Jander Torres da Silva

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
PERFIL DE CITOCINAS EM MULHERES GRÁVIDAS COM MALÁRIA POR
Plasmodium vivax, ACOMPANHADAS NA FUNDAÇÃO DE MEDICINA
TROPICAL DO AMAZONAS
JANDER TORRES DA SILVA
MANAUS
2007
ii
JANDER TORRES DA SILVA
PERFIL DE CITOCINAS EM MULHERES GRÁVIDAS COM MALÁRIA POR
Plasmodium vivax, ACOMPANHADAS NA FUNDAÇÃO DE MEDICINA
TROPICAL DO AMAZONAS
Dissertação
Programa
de
apresentada
Pós
Graduação
ao
da
Universidade do Estado do Amazonas, para
obtenção do grau de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Profª. Drª. Maria das Graças Costa Alecrim
Co-orientadora: Profª. Drª. Flor Ernestina Martinez Espinosa
MANAUS
2007
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
SILVA, Jander Torres
Perfil de citocinas em mulheres grávidas com malária por Plasmodium
vivax acompanhadas na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
/ Jander Torres da Silva – Manaus – AM: UEA; FMTAM, 2007.
xiii
79 pág. Ilus.
Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas
1. Malária 2. Citocinas 3. Interleucinas 4. Grávidas 5. Imunidade
I. Título
iv
DEDICATÓRIA
Ao senhor Deus, criador de todo o universo
e responsável pela nossa existência.
Aos meus pais, Antonio e Raimunda, o meu
mais profundo agradecimento pelos
ensinamentos da vida.
À minha esposa, Cacilda e aos nossos filhos
Larissa, Laura e Mauricio pela compreensão
nos momentos difíceis e abstinência do
nosso lazer.
A todos os meus amigos que me
incentivaram em mais essa jornada de
vitória na minha vida.
v
AGRADECIMENTOS
•
•
•
•
•
À Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA),
À Universidade do Estado do Amazonas (UEA),
À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM),
À Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (FHEMOAM).
À Fundação Muraki.
Pelo apoio financeiro e institucional para a realização deste trabalho cientifico.
Meus agradecimentos a todos que de maneira direta ou indireta, estiveram
envolvidos na colaboração deste estudo. Minha mais profunda gratidão e
compreensão a todos:
o Prof. Dr. Sinésio Talhari, Diretor-Presidente da FMTAM.
o Profa. Dra. Maria das Graças Costa Alecrim, Orientadora deste estudo.
o Profa. Dra. Flor Ernestina Matinez Espinosa, Co-orientadora deste
estudo.
o Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa, Coordenadora do curso de
Mestrado e Doutorado em Doenças Tropicais e Infecciosas.
o Profa. Dra. Adriana Malheiro, pelo seu conhecimento e apoio técnico
nas dosagens das citocinas.
o A todos os professores e funcionários do curso, em especial à
secretária Conceição.
o A Gerência de Epidemiologia da FMTAM, em especial ao Sr. Raul e a
amiga e colega de mestrado Graça Saraiva, pelas pesquisas
epidemiológicas.
o Aos meus colegas de mestrado pela oportunidade de convivência e
troca de informações cientificas durante o tempo em estivemos na sala
de aula.
o Minhas colegas mestras e bioquímicas pesquisadoras da Gerência de
Malária: MSc. Eva Batista, MSc. Mônica Manso, e em especial as
MSc. Ana Ruth e MSc. Yionne Cheuhan, cujo apoio nas pesquisas e
revisões dos dados foram fundamentais para o termino deste.
o Aos colegas bioquímicos da Gerência de Diagnóstico: Geraldo Majela,
Amarildo Felipe, Rogério Lobo e Sandro Morete pelo apoio na minha
ausência durante o curso, em especial ao meu chefe e amigo
MSc. Felipe Sardinha pelo apoio nas pesquisas.
vi
o Aos colegas bioquímicos da Gerência de Virologia: Bosco e Julita pela
colaboração técnica.
o A todos os técnicos e auxiliares da Gerência de Diagnóstico e Gerência
de Malária da FMTAM, em especial as colegas Socorro Pontes, Erika
Pinto, Elizabeth Vital, Andreza Cordeiro, Luciana Orêncio, Rosemary,
Marli Marques, Eckner Lessa e Juarez Nery.
o As acadêmicas e estagiárias do curso de farmácia-bioquímica que
colaboraram na triagem das amostras: Pricila Lima, Susy Caroline,
Sabrina Silva e Lisele Brasileiro.
o Ao biólogo Daniel e a biomédica Tatiane da FHEMOAM pelo apoio nas
técnicas de dosagens das citocinas.
o As bibliotecárias da FMTAM, Sra. Melke e Sra. Artemiza pelo apoio na
revisão literária.
o A todas as pacientes deste estudo, que de maneira anônima,
contribuíram para o aprimoramento da pesquisa e nosso
conhecimento.
o E a todos aqueles, funcionários ou não da FMTAM, que em algum
momento nos abordaram com uma palavra de incentivo pela conclusão
deste trabalho.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Figura 27
Figura 28
Figura 29
Figura 30
Figura 31
Distribuição global da malária por endemicidade............................
Incidência parasitária anual (IPA) no Amazonas.............................
Ciclo evolutivo dos plasmódios .......................................................
Maquete do Pronto Atendimento da FMTAM...................................
Técnica de coloração da gota espessa ...........................................
Punção digital ..................................................................................
Gota espessa e estendido sangüíneo .............................................
Punção venosa ................................................................................
Lavadora e leitora de ELISA ...........................................................
Esquema de diluições dos padrões (BD OptEIATM ) .................................
Equipamento PENTRA 120 para hemograma ................................
Equipamento DADE X-Pand para dosagens bioquímicas ..............
Distribuição da coleta das 194 amostras no D0 e D35 ...................
Episódios de malária durante a coleta das 194 amostras
analisadas no D0 e D35 ..................................................................
Sintomas clínicos da infecção malárica observados no D0 ............
Distribuição dos episódios de evolução da malária segundo os
dias de sintomas .............................................................................
Distribuição das pacientes segundo o estado obstétrico no
momento da coleta nas 194 amostras analisadas no D0 e D35 .....
Comparação dos títulos de citocinas presentes nas amostras do
D0 e D35 .........................................................................................
Comparação da média dos níveis de citocinas em pacientes
primoinfectadas e as com mais de uma infecção ...........................
Distribuição dos níveis de citocinas nas amostras coletadas no D0
segundo a freqüência de gravidez ..................................................
Correlação da densidade parasitária e a concentração de
citocinas nas amostras coletadas no D0 .........................................
Correlação da evolução dos sintomas em dias e a concentração
de citocinas .....................................................................................
Correlação do número de episódios anteriores de malária e a
concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 .............
Correlação da paridade e a concentração de citocinas nas
amostras coletadas no D0 ...............................................................
Correlação da amenorréia distribuída em semanas de gravidez e
a concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 ..........
Correlação da hemoglobina e a concentração de citocinas nas
amostras coletadas no D0 ...............................................................
Correlação da glicose e a concentração de citocinas nas
amostras coletadas no D0 ...............................................................
Correlação da creatinina e a concentração de citocinas coletadas
nas amostras do D0 ........................................................................
Correlação da bilirrubina total e a concentração de citocinas
coletadas nas amostras do D0 ........................................................
Correlação entre a bilirrubina direta e a concentração de citocinas
coletadas nas amostras do D0 ........................................................
Correlação da bilirrubina indireta e a concentração de citocinas
coletadas nas amostras do D0 ........................................................
2
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57
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
Distribuição da casuística no D0 (n=160) dos episódio de malária
por P.vivax em mulheres grávidas atendidas na FMTAM ...............
Distribuição dos níveis das citocinas segundo as concentrações
encontradas .....................................................................................
Distribuição qualitativa de citocinas em 194 amostras analisadas
no D0 (n=160) e D35 (n=34) ...........................................................
Comparação da média das citocinas em 194 amostras analisadas
no D0 (n=160) e D35 (n=34) ...........................................................
Média das citocinas entre as 160 amostras coletadas em grávidas
(n=146) e não grávidas (n=14) ........................................................
Comparação da média das citocinas entre os 160 episódios de
malária em pacientes primoinfectadas (n=22) e as que relataram
mais de uma infecção (n=138) ........................................................
Média das citocinas nas 160 amostras analisadas no D0 entre
primíparas (n=45) e multíparas (n=115) ..........................................
Resumo das correlações positivas e negativas nas 160 amostras
de citocinas analisadas no D0 ........................................................
38
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42
42
43
43
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58
ix
LISTA DE ABREVIAÇÕES
APC
CEP
CNK
EDTA
ELISA
FACS
FMTAM
GCSA
HCG
ICAM-1
IL
IL-1
IL-2
IL-6
IL-8
IL-10
INF-γ
IPA
IRN
IRO
LPS
OMS
OPAS
PCR
PCR
QBC
SNC
T CD4+
T CD8+
TCLE
TGB-β
Th1
Th2
TNF-α
TNF-α R
TNF-α R Hu
Célula Apresentadora de Antíngeno
Comitê de Ética em Pesquisa
Células Natural Killer
Ácido Dietilamino
Ensaio de Imunoadsorção Ligado à Enzima
Separação de células ativada por fluorescência
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Glycosaminoglycan Chondrointin Sulfate A
Hormônio do crescimento
Molécula de adesão intercelular tipo 1
Interleucinas
Interleucina 1
Interleucina 2
Interleucina 6
Interleucina 8
Interleucina 10
Interferon gama
Índice Parasitário Anual
Intermediários Reativos de Nitrogênio
Intermediários Reativos do Oxigênio
Lipopolissacarideos
Organização Mundial de Saúde
Organização Pan-Americana de Saúde
Proteína C Reativa
Reação em Cadeia da Polimerase
Quantitative Buffy Coat
Sistema Nervoso Central
Linfócitos T auxiliares tipo CD4+
Linfócitos T auxiliares tipo CD8+
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Fator beta transformador do crescimento
Células T auxiliares tipo 1
Células T auxiliares tipo 2
Fator de Necrose Tumoral alfa
Fator de Necrose Tumoral alfa Recombinante
Fator de Necrose Tumoral alfa Recombinante em Humanos
x
RESUMO
A malária na gravidez pode ter conseqüências tanto para a mãe quanto para
o feto, como predispor o aumento da anemia materna e o nascimento de crianças
com baixo peso. O mecanismo pelo qual a malária exerce esses efeitos ainda é
pouco conhecido, contudo a secreção de citocinas está elevada na placenta de
mulheres com malária no momento do parto, quando comparados com placentas de
mulheres grávidas sem malária. Na gravidez o plasmódio produz certas substâncias
como a hemozoína, a qual ativa os macrófagos a liberarem citocinas. Essas
citocinas parecem estar associadas com o crescimento retardado intra-uterino, mas
sem comprometimento no parto. Contudo através de mecanismos imunológicos
ocorre a produção de citocinas tanto pró-inflamatórias quanto antiinflamatórias. O
objetivo deste estudo foi avaliar o perfil e a concentração dos níveis séricos de
citocinas TNF-α, IL-6, IL8 e IL-10, em grávidas infectadas por P.vivax atendidas e
acompanhadas na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. É um estudo
descritivo, prospectivo, de série de casos com coleta de amostras sanguíneas de
grávidas infectadas com malária por P.vivax, onde as amostras coletadas no dia de
inicio do tratamento, chamado dia zero (D0) e no dia 35 (D35), após o inicio do
tratamento, sendo este grupo de autocontrole com diagnóstico negativo para
malária. As dosagens foram realizadas pelo método ELISA e os resultados
correlacionados com o D0 e D35; densidade parasitaria; episódios anteriores da
doença malárica e exames hematológicos e bioquímicos. No período de março a
agosto/2006, foram processadas 194 amostras procedentes de 112 mulheres que
apresentaram 160 episódios de malaria por P. vivax. Essas 112 mulheres tinham
uma média de idade de 23,8 ± 2,7 anos e sua paridade média foi de 2,7 ± 2
gestações. Os resultados das citocinas tiveram correlação estatisticamente
significativa com D0 quando comparadas com o D35, exceto o TNF-α. Também
mostrou uma significância estatística com a densidade parasitária, evolução dos
sintomas clínicos e os exames laboratoriais, exceto a glicose e a hemoglobina que
não tiveram significância estatística. Na literatura científica, existem atualmente
poucas pesquisas correlacionando a produção de citocinas em grávidas infectadas
por P. vivax, especialmente na região Amazônica. No presente estudo, foi
encontrado resultados de significância estatística entre os níveis de citocinas e a
fisiopatogenia da malária durante a gravidez, esses resultados podem contribuir para
uma melhor compreensão da imunidade e conduta clínica no tratamento de grávidas
que adquirem esta infecção.
Palavras chaves: malária, plasmódio, citocinas, gravidez, Amazônia.
xi
ABSTRACT
The malaria in the pregnancy can have consequences so much for the mother
as for the fetus, how to predispose the increase of the maternal anemia and the
children's birth with low weight. The mechanism for which the malaria exercises
those effects is still little known, however the cytokines secretion is elevated in the
women's placenta with malaria in the moment of the childbirth, when compared with
pregnant women's placentas without malaria. In the pregnancy the Plasmodium
produces certain substances as the hemozoine, which activates the macrofage
liberate cytokines. Those cytokines seem to be associated with the intra-uterine
growth, but without compromising in the childbirth. However, through immunological
mechanisms it happens the pro-inflammatory as anti-inflammatory production of so
much cytokines. The objective of this study was to evaluate the profile and the
concentration of the levels cytokines serum TNF-α, IL-6, IL8 and IL-10, in pregnant
infected by P.vivax assisted and accompanied in the Foundation of Tropical Medicine
of Amazon. It is a study descriptive, prospective, of series of cases with collection of
pregnant sanguine samples infected with malaria by P.vivax, where the samples
collected in the day of begin the treatment, called day zero (D0) and on the day 35
(D35), after begin of the treatment, being this self-control group with negative
diagnostic for malaria. The dosages were accomplished by the method ELISA and
the results correlated with D0 and D35; parasite density; episodes previous of the
disease malárica and hematological and biochemical exams. In the period of March
the agosto/2006, were processed 194 samples coming from 112 women that
presented 160 malaria episodes for P. vivax. Those 112 women had an average of
age of 23,8 ± 2,7 years and medium parity was of 2,7 ± 2 gestations. The results of
the cytokines had correlation significant statistically with D0 when compared with
D35, except TNF-α.
It also showed a statisticaly significant with the parasitic
density, evolution of the clinical symptoms and the exams laboratorys, except the
glucose and the hemoglobin that didn't have statisticaly significant. In the scientific
literature, they exist few researches currently correlating the cytokines production in
pregnant infected by P.vivax, especially in the Amazonian area. In the present study,
was found results of statisticaly significant between the cytokines levels and the
fisiopatogenia of the malaria during the pregnancy, those results can contribute to a
better understanding of the immunity and clinical conduct in the treatment of
pregnant that acquire this infection.
Key words: Plasmodium, malaria, cytokines, pregnancy, Amazonian.
xii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................
1.1 Malária ..............................................................................................................
1.1.1 Aspectos gerais ...........................................................................................
1.1.2 Aspectos epidemiológicos ...........................................................................
1.1.3 Malária em grávidas ....................................................................................
1.2 Transmissão .....................................................................................................
1.3 Ciclo biológico do plasmódio humano ..............................................................
1.4 Manifestações clínicas......................................................................................
1.5 Diagnóstico .......................................................................................................
1.6 Fisiopatologia da malária ..................................................................................
1.7 Citocinas ...........................................................................................................
1.7.1 Propriedades gerais das citocinas ................................................................
1.7.2 Interleucina-6 (IL-6) ......................................................................................
1.7.3 Interleucina-8 (IL-8) – Quimiocina ................................................................
1.7.4 Interleucina-10 (IL-10) ..................................................................................
1.7.5 Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) .......................................................
1.8 Resposta imune na malária ..............................................................................
1.9 Resposta imune na gravidez ............................................................................
1.10 Resposta imune na gestante com malária ....................................................
1.11 Malária na gravidez e citocinas .....................................................................
01
01
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25
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 28
2.1 Geral ................................................................................................................. 28
2.2 Específicos ....................................................................................................... 28
3. METODOLOGIA ...............................................................................................
3.1 Tipo de estudo ..................................................................................................
3.2 Local de estudo ................................................................................................
3.3 Critérios de elegibilidade ..................................................................................
3.4 Aspecto ético ....................................................................................................
3.5 Recursos financeiros ........................................................................................
3.6 Tamanho da amostra e controle .......................................................................
3.7 Coleta e armazenamento de amostras ............................................................
3.8 Densidade parasitária .......................................................................................
3.9 Determnação de citocinas: TNFα, IL-6, IL-8, IL-10 ..........................................
3.9.1 Técnica de ELISA utilizada para determinação das citocinas ......................
3.10 Exames hematológicos ..................................................................................
3.11 Exames bioquímicos ......................................................................................
3.12 Análise estatística ...........................................................................................
29
29
29
30
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30
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35
4. RESULTADOS ...................................................................................................
4.1 Descrição da casuística ....................................................................................
4.2 Análise do perfil de citocinas TNFα, IL-6, IL-8, IL-10 no D0 e D35 ..................
4.3 Correlação da densidade parasitária e a concentração de citocinas ...............
4.4 Correlação da evolução dos sintomas em dia e concentração de citocinas ....
4.5 correlação do número de episódios anteriores de malária e a concentração
de citocinas .............................................................................................................
36
36
40
47
48
49
xiii
4.6 Correlação da paridade e a concentração das citocinas ................................
4.7 Correlação da duração da amenorréia medida em semanas de gravidez e a
concentração de citocinas .....................................................................................
4.8 Correlação de hemoglobina e a concentração de citocinas ............................
4.9 Correlação da glicose e a concentração de citocinas .....................................
4.10 Correlação da creatinina e a concentração de citocinas ...............................
4.11 Correlação das bilirrubinas e a concentração de citocinas ...........................
4.12 Resumo dos resultados .................................................................................
50
5. DISCUSSÃO .....................................................................................................
59
6. CONCLUSÃO ...................................................................................................
67
51
52
53
54
55
58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 68
8. ANEXOS ...........................................................................................................
75
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Malária
1.1.1 Aspectos gerais
A malária é uma das doenças parasitárias mais antigas do mundo. Por muitos
anos, acreditava-se que ela era causada pelo ar dos pântanos e brejos, daí o nome
“mau ar”. Somente em 1880, o médico francês Charles Alphonse Laveran descobriu,
na Argélia, o seu agente infeccioso, identificando o parasito como o coccideo
Plasmodium. Em 1886, o inglês Ronald Ross relatou a fêmea do mosquito do
gênero Anopheles como o vetor responsável pela transmissão da doença,
descrevendo o ciclo do parasito no estômago do mosquito, dando início ás
investigações que levaram ao conhecimento das espécies de protozoários
esporozoários intracelulares que causam a malária humana: Plasmodium vivax (P.
vivax); Plasmodium falciparum (P. falciparum); Plasmodium malariae (P. malariae) e
Plasmodium ovale (P. ovale) (Garnham e Duggan, 1986).
A doença continua sendo um problema de Saúde Pública, causa prejuízos
sociais e econômicos nos países endêmicos e em desenvolvimento. É considerada
uma doença infecciosa, não contagiosa, com manifestações clínicas de caráter
agudo. Ao longo das últimas décadas, o P. vivax e P. falciparum vem modificando o
seu comportamento tanto no aspecto molecular de resistência do parasito às drogas
antimaláricas, quanto nos aspectos clínicos da doença (Alecrim, 1981; Alecrim,
2000).
1.1.2 Aspectos epidemiológicos
Das quatro espécies de plasmódios que acometem o homem, o P. vivax é a
espécie de maior distribuição geográfica nas zonas tropicais e subtropicais do globo.
O P. falciparum, comparado às outras espécies, ocasiona maior morbidade e
mortalidade, possuindo uma ampla distribuição mundial. No Brasil as espécies que
causam
a
doença são
predominantemente
o
P.
vivax e
respectivamente, e eventualmente o P. malarie (Brasil, 2006).
P.
falciparum
2
A doença malárica encontra-se amplamente disseminada nas regiões
tropicais e subtropicais, especialmente nas zonas quentes e pantanosas,
representando uma das mais importantes causas de morbidade na África, Ásia,
América do Sul e Oceania. Atualmente a doença é endêmica em 107 países, áreas
consideradas de risco para transmissão da malária, onde mais de 40% destes
encontram-se na África Sub-Saariana (Figura 1). Estima-se que anualmente entre
350 a 500 milhões pessoas adquirem a doença com mais de um milhão de mortes
no mundo, principalmente crianças menores de cinco anos de idade, para estes
dodos os países africanos contribuem com mais de 60% dos casos (WHO, 2005).
Figura 1: Distribuição global da malária por endemicidade (Fonte: WHO, 2005)
A malária não é distribuída de forma homogênea em muitos países
endêmicos além da fronteira do Brasil, existindo ainda áreas com pouca ou
nenhuma incidência da doença. Durante o ano de 2005 o Brasil notificou
aproximadamente 55% dos casos de malária em toda América do Sul, estando na
região Amazônica brasileira a maior concentração. Os 45% restantes foram
atribuídos aos países de fronteira como a Colômbia, Peru, Bolívia, Guianas e
Venezuela (PAHO, 2005).
3
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o Brasil possui áreas de
alto, médio e baixo risco de transmissão da malária (WHO, 2006). Em 2006 foram
registrados, no país, 537.594 casos, sendo 133.130 (24,8%) por P. falciparum,
395.773 (73,6%) por P. vivax e 8.471 (1,6%) por malária mista (P. falciparum e
P. vivax). Na Amazônia brasileira ocorrem 99,8% do total de casos registrados no
país (Brasil, 2007). Isso se justifica pelo fato da transmissão da malária ser
influenciada por projetos de colonização, áreas de garimpos e ocupações
desordenadas na periferia de áreas urbanas nos municípios em desenvolvimento
(AMAZONAS/FMTAM, 2005). A maioria dos casos está atualmente distribuída nos
Estados do Amazonas, Rondônia e Pará, que, juntos, foram responsáveis por
aproximadamente 88% de todos os casos na Amazônia no ano de 2006
(Brasil, 2007).
É uma região que apresenta condições ecológicas e socioeconômicas que
favorecem a transmissão da malária, que se comporta como uma doença sazonal.
As condições climáticas, principalmente no verão, facilitam o aumento da densidade
vetorial e o desenvolvimento dos parasitos nos vetores, tendo como um dos
principais facilitadores as águas das chuvas, dos rios, igarapés, lagos, áreas de
garimpos e outras (Alecrim, 1981).
No Amazonas foram registrados 191.606 casos de malária em 2006, sendo
144.951 por P. vivax (75,6%); 43.264 (22,6%) por P. falciparum e 3.386 (1,8%) por
malária mista (P. falciparum e P. vivax). O município de Manaus contribuiu com
40.599 notificações, destes 7.415 (18,3%) por P. falciparum; 32.600 (80,4%) por
P. vivax e 524 (1,3%) por malária mista (P. falciparum e P. vivax) (Brasil, 2007).
Nesse mesmo período, a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
(FMTAM), localizada na cidade de Manaus, é uma instituição estadual para
pesquisa, diagnóstico e tratamento da doença, que atende, aproximadamente,
23,5% dos casos de malária em todo o município, notificou 9.546 casos, sendo
1.773 (18,6%) por P. falciparum; 7.705 (80,7%) por P. vivax e 68 (0,7%) por malária
mista (P. falciparum e P. vivax) (Brasil, 2007).
4
1.1.3 Malária em grávidas
A doença possui uma incidência maior entre os homens, fato que pode estar
vinculado a ocupações, como caça e pesca em áreas com presença do vetor;
construções de estradas e áreas de garimpos - atividades geralmente realizadas
pelo sexo masculino, no entanto, ocorre uma alta incidência em mulheres e crianças
que habitam áreas próximas ao habitat do vetor (Tauil, 1996). Em 2006 dos casos
confirmados de malária no Brasil, 334.327 (60,8%) foram em homens e
203.267(39,2%) foram em mulheres, deste total 10.476 casos de mulheres grávidas,
sendo 3.334 (31,8%) por P. falciparum; 6.916 (66,3%) por P.vivax e 226 (1,9%) por
malária mista (P.falciparum e P. vivax) (Brasil, 2007).
Do total de 191.606 casos registrados no Estado do Amazonas em 2006,
houve 60,8% casos para homens e 39,2% para mulheres. Nas grávidas foram
notificados 3.944 casos, sendo 1.111 (28,2%) por P. falciparum; 2.750 (69,7%) por
P.vivax e 83 (2,1%) por malária mista (P.falciparum e P. vivax). No mesmo ano de
2006 o município de Manaus registrou 35,8% do total do Estado, sendo 63,6% casos
positivos para homens e 36,4% para mulheres. Nas grávidas foram notificados 858
casos, sendo 190 (22,1%) com malária por P. falciparum; 657 (76,6%) por P. vivax e
11 (1,3%) por malária mista (P.falciparum e P. vivax). Em 2006 a FMTAM notificou
912 grávidas, destas 463 foram positivas para malária, sendo 139 (30,0%) por
P. falciparum; 317 (68,4%) por P. vivax e 7 (1,6%) por malária mista (P. falciparum e
P. vivax). Até o mês de Abril de 2007, a FMTAM registrou 261 grávidas destas 97
positivas para malária, sendo 20 (20,6%) por P. falciparum e 77 (79,4%) por
P. vivax (Brasil, 2007).
1.2 Transmissão
A transmissão natural da malária nos mamíferos ocorre por meio da picada da
fêmea do mosquito infectado do gênero Anopheles da classe Insecta, ordem Díptera
e família Culicidae. São hematófagas e necessitam de sangue para o
desenvolvimento e amadurecimento dos seus ovos, promovendo a transmissão de
diferentes espécies de plasmódios. Tem como criadouros preferenciais, águas
limpas, de baixo fluxo, quentes e sombreadas, situação muito comum na Região
Amazônica. No Brasil, o principal vetor da malária em humanos é o Anopheles
darlingi, que tem grande importância epidemiológica pela sua abundância e ampla
5
distribuição na Região Amazônica brasileira pelo seu alto grau de antropofilia e
endofagia. O Anopheles (N) aquasalis distribui-se pela faixa que vai do Amapá até o
norte de São Paulo (Forattini, 2002).
A influência do clima no habitat dos vetores facilita, profundamente, o
desenvolvimento do parasito no seu interior, quanto maior a umidade relativa do ar,
maior
será
a
longevidade
dos
mosquitos.
A
temperatura
ideal
para
o
desenvolvimento dos plasmódios humanos situa-se entre 20 e 30ºC e as maiores
densidades dos vetores encontram-se abaixo de 900m de altitude (Tauil, 1996).
Como os plasmódios estão presentes na circulação sanguínea durante a
infecção, a transmissão da malária, embora muito raramente, também pode ocorrer
a partir de transfusões de sangue, transplante de órgãos, utilização compartilhada
de seringas por usuários de drogas endovenosas e da gestante para o filho (malária
congênita) antes ou durante o parto. Em algumas ocasiões, um mesmo paciente
pode ser inoculado com mais de uma espécie do parasito, resultando em infecções
mistas (Martins et al., 2007). As infecções mais freqüentes na Amazônia legal são
pelas espécies P. vivax e P. falciparum, que representaram 1,8% dos casos
diagnosticados na FMTAM em 2006 (Brasil, 2007).
A Organização Mundial de Saúde classifica a endemicidade das áreas
maláricas em quatro tipos distintos (MacDonald, 1956):
-
Área hipoendêmica, quando o percentual de esplenomegalia entre crianças
de dois a nove anos (índice esplênico) é menor que 10%;
-
Área mesoendêmica, quando o índice esplênico situa-se entre 11 e 50%;
-
Área hiperêndemica, quando este índice situa-se entre 50 e 75% e é, assim,
elevado também entre os adultos;
-
Área holoendêmica, quando o índice esplênico é maior que 75%.
Atualmente, o indicador mais utilizado pela Organização Pan-americana de
Saúde (OPAS) é o Índice Parasitário Anual (IPA), um indicador de incidência, que é
a ocorrência de casos por 1.000 habitantes. Baixo risco são áreas onde o IPA é
inferior a 10, médio risco onde o IPA está entre 11 e 49 e alto risco onde o IPA é
igual ou superior a 50 (PAHO, 2005).
6
O Índice Parasitário Anual no município de Manaus em 2006 foi estimado em
24,0 e o do estado do Amazonas em 58,5 no mesmo período, mostrando tratar-se
de áreas ainda com alto risco de incidência de malária (Figura 2) (Brasil, 2007).
IPA POR 1.000 HABITANTES
0,1 a 9,9 (baixo risco)
10 a 49,9 (médio risco)
> 49,9
(alto risco)
Fonte: FMTAM/SIVEP, 2006
Figura 2: Incidência Parasitária Anual (IPA) no Amazonas em 2006.
1.3 Ciclo biológico do plasmódio humano
A infecção malárica inicia-se quando esporozoitos infectantes são inoculados
no homem pelo inseto vetor. Após cerca de 30 minutos, estas formas desaparecem
da circulação sanguínea. Alguns esporozoitos são destruídos pelos macrófagos
enquanto outros penetram nas células parenquimatosas do fígado, os hepatócitos,
onde se multiplicam assexuadamente por um processo de divisão múltipla
(esquizogonia), que resulta na formação dos esquizontes teciduais primários e
posteriormente milhares de merozoitos são liberados nos capilares intra-hepáticos.
Esta primeira fase do ciclo é denominada exo-eritrocítica, pré-eritrocítica ou tissular
e, portanto, precede o ciclo sanguíneo do parasito (Braga, 2003) (Figura 3).
O desenvolvimento nas células do fígado requer, aproximadamente, uma
semana para o P. falciparum e P. vivax e, em média, duas semanas para o
7
P. malariae. Nas infecções por P. vivax, algumas destas formas exo-eritrocíticas,
denominadas hipnozoitos, permanecem latentes no fígado por meses ou anos e são
as responsáveis pelas recaídas tardias observadas nas infecções causadas por
estas espécies. Para essas formas e para os esquizontes teciduais é que a
primaquina está indicada no tratamento da malária por P. vivax (Braga, 2003).
O ciclo eritrocítico inicia-se quando os merozoitos tissulares invadem os
eritrócitos. Nos eritrócitos, se reproduzem por esquizogonia, formando novos
merozoitos e, por ruptura das células, ao final do ciclo, caem na circulação
sanguínea e reinvadem os eritrócitos reiniciando o ciclo (Figura 3). A duração desse
ciclo é variável de acordo com a espécie, cerca de 48 horas para o P.vivax, P. ovale
e P. falciparum e 72 horas para o P. malariae. Alguns merozoitos resultantes da
esquizogonia se diferenciam para a forma sexuada, os gametócitos, que também
invadem os eritrócitos. O gametócito macho é chamado de microgameta e a fêmea
de macrogameta (Braga, 2003).
O ciclo de vida no hospedeiro invertebrado começa pela ingestão de sangue
humano pela fêmea do mosquito Anopheles contendo as formas sexuadas. No
estômago do mosquito ocorre a fertilização destes gametas com a formação do
zigoto, que evolui até a formação de esporozoitos, que, alcançando as glândulas
salivares do mosquito, capacitam a fêmea deste invertebrado a produzir a infecção
no ser humano (Figura 3) (http://.dpd.cdc.gov).
8
Fonte:http://.dpd.cdc.gov/dpdx/HTLM/Malaria.asp?body=Frames/M-R/Malaria/body_Malaria_page2.htm
Alguns merozoitos resultantes da esquizogonia se diferenciam para a forma
Figura
3: Cicloda
evolutivo
dos plasmódios.
Alguns merozoitos
resultantes
esquizogonia
se diferenciam para a forma
1.4 Manifestações clínicas
As formas das manifestações clínicas dependem da espécie do plasmódio
infectante e do grau de imunidade do organismo nos pacientes com malária.
Geralmente as infecções causadas pelo P. vivax e P. malariae são benignas e com
baixa mortalidade. As causadas pelo P. falciparum podem apresentar um quadro
clínico mais grave, com inúmeras complicações, podendo levar à mortalidade,
particularmente, em hospedeiros não imunes (Souza, 1997).
A crise malárica tem relação com a duração do ciclo esquizogônico; com o
número de plasmódios em desenvolvimento e com o período de incubação, onde as
características clínicas são principalmente febres intermitentes, calafrio e cefaléia.
O período de incubação da malária é de 8 a 31 dias (média de 14 dias) na infecção
pelo P. vivax; de 7 a 14 dias (média de 10 dias) na infecção pelo P. falciparum e de
9
18 a 37 dias (média de 30 dias) na infecção pelo P. malariae. O exame físico mostra
algum grau de desidratação com mucosas hipocoradas em graus variados. O fígado
é palpável em um grande número de pacientes e o baço tende a crescer na medida
em que a infecção progride e se repete principalmente nas infecções por
P. falciparum (Souza, 1997).
1.5 Diagnóstico
Apesar do grande avanço nas técnicas imunológicas e da biologia molecular,
o diagnóstico primário e rotineiro da malária continua sendo feito pela pesquisa do
parasito no sangue periférico, seja pelo método da gota espessa (GE) ou pelo
esfregaço sanguíneo, em função de sua simplicidade de realização e baixo custo.
Esta técnica baseia-se na visualização do parasito através da microscopia ótica,
após coloração com corante vital (azul de metileno e Giemsa), permitindo a
diferenciação específica dos parasitos por espécie a partir da análise da sua
morfologia e pelos estágios de desenvolvimento encontrados no sangue periférico. A
determinação da densidade parasitária é útil para a avaliação prognóstica, e deve
ser realizada em todo paciente com malária, especialmente nos portadores de
P. falciparum que requerem certo acompanhamento hospitalar e ambulatorial
(FUNASA, 2001).
Com o aprimoramento de novas técnicas de diagnóstico nos últimos anos,
métodos rápidos, práticos e sensíveis vêm sendo desenvolvidos. O QBC®
(Quantitative Buffy Coat) é uma técnica que demanda da concentração dos parasitos
pela centrifugação e a coloração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) do parasito por
um composto químico de fluorocromo chamado laranja de acridina. Estudos
recentes têm mostrado que, embora mais rápido e objetivo, o QBC® ainda não se
mostrou superior à gota espessa no diagnóstico parasitológico da malária
(Braga, 2003).
Um grande avanço na metodologia diagnóstica da malária teve início a partir
de 1983, com o desenvolvimento de ensaios rápidos baseados na captura qualitativa
de um antígeno de P. falciparum, a Proteína 2 Rica em Histidina (PfHRP2). Mais
recentemente, foi desenvolvido outro método de diagnóstico rápido, que captura
10
antígenos de P. falciparum e P.vivax simultaneamente, utilizando anticorpos
policlonais e monoclonais marcados com ouro e dirigidos contra a enzima lactato
desidrogenase específica do parasito, presente no sangue total do paciente. Apesar
de promissores, os estudos de campo que foram feitos até o momento, para
determinar a sua efetividade no diagnóstico da malária, não são suficientes para
recomendar a sua utilização no Brasil (Arcanjo, 2004). Outros métodos de
excelência na área da biologia molecular é o PCR (Polimerase Chain Reaction) e a
citometria de fluxo (FACS); contudo, ainda são métodos de alto custo e de pouco
uso na rotina de diagnóstico (Alecrim, 2003).
1.6 Fisiopatologia da malária
A doença malárica deve ser considerada como resultado de uma infecção
intravascular, e fatores como ação dos parasitos nas hemácias e estimulação do
sistema imune do homem, são de grande importância no aparecimento da
sintomatologia. A estimulação imunológica é intensa durante a infecção e deve ser
relacionada com vários eventos patogênicos. Nas formas graves, determinada
geralmente pelo P. falciparum, encontra-se a sequestração ou citoaderência das
hemácias nos capilares e veias, contribuindo para a doença em nível microvascular
e com conseqüências para vários órgãos vitais (Alecrim e Alecrim, 2003).
A gravidade da doença está na dependência de fatores relacionados a
interações das células humanas e os parasitos, envolvendo determinantes genótipos
do hospedeiro e resposta imune específica. Seis fatores são indicados como
importantes na virulência dos plasmódios: capacidade de multiplicação; preferência
por determinado estágio de vida das hemácias; potencialidade para induzir liberação
de citocinas; habilidade para produzir citoaderência com formação de rosetas;
antingenicidade não reconhecida pelo hospedeiro e resistência às drogas
antimaláricas (Alecrim e Alecrim, 2003).
A citoaderência, que é formada envolvendo hemácias, pode levar à obstrução
de pequenos vasos sanguíneos, determinando doença microvascular. As citocinas
podem contribuir para agravar esta situação; o TNF-α é capaz de aumentar a
expressão de moléculas receptoras nas células endoteliais. Outro componente da
11
doença é uma alteração metabólica resultando no consumo de glicose e produção
de lactado. Com o avanço da microscopia eletrônica foi possível caracterizar que as
hemácias
estavam
diretamente
aderidas
nas
células
endoteliais
da
microvascularização através de protuberâncias chamadas knobs. Isso atuaria como
mecanismo facilitador para o aparecimento da doença grave de cérebro, rins,
placenta e outros órgãos. Recentemente, foi demonstrado que o glycosaminoglycan
chondrointin sulfate A (CSA) pode atuar como receptor para a aderência de
hemácias pavimentadas nas células endoteliais da placenta, pulmão e cérebro
(Rogerson e Brown, 1997).
As citocinas também são consideradas como fatores contribuintes para o
desenvolvimento de malária grave. Alguns estudos têm procurado mostrar a relação
entre a gravidade da infecção e os níveis circulantes de citocinas, principalmente o
TNF-α e outras interleucinas, associados com glycosyl phophatidyl inositol (GPI),
funcionaria como âncora na ligação covalente entre antígenos de superfície do
parasito e membrana lipidíca das células do hospedeiro; também devem ser
considerados na potencialidade de indução da citoaderência os ligantes ICAM-1 e
VCAM-1 (Alecrim e Alecrim, 2003; Santos et al., 2003). Atualmente se discute
também o papel do óxido nítrico (ON) na malária grave, devido que o ON tem na
morte dos parasitos da malária através dos macrófagos, monócitos e talvez por
leucócitos polimorfonucleares (Alecrim e Alecrim, 2003; Dantas, 2000).
A produção de ON pode resultar de estimulação pelo TNF-α nas células
endoteliais estimuladas, e seu aumento causaria alguns eventos encontrados na
malária grave como: hipotensão, acidose láctica, hipoglicemia e coma. Embora
ainda não seja bem claro o papel das citocinas, provavelmente, elas estão
envolvidas na disfunção placentária, supressão da eritropoese, disfunção hepática,
inibição da glicogênese e febre. Também são importantes mediadores para a lise de
parasitos pelos leucócitos ativados, liberação de oxigênio tóxico e óxido nítrico
(Mendis e Carter, 1995; Dantas, 2000; Alecrim e Alecrim, 2003).
12
1.7 Citocinas
Citocinas podem ser definidas como um grupo de proteínas que não são
anticorpos, secretadas por leucócitos e por células não leucocitárias que agem como
mediadores intercelulares. As citocinas diferem dos hormônios clássicos no sentido
de que elas são produzidas por vários tecidos ou tipos celulares e não por glândulas
especializadas. Estão envolvidas na comunicação entre as células, incluindo as do
sistema imune. São peptídeos ou glicopeptídeos produzidos pelas células do
sistema imune adquirido (linfócitos) e pelas células do sistema inato (macrófagos,
mastócitos, etc). Os eventos envolvendo os mediadores das citocinas ocorrem
durante a iniciação dos estágios efetores da resposta imune e o desenvolvimento
das células hematopoiéticas. Sua importância está na capacidade de influenciar
algumas funções do sistema celular, ou seja, contribuem com a regulação e
diferenciação do sistema imune (Abbas e Lichtman, 2005).
As citocinas produzidas por macrófagos possuem vários efeitos que
contribuem para a defesa do organismo. Um desses efeitos é a elevação de
temperatura corporal, que é mediada principalmente pelo TNF-α, IL-1 e IL-6,
pirógenos que causam febre e derivam de uma fonte endógena e não de
componentes bacterianos. A febre geralmente é benéfica para o hospedeiro, pois a
maioria dos agentes infecciosos cresce melhor em baixas temperaturas, e a
resposta imune adaptativa é mais intensa em temperaturas elevadas (Gorczynski e
Stanley, 2001; Seoh et al., 2003).
Os efeitos mais importantes do TNF-α, IL-1 e IL-6 são o início da reação da
resposta de fase aguda na infecção. Essa reação envolve uma alteração nas
proteínas secretadas pelo fígado no plasma sanguíneo e resultam da atividade do
TNF-α, IL-1 e IL-6 sobre os hepatócitos. Na resposta de fase aguda, os níveis de
algumas
proteínas
plasmáticas
diminuem,
enquanto
outras
aumentam
significativamente. A resposta de fase aguda consiste em um rápido ajustamento da
composição das proteínas plasmáticas em resposta a estímulos lesivos, incluindo
infecção, queimaduras, traumas e neoplasias (Gorczynski e Stanley, 2001;
Seoh et al., 2003).
13
Embora a reposta de fase aguda seja caracterizada por um início rápido,
poderá persistir em uma inflamação crônica. Em alguns pacientes com doença
inflamatória crônica, como a artrite reumatóide, as elevações plasmáticas poderão
induzir a deposição dessas proteínas no interstício dos tecidos (Brennan et al.,
1998).
Em geral, é aceito que a malária grave é conseqüência de alterações em
muitos órgãos e tecidos, onde as citocinas estão focadas no mecanismo
imunológico. Considerando que muitos fatores que envolvem o parasito podem
contribuir para a severidade da doença, como por exemplo, a ativação dos
macrófagos pelo Plasmodium e conseqüente produção de citocinas, principalmente
as pró-inflamatórias como o TNF-α e a IL-1. Esta visão é fundamentada em
experimentos murinicos, onde os extratos de toxicidade do parasito da malária foram
neutralizados com a aplicação de anticorpos monoclonais em camundongos (Angulo
e Fresno, 2002).
1.7.1 Propriedades gerais das citocinas
Normalmente as citocinas são produzidas durante as fases de ativação da
imunidade inata e específica, com a participação de múltiplos tipos celulares e na
regulação da resposta inflamatória, onde produzem um efeito rápido e autolimitado;
atuam sobre tipos celulares diferentes (Pleiotropismo) e podem exercer um mesmo
efeito (Redundância); promovem a síntese de uma ou mais citocinas (Sinergismo);
inibição da ação de outras citocinas (Antagonismo) e todas possuem ligação a
receptores específicos na superfície de células-alvo (Gorczynski e Stanley, 2001).
A união aos receptores ocorre na membrana celular para transmitir as
“informações” necessárias. Os macrófagos são células que mais produzem
citocinas, seguidos dos linfócitos T que são divididas em duas grandes categorias,
com base na expressão das moléculas de superfície celular em células CD4+ e
CD8+. Como regra geral os linfócitos T CD4+ consistem em células T auxiliares
(Th-Helper) que atuam na resposta imunológica, principalmente na secreção de
citocinas, enquanto os linfócitos T CD8+ são linfócitos T citotóxicos, podendo
14
também produzir citocinas em níveis bem menores que as células T CD4+
(Pardi, 2001).
As células T CD4+ podem ser divididas em dois subgrupos denominados Th1
e Th2, baseando-se nas citocinas que produzem. As células Th1 e Th2 apresentam
diferenças funcionais entre citocinas produzidas em relação aos aspectos da
resposta imunológica. As células Th1 são responsáveis pela secreção de citocinas
que ativam os macrófagos (IL-1, IL-12, TNF-α, INFγ) e as células T citotóxicas.
Como as células Th1 ativam os macrófagos que produzem fatores pró-inflamatórios,
essas citocinas produzidas são denominadas de citocinas pró-inflamatórias. As
citocinas produzidas pelas células Th2 (IL-4 e IL-10) induzem o aumento da
produção de anticorpos pelas células B e alterações na síntese de imunoglobulinas.
(Mossman et al., 1986).
1.7.2 Interleucina-6 (IL-6)
A IL-6 é uma citocina sintetizada por macrófagos, células endoteliais
vasculares, fibroblastos e outras células em resposta a IL-1 e ao TNF-α. Pode ser
detectada na circulação após infecção bacteriana por Gram-negativa ou por infusão
de TNF-α, sua secreção está mais acentuada em resposta ao TNF-α ou a IL-1 do
que aos LPS; não causa trombose vascular nem lesão tecidual, como é observada
em resposta ao LPS e ao TNF-α, induz os hepatócitos a sintetizarem diversas
proteínas plasmáticas, como o fibrinogênio que contribui para a resposta da fase
aguda. Também serve como um fator de crescimento para as células B ativadas na
seqüência de diferenciação das mesmas. Além disso, pode promover o crescimento
de células somáticas híbridas. Experimentos in vitro sugerem que a IL-6 serve como
um co-estimulador de células T e de timócitos, atuando ainda como co-fator com
outras citocinas no crescimento precoce das células hematopoiéticas da medula
óssea (Sharon, 2000).
A IL-6 é uma importante citocina pró-inflamatória, sua síntese está
diretamente associada com a IL-1 e o TNF-α. Como ocorre com a IL-1, a IL-6
também está associada com níveis elevados no pico febril da malária e outras
doenças infecciosas de caráter agudo (Clarck e Chaudhri, 1988). Seguindo os
15
critérios da OMS, entre malária grave e malária não grave ou não complicada,
estudo, realizado em crianças africanas com malária grave por P. falciparum,
comprovou que a IL-6 está correlacionada a níveis séricos elevados na malária
cerebral, não ocorrendo o mesmo nos casos de malária não complicada, que foram
usados como grupo controle, onde os níveis séricos foram pouco elevados ou
insignificantes (Lyke et al., 2004).
1.7.3 Interleucina-8 (IL-8) – Quimiocina
As quimiocinas têm forma estrutural homóloga às citocinas, possuem a
capacidade de estimular a motilidade (quimiocinese) e movimentos dirigidos
(quimiotaxia) dos leucócitos. O maior representante dessa família é a IL-8, que é
produzida por mononucleares ativados, bem como células teciduais (endotélio,
fibroblastos) e por megacariócitos (produção de plaquetas ricas em IL-8). São
moléculas que agem predominantemente sobre os leucócitos como mediadores da
resposta inflamatória aguda, ou seja, atraem os neutrófilos do sangue ao local da
infecção e da inflamação. A presença da IL-8 em concentração elevada foi
encontrada em aspirado bronquial de pacientes ventilados mecanicamente,
associados com uma alta incidência de pneumonia nosocomial (Abbas e Lichtman,
2005).
Até o momento, poucas informações foram encontradas sobre o papel da IL-8
na patogenia da malária. Sabe-se que se trata de uma quimiocina atrativa para
neutrófilos em infecções generalizadas. Pesquisa, realizada em um pequeno grupo
de crianças africanas com malária por P. falciparum, comprovou que não houve uma
elevação significativa dos níveis séricos de IL-8 correlacionados com a severidade
na malária por esta espécie, como está comprovado, através de culturas de células
que existe um aumento significativo desta interleucina em placentas infectadas de
mulheres com malária, sugerindo que, nestas condições há uma relevância para o
papel da IL-8 na patogenia da malária (Lyke et al., 2004).
1.7.4 Interleucina-10 (IL-10)
É uma citocina produzida por macrófagos ativados, por linfócitos e por células
não linfociticas, como os queratinócitos.
Assim como a IL-4, da IL-10 está
16
relacionada com a inibição da produção de outras citocinas (IL-1, IL-2 e TNF-α)
pelos macrófagos, bem como inibir as funções acessórias dos macrófagos na
ativação das células T. O efeito final dessas reações é inibir a inflamação na
resposta imune inata e mediada por células T (Moore et al., 1993).
Elevados níveis de IL-10 têm sido relatados em malária, como foi
demonstrado por estudos realizados em crianças africanas com malária grave que
apresentaram níveis elevados desta citocina e baixa produção de TNF-α, sugerindo
que a IL-10 promove a inibição da resposta antigênica, deste modo a IL-10 aparece
como um importante antagonista, prejudicando a resposta pró-inflamatória dos
antígenos da malária (De Waal et al., 1991).
Estudo realizado na Turquia, correlacionando a densidade parasitária da
malária por P. vivax, pelo método da gota espessa, com os níveis de citocinas nos
soros onde foram analisadas as citocinas IL-1, IL-6, IL-8 e IL-10 pelo método de
ELISA,
comparados
com
soros
de
pacientes
saudáveis,
as
citocinas
pró-inflamatórias como a IL-1 e IL-6, foram significativamente mais elevadas
proporcionalmente em relação à densidade parasitária; níveis de IL-8 mostraram
pouca significância em relação à densidade parasitária elevada, contudo houve uma
correlação positiva da IL-8 em relação à idade. Altas concentrações de IL-6 e IL-10
estavam correlacionadas com febre alta, enquanto a IL-8 não demonstrou uma
elevação significativa no mesmo estado clínico. Sugerindo-se, assim, que as
citocinas pró-inflamatórias estão associadas à elevada parasitemia na malária por
P. vivax (Yildiz et al., 2006).
1.7.5 Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α)
O TNF-α é produzido por várias células, incluindo os macrofágos ativados,
neutrófilos, lincocitos T e B, mastócitos, basófilos, eosinofilos, célula natural killer
(NK) e algumas células tumorais. Juntamente com a IL-1, o TNF-α desempenha um
papel crítico na iniciação da resposta imunológica inflamatória à infecção por
bactérias, fungos, protozoários, vírus e algumas vezes por neoplasias (Sharon,
2000; Clark e Chaudhri, 1988).
17
Os efeitos do TNF-α sobre as células alvo são potencializados pela presença
do INF-γ, fornecendo um bom exemplo de sinergismo das citocinas. O TNF-α pode
ter um efeito benéfico, quando produzido em pequenas concentrações, ou efeito
deletério, quando produzido em grandes concentrações. Os principais efeitos do
TNF-α incluem: a indução da anorexia e emagrecimento em doenças crônicas;
produção da necrose hemorrágica em tumores (caquexia); atuação no hipotálamo e
produz febre; participação na ativação dos neutrófilos e monócitos; indução dos
macrófagos a secretarem IL-1 e IL-6; estímulo à própria secreção pelos macrófagos;
indução
das
células
endoteliais
a
expressarem
moléculas
de
adesão;
potencialização da citotoxicidade nos macrófagos, aumentando o intermediário
reativo do oxigênio e intermediário reativo de nitrogênio (IRO e IRN) (Abbas e
Lichtman, 2005).
Estudos em Gâmbia mostraram que as concentrações do TNF-α foram
maiores em crianças com malária por P. falciparum que em crianças com outras
infecções, mas não houve diferenças significativas entre malária cerebral e malária
não complicada, sugerindo que a produção aumentada do TNF-α é uma resposta
normal do hospedeiro durante a infecção, mas o excesso de produção pode
predispor à malária cerebral ou evolução ao óbito (Kwiatkowski et al., 1993).
Pesquisa realizada no Sri Lanka, na África, comprovou que na infecção aguda
em pacientes primoinfectados por P. vivax, ocorre uma elevação sérica de TNF-α
durante o paroxismo febril, ou seja, sintomas clínicos como episódios de febre alta
acompanhada por rigorosos calafrios nas primeiras 48h, coincidindo com a ruptura
no sangue periférico da fase assexuada de esquizontes, com retorno do TNF-α ao
nível normal dentro de 4 a 8 horas. (Kurunaweera et al., 1998; Mendis et al., 1992).
Citocinas como o TNF-α e o Interferon Gama (IFN-γ), participam da inibição
da parasitemia e estimulação do aumento da fagocitose pelos macrófagos dos
eritrócitos parasitados por plasmódios (Ferreira et al., 1986). Na região Amazônica
comprovou-se uma associação direta entre os níveis de TNF-α e a gravidade da
malária por P. falciparum. Entretanto, não houve uma correlação direta da malária
18
grave com altos níveis de TNF-α, quando correlacionados com malária cerebral ou
mortalidade (Tanaka, 1993).
1.8 Resposta imune na malária
A imunidade mediada por células e a imunidade mediada por anticorpos estão
envolvidas diretamente na proteção contra as diferentes espécies de plasmódios. A
imunidade inata é responsável pela depuração parasitária no hospedeiro. A maior
parte desse processo é liberada por macrófagos e acontece no baço sob
circunstância normal. O fígado, contudo, pode exercer esta função como uma via
alternativa. Ambos os mecanismos das respostas inatas, celular e humoral
participam da eliminação do parasito e são dependentes dos linfócitos T CD4+ ,
especialmente seus subgrupos Th1 e Th2 que têm funções reguladoras na resposta
contra a malária, ambas sendo requeridas para o controle da infecção, mas
necessitando ser adequadamente sintonizada em tempo e intensidade (Angulo e
Fresno, 2002).
A eliminação do parasito no sangue requer a intervenção de células da classe
Th1 ou Th2 para o controle da parasitemia ou na síntese de anticorpos necessários
à depuração parasitária, levando-se em consideração a constante exposição em
áreas endêmicas o que pode levar a uma imunidade protetora (Reid, 1998). Outros
Mecanismos inespecíficos, como intermediários reativos de nitrogênio e oxigênio
(IRN e IRO), geralmente estão ligados à resposta Th1, sendo importante para o
controle da infecção aguda, porém uma vez que se adquire imunidade, estes
perdem importância.
A malária humana é caracterizada por uma interação complexa da resposta
imune do hospedeiro e estratégia de sobrevivência do parasito. Essa resposta está
associada aos estágios intra-eritrocitários pelo plasmódio que é dependente da
ativação diferencial de linfócitos T, especialmente o tipo T CD4+ , cuja participação
na imunidade protetora contra o parasito tem sido bem estabelecida em
experimentos murinos, porém pouco evidenciada na malária humana. Mais
recentemente, alguns estudos (Lyke et al., 2004) têm sido conduzidos em
populações humanas, abordando aspectos da regulação da resposta imune
19
protetora por linfócitos T. Esses estudos têm sido realizados, principalmente, em
regiões endêmicas, onde avaliam na sua maioria, respostas de células T aos
antígenos somáticos eritrocitários ou a proteínas recombinante do plasmódio (Pardi,
2001).
A IL-12 e o INFγ podem neutralizar as formas esporozoitas antes de estes
invadirem os hepatócitos, também impedem o seu crescimento ativando as células
de Kupffer (Reid, 1998). As células citotóxicas e INFγ promovem a eliminação
parasitária e a proteção mediada por linfócitos T CD8+ com a participação de
citocinas e óxido nítrico durante a replicação parasitária nas células hepáticas (Good
e Doolan, 1999). Depois da esquizogônica hepática a proteção contra as formas
eritrocitárias é parcialmente alcançada mediante anticorpos, mas a produção de
INFγ e a proliferação de células T, também estão associadas com a proteção
(Plebanski e Hill, 2000).
A patogênese da malária envolve vários mecanismos, os parasitos causam
efeitos físicos e metabólicos que resultam em uma doença microvascular com fortes
componentes intra-eritrocitários, como os intermediários reativos de nitrogênio (IRN)
e a produção de citocinas (Dantas, 2000). Estudos clínicos têm demonstrado uma
correlação entre a gravidade da doença e níveis circulantes de citocinas
(Kwiatkowski et al., 1990).
1.9 Resposta imune na gravidez
A gravidez é uma condição fisiológica na qual ocorrem várias mudanças
imunoendócrinas com a finalidade de facilitar a imunossupressão e a tolerância aos
antígenos paternos e fetais. Tem sido um grande desafio tentar entender quais os
mecanismos envolvidos na rejeição da placenta pelo sistema imunológico materno,
já que a mesma pode ser de origem embriônica, contendo material genético tanto
materno como paterno que são geneticamente estranhas à mãe e, portanto,
poderiam incitar as mesmas reações de intolerância imunológica observada nos
tecidos fetais. Após anos de intensas pesquisas imunológicas sobre reprodução
humana, ainda não se conhece perfeitamente o mecanismo de adaptação
imunológica presente na gestação, que permite o sucesso do enxerto placentário na
20
gravidez humana normal, porém existe uma relativa supressão de citocinas do tipo
Th1 (TNF-α e IL-6) na resposta de linfócitos, levando a uma prevalência na resposta
Th2 (IL-4 e IL-10) (Pereira et al., 2005).
Do ponto de vista imunológico o período gestacional é um modelo altamente
complexo, com freqüente exacerbação de patologias e alterações pré-existentes. O
sistema imune inato está ativo na gravidez, e, em razão da relativa supressão da
imunidade adaptativa, pode assumir um importante papel na defesa imune materna
(Sacks et al., 1999). Além disso, o sistema imune inato tem um papel na influência
dominante sobre a reprodução. Análises dos tipos celulares que estão presentes no
local da implantação do óvulo mostram que as células T e B, típicas do sistema
imune adaptativo, são raras, enquanto o predomínio populacional consiste de
células NK (Sacks et al, 1999; Pereira et al., 2005). Durante a gestação, como em
qualquer outro processo imunoinflamatório, a unidade últero-placentária inicia e
modula uma interação harmônica entre o endotélio vascular materno, as células
imunocompetentes presentes localmente, os determinantes antigênicos presente na
superfície do trofoblasto, ativamente regulando o processo de adesão, ativação e
migração celular, via modificações na rede de citocinas locais (Pereira et al., 2005).
O denominado “paradigma de Th1/Th2” parece responder a uma pergunta
desafiadora: por que o feto não é rejeitado pelo sistema imune materno, apesar da
presença de antígenos paternos em contato com as células imunocompetentes
maternas? Na interface materno-fetal as citocinas do tipo Th2, que são secretadas
não somente pelas células imunocompetentes, mas também por células da decídua
e da placenta, parecem ser as responsáveis pelo sucesso na manutenção da
gravidez (Zenclussen et al, 2002). Isso foi embasado na observação de que IL-4 e
IL-10 foram detectados em níveis aumentados durante a gravidez normal em
humanos e animais. Ao contrário, a produção excessiva de citocinas Th1 foi
associada à perda gestacional, especialmente citocinas como TNF-α, IL-1, IL-2 e
IFN-γ. Assim, a produção aumentada de citocinas Th2, oposta pela produção
diminuída de citocinas Th1, parece ser a razão perfeita para explicar a sobrevivência
do feto no útero materno. (Zenclussen et al, 2002; Pereira et al., 2005).
21
A IL-10 é uma citocina importante porque suprime a produção de citocinas
pró-inflamatórias por outras células. Numerosos estudos têm documentado a
produção de IL-10 na interface materno fetal. A gravidez não é dependente da
produção de IL-10, o que sugere que outros imunomoduladores também podem
contribuir para a sobrevivência do enxerto fetal. Também o aumento de cortisol,
progesterona, estradiol e testosterona, observado durante o terceiro trimestre, estão
envolvidos na polarização das citocinas Th2. Durante a gravidez, a produção de
citocinas é principalmente do tipo Th2; os linfócitos periféricos liberam menos TNF-α,
IL-2 e IFN-γ e mais IL-4 e IL-10, particularmente no terceiro trimestre da gestação.
Existe uma complexa interação hormonal, que acarreta a supressão de IL-6 e TNF-α
na resposta Th1, com aumento da resposta Th2 (Marzi et al., 1996; Pereira et al.,
2005).
Numerosas experiências têm demonstrado que a progesterona bloqueia o
estimulador
da
proliferação
mitogênica
linfocitária,
melhora
o
tempo
de
sobrevivência do feto, modula a produção de anticorpos, reduz a produção de
citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos na resposta antigênica, e altera a
secreção de citocinas dos clones das células T para favorecer a produção de IL-10.
O mecanismo pelo qual a progesterona exerce ações imunomoduladoras nos
tecidos reprodutivos ainda não está claro, mas envolve ações diretas e indiretas
sobre as células do sistema imune materno, o qual é sobrecarregado durante todo
os estágios de gestação normal (Marzi et al., 1996; Pereira et al., 2005).
Na literatura há muitos trabalhos científicos que consideram a gravidez como
uma ação do balanço imunológico, na qual o sistema imune da mãe permaneça
totalmente para o feto e ainda mantenha a imunidade para a defesa contra
microorganismos (Nadine et al., 2006). O desvio Th2 estabelecido durante a
gestação normal, pode comprometer a efetiva imunidade contra o parasito que
requer uma forte resposta Th1 para combater a infecção. Pelo contrario, uma
curativa resposta Th1 contra tal parasito pode superar a concentração de citocinas
Th2 necessárias para proteger a gestação e resultar em perda fetal (Luppi, 2003;
Lea e Calder, 1997).
22
A resistência adquirida também depende dos títulos dos isotipos de
anticorpos classes IgG1 e IgG3, que são anticorpos citofilicos específicos os quais
são produzidos em grandes quantidades na gravidez e cuja produção é induzida
principalmente por células Th2, que secreta a IL-10 e é responsável pela capacidade
protetora. Estudos sugerem que para a resposta ir de Th1 a Th2 é necessário um
número não interrompido de exposições como às sofridas por um adolescente ou
um adulto ao longo da vida, o que explica por que o estado de premunição é
particular a áreas hiperendêmicas (Smith, 1996).
A gravidez normal é caracterizada por um aumento de progesterona,
estrogênio e prolactina, além de vários hormônios placentários. É um estado de
predomínio do estrogênio que está associado com o perfil de citocinas Th2,
essencial para a tolerância materna ao feto e manutenção da gravidez. O estado
gestacional resulta de uma supressão da resposta imune celular, mas também na
preservação e algumas vezes do aumento da imunidade humoral. Estrogênio e
progesterona têm efeitos diferentes na regulação do equilíbrio Th1/Th2. A
progesterona aumenta a produção de IL-4 e IL-10 pelas células T. O estrogênio
também estimula a secreção de prolactina, que é um hormônio polipeptídico
secretado pela glândula pituitária anterior, que aumenta durante a gravidez e no
período de lactação. Têm efeito sobre células B e células T, está envolvida na
proliferação e diferenciação celular, e tem múltiplos efeitos sobre o sistema imune,
comprovando que a prolactina também está envolvida na reposta imune
(Pereira et al., 2005).
A placenta é imunologicamente um órgão onde o balanço entre a imunidade
materna e fetal deve ser mantido para o bem-estar próspero de ambos. Na malária
foi descrito um modelo hipotético no qual linfócitos T de memória estariam
envolvidos. Embora outros mecanismos parecem estar envolvidos, e isso sugere
uma resposta imune inapropriada em nível útero-placenta, como o envolvimento dos
macrófagos do tecido, os quais quando ativados sintetizam citocinas ou outros
fatores imunomoduladores, resultando em uma disfunção da placenta e,
posteriormente, outros efeitos sistêmicos (Moore et al., 2000).
23
1.10 Resposta imune na gestante com malária
A cada gestação a placenta e a circulação útero-placenta, são tecidos
formados sem desafio prévio à infecção malárica, portanto sem imunidade
específica local. Quando antígenos são apresentados apropriadamente, células
imunes no útero respondem à infecção; à medida que a gestação progride a
resposta local torna-se mais efetiva, limitando a replicação e possibilitando a
destruição parasitária. Esse mecanismo pode não ser muito competente na primeira
gestação, mas se torna progressivamente mais eficiente com gestações sucessivas
(McGregor, 1984).
As gestantes possuem uma maior suscetibilidade para um maior número de
infecções e de episódios com manifestações clínicas, quando comparadas com
mulheres não grávidas com a mesma idade e da mesma região (MenendezEspinosa, 1998; Jurande, 2002). A malária age também como causa da
imunossupressão com o aumento da incidência de outras infecções nas mulheres
grávidas de áreas endêmicas (Brabin et al., 1985). Em revisão sobre o tema, três
observações são básicas em pacientes grávidas com malária: primeira, a maior
suscetibilidade à infecção; segunda, a maior vulnerabilidade à doença, levando-se
em conta o tempo e o grau de exposição; por último, a influência da paridade sobre
as duas anteriores, segundo o grau de endemicidade, no entanto, em locais com
transmissões instáveis, a mulher por ter baixa imunidade, é suscetível à infecção em
qualquer gravidez, enquanto em locais de transmissão estável, a mulher adquire
imunidade
e
só
se
apresenta
mais
vulnerável
na
primeira
gestação
(Menendez, 1995).
Em regiões endêmicas para malária, freqüentemente o P. falciparum é isolado
na placenta, o qual está envolvido com a anemia severa nas mães e baixo peso
para a criança. Crianças que nascem de mães com infecção por P. falciparum na
placenta têm a capacidade reduzida de gerar uma resposta específica ao parasito. O
achado de parasitos ativos da malária na placenta durante o parto, está associado
ao aumento da freqüência de anticorpos específicos produzidos, principalmente, por
células B no cordão umbilical de recém-nascidos de mães que receberam
tratamento anti-malárico durante a gravidez (Engwerda e Good, 2005).
24
Em áreas de alta endemicidade, a infecção placentária do plasmódio é
normalmente maior que a infecção no sangue periférico. No entanto, na infecção
grave da placenta, a ausência de manifestação clínica ou infecção no sangue
periférico é freqüente em primigestas que foram expostas a várias infecções
anteriormente, possuindo certa imunidade, onde não há diferenças entre níveis de
anticorpos da malária na placenta e no sangue periférico observadas neste estado
gestacional (Menendez, 1995).
A paridade aparece como um fator importante em áreas de intensa
transmissão. A prevalência parasitária é maior em mulheres primigestas do que em
multíparas, pois as primeiras são os grupos mais vulneráveis em áreas de malária
estável. Onde a transmissão não é estável e não há imunidade, a infecção
manifesta-se clinicamente de forma intensa, sem guardar relação com o número de
gestações (McGregor et al., 1984). Outras complicações, como a hipoglicemia e a
anemia, são independentes da imunidade prévia ou da endemicidade da área, suas
causas obedecem a múltiplos fatores e estão fortemente associadas à morbidade e
mortalidade materno-infantil (Nosten et al., 1999).
Os efeitos mais severos da malária para o feto observados em áreas de baixa
endemicidade, comparada com áreas de alta endemicidade, podem ser, em
conseqüência da gravidez, associada com a resposta de células mediadoras da
reposta imune, como as células T, ou a ausência de níveis adequados de anticorpos
específicos na malária, produzidos por células B. Outra hipótese aceita seria a alta
suscetibilidade para malária de primíparas comparadas com multíparas, que teria
como resultado a aquisição da resposta humoral para malária, durante o curso da
primeira gravidez, reduzindo o risco da infecção em gravidez subseqüente
(Smith, 1996).
Nas grávidas que residem em áreas de transmissão baixa ou sazonal de
malária, comprovou-se que elas não adquirirem proteção contra a malária durante a
gravidez tão rápidamente quanto em áreas onde a transmissão é intensa. Embora o
risco de infecção da placenta esteja claramente reduzido após a primeira gravidez,
também não há redução da infecção na gravidez seguinte. Porém mulheres que
tiveram malária durante a gravidez, podem adquirir uma resposta humoral com a
25
produção de anticorpos que reconheçam antígenos de superfície na membrana dos
eritrócitos que estejam infectados por plasmódios na placenta, e esta resposta
aumenta conforme o número de paridades (Nadine et al., 2006).
Baixos níveis de anticorpos da malária na placenta são esperados em relação
ao sangue periférico para explicar a preferência do parasito por este local durante a
gravidez (Rasheed et al., 1993). Todavia, não há diferenças entre os níveis de
anticorpos anti-malária em primíparas e outros grupos de paridade, embora, de
acordo com a hipótese de Smith (1996), a depressão da imunidade humoral em
primíparas poderia ser uma explicação.
Não há diferenças comprovadas de anticorpos anti-malária entre primíparas,
principalmente no segundo trimestre, e mulheres não grávidas com antecedentes de
malária. Em áreas endêmicas ocorrem abortos em conseqüência da malária,
podendo ser sugerido que ocorra uma indução na resposta não específica, porém
essa indução não ocorre somente em áreas de alta endemicidade (Mutabingwa,
1994).
Mesmo quando a imunidade materna adquirida pela barreira placentária é
eficaz, o risco de morte e agravantes clínicos ainda existe tanto para a mãe quanto
para o feto, como, por exemplo, induzir o parto prematuramente e/ou nascimento
abaixo do peso normal, bem como provocar anemia grave para a mãe,
principalmente em primíparas infectadas, pois a malária na gravidez pode contribuir
significativamente para promoção da malária grave e levar a hemorragia acentuada,
insuficiência renal aguda (IRA), e indução de aborto (Kassam et al., 2006,
Alecrim et al., 2000).
1.11 Malária na gravidez e citocinas
A primeira linha da defesa contra a infecção ocorre na placenta. Linfócitos
maternos e citocinas associadas estão concentrados no espaço interviloso na
interfase materno-placentária determinando a evolução da infecção e facilitando ou
prevenindo a transmissão ao feto. Se um microorganismo atingir o espaço interviloso
encontra macrófagos placentários que sob a direção das citocinas promovem um
26
importante
papel
na
defesa.
Assim,
na
malária,
na
tuberculose
e
na
tripanossomíase, embora os macrófagos apareçam repletos de parasitos, pode não
ocorrer infecção congênita, mas caso contrário, a infecção ascendente desencadeia
a produção de citocinas que podem induzir o parto e produzir um parto pré-maturo
(Reid, 1998).
Na gravidez, citocinas como TNF-α e IL-1, são encontradas em níveis
normais durante o primeiro trimestre de desenvolvimento fetal e o nascimento,
entretanto níveis de TNF-α, IL-1 e IL-8 estão elevados na placenta e estão
associados como nascimento pré-maturo. IL-1 e IL-8 parecem ser responsáveis pelo
amadurecimento cervical. A síntese da prostaglandina pelo hipotálamo parece
potencializar os efeitos do TNF-α e IL-1, sendo que o TNF-α pode ainda causar ao
concepto o retardo do desenvolvimento intra-uterino (Carbo et al., 1995).
Durante a infecção por malária na gravidez, níveis elevados de interleucinas
IL-1, IL-8 e TNF-α e substância como hemozoínas produzidas pelo Plasmodium e
níveis baixos de IL-6 foram encontrados em placentas infectadas, quando
comparadas com placentas não infectadas. Os macrófagos da placenta estimulam
principalmente a produção de TNF-α e IL-8. Existe correlação entre o aumento da
expressão de TNF-α e concentração de hemozoínas na placenta. Níveis elevados
de TNF-α e IL-8 foram associados ao crescimento retardado intra-uterino, mas sem
comprometimento no parto, sugerindo, assim que a malária na gravidez induz
prejudicialmente a resposta pró-inflamatória na placenta (Moormann et al., 1999).
A importância das citocinas como mediadores dos efeitos da malária na
gravidez é consistente com a observação nas infecções por P. vivax, que também
podem induzir o nascimento pré-maturo (Nosten et al., 1999). Na infecção por
P. vivax, o TNF-α também está aumentado quando comparado com a infecção
placentária por P. falciparum, indicando, assim, que os níveis de TNF-α são
indiferentes entre as espécies de plasmódios, (Karunaweera et al., 1992).
Citocinas pró-inflamatórias como a IL-1, IL-6 e TNF-α, têm sido relacionadas
com a patologia da malária cerebral, e citocinas antiinflamatórias, como a IL-10,
27
parece ter um papel na regulação e proteção na malária. A concentração de TNF-α
é elevada em pacientes com malária grave, como a malária cerebral, isso foi
comprovado em experiências murinicas, contudo com o uso de anti-receptores
TNF-R2 em camundongos, não houve comprometimento cerebral e elevação dos
níveis de TNF-α quando comparados com camundongos normais (Mackintosh et al.,
2004).
Estudos realizados até o momento, têm contribuído com inúmeras e
importantes informações sobre o conhecimento do mecanismo de formação,
liberação e processos reacionais das citocinas em mulheres grávidas com malária,
sendo a maior parte desses estudos realizados em áreas de transmissão intensa e
estável por P. falciparum, especialmente na África (Brabin et al., 1985). Nas regiões
onde a malária é instável, por ser sazonal esporádica ou ocasional como na Ásia e
em países da América do Sul com transmissão ativa, a resposta imune ao
Plasmodium é complexa e ainda pouco estudada, contudo, as citocinas próinflamatórias e antiinflamatórias liberadas durante a gravidez como o TNF-α, IL-6,
IL-8 e IL-10, têm um papel fundamental em mulheres grávidas infectadas quando
comparadas com mulheres não grávidas com malária, podendo prejudicar no
decorrer da gravidez tanto o feto quanto a mãe (Yildez et al., 2006).
Na literatura científica há poucos trabalhos correlacionando o aumento da
produção de citocinas em mulheres grávidas infectadas por Plasmodium vivax. No
Estado do Amazonas, a incidência de malária vivax é elevada, sendo necessárias
pesquisas direcionadas, para melhor compreensão e acompanhamento dos
aspectos clínicos e laboratoriais da doença neste estado fisiológico. O presente
trabalho propõe descrever a concentração dos níveis séricos das citocinas TNF-α,
IL-6, IL8 e IL-10, em mulheres grávidas infectadas por Plasmodium vivax atendidas
e acompanhadas na FMTAM, contribuindo no entendimento da etiopatogenia da
doença em gestantes.
28
2. OBJETIVO GERAL
Descrever o perfil sérico das citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 em mulheres
grávidas com malária vivax atendidas e acompanhadas na Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas.
2.1 Objetivos específicos

Comparar as concentrações das citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 nas
amostras das grávidas com malária coletadas no D0 (dia zero) e D35
(trigésimo quinto dia).

Correlacionar os níveis séricos do TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10, com a densidade
parasitária/ mm3.

Correlacionar os níveis séricos do TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10, com o número de
episódios de malária e o tempo de evolução dos sintomas clínicos em dias.

Correlacionar os níveis séricos do TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10, com os
parâmetros hematológicos e bioquímicos.
29
3. METODOLOGIA
3.1 Tipo de estudo
Estudo descritivo, prospectivo, de série de casos, com coletas de amostras
sanguíneas de grávidas, com diagnóstico parasitológico positivo para malária, para
avaliar o perfil das citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10.
3.2 Local do estudo
O estudo foi conduzido na Gerência de Malária e Gerência de Diagnóstico da
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM), a qual está situada na
cidade de Manaus, desenvolvendo atividades nas áreas de assistência à saúde,
pesquisa científica e formação de recursos humanos em doenças tropicais.
Atualmente está sendo considerada como Centro de Referência nacional e
internacional para o tratamento de doenças tropicais (Figura 4). A FMTAM possui
uma importante participação no diagnóstico e tratamento da malária sendo
responsável por aproximadamente 14% das notificações de casos de malária de
todo o Estado do Amazonas (FMTAM, 2006; Brasil, 2007).
Fonte: FMTAM – Assessoria Técnica
Figura 4: Maquete do Pronto Atendimento (PA) da FMTAM
30
3.3 Critérios de elegibilidade
Foram incluídas todas as grávidas com diagnóstico parasitológico positivo
para malária por P. vivax e que concordaram em assinar o Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo A).
3.4 Aspecto ético
Este estudo foi conduzido com pacientes grávidas voluntárias que, após
entrevista individual, através do preenchimento da ficha clínica (Anexo B),
entenderam os objetivos do estudo e aceitaram participar assinando o termo de
consentimento livre e esclarecido dentro dos preceitos da ética em pesquisa com
humanos, sem prejuízo para o seu atendimento ou seu tratamento. O estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMTAM em 03 de Junho de 2005,
com registro CEP 0836-05 (Anexo C).
3.5 Recursos financeiros
Este estudo fez parte do projeto: Malária e Gravidez na Região Amazônica:
diagnóstico, tratamento e acompanhamento clínico-laboratorial de pacientes da
FMTAM, que recebeu recursos da Fundação de Amparo a Pesquisa no Amazonas
(FAPEAM/CNPq). Tal estudo abordou o quadro clinico da gestante com malária, o
efeito da malária sobre o curso da gestação, a resposta terapêutica à malária
durante a gestação, malária placentária, o efeito da malária sobre o feto e o recém
nascido, achados ultra-sonográficos da gestante com malária, co-infecção maláriaHIV/HTLV/Hepatite-B/Sífilis/ITU e a resposta imune da gestante com malária, o qual
faz parte este estudo. Também com os recursos do curso de Mestrado em Doenças
Tropicais
da
Universidade
do
Estado
do
Amazonas
(UEA),
através
da
Superintendência da Zona Franca da Manaus (SUFRAMA) e Fundação de apoio ao
ensino MURAKI.
.
3.6 Tamanho da amostra e controle
Foi um estudo de seguimento do tipo série de casos, cujo tamanho da
amostra foi estabelecido pela procura espontânea de todas as pacientes que
procuraram atendimento na FMTAM no período de Março a Agosto de 2006, onde
foram coletadas amostras de 251 mulheres grávidas com malária.
31
Contudo, apenas 112 grávidas acompanhadas tinham uma média de idade de
23,8 ± 2,7 anos e a média de paridade era de 2,7 ± 2 gestações, onde apresentaram
160 episódios para malária por P. vivax (algumas pacientes apresentaram mais de
um episódio de malária durante o estudo), sendo estabelecido à primeira coleta
como o D0 (dia zero), onde foram coletadas 160 amostras das 112 grávidas e a
segunda coleta no D35 (trigésimo quinto dia), que foi considerada como grupo
controle das mesmas pacientes, todavia, sem malária, sendo coletadas neste grupo
34 amostras das 112 grávidas, havendo acompanhamento parasitológico em vários
retornos entre o intervalo de D0 e D35. Essas coletas seguiram o fluxograma de
atendimento (Anexo D).
3.7 Coleta e armazenamento de amostras
Foram coletadas amostras de sangue por punção digital (Figura 6) para o
diagnóstico parasitológico da malária utilizando o método da gota espessa (Figura 7)
corada pelo método de Walker (OPS/OMS, 1975) e para a determinação da
densidade parasitária (Figura 5).
N
Secagem
Coleta
Azul
de
Metileno
Giemsa
Lavagem
Lavagem
Giemsa
Secagem
LEITURA
DIAGNÓSTICO
Realização: 20’ - 1h
Figura 5: Técnica de coloração da gota espessa pelo método de Walker
(Fonte: Arcanjo, 2004).
32
Também Foram realizadas coletas por punção venosa (Figura 8) 10 mL de
sangue total, fracionados em três tubos, sendo 3,5 mL com anticoagulante EDTA
para exames hematológicos; 3,5 mL sem anticoagulante para dosagens bioquímicas
e 3,0 mL para determinação dos níveis séricos do TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10, após
centrifugação o soro foi fracionado em alíquotas no volume de 500 µL e
armazenadas a -70ºC.
Figura 6: Punção digital
Figura 7: Gota espessa e
estendido sanguíneo
Figura 8: Punção venosa
(Fonte: SILVA, JT)
3.8 Densidade parasitária
A determinação da densidade parasitária foi realizada nas lâminas com
amostras de sangue coradas pelo método de coloração de Giemsa, contando o
número de parasitos em relação a 100 células brancas (leucócitos) e a densidade
convertida a parasitas/mm3 pela referência da contagem global de leucócitos de
cada indivíduo.
3.9 Determinação de citocinas: TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10.
O método de escolha para a determinação da concentração dos níveis
séricos das citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10, foi o método de ELISA (VOLLER et
al., 1976), segundo as especificações técnica dos kits que foram adquiridos
comercialmente da marca BD OptEIATM , que são amplamente utilizados, possuem
anticorpos monoclonais anticitocinas, com o sistema biotina-avidina, os quais são
altamente sensíveis e específicos, pode ser quantitativo e ainda permite a realização
de exames em grande escala. Têm a capacidade para realização de 20 placas com
96 poços cada, além se ser um método fácil de trabalhar e de baixo custo em
33
relação a outros métodos, como o PCR (KAIN et al., 1993b) e a citometria de fluxo –
FACS (ÁVILA, 1994). Os procedimentos de lavagem e leitura dos testes foram
realizados por equipamentos automatizados da marca ASYS® , modelo Atlantis e
Expert Plus respectivamente (Figura 9).
Figura 9: Lavadora e leitora de ELISA (Fonte: SILVA, JT)
3.9.1 Técnica de ELISA utilizada para determinação das citocinas
A técnica de ELISA utilizada para a quantificação das citocinas foi a
recomendada pelo próprio kit do fabricante – BD OptEIATM . Essa técnica consiste
na utilização de anticorpos primário e secundário diluídos em tampão de ligação,
cuja diluição ideal encontrada foi de 1:500 para anticorpo primário e 1:250 para
anticorpo secundário. A primeira etapa da reação teve inicio com a adição do
anticorpo primário em cada poço da placa e incubado em período noturno por 12
horas a 4ºC. A segunda etapa iniciou com a lavagem da placa com tampão de
lavagem contendo PBS e Tween-20, e em seguida foi adicionado, a cada poço da
placa, o tampão bloqueador contendo PBS e Soro Bovino Fetal (FBS), a placa foi
incubada em temperatura ambiente por 1h. Em seguida cada placa foi lavada três
vezes com o tampão de lavagem. A preparação da curva de calibração foi feita com
tampões previamente diluídos (Figura 10) e em seguida adicionada 100µL das
amostras em cada poço e incubados por 2 horas. Foi repetida a lavagem como na
etapa anterior, porém, com cinco lavagens para cada placa. Após a lavagem foi
adicionado em cada poço o anticorpo secundário contendo Biotina e a enzima de
aceleração HPR, Todas as placas foram incubadas em ambiente escuro por 1 hora
34
em temperatura ambiente. Após esse tempo todas as placas foram lavadas
novamente com sete lavagens cada e adicionado 100µL da solução substrato
contendo tetrametilbenzeno (TMB) e peroxidade em cada poço, incubado em campo
escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Após esse tempo foi adicionado 50
µL da solução de parada (2N H 2 SO 4 ) em cada poço. As leituras foram realizadas
em 450nm até 30 minutos após a ação da solução de parada.
300µL
Padrão
estoque
500 pg/mL
300µL
250 pg/mL
300µL
125 pg/mL
300µL
62,5 pg/mL
300µL
31,3 pg/mL
300µL
15,6 pg/mL
7,8 pg/mL
Figura 10: Esquema de diluições dos padrões (Fonte: BD OptEIATM )
3.10 Exames hematológicos
Para avaliação hematológica foram realizados os exames de hemograma
completo, incluindo o valor absoluto do hematócrito, contagem global da série
vermelha e série branca, índices hematimétricos e plaquetograma, em equipamento
automatizado da marca ABX, modelo PENTRA 120 RETIC (Figura 11).
Figura 11: Equipamento PENTRA 120, para hemograma (Fonte: SILVA, JT).
35
3.11 Exames Bioquímicos
As dosagens bioquímicas seguiram o protocolo de solicitação dos exames
para pacientes com malária: glicose, uréia, creatinina, bilirrubinas e transaminases,
realizadas através do aparelho DADE BEHRING, modelo X-PAND (Figura 12).
Figura 12: Equipamento DADE X-PAND, para dosagens bioquímicas
(Fonte: SILVA, JT).
3.12 Análise estatística
As informações foram armazenadas em banco de dados no programa Epi-Info
versão 6.04, o qual analisou as seguintes variáveis: comparação das médias pelo
teste “t” de Student; correlação pelo método de Pearson com intervalo de confiança
de 95% para mediar à força de associação entre duas variáveis; níveis de
significância estatística menor ou igual a 5% para rejeitar a hipótese nula (p < 0,05).
36
4. RESULTADOS
4.1 Descrição da casuística
As amostras foram coletadas durante o primeiro episódio do seguimento em
107 (55,2%) dos casos, no segundo episódio em 65 (33,5%), mas houve pacientes
que apresentaram vários episódios, a maior delas (0,5%) apresentou seis episódios
durante o seguimento. No entanto, não foi possível realizar a coleta das amostras
em todos os episódios.
Como este é um estudo de seguimento e acompanhamento, para a análise,
foram consideradas as amostras sangüíneas dos 160 episódios de malária no
primeiro dia do diagnóstico parasitológico positivo pela gota espessa e inicio do
tratamento, denominado de dia zero (D0) e como grupo controle foram coletadas 34
amostras com diagnóstico parasitológico negativo, das mesmas pacientes no
trigésimo quinto dia (D35) após o inicio do tratamento. Algumas pacientes tiveram
mais de um episódio de malária durante o seguimento do estudo, e entre o D0 e D35
foram realizados vários exames parasitológicos para acompanhamento da
densidade parasitária (Figura 13).
D35
34 (17,5%)
D0
160 (82,5%)
Figura 13: Distribuição da coleta das 194 amostras no D0 (n=160) e D35 (n=34).
37
A densidade parasitária média nas 194 amostras foi de 3515,9 parasitos por
milímetro cúbico (DP ± 5242,6); a média dos episódios anteriores de malária foi de
1,6 (DP ± 1,4), considerando todos os episódios que a paciente apresentou ao longo
da sua vida.
A maioria das amostras foi coletada quando as pacientes apresentaram o
primeiro episódio do seguimento: 107 (55,2%) dos casos e no segundo episódio do
seguimento 65 (33,5%); as restantes 22 amostras foram coletadas em pacientes que
apresentaram mais de dois episódios de malária durante o acompanhamento. Houve
uma paciente que apresentou seis episódios de malária durante o seguimento
(Figura 14). Não foi possível realizar a coleta das amostras em todos os episódios.
120
Coleta de amostras (n=194)
100
80
60
40
20
0
1 Episódio
2 Episódios
> 3 Episódios
Figura 14: Episódios de malária durante a coleta das 194 amostras analisadas no
D0 (n=160) e D35 (n=34).
Das 160 amostras analisadas no D0, 45 (28,1%) eram procedentes de
primigestas; 38 (23,8%) eram procedentes de adolescentes; 22 (13,7%) eram
primoinfectadas; 146 (91,3%) estavam grávidas no momento da coleta; 46 (28,8%)
tiveram recorrência parasitária (Tabela 1).
38
Tabela 1: Descrição da casuística no D0 (n=160) dos episódios de malária por
P. vivax em mulheres grávidas atendidas na FMTAM.
Ocorrência
Estado gestacional
Gestantes na coleta
Coleta pós-parto
Faixa etária
Adultas
Adolescentes
Número de gravidez
Gravidez = 1
Gravidez > 1
Número de infecções
Infecção = 1
Infecção > 1
Recorrência parasitária
Sim
Não
n = 160
%
146
14
91,3
8,7
122
38
76,2
23,8
45
115
28,1
71,9
22
138
13,7
86,3
46
114
28,7
71,3
Os sinais clínicos da infecção malárica foram evidenciados em 145 (90,6%)
pacientes, que relataram a tríade clássica dos sintomas clínicos da malária: febre em
118 (76,6%); calafrio em 115 (74,7%) e cefaléia em 127 (82,5%) (Figura 15).
82,5%
130
Frequência
125
76,6%
120
74,7%
115
110
105
Cefaléia
Febre
Calafrio
Figura 15: Sintomas clínicos observados no D0 em mulheres grávidas com
diagnóstico de malária por P. vivax atendidas no ambulatório especial de infecção e
gestação da FMTAM durante o período de março a agosto de 2006.
39
Nos 160 episódios de malária, foi possível fazer diagnóstico com menos de
24 horas de evolução dos sintomas em 37 (26,6%) deles. Nas restantes, a evolução
desses sintomas variou de dois a 21 dias, sendo a maior com 32 dias de evolução
(Figura 16).
40
35
Frequência
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
6
5
7
8
9
10
13
14
18
21
32
Dias de evolução
Figura 16: Distribuição dos episódios de evolução da malária segundo os
dias de sintomas.
Com relação à paridade ao momento da coleta, 178 (91,8%) amostras foram
coletadas em pacientes quando ainda gestantes, mas por tratar-se de um estudo de
seguimento, uma delas foi coletada no dia do parto; três nos primeiros sete dias
após o parto; quatro foram coletadas entre o dia oito e 28 dias após o parto; três
entre os 29 e 180 dias após o parto e cinco delas em pacientes não grávidas
(Figura 17).
Não grávidas
2,7
1,5
29 a 180 dias após parto
2,0
8 e 28 dias após parto
< 7 dias após parto
1,5
Dia do parto
0,5
91,8%
Grávidas
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Figura 17: Distribuição das pacientes segundo o estado obstétrico no
momento da coleta nas 194 amostras analisadas no D0 (n=160) e
D35 (n=34).
40
4.2 Análise do perfil de citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 coletadas no D0 e
D35.
Entre os níveis das citocinas encontradas nas 160 amostras de soro
coletadas no D0 dos episódios de malária, o TNF-α foi a citocina que apresentou a
menor concentração (135 pg/mL), com uma média de 2,9 pg/mL e desvio padrão de
12,7. A IL-10 foi a citocina que apresentou a maior concentração (598,3 pg/mL) com
uma média de 162,2 pg/mL e desvio padrão de 187,3. O valor 0 (zero) foi atribuído
como resultado negativo, ou seja, ausência de citocinas, e os valores acima de 0
(zero), foram considerados positivos (Tabela 2).
Tabela 2: Distribuição dos níveis das citocinas segundo as concentrações
encontradas.
CITOCINAS
n
Min (pg/mL)
Max (pg/mL)
Med (pg/mL)
DP
TNF-α
160
0
135,0
2,9
12,7
IL-6
160
0
456,0
51,9
106,3
IL-8
160
0
299,1
40,8
54,1
IL-10
160
0
598,3
162,2
187,3
O TNF-α (A) foi a citocina com a menor concentração detectada, onde a
maioria das amostras no D0 e no D35, ficaram abaixo de 40 pg/mL. A IL-6 (B) foi
detectada no D0 acima de 100 pg/mL, porém com baixo nível no D35. A IL-8 (C) foi
semelhante aos níveis da IL-6 (B). A IL-10 (D), foi a citocina que apresentou os
maiores níveis, ficando acima de 200 pg/mL (Figura 18).
41
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 18: Comparação dos títulos de citocinas encontradas nas amostras do
D0 (n=160) e D35 (n=34).
A concentração das citocinas, comparando a coleta das amostras no D0 e
D35, mostrou uma correlação positiva estatisticamente significativa para as citocinas
IL-6 (p<0,01); IL-8 (p<0,05) e IL-10 (p<0,01). Contudo não mostrou correlação
positiva estatisticamente significativa com o TNF-α (p>0,05). O TNF-α foi a citocina
com o menor número encontrado no D0 (26/160) e D35 (7/34). A IL-8 e IL-10
apresentaram um maior número no D0 (138/160 e 147/160 respectivamente). A IL-8
também teve correlação positiva estatisticamente significativa apresentando um
maior número no D35 (30/34) (Tabela 3).
D0 (160)
D35 (34)
42
CITOCINAS
Presença (n %) Ausência (n %) Presença (n %) Ausência (n %)
p*
TNF-α
26 (16,2)
134 (83,8)
7 (20,6)
27 (79,4)
> 0,05
IL-6
98 (61,2
62 (38,8)
7 (20,6)
27 (79,4)
< 0,01
IL-8
138 (86,2)
22 (13,8)
30 (88,2)
4 (11,8)
< 0,05
IL-10
147 (91,9)
13 (8,1)
16 (47,1)
18 (52,9)
< 0,01
Tabela 3: Distribuição qualitativa de citocinas em 194 amostras analisadas no
D0 (n=160) e D35 (n=34).
* Análise estatística do teste “t” de student
As amostras das citocinas coletadas no D0 e D35 mostraram uma média dos
títulos com diferença estatisticamente significativa para IL-6 (p<0,01); IL-8 (p<0,05) e
IL-10 (p<0,01). Contudo não houve significância estatística para o TNF-α (p>0,05),
pois esta citocina apresentou uma média de 2,9 pg/mL com desvio padrão de 12,7
no D0 e 1,9 pg/mL com desvio padrão de 4,7 no D35. A IL-6 apresentou uma média
de concentração de 51,9 pg/mL com desvio padrão de 12,7 no D0 e média de 12,3
pg/mL e desvio padrão de 64,0 no D35. A IL-8 e IL-10, ao contrário das demais,
mostraram uma maior concentração no D35 (18,5 pg/mL e 12,5 pg/mL
respectivamente (Tabela 4).
Tabela 4: Comparação da média das citocinas em 194 amostras analisadas no
D0 (n=160) e D35 (n=34).
CITOCINAS
D0 (160)
D35 (34)
p*
TNF-α
2,9 ± 12,7
1,9 ± 4,7
> 0,05
IL-6
51,9 ± 12,7
12,3 ± 64,0
< 0,01
IL-8
2,9 ± 12,7
18,5 ± 16,6
< 0,05
IL-10
2,9 ± 12,7
12,5 ± 46,4
< 0,01
* Análise estatística do teste “t” de student
Quando foram comparadas à média da concentração das citocinas no D0 de
mulheres grávidas (n=146) com mulheres não grávidas (n=14), não foi encontrada
diferença estatisticamente significativa (p>0,1 e p>0,5). O TNF-α foi a citocina com a
menor média de concentração encontrada: 3,2 pg/mL nas grávidas e 0,3 pg/mL em
não grávidas. A IL-10 foi a citocina com a maior média de concentração encontrada:
158,7 pg/mL em grávidas e 204,9 pg/mL em não grávidas. A IL-6 mostrou resultados
43
semelhantes entre grávidas e não grávidas (51,9 pg/mL e 51,0 pg/mL
respectivamente). A IL-8 teve uma média mais elevada nas não grávidas
(76,5 pg/mL) (Tabela 5).
Tabela 5: Média das concentrações de citocinas entre as 160 amostras coletadas
em grávidas (n=146) e não grávidas (n=14).
CITOCINAS
Grávidas (146)
Não grávidas (14)
p*
3,2 ± 13,3
0,3 ± 1,3
> 0,1
IL-6
51,9 ± 107,7
51,0 ± 94,6
> 0,5
IL-8
37,4 ± 49,4
76,5 ± 83,2
> 0,1
TNF-α
IL-10
158,7 ± 181,9
204,9 ± 240,2
* Análise estatística do teste “t” de student
> 0,1
Na análise da concentração das citocinas nas amostras coletadas no D0 das
pacientes sem antecedentes de infecções maláricas prévias (primoinfectadas)
(n=22), com aquelas que apresentaram pelo menos uma infecção anterior (n=138),
não mostrou diferença estatisticamente significativa para as diferentes citocinas
estudadas (p>0,1 e p>0,5) (Tabela 6).
Tabela 6: Comparação da média de citocinas entre os 160 episódios de malária em
pacientes primoinfectadas (n=22) e as que relataram mais de uma infecção (n=138).
CITOCINAS
Primoinfectadas (22)
> 1 Infecção (138)
p*
2,27 ± 6,30
3,03 ± 13,50
> 0,5
IL-6
30,64 ± 65,60
55,28 ± 111,28
> 0,5
IL-8
25,59 ± 31,20
43,27 ± 56,55
> 0,1
172,34 ± 190,63
> 0,1
TNF-α
IL-10
102,46 ± 155,10
* Análise estatística do teste “t” de student
44
A média dos níveis de citocinas tanto nas pacientes sem antecedentes de
infecções maláricas prévia (primoinfectadas) quanto nas que relataram pelo menos
uma infecção anterior, foi variada. O TNF-α (A) mostrou baixa concentração (média
de 2,65 pg/mL) em ambos os casos. A IL-6 (B) apresentou em algumas pacientes
níveis muito elevados (acima de 300 pg/mL), tanto em pacientes primoinfectadas
quanto nas com mais de uma infecção. A IL-8 (C) apresentou resultados
semelhantes com a IL-6 (B), e a IL-10 (D) apresentou uma maior concentração em
ambas as infecções, com uma média acima de 100 pg/mL (Figura 19).
(A)
(C)
(B)
(D)
Figura 19: Comparação da média dos níveis de citocinas em amostras coletadas no
D0 das pacientes sem antecedentes de malária (n=22), com aquelas que
apresentaram pelo menos uma infecção (n=138).
45
Na média da concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 entre
as pacientes primíparas (n=45) e as multíparas (n=115) infectadas, não foi
observada significância estatística (p>0,1 e p>0,5) (Tabela 7).
Tabela 7: Média das citocinas nas 160 amostras analisadas no D0 entre as
primíparas (n=45) e multíparas (n=115).
CITOCINAS
Gravidez = 1 (45)
Gravidez > 1 (115)
p*
2,0 ± 5,0
3,2 ± 14,7
> 0,1
IL-6
67,2 ± 135,6
45,9 ± 92,4
> 0,5
IL-8
41,7 ± 49,0
40,5 ± 56,0
> 0,5
155,4 ± 180,0
> 0,1
TNF-α
IL-10
181,3 ± 205,6
* Análise estatística do teste “t” de student
Nas amostras analisadas no D0 (n=160), a média dos níveis encontrados,
não apresentaram diferenças estatísticas (p>0,1 e p>0,5), quando comparadas entre
as pacientes primíparas e as que relataram mais de uma gravidez. No TNF-α (A) foi
encontrada baixa concentração (média de 2,6 pg/mL) em ambas as freqüências. As
interleucinas IL-6 (B) e IL-8 (C), tiveram resultados aproximados, apresentando em
algumas amostras concentração acima de 200 pg/mL em ambas as freqüências. Na
IL-8 foi encontrado uma concentração acima de 300 pg/mL em pacientes com mais
de uma gravidez. A IL-10 (D) também apresentou uma concentração acima de 200
pg/mL em ambos os casos (Figura 20).
46
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 20: Distribuição dos níveis de citocinas nas amostras coletadas no D0
segundo a freqüência de gravidez entre pacientes primíparas (n=45) e multíparas
(n=115).
47
4.3 Correlação da densidade parasitária e a concentração de citocinas
Segundo a análise estatística, foi encontrada uma correlação positiva
estatisticamente significativa em relação à densidade parasitária, expressa em
parasitos por milímetro cúbico (DP/mm3), com o TNF-α (A) (p<0,05); IL-6 (B)
(p<0,01)
e
IL-10
(D)
(p<0,01).
Contudo
não
houve
correlação
positiva
estatisticamente significativa com a IL-8 (C) (p>0,054), muito embora essa
correlação talvez fosse positiva e estatisticamente significativa, se tivéssemos
analisado um número maior de amostras, pois o índice de confiança ficou próximo
de 95% (p>0,054).
(A)
(C)
(B)
(D)
Figura 21: Correlação entre a densidade parasitária, expressa em parasitos por
milímetro cúbico (DP/mm3) e a concentração de citocinas nas amostras coletadas no
D0 (n=160).
48
4.4 Correlação da evolução dos sintomas em dias e a concentração de
citocinas
Observamos pela análise estatística que a correlação da evolução dos
sintomas em dias e as concentrações das citocinas nas amostras coletadas no D0
(n=160), não mostraram significância estatística (p>0,05).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 22: Correlação entre os dias de evolução dos sintomas (DES) e a
concentração de citocinas nas amostras coletadas do D0 (n=160).
49
4.5 Correlação do número de episódios anteriores de malária e a concentração
de citocinas
A análise da correlação entre o número de episódios anteriores de malária
(NEAM) e as concentrações das citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160),
mostrou que não houve correlação positiva estatisticamente significativa (p>0,05)
(Figura 23).
(A)
(C)
(B)
(D)
Figura 23: Correlação entre o número de episódios anteriores de malária (NEAM) e
a concentração das citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
50
4.6 Correlação da paridade e a concentração de citocinas
Na correlação entre o número de paridades com a concentração das
citocinas, foi observado que não houve uma correlação positiva estatisticamente
significativa entre ambos (p>0,05) (Figura 24).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 24: Correlação do número de paridade com as citocinas em amostras
coletadas de mulheres grávidas no D0 (n=160).
51
4.7 Correlação da duração da amenorréia medida em semanas e a
concentração de citocinas
Na avaliação da correlação da duração da amenorréia, a qual foi estimada
numericamente em semanas de gravidez com as citocinas, não mostrou correlação
positiva estatisticamente significativa (p>0,05). Contudo houve uma correlação
negativa estatisticamente significativa com IL-10 (D) (p<0,01). A análise mostra que
quanto maior duração da amenorréia, menor será a produção da IL-10 (D)
(Figura 25).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 25: Correlação da amenorréia, distribuída numericamente em semanas de
gravidez com a concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
52
4.8 Correlação da hemoglobina e a concentração de citocinas
A concentração da hemoglobina, expressa em g/dL, quando correlacionada
com a concentração das citocinas, não mostrou correlação positiva estatisticamente
significativa (p>0,05) (Figura 26).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 26: Correlação da hemoglobina, expressa em g/dL, e a concentração de
citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
53
4.9 Correlação da glicose e a concentração de citocinas
Na análise estatística da correlação entre a dosagem de glicose, expressa em
mg/dL, e
a concentração de citocinas,
não
mostrou
correlação
positiva
estatisticamente significativa (p>0,05).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 27: Correlação da glicose, expressa em mg/dL, e a concentração de
citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
54
4.10 Correlação da creatinina e a concentração de citocinas
Quando analisado a correlação entre a dosagem da creatinina, expressa em
mg/dL, e a concentração de citocinas, foi evidenciada uma correlação positiva
estatisticamente significativa com IL-6 (B) (p<0,01), IL-8 (C) (p<0,05) e IL-10 (D)
(p<0,05). Contudo não houve correlação significativa com TNF-α (A) (p>0,05).
Todavia, essa correlação talvez fosse positiva e estatisticamente significativa, se
fosse detectado um número maior TNF-α nas amostras analisadas, pois seus níveis
foram pouco encontrados em ambos os momentos da coleta (Figura 27).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 28: Correlação da creatinina, expressa em mg/dL e a concentração de
citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
55
4.11 Correlação das bilirrubinas e a concentração de citocinas
Em relação à correlação entre dosagem da bilirrubina total e suas frações
(direta e indireta) expressas em mg/dL, com a concentração de citocinas, ficou
comprovada algumas divergências estatisticamente significativas entre esses
metabólitos.
A correlação entre a dosagem da bilirrubina total e a concentração de
citocinas, mostrou que tem correlação positiva e estatisticamente significativa com a
IL-6 (B) (p<0,05), IL-8 (C) (p<0,05) e IL-10 (D) (p<0,05). Porém não apresentou
correlação positiva estatisticamente significativa com TNF-α (A) (p>0,05) (Figura 29).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 29: Correlação entre a dosagem da bilirrubina total, expressa em mg/dL e a
concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
56
Na correlação entre a dosagem da bilirrubina direta, expressa em mg/dl, e a
concentração
de
citocinas,
ficou
comprovado
uma
correlação
positiva
estatisticamente significativa com a IL-6 (B) (p<0,05), IL-8 (C) (p<0,05) e IL-10 (D)
(p<0,05). Mas não apresentou correlação positiva estatisticamente significativa com
o TNF-α (A) (p>0,05) (Figura 30).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 30: Correlação entre a dosagem da bilirrubina direta, expressa em mg/dL e a
concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
57
Na análise da correlação entre a dosagem da bilirrubina indireta e a
concentração de citocinas, foi demonstrado uma correlação positiva estatisticamente
significativa com a IL-6 (B) (p<0,05), IL-8 (C) (p<0,05) e IL-10 (D) (p<0,05). Todavia,
não mostrou correlação significativa com TNF-α (D) (p>0,05) (Figura 31).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 31: Correlação entre a dosagem da bilirrubina indireta, expressa em mg/dL, e
concentração de citocinas nas amostras coletadas no D0 (n=160).
58
4.12 Resumo dos resultados
Diante dos resultados encontrados em relação aos objetivos do trabalho, e a
correlação com os parâmetros da densidade parasitária; dias de evolução dos
sintomas clínicos da malária vivax; histórico de episódios anteriores de infecções;
paridade; amenorréia; exames hematológicos (hemoglobina) e bioquímicos (glicose,
creatinina e bilirrubinas), a tabela 8 demonstra todas as correlações positivas e
negativas estatisticamente significativas em relação às citocinas estudadas.
Todas as citocinas estudadas tiveram uma correlação positiva estatisticamente
significativa com a densidade parasitária. Todavia, não houve correlação positiva e
estatisticamente significativa com os dias de evolução dos sintomas, episódios
anteriores de malária e a paridade. A amenorréia, distribuída em semanas de
gravidez, apresentou correlação positiva estatisticamente significativa com a IL-10.
Nenhuma das citocinas analisadas apresentou correlação positiva e estatisticamente
significativa com a hemoglobina e a glicose.
As citocinas IL-6, IL-8 e IL-10
apresentaram correlações positivas e estatisticamente significativas com a creatinina
e a bilirrubina total e frações (direta e indireta). O TNF-α foi a única citocina que não
apresentou correlação positiva com as variáveis analisadas, com exceção da
densidade parasitária, onde esta correlação foi positiva e estatisticamente
significativa (Tabela 8).
Tabela 8: Resumo das correlações positivas e negativas nas 160 amostras de
citocinas analisadas no D0.
Correlações
TNF-α
IL-6
IL-8
IL-10
Densidade Parasitária
sim
sim
sim
Sim
Dias evolução sintomas
não
não
não
não
Episódios anteriores
não
não
não
não
Paridade
não
não
não
não
Amenorréia
não
não
não
Sim
Hemoglobina
não
não
não
não
Glicose
não
não
não
não
Creatinina
não
sim
sim
Sim
Bilirrubina total
não
sim
sim
Sim
Bilirrubina direta
não
sim
sim
Sim
Bilirrubina indireta
não
sim
sim
Sim
59
5. DISCUSSÃO
Na gravidez o sistema imunológico da mulher se encontra alterado, mas
controlado para o desenvolvimento do concepto, no entanto a situação se modifica
quando a grávida adquire malária neste período, pois o organismo enfrenta um
combate duplo, onde por um lado tenta proteger a ambos e por outro tenta combater
a agressão promovida pelo parasito (Núñes-González et al., 2001; Jurande et al.,
2003).
Nos resultados encontrados, os níveis de TNF-α apresentaram baixa
concentração em um número pequeno de pacientes. Resultados semelhantes
também foram encontrados em pacientes com mais de um episódio de malária e em
relação às demais citocinas estudadas. O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória
produzida, principalmente, durante a fase aguda da infecção e sua secreção é
induzida pela estimulação dos macrófagos, provavelmente sua baixa concentração
esteja relacionada com o grau de imunidade em mulheres com mais de um episódio
de malária. Como esse estudo foi com pacientes com malária não grave, foi
constatada uma baixa concentração desta citocina, pois a literatura relata que os
níveis elevados do TNF-α estão mais presentes em malária grave e malária cerebral
(Tanaka, 1993; Lyke et al., 2004).
Os resultados corroboram aos encontrados por Tanaka (1993) que avaliou o
perfil do TNF-α em indivíduos com malária grave na Amazônia, onde encontrou
correlação entre a parasitemia e níveis de TNF-α. Embora que, a dispersão dos
valores do TNF-α em relação às outras citocinas estudadas, deva estar atribuída ao
momento da coleta do sangue. Mendis et al., (1990) demonstraram que os níveis de
TNF-α aumentaram transitoriamente após o paroxismo produzido, principalmente,
pela liberação de merozoítos dos esquizontes maduros, diminuindo, quatro horas
após, o início do paroxismo. Na análise dos resultados foi encontrado um elevado
percentual (83,8% no D0 e 79,4% no D35) de pacientes com níveis indetectáveis de
TNF-α, possivelmente devido à coleta ter sido realizada muito tempo após o
paroxismo. Contudo, são necessários estudos futuros para melhor compreender a
associação desta citocina em gestantes com malária por P. vivax.
60
Não foi encontrada uma correlação positiva e estatisticamente significativa
entre a freqüência do número de gravidez e as citocinas estudadas. A maior parte
das amostras analisadas no D0 foi de pacientes que relataram acima de uma
gravidez (71,9%). Contudo, estudos semelhantes demonstraram que o TNF-α é
considerado uma das principais citocinas participantes da gestação e patologias
relacionadas; sua concentração em grávidas mostra variações que dependem da
idade gestacional (Núñes-González et al., 2001). Também a malária, em mulheres
primigestas, parece causar alterações significativas na síntese de citocinas na
placenta, com associação de níveis séricos elevados de TNF-α em infecção por
P. vivax quando comparado com P. falciparum (Moormann, 1999). Nossos
resultados são divergentes dessa informação, pois não encontramos níveis elevados
de TNF-α em grávidas primigestas com malária vivax.
Os níveis de TNF-α não apresentaram uma correlação estatisticamente
significativa com os níveis da IL-6 e as demais citocinas. Esses dados são
divergentes aos achados por outros estudos (Yildiz et al., 2006), onde estas duas
citocinas apresentaram concentrações elevadas em pacientes com alta densidade
parasitária na malária por P. vivax, porém, em pacientes não grávidas. Ambas são
citocinas com propriedades pró-inflamatórias semelhantes e possuindo sinergismo
entre si, o que sugere que ambas estejam presentes na fase aguda da infecção.
Embora, nos resultados encontrados, os níveis de TNF-α tenham sido bem abaixo
do esperado, a IL-6 apresentou uma elevação maior na maioria das pacientes no D0
(média de 51,9 pg/mL), e também ainda estava presente em amostras das mesmas
pacientes no D35 (média de 12,3 pg/mL), enquanto que o TNF-α manteve-se em
baixa concentração em ambos os momentos da coleta (média de 2,9 pg/mL e
1,9 pg/mL no D0 e D35, respectivamente).
A IL-6 apresentou uma correlação positiva e estatisticamente significativa com
a IL-10, cujos resultados de ambas foram muito próximos, principalmente, no D35
(média de 12,3 pg/mL para IL-6 e 12,5 pg/mL para IL-10). Sugerindo que durante o
estudo ocorreu um antagonismo, pois a IL-10 é uma citocina supressora da resposta
imune, que possui propriedade antagônica a IL-6, ou seja, inibição da ativação dos
macrófagos, que é uma das principais células de síntese desta citocina (Day et al.,
1999). Os efeitos mediadores das citocinas na malária foram, inicialmente,
61
demonstrados na malária grave e malária cerebral, onde a oscilação da febre no
paroxismo se mostrou equiparado com os níveis de TNF-α (Shaffer et al., 1991;
Mendis e Carter, 1995).
A resposta pró-inflamatória na malária por P. vivax, parece ter uma maior
importância durante o período de aumento da parasitemia, o que leva a um processo
sistêmico na ativação e secreção de várias citocinas, principalmente a IL-6, as quais
parecem ter um papel importante na resposta imune (Yildiz et al., 2006). Nas
grávidas, possivelmente, ocorre o mesmo processo, pois foi encontrada correlação
positiva e estatisticamente significativa entre a densidade parasitária e os níveis
elevados de TNF-α, IL-6 e IL-10. Contudo, não foi encontrada uma correlação com
os níveis de IL-8. Estes dados corroboram aos dados encontrados por Yildiz et al.
(2006), onde também não foi encontrada significância estatística em pacientes com
malária por P. vivax em regiões endêmicas na Turquia, sugerindo que a IL-8 esteja
mais relacionada com a malária grave cerebral, como relatam outros estudos (Lyke
et al., 2004).
Esse estudo foi realizado em mulheres grávidas com malária não grave, onde
foi encontrado níveis mais elevados de IL-6 no D0 (média de 51,9 pg/mL), quando
comparada com a IL-8 (média de 2,9 pg/mL). Também não foi encontrada uma
correlação da IL-8 e o número de parasitos. Embora, a IL-8 tenha apresentado
baixos níveis no D0 (média de 2,9 pg/mL), apresentou uma concentração mais
elevada no D35 (média de 18,5 pg/mL) em comparação com a IL-6 (média de
12,3 pg/mL) no mesmo momento da coleta. Outros estudos mostram que a IL-6 e
IL-8 estão relacionadas com a malária grave (Day et al., 1999).
Sabe-se que a IL-8 possui propriedade quimiocinética e é uma quimiocina que
estimula a migração de neutrófilos (Day et al., 1999), estando relacionada com
muitas doenças infecciosas, inclusive com a malária. Pouco se sabe sobre o papel
da IL-8 na patogênese da malária, contudo, reações in vitro, têm comprovado que a
síntese de lipopolissacarideos e IL-10 são fortes inibidores na produção de IL-8
(Marie et al., 2000).
62
Este estudo demonstrou correlação positiva e estatisticamente significativa da
IL-8 com a IL-10, onde a média dos níveis da IL-10 foi elevada (média de
158,7 pg/mL no D0 e 204,9 pg/mL no D35) quando comparada com a média da IL-8
(média de 37,4 pg/mL no D0 e 76,6 pg/mL no D35). A produção da IL-10 parece ser
natural em grávidas e pode estar com concentrações aumentadas, quando estas
adquirem malária. Contudo, é sugestivo que a IL-8 pode ter sua produção inibida,
pela síntese de IL-10, a qual parece ser produzida em grande quantidade em
mulheres grávidas com malária não grave, como de fato ocorreu no presente estudo.
Estudos realizados por Alecrim et al., (2000), na Amazônia, comprovam que
ocorre uma diferença significativa entre os sintomas da malária na gestante e os
observados na não gestante, onde geralmente a parasitemia da malária é mais
intensa nas grávidas do que entre as não grávidas. Entretanto, o grau de
parasitemia é diferente durante todo o período gestacional, sendo observado
aumento durante as primeiras semanas e uma redução mais próxima do parto
(Martinez-Espinosa, 1998). Embora, estudos futuros sejam necessários para melhor
compreender este mecanismo de associação entre a parasitemia e as citocinas nas
grávidas com malária, os resultados mostraram que tanto as citocinas pró e
antiinflamatórias estão diretamente associadas à parasitemia também em grávidas
com malária por P. vivax.
Não foi evidenciada uma correlação positiva entre as concentrações de
citocinas, o número de episódios anteriores de malária e os dias de evolução dos
sintomas, o que sugere que os níveis elevados de citocinas tanto pró-inflamatórias
(IL-6) quanto antiinflamatórias (IL-10) estejam predominantemente mais elevados na
fase aguda da infecção. Embora, tenham sido encontrados em algumas grávidas,
níveis elevados de citocinas, principalmente a IL-10, no D35, o que demonstra que a
IL-10 parece ser produzida naturalmente durante a gravidez (Jurande, 2003). As
formas graves da doença são mais freqüentes em indivíduos não expostos à
infecção e primoinfectados provenientes de áreas com pouca ou nenhuma
transmissibilidade (Baird, 1995), e também, estão associados à virulência da cepa
do parasito (Gupta et at., 1994).
63
Apesar da maioria das pacientes estudadas terem relatado mais de uma
infecção malárica (86,2%), os resultados não evidenciaram uma associação dos
episódios anteriores de malária com as citocinas estudadas, sugerindo que a
produção dessas citocinas seja autolimitada, ou seja, param de ser produzidas com
a cura da infecção. Alguns autores consideram que o risco de desenvolver malária
grave ou complicada é três vezes maior entre as grávidas (Luxemburger et al.,
1997), especialmente as primigestas (Martinez-Espinosa, 1998) e/ou aquelas
procedentes de áreas hiperêndemicas ou de transmissão instável (Jurande, 2003).
Neste último caso, quando as grávidas não têm uma imunidade prévia, também
estão mais suscetíveis a desenvolver a forma grave da doença (MartinezEspinosa,1998; Jurande, 2003).
Não foi observada correlação positiva entre anemia e a concentração das
citocinas, apesar da baixa concentração de hemoglobina sanguínea nas grávidas,
presente no momento da coleta no D0. A anemia é uma complicação freqüente
associada à própria fisiologia da gravidez, ao estado nutricional como na anemia
ferropriva, infecção por helmintos e protozoários, déficit de ferro, folatos,
hemoglobinopatias, como anomalias na hemoglobina S na anemia falciforme e
infecções patológicas como a malária e HIV (Fleming, 1989; Martinez-Espinosa,
1998). Este é um dos problemas obstétricos mais comuns com conseqüências
graves tanto para a mãe quanto para o concepto (Mutabingwa et al., 1993). A
gravidez associada à malária pode ser um importante fator de risco para outras
infecções primárias e secundárias, como potencializar o efeito da anemia (Brabin,
1985). No entanto, este estudo não demonstrou uma correlação positiva da baixa
concentração da hemoglobina com as concentrações séricas de TNF-α, IL-6, IL-8 e
IL-10.
Não houve correlação estatisticamente significativa da anemia (avaliada
através da hemoglobina) com as citocinas, no entanto, existem relatos na literatura
comprovando que os níveis elevados de TNF-α têm correlação positiva em
indivíduos com malária e anemia grave, uma vez que tal citocina apresenta
propriedade inibidora da eritropoese (Freitas, 2004). Nos dados encontrados não há
correlação de níveis elevados do TNF-α em pacientes anêmicas. Esses resultados
não corroboram com os estudos de Freitas (2004), onde foi demonstrado que
64
concentrações elevadas do TNF-α poderiam estar refletindo o efeito antiparasitário
dessa citocina, ou seja, poderia agir no controle da infecção e, consequentemente,
na gravidade da anemia. Este estudo demonstrou resultados com correlação
positiva e estatisticamente significativa do TNF-α com a densidade parasitária.
Foram encontrados altos níveis de IL-10 (média de 162,2 pg/mL) e baixos
níveis
de
TNF-α
(média
de 2,9 pg/mL). Porém, não houve
correlação
estatisticamente significativa de ambas com o grau de anemia das grávidas com
malária, sugerindo que ocorreu uma inibição da produção do TNF-α pela excessiva
concentração da IL-10 presente nas amostras analisadas. Estudo realizado por
Freitas (2004), em localidades do Estado do Pará, relatou que altos níveis de IL-10,
encontrados em pacientes anêmicos com infecção malárica, podem indicar um efeito
potencializador da resposta de anticorpos contra o parasito, que se traduziria em
uma maior retirada de eritrócitos da circulação. Outra interpretação residiria no efeito
antiinflamatório da IL-10, cujo aumento nas pacientes anêmicas refletiria a
necessidade e tentativa de controle na produção excessiva de TNF-α, que levaria ao
desenvolvimento de formas graves de anemia.
Nos exames bioquímicos das gestantes com malária não ficou evidente a
correlação entre glicemia e citocinas, entretanto mulheres grávidas são naturalmente
mais susceptíveis a desenvolver hipoglicemia devido ao aumento das células beta
do pâncreas, e isto é agravado, principalmente, nas infecções por P.falciparum,
provavelmente pelo estímulo da produção de insulina. Outros fatores importantes
seriam explicados pela redução nutricional na ingestão alimentar, maior consumo de
glicose pelos parasitos circulantes no sangue periférico, além do efeito hipoglicêmico
das citocinas de fase aguda, principalmente o TNF-α, e também o maior consumo de
glicose durante os episódios de paroxismo febris, onde estes efeitos podem
contribuir com a hipoglicemia no decorrer da gravidez (Martinez-Espinosa, 1998;
Jurande, 2003, Santos et al., 2003).
Embora não tenha sido encontrada a correlação entre a hipoglicemia e o
TNF-α neste estudo, a IL-10 apresentou níveis elevados (média de 162,2 pg/mL),
pois esta citocina possui, entre suas propriedades, a função regulatória e inibitória
sobre a produção do TNF-α, que foi encontrado em menor concentração (média
65
de 2,9 pg/mL) nas pacientes estudadas. Os efeitos conseqüentes da hipoglicemia
são mais freqüentes e complicados em mulheres grávidas com infecções graves e
primoinfectadas, ou seja, com pouca ou nenhuma imunidade.
Em mulheres com malária e com alguma imunidade, a glicose no sangue é
mais difícil de ser avaliada, pois neste caso as grávidas são frequentemente
assintomáticas (Jurande, 2003). Porém, a hipoglicemia materna pode ser
responsável pela redução de peso do concepto em associação com a parasitemia
no sangue periférico sem infecção placentária, mas com anemia materna acentuada
(Martinez-Espinosa, 1998; Jurande, 2003).
Nos casos mais graves de malária, as sequestrinas, presentes na superfície
das hemácias parasitadas por plasmódios, promovem a sua aderência em células
endoteliais através da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), receptor de
trombospondina, integrinas e glicoforina CD46 (Nakazawa et al., 1998; Turner et al.,
1998). Este fenômeno pode ser ativado por citocinas, por exemplo, o TNF-α, na pele
e outros sítios como o sistema nervoso central (SNC) e trato gastrintestinal (Santos
et al., 2003). Este fato poderia explicar a hipoglicemia, diarréia e alteração de
consciência em alguns casos (Santos et al., 2003).
Em geral, os acessos maláricos são acompanhados de intensa debilidade
física, associada a náusea, febre, calafrios e vômitos (OMS, 2000). As alterações
hematológicas mais freqüentes são a trobocitopenia, quase sempre acompanhadas
de leucocitose, com baixa concentração de hematócrito, e hemoglobina. Nas
alterações bioquímicas são observadas elevações na uréia, creatinina, bilirrubinas e
transaminases (AST/ALT). O aumento da uréia e creatinina são indicativos
laboratoriais de evolução da malária grave por insuficiência renal aguda (IRA), onde
a creatinina sérica é > 3,0 mg/dL; uréia > 60 mg/dl; bilirrubinas e transaminases
estão aumentadas três vezes em relação ao valor normal (OMS, 2000; FUNASA,
2001).
Nos achados laboratoriais, foram encontradas diferenças estatisticamente
significativa em relação ao aumento da creatinina e bilirrubinas com as citocinas
(exceto com o TNF-α, p>0,05). Os indicadores laboratoriais da evolução clínica na
66
gravidade da malária parecem não ter diferenças clínicas nas grávidas com malária
quando comparados com não grávidas com a mesma infecção. Estudos anteriores
com malaria grave (Day et al., 1999) relatam uma associação da insuficiência renal
com níveis elevados de TNF-α, mas pouco ou não elevados com relação a IL-6 ou
IL-10,
apesar
da
creatinina
plasmática
ter
sido
encontrada
fracamente
correlacionada com a IL-10.
Esses dados são divergentes dos achados neste estudo, pois foi encontrada
correlação estatisticamente positiva da creatinina com a IL-6, IL-8 e IL-10. Talvez
pelo fato do TNF-α ter apresentado baixa concentração (média de 2,9 pg/mL) em
relação as demais citocinas, não foi possível fazer a correlação de Pearson. Outra
hipótese seria o fato de altos níveis de TNF-α ser encontrado, geralmente, na
malária
grave.
Como
a
concentração
de
creatinina
e
bilirrubinas foram
correlacionadas positivamente com os níveis elevados das citocinas IL-6, IL-8 e
IL-10.
Assim,
podemos
sugerir
que
essas
citocinas
sejam
secretadas
proporcionalmente na fase aguda da doença, pois ocorre um declínio e
normalização tanto dos exames bioquímicos quanto das citocinas após o início do
tratamento, estando diretamente relacionadas à função renal e hepática nas
grávidas.
67
6. CONCLUSÃO
6.1 O presente estudo mostrou concentrações elevadas das citocinas IL-6, IL-8 e
IL-10 no D0 e baixos níveis no D35, quando as amostras foram comparadas em
ambos os momentos da coleta. .
6.2 A IL-10 se manteve com níveis elevados após o tratamento e após o D35
algumas pacientes.
6.3 Em relação às demais citocinas, o TNF-α se manteve proporcionalmente com
baixa concentração tanto do D0 quanto no D35.
6.4 A freqüência da concentração das citocinas estudadas comprovou ser
proporcional em relação à densidade parasitária.
6.5 Essa pesquisa mostrou que não há uma associação entre a concentração das
citocinas estudadas com o número de episódios anteriores de malária e o tempo de
evolução dos sintomas clínicos em dias nas grávidas com infecção por P. vivax.
6.6 Nos resultados do estudo, houve a ausência da correlação da hemoglobina e
glicose com as concentrações das citocinas analisadas. Todavia, mostram que os
níveis da IL-6, IL-8 e IL-10 são proporcionalmente elevados quando correlacionados
com a creatinina e as bilirrubinas.
6.7 Os resultados comprovaram que o TNF-α foi a única citocina que não teve
correlação positiva com os parâmetros dos exames hematológicos e bioquímicos.
68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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75
ANEXO – A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – TCLE
Eu, -------------------------------------------------------------------------------, RG----------------------,
domiciliada nesta cidade, à rua --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,
declaro de livre e espontânea vontade querer participar do estudo “Perfil de
citocinas em mulheres grávidas com malária por Plasmodium vivax
acompanhadas na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”. Autorizo o
uso dos dados obtidos da minha participação só para fins do presente estudo e
sempre que se guarde sigilo absoluto sobre a minha pessoa. Declaro que me foi
explicado que as informações que eu fornecerei e ajudarão no conhecimento de
como a malária afeta as mulheres e no caso das grávidas como afeta as crianças.
Me foi informado também que minha participação consiste em responder algumas
perguntas e que algumas amostras de sangue poderão ser tiradas da minha veia, do
meu dedo ou do sangue do cordão do meu bebê recém-nascido, e que alguns
pedacinhos da placenta serão guardados para estudos posteriores. Sei que posso
me negar a fazer parte do estudo a qualquer momento que eu desejar e que em tal
caso não sofrerei eu nem minha família nenhum tipo de castigo por isto, também
não deixarei de ter atendimento médico e terei direito a tratamento se eu chegar a
ter malária. Em caso de malária só receberei a medicação que o Ministério da Saúde
recomenda para minha idade e minha condição. Minha participação na pesquisa não
representara para mim nenhum risco e também não terei nenhum pagamento em
dinheiro nem em outra espécie. Sei que em caso de dúvida posso procurar
informação e/ou ajuda a qualquer momento na pessoa do Dr. Jander Torres
([email protected]) e da Dra. Flor Martínez ([email protected])
responsável pelo estudo, na Gerência de Malária da Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas (FMTAM) ou em caso de Urgência nos telefones:
9116-8241, 9126-4657, 9902-1158 e 3228-5748.
__________________________________________________ Data ___/___/___
Assinatura do Sujeito da Pesquisa ou do Responsável (No caso de menores de idade)
76
ANEXO – B
FICHA DE DADOS CLÍNICOS
Perfil de citocinas em mulheres Grávidas por P. vivax atendidas e
acompanhadas na FMTAM.
No. Projeto: ___________ No. Prontuário: ___________ Data ingresso: __/__/____
Identificação
Nome:___________________________________ Data nasc.:__/__/____ Idade: _________
Local de nascimento: _________________________Estado: _________
Local de residência: __________________________Estado: _________
Endereço em Manaus: _______________________________________________________
Bairro:_____________________ cep:_______________celular: __________________
Ponto de referência: ____________________________telefone: _______________
Estado civil: união estável ( ) tempo:___________ solteira ( ) divorciada ( ) viúva ( )
No de anos completos na escola: ____________________
Profissão: _____________________________ ocupação: __________________________
Antecedentes médicos
Doença crônica de base: s ( ) n ( ) quais? _____________________________________
Doença familiar: s ( ) n ( ) quais? ______________________________________________
Faz uso de álcool? Nunca ( ); no passado ( ); atualmente ( ) diário ( ) sem ( ) mensal ( )
ocasional ( ) duração ______ abstinência: ____ quantidade: ____ tipo:______________
Fumante? Nunca ( ); no passado ( ); atualmente ( ) diário ( ) semanal ( ) mensal ( )
ocasional ( ) duração________ abstinência: _____ quantidade: ________ tipo:__________
Faz uso de medicamentos? N ( ) s ( ) para que _______________
Faz uso de drogas ilícitas? Nunca ( ); no passado ( ); atualmente ( ) diário ( ) semanal ( )
mensal ( ) ocasional ( ) duração________ abstinência: ________ quantidade: _________
tipo: ________
Antecedentes Ginecológicos
Menarca: ____________ ciclos: ____dias por ____dias.
Gestações: _____ Partos ______ Abortos _________ Vivos______
Data do primeiro parto: __/__/____ filhos nasceram vivos: _______
filhos nasceram mortos: ______ filhos que morreram depois de nascer ____________
DUM (normal em tempo e duração): __/__/____ Está grávida? S ( ) N (
) NS (
Amenorreia:_______ DPP: __/__/____ faz CPN? S ( ) N ( ) no cons.: _____
Vida sexual ativa? S ( ) N ( ) método anticoncepcional? S ( ) N ( )
Qual? __________________ tempo de uso:________________
)
Antecedentes de malária anterior
No. de episódios anteriores de malária:0( ) 1 ( ) 2( ) 3( ) 4( ) >4 ( )
1ª. vez Data: __/__/____ Espécie: _____ Idade:____ grávida? S( ) N( ) Internada: S( ) N( )
Outro Data: __/__/____ Espécie: _____ Idade:____ grávida? S( ) N( ) Internada: S( ) N( )
Outro Data: __/__/____ Espécie: _____ Idade:____ grávida? S( ) N( ) Internada: S( ) N( )
Outro Data: __/__/____ Espécie: _____ Idade:____ grávida? S( ) N( ) Internada: S( ) N( )
Último. Data: __/__/____ Espécie: _____ Idade:____ grávida? S( ) N( ) Internada: S( ) N( )
77
ANEXO - C
ANEXO – D
78
ORGANOGRAMA DE ATENDIMENTO
Mulher Grávida
10-49 anos
GE (+) P.vivax
Consulta de 1ª. Vez com a equipe M&G
Sim
Assinar TCLE
Encaminhar ao
Amb. Malária
Inclusão Projeto
Citocinas
Coleta de Sangue
D0
GE(+)
Não
D35
GE(+)
GE(-)
HEMATOLOGIA
BIOQUÍMICA
CITOCINAS
CITOCINAS
(Grupo Controle)
ANEXO-E
IDADE
G
AMENOR
NEAG
DPML
Hb
Glicose
Creatinina
Bil Total
Bil Idta
DES
TNF
IL6
IL8
IL10
79
TABELA DE CORRELAÇÕES
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
IDADE
1
.
160
,577(**)
0
160
0,064
0,445
147
-0,015
0,849
155
-0,079
0,318
160
0,032
0,712
139
-0,155
0,09
121
0,115
0,231
111
-0,06
0,455
156
-0,166
0,07
120
0,011
0,897
139
,198(*)
0,012
160
-0,118
0,138
160
-0,052
0,515
160
-0,098
0,216
160
G
,577(**)
0
160
1
.
160
0,144
0,082
147
-0,106
0,188
155
-0,091
0,254
160
-0,129
0,131
139
-,201(*)
0,027
121
,200(*)
0,035
111
-0,107
0,185
156
-0,08
0,385
120
0,038
0,655
139
-0,027
0,735
160
-0,03
0,709
160
-0,094
0,235
160
-0,081
0,308
160
AMENOR
0,064
0,445
147
0,144
0,082
147
1
.
147
,307(**)
0
143
0,09
0,277
147
-0,171
0,052
130
-0,111
0,242
113
-0,003
0,978
104
0,016
0,853
143
-0,063
0,511
112
-0,006
0,95
128
0,107
0,196
147
-0,133
0,108
147
-0,059
0,478
147
-,246(**)
0,003
147
NEAM
-0,015
0,849
155
-0,106
0,188
155
,307(**)
0
143
1
.
155
-0,026
0,751
155
0,095
0,276
135
-0,04
0,669
118
-0,026
0,793
108
-0,107
0,19
151
-,193(*)
0,037
117
-0,035
0,692
134
-0,039
0,632
155
-0,09
0,267
155
-0,045
0,578
155
-0,112
0,163
155
** Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed)
* Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed)
DP/mm3
-0,079
0,318
160
-0,091
0,254
160
0,09
0,277
147
-0,026
0,751
155
1
.
160
-,199(*)
0,019
139
-0,007
0,935
121
-0,033
0,735
111
,160(*)
0,047
156
,241(**)
0,008
120
-0,015
0,862
139
,156(*)
0,049
160
,290(**)
0
160
0,153
0,054
160
,274(**)
0
160
Hb
0,032
0,712
139
-0,129
0,131
139
-0,171
0,052
130
0,095
0,276
135
-,199(*)
0,019
139
1
.
139
,290(**)
0,001
120
-0,09
0,351
110
0,022
0,802
136
-0,036
0,696
118
-0,125
0,172
121
-0,046
0,587
139
-0,146
0,087
139
0,021
0,804
139
-0,124
0,145
139
Glic.
-0,155
0,09
121
-,201(*)
0,027
121
-0,111
0,242
113
-0,04
0,669
118
-0,007
0,935
121
,290(**)
0,001
120
1
.
121
-0,042
0,662
111
,230(*)
0,011
120
,299(**)
0,001
114
-0,102
0,301
105
0,006
0,95
121
-0,028
0,761
121
0,158
0,084
121
0,129
0,158
121
Crea.
0,115
0,231
111
,200(*)
0,035
111
-0,003
0,978
104
-0,026
0,793
108
-0,033
0,735
111
-0,09
0,351
110
-0,042
0,662
111
1
.
111
,291(**)
0,002
110
,222(*)
0,023
105
0,025
0,811
95
-0,108
0,26
111
,356(**)
0
111
,206(*)
0,03
111
,311(**)
0,001
111
Bil Total
-0,06
0,455
156
-0,107
0,185
156
0,016
0,853
143
-0,107
0,19
151
,160(*)
0,047
156
0,022
0,802
136
,230(*)
0,011
120
,291(**)
0,002
110
1
.
156
,764(**)
0
116
0,025
0,773
135
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.
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.
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.
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.
160