A (Tris 200 mM, SDS 1%, NaCl 700 mM, EDTA 20 mM, tRNA 0,1 mg/mL) e
solução B (proteinase K 2mg/mL dissolvida em solução de CaCl2 0,36 mM; o pH final
foi ajustado para 9,0 utilizando o HCL). Os soros, juntamente com a solução de lise,
foram incubados a 37º C por 4 horas. O DNA viral foi extraído pelo uso de
fenol/clorofórmio, centrifugado, e a fase superior transferida para tubos contendo
etanol. Estes foram mantidos a -20ºC durante a noite. A segunda etapa da reação,
caracterizou-se pela centrifugação do material e a formação de um precipitado, que
em seguida foi lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em 30 µL de água
(milliQ autoclavada).
3.4.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Após a extração do DNA, realizou-se uma semi-nested PCR, para
amplificação e detecção do DNA viral relativo a região pré-S/S, que foi realizada em
duas etapas, de acordo com Motta-Castro et al. (2005).
Para a PCR-1 (1ª etapa), utilizou-se uma mistura contendo 1 pmol de cada
primer: PS1 e S2/S22 (Invitrogen) (Quadro 4), responsáveis pela amplificação do
fragmento de DNA do nucleotídeo 2826 ao 841 do genoma; 0,2 mM de cada dNTP
(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 3 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 1U de Taq
DNA polimerase, num volume final de 50 µL. Dois microlitros do HBV DNA extraído
de cada amostra obtido na fase anterior, além dos controles negativos (água) e
controle positivo (amostra HBV DNA positiva) foram misturados aos componentes
descritos acima, e em seguida esta mistura levada ao termociclador com o seguinte
programa: 94ºC por 3 minutos (desnaturação inicial), 30 ciclos de 95ºC por 30
segundos, 52ºC por 40 segundos e 72ºC por 2 minutos (desnaturação, anelamento e
extensão, respectivamente) e 72ºC por 7 minutos (alongamento final).
A segunda etapa (PCR-2) foi realizada empregando-se os primers PS1 e SR
(Invitrogen) (Quadro 4), além dos mesmos componentes mencionados acima. O
produto final da PCR-1 (2 µL) foi adicionado à nova mistura da reação e levado ao
termociclador, com o seguinte programa: 94ºC por 3 minutos (desnaturação inicial),
30 ciclos de 94º C por 20 segundos, 55ºC por 20 segundos e 72ºC por 1 minuto
(desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente) e 72ºC por 7 minutos
(alongamento final). O produto final da PCR-2 era composto de 1099 pares de base
(pb).
3.4.3 Eletroforese em gel de agarose
Ao gel de agarose preparado a 1% em tampão TBE (Tris-Borato EDTA), foi
acrescentado brometo de etídeo em uma concentração final de 0,5 µg/mL.Os
produtos da PCR-2 foram misturados a 5 µL do corante Azul de bromofenol,
aplicados ao gel e submetidos à eletroforese. As bandas formadas foram
visualizadas através de luz ultravioleta com auxílio de um transluminador, e
comparadas ao controle positivo.
Para evitar contaminação, vários cuidados foram tomados, como a
preparação dos reagentes pré-PCR, amplificação do DNA e a eletroforese em gel
dos produtos de PCR em ambientes separados.
3.4.4 Genotipagem por RFLP (Retriction Fragment Lenght Polymorphism
-Análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição)
O fragmento de DNA amplificado foi analisado pelo método de RFLP,
utilizando-se três enzimas de restrição ou endonucleases. As enzimas, EcoRI,
BamHI e StuI (New England BioLabs), foram diluídos segundo as recomendações
do fabricante, tendo como componentes água milliQ (8 µL), tampão específico para
cada enzima (2 µL) e enzima (10U).
Dez microlitros do produto obtido após a PCR-2 com igual volume de cada
enzima foram incubados a 37ºC durante quatro horas. Após este período, as
amostras contendo DNA digerido foram misturadas a 5µL de Azul de bromofenol,
aplicadas em gel de agarose a 3% e submetidas à eletroforese. Utilizou-se, também,
o marcador de peso molecular (100 bp DNA Ladder- Invitrogen )
(1 µL/mL do
marcador, 10 µL de TBE e 5 µL de Azul de bromofenol). As bandas formadas foram
visualizadas através de luz ultravioleta com o auxílio de um transluminador e
comparadas às bandas do marcador de peso molecular.
O método de RFLP permite, através da interpretação dos padrões
eletroforéticos, a distinção entre os genótipos A, D e F, conforme descrito por Araújo
et al. (2004).
3.5 Sequenciamento da região Pré-S/S
3.5.1 Amplificação das amostras para a região Pré-S/S
As amostras HBsAg e HBV DNA positivas, genotipadas pela técnica de RFLP,
foram também submetidas à semi-nested PCR para amplificação da região Pré-S/S.
Na primeira PCR, foram utilizados os primers externos P01 e S2/S22 (Quadro 4). A
segunda PCR foi realizada com os primers PS1 e S2/S22. O processo para
amplificação, nas duas etapas, incluíram os seguintes passos: desnaturação inicial
das amostras a 94ºC por 3 minutos, seguida por 30 ciclos a 95ºC durante 30
segundos, a 52ºC por 40 segundos e a 72ºC durante 2 minutos. Finalizando, com
alongamento a 72ºC por 7 minutos.
3.5.2 Purificação do DNA
O volume total (100 µL) do produto amplificado para região Pré-S/S foi
submetido à eletroforese em gel de agarose a 1%, contendo brometo de etídeo. Em
seguida, as bandas foram extraídas do gel e colocadas em tubos “eppendorfs” (1,5
mL) para serem eluídas e purificadas utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA).
Para cada 10 mg de fragmento do gel, adicionou-se 10 µL de solução de
ligação à membrana. A mistura foi homogeneizada em vórtex e incubou-se a 50ºC
por aproximadamente 10 minutos até a completa dissolução do gel. A seguir, o
material foi transferido para uma coluna que foi adaptada a um tubo de coleta, sendo
incubado a temperatura ambiente por um minuto e centrifugou-se a 14000 rpm
durante um minuto. O resíduo do tubo de coleta foi desprezado. Posteriormente,
adicionou-se 700 µL de solução de lavagem previamente diluída com etanol a 95% e
centrifugou-se a 14000 rpm por um minuto, sendo o produto do tubo de coleta
novamente desprezado. Em seguida, adicionou-se 500 µL da solução de lavagem e
centrifugou-se a 14000 rpm por cinco minutos. Para finalizar, a coluna foi adaptada a
um novo tubo “eppendorf” (1,5mL) e adicionou-se 50 µL de água livre de nucleases
à coluna, deixando incubar a temperatura ambiente por 1 minuto e centrifugando a
14000 rpm por mais um minuto. A coluna foi desprezada e o DNA coletado no tubo
“eppendorf” foi armazenado a -20ºC.
Na etapa seguinte, foi realizada a quantificação do DNA purificado. O produto
foi aplicado em gel de agarose a 2%, num volume de 4 µL de cada amostra.
Também aplicou-se 4 µL do marcador de massa e peso molecular ”low DNA mass
ladder” para comparar a intensidade das bandas e calcular a concentração,
determinando, assim, o volume de DNA utilizado na técnica de sequenciamento.
3.5.3 Seqüenciamento e análise da região Pré-S/S
As seqüências nucleotídicas das amostras amplificadas para região Pré-S/S
foram determinadas utilizando o Kit BigDye Terminator versão 3.1 (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) com primers específicos (PS1, S4, PS2 e S2).
Quando necessário, os primers: PS4 e S7 foram utilizados (Quadro 4).
Para cada reação de sequenciamento, empregou-se 5 µL do DNA na
concentração de 40 a 60 ng/µL, adicionados a 1,5 µL de água e 1 µL dos primers
específicos para a região Pré-S/S. As reações para sequenciamento foram
realizadas em um seqüenciador automático ABI 373
Biosystems,
Applied
Biosystems,
Foster
(Applied
City,
CA,
USA).
A análise das seqüências foi realizada utilizando um programa desenvolvido pelo
Grupo de Genética da Universidade de Wisconsin. Para análise filogenética, foi
construída uma árvore pelo método “Neighbor-joining” usando o programa Mega
versão 3.0 (Kumar et al. 2004).
Os genótipos das amostras do HBV deste estudo foram determinadas
acrescentando-se, na análise filogenética, seqüências de referência dos oito
genótipos conhecidos (A-H), bem como dos subgenótipos do vírus, disponíveis no
GenBank (designadas na árvore filogenética pelo número de acesso e o local de
origem - Figura 23 ).
Quadro 4-Primers utilizados na amplificação da região Pré-S/S e sequenciamento
Primers
P01
PS1
Sentido
sense
sense
Seqüência (5 ’ 3’)
GGACTCATAAGGTGGGGAA
CCATATTCTTGGGAACAAGA
PS2
anti-sense
GGTCCCCAGTCCTCGAGAAG
PS4
sense
S2
S4
S7
S22
SR
anti-sense
sense
anti-sense
anti-sense
anti-sense
ACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTG
GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA
TGCTGCTATGCCTCATCTTCT
TGAGCCAGGAGAAACGGGCT
GTATTTAAATGGATACCCAAAGA
CGAACCACTGAACAAATGGC
3.6 Processamento e análise dos dados
Os dados obtidos nas entrevistas, bem como os resultados dos testes
sorológicos e moleculares, foram analisados no programa Epi-Info versão 6.04
(Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta. GA). Prevalência e estimativa
de risco foram calculadas com intervalo de confiança de 95%. Os testes Quiquadrado, Qui-quadrado para tendência e exato de Fisher foram utilizados quando
apropriados. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
Após o cálculo da estimativa de risco dos fatores associados à exposição ao HBV
(positividade ao marcador anti-HBc) pela análise univariada, realizou-se a análise
multivariada, por regressão logística múltipla, através do pacote estatístico SPSS,
versão 11.0 for Windows para identificar as possíveis variáveis confundidoras.
4. RESULTADOS
4.1 Características da população estudada
As características sócio-demográficas dos 878 afro-descendentes estudados
da comunidade Kalunga são apresentadas na Tabela 1. A idade destes indivíduos
variou de 1 a 88 anos, com média de 28,3 e desvio padrão (dp) de 19,9 anos. Houve
predomínio do sexo feminino, representando 60,1% da população estudada.
Em relação ao estado civil, 52,7% dos entrevistados eram solteiros, 44,1%
casados ou relataram união consensual e 3,2% referiram ser separados ou viúvos.
O nível de escolaridade dos Kalungas foi predominantemente baixo. Do total, 33,9%
não possuíam escolaridade alguma, 60,9% tiveram acesso ao ensino fundamental,
5,1% referiram ter cursado o ensino médio e apenas um indivíduo (0,1%) cursou o
nível superior.
Grande parte da população (75,2%) relatou renda familiar menor que um
salário mínimo, 19,1% de um salário mínimo, 5,7% de dois ou mais salários. A
maioria dos participantes informou que exercia atividade como lavrador (66%). Em
relação ao restante, 14,5% ocupavam-se de atividades do lar, 10,2% eram
estudantes e 9,3% citaram outro tipo de ocupação, como professores, cozinheiras,
aposentados e agentes comunitários de saúde.
Característica
n
%
Feminino
528
60,1
Masculino
350
39,9
Solteiro
463
52,7
União consensual/casado
387
44,1
Separado/viúvo
28
3,2
Nenhum
262
33,9
Ensino Fundamental
471
60,9
Ensino Médio
39
5,1
Ensino Superior
1
0,1
< 1 salário
660
75,2
1 salário
168
19,1
≥ 2 salários
50
5,7
Média de Idade (dp) 28,3 anos (19,9)
Sexo
Estado Civil
Grau de Instrução*
Renda Familiar
Tabela 1 – Características dos 878 afro-descendentes estudados da
comunidade Kalunga do Estado de Goiás
Ocupação**
Lavrador
399
66,0
Do lar
88
14,5
Estudante
62
10,2
Outra
56
9,3
dp = desvio padrão
* Foram consideradas apenas crianças acima de 6 anos (n=773)
**Foram considerados apenas indivíduos acima de 14 anos (n=605)
4.2 Marcadores sorológicos e moleculares da infecção pelo vírus da hepatite B
na comunidade Kalunga
A Tabela 2 mostra a prevalência dos marcadores sorológicos para o vírus da
hepatite B na população estudada. Dos 878 indivíduos, 311 apresentaram
positividade para o anti-HBc, considerando marcador de exposição prévia, o que
resultou em uma prevalência global de 35,4% (IC 95% 32,3 - 38,7). Em 31,4% dos
indivíduos,
o
marcador
anti-HBc
estava
associado
ao
anti-
HBs, em 1,8% ao HBsAg e em 2,2% este marcador foi detectado isoladamente.
Em 301 (34,3%) indivíduos, verificou-se positividade isolada ao marcador antiHBs, sugerindo imunidade ao HBV.
Por outro lado, em 266 pessoas (30,3%), nenhum marcador para hepatite B
foi detectado, sendo estas, portanto, consideradas susceptíveis à infecção pelo
HBV.
Tabela 2- Prevalência dos marcadores sorológicos para o vírus da
nos 878 indivíduos da comunidade kalunga
Categoria
Marcadores sorológicos
Positivo
n
%
hepatite B
IC 95%a
Infectados
a
Anti-HBc
Anti-HBc/HBsAg
Anti-HBc/Anti-HBs
Total (Anti-HBc)
19
16
276
311
2,2
1,8
31,4
35,4
1,3 - 3,4
1,1 - 3,0
28,4 - 34,6
32,3 - 38,7
Vacinados
Anti-HBs
301
34,3
31,2 - 37,5
Suscetíveis
Ausência de marcador
266
30,3
27,3 - 33,5
IC: Intervalo de confiança
Ao analisar a distribuição da positividade isolada ao anti-HBs, de acordo com
a faixa etária, observou-se que a maioria dos soropositivos era crianças menores 10
anos (76,4%). Em indivíduos com 11-20 anos, um índice de 65,1% foi verificado,
seguido de um declínio para 10,3% na faixa etária de 21-30 anos, chegando ao
índice de 1% naqueles com idade superior a 40 anos (Figura 20).
A prevalência do marcador anti-HBc, segundo a faixa etária, também está
representada na Figura 20. Verificou-se uma curva ascendente com o aumento de
idade. Em crianças com até 10 anos, a positividade foi de 7,4% havendo um
aumento gradativo nos demais grupos de idade, atingindo o índice de 64,6% em
indivíduos com idade superior a 40 anos.
80%
70%
60%
50%
Anti-HBc (+)
40%
Anti-HBs (+)
30%
20%
10%
0%
≤ 10
11-20
21-30
31-40
41-50
>50
Figura 20 - Prevalência para os marcadores anti-HBs e anti-HBc de acordo com
faixa etária da comunidade Kalunga, Goiás.
A Tabela 3 mostra os dados sorológicos e moleculares das 16 amostras
HBsAg positivas. Somente duas amostras (12,5%) foram HBeAg reagentes, 12
(75%) foram anti-HBe positivas e as outras duas foram negativas para ambos os
marcadores. O HBV DNA esteve presente em 75% (12/16) das amostras HBsAg
reagentes. Após a realização da genotipagem (RFLP), o genótipo A foi encontrado
em 11 amostras (91,6%), sendo todas pertencentes ao padrão AI. Em uma amostra
HBV DNA positiva, não foi possível determinar o genótipo pela técnica empregada,
tendo em vista que a mesma foi fracamente positiva.
Tabela 3 - Características sorológicas e moleculares das 16 amostras HBsAg
positivas
a
Amostra
HBeAg
Anti-HBe
HBV DNA
Genótipoa
K-752
K -753
K -187
K -272
K -275
K -305
K -397
K -407
K -552
K -610
K -629
K -812
K -53
K -755
K -181
K -306
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
(Padrão)
A (AI)
A (AI)
A (AI)
A (AI)
A (AI)
A (AI)
A (AI)
A (AI)
ND
A (AI)
A (AI)
A (AI)
-
Padrão de RFLP, ND: não determinado
4.3 Fatores de risco associados à infecção pelo vírus da hepatite B
A Tabela 4 apresenta a análise univariada dos fatores de risco associados à
exposição ao HBV na população estudada, com seus respectivos intervalos de
confiança a 95%. Dentre os fatores analisados, o aumento da idade, analfabetismo,
história de parto realizado por parteiras da própria comunidade e relato de múltiplos
parceiros sexuais mostraram-se associados à infecção pelo HBV.
Tabela 4 - Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo
HBV em indivíduos da comunidade Kalunga
Fator de risco
HBV
%
Estimativa de risco
(IC 95%)a
Pos/Total
Idade (anos)
17/203
8,4
1,0
29/175
16,6
2,2 (1,1-4,3)
49/126
38,9
6,9 (3,6-13,5)
65/131
49,6
10,8 (5,7-20,7)
62/96
64,6
19,9 (10,0-40,4)
89/143
62,2
18,0 (9,5-34,5)
178/528
33,7
1,0
133/350
38,0
1,2 (0,9-1,6)
144/511
28,2
1,0
163/262
62,2
4,2 (3,1-5,8)
Não
253/724
34,9
1,0
Sim
43/113
38,1
1,1 (0,7-1,7)
Não
174/485
35,9
1,0
Sim
132/375
35,2
0,9 (0,7-1,3)
23/71
32,4
1,0
115/216
53,2
2,4 (1,3-4,2)
10/58
17,2
278/556
50,0
Não
239/486
49,2%
Sim
39/70
55,7%
≤ 10
11-20
21-30
31-40
41-50
>50
Sem informação 04
Sexo
Feminino
Masculino
Analfabetismo*
Não
Sim
História de hepatite na família
Sem informação 41
Compartilhamento de objetos de uso pessoal
Sem informação 18
Parto realizado por parteira da comunidade**
Não
Sim
Múltiplos parceiros sexuais***
Não
Sim
Doença Sexualmente Transmissível (DST)***
1,0
4,8 (2,4-9,7)
1,0
1,3 (0,8-2,1)
Sem informação 58
IC: Intervalo de Confiança
*Foram excluídos indivíduos menores de 6 anos (n = 773)
Após análise multivariada, ajustada para variáveis confundidoras, verificou-se
**Foram incluídas apenas mulheres que já tiveram filhos (n=287)
***Foram
indivíduos
que manteve-se
relataram atividade
sexual
(n=614)
que o incluídos
aumento
da idade
como
fator
associado à infecção pelo HBV.
a
Além disso, observou-se que os afro-descendentes do sexo masculino mostraram
uma chance de exposição ao vírus da hepatite B de 1,4 (IC 95% 1,0-2,0) vezes
superior em relação àquelas do sexo feminino. Os analfabetos apresentaram um
risco de 2,1 (IC 95% 1,4-3,1) vezes maior de infecção pelo HBV do que aqueles que
tinham algum grau de instrução. Para os indivíduos com história de múltiplos
parceiros sexuais, a chance de aquisição do HBV foi 2,4 (IC 95% 1,1-5,7) vezes
maior do que aqueles que não relataram essa característica (Tabela 5).
Tabela 5 - Análise multivariada dos fatores de risco associados à infecção pelo
HBV em indivíduos da comunidade Kalunga
Estimativa de risco (IC 95%a )
Fatores de risco
P
Não Ajustada
Sexo b
Feminino
Masculino
Ajustada
1,0
1,2 (0,9-1,6)
1,0
1,4 (1,0-2,0)
0,03
1,0
2,2 (1,1-4,3)
6,9 (3,6-13,5)
10,8 (5,7-20,7)
19,9 (10,0-40,4)
18,0 (9,5-34,5)
1,0
1,4 (0,7-2,9)
4,3 (2,1-8,6)
5,3 (2,6-10,5)
8,6 (4,1-18,2)
6,4 (3,0-13,3)
0,35
0,00
0,00
0,00
0,00
Analfabetismob
Não
Sim
1,0
4,2 (3,1-5,8)
1,0
2,1 (1,4-3,1)
0,00
Múltiplos parceiros sexuaisb
Não
Sim
1,0
4,8 (2,4-9,7)
1,0
2,4 (1,1-5,7)
0,04
Parto com parteirac
Não
Sim
1,0
2,4 (1,4-4,2)
1,0
1,6 (0,8-3,3)
0,18
Idade (anos)b
≤10
11-20
21-30
31-40
41-50
> 50
a
b
IC 95%: Intervalo de confiança; ajustado por sexo, idade, analfabetismo e múltiplos parceiros
sexuais; C ajustado por idade, analfabetismo e múltiplos parceiros sexuais.
4.4 Prevalência de infecção oculta pelo HBV
A pesquisa de infecção oculta para o vírus da hepatite B foi realizada em 295
amostras reagentes ao anti-HBc. O HBV DNA foi detectado em cinco destas
Tabela 6 - Características de risco relatadas pelos cinco indivíduos que
apresentaram infecção oculta pelo HBV na comunidade Kalunga
amostras, sendo todas anti-HBc/anti-HBs positivas e pertencentes ao genótipo A
(padrão AI), o que resultou numa prevalência de 1,7% para infecção oculta em
indivíduos
anti-HBc
reagentes
na
comunidade
estudada.
Ao
verificar
as
características dos cinco indivíduos que apresentaram infecção oculta para o HBV
(Tabela 6), observou-se que todos eram adultos, sendo dois do sexo feminino e três
do masculino. Eles relataram características de risco como história de hepatite na
família e/ou múltiplos parceiros sexuais, e não receberam a vacina contra hepatite B.
Amostra
Idade
Sexo
Características de risco
K-60
20
Feminino
Hepatite na família
Vacinação contra
HBV
Não
K-69
40
Masculino
Hepatite na família
Não
Múltiplos parceiros sexuais
K-530
30
Feminino
Múltiplos parceiros sexuais
Não
K-586
41
Masculino
Múltiplos parceiros sexuais
Não
K-654
63
Masculino
Múltiplos parceiros sexuais
Não
4.5 Análise filogenética da região Pré-S/S
Foi possível seqüenciar a região pré-S/S em nove das doze amostras HBV
DNA positivas, sendo todas elas pertencentes ao genótipo A, subgenótipo Aa. Com
a representação destas amostras na árvore filogenética, observou-se que cinco
foram agrupadas em dois subclusters (Figura 21). O primeiro foi formado pelos
isolados K-407 e K- 397 e, no segundo, agruparam-se os isolados K-752, K-753, K812 do HBV.
k-407
k-397
k-272
k-305
k-629
k-753
k-752
k-812
k-187
- Brasil
U55222-Brazil
- Somália
AY934771-Somalia
Aa
- Brasil
AY344101-Brazil
- Brasil
AY344105-Brazil
- África do
Sul
AY233283-South
Africa
83
AF297625-South
Africa
- África do
Sul
- Bélgica
AF090842-Belgium
55
M57663-Philippines
- Filipinas
- Bélgica
AF090838-Belgium
AJ309369-France
- França
Ae
93
A
- Polônia
Z35717-Poland
- África do
Sul
AY233286-South
Africa
90
66
AY344098-Brazil
- Brasil
- Estados Unidos
X02763-USA
AJ012207-Germany
- Alemanha
80
AF297624-South
Africa
- África do
Sul
AF090839-Belgium
- Bélgica
76
- Camarões
AJ605036-Cameroon
99
0.03
0.02
G
AF160501-France
- França
B
- China
AF282918-China
C
- Japão
V00867-Japan
D
- Itália
X65257-Italy
E
X75664-West
- OesteAfrica
Africano
F
- Brasil
X69798-Brazil
H
AY090457-Nicaragua
- Nicarágua
0.01
0.00
Figura 21 - Árvore filogenética da região pré-S/S do HBV, incluindo nove isolados de afro-descendentes da comunidade
Kalunga (K) e 25 seqüências do GenBank dos genótipos A a H (o número de acesso e o país de origem estão indicados).
5. DISCUSSÃO
Mundialmente, a infecção pelo vírus da hepatite B permanece como um grave
problema de saúde pública, não só pelos altos índices de prevalência, mas
essencialmente por ser uma das principais causas de doença hepática
aguda/crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. Essa infecção é uma das três
principais causas de morte na África e Ásia (Lavanchy 2005). No território brasileiro,
os índices de positividade aumentam no sentido sul/norte, sendo preocupantes os
dados do Ministério da Saúde, que estimam que cerca de 15% da população
brasileira já teve contato com esse vírus (Brasil 2005).
Estudos epidemiológicos abordando a distribuição da hepatite B em
populações são pouco freqüentes em nossa região e têm sido praticamente
limitados a grupos específicos. Embora os indivíduos que participaram deste estudo
apresentassem
características
específicas,
como
o
fato
de
serem
todos
descendentes de africanos, considera-se que esta é uma investigação que buscou a
representatividade de uma população, sendo composta por ambos sexos e com
participação de indivíduos de todas as faixas etárias. Além disso, merece destaque o
fato de que este trabalho se constitui no primeiro estudo sobre a infecção pelo vírus
da hepatite B em afro-descendentes que vivem em comunidade isolada no Estado
de Goiás, somando-se ao pequeno contingente de estudos sobre essa infecção na
população quilombola do Brasil (Motta-Castro et al. 2003, Motta-Castro et al. 2005).
Neste estudo, foi observada diferença na distribuição da população em
relação ao sexo, com predomínio do feminino (60,1%). A média de idade dos
Kalungas foi de 28,3 anos, sendo que aproximadamente 50% da população
apresentaram idade inferior a 20 anos. Estas características foram semelhantes às
encontradas na população de afro-descendentes que vivem em comunidades
isoladas em Mato Grosso do Sul (Motta-Castro et al. 2005). O predomínio de
mulheres e jovens, dentre os Kalungas estudados, pode representar a realidade da
maioria das comunidades rurais brasileiras, onde muitos adultos, principalmente os
homens, se deslocam para região urbana à procura de melhorias, como emprego
e/ou educação.
A escolaridade da comunidade Kalunga mostrou-se baixa, pois a maioria
cursou apenas o ensino fundamental (60,9%), bem como um índice expressivo de
analfabetismo (33,9%) foi verificado. Ainda, foi detectado um baixo nível
socioeconômico, em que grande parte da população possuía renda inferior a um
salário mínimo. A atividade ocupacional exercida pela maioria dos indivíduos era o
trabalho na lavoura. A comunidade Kalunga vive basicamente da agricultura de
subsistência, tal como a população estudada em Mato Grosso do Sul (Motta-Castro
et al. 2005). Além disso, a comunidade possui condições de higiene precárias, e
suas casas não apresentam banheiro, esgoto, água encanada e energia elétrica.
Estudos realizados na África mostraram uma variação na taxa de positividade
para o HBsAg de 9 a 20% (Richard-Lenoble et al. 1995, Kiire 1996, Mulders et al.
2004). No presente estudo, a prevalência de 1,8% observada para este marcador,
indicando infecção presente, embora seja menor que o índice encontrado na África,
foi maior que o verificado previamente em doadores de sangue no Estado de Goiás
(0,8%; IC 95%: 0,7-0,9) (Martelli et al. 1999).
Entretanto, a prevalência para o HBsAg verificada nos Kalungas foi próxima
às encontradas em indivíduos procedentes da área rural na Região Amazônica
(4,3%; IC 95%:1,9 - 4,7) (Braga et al. 2005), no Vilarejo Ranchão, em Mato Grosso
(3%; IC 95%: 2,0-4,0) (Souto et al. 2001b) e em Cavunge, na Bahia (2,6%; IC 95%:
1,9-3,5) (Almeida et al. 2006), bem como à relatada por Motta-Castro et al. (2005)
(2,2%; IC 95%: 1,4-3,2) em afro-descendentes de comunidades isoladas em Mato
Grosso do Sul.
A prevalência global da infecção pelo HBV, calculada pela positividade para o
marcador anti-HBc, foi de 35,4%, sendo maior que a reportada em doadores de
sangue no Estado de Goiás (10,7%; IC 95%: 10,4-10,9) (Martelli et al. 1999). Por
outro lado, na África, onde muitos países são considerados endêmicos para a
hepatite B, essa prevalência assume valores maiores, variando de 31,4% a 90%
(Martinson et al. 1998, Miller et al. 1998, André 2000, Karim et al. 2001, Mulders et
al. 2004).
Considerando populações rurais brasileiras, a prevalência global encontrada
no presente estudo se assemelha à mostrada por Souto et al. (2001b) em Mato
Grosso (31%; IC 95%: 27,0-34,0), mas foi superior à taxa verificada por Almeida et
al. (2006) (9,8%; IC 95%: 8,3-11,4), que realizaram um estudo em uma população
rural que contou com 84,6% de indivíduos afro-brasileiros. A prevalência global para
hepatite B na comunidade Kalunga também foi maior que a observada em afrodescendentes isolados de Mato Grosso do Sul (19,8%; IC 95%: 17,5-22,3) (MottaCastro et al. 2005).
De forma geral, a Região Centro-Oeste é considerada como área de
endemicidade baixa a intermediária, tendo em vista os índices de prevalência
encontrados para o marcador HBsAg (Souto 1999). Adicionalmente, os achados da
presente investigação indicam um padrão semelhante de endemicidade para a
comunidade estudada, considerando as categorias determinadas pela Organização
Mundial da Saúde (WHO 2004).
A positividade ao anti-HBc de acordo com a idade revelou que 7,4% das
crianças com até 10 anos de idade foram expostas ao HBV. Esse índice foi
semelhante ao verificado em uma comunidade rural de Mato Grosso (7,5%) (Souto
et al. 2001b) e nas comunidades quilombolas de Mato Grosso do Sul (8,1%) (MottaCastro et al. 2005). Estes dados refletem a aquisição da infecção pelo HBV no início
da vida, situação que é característica de regiões endêmicas (Alter 2003, Lavanchy
2004). Embora este resultado sugira a ocorrência da transmissão intrafamiliar ou
horizontal do HBV, não foram encontradas crianças com idade inferior a 5 anos com
positividade ao HBsAg, bem como mulheres gestantes com reatividade a esse
marcador. Sendo assim, mais estudos são necessários para avaliar a ocorrência da
transmissão vertical do HBV na comunidade Kalunga. Além disso, alguns trabalhos
têm relatado que o contato próximo entre as crianças, o compartilhamento de
balas/doces e a presença de lesões da pele, como as provocadas por escabiose,
parecem favorecer a disseminação do HBV em comunidades fechadas (Leichtner et
al. 1981, Zuckerman 1990, Martinson et al. 1998, Brasil et al. 2003). Na época da
coleta de dados e amostras sanguíneas deste estudo, todas essas características
foram observadas na comunidade Kalunga.
Merece ainda destaque que em outra parcela da população, alvo da
campanha de vacinação para hepatite B (os adolescentes), a prevalência para o
HBV foi de 16,6 %, sendo superior ao índice encontrado por Oliveira et al. (2006) em
Goiânia (5,9%). Ainda, a prevalência global da infecção pelo HBV, segundo a faixa
etária, demonstrou que há tendência de crescimento da taxa de infecção
proporcionalmente ao aumento idade. Resultados semelhantes foram encontrados
em outros estudos realizados no Brasil (Braga et al. 2005, Motta-Castro et al. 2005,
Bertolini et al. 2006). Esta característica sustenta a impressão de que a maioria dos
Kalungas pode entrar em contato com o HBV, em algum momento de suas vidas e,
ainda, justifica a necessidade da expansão da estratégia de vacinação aos
indivíduos de todas as faixas etárias.
Aproximadamente 35% dos indivíduos estudados apresentaram positividade
isolada ao marcador anti-HBs, refletindo o índice de cobertura vacinal para hepatite
B na comunidade Kalunga. Este índice foi semelhante ao encontrado numa
população com grande número de afro-brasileiros no Acre (31%) (Viana et al. 2005),
superior ao encontrado na Bahia (6,8%) (Almeida et al. 2006) e nos afro
descendentes do Mato Grosso do Sul (9,1%) (Motta-Castro et al. 2005).
Ao estratificar este índice por faixa etária, observou-se que a maioria dos
vacinados era crianças com idade menor ou igual a 10 anos (76,4%) ou jovens
entre 11 e 20 anos de idade (65,1%). Estes percentuais são baixos, uma vez que,
considera-se como boa cobertura vacinal, quando 95% da população alvo
encontram-se imunizados (Brasil 2001). Por outro lado, nas demais faixas etárias
praticamente não foram observados indivíduos protegidos contra esta infecção.
Assim, notoriamente, a distribuição da infecção pelo HBV de acordo com a idade
assume valores inversamente proporcionais aos de vacinação prévia contra esta
doença.
No Brasil, a vacinação para hepatite B foi introduzida no Programa Nacional
de Imunização a partir do ano de 1998, sendo direcionada às crianças já no primeiro
ano de vida e, em 2001, foi estendida aos indivíduos com até 20 anos de idade.
Provavelmente, a longo prazo, essa intervenção diminuirá substancialmente o
número de indivíduos infectados e de portadores crônicos do HBV na comunidade
Kalunga, pois, apesar da dificuldade de acesso, observou-se que nos últimos anos
houve um grande esforço do serviço de saúde pública em imunizar esta população.
Entretanto, grande parte dos indivíduos
(30,3%; IC 95%: 27,3 - 33,5) não
apresentou positividade para nenhum marcador sorológico da hepatite B, revelando
um índice alto de pessoas ainda susceptíveis a esta infecção. Tais achados indicam
que ainda é necessário desenvolver estratégia de prevenção que considere as
peculiaridades de certos grupos populacionais, observando as dificuldades
geográficas, bem como as características sócio-culturais.
Quanto a distribuição da prevalência do anti-HBc em relação ao sexo,
verificou-se uma maior freqüência deste marcador em indivíduos do sexo masculino
(38%) do que no feminino (33,7%). O risco de infecção maior para o sexo masculino
foi reportado por outros autores (Lewis-Ximenez et al. 2002, Ferreira et al. 2006). Se
considerarmos que a hepatite B é uma importante doença sexualmente
transmissível (Russi et al. 2003) e o fato de que homens geralmente têm mais
chance de se tornarem portadores crônicos do HBV do que as mulheres (Szmuness
et al. 1978), estes achados podem refletir o importante papel do sexo masculino na
aquisição e disseminação da hepatite B na comunidade estudada. Como era de se
esperar, maiores freqüências de múltiplos parceiros sexuais (59,3%) e de doenças
sexualmente transmissíveis (18%) foram encontradas em indivíduos do sexo
masculino em relação ao feminino (9,7% e 9,2%, respectivamente - dados não
mostrados).
A via sexual parece ser um importante modo de disseminação do HBV na
comunidade Kalunga, já que essa população apresenta um gradiente crescente da
prevalência em relação à idade dos indivíduos. Confirmando esse achado, o
histórico de múltiplos parceiros sexuais permaneceu como um fator associado a
infecção pelo vírus da hepatite B, após a análise multivariada. De fato, vários
autores relatam que a atividade sexual tem sido apontada como uma das principais
causas de transmissão do HBV (Martelli et al.1990, Passos et al. 1992, Clemens et
al. 2000, Souto et al. 2001b, Hou et al. 2005).
Embora, na análise multivariada, a história de parto realizado por parteiras
não tenha permanecido como um fator associado à infecção pelo HBV, o resultado
da análise univariada sugere que a prática das parteiras nesta comunidade pode ser
uma importante rota de transmissão horizontal durante o período perinatal. Aliás, tal
procedimento é comum em comunidades rurais brasileiras. No ano da coleta de
dados deste estudo (2004), o Ministério da Saúde registrou 31 mil partos realizados
por parteiras tradicionais em todo o Brasil e, neste mesmo ano, as parteiras
Kalungas foram responsáveis pela maioria dos partos dessa comunidade (JB 2005).
Além disso, é bastante provável que o procedimento aconteça em condições de
higiene precária, sem paramentação adequada e com compartilhamento de objetos
entre indivíduos infectados e não infectados. Adicionalmente, a única parteira que
participou do estudo apresentou positividade ao marcador anti-HBc, evidenciando,
assim, exposição prévia ao HBV.
A transmissão intrafamiliar do HBV também pode ser sugerida nesta
investigação. Mais da metade da população Kalunga relatou que teve ou tem algum
parente próximo com hepatite. Além disso, a análise filogenética demonstrou a
formação de dois subclusters. O primeiro foi formado pelos isolados K-407 e K-397,
enquanto o segundo, pelos isolados K-752, K-753 e K-812. É interessante observar
que os indivíduos do primeiro subcluster eram dois irmãos, com 35 e 37 anos de
idade e ambos relataram o compartilhamento de objetos de higiene pessoal, como
cortador de unhas, barbeador e escova de dentes. Além disso, o pai destes dois
indivíduos apresentou positividade ao marcador anti-HBc e também referiu que já
compartilhou objetos de higiene pessoal em casa. Em relação ao segundo
subcluster, observou-se que os três indivíduos tinham idade de 8, 10 e 13 anos,
eram irmãs e duas delas apresentaram reatividade ao marcador HBeAg. Ainda,
notou-se características de risco comuns às três, como compartilhamento de objetos
de uso pessoal (cortadores de unhas e escovas de dente). De fato, alguns estudos
indicam uma forte influência do contato interpessoal entre familiares, principalmente
entre irmãos, na disseminação do HBV (Hsu et al. 1993, Brasil et al. 2003, Lobato et
al. 2006). Além disso, o compartilhamento de objetos de higiene (escovas de dente,
barbeador e toalhas de banho), hábito comum em populações pobres, foi observado
em freqüência elevada num estudo sobre transmissão intrafamiliar realizado no Acre
(Lobato et al. 2006).
Apesar de estudos moleculares realizados no Brasil reportarem a circulação
dos genótipos A, B, C, D e F, sendo A, D e F os mais prevalentes no País (Moraes
et al. 1996, De Castro et al. 2000, Teles et al. 2002, Araújo et al. 2004, Carrilho et al.
2004, Sitnik et al. 2004, Motta-Castro et al. 2005, Viana et al. 2005), apenas o
genótipo A foi detectado na comunidade Kalunga. Este genótipo, apesar de
apresentar distribuição mundial, é prevalente em certas partes da África (Bowyer et
al. 1997, Sugauchi et al. 2003b, Kimbi et al. 2004, Mulders et al. 2004).
Semelhantemente, o genótipo A foi dominante em comunidades isoladas de afrodescendentes de Mato Grosso do Sul (Motta-Castro et al. 2005). O mesmo foi
encontrado com maior freqüência em afro-descendentes na Venezuela, onde há
predomínio do genótipo F (Quintero et al. 2002).
A análise por RFLP mostrou que todos os isolados apresentaram o padrão AI.
Este padrão já foi identificado como do subgrupo A’ por Araújo et al. (2004),
correspondendo ao subgenótipo Aa (onde “a” indica procedência Africana ou
Asiática) (Sugauchi et al. 2004). Para confirmar estes dados, realizou-se a análise
filogenética da região Pré-S/S, que mostrou a presença do genótipo A, subgenótipo
Aa na comunidade Kalunga. Tais achados, sugerem a procedência africana para o
genótipo A, subgenótipo Aa, circulante no Brasil.
Embora o sequenciamento seja considerado como a técnica “padrão-ouro”
para caracterização molecular do HBV, neste estudo observou-se total concordância
entre amostras genotipadas por RFLP e sequenciamento. Estes resultados
demonstram ser a metodogia de RFLP indicada para caracterizar amostras do
genótipo A, principalmente no nosso País, onde este genótipo é prevalente (Teles et
al. 1998, Araújo et al. 2004, Motta-Castro et al. 2005, Viana et al. 2005). Além disso,
deve-se considerar que a técnica de RFLP é um procedimento mais simples,
acessível e com um custo menor em relação ao sequenciamento de DNA.
Dentre as 16 amostras HBsAg reagentes, os marcadores HBeAg e anti-HBe
foram encontradas em 12,5 % e 75% , respectivamente. O HBV DNA foi detectado
em todas as amostras reagentes ao HBeAg e também em 83% das anti-HBe
positivas. Alguns estudos sugerem que esse perfil ocorre devido a presença de
mutações específicas na região pré-core e promotor do core que podem afetar a
expressão do HBeAg nos isolados Aa (Ahn et al. 2003, Kimbi et al. 2004, Sugauchi
et al. 2004, Tanaka et al. 2004). Assim, mais estudos são necessários para
caracterizar possíveis mutações nessas regiões nos isolados Aa do HBV da
comunidade Kalunga que apresentam o fenótipo anti-HBe.
O genótipo E circula predominantemente no Oeste da África e parece ser
restrito a esse continente. Um estudo conduzido por Mulders et al. (2004) sugere
que o genótipo E tem um curto período de evolução histórica em humanos, o que
pode explicar a sua ausência no Brasil, apesar do tráfico de escravos só ter sido
extinto em nosso País em 1857. Esse genótipo não foi encontrado na comunidade
Kalunga, bem como nas comunidades afro-descendentes de Mato Grosso do Sul
(Motta-Castro et al. 2005). Por outro lado, o genótipo E foi reportado pela primeira
vez na Argentina em um estudo recente realizado com pacientes afro-descendentes
(Mathet et al. 2006). Esse dado sustenta a necessidade de realização de outros
estudos moleculares na América do Sul, principalmente nas demais comunidades
afro-descendentes no Brasil.
O emprego da biologia molecular e o aperfeiçoamento de algumas técnicas
quanto a sensibilidade tornaram possível esclarecer muitos aspectos virológicos da
infecção pelo HBV, inclusive contribuíram para demonstrar a ocorrência de infecção
oculta pelo vírus da hepatite B, situação onde o DNA deste vírus pode ser
encontrado no tecido hepático e/ou no sangue de indivíduos HBsAg negativos (Silva
et al. 2005a, Raimondo et al. 2007). Nesta investigação, uma taxa de infecção oculta
de 1,7% foi encontrada, sendo o HBV DNA detectado em cinco amostras anti-HBc e
anti-HBs reagentes. Esta prevalência está de acordo com os índices encontrados
em doadores de sangue no Brasil (0 a 4%) (Almeida Neto et al. 2001, Arraes et al.
2003, Gonçales Jr. et al. 2003, Silva et al. 2005a), bem como de outros países, onde
as taxas de infecção oculta são consideradas baixas (0 - 7,7%), como Alemanha
(Henning et al. 2002, Jilg et al. 2001), Estados Unidos (Kleinman et al. 2003) e
Venezuela (Gutiérrez et al. 1999). Além disso, a prevalência observada na
comunidade Kalunga está dentro da faixa reportada para amostras reagentes aos
marcadores anti-HBc e anti-HBs (0,5% a 15%) (Liu et al. 2006a).
As características de risco relatadas pelos indivíduos que apresentaram
infecção oculta pelo HBV como história de hepatite na família e/ou múltiplos
parceiros sexuais reforçam os dados da análise filogenética, que sugeriram a
ocorrência da transmissão intrafamiliar na comunidade Kalunga, bem como os
encontrados na análise dos fatores de risco, ao mostrar relato de múltiplos parceiros
sexuais como uma variável independentemente associada a infecção pelo HBV na
população estudada.
Diante dos resultados encontrados neste estudo, pode-se inferir que os
fatores de risco, bem como outros dados epidemiológicos associados a análise
filogenética, apontam a importante participação da transmissão horizontal (sexual e
intrafamiliar) do vírus da hepatite B na comunidade Kalunga. Além disso,
considerando o grande contingente de indivíduos susceptíveis a esta infecção, fazse necessária a implementação de medidas que reforcem a educação em saúde,
bem como a ampliação das estratégias de vacinação na população estudada.
6. CONCLUSÕES
♦ A prevalência global da infecção pelo HBV de 35,4% foi superior ao
encontrado em comunidades quilombolas em Mato Grosso do Sul,
indicando
uma
endemicidade moderada para hepatite B
nessas
comunidades;
♦ Após análise multivariada, fatores como aumento da idade, analfabetismo
e relato de múltiplos parceiros sexuais permaneceram associados à
infecção pelo HBV na comunidade Kalunga, o que corrobora os dados
encontrados em outras comunidades quilombolas no Brasil Central;
♦ O DNA viral foi detectado, como esperado, na maioria das amostras
HBsAg (75%; 12/16) e HBeAg (100%; 2/2) reagentes. Outrossim, em 83%
(10/12) das amostras anti-HBe positivas, sugerindo a presença de
mutações na região pré-core e promotor do core, que afetam a expressão
do HBeAg, o que justifica o perfil anti-HBe associado ao DNA HBV;
♦ O índice de 1,7% para infecção oculta nos indivíduos anti-HBc reagentes
está dentro da variação encontrada em outros estudos no Brasil, o que
retrata o estado de portador do HBV mesmo na ausência do marcador
HBsAg e, consequentemente a possibilidade de transmissão viral;
♦ O genótipo A (padrão AI) foi o único encontrado em todas as amostras
genotipadas por RFLP, sendo a presença deste, confirmada pelo
sequenciamento (subgenótipo Aa), sugerindo que o mesmo foi introduzido
no Brasil durante o tráfico de escravos da África;
♦ Este estudo contém informações importantes sobre a prevalência para
todos os marcadores do HBV, que refletem o índice de indivíduos
infectados, imunes e susceptíveis à hepatite B, bem como os fatores de
risco para essa infecção na comunidade Kalunga. Além disso, fornece
dados moleculares que permitem inferir a procedência africana para os
isolados do HBV na população estudada. Estes resulltados poderão
subsidiar a reestruturação das medidas de controle e prevenção da
hepatite B na comunidade Kalunga.
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ANEXO:
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA
HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE COMUNIDADE ISOLADA DO
ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS).
Data:___/___/____
Nº__________
Nome:____________________________________________________________
Agente de Saúde:__________________________________________________
Local_____________________________________________________________
Sexo: Feminino (1)
Masculino (2)
Idade:
Estado Civil: Solteiro (1)
Casado (2)
Outro (3)
Nome do Pai:______________________________________________________
Nome da Mãe:_____________________________________________________
Nome Esposa (o): __________________________________________________
Nº de filhos: __________
Filho (s): _________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Nºpessoas/Lar:______________
Profissão:___________________
Grau de Instrução:__________________________
Nenhum (1)
1º Grau (2)
2º Grau (3)
3º Grau (4)
Renda Familiar:
< 1 salário
(1)
1 salário (2)
2 a 4 salários (3)
5 salários (4)
Teve Icterícia ou hepatite anterior?
Não (1)
Hepatite na família?
Sim(2)
Não (1)
Caso afirmativo: Irmão (1)
Pai(2)
Filho (a) (5)
Outro (6)
S/inf.(9)
Sim(2)
Mãe(3)
S/inf.(9)
Esposo(a)(4)
Antecendentes de:
a) Doença(s):____________________________________________
b) Hospitalização:
Não(1)
Sim(2)
S/inf.(9)
Caso afirmativo: Por que?___________________________ ano?________
c) Cirurgia:
Não(1)
d) Hemotransfusão:
Sim(2)
Não(1)
Sim(2)
S/inf.(9)
S/inf.(9)
nº Transfusão________
Ano da primeira transfusão_____________________________
e) Parto normal
Não(1)
Sim(2)
S/inf.(9)
Parteira?
Não(1)
Sim(2)
S/inf.(9)
f) Contato com sangue de outra pessoa?
Não (1)
Sim (2)
S/inf.(9)
g) Compartilhamento de objetos pessoais? Não (1)
Sim(2)
S/inf.(9)
Qual? Lâmina/navalha (1)
Escova (2)
h) Tratamento dentário:
Não (1)
Outros (3) qual?_________
Sim (2)
S/inf. (9)
Nº de parceiros: ______________________
DST: ______________________________________________________
Vacina contra Hepatite B:
Sim (1)
Não (2)
Caso afirmativo: Nº doses__________
Resultados:
HBsAg:
SNR (1)
Reagente (2)
Anti-HBc Total:
SNR (1)
Reagente (2)
Anti-HBs:
SNR (1)
Reagente (2)
HBeAg:
SNR (1)
Reagente (2)
Anti-HBe:
SNR (1)
Reagente (2)
S/inf. (9)
DNA-HBV:
Negativo (1)
Genótipo:_____
RFLP(
Positivo (2)
) Sequenciamento (
)
Observações:________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________________________________________________
Artigo (no prelo)
Matos MAD, Reis NRS, Kozlowski AG, Teles SA, Motta-Castro ARC, Mello FCA,
Gomes SA, Martins RMB. Epidemiological Study of Hepatitis A, B and C in the
Largest Afro-Brazilian Isolated Community.Transactions of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene (2008) 102.
Epidemiological Study of Hepatitis A, B and C in the Largest
Afro-Brazilian Isolated Community
Running title: Hepatitis A, B and C in Afro-Brazilian
Márcia A. D. Matos a, Nádia Rúbia S. Reis a, Aline G. Kozlowski a, Sheila A. Teles b, Ana
Rita C. Motta-Castro c, Francisco C.A. Mello d, Selma A. Gomes d, Regina M.B. Martins a,*
a
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás (UFG),
Caixa Postal 131, CEP 74605-050, Goiânia, Goiás, Brazil
b
c
Faculdade de Enfermagem, UFG, Goiânia, Goiás, Brazil
Departamento de Farmácia Bioquímica, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul,
Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil
d
Departamento de Virologia, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
_________________________________
*Corresponding author.
Phone: +5562-32096129 Fax: +5562-35211839 E-mail address: rbringel@ terra.com.br
(R.M.B. Martins)
Summary
This study was conducted to estimate the prevalence and molecular epidemiological features
of viral hepatitis A, B and C in the Kalunga population, which represents the largest AfroBrazilian isolated community. Among 878 individuals studied, the overall
prevalence of
anti-HAV was 80.9%, with a significant rise from 44.8% to near 100% between the first and
fourth decade of life. Rates for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibody to hepatitis
B core antigen (anti-HBc) of 1.8% and 35.4%, respectively, were found. Increasing age, male
gender, illiteracy and history of multiple sexual partners were associated with hepatitis B
virus (HBV) infection. An occult HBV infection rate of 1.7% (5/295) was found among antiHBc-positive individuals. HBV genotype A (subtype Aa) was dominant in this community.
Only 5/878 individuals (0.6%) were positive for anti-hepatitis C virus (HCV). HCV RNA was
detected in three of them, who were infected with genotype 1 (subtype 1a). These findings
point out high, intermediate and low endemicity for hepatitis A, B and C, respectively, in the
Kalunga community in Brazil. Circulation of HBV genotype A (subtype Aa) in this AfroBrazilian isolated community indicates the introduction of this virus during the slave trade
from Africa to Brazil.
KEYWORDS
Hepatitis A virus;
Hepatitis B virus;
Hepatitis C virus;
Afro-Brazilian;
Prevalence;
Genotypes
1. Introduction
Viral hepatitis A, B and C occur throughout the world. However, there are marked
geographical differences with regard to the epidemiological patterns and health impact of the
respective infections (Lavanchy, 2002). The endemicity of hepatitis A virus (HAV) infection
varies between developed and developing countries (Jacobsen and Koopman, 2004). In
Brazil, although hepatitis A is considered an endemic infection, some studies have shown a
shift from high to intermediate endemicity in HAV infection epidemiological pattern,
especially in south and southeast regions. Furthermore, within this country seroprevalence
rates may vary by age, socioeconomic status, urbanisation level and access to clean water as
sanitation facilities (Vitral et al., 2006).
Despite of a highly effective vaccine, hepatitis B virus (HBV) infection is still a
significant health concern in the world. In Western countries, HBV infection is acquired
primarily in adulthood, whereas it occurs perinatally or in childhood in Africa and Asia where
chronic hepatitis B is common (Lavanchy, 2004). Current HBV infection is commonly
diagnosed by the presence of hepatitis B surface antigen (HBsAg). However, HBV DNA has
been detected in blood or liver of HBsAg-negative individuals. This condition is called occult
HBV (Chemin and Trépo, 2005). HBV has been classified into eight genotypes (A to H),
which have a characteristic geographical distribution (Allain, 2006). In Brazil, the prevalence
of HBV infection is heterogeneous, with the highest rates in Western Amazon region
(Martelli et al., 1999; Viana et al., 2005). Genotypes A, D and F predominate in this country,
whilst genotypes B and C have been detected at a very low prevalence (Araujo et al., 2004;
Sitnik et al., 2004; Viana et al., 2005). Similarly, hepatitis C virus (HCV) infection prevalence
and genotypes (1-6) have distinct geographical distributions (Prati, 2006; Simmonds et al.,
2005). In Brazil, anti-HCV prevalence in blood donors varied from 0.3% in Santa Catarina
state, South region, to 5.9% in Amazon region (da Fonseca and Brasil, 2004; Rosini et al.,
2003). In the five Brazilian geographical regions, genotype 1 has been the most frequently
detected (Campiotto et al., 2005).
The Brazilian population is descendant mainly from European colonisers, Africans,
and Amerindians. African individuals were introduced to Brazil by slave trade. Some of them
escaped from gold mines or farms, settling in remote valleys. These runaway-slave
descendants stayed in culturally and isolated communities, called quilombos, without
significant additional admixture since their establishment. Nowadays, there are 1137
communities whose history and tradition allows them to be identified as remnants of
quilombos. The Kalunga community, which is located in Central Brazil, is considered the
largest Afro-Brazilian isolated community. The epidemiological status of HAV, HBV and
HCV infections of this community remains unknown. The objective of this study was to
evaluate the prevalence and epidemiological features of the viral hepatitis A, B and C among
the Kalunga population in Brazil.
2. Materials and methods
2.1. Study population
The Kalunga community occupies an area of approximately 237000 hectares in the
northeast of the State of Goiás, Central Brazil, and is located near the cities of Cavalcante,
Monte Alegre and Teresina de Goiás, with an estimated population of 3000 individuals. The
Kalungas live in very poor conditions in remote settlements in the mountains on both sides of
the Paraná River, on slopes and in valleys, called Vãos. All of the area occupied by the
Kalungas was officially recognised by the state government in 1991 as an Historical Site and
the Kalungas are preserved as Patrimônio Cultural Kalunga. Figure 1 shows the geographical
location of this community.
In a pilot study, rates of 80%, 30%, and 0.5% were found for HAV, HBV, and HCV
infections, respectively. In this study, to evaluate the prevalence for these infections, the
studied sample was estimated according to the size of population (3000 inhabitants) and on
the basis of an expected HCV prevalence of 0.5%. In accordance with these data, the
minimum sample size necessary would be 855 individuals. Thus, the present study included
878 randomly selected individuals living in the Kalunga community. Informed consent was
obtained from all participants (or their parents for children). Between May and July 2004,
participants were interviewed regarding demographic characteristics, HBV vaccination and
risk factors known to be associated with hepatitis transmission. Blood samples were collected
from all individuals and sera were stored at -20ºC.
The population ranged in age from <1 to 88 years (average 28.3 years). There were
528 females and 350 males. The majority of these individuals had low socioeconomic (95%
reported income ≤ one Brazilian minimum wage/month, approximately US$ 165) and
education levels (34% were illiterate, 61% had < 8 years and 5% had >8 years of schooling),
poor hygiene and crowded conditions. Also, the majority of them lived basically on
subsistence agriculture or cattle-raising, and their houses had no sewage system and tap water
service.
2.2. Serological tests
All serum samples were tested by ELISA for the presence of anti-HAV antibodies
(total anti-HAV), HBsAg, antibody to hepatitis B core antigen (anti-HBc), antibody to
hepatitis B surface antigen (anti-HBs) and hepatitis C antibody (anti-HCV). Total anti-HAV-
positive samples were submitted to IgM anti-HAV detection (Hepanostika Uni-form Organon
Teknika B.V., Boxtel, The Netherlands). Anti-HCV-positive samples were re-tested for
confirmation using a line immunoassay (INNO-LIATM HCV Ab III; Innogenetics, Ghent,
Belgium).
2.3. Detection of viral nucleic acid and genotyping
2.3.1 HAV RNA - As none of the study participants showed serological evidence of acute or
recent of hepatitis A infection, testing for HAV RNA was not performed.
2.3.2 HBV DNA – HbsAg-and anti-HBc-positive samples were submitted to DNA extraction
using phenol/chloroform following treatment of 250 µl of serum with 0.5 mg/ml of Proteinase
K in the presence of 0.2 M NaCl and 0.25% sodium dodecyl sulphate, for 4 h at 37ºC (Niel et
al., 1994). After precipitation with ethanol, the pellet was dried and re-suspended in 30 µl of
distilled water. A previously developed genotyping method (Araujo et al., 2004), based on
PCR amplification of the preS/S region and subsequent RFLP analysis, was used with some
modifications (Motta-Castro et al., 2005). Briefly, the first round of PCR was performed with
1 µl of DNA in a final volume of 50 µL using a mixture of one sense primer (PS1:
5’-CCATATTCTTGGGAACAAGA-3’, nucleotide positions 2826-2845) and two antisense
primers
(S2
5’-GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA-3’,
819-841;
and
S22:
5’-GTATTTAAATGGATACCCACAGA-3’, 819-841). The second round of amplification
was performed with 1µL of the first round PCR product, with sense primer PS1 and antisense
primer SR (5’-CGAACCACTGAACAAATGGC-3’, 685-704), generating a fragment of
about 1099 bp in length. Ten microliters of PCR products were digested separately with
BamHI, EcoRI and StuI restriction endonucleases. Digestion products were analysed in 2%
agarose gel electrophoresis.
HBV DNA-positive samples by PCR-RFLP genotyping were further submitted to
amplification of the entire preS/S region using a semi-nested PCR assay. This region was first
amplified with external primers P01 (5’ – GGA CTC ATA AGG TGG GGA A-3’, sense,
2470-2488) and S2/S22. The second round was performed using sense primer PS1 and
antisense primers S2/S22. The HBV DNA amplification for the sequencing procedure
included the following steps for the first and second round: initial denaturation of samples at
94°C for 3 min, followed by 30 cycles each of denaturation at 95°C for 30s, annealing at 52°C
for 40s and extension at 72°C for 2 min. The final extension was at 72°C for 7 min. PCR
products (50 ul) were loaded onto 2% agarose gel. DNA bands were extracted from the
agarose gel and purified using the Kit WizardR SV Gel and PCR Clean-up System (Promega,
Madison, WI, USA). Nucleotide sequences of preS/S region were determined by direct
nucleotide sequencing reaction in both directions using BigDye R Terminator Kit (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) with specific internal HBV primers PS1, S4 (5’-TGC
TGC TAT GCC TCA TCT TCT-3’, sense, 416 – 436), PS2 (5’-GGT CCC CAG TCC TCG
AGA AG-3’, antisense, 143-124) and S2, as well as (when necessary) the primers PS4
(5’-ACA CTC ATC CTC AGG CCA TGC AGT G-3’, sense, 3194-3218), S2, S4, and S7 (5
´-TGA GCC AGG AGA AAC GGG CT-3´, antisense, 676 – 656). Sequencing reactions were
performed on an ABI 373 automated sequencer (Applied Biosystems). Bioinformatic analysis
of the sequences was performed using the University of Wisconsin Genetic Computer Group
package. A Neighbour-joining phylogenetic tree was drawn and rearranged using the Mega
program version 3 (Kumar et al., 2004).
2.3.3 HCV RNA – All ELISA anti-HCV positive samples were submitted to RNA extraction,
reverse transcription and a nested PCR with primers complementary to the conserved area of
the 5’ NC region of HCV, essentially as described by Ginabreda et al. (1997). HCV
genotyping was determined in all HCV RNA-positive samples. A line probe assay (InnoLiPA HCV II; Innogenetics) was used to determine the genotype in the amplicons of the 5’
NC region according to the procedure described by the manufacturer.
In HBV DNA and HCV RNA detection, to avoid cross-contamination between
samples standard precautions were used in all manipulations. Separate areas were used for
reagents, samples and manipulation of amplified products.
2.4. Statistical analysis
The χ2 test and χ2 for trend were undertaken to evaluate risk factors associated with
HBV infection (defined as anti-HBc positivity). Statistical significance was assessed at
P=0.05 in all analyses. Risk factors, first estimated by odds ratio in univariate analysis, were
subsequently analysed by multiple logistic regression to identify possible confounders.
Statistical evaluations were performed using EpiInfo (CDC, Atlanta, GA, USA).
3. Results
An overall anti-HAV prevalence of 80.9% (95% CI 78.1 - 83.4%) was found among
the Kalunga population. Figure 2 shows the prevalence of anti-HAV in different age groups.
There was a significant association for increasing anti-HAV positivity with increasing age,
rising from 44.8% in the 0-10 years age group to 83.4% among the 11-20 year-old Kalungas,
reaching near 100% in those >30 years (χ2 = 224.9; P < 0.001).
Of the 878 individuals, 16 (1.8%) were positive for HBsAg and anti-HBc, 19 (2.2%)
were anti-HBc-positive only and 276 (31.4%) had anti-HBs and anti-HBc markers, resulting
in an overall anti-HBc prevalence of 35.4% (95% CI 32.3-38.7%). Isolated anti-HBs was
detected in 301 persons (34.3%) who reported vaccination. The prevalence of anti-HBc in
different age groups is shown in Figure 3. There was a significant association for increasing
anti-HBc positivity with increasing age, which revealed that 7.4% of the 0-10-year-old
Kalungas were infected by HBV. This rate increased to 16.6% among those 11-20 years old,
with further rises to 38.9% and 49.6% among 21-30 year-old and 31-40-year-old groups,
respectively. The seroprevalence reached 62.2% in the 41-50-year-old group and was 64.6%
among those >50 years (χ2 = 5.9; P = 0.01). On the other hand, a decrease was observed for
anti-HBs positivity with increase age (Figure 3). Among the 0-10 year-old and 11-20-year-old
groups, 76.4% and 65.1% had anti-HBs and reported hepatitis B vaccination, decreasing to
10.3%, 4.6% and 1% in the other age groups, respectively.
Analysis of all risk factors studied showed that age, illiteracy, history of multiple
sexual partners and delivery with traditional birth attendants were significantly associated
with HBV positivity by univariate analysis. However, multivariate analysis revealed that male
gender, increasing age, illiteracy and history of multiple sexual partners were independently
associated with HBV infection in this population (Table 1).
HBV DNA was detected in 12/16 (75%) HBsAg-positive serum samples. Of these, 11
(91.6 %) HBV DNA-positive samples were successful genotyped by RFLP. All belonged to
genotype A (AI RFLP pattern). Nucleotide sequencing of the preS/S region was successful
performed in 9 of the 11 isolates previously genotyped by PCR-RFLP. Phylogenetic analysis
was performed, including the 9 HBV sequences determined in this study and 25 additional
sequences available from GenBank. Figure 4 shows a phylogenetic tree which confirmed that
nine Kalungas isolates belonged to genotype A, subtype Aa. Among them, two subclusters
were observed: the first was constituted by two HBV isolates (K-407 and K-397) from
members of the same family and the other by three isolates (K-753, K-752 and K-812) from
members of another family.
All only anti-HBc positive samples were HBV DNA-negative. Five anti-HBs-and antiHBc-positive samples were HBV DNA-positive (genotype A, AI RFLP pattern), resulting in
an occult HBV infection rate of 1.7% (5/295) among anti-HBc-positive individuals.
With respect to HCV infection, only 5/878 (0.6%, 95% CI 0.2-1.4%) were anti-HCVpositive. These individuals ranged in age from 12 years to 74 years. Three were males and
two females. HCV RNA was detected in three of them, who were infected with genotype 1,
subtype 1a.
4. Discussion
The present study is the first report on the epidemiology of HAV, HBV and HCV
infections in the largest Afro-Brazilian isolated community, which constitutes a useful
approach to evaluate future improvements in health and sanitation standards. The anti-HAV
prevalence found in the Kalunga community was similar to that obtained in urban and rural
isolated Afro-descendant communities in the State of Mato Grosso do Sul, Central Brazil
(75.6%) (Kozlowski et al., 2007). In these populations, low income, low educational level,
crowding and lack of access to safe drinking water and sanitation facilities are associated with
increased HAV seroprevalence. Also, the age-specific anti-HAV prevalence profile found in
the Kalunga community (Figure 2) was similar to the pattern observed in areas with high
endemicity (Jacobsen and Koopman, 2004). Thus, improvements in education and sanitary
conditions in this community are a priority to change this pattern as well as to prevent other
enterically transmitted infections.
The proportions of anti-HBc and HBsAg markers in this Afro-Brazilian isolated
community were lower than those observed in Africa (56-98% and 5% to ≥ 20%,
respectively) (Custer et al., 2004; Kew, 1996; Kiire, 1996; Mulders et al., 2004), but higher
compared with rates found in local blood donors (10.7% and 0.8%, respectively) (Martelli et
al., 1999). With reference to other Afro-Brazilian isolated communities, although a similar
HBsAg prevalence (2.2%) was reported by Motta-Castro et al. (2005) in the State of Mato
Grosso do Sul, Central Brazil, a lower anti-HBc prevalence (19.8%) was shown in those
communities of African origin.
The age-specific anti-HBc prevalence profile showed that 7.4% of the children under
10 years were exposed to HBV. Many studies have demonstrated that maternal transmission
during the perinatal or early childhood period as well as horizontal transmission that occurs as
a consequence of close contact between family members are important routes of HBV spread,
especially in communities with poor hygiene conditions and low socio-economic and
education levels (Dumpis et al., 2001; Kew, 1996; Silveira et al., 1999; Stuver et al., 1997).
Intrafamilial transmission of HBV was also indicated in the Kalunga community by
phylogenetic tree analysis, in which two subclusters were observed. The first was constituted
by HBV isolates (K-407 and K-397) from two brothers (aged 35 and 37 years) whose father
was anti-HBc positive, whilst the other (K-752, K-753 and K-812) was from three sisters
(aged 8, 10 and 13 years, respectively) whose mother was anti-HBc positive. Additionally, in
this community delivery with traditional birth attendants is also an important route of
horizontal transmission during the perinatal period, as suggested by univariate analysis of risk
factors. It is most likely that this procedure occurred in poor hygienic conditions, with sharing
of ancillary supply equipment such as scissors between infected and non-infected individuals.
The anti-HBc prevalence increased with age, suggesting that sexual activity may
contribute to horizontal spread of this infection among adults in the Kalunga community. In
fact, history of multiple sexual partners was significantly associated with HBV infection.
Male gender also seemed to play an important role in the acquisition of HBV infection. These
findings are in accordance with other Brazilian studies (Lewis-Ximenez et al., 2002; Silveira
et al., 1999).
Although only HBV isolates of genotype A were detected in the studied population,
other genotypes (B, C, D and F) circulate in Brazil (Araújo et al., 2004; Sitnik et al., 2004;
Viana et al., 2005). Genotype A has been shown to be prevalent in certain parts of Africa
(Bowyer et al., 1997; Kimbi et al., 2004; Mulders et al., 2004). Of note, only this genotype
was found in other Afro-Brazilian isolates communities (Motta-Castro et al., 2005) and was
also detected in Afro-Venezuelan groups at a frequency higher than in the general population
of Venezuela, where genotype F is dominant (Quintero et al., 2002). In this study, all HBV
isolates showed the same RFLP pattern (AI), which was identified previously as subgroup A’
(Araújo et al., 2004) or subtype Aa (‘a’ standing for Africa/Asia) (Sugauchi et al., 2004).
Additionally, phylogenetic analysis of the preS/S region confirmed the presence of genotype
A, subtype Aa in the largest Afro-Brazilian isolated community, which may be result of the
displacement of African population during the slave trade that occurred from the 16th to 19th
centuries.
The present study provides the first data on the prevalence of occult HBV infection in
a community-based population in Brazil. Although no similar reports are available for
comparative purposes, the proportion found among the anti-HBc-positive individuals in the
Kalunga community was within the range of occult HBV infection rates reported among antiHBc-positive blood donors in Brazil (0-4%) (Almeida Neto et al., 2001, Gonçales Jr et al.
2003).
Although Brazil included the hepatitis B vaccine in the childhood immunisation
schedule in 1998 and this vaccine has also been recommended and offered free of charge to
all individuals under 20 years old since 2001, one-third of this target population in the
Kalunga community did not reported HBV vaccination. This finding emphasises the need for
additional health education programmes to improve the HBV vaccination coverage in this
target group.
The anti-HCV prevalence found in this study was lower than that observed previously
in local blood donors (1.4%) (Martins et al., 1994), but comparable with those reported in
other Brazilian rural populations (0-1.7%) (Ferrari et al., 1999; Silva et al., 1995). These data
show that HCV infection has a low endemicity in rural populations in Brazil.
In conclusion, our findings point out high, intermediate and low endemicity for
hepatitis A, B and C, respectively in the Kalunga community in Brazil. This investigation also
demonstrates the circulation of HBV genotype A, subtype Aa, indicating a common
introduction of this virus during the slave trade from Africa to Brazil. However, owing to the
large extension of Brazilian territory, further studies in remnants of quilombos from other
geographical regions are needed to design appropriate and effective prevention and control
strategies for this target population.
Authors’ contributions: SAT, ARCMC and RMBM designed the study protocol; MADM,
NRSR, AGK, SAT, ARCMC and RMBM carried out the interview and blood collection;
MADM, NRSR and AGK carried out the serological tests, detection of viral nucleic acid and
genotyping; FCAM and SAG carried out the nucleotide sequencing and phylogenetic
analysis; SAT carried out the statistical analysis. MADM and RMBM
drafted the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. MADM and
RMBM are guarantors of the paper.
Acknowledgments
The authors are grateful to the members of the Kalunga community who agreed to
participate in this study, and to the public authorities and health workers of the city of
Cavalcante, State of Goiás, Brazil, for their local support help. We acknowledge Ágabo M.C.
Silva, Laura B. Nascimento, Marcos A. Matos, Michelle D.S. Oliveira, Nara R. Freitas,
Renata C. Ferreira and Viviane R. Tavares for their technical assistance. We are grateful to
the sequencing group of the PDTIS program of Fundação Oswaldo Cruz for performing the
DNA sequencing.
Funding: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, Brazil
(Ref. No. 504628/2003-8).
Conflicts of interest: None declared.
Ethical approval: Ethical Committee of the Federal University of Goiás, Goiânia city, Goiás
state, Brazil (Ref. No. 64/2003)
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for hepatitis A in Brazil, 1980-2002 – A review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 119-127.
Figure 1 Geographical location of the Kalunga community (black).
Seroprevelence (%)
Age groups (years)
Figure 2 Age-specific seroprevalence rates of hepatitis A virus antibodies among Kalungas in
Brazil.
Seroprevalence (%)
Figure 3 Prevalence of antibodies to hepatitis B core antigen (anti-HBc) and hepatitis B surface antigen
HBs) among Kalungas in Brazil according to age.
Age groups (years)
(anti-
Table 1 Logistic regression model with variables associated with hepatitis B virus infection in the
univariate analysis in the Kalunga community, Brazil
Variable
Crude
OR (95%CI)
Adjusted
OR (95% CI)
1.0
1.2 (0.9-1.6)
1.0
1.4 (1.0-2.0)
0.03
1.0
2.2 (1.1-4.3)
6.9 (3.6-13.5)
10.8 (5.7-20.7)
19.9 (10.0-40.4)
18.0 (9.5-34.5)
1.0
1.4 (0.7-2.9)
4.3 (2.1-8.6)
5.3 (2.6-10.5)
8.6 (4.1-18.2)
6.4 (3.0-13.3)
0.35
0.00
0.00
0.00
0.00
Illiteracya
no
yes
1.0
4.2 (3.1-5.8)
1.0
2.1 (1.4-3.1)
0.00
Multiple sexual partnersa
no
yes
1.0
4.8 (2.4-9.7)
1.0
2.4 (1.1-5.7)
0.04
Delivery with traditional
birth attendants b
no
yes
1.0
2.4 (1.4-4.2)
1.0
1.6 (0.8-3.3)
0.18
Gendera
female
male
Age (years)a
≤10
11-20
21-30
31-40
41-50
≥ 50
OR: odds ratio.
a
adjusted by gender, age, illiteracy and multiple sexual partners.
b
adjusted by age, illiteracy and multiple sexual partners.
P-value
k-407
k-397
k-272
k-305
k-629
k-753
k-752
k-812
k-187
U55222-Brazil
Aa
AY934771-Somalia
AY344101-Brazil
AY344105-Brazil
AY233283-South Africa
83
AF297625-South Africa
AF090842-Belgium
55
M57663-Philippines
AF090838-Belgium
AJ309369-France
Ae
93
A
Z35717-Poland
AY233286-South Africa
90
66
AY344098-Brazil
X02763-USA
AJ012207-Germany
80
AF297624-South Africa
AF090839-Belgium
76
AJ605036-Cameroon
99
0.03
0.02
G
AF160501-France
B
AF282918-China
C
V00867-Japan
D
X65257-Italy
E
X75664-West Africa
F
X69798-Brazil
H
AY090457-Nicaragua
0.01
0.00
Figure 4 Phylogenetic tree analysis of the pre-S/S region of 9 hepatitis B virus (HBV) isolates
from this study (K=Kalunga), as well as 5 Brazilian HBV isolates and 20 GenBank sequences of
genotypes A to H (accession number countries of origin are indicated).