produção de micropartículas e nanopartículas poliméricas

PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS E NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS
PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS EM SISTEMAS HETEROGÊNEOS DE
POLIMERIZAÇÃO
Marco Antonio Monteiro de Oliveira
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Engenharia Química, COPPE,
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Engenharia Química.
Orientador(es): José Carlos Costa da Silva Pinto
Márcio Nele de Souza
Rio de Janeiro
Outubro de 2011
PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS E NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS
PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS EM SISTEMAS HETEROGÊNEOS DE
POLIMERIZAÇÃO
Marco Antonio Monteiro de Oliveira
TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO INSTITUTO ALBERTO LUIZ
COIMBRA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA DE ENGENHARIA (COPPE) DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM
CIÊNCIAS EM ENGENHARIA QUÍMICA.
Examinada por:
________________________________________________
Prof. José Carlos Costa da Silva Pinto, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Márcio Nele de Souza, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Marcos Antonio da Silva Costa, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Luis Mauricio Trambaioli da Rocha e Lima, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Fernando Gomes de Souza Junior, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Tito Lívio Moitinho Alves, D.Sc.
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
OUTUBRO DE 2011
Oliveira, Marco Antonio Monteiro de
Produção
de
micropartículas
e
nanopartículas
poliméricas para aplicações biomédicas em sistemas
heterogêneos de polimerização/ Marco Antonio Monteiro
de Oliveira. – Rio de Janeiro: UFRJ/COPPE, 2011.
IX, p.: 277 : il.; 29,7 cm.
Orientador: José Carlos Costa da Silva Pinto
Márcio Nele de Souza
Tese (doutorado) – UFRJ/ COPPE/ Programa de
Engenharia Química, 2011.
Referências Bibliográficas: p. 212-237.
1. Polimerização. 2. Sistemas heterogêneos. 3.
Polímeros para aplicações biomédicas. I. Pinto, José
Carlos Costa da Silva et al.. II. Universidade Federal do
Rio de Janeiro, COPPE, Programa de Engenharia
Química. III. Título.
iii
Aos meus pais, Júlio e Margarete.
iv
Agradecimentos
Aos Mestres, familiares, amigos e companheiros, muito obrigado por todo incentivo,
ensinamentos e desafios.
O autor também agradece,
Ao Professor Márcio Nele de Souza, pelo convite para ingressar no Doutorado,
pela amizade e pela confiança em mim depositada.
Ao Professor José Carlos Costa da Silva Pinto, pela amizade, confiança e
dedicação.
Aos Professores Per B. Zetterlund e Thomas P. Davis, pela orientação e
amizade, assim como ao Dr. Cyrille Boyer, ao Dr. Michael Raymond Whittaker
e todos os membros do Centre for Advanced Macromolecular Design da
University of New South Wales (Sydney, Australia).
Ao Prof. Antonio Gilberto Ferreira e ao laboratório de RMN do Departamento
de Química da Universidade Federal de São Carlos, pelas análises de RMN
apresentadas no Captíluo 2.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e à
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pelas bolsas de
estudo e financiamento dos projetos de pesquisa.
Ao corpo docente, pesquisadores e funcionários do Programa de Engenharia
Química da COPPE/UFRJ.
À Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Ao Governo Brasileiro, pelas atuais políticas de incentivo a pesquisa e
desenvolvimento.
v
Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)
PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS E NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS
PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS EM SISTEMAS HETEROGÊNEOS DE
POLIMERIZAÇÃO
Marco Antonio Monteiro de Oliveira
Outubro/2011
Orientadores: José Carlos Costa da Silva Pinto
Márcio Nele de Souza
Programa: Engenharia Química
Neste trabalho foram estudados dois sistemas de polimerização em sistemas
heterogêneos, visando à produção de polímeros para aplicações biomédicas. Em um
primeiro momento, o objeto de estudo foi a produção de micropartículas poliméricas
dopadas
com
fármacos
para
uso
em
procedimentos
de
embolização
ou
quimioembolização vascular. As micropartículas poliméricas foram sintetizadas com a
incorporação in situ de fármacos durante a polimerização via radical livre em
suspensão. Os resultados experimentais indicaram que o tipo de fármaco, a quantidade e
sua estratégia de incorporação contribuem para significativas mudanças na morfologia
das partículas e nas propriedades moleculares dos polímeros sintetizados. Em um
segundo momento, o objeto de estudo foi a síntese de nanogéis biodegradáveis para
aplicação em sistemas de liberação controlada de biomoléculas. Utilizando a técnica de
polimerização RAFT em miniemulsão inversa, foi desenvolvida uma estratégia para
sintetizar nanogéis biodegradáveis com arquitetura molecular bem definida e com
características apropriadas para potencial aplicação como sistema de liberação de
biomoléculas.
vi
Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the
requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)
PRODUCTION OF POLYMERIC MICROPARTICULES AND NANOPARTICULES
USING HETEROGENEOUS POLYMERIZATION SYSTEM FOR BIOMEDICAL
APPLICATION
Marco Antonio Monteiro de Oliveira
October/2011
Advisors:
José Carlos Costa da Silva Pinto
Márcio Nele de Souza
Department: Chemical Engineering
In this study we report the use of different polymerization systems to produce
polymers to be used in biomedical applications. In a first moment, polymer
microparticles containing drugs were produced for use as embolic or chemoembolic
agents. The polymer microparticles were synthesized by suspension polymerization
with in situ incorporation of drugs during polymerization reaction. Experimental results
showed that the final properties of the obtained polymers depend on the type of drug,
amount and strategy of drug incorporation. In a second moment, biodegradable
hydrogel nanoparticles were synthesized for use as nanocarriers for bioactive molecules.
In order to achieve this objective, an operation strategy was developed to synthesize
biodegradable hydrogel nanoparticles via RAFT inverse miniemulsion polymerization
with well-defined molecular architecture and characteristics that guarantee the potential
application of the biodegradable hydrogel nanoparticles for the controlled release of
bioactive molecules.
vii
Sumário
Capítulo 1
Introdução
1.1 Introdução
1.2 Objetivos da Tese
1.3 Estrutura da Tese
1 1 2 6 7 Capítulo 2
9 Síntese de micropartículas poliméricas com a incorporação in situ de fármacos via
polimerização em suspensão – Parte 1
9 2.1 Introdução
10 2.1.1 A embolização vascular
10 2.1.2 Polimerização em suspensão
18 2.1.3 Partículas esféricas com morfologia do tipo casca-núcleo de PVA/PVAc
24 2.1.4 Incorporação de fármacos em polímeros
31 2.2 Objetivo e justificativa
36 2.3 Metodologia experimental
37 2.3.1 Materiais
37 2.3.2 Unidade Experimental
38 2.3.3 Métodos
39 2.3.4 Caracterização
41 2.4 Resultados & Discussão
46 2.4.1 Efeitos da incorporação in situ de amoxicilina nas reações de homopolimerização
em suspensão do acetato de vinila
46 2.4.2 Efeitos da incorporação in situ de amoxicilina nas reações de copolimerização em
suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila.
55 2.5 Conclusões
73 Capítulo 3
75 Síntese de micropartículas poliméricas com a incorporação in situ de fármacos via
polimerização em suspensão – Parte 2
75 3.1 Introdução
76 3.1.1 Cinética da polimerização em suspensão
76 3.1.2 Quimioembolização vascular
83 3.1.3 Fármacos potenciais e aplicações
85 3.2 Objetivo e justificativa
94 3.3 Metodologia experimental
95 3.3.1 Materiais
95 3.3.2 Unidade Experimental
96 3.3.3 Métodos
97 3.3.4 Caracterização
100 3.4 Resultados & Discussão
105 3.4.1 Efeitos da incorporação in situ de amoxicilina nas reações de copolimerização em
suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila – Parte 2
105 3.4.2 Efeitos da incorporação in situ de doxorrubicina nas reações de copolimerização
em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila
130 3.5 Conclusões
141 Capítulo 4
143 viii
Síntese de nanogel biodegradável para aplicações biotecnológicas através de
polimerização RAFT em miniemulsão inversa
143 4.1 Introdução
144 4.1.1 Polimerização radical livre viva/controlada
144 4.1.2 Miniemulsão
154 4.1.3 Nano-hidrogéis
160 4.2 Objetivo e justificativa
162 4.3 Metodologia experimental
164 4.3.1 Materiais
164 4.3.2 Síntese do agente RAFT
165 4.3.3 Síntese do agente macro-RAFT
166 4.3.4 Síntese do agente reticulante biodegradável
167 4.3.5 Polimerização em miniemulsão
168 4.3.6 Caracterização
169 4.4 Resultados & Discussão
172 4.4.1 Síntese dos compostos orgânicos
172 4.4.2 Formação da miniemulsão
177 4.4.3 Polimerização em miniemulsão
181 4.5 Conclusões
208 Capítulo 5
Conclusões
Sugestões
209 209 210 Referências bibliográficas
212 Anexo
Teste de atividade farmacológica in vitro
Teste de liberação prolongada de fármacos
Curvas de DSC
Ressonância Magnética Nuclear
238 238 250 254 269 ix
Capítulo 1
Introdução
Neste Capítulo é apresentada uma introdução do tema central dessa Tese de Doutorado,
abordando alguns conceitos gerais que serão aprofundados posteriormente em seções
mais específicas do trabalho. Além do texto introdutório, este Capítulo traz ainda o
objetivo geral da Tese, bem como uma seção que detalha a forma em que o documento
está estruturado.
1
1.1 Introdução
Polímeros são macromoléculas de alta massa molar, formadas usualmente por
um grande número de moléculas pequenas que se associam por meio de ligações
covalentes. Essas moléculas pequenas que se “unem” para dar origem ao polímero são
chamadas de monômeros, enquanto a reação que “une” essas moléculas é conhecida
como polimerização. [1] A transformação de um monômero em polímero pode ser
genericamente representado pela Figura 1.1, onde o índice “n” representa o grau de
polimerização do polímero, ou seja, o número de unidades (ou meros, derivados do
monômero) que se repetem ao longo da cadeia do polímero. [2]
H
H
H
H
=
n
Figura 1.1 – Exemplo de polimerização; etileno.
Embora muitas classificações distintas possam ser propostas e já tenham sido
usadas, dois tipos de classificação de polímeros são mais usuais. Um tipo de
classificação se baseia na estrutura química dos monômeros e classifica os polímeros
em polímero de adição ou polímeros de condensação. Um outro tipo de classificação
leva em conta o mecanismo da reação de polimerização, que pode ser basicamente um
mecanismo que ocorre em etapas ou então um mecanismo de reação em cadeia. [1-3]
Polímeros de adição são normalmente produzidos por reações em cadeia, enquanto os
polímeros de condensação são formados por polimerizações em etapas.
2
A classificação que leva em conta a estrutura molecular do monômero foi
sugerida por W. H. Carothers1 e diz que os polímeros de condensação são formados por
dois ou mais monômeros polifuncionais que, ao reagirem entre si, formam a cadeia
polimérica e frequentemente uma segunda molécula, que é um subproduto de baixa
massa molar. Este tipo de reação é apresentada na Figura 1.2, que representa uma
reação entre moléculas de diaminas e diácidos, formando uma poliamida e levando à
eliminação de uma molécula de baixa massa molar (no caso, a água). [2, 3]
n H2N R1 NH2 + n HOOC R2 COOH
H
N R1
N C R2 C
H
H O
n
OH + 2n - 1 H2O
O
Figura 1.2 – Exemplo de reação de policondensação. [2]
Embora a classificação proposta por Carothers tenha sofrido algumas
modificações ao longo do tempo, os polímeros obtidos por reações de adição podem ser
bem representados pelos materiais formados por monômeros vinílicos2, não ocorrendo a
perda de moléculas de baixa massa molar durante a reação. Neste tipo de polímero, a
unidade repetitiva da cadeia principal do polímero possui composição igual ao do
monômero, conforme ilustrado anteriormente na Figura 1.1. [2] Nesse tipo de
polimerização, a macromolécula cresce gradativamente, por intermédio de adição de
unidades méricas individuais, com auxílio de uma espécie ativa (ou catalisador).
1
Wallace Hume Carothers (1896-1937) – Contribuiu com muitos avanços para a ciência de polímeros. Foi nos laboratórios da
DuPont Co. que a equipe de Carothers desenvoleu dois dos polímeros mais usados no século XX: o Nylon® e o Neoprene®.
2
Moléculas que possuem dupla ligação carbono-carbono; o termo vinil se refere estritamente ao grupo CH2=CH-. [4]
3
Independentemente do mecanismo responsável pela reação de polimerização,
existem vários sistemas distintos que podem ser usados para conduzir essas reações. De
forma genérica, os sistemas disponíveis para conduzir as reações de polimerização
podem ser divididos em sistemas homogêneos e sistemas heterogêneos de
polimerização.
Nos sistemas homogêneos de polimerização, todos os reagentes e produtos
encontram-se solubilizados em uma única fase, sendo os sistemas de polimerização em
solução e em massa os exemplos mais estudados. A grande vantagem do uso de
sistemas homogêneos de polimerização diz respeito à obtenção de polímeros com alto
grau de pureza. Já nos sistemas heterogêneos de polimerização, a presença de duas ou
mais fases imiscíveis caracteriza o processo de polimerização. [5] A principal vantagem
desses tipo de sistema de polimerização é a fácil recuperação do polímero ao final do
processo e a alta taxa de troca de calor. Além disso, é possível obter polímeros com alta
massa molar e na forma de partículas sólidas, com tamanhos que podem variar de 100
nm até 2,000 µm. [6]
Nos sistemas heterogêneos de polimerização, convencionalmente o monômero,
de natureza hidrofóbica, é disperso em um solvente hidrofílico, geralmente a água. As
duas fases imiscíveis são misturadas, empregando-se uma força de cisalhamento que
promove a quebra da fase dispersa em pequenas gotas dispersas no diluente (fase
contínua). Para garantir que a fase dispersa permaneça na forma de pequenas gotas
durante todo o processo de polimerização, diversas estratégias podem ser adotadas,
incluindo a utilização de componentes químicos, que atuam estabilizando a gota contra
efeitos de coalescência, e estratégias operacionais fundamentalmente físicas, como a
manutenção da agitação vigorosa do sistema. [6]
4
Quando o monômero utilizado apresenta uma natureza hidrofílica, para conduzir
uma polimerização em um sistema heterogêneo faz-se necessário o uso de um solvente
de natureza hidrofóbica. Neste cenário, diz-se que o processo de polimerização é
inverso. Assim como o solvente, os demais componentes químicos utilizados na
polimerização devem ser adaptados para interagir melhor com a natureza hidrofílica do
monômero ou com a natureza do solvente hidrofóbico empregado. Entretanto, os
mesmos conceitos fundamentais podem ser usados para gerar e, em muitos casos,
explicar os fenômenos que ocorrem nas polimerizações em sistemas heterogêneos
convencionais e inversos.
Os sistemas heterogêneos de polimerização mais estudados são as suspensões e
emulsões. Embora sejam sistemas onde os monômeros estão dispersos em um diluente,
essas técnicas de polimerização se diferenciam em diversos aspectos, principalmente no
que diz respeito ao mecanismo de formação das gotas, ao tamanho das gotas geradas e à
cinética/mecanismo de polimerização. [6] A depender das características particulares
dos sistemas heterogêneos de polimerização, costuma-se escolher o sistema de
polimerização de acordo com as características desejadas para o produto final.
Os polímeros naturais estão presentes nos seres vivos na forma de
macromoléculas de DNA, proteínas, polissacarídeos, entre tantas outras. [7] Por terem
sua síntese regulada por complexos mecanismos celulares e enzimáticos, os polímeros
naturais, como o DNA, possuem estrutura estritamente bem definida. [8]
Com o advento da Química Contemporânea, inúmeros avanços foram
alcançados no século XX no campo dos sistemas de polimerização, incluindo desde a
identificação das macromoléculas [9, 10] até o desenvolvimento de inúmeras técnicas
distintas de polimerização. [3] Essas técnicas mudaram a vida moderna como um todo,
pois permitiram ao homem criar uma nova classe de materiais, que hoje são empregados
5
nos mais variados tipos de aplicações, incluindo desde a confecção de embalagens para
alimentos [11] até dispositivos nanométricos usados para o tratamento de doenças. [12,
13]
Particularmente os polímeros vêm sendo cada vez mais utilizados em aplicações
biomédicas nas últimas décadas. [14] A facilidade de obtenção desses materiais e a
possibilidade de sintetizar um produto de acordo com a patologia e a necessidade do
paciente são algumas das diversas vantagens dos polímeros sintéticos frente aos
polímeros naturais e outros tipos de materiais. O desenvolvimento de novas estratégias
de polimerização possibilita cada vez mais a síntese de novos polímeros para aplicações
biomédicas que apresentem características bem definidas em relação a morfologia [15]
ou a arquitetura molecular precisa do polímero. [16]
O desenvolvimento de novas técnicas médicas e o melhor entendimento de
como ocorrem determinadas patologias, até mesmo a nível celular, faz crescer de forma
continuada necessidade do desenvolvimento de novos materiais, precisamente
sintetizados para desempenhar papéis específicos no combate à patologias com efeitos
colaterais mínimos ao paciente. Desta maneira, a pesquisa de novas estratégias de
polimerização e o desenvolvimento de novos materiais poliméricos, para uso em
aplicações biomédicas, certamente contribuirá de maneira positiva não apenas nas
Ciências mas como na qualidade de vida da sociedade.
1.2 Objetivos da Tese
A presente Tese de Doutorado tem como objetivo principal utilizar sistemas
heterogêneos de polimerização para a produção de novos materiais poliméricos, na
6
forma de micropartículas e nanopartículas, para serem usadas em aplicações
biomédicas.
As micropartículas poliméricas são produzidas nesse trabalho com auxílio de
reações de polimerização em suspensão. Essas reações são conduzidas por intermédio
do mecanismo de polimerização via radicais livres, empregando técnicas já reportadas
na literatura científica. O diferencial do presente trabalho é a produção das
micropartículas com a incorporação in situ de fármacos durante as reações de
polimerização, sendo avaliada a influência da adição de um fármaco sobre a qualidade
final do polímero produzido.
As nanopartículas poliméricas são produzidas nesse trabalho com auxílio de
reações de polimerização em miniemulsão inversa. Essas reações são conduzidas
utilizando a técnica de polimerização RAFT (Reversible Addition-Fragmentation Chain
Transfer), que permite a síntese de polímeros com arquitetura molecular bem definida.
O caráter inédito do presente trabalho está relacionado aos poucos trabalhos publicados
na literatura científica acerca de reações de polimerização em miniemulsão inversa,
utilizando a técnica de polimerização RAFT.
1.3 Estrutura da Tese
A parte textual desta Tese está organizada em cinco Capítulos, incluindo este
primeiro Capítulo introdutório. Apresenta-se ainda uma seção que contém as referências
bibliográficas e um Anexo que descreve algumas caracterizações, ambos localizados no
final do documento.
Nos Capítulos 2 e 3 é descrita a obtenção de micropartículas poliméricas, para
serem posteriormente utilizadas em aplicações biomédicas. As micropartículas são
7
obtidas com auxílio de reações de polimerização via radicais livres em suspensão, com
a incorporação in situ de fármacos durante o processo de produção das partículas. No
Capítulo 4 é descrito o desenvolvimento de uma estratégia para a produção de
nanopartículas poliméricas por intermédio da polimerização em miniemulsão inversa,
utilizando a técnica de polimerização RAFT. No Capítulo 5 são apresentadas as
principais conclusões, observações e hipóteses, formuladas a partir dos resultados
apresentados.
Os Capítulos 2, 3 e 4 desta Tese foram elaborados na forma de artigos
científicos. Desta forma, estes Capítulos possuem seções individuais de introdução,
descrição da parte experimental, apresentação de resultados e discussão, além das
conclusões pertinentes, apresentadas ao final de cada Capítulo. Optou-se por esta
organização para facilitar a compreensão do leitor. Excepcionalmente, optou-se no
Capítulo 4 pela não tradução de alguns nomes de substâncias, técnicas, métodos, etc.,
originalmente escritos em itálico na língua inglesa e ainda sem tradução consensual
para a língua portuguesa.
Seguindo as recomendações das normas de elaboração de Teses da
COPPE/UFRJ, as referências bibliográficas estão organizadas de forma numerada,
conforme citadas ao longo de todo documento. Desta forma, não há seções de
referências individuais para cada Capítulo, mas apenas uma lista comum para todo o
documento, localizada na seção final da Tese.
8
Capítulo 2
Síntese de micropartículas poliméricas
com a incorporação in situ de fármacos
via polimerização em suspensão – Parte 1
Neste capítulo, é apresentada uma investigação dos efeitos da incorporação in
situ de um fármaco durante reações de polimerização via radicais livres em suspensão,
para a produção de micropartículas poliméricas que apresentam uma morfologia do tipo
casca-núcleo que são empregadas em procedimentos médicos de embolização vascular.
Este estudo foi realizado utilizando a amoxicilina como fármaco modelo, em diferentes
concentrações e usando diferentes estratégias de incorporação. Parte dos resultados
descritos neste Capítulo foram apresentados na forma de trabalho completo no 10º
Congresso Brasileiro de Polímeros (2009) [17] e também na forma de artigo na revista
Macromolecular Symposia (2011). [15]
9
2.1 Introdução
2.1.1 A embolização vascular
Aplicada clinicamente desde meados de 1960 para corrigir diversos quadros
clínicos, como sangramentos, aneurismas e malformações vasculares, a embolização é
uma técnica radiológica que consiste na obstrução intencional de um vaso sanguíneo.
[18, 19] Para alcançar este objetivo, um pequeno cateter angiográfico é introduzido
dentro do sistema vascular e orientado até o local desejado, onde se faz a injeção de um
material finamente dividido, que promove a oclusão física do vaso, levando à
diminuição do fluxo sanguíneo na região e, consequentemente, à necrose do tecido por
isquemia. [20] Além de aplicações já consagradas nos últimos 50 anos, atualmente a
embolização vem sendo empregada com resultados satisfatórios para o tratamento de
leiomioma uterino, malignidade hepática e malformações vasculares. [21] Como o
procedimento de embolização possui inúmeras aplicações na área médica, a revisão que
será feita focará apenas a utilização da técnica de embolização em miomas uterinos.
Entretanto, as considerações aqui feitas podem, em muitos dos casos, servir de base
para o uso da embolização no tratamento de outros tipos de patologias.
Os miomas uterinos, também conhecidos por leiomiomas ou fibromas, são
tumores benignos difíceis de serem tratados e que frequentemente apresentam
complicações, como hemorragias e aumento das dimensões do útero, causando dor e
desconforto. Clinicamente, até meados de 1995, a principal indicação de tratamento
para todas as mulheres que desejavam manter sua “fertilidade” era a miomectomia3.
Desta forma, com o intuito de reduzir e até mesmo eliminar os sintomas do mioma
uterino, RAVINA et al. [23] utilizaram a técnica de embolização da artéria uterina,
3
Procedimento cirúrgico usado na remoção de leiomiomas; preserva a fertilidade e o fluxo menstrual da paciente. [22]
10
obtendo grande sucesso. A partir deste estudo, a embolização da artéria uterina foi, e
continua sendo, bastante estudada e indicada como tratamento alternativo para casos de
miomatose sintomática. [19] A esquematização de um procedimento de embolização é
ilustrado na Figura 2.1
Figura 2.1 – Esquema de embolização de fibroma uterino utilizando partículas de PVA. [24]
Os fatores de risco associados aos tumores uterinos são principalmente
relacionados à etnia e à idade. Mulheres negras possuem de duas a três vezes mais
chances de desenvolverem esse tipo de tumor, quando comparadas a mulheres de outras
etnias. As chances de desenvolver este tipo de anomalia celular diminuem também após
a menopausa, sendo de 70 a 90% menores após esta etapa de vida. Redução similar é
observada em mulheres que tiveram algum filho. Os miomas uterinos se manifestam por
meio de distúrbios na menstruação e outros sintomas relacionados à pressão na região
uterina, sendo que os sintomas dependem do tipo, tamanho e localização do tumor.
Apesar disso, estima-se que metade das mulheres que apresentem algum tipo de fibroma
não manifestem nenhum tipo de sintoma. [24]
11
O tratamento de tumores sempre requer a tomada de decisões importantes que
afetam de alguma forma a saúde do paciente. No caso de tumores uterinos, BANU &
MANYONDA [24] apontam ao menos três tipos de abordagens que ainda hoje são
usadas para o tratamento dos miomas. A presença de fibromas pequenos e
assintomáticos apresentam baixo risco carcinogênico e requerem apenas a observação.
Embora o tratamento convencional à base de medicamentos não constitua a intervenção
mais usada pelos médicos, o uso de hormônio e outras substâncias, como o ácido
tranexâmico, deve ser adotado como tratamento de primeira escolha. A última escolha
para o tratamento dos tumores uterinos é a intervenção cirúrgica, classicamente
utilizada para este tipo de quadro clínico. A intervenção cirúrgica geralmente é feita
com uma histerectomia4, que ocasiona a perda da fertilidade, ou da miomectomia, em
que a fertilidade é preservada.
PELAGE et al. [26] utilizaram a embolização da artéria uterina para o
tratamento de mulheres com leiomiomas, visando principalmente à diminuição de
sintomas relacionados a anomalias menstruais. Usando partículas de poli(álcool
vinílico) (PVA) na faixa de 150-300 µm, os médicos verificaram que a maioria das 80
pacientes tratadas apresentou grande melhora nos sintomas e diminuição significativa
do tamanho dos miomas.
Com o objetivo de determinar a segurança e eficácia do uso da embolização da
artéria uterina em pacientes com miomas uterinos, SPIES et al. [27] realizaram um
longo estudo com 200 pacientes (entre 1997-1999). Neste estudo, todas as pacientes
foram submetidas à embolização com partículas de PVA, com tamanho variando na
faixa entre 500-710 µm. Com auxílio de um questionário usado para acompanhamento
do trabalho, os pesquisadores verificaram que cerca de 93% das pacientes tratadas
4
Cir. Ablação (retirada) do útero, em extensão variável. [25]
12
ficaram satisfeitas com a melhora nos sintomas relacionados aos miomas, como a
característica dor na região pélvica e o intenso sangramento menstrual. Desta maneira,
os médicos concluíram que a embolização da artéria uterina pode ser considerado um
procedimento seguro para o tratamento primário de leiomiomas, com poucas chances de
gerar complicações e grande possibilidade de causar a satisfação das pacientes, por
causa da melhora dos sintomas associados aos miomas.
Atualmente há um número considerável de publicações que reportam o sucesso
clínico do procedimento de embolização da artéria uterina, que é da ordem de 86-100%.
Até o ano de 2004, mais de 45.000 procedimentos já tinham sido realizados e apenas
três casos de óbitos foram relatados. [24] Entretanto, embora hoje seja largamente
empregada nos Estados Unidos e nos países da Europa Ocidental, a embolização da
artéria uterina continua sendo um tratamento secundário e ainda sob avaliação, uma vez
que a miomectomia permanece sendo o procedimento mais indicado para o tratamento
de miomas uterinos, mesmo quando a paciente não deseja manter sua fertilidade. [28]
Outro fator que coloca a embolização uterina como um tratamento de segunda escolha
pelos médicos é o alto custo, associados ao material usado para promover a
embolização. Este alto custo é relevante não apenas no Brasil, mas também em outros
países da Europa e América do Norte. Em relação à histerectomia, o procedimento de
embolização da artéria uterina já é indicado por alguns centros de excelência como uma
técnica alternativa a este procedimento cirúrgico. [28]
Os procedimentos de embolização, de um modo geral, e mais especificamente o
procedimento de embolização da artéria uterina, devem ser vistos sempre em função de
três pontos fundamentais: a seleção da paciente, a técnica de embolização propriamente
dita e os procedimentos pós-operatórios. Quanto à seleção da paciente, é sempre
importante ressaltar que menos da metade das mulheres que apresentem algum tipo de
13
fibroma necessitam de um tratamento. Embora seja um procedimento seguro, o
acompanhamento pós-operatório deve ser feito com os procedimentos de rotina, com o
intuito de identificar possíveis complicações. [19]
Em relação aos aspectos técnicos, as duas variáveis de maior importância
durante a embolização são a escolha do material embolizante e o ponto final da
embolização. Embora uma série de materiais já tenha sido empregada como agentes
embólicos, incluindo partículas, fluidos, balões e adesivos, [18] os três materiais mais
usados atualmente como agentes embólicos são as microesferas calibradas, as esponjas
hemostáticas e as partículas de PVA. [19]
O ponto final da embolização parece ser de grande importância para que o
procedimento seja bem realizado, já que a injeção insuficiente de material embólico
pode não atingir o resultado desejado e uma super-injeção de material pode desencadear
intensa isquemia local, aumentando o risco de complicações. Ainda assim, sempre é
desejável injetar a menor quantidade possível de partículas embolizantes, para que as
chances de que migrações acidentais dessas partículas ocorram para outros locais,
principalmente o ovário, sejam minimizadas. [19]
Como observado por PEIXOTO, [29] apesar do procedimento de embolização
ser amplamente utilizado, muitos aspectos técnicos ainda não foram bem estabelecidos,
como o ponto final mais adequado para o procedimento ou o agente embólico mais
propício a ser utilizado, incluindo a faixa apropriada de tamanho. Segundo a autora,
observa-se na literatura que cada médico utiliza o procedimento que considera mais
indicado, de acordo com a situação clínica da paciente.
14
Os agentes embólicos
Um agente embólico ideal deve contemplar uma série de características que
incluem: i) ser eficiente na oclusão vascular; ii) ser de fácil obtenção; iii) ser
biocompatível; iv) passar facilmente pelo cateter; v) levar a uma embolização
homogênea; vi) produzir uma resposta inflamatória; vii) não ser carcinogênico. [30]
Algumas dessas características, como a facilidade de passar pelo cateter, está
intimamente relacionado à morfologia das partículas. [31] Outras características, como
a biocompatibilidade e a não-carcinogenicidade, são requisitos básicos para qualquer
tipo de biomaterial.
Utilizando essas características como um “guia” das metas a serem atingidas,
muitas pesquisas têm sido realizadas com o intuito de desenvolver novos agentes
embólicos, uma vez que a maioria dos agentes existentes ainda apresentam muitas
características indesejadas, como morfologia irregular, tendência a formar aglomerados,
difícil passagem pelo cateter e a oclusão incompleta dos vasos. [29]
Como citado anteriormente e revisado por KISILEVZKY & MARTINS, [19]
atualmente os três principais agentes embólicos usados são as esponjas hemostáticas, as
microesferas calibradas e as partículas de PVA. As esponjas hemostáticas, mais
conhecidas por Gelfoam®, é um material gelatinoso com capacidade de coagular o
sangue, que já foi extensamente utilizado em procedimentos de embolização.
Comercializado em duas apresentações (pó com granulometria de 40-60 µm ou
lâminas), o Gelfoam® possui algumas vantagens quando usado como agente embólico,
como a fácil injeção e o fato de estar “pronto para uso”, embora sua aplicação mais
frequente seja como agente hemostático. [32] Contudo, uma grande desvantagem desse
material no uso como agente embólico é a biodegradabilidade, que pode resultar na
recanalização dos vasos ou do tecido embolizado com o tempo. [32, 33] Outro fator
15
importante a ser considerado é que o uso do Gelfoam® em pó pode acarretar em
necroses além do ponto de embolização desejado, fato esse devido ao tamanho das
partículas. [32] Mesmo sendo reabsorvíveis pelo corpo, as esponjas hemostáticas de
gelatina são partículas eficientes e seguras para uso em procedimentos de embolização
da artéria uterina, podendo ser usada para o tratamento de fibromas sintomáticos. Esse
material ainda possui uma propriedade interessante, que é a capacidade de absorção de
fluidos. Essa característica pode contribuir para que as partículas de gelatina usadas na
embolização absorvam compostos, como por exemplo antibióticos, antes de sua injeção
no cateter, contribuindo para a prevenção de complicações, como as infecções
bacterianas. [33]
As microesferas calibradas são partículas de gelatina trisacrílica que possuem
morfologia esférica bem definida e distribuição de tamanhos monodispersa. Essas
partículas, comercializadas com o nome de Embospheres®, vêm sendo empregadas
como um novo tipo de agente embólico e apresentam diversas características desejáveis,
como morfologia esférica, faixa de tamanhos precisamente calibrada, propriedades
hidrofílicas, maciez, não são absorvíveis pelo organismo e apresentam fácil passagem
pelo cateter. Todas essas características resultam numa obstrução mais efetiva dos
vasos, além de uma penetração mais distal5. [29, 34, 35] As microesfereas calibradas de
gelatina trisacrílica já mostraram eficiência clínica superior frente a outros agentes
embolizantes na devascularização de miomas cerebrais [36] e também na embolização
de tumores ósseos. [37] Na embolização da artéria uterina, CHUA et al. [38]
verificaram que as microesferas calibradas (700-900 µm) conseguem penetrar mais na
vascularização dos miomas do que partículas não-esféricas de PVA (355-500 µm),
resultando em agentes embólicos mais específicos para esta prática em especial. A
5
Anatomia. Refere-se ao ponto em que uma estrutura ou órgão fica afastado do seu centro ou de sua origem. [25]
16
agregação das partículas de PVA no cateter durante a aplicação é provavelmente
associada ao formato irregular das partículas. [37]
Uma das principais razões para que o PVA seja o material mais escolhido como
agente embólico, além da biocompatibilidade, é o aumento de volume do PVA quando
entra em contato com meios aquosos, por causa da absorção de água. Essa propriedade
permite as partículas de PVA “inchar” e provocar a obstrução do vaso embolizado. [29]
Outra razão importante é o baixo custo de produção das partículas de PVA, que podem
levar à produção de materiais eficientes e acessíveis a populações de baixa renda.
O tamanho das partículas sempre foi ressaltado como um ponto importante,
desde que estudos sobre o uso da embolização da artéria uterina começaram a aparecer
na literatura médica. A esse respeito, WORTHINGTON-KIRCH et al. [39] chamaram a
atenção para algumas mudanças importantes nos protocolos de embolização,
principalmente associados ao tamanho das partículas de PVA usadas nos procedimentos
cirúrgicos, que passaram a ser usadas em duas faixas de tamanho: 300-500 µm e/ou de
500-700 µm. As partículas na faixa de 150-300 µm estão sendo abandonadas, devido ao
grande risco de efeitos colaterais, como infecções e necrose do tecido uterino. [26]
KISILEVZKY & MARTINS [19] relataram que melhores resultados pós-operatórios
são alcançados quando partículas na faixa de 500 a 700 µm são utilizadas.
É muito importante enfatizar que a natureza hidrofílica do PVA promove uma
boa interação com os fluidos orgânicos e com as paredes dos vasos, o que permite
explicar a eficiência desse material nos agentes embólicos. Contudo, uma eficiência
similar pode ser obtida se o PVA constituir a superfície de outras partículas. Como o
controle da morfologia das partículas pode ser melhor realizado com outros materiais
através de técnicas simples, a incorporação de uma casca de PVA a outros materiais
constitui uma alternativa interessante.
17
Embora o PVA seja largamente utilizado como agente embólico, outros tipos de
materiais continuam sendo desenvolvidos e estudados, com a caracterização
comparativa de desempenhos em diversos tipos de embolização. Isto inclui
micropartículas de hidroxiapatita, [31] esferas de quitosana [40] e líquidos adesivos.
[41]
2.1.2 Polimerização em suspensão
A polimerização em suspensão é um processo heterogêneo, que consiste na
suspensão inicial de um monômero (contendo um iniciador e/ou catalisador) na forma
de gotas em uma fase contínua, que geralmente é a água. As gotas de monômero são
mantidas em suspensão e impedidas de aglomerarem por intermédio da combinação de
agitação do sistema e da adição de agentes estabilizantes. Os agentes estabilizantes (ou
de suspensão) mais usados são os polímeros solúveis em água, como o poli(álcool
vinílico) (PVA), e os compostos inorgânicos insolúveis em água, como o fosfato de
cálcio. [3] Neste tipo de polimerização, é usado frequentemente um iniciador radicalar
solúvel no monômero, tais como os peróxidos. Admite-se em geral que cada gota de
monômero suspensa se comporta como um reator em miniatura, onde ocorre uma
polimerização em massa. Assim, a consideração geralmente feita é de que a cinética da
polimerização em suspensão seja similar à cinética da polimerização em massa. [3, 6]
Por apresentar diversas vantagens práticas, como a fácil recuperação do
polímero e as baixas viscosidades do meio reacional, a técnica de polimerização em
suspensão é usada preferencialmente para obtenção de várias resinas comerciais,
incluindo polímeros e copolímeros de estireno, cloreto de vinila, acetato de vinila e
metacrilato de metila. [42] Na Figura 2.2, é ilustrado um processo de polimerização em
18
suspensão convencional, que utiliza um monômero hidrofóbico disperso em um diluente
hidrofílico, neste caso a água – que constitui a fase aquosa contínua do sistema.
!
!
!
!
Agitação
!
Polimerização
!
!
!
Fase orgânica
!
!
Fase Aquosa
!
Figura 2.2 – Representação esquemática do processo de polimerização em suspensão
convencional, utilizando um monômero orgânico e água como fase contínua.
Como revisado por MACHADO et al., [42] os principais tipos de polimerização
em suspensão, usados para a produção comercial de polímeros, incluem a suspensão do
tipo pérola, do tipo granular, do tipo massa-suspensão (ou semi-suspensão), a suspensão
inversa, do tipo suspensão-emulsão, do tipo dispersão e a micro-suspensão. As
principais características desses tipos de polimerização em suspensão estão descritos na
Tabela 2.1, conforme revisado e descrito por MACHADO et al. [42]
Outra grande vantagem da técnica de polimerização em suspensão é o fato de
que é possível controlar o tamanho médio final das partículas e a distribuição do
tamanho de partículas por meio de manipulação de variáveis operacionais do sistema,
como a velocidade de agitação. O tamanho médio das partículas obtidas na
polimerização em suspensão varia na faixa de 20 a 2000 µm, sendo que o tamanho final
das partículas e sua distribuição são definidos por um conjunto de fatores que incluem a
19
concentração e o tipo de agente de suspensão, o tipo de monômero, a velocidade de
agitação e a presença de cargas na mistura inicial. [42, 43] Além dessas variáveis,
comumente reportadas, fatores como o tipo de impelidor6 usado, a cinética de
polimerização, a tensão interfacial e a viscosidade e densidade das fases contínua e
dispersa também exercem grande influência no tamanho final das partículas formadas.
[44, 45]
Tabela 2.1 – Principais tipos de polimerização em suspensão. [42]
Tipo de polimerização em suspensão
Principais características
Pérolas esféricas de forma definida
Pérola
Conversão entre 65-99%
Monômero não dissolve o polímero
Granular
Grãos opacos e irregulares
Processo
Semi-suspensão
em
duas
etapas,
considerando
inicialmente em massa antes da dispersão
Obtenção de partículas com tamanhos homogêneos
Monômeros solúveis em água
Inversa
Meio dispersante orgânico
Processo em duas etapas, com produção simultânea
Suspensão-Emulsão
de micro e nanopartículas
Obtenção de partículas do tipo casca-núcleo
A polimerização começa em solução e ocorre a
Dispersão
precipitação da fase polimérica
Obtenção de partículas com tamanhos homogêneos
Micro-suspensão
Altas taxas de conversão
Obtenção de partículas com tamanhos homogêneos
O processo de formação das partículas em uma polimerização em suspensão
pode ser entendido como uma sequência de três etapas. Inicialmente, o que existe é uma
dispersão do monômero líquido em pequenas gotas, que são estabilizadas pela ação do
agente de suspensão e a velocidade de agitação do sistema. Na segunda etapa, acontece
6
Adaptação para a lingua portuguesa do termo em inglês impeller – parte rotatória de um dispositivo que tem a função de
movimentar um fluído por rotação.
20
um equilíbrio dinâmico, usualmente reportado como de “quebra-coalescência”. Esse
fenômeno, que ocorre entre as gotas de monômero-polímero, determina o tamanho final
das partículas presentes no sistema. O processo de “quebra-coalescência” das gotas
pode ser entendido da seguinte maneira: ao entrar em contato com o agitador, as gotas
se quebram; longe do impelidor as gotas se “juntam” (coalescem), ao entrarem em
contato umas com as outras. Na terceira etapa do processo, as gotas atingem uma
viscosidade tão alta que se comportam como partículas poliméricas sólidas, não
ocorrendo mais nem o quebramento nem a coalescência, fazendo com que as partículas
mantenham o tamanho constante. Este fenômeno tem muita importância prática, pois a
morfologia das partículas, assim como a e distribuição de tamanhos, afeta diretamente o
manuseio e processamento do polímero. [43]
Embora o tamanho das gotas em uma polimerização em suspensão seja função
das taxas de quebra e coalescência do sistema, segundo BROOKS et al., [44, 45] a
evolução do tamanho de partículas pode ser descrita em quatro estágios característicos.
Estes estágios seriam:
Transição – a taxa de quebra das gotas é superior ao de coalescência; ocorre a
redução do tamanho das gotas até a obtenção de tamanhos bastantes
homogêneos.
Quasi-estacionário – a taxa de quebra é praticamente igual à de coalescência; o
tamanho das gotas permanece constante. A observação deste estágio depende
das condições experimentais usadas na polimerização.
Crescimento – a taxa de quebra é inferior à de coalescência; crescimento das
gotas.
21
Identificação – devido às altas viscosidades das gotas, estas passam a se
comportar como partículas sólidas, não sendo possível mais coalescerem com
outras gotas. Nesta fase, as taxas de quebra e coalescência são nulas.
Conforme revisado por MELO, [46] alguns estudos [44, 47] tiveram conclusões
bastante semelhantes sobre a influência de algumas das principais variáveis que
influenciam a evolução e o tamanho final da partícula em uma polimerização em
suspensão. Uma dessas variáveis é o agente estabilizante usado nas reações em
suspensão – também conhecido como agente de suspensão.
O agente de suspensão, é um componente indispensável na polimerização em
suspensão, pois esta classe de substâncias afeta diretamente a morfologia e a
distribuição final de tamanhos das partículas. Os três principais tipos de agentes de
suspensão usados nas reações de polimerização em suspensão são os polímeros solúveis
em água (como a gelatina e o PVA), os sais inorgânicos insolúveis (como os sais de
Mg, Ca e Al) e as misturas (contendo, por exemplo, polímeros orgânicos e sais
inorgânicos). [43] Dentre os inúmeros estabilizantes disponíveis, o PVA é um dos
compostos mais usados nas polimerizações em suspensão. [42] A grande vantagem do
uso do PVA, assim como dos demais agentes de suspensão poliméricos, é que esses
estabilizantes diminuem a tensão interfacial entre a gota de monômero e a fase aquosa
do sistema, permitindo a estabilização da interface e contribuindo com a redução das
taxas de coalescência. Os agentes de suspensão também previnem a coalescência entre
as gotas ao adsorverem na superfície e formarem uma fina camada protetora. Os sais
inorgânicos usados como agentes de suspensão apresentam algumas vantagens frente
aos estabilizantes poliméricos. Dentre essas, destacam-se os fatos de serem mais
baratos, causarem menor impacto ambiental e não formarem um filme sobre a superfície
22
das partículas, de maneira que os sais podem ser facilmente retirados do produto final
por lavagem. [43] De um modo geral, espera-se uma diminuição no tamanho de
partículas, à medida que se aumenta a concentração de agente de suspensão no meio
reacional. [44, 47]
Juntamente com a quantidade de agente de suspensão, a velocidade de agitação é
a uma das variáveis mais utilizadas para controlar o tamanho de gotas/partículas em
uma reação de polimerização em suspensão. O aumento da velocidade de agitação leva
à geração de gotas menores, ao aumentar a taxa de quebra das gotas, embora o aumento
de velocidade também possa aumentar a taxa de coalescência das gotas. [44, 45]
Nos processos de polimerização em que monômeros vinílicos são usados, a
polimerização ocorre usualmente por meio do mecanismo de radicais livres. Como já
descrito, neste tipo de polimerização é necessário gerar radicais livres para iniciar a
reação de polimerização, etapa esta que pode ser feita por intermédio de diversos tipos
de mecanismos. [1, 3] Assim como os agentes de suspensão, existem diversos tipos de
iniciadores disponíveis para os mais diversos tipos de sistemas de polimerização.
Entretanto, para a polimerização em suspensão, os iniciadores devem ser solúveis na
fase dispersa do sistema; ou seja, na fase que contém os monômeros. Em geral
pertencentes à família dos peróxidos orgânicos ou azocompostos, os iniciadores usados
nos processos de polimerização em suspensão são misturados à fase dispersa (0,1 a
0,5% em relação à massa de monômero) antes do sistema alcançar a temperatura de
reação. [42]
Além das variáveis citadas, o comportamento cinético da polimerização pode
influenciar drasticamente o tamanho e a distribuição de tamanhos final das partículas
produzidas na polimerização em suspensão. Uma vez que a identidade final das
partículas está intimamente associada ao aumento da viscosidade das gotas durante as
23
reações de polimerização, variáveis que atuam diretamente sobre a cinética de
polimerização (como a concentração de iniciador e a temperatura de polimerização)
também exercem uma importante influência sobre o tamanho final das partículas
formadas e sua distribuição. [44, 45]
Na técnica de suspensão, as reações de copolimerização normalmente são
conduzidas em batelada, empregando-se comonômeros miscíveis na fase orgânica e
alimentados de uma única vez, embora comonômeros que apresentem solubilidade em
água também possam ser empregados. [42] Essas estratégias operacionais não são muito
comuns por causa do bem conhecido efeito de desvio de composição em reações de
copolimerização conduzidos em batelada. [3]
2.1.3 Partículas esféricas com morfologia do tipo
casca-núcleo de PVA/PVAc
O PVA, representado na Figura 2.3, é um polímero que não pode ser sintetizado
diretamente por polimerização, pois o seu monômero (o álcool vinílico) não existe em
estado livre. Desta forma, a estratégia usada para obter o PVA consiste em primeiro
sintetizar um polímero, que em geral é um poli(éster vinílico), e depois modificá-lo até
a obtenção do PVA. [29, 48, 49]
n
OH
Figura 2.3 – Poli(álcool vinílico) (PVA)
24
O poli(éster vinílico) mais empregado na produção do PVA é o poli(acetato de
vinila) (PVAc). Este polímero pode ser sintetizado através de polimerização via radicais
livres a partir do monômero acetato de vinila (VAc), que possui uma grande tendência
de formar polímeros ramificados (Figura 2.4). O PVAc é um polímero que possui baixa
resistência química e, consequentemente, uma alta susceptibilidade à degradação. Dadas
essas características, a obtenção do PVA geralmente ocorre em duas etapas:
primeiramente faz-se a síntese do PVAc a partir do VAc e, posteriormente, faz-se a
modificação do PVAc a PVA por meio de uma reação química. [29]
As propriedades físicas e químicas do PVA sintetizado dependem diretamente
do tipo de polímero usado para sua produção e também das condições de operação da
etapa de modificação. Variáveis como temperatura de reação, conversão do monômero
em polímero, uso de solvente, quantidade e tipo de iniciador, etc., não influenciam
apenas a qualidade do PVAc obtido, mas também a qualidade do PVA que será
sintetizado. [48]
R
!
O
O
n
O
O
Figura 2.4 – Reação de polimerização do acetato de vinila.
A modificação do PVAc para formar o PVA pode ser realizada com auxílio de
diversas estratégias. Geralmente, esses métodos de hidrólise são agrupadas de acordo
com o tipo de catalisador usado. Essas reações estão representadas nas Figuras 2.5 a 2.8,
conforme descrito por FINCH. [49]
25
O
+
n
O
n ROH
ácido ou base
n
+
n RO
OH
O
Figura 2.5 – Reação de alcoólise de PVAc.
O
+
n
O
n H2O
ácido ou base
n
+
n HO
OH
O
Figura 2.6 – Reação de hidrólise do PVAc.
O
+
n
O
n HNR1R2
H2O
n
+ n R2R1N
OH
O
Figura 2.7 – Reação de aminólise do PVAc.
O
+
n
O
O
n NH3
NH4Cl ou
NH4OOCCH3
n
+
n H2N
OH
Figura 2.8 – Reação de amonólise do PVAc.
Durante a transformação do PVAc em PVA, deve-se considerar que também
acontecem reações secundárias paralelamente à reação principal. Conforme
exemplificado na Figura 2.9, uma pequena quantidade de monômero residual (acetato
26
de vinila) pode reagir, sendo convertido a acetaldeido, caso seja empregado um
catalisador alcalino e compostos hidroxilados alifáticos. [50]
Os dois métodos mais empregados para produzir PVA a partir de PVAc são as
reações de hidrólise (também conhecida como reação de saponificação) e a reação de
transesterificação (alcoólise). Em ambos os casos, o PVA precipita quase que
instantaneamente na forma de flocos com morfologia irregular. [48, 51] O PVA obtido
pelos métodos descritos anteriormente costumam apresentar coloração que varia do
branco ao amarelo (cor associada à formação de subprodutos indesejados ou à presença
de acetato de vinila residual) na forma de pó ou de grânulos. Mesmo existindo uma
grande variedade de qualidades, os tipos de PVA produzidos e comercializados podem
ser classificados como PVA’s parcialmente hidrolisados ou totalmente hidrolisados.
[48]
O
O
O +
ROH
KOH
+
O
RO
Figura 2.9 – Reação secundária do VAc durante a hidrólise do PVAc em PVA.
As resinas de PVA produzidas industrialmente geralmente são obtidas por
alcoólise do PVAc, que apresenta elevadas taxas de reação e promove a hidrólise do
PVAc a PVA quase por completa. Por esta razão, a obtenção de resinas parcialmente
hidrolisadas por alcoólise é difícil, considerando-se as condições de hidrólise
convencionais. Outro fato importante é que a obtenção de partículas com morfologia
definida é muito difícil nas condições usuais de operação, já que as resinas de PVA são
27
insolúveis no álcool usado nas reações (quase sempre o metanol), o que ocasiona sua
precipitação na forma de flocos irregulares, à medida que são formadas. [52]
Como discutido nas seções anteriores, os agentes embólicos possuem três
requisitos importantes: o tipo de material usado, o tamanho das partículas e a forma das
partículas. Entretanto, a maioria dos agentes embólicos hoje disponíveis ainda apresenta
uma série de inconvenientes, como morfologia irregular, tendência a formar
aglomerados e dificuldade em passar pelo cateter. [29, 52]
De longe, o PVA é o material mais usado e pesquisado, devido a algumas de
suas características, principalmente a biocompatibilidade. Mesmo assim, o PVA
sintetizado para ser usado como agente embólico deve ter, além das propriedades já
mencionadas, boa resistência a solventes e também uma elevada resistência térmica,
para que este seja estável a procedimentos de esterilização do material. [53]
PINTO et al. [53] observaram que os três requisitos desejados para um agente
embólico podem ser controlados, usando o sistema de polimerização em suspensão. A
grande questão tecnológica diz respeito à obtenção de partículas esféricas de PVA, já
que, como discutido previamente, este polímero não pode ser obtido por polimerização
direta de seu monômero. Desta maneira, foi proposta a síntese do PVAc pelo método
clássico de polimerização em suspensão, seguida de uma reação de modificação (por
exemplo a hidrólise), para obter partículas esféricas com morfologia casca-núcleo, em
que a casca modificada é formada por PVA e o núcleo denso é formado por PVAc.
O esquema geral proposto por PINTO et al. [53] está representado na Figura
2.10. As principais vantagens do processo incluem a obtenção das partículas esféricas
com morfologia casca-núcleo em um processo sequencial em duas etapas, a
possibilidade de controlar a formação da “casca” de PVA e a flexibilidade de usar
28
diversas condições experimentais para produzir materiais com propriedades distintas – o
que inclui o uso de comonômeros, solventes, fármacos, substâncias ativas, etc.
Posteriormente, PEIXOTO et al. [52] e PEIXOTO [29] utilizaram vários tipos
de solventes orgânicos (como o pentano, o ciclohexano e o heptano) durante a obtenção
das partículas esféricas com morfologia casca-núcleo de PVA/PVAc, misturando-os à
fase monomérica. O uso de solvente permitiu a obtenção de partículas porosas menos
densas, o que constitui uma vantagem durante a aplicação do agente embólico, pois
diminui alguns problemas frequentemente relatado pelos médicos, como agregação no
cateter de injeção e a rápida sedimentação das partículas embolizantes ainda na seringa.
!
!
!
!
Polimerização
Modificação
!
!
!
!
!
!
Fase orgânica
Fase aquosa
!
PVA
PVAc
PVAc
Figura 2.10 – Ilustração do processo de obtenção das partículas esféricas com morfologia tipo
casca-núcleo de PVA/PVAc por polimerização em suspensão proposta por PINTO et al. [53]
As vantagens práticas observadas pelas partículas casca-núcleo de PVA/PVAc
incluem o fato de o PVA encontrar-se suportado em um material praticamente insolúvel
em soluções aquosas, que é o PVAc. Isso evita que as partículas se solubilizem em
soluções aquosas, o que contribui para melhorar a estabilidade química e mecânica das
29
partículas, o que é muito positivo nessa aplicação. Além disso, as partículas com
estrutura casca-núcleo tendem a “inchar” menos, uma vez que a camada de PVA
formada não é tão extensa, diminuindo o aumento de volume das partículas e as chances
de obstruções não desejadas do cateter. [29] Finalmente, a cobertura da casca de PVA é
suficiente para conferir o caráter hidrofílico às partículas preparadas.
Quanto ao desempenho das partículas no procedimento de embolização, as
matrizes de PVA/PVAc esféricas e com morfologia casca-núcleo mostraram ser muito
mais eficientes que as partículas de PVA com morfologia irregular (Figura 2.11). Testes
in vivo [21, 52, 53] com coelhos demonstraram que, embora ambos os tipos de
partículas sejam eficientes quanto a oclusão do vaso, quando as partículas esféricas
foram empregadas, a fibrose do tecido embolizado foi mais intensa.
É importante enfatizar que as partículas foram testadas in vivo, para o tratamento
pré-operatório de tumores com sucesso. [54, 55] Por isso, o uso desse material foi
aprovado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil), sendo atualmente
comercializado com o nome de Spherus® (First Line Brasil).
A
A
B
B
Figura 2.11 – Comparação entre partículas irregulares de PVA (A) e de partículas com
morfologia casca-núcleo de PVA/PVAc (B) e suas respectivas eficiências na embolização
vascular. [52]
30
Como verificado por PINTO et al. [53], MENDES et al. [21] e PEIXOTO et al.
[52], dentre todas as características e requisitos desejados para um agente embólico, a
forma e o tamanho das partículas exercem influência marcante no resultado final da
embolização, mostrando-se de forma inequívoca que procedimentos realizados com
partículas esféricas apresentaram melhores resultados frente a agentes embólicos
irregulares. Entretanto, quando vários agentes embólicos esféricos são comparados,
diferenças nas características das partículas e na eficiência das mesmas na embolização
vascular podem também ser observadas. [56]
2.1.4 Incorporação de fármacos em polímeros
Em 1968 a Alza Corporation (Palo Alto, CA, EUA) criou o termo drug delivery
system para introduzir o conceito de um sistema de liberação continuada de fármacos,
que proporcionaria a ação farmacológica desejada com mínimos efeitos colaterais. As
principais características desejadas para um sistema de liberação controlada são a
capacidade de absorver o fármaco e a capacidade de liberá-lo de forma controlada em
um sítio de ação específico. Essas características são melhor entendidas quando os
medicamentos usados são os anti-cancerígenos. Nestes casos, essa classe de fármacos é
altamente tóxica e responsável por uma série de efeitos colaterais, estes devem ser
liberados apenas em “alvos” específicos (as células “doentes”), em quantidades e tempo
suficientes para realizar o tratamento. [57]
Para ser considerado ideal, um sistema de liberação controlada de fármacos deve
ter algumas características chaves que incluem a biocompatibilidade, a resistência
mecânica, o conforto para o paciente, a absorção de altas quantidades de droga durante
o preparado, a não liberação da droga acidentalmente, a fácil produção e a possibilidade
de esterilização. Para sistemas de liberação controlada de drogas anti-cancerígenas,
31
algumas propriedades adicionais são também desejadas. Entre elas podem ser citadas a
capacidade atingir o “câncer” de maneira específica, promover a absorção da droga pelo
tecido “doente”, de controlar e manter a liberação da droga durante o tratamento, de
aumentar o tempo de exposição do tumor ao fármaco e também de não permitir a
elevação dos níveis do medicamento sistemicamente. [58]
Muitos estudos e pesquisas têm sido realizadas para desenvolver sistemas de
liberação de fármacos. [57, 59-67] Neste contexto, os materiais poliméricos
(principalmente os sintéticos) apareceram com destaque por apresentarem inúmeras
vantagens. [68, 69] A principal delas é a facilidade de produzir, sintetizar e/ou
modificar inúmeros tipos de polímeros, para serem usados como dispositivos de
liberação controlada, em função do fármaco ou alvo desejado. Outras características
importantes são a biocompatibilidade e a biodegradabilidade, [70] comuns a muitos
polímeros naturais e sintéticos.
No que se refere ao preparo de microcápsulas e/ou microesferas (ou
respectivamente nanocápsulas e nanoesferas) poliméricas, para serem usadas como
sistemas de liberação controladas de droga, existem basicamente dois métodos usados
para carregar as drogas ou substâncias ativas nas matrizes poliméricas: incorporação ou
adsorção. No primeiro método, a substância é solubilizada no meio reacional de
polimerização antes da adição do monômero, o que faz com que a substância
encapsulada fique presa no interior da matriz. Na segunda estratégia, a substância é
adicionada ao meio quando a matriz polimérica já está formada. Neste método, a
substância encontra-se adsorvida predominantemente na superfície do dispositivo. [61]
O método de incorporação é extremamente interessante, pois permite sintetizar a
matriz polimérica e carregar o fármaco desejável simultaneamente. Do ponto de vista de
processo, elimina-se uma etapa e reduzem-se os custos globais de produção do
32
dispositivo. Porém, o maior desafio deste método é garantir que o fármaco incorporado
tenha sua atividade preservada, já que os componentes e condições da polimerização
podem interagir com o fármaco, destruindo a molécula ou desativando o centro ativo
que é responsável pela ação farmacológica.
HENRY-MICHELLAND et al. [71] utilizaram a polimerização em emulsão
para incorporar antibióticos ß-lactâmicos (ampicilina e gentamicina) em nanopartículas
biodegradáveis de policianoacrilatos. Os autores verificaram que os antibióticos
preservaram sua atividade antimicrobiana após o processo de polimerização, além de
confirmarem que o perfil de liberação dos antibióticos depende da degradação da matriz
polimérica (que, no caso dos acrilatos, é feita principalmente por via enzimática).
Usando a mesma estratégia de produção, COUVREUR et al. [72] testaram a atividade
in vivo de nanopartículas de poli(iso-hexilcianoacrilato) carregadas com ampicilina,
verificando que a absorção da ampicilina foi maior quando esta estava associada às
nanopartículas, em comparação com a droga livre.
FONTANA et al. [63] descreveram uma metodologia para preparar
nanopartículas
de
polietilcianoacrilatos
(PECA)
carregadas
com
antibiótico
(ampicilina). As partículas foram preparadas por polimerização em emulsão e a
incorporação do antibiótico foi feita através da fase aquosa do sistema. Os autores
observaram que o processo de incorporação da droga não afetou a atividade do fármaco
nem o tamanho das nanopartículas formadas. Em outro estudo, FONTANA et al. [62]
utilizaram a mesma metodologia para preparar nanopartículas de PECA, agora
carregadas com outro tipo de antibiótico (amoxicilina), e avaliaram a influência da
adição de polietilenoglicol (PEG) no momento da polimerização. O uso do PEG alterou
as propriedades das nanopartículas sintetizadas, como o tamanho das partículas
33
formadas, o potencial zeta, a capacidade de incorporação do fármaco e o perfil de
liberação de fármacos das nanopartículas.
SOMA et al. [73], com o intuito de contornar efeitos de resistências a drogas,
utilizaram a tecnologia de polimerização em emulsão para incorporar dois fármacos
com ação anticancerígena em uma mesma nanopartícula de policianoacrilato. Os testes
in vitro mostraram que, além de terem suas atividades farmacológicas preservadas, a
incorporação de ambos os fármacos na mesma nanopartícula provocou uma ação
sinérgica positiva.
Como brevemente descrito, a maior parte dos estudos que utilizam a técnica de
incorporação de fármacos em partículas poliméricas produz os polímeros por
intermédio de sistemas em emulsão. Contudo, há alguns estudos que utilizam outras
técnicas, como o caso de ICONOMOPOULOU et al. [64], que incorporaram agentes
antimicrobianos em partículas poliméricas, usando a técnica de polimerização em
suspensão, e por PARK & KIM, [74] que incorporaram um antibiótico em partículas de
PVAc por miniemulsão.
O método mais fácil (e mais usado) para carregar dispositivos com fármacos é a
metodologia de adsorção clássica, que consiste em colocar os dois materiais em contato.
Este método, conforme descrito por LEWIS et al., [75] é o mais empregado para
preparar os agentes utilizados em quimioembolização e também para carregar outras
substâncias ativas nas partículas de polímeros, como, por exemplo, proteínas e vacinas.
[66, 76-78]
Além da adsorção clássica, algumas outras técnicas também são usadas como
estratégia para carregar fármacos, como a solubilização do polímero em um solvente
orgânico, [79] a deposição interfacial, [80] a secagem por spray-drying [81] e a técnica
de evaporação de solvente. [67, 82]
34
As técnicas de incorporação e adsorção são usadas conforme a necessidade do
dispositivo a ser preparado. Embora o método de incorporação seja atrativo do ponto de
vista do processo, nem sempre ele pode ser usado. A escolha entre a técnica de
incorporação e a técnica de adsorção depende do tipo de resposta esperada. Como
exemplo, ARIAS et al. [83] prepararam um sistema polimérico magnético de liberação
controlada de quimioterápicos. Os dispositivos, que apresentaram morfologia do tipo
casca/núcleo, foram sintetizados via polimerização em emulsão e o carregamento dos
fármacos nas matrizes poliméricas foi feito tanto pelo método de incorporação quanto
pelo método de adsorção. Os autores constataram que, dependendo do método utilizado,
diferentes perfis de liberação dos fármacos são obtidos. Em geral, drogas incorporadas
no momento da polimerização levam o dispositivo a apresentar um perfil de liberação
bifásico e mais lento, quando comparados aos perfis obtidos quando as drogas são
adsorvidas nos dispositivos.
TUROS et al. [84, 85] desenvolveram uma nova metodologia para carregar
antibióticos β-lactâmicos pouco solúveis em água em matrizes poliméricas à base de
acrilatos. Segundo a abordagem proposta, primeiro transforma-se inicialmente o
fármaco em um derivado de acrilato. Em seguida, o fármaco funcionalizado é
dissolvido com o monômero, sendo as partículas poliméricas, com o fármaco
incorporado, sintetizadas por polimerização via radicais livre. Os autores mostraram que
o uso de fármacos funcionalizados leva à formação de um polímero em que o fármaco
está de fato ligado covalentemente à matriz e que as partículas poliméricas formadas
apresentaram atividade antibacteriana in vitro e mostraram ainda que, de alguma forma,
a matriz polimérica aumentou a eficiência do antibiótico, quando este se encontrava
ligado covalentemente à matriz. Os autores destacaram que a metodologia torna fácil a
preparação de matrizes poliméricas conjugadas com antibióticos e também torna
35
possível a incorporação de fármacos pouco solúveis em água direto na matriz
polimérica, sem a necessidade de pós-processamentos.
Uma outra abordagem alternativa é a funcionalização do monômero, para que
este apresente atividade farmacológica. Esta foi a estratégia usada por CAO & SUN
[86] para o desenvolvimento de uma emulsão polimérica com atividade antimicrobiana,
para uso posterior como aditivo de tintas comerciais. Embora este material a princípio
não tenha uso farmacêutico, a estratégia utilizada (de primeiro funcionalizar o
monômero e depois fazer o polímero) leva à formação de um material com
“propriedades farmacológicas”, sem que necessariamente exista um fármaco a ser
incorporado e/ou adsorvido à matriz polimérica.
2.2 Objetivo e justificativa
O principal objetivo deste Capítulo é verificar as influências da incorporação in
situ de um fármaco durante o processo de polimerização em suspensão, para a produção
de micropartículas poliméricas, com morfologia tipo casca-núcleo, para serem usadas
como agentes embólicos. Para este fim, será usado um fármaco modelo (amoxicilina) e
serão avaliadas as alterações nas características morfológicas e moleculares das
micropartículas poliméricas sintetizadas na presença do fármaco.
Embora haja muitos estudos que se proponham a encapsular fármacos utilizando
técnicas de polimerização, poucos são os que estudam as influências da incorporação in
situ deste fármaco sobre as características e propriedades finais do polímero obtido.
Grande parte, se não todos os estudos, tem como principal foco estudar a cinética de
liberação dos fármacos, sendo que a caracterização do polímero é vista como um
aspecto secundário do problema, na maior parte das vezes não abordada. Além disso,
36
nenhum estudo reportou os efeitos da incorporação in situ de fármacos durante a
polimerização em suspensão para a obtenção de agentes embólicos.
A escolha da amoxicilina é justificada pois além de servir como fármaco
modelo7, o uso de antibióticos é feito profilaticamente em procedimentos de
embolização, [20] sendo que alguns autores já previram uma possível associação de
fármacos antibióticos com agentes embolizantes; também para fins profiláticos. [33]
Além disso, o desenvolvimento de um agente embólico com algum tipo de antibiótico
pode aumentar o tempo de armazenamento do material, embora seja importante
enfatizar que este tipo de material deve ser estéril e não apenas isento de
microrganismos vivos.
2.3 Metodologia experimental
A metodologia experimental usada seguiu basicamente as especificações
descritas previamente por PINTO et al., [52, 53] com algumas modificações
experimentais para promover a incorporação in situ do fármaco.
2.3.1 Materiais
Foram usados os seguintes reagentes: acetato de vinila (VAc, 99%, Vetec
Química Fina), água (destilada, desmineralizada e microfiltrada), amoxicilina
trihidratada compactada (Grau A, Laboratório Globo Ltda.), clorofórmio deuterado
(CDCl3, 99,8%, Cambridge Isotope Laboratories), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO,
99,9%, Cambridge Isotope Laboratories), hidróxido de sódio (NaOH, 99%, Vetec
7
O termo “fármaco modelo” foi empregado nesta Tese sendo um fármaco que possuísse atividade farmacológica direta ou indireta
na embolização vascular e que pudesse servir de base comparativa para possíveis estudos com outros fármacos.
37
Química Fina), lauril sulfato de sódio (LSS, 90%, Vetec Quimica Fina), metacrilato de
metila (MMA, 99%, Sigma-Aldrich ou Denstply Brasil), peróxido de benzoíla (BPO,
97%, Vetec Química Fina), poli(álcool vinílico) (PVA, 88% de hidrólise e Mw = 78.000
g/mol, Vetec Química Fina,) e tetrahidrofurano (THF, 99,9%,Tedia).
Em todos os experimentos relatados neste Capítulo, utilizaram-se os reagentes
conforme recebidos pelos fornecedores, não sendo empregado nenhum tipo de
procedimento de purificação. A única exceção foi a água usada nos experimentos, que
foi destilada, desmineralizada e microfiltrada.
2.3.2 Unidade Experimental
A unidade experimental usada nas reações de polimerização e na etapa de
saponificação está ilustrada na Figura 2.12. A unidade era operada na pressão
atmosférica e a aferição da temperatura dentro do reator acompanhada com termopar e
eventualmente através de um termômetro de mercúrio.
Figura 2.12 – Esquema e fotos parciais da unidade experimental usada nas reações de
polimerização e na etapa de saponificação.
38
A unidade experimental apresentada na Figura 2.12 era composta por: reator de
vidro encamisado de 1 L (FGG Equipamentos Científicos Ltda, Brasil), conectado a um
sistema de aquecimento/refrigeração a água com temperatura programada Haake
Phoenix II (Thermo Electron Co., Alemanha), equipado com tampa de aço inoxidável
com 6 orifícios, agitador mecânico EuroStar Digital (IKA, Alemanha), haste reta,
impelidor tipo hélice com 6 pás e condensador de serpentina de vidro, conectado a um
sistema de refrigeração a água com temperatura programada Isotemp 2028P (Fisher
Scientific com refrigerador PolyScience KR30A).
2.3.3 Métodos
Polimerização em suspensão
As reações de polimerização em suspensão, via mecanismo clássico de radicais
livres, foram realizadas na unidade descrita anteriormente. O procedimento adotado foi
o mesmo descrito por PINTO et al., [53] exceto quando especificado.
Os componentes da receita padrão usada nas polimerizações em suspensão estão
descritas na Tabela 2.2. Inicialmente adicionava-se ao reator uma solução do agente de
suspensão no meio dispersante e aquecia-se o reator até a temperatura estipulada para a
reação (70-90ºC). Após atingir a temperatura desejada, era adicionada uma solução
contendo (co)monômero(s) e o iniciador, mantendo o sistema na temperatura e
velocidades de agitação (600-700 rpm) definidos no plano da reação. A adição dos
componentes orgânicos da suspensão caracterizava o início da reação, que tinha uma
duração de aproximadamente 240 minutos. Ao final da etapa de reação, a temperatura
do reator era ajustada para 30 ± 5 ºC e o conteúdo do mesmo era retirado. A obtenção
do polímero era feita separando-se o precipitado do sobrenadante por filtração,
39
utilizando-se água destilada para lavar as partículas. O polímero obtido era então seco
em estufa a vácuo a 25 ºC e processado em gral de porcelana, até a separação dos
grânulos observados visualmente. Nas reações realizadas, adicionou-se um fármaco
numa proporção que variava de 0-1% (m/m) em relação à quantidade de monômero
utilizado na formulação. O fármaco era adicionado ao meio reacional de duas formas: o
primeiro método consistia na dissolução do fármaco na solução orgânica, que era
composta pela mistura do(s) (co)monômero(s) e iniciador; o segundo método
empregado era o de solubilizar o fármaco na fase aquosa do meio.
Tabela 2.2 – Receita genérica de polimerização em suspensão a 70 ou 90 ºC.
Fase contínua
Água
PVA
Fase dispersa
VAc
MMA
BPO
Fármaco*
Quantidade (g)
420
0,2
140 – 200
0 – 60
2–4
0–2
Função
Fase contínua
Agente de suspensão
(co)Monômero
Comonômero
Iniciador
Fármaco
PVA = poli(álcool vinílico); VAc = acetato de vinila; MMA = metacrilato de metila; BPO = peróxido de benzoíla.
Reação de saponificação
A reação de saponificação, que visa à conversão parcial do PVAc superficial em
PVA, foi realizada seguindo basicamente a metodologia descrita por PINTO et al. [53]
e PEIXOTO [29]. A principal diferença em relação à metodologia originalmente
proposta é que, para poder estudar os efeitos da incorporação do fármaco nas
propriedades dos polímeros (núcleo e também na casca de PVA), este processo foi
realizado em duas etapas distintas.
No procedimento adotado, em um sistema com controle de agitação e
temperatura, 20 g de polímero seco reagiam com 20 mL de solução NaOH 40% (m/v)
em 80 mL de água, durante 2 horas, mantendo-se a temperatura controlada em 30 ± 5 ºC
40
e a agitação em 500 rpm. Ao final da reação, o polímero era recuperado por filtração,
lavado com água destilada e seco em estufa a vácuo a 25ºC.
2.3.4 Caracterização
Microscopia
As características macroscópicas das partículas obtidas foram determinadas com
auxílio de um microscópio ótico SMZ 800 (Nikon, Japão) e câmera digital Coolpix 995
(Nikon, EUA). A microestrutura das partículas foi analisada com auxílio de microscopia
eletrônica de varredura, em equipamento Quanta 200 (FEI Company, EUA). Neste caso,
antes da visualização as amostras eram recobertas com uma camada de ouro de 300 nm,
utilizando-se um metalizador JFC-1500 (JEOL, Japão).
Cromatografia de permeação em gel (GPC)
As determinações de massas molares dos polímeros sintetizados foram
realizadas em cromatógrafo Waters, usando THF como fase móvel (vazão 1 mL/min) e
equipado com detector de refração 410 e três colunas Styragel HR (500 – 30 × 103 Da, 5
× 103 – 600 × 103 Da e 2 × 103 – 4 × 106 Da) a 40 ºC. O sistema foi calibrado
utilizando-se 12 padrões de poliestireno (Shodex Standard).
Todas as análises de GPC descritas neste Capítulo foram realizadas no Centro de
Caracterização e Desenvolvimento de Materiais (CCDM) da Universidade Federal de
São Carlos – SP, Brasil. As distribuições de massas molares apresentadas neste Capítulo
foram normalizados em relação ao valor máximo, segundo a relação:
41
ynormalizado =
yi
(2.1)
ymáximo
Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)
Aproximadamente 10 mg de amostra eram pesadas em uma cápsula de alumínio,
selada com o auxílio de uma prensa. A determinação da Tg foi realizada em um
calorímetro DSC-7 (Perkin-Elmer, EUA), na faixa de -20 a 140 ºC, a uma taxa de
aquecimento de 10 ºC/minuto e durante a segunda rampa de aquecimento, para eliminar
a história térmica do polímero.
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (13C-RMN)
As análises de
13
C-RMN descritas neste Capítulo foram realizadas em
equipamento Varian UNIT-Plus (Varian Analytical Instruments, EUA), operando a 100
MHz e equipado com uma sonda de 10 mm de diâmetro interno. Para preparo das
amostras, utilizou-se ou clorofórmio deuterado (CDCl3) ou dimetilsulfóxido deuterado
(DMSO). O tetrametilsilano (TMS) foi usado como referência interna e manteve-se a
temperatura constante em aproximadamente 25ºC em todas as análises realizadas.
A Tabela 2.3 e a Figura 2.13 apresentam os deslocamentos específicos dos
núcleos de carbono para o PVAc, PMMA e PVA, de acordo com os polímeros
sintetizados e de dados já catalogados na literatura. [87, 88] A Tabela 2.4 apresenta os
deslocamentos específicos dos núcleos de carbono da amoxicilina, sendo o espectro de
13
C-RMN apresentado na Figura 2.14. Baseando-se em dados já publicados [87] e
também em espectros gerados por simuladores de RMN, foi possível identificar todos
os deslocamentos específicos para o fármaco, conforme assinalado no espectro.
42
Tabela 2.3 – Deslocamento dos núcleos de carbono de PVAc e PVAc-co-PVA.
Carbono
Expa
66.4
38.8
A1
A2
A3
A4
A5
A6
B1
B2
C1
C2
C3
PVAc
Refa,b
66.4
38.9
Expa
PMMA
54.2
44.7
Refa,b
PVA
Expa
Refb,c
54.6
44.5
67.9
44.8
170.1
20.7
68.4
45.3
170.0
20.6
177.7
51.6
18.5 16.2
177.5
51.4
18.1 16.4
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
Valores em ppm para 13C-RMN; aCDCl3; bBRANDOLINI & HILLS [88]; cD2O.
C3
A2
A6
A4
A5
A1
n
m
A3
O
O
B1
j
O
C1
OH
O
B2
C2
Figura 2.13 – Deslocamento de 13C-RMN para poli(acetato de vinila) (PVAc), poli(metacrilato
de metila) (PMMA) e poli(álcool vinílico) (PVA).
Tabela 2.4 – Deslocamento dos núcleos de carbono da amoxicilina.
Carbono
Amoxicilinaa
Referênciab
Simuladorc
C2
60.3
64.6
59.80
C2α
29.9
27.5
26.49
C2β
33.7
31.8
31.32
C3
75.4
73.9
69.48
C5
67.0
67.0
66.54
C6
58.4
57.5
60.34
C7
-
170.0
166.30
C9
175.7
173.1
176.30
C10
-
57.2
-
C11
172.4
173.6
171.62
C3’ C5’
118.0
115.0
117.22
C1’
129.3
128.1
130.41
C2’ C6’
131.5
131.4
127.55
C4’
160.6
156.8
-
Valores em ppm para 13C-RMN; aDMSO; bDI STEFANO et al. [87] em DMSO + NAOD em D2O; cSimulador.
43
5'
HO
6'
DMSO
O
4'
H
3'
10
1'
9
2'
H
8
S
N
H
NH2
6
5
7
4
1
N
2
3
O
COOH
11
C3', C5'
C2', C6'
C2-beta, alfa
C5
C4'
C3
C9 C11
C2
C6
C1'
Figura 2.14 – Espectro de 13C-RMN da amoxicilina usada nos experimentos.
Devido à baixa solubilidade da amoxicilina pura em clorofórmio, usou-se como
solvente o DMSO, que gera um sinal característico em 39.7 ppm. Como este solvente
não apresenta anéis benzênicos em sua estrutura, os dados de deslocamento de núcleos
de carbono em DMSO e em clorofórmio podem ser usados de forma comparativa.
Liberação de Fármaco
Os testes de liberação de fármacos e/ou compostos bioativos geralmente são
realizados por intermédio de extração da substância de interesse em meio aquoso. Este
meio pode ter características especiais, como pH ácido, no caso de fármacos ou
compostos que são absorvidas no estômago, ou pH 7,4 para formulações injetáveis.
Após um período estabelecido, faz-se uma dosagem do meio extrator para estabelecer a
concentração de fármaco liberado. Esta dosagem geralmente é feita por leitura da
absorção na região do UV-Vis, em espectrofotômetros ou por cromatografia líquida.
44
Em um balão volumétrico de 50 mL, pesou-se 1 g de amostra, anotando-se
exatamente o peso. Em seguida, completou-se o volume do frasco com uma solução
extratora de lauril sulfato de sódio 1% (m/v) em água. O recipiente foi agitado em por 2
horas a temperatura ambiente (placa de agitação horizontal HS-250, IKA, Germany).
Após o período de extração, os sólidos foram retirados por filtração e o extrato
recolhido em frasco limpo e seco. A absorbância dos extratos aquosos foram
determinadas em espectrofotômetro UV-Vis (Lambda 35, Perkin-Elmer, EUA),
utilizando cubetas de quartzo de 5 mm, para leituras de varredura entre as regiões de
200-700 nm, e em comprimentos de onda específicos de 228 e 274 nm, correspondentes
aos dois picos de absorção da amoxicilina trihidratada neste meio extrator. A solução
extratora de lauril sulfato de sódio 1% foi utilizado como branco, para fins de calibração
do equipamento. A determinação da concentração de amoxicilina extraída das amostras
foi calculada a partir de equações geradas com curvas analíticas, obtidas com soluções
de concentrações conhecidas de amoxicilina no meio extrator para os dois
comprimentos de onda específico (228 e 274 nm).
45
2.4 Resultados & Discussão
2.4.1
Efeitos
da
incorporação
amoxicilina
nas
homopolimerização
in
situ
reações
em
suspensão
de
de
do
acetato de vinila
Para estudar os efeitos da incorporação de um fármaco modelo durante a
produção de micropartículas de PVAc, utilizaram-se diferentes concentrações de
amoxicilina nas homopolimerizações do VAc. O fármaco (amoxicilina) foi incorporado
in situ ao meio reacional, antes do início da reação de polimerização, utilizando duas
estratégias: por meio da solubilização na fase orgânica ou na fase aquosa do sistema de
polimerização em suspensão. Os componentes e condições utilizadas nestes
experimentos estão especificados na Tabela 2.5.
Tabela 2.5 – Receita de homopolimerização em suspensão do acetato de vinila.
Fase contínua
Água
PVA
Fase dispersa
VAc
BPO
Amoxicilina
Quantidade (g)
420
0,2
200
2
0 – 2*
Função
Fase contínua
Agente de suspensão
Monômero
Iniciador químico
Fármaco modelo
PVA = poli(álcool vinílico); VAc = acetato de vinila; BPO = peróxido de benzoíla.
*0; 0,1; 0,5 ou 1% (m/m) em relação à massa do monômero; adição em apenas umas das fases.
Reações realizadas com temperatura do reator à 70 ± 5 ºC e 700 rpm.
A amoxicilina (Figura 2.15) é uma penicilina semi-sintética de amplo espectro
de ação e utilizada principalmente na terapêutica de infecções das vias aéreas
superiores. [89, 90] Este fármaco possui aparência de pó branco e cristalino, sendo a
46
forma trhidratada a mais utilizada nas formulações comerciais. Em termos de
solubilidade, a amoxicilina possui solubilidade em água (4 mg/mL) e praticamente
nenhuma solubilidade em diversos solventes orgânicos, [91] sendo a identificação da
substância feita geralmente por análises de espectrometria na região do infra-vermelho e
ultra-violeta.
HO
O
H
H
S
N
H
NH2
N
O
COOH
Figura 2.15 – Estrutura da amoxicilina.
Um dos principais objetivos perseguidos durante a produção dos agentes
embólicos, como no caso de partículas com morfologia casca-núcleo, é a obtenção
dessas micropartículas no formato esférico e com uma faixa de tamanhos definida. Na
investigação da morfologia das micropartículas, à medida em que as amostras eram
produzidas e processadas, estas eram observadas por microscopia (óptica e eletrônica),
para avaliar a morfologia aparente e a existência de micro e nano-estruturas. A
incorporação in situ da amoxicilina na matriz polimérica (seja na fase orgânica ou na
fase aquosa do sistema) ocasionou alterações significativas nas propriedades
morfológicas das micropartículas poliméricas produzidas.
A primeira observação feita diz respeito à cor do polímero obtido, como
apresentado nas Figuras 2.16 e 2.17. Normalmente, o PVAc obtido por este tipo de
reação (polimerização em suspensão do acetato de vinila) apresenta uma coloração
branca-opaca. Com a adição da amoxicilina na reação, todos os polímero apresentaram
uma coloração “amarelada”, que aumentava de intensidade, à medida que a
47
concentração de fármaco também aumentava. Este comportamento foi observado
quando o fármaco foi incorporado tanto na fase orgânica do sistema (Figura 2.16)
quanto na fase aquosa (Figura 2.17).
i)
ii)
iii)
iv)
Figura 2.16 – PVAc sintetizado com incorporação in situ de amoxicilina na fase orgânica da
homopolimerização em suspensão do acetato de vinila. i) PVAc; ii) PVAc + 0,1% de
amoxicilina; iii) PVAc + 0,5% de amoxicilina; iv) PVAc + 1% de amoxicilina.
i)
ii)
iii)
iv)
Figura 2.17 – PVAc sintetizado com incorporação in situ de amoxicilina na fase aquosa da
homopolimerização em suspensão do acetato de vinila. i) PVAc; ii) PVAc + 0,1% de
amoxicilina; iii) PVAc + 0,5% de amoxicilina; iv) PVAc + 1% de amoxicilina.
Uma mudança de coloração do polímero (de branco para amarelo) pode ser
observada quando o PVAc era hidrolisado com hidróxido de sódio para a obtenção do
PVA. [48] Como revisado, a amoxicilina em sua forma trihiradata tem aspecto de um
pó branco e cristalino. Desta forma, a mudança na coloração do polímero é um indício
de que algum tipo de “modificação” está ocorrendo, seja uma adsorção do fármaco na
matriz polimérica, reações de hidrólise do PVAc e/ou outro tipo de interação entre a
matriz polimérica e o fármaco. Esta mudança de coloração também pode ser influência
48
de outro fatores, como a presença considerável concentração de monômero residual
e/ou outras impurezas no meio reacional. Embora a mudança de cor seja um aspecto
visual importante para monitoramento do processo, para fins de um procedimento de
embolização ela não possui importância.
A característica mais desejável do agente embólico, produzido por esta
tecnologia de polimerização em suspensão, é a obtenção de partículas com morfologia
esférica. Como já observado nas Figuras 2.16 e 2.17, muitas amostras apresentaram
uma característica borrachosa e outras foram obtidas como grandes aglomerados. A
Figura 2.18 apresenta micrografias de amostras das micropartículas de PVAc, com a
adição de amoxicilina na fase orgânica (Figura 2.18a) e na fase aquosa do sistema
(Figura 2.18b). Além das características já relatadas, foi possível observar por análise de
microscopia que a grande maioria das amostras apresentou perda da morfologia
esférica.
A
B
500 µm
500 µm
Figura 2.18 – Micropartículas de PVAc sintetizadas com incorporação in situ de 1% de
amoxicilina à fase orgânica (A) ou a fase aquosa (B) da homopolimerização em suspensão do
acetato de vinila.
Pelo fato da maior parte das amostras ter apresentado aspecto borrachoso,
formação de aglomerados e perda da morfologia esférica, o pós-processamento e
49
manuseio das amostras ficou comprometido, impossibilitando a realização da segunda
etapa do processo de formação das partículas com morfologia casca-núcleo: a reação de
saponificação.
O aspecto borrachoso do material está normalmente associado a três fatores: às
baixas massas molares (indicando que a amoxicilina pode atuar como um agente de
transferência de cadeia), à baixa cristalinidade do produto final (indicando que a
amoxicilina pode ser incorporada ao polímero, perturbando a estrutura regular do
material) ou às baixas conversões (indicando que a amoxicilina pode atuar como um
inibidor de reação).
O método empregado para incorporar o fármaco no momento da formação das
matrizes poliméricas provocou alterações significativas nas propriedades dos polímeros
sintetizados, como mostrado a seguir. A Tabela 2.6 contém os valores das massas
molares médias e das temperaturas de transição vítrea (Tg), como funções da
concentração e da fase na qual o fármaco foi adicionado, para a homopolimerização em
suspensão do acetato de vinila.
Tabela 2.6 – Valores de massa molar e Tg do como função dos teores de amoxicilina no meio
reacional da homopolimerização do acetato de vinila a 70 ºC.
Concentração de amoxicilina (% m/m)
Fase orgânica
Fase aquosa
0,1
0,5
1,0
0,1
0,5
1,0
Massa molar (× 10-3 g/mol)
Mn
Mw
Mw/Mn
15
125
8,28
103
252
2,44
8
58
7,52
74
166
2,26
122
286
2,34
115
285
2,48
113
244
2,15
Tg (ºC)
40,95
40,43
32,38
33,66
41,39
41,18
29,44
Como pode ser observado na Tabela 2.6, a adição de fármaco em concentrações
superiores a 0,1% ocasionou alterações significativas nos valores da Tg do polímero.
Quando a concentração do fármaco adicionado na fase aquosa aumentou de 0,5% para
50
1,0%, ocorreu uma queda no valor da Tg de aproximadamente 10ºC. Este
comportamento não foi observado quando o fármaco foi adicionado à fase orgânica do
sistema, já que uma queda brusca no valor da Tg ocorreu quando a concentração de
fármaco aumentou de 0,1 para 0,5%, com um ligeiro aumento no valor da Tg quando a
concentração aumentou de 0,5 para 1,0%. Pode-se dizer que a adição da amoxicilina
causa redução da Tg do produto final, sendo esse efeito mais significativo quando a
adição ocorre na fase aquosa.
A Tabela 2.6 também traz os resultados das massas molares médias dos
polímeros de PVAc obtidos na presença da amoxicilina. Uma análise dos dados
numéricos apresentados aponta para um aumento da massa molar quando se adiciona o
fármaco no sistema. As curvas de distribuição de massa molar (Figura 2.19) confirmam
os dados numéricos apresentados, indicando a presença de polímeros de alta massa
molar e elevadas razões Mw/Mn, característico de processos de polimerização via
radicais livres. [3] Entretanto, os resultados da Tabela 2.6 e da Figura 2.19 apontam
para a existência de um comportamento complexo, quando a amoxicilina é adicionada
in situ durante a reação de polimerização.
Conforme foi analisado, o aumento inicial de massa molar é seguido de queda
consistente, à medida que aumentam os teores de amoxicilina no meio. O
comportamento observado para a relação “massa molar x concentração de fármaco”, de
certa forma, foi o oposto do esperado, uma vez que a expectativa era de que o fármaco
pudesse atuar como um agente de transferência de cadeia, o que levaria a uma redução
da massa do polímero, à medida que a concentração do fármaco aumentasse no sistema.
O único caso em que de fato isso ocorreu foi quando o fármaco estava em concentração
de 0,5% na fase orgânica do sistema.
51
a)
1.2
1.0
w(log M) (a.u.)
0.8
0%
0.6
0,1%
0,5%
0.4
1%
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
b)
1.2
1.0
w(log M) (a.u.)
0.8
0%
0.6
0,1%
0,5%
0.4
1%
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
Figura 2.19 – Distribuições de massas molares dos homopolímeros de PVAc sintetizados com
incorporação in situ de amoxicilina à homopolimerização em suspensão do acetato de vilina. a)
adição da amoxicilina na fase orgânica; b) adição da amoxicilina na fase aquosa.
52
Estes primeiros resultados apresentados sugerem que a amoxicilina, nesta faixa
de concentração, não atua como um agente de transferência de cadeia, mas como
comonômero e/ou um plastificante, devido a redução nos valores de Tg. Isso pode
explicar por que a massa molar aumenta e a temperatura de transição vítrea diminui,
sugerindo mudanças de arquitetura molecular do polímero. O efeito menos pronunciado
na fase aquosa pode estar associado à menor incorporação do comonômero e à maior
atividade de reação quando as concentrações de comonômero são menores.
Para tentar elucidar a hipótese de incorporação do fármaco na estrutura
molecular, testes de
13
C-RMN foram realizados com o intuito de determinar a
composição dos polímeros sintetizados nesta etapa. Os espectros obtidos quando a
amoxicilina foi incorporada aos polímeros apresentaram interpretações semelhantes (ver
Anexo), sendo ilustrado pela Figura 2.20.
B1
A2
B2
A1
n
O
O
B1
A1
B2
A2
CDCl3
1%
0%
Figura 2.20 – Espectro de
13
C-RMN do PVAc sintetizado com incorporação in situ de
amoxicilina (0-1%) à fase orgânica da polimerização em suspensão do acetato de vinila.
53
Os espectros anteriormente apresentados na Figura 2.20 são referente às
amostras de PVAc sintetizado na ausência ou com a incorporação in situ de 1% de
amoxicilina à fase orgânica da homopolimerização em suspensão do acetato de vinila.
Entretanto, neste e em todos os outros espectros analisados (ver Anexo), foi possível
identificar os deslocamentos dos núcleos de carbono referentes ao PVAc (δ = 21.1,
38.7, 66.9 e 170.3 ppm), além de outros sinais referentes ao resíduo de solvente (CDCl3,
δ = 77.16 ppm), ao iniciador (BPO, δ = 128.7 ppm) e ao monômero (VAc, δ = 20.7,
97.4 e 141.3 ppm). Entretanto, não foram observados deslocamentos específicos
referentes aos núcleos de carbono da amoxicilina, podendo-se concluir que: (i) ou não
ocorreu a incorporação através de ligação química entre as moléculas do fármaco e a
matriz polimérica sintetizada, (ii) ou a incorporação foi muito pequena, estando próxima
dos limites de detecção da técnica de 13C-RMN.
A etapa de saponificação não foi realizada para este conjunto de amostras
devido à natureza dos polímeros obtidos. Os baixos valores de Tg, a presença de
monômero residual e tendência a formar polímeros ramificados produziu polímeros de
PVAc com aspecto borrachoso e uma alta tendência a formar aglomerados, o que
inviabilizou qualquer tipo de etapa de pós processamento.
54
2.4.2
Efeitos
da
amoxicilina
incorporação
nas
in
situ
reações
de
de
copolimerização em suspensão do acetato
de vinila e metacrilato de metila.
Para minimizar os efeitos de aglomeração, formação de polímeros borrachosos
com alta tendência a formar aglomerados e de perda de morfologia esférica, como
discutido anteriormente, acrescentou-se à formulação um comonômero (MMA), para
que a temperatura de transição vítrea (Tg) do material fosse elevada e, desta maneira, o
polímero obtido apresentasse uma característica mais estável na temperatura ambiente,
possibilitando um melhor manuseio e pós-processamento das amostras após a primeira
etapa de copolimerização em suspensão. A Tabela 2.7 especifica as reações realizadas
nesta etapa.
Tabela 2.7 – Receita de copolimerização em suspensão.
Fase contínua
Água
PVA
Fase dispersa
VAc
MMA
BPO
Amoxicilina
Quantidade (g)
420
0,2
140
60
4
0 – 2*
Função
Fase contínua
Agente de suspensão
Comonômero
Comonômero
Iniciador
Fármaco modelo
PVA = poli(álcool vinílico); VAc = acetato de vinila; MMA = metacrilato de metila; BPO = peróxido de benzoíla.
*0; 0,1; 0,5 ou 1% (m/m) em relação à massa total de comonômero; adição em apenas umas das fases.
Reações realizadas com temperatura do reator à 90 ± 5 ºC e 600 rpm.
As metas propostas foram alcançadas (como discutido adiante), pois a
substituição do VAc por uma mistura de comonômeros (VAc : MMA; 70:30) elevou a
Tg do material, permitindo a síntese de copolímeros com características de pó uniforme,
bem diferente dos homopolímeros de PVAc obtidos nas reações anteriores. As Figuras
55
2.21 e 2.22 apresentam as micrografias das partículas de PVAc-co-PMMA, obtidas com
a adição de amoxicilina na fase orgânica (Figura 2.21) e na fase aquosa do sistema
(Figura 2.22).
i)
ii)
iii)
iv)
Figura 2.21 – PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ de amoxicilina na fase
orgânica da copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila.
i) PVAc-co-PMMA; ii) PVAc-co-PMMA + 0,1% de amoxicilina; iii) PVAc-co-PMMA + 0,5%
de amoxicilina; iv) PVAc-co-PMMA + 1% de amoxicilina.
i)
ii)
iii)
iv)
Figura 2.22 – PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ de amoxicilina na fase
aquosa da copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila.
i) PVAc-co-PMMA; ii) PVAc-co-PMMA + 0,1% de amoxicilina; iii) PVAc-co-PMMA + 0,5%
de amoxicilina; iv) PVAc-co-PMMA + 1% de amoxicilina.
Embora, em termos de manuseio, as amostras de copolímero PVAc-co-PMMA
com amoxicilina tenham apresentado desempenho bem superior ao dos polímeros de
PVAc, as Figuras 2.23a e 2.23b permitiram concluir que a adição do fármaco in situ nas
reações de polimerização parece perturbar a formação de micropartículas esféricas.
56
A
B
500 µm
500 µm
Figura 2.23 – Micropartículas de PVAc-co-PMMA sintetizadas com incorporação in situ de 1%
de amoxicilina à fase orgânica (A) ou a fase aquosa (B) da copolimerização em suspensão do
acetato de vinila e metacrilato de metila.
Embora a concentração de fármaco no meio seja relativamente baixa, essas
primeiras observações podem ser um indício de que o fármaco tenha atividade
superficial, o que levaria à modificação da tensão interfacial do meio e à modificação da
morfologia das micropartículas obtidas.
A técnica de microscopia óptica possui grande utilidade para a identificação da
morfologia das partículas sintetizadas; porém, a resolução desta técnica é limitada. Para
observar a formação de possíveis microestruturas, algumas amostras foram investigadas
utilizando a microscopia eletrônica de varredura. Como observado pela microscopia
óptica, na microscopia eletrônica a morfologia esférica dos copolímeros também foi
observada, porém com algumas diferenças nas características superficiais das partículas.
A Figura 2.24 mostra detalhes da estrutura superficial e interna das micropartículas de
PVA/PVAc-co-PMMA sintetizada por meio da copolimerização em suspensão do
acetato de vinila e metacrilato de metila e posterior etapa de saponificação. As
micropartículas podem apresentar deformações superficiais que alteram a morfologia
esférica ideal. Entretanto, é provável que todas as partículas sejam densas e não
possuam microestrutura porosa no interior da partícula.
57
Figura 2.24 – Detalhe da superfície e do interior das micropartículas de PVA/PVAc-co-PMMA
sintetizada por meio da copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de
metila e posterior etapa de saponificação.
Quando o fármaco foi incorporado na fase orgânica da suspensão, as
micropartículas apresentaram muitos e pequenos poros superficiais, como pode ser visto
na Figura 2.25. O diâmetro característico desses poros variou de 500 a 1.000 nm de
diâmetro. Além disso, estas micropartículas apresentaram uma rugosidade superficial
bastante pronunciada e característica, além morfologia esférica mais regular, quando
comparadas com as micropartículas sintetizadas sem a presença do fármaco nas mesmas
condições de síntese. Na Figura 2.25 é possível identificar uma “casca”, com cerca de 5
µm, na superfície da partícula, indicando a atividade superficial do fármaco e a
interação com o meio de reação. Outra característica observada foi de que, assim como
para as partículas produzidas sem fármaco, as partículas sintetizadas com a adição de
amoxicilina à fase orgânica da suspensão observadas também se apresentaram densas e
sem a presença de microestruturas no interior das partículas, conforme Figura 2.25.
Pelas observações realizadas durante as análises de microscopia e no processo de
amostragem, é provável que todas as partículas apresentem essa densidade característica
e a ausência de microestruturas no interior das mesmas.
58
Figura 2.25 – Detalhe da superfície e interior de micropartículas de PVA/PVAc-co-PMMA
sintetizadas com incorporação in situ de 1% de amoxicilina à fase orgânica da copolimerização
em suspensão do acetato de vilina e metacrilato de metila e posterior etapa de saponificação.
A incorporação da amoxicilina na fase aquosa da suspensão levou em geral à
formação de micropartículas com morfologia esférica bem definida, porém sem a
presença de rugosidade superficial acentuada, como pode ser visto na Figura 2.26.
Nestas micropartículas, além dos poros superficiais, foi verificada também a existência
de poros nas camadas mais internas da matriz polimérica, provavelmente devido à
incorporação de microgotas de água. Entretanto, é bastante provável que a maioria das
partículas apresente uma estrutura densa em seu interior.
59
Figura 2.26 – Detalhe da superfície e interior de micropartículas de PVA/PVAc-co-PMMA
sintetizadas com incorporação in situ de 1% de amoxicilina à fase aquosa da copolimerização
em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila e posterior etapa de saponificação.
As análises de microscopia óptica e eletrônica indicam que a incorporação do
fármaco modelo influencia as propriedades morfológicas das micropartículas
produzidas. Nos copolímeros produzidos, quando o fármaco foi adicionado ao sistema,
obtiveram-se micropartículas com uma morfologia esférica mais bem definida. Uma
hipótese a ser considerada é de que o fármaco atue como um co-estabilizante, fato este
que pode ser observado mais facilmente quando o fármaco foi incorporado na fase
aquosa da suspensão, onde sua solubilidade é aparentemente maior e onde a interação
química com o meio reacional pode ser minimizada.
A polimerização em suspensão é um processo que gera partículas dentro de uma
faixa de 20 a 2.000 µm. [43] Por esta razão, muitos pesquisadores escolhem esta técnica
para a produção de polímeros para serem usados como agente embólicos. [52, 53, 92]
Entretanto, como descrito anteriormente, além da morfologia esférica, é importante que
as partículas apresentem uma distribuição homogênea de tamanho. Essa distribuição
homogênea pode ser alcançada ajustando-se algumas variáveis do processo de
polimerização, como a concentração do agente de suspensão, a velocidade de agitação,
60
etc. [43] ou através de pós-processamento da amostra, que consiste basicamente em
etapas de moagem e tamisação. [92]
Embora o processo de tamisação seja muito empregado para separar as
partículas em classes de tamanho bastante homogênas (ex. 200-300 µm), observações
práticas mostram que o processo de moagem pode gerar uma alta taxa de partículas
quebradas, especialmente se estas partículas apresentaram altos valores de Tg, como no
caso dos copolímeros de PVAc-co-PMMA, como discutido adiante.
A Figura 2.27 apresenta algumas micrografias onde é possível observar detalhes
dos fragmentos dos copolímeros (sintetizados na presença de fármaco) após processo de
moagem. Além de confirmar que estes fragmentos são oriundos de partículas esféricas,
também foi observado que, em alguns casos, algumas micropartículas mostraram
evidências de serem “ocas” e com a presença de alguns pequenos poros, contrastando
com as partículas sintetizadas na ausência de qualquer tipo de fármaco, que
apresentaram estrutura densa e sem nenhum tipo de poro no interior da partícula.
Figura 2.27 – PVAc-co-PMMA e PVA/PVAc-co-PMMA sintetizadas com incorporação in situ
de 1% de amoxicilina à fase aquosa da copolimerização em suspensão do acetato de vilina e
metacrilato de metila (esquerda) e após etapa de saponificação (direita).
61
A Tabela 2.8 contém os resultados de massa molar e temperatura de transição
vítrea (Tg), como função da concentração e da fase na qual o fármaco foi adicionado,
para os copolímeros de PVAc-co-PMMA. Novamente, a adição de fármaco no sistema
de polimerização levou a mudanças significativas nos valores de massa molar e Tg do
material. Entretanto, as distribuições de massas molares (Figura 2.28) indicam que essas
alterações foram significativamente diferente do comportamento observados para os
homopolímeros de PVAc.
Tabela 2.8 – Valores de massa molar e Tg do como função dos teores de amoxicilina no meio
reacional da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila a 90 ºC.
Concentração de amoxicilina (% m/m)
Fase orgânica
Fase aquosa
0
0
0,1
0,5
1,0
0,1
0,5
1,0
Massa molar (× 10-3 g/mol)
Mn
Mw
Mw/Mn
24
63
2,60
30
61
2,05
5
78
16,35
29
81
2,77
33
66
2,02
20
59
2,96
49
78
1,59
Tg (ºC)
57,41
62,22
36,52
54,99
66,53
63,56
82,32
Os dados da Tabela 2.8 e da Figura 2.28 indicam que nas reações de
copolimerização com adição in situ de fármaco ocorreu novamente um aumento da
massa molar com o aumento da concentração de fármaco no meio, confirmando
observações anteriores. Entretanto, os valores de Mw obtidos foram bem inferiores aos
obtidos com os homopolímeros de PVAc, fato este provavelmente resultante das taxas
de terminação mais elevadas durante a copolimerização do acetato de vinila e do
metacrilato de metila. [93]
Assim como observado para os homopolímeros de PVAc, novamente a relação
“massa molar x concentração de fármaco” foi a oposta à esperada, uma vez que a
expectativa era de que o fármaco pudesse atuar como um agente de transferência de
cadeia.
62
a)
1.2
1.0
w(log M) (a.u.)
0.8
0%
0.6
0,1%
0,5%
0.4
1%
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
b)
1.2
1.0
w(log M) (a.u.)
0.8
0%
0.6
0,1%
0,5%
0.4
1%
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
Figura 2.28 – Distribuições de massas molares dos copolímeros de PVAc-co-PMMA
sintetizadas com incorporação in situ de amoxicilina à copolimerização em suspensão do
acetato de vilina e metacrilato de metila. a) adição da amoxicilina na fase orgânica; b) adição da
amoxicilina na fase aquosa.
63
A Tabela 2.9 mostra os resultado das massas molares como função da
concentração e da fase na qual o fármaco foi adicionado, após o processo de
saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA). A Figura 2.29 mostra as curvas de distribuições
de massa molar dos copolímeros, antes e após a etapa de saponificação.
Tabela 2.9 – Valores de massa molar como função dos teores de amoxicilina no meio reacional
da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila a 90 ºC e posterior etapa de
saponificação.
Concentração de amoxicilina (% m/m)
Fase orgânica
Fase aquosa
0
0
1
0
0
1
Mn
33
31
45
Massa molar (× 10-3 g/mol)
Mw
Mw/Mn
94
2,88
77
2,49
72
1,60
Os resultados mostram que a reação de saponificação não alterou de maneira
significativa os valores das massas molares média dos copolímeros, exceto no caso em
que o copolímero for sintetizado sem a presença de amoxicilina, em que se observou um
ligeiro aumento no valor de massa molar do material.
Desta forma, os valores de Mw apresentados indicam que o fármaco incorporado
in situ influencia o processo de polimerização e, através de possíveis interações do
fármaco com o polímero em formação, as propriedades finais do material obtido. Como
a hipótese de o fármaco atuar como um agente de transferência de cadeia, nesta faixa de
concentração da amoxicilina, pode ser a princípio descartada, outras hipóteses devem
então ser levantadas para tentar elucidar os comportamentos observados. Uma dessas
hipóteses, como já discutido, é admitir que parte das moléculas da amoxicilina atua
como comonômero e/ou um agente reticulante durante o processo de polimerização (o
que é compatível com a estrutura molecular multifuncional e insaturada da molécula de
amoxicilina).
64
a)
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0.6
Norm
0.4
Sapo
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
b)
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0.6
Norm
0.4
Sapo
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
c)
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0.6
Norm
0.4
Sapo
0.2
0.0
2
3
4
5
6
7
log M (g/mol)
Figura 2.29 – Distribuições de massas molares dos copolímeros de sintetizadas com
incorporação in situ de amoxicilina à copolimerização em suspensão do acetato de vilina e
metacrilato de metila. (a) sem adição de amoxicilina; (b) adição de 1% de amoxicilina na fase
orgânica; (c) adição de 1% de amoxicilina na fase aquosa. “Norm” = PVAc-co-PMMA, “Sapo”
= PVA/PVAc-co-PMMA.
65
Para tentar elucidar a hipótese de incorporação do fármaco na estrutura
molecular, análises de
13
C-RMN foram realizados com o intuito de determinar a
composição dos copolímeros sintetizados. Todo os espectros obtidos (ver Anexo)
apresentaram interpretações semelhantes e são ilustrados nas Figuras 2.30 e 2.31.
Nos espectros analisados, foi possível identificar os deslocamentos dos núcleos
de carbono referentes ao PVAc, PMMA e PVA (quando presente), além de outros
sinais, referentes à resíduos do solvente (CDCl3, δ = 77.16 ppm), do iniciador (BPO, δ =
128.7 ppm) e comonômeros (VAc, δ = 20.7, 97.4 e 141.3 ppm; MMA, δ = 18.5, 51.6 e
167.8 ppm). Entretanto, assim como observado nos homopolímeros de PVAc,
novamente não foram observados deslocamentos específicos referentes aos núcleos de
carbono da amoxicilia.
C3
A4
A2
A1
n
A3
O
O
O
C1
B1
CDCl3
O
C2
B2
C2
A4
C1 B1
A1
A3
A2
B2
C3
1%
0%
Figura 2.30 –Espectro de
13
C-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado na ausência e com
incorporação in situ de 1% de amoxicilina à fase orgânica da copolimerização em suspensão do
acetato de vinila e metacrilato de metila (copolímero aleatório).
66
C3
A4
A2
A6
A1
A5
n
A3
O
O
B1
O
C1
OH
O
CDCl3
B2
C2
C2
A6, A4
C1 B1
A5, A1 A3
B2
C3
A2
Figura 2.31 –Espectro de 13C-RMN do PVA/PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in
situ de 1% de amoxicilina à fase orgânica da copolimerização em suspensão do acetato de vinila
e metacrilato de metila e posterior etapa de saponificação (copolímero aleatório).
Uma vez que não foram observados deslocamentos específicos referentes aos
núcleos de carbono da amoxicilina, pode-se concluir que: ou não ocorreu a incorporação
através de ligação química entre as moléculas do fármaco e a matriz polimérica
sintetizada, ou a incorporação foi muito pequena – estando próxima dos limites de
detecção da técnica de 13C-RMN (ao redor de 1%).
A técnica de RMN pode ser usada com um caráter quantitativo quando o foco
está voltado a definir a composição de uma amostra. Esse estudo é realizado
calculando-se a área dos picos referentes aos carbonos e fazendo correlações de
proporcionalidade. A Tabela 2.10 a seguir apresenta os cálculos de composição dos
copolímeros sintetizados, com maiores detalhes apresentados no Anexo desta Tese.
67
Table 2.10 – Composição dos copolímeros sintetizados.
Copolímero
% PVAc
% PMMA
% PVA
PVAc-co-PMMA
21.7
78.3
0
PVA/PVAc-co-PMMA
15.4
78.0
6.6
PVAc-co-PMMA 1% (fase orgânica)
38.7
61.3
0
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (fase orgânica)
15.3
76.3
8.3
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
Embora os resultados de
13
C-RMN não tenham sido conclusivos, uma hipótese
provável é a de que parte das moléculas de amoxicilina estejam ligadas à matriz
polimérica de forma não covalente. Isso permitiria que parte significativa deste fármaco
possa ser liberado ou difundido para um meio extrator. É importante observar que,
mesmo que esta hipótese seja confirmada, não seria possível concluir que uma pequena
fração das moléculas não tenha interagido quimicamente com a matriz polimérica no
momento da polimerização, já que foram apresentados indícios de modificação da
estrutura molecular do material produzido.
Para verificar se os polímeros sintetizados com a incorporação da amoxicilina in
situ apresentava algum perfil de liberação do fármaco, foram realizados testes de
liberação. Estes testes consistiram em extrair o fármaco para um meio aquoso e
posteriormente determinar a quantidade de amoxicilina presente neste meio.
Utilizando uma solução extratora de LSS 1%, determinaram-se os comprimentos
de onda, na região do UV-Vis, onde ocorrem os máximos de absorção da amoxicilina
neste meio (228 e 274 nm). Além disso, foi observado que os extratos obtidos dos
polímeros apresentavam perfis de absorção distintos na região do UV-Vis (Figura 2.32),
o que permitiu correlacionar as absorções lidas com a liberação do fármaco para o meio
extrator.
68
0,0
200
250
300
350
400
nm
Name
Description
Amostra 14.Sample
!
a) !
!
208,07nm; 3,67Abs
3,5
204,10nm; 3,44Abs
3,0
3,5
228,39nm; 2,73Abs
Unidade deAbs
Absorbância
Abs
2,5
3,0
210,84nm; 3,31Abs
2,0
2,5
205,93nm; 3,42Abs
1,5
2,0
1,0
1,5
272,77nm; 0,35Abs
0,5
1,0
0,0
0,5
200
250
223,09 nm ; 0,19982 A
Name
Description
0,0 Amox.Sample
200
300
350
400
350
400
nm
250
300
!
nm
Comprimento de onda (nm)
Name
Description
Amostra 15.Sample
b) !
!
3,5
Unidade de Abs
Absorbância
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
223,00nm; 0,45Abs
0,5
0,0
200
250
300
350
400
nm
Comprimento de onda (nm)
Name
Description
Amostra 14.Sample
!
!
Figura 2.32 – Exemplo de espectro de varredura na região do UV-Vis de extrato de copolímero
em solução extratora de lauril sulfato de sódio 1%. a) PVAc-co-PMMA; b) PVAc-co-PMMA
com 1% 3,5de amoxicilina (fase orgânica).
3,0
2,5
Como
todos as amostras apresentaram absorção nos comprimentos de onda
2,0
Abs
específicos da amoxicilina (228 e 274 nm), para poder estabelecer apenas a absorção
1,5
associada ao fármaco, a absorção dos polímeros sem fármacos (PVAc-co-PMMA e
1,0
PVA/PVAc-co-PMMA) nestes comprimentos de onda específicos foram descontados
0,5
223,09 nm ; 0,19982 A
0,0
200
250
300
nm
Name
Description
Amostra 15.Sample
350
400
69
!
para fins de cálculo. A Tabela 2.11 resume os resultados dos testes de liberação de
amoxicilina dos copolímeros de PVAc-co-PMMA e PVA/PVAc-co-PMMA, utilizando
curvas analíticas de amoxicilina na mesma solução extratora como referências para os
cálculos das concentrações de amoxicilina liberada (Figuras 2.33a e 2.33b).
Tabela 2.11 – Teor de amoxicilina liberada dos copolímeros.
Amostra
PVAc-co-PMMA
PVA/PVAc-co-PMMA
PVAc-co-PMMA 1% (org)
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (org)
PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
228 nm
A
Conc. (µg/mL)
0,26 ± 0,02
24,12 ± 1,90
0,52 ± 0,01
48,19 ± 1,37
0,05 ± 0,01
4,81 ± 0,92
274 nm
A
Conc. (µg/mL)
0,03 ± 0,00
26,69 ± 3,26
0,08 ± 0,01
59,77 ± 5,44
-
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
A = absorbância; Conc. = concentração da amoxicilina liberada; média ± desvio padrão, n = 2
a)
b)
1.5
y = 0.0013x - 0.0017
R² = 0.99956
0.12
Absorção
1.2
Absorção
0.15
y = 0.0108x - 0.004
R² = 0.99999
0.9
0.6
0.3
0.09
0.06
0.03
0
0
0
50
100
Concentração (µg/mL)
150
0
50
100
150
Concentração (µg/mL)
Figura 2.33 – Curvas analíticas de amoxicilina em solução de lauril sulfato de sódio 1%.
a) leitura em comprimento de onda = 228 nm; b) leitura em comprimento de onda = 274 nm.
Pelos dados obtidos por espectrofotometria na região do UV-Vis, pode-se
concluir que ocorreu a extração de quantidades apreciáveis do fármaco em algumas
amostras, demonstrando que parte da amoxicilina não se encontra ligada
covalentemente às cadeias poliméricas. Entretanto, é pouco provável que o
procedimento de extração tenha esgotado toda amoxicilina adsorvida (de forma nãocovalente) nas partículas de copolímeros, uma vez que o tempo de extração do fármaco
70
foi de apenas 2 horas. Desta forma, embora apreciáveis quantidades de amoxicilina
tenha sido liberada das partículas durante o processo de extração, é provável que ainda
haja uma fração adsorvida e possivelmenete outra (provavelmente em menor
quantidade) ligada covalentemente nas cadeias de copolímero. Sendo assim, os dados
apresentados na Tabela 2.11 servem como um bom indicativo de que a maior fração de
amoxicilina está adsorvida nas partículas; e um incerto indicativo da eficiência de
incorporação e/ou fração de fármaco ligada covalentemente às cadeias poliméricas.
De acordo com o perfil de liberação observado na Tabela 2.11, pode-se admitir
que, quando o fármaco é incorporado na fase orgânica, este encontra-se disperso de
forma mais homogênea no interior da partícula, o que reduz de forma significativa a
quantidade do fármaco extraído destas partículas. Entretanto, quando estas partículas
são saponificadas, pode-se observar a liberação de fármaco para o meio. Este perfil de
liberação nas partículas com “casca” de PVA pode ser associado a uma maior facilidade
de penetração do meio extrator nas partículas e, com isso, uma transferência de massa
mais facilitada.
Entretanto, quando o fármaco foi incorporado na fase aquosa do sistema, o perfil
de liberação observado foi o oposto. Nas partículas não saponificadas, observou-se um
perfil de liberação significativo do fármaco. Isso aponta para a existência de uma maior
concentração de fármaco na superfície da partícula, o que já poderia ser esperado, uma
vez que nas polimerizações em suspensão as reações ocorrem essencialmente na fase
orgânica. A não liberação do fármaco quando os copolímeros foram saponificados pode
estar associado à “destruição” e pré-extração do fármaco, ocasionada pelas condições
de saponificação empregadas. Baseado nas observações feitas anteriormente, foi
proposto um mecanismo esquemático do possível comportamento de distribuição da
71
amoxicilina nas matrizes poliméricas, antes e após o processo de saponificação, como
ilustrado na Figura 2.34.
a)
b)
!
!
NaOH 40%
NaOH 40%
30ºC – 2 h
30ºC – 2 h
PVA
PVAc-co-PMMA
PVA
PVAc-co-PMMA
PVAc-co-PMMA
Amoxicilina
PVAc-co-PMMA
Amoxicilina
Figura 2.34 – Perfil hipotético de distribuição de amoxicilina nos copolímeros antes (PVAc-coPMMA) e após etapa de saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA); a) amoxicilina incorporada in
situ através da fase orgânica do sistema; b) amoxicilina incorporada in situ através da fase
aquosa do sistema.
Uma observação pertinente pode ser feita a respeito da produção da casca de
PVA na superfície das micropartículas de PVAc-co-PMMA. Conforme visto por
FINCH, [49] os meros de PMMA dificilmente são atacados nesse tipo de reação de
hidrólise. Mesmo em condições drásticas, apenas uma pequena porcentagem de PMMA
sofre hidrólise, conforme ilustrado na Figura 2.35. Assim, pode-se admitir que no
processo de saponificação empregado, apenas os radicais acetatos presente na superfície
das partículas de copolímero sofreram reação de hidrólise.
O
O
O
O
O
n
NaOH
O
O
OH
O
O
n
O
OH
ONa
O
Figura 2.35 – Esquematização da reação de saponificação de copolímero de PVAc-co-PMMA
conforme descrito por FINCH. [49]
72
2.5 Conclusões
Reações de homopolimerização e copolimerização em suspensão foram
realizadas na presença de amoxicilina, para a síntese de micropartículas poliméricas
para uso em embolização vascular. Observou-se que de fato é possível incorporar a
amoxicilina nas micropartículas poliméricas no momento de sua síntese. Entretanto,
dependendo da estratégia e concentração da amoxicilina incorporada in situ, foram
observadas diversas alterações na morfologia e nas características moleculares dos
polímeros produzidos.
Embora seja possível produzir micropartículas de PVAc por meio da
polimerização em suspensão do acetato de vinila, os polímeros sintetizados na presença
de amoxicilina apresentaram aspecto borrachoso, tendência a formar aglomerados e
perda da morfologia esférica. A incorporação in situ de fármaco, na faixa de 0,1 a 1%,
ocasionou significativas alterações nas propriedades moleculares finais do PVAc
produzido. Este fato foi comprovado por alterações nos valores de massa molar e
temperatura de transição vítrea das micropartículas de PVAc, em função da
concentração de fármaco e estratégia de incorporação.
A utilização do MMA como comonômero permitiu a síntese de micropartículas
de PVAc-co-PMMA, na presença de amoxicilina, com morfologia esférica e sem
tendência a formar aglomerados. Análises mais detalhadas das micropartículas
permitiram concluir que a estratégia de incorporação da amoxicilina possui influência
direta na morfologia das micropartículas. Assim como observado para as
micropartículas de PVAc, a incorporação in situ de amoxicilina na faixa de 0,1 a 1%,
também ocasionou significativas alterações nas propriedades moleculares finais dos
copolímeros de PVAc-co-PMMA produzidos. Este fato foi comprovado por alterações
73
nos valores de massa molar e temperatura de transição vítrea das micropartículas, em
função da concentração de fármaco e estratégia de incorporação.
Os resultados obtidos para as micropartículas de PVAc-co-PMMA permitem
concluir que, pelas mudanças nas morfologias das micropartículas, é provável que a
amoxicilina possua algum tipo de atividade superficial, mesmo presente em pequenas
concentrações. Também é provável o fato de que a amoxicilina modifique o mecanismo
de polimerização, uma vez que foram observadas significativas alterações nas
propriedades dos copolímeros sintetizados.
Adicionalmente, os experimentos de liberação de fármaco indicaram que grande
parte da amoxicilina incorporada não está ligada quimicamente às cadeias poliméricas,
fato este também confirmado por análises de RMN. Os experimentos de liberação de
amoxicilina dos copolímeros de PVAc-co-PMMA e PVA/PVAc-co-PMMA também
indicaram que a distribuição do fármaco nas partículas está associada à sua estratégia de
incorporação in situ e que o perfil de liberação da amoxicilina está intimamente ligada à
etapa de saponificação, responsável pela formação da casca de PVA.
74
Capítulo 3
Síntese de micropartículas poliméricas
com a incorporação in situ de fármacos
via polimerização em suspensão – Parte 2
No Capítulo anterior foi mostrado que a incorporação in situ de amoxicilina
durante a polimerização em suspensão promove significativas alterações nas
propriedades morfológicas e moleculares dos polímeros sintetizados. Neste Capítulo é
feito um estudo mais detalhado dessas alterações, incluindo um estudo sobre a
influência dos fármacos na cinética da polimerização em suspensão. Além da
amoxicilina, também são descritos os efeitos da incorporação in situ da doxorrubicina,
na copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila.
75
3.1 Introdução
3.1.1 Cinética da polimerização em suspensão
Os processos de polimerização via radicais livres são largamente empregados
para a produção de polímeros comerciais. A escolha deste processo para implementação
em plantas industriais é devida a algumas vantagens frente a outros métodos de
polimerização. Dentre estas vantagens, é possível citar (i) a possibilidade de usar uma
larga gama de monômeros, (ii) tolerância à presença de grupos funcionais
contaminantes, (iii) condições reacionais amplas e (iv) possibilidade de usar distintas
técnicas de polimerização. [3] Desta forma, o processo de polimerização via radicais
livres é uma técnica fácil de ser implementada, sendo considerada relativamente de
baixo custo, quando comparada a outras tecnologias disponíveis.
As reações de polimerização via radicais livres podem ser descritas em termos
de equações matemáticas clássicas, que descrevem de maneira resumida o mecanismo
cinético das reações. As etapas e o mecanismo cinético podem ser descritos em termos
das seguintes etapas:
Iniciação:
d
I !k!
" 2R •
(3.1)
r
R •+M !k!
" P1 •
(3.2)
Propagação:
k
p
Pn •+M ! !
" Pn+1 •
(3.3)
76
Terminação:
tc
Pn •+Pm • !k!
" # n+m
(3.4)
td
Pn •+Pm !k!
" #n + #m
(3.5)
A primeira etapa da reação é a iniciação, em que os radicais livres são gerados.
Normalmente são usados iniciadores químicos que geram radicais livres por
decomposição térmica; [3, 42] porém, outros tipos de iniciação (fotoquímica, radiação
ionizante, etc.) podem ser empregados para a geração de radicais livres. [1, 3, 94] A
etapa de iniciação está relacionada à geração do radical primário (RŸ) por decomposição
do iniciador (I) e à combinação deste radical com uma molécula de monômero (M), que
culmina na formação da primeira cadeia de polímero vivo (P1Ÿ), com comprimento de
cadeia unitário.
Conforme descrito por ODIAN, [3] na etapa de iniciação anteriormente descrita
o consumo do iniciador químico usado para gerar os radicais livres pode ser descrita
pela Equação 3.6, embora a decomposição dos iniciadores químicos geralmente seja
expressa em termos de meia-vida (t½), conforme descrito na Equação 3.7.
!d[I ]
= kd [I ]
dt
t1 2 =
0.693
kd
(3.6)
(3.7)
onde kd é a constante cinética de decomposição do iniciador.
Iniciadores químicos com diferentes estruturas possuem taxas de decomposição
e tempo de meia-vida (t½) distintos; porém, a temperatura, e também o solvente usado
na polimerização, exercem influência direta no tempo de meia-vida (t½) de um
77
determinado iniciador químico, sendo que o tempo meia-vida (t½) diminui quando a
temperatura do sistema é aumentada. Como atualmente existe uma grande variedade de
iniciadores químicos disponíveis comercialmente, as constantes de dissociação térmica
(kd) podem ser facilmente encontradas na literatura científica, facilitando desta forma a
determinação do tempo de meia-vida (t½) do iniciador em um determinado solvente e
temperatura. [95]
Conforme descrito anteriormente, a etapa de iniciação é constituída de duas
reações, sendo a primeira delas (decomposição do iniciador) a etapa determinante da
iniciação. Assim, a taxa de geração dos radicais primários responsáveis pela formação
das cadeias pode ser representada pela Equação 3.8, em que ƒ representa a eficiência do
iniciador (ou seja, fração de iniciador efetivamente útil na formação do polímeros):
Rr = 2 fkd [I ]
(3.8)
Na segunda etapa da reação, a propagação, ocorre o crescimento da cadeia
polimérica por meio de seguidas incorporações de monômeros (M) à espécie ativa em
crescimento (PnŸ), gerando uma cadeia de polímero com comprimento cada vez maior
(Pn + 1Ÿ). A taxa de polimerização pode então ser associada principalmente ao consumo
do monômero durante essa etapa da reação. Embora haja um pequeno consumo de
unidades monoméricas na etapa de iniciação, este consumo pode ser negligenciado
frente ao grande consumo de monômero na etapa de propagação. Assim, a taxa de
polimerização (ou taxa de consumo de monômero) pode ser definido na forma
Rp = k p [Pn •][M ]
(3.9)
78
onde [M] é a concentração de monômero e [PnŸ] é a quantidade total de cadeias em
crescimento. [3]
A última etapa da reação compreende a terminação, quando ocorre a morte (ou
perda de atividade) do radical livre. A terminação pode ocorrer por combinação, quando
duas espécies ativas em crescimento (PnŸ e PmŸ) reagem, formando uma cadeia
polimérica morta de comprimento maior (Λn + m). A etapa de terminação também pode
ocorrer por desproporcionamento. Nesse caso, ao invés de duas cadeias poliméricas
ativas se combinarem formando uma espécie maior, elas reagem formando duas
espécies mortas similares (Λn e Λm). Como ocorre a abstração de um átomo de
hidrogênio de uma das cadeias nessa etapa, uma das espécies mortas formada é
insaturada, o que pode ser importante para descrever a estabilidade química final do
material produzido. [3]
Existem ainda outros tipos de etapas em que cadeias de polímero mortas são
formadas. Por exemplo, durante a etapa conhecida como de transferência de cadeia, as
espécies ativas (PnŸ) podem transferir a atividade para uma outra espécie, como o
solvente ou o monômero, formando uma cadeia de polímero morta (Λn) e uma espécie
ativa que continua a reação. Essa etapa costuma controlar a massa molar do polímero
final, porque ela interrompe o crescimento da cadeia.
Na polimerização via radicais livres em geral admite-se como válida a hipótese
de estado-estacionário para a concentração de radicais (Equação 3.10). De acordo com
essa hipótese, a concentração de radicais atinge quase que instantaneamente um patamar
e permanece em equilíbrio durante toda a reação, uma vez que as taxas de iniciação (Ri)
e as taxas de terminação (Rt) são muito elevadas e, por isso mesmo, iguais. [3]
79
Ri = Rt = kt [P•]2
(3.10)
Reorganizando a Equação 3.10 e substituindo-a na Equação 3.9, obtém-se a
expressão da taxa de polimerização (3.11), que geralmente é expressa na forma da
Equação 3.12 ao se substituir o termo “Ri”, previamente definido.
12
!R $
Rp = k p [M ]# i &
" kt %
(3.11)
12
! 2 fkd [I ] $
Rp = k p [M ]#
&
" kt %
(3.12)
As polimerizações que ocorrem via radicais livres apresentam algumas
peculiaridades quanto à cinética de reação. Uma delas é o efeito gel (também conhecido
como efeito Trommsdorff ou efeito Norrish-Smith), que é uma auto-aceleração da
reação. [1] Normalmente, espera-se que a taxa de reação diminua com o tempo,
principalmente por causa do consumo dos reagentes. Na presença do efeito gel pode
ocorrer o oposto, observando-se uma dramática aceleração da cinética de reação quando
as conversões atingem faixas de 20-40%. [3] Este efeito é consequência da diminuição
das reações de terminação devido à menor mobilidade das cadeias poliméricas em um
meio progressivamente mais viscoso. [1, 96] A ocorrência do efeito gel pode ser
operacionalmente perigosa, pois a auto-aceleração pode ocasionar a elevação da
temperatura dentro do reator de maneira muito brusca, além de afetar diretamente as
propriedades finais do polímero sintetizado. [42, 96]
Outro efeito bastante comum em polimerizações via radicais livres é o efeito
vítreo. Normalmente, à medida que a conversão aumenta, a fração da fase polimérica
80
também aumenta, fazendo com que esta passe gradualmente para o estado sólido
(vítreo). Assim, quando a polimerização é realizada a uma temperatura inferior à
temperatura de transição vítrea do material (que aumenta com a conversão) observa-se a
diminuição da constante de propagação da reação, influenciada por uma menor
mobilidade das moléculas de monômero dentro da fase dispersa do sistema. [46, 96]
Esse efeito reduz a taxa efetiva de reação e contribui com a manutenção de altos teores
de monômero residual no meio.
Quando dois ou mais monômeros distintos são usados no mesmo processo de
polimerização, diz-se que o processo é de copolimerização. As espécies monoméricas
usadas na copolimerização, chamadas de comonômeros, podem ser distribuídas de
diversas formas ao logo da cadeia de polímero. A distribuição pode ser aleatória,
alternada, em blocos ou na forma de enxertos. [3, 42] Em cada caso, obtém-se um
conjunto distinto de propriedades para o produto final, de maneira que não é possível
descrever o sistema apenas com base na composição do copolímero obtido.
As reações de copolimerização possuem uma importância tecnológica muito
grande, uma vez que é possível modificar as propriedades de um material polimérico
adicionando-se um segundo monômero à reação de polimerização. Além disso, as
reações de copolimerização permitem a produção de uma vasta gama de materiais com
propriedades distintas, uma vez que é possível utilizar diversas combinações de
monômeros em diversas concentrações e manipulando diferentes variáveis de processo.
Essas características fazem com que as reações de copolimerização tenham grande
importância industrial, de maneira que grande parte dos materiais poliméricos
produzidos são resultantes de reações de copolimerização. [3]
Assim como nas reações de homopolimerização, em que apenas um monômero
é usado, as reações de copolimerização também apresentam as etapas de iniciação,
81
propagação e terminação. Entretanto, com a adição de um segundo monômero à reação
de polimerização, o modelo matemático usado deve incluir novas equações, para desta
forma descrever melhor o sistema. Essas equações, descritas a seguir, são equações que
descrevem o mecanismo clássico de copolimerizações via radicais livres em solução,
sendo as notações aqui apresentadas as mesmas utilizadas por PINTO & RAY. [93]
Iniciação
d
I !k!
" 2R •
(3.13)
r1
R •+M1 !k!
" P10 •
(3.14)
r2
R •+M 2 !k!
" Q01 •
(3.15)
Propagação
k
(3.16)
k
(3.17)
k
(3.18)
k
(3.19)
t11
Pij •+Pnm • !k!
" # i+n, j+m
(3.20)
2
Pij •+Qnm • !k!
" # i+n, j+m
(3.21)
t 22
Qij •+Pnm • !k!
" # i+n, j+m
(3.22)
p11
Pij •+M1 ! !
" Pi+1, j
p 21
Qij •+M1 ! !
" Pi+1, j
p12
Pij •+M 2 ! !
" Qi, j+1
p 22
Qij •+M 2 ! !
!
" Qi, j+1
Terminação
Conforme revisto por ODIAN, [3] o mecanismo de copolimerização
normalmente se baseia no modelo último, que admite que a reatividade das cadeias
vivas (cadeias em crescimento) depende unicamente da atividade da unidade terminal,
82
sendo a composição final do copolímero dependente deste fator. Desta maneira,
supondo que dois monômeros (M1 e M2) possam ser copolimerizados, é possível
descrever quatro possíveis reações na etapa de propagação da copolimerização
(conforme demonstrado anteriormente) e novos parâmetros que descrevem a
propagação cruzada (Equação 3.23) e a terminação cruzada (Equação 3.24) nas reações
de copolimerização.
rij =
k pii
k pij
!ij =
(3.23)
ktij
ktii ktij
(3.24)
As equações apresentadas anteriormente descrevem importantes informações
sobre o sistema de copolimerização. O termo “rij” define a reatividade dos monômeros,
ou em outras palavras, o quão diferente é a reação de propagação cruzada se
comparadas com as reações de homopolimerização dos respectivos monômeros. Já o
termo “ψij” determina a constante de terminação cruzada das cadeias de copolímeros.
Embora essas equações sejam aceitas como parte do mecanismo clássico de
copolimerização, elas apresentam algumas falhas que em geral são alvo de críticas,
como o fato do termo “ψ” geralmente ser influenciado pela composição de alimentação
do sistema. [93]
3.1.2 Quimioembolização vascular
Estudando as propriedades de liberação controlada de um quimioterápico
microencapsulado em artérias renais de cachorros, KATO et al. [97] observaram que o
83
efeito terapêutico da infusão dessas microcápsulas era resultante da ação conjunta da
liberação local do fármaco e da embolização do vaso. Isso levou os autores a postularem
o termo quimioembolização8, [98] que consiste em combinar a infusão intra-arterial de
um quimioterápico com a embolização vascular.
A ideia de adicionar um fármaco quimioterápico a um agente embólico possui
outras vantagens. Com a oclusão do vaso e consequente desenvolvimento de isquemia
local, o agente embólico tem um contato mais próximo com as células tumorais. Dessa
forma, a liberação do fármaco estaria mais restrita a um local de ação específico,
diminuindo as concentrações do fármaco na circulação sistêmica, contribuindo desta
maneira com a diminuição dos efeitos colaterais. [98, 99]
Nas últimas décadas, diversas pesquisas foram realizadas com o intuito de
desenvolver agentes embólicos e carregá-los com medicamentos quimioterápicos para
uso na quimioembolização transarterial. [58] De um modo geral, o conceito seguido
sempre visa combinar a ação de um fármaco quimioterápico com a embolização da
artéria que alimenta o tumor. Entretanto, ainda não existe uma metodologia que possa
ser usada como referência na realização da quimioembolização transarterial, uma vez
que há muitas variações na escolha do fármaco, do material embolizante e do contraste
utilizado. [75]
DC Bead® (Biocompatibles, Surrey, UK) são microesferas não-biodegradáveis
usadas como agente embólico. Essas esferas são feitas de PVA modificado com grupos
sulfonatos, o que permite a este dispositivo “sequestrar” fármacos com cargas opostas e
liberá-los de forma controlada. O produto possui certificação para ser usado no
tratamento de tumores hipervascularizados, podendo ser carregado com fármacos
quimioterápicos, como a doxorrubicina e o irinotecan. [58, 75]
8
Adaptação do termo original em língua inglesa chemoembolization.
84
LEWIS et al. [75] analisaram a capacidade de quatro tipos de microesferas
comerciais usadas como agentes embólicos (Countor SE®, Embosphere®, Bead
Block® e DC Bead®) de absorverem e liberarem doxorrubicina. Por apresentarem
cargas em sua superfície, apenas as microesferas DC Bead® apresentaram capacidade
de absorção e liberação, conseguindo absorver 45 mg/mL de fármaco e apresentando
um perfil de liberação que se prolongou por alguns dias. Essas características encorajam
a utilização desse dispositivo na quimioembolização transarterial, com a liberação da
droga no sítio tumoral e com a provável diminuição dos efeitos colaterais.
Microesferas degradáveis também são alvo de estudos sobre dispositivos para a
quimioembolização. WU et al. [100] prepararam microesferas de gelatina contendo
glicopeptídeo antitumoral, para uso em procedimentos de embolização de tumores
faciais. Os bons resultados observados pelos autores apontam para o potencial uso
dessas microesferas como veículos para drogas a serem usadas em procedimentos de
quimioembolização.
É importante salientar que nenhum estudo reporta a incorporação de fármacos in
situ durante a produção das partículas embolizantes. Portanto, esse tema precisa ser
ainda investigado, já que incorporação in situ pode tornar o processo mais simples e
eficiente.
3.1.3 Fármacos potenciais e aplicações
Embora existam diversos agentes quimioterápicos e alguns deles, como
irinotecano, doxorrubicina e mitomicina C, já sejam utilizados em quimioembolização,
[75, 78, 97, 98, 101-103] outros fármacos ou biomoléculas também podem ser usados
em conjunto com agentes embólicos e quimioembólicos.
85
Penicilina
Observada pela primeira vez por Alexander Fleming em 1928 e posteriormente
isolada em 1940 por Florey, Chain & Abraham, as penicilinas constituem um dos
principais antibióticos, sendo ainda amplamente utilizadas no tratamento de inúmeras
doenças infecciosas. Pertencente ao grupo de drogas ß-lactâmicas, o núcleo básico da
penicilina, apresentado na Figura 3.1, é constituído por um anel tiazolidínico ligado a
um anel ß-lactâmico, que é o sítio ativo da molécula. As primeiras penicilinas isoladas
foram as benzilpenicilinas (penicilina G) de ocorrência natural e outras penicilinas
semelhantes. Embora elas apresentem atividade frente a uma grande variedade de
microorganismos, as benzilpenicilinas apresentam alguns inconvenientes, como a
precária absorção quando administrada via oral e a sensibilidade a enzimas bacterianas
ß-lactamases. [89, 90]
O
H
R1
H
S
N
H
N
O
COOH
Figura 3.1 – Estrutura básica da penicilina
As drogas ß-lactâmicas apresentam mecanismo de ação que corresponde à
inibição da síntese do peptideoglicano da parede celular bacteriana. Esta inibição é
desencadeada após a droga se unir ao sítio de ligação na bactéria (proteínas de ligação
da penicilina), que resulta na inibição da formação das ligações cruzadas das cadeias
peptídicas, integrantes da estrutura do peptideoglicano celular bacteriano. Assim, ocorre
86
a inibição das enzimas autolíticas da parede celular, resultando na lise9 da bactéria. A
resistência à penicilina apresentada por algumas bactérias pode ser enquadrada em três
causas principais: produção de enzimas ß-lactamases (que cliva o anel ß-lactâmico da
droga), redução da permeabilidade da membrana externa (menor chance da droga
atingir no local-alvo) ou modificações nos sítios de ligação à penicilina. [89]
Conforme já descrito no Capítulo 2, a amoxicilina (Figura 3.2) é uma penicilina
semi-sintética, de amplo espectro de ação e que apresenta uma excelente absorção
quando administrada via oral, podendo também ser administrada via parenteral. Com
tempo de meia-vida de 80 minutos, geralmente está disponível em formulações
comerciais em associação com o ácido clavulônico, que é um inibidor da enzima ßlactamase. Quando administrados 250 mg, concentrações máximas médias de 4 µg/mL
são alcançadas após 2 horas da ingestão. Aproximadamente 20% da amoxicilina
absorvida se liga às proteínas plasmáticas do sangue, enquanto a maior parte ingerida da
droga é excretada na urina em sua forma ativa. As indicações terapêuticas da
amoxicilina incluem principalmente as infecções das vias aéreas superiores, que são
causadas principalmente por patógenos como Streptococcus pyogenes, Streptococcus
pneumoniae e Haemophilus influenzae. [89, 90]
HO
O
H
H
S
N
H
NH2
N
O
COOH
Figura 3.2 – Estrutura da amoxicilina (previamente apresentada no Capítulo 2).
9
Bioquímica. “Ruptura ou dissolução de membrana plasmática ou de parede bacteriana, e que leva à morte da célula e à liberação
de seu conteúdo”. [25]
87
A amoxicilina e a ampicilina (fármaco modelo do grupo da amoxicilina)
possuem estruturas muito semelhantes, divergindo apenas quanto ao grupo hidroxila
ligado ao anel benzênico da estrutura, que na ampicilina é substituído por um radical
hidrogênio. Devido à grande similaridade estrutural, o espectro antimicrobiano destes
fármacos é praticamente o mesmo. A exceção se faz pelo fato de que a amoxicilina
apresenta uma menor eficiência no tratamento da Shigelose, em comparação com a
ampicilina. [90] Nas formulações comerciais, a amoxicilina geralmente se encontram na
forma trihidratada (pó branco cristalino), que apresenta certa solubilidade em água (4
mg/mL), metanol (7,5 mg/mL) e etanol (3,4 mg/mL) e praticamente nenhuma
solubilidade em hexano, benzeno, etilacetato e acetonitrila, [91] sendo a identificação
da substância feita geralmente por espectrometria na região do infra-vermelho e ultravioleta (com absorções específicas em 230 e 274 nm).
Asparaginase
Dentre as inúmeras drogas usadas para o tratamento de doenças neoplásicas, a
L-aparaginase destaca-se por sua ação antileucêmica e por vir sendo utilizada na
quimioterapia do câncer há mais de 40 anos. Seu mecanismo de ação consiste na
hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônia, o que induz a morte
celular, uma vez que este aminoácido é essencial para a síntese de proteínas. [90]
A L-asparaginase é produzida em grandes quantidades por Escherichia coli e
Erwinia caratovora (Erwinia chrysanthemi), que produzem enzimas que apresentam
mecanismos de ação similares, divergindo apenas nas propriedades farmacocinéticas e
no potencial alergênico que o paciente pode apresentar, dependendo da fonte de
obtenção da enzima. Embora a fonte de L-asparaginase comercial seja geralmente
obtida de uma das bactérias mencionadas, ela também pode ser isolada do soro de
88
mamíferos e de outras bactérias, [104] como a Serratia marcescens, Enterobacter
aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Zymomonas mobilis. [105]
Um tipo de produto enzimático produzido a partir da L-asparaginase nas décadas
de 1970 e 1980 é o PEG-L-asparaginase. Esta é uma forma modificada da enzima
obtida de Escherichia coli, através de combinação com o polietilenoglicol (PEG), que
resulta em uma ação mais prolongada e uma menor sensibilidade à droga, em relação à
enzima original. [104, 105]
A enzima L-asparaginase é composta por quatro subunidades idênticas, que
permanecem ligadas principalmente por forças de interação não-covalentes. [105, 106]
As enzimas isoladas de Escherichia coli apresentam massa molar de 138.000 a 141.000
Da, enquanto que as formas isoladas de Erwinia chrysanthemi normalmente apresentam
massa molar de 138.000 Da e diferente ponto isoelétrico, em relação à enzima de
Escherichia coli. [107]
A L-asparaginase obtida de Escherichia coli apresenta grande estabilidade,
quando armazenada sob refrigeração (8ºC) em meio estéril, não sendo muito influente o
tipo de material do recipiente usado para o armazenamento. Em função do pH e da
temperatura, a estabilidade da enzima pode variar de acordo com as condições
empregadas. Numa faixa de pH entre 4,5 e 11,0 a enzima mantém sua atividade;
porém, quando o meio é mais alcalino, há uma maior estabilidade. A temperatura parece
influenciar mais a estabilidade da enzima, uma vez que acima de 60ºC a proteína
desnatura e, dependendo do pH do meio, a recuperação da sua atividade pode não ser
mais possível. [106]
A atividade antitumoral da L-asparaginase permite a utilização desta enzima no
tratamento de diferentes tipos de tumores, tanto em crianças como em pacientes com
idade avançada. [107] As diversas indicações terapêuticas do uso da L-asparaginase
89
incluem principalmente o tratamento de leucemia linfocítica aguda, da doença de
Hodgkin, da leucemia mielomonocítica aguda e no tratamento de linfosarcomas e
melanossarcoma. [105, 108] Geralmente a L-asparaginase é um componente nos
esquemas de tratamentos, já que ela quase sempre é administrada em combinação com
outros fármacos (como o metotrexato, a doxorrubicina, a vincristina, a prednisona,
dentre outros) para o esquema de tratamento da leucemia linfocítica aguda. A enzima
produzida a partir de Escherichia coli pode ser administrada via intramuscular ou via
intravenosa, utilizando várias estratégias. Uma estratégia bastante utilizada é a
administração de 5.000-10.000 U/m2 alternadamente ou a cada 3 dias, por um período
de 2 a 4 semanas. Uma outra alternativa é a administração de dose única semanal de
25.000 U. A PEG-L-asparaginase é administrada em doses de 2.500 U/m2 em semanas
alternadas, uma vez que esta forma possui um tempo de meia vida maior. [90]
A toxicidade relacionada ao uso da L-asparaginase pode ser resumida em dois
grupos de efeitos colaterais. No primeiro grupo se enquadram todos os efeitos tóxicos
relacionados à sensibilização do sistema imunológico à presença de uma proteína
exógena. O segundo grupo de efeitos é composto pelos sintomas relacionados à inibição
da síntese da asparagina. Os principais efeitos tóxicos associados à L-asparaginase são
semelhantes para os diversos tipos de enzima (exceto para as reações de
hipersensibilidade) e incluem disfunção hepática, pancreatite, imunosupressão,
deficiência nos fatores de coagulação, entre outros. [104]
Embora efeitos colaterais sejam frequentemente relatados, MÜLLER & BOOS
[107] chama a atenção para o fato que, em muitos casos, a asparaginase é administrada
em conjunto com outros medicamentos, dificultando desta maneira especificar se a
reação adversa observada é realmente resultante da ação da L-asparaginase ou das
outras drogas administradas.
90
Recentemente, PINTO et al. [109] desenvolveram uma metodologia para
produção de L-asparaginase em fermentações de Zymomonas mobilis. A enzima é
produzida em largas quantidades quando a fermentação é conduzida em meio de cultura
que contém asparagina ou sais de aspartato como fontes de nitrogênio.
Ácido Tranexâmico
O ácido tranexâmico (Figura 3.3) é um agente antifibrinolítico sintético derivado
da lisina, usado em diversas situações clínicas que envolvem hemorragias, com o
principal objetivo de diminuir a perda de sangue e a necessidade de transfusões durante
procedimentos cirúrgicos. Dentre as principais aplicações, destaca-se o uso do ácido
tranexâmico em cirurgias cardíacas, transplantes e alguns procedimentos ortopédicos.
[110, 111] Este ácido apresenta uma solubilidade em água de 0,17 g/mL, sendo muito
pouco solúvel em álcool e éter e praticamente insolúvel na maioria dos solventes
orgânicos. Quimicamente estável e não higroscópico, a DL50 para ratos e camundongos
é de aproximadamente 1200 e 1500 mg/kg (via intravenosa), respectivamente. [91]
H
COOH
H2N
H
Figura 3.3 – Ácido tranexâmico
Além das aplicações já mencionadas, o ácido tranexâmico mostrou-se eficaz no
tratamento de sangramentos em pacientes que apresentam algum tipo de desordem na
coagulação do sangue, seja esta doença adquirida ou congênita. Um exemplo disto é que
o uso desse agente, como droga profilática ou de tratamento, pode ser bastante
conveniente para casos de sangramentos em pacientes que apresentem hemofilia
91
adquirida. [112] Em pacientes com câncer avançado, o uso de ácido tranexâmico e
outros agentes anti-fibrinolíticos para o controle de sangramentos, ainda requer mais
estudos clínicos que comprovem de fato a sua eficácia terapêutica. [113] Na área de
ginecologia, o ácido tranexâmico já foi usado em diferentes casos, sendo efetivo na
redução da perda de sangue associada à menstruação e em sangramentos associados à
gestação. [110] No caso de miomas uterinos, embora as intervenções cirúrgicas sejam o
tratamento mais adotado, o ácido tranexâmico pode ser um dos medicamentos usados
para o alívio de alguns sintomas associados. [24] Contudo, os efeitos do uso deste
fármaco em cirurgias ginecológicas foram muito pouco relatados na literatura médica.
[111]
Atualmente o ácido tranexâmcio possui apresentações para uso oral e
intravenoso, sendo bem tolerado e apresentando poucos efeitos colaterais. [110] As
apresentações disponíveis para administração por via oral incluem cápsulas,
comprimidos e xarope, sendo que a dose recomendada varia de acordo indicação
terapêutica. [114] Em procedimentos cirúrgicos, embora existam algumas diferenças,
geralmente o esquema adotado é o de administrar uma dose de 10 mg/kg via
intravenosa antes da cirurgia e posteriormente seguir com uma infusão de 1mg/kg/h do
fármaco. [110, 111]
Utilizando o esquema de administração descrito anteriormente, CAGLAR et al.
[111] conduziram um estudo sobre os efeitos do uso pré e pós-operatório do ácido
tranexâmico como agente terapêutico para redução do sangramento em procedimentos
de retirada de miomas uterinos. Embora os autores tenham observado uma significativa
redução do sangramento quando o ácido tranexâmico foi administrado, a redução da
perda de sangue (cerca 200 mL) não foi considerada muito significativa. Desta forma,
92
os pesquisadores concluíram que aparentemente o uso do ácido tranexâmico no
esquema de administração proposto não trouxe maiores benefícios na miomectomia.
Doxorrubicina
A doxorrubicina é um antibiótico da antraciclina produzidos pelo fungo
Streptococcus peucetius var. caesius, e é considerado como um dos mais importantes
quimioterápicos antitumorais, [90] sendo comumente usado em procedimentos de
quimioembolização. [115-117] Embora a doxorrubicina possua um amplo espectro de
ação para neoplasias humanas, incluindo tumores sólidos, seu uso clínico é limitado
pelos seus efeitos colaterias (cardiopatia, mielosupressão, distúrbios gastrointestinais,
dentre outros), que em geral é associado a dose administrada. [90]
A estrutura química da doxorrubicina está representada na Figura 3.4. Como
todos os antibióticos antraciclínicos, a doxorrubicina possui em sua estrutura um açúcar
pouco comum (daunosamina), além de componentes quinona e hidroquinona, que
permitem à molécula atuar como agentes doadores e aceptores de elétrons. [90]
O
OH
O
OH
OH
H
O
O
OH
O
O
OH
NH2
Figura 3.4 – Estrutura da doxorrubicina
93
O mecanismo de ação da doxorrubicina baseia-se na habilidade desta molécula
de se intercalar com o DNA e com isso afetar muitas funções reguladas pelo DNA,
como por exemplo a síntese de DNA e RNA. Desta forma, a doxorrubicina e as
antraciclinas são consideradas tanto mutagênicas quanto carinogênicas. [90] Embora o
mecanismo de ação deste medicamento seja primariamente na intercalação com o DNA
celular, outras rotas de ação têm sido propostas, envolvendo a indução de morte celular
por exposição ao medicamento a receptores presentes na superfície e no interior da
célula. [90, 115, 118]
O cloridrato de doxorrubicina é o nome genérico do medicamento, disponível
apenas em pó para solução injetável. Sua aparência é de um sólido cristalino de
coloração vermelha, livremente solúvel em água e álcoois hidratados, moderadamente
solúvel em metanol anidro e insolúvel em solventes orgânicos apolares. [91]
3.2 Objetivo e justificativa
O principal objetivo deste Capítulo é apresentar informações mais detalhadas a
respeito das influências da incorporação in situ da amoxicilina durante o processo de
polimerização em suspensão, para a produção de micropartículas poliméricas com
morfologia tipo casca-núcleo, para serem usadas como agentes embólicos. Além das
propriedades morfológicas e moleculares, também são apresentadas informações sobre
a cinética de polimerização na presença de amoxicilina. Também é objeto de estudo
neste Capítulo avaliar as influências da incorporação in situ de um quimioterápico
comumente usado no tratamento de tumores (doxorrubicina), avaliando sua influência
nas propriedades morfológicas e moleculares dos polímeros sintetizados, bem como sua
influência sobre a cinética de polimerização em suspensão.
94
Conforme justificado no Capítulo anterior, embora haja muitos estudos que se
proponham a encapsular fármacos utilizando técnicas de polimerização, poucos são
aqueles que estudam as influências da incorporação in situ deste fármaco sobre as
características e propriedades finais do polímero obtido, sendo que nenhum estudo
reportou os efeitos da incorporação in situ de fármacos durante a polimerização em
suspensão, para a obtenção de agentes embólicos. Além de apresentar informações mais
detalhadas dos efeitos da incorporação in situ da amoxicilina, este Capítulo também traz
um estudo dos efeitos da incorporação in situ da doxorrubicina, que é um fármaco
comumente
usado
no
tratamento
de
tumores
e
em
procedimentos
de
quimioembolização.
3.3 Metodologia experimental
A metodologia experimental usada seguiu basicamente as especificações
descritas previamente por PINTO et al., [52, 53] com algumas modificações nos
experimentais necessários para promover a incorporação in situ do fármaco.
3.3.1 Materiais
Os reagentes usados foram: acetato de vinila (VAc, 99%, Vetec Química Fina),
água (destilada, desmineralizada e microfiltrada), amoxicilina trihidratada compactada
(Grau A, Laboratório Globo Ltda.), clorofórmio deuterado (CDCl3, 99,8%, Cambridge
Isotope Laboratories), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6, 99,9%, Cambridge
Isotope Laboratories), doxorrubicina (cloridrato; Eurofarma, Brasil), hidróxido de sódio
(NaOH, 99%, Vetec Química Fina), metacrilato de metila (MMA, 99%, Sigma-Aldrich
ou Denstply Brasil), peróxido de benzoíla (BPO, 97%, Vetec Química Fina), poli(álcool
95
vinílico) (PVA, 88% de hidrólise e Mw = 78.000 g/mol, Vetec Química Fina,),
tetrahidrofurano (THF, 99,9%,Tedia).
Os reagentes foram utilizados conforme recebido pelos fornecedores, exceto
quando especificado. A água utilizada nos experimentos foi destilada, desmineralizada e
microfiltrada.
3.3.2 Unidade Experimental
A unidade experimental usada nas reações de polimerização e na etapa de
saponificação foi a mesma descrita no Capítulo 2 e está ilustrada na Figura 3.5. A
unidade era operada na pressão atmosférica e a aferição da temperatura dentro do reator
acompanhada com termopar e eventualmente através de um termômetro de mercúrio.
Figura 3.5 – Esquema e fotos parciais da unidade experimental usada nas reações de
polimerização e na etapa de saponificação (previamente apresentada no Capítulo 2).
A unidade experimental apresentada na Figura 3.5 era composta por: reator de
vidro encamisado de 1 L (FGG Equipamentos Científicos Ltda, Brasil), conectado a um
sistema de aquecimento/refrigeração a água com temperatura programada Haake
96
Phoenix II (Thermo Electron Co., Alemanha), equipado com tampa de aço inoxidável
com 6 orifícios, agitador mecânico EuroStar Digital (IKA, Alemanha), haste reta,
impelidor tipo hélice com 6 pás e condensador de serpentina de vidro, conectado a um
sistema de refrigeração a água com temperatura programada Isotemp 2028P (Fisher
Scientific com refrigerador PolyScience KR30A).
3.3.3 Métodos
Purificação dos monômeros
Os monômeros, acetato de vinila (VAc) e metacrilato de metila (MMA), foram
purificados separadamente antes de serem utilizados nas reações e/ou análises.
Inicialmente, utilizando um funil de separação, os monômeros eram lavados duas vezes
com uma solução aquosa de NaOH 3% (m/v), na proporção de 1:1 (monômero : solução
de NaOH), descartando-se a fase aquosa. Após este processo, o monômero era
neutralizado com água destilada, na proporção de 1:1 (monômero : água), até que a fase
orgânica atingisse pH = 7. O monômero lavado e neutralizado era então transferido
para um frasco âmbar (contendo uma pequena quantidade de cloreto de cálcio) e
acondicionado sob refrigeração (-15 ºC) por pelo menos 24 horas. Posteriormente, o
cloreto de cálcio era removido por filtração e pequenas quantidades de água eram
removidas com o auxílio de um funil de separação. O monômero lavado e neutralizado
era então destilado sob atmosfera de nitrogênio, sendo o monômero purificado
recuperado e armazenado em frasco âmbar sob refrigeração (-15 ºC) até sua utilização.
97
Polimerização em suspensão
As reações de polimerização em suspensão via mecanismo clássico de radicais
livres, foram realizadas na unidade descrita anteriormente. O procedimento adotado foi
fundamentalmente o mesmo descrito por PINTO et al., [53] exceto quando
especificado.
Os componentes da receita padrão usada nas polimerizações em suspensão estão
descritas na Tabela 3.1. Incialmente adicionava-se ao reator uma solução do agente de
suspensão no meio dispersante e aquecia-se o reator até a temperatura estipulada para a
reação (70 ± 5 ºC). Após atingir a temperatura desejada, era adicionada uma solução
contento comonômeros purificados e o iniciador, mantendo o sistema na temperatura e
velocidades de agitação (700 rpm) definidos no plano da reação. A adição dos
componentes orgânicos da suspensão caracterizava o início da reação, que tinha uma
duração de aproximadamente 240 minutos. Ao final da etapa de reação, a temperatura
do reator era ajustada para 30 ± 5 ºC e o conteúdo do mesmo era retirado. A obtenção
do polímero era feita separando-se o precipitado do sobrenadante por filtração,
utilizando-se água destilada para lavar as partículas. O polímero obtido era então seco
em estufa a vácuo a 25 ºC e processado em gral de porcelana, até a separação dos
grânulos observados visualmente.
Nas reações realizadas neste Capítulo, a incorporação do fármaco ocorreu
somente por intermédio da fase aquosa do sistema, dissolvendo uma quantidade
determinada do medicamento na fase contínua da suspensão antes do início da reação.
No caso da amoxicilina, a quantidade de fármaco adicionada variou entre 0-3% (m/m).
No caso da doxorrubicina, o fármaco era reconstituído em água e posteriormente
adicionado à fase contínua do sistema. Neste caso específico, a quantidade de
98
doxorrubicina final adicionada era igual a aproximadamente 0,12 g/L (ou 2,05 × 10-4
mol/L).
Tabela 3.1 – Receita genérica de polimerização em suspensão a 70 ºC.
Fase contínua
Água
PVA
Fase dispersa
VAc
MMA
BPO
Fármaco*
Quantidade (g)
420
0,2
140 - 200
0 - 60
2–4
0 – 3%
Função
Fase contínua
Agente de suspensão
Comonômero
Comonômero
Iniciador
Fármaco
PVA = poli(álcool vinílico); VAc = acetato de vinila; MMA = metacrilato de metila; BPO = peróxido de benzoíla.
Durante as reações de polimerização, amostras foram retiradas em intervalos
pré-determinados para a caracterização do material. O procedimento consistia em
transferir aproximadamente 4 g de amostra do reator para uma cápsula de alumínio,
contendo pequenas gotas de uma solução aquosa de hidroquinona 1%. O peso de cada
amostra era determinado imediatamente após o processo de amostragem, levando em
consideração o peso da cápsula e da solução de hidroquinona. Após atingir a
temperatura ambiente, as amostras eram secas em estufa de circulação de ar (65 ± 5 ºC),
até que todas as amostras tivessem atingido peso constante (± 0,0005 g).
Reação de saponificação
A reação de saponificação, que visa à conversão parcial do PVAc superficial em
PVA, foi realizada seguindo basicamente a metodologia proposta por PINTO et al. [53]
e PEIXOTO [29]. A principal diferença em relação à metodologia originalmente
proposta é que, para poder estudar os efeitos da incorporação do fármaco nas
propriedades dos polímeros (núcleo e também na casca de PVA), este processo foi
realizado em duas etapas distintas.
99
No procedimento adotado, em um sistema com controle de agitação e
temperatura, 20 g de polímero seco reagiam com 20 mL de solução NaOH 40% (m/v)
em 80 mL de água durante 2 horas, mantendo-se a temperatura controlada em 30 ± 5 ºC
e a agitação em 500 rpm. Ao final da reação, o polímero era recuperado por filtração,
lavados com água destilada e secos em estufa a vácuo a 25 ºC.
3.3.4 Caracterização
Teste de solubilidade
A amoxicilina trihidratada possui uma solubilidade em água de 4 mg/mL; [91]
entretanto, sua solubilidade em outras soluções aquosas e solventes orgânicos não é
conhecida. Para determinar a solubilidade da amoxicilina em solução aquosa de PVA,
acetato de vinila e metacrilato de metila, foram realizados testes de solubilidade
conforme descrito a seguir.
Em um frasco de 100 mL equipado com barra magnética, adicionaram-se 50 mL
de solvente (monômero ou solução aquosa de PVA 0,5 mg/mL). Sob leve agitação,
adcionou-se amoxicilina até completa saturação/precipitação. O recipiente foi mantido
sob temperatura e agitação constante por aproximadamente 1 hora. Após este período, a
solução foi filtrada e a absorbância das soluções determinadas em espectrofotômetro
UV-Vis (Lambda 35, Perkin-Elmer, EUA), utilizando cubetas de quartzo de 5 mm, nos
comprimentos de onda de 228 e 272nm. A determinação da solubilidade das amostras
foi feita comparando as leituras obtidas com soluções contendo quantidades conhecidas
de amoxicilina (solução padrão) para cada solvente testado (solução de PVA, acetato de
vinila e metacrilato de metila). Os testes de solubilidade da amoxicilina em solução de
100
PVA foram realizados a 25 e 75 ºC e com os monômeros acetato de vinila e metacrilato
de metila a 25 e 50 ºC. Os testes de solubilidade foram realizados em duplicata.
Tensão interfacial
Análises de tensão interfacial foram realizadas com auxílio de um tensiômetro
de gota pendente DSA-100 (Krüss, Alemanha). De acordo com essa técnica, uma gota é
formada em um tamanho e formato tal que é possível calcular a tensão interfacial
(através da equação de Laplace) entre a gota e um meio em que esta é imiscível. Todas
as análises foram realizadas a 20,6 ºC, utilizando os valores de 0,9980 g/cm3 para a
densidade de água ou solução de PVA (0,48 g/L), 0,9340 g/cm3 para a densidade do
acetato de vinila (VAc) e 0,9400 g/cm3 para a densidade do metacrila de metila (MMA)
ou para a mistura de monômeros. Em alguns testes, amoxicilina foi misturada à fase
aquosa (água ou solução de PVA) ou à fase orgânica (mistura de monômeros). A
quantidade de fármaco adicionada foi de aproximadamente 0,5 g/L à fase aquosa e em
quantidade que atingisse a saturação a 22 ºC na fase orgânica (menos de 0,5 g/L).
Microscopia
A microestrutura da partícula de polímero foi analisada por meio de
microfotografias feitas em microscópio eletrônico de varredura Quanta 200 (FEI
Company, EUA). Segundo esta metodologia, as amostras eram recobertas com uma
camada de ouro de 300 nm, utilizando-se um metalizador JFC-1500 (JEOL, Japão),
antes da visualização.
101
Tamanho de partículas
A distribuição de tamanho de partículas foi determinada utilizando um
analisador de tamanho de partículas Mastersizer 2000 (Malvern, UK). Um pequena
quantidade de polímero seco era diretamente colocada no equipamento até a obtenção
de um nível mínimo de espalhamento de luz (obscurecência).
Cromatografia de permeação em gel (GPC)
Para realizar as determinações de massas molares, as amostras de polímero eram
solubilizadas em THF, filtradas em filtro de 0,45 µm e injetadas em sistema
cromatográfico, usando THF como fase móvel, vazão de 1 mL/min, na temperatura de
40ºC. As análises foram realizadas em cromatógrafo Viscotek (VE2001) equipado com
detector de refração Viscotek VE3580 e quatro colunas Phenomenex (106, 105, 103 e
500 Å) e calibradas com padrões de poliestireno. As curvas de distribuições de massas
molares apresentadas neste Capítulo foram normalizados em relação ao valor máximo,
segundo a relação:
ynormalizado =
yi
ymáximo
(3.25)
Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)
A análises de DSC foram realizadas em equipamento DSC 1822e (Mettler
Toledo, Brasil). Cerca de 3 mg de amostra tiveram seu peso exatamente determinado e
submetido a uma faixa de aquecimento de 25 a 250ºC, com taxa de aquecimento de
10ºC/min em cápsula de alumínio com tampa furada. Nitrogênio foi utilizado como gás
102
de arraste numa vazão de 80 mL/min. Nas análises realizadas, uma cápsula de alumínio
vazia foi utilizada como referência.
Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (1H-RMN)
As análises de
1
H-RMN descritas neste Capítulo foram realizadas em
equipamento Bruker DPX 300 (Bruker Co.), operado a 300 MHz e equipado com sonda
de 5 mm de diâmetro. Para preparo das amostras, utilizou-se ou clorofórmio deuterado
(CDCl3) ou dimetilsulfóxido deuterado (DMSO). O tetrametilsilano (TMS) foi usado
como referência interna e manteve-se a temperatura constante em 25ºC. A Figura 3.6 e a
Tabela 3.2 apresentam os deslocamentos específicos de prótons para o PVAc, PMMA e
PVA. [88]
E
A
G
D
H
B
n
O
m
A3
j
O
O
OH
I
O
C
F
Figura 3.6 – Deslocamento característico dos prótons do PVAc, PMMA e PVA.
Tabela 3.2 – Deslocamento dos prótons dos polímeros PVAc, PMMA e PVA.
Próton
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Expa
1.8
4.8
2.1
PVAc
Refb,c
2.1
5.2
2.3
Expa
1.8
0.7-0.9
3.5-3.8
PMMA
Refb,c
PVA
Exp
Refb,d
-
1.9
4.3
4.8
2.7
1.2-1.4
4.0
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
Valores em ppm para 1H-RMN; aDMSO; bBRANDOLINI & HILLS [88]; cCDCl3; dD2O.
103
Nas Figuras 3.7 e 3.8 são ilustrados os deslocamentos dos prótons para a
amoxicilina e para a doxorrubicina, segundo simuladores de RMN.
5.35
6.63
HO
7.06
6.63
O
4.85
5.19
4.86
H
H
S
N
H
7.06
1.55
8.03
NH2
N
5.11
1.55
4.72
O
OH
11.0
O
12
11
10
9
8
7
6
PPM
5
4
3
2
1
0
Figura 3.7 – Espectro simulado de 1H-RMN da amoxicilina.
5.35
O
OH
O
7.88
3.37;3.12
OH 3.65
7.93
4.69
OH 3.65
7.28
2.25;2.00
H 4.20
O
O
OH
O
3.83
1.18
O
5.35
4.95
3.85
3.55
2.08;1.82
2.81
OH 3.58
NH2
5.11
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
PPM
Figura 3.8 – Espectro simulado de 1H-RMN da doxorrubicina.
Incorporação de Fármaco
Durante as reações de polimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila,
amostras foram retiradas em intervalos pré-determinados para a avaliação da eficiência
104
de incorporação do fármaco nas partículas poliméricas. O procedimento consistia em
transferir uma alíquota de aproximadamente 5 mL da fase contínua para um recipiente
de vidro. Em seguida, possíveis sólidos eram removidos por filtração e a amostra
submetida à duas diluições seriadas, tomando-se alíquotas de 1 mL, utilizando uma
solução aquosa de PVA 10( 0,48 g/L) como diluente e balões volumétricos de 25 mL. A
determinação das absorbâncias das amostras foram determinadas em espectrofotômetro
UV-Vis (Lambda 35, Perkin-Elmer, EUA), utilizando cubetas de quartzo de 5 mm e
comprimento de onda específico de 228 e 274 nm. A quantidade de amoxicilina
incorporada foi calculada a partir de correlações com dados de concentrações
conhecidas de amoxicilina no meio reacional
3.4 Resultados & Discussão
3.4.1
Efeitos
da
amoxicilina
incorporação
nas
in
situ
reações
de
de
copolimerização em suspensão do acetato
de vinila e metacrilato de metila – Parte 2
No Capítulo anterior, foi demonstrado ser possível sintetizar partículas esféricas
de PVAc-co-PMMA na presença de amoxicilina adicionada in situ durante a reação de
polimerização em suspensão. Os resultados permitiram concluir que, pelas mudanças
morfológicas e moleculares observadas, a amoxicilina provavelmente exerce algum tipo
10
A solução aquosa de PVA utilizada nos testes analíticos, como branco ou como diluente, foi a mesma utilizada como fase
contínua nas reações de polimerização.
105
de atividade superficial, além de provavelmente alterar a cinética da polimerização.
Para avaliar o tipo de interação que a amoxicilina estabelece com as fases
dispersa (orgânica; comonômeros) e contínua (aquosa; solução de PVA) do sistema de
polimerização em suspensão, foram determinadas as solubilidades do fármaco nas
diferentes fases. Na fase contínua, composta de água purificada e uma pequena
quantidade de agente de suspensão (0,48 g/L), a amoxicilina apresentou uma faixa de
solubilidade de 2,9 a 15,4 g/L, quando a temperatura variou entre 25 e 70 ºC. Essas
solubilidades são equivalentes a 0,3 a 1,5% da massa de monômero no sistema de
polimerização em suspensão. Já a solubilidade da amoxicilina no acetato de vinila
(VAc) foi de 0,15 a 0,22 g/L para uma variação de temperatura de 25 a 50 ºC, o que
representa somente uma concentração de 0,02 a 0,03%, em relação à massa de
monômero. O fármaco não apresenta qualquer solubilidade significativa no metacrilato
de metila (MMA).
Os resultados de solubilidade levam a concluir que, quando a amoxicilina é
adicionada no reator de polimerização através da fase aquosa do sistema, o fármaco é
completamente solubilizado quando a temperatura interna do reator atinge a
temperatura de reação (70 ºC). Entretanto, quando se adiciona o fármaco diretamente na
fase dispersa do sistema (fase orgânica; comonômeros), a amoxicilina não se dissolve
completamente. Consequentemente, nesse caso o fármaco está presente no sistema na
forma de um pó finamente dividido e suspenso nas gotas de monômeros. Essa fato pode
explicar a acumulação do fármaco na superfície das partículas e a consequente formação
da rugosidade e poros superficiais, principalmente após o processo de saponificação das
partículas. Isso explica também porque a incorporação de fármaco na cadeia polimérica
não pode ser grande e porque existe sempre quantidade apreciável de amoxicilina livre
no meio.
106
Devido às alterações observadas na morfologia superficial das partículas,
conforme apresentado no Capítulo 2, considerou-se a hipótese de que, quando a
amoxicilina é adicionada in situ ao sistema de polimerização em suspensão, esta atue
como um coestabilizante ou exerça alguma atividade superficial, sendo este efeito
melhor visualizado quando o fármaco é dissolvido na fase aquosa do sistema.
Entretanto, os resultados apresentados na Figura 3.9 não demonstraram nenhuma
modificação nos valores da tensão interfacial quando a amoxicilina foi adicionada ao
sistema. Conforme observado na Figura 3.9, a adição da amoxicilina, tanto na fase
aquosa quanto na fase orgânica do sistema, não influenciou a tensão interfacial das
gotas.
O decréscimo na tensão interfacial só foi observado quando um agente de
suspensão (PVA, 0,48 g/L) foi adicionada. Entretanto não foi observado um efeito
sinérgico do fármaco na redução da tensão interfacial.
Conforme a Figura 3.9, os testes realizados apenas com amoxicilina (sem adição
de PVA à fase contínua) demonstraram que o fármaco de fato não atua reduzindo a
tensão interfacial do sistema. Desta forma, a partir dos resultados apresentados
anteriormente, não foi possível atribuir um efeito positivo da amoxicilina na redução da
tensão interfacial entre a fase aquosa contínua e a fase dispersa (gota de comonômero).
Sendo assim, os efeitos morfológicos parecem estar associados ao depósito de sólido na
superfície da partícula orgânica dispersa no meio. Embora seja de conhecimento que o
aumento de concentração de estabilizante e temperatura atuem reduzindo a tensão
interfacial em sistemas dispersos, [47] devido à grande instabilidade do sistema
experimental de análise de tensão interfacial, não foi possível obter medidas de tensão
em temperaturas superiores a 20,6 ºC. Este fator influenciou de maneira significativa a
quantidade de fármaco que pode ser solubilizado no sistema.
107
a)
18
Tensão interfacial (mN/m)
15
12
A
9
B
C
6
D
3
0
0
3
6
9
12
15
18
21
Tempo (minutos)
b)
18
Tensão interfacial (mN/m)
15
12
E
9
F
G
6
H
3
0
0
3
6
9
12
15
18
21
Tempo (minutos)
Figura 3.9 – Tensão interfacial de gotas de monômeros em meio aquoso. a) (A) VAc em H2O;
(B) MMA em H2O; (C) VAc/MMA (70:30) em H2O; (D) VAc/MMA (70:30) em solução de
PVA. b) (E) VAc/MMA (70:30), em solução de PVA + amoxicilina; (F) VAc/MMA (70:30) +
amoxicilina, em solução de PVA; (G) VAc/MMA (70:30), em H2O + amoxicilina; (H)
VAc/MMA (70:30) + amoxicilina, em H2O.
108
Embora os testes de tensão interfacial não tenham apontado para nenhum efeito
sinérgico da amoxicilina quando a estabilização da fase dispersa do sistema (gotas de
comonômeros), os resultados dos testes de solubilidade permitiram estimar as
quantidades máximas em que este fármaco pode ser incorporada in situ durante as
reações de polimerização em suspensão. Baseando-se nesses resultados, novas reações
de copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila foram realizadas,
promovendo a adição da amoxicilina apenas pela fase aquosa do sistema e em uma
faixa mais ampla de concentração, que variou de 1 a 3% em relação à massa de
monômero. Desta forma, quando as incorporações foram realizadas na faixa de 1%, o
fármaco estava completamente solúvel na fase contínua do sistema, ao passo que,
quando a concentração era igual a 3%, apenas parte da amoxicilina estava solúvel.
A análise da morfologia final das partículas de copolímeros foi realizada com
auxílio de análises de microscopia eletrônica de varredura. Conforme demonstrado na
Figura 3.10, na ausência de fármaco foi possível sintetizar partículas de copolímero com
morfologia esférica bem definida, o que contrasta com os resultados anteriormente
apresentados no Capítulo 2. Esse resultado provavelmente está associado ao uso de
comonômeros purificados, uma vez que os mesmos resultados foram observados para
homopolimerização em suspensão do acetato de vinila.
Outra observação feita foi de que as partículas esféricas produzidas na ausência
de fármaco não apresentaram poros superficiais e ou poros/microestruturas nas camadas
mais internas das partículas, fato este que já tinha sido observado nos experimentos
previamente apresentados no Capítulo 2. Além disso, conforme já descrito, pela
caracterísitca das amostras analisadas, é provável que todas as partículas sejam densas e
não possuam microestruturas porosas no seu interior, provavelmente devido a ausência
109
de fármaco no meio reacional e ao não aprisionamento de microgotas de água durante a
formação das partículas.
Figura 3.10 – Micrografia das partículas de copolímero de PVAc-co-PMMA
A etapa de saponificação do copolímero não promoveu alterações na morfologia
esférica das partículas, conforme mostrado na Figura 3.11. Entretanto, pode-se observar
a formação de pequenos poros superficiais em grande parte da superfície das partículas,
o que pode ser correlacionado à reação de hidrólise dos radicais acetato presentes nas
esferas de copolímero, uma vez que essas amostras foram sintetizadas na ausência de
fármaco.
110
Figura 3.11 – Micrografia das partículas de copolímero após reação de saponificação
(PVA/PVAc-co-PMMA).
Entretanto, ao se incorporar 3% de amoxicilina à fase aquosa da reação de
polimerização em suspensão, significativas alterações nas características morfológicas
das partículas puderam novamente ser observadas, conforme mostrado Figura 3.12.
Novamente foi possível afirmar que a adição in situ de amoxicilina de fato promove
alterações na morfologia da partícula, o que reforça as observações feitas no Capítulo 2.
Desta forma, a presença da amoxicilina na forma de um pó finamente dividido mais
uma vez explica a formação de uma superfície rugosa, devido à acumulação da droga
111
nas vizinhanças da superfície das partículas. Entretanto, a etapa de saponificação parece
exercer um efeito sinérgico, em relação à formação de poros superficiais.
A
A
B
B
Figura 3.12 – Micrografia das partículas de copolímero de PVAc-co-PMMA com 3% de
amoxicilina adicionada in situ à reação de polimerização. A) antes da reação de saponificação;
B) após a reação de saponificação.
A adição e acúmulo de amoxicilina acima do limite de solubilidade do fármaco
no meio possui influência definitiva no controle da morfologia esférica da partícula.
Conforme demonstrado anteriormente na Figura 3.12, a presença de partículas esféricas
é representativamente inferior ao de partículas com deformação na morfologia esférica
“padrão” das partículas de copolímero. Como os testes de tensão interfacial
112
demonstraram que a amoxicilina não possui efeito positivo na redução da tensão
interfacial das gotas de comonômeros, a adição em excesso deste fármaco pode
interferir de maneira negativa na formação de partículas esféricas, uma vez que a
amoxicilina não atua como um coestabilizador das gotas de comonômeros.
Na Figura 3.13 é apresentado o espectro de 1H-RMN do copolímero sintetizado
na presença de diferentes concentrações de amoxicilina (0-3%). Neste espectro foi
possível identificar os deslocamentos específicos dos prótons relacionados ao
copolímero aleatório sintetizado (VAc em δ = 4.8 ppm (−CHO−) e do MMA em δ =
3.6-3.8 ppm (−COOCH3)). Porém, não foi possível identificar nenhum sinal específico
referente à amoxicilina ou aos prótons do segmento de PVA, provavelmente devido às
baixas concentrações dessas substâncias nas matrizes poliméricas. Os sinais observados
entre δ = 7.0-8.0 ppm são deslocamentos relacionados ao iniciador utilizado (BPO).
E
D
A
HDO
B
n
O
O
O
DMSO
F
O
C
F
C
B
E
A, D
Figura 3.13 - 1H-RMN para copolímero aleatório de PVAc-co-PMMA sintetizado com
incorporação in situ de amoxicilina, após o processo de saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA).
113
Com auxílio de cálculos de integração das áreas dos picos, pode-se determinar
que os copolímeros sintetizados na ausência de amoxicilina apresentaram uma
composição média de 1 : 1,2 (VAc : MMA). Esse fato pode ser explicado devido às
maiores constantes cinéticas de propagação do MMA em relação ao VAc, [93] uma vez
que a composição inicial da mistura de comonômeros era de 70:30 (VAc:MMA).
Entretanto, ao se analisar detalhadamente os espectros, pode-se observar que o aumento
da concentração de amoxicilina no sistema provoca a redução da proporção final de
PVAc. Efeito similar havia sido detectado no Capítulo anterior e talvez indique que a
amoxicilina reage preferencialmente com os radicais VAc, tornando as polimerizações
de VAc mais sensíveis à presença de amoxicilina que as copolimerizações.
Na Figura 3.14 são apresentados os resultados de DSC para a amoxicilina e para
os copolímeros sintetizados, antes e após processo de saponificação das partículas. Os
resultados indicaram que, quando misturas físicas de amoxicilina e copolímero são
feitas, o perfil térmico da amostra é resultado da contribuição de ambos os tipos de
moléculas.
Entretanto, para as amostras de copolímero sintetizadas na presença de
amoxicilina, não foi possível observar claramente o sinal característico da amoxicilina,
fato este que pode estar correlacionado à baixa concentração de fármaco presente nas
amostras. O mesmo fato foi observado para as amostras saponificadas, uma vez que o
baixo conteúdo de PVA nas matrizes poliméricas também não influenciou de maneira
significativa o perfil térmico das amostras.
Uma característica importante da técnica de embolização vascular é o tamanho
do agente embólico usado. Por exemplo, para procedimentos de embolização da artéria
uterina, é recomendado o uso de partículas na faixa de 300-700 µm. [39] Por meio de
114
Fluxo de calor (W.g-1)
Endo
Exo 
a)
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
210
225
240
Temperatura (ºC)
Amoxicilina
Amox : copol (1:1)
3%
1%
0%
Fluxo de calor (W.g-1)
Endo
Exo 
b)
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
210
225
240
Temperatura (ºC)
Amoxicilina
Amox : Copol (1:1)
3%
1%
0%
Figura 3.14 – Curvas de DSC para amoxicilina e copolímeros sintetizados com a incorporação
in situ de amoxicilina (0-3%) durante reações de polimerização em suspensão. (a) copolímeros
antes da saponificação; (b) copolímeros após a saponificação.
115
análises de tamanho de partícula (Figura 3.15), pode-se determinar que o tamanho
médio das partículas sintetizadas foi de 200-320 µm. Embora este valor seja um pouco
inferior ao tamanho médio recomendado para os procedimentos de embolização da
artéria uterina, este valor é na verdade uma média dos vários tipos de frações de
partículas obtidas, onde as maiores frações obtidas estiveram dentro de uma faixa de
100-600 µm. Além disso, é sabido que o controle do tamanho final das partículas
poliméricas produzidas por intermédio de polimerizações em suspensão pode ser
ajustado com um controle mais refinado de algumas variáveis de processo, como por
exemplo a velocidade de agitação do sistema e também a concentração de agente de
suspensão utilizado. [42-45]
Uma outra alternativa para obter um controle mais refinado do tamanho final das
partículas é a utilização de tipos específicos de polimerização em suspensão, como é o
caso da Semi-suspensão, que é um processo em duas etapas onde as partículas obtidas
possuem tamanhos bastante homogêneos. [42]
Entretanto, conforme observado na Figura 3.15, tanto a incorporação in situ de
amoxicilina quanto a etapa de saponificação das partículas de copolímero promoveram
alterações no tamanho final das partículas. Através dos resultados apresentados, pode-se
concluir que a etapa de saponificação reduziu o tamanho médio das partículas nas
amostras que foram sintetizadas na presença de amoxicilina. Já nas partículas
sintetizadas na ausência de fármaco, o efeito oposto foi observado.
A etapa de saponificação (Figura 3.16) tem como objetivo tornar o copolímero
mais biocompatível, formando uma camada superficial de PVA, por meio da hidrólise
de radicais acetatos. Admitindo a hipótese que apenas os radicais acetatos participam da
reação de hidrólise (a hidrólise de radicais acrilatos só ocorre em condições
extremamente alcalinas [49]), o aumento no tamanho final das partículas só pode ter
116
a)
Volume (%)
12
9
6
3
0
10
100
1,000
Tamnho de partícula (µm)
PVAc-co-PMMA
PVA/PVAc-co-PMMA
b)
Volume (%)
12
9
6
3
0
10
100
1,000
Tamanho de partícula (µm)
PVAc-co-PMMA 1%
PVA/PVAc-co-PMMA 1%
c)
Volume (%)
12
9
6
3
0
10
100
1,000
Tamanho de partícula (µm)
PVAc-co-PMMA 3%
PVA/PVAc-co-PMMA 3%
Figura 3.15 – Distribuição de tamanho de partículas de copolímeros antes (PVAc-co-PMMA) e
após a etapa de saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA). (a) sem incorporação de amoxicilina;
(b) com incorporação in situ de 1% de amoxicilina; (c) com incorporação in situ de 3% de
amoxicilina.
117
sido ocasionado pelo consumo das partículas menores. Como o PVA é solúvel em água
e como a massa das partículas diminui com a saponificação, o deslocamento de
distribuição de tamanhos pode ser ocasionada pela dissolução das partículas menores no
meio aquoso.
NaOH 40 wt%
30 ºC - 2 h
PVA
PVAc-co-PMMA
PVAc-co-PMMA
Figura 3.16 – Representação esquemática do processo de saponificação de partículas esféricas
de copolímero aleatório de PVAc-co-PMMA.
É muito curioso perceber que a presença de amoxicilina provoca deslocamento
dos tamanhos de partícula para valores maiores, provavelmente porque se deposita na
superfície e reduz a eficiência de proteção do agente de suspensão. Durante a
saponificação, os deslocamentos são pouco pronunciados na direção de tamanhos
menores, como seria esperado se a saponificação não é muito intensa e se o PVA não se
dissolve no meio.
Como demonstrado no Capítulo 2, a incorporação in situ da amoxicilina através
da fase aquosa do sistema de polimerização em suspensão acarreta na adsorção do
fármaco preferencialmente na superfície das partículas de copolímero. Desta forma,
teoricamente a etapa de saponificação promove uma remoção (ou hidrólise) da
amoxicilina adsorvida na superfície das partículas. A Figura 3.15, além das micrografias
anteriormente apresentadas, reforçam essa hipótese, uma vez que partículas sintetizadas
na presença de diferentes concentrações de amoxicilina apresentam distribuições
118
distintas de tamanho de partículas. Após a etapa de saponificação, a amoxicilina
presente na superfície das partículas é removida, mas evita a remoção pronunciada de
PVA da superfície, efeito que ocasiona uma ligeira redução no tamanho médio final das
partículas de copolímero.
A redução no tamanho médio das partículas de copolímero sintetizadas na
presença de amoxicilina, após o processo de saponificação também pode estar
relacionada à uma menor quantidade de reações de ramificação, uma vez que os dados
de 1H-RMN revelaram uma menor concentração de radicais acetatos disponíveis para
reagirem em reações de saponificação.
A dinâmica da conversão global dos monômeros foi monitorada quando
diferentes concentrações de amoxicilina foram adicionadas ao reator durante as reações
de polimerização do VAc e MMA. Conforme demonstrado na Figura 3.17, a
homopolimerização do VAc é significativamente afetada pela aumento da concentração
de amoxicilina no meio reacional. Neste caso, o fármaco exerce uma clara ação
inibitória nas taxas reacionais.
Entretanto, nas reações de copolimerização do VAc/MMA, o efeito inibitório
não se mostrou tão evidente, conforme mostrado na Figura 3.18. Esse fato pode ser
função das altas taxas de terminação dos radicais livres em reações de copolimerização
na presença de MMA. Apesar disto, é interessante observar que o efeito inibitório da
amoxicilina parece depender da composição do meio reacional. Nas reações de
copolimerização, na ausência ou presença de fármaco, a conversão global não
ultrapassaram mais do que 50%, indicando que nesse tipo de copolimerização faz-se
necessário adotar estratégias para atingir valores mais elevados de conversão. Desta
forma, devido às baixas taxas reacionais, as copolimerizações de VAc/MMA devem ser
realizadas em mais altas temperaturas, por longos períodos e adotando procedimentos
119
100
Conversão (%)
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
Tempo de reação (minutos)
0%
1%
3%
Figura 3.17 – Evolução da conversão global do monômero com o tempo de reação, na ausência
(0%) e na presença (1-3%) de amoxicilina incorporada in situ durante as reações de
homopolimerização em suspensão do acetato de vinila (VAc).
50
Conversão (%)
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
Tempo de reação (minutos)
0%
1%
3%
Figura 3.18 – Evolução da conversão global de comonômeros com o tempo de reação, na
ausência (0%) e na presença (1-3%) de amoxicilina incorporada in situ durante as reações de
copolimerização em suspensão do acetato de vinila (VAc) e metacrilato de metila (MMA).
120
que aumentem a quantidade o tempo de vida dos radicais livres, seja pelo uso de
maiores concentrações de iniciadores químicos ou em combinação com outras
estratégias.
A dinâmica da conversão global dos monômeros foi monitorada em diversas
oportunidades, tanto para a homopolimerização do VAc quanto para a copolimerização
do VAc/MMA. Nas reações de homopolimerização, o gráfico apresentado na Figura
3.17 representa os resultados mais consistentes obtidos, avaliando o comportamento
dinâmico de conversão em relação à concentração de fármaco incorporada in situ
durante a reação de polimerização em suspensão do acetato de vinila. Embora não
apresentados, esse comportamento dinâmico apresentou o mesmo perfil quando outros
conjuntos de reações foram realizados.
Conforme observado na Figura 3.18, a dinâmica de conversão global dos
comonômeros, para a reação de copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila, não apresentou o mesmo perfil cinético em relação à reação de
homopolimerização do acetato de vinila. Desta forma, outras reações foram conduzidas
para verificar a reprodutibilidade dos dados anteriormente apresentados, conforme
demonstrado nos gráficos da Figura 3.19 (que comprova o comportamento cinético
anteriormente apresentado na Figura 3.18).
No Capítulo 2, observou-se que a incorporação in situ de amoxicilina nas
reações de copolimerização promove significativas alterações nos valores de massa
molar final dos copolímeros obtidos. Desta forma, quando a amoxicilina era
incorporada em pequenas quantidades, o efeito observado foi o de um aumento da
massa molar do copolímero obtido. Observou-se que esse aumento está relacionado à
quantidade de fármaco adicionado ao meio reacional, uma vez que a massa molar
aumentava, à medida em que a quantidade de amoxicilina era aumentada no meio
121
a)
Conversão (%)
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
Tempo de reação (minutos)
Corrida 1
Corrida 2
b)
Conversão (%)
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
Tempo de reação (minutos)
Corrida 1
Corrida 2
c)
Conversão (%)
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
Tempo de reação (minutos)
Corrida 1
Corrida 2
Figura 3.19 – Réplica das medidas de conversão global das reações de copolimerização em
suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila. (a) sem incorporação de amoxicilina; (b)
com incorporação in situ de 1% de amoxicilina; (c) com incorporação in situ de 3% de
amoxicilina.
122
reacional, independentemente da fase em que o fármaco era incorporado. Desta forma,
baseado nos dados previamente apresentados, especulou-se que parte do fármaco
poderia estar atuando como agente reticulante, quando utilizado em baixas
concentrações (até 1% em relação à massa do monômero).
Nos experimentos relatados neste Capítulo, a concentração de amoxicilina no
meio reacional variou entre 0-3%. Os dados de massa molar dos copolímeros obtidos
(Tabela 3.3) indicaram que a incorporação de 1% de amoxicilina no meio reacional
aumentou ligeiramente os valores de massa molar dos copolímeros. Este efeito não foi
observado quando a concentração de amoxicilina no meio reacional de copolimerização
foi de 3%.
Table 3.3 – Valores de massa molar para copolímeros de acetato de vinila e metacrilato de
metila sintetizados com adição in situ de amoxicilina (0-3%) durante a copolimerização em
suspensão antes (PVAc-co-PMMA) e após a etapa de saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA).
Amostra
PVAc-co-PMMA 0%*
PVAc-co-PMMA 1%*
PVAc-co-PMMA 3%*
PVA/PVAc-co-PMMA 0%
PVA/PVAc-co-PMMA 1%
PVA/PVAc-co-PMMA 3%
Conversão
45
49
42
> 45
> 49
> 42
Mn × 10-3 (g/mol)
37
39
21
37
40
29
Mw × 10-3 (g/mol)
64
84
60
64
79
68
Mw/Mn
1,72
2,18
2,84
1,73
1,96
2,32
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
* amostra retirada após 240 minutos de polimerização.
Na Figura 3.20 estão ilustradas as distribuições de massas molares dos
copolímeros de PVAc-co-PMMA obtidos nas reações de copolimerização do acetato de
vinila e metacrilato de metila. A incorporação in situ de 1% de amoxicilina produziu um
pequeno deslocamento da curva de distribuição da massa molar, principalmente nas
frações poliméricas de valores elevados de massa molar, sendo este um efeito
ligeiramente diferente do observado anteriormente no Capítulo 2.
123
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
log M (g/mol)
0%
1%
3%
Figura 3.20 – Curvas de distribuição de massa molar das amostras finais de copolímeros de
acetato de vinila e metacrilato de metila sintetizados coma incorporação in situ de 0-3% de
amoxicilina (PVAc-co-PMMA). 0%) Mw = 64 × 103 g/mol, Mw/Mn = 1,72; 1%) Mw = 82 × 103
g/mol, Mw/Mn = 2,40; 3%) Mw = 64 × 103 g/mol, Mw/Mn = 1,97.
Entretanto, a incorporação in situ de 3% de amoxicilina não ocasionou um
deslocamento da curva de distribuição de massa molar do copolímero produzido, sendo
o perfil da curva bastante similar ao do copolímero sintetizado na ausência de fármaco.
Neste caso, o excesso de amoxicilina presente no meio reacional pode estar atuando
como um agente de transferência de cadeia, reduzindo os valores de Mw. É provável que
o comportamento complexo (aumento, seguido de queda) tenha relação com a
incorporação da amoxicilina como comonômero e possível reticulação. A incorporação
exagerada pode levar à inibição e redução de massa molares.
A etapa de saponificação dos copolímeros produzidos não alterou de maneira
significativa os valores de massa molar dos polímeros, conforme demonstrado na
Tabela 3.3. A mesma conclusão pode ser feita para as curvas de distribuição de massa
124
molar dos copolímeros após o processo de saponificação (Figura 3.21), onde apenas
algumas pequenas alterações na distribuição da massa molar foram observadas.
Portanto, parece certo que a presença do PMMA e da amoxicilina reduzem a
sensibilidade do material à etapa de saponificação.
Uma análise mais detalhada da dinâmica de evolução das massa molares durante
as reações de copolimerização é apresentada nas Figuras 3.22 e 3.23. Os dados
apresentados indicam que as massa molares apresentam um comportamento dinâmico
bastante similar, para reações conduzidas na presença de diferentes concentrações de
amoxicilina.
De acordo com os dados das Figuras 3.22 e 3.23, o comportamento dinâmico
das massas molares médias (Mn e Mw) tendem a permanecer em um patamar constante
após os primeiros minutos de reação, apresentando apenas um ligeiro aumento nos
instantes finais da reação. Este efeito é claramente observado quando a concentração de
amoxicilina presente no meio reacional é de 1%.
Analisando os resultados apresentados e também os resultados apresentados no
Capítulo 2, parece claro que a amoxicilina afeta as reações de copolimerização do
acetato de vinila e metacrilato de metila de diferentes maneiras. Quando o fármaco está
presente no meio reacional em concentrações de até 1%, o efeito observado foi de uma
grande interação do fármaco com as cadeias poliméricas, o que ocasionou uma pequena
elevação da massa molar final dos copolímeros produzidos. Entretanto, para
concentrações superiores a 1%, a tendência é de que o excesso de amoxicilina no meio
reacional (superior ao limite de solubilidade do fármaco) promova não mais um
incremento da massa molar final, mas sim uma redução da massa molar final do
copolímero, atuando neste caso como um agente de transferência de cadeia.
125
a)
w(log M) (a.u.)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
log M (g/mol)
PVAc-co-PMMA
PVAc-co-PMMA/PVA
b)
w(log M) (a.u.)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
log M (g/mol)
PVAc-co-PMMA + 1%
PVA/PVAc-co-PMMA + 1%
c)
w(log M) (a.u.)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
log M (g/mol)
PVAc-co-PMMA + 3%
PVA/PVAc-co-PMMA + 3%
Figura 3.21 – Curvas de distribuição de massa molar das amostras finais de copolímeros de
VAc/MMA sintetizados coma incorporação in situ de amoxicilina, antes (PVAc-co-PMMA) e
após processo de saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA). (a) sem incorporação de amoxicilina;
(b) com incorporação in situ de 1% de amoxicilina; (c) com incorporação in situ de 3% de
amoxicilina.
126
a)
90
Mn x 10-3 (g/mol)
75
60
45
30
15
0
0
50
100
150
200
250
40
50
Tempo de reação (minutos)
0%
1%
3%
b)
90
Mn x 10-3 (g/mol)
75
60
45
30
15
0
0
10
20
30
Conversão (%)
0%
1%
3%
Figura 3.22 – Evolução dinâmica da massa molar numérica (Mn) em função (a) do tempo de
reação e (b) da conversão global, para reações de copolimerização em suspensão do acetato de
vinila e metacrilato de metila, na ausência (0%) e com a incorporação in situ de diferentes
concentrações de amoxicilina (1-3%).
127
a)
90
Mw x 10-3 (g/mol)
75
60
45
30
15
0
0
50
100
150
200
250
40
50
Tempo de reação (minutos)
0%
1%
3%
b)
90
Mw x 10-3 (g/mol)
75
60
45
30
15
0
0
10
20
30
Conversion (%)
0%
1%
3%
Figura 3.23 – Evolução dinâmica da massa molar ponderal (Mw) em função (a) do tempo de
reação e (b) da conversão global, para reações de copolimerização em suspensão do acetato de
vinila e metacrilato de metila, na ausência (0%) e com a incorporação in situ de diferentes
concentrações de amoxicilina (1-3%).
128
Esse comportamento está possivelmente relacionado aos limites de solubilidade
do material e acúmulo de sólido na superfície das partículas de polímero, uma vez que a
amoxicilina acima do limite de solubilidade deve permanecer na interface gota-água do
sistema. Entretanto, também é importante ressaltar que os efeitos cinéticos promovidos
pela amoxicilina estão provavelmente relacionados à presença de múltiplas
funcionalidades na molécula de fármaco. Além disso, é possível que os efeitos cinéticos
observados também possam ser função de limitações quanto à difusão de reagentes ao
longo da copolimerização e/ou um possível efeito gel, comum nesses tipos de reações.
No Capítulo 2, foi demonstrado (e proposto) um perfil hipotético de
incorporação e liberação de amoxicilina das partículas poliméricas. Com base nos
resultados obtidos, hipotetisou-se que grande parte das moléculas de amoxicilina não se
encontra ligada covalentemente às cadeias poliméricas e sim adsorvidas a matriz
polimérica. Entretanto, devido ao processo de extração de fármaco utilizado, também
hipotetisou-se ser provável que nem todo o fármaco possivelmente adosrvido foi
extraído dos polímeros, sendo assim incerto determinar o percentual (ou eficiência) de
incorporação in situ do fármaco nos copolímeros.
Nas reações realizadas neste Capítulo, a adição in situ da amoxicilina foi
realizada apenas pela fase aquosa do sistema e em concentrações superiores as usadas
anteriormente (1-3%). Desta forma, análises de espectrofotometria na região do UV-Vis
da fase contínua da suspensão, no início e final das reações de polimerização,
permitiram determinar que a quantidade de amoxicilina incorporada in situ durante as
reações de copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila provavelmente
está na faixa de 7-8%.
129
3.4.2
Efeitos
da
incorporação
doxorrubicina
nas
in
situ
reações
de
de
copolimerização em suspensão do acetato
de vinila e metacrilato de metila
Nas seções anteriores foi demonstrado que a incorporação in situ de amoxicilina
durante a copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila
contribui para significativas modificações em algumas das propriedades finais das
partículas, o que inclui a morfologia, a massa molar e comportamento térmico dos
copolímeros. Concluiu-se que tanto a concentração quanto a estratégia de incorporação
da droga afetam essas propriedades. A seguir, será descrito como a incorporação in situ
de doxorrubicina, durante a copolimerização em suspensão do acetato de vinila e
metacrilato de metila, afeta as propriedades morfológicas e moleculares das partículas
de copolímero, bem como a cinética de copolimerização.
Na Figura 3.24 são apresentadas micrografias das partículas de copolímero de
VAc e MMA sintetizadas na presença de doxorrubicina. De uma forma geral, foi
possível sintetizar partículas com uma morfologia esférica bem definida. Entretanto,
assim como observado quando a amoxicilina foi utilizada como droga modelo, a
doxorrubicina também leva à formação de uma superfície irregular. Devido à natureza
polar da molécula de doxorrubicina, este fármaco mostrou-se totalmente insolúvel nos
monômeros acetato de vinila e metacrilato de metila. Desta forma, a incorporação da
doxorrubicina ocorreu somente através da fase contínua (aquosa) do sistema de
polimerização em suspensão, fato que contribui para uma possível acumulação do
fármaco na superfície das partículas de copolímero.
130
Figura 3.24 – Micrografia de partículas de copolímero sintetizadas com a incorporação in situ
de doxorrubicina durante a polimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de
metila (PVAc-co-PMMA).
Utilizando a mesma estratégia de síntese apresentada anteriormente, com o
intuito de obter partículas com maior biocompatibilidade, após a obtenção das
partículas de copolímero estas foram submetidas a uma posterior etapa de
saponificação, para a produção de uma casca de PVA na superfície das partículas por
meio da hidrólise dos radicais acetatos. Na Figura 3.25 são apresentas as micrografias
após o processo de saponificação, sendo possível afirmar que, nas condições usadas,
esta etapa não ocasionou modificações na morfologia esférica das partículas. Entretanto,
uma análise mais minuciosa indicou mudanças significativa nas superfícies das
partículas, com acúmulo de pó e presença de rugosidade, porém sem a formação de
poros superficiais. Essas modificações superficiais seguiram o mesmo comportamento
quando a amoxicilina foi usada como fármaco modelo e incorporado através da fase
aquosa do sistema de polimerização. [15]
As micropartículas poliméricas foram obtidas na forma de um pó finamente
dividido, apresentando uma coloração ligeiramente avermelhada, provavelmente devido
a alguma adsorção de doxorrubicina à superfície das partículas, uma vez que esse
131
Figura 3.25 – Micrografia de partículas de copolímero de sintetizadas com a incorporação in
situ de doxorrubicina durante a polimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato
de metila após o processo de saponificação (PVA/PVAc-co-PMMA).
medicamento apresenta uma intensa e característica coloração vermelha quando
solubilizado em água. Entretanto, análises espectrofotométricas de UV-Vis (480-490
nm; específico para a doxorrubicina) da fase contínua do sistema de polimerização em
suspensão, onde a droga fora incorporada, mostraram-se inconclusivos quanto à
incorporação da doxorrubicina no polímero.
Dessa maneira, outra técnicas analítica (1H-RMN) foi utilizada para determinar,
mesmo que qualitativamente, se houve alguma incorporação de doxorrubicina na
superfície das partículas. Porém, novamente não foi possível chegar a uma conclusão a
respeito da incorporação do fármaco nas partículas. Na Figura 3.26 é apresentado o
espectro de 1H-RMN do copolímero sintetizado na presença de doxorrubicina. Assim
como no espectro de 1H-RMN do copolímero sintetizado na presença de amoxicilina,
também foi possível identificar os deslocamentos específicos dos prótons relacionados
ao copolímero aleatório sintetizado, que são os sinais de ressonância do PVAc em δ =
4.8 ppm (−CHO−) e do PMMA em δ = 3.6-3.8 ppm (−COOCH3). Porém, não foi
possível identificar nenhum sinal específico que poderia ser relacionado à doxorrubicina
132
e aos segmentos de PVA para as amostras saponificadas. Os sinais observados entre δ =
7.0-8.0 ppm são os sinais relacionados aos prótons aromáticos do iniciador utilizado
(BPO), sendo observado em todos os 1H-RMN para este tipo de copolímero, inclusive
para as amostras sintetizadas na ausência de fármaco.
E
D
A
B
n
O
HDO
O
O
DMSO
O
C
F
F
C
A, D
E
B
Figura 3.26 – 1H-RMN para copolímero aleatório de PVAc-co-PMMA sintetizado com
incorporação in situ de doxorrubicina após o processo de saponificação (PVA/PVAc-coPMMA).
Com auxílio das análises de tamanho de partícula (Figura 3.27), pode-se
determinar que as maiores frações de partículas obtidas estiveram dentro de uma faixa
de 200-1.000 µm. Embora este valor seja um pouco superior ao tamanho médio obtido
quando a síntese ocorreu na presença da amoxicilina (e/ou na ausência de qualquer tipo
de fármaco; ~100-600 µm), este valor é na verdade uma média dos vários tipos de
frações de partículas obtidos. Este deslocamento de tamanho de partícula para frações
133
superiores pode estar relacionado à etapa de pós-processamento das amostras, onde uma
leve maceração manual dos grãos foi feita para desfazer possíveis aglomerados
poliméricos. Apesar disso, nota-se um significativo deslocamento para valores mais
altos, indicativo de maior aglomeração de partículas na presença de fármaco.
12
Volume (%)
9
6
3
0
10
100
1000
Tamanho de partícula (µm)
PVAc-co-PMMA + fármaco
PVA/PVAc-co-PMMA + fármaco
Figura 3.27 –Distribuição de tamanho de partículas de copolímeros sintetizados com a
incorporação in situ de doxorrubicina antes (PVAc-co-PMMA) e após a etapa de saponificação
(PVA/PVAc-co-PMMA).
Conforme observado na Figura 3.27, tanto a incorporação in situ de
doxorrubicina quanto a etapa de saponificação das partículas de copolímero não
promoveram significativas alterações no tamanho final das partículas, sendo este um
efeito contrário ao observado quando a amoxicilina foi usada como fármaco. Porém, é
importante ressaltar que a quantidade de doxorrubicina adicionada ao meio reacional
(0,12 g/L) foi significativamente inferior ao de amoxicilina (até 14 g/L; 3%).
134
A trajetória da cinética de polimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila foi monitorada na ausência e na presença de doxorrubicina (Figura 3.28). Mesmo
presente em pequena concentração, a doxorrubicina parece afetar a cinética da reação,
exercendo um efeito inibitório em relação à evolução da conversão global.
50
Conversão (%)
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
Tempo de reação (minutos)
Sem fármaco
Com fármaco
Figura 3.28 – Evolução da conversão global de comonômeros com o tempo de reação, na
ausência e na presença de doxorrubicina incorporada in situ durante as reações de
copolimerização em suspensão do acetato de vinila (VAc) e metacrilato de metila (MMA).
Novamente, a conversão global não ultrapassou mais do que 50%, indicando que
nesse tipo de copolimerização faz-se necessário adotar estratégias para atingir valores
mais elevados de conversão. Entretanto, conforme observado anteriormente para as
reações realizadas na presença de amoxicilina, a presença de um fármaco multifuncional
durante as reações de copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila
possui uma significativa influência na cinética de copolimerização. O efeito inibitório
da doxorrubicina pode estar associado à estrutura do fármaco, que possui certa
135
semelhança ao de inibidores químicos de polimerização, como é o caso da hidroquinona
(Figura 3.29). Além disso, os efeitos cinéticos induzidos pela presença de doxorrubicina
podem também estarem associados a efeitos de difusão ou efeitos gel no sistema de
polimerização.
A
O
B
OH
OH
O
OH
OH
H
O
O
OH
O
OH
O
OH
NH2
Figura 3.29 – Comparação entre a estrutura da doxorrubicina (A) e da hidroquinona (B).
A incorporação in situ de doxorrubicina também ocasionou uma significativa
modificação na dinâmica da trajetória da massa molar do copolímero ao longo da reação
de copolimerização. Como demonstrado na Figura 3.30, a massa molar numérica média
(Mn) permaneceu praticamente constante ao longo de toda a reação conduzida na
ausência de fármaco. Na presença de doxorrubicina, os valores de Mn permaneceram em
um patamar até um determinado valor de conversão, apresentando uma tendência a um
decrescimento após este ponto.
136
a)
120
Mn x 10-3 (g/mol)
90
60
30
0
0
50
100
150
200
250
40
50
Tempo de reação (minutos)
Sem fármaco
Com fármaco
b)
120
Mn x 10-3 (g/mol)
90
60
30
0
0
10
20
30
Conversão (%)
Sem fármaco
Com fármaco
Figura 3.30 – Evolução dinâmica da massa molar numérica (Mn) em função (a) do tempo de
reação e (b) da conversão global, para reações de copolimerização em suspensão do acetato de
vinila e metacrilato de metila, na ausência e com a incorporação in situ de doxorrubicina.
137
Na Figura 3.31 são apresentados os dados em relação à massa molar ponderal
(Mw). Quando a reação foi realizada na ausência de fármaco, os valores de Mw
permaneceram constantes ao longo da reação/conversão. Na presença de doxorrubicina,
os valores de Mw permaneceram em um mesmo patamar até a conversão global atingir
um determinado valor. Entretanto, ao contrário do observado para os valores de Mn, o
valores de Mw sofreram um incremento considerável. Efeitos similares foram
observados quando pequenas quantidades de amoxicilina foram adicionadas durante a
polimerização, [15] sendo o efeito de aumento dos valores de Mw atribuídos a possíveis
reações de reticulação, devido às múltiplas reações de transferência à molécula do
fármaco e também a possíveis efeitos de difusão de reagentes ao longo da
copolimerização. Neste caso em particular é provável que a abrupta elevação dos
valores de Mw seja função de um forte efeito gel do sistema de copolimerização em
presença de doxorrubicina.
Na Figura 3.32 são apresentadas as distribuições de massas molares dos
copolímeros obtidos ao final do processo de polimerização. Conforme pode ser
observado, a incorporação in situ de doxorrubicina promoveu significativas alterações
na distribuição de massas molares dos copolímeros obtidos, sendo as maiores diferenças
observadas para frações de cadeias de baixo e alta massas molares quando as reações
foram realizadas na presença de fármaco. Os resultados reforçam o provável efeito de
reticulação resultante de múltiplas etapas de transferência para o fármaco, resultando em
alargamento expressivo das distribuições de massas molares.
O processo de saponificação promoveu apenas algumas pequenas alterações nos
perfis de distribuição de massa molar. O efeito observado neste caso pode estar
relacionado a reações de ramificação de monômeros residuais presentes nas partículas,
principalmente acetato de vinila residual.
138
a)
120
Mw x 10-3 (g/mol)
90
60
30
0
0
50
100
150
200
250
40
50
Tempo de reação (minutos)
Sem fármaco
Com fármaco
b)
120
Mw x 10-3 (g/mol)
90
60
30
0
0
10
20
30
Conversão (%)
Sem fármaco
Com fármaco
Figura 3.31 – Evolução dinâmica da massa molar ponderal (Mw) em função (a) do tempo de
reação e (b) da conversão global, para reações de copolimerização em suspensão do acetato de
vinila e metacrilato de metila, na ausência e com a incorporação in situ de doxorrubicina.
139
a)
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
5.5
6
6.5
log M (g/mol)
Sem fármaco
Com Fármaco
b)
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
3
3.5
4
4.5
5
log M (g/mol)
Sem fármaco
Com fármaco
Figura 3.32 – Curva de distribuição da massa molar da amostra final de copolímero VAc/MMA
sintetizado na ausência e na presença de doxorrubicina incorporada in situ durante a
copolimerização em suspensão do VAc e do MMA. (a) antes da reação de saponificação; (b)
após a reação de saponificação.
140
3.5 Conclusões
Neste Capítulo foram realizados estudos mais aprofundados a respeito das
reações de copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila
na presença de fármacos, adicionados in situ no meio reacional durante as reações de
polimerização.
Utilizando novamente a amoxicilina como fármaco modelo, pode-se confirmar
que a adição in situ do fármaco promove significativas alterações nas características
finais dos copolímeros formados. Observou-se que a morfologia e as características
superficiais das partículas são alteradas pela quantidade de fármaco adicionado e
também pelo processo de saponificação. No entanto, os efeitos morfológicos são
provavelmente devido ao depósito de fina película de sólido pulverizado na superfície
das partículas. Em termos cinéticos, a adição in situ de fármaco promove significativas
alterações na cinética de homopolimerização do acetato de vinila, sendo que um forte
efeito inibitório foi observado com o aumento da concentração de fármaco no meio
reacional. Nas reações de copolimerização, esse efeito inibitório foi minimizado pela
presença do metacrilato de metila, indicando a incorporação preferencial de amoxicilina
por radicais acetato de vinila. As propriedades moleculares finais dos copolímeros
sintetizados também foram afetadas, embora resultados de 1H-RMN e análises térmicas
não tenham apresentado significativas diferenças. Entretanto, pode-se concluir que a
amoxicilina pode exercer efeitos cinéticos competitivos nas propriedades moleculares
finais dos copolímeros. Desta forma, variações na concentração de fármaco de 0-1%
parece exercer um efeito aditivo para as propriedades moleculares, ao passo que
concentrações acima de 1% tendem a exercer um efeito inibitório.
141
Neste Capítulo também foi estudado o uso de outro tipo de fármaco na
copolimerização em suspensão do acetato de vinila e metacrilato de metila. Utilizando
as mesmas condições experimentais e a mesma estratégia de incorporação in situ,
observou-se que pequenas concentrações de doxorrubicina promoveram significativas
alterações nas características finais dos copolímeros produzidos. Além de mudanças na
morfologia das partículas, a presença de doxorrubicina também provocou alterações na
cinética de copolimerização, sendo que um forte efeito inibitório foi observado.
Entretanto, a presença deste fármaco no meio reacional ocasionou um significativo
aumento da massa molar final do copolímero produzido, apontando para um possível
efeito reticulador deste fármaco nas reações de polimerização.
142
Capítulo 4
Síntese de nanogel biodegradável para
aplicações biotecnológicas através de
polimerização RAFT em miniemulsão
inversa
Neste Capítulo é descrita uma metodologia que viabiliza a utilização do
monômero 2-(dimetilamino) metacrilato de etila em sistemas heterogêneos inversos de
polimerização. Mais especificamente, utilizando a técnica de polimerização RAFT em
miniemulsão inversa, foi possível sintetizar nano-hidrogéis biodegradáveis a partir do
monômero 2-(dimetilamino) metacrilato de etila. Devido às propriedades singulares do
monômero usado, o hidrogel sintetizado possui grande potencial para ser usado como
plataformas de liberação controlada de fármacos ou biomoléculas. Os resultados
apresentados neste Capítulo foram publicados como artigo na Macromolecules. [16]
143
4.1 Introdução
4.1.1 Polimerização radical livre viva/controlada
Como descrito nos capítulos anteriores, as reações de polimerização via radicais
livres ocorrem basicamente ao longo de três etapas. Na primeira etapa (iniciação) são
gerados os radicais livres que dão início à reação de polimerização. Na segunda etapa
(propagação) ocorre o crescimento da cadeia polimérica, por intermédio de seguidas
incorporações de monômeros à espécie ativa em crescimento. Na última etapa da reação
(terminação), ocorre a “morte” (perda de atividade) da espécie ativa em crescimento,
formando então uma cadeia de polímero morto inativo. Esta etapa possui grande
importância no controle do tamanho final da cadeia de polímero formada, podendo
ocorrer por diversos tipos de mecanismos. [3, 42] Essas etapas são geralmente descritas
da seguinte forma:
Iniciação:
d
I !k!
" 2R •
(4.1)
r
R •+M !k!
" P1 •
(4.2)
Propagação:
k
p
Pn •+M ! !
" Pn+1 •
(4.3)
Terminação:
tc
Pn •+Pm • !k!
" # n+m
(4.4)
td
Pn •+Pm !k!
" #n + #m
(4.5)
144
Neste tipo de reação de polimerização, a concentração das espécies em
crescimento é de aproximadamente 10-7 M, [3, 119] sendo que as cadeias crescem por
aproximadamente 1 segundo antes de sofrerem a terminação, ocasionando a formação
de cadeias poliméricas “mortas”. [120] As reações de polimerização via radicais livres
também são caracterizadas pela formação de cadeias de tamanho heterogêneo e com
altos valores de massa molar, características que resultam em altos índices de
polidispersão (Mw/Mn > 1,5). [119]
Quando dois ou mais monômeros distintos são usados no mesmo processo de
polimerização, diz-se então que o processo é de copolimerização. Os comonômeros
podem estar distribuídos de diversas formas ao logo da cadeia polimérica, de forma
aleatória, alternada, em blocos ou na forma de enxertos. [42] Em cada caso, obtém-se
um conjunto distinto de propriedades para o produto final, de maneira que não é
possível descrever o sistema apenas com base na composição do copolímero obtido. Os
processos de copolimerização possuem uma importância tecnológica muito importante,
pois permitem que sejam produzidos materiais com propriedades específicas. Como nos
processos de copolimerização dois ou mais comonômeros são envolvidos, pode-se dizer
que existem virtualmente infinitas possibilidades de se produzir copolímeros distintos,
com as mais diversas propriedades. [3]
Os processos de polimerização via radicais livres são largamente empregados
para a produção de resinas poliméricas de alta massa molar. O que leva a escolha desta
técnica na implementação em plantas industriais são basicamente três fatores: primeiro,
esta técnica pode ser usada com uma larga gama de monômeros vinílicos; segundo, esta
técnica é considerada “robusta”, por ser tolerante à presença de uma grande gama de
grupos funcionais, condições reacionais e impurezas; por fim, é uma técnica fácil de ser
implementada, sendo considerada de relativamente baixo custo, em comparação com
145
outras tecnologias disponíveis. Porém, a técnica de polimerização via radicais livres
apresenta também algumas desvantagens. A principal delas é o pobre controle que esta
técnica oferece sobre à estrutura das moléculas, principalmente em relação à massa
molar final do polímero, à composição e à arquitetura obtida. [119] Desta maneira,
quando se utiliza a técnica de polimerização via radicais livres, não é possível sintetizar
copolímeros em bloco, polímeros com distribuição estreita de massas molares e nem
polímeros com arquitetura molecular complexa. Isso ocorre porque a alta reatividade
dos radicais presentes no meio reacional, que se envolvem espontâneamente em reações
de terminação ou outros tipos de reações secundárias, [3, 121] causa a morte do radical
e a interrupção do crescimento da cadeia polimérica. A alta reatividade dos radicais
pode ser exemplificada através do tempo de vida da cadeia polimérica em crescimento,
que em geral é da ordem de 1 segundo (da etapa de iniciação à terminação). Por isso,
novas cadeias são continuamente geradas durante toda a reação de polimerização. [120]
Uma alternativa desenvolvida para a obtenção de polímeros com estrutura
molecular mais bem definida é o mecanismo de polimerização viva em que a etapa de
terminação é suprimida (ou significativamente ibnibida). Utilizando esta técnica, é
possível obter copolímeros em bloco e polímeros com arquitetura extremamente
precisa. O que caracteriza as reações de polimerização viva é que não há reações de
terminação entre as cadeias poliméricas, ou qualquer outro tipo de reação que resulte na
morte do radical propagador da cadeia. Desta forma, o radical em propagação continua
presente no meio reacional até que se esgote o monômero (e ao final do processo,
obtém-se um polímero vivo). Se mais monômero for adicionado ao meio reacional, a
reação polimerização é reiniciada, até que se esgote novamente o monômero do meio
reacional. [3, 122] Em um processo ideal de polimerização viva, todas as cadeias são
iniciadas no início da reação e todas as cadeias crescem simultaneamente com a mesma
146
velocidade de propagação. [119] O grande empecilho para o uso da técnica de
polimerização viva é que ela é extremamente sensível a mudanças nas composições dos
componentes químicos, à presença de impurezas e a mudanças nas condições
reacionais, além de serem compatíveis apenas com uma limitada gama de solventes. [3]
A polimerização via radicais livres viva/controlada (Controlled/Living Radical
Polymerization, CLRP) é caracterizada por ser uma polimerização via radicais livres
que exibe características de uma polimerização viva; ou seja, as reações de terminação e
outras reações secundárias, que ocasionam a morte da espécie ativa, são mantidas em
níveis negligenciáveis. [94] Embora a polimerização radicalar controlada não constitua
uma polimerização realmente viva, uma vez que a etapa de terminação não é
completamente suprimida, as técnicas de CLRP possuem uma série de vantagens em
relação às técnicas de polimerização via e radicais livres, permitindo exercer um nível
de controle do polímero final comparável aos de polimerizações vivas. Dentre essas
vantagens, incluem a compatibilidade com uma larga gama de monômeros, grupos
funcionais e condições reacionais. [94, 121]
Todos os tipos de CLRP seguem basicamente o mesmo princípio quanto ao
mecanismo de crescimento de cadeia, durante a etapa de propagação. Neste
mecanismo, genericamente exemplificado pela Figura 4.1, as cadeias em crescimento
alternam estados “ativos” e “dormentes”, ocorrendo o crescimento da cadeias (com
incorporações de unidades monoméricas) quando esta se encontra no estado ativo. [119,
121] Diferentes espécies podem provocar a “dormência” das espécies ativas, gerando
diferentes técnicas de CLRP.
Pn
A
(dormente)
Katv
Kdest
Kp
Pn
(+M) + A
(ativo)
Figure 4.1 – Representação genérica de equilíbrio ativo-dormente em sistemas de CLRP.
147
O leitor deve tomar alguns cuidados para não confundir alguns conceitos que
têm sido difundidos de maneira equivocada na literatura científica. Conforme revisado
por ZETTERLUND et al., [121] deve ser observado que:
•
“Vivo” – o termo “vivo” (livingness) em ciência de polímeros deve ser usado
estritamente para descrever mecanismos em que as cadeias poliméricas podem
ter seu tamanho estendido quando mais monômero for adicionado ao meio
reacional. [123] Como já discutido, as técnicas CLRP não são verdadeiramente
vivas.
•
Controle – este termo deve ser empregado quando o valor de Mn cresce de
maneira linear com o aumento da conversão, enquanto o índice Mw/Mn decresce
com o aumento da conversão. [123] Nem toda polimerização viva permite o
controle da massa molar.
•
Concentração de cadeias em crescimento ([PŸ]) – é um equívoco associar o
sucesso de control/livingness ao equilíbrio das espécies ativas e dormentes,
ocasionando uma baixa concentração de [PŸ] e, por conseguinte, baixas taxas de
terminação. O fato é que uma redução em [PŸ] não necessariamente resulta em
uma menor taxa de terminação em relação à taxa de propagação. O ponto
fundamental para o sucesso das técnicas de CLRP é que, como nestes sistemas o
número de cadeias é muito maior, a taxa de terminação por cadeia é muito
menor.
Embora existam diversas técnicas de CLRP, [121] as mais conhecidas e
pesquisadas até o momento são a polimerização mediada por nitróxido (NitroxideMediated Polymerization, NMP), polimerização por transferência de átomo (AtomTransfer Radical Polymerization, ATRP) e transferência de cadeia por adição-
148
fragmentação reversível (Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer, RAFT).
[119, 121] Dentre estas técnicas, a polimerização RAFT é uma das mais versáteis, [94,
124, 125] podendo ser usada com uma diversa gama de monômeros, sistemas de
polimerização e condições reacionais, gerando polímeros com distribuições de massas
molares bastante estreitas. [94, 126]
Polimerização RAFT
As técnicas de polimerização RAFT [127] e Macromolecular Design via the
Interchange of Xanthates (MADIX) [128] foram reportadas na literatura científica
quase que simultaneamente. Ambas as técnicas de CLRP utilizam o mesmo tipo de
mecanismo químico, divergindo apenas em relação ao tipo de agente de transferência
utilizado nas reações de polimerização, que geralmente são reportados apenas como
agentes RAFT. [94] Conforme descrito por MOAD et al., [119] idealmente, as
principais características de uma polimerização RAFT são:
a) As reações de polimerização RAFT podem ser realizadas adicionando-se
uma certa quantidade de agente RAFT a uma reação de polimerização
convencional, não sendo necessário trocar nenhum componente químico
(monômero, iniciador ou solvente) nem mesmo ajustar as condições
operacionais do sistema (temperatura, pressão, entre outras).
b) A polimerização RAFT deve apresentar características das polimerizações
vivas.
c) A massa molar pode ser predeterminada usando a Equação 4.6, em que o
termo [M]0 – [M]t representa a quantidade de monômero consumido e “mM”
é a massa molar do monômero:
149
!!(!"ó!"#$) ≈ [!]! ![!]!
[!]!
!"
(4.6)
d) Os polímeros gerados possuem estreita distribuição de massas molares
(Mw/Mn ≈1,1)
e) A técnica RAFT deve permitir a síntese de moléculas com arquitetura bem
definida, permitindo a formação de copolímeros de bloco, copolímeros tipo
“estrela” e outros tipo de estruturas moleculares complexas, conforme
ilustrado na Figura 4.2.
copolímero de bloco tipo A-B
copolímero estrela
copolímero de bloco tipo A-B-A
copolimero de enxerto
microgel
Figura 4.2 – Alguns tipos de arquitetura polimérica que podem ser sintetizadas com a técnica de
polimerização RAFT. Adaptação da figura originalmente publicada por MOAD et al. [119]
Os agentes RAFT (Figura 4.3) são compostos químicos que possuem uma
função tiocarboniltio ligada a dois “grupos” distintos, normalmente representados como
sendo um grupo “Z” e grupo um “R”. Esses grupos possuem funções específicas e a
escolha/combinação de grupos no agente RAFT possui influência direta no controle da
polimerização, uma vez que esses grupos possuem funções distintas. O grupo “Z”
possui a função de ativar a dupla ligação C=S, para favorecer a adição de radicais nesta
parte de molécula e altas constantes de transferência de fragmentos. Já o grupo “R”
150
deve ser um bom grupo de saída e re-iniciador de reações de radicais livres. [94, 119,
126]
(a)
S R
S
Z
(b)
S R
S
O
Z
Figura 4.3 – Estrutura genérica de um agente RAFT (a) e um agente MADIX (b), conforme
apresentado por BOYER et al. [94]
Atualmente, comparado-se com os dados publicados na literatura, [119, 129,
130] poucos são os agentes RAFT disponíveis comercialmente. Entretanto, essas
substâncias podem ser obtidas em laboratório com auxílio de técnicas de síntese
orgânica em processos relativamente simples, com relativa pureza e alto rendimento.
[119]
O mecanismo pelo qual ocorre a polimerização RAFT geralmente pode ser
descrito em termos de cinco etapas, [94, 119, 124, 129-131] conforme ilustrado a
seguir:
Iniciação:
d
I !k!
" 2X •
(4.7)
r
X •+M !k!
" Pn •
(4.8)
Transferência de cadeia reversível:
$ &
!" # $
%
$ &
!" $
%
!" $
$ #&
%
(4.9)
Re-iniciação:
k
p
R •+M ! !
" Pm •
(4.10)
Equilíbrio de cadeia:
151
$ !&
!" # $
%
$ !&
!" $
%
!" $
$ # !&
%
(4.11)
Terminação:
tc
Pn •+Pm • !k!
" # n+m
(4.12)
A primeira etapa (iniciação) ocorre exatamente como numa reação convencional via
radicais livres, em que são gerados os radicais livres11 que dão início à reação de
polimerização. Embora seja possível usar diferentes métodos para gerar os radicais
livres, a decomposição térmica de iniciadores químicos é o método mais adotado para
gerar os radicais livres em polimerizações RAFT. Em seguida, pequenas espécies em
crescimento oriundas da etapa de iniciação reagem preferencialmente com todas as
moléculas de agente RAFT presentes no meio reacional, devido à alta reatividade da
ligação C=S do agente RAFT frente a qualquer outro tipo de dupla ligação presente no
meio reacional (como as duplas ligações dos monômeros vinílicos). O agente RAFT
pode então retornar a sua configuração original e/ou “liberar” o radical R•. Na etapa
seguinte, ocorre o crescimento da cadeia polimérica por meio de seguidas incorporações
de monômero à espécie ativa em crescimento, gerando uma cadeia de polímero cada vez
maior. A principal diferença para a reação via radicais livres convencional é que na
reação RAFT as cadeias em crescimento são “rapidamente capturadas” pelo grupo
tiocarbonila do agente RAFT e desta forma, o intercâmbio de cadeias em crescimento
entre o agente RAFT garante que todas as cadeias tenham a mesma “chance” de crescer.
A última etapa do processo, embora minimizada, compreende a reações de terminação.
11
Para as reações viva/controlada, na etapa de iniciação o radical livre é representado por XŸ ao invés de RŸ.
152
Conforme revisado por BOYER et al., [94] polímeros sintéticos têm sido
largamente utilizado em aplicações biotecnológicas, o que inclui a produção de
compostos para uso na indústria farmacêutica, implantes biomédicos, entre outros. Em
geral, a estratégia de síntese do polímero pode variar de acordo com a aplicação final
desejada. Entretanto, um ponto em comum para um melhor desempenho do material é a
uniformidade das principais propriedades do polímero, que normalmente são as
características de massa molar, arquitetura da cadeia polimérica, composição e
funcionalidades químicas.
Por ser uma técnica versátil, o uso da polimerização RAFT oferece inúmeras
vantagens para a síntese de polímeros para aplicação biotecnológica, [94, 125] dentre as
quais podem ser citadas três principais pontos:
1) Possibilidade do uso de uma grande variedade de monômeros e solventes. [119,
127]
2) O uso da técnica RAFT possibilita também a síntese de polímeros com diversos
tipos de arquitetura molecular, como os copolímeros em bloco, de enxerto, tipo
estrela, entre outros. [119, 124]
3) A técnica RAFT foi adaptada para uso em diferentes sistemas de polimerização,
incluindo
polimerizações
em
suspensão,
[132]
emulsão,
[133,
134]
miniemulsão, [134] miniemulsão inversa [135] e microemulsão. [136]
Além das características anteriormente descritas, uma vantagem única dos
polímeros sintetizados com auxílio da técnica RAFT é a possibilidade de reação dos
grupos terminais das cadeias poliméricas com uma inúmera gama de reagentes, [94,
125] o que abre inúmeras possibilidades de pós-funcionalização e bioconjugação dos
polímeros formados.
153
Embora a técnica de polimerização RAFT seja bastante atrativa, inclusive para
implementação em ambientes industriais, esta técnica também apresenta algumas
desvantagens. Em um passado recente, um dos maiores obstáculos para o uso desta
técnica era o acesso aos agentes RAFT. Entretanto, este cenário reverteu-se nos últimos
anos, sendo que atualmente uma considerável variedade de agentes RAFT está
disponível comercialmente [125] embora a maior parte deles tenham que ser obtidos por
processos simplificados de síntese orgânica. [130]
Outro aspecto negativo relacionado à técnica RAFT, especialmente quando se
deseja empregar o produto em aplicações biotecnológicas, é a toxicidade do agente
RAFT. Um estudo recente realizado por CHANG et al. [137] demonstrou que a
toxicidade do polímero final depende do tipo de agente RAFT utilizado, sendo
necessário adotar estratégias para eliminar a toxicidade do produto final produzido,
antes de empregá-lo em aplicações biotecnológicas.
4.1.2 Miniemulsão
As miniemulsões convencionais são sistemas compreendidos basicamente por
uma dispersão de surfactantes hidrossolúveis em água, que estabilizam gotas
hidrofóbicas de tamanho entre 50-500 nm. Esses sistema são preparados misturando-se
o componente hidrofóbico em água, na presença do surfactante hidrossolúvel e também
de uma agente de pressão osmótica. [138, 139] Como em qualquer sistema heterogêneo,
existem duas fases: uma fase contínua e uma fase dispersa. A fase contínua representa a
maior fração do sistema (usualmente ao redor de ¾ a ⅘ do volume total), sendo
constituída nos sistemas convencionais por um solvente polar e nos sistemas inversos
por algum tipo de solvente apolar. A fase dispersa das miniemulsões poliméricas
convencionais tem como componente principal uma mistura de monômeros
154
hidrofóbicos (como o estireno), enquanto os sistemas inversos utilizam monômeros
hidrofílicos (como o ácido acrílico). [138]
Como as miniemulsões são sistemas termodinamicamente instáveis, a formação
desses sistemas requer o emprego de uma força de cisalhamento de alta energia para
“quebrar” a fase dispersa em gotas de tamanho nanométrico. Diversos processos podem
ser empregados para gerar as miniemulsões; contudo, o uso de sondas de ultrassom e
homogeneizadores são as técnicas mais empregadas para esse fim, sendo o último
citado o único atualmente viável para uso em plantas industriais. Além disso, é
recomendado que seja feita uma pré-mistura antes do processo de emulsificação, uma
vez que, embora os equipamentos usados para gerar as emulsões consigam gerar altas
forças de cisalhamento, normalmente esses mesmos sistemas não promovem uma boa
agitação. [140] Embora a utilização de equipamentos que empregam uma força de
cisalhamento de alta energia constitua o método mais usado para gerar miniemulsões,
alternativas que utilizam baixa energia também já foram reportados. [141-143]
Como as miniemulsões são sistemas termodinamicamente instáveis, faz-se
necessário também o uso de um agente surfactante, que diminui a tensão interfacial
entre a fase dispersa e a fase contínua. [144] Nos sistemas convencionais de
miniemulsão, geralmente são empregados surfactantes iônicos, [140] embora seja
possível usar outros tipos de surfactantes. [145, 146] Já nos sistemas inversos, são
usados tipicamente surfactantes não-iônicos, que atuam prevenindo a fusão das gotas
hidrofílicas por estabilização estérica. [144] Como os sistemas inversos requerem o uso
de surfactantes com baixos valores HLB12, [138] os surfactantes mais usados incluem o
Span 80®, o Tween 85® e surfactantes poliméricos. [144]
12
Balanço hidrofílico-lipofílico (Hydrophile–lipophile balance, HLB) – valor arbitrário de 0-20 que indica o conteúdo das partes
hidrofílicas e hidrofóbicas da molécula de surfactante e seu comportamento. [4]
155
O efeito Ostwald ripening (degradação difusional) possui grande influência na
estabilidade de emulsões em geral. Este efeito é governado pela pressão de Laplace
entre gotas da fase dispersa que possuem tamanhos diferentes, que culmina na
transferência de massa na fase dispersa, das gotas menores para as gotas de maior
tamanho. A transferência de massa é governada tanto pela curvatura das gotas quanto
pela diferente composição química no interior das gotas. [147] Basicamente, por causa
do acúmulo de energia na interface existente entre a fase dispersa e a fase contínua, o
potencial químico dos componentes existentes na fase dispersa aumenta com a redução
do tamanho da gota. Uma estratégia desenvolvida para aumentar a estabilidade das
miniemulsões é adicionar à fase dispersa um agente de pressão osmótica. Essa
substância tem como objetivo equilibrar a pressão osmótica no interior das gotas, e com
isso, evitar efeitos de degradação difusional. A adição de um “coestabilizante” reduz a
tensão interfacial e a concentração do monômero, reduzindo o potencial químico e as
taxas de transferência de massa. Nos sistemas convencionais, os agentes de pressão
osmótica devem, independentemente de sua característica química, ser substâncias
hidrofóbicas e apresentar pouca solubilidade em água (menos de 10-7 mL/mL), ao passo
que nos sistemas inversos os agentes de pressão osmótica são sais e/ou uma pequena
quantidade de água. [138, 139]
Segundo ANTONIETTI & LANDFESTER, [148] as principais características
que uma miniemulsão polimérica deve apresentar são:
1) Durante o processo de emulsificação, que requer o emprego de altas energias de
cisalhamento, o tamanho das gotas é caracterizado por um processo dinâmico de
fissão e fusão das gotas, que tende a chegar a um estado de equilíbrio cinético de
quebra-coalescência.
156
2) O uso de um agente de pressão osmótica garante a estabilidade das gotas após o
processo de emulsificação. Quando todas as gotas possuem a mesma pressão
interna efetiva, o tamanho das gotas não se altera por efeitos de degradação
difusional, mas apenas por colisão das gotas.
3) A polimerização em miniemulsões só ocorre por intermédio da etapa de
nucleação das gotas.
4) Em um sistema de miniemulsão, a cobertura das gotas com surfactante é quase
sempre incompleta, para evitar a formação de micelas e o mecanismo de
nucleação micelar.
5) O tamanho final das gotas está relacionado à quantidade de surfactante presente
na superfície das gotas. Quanto maior for a concentração de surfactante no meio,
menor será o tamanho das gotas e maior a cobertura das gotas com surfactante.
Além desses pontos, CAPEK [144] também acrescenta as seguintes
características para as miniemulsões inversas:
•
A existência de uma interface compacta de surfactantes pode ajudar a estabilizar
as gotas, mas pode formar uma barreira intransponível à entrada de radicais da
fase contínua do sistema.
•
Nos sistemas inversos, a polimerização pode ser iniciada por radiação,
iniciadores químicos hidrofílicos, e/ou iniciadores químicos hidrofóbicos.
Embora os sistemas heterogêneos de polimerização gerem partículas poliméricas
de tamanhos distintos, esses sistemas (principalmente as miniemulsões) não são
definidos pela faixa de tamanho de gota/partícula gerada, mas sim pelo mecanismo com
que estas gotas/partículas são formadas. [148]
157
As microemulsões são sistemas geralmente formados pela mistura de grandes
quantidades de surfactantes, o que implica na falta de necessidade de usar alta energia
de cisalhamento para formar a emulsão. As gotas apresentam em geral uma cobertura
completa de sua superfície, sendo que a polimerização ocorre por mecanismos de
nucleação primária e secundária, gerando ao final do processo a um pequeno aumento
das distribuições do tamanho das gotas, além da presença de micelas vazias nos
sistemas. Em geral, as microemulsões geram um látex composto por micelas/partículas
bem pequenas, em torno de 5-50 nm. [148]
As macroemulsões poliméricas possuem um mecanismo de reação bastante
particular. [149-153] Neste sistema, após o processo de emulsificação, as gotas geradas
(estabilizadas por surfactantes) funcionam como um reservatório de monômero. Este
monômero difunde-se através da fase contínua até chegar a uma micela ou gota (ambas
também estabilizadas por surfactante), onde ocorre a reação de polimerização.
Entretanto, as miniemulsões poliméricas apresentam um mecanismo completamente
diferente de nucleação, já que os locais da reação de polimerização são as próprias gotas
de monômero, que funcionam como um “nano reator”. Desta forma, o látex polimérico
final é basicamente uma “cópia” das gotas originalmente formadas, sendo que o
tamanho final das partículas é definido pelo processo de dispersão em conjunto com a
estabilidade
das
gotas/partículas
durante
a
polimerização.
[144,
148,
154]
Comparativamente, as suspensões poliméricas são bastantes similares ao sistemas de
miniemulsões,
diferenciando-se
basicamente
em
relação
ao
tamanho
das
gotas/partículas formadas (na faixa de micras) e estabilidade das partículas. [148]
Conforme descrito por ANTONIETTI & LANDFESTER, [148] a polimerização
via radicais livres em miniemulsões ocorre por meio do mecanismo de nucleação das
gotas. Neste mecanismo, as gotas formadas durante o processo de emulsificação são
158
nucleadas pela entrada de radicais, que são gerados quase sempre na fase contínua do
sistema. De forma ideal, assume-se que o processo de nucleação das gotas é o
mecanismo dominante e que todas as gotas do sistema são nucleadas. Isso implica que,
desconsiderando os processos de coalescência e/ou degradação difusiva das gotas [140],
o número de partículas poliméricas não se altera durante a reação de polimerização.
Também é possível usar iniciadores solúveis na fase dispersa das minemulsões. Neste
caso, a geração dos radicais ocorrerá diretamente no interior de cada gota.
HJN
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FiguraQ.R
4.44%.,&"45)$%&#
– Comparação
dos diferentes
processos
de polimerização em sistemas heterogêneos.
4",%/'!%&#S
;&)24",%/'!%&#S
Q7R $5$;"#$%&#
;&)24",%/'!%&#0
(a) macroemulsão; (b) miniemulsão; (c) microemulsão; (d) suspensão. Figuras à esquerda da
!"#$%&# '! !(" &%)*+'!", %#!",-'." .)&$" !& /",&0 1&#!,',2 !& !('!3 4%#%"45)$%&#$ '," .,%!%.'))2 $!'6%)%/"73
seta = antes da polimerização; Figuras a direita da seta = após a polimerização. [148]
,"85%," (%9( $("', !& ,"'.( ' $!"'72 $!'!"3 '#7 !(" %#!",-'.%') !"#$%&# %$ 45.( )',9", !('# /",&0 :(" (%9(
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$%&#$3 !(" ,"'7", %$ ,"-",,"7 !& !(" ,"<%"+ )%!",'!5," GHH3IJ3IKL0
Até a presente data, poucos trabalhos descrevem técnicas de CLRP em
miniemulsão inversa utilizando ATRP [155-158] ou RAFT. [119, 125] Mais
especificamente sobre a polimerização RAFT em miniemulsão inversa, Schork et al.
estudaram o comportamento desse sistema de polimerização com os monômeros
acrilamida, [135, 159, 160] ácido acrílico [160] e N-isopropilacrilamida, [161] enquanto
que McCormick et al. utilizaram o monômero N,N-dimetilacrilamida. [162]
Fase orgânica
!
!
!
!
(mini)Emulsificação
Polimerização
!
!
!
!
!
!
Fase aquosa
!
Monômero
Surfactante
Figura 4.5 – Representação de um processo de polimerização em miniemulsão inversa.
Adaptado da figura originalmente publicada por ANTONIETTI & LANDFESTER. [148]
4.1.3 Nano-hidrogéis
Os nano-hidrogéis (nanopartículas poliméricas hidrofílicas e reticuladas)
possuem um grande número de propriedades vantajosas em aplicações de liberação
controlada. [155, 163-165] Algumas dessas vantagens incluem: (i) a possibilidade de
controlar o tamanho das nanopartículas com relativa precisão, (ii) a grande interface
disponível para a realização de bioconjugações; e (iii) o interior das partículas pode ser
160
usado para carrear fármacos. Por meio do controle da densidade da reticulação dos
nano-hidrogéis, é possível criar uma matriz com uma porosidade definida, o que
permite um controle preciso da capacidade do nano-gel polimérico de absorver e liberar
fármacos (ou biomoléculas) de uma maneira controlada. [164]
Para otimizar o desempenho dos nano-hidrogéis em aplicações de liberação
controlada, uma série de critérios deve ser preenchidos. [163] Isso inclui uma longa
estabilidade durante a circulação in vivo, a presença de grupos funcionais na superfície
das nanopartículas (introduzido através de pós-modificação para aumentar o
“reconhecimento” das nanopartículas por receptores celulares), o tamanho de partícula
menor de 200 nm e a habilidade do nano-hidrogel de se degradar por meio de estímulo
externo (pH, ação enzimática, dentre outros). Em um cenário de liberação controlada de
fármacos ou biomoléculas, a biodegradação é um fator importante não apenas para
facilitar a liberação do composto de interesse, mas também para facilitar a remoção das
nanopartículas “vazias” e seus resíduos. [16]
Conforme descrito anteriormente, as técnicas de polimerização via radicais
livres viva/controlada (Controlled/Living Radical Polymerization, CLRP) [166] permite
a síntese de polímeros com arquitetura molecular bem definida, tendo sido recentemente
adaptada para uso em diversos tipos de sistemas dispersos (como emulsão, miniemulsão
e microemulsão), o que torna possível o uso destas técnicas como rota de síntese de
nanopartículas compostas por polímeros com arquitetura molecular complexa e
definida. [121, 167] As técnicas de CLRP também podem ser empregadas em
polimerizações reticuladoras. Neste caso, é possível sintetizar matrizes poliméricas mais
homogêneas e definidas. [168-171] Desta forma, as técnicas de CLRP em sistemas
dispersos oferecem uma atrativa rota de síntese para o preparo de nano-hidrogéis, redes
poliméricas adaptáveis e com estrutura molecular bem definida, para uso posterior em
161
aplicações de liberação controlada de fármacos ou biomoléculas. [155, 163, 164] Dentre
as diversas técnicas de CLRP, a técnica RAFT é tida como a mais versátil, [124, 125]
sendo desta forma uma técnica interessante para ser usada no preparo de polímeros para
aplicação biomédica (liberação controlada de fármacos e biomoléculas), devido à baixa
toxicidade dos agentes RAFT usualmente empregados na polimerização. [137, 172]
Para sintetizar nano-hidrogéis por meio de polimerizações reticuladoras, é quase
sempre necessário usar um sistema inverso, ou seja, um sistema em que a fase contínua
seja lipofílica e a fase dispersa hidrofílica, estabilizado por um surfactante lipofílico.
[121] O sistema heterogêneo de polimerização mais viável para a implementação de
uma técnica de CLRP, e também para sintetizar nanopartículas híbridas, [173-175] é a
polimerização em miniemulsão. [176, 177]
4.2 Objetivo e justificativa
Neste Capítulo, é feito o desenvolvimento de uma metodologia que possibilita a
polimerização RAFT em miniemulsão inversa, utilizando o monômero hidrofílico 2(dimetilamino) metacrilato de etila (DMAEMA). Polímeros contendo DMAEMA em
sua estrutura têm atraído atenção de muitos pesquisadores, devido à habilidade deste
tipo de monômero/polímero de interagir com moléculas de DNA ou RNA, formando
complexos do tipo plasmídeo-polímero, que podem ser absorvidos por células. [178181] Esta interação se dá pelo fato de que grupos aminos, como o presente no
DMAEMA, podem ser facilmente quaternizados para formar polímeros com cargas
positivas (Figura 4.6), sendo este polímero com carga superficial pode interagir de
maneira eletrostáticas com alguns tipos de biomoléculas, como é o caso do RNA. [182185]
162
Pelas razões apresentadas, o DMAEMA é um monômero que possui uma grande
importância tecnológica, pois permite que sejam sintetizados polímeros sensíveis a
estímulos de pH e temperatura, podendo ser empregados no preparo de plataformas de
sistemas de liberação controlada de fármacos ou biomoléculas. [186-188]
O
O
O
N
O
Ácido
HN
Figura 4.6 – Exemplo de quaternização do DMAEMA com ácido.
Outra justificativa para a realização deste trabalho é que, poucos foram os
trabalhos publicados na literatura científica que utilizam alguma técnica de
polimerização viva/controlada em sistema heterogêneo de polimerização, especialmente
utilizando monômeros hidrossolúveis (sistemas inversos de polimerização). WANG et
al. [189] recentemente reportaram o preparo de nanopartículas via miniemulsão inversa
à base de PDMAEMA. Entretanto, a estratégia utilizada pelos autores foi a utilização do
PDMAEMA como um “macro-iniciador” da polimerização em miniemulsão. A
presente proposta visa à adaptação da técnica de miniemulsão inversa para possibilitar o
uso do monômero DMAEMA como principal constituinte da fase dispersa do sistema
de polimerização RAFT (ou CLRP em geral). Desta forma, este trabalho contribuirá
com valiosas informações acerca da cinética/mecanismo de polimerização do sistema
estudado.
163
4.3 Metodologia experimental
4.3.1 Materiais
Todos os reagentes foram usados conforme recebido: 2-(dimetilamino) acrilato
de etila (DMAEA, 98%, Aldrich), 2-(dimetilamino) metacrilato de etila (DMAEMA,
98%, Aldrich), 2,2’-azo-bis[2-(-imidazoli-2-il) propano] dicloridrato (VA-044, 97%,
Waco), 3,3’-ácido ditiopropanoico (99%, Sigma-Aldrich), 4-dimetilaminopiridina
(DMAP, 99%, Aldrich), 4,4’-azobis(ácido 4-cianopentanoico) (98%, Fluka), acetonitrila
(99,7%, Ajax Finechem), cloreto de benzila (99%, Sigma Aldrich), cicloexano (99%,
Ajax Finechem), clorofórmio deuterado (CDCl3, 99,8%, Cambridge Isotope
Laboratories), dimetil-sulfóxido deuterado (DMSO-d6, 99,9%, Cambridge Isotope
Laboratories), óxido de deutério (D2O, 99,9%, Cambridge Isotope Laboratories),
diclorometano (DCM, 99,5%, Ajax Finechem), éter etílico (99%, Ajax Finechem),
difenil éter (99%, Sigma Aldrich),
DL-ditiotreitol
(99%, Sigma-Aldrich), enxofre (APS,
99,3%), acetato de etila (99,5%, Ajax Finechem), ácido clorídrico (HCl, 32%, Ajax
Finechem), metanol anidro (99,8%, Sigma-Aldrich), n-hexano (95%, Ajax Finechem),
trietilamina (99%, Sigma-Aldrich), N,N-dicilohexilcarbodiimida (DCC, 99%, Fluka),
N,N-dimetilacetamida (DMAc; 99,9%, Sigma Aldrich), éter de petróleo (BR 40-60ºC,
Ajax Finechem), poli(etileno glicol) metacrilato (Mn = 526 g/mol, Aldrich), poli(etileno
glicol) metacrilato de éter metílico (PEG-MA, Mn = 475 g/mol, Sigma-Aldrich),
ferricianeto de potássio (98%, Sigma-Aldrich), silica gel (60 Å, 70-230 mesh, Grace),
cloreto de sódio (NaCl, 99%, Sigma-Aldrich), hidróxido de sódio (NaOH, 97%, Ajax
Finechem), solução de metóxido de sódio 25% em metanol (Sigma-Aldrich), sulfato de
164
sódio (99%, Ajax Finechem), Span 80 (Fluka), tetraidrofurano (THF, Honeywell, grau
HPLC), tolueno (99,5%, Ajax Finechem).
2,2’-azo-bis(isobutironitrila) (AIBN, 98%, Sigma-Aldrich) foi recristalizado duas vezes
em acetona antes de ser usado.
4.3.2 Síntese do agente RAFT
O agente RAFT ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico foi sintetizado conforme
metodologia descrita na literatura, [190, 191] com algumas pequenas adaptações
experimentais. O procedimento de síntese foi constituído de três etapas sequenciais,
como descrito a seguir:
1) Síntese do ácido ditiobenzóico. Em um balão de fundo redondo de três bocas,
adcionou-se solução de metóxido de sódio 25% em metanol (108 g, 0,5 mol), metanol
anidro (125 g) e enxofre (16 g, 0,5 mol). Cloreto de benzila (31,5 g, 0,25 mol) foi
adicionado durante 1 hora sob agitação a temperatura ambiente. O sistema foi então
mantido sob agitação e aquecimento (67 ºC) durante pernoite. A reação foi resfriada
com auxílio de um banho de gelo até 0 ºC. O sal precipitado foi removido por filtração e
o excesso de solvente foi removido por evaporação rotatória. Ao resíduo viscoso,
acrescentaram-se 250 mL de água deionizada e a solução transferida para um funil de
separação. A solução de ditiobenzoato de sódio foi lavada primeiro com éter etílico
(300 mL) + HCl 1N (250 mL) e posteriormente com água deionizada (100 mL) + NaOH
1 N (250 mL). Este procedimento de lavagem foi realizado por três vezes, até a
obtenção de uma solução de ditiobenzoato de sódio.
2) Síntese do dissulfeto de bis(tiobenzoíla). 175 mL da solução de ditiobenzoato de
sódio foram transferidos para um balão de fundo redondo de três bocas. Posteriormente,
165
adicionou-se uma solução de ferricianeto de postássio (16,5 g, 0,05 mol em 250 mL de
água deionizada) por 1 hora, mantendo-se forte agitação a temperatura ambiente. O
precipitado resultante, de coloração vermelho/roxo, foi filtrado e lavado com água
deionizada até que a água de lavagem não apresentasse coloração residual. Os sólidos
foram secos à vácuo a temperatura ambiente.
3) Síntese do ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico. Em um balão de fundo redondo
adicionou-se acetato de etila (80 mL), 4,4’-azo-bis(ácido 4-cianopentanoico) (8,5 g,
0,03 mol) e dissulfeto de bis(tiobenzoila) (5,7 g, 0,018 mol). A solução resultante foi
aquecida sob refluxo durante pernoite. Após o período de reação, o solvente foi
removido por evaporação rotatória e o produto foi isolado por coluna cromatográfica
recheada de sílica gel (fase estacionária), usando acetato de etila e éter de petróleo
(50/50 v/v) como eluente (fase móvel). Frações que apresentaram coloração
vermelha/rosa foram combinadas e o solvente removido por rota-evaporação. O produto
final foi armazenado a -15 ºC.
4.3.3 Síntese do agente macro-RAFT
Poli(etileno glicol) metacrilato de éter metílico (PEG-MA, 8 g, 16,8 mmol; Mn =
475 g/mol), AIBN (27,2 mg, 0,16 mmol), agente RAFT (232 mg, 0,8 mmol) e
acetonitrila (8 g, 2 mol) foram carregados em um frasco de fundo redondo equipado
com uma barra magnética. O recipiente foi selado e purgado com nitrogênio por 1 hora
a 15 ºC. O frasco foi então transferido para um banho, onde permaneceu por 6 horas a
70 ºC sob agitação. Após este período, o excesso de solvente foi removido com ar
comprimido a temperatura ambiente. O produto viscoso resultante foi purificado por
diálise, utilizando uma membrana de celulose (MW 3.500 g/mol), primeiro com água
166
deionizada e posteriormente com metanol. Após o processo de diálise, o excesso de
solvente foi novamente removido com ar comprimido a temperatura ambiente. O
produto final, com característica vermelha e viscosa, foi armazenado a -15 ºC.
4.3.4 Síntese do agente reticulante biodegradável
O agente reticulante biodegradável (Ditiopropionil poli(etileno glicol)
dimetacrilato, DMA-PEOSS) foi preparado conforme metodologia descrita na literatura,
[157] com algumas pequenas adaptações experimentais.
Inicialmente, poli(etileno glicol) metacrilato (Mn = 526 g/mol) foi purificado,
conforme metodologia descrita por STÖVER et al. (2004). [192] Em um funil de
separação, 50 mL de poli(etileno glicol) metacrilato foram dissolvidos em 200 mL de
água deionizada e posteriormente extraídos com difenil éter (2 × 50 mL). A suspensão
resultante foi então separada por centrifugação a 5.000 rpm por 5 minutos. A fase
orgânica foi descartada e a fase aquosa extraída com uma solução de
diclorometano/hexano (3:1) ( 2 × 250 mL). A suspensão foi novamente separada (5.000
rpm por 5 minutos), descartando-se a fase aquosa. O poli(etileno glicol) metacrilato
purificado foi recuperado da fase orgânica após remoção do solvente (por evaporação
rotatória a 40 ºC).
Em um balão de fundo redondo contendo poli(etileno glicol) metacrilato
purificado (10 g, 19 mmol), DCM (60 mL), DCC (3,9 g, 19 mmol) e DMAP (0,5 g), foi
adicionada lentamente durante 20 minutos uma solução de 3,3’-ácido ditiopropanóico
(2,3 g, 10 mmol) em THF (30 mL), mantendo-se o frasco em um banho de gelo e sob
agitação constante. Após o término da adição, a mistura foi mantida sob agitação a
temperatura ambiente durante pernoite. Os sólidos formados foram removidos por duas
167
filtrações a vácuo e o solvente foi removido por evaporação rotatória a 30 ºC. O óleo
resultante, de coloração amarelada, foi armazenado a -15 ºC.
4.3.5 Polimerização em miniemulsão
A receita básica de preparo da miniemulsão (Tabela 4.1) foi desenvolvida
baseando-se nos trabalhos de SCHORK e colaboradores. [135, 159] O procedimento
adotado nos testes seguiu a metodologia descrita a seguir. Inicialmente, em um frasco
de vidro descartável, uma solução contendo todos os componentes da fase aquosa eram
dissolvidos em uma solução aquosa de HCl 1%. O pH da fase aquosa era então ajustado
para um valor final de pH na faixa 2-3 usando uma solução de HCl 20%. Em um outro
frasco de vidro descartável foi preparada uma solução da fase orgânica, dissolvendo-se
o surfactante Span 80 em cicloexano. A fase aquosa (fase dispersa) era então misturada
à fase orgânica (fase contínua) com auxílio de agitação por 30 minutos a 15 ºC, sendo
posteriormente ultrassonificada por 10 minutos (70% de amplitude, Brason Digital
Sonifier 450), mantendo-se o frasco resfriado em um banho de gelo. A miniemulsão
resultante era então transferida para um balão de fundo redondo de 50 mL, equipado
com uma barra magnética, sendo o frasco selado com septo de borracha e purgado com
nitrogênio por 30 minutos a 15 ºC.
As reações de polimerização eram realizadas a 60 ºC sob agitação constante.
Amostras eram tiradas em intervalos pré-determinados para caracterização, com auxílio
de uma seringa descartável de 5 mL. Após a reação (ou amostragem), adicionava-se
acetona à miniemulsão, seguida de procedimento de centrifugação a 7.500 rpm por 15
minutos. A mistura contendo cicloexano/acetona era então removida e o precipitado era
seco a vácuo a temperatura ambiente. Dez miligramas de amostra seca eram então
tratados com algumas gotas de trietilamina por 30 minutos (para neutralizar as cargas
168
positivas dos polímeros). Em seguida, a amostra era dissolvida em solvente apropriado
para análise de GPC ou RMN. Para as reações de polimerização em que foi usado o
agente reticulante, após o processo de neutralização, as amostras eram sequencialmente
tratadas com 100 µL de uma solução de
DL-ditiotreitol
0,5 M por uma hora (para a
quebra das ligações dissulfeto). A solução resultante era então seca por processo de
freeze-drying e o polímero resultante era solubilizado em solvente apropriado para
análise de GPC ou RMN.
Tabela 4.1 – Receita de polimerização em miniemulsão inversa a 60 ºC
Fase contínua
Cicloexano
Span 80
Fase dispersa
a
HCl(aquo) 1%
NaCl
VA-044
DMAEMA
macro-RAFT
DMA-PEOSS
Quantidade (g)
20
1
2,5
0,05
0,0051
1
0,87b ou 0,90c
0,05
Observações
[M]:[I] = 400:1
[M]:[RAFT] = 100:1
Conforme Mn
Quando presente
VA-044 = 2,2’-azo-bis[2-(-imidazoli-2-il) propano] dicloridrato; DMAEMA = 2-(dimetilamino) metacrilato de etila;
DMA-PEOSS = ditiopropionil poli(etileno glicol) dimetacrilato. a O pH final da fase dispersa foi ajustado com HCl(aquo) 20% até
pH = 2-3. b macro-RAFT1: Mn = 13.650 g/mol, Mw/Mn = 1,11. c macro-RAFT2: Mn = 14.200 g/mol, Mw/Mn = 1,09.
4.3.6 Caracterização
Cromatografia de permeação em gel (GPC)
Para realizar as determinações de massas molares, as amostras de polímero
(previamente processadas) eram solubilizadas em DMAc, filtradas em filtro de 0,45 µm
e injetadas em sistema cromatográfico, usando DMAc como fase móvel na vazão de 1
mL/min. A temperatura das colunas era mantida em 50ºC. As análises foram realizadas
em cromatógrafo Shimadzu equipado com detector de refração RID-10A, pre-coluna de
5 mm (Polymer Laboratories, 50 × 7,8 mm2) e quatro colunas PL Styragel (105, 104, 103
e 500 Å), calibradas com padrões de poliestireno de 500 a 106 g/mol.
169
A massa molar numérica média teórica (Mn,th) foi calculada com base nas
Equações 4.13 e 4.14:
M n,th =
[M ]0 MWmon!
+ MWMacroRAFT
[MacroRAFT ]0
(4.13)
M n,th =
[M ]0 MWmon!
[AR]0 MWAR!
+
+ MWMacroRAFT
[MacroRAFT ]0 [MacroRAFT ]0
(4.14)
onde “M” representa monômero, “MW” é a massa molar, “α” é a conversão e “AR”
representa agente reticulante. A Equação 4.13 foi usada para o cálculo da massa
molecular teórica para as reações que usaram apenas o macro-RAFT agente. A Equação
4.14 foi usada para calcular a massa molecular teórica dos polímero em reações que
utilizaram o macro-RAFT agente e o agente reticulante, considerando a massa molar
após o processo de clivagem das ligações dissulfeto. As curvas de distribuições de
massas molares apresentadas neste Capítulo foram normalizados em relação ao valor
máximo, segundo a relação:
ynormalizado =
yi
ymáximo
(4.15)
Cromatografia gasosa (GC)
A conversão do monômero foi determinada por cromatografia gasosa, utilizando
o procedimento descrito a seguir: 0,1 g da amostragem obtida da miniemulsão era
diluída em 2 mL de uma solução GC (cicloexano:tolueno, 1.000:2) e injetadas em
cromatógrafo gasoso. As análises foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu 17A,
170
equipado com coluna AT-Wax (Heliflex capillary, Altech) e usando H2 como gás
carreador. O injetor, a coluna e o detector operavam a 200, 120 e 250 ºC,
respectivamente. O cálculo de conversão foi feito comparando-se as áreas do
monômero, do solvente (cicloexano) e do padrão interno (tolueno).
Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (1H-RMN)
As análises de
1
H-RMN descritas neste Capítulo foram realizadas em
equipamento Bruker DPX 300 (Bruker Co.), operado a 300 MHz e equipado com sonda
de 5 mm de diâmetro. Para preparo das amostras, utilizou-se clorofórmio deuterado
(CDCl3), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO) ou óxido de deutério (D2O). O
tetrametilsilano (TMS) foi usado como referência interna e manteve-se a temperatura
constante em aproximadamente 25ºC em todas as análises realizadas.
Tamanho de partícula (por Dynamic Light Scattering – DLS)
As medidas de DLS foram realizadas em instrumento Malvern Zetasizer Nano
ZS, equipado com laser 4 mW He-Ne, operando no comprimento de onda 633 nm e
utilizando um detector de fotodiodo de alta eficiência. A miniemulsão foi analisada
conforme retirada do processo de amostragem.
Também foi determinado o tamanho médio das nanopartículas reticuladas em
solução tampão. Essas nanopartículas foram isoladas a partir do látex final,
adicionando-se acetona à miniemulsão, seguida de procedimento de centrifugação a
7.500 rpm por 15 minutos. A mistura de cicloexano/acetona era então removida e o
precipitado seco a vácuo a temperatura ambiente. As partículas foram re-suspensas em
solução aquosa de HCl 20% (pH = 1-2), água deionizda (pH = 7) e carbonato de sódio
171
aquoso (pH =12). O potencial zeta das nanopartículas foi determinado em água
deionizada.
4.4 Resultados & Discussão
4.4.1 Síntese dos compostos orgânicos
O agente RAFT ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico (Figura 4.7) foi
preparado seguindo basicamente a rota de síntese descrita por MITSUKAMI et al.,
[190] e também na metodologia descrita por THANG et al. [191].
CN
S
HO
S
O
Figura 4.7 – Estrutura do agente RAFT ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico sintetizado.
Esta é uma rota de síntese considerada simples e constituída de três etapas
sequenciais. A primeira etapa do processo é a síntese do ácido ditiobenzóico (DTBA),
que é revertido em sua forma salina (conforme Figura 4.8). Embora existam outras rotas
para a produção do DTBA, a rota de síntese seguida é reportada como a metodologia de
síntese de melhores rendimentos finais. [190]
S
CH3OH
Cl
NaOCH3/ S
SNa
Figura 4.8 – Esquema da reação de síntese do ácido ditiobenzóico (DTBA).
172
A segunda etapa do processo consiste na reação de uma solução de
ditiobenzoato de sódio com ferricianeto de potássio, que resulta na síntese do dissulfeto
de bis(tiobenzoila) como composto principal (conforme Figura 4.9).
S
S
K3[Fe(CN)6]
SNa
S
H2O
S
S
Figura 4.9 – Esquema da reação de síntese do dissulfeto de bis(tiobenzoíla).
A terceira etapa de síntese consiste em reagir o dissulfeto de bis(tiobenzoila)
produzido com um azo-composto (4,4’-azo-bis(ácido 4-cianopentanóico) em acetato de
etila (conforme Figura 4.10), para a obtenção do agente RAFT desejável.
S
CN
acetato de etila
S
ABCVA
HO
S
S
S
S
O
Figura 4.10 – Esquema da reação de síntese do agente RAFT ácido 4-cianopentanóico
ditiobenzóico sintetizado. 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio) pentanoic acid.
A pureza final do produto depende dos métodos de purificação empregados após
a síntese do composto. Diversas estratégias podem ser adotadas, como a combinação de
duas ou mais técnicas de purificação, para eliminação de subprodutos e solventes
residuais. No presente trabalho, o produto final foi purificado utilizando a técnica de
coluna cromatográfica, [193] utilizando acetato de etila e éter de petróleo como eluente,
173
sendo que a confirmação da obtenção do produto desejado foi feita por 1H-RMN
(Figura 4.11).
z
S
CN
j
a
HO
z
b
S
i
O
c
Acetona
CDCl3
a
b
i, j
c
H2O
Figura 4.11 – Espectro de 1H-RMN do agente RAFT ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico
sintetizado; ressonâncias observadas (300 MHz, CDCl3)/ δ ppm: 1.94 (s, 3H, CH3); 2.39-2.77
(m, 4H, CH2CH2); 7.42 (m, 2H, m-ArH); 7.59 (m, 1H, p-ArH) e 7.92 (m, 2H, o-ArH).
De acordo com algumas referências, [190, 191] as ressonâncias entre δ ∼ 7.4-8.0
ppm representam os prótons do anel aromático do grupamento fenila; entre δ ∼ 2.4-3.0
ppm, os prótons do grupamento metileno do ácido cianopentanóico; e as ressonâncias
próximas de δ ∼ 2.0 ppm, os prótons do grupamento metila do mesmo fragmento. O
espectro da Figura 4.11 também apresentou alguns outros picos, todos eles associados a
impurezas, [194] como o pico do solvente (CDCl3, δ ∼ 7.26 ppm), diclorometano (δ ∼
5.30 ppm), acetona (δ ∼ 2.17 ppm), água (δ ∼ 1.52 ppm) e alguns outros não
assinalados.
174
Conforme mencionando anteriormente, essas impurezas podem ser removidas
por sucessivos processos de cromatografia, alternando-se a composição do eluente, por
exemplo. Outra estratégia bastante usada é a combinação de dois ou mais processos de
purificação (como, por exemplo, cromatografia, pervaporação e cristalização), uma vez
que grande parte das impurezas observadas no espectro são resíduos de solventes
usados durante o processo de síntese/purificação. Entretanto, a Figura 4.11 apresentada
indica a obtenção do produto final pretendido com relativo grau de pureza, após o
processo de purificação por coluna cromatográfica.
O agente reticulante escolhido para ser usado (DMA-PEOSS, Figura 4.12) foi
sintetizado conforme metodologia descrita por OH et al. [157] Os diferenciais desse
agente reticulante incluem a solubilidade em água e a presença de uma ponte dissulfeto
(o que confere biodegradabilidade à molécula), além da rota de síntese relativamente
simples.
O
O
O
O
S
O
S
k
O
O
k
O
Figura 4.12 – Estrutura do agente reticulante biodegradável (Ditiopropionil poli(etileno glicol)
dimetacrilato, DMA-PEOSS). Dithiopropionyl poly(ethylene glycol) dimethacrylate.
Este composto foi obtido por uma reação direta entre o poli(etileno glicol)
metacrilato e o ácido ditiopropiônico (Figura 4.13) e posterior processos de purificação.
A confirmação da obtenção do produto desejado foi feita por 1H-RMN (Figura 4.14).
Conforme observado pelo espectro de 1H-RMN, o produto final também
apresentou algumas impurezas que não foram removidas pelas etapas de purificação
realizadas. Além disso, o produto final obtido apresentou uma pequena quantidade de
175
sal, além de um aspecto ligeiramente diferente do relatado por OH et al. [157]
Entretanto, testes preliminares realizados demonstraram que o agente reticulante
sintetizado mostrou-se eficaz em promover a reticulação de redes poliméricas e sofrer
posterior degradação em ambientes redutores, através da quebra das ligações dissulfeto.
O
O
+
OH
O
S
HO
n
OH
S
O
THF
DCC/ DMAP/ DCM
O
O
O
S
n
O
O
S
O
O
n
O
Figura 4.13 – Reação de síntese do agente reticulante DMA-PEOSS
O
O
B
Z
D
E
O
O
O
S
n
C
A
A
C
S
O
D
E
n
Z
B
O
O
HDO
C
THF
A
DCC/ DMAP
Figura 4.14 – Espectro do
Z
1
Z
D
B
E
DMSO
H-RMN do agente reticulante DMA-PEOSS sintetizado;
ressonâncias observadas (300 MHz, DMSO-d6)/ δ ppm: 1.9 (s, 6H, CH3-), 2.7 (t, 4H, -COCH2CH2-SS-), 2.9 (t, 4H, -OOC-CH2-CH2-SS-), 3.3-3.7 (m, 72H, -(CH2CH2O)n-), 4.0-4.3 (m, 8H, COO-CH2- e -CH2-OOC-), 5.7 (s, 2H, CH=), 6.0 (s, 2H, CH=).
176
4.4.2 Formação da miniemulsão
Em um sistema de polimerização em miniemulsão inversa, um monômero
hidrofílico é usado como principal componente da fase dispersa (fase aquosa) e um
solvente não polar é usado como principal componente da fase contínua do sistema
(fase orgânica). Usualmente, este tipo de miniemulsão inversa (água-em-óleo ou
simplesmente w/o) produz um sistema leitoso opaco bem característico, que é bem
reportado na literatura. [135]
Um critério fundamental para a formação de uma miniemulsão estável é que o
monômero tenha uma solubilidade limitada na fase contínua. Desta maneira, em um
sistema inverso, quanto mais hidrofílico for o monômero, mais estável será o sistema,
devido à baixa (ou nenhuma) solubilidade do monômero na fase contínua, [144] fato
este que também previne efeitos como o de degradação difusional. O monômero
escolhido DMAEMA (e seu derivado acrilato) é um composto que apresenta
miscibilidade em uma grande variedade de solventes, o que inclui solventes polares,
como a água, e solventes apolares, como cicloexano, n-hexano e heptano, que poderiam
ser candidatos primários para constituição da fase contínua de uma miniemulsão
inversa.
Para contornar esta dificuldade, optou-se em seguir o procedimento utilizado por
ARMES et al., [195, 196] em que a adição de cargas positivas em monômeros que
apresentam
aminas
terciárias,
como
é
o
caso
do
DMAEMA,
aumenta
consideravelmente a solubilidade desses monômeros em meios aquosos neutros e
ácidos, consequentemente reduzindo a solubilidade em meios orgânicos. Para realizar a
adição de cargas à estes monômeros, o que leva à protonação das aminas terciárias, foi
necessário utilizar soluções aquosas ácidas (HCl 1-20 %), ajustando o pH final para
valores ácidos (pH < 4). Este procedimento assegurou que o monômero protonado
177
permanecesse predominantemente na fase aquosa do sistema, fato este comprovado pela
formação de duas fases distintas e não-detecção de traços de monômero na fase
contínua (cicloexano), conforme análises 1H-RMN apresentadas nas Figuras 4.15 e
4.16.
Embora uma miniemulsão inversa possa ser preparada usando-se apenas um
surfactante com baixo valor HLB, [138, 144] para prevenir a ocorrência de efeitos como
o de degradação difusional, que desestabilizam a miniemulsão é necessário adicionar
um agente de pressão osmótica. [197] Este agente é caracterizado por ser uma
substância de baixa massa molar, solúvel na fase dispersa e que apresente baixa
solubilidade na fase contínua. No caso de uma miniemulsão inversa, em que a fase
dispersa é aquosa, esse agente de pressão osmótica geralmente é um sal, como o NaCl,
Na2SO4 ou o K2SO4. [138, 144]
F
B H
C
H
H
A
O
O
D
E
N
F
E
D
F
A B
C
CDCl3
Figura 4.15 – 1H-RMN do monômero 2-(dimetil amino) acrilato de etila purificado em CDCl3.
178
cicloexano
CDCl3
Figura 4.16 – Teste de partição do monômero DMAEMA protonado em cicloexano.13
Desta forma, testes preliminares foram realizados para avaliar principalmente a
estabilidade do sistema frente a diferentes tipos de componentes básicos da
miniemulsão, além de suas respectivas concentrações. Algumas variáveis do processo
de preparo da miniemulsão, além da estratégia de preparo, também foram objeto de
estudo nesta fase. O procedimento adotado nestes testes preliminares é ilustrado no
Esquema 4.1.
Preparo da
pré-mistura
Miniemulsificação
Degaseificação
("purga")
Polimerização
Esquema 4.1 – Procedimento adotando para o preparo da miniemulsão inversa.
13
Procedimento experimental do teste: (1) dissolução do monômero em solução aquosa ácida (HCl 20%) e mistura com
cicloexano; (2) ultrasonificação por 10 minutos a 70% de amplitude; (3) mistura por 24 horas a 45 ºC; (4) separação das fases e
análise do cicloexano por 1H-RMN em CDCl3.
179
Os testes foram realizados utilizando o monômero DMAEMA ou seu derivado
acrilato (DMAEA), o cicloexano como o principal constituinte da fase contínua, NaCl
como o principal agente de pressão osmótica e alguns tipos de surfactantes em
diferentes concentrações (Span 80®, Span 85®, Pluronic® L-121 ou Pluronic® L-81). O
procedimento de miniemulsificação foi realizado após o preparo da pré-mistura,
aplicando-se ultrassom a amostra (5-10 minutos, amplitude entre 45 e 70%) e um banho
de gelo para resfriar o sistema. Após a obtenção da miniemulsão, parte das amostras foi
degaseificada com nitrogênio por 30 minutos. As amostras submetidas ao processo de
degaseificação
foram
posteriormente
testadas
em
reações
preliminares
de
polimerização, conduzidas em diversos intervalos de tempo (60-1.200 minutos) e de
temperatura (44-60ºC).
Embora diferentes testes tenham sido realizados, aqueles que utilizaram o
cicloexano como solvente orgânico, o Span 80 (Figura 4.17) como surfactante e o NaCl
como agente de pressão osmótica apresentaram melhores resultados quanto à
estabilidade da miniemulsão formada. O ácido escolhido para o ajuste do pH do meio,
garantindo assim a protonação do monômero, foi o HClaquo em concentrações que
variaram entre 1 e 20%.
O
O
O
HO
HO
OH
Figura 4.17 – Estrutura do surfactante Span 80®.
Independentemente da estabilidade, prolongada ou não, todos os testes
produziram miniemulsões inversas com característica leitosa opaca, normalmente
180
esperada para este tipo de sistema. Esta receita genérica mostrou-se bastante robusta,
pois foi possível acrescentar outros constituintes à formulação (agente RAFT e agente
reticulante) e/ou elevar a proporção da fase dispersa do sistema para até 20 % do total
da miniemulsão e ainda assim obter miniemulsões estáveis por mais de 72 horas. A
Figura 4.18 representa um tipo de miniemulsão inversa obtida nestes testes
preliminares.
Figura 4.18 – Teste de polimerização em miniemulsão inversa com o monômero DMAEA.
Polimerização via radicais livres à 44 ºC por 360 minutos.14 Frascos da esquerda para a direita:
(1) antes da ultrasonificação, (2) após a ultrasonificação, (3) 120 minutos, (4) 240 minutos e (5)
360 minutos de polimerização. Foto tirada 24 horas após a reação.
Com base nessa receita, foi possível estabelecer uma receita e uma metodologia
de preparo para a produção da miniemulsão inversa, previamente apresentadas na
Tabela 4.1 da seção de materiais e métodos deste Capítulo.
4.4.3 Polimerização em miniemulsão
O plano proposto foi o de utilizar a receita/metodologia desenvolvida para
conduzir três tipos de reações de polimerização em miniemulsão inversa, utilizando o 2-
14
Receita usada: cicloexano (20 g), Span 80 (1 g), HCl 1% (2,5 g), NaCl (0,05 g), VA-044 (0,0056 g), DMAEA (1 g) e HCl 20%
(~30 gotas).
181
(dimetilamino) metacrilade de etila (DMAEMA) como monômero. Os tipos de reações
realizadas foram a polimerização convencional, a polimerização na presença do agente
RAFT sintetizado e a polimerização na presença do agente RAFT e do agente
reticulante DMA-PEOSS. Desta forma, como discutido ao longo do texto, foi possível
comparar a estabilidade da miniemulsão inversa e o comportamento da polimerização
(cinética, evolução de massa molar dos polímeros, etc.) com base nos diferentes tipo de
reações de polimerização realizadas.
Polimerização convencional
A polimerização convencional em minemulsão inversa do DMAEMA (Figura
4.19) foi conduzida utilizando a receita e procedimento estabelecidos e descritos na
seção experimental. Entretanto, por ser uma reação conduzida em mecanismo clássico
de radicais livres, não foi empregado o agente RAFT. Neste conjunto de reação também
não foi empregado o agente reticulante.
DMAEMA
VA-044
60 ºC
Figura 4.19 – Esquema da polimerização convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA.
Conforme observado nos testes preliminares e demonstrado pela Figura 4.20, a
miniemulsão gerada apresentou predominantemente uma característica leitosa opaca. A
miniemulsão gerada apresentou uma estabilidade visual de algumas horas, o que
182
garantia a estabilidade do sistema entre a etapa de formação da emulsão e o início da
polimerização, quando o processo era realizado sob forte agitação mecânica.
Entretanto, conforme observado na Figura 4.20, após 24 horas algumas amostras
apresentaram uma visível separação de fases no fundo do frasco e possivelmente
alguma coagulação na fase interna do látex, embora este fato não tenha sido
comprovado. Todas as amostras apresentaram sedimentação após 7 dias (armazenadas a
temperatura ambiente e ao abrigo de luz), indicando que a estabilidade da emulsão
produzida foi suficiente apenas para conduzir a reação de polimerização.
a)
b)
Figura 4.20 – Exemplo de polimerização convencional em miniemulsão inversa. Reação
conduzida a 60 ºC por 360 minutos; receita segundo Tabela 4.1. a) após 24 horas; b) após 7
dias. Frascos da esquerda para a direita: (1) antes da ultrassonificação, (2) após a
ultrassonificação, (3) 15 minutos, (4) 30 minutos, (5) 60 minutos, (6) 120 minutos e (7) 360
minutos de polimerização.
183
A polimerização convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA
apresentou uma cinética bastante rápida (Figura 4.21), com aproximadamente 70% de
conversão em 1 hora de reação. Entretanto, por meio da realização de várias reações,
observou-se que a conversão para este tipo de sistema parece não ultrapassar o patamar
de ~90%, mesmo após 6 horas de polimerização. Em alguns testes foi possível atingir
conversões de 95-98%, mantendo o sistema sob condições reacionais constantes por
aproximadamente 20 horas. Entretanto, foi observado uma total perda de estabilidade do
látex final obtido nestas reações.
100
Conversão (%)
80
60
40
20
0
0
100
200
300
400
Tempo de reação (minutos)
Figura 4.21 – Gráfico de conversão versus tempo de reação da polimerização convencional em
miniemulsão inversa do DMAEMA.
Os resultados de massa molar obtidos para a reação de polimerização
convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA (Tabela 4.2 e Figura 4.22)
apresentaram resultados numéricos bastante elevados (da ordem de 105 g/mol), o que
184
era esperado para polímeros sintetizados por mecanismo de polimerização via radicais
livres em miniemulsão. A distribuição de massas molares (Figura 4.22) apresentou um
perfil bimodal, provavelmente por causa da variação da concentração dos reagentes e
taxas de reação de terminação com a conversão. Entretanto, os resultados de massa
molar apresentados foram considerados satisfatórios, uma vez que eles confirmaram a
viabilidade da síntese do PDMAEMA pelo mecanismo convencional de radicais livres,
caracterizado por amostras com altos valores de massa molar e alto índice de
polidispersão Mw/Mn.
Tabela 4.2 – Dados de massa molar para as amostras de PDMAEMA obtidos por meio da
polimerização convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA.
Tempo de reação (min)
30
60
120
360
Mn × 10-3 (g/mol)
368
215
139
226
Conversão (%)
64
68
82
86
Mw/Mn
3,03
2,60
3,90
3,62
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
64%
0.6
68%
82%
0.4
86%
0.2
0.0
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
log M (g/mol)
Figura 4.22 – Distribuição de massas molares para as amostras de PDMAEMA obtidas por meio
da polimerização convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA.
185
As emulsões, antes e após o processo de polimerização, também foram avaliadas
quanto ao tamanho de gotas/partículas geradas. Conforme mostrado na Figura 4.23,
para as diversas polimerizações convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA, o
tamanho médio de partículas gerado foi de aproximadamente 100 nm, valor que
permaneceu relativamente constante durante todo o processo de polimerização.
a)
8
dw/dn
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
80
100
Converão (%)
b)
400
dn (nm)
300
200
100
0
0
20
40
60
Conversão (%)
Figura 4.23 – Tamanhos médios de partícula em função da conversão para a polimerização
convencional em miniemulsão inversa do DMAEMA. a) dvolume/dnumérico; b) dnumérico.
A distribuição de tamanhos de partícula (Figura 4.24) para uma amostra obtida
durante o processo de polimerização convencional em miniemulsão inversa do
186
DAMEMA aponta para uma relativa homogenidade do tamanho de partículas formadas
e ausência de frações de tamanho de partícula elevados.
Quantidade relativa (a.u.)
20
15
10
5
0
10
100
1,000
10,000
Diâmetro (nm)
volume
número
Figura 4.24 – Distribuições de tamanhos de partículas para a polimerização convencional em
miniemulsão inversa do DMAEMA. Látex da amostra com 82% de conversão.
Com o conjunto de dados apresentados, foi possível estabelecer um conjunto de
características básicas do processo de polimerização em miniemulsão inversa do
DMAEMA, que servirá de base para a comparação com os resultados obtidos quando a
polimerização foi conduzida na presença do agente RAFT e do agente reticulante,
conforme apresentado nas próximas seções.
Polimerização RAFT
Foram realizadas reações de polimerização em miniemulsão inversa do
DMAEMA na presença do agente RAFT previamente sintetizado. Conforme
187
apresentado na Tabela 4.1, a diferença da polimerização convencional para a
polimerização RAFT é a adição do agente RAFT à receita de polimerização. A
concentração do agente RAFT escolhida foi de 1:100 em relação à quantidade de
monômero presente. Neste conjunto de reações, para poder avaliar apenas o
desempenho do agente RAFT, também não foi empregado o agente reticulante.
A polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA tem sua reação
esquematizada na Figura 4.25. De acordo com o esquema proposto, cada cadeia em
crescimento só possui apenas uma única molécula do agente RAFT, embora também
sejam geradas cadeias de PDMAEMA sem agente RAFT em sua estrutura ao longo da
polimerização.
CN
O
O
+
S
HClaquo 1%/ VA-044
HO
S
S
NC
HO
60 ºC
S
n
O
N
O
O
O
NH
Figura 4.25 – Reação de polimerização do DMAEMA na presença do agente RAFT ácido 4cianopentanóico ditiobenzóico sintetizado.
Um desafio particular encontrado ao incluir o agente RAFT sintetizado na
receita de miniemulsão inversa foi a migração dos componentes entre as fases do
sistema. Embora o agente RAFT tenha de fato solubilidade na fase dispersa do sistema
(fase aquosa), durante a etapa de pré-mistura este composto também apresentou uma
grande afinidade pela fase contínua (orgânica).
O agente RAFT sintetizado (ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico) possui uma
característica coloração vermelha/rosa. Desta forma, sua adição no sistema confere uma
188
coloração rósea característica, facilitando a monitoração da migração do componente e
também de sua degradação ao longo da polimerização. Com o intuito de proceder uma
polimerização RAFT controlada, o agente foi solubilizado na fase dispersa do sistema
antes de ser misturado com a fase contínua. Entretanto, conforme ilustrado na Figura
4.26, após alguns minutos da etapa da pré-mistura (onde ambas as fases são misturadas)
praticamente todo o agente RAFT migrou para a fase orgânica do sistema.
Figura 4.26 – Migração do agente RAFT (ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico) da fase
dispersa (aquosa) para a fase contínua (orgânica) do sistema de pré-mistura da miniemulsão
inversa. Teste realizado utilizando DMAEA como monômero e 0,01 g de agente RAFT. Frascos
da esquerda para a direita: (1) antes da ultrassonificação, (2) após a ultrassonificação, (3) 60
minutos, (4) 240 minutos e (5) 20 horas de polimerização.
Os dados reportados indicam que, mesmo solubilizando o agente RAFT na fase
dispersa da miniemulsão, realizando o processo de miniemulsificação e posteriormente
o processo de polimerização, durante as duas últimas etapas o agente RAFT utilizado
tende a migrar para a fase contínua do sistema, culminando numa maior instabilidade do
sistema formado. Além disso, a saída do agente RAFT das gotas formadas, onde ocorre
as reações de polimerização, também levam a um pobre controle da polimerização
RAFT em miniemulsão e, consequentemente, a um produto final fora dos padrões
desejadas para uma técnica de CLRP.
189
A solução encontrada para aumentar a afinidade do agente RAFT pela fase
dispersa do sistema de miniemulsão inversa foi o de “modificar” o agente RAFT
sintetizado. A modificação proposta consistiu em “adicionar” ao agente RAFT um
bloco de poli(etileno glicol), que aumenta a afinidade do agente por meios polares (no
caso, a fase dispersa do sistema; ácida/aquosa) e consequentemente causa a redução da
solubilidade do agente RAFT em meios apolares (no caso a fase contínua; cicloexano).
A modificação do agente RAFT, produzindo um agente macro-RAFT, se deu através de
uma reação de polimerização em solução (Figura 4.27) na presença do monômero
poli(etileno glicol) metil eter metacrilato (PEG-MA; Mn = 475 g/mol), sendo o produto
final obtido após processos de purificação (diálise utilizando solventes polares).
CN
O
O
+
S
Acetonitrila
HO
S
S
NC
HO
70 ºC
S
n
O
O
O
O
O
8
O
8
Figura 4.27 – Reação de modificação do agente RAFT ácido 4-cianopentanóico ditiobenzóico,
resultando na formação de um agente macro-RAFT.
Durante esta etapa, diversos lotes de agente macro-RAFT foram produzidos e
analisados por GPC e 1H-RMN. Os dados de 1H-RMN comprovaram o sucesso da
reação de modificação, que pode ser vista como uma reação de “extensão de cadeia” do
agente RAFT original. Na Figura 4.28 é ilustrado o espectro de 1H-RMN de um lote de
macro-RAFT sintetizado, em que são observados os deslocamentos químicos do bloco
polimérico inserido e do agente RAFT original.
190
g
S
NC
j
a
h
HO
i
O
n
b
S
O
c
O
d
e
O
8
HDO
e
f
a
c
b
f
acetona
d
i, j
h
g
Figura 4.28 – Espectro de 1H-RMN do agente macro-RAFT1 sintetizado com auxílio de reação
de extensão de cadeia; ressonâncias observadas (300 MHz, D2O)/ δ ppm: 1.5-2.0 (m, 3H, CH2CH), 3.36 (s, 3H, CH3), 3.60 (m, nH, O-CH2-CH2-O-), 4.10 (s, 2H, COO-CH2), 7.36 (m, 2H,mArH), 7.50 (m, 1H, p-ArH), 7.87 (m, 2H, o-ArH).
Além dos dados de 1H-RMN, os dados de GPC obtidos comprovaram um ótimo
controle da reação de “extensão de cadeia”, fato este que pode ser traduzido por valores
de Mw/Mn < 1,10 e massas molares (Mn) próximas aos valores teóricos calculados e/ou
em concordância com os valores calculados com auxílio dos dados obtidos por 1HRMN, conforme demonstrado na Tabela 4.3.
Seguindo a receita/metodologia apresentada anteriormente e usada na
polimerização convencional, reações de polimerização na presença do agente macroRAFT foram conduzidas em miniemulsão inversa. Este tipo de reação gerou
copolímeros em blocos, conforme esquema geral de reação apresentado na Figura 4.29.
191
Tabela 4.3 – Características dos macro-RAFT agente produzidos
1
Teórico*
H-RMN
Mn (g/mol)
Mn (g/mol)
macro-RAFT1
9.780
16.110
macro-RAFT2
9.780
20.070
* Considerando 99% de conversão.
Amostra
GPC
Mw (g/mol)
15.180
15.450
Mn (g/mol)
13.650
14.200
Mw/Mn
1,11
1,09
a)
MacroRAFT
DMAEMA
VA-044
60 ºC
b)
S
NC
n
O
S
NC
HO
S
HClaquo 1%/ VA-044
DMAEMA/ 60 ºC
O
O
O
HO
8
S
n
O
m
O
O
O
O
O
8
NH
Figura 4.29 – Esquema da polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA. a)
esquematização geral da reação nas gotas da miniemulsão; b) reação química.
Na Figura 4.30 é apresentado um exemplo da miniemulsão inversa obtida
utilizando o agente macro-RAFT. Por causa da forte coloração do composto RAFT, a
simples análise visual da pré-mistura formada (antes da etapa de ultrasonificação)
confirma que a estratégia de “extensão de cadeia” com um monômero à base de
poli(etileno glicol) de fato conferiu uma maior hidrossolubilidade ao agente RAFT.
Desta forma, pouca ou nenhuma migração do agente macro-RAFT para a fase contínua
do sistema foi observada. Além disso, as emulsões produzidas na presença do agente
macro-RAFT apresentaram uma maior estabilidade, se comparadas às emulsões
produzidas sem o agente macro-RAFT (polimerização convencional). Esta estabilidade
192
ficou próxima de sete dias, sendo que apenas após este período, algumas amostras
apresentaram coagulação ou a presença de precipitados.
(a)
(b)
(c)
Figura 4.30 – Exemplo de miniemulsão inversa preparada na presença do agente macro-RAFT.
a) antes de etapa de ultrasonificação; b) após a etapa de ultrasonificação; b) após 30 minutos de
polimerização (~ 36% de conversão).
Assim como observado para as reações de polimerização convencional, a
polimerização do DMAEMA na presença do agente macro RAFT também apresentou
comportamento similar (Figura 4.31), com uma rápida velocidade de polimerização,
atingindo conversões próximas a 70% em 60 minutos de reação. A diferença observada
para as duas reações foi de que, na polimerização RAFT, foi alcançada quase a
completa conversão (> 98%) em 360 minutos de reação. Já na polimerização
convencional, conversões próximas a 98% só foram alcançadas quando a reação foi
estendida para além de 20 horas, conforme discutido anteriormente.
Os dados de distribuição de massas molares para polimerização realizada na
presença do agente macro-RAFT (Figura 4.32) demonstra o deslocamento das curvas
para valores de maior massa molar à medida que ocorre o aumento da conversão. Este
fato é consistente com um processo de polimerização tipo CLRP. Entretanto, as
distribuições de massas molares para conversões diferentes de zero apresentam uma
193
100
Conversão (%)
80
60
40
20
0
0
100
200
300
400
Tempo de reação (minutos)
Convencional
RAFT
Figura 4.31 – Gráfico de conversão versus tempo de reação da polimerização RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA. Os dados relativos ao processo convencional foram
previamente apresentados na Figura 4.21.
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0%
36%
0.6
70%
0.4
92%
98%
0.2
0.0
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
log M
Figura 4.32 – Distribuições de massas molares para as amostras de PDMAEMA obtidas por
intermédio da polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA. 0% indica a
distribuição de massas molares do agente macro-RAFT.
194
pequena inflexão. Neste caso, essa inflexão pode ser um indicativo de que uma fração
do agente macro-RAFT possivelmente não participou da reação de polimerização. Este
efeito pode ter sido ocasionado por diversos fatores, como a presença de cadeias mortas
do agente macro-RAFT inicial (cadeias que não continham o agente macro-RAFT como
grupo terminal) ou uma característica inerente da própria polimerização heterogenia.
Além do deslocamento das distribuições de massas molares para valores mais
elevados, o “controle” de reações do tipo CLRP muitas vezes é avaliada também pelos
dados de evolução da massa molar média em função da conversão do monômero. A
Figura 4.33 traz os dados da evolução dos valores de massa molar média (Mn) e índice
de polidispersão Mw/Mn em função da conversão do DMAEMA, realizada na presença
do agente macro-RAFT. Como demonstrado, os valores de Mn crescem linearmente
com a conversão, alcançando valores próximos dos valores teóricos calculados. Este
fato demonstra que o sistema se comportou de forma “controlada”, uma vez que os
dados de Mn são consistentes com as distribuições, ambos demonstrando a evolução das
massas molares com a conversão. O “controle” da reação de polimerização RAFT
também é ressaltado pelos valores de Mw/Mn (< 1,3), indicando a efetiva ação do agente
macro-RAFT em promover o crescimento do bloco de PDMAEMA de forma
controlada.
Conforme apresentado na Figura 4.33, os valores das massas molares médias
para os polímeros sintetizados sem a presença do agente macro-RAFT foram muito
superiores, quando comparados aos valores obtidos nas polimerizações feitas na
presença do agente macro-RAFT. Embora as distribuições de massas molares dos
polímeros sintetizados na presença do agente macro-RAFT tenha apresentado uma
aparente larga distribuição, o que não seria condizente com os valores de Mw/Mn < 1,3 ,
quando se comparam as distribuições de massas molares para das reações de
195
polimerização convencional e RAFT do DMAEMA (Figura 4.34), é possível verificar
que os dados são coerentes. Na polimerização convencional, a distribuição larga das
curvas são condizentes com valores de Mw/Mn maior do que 2,5 (e maior do que nas
reações conduzidas na presença do agente macro-RAFT).
1.5
MW/Mn
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
35
30
Mn ×10-3 (g/mol)
25
20
15
10
5
0
Conversão (%)
Figura 4.33 – Mw/Mn e Mn em função da conversão para reação de polimerização RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA.
196
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0% RAFT
0.6
98% RAFT
86% convencional
0.4
0.2
0.0
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
log M (g/mol)
Figura 4.34 – Comparativo das distribuições de massas molares da polimerização convencional
e RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA.
Conforme
descrito
anteriormente,
na
polimerização
convencional
em
miniemulsão inversa do DMAEMA, o tamanho médio das gotas geradas foi de
aproximadamente 100 nm, sendo que este valor permaneceu relativamente constante
durante todo o processo de polimerização. Para a polimerização RAFT (Figura 4.35), o
diâmetro numérico médio foi bastante similar antes da polimerização (dn ≈ 100 nm).
Entretanto, com o andamento das reações de polimerização, comportamentos
distintos foram observados. Enquanto que nas reações convencionais o tamanho médio
de partículas permaneceu constante, nas reações realizadas na presença do agente
macro-RAFT foi observado um aumento significativo do tamanho de partícula quando a
conversão variou entre 0-30%. Quando a conversão atingiu valores superiores a 30%,
aparentemente o tamanho médio das partículas permaneceu em um patamar entre 250290 nm. Este efeito de certa forma era esperado, uma vez que é reportado que manter a
197
estabilidade coloidal em um sistema CLRP é mais difícil do que em sistemas
convencionais. [121, 198] Além disso, a distribuição inicial de tamanhos é muito mais
larga no caso da polimerização RAFT, o que favorece efeitos de degradação difusiva de
tamanhos. Provavelmente a distribuição inicial de tamanhos é distinta por causa das
diferentes viscosidades do meio reacional.
a)
8
dw/dn
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
80
100
Converão (%)
Convencional
RAFT
b)
400
dn (nm)
300
200
100
0
0
20
40
60
Conversão (%)
Convencional
RAFT
Figura 4.35 – Gráficos de tamanho médio de partícula em função da conversão para a
polimerização convencional e polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA. a)
dvolume/dnumérico; b) dnumérico. Os dados da polimerização convencional foram previamente
apresentados na Figura 4.23.
198
A distribuição de tamanhos por peso em altas conversões (Figura 4.36) revela
que uma pequena população de micro-partículas estava presente no sistema RAFT;
porém, não foram identificadas no sistema convencional. Os valores de dw/dn foram
similares para ambos os sistemas durante toda a polimerização, embora o sistema que
continha o agente RAFT tenha apresentado uma distribuição de tamanho de gota inicial
mais larga do que o sistema convencional.
Quantidade relativa (a.u.)
20
15
10
5
0
10
100
1,000
10,000
Diâmetro (nm)
volume
número
Figura 4.36 – Distribuições de tamanho de partículas para a polimerização RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA. Latex da amostra com 92% de conversão.
A confirmação da formação do produto desejado também foi confirmada por 1HRMN, conforme espectro apresentado na Figura 4.37. No espectro apresentado, foi
possível identificar os principais deslocamentos associados ao agente RAFT original, ao
bloco de poli(etileno glicol) e também ao bloco de PDMAEMA adicionado
posteriormente nas reações de polimerização. Este resultado é mais um indício da
atividade do agente RAFT sintetizado e da realização de uma reação do tipo CLRP.
199
j
g
NC
l
S
a
HO
h
k
i
m
O
O
O
O
c
O
m
d
e
n
e
HDO
O
8
o
c
o
NH
f
a
b
S
n
o
b
f
n
m
d
i, j
h, k
g, l
Figura 4.37 – Espectro de 1H-RMN do PDMAEMA-b-P(OEG-MA) sintetizado através de
polimerização em miniemulsão inversa na presença do agente macro-RAFT. Amostra t = 360
minutos; 98% de conversão.
Espectros similares também foram obtidos para as amostras de látex recolhidas
durante os processos de amostragem da reação de polimerização RAFT. As maiores
diferenças observadas foram relativa às áreas dos picos em δ = 3.0 e δ = 3.4 ppm,
relativos aos picos característicos do PDMAEMA e do agente macro-RAFT. Como é
esperado, a relação entre esses picos muda com o aumento da conversão do monômero.
Desta forma, também é possível utilizar os espectros de RMN para predizer a massa
molar numérica (Mn) final do copolímero em bloco obtido, como foi feito para os
diferentes lotes de agente macro-RAFT produzidos.
200
Polimerização RAFT com agente reticulante biodegradável
Após observar o comportamento da polimerização convencional e RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA, um terceiro tipo de reação foi conduzido: a
polimerização RAFT na presença do agente reticulante DMA-PEOSS, conforme
esquema apresentado na Figura 4.38.
MacroRAFT
DMAEMA DMA-PEOSS
VA-044
60 ºC
Figura 4.38 – Esquema da polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA na
presença do agente reticulante DMA-PEOSS.
Devido à característica da receita de miniemulsão desenvolvida, em que uma
grande quantidade de “solvente” continua presente dentro das gotas, o látex final gerado
após o processo de miniemulsão pode não conter de fato partículas poliméricas. Numa
visão mais criteriosa, as cadeias poliméricas sintetizadas estão solubilizadas dentro das
gotas da miniemulsão inversa. Desta forma, a obtenção de partículas só pode ser
alcançada se um agente reticulante é introduzido no sistema. Neste caso, o DMAPEOSS pode atuar formando o nano-hidrogel, que na verdade são nanopartículas
poliméricas hidrofílicas e reticuladas.
Utilizando a mesma metodologia descrita anteriormente, partículas reticuladas
biodegradáveis foram sintetizadas via polimerização RAFT em miniemulsão inversa do
DMAEMA na presença do agente reticulante DMA-PEOSS. Em termos práticos,
201
conforme descrito na Tabela 4.1, a diferença entre a polimerização RAFT e esta foi a
adição do agente reticulante à receita de miniemulsão inversa.
A taxa de polimerização para esta reação foi bastante similar se comparada com
a reação de polimerização RAFT sem a presença do agente reticulante, conforme é
mostrada na Figura 4.39.
100
Conversão (%)
80
60
40
20
0
0
100
200
300
400
Tempo de reação
RAFT
RAFT c/ DMA-PEOSS
Figura 4.39 – Gráfico de conversão versus tempo de reação da polimerização RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA, com e sem a presença do agente reticulante DMA-PEOSS.
Os dados da cinética RAFT foram previamente apresentados na Figura 4.31.
Em relação aos tamanhos médios de partícula obtidos para as reações realizadas
na presença do agente reticulante, o tamanho numérico médio obtido foi menor, em
comparação com os tamanhos observados na polimerização conduzida sem o agente
RAFT (Figura 4.40). Os dados indicaram que o tamanho médio foi de aproximadamente
200 nm, para conversões entre 30-100%.
202
a)
25
dw/dn (nm)
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
80
100
Conversão (%)
RAFT
RAFT c/ DMA-PEOSS
b)
400
dn (nm)
300
200
100
0
0
20
40
60
Conversão (%)
RAFT
RAFT c/ DMA-PEOSS
Figura 4.40 – Gráficos de tamanho médio de partícula como função da conversão para a
polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA com e sem a presença do agente
reticulante DMA-PEOSS. a) dvolume/dnumérico; b) dnumérico. Os dados da polimerização RAFT foram
previamente apresentados na Figura 4.35.
Observa-se entretanto, que a distribuição de tamanhos de partículas apresentouse significativamente larga, dado este indicado pelos elevados valores iniciais de dw/dn
(Figura 4.40). Além disso, para as reações de polimerização RAFT realizadas na
presença do agente reticulante, foi observada uma grande população de partículas na
faixa de micra, conforme dados da Figura 4.41. O aumento dos índices de polidispersão
estão provavelmente relacionados ao aumento da viscosidade inicial da fase dispersa.
203
Os menores tamanhos médios provavelmente se devem ao aumento mais rápido das
viscosidades da fase dispersa, que tendem à minimizar os efeitos de difusão degradativa
dos tamanhos.
Quantidade relativa (a.u.)
20
15
10
5
0
10
100
1,000
10,000
Diâmetro (nm)
volume
número
Figura 4.41 – Curva de distribuição de tamanho de partículas para a polimerização RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA com a presença do agente reticulante DMA-PEOSS. Latex
da amostra com 94% de conversão.
As nanopartículas reticuladas obtidas foram subsequentemente induzidas à
reação de oxi-redução com ditiotreitol. Este procedimento tinha o objetivo de reduzir as
ligações dissulfeto, gerando cadeias primárias do gel. Idealmente, essas cadeias
primárias teriam distribuições de massa molar bastante similar ao do polímero obtido
sem a presença do agente reticulante. [169-171, 199] No caso específico, este estudo
compara as reações de polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA,
com e sem a presença do agente reticulante DMA-PEOSS.
204
As distribuições de massas molares das cadeias após o processo de degradação
do hidrogel (Figura 4.42) revelam uma estreita distribuição monomodal de massa molar
que cresce com a conversão do monômero.
1.2
w(log M) (a.u.)
1.0
0.8
0%
47%
0.6
81%
0.4
94%
97%
0.2
0.0
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
log M (g/mol)
Figura 4.42 – Distribuições de massas molares para as cadeias primárias de PDMAEMA obtidas
através da polimerização RAFT em miniemulsão inversa do DMAEMA com a presença do
agente reticulante DMA-PEOSS. 0% indica distribuições de massa molares do agente macroRAFT; após redução do gel pela ação do DL-ditiotreitol para quebrar as pontes dissulfeto.
Interessantemente, o pequeno “ombro” de frações de baixa massa molar presente
na reação de polimerização RAFT (sem agente reticulante, Figura 4.32) não está
presente quando a reação foi conduzida na presença do agente reticulante. Este fato
sugere que o pequeno “ombro” de frações de baixa massa molar observados em reações
de polimerização RAFT sem a presença do agente reticulante, se deve ao mecanismo
heterogêneo da polimerização, não sendo causado necessariamente por cadeias “mortas”
205
do agente macro-RAFT, conforme hipótese proposta anteriormente. Caso isso fosse
verdade, a presença do ombro deveria ser confirmada no hidrogel.
Nas reações de polimerização RAFT realizadas na presença do agente
reticulante, observou-se que os valores de massa molar (Mn) das cadeias cresceu com a
conversão conforme esperado para este tipo de reação (Figura 4.43). Entretanto, esses
valores numéricos foram ligeiramente superiores aos valores teóricos calculados,
embora os valores de polidispersção tenham permanecidos baixos (Mw/Mn < 1,3),
mesmo para as amostras de alta conversão. Isso possivelmente indica que a degradação
das ligações de reticulação não é de fato completa.
1.5
Mw/Mn
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
40
Mn x 10-3 (g/mol)
35
30
25
20
15
10
5
0
Conversão (%)
Figura 4.43 – Mw/Mn e Mn em função da conversão para a reação de polimerização RAFT em
miniemulsão inversa do DMAEMA com a presença do agente reticulante DMA-PEOSS.
206
Após serem isoladas e purificadas, as nanopartículas podem ser facilmente
redispersas em meio aquoso, onde apresentam um comportamento dependente do pH do
meio em que são dispersas. [186] As observações experimentais indicaram uma
diminuição do tamanho das partículas com o aumento do pH do meio aquoso em que as
nanopartículas foram redispersas (Figura 4.44). O decréscimo de tamanho foi da ordem
de 100 nm e pode ser atribuído às menores solubilidades do PDMAEMA em valores
elevados de pH.
250
dn (nm)
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
pH
Figura 4.44 – Alteração do tamanho hidrodinâmico das nanopartículas reticuladas a base de
PDMAEMA em função do pH do meio aquoso.
As nanopartículas purificadas também foram avaliadas quanto à presença de
carga superficial em pH neutro. Conforme esperado, o potencial zeta das partículas em
água (pH ≈ 7) foi de +42 mV, indicando a presença de cargas positivas na superfície das
partículas. Esta presença de cargas positivas na superfície do nanogel oferece a
possibilidade do uso desta matriz como sistema de liberação controlada de genes, uma
vez que, em tese, pode-se promover a conjugação deste nanogel com biomoléculas de
interesse, como o RNA ou DNA.
207
4.5 Conclusões
Neste Capítulo foi descrita a síntese de nanopartículas de hidogel biodegradável
com auxílio da polimerização em miniemulsão inversa do monômero 2-(dimetilamino)
metacrilato de etila (DMAEMA), na presença de um agente RAFT e um agente
reticulante específico.
As condições experimentais foram otimizadas para, durante o processo de
emulsificação, minimizar a partição do monômero e também do agente RAFT para a
fase contínua da miniemulsão inversa. Mais especificamente, a estratégia de
acidificação da fase dispersa permitiu a utilização deste monômero em um sistema de
polimerização heterogêneo. Além disso, as estratégias adotadas traduziram-se na
possibilidade de obter nanopartículas com uma estrutura bem definida.
As análises de massa molar realizadas apontaram para a condução de dois tipos
de mecanismos de polimerização. Na ausência de agente RAFT, o sistema se comportou
como uma polimerização em miniemulsão via radicais livres convencional,
caracterizado por elevados valores de massa molar e polidispersão (Mw/Mn). Entretanto,
ao incluir o agente RAFT na miniemulsão inversa, o mecanismo observado foi de
polimerizações conduzidas segundo um mecanismo vivo/controlado. Este fato foi
comprovado pela preservação de atividade do agente RAFT, formação de blocos de
copolímeros, estreitas distribuições de massas molares, baixo valores de polidispersão
(Mw/Mn) e evolução linear da massa molar com a conversão.
A reticulação das partículas foi alcançada usando-se um agente reticulante
biodegradável. Além disso, a presença de cargas na superfície conferiu às partículas
uma característica bastante desejável, caso estas sejam usadas como sistemas de
liberação de biomoléculas.
208
Capítulo 5
Conclusões
O objetivo geral da Tese apresentada foi o de utilizar sistemas heterogêneos de
polimerização para a produção de novos materiais poliméricos, na forma de
micropartículas e nanopartículas, para serem usados em aplicações biomédicas.
Em um primeiro momento, o estudo foi direcionado para a síntese de
micropartículas poliméricas por meio de reações de polimerização via radicais livres em
suspensão. O diferencial da proposta foi a incorporação in situ de medicamentos durante
a reação de polimerização do acetato de vinila e a copolimerização do acetato de vinila
e metacrilato de metila. Com base nos dados apresentados, foi possível concluir que a
incorporação in situ de fármacos multifuncionais durante as reações de polimerização é
uma estratégia viável para a obtenção de micropartículas carregadas com medicamento.
Entretanto, o tipo de fármaco escolhido, a concentração e a estratégia de incorporação
promovem significativas alterações nas propriedades morfológicas e moleculares das
micropartículas, além de exercerem influência direta na cinética de polimerização.
209
Em um segundo momento, foi descrita uma metodologia que possibilitou a
produção de nanopartículas poliméricas hidrossolúveis a partir do monômero hidrofílico
2-(dimetilamino) metacrilato de etila. Neste caso, a estratégia de síntese de compostos
orgânicos e de formação da emulsão permitiu a obtenção nanopartículas por meio de
reações de polimerização via mecanismo de transferência de cadeia por adiçãofragmentação reversível (RAFT) em miniemulsão inversa. Conforme foi demonstrado,
a polimerização ocorreu através de um mecanismo controlado/vivo, fato este
comprovado pela preservação da atividade dos agentes RAFT sintetizados, pelo
formação de blocos de copolímeros, pelas estreitas distribuições de massa molar, por
baixos valores de índice de polidispersão (Mw/Mn) e pela evolução linear da massa
molar com a conversão. A adição de um agente reticulante à miniemulsão conferiu
biodegradabilidade ao nano-hidrogel produzido, que apresentou características
desejáveis para serem usadas como plataforma para a liberação de fármacos e
biomoléculas.
Sugestões
Embora os resultados apresentados na presente Tese tenham sido conclusivos e
suficientes para a elaboração das hipóteses apresentadas, diversos outros aspectos não
foram objetos de estudo. Desta forma, as seguintes sugestões para a realização de
trabalhos futuros certamente contribuirão para a complementação dos resultados aqui
apresentados.
Uma preocupação percebida durante os experimentos foi a retenção de atividade
farmacológica dos fármacos incorporados durante as reações de polimerização em
suspensão, uma vez que estas reações ocorrem em altas temperaturas e na presença de
210
radicais livres. Desta forma, testes in vitro e in vivo são necessários para a comprovação
da atividade farmacológica dos fármacos incorporados às matrizes poliméricas.
Conforme apresentado no Anexo, testes prelimiares foram conduzidos, mas não de
maneira conclusiva.
Embora os resultados de liberação apresentados no Capítulo 2 tenham sido
suficientes para traçar algumas hipóteses, faz-se necessário realizar testes mais
específicos de liberação controlada de fármacos. Conforme foi suposto, o tempo de
extração do fármaco (2 horas) provavelmente não foi suficiente para extrair toda
amoxicilina adsorvida na matriz polimérica. Desta forma, sugere-se que estes testes
sejam realizados por periodos prolongados (de 24 horas ou mais) e baseados em
metodologias oficiais de análise, o que certamente contribuirá para traçar um perfil
farmacocinético mais específico de liberação do fármaco e também dados mais precisos
em relação a eficiência de incorporação do fármaco na matriz polimérica. Uma
metodologia para a avaliação da extração do fármaco por períodos prolongados foi
proposta e está apresentada no Anexo desta Tese.
Conforme explicado no Capítulo 4, os nanogéis a base de PDMAEMA têm
atraído bastante interesse devido a sua interação/uso em sistema de liberação de
fármacos e biomoléculas, em especial moléculas de DNA e RNA. Desta forma, sugerese testar os nanogéis a base de PDMAEMA sintetizados quanto sua capacidade de
conjugação e liberação de biomoléculas (DNA e RNA).
A estratégia desenvolvida e apresentada no Capítulo 4 permite que outros
monômeros hidrofílicos possam ser usados para a produção de nanogéis. Desta forma,
sugere-se que outras estratégias de produção de nanogéis sejam feitas, utilizando
diferentes monômeros, agentes reticulantes, agentes RAFT e condições experimentais.
211
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237
Anexo
Teste de atividade farmacológica in vitro
No Capítulo 2 foi demonstrada a incorporação in situ durante a reação de
copolimerização do acetato de vinila e metacrila de metila da amoxicilina. Um
questionamento que deve ser levado em consideração na estratégia de incorporação in
situ de fármacos é a retenção de atividade farmacológica do fármaco após o processo de
polimerização/síntese das partículas. No caso específico da amoxicilina, a principal
preocupação está relacionada à degradação do anel β-lacâmico do composto, que é
responsável pela ação antibacteriana da amoxicilina. Neste caso, a confirmação da
retenção de atividade da amoxicilina pode ser verificada com auxílio de testes
microbiológicos in vitro.
O teste microbiológico in vitro pode ser realizado com a elaboração de diversas
metodologias. Entretanto, duas delas parecem ser mais adequadas para o presente caso:
o contato direto das micropartículas com fármaco com microorganismos sensíveis à
amoxicilina ou a extração do fármaco das partículas e posterior teste microbiológico.
Neste anexo, são apresentados alguns resultados preliminares relacionados a segunda
estratégia apenas.
238
Metodologia experimental
Teste microbiológico
A técnica seguida foi o “Método da difusão em ágar – técnica do disco”, que tem
como fundamento medir um halo de inibição de crescimento em uma placa contendo
um microrganismo. Este halo de inibição observado é proporcional à difusão e à
concentração de um determinado antibiótico para o meio de cultura. Os procedimentos
experimentais descritos a seguir foram baseados na metodologia descrita por
OLIVEIRA (2005) [200] , com algumas pequenas modificações experimentais.
1. Preparo dos discos de papel absorvente
a.
Foram utilizados discos de papel secos, esterilizados e sem antibióticos de
aproximadamente 6 mm de diâmetro (DME – Araçatuba, SP).
b.
Cada disco foi impregnado com 15 µL de “solução teste” em câmara de fluxo laminar.
2. Preparo das placas
a.
Prepararam-se antecipadamente placas contendo ágar Mueller-Hinton15 e também
caldos Mueller-Hinton.
b.
Dois microorganismos foram reativados em placas contendo ágar nutriente (24 h a
35ºC) e inoculados nos caldos Muller-Hinton para promover seu crescimento (48 h a
35ºC).
c.
Utilizando um swab (haste de plástico com algodão nas pontas) esterilizado, distribuiuse o inóculo microbiano sobre a superfície do ágar.
d.
Com um pinça estéril, distribuíram-se os discos (que foram previamente impregnados)
sobre a superfície do ágar.
e. Incubaram-se as placas contendo os discos em estufa a 35ºC por um período de 16-18 h.
Após esse período, fizeram-se as leituras das placas, para verificar os halos de inibição
de crescimento formado.
15
Ágar Mueller-Hinton – meio de cultura usado para testes de sensibilidade de microorganismos à antibióticos. Sua composição
aproximada consiste de extrato de carne (2 g/L), caseína hidrolisada (17,5 g/L), amido (1,5 g/L) e ágar (17 g/L).
239
A Tabela A1 resume os resultados obtidos para os extratos aquosos das amostras
testadas neste teste microbiológico. Os extratos poliméricos foram obtidos conforme
descrito no teste de liberação do fármaco, exceto pela proporção polimero/solução
extratora. Em cada placa de teste colocaram-se seis discos com os extratos já
impregnados: um disco para o branco, um disco para cada concentração de amoxicilina
testada, um disco para o extrato da amostra e mais um disco contendo uma concentração
determinada de amoxicilina (10 µg/disco – DME, Araçatuba, SP).
Tabela A1 – Extratos aquosos usados no teste microbiológico.
Extrato Aquoso
Característica
Amoxicilina (µg/µL )*
Branco
0
Amox 1
Controle positivo
0,33
Amox 2
Controle positivo
0,66
Amox 3
Controle positivo
1,33
PVAc-co-PMMA
Amostra
0
PVA/PVAc-co-PMMA
Amostra
0
PVAc-co-PMMA 1% (org)
Amostra
0
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (org)
Amostra
0,25
PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
Amostra
0,60
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
Amostra
0
Solução Extratora
Amox = amoxicilina; PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
* Concentração estimada
Os testes foram realizados em duplicata, utilizando-se dois conjuntos de placas.
Em um primeiro conjunto, o microorganismo que foi inoculado foi a Escherichia coli
DH5alfa (ATCC 53868), que é sensível à amoxicilina, o que faz deste microorganismo
o controle positivo do ensaio. Em um outro conjunto de placas, o microorganismo que
foi inoculado foi a Pseudomonas aeruginosa PAO1, que é resistente à amoxicilina,
sendo este o controle negativo. Os tamanhos dos halos observados nas placas foram
determinados com o auxílio de uma régua.
240
Teste de liberação de fármacos
Em um recipiente com volume exato, pesou-se uma certa quantidade de amostra
(polímero ou amoxicilina) e adicionou-se um meio extrator, que consistia de uma
solução aquosa de lauril sulfato de sódio 1% (m/v). O recipiente foi então agitado em
shaker horizontal HS-250 (IKA, Germany) por 2 horas a temperatura ambiente, para
promover a extração da amoxicilina para o meio extrator. Após o período de extração,
foi determinada a concentração do fármaco na solução extratora por absorção na região
do UV-VIS ou por cromatografia líquida.
•
Absorção na região do UV-Vis
A absorbância dos extratos aquosos foram determinadas utilizando espectrofotômetro UV-Vis
(Lambda 35, Perkin-Elmer, EUA) para leituras de varredura entre as regiões de 200-700 nm e
em comprimentos de onda específicos de 228 e 274 nm, correspondentes aos dois picos de
absorção da amoxicilina trihidratada neste meio extrator. A solução aquosa de lauril sulfato de
sódio 1% foi utilizado como branco, para fins de calibração do equipamento. A determinação da
concentração de amoxicilina no meio foi calculada a partir de equações geradas com curvas de
calibração, obtidas com soluções de concentrações conhecidas de amoxicilina no meio extrator
para os dois comprimentos de onda específicos (conforme Capítulo 2).
•
Cromatografia líquida de alta eficiência
A concentração de amoxicilina liberada nos extratos aquosos de algumas amostras foi
determinadas por cromatografia líquida. Para isto, utilizou-se um sistema cromatográfico modelo
Elite Lachrom (Merck, EUA), equipado com detector DAD e utilizando coluna C-18 250 x 4
mm, com poros de 10 µm (Teknokroma). A metodologia experimental seguida foi referente ao
método de detecção para amoxicilina comprimidos (USP, 2008).
241
Resultados
Com base nos resultados obtidos do teste de liberação do fármaco para o meio
extrator, foi observado que algumas amostras do copolímero de PVAc-co-PMMA
liberaram amoxicilina para a solução extratora. Resta apenas saber se esta “amoxicilina”
liberada está em sua forma ativa; ou seja, inibindo o crescimento de microorganismos
sensíveis a ela.
Como a concentração obtida no primeiro teste de liberação foi muito baixa, para
poder observar uma inibição de crescimento bacteriano, um novo procedimento de
extração foi realizado, aumentando-se a relação polímero/solução extratora, a fim de
obter extratos com maiores concentrações do fármaco. A Tabela A.2 traz os resultados
da atividade antimicrobiana dos extratos obtidos a partir de algumas amostras de
copolímeros de PVAc-co-PMMA e PVA/PVAc-co-PMMA. Além dos extratos
poliméricos, foram testados quanto a atividade antimicrobiana a solução extratora de
LSS 1% (branco), soluções de amoxicilina preparadas com a solução extratora de LSS
1% e um disco padrão comercial contendo uma quantidade determinada de amoxicilina.
Tabela A.2 – Atividade antimicrobiana do extrato aquoso de copolímeros pelo método de
difusão em ágar (técnica do disco).
Polímero
Amostra
Branco
Amox 1
Amox 2
Amo 3
Padrão
PVAc-co-PMMA
-
-
25,0 ± 1,4
23,0 ± 1,4
25,0 ± 1,4
32,0 ± 2,8
PVA/PVAc-co-PMMA
-
-
26,0 ± 2,8
25,0 ± 1,4
23,0 ± 4,2
30,0 ± 8,5
PVAc-co-PMMA 1% (org)
-
-
22,0 ± 8,5
26,0 ± 5,7
25,0 ± 4,2
39,0 ± 9,9
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (org)
-
-
26,0 ± 0,0
25,0 ± 1,4
25,0 ± 1,4
38,0 ± 0,0
PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
-
-
27,0 ± 1,4
27,0 ± 1,4
28,0 ± 0,0
30,0 ± 0,0
PVA/PVAc-co-PMMA 1%(aquo)
-
-
26,0 ± 0,0
25,0 ± 1,4
26,0 ± 0,0
25,0 ± 4,2
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
*Diâmetro do halo de inibição em mm para placas com E. coli; Média ± Desvio padrão, n= 2
Controle Negativo (Pseudomonas aeruginosa) = não foi observada inibição do crescimento para nenhum disco
242
Antes da análise dos dados obtidos nos testes microbiológicos, é importante
frisar que os resultados descritos anteriormente na Tabela A.2 são meramente
qualitativos, embora os testes tenham sido feitos em duplicata e seguindo todas as
recomendações para testes de atividade microbiana. O motivo da não interpretação
quantitativa dos resultados é a baixa precisão associada à medida dos halos.
Algumas conclusões podem ser tomadas com base nos resultados apresentados
na Tabela A.2. A primeira delas é que o teste foi bem realizado, ao passo que o
microorganismo sensível (E. coli) e o resistente (P. aeruginosa) comportaram-se de
acordo com o esperado. A segunda conclusão foi quanto aos resultados das soluções
controle (branco e padrões de amoxicilina). A solução extratora não inibiu o
crescimento da bactéria, o que era um comportamento esperado. Além deste, outro
comportamento esperado foi a inibição do crescimento da E. coli pelas três soluções
contendo amoxicilina (amox 1, amox 2 e amox 3) e também pelo disco padrão.
Embora qualitativamente os controles positivos tenham se comportado conforme
previsto, “quantitativamente” eles apresentaram algumas divergências. A primeira delas
ficou por conta do tamanho dos halos observados para as soluções de amoxicilina, já
que as amostras possuíam concentrações distintas do fármaco, o que deveria gerar halos
de tamanhos diferentes. A segunda divergência foi em relação ao tamanho dos halos
gerados pelos discos comerciais padrões de amoxicilina. Segundo informações do
fabricante, o disco deveria gerar um halo de 16-22 mm, usando E. coli ATC 25922. Os
resultados obtidos foram ligeiramente superiores a esta faixa; porém, como dito
anteriormente, estão de acordo com o esperado. Além disso, é importante recordar que o
tamanho do halo gerado teoricamente depende do tipo de microorganismo utilizado e da
concentração de antibiótico, entre outro fatores.
243
Pelos resultados preliminares de liberação do fármaco, era esperado que apenas
as amostras de PVA/PVAc-co-PMMA 1% (fase orgânica) e PVAc-co-PMMA 1% (fase
aquosa) liberassem amoxicilina para a solução extratora, fazendo com que essas
amostras inibissem o crescimento microbiano. Os demais extratos poliméricos não
deveriam promover a inibição do crescimento microbiano, por não conterem
amoxicilina ou não liberá-la para o meio.
Os extratos poliméricos que não continham amoxicilina, ou onde esta não era
liberada, conforme especulações realizadas nos testes de liberação do fármaco,
comportaram-se de forma esperada: não inibiram o crescimento do microorganismo.
Este resultado, de certa forma, contribui para reforçar o argumento do modelo gerado e
também para comprovar que a matriz polimérica pura (PVAc-co-PMMA ou
PVA/PVAc-co-PMMA) não possui atividade antibacteriana. Contudo, as soluções dos
polímeros que teoricamente liberariam amoxicilina para a solução extratora não
inibiram o crescimento microbiano. Este resultado, a princípio, levou à formulação das
seguintes hipóteses:
•
Não ocorreu liberação de amoxicilina para a solução extratora testada;
•
Ocorreu liberação de amoxicilina em quantidades insuficientes para inibir o
crescimento bacteriano;
•
Ocorreu a liberação de uma amoxicilina sem ação antimicrobiana.
Para tentar responder essas hipóteses, utilizou-se a mesma metodologia de
leitura dos extratos na região do UV-Vis, para determinar a concentração de fármaco
nos extratos testados. Esses resultados são apresentados na Tabela A.3. Diferentemente
dos testes de liberação do fármaco, o procedimento de extração foi realizado apenas
uma vez. As leituras em 228 nm não foram computados, pois muitas delas extrapolaram
244
a escala de absorção na região do UV-Vis. Desta forma, assim como realizado
anteriormente, para fins de quantificação apenas os dados calculados na região de 274
nm foram considerados.
Tabela A.3 – Concentração de amoxicilina nas soluções poliméricas utilizadas nos ensaios
microbiológicos.
228 nm
Amostra
274 nm
A
Conc Amox
(µg/mL)
A
Conc Amox
(µg/mL)
PVAc-co-PMMA
-
-
-
-
PVA/PVAc-co-PMMA
-
-
-
-
PVAc-co-PMMA 1% (org)
-
-
0,10 ± 0,00
74,38 ± 0,00
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (org)
-
-
0,23 ± 0,00
179,77 ± 0,00
PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
-
-
1,16 ± 0,00
120,54 ± 0,00
PVA/PVAc-co-PMMA 1% (aquo)
-
-
0,02 ± 0,00
15,92 ± 0,00
PVAc = poli(acetato de vinila); PMMA = poli(metacrilato de metila); PVA = poli(álcool vinílico).
% = concentração de amoxicilina adicionada ao meio de reação; Média ± Desvio padrão para n = 2 (leituras).
Comparando-se os resultados da Tabela A.3 com os dados de liberação de
fármaco apresentados no Capítulo 2, observa-se que a concentração de amoxicilina
presente nos extratos foi significativamente superior, sendo possível identificar a
liberação de fármaco inclusive em polímeros onde antes isso não foi possível. Este
perfil era esperado pois, intencionalmente, a proporção polímero/solução extratora foi
alterada, para que houvesse uma maior liberação de amoxicilina para o meio aquoso. É
importante observar que os novos resultados obtidos corroboram os perfis apresentados
anteriormente no Capítulo 2.
Apesar de uma maior quantidade de amostra, essas concentrações ainda foram
muito baixas e não atingiram a meta de 660 µg/mL, o que garantiria um conteúdo de
10µg de amoxicilina por disco, valor este igual ao de um dos padrões positivos. Para se
ter uma idéia da baixa concentração dos extratos, a amostra de PVA/PVAc-co-PMMA
245
1% (fase orgânica), com 180 µg/mL, só garante aproximadamente cerca de 2,7 µg de
amoxicilina no disco teste, o que não é uma quantidade apreciável do fármaco para que
um halo de inibição qualitativo pudesse ser observado.
Embora os resultados de espectrofotometria na região do UV-Vis tenham
permitido quantificar a liberação da amoxicilina, esta técnica possui algumas limitações.
A principal delas é a absorção do polímero na mesma faixa de comprimento de onda da
amoxicilina, que pode estar influenciando os resultados, mesmo que a absorção do
polímero tenha sido descontada nos cálculos. Para avaliar de fato a presença da
amoxicilina nos extratos, esses foram analisados por cromatografia líquida, que utiliza
um princípio de separação e detecção mais preciso. As Figuras A1 , A2 e A3 ilustram os
multicromatogramas da amoxicilina padrão, do extrato de PVAc-co-PMMA e do
PVAc-co-PMMA com 1% de amoxicilina incorporado na fase aquosa da suspensão,
respectivamente.
Figura A1 – Multicromatograma da Amoxicilina pura.
246
Figura A2 – Multicormatograma do extrato de PVAc-co-PMMA puro.
Figura A3 – Multicromatograma do extrato de PVAc-co-PMMA com 1% de amoxicilina
(adição na fase aquosa).
247
Os multicromatogramas são gráficos bastantes ilustrativos pois, além da relação
“absorção x tempo” de retenção, eles também trazem a intensidade da absorção em
função dos diversos comprimentos de onda. Conforme observado na Figura A1, que
traz o multicromatograma da amoxicilina padrão, este fármaco possui seu pico de
absorção facilmente identificado por uma grande absorção no tempo de retenção de 5
minutos. A Figura A2, referente ao PVAc-co-PMMA, possui dois picos de retenção em
20-25 minutos e 35 minutos aproximadamente, que provavelmente é uma absorção
associada ao polímero que foi solubilizado no meio aquoso. Em ambos os gráficos, o
pico na região entre 0-5 minutos é referente à solução extratora de LSS 1%.
A Figura A3, referente à amostra de PVAc-co-PMMA com 1% de amoxicilina
incorporada na fase aquosa da suspensão, apresentou um pequeno pico de absorção em
5 minutos, que é correspondente à amoxicilina. Entretanto, por ser um pico de baixa
intensidade, não foi possível determinar a concentração da amoxicilina nesta amostra,
mas apenas assinalar sua presença. O multicromatograma para este extrato também
apresentou picos de absorção referentes à solução extratora de LSS 1% e também ao
provável pico do polímero em 20-25 minutos. Os demais extratos das outras amostras
poliméricas testadas nos ensaios microbiológicos e que “continham” amoxicilina
apresentaram a mesma interpretação feita para a Figura A3. Devido ao baixo teor de
amoxicilina nas amostras/extratos, o pico específico da amoxicilina em 5 minutos teve
uma difícil identificação, o que impossibilitou quantificação da amoxicilina nos extratos
pela técnica de cromatografia.
As soluções padrões de amoxicilina tiveram seus resultados de concentrações
confirmados com alta precisão tanto pela técnica de UV-Vis quanto pela técnica
cromatográfica. A não quantificação da amoxicilina dos extratos poliméricos, pela
248
técnica de cromatografia, pode ser um indício de uma superestimação dos resultados de
UV-Vis, ou apenas uma baixa concentração de fármaco nos extratos.
Desta forma, das três hipóteses anteriormente levantadas, aparentemente a
primeira delas, “Não ocorreu liberação de amoxicilina para a solução extratora
testada”, poderia ser descartada, já que foi “observada” a presença de amoxicilina tanto
pela técnica de UV-Vis quanto pela técnica cromatográfica. A hipótese “ocorreu
liberação de amoxicilina em quantidades insuficientes para inibir o crescimento
bacteriano” ainda parece ser a mais concordante com os resultados reunidos até então,
embora não se tenha provado de fato que a amoxicilina manteve sua atividade
antimicrobiana intacta. Esses questionamentos levam a considerar que também não é
possível descartar a última hipótese levantada, de que “ocorreu liberação de uma
amoxicilina sem atividade antimicrobiana”.
Como de fato nenhuma hipótese foi comprovada e nem descartada, é sugerido
que novos testes, com concentrações mais elevadas da amoxicilina no meio reacional,
sejam realizados para comprovar a atividade antimicrobiana do fármaco após a sua
incorporação na matriz polimérica, além de seu perfil de liberação. No entanto, parece
muito claro que as quantidades de fármaco liberadas na condição presente são pequenas,
havendo talvez a necessidade de aperfeiçoar a estrutura da partícula para aumentar a
liberação no meio. Outra sugestão seria a realização destes testes segundo uma outra
metodologia, em que as partículas poliméricas com fármacos incorporados sejam
introduzidas diretamente no meio de cultura. Desta forma, seria avaliada a atividade
antimicrobiana da partícula polimérica como um todo – e não apenas do fármaco
incorporado nas partículas.
249
Teste
de
liberação
prolongada
de
fármacos
No Capítulo 2 foi demonstrado que a amoxicilina incorporada in situ durante as
reações de copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de metila pode ser
extraída quando colocada em contato com uma solução extratora. Entretanto, caso as
micropartículas sejam usadas em procedimentos de quimioembolização, será necessário
conhecer o perfil de liberação do fármaco incorporado nas micropartículas.
Seguindo algumas metodologias, [101, 201-203] foi testada de forma preliminar
a liberação prolongada da amoxicilina. Esta metodologia, que utiliza um Aparato T
(Figura A4), tenta simular uma difusão do medicamento da partícula para o meio
extrator, conforme provavelmente aconteceria no sistema vascular. Desta forma, é
possível acompanhar a difusão do medicamento por longos períodos (24h – 72 h).
Figura A4 – Esquema da vidraria Aparato T conectada à bomba de circulação e ao aparelho de
UV-Vis.
250
Metodologia experimental
Material
Polímero com faixa de tamanho estreita, bomba de circulação, banho de
refrigeração, placa de agitação magnética com aquecimento, solução aquosa de LSS
1%, eppendorff, espátula, proveta de 250 mL, becher de 200 mL e vidraria Aparato T
com as seguintes dimensões: L = 20 cm; d1 = 1,5 cm; d2 = 1,0 cm; h1 = 10,0 cm; h2 =
5,5 cm.
Metodologia
1) Em um becher, colocar 200 mL de solução SLS 1%. Posicionar o becher em
uma placa com sonda de controle de temperatura e ajustar para 37°C. Colocar
também uma pequena barra magnética e iniciar uma agitação “bem fraca” da
solução.
2) Posicionara sonda do UV/VIS no becher com a solução de SLS 1% e “zerar” o
aparelho no comprimento de onda específico de leitura do medicamento.
3) Posicionar o Aparato T em uma posição adequada, com o auxílio de um suporte
e garras. Conectar as mangueiras do banho de refrigeração. Ligar o banho de
refrigeração, ajustando a temperatura para 40°C.
4) Em um eppendorff, pesar aproximadamente 0,1 g da amostra de polímero seco.
Anotar o peso. Conectar o eppendorff ao Aparato T.
5) Conectar as mangueiras do Aparato T na bomba e no becher – que já está com a
sonda e a Sol. SLS 1%.
6) Acionar a bomba para uma vazão de 50 mL/min, garantindo que o líquido
preencha todo o sistema.
251
7) Assim que a bomba for acionada, iniciar a aquisição de dados. Programar o
computador para fazer leituras a cada 5 minutos por um período total de 24h
(tempo total do experimento).
8) Após o fim do experimento, descartar o eppendorff e o polímero. Lavar toda a
vidraria usada e circular água destilada pelas mangueiras da bomba antes de
iniciar um novo procedimento.
Observações:
-­‐
Usar amostras com faixa de tamanho estreita. Usar conjunto de peneiras para
garantir esta faixa de tamanho.
-­‐
Ao invés de Sol SLS 1%, pode-se fazer o experimento com Solução Tampão
Fosfato (PBS), pH 7.4.
Resultados
Utilizando o polímero PVA/PVAc-co-PMMA + 3% de amoxicilina (Capítulo 3),
o gráfico apresentado na Figura A5 foi obtido e indica que de fato há uma liberação
prolongada do fármaco. Entretanto, conforme demonstrado nas seções anteriores, faz-se
necessário comparar os resultados obtidos com o polímero sem amoxicilina, uma vez
que o PVA presente na partícula também se solubiliza na solução extratora,
promovendo absorção na mesma região de leitura da amoxicilina.
252
1.0
0.9
0.8
0.7
A
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tempo (horas)
Figura A5 – Perfil de liberação prolongada da amoxicilina extraída do copolímero PVA/PVAcco-PMMA + 3%.
253
Curvas de DSC
A seguir são apresentadas as curvas de calorimetria diferencial de varredura
(DSC) dos polímeros de PVAc e copolímeros de PVAc-co-PMMA apresentados no
Capítulo 2. Conforme descrito na seção de material e métodos do Capítulo 2, as análises
de DSC foram realizadas em um calorímetro DSC-7 (Perkin-Elmer), na faixa de -20 a
140 ºC e utilizando uma taxa de aquecimento de 10 ºC/minuto. Para a determinação dos
valores de Tg dos polímeros, considerou-se apenas a segunda rampa de aquecimentos,
para desta forma eliminar a história térmica do polímero analisado.
Nas páginas a seguir, são reportadas as curvas de DSC obtidas para os polímeros
mencionados.
254
Filename:
C:\Program Files\Pyr...\amostra6(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra6(marco)
Sample Weight: 18.200 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
30
28
Tg: Half Cp Extrapolated = 40.95 °C
Delta Cp = 0.678 J/g*°C
26
Heat Flow Endo Up (mW)
24
Onset = 37.16 °C
22
20
18
16
14
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/17/2008 2:56:48 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A6 – Curva de DSC do PVAc.
255
Filename:
C:\Program Files\Pyr...\amostra5(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra5(marco)
Sample Weight: 14.950 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
30
28
26
Tg: Half Cp Extrapolated = 40.43 °C
Delta Cp = 0.605 J/g*°C
24
Heat Flow Endo Up (mW)
22
Onset = 37.10 °C
20
18
16
14
12
10
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/10/2008 3:25:03 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A7 – Curva de DSC do PVAc + 0,1% amoxicilina (fase orgânica).
256
Filename:
C:\Program Files\Pyr...\amostra2(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra2(marco)
Sample Weight: 11.430 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
25
Tg: Half Cp Extrapolated = 32.38 °C
24
Delta Cp = 0.558 J/g*°C
23
Onset Y = 23.0705 mW
Onset X = 138.62 °C
22
Onset = 28.18 °C
Heat Flow Endo Up (mW)
21
20
19
18
17
16
15
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/10/2008 12:56:45 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A8 – Curva de DSC do PVAc + 0,5% amoxicilina (fase orgânica).
257
Filename:
C:\Program Files\Pyr...\amostra4(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra4(marco)
Sample Weight: 16.630 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
40
35
30
Tg: Half Cp Extrapolated = 33.66 °C
Heat Flow Endo Up (mW)
Delta Cp = 0.540 J/g*°C
25
Onset = 29.86 °C
20
15
10
5
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/10/2008 3:31:05 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A9 – Curva de DSC do PVAc + 1,0% amoxicilina (fase orgânica).
258
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Program Files\Py...\amostra11(marco).dsd
Grazielle
amostra11(marco)
16.830 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
30
28
Tg: Half Cp Extrapolated = 41.39 °C
26
Delta Cp = 0.729 J/g*°C
Heat Flow Endo Up (mW)
24
Onset = 37.69 °C
22
20
18
16
15
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
1/15/2009 3:24:21 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A10 – Curva de DSC do PVAc + 0,1% amoxicilina (fase aquosa).
259
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Program Files\Py...\amostra12(marco).dsd
Grazielle
amostra12(marco)
20.190 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
30
28
Tg: Half Cp Extrapolated = 41.18 °C
Delta Cp = 0.700 J/g*°C
Heat Flow Endo Up (mW)
26
24
Onset = 37.48 °C
22
20
18
16
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
1/15/2009 3:27:09 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A11 – Curva de DSC do PVAc + 0,5% amoxicilina (fase aquosa).
260
Filename:
C:\Program Files\Pyr...\amostra7(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra7(marco)
Sample Weight: 10.900 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
26
25
Tg: Half Cp Extrapolated = 29.44 °C
24
Delta Cp = 0.576 J/g*°C
23
Heat Flow Endo Up (mW)
22
Onset = 25.40 °C
21
20
19
18
17
16
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/17/2008 2:19:17 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A12 – Curva de DSC do PVAc + 1,0% amoxicilina (fase aquosa).
261
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Program Files\Py...\amostra15(marco).dsd
Grazielle
amostra15(marco)
17.060 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
18.88
30
18
28
16
26
Tg: Half Cp Extrapolated = 57.41 °C
14
Delta Cp = 0.305 J/g*°C
24
Heat Flow Endo Up (mW)
22
Onset = 51.41 °C
10
20
8
18
6
16
4
Derivative Heat Flow (mW/min)
12
2
14
0
12
-2
10
-19.97
-2.491
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
1/28/2009 3:53:19 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A13 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA.
262
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Program Files\Py...\amostra16(marco).dsd
Grazielle
amostra16(marco)
12.460 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
12.72
28
12
27
26
10
25
8
24
Tg: Half Cp Extrapolated = 62.22 °C
Derivative Heat Flow (mW/min)
Heat Flow Endo Up (mW)
Delta Cp = 0.242 J/g*°C
6
23
Onset = 50.62 °C
22
4
21
2
20
19
0
18
17
-19.97
-2
-2.264
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
2/12/2009 4:43:11 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A14 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA + 0,1% amoxicilina (fase orgânica).
263
Filename:
C:\Program Files\Py...\amostra10(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra10(marco)
Sample Weight: 17.560 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
14.27
14
28
27
12
26
10
25
8
Tg: Half Cp Extrapolated = 36.52 °C
Delta Cp = 0.176 J/g*°C
23
6
Derivative Heat Flow (mW/min)
Heat Flow Endo Up (mW)
24
22
Onset = 30.62 °C
4
21
20
2
19
0
18
-19.97
-0.5136
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/17/2008 1:27:31 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A15 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA + 0,5% amoxicilina (fase orgânica).
264
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Program Files\Py...\amostra14(marco).dsd
Grazielle
amostra14(marco)
17.090 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
22.8
35
22
34
20
32
18
30
16
28
14
26
Heat Flow Endo Up (mW)
Delta Cp = 0.202 J/g*°C
12
24
10
22
Onset = 48.95 °C
8
Derivative Heat Flow (mW/min)
Tg: Half Cp Extrapolated = 54.99 °C
20
6
18
4
16
2
14
0
12
-2
10
-19.97
-2.653
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
1/28/2009 2:54:47 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A16 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA + 1,0% amoxicilina (fase orgânica).
265
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Program Fil...\amostra17(leilane)dsd.dsd
Grazielle
amostra17(leilane)
19.450 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
35
34
32
30
Tg: Half Cp Extrapolated = 66.53 °C
28
Delta Cp = 0.319 J/g*°C
Heat Flow Endo Up (mW)
26
24
Onset = 56.65 °C
22
20
18
16
14
12
10
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
7/20/2009 2:31:37 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A17 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA + 0,1% amoxicilina (fase aquosa).
266
Filename:
Operator ID:
Sample ID:
Sample Weight:
Comment:
C:\Pro...\amostra14(marco)@090128142731.dsd
Grazielle
amostra13(marco)
12.430 mg
PerkinElmer Thermal Analysis
26.12
12.34
12
25
10
24
Tg: Half Cp Extrapolated = 63.56 °C
23
Delta Cp = 0.338 J/g*°C
8
6
Onset = 49.07 °C
21
20
4
Derivative Heat Flow (mW/min)
Heat Flow Endo Up (mW)
22
19
2
18
0
17
16
-2
15
-19.97
-2.75
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
1/28/2009 3:10:45 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A18 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA + 0,5% amoxicilina (fase aquosa).
267
Filename:
C:\Program Files\Pyr...\amostra8(marco).dsd
Operator ID:
Sample ID:
amostra8(marco)
Sample Weight: 11.010 mg
Comment:
PerkinElmer Thermal Analysis
25
24
23
Tg: Half Cp Extrapolated = 82.32 °C
Delta Cp = 0.214 J/g*°C
22
Onset = 78.43 °C
Heat Flow Endo Up (mW)
21
20
19
18
17
16
15
-20
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
100
120
140
12/10/2008 4:02:38 PM
1) Hold for 1.0 min at -20.00°C
2) Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
3) Cool from 140.00°C to -20.00°C at 100.00°C/min
4)
5)
Hold for 3.0 min at -20.00°C
Heat from -20.00°C to 140.00°C at 10.00°C/min
Figura A19 – Curva de DSC do PVAc-co-PMMA + 1,0% amoxicilina (fase aquosa).
268
Ressonância Magnética Nuclear
Nas páginas a seguir são apresentadas espectros de ressonância magnética
nuclear (RMN) de outras amostras de polímeros de PVAc e copolímeros de PVAc-coPMMA que não foram apresentados no Capítulo 2 e no Capítulo 3.
Conforme descrito na seção de material e métodos do Capítulo 2, as análises de
13
C-RMN foram realizadas em equipamento Varian UNIT-Plus (Varian Analytical
Instruments, EUA), operado a 100 MHz e equipado com sonda de 10 mm de diâmetro
interno. Para o preparo das amostras, utilizou-se clorofórmido deuterado (CDCl3; δ =
77.16 ppm). O tetrametilsilano (TMS) foi usado como referência interna e manteve-se a
temperatura em aproximadamente 25 ºC em todas as análises.
Os espectros de 1H-RMN são referentes às amostras reportadas no Capítulo 3 e
conforme descrito na seção de material e métodos do Capítulo 3, as análises foram
realizadas em equipamento Bruker DPX 300 (Bruker Co.), operado a 300 MHz e
equipado com sonda de 5 mm de diâmetro interno. Para o preparo das amostras,
utilizou-se dimetilsulfóxido deuterado (DMSO; δ = 2.5 ppm). O tetrametilsilano (TMS)
foi usado como referência interna e manteve-se a temperatura em aproximadamente 25
ºC em todas as análises.
269
Figura A20 – Espectro de
13
C-RMN do PVAc sintetizado com incorporação in situ de
Figura A21 – Espectro de
13
amoxicilina (0,1%) à fase orgânica da polimerização do acetato de vinila (Capítulo 2).
C-RMN do PVAc sintetizado com incorporação in situ de
amoxicilina (0,1%) à fase aquosa da polimerização do acetato de vinila (Capítulo 2).
270
Figura A22 – Espectro de
13
C-RMN do PVAc sintetizado com incorporação in situ de
amoxicilina (0,5%) à fase aquosa da polimerização do acetato de vinila (Capítulo 2).
Figura A23 – Espectro de 13C-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ
de amoxicilina (0,1%) à fase orgânica da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila (Capítulo 2).
271
Figura A24 – Espectro de 13C-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ
de amoxicilina (0,5%) à fase orgânica da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila (Capítulo 2).
Figura A25 – Espectro de 13C-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ
de amoxicilina (1%) à fase orgânica da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila (Capítulo 2).
272
Figura A26 – Espectro de 13C-RMN do PVA/PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in
situ de amoxicilina (1%) à fase orgânica da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato
de metila e posterior processo de saponificação (Capítulo 2).
Figura A27 – Espectro de 13C-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ
de amoxicilina (0,1%) à fase aquosa da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila (Capítulo 2).
273
Figura A28 – Espectro de 13C-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ
de amoxicilina (0,5%) à fase aquosa da copolimerização do acetato de vinila e metacrilato de
metila (Capítulo 2).
Figura A29 – Espectro de 13C-RMN do PVAc-co-PMMA (Capítulo 2).
274
Figura A30 – Espectro de 13C-RMN do PVA/PVAc-co-PMMA (Capítulo 2).
Figura A31 – Espectro de 1H-RMN do PVAc-co-PMMA (Capítulo 3).
275
Figura A32 – Espectro de 1H-RMN do PVA/PVAc-co-PMMA (Capítulo 3).
Figura A31 – Espectro de 1H-RMN do PVA/PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in
situ de amoxicilina (1%) à fase aquosa da copolimerização em suspensão do acetato de vinila e
metacrilato de metila e posterior processo de saponificação (Capítulo 3).
276
Figura A32 – Espectro de 1H-RMN do PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in situ
de amoxicilina (3%) à fase aquosa da copolimerização em suspensão do acetato de vinila e
1
metacrilato de metila (Capítulo 3).
Figura A31 – Espectro de H-RMN do PVA/PVAc-co-PMMA sintetizado com incorporação in
situ de amoxicilina (3%) à fase aquosa da copolimerização em suspensão do acetato de vinila e
metacrilato de metila e posterior processo de saponificação (Capítulo 3).
277