Humanas

55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
1
Análise de amostras biológicas de cena de crime
para um futuro confronto em investigação de perfil de
DNA. Efeito dos reagentes dos testes presuntivos na
obtenção dos perfis de STR para identificação humana
Auler-Bittencourt, E1; Soares-Vieira, JA2; Angeramis, NG1; Silva, CE1; Hirschfeld, RCR1; Iwamura, ESM3
Instituto de Criminalística de São Paulo - Núcleo de Biologia e Bioquímica Laboratório de DNA, Brasil
Departamento de Medicina Legal, Ética Médica, Medicina Social e do Trabalho, Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo, Brasil
3
Escola Paulista de Medicina Universidade Federal de São Paulo EPM/UNIFESP (Departamento de Patologia) Brasil
1
2
Palavras-chave: testes presuntivos, manchas de sangue, DNA
O aumento das evidências de manchas de sangue, lavadas ou limpas para tentar mascarar a análise de perfis de
DNA para identificação humana, em cenas de crime tem aumentado o uso de testes presuntivos em amostras
encaminhadas aos laboratórios de DNA. Alguns dos testes presuntivos utilizados para identificação de manchas
de sangue e sêmen podem potencialmente afetar a recuperação do DNA de alto peso molecular dessas amostras,
ou mesmo esgotá-las, especialmente as que apresentam pouca quantidade de DNA. Após os testes presuntivos,
muitas vezes, essas amostras são descartadas. Este trabalho tem como objetivo analisar o perfil de DNA de
amostras submetidas aos testes presuntivos e as lavagens com alvejantes com cloro e sem cloro. Para tanto foram
conduzidos dois protocolos diferentes: a) Oito amostras de sangue humano in natura, com perfis previamente
conhecidos (controles), foram distribuídas em tecido de algodão, secas à temperatura ambiente, maceradas em
solução fisiológica, soro de Coombs e posteriormente armazenadas por três meses em diferentes temperaturas
(temperatura ambiente e freezer – 20oC). b) Uma outra amostra de sangue humano in natura do tipo sanguíneo
A já tipada através das técnicas de DNA (controle) foi utilizada. Alíquotas de 200 µL foram distribuídas em três
diferentes tipos de tecido: tecido de algodão, tecido tipo jeans e tecido tipo sintético. As amostras foram secas à
temperatura ambiente por 24 horas. As manchas depositadas nos três diferentes tipos de tecidos foram então
divididas em três grupos: manchas que não foram submetidas a lavagem, manchas submetidas a lavagem com
alvejante sem cloro e manchas submetidas a lavagem com alvejante com cloro e sabão em pó. As amostras foram
novamente secas à temperatura ambiente por 24 horas antes de serem submetidas ao Luminol. As amostras
foram submetidas à extração do DNA com Chelex 100 e amplificadas com o Kit Identifiler (Applied Biosystems)
segundo recomendações do fabricante. As manchas de sangue expostas à solução fisiológica e ao soro de Coombs
apresentaram perfis de DNA consistentes com as amostras não tratadas (controles). Esse resultado demonstra que
os peritos devem guardar as amostras submetidas à solução fisiológica e Soro de Coombs para futuro confronto de
DNA quando necessário. Além disso neste trabalho discutimos o padrão de manchas de sangue após as lavagens
com soluções alvejantes, bem como a quantidade de DNA obtida dessas amostras.
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Evaluation of two methods of DNA extraction from
human bones for forensic identification
Santos, S.M1,3; Fernandes, MCM2; de Sá Filho, AL1,2; Araújo Filho, VS4; Maia, MMD2; Souza, PRE2
Universidade de Pernambuco – Instituto de Ciências Biológicas.
Universidade Federal Rural de Pernambuco – Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA.
3
Instituto de Criminalística de Pernambuco – Núcleo de DNA Forense. 4Laboratório de DNA Forense da Paraíba.
[email protected]
1
2
Keywords: Molecular, Forensic biology, Freezer MilI, Bone.
The resolution of complex cases of human DNA identification from human remains as: bones, teeth, muscles and
blood, became possible after the advent of polymerase chain reaction amplification (PCR). The use of short tandem
repeat sequences (STRS) in order to determine genetic identity is one of the most important instruments of the
human molecular genetics being in view its proven importance for the legal- medicine practice, becoming an
indispensable tool in criminal investigations. In accidental cases as catastrophes, disappeared people, among others
situations, bones and teeth constitute biological material for DNA typing, because of theirs mineralized structure
of the bone, compared with other tissues, its has a delayed degradation process. Therefore, the aim of this study was
to compare two extraction methods of DNA adopting human bones in Forensic Laboratory for Genetic in Brazil.
Were selected 10 bones as distributed: 09 segments of femur and 01 humerus from cadavers not identified (01
exhumed, 03 founded in a reed, 03 carbonized and 03 found in forest) in different states of conservation. Soft tissues
had been remove from bones using scalpel and gauze. With the aid of one (Dremel 300) had been removed 02 discs
of each bone, in a total of 20 samples. The samples were thus divided on the following form: 01 disc of each bone
was sprayed through the Freezer Mill and submitted to the protocol that praises the complete demineralization
of the bone tissue and the 10 remaining discs had been submitted to the protocol of extraction of DNA of bone
without spraying. After the extraction, all the samples had been submitted the amplification, quantification and
sequencing, using appropriate equipment and kits. All 20 evaluated samples had had its successfully identified
nuclear autossomic DNA (nDNA) however, was observed a significant difference in the amount of DNA obtained.
Thus, we can conclude that the use of this technique of humam DNA bone extraction without spraying, could
significantly reduce the total cost of the process, being easily applied and still more efficient to recovery of the DNA.
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Desenvolvimento de sistema multiplex para
amplificação de Loci STR Do cromossoma Y: aplicação
em genética de populações e forense
Bernardo, S1,*; Oliveira, AM1; Silva, DA1,2; Carvalho, EF1
Laboratório de Diagnósticos por DNA, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Depto de Patologia e Laboratórios, FCM, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
*Bolsista de Iniciação Científica/pibic-uerj
[email protected]
1
2
Palavras-chave: STR cromossoma Y, PCR Multiplex, STR, Genética Forense, Y-STR
A identificação de indivíduos por DNA se baseia na obtenção de perfis genéticos resultantes da análise de
múltiplas regiões hipervariáveis presentes no genoma. Na espécie humana a metodologia é amplamente utilizada
por demanda judicial, dando suporte a decisões em esferas cíveis e criminais. No DNA, regiões polimórficas
encontram-se presentes em cromossomas sexuais, autossômicos e no DNA mitocondrial. Em apenas uma
diminuta fração do cromossoma Y se observa o fenômeno de recombinação gênica com o cromossoma X. Em
conseqüência, o cromossoma Y é transmitido quase que integralmente como um haplótipo de pai para filho, salvo
quando da ocorrência de eventos mutacionais. Na atualidade, é crescente a utilização de marcadores do tipo STR
(short tandem repeats) do cromossoma Y em estudos de ancestralidade e na área forense. Diante da crescente
aplicabilidade do cromossoma Y em genética forense, especialmente no tocante a crimes sexuais, desenvolver
metodologias que possibilitem uma análise fidedigna de evidências criminais onde quantidades diminutas de
material biológico são detectadas é um dos focos principais de pesquisadores com área de atuação em ciências
forenses. Comercialmente, são encontrados sistemas multiplexes capazes de amplificar vários loci STR em uma
única reação de PCR. Para a análise de regiões polimórficas Y- STR, o kit comercial AmpFℓSTR®Y-filer™ (Applied
Biosystems) vem sendo, em termos mundiais, largamente utilizado pelos laboratórios forenses. O objetivo inicial
deste trabalho foi desenvolver um sistema multiplex capaz de amplificar simultaneamente os loci: DYS 389I;
DYS 389II; DYS 393; DYS 460; GATA A10 e GATA H4 do cromossoma Y. O sistema ora desenvolvido apresenta
4 regiões em comum com o sistema comercial Y-filer e incorpora duas regiões que, apesar dos elevados graus
de polimorfismos, não fazem parte de produtos comerciais. Na padronização do sistema multiplex, amostras
de DNA controle (007) foram amplificadas a partir de diversas versões do hexaplex, as quais diferiam quanto
às concentrações dos diferentes primers. Nessa etapa, o objetivo era a obtenção de condição para a reação de
PCR que se relacionasse com a geração de iguais quantidades de produtos de amplificação para cada um dos loci
do sistema multiplex. De modo geral, amostras contendo 1,0 ng de DNA eram amplificadas por PCR, sendo os
produtos submetidos à eletroforese capilar (ABI Prism 3100 AVANT) e analisados com o software Gene Mapper
v3.2. O multiplex desenvolvido apresenta performance semelhante a do Kit Y-filer. Novas estratégias estão sendo
traçadas para que novos marcadores Y-STR sejam incorporados ao hexaplex com o objetivo de aumentar o seu
poder de discriminação. Após testes de validação, o sistema multiplex será utilizado em estudos populacionais e de
vínculo genético com a vantagem de proporcionar uma maior discriminação entre indivíduos uma vez que agrega
loci não anteriormente incluídos em outros sistemas multiplexes.
Apoio Financeiro: Programa DNA. Universidade do Estado do Rio de Janeiro e Tribunal de Justiça do Estado do Rio
de Janeiro.
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Analysis of DNA profiles extracted from degraded
samples from archival of formalin fixed tissue included
in paraffin (FFTIP) and hairs
Iwamura, ESM1; Soares-Vieira, JA2; Silva, MS1; Funabashi, KS1; Godoy,CD1; Munoz, DR2
Laboratorio de Patologia Molecular- Departamento de Patologia - Escola Paulista de Medicina/Universidade Federal de São Paulo Brazil
Departamento de Medicina Legal Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Paraffin-embedded, Archival samples, Hairs, DNA extraction, PCR, STR
The ability to study DNA extracted from archival of formalin fixed tissue included in paraffin (FFTIP) enables
valuable retrospective investigations. However, according to some authors is difficult to obtain genomic DNA of
good quality, since the process of fixation often results in fragmentation of DNA. During formalin fixation, crosslinks of protein-protein and protein-DNA interactions are formed. In addition, the formaldehyde in the tissue
gradually changes into formic acid, hydrolyzing the DNA. High quality DNA for amplification is a limiting factor
in such samples. The fixative used, inclusion and storage conditions can contribute to the degradation of DNA. In
order to evaluate the quality of DNA extracted, formalin fixed spleen and lung embedded in paraffin from necropsy
and hair with or without bulbs, using three methods of extraction (QIAmp DNA mini, QIAmp DNA micro, GFX kit
and fenol chlorophorm followed by Centricon 30) were tested. The amount of DNA recovered was quantified by
NanoDrop espectophotometer. The beta actin, amelogenin gene and the profile of STR were analyzed. Based on
experimental results, a general guideline concerning the appropriate extraction method according to the tissue
and the quantity of the starting material for the analysis of DNA from FFTIP and hairs could be suggested.
Finantial support: FAPESP Proc. Nº 2008/11233-8. Karina S. Funabashi is fellowship from Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) 2009-2011
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Tratamento de restos mortais para identificação
humana por análise de DNA: Aplicação em genética de
populações e forense
Ribeiro, AC1*; Carvalho, EF1; Silva, DA1,2
Laboratório de Diagnósticos por DNA, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Depto de Patologia e Laboratórios, FCM, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
*Bolsista de Iniciação Científica/pibic-CNPq
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Restos Mortais, Identificação Humana, Genética Forense, DNA
Introdução. A identificação humana por DNA é uma ferramenta poderosa em estudos de vínculos genéticos,
proporcionando uma vasta aplicabilidade nas diversas áreas da biologia molecular. Em estudos ou casos forenses,
essa metodologia é amplamente utilizada, devido seu alto grau de eficácia e rapidez nos resultados. Na resolução
de casos forenses, a partir de uma amostra biológica, mais precisamente um Resto Mortal, a determinação do
perfil genético é decisiva para a conclusão do caso em questão, já que, ao obtermos o perfil genético da amostra,
podemos provar efetivamente quem seria o doador do material analisado. O tratamento de Restos Mortais é
uma etapa que antecede ao processo específico de identificação humana por DNA, e tem um papel decisivo na
conclusão de casos forenses. Objetivo. Motivado pela escassez de material relacionado a metodologia de análise
voltada para o processamento deste tipo de amostra biológica, o objetivo inicial deste trabalho foi preparar um
manual de procedimentos e técnicas para o tratamento de restos mortais usados na detecção de perfis genéticos.
Metodologia. A metodologia empregada para a produção deste material didático envolveu a realização de três
etapas de trabalho: levantamento de procedimento de coleta, acautelamento e manipulação de amostras
biológicas baseado em dados da literatura e da rotina de trabalho do no laboratório de Diagnósticos por DNA da
Universidade Estadual do Rio de Janeiro. Resultado. Como resultado deste levantamento, foi elaborado um manual
de procedimentos técnicos para tratamento de amostras biológicas de restos mortais. Este manual oferece, além
da descrição dos procedimentos, um banco de imagens que proporciona uma melhor compreensão de cada etapa
deste processo, facilitando assim a reprodução desta metodologia pelos leitores. Conclusão. Este trabalho fornece
uma fonte tecnicamente detalhada, para todos os profissionais da área, que desejam realizar esse tipo de atividade.
Apoio Financeiro: Programa DNA. Universidade do Estado do Rio de Janeiro e Tribunal de Justiça do Estado do Rio
de Janeiro. CNPq.
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Uma alternativa na eliminação de interferentes em
amostras de DNA
Guimarães, FM1; Chassot, FGC1; Matte, CHF2
Faculdade de Biociências – PUCRS. 2Genética Forense – IGP/RS.
[email protected]
1
Palavras-chave: Maxwell,eliminação de interferentes, DNA forense.
Perícias comparativas de DNA auxiliam tanto na investigação policial quanto no processo judicial. Uma das análises
realizadas é a determinação da origem do sangue encontrado em materiais diversos que possam estar envolvidos
em algum ato criminoso. No entanto, esta determinação muitas vezes é impossibilitada devido à presença de
interferentes e baixa quantidade de DNA, os quais podem prejudicar as etapas de extração e/ou amplificação
do material genético. Neste trabalho, relatamos uma experiência vivenciada pelo Setor de Genética Forense do
Instituto-Geral de Perícias do Rio Grande do Sul em um caso de homicídio onde foi encontrado um corpo próximo
a um veículo incendiado. A investigação policial levou a um suspeito, na casa do qual foi encontrada uma faca com
sangue. Foram realizadas diversas técnicas para extração do material genético do sangue presente na faca, dentre
elas extração orgânica com membrana concentradora e extração orgânica com precipitação por isopropanol, sem
sucesso na obtenção de um perfil genético. Em uma última tentativa, utilizando-se o “DNA IQ Casework Sample Kit”
com o equipamento Maxwellâ LEV, que se baseia no princípio de lavagens do DNA ligado a partículas magnéticas, foi
possível a obtenção do perfil genético, sugerindo a presença de interferentes na amostra os quais foram eliminados
com a técnica de extração utilizada. Desta forma, o kit em questão demonstrou ser uma boa técnica de extração,
levando a produção de um material genético adequado para a análise, livre de inibidores.
Apoio Financeiro: IGP/RS e SENASP.
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Estojo de cartucho deflagrado: Uma possível fonte
de DNA
Chassot, FGC1; Guimarães, FM1; Baldasso, JP2; Matte, CHF3
Faculdade de Biociências – PUCRS. 2Balística Forense – IGP/RS. 3Genética Forense – IGP/RS.
[email protected]
1
Palavras-chave: DNA forense, estojo, deflagrado, degradada, balística, mitocondrial.
Cartuchos deflagrados são vestígios comumente encontrados em locais de crime cometido por arma de fogo.
Como resultado do disparo o cartucho fragmenta-se em duas partes: o projétil, que segue sua trajetória até
encontrar o alvo ou alcançar sua máxima trajetória no solo, e o estojo, que fica retido na arma ou é ejetado nas
proximidades do local do disparo. Entretanto, apesar de constituir, em muitos casos, a única evidência que
esteve previamente em contato com o atirador durante o carregamento da arma, testes de DNA raramente são
requisitados em estojos encontrados nas cenas de crime. Isso ocorre por acreditar-se que a baixa quantidade
de DNA, degradação por calor ou inibição da reação de PCR, dificultariam a obtenção de um perfil genético. O
presente trabalho teve por objetivo avaliar a possibilidade de obtenção de perfil genético, completo ou parcial,
a partir de estojos de cartuchos deflagrados cinco minutos após o carregamento da arma. A arma utilizada foi
uma pistola semi-automática, calibre.380 ACP, da marca Taurus, e os disparos foram realizados contra uma caixa
de tiro contínuo no Setor de Balística Forense do Instituto-Geral de Perícias do Rio Grande do Sul (IGP/RS). Os
estojos foram recolhidos e enviados ao Setor de Genética Forense – IGP/RS para a realização de coleta, extração,
amplificação, sequenciamento e genotipagem do material genético do atirador. A coleta do material biológico
dos estojos foi realizada por meio de duas metodologias: com auxilio de swab estéril umedecido em água ultrapura e friccionado por toda a superfície de 12 estojos e imersão em solução fisiológica de outros 12 estojos. A
extração de DNA foi realizada pelo método orgânico. As amostras foram submetidas à amplificação por PCR
para DNA nuclear utilizando-se os kits comerciais AmpFlSTR® IdentifilerTM e AmpFlSTR®MiniFilerTM e para DNA
mitocondrial utilizando-se primers específicos para a região hipervariável 1 (HV1). A quantificação dos produtos
amplificados foi feita em gel de agarose 1%. Sequenciamento e genotipagem foram feitos no equipamento ABI
PRISMTM 3100-Avant Genetic Analyser, com auxílio dos softwares Sequencing Analysis v5. 1.1, Chromas e Clustal-X.
Até o presente momento uma das amostras testadas apresentou perfil genético mitocondrial coincidente com
o do atirador, demonstrando assim que há possibilidade de utilizar-se estojos de cartuchos deflagrados como
fonte de DNA. Mais amostras serão adicionadas ao estudo, assim como outras regiões serão sequenciadas.
Apoio Financeiro: IGP/RS e SENASP.
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Implementação de banco de dados de frequências
alélicas de STRs autossômicos para fins forenses na
população de Santa Catarina
Moreti, T; Torres, SRR; Sauerbier, TS; Junior, OS; Sereia, AFR; Farias, T; Coelho, CC; Souza, IR
Laboratório de Polimorfismos Genéticos – BEG – CCB - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC.
* Instituto Geral de Perícias de Santa Catarina - Setor de Genética Forense.
Palavras-chave: Banco de dados, frequências alélicas, Genética Forense, Santa Catarina, STR.
Devido à baixa qualidade e à exiguidade das amostras biológicas que rotineiramente aportam em um laboratório
de DNA forense, a metodologia aplicada é baseada na análise de STRs. Nos casos de identificação utilizando STRs,
o laboratório deve possuir uma base de dados de frequências alélicas própria da população a qual presta serviços.
O objetivo deste trabalho é ampliar as condições técnico-científicas no cenário estadual catarinense através da
implementação de um banco de frequências alélicas de STRs autossômicos, avaliando parâmetros estatísticos
de interesse forense relacionados aos exames de identificação nestes marcadores. A amostra constitui-se de 452
indivíduos não relacionados do estado de Santa Catarina, representando uma população tri-híbrida, composta
principalmente pela mistura de indivíduos descendentes de europeus, africanos-subsaarianos e ameríndios. O
banco de dados foi construído através da análise de 15 locos STRs autossômicos: CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA,
D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, utilizando o conjunto
comercial AmpFℓ STR® IdentifilerTM PCR Amplification. O levantamento da distribuição alélica revelou que os
locos com menor e maior número de alelos foram, respectivamente, o TH01 com 6 alelos e o FGA com 19 alelos.
A maior frequência observada foi a do alelo TPOX*8, com 0,496. Os resultados relativos aos cálculos de poder de
discriminação demonstram que os locos com maior poder de discriminação são: D18S51 (96,9%), D2S13 (96,8%) e
FGA (96,7%). O loco com menor poder de discriminação é TPOX, com 84%. O poder de discriminação acumulado
para os 15 locos STRs analisados foi de 1 – 1,71535-18 = 0,99999999999999999828465. Os cálculos dos parâmetros
forenses revelaram que a probabilidade de coincidência variou entre 1 em 6,2 (TPOX) e 1 em 32,2 (D18S51). Em
relação ao índice de conteúdo de polimorfismo (PIC) todos os locos apresentaram valores significativos (maiores
que 0,5), demonstrando-se bastante informativos. O maior polimorfismo indicado pelo PIC foi observado para
D18S51 (PIC = 0,86) e o menor para TPOX (PIC = 0,62). Os resultados dos cálculos dos parâmetros forenses em
relação à paternidade indicam o loco D18S51 como o loco com maior poder de exclusão, 70,4% e maior índice
típico de paternidade, 3,44 e, o loco TPOX com o menor poder de exclusão, 29,1%. O poder de exclusão acumulado
para os 15 locos STRs analisados foi de 0,99999682066. As distribuições dos genótipos estão em equilíbrio HardyWeinberg, X2(30) = 30,603005, p=0,435106. O loco D18S51 apresentou a maior heterozigosidade (85,5%) e o loco TPOX
a menor (60%). Finalmente, os parâmetros forenses calculados mostraram que o banco de dados de frequências
alélicas de Santa Catarina é uma ferramenta útil para a identificação pessoal, justificando seu uso para a população
do estado.
APOIO: CAPES//UFSC/IGP-SC.
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Importância dos bancos de perfis genéticos criminais
no âmbito forense
Szczerbicki, CPGM1; Leite, FPN2; Carvalho, BA3
Pós-Graduanda em Biologia e Genética Forense da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul.
Perito do Instituto-Geral de Perícias do Rio Grande do Sul e Professor do Curso de Pós-Graduação em Biologia e Genética Forense da
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: banco de perfil genético, DNA, marcadores genéticos, identificação humana, genética forense.
Os avanços na tecnologia de DNA e a utilização de polimorfismos genéticos têm facilitado a criação de bancos de
dados de indivíduos, com o propósito de investigação criminal. Assim, várias possibilidades foram abertas para
esse fim, e se forem comparados os perfis genéticos obtidos de evidências encontradas em cenas de crimes (como
exemplo sangue, cabelo, saliva e esperma) com os perfis de DNA de amostras armazenadas em bancos de dados,
pode-se localizar o autor de um crime mais facilmente. Dados de 2007 da Polícia Federal mostram que apenas 6%
dos homicídios foram elucidados sendo uma das taxas mais baixas do mundo, diferente do que é verificado em
outros países. Estes dados mostram ainda que no Rio de Janeiro este número cai ainda mais, ficando entre 3 e 4%.
Em São Paulo, onde 24% dos inquéritos são arquivados, a taxa está entre 10 e 12%. Em países onde a legislação na
área de DNA está mais avançada, a taxa de elucidação de crimes é bem maior. Na Argentina é de 45%, nos EUA é
de 65%, na França é de 80% e na Inglaterra chega a 90%. Além de sugerir a criação de bancos de dados criminais, a
International Criminal Police Organization (Interpol) tem estabelecido protocolos com vários países para a troca
de dados destes mesmos bancos criminais, visando obter informações de criminosos que muitas vezes estão
com seus perfis genéticos já arquivados. A implementação dos bancos de perfil genético criminal apresentou um
efeito profundo, em termos de aplicações forenses específicas, nas tecnologias moleculares. Eles têm alterado a
paisagem do sistema de justiça criminal e remodelado o campo da ciência forense, principalmente por fornecerem
a possibilidade de identificação de indivíduos e resolução de casos nos quais não existem suspeitos. Ao se construir
um banco de dados operacional para armazenamento e comparação de informações genéticas, as informações
geradas devem ser úteis ao maior número de casos possíveis e, para isto, deve incluir além de dados sobre as
regiões STR presentes no DNA nuclear, as tipagens de DNA mitocondrial (mtDNA), sempre que cabível. Isto, em
virtude de que é comum a identificação de esqueletos a partir da análise de mtDNA. No âmbito nacional, o Brasil
iniciou no mês de maio os primeiros passos para a implantação de um banco de perfil genético, onde assinou um
acordo com o FBI, para a utilização do software CODIS (Combined DNA Index System), que já vem sendo utilizado
em mais de 30 países. Portanto, torna-se imperioso que se unam forças para a implantação de um banco de dados
de DNA nacional, compatível com os sistemas internacionais, para que a polícia brasileira dê um passo importante
em direção à tecnologia, conforme já ocorre em outras partes do mundo.
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Utilização de 48 marcadores bialélicos do tipo
INDEL informativos de ancestralidade em estudos
populacionais e forenses
Francez, PA; 1Silva, RS; 2Ribeiro-Rodrigues, EM; 2Santos, SEB.
1,2
Laboratório de Genética Forense da Polícia Técnico- Científica do Amapá.
Laboratório de Genética Humana e Médica da Universidade Federal do Pará.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Genética forense, INDEL, Etnia, Ancestralidade.
A biologia molecular foi utilizada pela primeira vez na área forense em 1995 na Inglaterra, por Jeffreys, Brookfield e
Semeor em um caso de imigração ilegal. Um ano depois Jeffreys, utilizando minissatélites, identificou o estuprador
e assassino de duas pessoas (Jeffreys et al., 1994). Os marcadores do tipo INDEL (inserção e deleção) são muito
freqüentes no genoma humano e apresentam distintas vantagens em estudos populacionais e forenses, tais como
a baixa taxa de mutação, menor risco que os STRs de interpretações incorretas de alelos, amplicons menores
(50 pares de base ou menos) que permitem trabalhar com DNA degradado, etc. (Weber et al., 2002). Em 2002
Weber et al. identificaram e caracterizaram 2000 polimorfismos bialélicos de inserção-deleção (indels) no genoma
humano. A grande adaptabilidade dos indels para a amplificação de DNA degradado combinada com a facilidade
de tipagem e com este altíssimo poder de descriminação torna os MULTINDELS uma poderosa plataforma para
a determinação de identidade genética pelo DNA (Pena, 2004). Neste estudo, foram empregados 48 marcadores
bialélicos informativos de ancestralidade do tipo INDEL para estimar o percentual de contribuição étnica para
os três grupos parentais da população brasileira em uma amostra de 130 indivíduos da cidade de Macapá. Os
dados genéticos foram comparados com os resultados obtidos em relação a características físicas dos voluntários
(etnia e cor da pele) obtidas por auto-avaliação e hetero-avaliação. Também se verificou a eficiência da utilização
destes marcadores na estimativa de ancestralidade em três cadáveres desconhecidos esqueletizados submetidos
a exame de DNA na POLITEC-AP e em três amostras de sêmen coletadas de vítimas de estupro. Observou-se
uma forte correlação entre os percentuais de contribuição étnica observados pelos marcadores do tipo INDEL
e as características físicas dos voluntários. Em todos os seis casos criminais investigados a amplificação dos
48 marcadores INDEL foi bem sucedida e as estimativas de ancestralidade foram coerentes com os resultados
obtidos pela antropologia forense (no caso das ossadas) e por uma enquete (nos casos de violência sexual). Com os
resultados apresentados, acreditamos que os Multindels podem se tornar uma ferramenta efetiva em estudos de
Genética de Populações bem como em investigações forenses.
Apoio financeiro: POLITEC-AP e UFPA
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Análise de marcadores genéticos fenotípicos humanos
associados à pigmentação de pelo, pele e olhos
Neitzke-Montinelli, V¹; Ürményi,TP¹; Rondinelli, E¹; Moura-Neto, RS2; Silva, R¹
¹Laboratório de Metabolismo macromolecular Firmino Torres de Castro – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
2
Laboratório de Biologia Forense – Instituto de Biologia - UFRJ.
[email protected]
Palavras-chave: polimorfismo, mc1r, melanina, freqüência alélica e forense.
Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) são marcadores promissores para análises forenses devido à sua
abundância no genoma humano, baixa taxa de mutação, análise automatizada e aumento potencial de sítios
analisados devido à redução no tamanho do fragmentos de DNA que são produzidos. Os marcadores de SNPs
poderão desempenhar um papel importante em análises de amostras forenses complicadas, tais como, amostras
muito degradadas, devido ao tamanho do fragmento; reconstrução familiar para pessoas desaparecidas e restos
humanos não identificados; tanto quanto para prover ferramentas que ajudarão na investigação em casos que não
há suspeitos, restringindo o número de possíveis suspeitos através de análises que indicam alguma característica
física. Para análise deste último caso são utilizados marcadores fenotípicos, que através da identificação de SNPs
associados com o fenótipo, é possível a inferência de características físicas do indivíduo. Neste trabalho, o alvo do
estudo é o gene do receptor de melanocortina-1 (mc1r). O mc1r pertence à família de receptores acoplados à proteína
G conhecidos como receptores de melanocortina (MCRs). O gene mc1r localiza-se no cromossomo 16q24.3, sem
íntron e possui uma ORF de 951pb que codifica uma proteína de 317 aminoácidos. Este receptor é bastante expresso
em melanócitos e melanomas e é responsável pela regulação entre a produção de eumelanina e feomelanina. SNPs
descritos neste gene resultam em um fenótipo ruivo e de pele muito clara, já que estas variantes promovem perdade-função do receptor, levando a uma predominante produção do pigmento feomelanina. O objetivo do trabalho
é analisar os polimorfismos de parte da região promotora e da região codificante do gene mc1r humano e associálos à pigmentação da pele, pelo e olhos. Foram coletadas amostras de 54 voluntários de diferentes fenótipos e
analisadas 27. Estes foram submetidos a um questionário e declaração de consentimento livre e esclarecido. As
regiões, promotora e codificante, foram amplificadas e em seguida seqüenciadas, possibilitando a detecção do
polimorfismo, análise do genótipo e da freqüência dos alelos. Resultados preliminares das freqüências de duas
variantes da região promotora mostrou que para o SNP rs3212346, a freqüência do alelo G é de aproximadamente
93%, semelhante ao encontrado na população Européia, não sendo encontrada em heterozigose. Já o rs3212345,
há a predominância do alelo C, cerca de 64%, não havendo semelhanças com as freqüências vistas em populações
Européias, Africanas nem Asiáticas. Já na região codificante, não foram encontradas variantes que levassem a
uma mudança fenotípica. Foi observado o polimorfismo Trp160Arg, considerado um forte indicador para ruivos e
pele clara, que em heterozigose não expressou o fenótipo. Além disso, polimorfismos descritos em alta frequência
em determinadas regiões geográficas, como Leu60Val e Ser171Ala, foram observadas, e que tiveram associação
fenotípica com a população de origem dos indivíduos.
Apoio Financeiro: FAPERJ, PIBIC, CNPq.
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Variabilidade Genética de Cinco SNPs associados à
estatura na população de Belém
Takeshita, LYC¹; Vasconcelos, JM¹; Pedroza, LSRA¹; Maia, MHT²; Lima, CPS¹; Oliveira, LF¹; Barbosa, CM¹;
Sastre, D¹; Henderson, BLR¹; Castro, APG¹; Santos, EJM¹
¹Laboratório de Genética Humana e Médica – Instituto de Ciências Biológicas – UFPA. ²Laboratório de Biologia Evolutiva e Conservação
de Vertebrados - Instituto de Biociências - USP
Palavras-chave: polimorfismo genético, SNP, estatura, PCR em tempo real
Dentre as diversas características quantitativas na espécie humana, a estatura adulta é uma das mais interessantes,
por se manter estável por boa parte da vida adulta, fácil de ser aferida e com uma elevada herdabilidade (80-90%).
Entretanto, apenas recentemente estudos de associação por triagem genômica em larga escala validaram 52 SNPs
(Single Nucleotide Polimorphisms) como associados à estatura. Os cinco loci com maior significância - rs4896582,
rs2282978, rs6060373, rs1042725 e rs6763931, estão próximos aos genes GPR126, CDK6, GDF5-UQCC, HMGA2 e
ZBTB38, respectivamente. Visto que a descrição dos polimorfismos destes SNPs em populações humanas é restrita
a poucas populações africanas, caucasóides e asiáticas, o objetivo do presente estudo foi descrever a variabilidade
genética destes SNPs em amostras da população de Belém. Foram genotipados 84 indivíduos não aparentados,
representativos da população de Belém, com idade entre 20 e 50 anos. A genotipagem foi realizada através de
discriminação alélica por PCR em tempo real. As frequências dos alelos menos frequentes para os SNPs estudados
foram: 45% (rs4896582*G; N=83), 40% (rs2282978*C; N=84), 36% (rs6060373*G; N=73), 38% (rs1042725*C; N=47)
e 38% (rs6763931*A; N=51). As frequências alélicas observadas nos SNPs rs1042725, rs2282978 e rs6060373 foram
semelhantes às frequências alélicas em populações caucasianas, referidas na literatura. Já as freqüências do SNP
contido em rs6763931 assemelharam-se à frequência alélica em chineses. As frequências alélicas do locus rs4896582
(45% para o alelo G) mostrou-se diferente das descritas para europeus (27%) e asiáticos (27-33%) e africanos (0%).
Como a população de Belém é miscigenada, possuindo em torno de 50% de europeus, 20% de africanos e 30% de
amerindios, é provável que a elevada frequência deste alelo reflita altas frequências dele em ameríndios. Assim o
presente resultado permite inferir indiretamente que as populações indígenas amazônicas possuem este alelo em
alta frequência, diferindo-se dos demais grupos étnicos. Este é a primeira descrição da variabilidade destes loci em
populações brasileiras.
Apoio Financeiro: UFPA, CNPq
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Ancestralidade genômica em duas tribos indígenas do
norte do Brasil
Bomfim, TF1; Acosta, AX1,3; Quieiroz, AMDGR1; Galvão-Castro, B1,4; Abe-Sandes, K1,2
Laboratório Avançado de Saúde Pública - LASP/CPqGM/FIOCRUZ;
Universidade do Estado da Bahia – UNEB;
Faculdade de Medicina – UFBA;
Fundação Baiana para o Desenvolvimento das Ciências.
[email protected]
Palavras-chave: Ancestralidade, Ameríndios, Polimorfismos.
O processo de povoamento das Américas é ainda bastante discutido no que se refere ao tempo, ao número de
ondas migratórias e ao tamanho das populações ancestrais. A teoria mais recente, com base em dados do DNAmt,
postula que a população Ameríndia foi formada a partir de uma única onda migratória de asiáticos através do
Estreito de Bering ocorrida entre 11.000 e 19.000 anos atrás. A dispersão dessa população no território brasileiro,
ocorreu de forma heterogênea, hoje observada maior concentração ao norte do país. Estima-se que até o ano
1500 viviam no Brasil 2,4 milhões de Ameríndios. Com o descobrimento do Brasil e a chegada dos colonizadores
portugueses e dos escravos africanos (grande contingente de imigrantes composto em sua maioria por homens),
no período colonial, estes imigrantes entraram em contato com a população nativa e desse contato tri-híbrido
originou-se a população brasileira. A convivência dos europeus com os ameríndios gerou diversos problemas
que contribuíram para a diminuição do desta população no Brasil, como, por exemplo: introdução de doenças
infecciosas, o trabalho escravo e os conflitos constantes de cultura e costumes e pela posse da terra. Estima-se
que hoje existem aproximadamente 326.000 ameríndios no Brasil. Neste trabalho investigou-se a ancestralidade
genômica em 262 indivíduos pertencentes a 2 tribos indígenas do norte do Brasil (Tiriyó e Waiampi), com o
objetivo de avaliar fluxo gênico e estimar a porcentagem de mistura genética com outras populações. Para isto,
foi utilizando 8 marcadores informativos de ancestralidade (AT3, APO, Sb19.3, PV92, CKMM, FYnull, LPL e GC).
As frequências desses marcadores nas tribos indígenas do Brasil foram bastante similares às encontradas em
Nativos Americanos da America do Norte, sugerindo homogeneidade entre essas populações e possivelmente
origem comum. A freqüência do alelo 1 foi 0,25; 0,98; 0,31; 0,95; 0,74; 0,97; 0,25; 0,22 e 0,74 respectivamente para
os marcadores AT3, APO, Sb19.3, PV92, CKMM, FYnull, LPL, GC-1F e GC-1S. Avaliando a estimativa de mistura
populacional através do programa ADMIX 3, considerando o modelo de miscigenação triíbrido, não foi detectado
mistura nas duas tribos. Outras análises utilizando ADMIX 2, considerando o modelo diíbrido ameríndia-européia
ou ameríndio-africana na formação dessas 2 tribos, observou-se que as contribuições européias e/ou africanas
apresentaram percentuais insignificantes. Em vista disso pode-se concluir que, a despeito do intenso processo de
miscigenação ocorrido no Brasil, algumas tribos ainda apresentam perfil genético bem homogêneo, mantendo e
conservando as características ancestrais, tanto cultural como biológica.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde
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Analysis of PPARα and MMP9 polymorphisms in a
population from Cuiabá – Mato Grosso
Mazzotti, DR1; Furuya, TK1; Ota, VKA1; Chen, ES1; Jacomini, A2; Cordeiro, B2; Magalhães, C2; Singulane C2;
Potrich T2; José F2; Borsatto-Galera, B2; Smith, MAC1
Morphology and Genetics Department – Federal University of Sao Paulo
Medical Genetics and Molecular Biology Unit – University of Cuiaba
[email protected]
1
2
Keywords: polymorphisms, PPARα, MMP9, dyslipidemia, Cuiabá
Cardiovascular diseases and dyslipidemia are among the most important modern life disorders and thus a global
public health problem. Several polymorphisms have been studied as genetic risk factors for these diseases, including
variations in genes involved in lipid metabolism, as PPARα, and extracellular matrix degradation, like MMP9. This
study aimed to associate PPARα L162V, PPARα +2498G>C (Intron 7) and MMP9 -1562C>T polymorphisms with
prevalent and age-related diseases in a population of 497 middle-aged and elderly subjects living in Cuiabá – Mato
Grosso. The whole population was constituted of white (43.5%), brown (37.9%), black (16.9%), asian origin (1.4%) and
other origins (0.4%) individuals. PPARα 162V allele frequency was 4.63% (N=205), PPARα +2498C allele frequency
was 27.9% (N=448) and MMP9 -1562T allele frequency was 9.91% (N=444). These allele frequencies were similar
to others found in European and Brazilian populations. PPARα L162V polymorphism did not follow the HardyWeinberg equilibrium distribution, confirming our previous findings from our group in a Brazilian elderly population
from São Paulo, despite of the different ethinic composition between these two populations. Our findings also
showed significant associations between PPARα 162V and +2498C alleles and dyslipidemia (p=0.012 and p=0.009,
respectively). PPARα 162V allele was previously associated with metabolic sysndrome features,corroborating our
findings. Moreover, PPARα +2498C allele was associated with atherosclerosis progression, a trait highly related to
dyslipidemia. Besides, we found a tendency of association between MMP9 -1562C allele and dyslipidemia (p=0.067).
Therefore, these findings will lead to a better comprehension of the physiopathology of these genes in the Brazilian
population and the characterization of risk factors for these complex diseases might be useful in their diagnosis,
prognosis and treatment.
Financial Support: CAPES, CNPq, FAPESP and FAPEMAT
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Análise da frequência alélica de 18 polimorfismos de
inserção Alu em uma amostra de euro-descendentes
Pereira, JF1; Araújo, LJ1; Ferreira, RS3; Barbosa, AAL3; Abé-Sandes, K2,4; Sousa, SMB3; Rios, DLS1,2
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – UEFS/FIOCRUZ, 2Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da
Bahia - UNEB, 3Departamento de Ciências Biológicas - UESB, 4Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - FIOCRUZ-BA
[email protected].
1
Palavras-chave: Etnia, Euro-descendentes, genética de populações, inserção Alu e polimorfismos.
Os polimorfismos de inserção Alu são altamente informativos em estudos de genética de populações, permitindo
sua utilização como instrumento de investigação para caracterizar a composição genética de diferentes povos,
uma vez que possui freqüências diferenciadas para cada etnia. Com o objetivo de caracterizar as freqüências
alélicas de 18 marcadores de inserção Alu, que apresentam um grande diferencial de freqüência entre africanos/
europeus/asiáticos, foi escolhida uma amostra constituída por 92 indivíduos de origem européia provenientes
de Ribeirão Preto - SP, foram selecionados apenas os indivíduos que informaram ter os quatro avós do mesmo
grupo étnico (Abé-Sandes, 2002). Estas amostras foram coletadas no Hemocentro de Ribeirão Preto. Utilizouse a técnica de PCR-multiplex seguida de PAGE não-desnaturante a 8% e a visualização das bandas foi feita
através da coloração com nitrato de prata. Estes dados foram utilizados para cálculos de frequências alélicas,
Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), utilizando-se o programa GENEPOP. Dos 18 polimorfismos analisados, os
loci Ya5ACA647, Ya5AC1982, Yb8NBC157 e Ya5NBC150, foram os que apresentaram maior freqüência alélica para
ausência da inserção Alu, sendo que apenas os loci Ya5ACA647 e Ya5NBC150 apresentaram similaridade com as
freqüências alélicas de populações européias. Dos 18 loci analisados seis não estavam em Equilíbrio de HardyWeinberg (Ya5ACA1441, Ya5NBC327, Ya5ACA1242, Ya5NBC45, Ya5AC1982 e Ya5ACA1002) sendo que dois podem
ser explicados por déficit de heterozigotos (Ya5NBC45 e Ya5ACA1441) e quatro por excesso de heterozigotos
(Ya5NBC327, Ya5ACA1242, Ya5AC1982 e Ya5ACA1002). Portanto o excesso de heterozigotos explica melhor os
desvios para o EHW que ocorreu nas amostras. Efeitos de amostragem e mistura étnica recente, poderiam também
explicar os desvios observados nestas amostras. Diante destes resultados são necessários a utilização de um maior
número de marcadores informativos de ancestralidade no intuito de verificar a ocorrência do pequeno número
de loci que apresentaram similaridade com as freqüências alélicas de populações européias, embora os dados
de europeus disponíveis na literatura sejam de frequências alélicas de populações alemãs e a amostra de eurodescendentes estudada tenha ascendência portuguesa seguida de italiana.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESB.
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Freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo
T3111C na região 3’UTR de hCLOCK em uma amostra
da população de Alagoas
Figueredo, DS¹; Marques, TEBS¹; Oliveira, MNS¹; Gitaí, DLG²; De Andrade, TG¹
¹Laboratório de Biologia Molecular e Expressão Gênica. Universidade Federal de Alagoas, Campus Arapiraca.
2
Setor de Genética e Biologia Molecular, ICBS, UFAL, Maceió.
[email protected]
Palavras-chave: Ritmos circadianos, SNPs, Clock. PCR-RFLP, cronotipo
Os ritmos circadianos, envolvidos em diversos eventos fisiológicos e comportamentais, são determinados
geneticamente e modulados por fatores exógenos, como a luz. A maquinaria molecular central responsável pela
produção destes ritmos consiste em um conjunto de genes expressos em neurônios do Núcleo Supraquiasmático
(NSC), no Hipotálamo, e regulados por um complexo de retroalimentação ativador e supressor da transcrição
gênica. Muitas proteínas desta maquinaria atuam como fatores de transcrição, associando-se a regiões específicas
do promotor de diversos genes regulados pelo relógio biológico. De fato, muitos genes no genoma humano são
expressos ciclicamente, e suas funções são as mais diversas. Polimorfismos em genes circadianos como Clock
e Per foram associados à preferência circadiana (cronotipos) e distúrbios como síndrome do atraso de fase de
sono, distúrbio do déficit de atenção em adultos, desordem afetiva sazonal (SAD) e transtorno bipolar. O alelo
C de um polimorfismo na região não traduzida 3’UTR do gene Clock (T3111C) foi associado a uma tendência
para tipos vespertinos em diferentes populações. O estudo deste polimorfismo em uma amostra da população
do sudeste brasileiro não demonstrou, entretanto, essa associação. Neste caso, os autores argumentam sobre um
possível efeito mascarador da latitude ou a participação de outros genes. O presente trabalho tem por objetivo
analisar as freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo T3111C, em uma amostra da população de
Alagoas fenotipada para cronotipos matutinos, intermediários e vespertinos. Para a obtenção destes fenótipos,
170 sujeitos responderam ao questionário de Hörne-Ostberg para preferência circadiana. O DNA foi extraído
de 62 amostras de leucócitos obtidos de sangue periférico e a genotipagem realizada através de PCR-RFLP. As
freqüências encontradas para os alelos C e T na amostra estudada foram de 0.288 e 0.712, respectivamente. O
genótipo C/C apresentou 9,1%, T/T 51,5% e o heterozigoto 39,4%. Os dados de freqüência alélica e genotípica para
a população geral e para os subgrupos matutino (n=34) e vespertino (n=12) foram semelhantes aos apresentados
em estudo anterior no Brasil. Entretanto, os resultados para o subgrupo intermediário (n=20) mostram uma
freqüência maior do alelo C em nosso trabalho. No estudo anterior, nenhum homozigoto C/C foi relatado em um
total de 50 indivíduos intermediários estudados. A freqüência do alelo C foi de 0.160, correspondente aos 32% de
heterozigotos T/C encontrados. Em nosso trabalho, identificamos 3 indivíduos (15%) C/C, 7 (35%) T/C e 10 (50%)
T/T, com freqüências alélicas de 0.325 para C e 0.675 para T. Embora o número de amostras ainda seja insuficiente
para análises de associação, os resultados preliminares indicam uma diferença na freqüência do alelo C em um
subgrupo de indivíduos caracterizados com cronotipo intermediário, o que pode refletir um possível papel desta
variante polimórfica e do ambiente na modulação dos fenótipos circadianos observados.
Apoio Financeiro: FAPEAL.
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Polimorfismo Asp299Gly do TOLL-LIKE RECEPTOR-4
em amostras de Coari-Amazonas
Heckmann, MIO1; Cheli Batista, MJ2; Costa, AG1; Santos, JD1; Tomé da Conceição, JK1; Andrade Casseb,
A 2 3; Engracia, V2 3.
Instituto de Saúde e Biotecnologia – Universidade Federal do Amazonas, ISB-UFAM
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais, IPEPATRO
3
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: TLR4, Polimorfismo Asp299Gly, Coari-AM.
A imunidade inata é a primeira barreira de defesa imunológica humana contra inúmeros microorganismos, sendo
efetuada principalmente por células dendríticas e macrófagos, que expressam receptores de membrana, entre
estes os receptores Toll-Like (TLRs). Estes TLRs são uma família de receptores que em humanos compreendem
10 membros que identificam vários componentes bacterianos, parasitários e virais. O TLR4, reconhece
Lipopolissacarídeos (LPS) presentes em bactérias gram-negativas, além de outros componentes microbianos
como as âncoras de Glicosil-fosfatil-linositol de parasitas como os Plasmodium falciparum e Trypanosoma cruzi.
Este TLR possui dois polimorfismos que podem atenuar a resposta imune a esses componentes, sendo uma delas
a variação Asp299Gly. Deste modo o objetivo deste estudo é descrever a freqüência polimórfica deste marcador
em 100 indivíduos de Coari-Amazonas. O DNA foi extraído segundo o protocolo descrito por Higuchi, seguido
de PCR para a amplificação do fragmento de DNA. Após amplificação o fragmento foi visualizado em PAGE a
6% e corados com AgNO, confirmada a amplificação o fragmento foi submetido a digestão com a Enzima NcoI
e posteriormente visualizados. Para os cálculos das freqüências gênicas e equilíbrio em Hardy-Weinberg, foram
utilizados os programas GENIOC, através do pacote Fregen. A análise dos resultados demonstrou que somente três
indivíduos são heterozigotos (0,03) portadores do polimorfismo Asp299Gly do TLR4. Quando aplicado o teste de χ2
estes apresentaram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (χ2=0,025; p=0,1269). Na presente amostra as freqüências
obtidas são menores que as observadas em populações caucasóides, provavelmente dado a contribuição tri-híbrida
desta população e a elevada contribuição ameríndia nesta região. Em conclusão, foi observado que a freqüência
desta variação polimórfica é menor que em populações caucasóides, no entanto, futuras analises deverão ser
realizadas.
Apoio: UFAM; IPEPATRO.
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Estudo de freqüência do lócus -308 G/A, -244 G/A e
-238 G/A do gene TNFα
Delani D1; Andrade – Casseb, A1; Engracia, V1
1
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais
Palavras-chave: TNFα, SNPs, Rondônia, Malária, Polimorfismos Genéticos.
O fator de necrose tumoral é uma citocina envolvida na sepse, faz parte de uma superfamília de proteínas que
induzem necrose das células tumorais, e caracteriza-se como uma das moléculas mais importantes na promoção
da resposta inflamatória. Sua estrutura desempenha uma série de ações em vários sistemas orgânicos, sendo
produzido, sobretudo por macrófagos. A indução da resposta imune depende da expressão e co-estimulação de
moléculas e citocinas dos antígenos presentes na célula. A população de Rondônia é caracterizada por uma grande
variabilidade étnica, além de estar localizada em um ponto da Amazônia brasileira com vários tipos de patologias
tropicais predominantes. Essa exposição a endemias como a malária podem ter exercido uma pressão gênica
favorecendo o aparecimento de polimorfismos que possam estar associados diretamente com essas patologias.
Assim, espera-se analisar 03 mutações (-308, -244 e -238) localizadas no gene TNFα, em diferentes amostras
populacionais do estado de Rondônia calculando-se as freqüências gênicas e genotípicas destas amostras.
Foram selecionadas aleatoriamente 1000 amostras de 14 populações do estado de Rondônia e de mais duas
unidades hospitalares do município de Porto Velho – RO, onde foram coletados dados antropogenético e foi
realizada a anamnese. Foram coletados 10ml de sangue total, dentro dos padrões do CONEP sob o número de
aprovação (13356/REGISTRO NO CEP 051/6). A extração do DNA foi realizada através do método Brazol e para
analise das amostras estão sendo utilizadas às técnicas de PCR (reação em cadeia da polimerase), RFLP (análise
do polimorfismo do fragmento de restrição), seguidos de eletroforese em géis de agarose e poliacrilamida. Para
as análises estatísticas dos dados foi utilizado o Programa GENEPOP, (Version 3,4, 2003). Estimando freqüências
gênicas e genotípicas. Os dados estão armazenados em banco de dados SPSS 15.00. Seguindo esta metodologia
encontramos a freqüência do alelo GA para o lócus -308 foi de 0,0598 para o alelo GA (heterozigoto), em um total de
167 indivíduos estudados, (0,08 em Engenho Velho, 0,063 em Candelária, 0,058 em Cacoal/Jarú e de 0,103 em Bate
Estaca). Na distribuição alélica foi observado uma freqüência de 0,0299 para o alelo A (com a mutação), e 0.9701
para o alelo G (selvagem). Nos lócus -238 e -244 o alelo selvagem foi predominante, ou seja, a população em estudo
foi monomórfica em 53 indivíduos analisados, confirmando a prerrogativa de que as populações estudadas estão
em equilíbrio Hardy-Weinberg. Estas análises ainda não permitem realizar associações entre haplótipos do TNF
e as manifestações graves de infecção, devido o baixo número amostral analisado neste trabalho até o momento.
Análises estão em andamento a fim de estabelecer um perfil característico do gene TNFα na população em estudo,
e assim concluir os testes moleculares destas amostras.
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Distribuição alélica de ∆F508 em amostras de Coari Amazonas
Tomé-da-Conceição, JK1; Guimarães, M2; Alves, PH2; Costa, AG1; Santos, JD1; Andrade-Casseb, A2;
Engracia, V2; Heckmann, MIO1,2.
Instituto de Saúde e Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, ISB-UFAM
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais, IPEPATRO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ∆F508, Coari, Amazonas.
A Fibrose Cística é uma doença causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Condutance
Regulator). Segundo o Cystic Fibrosis Mutations Database atualmente encontram-se descritas 1604 mutações ao
longo deste gene, entre as diversas mutações uma deleção de 3 pb no códon 508 (∆F508) é a mais freqüente em
populações caucasóides. O estado do Amazonas é o maior estado Brasileiro, estudos moleculares que determinam
a freqüência da mutação DF508 são ausentes nesta região, sobretudo em relação a população do Médio Solimões.
Análises moleculares destas populações vêm contribuir para um melhor entendimento da formação da população
da região Norte, visto que, historicamente a participação do componente indígena é elevada. Neste trabalho foram
analisadas amostras de 179 indivíduos nascidos em Coari, estado do Amazonas e coletados durante consulta
médica nas dependências do Hospital Regional de Coari. Os testes moleculares foram iniciados pela extração de
DNA, realizada segundo o protocolo de Higuchi (1989), sendo seguida por PCR para amplificação do fragmento
de DNA, utilizando primers específicos. Após a amplificação o fragmento foi submetido à eletroforese em PAGE
a 6% e coradas com Nitrato de Prata a 10% para visualização dos fragmentos. Os resultados revelaram que em
amostras de indivíduos nascidos em Coari, região brasileira cujo povoamento deveu-se a uma grande contribuição
Ameríndia, a freqüência da mutação DF508 é nula. Estes resultados confirmam a baixa freqüência da mutação
DF508 em populações miscigenadas. Além disso, a completa ausência desta mutação nesta amostra pode ser
atribuída à elevada contribuição ameríndia da região Norte do Brasil.
Apoio: Fapeam, IPEPATRO
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Frequência dos fenótipos de grupos sanguíneos ABO
e a relação com ancestralidade em acadêmicos do
Instituto de Saúde e Biotecnologia/UFAM/Coari
Reis, RS; Guimarães, J; Taranto, CR; Gama, ASM; Fernandes, AB; Reis-Júnior, JD; Carvalho, V
[email protected]
Universidade Federal do Amazonas – Instituto de Saúde E Biotecnologia.
Palavras-chave: Grupos Sanguíneos, Acadêmicos, Ancestralidade, Amazonas, Instituto de Saúde e Biotecnologia
Na Região do Médio Solimões, pertencente ao Amazonas, os projetos de implantação do Gasoduto Manaus/Coari
e do Instituto de Saúde e Biotecnologia/UFAM/Coari contribuíram para imigração de indivíduos de outras regiões,
aumentando a variabilidade genética da população. Diversos polimorfismos são conhecidos nos componentes
do sangue humano, em especial nos antígenos dos sistemas de grupos sanguíneos ABO devido a sua rápida
classificação em diferentes fenótipos, o qual caracteriza-se pela expressão de antígenos protéicos e carboidratos
na membrana eritrocitária e identificados por anti-soros específicos. Estes polimorfismos são tradicionalmente
usados na estimativa da participação dos caucasóides (A, B e AB), negróides (O) e ameríndios (O) na constituição
de populações tri-híbridas brasileira, uma vez que estes marcadores, determinados geneticamente, possuem
proporções diferentes em cada população. A região do Médio Solimões teve como primeiros habitantes os indígenas,
sendo posteriormente colonizada por espanhóis e portugueses, estas migrações ao longo do tempo contribuíram
para o alto percentual de miscigenação brasileira. Com base nessas informações este estudo teve com objetivo,
determinar a freqüência fenotípica dos grupos sanguíneos ABO em amostras de acadêmicos do ISB/UFAM/
Coari. O estudo compreendeu uma amostra de 70 indivíduos, dos quais foram coletados dados antropogenéticos e
amostras de sangue e saliva. Para detecção dos fenótipos dos grupos sanguíneos ABO foram utilizadas as técnicas
de hemaglutinação direta, inibição da hemaglutinação e Dot-blot-ELISA. Os resultados da fenotipagem junto às
informações do questionário antropogenéticos foram tabulados em arquivo acess e comparados através do teste
de qui-quadrado. Nossos resultados indicaram que o alelo O (68%) é o mais frequente, corroborando com os dados
antropogenéticos que indicam que estes acadêmicos têm descendência amazonense, tendo sua origem ameríndia
e/ou negróide. Estes resultados preliminares corroboram com os relatórios de povoamento e elevadas taxas de
miscigenação da região do Médio Solimões na Amazônia.
Instituição de Fomento: PROEXTI/UFAM
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Frequência de fenótipos de grupos sanguíneos ABO
e a relação com ancestralidade em comunidades
ribeirinhas do Médio Solimões
Taranto, CR; Barros, HOQ; Gama, ASM; Fernandes, AB; Reis-Júnior, JD; Reis, RS; Carvalho, V; Guimarães, J.
Universidade Federal do Amazonas, Instituto de Saúde E Biotecnologia.
Palavras-chave: Grupos Sanguíneos, Ribeirinhos, Ancestralidade
A variabilidade genética presente em uma determinada população é condicionada por diferentes fatores, desde
seus fundadores até a diversidade de seu meio físico e sócio-cultural. Diversos polimorfismos são conhecidos nos
componentes do sangue humano, em especial nos antígenos dos sistemas de grupos sanguíneos ABO devido a
sua rápida classificação em diferentes fenótipos. Estes polimorfismos são tradicionalmente usados na estimativa
da participação dos caucasóides (A, B e AB), negróides (O) e ameríndios (O) na constituição de populações tri hibridas brasileira, uma vez que estes marcadores possuem proporções diferentes em cada população. A região do
Médio Solimões pertence ao Amazonas teve como seus primeiros habitantes indígenas os Muras, Irijus e Purus,
sendo posteriormente colonizada por espanhóis e portugueses, estas migrações ao longo do tempo contribuíram
para o alto percentual de miscigenação brasileira. Com base nessas informações este estudo teve com objetivo,
determinar as freqüências Fenotípicas dos grupos sanguíneos ABO em amostras de duas comunidades ribeirinhas.
O estudo compreendeu uma amostra de 91 indivíduos, 55 ribeirinhos da Comunidade da Costa do Itapéua e 36
ribeirinhos da Comunidade Costa do Jussara localizados em margens opostas do Médio Solimões, dos quais foram
coletados dados antropogenéticos e amostras de sangue e saliva. Para detecção fenotípica dos grupos sanguíneos
ABO foram utilizadas as técnicas de hemaglutinação direta, inibição da hemaglutinação e Dot-blot-ELISA. Os
resultados da fenotipagem junto às informações do questionário antropogenéticos foram tabulados em arquivo
acess e comparados através do teste de qui-quadrado. Nossos resultados indicaram que na comunidade do Itapéua
o alelo O (80%) é o mais freqüente, corroborando com os dados antropogenéticos que indicam que estes ribeirinhos
têm descendência amazonense tendo sua origem é ameríndia e negróides, para a Costa do Jussara observouse uma freqüência dominante do fenótipo A (36,1%), sendo relatada a região nordeste como originária de seus
parentais caucasóides. Estes resultados preliminares corroboram com os relatórios de povoamento e elevadas
taxas de miscigenação da região do Médio Solimões na Amazônia.
Instituição de Fomento: Fundação de Amparo a Pesquisa do Amazonas – FAPEAM
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Genotipagem do sistema sanguíneo Duffy em uma
comunidade de afros-descendentes de Saracura
(Santarém –PA)
Oliveira, TF; Martins da Silva, NA; Gomes Queiroz, M; Cardoso, GL; Guerreiro, JF
[email protected].
Universidade Federal do Pará. Instituto de Ciências Biológicas. Laboratório de Genética Humana e Médica.
Palavras-chave: afros-descendentes, duffy, resistência a malára, quilombolas, plasmodium vivax.
O sistema sanguíneo Duffy ou DARC (duffy antigen blood cell) é um grupo de glicoproteínas encontradas na
superfície exterior de membranas eritrocitárias, atuando como receptores para diversas quimiocinas, participando
na retirada destas da circulação sanguínea. E da mesma maneira, esses antígenos servem como “porta de entrada”
nos eritrócitos para certos microorganismos, tendo como principal exemplo, os merozoítos de um dos agentes da
malária, plasmodium vivax. Esse sistema inclui dois antígenos, Fya e Fyb, que condiciona respectivamente o alelo
FYA e o alelo FYB. O lócus do sistema sanguíneo Duffy está localizado no cromossomo 1, o qual é definido por três
alelos, Fya, Fyb e Fy0, sendo este último o resultado de uma mutação na região promotora deste gene (T-33C), a qual
bloqueia a sua expressão. Os genótipos FYA/FYA e FYA/FY correspondem ao fenótipo Fy(a+b-), o FYB/FYB e FYB/
FY ao Fy(a-b+), o FYA/FYB ao Fy(a+b+) e o FY/FY ao Fy(a-b-). O que confere grande importância a esse antígeno é
o fato de uma vez que o antígeno Duffy está ausente (Fy0), há dificuldade na invasão dos merozoítos nos eritrócitos
durante infecção por malária, e dessa forma o genótipo Fy0/Fy0 é considerado como resistente a doença, e mostrase mais freqüente em populações negras. O presente trabalho teve como objetivo investigar as distribuições das
freqüências genotípicas e alélicas do sistema sanguíneo Duffy na população de afro-descendentes de Saracura,
no município de Santarém (PA). Foram genotipados 38 indivíduos, e a caracterização genotípica foi realizada
por meio de reação em cadeia pela polimerase, utilizando-se quatro “primers” alelo-específicos que permitem a
identificação dos seis possíveis genótipos. A identificação dos produtos da PCR foi feita por meio de eletroforese
em gel de agarose a 2%. As freqüências genotípicas e alélicas foram estimadas usando-se o programa BIOESTAT 3.0.
Foram encontradas as seguintes freqüências genotípicas: Fya/Fya: 15,8%; Fyb/Fyb: 10,5%; Fy0/Fy0: 23,7%; Fya/Fyb:
23,7%; Fya/Fy0: 18,4%; Fyb/Fy0: 7,9%. Sendo importante ressaltar que o alelo Fy0 apresentou elevada freqüência,
correspondendo a uma constância de 37%. As freqüências genotipicas observadas no presente trabalho foram
estatisticamente diferentes das observadas no trabalho de Perna et al. (2007) que investigou várias comunidades
quilombolas da Amazônia, onde a freqüência do genótipo FY*0/FY*O (23,17%) foi quase 2 vezes menor no presente
trabalho. As elevadas freqüências observadas para o alelo FY*0 está de acordo com o esperado, uma vez que este
apresenta elevadas freqüências em comunidades remanescentes de quilombolas, e as diferenças estatísticas
observadas entre as amostras pode ser resultado de diferentes processos de composição étnica ocorrido entre
essas comunidades quilombolas da Amazônia.
Apoio Financeiro: UFPA.
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Padrões de diversidade dos genes do complexo NADPH
oxidase do fagócito: Evidência de seleção natural no
Neutrophil Cytosolic Factor 2 (NCF2) em populações
Asiáticas
Machado, M1; Lyon, F1; Cheen, R3; Burdett, L2; Crenshaw, A2; Yeager, M2; Chanock, S3; Tarazona-Santos, E1
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Intramural Research Support Program, SAIC Frederick, NCI-FCRDC, Frederick and Core Genotype Facility, NCI, NIH, Gaithersburg
3
Section of Genomic Variation, Pediatric Oncology Branch, National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH), Gaithersburg
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Granulomatose crônica, SNP, NCF2, NADPH oxidase.
A NADPH oxidase do fagócito é um complexo enzimático responsável pela explosão respiratória que catalisa
a redução do oxigênio molecular para O2- gerando espécies reativas de oxigênio (ROS), uma reação crítica para
a atividade microbicida dos fagócitos. Em células não-fagocitárias, a NADPH oxidase produz uma quantidade
substancialmente menor de O2- e, em alguns casos, alterações na sua produção podem estar associados às
doenças neurodegenerativas e prejuízo cardiovascular. A NADPH oxidase inclui duas subunidades polipeptídicas
membranares, gp91-phox and p22-phox (codificadas pelos genes CYBB e CYBA) e três subunidades citoplasmáticas,
p40-phox, p47-phox and p67-phox (codificados pelos genes NCF4, NCF1 e NCF2). Mutações em CYBB, CYBA, NCF1
ou NCF2 podem resultar na doença Granulomatose Crônica, uma imunodeficiência primária. O objetivo deste
estudo é determinar se a seleção natural tem modelado o padrão de diversidade de NCF2, o que estaria coerente
com diferentes estudos que têm evidenciado a importância da seleção natural na determinação da variabilidade de
genes do sistema imune em populações humanas. Para isso, resequenciamos 11596 bp de NCF2 em 102 indivíduos
sadios de populações Africanas (24), Européias (31), Asiáticas (24) e 23 Latino-americanos miscigenados e
comparamos os resultados com os padrões de diversidade de CYBB, CYBA e NCF4, parcialmente resequenciados
nos mesmos indivíduos. Para NCF2 encontramos 85 SNPs, incluindo 4 não-sinônimos, sendo dois deles comuns. A
diversidade e os parâmetros de recombinação para o NCF2 tanto quanto para o CYBB, CYBA e NCF4 são maiores
nos Africanos que nos não-africanos, o que está de acordo com a história demográfica das populações humanas.
Embora a maior parte dos padrões de diversidade sejam compatíveis com o modelo de equilíbrio mutaçãoderiva nas quatro populações estudadas, a variabilidade de NCF2 na Ásia apresenta uma estrutura haplotípica
particularmente diferenciada, com um haplótipo modal que é raro nas outras populações, baixa diversidade e um
excesso de sítios segregantes raros (D de Fu e Li = -2.67, p = 0.007). Esse padrão de diversidade é compatível com
a ação de seleção natural positiva atuando no NCF2 em populações asiáticas. As análises genéticas populacionais
estão sendo complementadas com inferências evolutivas sobre a ação da seleção natural na escala evolutiva
dos mamíferos, utilizando estimativas do parâmetro ω (razão de substituições sinônimas e não-sinônimas) em
diferentes domínios dos genes e com a análise do espectro mutacional em pacientes com granulomatose crônica.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPEMIG, NIH-USA
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Perfis das frequências alélicas nos loci STR D3S1358,
CSF1PO, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820,
D8S1179 na população brasileira
Neves, AF1,2; Saraiva, ACM1; Julião, JAS1; Amaro, S1; Ferreira, TRP1; Goulart, LR3.
Laboratório Biogenetics Tecnologia Molecular Ltda, Uberlândia – MG
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – GO
3
Laboratório de Nanobiotecnologia, Instituto de Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: PCR, STR, loci, vínculo genético, população brasileira.
Os polimorfismos STRs apresentam aplicações no mapeamento de doenças humanas, na construção de árvores
filogenéticas e nas identificações forenses. A interpretação correta dos dados destes polimorfismos depende das
diferenças encontradas nas distribuições das freqüências alélicas entre as populações. Embora apresente um
menor poder informativo comparado aos marcadores VNTRs, os loci STRs estão sendo cada vez mais utilizados
nas rotinas laboratoriais e testes de paternidade por meio de kits contendo quinze loci. Embora a utilização dos
STRs tenha aumentado nos últimos, poucos são os trabalhos publicados envolvendo análises destas regiões em
populações humanas. Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar a análise simultânea de sete
loci STRs visando aumentar as informações sobre a frequência destes marcadores na população brasileira. No
presente trabalho, foram avaliados os loci D3S1358 (N= 1056), CSF1PO (N= 1066), D18S51 (N= 996), D5S818 (N=
1069), D13S317 (N= 1063), D7S820 (N= 1066) e D8S1179 (N= 1063) após extração do DNA genômico e amplificação
simultânea por PCR com primers marcados. Após a amplificação, os loci foram analisados por eletroforese capilar
em seqüenciador automático e software específico. As freqüências dos marcadores STRs foram determinadas a
partir dos genótipos dos indivíduos. Foram verificados 11, 9, 19, 10, 8, 9 e 11 alelos para os marcadores D3S1358,
CSF1PO, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 e D8S1179, respectivamente. O lócus mais polimórfico foi D18S51,
corroborando com dados reportados para a população do estado do Rio de Janeiro e Caucasiana brasileira.
Comparando os alelos encontrados com as populações citadas, observou-se que no presente trabalho os loci
analisados foram mais polimórficos, provavelmente devido ao maior número de indivíduos analisados. Os dois
alelos mais freqüentes para cada lócus foram: 15 (0.3007) e 16 (0.2746) para D3S1358; 11 (0.2819) e 12 (0.3175) para
CSF1PO; 14 (0.1591) e 15 (0.1616) para D18S51; 11 (0.3326) e 12 (0.3526) para D5S818; 11 (0.2908) e 12 (0.3072) para
D13S317; 10 (0.2683) e 11 (0.2495) para D7S820 e; 13 (0.2908) e 14 (0.3072) para D8S1179. Todos os loci analisados
apresentaram-se em equilíbrio de Hardy–Weinberg (P> 0,05), com exceção de D3S1358 (P= 0,00103). Os resultados
apresentados sugerem que os marcadores STRs analisados neste trabalho são altamente polimórficos e podem ser
aplicados para fins de cálculos dos parâmetros estatísticos da análise de vínculo genético e forense na população
brasileira altamente miscigenada.
Apoio Financeiro: biogenetics tecnologia molecular LTDA, FAPEMIG, FINEP.
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Allelic frequencies and mutation rates of 15 STR loci
from Goiania-GO population
Silva, DM1,2,3; Silva, MB1; Costa, EOA1,3; Melo, COA1,3; de Melo, AV1; Godoy, FR1; Vieira, TC1,2; Rios, PS1;
Rodovalho, RG4; da Cruz, AD1,2,3,.
[email protected]
1
Núcleo de Pesquisas Replicon - Universidade Católica de Goiás.
2
Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, Superintendência Leide da Neves Ferreira, Secretaria do Estado de Saúde
de Goiás.
3
Programa de Mestrado em Genética, Universidade Católica de Goiás.
4
Laboratório Biocroma, Goiânia, Goiás.
Keywords: mutation rates, allelic frequencies, STR markers, Goiânia population, Central Brazil.
A total of 215 families comprised of 430 individuals from Goiania-GO were studied to report the mutation rates
and allelic frequencies of 15 microsatellites loci commoly used on forensics and paternity tests. All participants
contributed voluntarily with 5 mL of peripheral blood collected in vacutubes containing sodium heparin. Total DNA
was isolated from blood samples using the Ready Amp Genomic DNA Promega Kit© (Promega Corporation, USA)
and stored at -20o C until analysis. We isolated the genomic DNA from blood samples using Easy DNA Genomic
Kit (Invitrogen, USA) and stored at -20o C until analysis. The following DNA loci were analyzed by PCR: CSF1PO,
D8S1179, FGA, Amelogenin, vWA, D18S51, Penta E, TH01, D13S317, D5S818, D3S1358 and TPOX. PCR was carried
out with a themocycler IQ5 (Biorad, USA). All reactions were performed in a final volume of 12.5 µl and we used 100
ng of genomic DNA as a template. For DNA amplification of all loci, both reactions and termocycling procedures
followed the manufacters recommendations. To genotype, amplicons were visualized in the MEGABACE Automatic
Genotyping (GE HealthCare®) and analyzed using Fragment Profiler (Amersham Biosciences®). Every time a nonparental allele was observed, a complete PCR assay was carried out to ensure reproducibility of the result. To
verify mutation rates and allelic frequencies in the 15 STRs loci the software Arlequin 3.1 and PowerStats v.1.2
(Promega) were used. The results demonstrated that mutations rates varied from 0,8 to 3 x 10-4 mutations/locus/
generation, which corroborated to expected mutation rates. The loci FGA and Penta E showed the highest number
of alleles, both with 18 alleles. The biggest allelic frequencies were observed at allele 8 from TPOX marker. Others
statistical parameters were analyzed with high PIC, PD and PE in D18S51 locus. The allelic frequencies of Goiânia
population were compared to others Brazilian populations, according to the genetic distances (Fst values) obtained
by Arlequin software. No differences were observed in inter populational statistical analysis (p>0.05) and all STR
loci were in Hardy-Weinberg equilibrium. In this way, the aim of this study was to generate a genetic database using
mutational rates and allelic frequencies that could be used in paternity tests and human identification studies, due
to similarity showed with others Brazilian populations.
Supported by: CNPq, FAPEG, PROPE/UCG
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Distribuição alélica de 15 STR autossômicos de uma
Subpopulação de Pomeranos no estado do Espírito
Santo, Brasil
Malta, FSV2; Silva, BC1; Wolfgramm, EV1; Carvalho, FM1; Castro, AM2;Ferreira, ACS2; Paula, F1; Louro, ID1
Núcleo de Genética Humana e Molecular - Departamento de Ciências Biológicas Centro de Ciências Humanas e Naturais - Universidade
Federal do Espírito Santo.
2
Instituto Hermes Pardini – Departamento de Genética Humana.
[email protected]
1
Palavras-chave: Forense, Genotipagem, CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA,
Penta D, Penta E, TPOX, TH01 e vWA, Pomeranos.
População: Foram analisados 82 indivíduos da terceira maior população de descendentes de Pomeranos do mundo,
localizada nas regiões montanhosas do estado do Espírito Santo (ES), Brasil. Esses indivíduos vieram da região
da Pomerânia, localizada em uma porção da antiga Prússia. Durante a segunda guerra a região foi invadida e os
pomeranos foram expulsos de suas propriedades e muitos se refugiaram na Alemanha Ocidental, EUA, Austrália e
Brasil. Eles trouxeram vários costumes de sua cultura inclusive sua língua. Por muitos anos viveram isolados e por
esse motivo mantiveram suas características culturais e genéticas.
Objetivos: Avaliar a distribuição alélica de 15 marcadores STR autossômicos de 82 indivíduos descendentes da
população de Pomeranos.
Materiais e Métodos: As amostras de sangue foram coletadas de indivíduos voluntários residentes em 11 cidades
do ES, após terem assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, em tubos contendo EDTA e algumas
amostras foram coletadas no cartão FTA® Elute. O DNA foi extraído de acordo com o protocolo de extração descrito
por Miller (1988) e algumas amostras conforme as instruções do fabricante do cartão FTA. A amplificação dos
marcadores foi realizada pelo kit PowerPlex®16 (CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818,
D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TPOX, TH01, vWA e amelogenina). A análise dos fragmentos de DNA foi
realizada no sequenciador automático MegaBACEtm 4000 utilizando o programa Fragment Profiler. A distribuição
alélica foi calculada usando o programa Power Stats v.12.
Resultados e Discussão: Todos os marcadores STR estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg, com exceção do
marcador TPOX que apresentou P=0,0211. Os marcadores se mostraram bastantes polimórficos com destaque
para os loci D16S539 e FGA. Este é o primeiro estudo da frequência alélica dos marcadores CSF1PO, D13S317,
D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TPOX, TH01, vWA realizado
na população de descendentes Pomeranos localizada no estado do ES.
Apoio Financeiro: FAPES, Prodimol e Instituto Hermes Pardini.
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Microssatélites da região do MHC: um estudo de
seleção em populações ameríndias.
Nunes, K1; Santos, EJM2; Meyer, D1
1
2
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências – USP.
Instituto de Ciências Biológicas – UFPA.
Palavras-chave: populações ameríndias, seleção natural, microssatélites, MHC, HLA
O MHC (Major Histocompatibility Complex) é uma região de 4Mb do cromossomo 6 humano (6p21.31) na qual
encontra-se a maior concentração de genes do sistema imunológico. Muitos destes genes, em especial os HLA
(Human Leukocyte Antigens), apresentam em suas regiões codificadoras e/ou reguladoras, um padrão de variação
genética condizente com o esperado para regiões que estão ou estiveram sobre o regime de seleção balanceadora.
A seleção balanceadora mantém níveis de variabilidade populacional além do esperado sob neutralidade. Neste
caso, tal padrão é explicado pela co-evolução patógenos e hospedeiros. As populações ameríndias possuem uma
história evolutiva peculiar e apresentam um padrão de variação genética distinto das demais regiões do mundo,
com baixa variação intra e alta variação inter-populacional. O presente estudo busca testar se a pressão seletiva
sobre os genes da região do MHC nas populações nativas da América do Sul poderia resultar na diminuição da
diferenciação genética entre as populações. Para tanto, foram genotipados 7 microssatélites do MHC (D6S291,
D6S439, D6S2874, D6S2927, D6S2928, D6S105, D6S276) em 7 populações ameríndias da Amazônia (Arara, AwaGuajá, Katuena, Kayapó, Parakanã, Urubu-Kaapor e Zoé). Devido ao desequilíbrio de ligação com genes MHC,
os microssatélites desta região foram considerados marcadores sobre o efeito de seleção e foram comparados
com dados pré-existentes para populações ameríndias sul americanas de microssatélites espalhados pelo
genoma, os quais foram considerados marcadores neutros. Os valores de Fst encontrados entre os dois grupos
de microssatélites são similares (Fst = 0,185 e 0,147 para os marcadores do MHC e genômicos respectivamente).
Esse resultado corrobora estudos que compararam genes HLA e não-HLA e também não verificaram aumento
(seleção positiva) ou diminuição (seleção balanceadora) dos valores de Fst em relação aos loci neutros. As variações
nas medidas de diferenciação populacional são difíceis de serem detectadas e a história demográfica e o modelo
seletivo podem ser característicos de cada população. Portanto, para essa análise ser mais precisa seria adequado
analisar marcadores neutros e selecionados nos mesmos indivíduos da mesma população.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Estudo dos polimorfimos dos microssatélites BAT-25 E
D2S123 em indivíduos residentes no estado do Rio de
Janeiro
Spetseris, RCV1,2; Macedo, JMB2; Guillobel, HCR1
Laboratório de Genoma II – Depto de Biofísica e Biometria – Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes – UERJ
Laboratório de Biologia Molecular – Depto de Bioquímica - Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes – UERJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélite, polimorfismo, BAT-25, D2S123, MSI
Microssatélites são regiões dispersas do genoma humano contendo unidades de 1 a 5 pares de bases repetidas
justapostas. Durante a replicação podem ocorrer alterações no número de repetições devido ao deslizamento
da DNA-polimerase, resultando em contração ou alongamento da fita de DNA. Na célula normal tais erros são
corrigidos por um sistema de reparo do DNA, o reparo de mau pareamento de bases; na célula com deficiência
nesta via de reparo, as variações no tamanho das regiões com repetições permanecem. Tal fato pode predispor ao
câncer se genes apresentando regiões de repetição e envolvidos com a carcinogênese forem afetados. A variação
do tamanho dessas regiões em células normal e tumoral é o que caracteriza a instabilidade de microssatélite
(MSI). Entretanto, existem variações polimórficas distribuídas caracteristicamente nas populações em função de
sua origem étnica. O BAT-25 é uma região constituída de uma seqüência de 25 timinas situada no íntron 16 do
oncogene c-kit. É um marcador bastante estável, apresentando-se quase monomórfico em caucasianos, o que
facilitaria o estudo de MSI em amostras tumorais, pois dispensaria a análise de amostras pareadas de DNA de
células normal e tumoral de mesmo indivíduo. Todavia, foi observado que afro-americanos, negros africanos e
outros povos apresentam em indivíduos saudáveis outro(s) alelos(s) deste marcador dentro de suas populações,
o que inviabiliza a avaliação não pareada em populações miscigenadas. Como a nossa população é multiétnica,
oriunda da miscigenação entre colonizadores europeus, negros escravos e indígenas, estudamos como se apresenta
tal marcador em nossa população. Estudamos também como se dá a variabilidade do microssatélite D2S123,
constituído de repetições em número variado da seqüência CA. Ambos fazem parte do grupo de 5 microssatélites
recomendado pela National Cancer Institute Sponsored Consensus Conference de 1997 para o estudo de MSI. Para
tanto, utilizamos a técnica de amplificação de DNA por PCR e avaliamos os polimorfismos por eletroforese em gel
de poliacrilamida desnaturante, tomando como grupo de estudo uma amostra de moradores do estado do Rio de
Janeiro, pertencentes a um banco de DNA. No presente, 217 amostras de DNA foram amplificadas para o BAT-25.
Pudemos observar a ocorrência de seqüências de dois tamanhos diferentes, sendo a mais curta sempre presente
em heterozigose e em números bem reduzidos de indivíduos da amostra, correspondendo à variação já referida
na literatura para caucasianos. Já o D2S123 se apresenta em variados tamanhos, a partir das amostras de DNA
amplificadas. De posse dos resultados obtidos e dos que obtivermos pretendemos estudar a distribuição dos alelos
do BAT-25 e do D2S123 na população, procurando estabelecer a relação que possa existir entre a freqüência dos
genótipos encontrados e parâmetros da população em estudo como gênero e etnia.
Apoio Financeiro: FAPERJ E CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Kinship analysis using DNA tests in a Brazilian
population sample. STR analysis and inconsistencies
Soler, MP & Iwamura, ESM
Laboratório de Patologia Molecular - Departamento de Patologia - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo – São
Paulo, Brasil
Keywords: Paternity tests, mutation rates, short tandem repeats –STR, Brazilian population
In the recent years, the search for DNA paternity test has become a reality for Brazilians. The reason for this may
be financial and social issues or healthwises. This study addresses the general profile of Brazilians who made
kinship tests in private laboratories (certified by ISFG-GEP), using the DNA typing. We have also considered the
exam requested, the results of the analysis and the inconsistencies present. Genetic information and personal
reports were obtained from 713 kinship cases of private laboratories, in the year 2006, using 13 or 15 autosomal
STR markers. This population is a representative sample of the mixed ethinicity of Brazil, and is consist of 2,110
individuals of different regions of the country, comprising 23 States of the federation. Concerning the birthplace
of the mother and the alleged father, 78.7% are from the South-Southeast, 16.7% from the Northeast, 4.4% from
the Midwest and 0.3% from the North. The maternal age at the time of conception with the highest prevalence
was 15-25 years (65%), average of 23 years old. The predominant range of paternal age of conception was 20-30
years (51%), average of 29.4 years old. The tests were requested in 77.6% of cases when the child was in the range
of 0-10 years old and 16% in the range of 10-20 years old. The ethnicity reported by majority of the mothers was
Caucasian (74.3%). Similarly, 80% of the supposed families were declared Caucasian. Only 13% of these two groups
are declared Mulattoe and the rest Black or Asian. The exams made up of mother, child or children and the alleged
father were 96%, while the reconstruction’s cases were only 0.3% of the sample. Concerning the analysis of results,
in 32% of the cases the alleged father was not the biological father. Children who have a father declared in the birth
certificate, 50.2% was not confirmed as the biological ones. In inclusions, in which there was inconsistencies, we
found 18 cases of mutation which identified 15 as being of paternal origin, 1 of maternal origin and 2 undefined, at
12 loci - D21S11 (1), D851179 (1), vWA (3), FGA (3), D18S51 (2), D5S818 (1), D16S539 (1), CSF1PO (2), D19S253 (1),
D3S1358 (1), D19S433 (1), D13S317 (1). The rate of mutation found ranged from 1 to 3.1 x 10-3 per locus per gamete
per generation. Furthermore, 16 of the mutations were gain/loss of a single repetition. Among the parents, who was
the source of mutation, a mean age of 32 years was observed.
Financial Support:FAPESP 2008/10743-2
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Taxa de mutação germinativa para 15 locos STR
autossômicos na população de Goiânia–GO
Rodrigues, FS1; Silva, DM1,2,3; Rodovalho, RG4; Vieira, TC1,2,3
Programa de Pós-Graduação Latu Sensu, Especialização em Genética - Universidade Católica de Goiás.
Núcleo de Pesquisas Replicon - Universidade Católica de Goiás.
3
LAGENE – Laboratório de Citogenética e Genética Humana.
4
Laboratório Biocroma–Laboratório de Análises de DNA.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: STR, taxa de mutação, teste de paternidade, biomonitoramento de radioacidentados.
A ocorrência de mutações em células germinativas é transmitida aos descendentes e pode interferir nos resultados
de testes de vínculo genético. Devido ao elevado grau de polimorfismo, resultante de suas altas taxas mutacionais,
os STR são amplamente utilizados como marcadores em testes de paternidade. Pela estimativa destas taxas é
possível identificar o perfil genético correto dos indivíduos e determinar o número de mutações que podem ser
consideradas como casos de exclusão da paternidade. Em decorrência da miscigenação da população brasileira,
vários estudos têm demonstrado a variabilidade genética dos STR, em populações localizadas em distintas áreas
do nosso país. Portanto, para garantir uma determinação precisa do vínculo genético, deve-se incluir na avaliação
estatística a taxa de mutação específica para a população em questão. Não havendo nenhum estudo semelhante
nesta região, os dados utilizados para os cálculos estatísticos são de outras populações, portanto este estudo se
faz importante para minimizar erros estatísticos decorrentes de subestruturação populacional. Os locos STR
apresentam-se também como importantes marcadores para biomonitoramento de mutações germinativas em
acidentes radioativos. As radiações ionizantes levam a um aumento significativo da taxa mutacional. Portanto a
determinação da taxa basal de mutações da população de Goiânia é necessária para comparação em estudos de
taxas de mutação induzidas pela radiação, devido ao acidente radioativo com o Césio-137. O objetivo deste trabalho
foi estabelecer a taxa basal de mutações germinativas na população de Goiânia para 15 marcadores microssatélites
autossômicos, com a finalidade de se criar um banco de dados de interesse para cálculos estatísticos em testes
de vínculo genético e também na análise comparativa em estudos sobre mutações induzidas. Foram estudados
215 testes de paternidade realizados em Goiânia no período de janeiro a dezembro de 2008. As amostras foram
coletadas por punção venosa de sangue periférico, o DNA foi extraído, amplificado por PCR e submetido à análise.
Os resultados dos cálculos estatísticos mostraram taxas mutacionais específicas para cada loco variando de 0,8
a 3,1 x 10-4 mutações/loco/geração e a taxa mutacional total para os 15 marcadores analisados foi de 8,5 x 10-4.
Foi determinado também a origem da mutação, se materna ou paterna, se houve perda ou ganho de unidades de
repetição, o número de mutações e as taxas mutacionais por loco.
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Estimativas de mistura interétnica utilizando
marcadores do tipo indel ligados ao cromossomo X
Resque, RL; Freitas, NSC; Ribeiro-Rodrigues, EM; Santos, NPC; Santos, SEB
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: cromossomo X, ancestralidade, marcadores genéticos, mistura interétnica, populações miscigenadas.
A população brasileira é uma das mais heterogêneas do mundo, tanto do ponto de vista sócio-cultural quanto do
ponto de vista genético. Este fato é resultado de cinco séculos de interação social e genética, que ocorreu entre
ameríndios, europeus e africanos. Estimativas precisas das proporções ancestrais em populações miscigenadas,
feitas a partir do estudo com marcadores genéticos, têm sido usadas para responder questões relacionadas à
genética forense e à antropologia e são fundamentais como controle dos efeitos de uma possível subestruturação
populacional em estudos de associação. Nos últimos anos o interesse em estudar Marcadores Informativos de
Ancestralidade (AIM) tem crescido bastante devido a sua ampla aplicabilidade. AIMs são marcadores cujas
frequências alélicas variam significantemente entre populações geograficamente distintas e podem ser usados
para inferir mistura interétnica. Do que é conhecido, muito poucas são as publicações mostrando marcadores
de ancestralidade ligados ao cromossomo X. Neste estudo nós construímos um painel de 24 marcadores do tipo
INDEL (inserção e deleção de pequenos fragmentos de DNA), todos ligados ao cromossomo X, que podem ser
genotipados em uma única reação de PCR seguida de eletroforese capilar. Nosso maior objetivo foi o de identificar
e caracterizar marcadores do cromossomo X que fossem capazes de diferenciar grupos geográficos distintos para
serem utilizados em estudos de sub-estruturação populacional e de antropologia biológica. Nós genotipamos 461
indivíduos de populações ditas como parentais das atuais populações brasileiras. Essas amostras incluem 103
indivíduos de origem predominantemente européia; 140 indivíduos de origem africana; e 218 indivíduos Nativos
Americanos. Genotipamos também 745 indivíduos de populações miscigenadas do Brasil que incluem: 146
indivíduos da região Norte; 235 da região Nordeste; 226 da região Sudeste; e 138 indivíduos do Sul do país. Empregamos
o programa Structure v.2.0 para estimar a mistura interétnica individual e global das populações miscigenadas. A
população do Norte do Brasil apresentou uma maior contribuição da ancestralidade indígena (42%), seguida da
européia (34%) e africana (24%). As populações nordestinas têm maior contribuição de ancestralidade européia
(37%) e africana (36%) e menor contribuição de nativos americanos (27%). De forma semelhante as populações
do Sudeste brasileiro tem maior contribuição de europeus e africanos (38% e 35%, respectivamente). No sul do
país a contribuição de genes europeus é a mais elevada (46%) seguidas de indígenas (34%) e africanos (20%).
Os dados obtidos são diferentes daqueles estimados com base em marcadores autossômicos, principalmente no
que se refere a contribuição indígena. É provável que tais resultados reflitam o fato que o início da formação do
povo brasileiro foi baseado em casamentos preferenciais entre homens europeus (que contribuíam com somente
1/3 dos cromossomos X da próxima geração) e mulheres indígenas (2/3 dos cromossomos X) e, posteriormente,
mulheres africanas.
Orgão financiador: FINEP, CNPQ, UFPA.
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Determinação da origem genética da população
urbana de porto velho estado de rondônia através do
marcador DYS393
Krauze, A1,2; Casseb, AA2,3; Cantanhêde, LM2; Farias JD2,3; Guimarães, M2,3; Simões, AL4; Engracia, V2,3.
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical – CEPEM
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO
3
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
4
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Y-STRs, Frequência, Marcadores, Populações, Rondônia,
Introdução: Marcadores Informativos de Ancestralidade (AIM) são marcadores que apresentam diferenciais de
freqüência maiores que 0,3 entre grupos definidos geográfica ou etnicamente. Suas aplicações são múltiplas tanto
em Genética Forense como em estudo de associações entre polimorfismos genéticos e doenças e em estimativas de
composição ancestral de populações híbridas, cuja precisão é diretamente proporcional à magnitude da diferença
das freqüências dos marcadores utilizados. A análise de marcadores moleculares do cromossomo Y é importante
nesse sentido devido à sua herança uniparental, haploidia e ausência de recombinação. O presente trabalho teve
como objetivo definir a freqüência dos alelos e haplótipos dessa população em relação ao marcador DYS393.
Material e Métodos: Foram analisados 100 cromossomos de recém nascidos na maternidade do Hospital de Base
da cidade de Porto Velho - RO. O DNA foi extraído utilizando-se protocolos de proteinase K, amplificado por PCR,
com primers específicos para o loco analisado. A visualização em PAGE corado com nitrato de prata 10%. As
freqüências alélicas foram feitas por método de contagem gênica
Resultado: Foram identificados quatros alelos *12, *13, *14 e*15 para o loco DYS393 com freqüências
0,0700/0,6400/0,2500 e 0, 0400, respectivamente, caracterizou-se como sendo o haplótipo 13. O observado foi
semelhante ao encontrado em outras populações brasileiras em que se observa freqüência de 0,68 em caucasóides
e de 0,78 em miscigenados mulatos para o alelo mais freqüente.
Discussão: Os resultados observados contribuem para caracterização genética da população do estado de
Rondônia, que têm apresentado nas últimas décadas um fluxo migratório intenso, atualmente influenciado pela
construção das usinas do Rio Madeira. Os dados obtidos serão posteriormente aplicados em projetos visando a
aplicação de políticas de saúde pública
Agência Financiadora: CEPEM, CNPq, IPEPATRO
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Identificação de novos polimorfismos do cromossomo
Y humano em populações indígenas americanas
Jota, MSA¹; Lacerda, DR¹; Bisso-Machado, R²; Paixão-Cortes, VR²; Bortolini, MC²; Santos, FR¹
¹ Departamento de Ciências Biológicas. UFMG
² Departamento de Genética. UFRGS
[email protected]
Palavras-chave: polimorfismo, cromossomo Y, populações indígenas americanas.
Desde o início do estudo de variações do cromossomo Y humano, na década de 1990, revelou-se uma grande
dificuldade em se encontrar polimorfismos. Essa dificuldade é em grande parte explicada pela natureza não
recombinante da maior parte deste cromossomo e, além disso, pelo tamanho populacional efetivo que é quatro
vezes menor que o de autossomos. Vários métodos de detecção de polimorfismos (e.g. seqüenciamento, DHPLC
e SSCP) revelaram marcadores informativos que atualmente podem ser genotipados por protocolos baseados
em PCR. O Consórcio do Cromossomo Y (YCC) começou, em 2002, a sistematizar a nomenclatura de linhagens
(haplogrupos e haplótipos) baseada em 245 marcadores, entre SNPs e indels. Apesar de novos polimorfismos
terem sido descritos desde então, há ainda várias lacunas na filogenia do Y, entre estas, nos cromossomos de
indígenas americanos. Atualmente, é consensual o reconhecimento de duas grandes linhagens específicas de
nativos americanos, os haplogrupos C e Q, sendo a primeira encontrada apenas na América do Norte. Dentro do
haplogrupo Q (ou Q-M242), o marcador DYS199 (M3) permite discriminar a sub-linhagem Q-M3 (ou Q1a3a), a mais
comum nas Américas e considerada como autóctone, isto é, originada no continente após a vinda dos migrantes
asiáticos. No entanto, são ainda necessários mais marcadores para discriminação de outras sub-linhagens de Q,
tanto dentro de Q-M3, como no paragrupo Q* (Q menos cromossomos Q-M3), que permitirão definir mais grupos
monofiléticos e comparar populações no nível intracontinental. Este estudo buscou detectar novos polimorfismos
pelo seqüenciamento de fragmentos de cromossomos Y divergentes, pré-definidos por análise filogeográfica de
haplótipos de microssatélites. Primeiro, foi desenhada uma rede de haplótipos com dados de 6 microssatélites
a partir de cromossomos Q* ou Q-M3 de indígenas de distintas localidades americanas (Andes, Amazônia e
Alaska). Posteriormente, foram selecionados 10 indivíduos em diferentes extremidades da rede filogeográfica que
representavam haplótipos mais divergentes, considerando também distintas origens geográficas. Onze loci de
cópia única do cromossomo Y foram seqüenciados em todos os indivíduos (~6 kb) e cinco prováveis polimorfismos
foram identificados. Entre estes, um novo SNP foi detectado em um indivíduo Q* da região andina, sendo assim
um possível identificador de uma sub-linhagem autóctone do continente sul-americano. A abordagem adotada
neste estudo mostrou-se eficiente para busca de polimorfismos, permitindo também economizar DNA (amostras),
insumos, horas de trabalho e recursos financeiros.
Apoio Financeiro: FAPEMIG
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Ameríndios, cromossomos Y e a busca pelas origens
Bisso-Machado, R1; Paixão-Côrtes, VR1; Bonatto, SL2; Salzano, FM1; Bortolini, MC1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências – UFRGS
Faculdade de Biociências – PUCRS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cromossomo Y, SNPs, ameríndios, evolução, origem.
A atual árvore filogenética do cromossomo Y mostra uma resolução mais acurada do que as anteriores, mas revela
novas questões, tais como as incertezas sobre a filogenia do haplogrupo Q e seus derivados, todos relacionados
aos nativos americanos e certas populações asiáticas. Esta investigação visa estender nosso conhecimento a
respeito do tema, bem como apresentar dados para tribos que até o momento nunca haviam sido estudadas para
o cromossomo Y. A investigação envolveu 101 indivíduos (81 sul-ameríndios de15 tribos: Apalaí, n =2; Arara, n = 7;
Araweté, n = 1; Caingang, n = 1; Gavião, n = 7; Jamamadi, n = 3; Karitiana, n = 3; Kuben-Kran-Kegn, n = 2; Lengua,
n = 11; Suruí, n =7; Tenharin, n = 1; Wai-Wai, n = 9; Xavante, n = 15; Xicrin, n = 6; Zoró, n= 6, pertencentes a 5
grupos lingüísticos distintos (Arawa, Ge, Karib, Lengua e Tupi), além de 20 esquimós siberianos. Os marcadores
utilizados foram: M3, M17, M194, M199, M242, P292, RPS4Y711. Com exceção do M17, que define o mais comum
cromossomo europeu (R1a1*), todos os demais são típicos de asiáticos e/ou nativos americanos. Seqüenciamento
(M194, M199, P292), RFLP (M3, M242, M17) ou PCR alelo-específico (competição; RPS4Y711) foram utilizados para
identificar o estado alélico em cada cromossomo. Foi possível determinar que Q1a3a* (autóctone nativo-americano,
de provável origem Beringiana) é o mais freqüente: Apalaí (50%), Arara (100%), Gavião (100%), Karitiana (100%),
Kuben-Kran-Kegn (50%), Lengua (63%), Suruí (100%), Tenharin (100%), Wai-Wai (100%), Xavante (100%), Xicrin
(100%), Zoró (100%); o haplogrupo Q*, que por outro lado também é encontrado na Ásia, foi observado entre os
Araweté (100%), Esquimós Siberianos (40%), Jamamadi (100%), e Lengua (37%), enquanto R1a1* somente entre os
Esquimós Siberianos (5%). Observou-se também cromossomos Y de provável origem não indígena entre os Apalaí,
Kuben-Kran-Kegn e Caingang. Vale destacar ainda que nenhum sub-haplogrupo de Q1a3a*, nem tampouco novas
mutações nas três regiões seqüenciadas, foram identificadas, o que reforça a idéia da origem comum e relativamente
recente de todos nativos americanos. A ausência de Q1a3a* em algumas populações nativo-americanas, pode,
por sua vez, ser explicada pelo pequeno tamanho amostral investigado até aqui, ou ainda pela deriva genética,
fenômeno micro-evolutivo reconhecidamente marcante na história evolutiva dos primeiros americanos.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq.
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Estudo de Associação entre o Marcador de
Ancestralidade B do mtDNA e o Marcador do
Polimorfismo Asp299Gly do TLR-4 em Amostras de
Coari-AM
Costa, AG1; Jano, M2; Santos, JD1; Tomé-da-Conceição, JK1; Andrade-Casseb, A2,3; Engracia, V2,3;
Heckmann, MIO1,2
Laboratório de Genética Humana – Instituto de Saúde e Biotecnologia – UFAM.
Laboratório de Genética – Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais, IPEPATRO.
3
Universidade Federal de Rondônia - UNIR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Polimorfismo Asp299Gly, TLR4, Haplogrupo B, mtDNA, Coari-AM.
O crescimento populacional na região Amazônica foi marcado por vários processos migratórios como a vinda dos
colonos portugueses e espanhóis, os dois ciclos da borracha, a abertura da Zona Franca de Manaus e atualmente a
vinda dos trabalhadores da Petrobras com a descoberta de petróleo na bacia de Urucu, entretanto, pouco se conhece
sobre esses indivíduos migrantes. Neste contexto torna-se necessário caracterizar a estrutura desta população a
fim de fornecer dados que possam ser utilizados na correlação com as doenças endêmicas de cada região. Para
tal citamos como exemplo o marcador do haplogrupo B do mtDNA, muito utilizado em estudos de caracterização
populacional. Em contrapartida citamos o marcador do polimorfismo Asp299Gly do Toll-Like Receptor-4 (TLR4),
responsável pela ativação da resposta do sistema imune inato. Deste modo este estudo tem como objetivo realizar
estudo associação entre o marcador do haplogrupo B do mtDNA e o marcador do polimorfismo Asp299Gly do
TLR-4 em amostras de Coari-AM, dado que esta região não possui estudos direcionados a esta temática A amostra
é composta de 100 indivíduos provenientes do Hospital Regional de Coari – Amazonas. Do material biológico
foi extraído o DNA segundo o protocolo de Higuchi, seguida por PCR para a amplificação do fragmento de DNA
de ambos os marcadores, utilizando primers específicos para cada sistema. Após amplificação o fragmento foi
visualizado em PAGE a 6% e corados com AgNO a 10%. Após a confirmação da amplificação do fragmento do
polimorfismo do TLR4, este foi submetido à digestão com a Enzima NcoI e posteriormente visualizado. A análise
dos resultados demonstrou que somente três indivíduos (0,03) são heterozigotos portadores do polimorfismo
Asp299Gly do TLR4. Quanto aos resultados do marcador de Ancestralidade B do mtDNA, observou-se que 16% dos
indivíduos possuíam a deleção 9pb a qual é muito freqüente entre populações descendentes de ameríndios. No
estudo de associação entre estes marcadores foi observado que não há associação entres os mesmos na presente
amostra demonstrando a necessidade de ampliar a amostra e o desenvolvimento de futuras análises, com objetivo
de refinar este estudo.
Apoio Financeiro: Fapeam; IPEPATRO
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Freqüência do Haplogrupo B do mtDNA em amostras
de Coari – AM
Santos, JD1; Catanhede LM2; Jano, M2; Costa, AG1; Tomé da Conceição, JK1; Andrade-Casseb, A2;
Engracia, V2; Heckmann, MIO1
Instituto de Saúde e Biotecnologia – Universidade Federal do Amazonas.
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mtDNA, Haplogrupo B, Coari, Amazonas
Historicamente a região Amazônica é conhecida pela imensidão de sua floresta e pela elevada contribuição indígena.
Uma importante ferramenta utilizada para caracterizar a estrutura populacional de diferentes populações, o DNA
mitocondrial tem sido intensamente utilizado em diferentes populações. Em contra partida, dados referentes a
haplogrupos do mtDNA em amostras da região Norte são poucos e ausentes os que descrevem a diversidade
genética de populações urbanas do estado do Amazonas, em específicos da região do Médio Solimões. O objetivo
desta pesquisa foi determinar a freqüência de um dos marcadores mais freqüente em populações ameríndias,
no caso uma deleção de 9 pb na molécula do DNA mitocondrial, denominada haplogrupo B do mtDNA (Del 9pb
COII/tRNALys). A amostra é composta de 100 indivíduos provenientes do Hospital Regional de Coari – Amazonas.
O haplogrupo B foi caracterizado a partir do mtDNA pela técnica de PCR, seguido de PAGE a 6%, corados com
AgNO3 a 10%, para confirmar a amplificação do fragmento. O haplogrupo B apresentou altos índices de freqüência,
correspondendo a 16% dos genótipos observados da amostra. Em conclusão a presença de haplogrupo ameríndio
em proporções significativas corrobora com dados históricos da região Amazônica, refletindo a significante
contribuição indígena, através da linhagem materna, do início do povoamento pós-descobrimento.
Apoio: Fapeam, IPEPATRO
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Casamentos, fluxo gênico e mistura genética em
populações humanas: O impacto das migrações sobre
três comunidades quilombolas do Rio São Francisco
Amorim, CEG1; Gontijo, CC2; Reis, BF2; Pedrosa, MAF2; Falcão-Alencar, G2; Diniz, MECG2; Godinho, NMO23;
Toledo, RCP2; Klautau-Guimarães, MN2; Luizon, MR4; Simões, AL4; Oliveira, SF2.
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, UFRGS. 2Departamento de Genética e Morfologia, Instituto de Ciências
Biológicas, UnB. 3Instituto de Criminalística de Goiás. 4Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.
[email protected]
1
Palavras-chave: remanescente de quilombo, demografia, AIM, SNP, inserção Alu.
Remanescentes de quilombos são sociedades multiétnicas com origem relacionada à presença do escravo africano
no Brasil. A história demográfica dessas populações tem sido estudada a partir de fontes históricas, etnográficas
e, em menor parte, de fontes demográficas e genéticas. No presente trabalho, buscou-se analisar a origem e o
impacto das imigrações recentes e antigas sobre a constituição genética dos remanescentes de quilombos de
Mocambo, Rio das Rãs e Sacutiaba, três comunidades localizadas ao longo do Rio São Francisco. Para tanto, foram
analisados parâmetros demográficos (sexo, estado matrimonial e local de nascimento) e genéticos (diferenciação
gênica e genotípica, heterozigose, desequilíbrio de ligação, Fis, mistura genética e estrutura populacional) baseado
em 16 marcadores genéticos autossômicos informativos de ancestralidade, tanto na amostra total como também
nas parcelas de nativos e imigrantes. Os imigrantes corresponderam a 22,1% dos indivíduos analisados, sendo
que a maioria era de mulheres que migraram principalmente em decorrência da contração de matrimônio. Não
foram encontradas diferenças genéticas estatisticamente significativas entre os imigrantes e nativos considerando
a distribuição gênica e genotípica e a heterozigose. Além disso, a inclusão dos imigrantes nas análises de estrutura
populacional e mistura genética não causou alterações substanciais nos resultados quando comparados a essas
análises realizadas com nativos exclusivamente. Nas três comunidades, houve predomínio de casamentos entre
indivíduos da mesma população (endogamia local), porém os valores de Fis não foram significativos, sugerindo
que essa prática não foi suficiente para alterar substancialmente a estrutura populacional dessas comunidades.
O padrão de desequilíbrio de ligação entre os 16 loci analisados indicou haver fluxo gênico contínuo para essas
populações. Com relação à constituição genética, a contribuição parental africana foi predominante - 52,2% em
Mocambo, 65,5% em Rio das Rãs e 64,3% em Sacutiaba. Além disso, foi observado um incremento na contribuição
africana em decorrência da imigração em Rio das Rãs e Sacutiaba, ambas localizadas na Bahia, estado em que
as populações urbanas apresentam predominantemente a contribuição genética dessa parental. O contrário
foi observado em Mocambo, onde a imigração aumentou a proporção de contribuição européia e ameríndia. É
possível que, em algum momento de suas histórias, essas populações estivessem isoladas, porém a barreira ao fluxo
gênico já está bastante dissolvida atualmente. Os dados aqui apresentados revelaram que o impacto da imigração
recente está sendo baixo, o que deve estar relacionado à homogeneização em processo, ocasionada pelo fluxo
gênico operante ao longo de grande parte da história dessas populações. Adicionalmente, os dados encontrados
corroboram outras fontes históricas, que indicam a participação predominante de africanos e miscigenação com
pessoas de outras origens durante a formação destas comunidades, como os ameríndios, os europeus e os seus
descendentes.
Apoio financeiro: CNPq e FINATEC.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
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Polimorfismos de interesse farmacogenético em
brasileiros com ascendência japonesa
Perini, JAa; Santana, ISCa; Vargens, DDa; Moriguchi, EHb; Ribeiro-dos-Santos, AKCc; Tsutsumi, Mc; SuarezKurtz, Ga
Instituto Nacional de Câncer,
Universidade do Vale do Rio dos Sinos,
c
Universidade Federal do Pará.
[email protected]
a
b
Palavras-chave: FARMACOGENÉTICA, CYP2C9, CYP2C19, GSTM3, VKORC1
A influência da etnia na resposta aos medicamentos pode ser um reflexo da variação na distribuição de freqüência
de polimorfismos (SNPs) em genes envolvidos na farmacocinética e/ou na farmacodinâmica dos medicamentos. Os
genes CYP2C9, CYP2C19, GSTM3 e VKORC1, de reconhecido interesse farmacogenético, apresentam polimorfismos
com diferentes freqüências alélicas entre distintas populações. O objetivo deste estudo é comparar a freqüência
dos SNPs CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, CYP2C19*3, GSTM3*A/B, VKORC1 3673G>A, 5808T>G, 6856G>C
e 9041G>A entre brasileiros com ascendência japonesa (1ageração), japoneses nativos que residem no Brasil e
brasileiros sem ascendência japonesa. Foram recrutados 200 japoneses nativos residentes no sul e no norte do
Brasil, e 126 brasileiros descendentes de japoneses (1a geração). O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética das
instituições participantes e todos os voluntários assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Os
SNPs em CYP2C9, CYP2C19 e VKORC1 foram genotipados por PCR em tempo real e o polimorfismo GSTM3*A/B
foi identificado por PCR-RFLP. A tabela 1 mostra dados de freqüência alélica (%) na população estudada e dados
descritos na literatura pelo nosso grupo para brasileiros sem ascendência japonesa.
Tabela 1:
Gene
CYP2C9
CYP2C19
GSTM3
VKORC1
SNPs
Japoneses Nativos
*2
*3
*2
*3
B
3673A
5808G
6853C
9041A
0
2,8
30,6
10,6
0
90,3
0,5
90,8
10,0
Japoneses de 1º
geração
0
0,8
27,1
13,6
0
88,1
0,4
88,5
11,9
Brasileiros sem
ascendência Japonesaa
8,6
6,5
13,2
0,2
39.0
33,3
21,2
39,5
37,7
Pb
<0,00001
<0,00001
<0,00001
<0,00001
Dados obtidos de Vianna-Jorge e cols., 2004; Suarez-Kurtz e cols., 2007 e Perini e cols., 2008.
ANOVA, comparação entre os três grupos.
a
b
38
As freqüências alélicas dos SNPs investigados não diferem entre japoneses nativos e brasileiros com ascendência
japonesa (1a geração), mas são significativamente diferentes dos brasileiros sem ascendência japonesa residentes
do Rio de Janeiro. Sabendo que estes polimorfismos influenciam a dose requerida de medicamentos amplamente
utilizados na prática clínica, e devido à similaridade de freqüência desses SNPs entre Japoneses nativos e os que
residem no Brasil, seria possível a utilização de brasileiros com ascendência japonesa (~ 500.000 indivíduos), em estudos
clínicos para o registro de medicamentos no Japão no âmbito da Conferência Internacional sobre Harmonização.
Apoio financeiro: FAPERJ e CNPq
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The genetic structure of Native Americans: Inferences
from SNPs in genes involved in carcinogenesis,
immunity and pharmacogenetics
Soares-Souza, GB1; Chevitarese, J1; Gilman, RH4,5; Yeager, M6; Chanock, SJ2,3, Tarozona-Santos, E1,2
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brazil. 2Section of Genomic
Variation, Pediatric Oncology Branch, National Cancer Institute, National Institute of Health, MD, United States. 3Laboratory of
Translational Genomics, National Cancer Institute, National Institute of Health, MD, United States. 4Asociación Benéfica PRISMA, Lima,
Peru. 5Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, MD, United States. 6Core Genotyping Facility, National Cancer
Institute, National Institute of Health, MD, United States
1
Keywords: Genetic strucuture, Native-americans, Snps, Pharmacogenetics, South America
We have studied the genetic structure of South Amerindian populations in the context of worldwide diversity. We
genotyped 1442 SNPs located on 400 genes involved in cancer, immunity and pharmacogenetics in the following
67 Western South Amerindians: (a) 22 Quechua highlanders from the Peruvian Andes; (b) 17 Quechuas from San
Martin; (c) 21 Matsiguengas from the Monte Carmelo community and (d) 7 Cayapas from Ecuador. Samples b-d
are settled in the geographic region located between Andean Mountains (West) and the Amazon region (East). We
also genotyped the Human Genome Diversity Panel that include the following South Amerindians: 24 Karitiana,
21 Surui, 13 Piapoco and Curripaco, 25 Pima and 25 Maya. The following results emerge from the SNPs and
haplotype analyses: (1) Most of the loci fit the Hardy-Weinberg Equilibrium in most populations. (2) With the
exception of the San Martin population (FIS = 0.06), none of the Western South Amerindian populations studied by
us evidence high levels of inbreeding or Wahlund effect. (3) Consistently with previous studies, South Amerindians
and Oceanian populations show the lowest intra-population diversity compared with autochthonous populations
from other continents. (4) Within South America, Western South Amerindians show the highest intra-population
diversity, consistently with an evolutionary model previously proposed by us, which suggest a higher long term
effective population size and levels of gene flow among them. (5) Comparing the different continents, the betweenpopulation diversity is clearly the highest for South Amerindians (FST = 0.19).This value is almost twice the level
of differentiation observed for the worldwide population (FST = 0.11). (6) We identified genes (such as COMT and
CYP1A1, important in pharmacogenetics), with a high level of differentiation in Native Americans respect to other
continents. Identifying SNPs with these characteristics is important because markers with large differences in
allele frequencies among continental groups may produce false positive results in epidemiological studies involving
complex traits with different incidences among continental groups. Our results provide important information
about the genomic structure of South Amerindians, an underrepresented group in population genetic studies, in
particular for genes involved in carcinogenesis, immunity and pharmacogenetics.
Financial Support: CAPES, CNPq, NCI/NIH, FAPEMIG
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Glutatião s-tranferase, classe Theta: Frequências
fenotípicas em amostra hospitalar de parturientes e
recém-nascidos de Porto Velho, Rondônia
Farias, JD1,2; Lafontaine, R1,2; Guimarães, M1,2; Krauze, A1,2; Andrade-Casseb; A1,2; Engracia, V1,2
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: GST, GST Theta, Fenótipo Nulo, Distribuição alélica, Rondônia
Glutatião S-Transferase (GSTs, EC 2.5.1.18) é a enzima que desempenha a maior atividade de desintoxicação
celular de compostos eletrofílicos tanto de origem endógena quanto de origem exógena, incluindo mutagênicos,
carcinogênicos e alguns agentes terapêuticos. Catalisam a conjugação destes compostos ao tripeptídeo glutatião
(GSH). Em humanos há oito classes gênicas distintas de GST citosólicas, localizadas em cromossomos distintos,
sendo as maiores classes alpha, mu, pi e theta. A classe theta localiza-se no cromossomo 22q11.2, com dois alelos em
frequência polimórfica: um alelo funcional (GSTT1*A), que expressa a proteína GSTT1 e um alelo nulo (GSTT1*0).
Tem sido observado que as freqüências alélicas de genes metabólicos não são randomicamente distribuídas nas
populações humanas, mas seguem padrões específicos a modelos étnicos e/ou geográficos. O alelo nulo de GSTT1
resulta de uma deleção do gene inteiro, e sua frequência na população espanhola apresenta uma proporção de
23,1%. No Brasil foi observada uma distribuição de GSTT1 nulo de 22,3 e 26,3% entre indivíduos brancos e negros,
respectivamente, de São Paulo e de 20 a 24% na população de afro-descendentes na Bahia. Rondônia foi colonizado
por várias ondas migratórias de diversas regiões do país, e a estrutura populacional é heterogênea, reproduzindo
o caráter miscigenado da população brasileira. Estimamos que os alelos da GSTT1 apresentariam freqüências
polimórficas, como ocorre em outras populações brasileiras e na distribuição mundial. Amostras de sangue
periférico foram coletadas na maternidade do Hospital de Base da cidade de Porto Velho, Rondônia, após parto
normal ou por cesariana, sendo analisados 616 cromossomos de parturientes, e 574 de recém-nascidos (sangue de
cordão umbilical). Após a extração de DNA, estes foram genotipados via PCR multiplex, com amplificação da região
alvo de GSTT1 que gera um fragmento de 480 pb, e de uma região de CYP1A1, gerando um outro fragmento de 312
pb, usado como controle para o alelo nulo. A visualização ocorreu em PAGE 10% corado com nitrato de prata 10%.
Detectamos através de contagem gênica direta, a presença ou ausência do gene da GSTT1. Dentre as amostras
analisadas foi observado que cerca de 22,72% (70/308) de parturientes apresentaram o fenótipo nulo; a frequência
deste fenótipo foi maior entre os recém-nascidos, compreendendo cerca de 29,96% (86/287) da amostra. Não foram
observadas diferenças significantes na distribuição do polimorfismo de GSTT1 quando comparados com outras
populações brasileiras, sendo assim, observado o reflexo da miscigenação ocorrida em Rondônia como resultado
das diversas ondas migratórias recebidas durante a formação deste estado.
Agradecimento: Hospital de Base Dr. Ari Pinheiro, Porto Velho-RO.
Agência Financiadora: IPEPATRO,FIOCRUZ, FNS
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Polimorfismos Genéticos da Tiopurina Metiltransferase
e da Metilenotetrahidrofolato Redutase em uma
amostra da população do Rio de Janeiro
Fraga, AO1; Coutinho, PC1,4; Hatagima, A1
1
4
Laboratório de Genética Humana, IOC – FIOCRUZ – RJ
Programa de Pos Graduação em Biologia – UERJ
Palavras-chave: TPMT, MTHFR, Polimorfismos genéticos, LLA, controle.
As enzimas tiopurina metiltransferase (TPMT) e 5,10 metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) têm sido
implicadas na resposta ao tratamento e suscetibilidade ao câncer. A TPMT está envolvida no metabolismo de
drogas tiopurínicas comumente usadas na terapia de várias doenças incluindo as leucemias, enquanto a MTHFR
atua na via metabólica do folato e na reposta do paciente ao fármaco metotrexate (MTX). Mutações no gene
TPMT têm efeitos profundos na toxicidade das tiopurinas e eficácia terapêutica destas drogas. A variação na
atividade da TPMT é controlada por polimorfismos comuns tais como: TPMT C238G, TPMT G460A e TPMT A719G.
Os polimorfismos MTHFR C677T e o MTHFR A1298C também estão relacionados com baixa atividade enzimática
e os alelos mutantes têm sido associados com o risco de leucemia e efeitos hepatotóxicos após tratamento com
MTX. Este trabalho visa descrever a distribuição das freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos TPMT
C238G, TPMT G460A e TPMT A719G e MTHFR C677T e MTHFR A1298C em uma amostra (doadores de sangue)
da população do Rio de Janeiro, que posteriormente será uma referência para os estudos caso-controle. Os
polimorfismos genéticos foram determinados no DNA genômico utilizando as técnicas da PCR ou PCR-RFLP. Os
produtos foram analisados em géis de agarose e de poliacrilamida, corados com brometo de etídeo sob luz UV. Os
polimorfismos MTHFR C677T e A1298C foram determinados em 476 e 464 doadores de sangue, respectivamente.
Para o polimorfismo MTHFR C677T a frequência do alelo MTHFR 677T foi 0,28 e as frequências genotípicas foram
de 52,1% para CC, 40,1% para CT e 7,8% para TT; enquanto para MTHFR A1298C a frequência do alelo MTHFR
1298C foi 0,21 e as frequências genotípicas foram de 62,3% para AA, 32,5% para AC e 5,2% para CC. A distribuição
genotípica observada foi similar entre os sexos e faixas etárias para os dois polimorfismos da MTHFR, porém foi
estatisticamente diferente entre brancos e não-brancos. Essas freqüências estão de acordo com o esperado pelo
equilíbrio de Hardy-Weinberg. Três polimorfismos do gene TPMT foram determinados em 200 indivíduos e as
freqüências observadas para os alelos foram: 96,0% para TPMT*1; 0% para TPMT*2; 1,75% para TPMT*3A; 0,5% para
TPMT*3B e 1,75% para TPMT*3C. A distribuição genotípica da TPMT está em desequilíbrio de Hardy-Weinberg e
não difere entre sexo, idade e etnia.
Financiamento do Projeto: CNPq, Convênio FIOCRUZ-FAPERJ e CAPES.
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Variabilidade do gene BChE em amostra da população
afro-descendente de Curitiba
Jackowski, D; Alves, HS; Chaves, TJ; Chautard-Freire-Maia, EA; Souza, RLR
Departamento de Genética. Setor de Ciências Biológicas. Universidade Federal do Paraná.
[email protected]
Palavras-chave: Butirilcolinesterase, gene BCHE, variabilidade genética, população Afro-descendente, frequência haplotípica.
A butirilcolinesterase (BChE) é uma enzima sérica, codificada pelo gene BCHE (3q26.1-q26.2), produzida no
fígado e encontrada em vários tecidos do organismo. O presente estudo visa investigar a variabilidade genética e
haplotípica do gene BCHE em uma amostra da população de origem Afro-descendente de Curitiba, com o objetivo
de comparar as frequências encontradas com as de outras populações, a fim de tentar estabelecer a origem
das mutações analisadas. As variações nos exons 1 (-116G>A; rs1126680), 2 (D70G; 209A>G; rs1799807 e E255D;
765C>G; rs16849700) e 4 (A539T; 1615G>A; rs1803274) foram investigadas por PCR-SSCA e a variação 1914A>G
(rs3495) foi detectada pelo método de Genotipagem por Taqman. Os resultados obtidos revelam uma frequência
de 4,04% ± 1,28% para a variante -116A nos Afro-brasileiros, que corresponde à cerca da metade da frequência
da população Euro-brasileira. Para a variante 209G a frequência encontrada foi de 1,49% ± 0,56%. Considerando
o alelo 765C, este está presente apenas em populações africanas ou de ancestralidade africana e nossos dados
revelaram uma frequência de 3,62% ± 0,86%, ou seja, cerca da metade da frequência na África. Além disso, a
variante 1615A apresenta uma frequência de 19,14% ± 1,81% e a variante 1914G apresenta frequência de 38,31% ±
2,33%. A comparação das frequências das mutações -116G e 765C com outros estudos revelaram que estas diferem
da frequência encontrada na população de Curitiba. A análise haplotípica revelou os seguintes haplótipos como
mais frequentes: [-116G; 209A; 765G; 1615G; 1914A] com 57,34%, [-116G; 209A; 765G; 1615G; 1914G] com 21,56% e
[-116G; 209A; 765G; 1615A; 1914G] com 9,17%. As análises de desequilíbrio de ligação possibilitaram concluir que os
desequilíbrios encontrados eram os mesmos daqueles já descritos em outros estudos, com exceção da ausência de
desequilíbrio entre as mutações 209A>G e 1615G>A e, analisando esses dados para as variantes 765C>G e 1615G>A
sugere-se que a mutação 765C tenha surgido em um cromossomo com a variante 1615A.
Auxílio Financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária
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Variabilidade do gene Bche em populações indígenas
do Paraná
Alves, HS; Petzl-Erler, ML; Chautard-Freire-Maia, EA; Souza, RLR
Depto de Genética, Universidade Federal do Paraná.
[email protected]
Palavras-chave: butirilcolinesterase, Kaingang, Guarani- M´Bya, populações indígenas.
Os Kaingang e Guarani constituem os dois maiores grupos de ameríndios que vivem no sul do Brasil. Estes
grupos possuem uma origem comum nos paleo-ameríndios que colonizaram a América do Sul, e historicamente
compartilham espaços geográficos e, mais recentemente, estabeleceram contato com grupos europeus e africanos.
A butirilcolinesterase (BChE) é uma enzima sérica, codificada pelo gene BCHE. Este gene está localizado no
cromossomo 3 e possui aproximadamente 70 variantes descritas, sendo a grande maioria muito rara. Os estudos
sobre a função da BChE indicam que está relacionada com diversos aspectos fisiológicos como: metabolismo de
lipídios, co-regulação da neurotransmissão colinérgica, proliferação celular nervosa e proteção contra agentes
tóxicos neurais. No presente estudo analisamos três SNPs (polimorfismos de um único nucleotídeo) no gene
BCHE, além de dois SNPs a montante e dois SNPs a jusante, por PCR-SSCA e genotipagem por TaqMan, em uma
amostra de 60 Kaingang e outra de 60 Guarani-M´Bya. As duas aldeias estão localizadas dentro da Área Indígena
de Rio das Cobras (25º18’S, 52º32’W), no município de Nova Laranjeiras, estado do Paraná. Os dados obtidos foram
comparados com os de outras populações. Dentro do gene BCHE: o alelo -116A do SNP rs1126680 está ausente nos
ameríndios, assim como em asiáticos e africanos da Nigéria, levando à hipótese de origem européia desta mutação;
o alelo K do SNP rs1803274 apresentou freqüência de 14,81% ± 3,42% em Guarani-M´Bya (N=54) e de 3,51% ±
1,72% em Kaingang (N=57). A presença da mutação K em outras populações ameríndias indica sua presença em
paleoíndios; o alelo G do SNP 1914 (rs3495) apresentou frequência de 1,75% ± 1,23% em Guarani-M´Bya (N=57)
e de 3,45% ± 1,69% em Kaingang (N=58), sendo significativamente menos freqüente em ameríndios do que em
europeus, asiáticos e africanos. Dos SNPs ao lado do gene BCHE, três (rs2863381, rs7624915, rs4387996) mostraram
diferenças significativas nas freqüências alélicas entre as duas populações e no outro (rs4440084) as freqüências
alélicas não diferiram. A análise dos haplótipos mostrou que Guarani- M´Bya têm cerca do dobro do número
de haplótipos que Kaingang e que as duas populações também diferem quanto ao haplótipo mais freqüente.
As frequências alélicas e a diversidade haplotípica mostraram que o tempo de divergência entre estes grupos
ameríndios foi suficiente para distingui-los geneticamente. Comparando com outras populações, os SNPs rs3495,
rs7624915 e rs4387996 tiveram uma inversão do alelo mais freqüente, quando comparados ao grupo nigeriano,
sendo essa mesma tendência percebida em 75% do SNPs analisados pelo consórcio HapMap.
Auxílio Financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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44
Estudo descritivo das frequências alélicas e
genotípicas das isoformas CYP2B6 e CYP2C8 na
população moçambicana
Arnaldo, P¹; Thompson, R1; Suffys, PN2; Lopes, MQP2; Santos, AR2
¹Instituto Nacional de Saúde- Ministério da Saúde, Moçambique.
2
Laboratório de Biologia Molecular Aplicado a Micobactérias- IOC- Fiocruz.
[email protected]/ [email protected].
Palavras-chave: Malária; polimorfismo; CYP2B6, CYP2C8; CYP450.
As isoenzimas CYP2B6 e CYP2C8 humanas são codificadas por genes polimórficos pertencentes ao complexo
enzimático do Citocromo P-450 humano e apresentam diferentes variantes alélicas designadas pela presença de
polimorfismos de base única. Ambas as isoenzimas estão envolvidas na biotransformação de uma ampla variedade
de fármacos, incluindo antimaláricos. Sabe-se hoje que variações genéticas em genes humanos que codificam
para enzimas envolvidas na biotransformação de fármacos podem contribuir para diferenças interindividuais
tanto na resposta imunológica como terapêutica. No caso das drogas antimaláricas, polimorfismos em genes
metabolizadores podem influenciar tanto nos desfechos terapêuticos desfavoráveis,como na falha ou diminuição
da eficácia dos antimaláricos. Sendo a malária uma doença endêmica em Moçambique, onde a população está
sujeita a medicação concomitante em esquemas terapêuticos padronizados e normalizados em todo país, a
avaliação destes perfis genéticos é de fundamental relevância para definir subgrupos potencialmente em risco de
efeitos adversos e/ou fracasso terapéutico aos antimaláricos em uso. O conhecimento sobre a diversidade alélica
dos genes CYP2B6 e CYP2C8 que codificam para estas isoformas e em conseqüência fornecer informações capazes
de nortear futuros estudos para avaliar o impacto prático destes polimorfismos nos desfechos terapêuticos da
malária nesta população é de suma importância. Para tal, foram coletadas amostras de sangue em 391 dadores
voluntários em papel de filtro “FTA Classic Cards” (Whatman) e genotipadas para os alelos frequentemente
reportados. O DNA genômico no papel foi purificado segundo as instruções do fabricante e genotipadas por
PCR-RFLP para os genes CYP2B6 e CYP2C8 com algumas modificações. Após a genotipagem de 351 indivíduos,
os resultados preliminares mostram uma frequência absoluta da variante CYP2B6*9 (516G→T) de 0,43. Não foi
observada diferença significativa das frequências alélicas entre os indivíduos do sexo masculino e feminino
(p=0.102). Para o gene CYP2C8, a frequência do alelo CYP2C8*2 (805A→T) foi de 0.16 em 338 amostras analisadas e
não houve diferença estatisticamente significativa para a variável gênero (p=0.69). Em relação a variante CYP2C8*4
(792C→G), dos 346 indivíduos genotipados a frequência da variante mutante foi de 0,005. A comparação entre
as frequências alélicas das 3 diferentes variantes estudadas para os genes em questão entre as diferentes regiões
geográficas de Moçambique mostrou diferença significativa somente para CYP2B6*9 (516G→T), a qual mostrouse significativamente mais frequente nas regiões norte e sul do país (p= 0,002). Um total de 20% das amostras
pertencentes aos 3 possíveis genótipos para cada variante serão submetidas a sequenciamento para confirmação
dos resultados.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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45
Distribuição de duas variantes genéticas no gene
CYP3A5 na população brasileira
Soares, NA1; Kohlrausch, FB1; Hutz, MH2; Moraes, MO3; Perini, JA1; Ribeiro-dos-Santos, AKC4 RomanoSilva, MA5 Suarez-Kurtz, G1
Divisão de Farmacologia, Instituto Nacional de Câncer, RJ
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS
3
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, CE
4
Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do Pará, PA
5
Departamento de Psiquiatria e Neurologia. Universidade Federal de Minas Gerais, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Brasil, CYP3A5, farmacogenética, polimorfismos
A CYP3A5 é uma enzima polimórfica que metaboliza uma grande variedade de fármacos em uso na prática
clínica, sendo, potencialmente uma importante variável farmacogenética. Alelos de CYP3A5 com relevância
farmacogenética ocorrem com freqüências variáveis entre diferentes grupos étnicos e isto pode ter conseqüências
na resposta ao tratamento farmacológico. A população brasileira é reconhecidamente heterogênea, e, assim, a
extrapolação de dados derivados de grupos étnicos homogêneos não se aplica à maioria dos brasileiros. O objetivo
deste trabalho foi determinar as freqüências de dois polimorfismos funcionais no gene CYP3A5 (alelos CYP3A5*3,
6986A>C e CYP3A5*6, 14690G>A) em 1.032 amostras de DNA de indivíduos residentes em quatro regiões do país
(Norte, Nordeste, Sudeste e Sul, aproximadamente 250 amostras/região). Os voluntários se autoclassificaram em
relação à “cor/raça” de acordo com os critérios do IBGE, como brancos (n = 342), pardos (n=349) e pretos (n=341).
Os polimorfismos foram genotipados através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real.
Foram observadas diferenças significativas na distribuição dos alelos *3 e *6 entre brancos, pardos ou pretos no
conjunto da população e em cada região geográfica (P < 0,0001 em todos os casos). A freqüência do alelo CYP3A5*3
foi maior em brancos, intermediária em pardos e menor em pretos. A tendência oposta foi observada em relação à
freqüência do alelo CYP3A5*6. A freqüência dos alelos CYP3A5*3 e *6 variou significativamente entre as amostras
de brancos (P = 0,03) e de pardos (P = 0,02) mas não entre as de pretos (P = 0,16), provenientes das quatro regiões
geográficas. Este conjunto de resultados é consistente com a heterogeneidade da população brasileira e oferece
subsídios para o desenho de futuros estudos farmacogenéticos em nossa população.
Apoio financeiro: CNPq, Faperj e Finep
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46
CYP2C9 e VKORC1 influenciam na dose terapêutica de
varfarina
Botton, MR1; Bandinelli, E2; Rohde, LEP3; Amon, LC4; Hutz, MH1,2.
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Departamento de Medicina Interna, Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
4
Serviço de Medicina Interna, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: varfarina, CYP2C9, VKORC1, farmacogenética, anticoagulação
A varfarina é um medicamento da classe dos anticoagulantes orais cumarínicos muito utilizada na profilaxia
de doenças tromboembólicas. Existe uma grande variação interindividual na resposta aos cumarínicos, uma
vez que a farmacocinética e a farmacodinâmica do medicamento variam de acordo com fatores ambientais e
genéticos. As enzimas CYP2C9, responsável pela maior parte da metabolização do fármaco, e VKORC1, alvo dos
cumarínicos, estão diretamente envolvidas na farmacocinética e farmacodinâmica da varfarina, respectivamente.
Polimorfismos nesses genes estão relacionados com variação na resposta ao medicamento. O objetivo do trabalho
é investigar a influência dos polimorfismos CYP2C9*2 no gene CYP2C9 e -1639G>A e 1173C>T do gene VKORC1 na
dose/resposta de varfarina. Os polimorfismos foram identificados através da técnica de PCR seguida de clivagem
com endonucleases de restrição (PCR/RFLP). O desequilíbrio de ligação e a estimativa dos haplótipos foram feitos
através do software Arlequin 3.11. A análise do desequílibrio de Hardy-Weinberg foi feito através do χ² no software
BioEstat 5.0. As análises estatísticas em relação às doses de varfarina foram realizadas pelos métodos de KruskalWallis e Student-Newman-Keuls através do software BioEstat 5.0. Até o momento, foram genotipados 77 pacientes
anticoagulados do HCPA com INR alvo variando entre 2,0 e 3,5, de acordo com a patologia. Nesta amostra, a
distribuição genotípica está em Equilíbrio de Hardy-Weinberg para todos os polimorfismos. As frequências dos alelos
CYP2C9*2, -1639A e 1173T do gene VKORC1 foram 18%, 35% e 36% respectivamente, sendo similar às frequências
descritas em outras populações de Eurodescendentes. Os polimorfismos estudados do gene VKORC1 apresentam
desequilíbrio de ligação, os haplótipos mais prevalentes foram o -1639G/1173C – HB (62,9%) e o -1639A/1173T
– HA (33,7%). As diferenças nas doses médias foram estatisticamente significativas (H=17,542; p=0,0015). Os
haplótipos do gene VKORC1 apresentam grande influência na resposta à varfarina, os pacientes HB/HA e HA/
HA necessitam de uma dose 30,8% e 41,8% menor quando comparados a pacientes HB/HB (p=0,0016 e p=0,0003).
O polimorfismo CYP2C9*2 também se mostrou importante nas doses semanais de varfarina da população em
estudo, apresentando médias que variam significativamente entre si (H=8,2491; p=0,0162). Pacientes heterozigotos
para esta variante necessitam de dose 30,2% menor que os homozigotos para o alelo selvagem (p=0,0041). Dessa
forma, os dados obtidos até o momento indicam que os pacientes que possuem o haplótipo HA necessitam de
uma menor dose do anticoagulante varfarina, assim como aqueles portadores do alelo 2C9*2 em nossa população.
Portanto, pacientes que possuem este perfil genético apresentam uma maior sensibilidade ao medicamento,
mostrando a importância do conhecimento do genótipo do indivíduo para que se possa predizer a correta dose
terapêutica para cada paciente, visando o alcance do INR alvo.
Apoio: CNPq, Institutos do Milênio (CNPq), PRONEX e FAPERGS
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O polimorfismo 421C>A do gene ABCG2 não está
associado à eficácia e tolerância ao tratamento com
sinvastatina
Sortica, VA1; Fiegenbaum, M2; Lima, LO 2; Almeida, S2; Hutz, MH1
1
2
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre – UFCSPA
Palavras-chave: ABCG2, 421C>A, polimorfismo, sinvastatina, famacogenética
O ABCG2, também conhecido como proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP), é um transportador de efluxo
da superfamília da “adenosine triphosphate (ATP)-binding cassete” expresso na membrana apical dos enterócitos,
hepatócitos e células renais. O SNP 421C>A (Gln141Lys) do ABCG2 está associado com a redução na atividade desse
transportador in vitro. Os inibidores de HMG CoA redutase (estatinas) rosuvastatina, atorvastatina, fluvastatina e
pravastatina são substratos desse transportador. Estudos de farmacocinética demonstram que o alelo 421A está
relacionado com o aumento da concentração plasmática da atorvastatina e da rosuvastatina. Até o momento,
não existem estudos avaliando a influência desse polimorfismo na resposta ao tratamento com sinvastatina. O
objetivo do presente trabalho foi investigar se o SNP 421C>A está associado à resposta e à tolerância ao tratamento
com o inibidor de HMG Coa redutase sinvastatina. Duzentos e dezessete pacientes hipercolesterolêmicos de
ancestralidade européia da população de Porto Alegre, selecionados por histórico médico, exames físicos, clínicos
e laboratoriais, foram tratados por seis meses com sinvastatina, tendo os níveis de lipídeos e lipoproteínas medidos
antes e após dois e seis meses de tratamento. Dos pacientes que iniciaram o tratamento, 188 completaram o
tratamento de seis meses e foram incluídos na análise de associação à resposta da sinvastatina. Os 29 pacientes
que apresentaram efeitos adversos não completaram o tratamento e foram incluídos na análise de associação da
tolerância ao medicamento. O SNP 421C>A foi determinado por discriminação alélica através da técnica de PCR
em tempo real. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na diferença média percentual
dos níveis de colesterol total (-26,7% e -27,0%; p = 0,532), LDL colesterol (-36,9% e -36,0%; p = 0,937), HDL colesterol
(2,8% e 4,2%; p = 0,446) e triglicerídeos (-7,8% e -12,6%; p = 0,212) entre os pacientes homozigotos 421CC (n = 162)
e os portadores do alelo 421A (421CA e 421AA, n = 26). Não existem diferenças estatisticamente significativas das
frequências alélicas ou genotípicas entre o grupo de pacientes que apresentou efeitos adversos (n = 29) e o grupo
controle (n = 66) de pacientes que utiliza a sinvastatina por mais de um ano sem apresentar efeitos adversos (p
= 0,601 e 0,607; respectivamente). Concluímos que o SNP 421C>A do gene ABCG2 não parece estar associado
à resposta ao tratamento com sinvastatina ou ao aparecimento de efeitos adversos relacionados ao uso desse
medicamento, apesar de estar associado com a diminuição do transporte de outras estatinas.
Institutos do milênio, CNPq, Pronex/FAPERGS
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Análise farmacogenética do gene do transportador
de dopamina e a resposta ao tratamento com
metilfenidato em crianças com o Transtorno de Déficit
de Atenção/Hiperatividade
Genro, JP1; Roman, T1; Rohde, LA2; Hutz, MH1.
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: TDAH, dopamina, DAT1, SLC6A3, transportador de dopamina, metilfenidato
O Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) está entre as doenças psiquiátricas mais comuns
na infância e adolescência, afetando 5.3% de crianças em todo mundo. Os principais sintomas deste transtorno
são a desatenção, a hiperatividade e a impulsividade, acarretando prejuízo significativo na vida familiar, escolar
e social. No que diz respeito à intervenção medicamentosa os estimulantes são os fármacos de primeira escolha,
apresentando efeito na melhora dos sintomas em mais de 70% dos casos. No Brasil, o único estimulante disponível
é o metilfenidato (MPH). O transportador de dopamina apresenta-se como candidato principal nos estudos
farmacogenéticos do MPH, pois além de exercer papel chave na regulação da neurotransmissão dopaminérgica,
ele é o principal sítio de ligação do fármaco. Vários polimorfismos já foram descritos no gene do transportador
de dopamina (DAT1 ou SLC6A3), dentre estes, principalmente aqueles localizados nas regiões flanqueadoras 3’
e 5’ do gene já foram associados ao TDAH. Em um estudo prévio do nosso grupo nós detectamos associação do
gene DAT1 com TDAH apenas na região promotora. O objetivo deste trabalho foi verificar se a variante -839 C/T
(rs2652512) localizada na região promotora do gene está associada com a resposta ao MPH. A identificação dos
genótipos foi realizada através da técnica da PCR, posterior clivagem com enzima de restrição Msp I e visualização
em gel de agarose 2,5 %. A amostra foi composta por 106 crianças ou adolescentes com TDAH tratados com
MPH com dose superior a 0.3 mg/dia. Os pacientes foram avaliados pelo Serviço de Psiquiatria da Infância e
Adolescência do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Foi utilizado como instrumento para avaliação dos
sintomas a sub-escala SNAP IV (Swanson, Nolan e Pelham versão IV), realizada por psiquiatras cegos para os
genótipos e respondida pelos pais dos probandos. Essa avaliação foi utilizada como critério de melhora, sendo
realizada para medidas basais, 1 mês e 3 meses após o início do tratamento. Os dados foram analisados através de
um modelo de ANOVA para medidas repetidas. Pacientes homozigotos para o alelo T apresentaram uma redução
significativamente maior nos sintomas de oposição (p=0,003) e desatenção (p=0,004) quando comparados aos
pacientes portadores do alelo C ao longo dos 3 meses de tratamento. Estes resultados sugerem que a reposta ao
MPH em crianças com TDAH é influenciada pelo genótipo do polimorfismo -839 C/T do gene DAT1. O alelo C
associado com uma pior resposta neste estudo foi detectado como possível alelo de risco para o desenvolvimento
da doença em um estudo prévio do nosso grupo. Estes achados corroboram a importância deste gene no TDAH, e
sugerem que a região promotora do gene DAT1 desempenhe um papel tanto na suscetibilidade ao desenvolvimento
da doença como na resposta ao tratamento com MPH.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, PRONEX, Instituto do Milênio, FAPERGS.
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49
A variante Val158Met do gene COMT e resposta
ao tratamento com metilfenidato em crianças com
transtorno de déficit de atenção e hiperatividade
Salatino-Oliveira, A1; Guimarães, AP1; Genro, JP1; Zeni, C2; Polanczyk, G2; Rohde, LA2; Hutz, MH1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil;
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil;
1
2
Palavras-chave: COMT, Val158Met, TDAH, metilfenidato.
O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é uma doença psiquiátrica comum na infância e
adolescência, sendo caracterizada principalmente por sintomas de desatenção, hiperatividade e impulsividade.
O TDAH é associado com diversas comorbidades, tais como o transtorno opositor desafiante. Vários estudos
confirmam que o TDAH é uma doença complexa, envolvendo o efeito de muitos genes, além da contribuição
ambiental. Sugere-se que pacientes com TDAH apresentem um desequilíbrio nos sistemas das catecolaminas
no córtex pré-frontal. Um dos fármacos mais utilizados em seu tratamento é o metilfenidato (MPH), que age
no aumento dos níveis de catecolaminas na fenda sináptica. O gene catecol-O-metiltransferase (COMT) codifica
uma enzima que atua na degradação das catecolaminas. O polimorfismo Val158Met causa uma substituição
de aminoácido que afeta a estabilidade dessa enzima, sendo a variante valina associada a quatro vezes mais
atividade enzimática do que a metionina. Além disso, evidências da literatura sugerem que este polimorfismo
está associado ao comportamento anti-social em indivíduos com TDAH. O objetivo deste trabalho foi avaliar se
o polimorfimo Val158Met no gene COMT tem um efeito diferencial na resposta aos sintomas de oposição em
crianças tratadas com MPH. A amostra foi composta de 133 crianças com TDAH e sintomas de oposição, tratadas
com MPH. Os pacientes passaram por avaliação clínica pelo Serviço de Psiquiatria da Infância e Adolescência do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A investigação do polimorfismo foi realizada através de PCR e clivagem com
enzima de restrição. Utilizando um modelo linear generalizado (GLM) verificou-se que pacientes portadores do
alelo metionina, quando comparados com pacientes homozigotos para o alelo valina, obtiveram uma melhora
significativamente maior dos sintomas de oposição após o primeiro mês (p= 0,048) de tratamento. Quando os três
primeiros meses de tratamento foram analisados, não houve diferença significativa na melhora dos sintomas entre
os dois grupos (p= 0,101). O achado do presente estudo sugere que o polimorfismo está influenciando a resposta
ao fármaco no primeiro mês de tratamento. Entretanto, cabe ressaltar que, uma vez que esse resultado não se
manteve significativo após o terceiro mês de tratamento, ainda é precoce afirmar o papel desse gene na resposta
ao metilfenidato em crianças com TDAH.
Apoio financeiro: CNPq, Instituto do Milênio, PRONEX, FAPERGS.
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50
Farmacogenética do Metabolismo do Irinotecano:
Prevalência de Polimorfismo da UGT1A1 em Pacientes
com Adenocarcinoma Colorretal Tratados no Instituto
Nacional de Câncer
Oliveira, GLa; Duque, CGa; Povedano, Pa; Santos, EMTb; Zuccherato, LW b; Oliveira, IMa; Stefanoff, CG a;
Casali-da-Rocha, JCa
a.
b.
Instituto Nacional de Câncer (INCA), Banco Nacional de Tumores e DNA
Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratorio de Diversidade de Genetica Humana
Palavras-chave: irinotecano, UGT1A1, farmacogenética, polimorfismos e colorretal
A variabilidade genética hereditária possui um papel fundamental na utilização do irinotecano, um inibidor de
topoisomerase I amplamente utilizado no tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático. Altos níveis
séricos de SN-38, o metabólito mais ativo deste quimioterápico, estão relacionados a defeitos constitutivos na via de
glucoronidação, mais especificamente às variações genéticas da enzima uridina difosfato-glucoronosiltransferase
1A1 (UGT1A1). A variante UGT1A1*28/*28, caracterizada pela presença, em ambos os alelos, de 7 cópias da
repetição TA (TA7) na região promotora do gene, ao invés de 6 cópias (TA6), está associada com maior toxicidade
e taxa de resposta ao irinotecano. A eficiência da transcrição do gene é inversamente proporcional ao número de
repetições TA na caixa TATA (5 a 8 repetições). Entretanto, não está estabelecida a utilidade clínica da genotipagem
da UGT1A1 no ajuste da dose do irinotecano, já que uma redução de dose poderia levar a uma menor toxicidade,
mas também a uma menor resposta no tumor. Além disso, em uma era de crescentes custos dos tratamentos
oncológicos, não se sabe ainda qual o impacto farmacoeconômico que a pesquisa deste polimorfismo teria em
nossa população, tendo em vista a distribuição deste polimorfismo genético varia consideravelmente entre as
populações. O presente estudo teve como objetivo determinar a prevalência do polimorfismo da UGT1A1 em
pacientes com câncer colorretal metastático tratados com irinotecano isolado no INCA entre 2003 e 2006. Foram
avaliados 56 pacientes. A idade mediana foi de 56 anos, sendo que a maioria (63,7%) apresentava metástases
hepáticas. A sobrevida global média após o início do irinotecano foi de 10 meses. A pesquisa do polimorfismo foi
realizada mediante extração do DNA de tecido conservado em bloco de parafina. O número de repetições TA na
região promotora do gene da UGT1A1 foi obtido pela mensuração de produtos da reação de cadeia de polimerase
de primers específicos. Os genótipos encontrados foram: 5/7 em 1 paciente (1,7%); 6/6 em 25 (44,6%); 6/7 em 24
(42%); 6/8 em 1 (1,7%) e 7/7 em 6 pacientes (10,7%). A freqüência do genótipo 7/7 foi semelhante à encontrada
na população branca dos Estados Unidos (11%) e maior que à encontrada em japoneses (0,7 a 2,3%). Aplicando o
modelo preliminar de Palomaki (Genet Med 2009:11:24-34) à nossa população, em se esperando uma efetividade
de 100% da redução da dose evitar neutropenia, 36 pacientes teriam que ser testados para que se evitasse 1 caso,
às custas de 1 paciente adicional cujo tumor não responderia à quimioterapia.
Apoio financeiro: FAPERJ e BNT
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51
A genetic variant significantly associated with response
to antiepileptic drugs in mesialtemporal lobe epilepsy
Silva, MS1; Secolin, R1; Conte, FF; Dogini, DB; Bilevicius, E2; Cendes, F2; Lopes-Cendes, I1
1
2
Department of Medical Genetics;
Department of Neurology; Faculty of Medical Sciences, University of Campinas - UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
Keywords: Farmacogenética, polimorfismo de nucleotídeo único – SNPS, epilepsia de lobo temporal mesial, genotipagem/expressão,
sistema TaqMan (applied biosystems)
Rationale: Mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is associated with a high proportion of patients who do not
respond well to treatment with antiepileptic drugs (AEDs). There is functional evidence that genetic variation, such
as single nucleotide polymorphisms (SNPs), can affect the expression of drug transporter genes. In addition, there
is a previous report of a significant association between an SNP in the ABCB1 gene and pharmacoresistance in a
group of patients with different types of epilepsy; however, this study was not further replicated. The purpose of our
study was to evaluate whether SNPs in drug-transporter genes could be associated with pharmacoresistance to
AEDs in a large group of patients with MTLE. Methods: Consecutive patients with clinical-EEG diagnosis of MTLE
were ascertained at the epilepsy clinic of our University Hospital. We included a total of 138 drug-resistant patients
and compared with 88 drug-responsive patients who were seizure free on AEDs. We genotyped 30 dbSNPs in 4
different genes (RALBP1, ABCB1, ABCC2, ABCC4). Genotyping was carried out using the TaqMan system™ (Applied
Biosystems). The significance of allelic association was assessed using logistic regression (logistf function in R
environment). P-values were corrected by Bonferroni. We also analyzed the genetic structure of both population
groups using Fst and AMOVA with Arlequin v.3.11. In addition, we quantified the expression of ABCC2 transcripts
(using Real-Time PCR, ABI7500, TaqMan system™) in hippocampal tissue collected during epilepsy surgery
in 4 patients with refractory MTLE. Results: Genotypic frequencies for all SNPs studied were in Hard-Weinberg
equilibrium in both groups. Sample power calculation showed a statistical power of 0.98 for detecting association.
The mean Fst was 0.00111 between drug-responsive and drug-resistant patients. Genetic variance between groups
was 0.11 and within groups was 99.88. Logistic regression showed no significant association between any of the
SNPs studied in RALBP1, ABCB1 and ABCC4 and pharmacoresistance. However, we found a significant association
between an exonic SNP rs3740066 (Ile1324Ile), at the ABCC2 gene and pharmacoresistance (p=0.0368); OR = 1.51,
IC (1.01:2.29). In addition, we found that expression of ABCC2 was higher in patients with refractory MTLE when
compared to samples obtained from autopsy material (control) and this difference was statistically significant
(ANOVA, p=0.0170). Conclusion: We found that both populations, drug-resistant and drug-responsive patients with
MTLE, are very similar in their genetic structure. In addition, they both show a large amount of genetic variability
within the groups. We exclude the association between pharmacoresistance to AEDs in patients with MTLE and
SNPs in the ABCB1 gene; by contrast, we found a significant associating between a SNP in the ABCC2 gene and this
phenotype, which was in agreement with a functional essay showing a significantly increase in expression of the
ABCC2 gene in patients with pharmacoresistance to AEDs.
Support: FAPESP
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Identificação de polimorfismos nos genes
N-acetiltransferase 2 e citocromo P450 2E1
em resposta a isoniazida, em pacientes com
tuberculose no estado do Pará
Santos, NPC1; Fernandes, DCRO1; Paiva, SC1; Carvalho, DC1; Silva, CB1; Fernandes, MR1; Ribeiro dos
Santos, AKC1; Santos, SEB1; Hutz, MH2
Universidade Federal do Pará, Instituto Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Departamento de Genética
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tuberculose; Isoniazida; NAT2; CYP2E1; Hepatotoxicidade
A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo, sendo a responsável pela morte anual de cerca
de 1,8 milhões de pessoas, em diferentes partes do mundo. O tratamento da tuberculose consiste no uso de três
diferentes medicamentos: isoniazida (INH), rifampicina (RMP) e pirazinamida (PZA). A INH é metabolizada pela
N-acetiltransferase 2 (NAT2) e pelo citocromo P450 (CYP2E1) portanto polimorfismos nesses genes podem modular
a resposta a esse fármaco em pacientes com tuberculose. No presente estudo, foram investigados 276 pacientes
com tuberculose tratados com isoniazida no Hospital Universitário João de Barros Barreto e na Unidade hospitalar
da Sacramenta, Belém PA. Os pacientes foram separados em dois grupos de acordo com a resposta terapêutica a
isoniazida: O primeiro incluiu 258 indivíduos que não apresentavam hepatotoxicidade e o segundo foi composto
por 18 indivíduos que apresentavam hepatotoxicidade. O gene NAT2 foi analisado através da reação em cadeia
da polimerase seguido de seqüenciamento. Foram identificados nove SNPs associados com a metabolização da
isoniazida. No gene CYP2E1, três SNPs (C1053T; G1293C; T7632A) e um INDEL(96pb) foram investigados. Os três
SNPs foram genotipados por PCR em tempo real utilizando ensaios Taqman-ABI, enquanto que a inserção\deleção
foi identificada por amplificação por PCR e posterior visualização em gel de Agarose 1,5%. Possíveis variáveis
clínicas e demográficas potencialmente confundidoras para o desfecho hepatotoxicidade tais como tabagismo,
etilismo, comorbidades e etnicidade foram investigadas. As variáveis significantes foram posteriormente incluídas
no modelo de regressão logística. Dos alelos identificados 56,5% estavam associados ao fenótipo de acetilação
lenta na amostra total. O risco de hepatotoxicidade foi significantemente associado em indivíduos portadores
de dois alelos de acetilação lenta (P=0,0087;OR=4,83;CI95%1,49-15,68). Em relação ao gene CYP2E1, os resultados
mostram uma prevalência maior, embora não significante de indivíduos homozigotos para o haplotipo selvagem
(*1A-*1A-*1C) no grupo de pacientes que apresentavam hepatotoxicidade (83%) quando comparado ao grupo
que não apresentou essa manifestação (64%). Quando o efeito conjunto dos genes NAT2 e CYP2E1 foi analisado
verificou-se que pacientes homozigotos para alelos de acetilação lenta e para o haplótipo selvagem de CYP2E1
apresentavam um risco significantemente maior de hapatotoxicidade do que pacientes com outros genótipos.
(OR=4,57; 95%CI:1,39-14,99;P=0,012). Esses resultados mostram que a avaliação de vários genes é mais adequada
para predizer os efeitos adversos da isoniazida do que a análise individual de cada gene.
APOIO FINANCEIRO: CNPq; Institutos do Milênio.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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53
Marcadores de ancestralidade do tipo INDEL e controle
genômico: Aplicação em uma investigação sobre
resposta farmacogenética à isoniazida
Fernandes, DCRO1; Santos, NPC1; Paiva, SC1; Carvalho, DC1; Ribeiro-Rodrigues, EM1; Bezerra, CS1;
Fernandes, MR1; Ribeiro dos Santos, AKC1; Hutz, MH2; Santos, SEB1
Universidade Federal do Pará, Instituto Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Departamento de Genética
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hepatotoxicidade, INDEL, tuberculose, Isoniazida, Ancestralidade
A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo, sendo a responsável pela morte anual de cerca de
1,8 milhões de pessoas, em diferentes partes do mundo. A hepatotoxicidade causada pelo uso de medicamentos
anti-tuberculose tem a maior taxa de mortalidade no mundo causada pelo emprego de fármacos nos tratamentos
de diferentes enfermidades. A identificação de genes (e formas alternativas desses genes) responsáveis por efeitos
adversos em resposta aos fármacos pode ser muito útil no estabelecimento de políticas de saúde publica e no
desenho e interpretação de ensaios clínicos. A existência de diferenças inter-étnicas em relação a variabilidade
encontrada em genes envolvidos com resposta aos fármacos, pode ser um fator importante para a interpretação
errônea dos resultados. Em investigações do tipo caso/controle os resultados podem ser mal interpretados em
função da existência de uma estratificação populacional não identificada, entre os dois grupos investigados. Este
fato é particularmente importante quando as investigações são realizadas em populações miscigenadas em um
passado relativamente recentemente (como é o caso da maioria da população brasileira). Neste trabalho nós
empregamos um painel de 48 Marcadores (bialélicos do tipo INDEL- Inserção e Deleção de pequenos fragmentos
de DNA) Informativos de Ancestralidade, para estabelecer o controle genômico de ancestralidade, em uma amostra
de 135 pacientes portadores de tuberculose do Estado do Pará, todos eles tratados com o fármaco Isoniazida. Estes
pacientes foram agrupados segundo a resposta medicamentosa ao tratamento: i) Grupo I, formado por pacientes
que desenvolveram hepatotoxicidade medicamentosa (118 indivíduos) e; Grupo II, formado por pacientes que não
desenvolveram hepatotoxicidade medicamentosa, quando condicionados ao mesmo tratamento (17 indivíduos).
Todas análises foram realizadas empregando a técnica de PCR multiplex (os 48 sistemas são genotipados em três
reações de PCR, seguidas de eletroforese capilar). As estimativas de mistura inter-étnica individual e global foram
realizadas com o programa Structutre v.2.0. No grupo I, os valores globais de mistura interétnica foram: 41% de
ancestralidade européia, 25% de ancestralidade Africana e 34% de ancestralidade indígena. No grupo II os valores
estimados são: 34% de ancestralidade européia, 29% de ancestralidade Africana e 37% de ancestralidade indígena.
Quando se compara os dois grupos a ancestralidade européia é significantemente diferente entre eles (P=0,034),
mostrando que existe subestruturação populacional entre as amostras.
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54
Investigação de possível associação entre o alelo nulo do
gene GSTM1 e o desenvolvimento de hepatotoxicidade
em resposta ao tratamento com Isoniazida, em pacientes
portadores de tuberculose do estado do Pará
Paiva, SC1; Santos, NPC1; Fernandes, DCRO1; Ribeiro dos Santos, AKC1; Hutz, MH2; Santos, SEB1
Universidade Federal do Pará, Instituto Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Departamento de Genética
[email protected]
1
2
Palavras-chave: alelo nulo, GSTM1, Isoniazida, tuberculose e hepatotoxicidade
A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo, sendo a responsável pela morte anual de cerca de 1,8
milhões de pessoas, em diferentes partes do planeta. O tratamento da tuberculose consiste no uso de três diferentes
medicamentos, dentre eles, a Isoniazida (INH). A metabolização deste fármaco é feita, dentre outras, pela ação das
enzimas N-acetiltransferase 2 (NAT2), Citocromo P450 (CYP2E) e Glutationa S-transferase (GST), que produzem e
eliminam metabólitos tóxicos. Polimorfismos nos genes que codificam estas enzimas podem modular a atividade
das mesmas e interferir no risco do paciente desenvolver hepatotoxicidade em conseqüência do tratamento. A
enzima GSTM1 participa da metabolização da INH, degradando as vias tóxicas dos genes CYP2E1 e NAT2. Esse
processo se dá por reações de conjugação entre a glutationa e os substratos, que são solubilizados e liberados do
corpo. Uma das mutações comuns do gene GSTM1 é a deleção de um grande segmento de DNA que elimina a
função da enzima. Quando em homozigose, essa deleção resulta na completa perda da atividade enzimática do
seu portador, o que dificulta o processo de detoxificação. Indivíduos que apresentam pelo menos um dos alelos
funcionais possuem atividade enzimática considerada como normal. No presente estudo, foram investigados
130 pacientes diagnosticados como portadores de tuberculose, em tratamento no Hospital Universitário João de
Barros Barreto, na cidade de Belém (P), em relação à presença, ou não, da deleção do gene GSTM1. Todos os
pacientes investigados eram tratados de forma padrão, com a administração de Isoniazida. Os 130 pacientes foram
reunidos em dois grupos de acordo com a resposta terapêutica a isoniazida: o primeiro incluiu 114 indivíduos que
não apresentavam hepatotoxicidade medicamentosa devida ao tratamento; o segundo grupo foi composto por 16
indivíduos que apresentaram sintomas de hepatotoxicidade após a administração da droga. A presença ou ausência
da deleção foi investigada através de simples reação de PCR seguida de eletroforese em gel de agarose. Neste caso,
a ausência de amplificação identifica indivíduos homozigotos para a deleção e a presença identifica os indivíduos
com uma (heterozigoto) ou duas (homozigoto) cópias do alelo dito normal (sem a mutação). Os dados relativos
ao gene GSTM1 demonstram que 39 indivíduos (34%) que não desenvolveram hepatotoxidade são homozigotos
para a deleção ( freqüência alélica = 0.585). Entre os indivíduos que desenvolveram hepatotoxidade seis (37.5%)
são homozigotos para a deleção ( freqüência alélica = 0.612). As análises estatísticas mostraram que não existe
diferenças significativas (tanto da freqüência do genótipo homozigoto como da freqüência alélica) nos dois grupos
considerados. As diferenças observadas não são significativas do ponto de vista estatístico, mesmo quando se
analisa (através de regressão logística múltipla) os dados em conjunto com as seguintes variáveis independentes:
ancestralidade européia; etilismo; tabagismo e comorbidade. (OR=1,06;95%, CI: 0,33-3,38; P=0,9275).
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55
Genetic polymorphisms of NAT2, CYP2E1, GSTs
enzymes and the occurrence of antituberculosis druginduced hepatotoxicity in Brazilian TB patients
Teixeira, RLF*; Morato, RG; Cabello, PH; Miranda, AB; Muniz, LMK; Moreira, ASR; Kritski, AL; Mello, FCQ;
Suffys, PN; Santos, AR
* Laboratory of Human Genetics, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil
[email protected]
Keywords: Drug-metabolizing enzymes, hepatotoxicity, tuberculosis, isoniazid, pharmacogenetics, Brazilian subjects
The problem of liver adverse reactions induced by antituberculosis drugs is a relevant subject of investigation.
Isoniazid (INH), one of the most important drugs used in antituberculosis treatment, is also the major drug involved
in hepatotoxicity. Differences in isoniazid-induced toxicity have been attributed to genetic variability in several loci
such as NAT2, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1, coding for drug-metabolizing enzymes. Considering the differences in the
NAT2, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 alleles and distribution among interethnic populations, our goal was to evaluate
the contribution of their polymorphisms in the susceptibility to antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in
Brazilian individuals. A total of 167 TB patients treated with isoniazid-containing antituberculosis schemes were
genotyped for NAT2, CYP2E1, GSTM1 and GSTM1 polymorphisms. Genotype and allele frequencies were compared
between TB patients with (cases) or without liver adverse events using multivariate logistic regression analyses.
Among cases, 37 patients presented hepatotoxicity and 27 had drug-induced hepatitis. Statistical analyses revealed
no significant association between CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 genotypes and liver side effects occurrence. However,
slow acetylators had a higher incidence of hepatitis than intermediate/fast acetylators [22% (18/82) versus 9.8%
(6/61); OR, 2.86; CI 95%, 1.06-7.68; p = 0.04). Logistic regression showed that slow acetylation status was the only
independent risk factor for both antituberculosis drug-induced hepatotoxicity (OR, 2.62; 95% IC, 1.75-3.49; p =
0.03) and hepatitis (OR, 3.59; 95% IC, 2.53-4.64; p=0.02). CONCLUSIONS: Slow acetylation status is a significant risk
factor for hepatotoxicity and/or hepatitis occurrence during antituberculosis treatment with isoniazid-containing
schemes in Brazilian individuals.
Financial support: FAPERJ; PAPES V
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56
A influência da interação de polimorfismos na resposta
metabólica medicamentosa
Pinto, PDC1; Machado, A1; Alencar, DO1; Hutz, MH2; Salgado, CG3 Santos, SEB1; Ribeiro-dos-Santos, AKC 1
Laboratório de Antropologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará.
2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
3
Laboratório de Dermato-Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará.
[email protected]
1
Palavras-chave: Resposta medicamentosa, GSTT1, GSTM1, G6PD, N-Ramp, Hanseníase
Introdução: O Brasil é o segundo país do mundo em número de casos registrados e em prevalência de hanseníase,
particularmente no estado do Pará esses números são elevados. O tratamento preconizado pela OMS ao paciente
com hanseníase, baseia-se no uso da poliquimioterapia (rifampicina, dapsona, clofazimina). Entretanto, alguns
polimorfismos presentes em genes que participam do processo de detoxificação celular e proteção contra estresse
oxidativo, podem influenciar o mecanismo de resposta no tratamento da hanseníase. Os genes GSTT1 e GSTM1
são responsáveis pela decodificação de enzimas pertencentes à superfamília das Glutationas S-Transferases (GST),
que englobam principalmente as enzimas de metabolização de Fase II e desempenham um papel fundamental
no metabolismo celular, bem como na modificação e eliminação de compostos eletrofílicos reativos. A G6PD é
uma enzima que catalisa o primeiro passo na via das pentoses fosfato. Sua função é proteger as células dos efeitos
oxidativos dos radicais livres de oxigênio. Enquanto, o gene N-RAMP 1 (transportadores de prótons di-valentes)
codifica uma proteína transmebranar do tipo multi-passe. Esta proteína funciona como um transportador de metal
de transição divalente ( ferro e manganês), envolvido no metabolismo de ferro e na resistência a determinados
micróbios patogênicos. Objetivos: Investigar a relação dos polimorfismos presentes nos genes N-Ramp 1, GSTT1,
GSTM1 e G6PD em 80 pacientes com hanseniase, selecionados de acordo com a progressão da doença ao da
sua resposta ao medicamento, do hospital Marcelo Cândia (PA). Métodos: As amostras de DNA foram extraídas
pela técnica fenol-clorofórmio e posteriormente quantificadas, em seguida foram realizadas técnicas básicas de
biologia molecular (reação em cadeia da polimerase, digestão por endonuclease, eletroforese em suporte sólido) e
seqüenciamento direto no analisador genético ABI 3130 (Applied Biosystems, CA - USA). Resultados: A freqüência
do alelo GSTT1*G foi de 0,966 enquanto que do alelo GSTT1*A foi de 0,034. entre os pacientes. Destes, 45,6% são
homozigotos para a deleção do gene GSTM1 e 5% apresentaram deficiência de G6PD. Em relação ao gene N-Ramp
1, o alelo deleção (4 pb) apresentou freqüência de 0.118. Conclusões: O impacto de um conjunto de variações
polimórficas pode evidenciar uma resposta metabólica diferenciada entre pacientes de doenças negligenciadas.
Desta forma, são necessários estudos mais abrangentes para avaliar a influência da interação destes polimorfismos
na resposta metabólica medicamentosa.
Apoio financeiro: CNPq, FADESP e UFPA.
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57
Análise comparativa do padrão da expressão gênica
em linhagens celulares leucêmicas com e sem o
fenótipo de Resistência a Múltiplas Drogas (MDR)
Bagni, C1,2; Pinho, MB3; Rumjanek, VM4; Moreira, MAM2
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ, RJ
Divisão de Genética, Centro de Pesquisa, INCA, RJ
3
Laboratório de Bioinformática e Biologia Computacional, INCA, RJ
4
Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ, RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: expressão gênica, resistência a múltiplas drogas, MDR, microarray, linhagens leucêmicas
O fenótipo de Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) confere às células mecanismos de resistência simultânea a
diferentes agentes citotóxicos não relacionados, resultando na incapacidade da droga em induzir a morte celular,
permitindo que células tumorais sobrevivam, afetando a resposta dos pacientes ao tratamento quimioterápico.
Existem múltiplos mecanismos que contribuem para este fenótipo: falha na regulação da apoptose, aumento
na detoxificação intracelular, alteração no reparo de danos ao DNA, e ativação ou superexpressão de proteínas
transportadoras de drogas. Neste trabalho procuramos compreender os mecanismos de desenvolvimento de
resistência a múltiplas drogas de maneira global, utilizando uma abordagem genômica em linhagens tumorais. A
fim de verificar a variação do padrão de expressão entre uma linhagem celular sensível a drogas e outra, derivada
desta, resistente a múltiplas drogas, foi feita uma análise comparativa da expressão gênica global por microarranjos.
Utilizamos a linhagem leucêmica mielóide crônica K562, de fenótipo não-MDR e a linhagem K562-Lucena 1,
com fenótipo MDR (esta cultivada em meio de cultura na presença ou na ausência de vincristina). O RNA total
foi extraído, marcado e hibridizado em chips da Affymetrix (GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array), e
digitalizados no GeneChip® Scanner 3000 (Affymetrix). Os dados de expressão gênica foram extraídos e analisados
através do software CARMAweb em conjunto com Bioconductor e normalizados pelo método GCRMA. Os genes
diferencialmente expressos foram selecionados pelo método moderated t-statistics (pacote Limma - Bioconductor)
utilizando estatística bayesiana, valor de cut-off de p ≤ 0,01 e valor absoluto de expressão maior que 4 vezes. Os
valores reais foram corrigidos pelo método Benjamini e Hochberg para o controle do FDR (False Discovery Rate). Os
genes diferencialmente expressos foram classificados pela Ontologia Gênica (GO) com o software Ingenuity Pathway
Analysis (Ingenuity Systems Inc.). Na análise comparativa entre K562 e Lucena sem exposição ao quimioterápico,
encontrou-se um total de 365 genes diferencialmente expressos (p £ 0,01). Lucena apresentou maior número de
genes com expressão diminuída (188) em relação aos genes superexpressos (177). Nas classificações das categorias
funcionais, os resultados obtidos mostraram que a linhagem Lucena, com fenótipo MDR, apresentou uma elevada
expressão de genes relacionados à sinalização intercelular, transporte molecular e organização e morfologia celular;
além de uma baixa expressão de genes envolvidos com crescimento e proliferação celular, e com a expressão
gênica. Os dois genes com maior valor absoluto de expressão em Lucena - MDR1 (~256 vezes mais expresso) e
CD36 (envolvido na fagocitose de células apoptóticas, ~125 vezes mais expresso) - estão relacionados a um pior
prognóstico e menor sobrevida em pacientes com leucemia mielóide aguda. Na comparação entre Lucena exposta
e não exposta ao quimioterápico, não observamos nenhum gene diferencialmente expresso significativamente, de
acordo com nossos critérios de cut-off e valor absoluto de expressão.
Apoio Financeiro: CNPq, Ministério da Saúde, FAF, Swiss Bridge Foundation.
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58
Variabilidade do polimorfismo de 14 pb do gene HLA-G
em populações indígenas
Pincerati, MR1; Labuda, D2; Ruiz-Linares, A3; Meyer, D1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
CHU Sainte-Justine, Département de Pédiatrie, Université de Montréal, Montréal, PQ, Canada
3
The Galton Laboratory, Department of Biology, University College London, London, United Kingdom
1
2
Palavras-chave: HLA-G, polimorfismo, seleção balanceadora, variabilidade genética e populações indígenas
HLA-G é um gene HLA não-clássico com expressão tecido-específica e propriedades imunoreguladoras. Estudos
populacionais encontraram evidência de seleção balanceadora na região promotora desse gene, sugerindo
que o mecanismo seletivo está relacionado com um padrão de expressão altamente regulado. A região 3’UTR
também parece ter um importante papel na regulação da expressão deste gene. Essa região é caracterizada pela
presença de um polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb. Este polimorfismo possui um papel na regulação do
splicing alternativo do gene HLA-G e na estabilidade do mRNA. Devido ao seu papel funcional, muitos estudos
associam esse polimorfismo com complicações gestacionais, tais como aborto recorrente e pré-eclampsia.
Apesar do alelo de inserção estar relacionado com distúrbios da gravidez, estudos populacionais, especialmente
em populações indígenas da Amazônia, sugerem o efeito de seleção balanceadora (vantagem de heterozigoto)
atuando na manutenção dos alelos de inserção e deleção em freqüências semelhantes. Entretanto, devido ao
fato de haver evidências de seleção balanceadora na região promotora desse gene, não está claro se o padrão de
variação encontrado é conseqüência de ação direta de seleção ou de efeito carona. Na tentativa de contribuir
para um melhor entendimento do padrão de variação do polimorfismo de 14pb do gene HLA-G, populações
indígenas da América do Sul foram analisadas neste trabalho. Foram genotipados 36 indivíduos das populações
Arhuaco, Embera e Kogi. O polimorfismo de 14pb foi amplificado por PCR e analisado em gel de poliacrilamida
6%. As freqüências encontradas foram de 62,5% e 37,5%, para a inserção e deleção, respectivamente. Os resultados
mostram que essas populações apresentam freqüências semelhantes às encontradas para as outras populações
indígenas estudadas, sugerindo um mesmo mecanismo evolutivo na manutenção das freqüências desses alelos
nas populações indígenas Nativo-Americanas.
Apoio financeiro: FAPESP
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59
Análise do polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb
(rs1074) do gene HLA-G em populações indígenas sul
americanas
Cazarolli, JC; Malinsky, FR; Veit, T; Bortolini, MC; Salzano, FM; Chies, JAB; Schiengold, M
Laboratório de Imunogenética, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: HLA-G, fertilidade, ameríndio, polimorfismo, imunogenética
HLA-G é uma molécula de classe I não clássica do MHC, que foi inicialmente descrita como estando envolvida na
proteção do feto semi-alogênico contra a resposta imune da mãe, durante a gravidez. Diferentes polimorfismos
já foram descritos para o gene HLA-G, entre os quais se destaca o polimorfismo de inserção/deleção de 14bp,
no éxon 8. Entre outras situações, este polimorfismo tem sido associado ao desenvolvimento de doenças autoimunes e pró-inflamatórias, tais como artrite idiopática juvenil e lupus eritematoso sistêmico. Até o momento,
amostras de DNA de 238 índios amazônicos, pertencentes a 21 diferentes tribos (Apalai, Assurini, Ayoreo, Caiapó,
Caingang, Galibi, Gavião, Gorotire, Kuben-Kran-Kegn, Mapuche, Munducuru, Mura, Pacas Novos, Parakanã, Surui,
Tenharin, Urubu Kaapor, Xavante, Xicrin, Yanomama, Zoró), foram estudadas com relação a esse polimorfismo.
Analisando-se as diversas tribos em conjunto, quinze por cento dos indivíduos foram homozigotos para a inserção,
57% heterozigotos e 28% homozigotos para a deleção. Verificou-se que as frequências genotípicas não estão em
equilíbrio de Hardy-Weinberg, o que pode ser explicado pelo baixo número amostral referente a algumas das tribos
analisadas. Quando consideradas individualmente, seis tribos apresentaram excesso e uma tribo apresentou
deficiência de heterozigotos. Uma tribo apresentou o alelo de deleção fixado. As frequências alélicas encontradas
foram de 0,43 para o alelo de inserção e 0,57 para o alelo de deleção, não diferindo significativamente quando
comparadas com uma amostra controle de nosso laboratório (n = 356 indivíduos Euro-descendentes; 0,42 para
o alelo de inserção e 0,58 para o alelo de deleção). Nossos resultados indicam a ocorrência de um maior número
de indivíduos heterozigotos como responsável pelo desvio do equilíbrio de Hardi-Weinberg nos grupos indígenas
analisados, em concordância com estudos anteriores, que sugerem uma seleção balanceadora.
Auxílio financeiro: CNPq.
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60
Haplotype diversity of the HLA-G 3´ untranslated region
Mendes-Junior, CT1; Castelli, EC2; Deghaide, NHS2; Albuquerque, RS2; Muniz, YCN2; Simões, RT2;
Carosella, ED3; Moreau, P3; Donadi, EA2
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-901, Ribeirão
Preto-SP, Brasil
2
Divisão de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
14048-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil.
3
Commissariat à l’Energie Atomique/DSV/I2BM/Service de Recherches en Hémato-Immunologie, IUH, Hôpital Saint-Louis, 75010 Paris.
1
Keywords: population genetics, genetic diversity, HLA-G, SNPs, 3’UTR
The HLA-G gene is a non-classical class I HLA locus, predominantly expressed at the maternal–fetal interface. It
has been associated with maternal–fetal tolerance and in the inhibition of cytotoxic T lymphocyte and natural
killer cytolytic functions. At least two variations in the 3´untranslated region (UTR) of the HLA-G locus are
associated with HLA-G expression levels, the 14-bp deletion/insertion polymorphism and the +3142 SNP. However,
this region has not been completely characterized yet. Given that, and since the Brazilian population is a rich
repository of HLA variations, the variability of the 3´UTR of the HLA-G gene and its haplotype structure were
characterized in 155 individuals from Southeastern Brazil, as well as the HLA-G allele associated with each 3´UTR
haplotype. Eleven 3´UTR haplotypes were found, eight of them with frequencies higher than 1%. Several HLA-G
alleles presented only one 3´UTR haplotype. In addition, a high linkage disequilibrium among the variation sites
was detected, especially among the 14-bp insertion and the alleles +3142G and +3187A, all previously associated
with low mRNA availability, demonstrating that their effect may not be independent. Since the variation in the
promoter region per se does not fully explain the differential expression profile observed for several HLA-G alleles,
the detailed analyses of the 3´UTR of the HLA-G locus may shed some light into the mechanisms underlying the
regulation of HLA-G expression.
FINANCIAL SUPPORT: CNPq/Brazil (Grant 475670/2007-8) and CAPES/COFECUB (Grant 653/09). C.T.M.J.
(07/58391-4) was and E.C.C (07/58420-4) is supported by post-doctoral fellowships from FAPESP/Brazil.
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Relação entre polimorfismos e haplótipos da região
3’ UTR do HLA-G e carcinoma papilífero de células
transicionais em bexiga
Muniz, YCN1; Castelli, EC1; Simões, RT1; Mendes-Junior, CT2; Castelar, L3; Cologna, A4; Carosella, ED5;
Moreau, P5; Donadi, EA1
Divisão de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
14048-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil.
2
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-901, Ribeirão
Preto-SP, Brasil.
3
Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14048-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil.
4
Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14048-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil.
5
Commissariat à l’Energie Atomique/DSV/I2BM/Service de Recherches en Hémato-Immunologie, IUH, Hôpital Saint-Louis, 75010 Paris.
1
Palavras-chave: HLA-G, 3’UTR, carcinoma de bexiga, imunogenética, polimorfismos
O antígeno leucocitário humano G (HLA-G) desempenha um papel importante na regulação da resposta imune,
inibindo a função de citolítica das natural killer e células T citotóxicas, e com um papel fundamental na progressão
tumoral. Em um estudo anterior, avaliando polimorfismos da região codificadora do HLA-G, foi detectado alguns
alelos associados com tumores de bexiga de alto grau particularmente em tabagista, enfatizando a associação dos
alelos G * 010401 e G * 010404 com a alta suscetibilidade à tumores de alto grau. Sabendo que polimorfismos da
3’UTR do HLA-G têm sido associados com a disponibilidade e estabilidade do mRNA, incluindo sítio de ligação
de miRNA, o objetivo deste estudo foi explorar a possível influência desta região na suscetibilidade ao carcinoma
transitório de bexiga (TCC) e o desenvolvimento e progressão em pacientes fumantes e não fumantes, em uma
nova amostra de 74 pacientes brasileiros. Os sítios polimórficos da 3’UTR no éxon 8 incluiu a indel de 14-pb e 6
SNPs (3003 T/C, 3010 C/G, 3027 A/C, 3035 C/T, 3142 G/C e 3187 A/G), todos avaliados pelo seqüenciamento direto
do produto da PCR. Haplótipos para esta região foram obtidas por inferências probabilísticas. Os pacientes foram
estratificados em quatro subgrupos de acordo com o grau do tumor e o estado de tabagismo. Ambos, pacientes e
controles, apresentaram oito haplótipos 3’UTR. Comparações entre pacientes e controles não revelou diferenças
significativas em relação as freqüências alélicas, genotípicas e haplótípicas, considerando pacientes como um todo
ou após a estratificação dos pacientes, no entanto, uma tendência ao aumento do haplótipo 14pb Del-TCCCGA
(associada aos alelos G*010401 e 010404) foi observada entre os pacientes com tumores de alto grau. Considerando
os resultados anteriores sobre os polimorfismos da região codificadora do HLA-G e susceptibilidade ao TCC, e
dado o elevado desequilíbrio ligação entre haplótipos da 3’UTR do HLA-G e os alelos HLA-G, estudos adicionais
abrangendo uma amostra maior pode ser conduzida para explorar ainda mais esta associação.
Apoio Financeiro: CNPQ
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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62
Avaliação do polimorfismo de deleção/inserção de 14
pb na molécula HLA-G em pacientes infectados com os
vírus da hepatite B e C
Toledo, SS1,2; Dadalto, JD1,2; Soares, CP3; Donadi, EA4; Souto, FJD5; Bassi, CL1,6
Laboratório de Investigação Médica – Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Federal do Mato Grosso (FCM-UFMT)
Instituto de Biociências de Mato Grosso (IB-UFMT)
3
Depto. Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Estado de São Paulo (UNESP-Araraquara)
4
Depto. Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP)
5
Depto. de Clínica Médica da FCM-UFMT
6
Depto. de Ciências Básicas da FCM-UFMT
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hepatite B, hepatite C, HLA-G, polimorfismo, 14pb
As hepatites virais (B e C) são um importante problema de saúde mundial, acometendo milhões de pessoas.
A molécula de imunhistocompatibilidade HLA-G tem sido relacionada como um mecanismo de evasão da
resposta imune do hospedeiro que pode ser utilizado por vírus, mas o papel desta molécula nas hepatites B e
C ainda não foram investigados. Esse trabalho tem por objetivo determinar a freqüência do polimorfismo 14pb
del/ins em indivíduos portadores dos vírus HBV e HCV, comparando com a de indivíduos não afetados pela
doença. Foram obtidas amostras de DNA de 50 pacientes com HBV e 24 com HCV, além de 55 controles, sendo o
polimorfismo determinado através da técnica de PCR. As bandas dos polimorfismos 14pb ins (152 pb) e 14pb del
(138 pb) foram visualizadas em gel de poliacrilamida a 10% corado com prata. Quando comparados os genótipos
entre pacientes HBV e controles, foi observado um número maior de indivíduos homozigotos para deleção de
14pb (14pb del/del) em relação aos homozigotos para inserção (14pb ins/ins), no grupo de pacientes (p=0,05,
OR=3,73, IC95% 1,1-12,67), sendo que a freqüência do alelo 14pb del também apresentou-se significativamente
aumentada nos pacientes em relação aos controles (p=0,05; OR=1,79, IC95%:1,03-3,12). Considerando que os
genótipos 14pb del/del e 14pb del/ins conferem mesmo fenótipo de expressão de HLA-Gs, indivíduos com esses
genótipos foram agrupados e comparados aos indivíduos 14pb ins/ins, sendo observado um maior número de
indivíduos 14pb del/del e heterozigotos no grupo de pacientes em relação ao grupo controle (p=0,05, OR=3,07,
IC95% 1,02-9,28). Não houve diferença estatisticamente significativa em nenhuma comparação entre o grupo de
pacientes com HCV e grupo controle (p>0,05). Os dados obtidos até o momento sugerem que o polimorfismo
14pb del pode conferir maior suscetibilidade para a infecção crônica pelos vírus da hepatite B. Existem
evidências que o polimorfismo de deleção/inserção de 14pb (14pb del/ins) pode estar fortemente relacionado
com diferenças na expressão gênica da forma solúvel da molécula (HLA-Gs). Já foi demonstrado que indivíduos
14pb ins/ins apresentam níveis significativamente reduzidos de expressão de HLA-Gs em comparação com
aqueles 14pb del/del e del/ins, o que poderia facilitar a eliminação do vírus pelo sistema imune e contribuir
para a menor freqüência desses indivíduos na amostra analisada. A análise num número maior de amostras,
bem como a verificação da associação desses polimorfismos com manifestações clínicas da doença, ajudarão a
elucidar o papel deste polimorfismo nas hepatites virais.
Apoio: FAPEMAT, CNPq e CAPES
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63
Análise preliminar do polimorfismo +3142 do gene
HLA-G em pacientes com lupus eritematoso sistêmico
Consiglio, CR1; Veit, TD1; Mucenic, T2; Monticielo, O2; Xavier, RM2; Brenol, JCT2; Chies, JAB1
1
2
Laboratório de Imunogenética UFRGS
Serviço de Reumatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Palavras-chave: Lúpus eritematoso sistêmico, HLA-G, miRNA
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é um doença inflamatória auto-imune que envolve diversos órgãos e sistemas.
Sua etiopatogênese permanece desconhecida, porém, provavelmente, possui origem multifarotial, envolvendo
interações entre fatores genéticos, hormonais imunológicos e ambientais. A molécula de HLA não clássica HLA-G
é induzida no curso de patologias inflamatórias e sua expressão foi sugerida como um possível mecanismo de
proteção tecidual contra respostas inflamatórias auto-imunes. MicroRNAs parecem estar envolvidos na regulação
da expressão do gene HLA-G através de um provável sítio de ligação na região 3’ não traduzida. Dentro dos 20nt
deste sítio de ligação, existe um polimorfismo (+3142C/G - rs1063320) responsável por uma diferença na afinidade
da ligação pelo microRNA (miRNA) e na supressão da tradução. Neste estudo, foi investigada a influência do
polimorfismo +3142 do gene HLA-G em pacientes de LES, analisando 83 pacientes com LES e 328 controles. Métodos:
Pacientes e controles foram genotipados por PCR com primers específicos para a região 3’ do gene HLA-G seguido
da clivagem dos fragmentos amplificados com a enzima BaeG I. Resultados: Ambos os grupos encontravam-se
em equilíbrio de Hardy-Weinberg. O genótipo GG encontrava-se em maior frequência no grupo de pacientes, mas
esta diferença não foi significativa (31,0% contra 26,5%, OR = 1,24 CI 95%: 0,77 - 1,98). Também observou-se, nos
pacientes, uma maior frequência do alelo G, não significativa (57,5% contra 52,3%, P = 0,238). Discussão: Como
o HLA-G está relacionado a processos de imunorregulação da resposta imune, infere-se que sua presença seria
um fator favorável no controle da inflamação inerente ao LES. O alelo G está associado a uma maior afinidade de
ligação dos miRNAs ao mRNA de HLA-G e, consequentemente, a uma menor expressão dessa molécula. Dessa
forma, a maior frequência observada do alelo G e do genótipo GG nos pacientes era esperada. Entretanto, os dados
atuais do estudo não são suficientes para confirmar um papel para o polimorfismo +3142C/G na patogênese do
LES. Nesse prisma, o aumento no número amostral será de suma importância para o esclarecimento do real papel
desse polimorfismo na patologia do LES.
Apoio financeiro: CNPq
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64
Estudo do polimorfismo de deleção/inserção de 14pb
na molécula de imunohistocompatibilidade G (HLA-G)
em pacientes com hanseníase
Leotti, NF1; Ramos, JMH1; Donadi, EA2; Soares, CP3; Souto, FJD4; Toledo, SS5; Dadalto, JD5; Bassi, CL6
Laboratório de Investigação Médica – Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Federal do Mato Grosso (FCM-UFMT)
Depto. Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP)
3
Depto. Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Estado de São Paulo (UNESP-Araraquara)
4
Depto. de Clínica Médica da FCM-UFMT
5
Instituto de Biociências de Biociências IB-UFMT. 6Depto. de Ciências Básicas da FCM-UFMT
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Polimorfismo, 14pb, HLA-G, Hanseníase
A hanseníase é uma doença infecciosa de evolução lenta e com muitos desfechos clínicos, dependentes da
resposta imune mais ou menos efetiva que os acometidos apresentam. A resposta imune Th1 é mais efetiva para
forma tuberculóide determinando uma doença mais contida, diferente da forma “virchowiana”, onde a resposta
imune Th1 é pouco eficaz. Nos últimos anos, vários estudos apontam a molécula HLA-G como um modulador
da resposta imune, inibindo a resposta Th1. Um dos polimorfismos descritos para HLA-G é a inserção/deleção
de 14pb no exon 8, o qual pode influenciar a expressão da forma solúvel da molécula (HLA-Gs). O objetivo deste
trabalho é avaliar a freqüência do polimorfismo de inserção/deleção de 14pb no gene de HLA-G em indivíduos
portadores de hanseníase. Até o momento, 52 pacientes portadores de hanseníase e 55 controles foram avaliados
para o polimorfismo de inserção/deleção de 14pb por PCR com primers específicos, sendo que os produtos de
amplificação foram visualizados em gel de poliacrilamida a 10% corado com nitrato de prata. A análise estatística
(teste de Fisher) demonstrou que não houve associação do polimorfismo (p>0,05) com a doença, sugerindo que
o polimorfismo de 14pb não influencia a resposta imune na hanseníase. No entanto, esses resultados ainda são
preliminares, e este estudo está tendo continuidade com a ampliação do número amostral e com a busca por
associação desse polimorfismo também com as manifestações clínicas da doença, de modo a verificar a real
contribuição do mesmo para a doença.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES E FAPEMAT.
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65
Estudo de associação entre o polimorfismo de base
única na região 3’UTR do gene IL12RB1 e a hanseníase
Moreira, SJM1; Cardoso, CC1; Moraes, MO1
Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hanseníase, FIOCRUZ – RJ
[email protected]
1
Palavras-chave: hanseníase, polimorfismo, IL-12, IL-23, IFN-γ
A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium
leprae, o qual infecta principalmente macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. Apesar
da existência de um tratamento eficaz, a hanseníase ainda representa um problema de saúde pública em países
subdesenvolvidos em virtude de sua alta incidência. Sabe-se que a resposta imune do hospedeiro influencia
tanto na suscetibilidade quanto no curso da infecção, uma vez que a doença não é desenvolvida por todos os
indivíduos expostos e apresenta amplo espectro de formas clínicas. Por esta razão, diversos estudos têm sido
desenvolvidos com o propósito de identificar variações genéticas associadas à esta doença. Considerando a
importância do eixo IL-12/IFN-γ na resposta a patógenos intracelulares, qualquer gene que codifique para tais
citocinas ou seus receptores constitui um importante candidato para estudos de associação. Neste contexto,
estudos prévios desenvolvidos no laboratório detectaram associação entre polimorfismos de base única (SNP) nos
genes IFNG e IL12B e o desenvolvimento de hanseníase. O gene IL12RB1 também desempenha um papel essencial
para o funcionamento deste eixo da resposta, uma vez que a cadeia IL12Rb1 está presente nos receptores das
interleucinas 12 e 23, ambas responsáveis por estimular a produção de IFN-γ. Por esta razão, o presente estudo teve
como objetivo verificar se existe associação entre o SNP rs3746190, localizado na região 3’UTR do gene IL12RB1
e a hanseníase, utilizando um desenho de estudo do tipo caso-controle composto por 1005 indivíduos, sendo 395
casos e 610 controles. A genotipagem foi realizada através do método PCR – RFLP com o auxílio da enzima de
restrição AvaI. As comparações entre as frequências deste SNP em pacientes e controles foram realizadas através
de modelos de regressão logística e demonstraram que os carreadores do alelo T apresentam uma chance reduzida
de desenvolver a doença (OR = 0,63; p = 0,004). Os valores de OR dos genótipos TC e TT (0,66 e 0,52, respectivamente)
sugeriram ainda um efeito dose-dependente, o que foi confirmado pelo teste de qui-quadrado de tendência (p =
0,004). Entretanto, não foi observada associação desse polimorfismo com o desenvolvimento de formas localizadas
ou disseminadas da doença. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que o SNP rs3746190 está associado
à proteção contra a hanseníase per se.
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66
Variabilidade do gene NAT2 e Perfil de Acetilação em
Hansenianos do Estado de Rondônia
Santos, RA1; Pinto, RS2; Lopes, MQP2; Narahashi, K3; Suffys, PN2; Santos, AR2; Moura, MMF1
Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnolocia – CIBEBI -Universidade Federal de Rondônia
Laboratório de Biologia Molecular aplicada a Micobactérias – Instituto Oswaldo Cruz, IOC- FIOCRUZ
3
Policlínica Oswaldo Cruz, Porto Velho – RO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SNPs, NAT2, hanseníase, acetilação
As variações genéticas humanas entre elas as inter-étnicas podem influenciar, pelo menos em parte, a variabilidade
da resposta a drogas, principalmente na incidência de efeitos adversos e interações medicamentosas. Polimorfismos
genéticos que influenciam na resposta a drogas podem existir em genes codificadores de enzimas metabolizadoras
de drogas e tais polimorfismos podem influenciar a atividade biológica final da enzima levando ao aparecimento
de desfechos desfavoráveis. A enzima N-acetiltransferase2 humana (NAT2), codificada pelo gene NAT2 é primordial
na acetilação de diversas drogas, como a dapsona, usada no tratamento da hanseníase. Até o momento, já foram
identificados 53 alelos para este gene, os quais consistem na combinação de até quatro SNPs na região codificante.
Dependendo dos polimorfismos presentes no gene, três fenótipos são possíveis: acetiladores lentos, acetiladores
intermediários e acetiladores rápidos. Os acetiladores lentos seriam mais suscetíveis a reações adversas a drogas
metabolizadas pela enzima N-acetiltransferase2. A população brasileira, miscigenada, se distribui no território
nacional de modo diverso nas diferentes regiões. Tendo em vista a diversidade alélica do gene NAT2 de acordo
com a etnia, supõe-se que o padrão de resposta às drogas metabolizadas pela enzima NAT2 deve ser diferente
dependendo da população estudada. O objetivo desta pesquisa foi descrever os SNPs do gene NAT2 existentes na
população de Rondônia, bem como os fenótipos de acetilação presentes. A identificação de SNPs foi realizada a
partir do seqüenciamento direto da região codificante do referido gene, que contém 1093 pb (“intronless” – 873pb).
Foram utilizadas amostras de sangue de pacientes do estado de Rondônia em tratamento para hanseníase com
esquemas contendo dapsona. A análise do DNA de 60 indivíduos mostrou que 10 SNPs mais freqüentemente
relatados na literatura estavam presentes na população estudada. Dentre os SNPs associados com acetilação lenta,
os mais freqüentes foram: G191A; T341C; G590A e G857A com freqüências de 0,0666; 0,6666; 0,4166; e 0,2333. Os
SNPs C282T; C481T e A803G (não relacionadas ao fenótipo NAT) estavam presentes com freqüências de 0,6333;
0,4666 e 0,1666. Os fenótipos apresentaram as seguintes freqüências: Acetiladores rápidos (0,0877), acetiladores
intermediários (0, 4912) e acetiladores lentos (0,4210). Os dados apresentados mostram que a população de
Rondônia possui uma alta freqüência de acetiladores lentos, o que poderia estar associado a um maior risco de
reações adversas a dapsona.
Apoio financeiro: Capes e FNS – Ministério da Saúde.
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Multiplex sequence-specific PCR reveals association of
MASP2*V377A with susceptibility to lepromatous and
borderline leprosy
Boldt, ABW¹; Sanchez, MIN¹; Stahlke, ERS2; Messias-Reason, IJT¹
¹Laboratório de Imunopatologia Molecular – Hospital de Clínicas, UFPR, Curitiba, PR
2
Departamento Estadual de Saúde do Paraná – Curitiba, PR
[email protected]
Keywords: multiplex PCR, PCR-SSP, leprosy, MASP2, FCN1, polymorphism
Leprosy is caused by intracellular Mycobacterium leprae infection. It is considered one of the most ancient of human
diseases, comprising a wide range of manifestations ranging from lepromatous leprosy to less severe tuberculoid
leprosy. Mannose-binding lectin (MBL) may enhance the attachment and ingestion of M. leprae and other
intracellular pathogens that exploit complement receptors to invade phagocytes. MBL and ficolins (FCN) both
initiate the lectin pathway of complement upon recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)
and activation of MBL-associated serine proteases (MASPs). In a previous study, we identified an association of
low MBL levels and corresponding MBL2 haplotypes with lepromatous and borderline leprosy. In this work, we
investigated single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the FCN1 and MASP2 genes in 214 leprosy patients (mean
age 50.5 years [range 15-94 years], 39% female, 61% male) and 203 controls (mean age 36.1 years [range 16-71
years], 42% female, 58% male) from Southern Brazil. Patient diagnosis followed the classification of the leprosy
spectrum criteria of Ridley and Jopling, being 127 lepromatous (LP), 30 borderline (BL), 22 tuberculoid (TB) and
13 indeterminate (ID) (21 were unspecified). Informed written consent was obtained from all individuals and the
study was approved by the local medical ethics committee. To expedite SNP identification, we simultaneously
genotyped the rs2989727 SNP in the FCN1 distal promoter region, rs7548659 SNP in the MASP2 promoter,
rs17409276 in MASP2 intron 8 and rs2273346 (p.V377A) in MASP2 exon 9 using multiplex PCR with sequencespecific primers. We also evaluated the intron 8 and exon 9 MASP2 SNPs with forward-reverse primers to allow
SNP phasing. Interpretation was based on the electrophoretic pattern of the amplified fragments. Statistics was
done using the Arlequin v.3.1 software package and Fisher’s exact test. Genotype distributions were in Hardy and
Weinberg equilibrium and comparable to those found in admixed populations with major European component.
The MASP2*V377A allele (in absolute linkage disequilibrium with C allele in intron 8) was found associated with LP
and BL, as opposed to TB and ID (5.4% or 16/298 and 0% or 0/70, respectively, P = 0.037). The substitution of V by A
probably decreases the hydrophobic interaction in the inner core of the CCP2 domain of the MASP-2 protein and is
known to decrease MASP-2 levels in serum. Lower MASP-2 levels due to the p.V377A SNP could therefore increase
susceptibility to more severe forms of leprosy.
Financial support: CAPES and CNPq.
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68
Estudo de associação entre polimorfismos de base
única no gene IFNG e a hanseníase
Cardoso, CC1; Pereira, AC2; Brito-de-Souza, VN2; Maniero, VC1; Parelli, FPC2; Moraes, MO1
Instituto Oswaldo Cruz - Laboratório de Hanseníase – Fiocruz – RJ
Instituto Lauro de Souza Lima - Bauru – SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hanseníase, IFN-g, SNPs, suscetibilidade genética, estudos de associação
A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium
leprae. Apesar da eficácia do tratamento, ainda hoje a hanseníase representa um problema de saúde pública em
diversos países em virtude de sua alta incidência. Por esta razão, muitos pesquisadores têm concentrado cada
vez mais os seus esforços no desenvolvimento de ferramentas que possam auxiliar no diagnóstico precoce, bem
como na identificação dos indivíduos mais suscetíveis à doença. Seguindo esta tendência, diversos estudos de
epidemiologia genética têm demonstrado associação entre a hanseníase per se e a presença de polimorfismos de
base única (SNPs) em genes de proteínas do sistema imunológico. Tendo em vista o papel crucial do interferon-g
na resposta a patógenos intracelulares, o presente estudo teve como objetivo verificar a associação entre os SNPs
IFN+874 e rs2069727 e o desenvolvimento de hanseníase per se. Para este fim, foram desenvolvidos dois estudos
de caso-controle independentes utilizando amostras obtidas das populações das cidades de Bauru (SP) e Rio de
Janeiro (RJ). A genotipagem dos SNPs foi realizada através das metodologias de PCR-ARMS e discriminação alélica
por PCR em tempo real. As análises estatísticas incluíram a comparação entre as freqüências de casos e controles
através de modelos de regressão logística com o auxílio do software R. Na primeira etapa do estudo, ambos os SNPs
foram genotipados na amostra de Bauru. Os resultados obtidos indicaram que tanto os carreadores do alelo +874T
quando do alelo rs2069727C apresentaram chance reduzida de desenvolver a doença, com valores de OR iguais a
0,40 (p = 0,004) e 0,37 (p = 0,006), respectivamente. Este efeito se mostrou étnico-específico em ambos os casos,
uma vez que a proteção só foi observada em indivíduos afro-descendentes. As análises de desequilíbrio de ligação
demonstraram ainda que os SNPs +874 e rs2069727 pertencem ao mesmo bin (r2 > 0,8), o que possibilitou o uso de
apenas um dos SNPs como tag para o haplótipo. Por esta razão, o estudo de replicação conduzido na amostra do
Rio de Janeiro incluiu apenas a genotipagem do SNP da posição +874. Os resultados obtidos a partir deste segundo
estudo confirmam o efeito protetor observado nos carreadores do alelo +874T (OR=0,59; p = 0,01), reforçando a
importância deste SNP no desenvolvimento da hanseníase. Além disso, o efeito do SNP também foi observado
especificamente no subgrupo de indivíduos afro-descendentes desta amostra. Os resultados obtidos a partir dos
dois estudos demonstram que o alelo +874T confere proteção contra a hanseníase per se e sugerem fortemente que
este efeito seja étnico-específico.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Estudo genético de associação entre polimorfismos no
gene VDR e a hanseníase
Marques, CS1; Cardoso, CC1; Moraes, MO1
Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Hanseníase, FIOCRUZ-RJ
[email protected]
1
Palavras-chave: hanseníase, VDR, polimorfismos, genotipagem, estudo caso controle
O estudo da hanseníase é uma estratégia de saúde pública nacional e internacional, visto que esta doença
infecciosa afeta 400.000 novos pacientes a cada ano. O sucesso da infecção se dá pela capacidade do patógeno,
Mycobacterium leprae, em subverter a resposta imunológica e proliferar-se lentamente em macrófagos de pele
e células de Schwann nos nervos. O desfecho da doença está associado tanto a fatores ambientais quanto
genéticos, sendo que diversos estudos indicam que variações genéticas no hospedeiro podem alterar o seu perfil
imunológico, podendo influenciar na susceptibilidade e no curso da infecção. Desta forma, tem-se buscado
identificar marcadores genéticos que explicariam a susceptibilidade/resistência de determinados indivíduos à
doença. O gene do receptor da vitamina D (VDR) tem sido considerado um relevante candidato para estudos de
associação com a hanseníase, uma vez que está envolvido em rotas imunorregulatórias mediadas pela vitamina
D, ao estimular a produção de microbicidas por macrófagos ativados. O objetivo do trabalho foi verificar se existe
associação entre os polimorfismos localizados no gene VDR e o desenvolvimento de hanseníase per se, através de
um estudo caso-controle composto por 1003 indivíduos (416 casos e 587 controles). Para tal fim foram utilizados
dois polimorfismos de base única (SNPs), um localizado no start códon do éxon 2 (rs2228570), e outro no códon 352
do éxon 9 (rs731236). As genotipagens dos polimorfismos foram realizadas através de PCR-RFLP, e as comparações
entre as freqüências dos mesmos em casos e controles foram realizadas através de modelos de regressão logística
com ajuste para as covariáveis sexo e etnia. Todas as análises foram conduzidas com o auxílio do software R,
versão 2.6.1. Os resultados obtidos indicaram que a presença do alelo T no SNP rs2228570 confere proteção ao
desenvolvimento de hanseníase per se, com valores de OR iguais a 0,62 (CT; p = 0,0018) e 0,41 (TT; p = 0,0004).
Os carreadores do alelo T apresentaram uma OR de 0,57 (p = 0,0001). Já o polimorfismo rs731236 não se mostrou
associado, porém as análises com haplótipos mostraram que indivíduos portadores da combinação dos alelos T
no SNP rs731236 e T no rs2228570 possuem menos chance de desenvolvimento da doença (OR = 0,50; p = 0,0068).
Assim, estes resultados demonstram que a presença do polimorfismo rs2228570 do gene VDR contribui para a
proteção ao desenvolvimento da hanseníase per se.
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70
Evolutionary insights into CD80 and CD86 Gene
Polymorphisms
Beltrame, MH1; Pincerati, MR1; Dalla-Costa, R1; Tsuneto, LT3; Freire-Maia, EAC2; Petzl-Erler, ML1
Laboratório de Genética Molecular Humana
Laboratório de Polimorfismos e Ligação, UFPR, Curitiba, Brazil
3
Departamento de Análises Clínicas, UEM, Maringá, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: CD80, CD86, population genetics, Amerindians, B7 molecules
CD80 and CD86 are homologous genes, closely linked on chromosome 3 (3q21), that encode for structurally
related glycoproteins, members of the immunoglobulin superfamily. They are expressed on the surface of antigen
presenting cells, and play essential roles for stimulation and inhibition of T cells through binding to the CD28 and
CTLA-4 receptors. The aim of this study was to describe the frequencies of CD80 promoter and CD86 exon 8 variants
and the linkage disequilibrium (LD) between them, in various ethnic groups, and to access information about
the evolution of these polymorphisms. CD80 promoter -557_-561insCATGA (-558ins), -454C>A, -387T>C, -232G>A,
-79G>C, -7T>C, 5C>A and CD86 exon 8 1057G>A polymorphisms were analyzed by PCR-SSOP (amplification
followed by hybridization with sequence specific oligonucleotide probes) in samples of nine populations: three
Brazilian urban populations (of predominantly European, of mixed African and European, and of Japanese
ancestry); five Brazilian Amerindian populations from the Guarani and Kaingang groups, and Africans, totaling
1,124 individuals. All alleles and haplotypes were found in the African population sample, so it was possible to
conclude that the polymorphisms analyzed originated before the human migrations out of Africa. Nucleotide -79
was found to be monomorphic in four Amerindian populations and the occasional presence of the G allele in these
populations is probably due to gene flow from non-Amerindians. This allele was lost probably due to a founder
effect that the ancestral Amerindian population(s) had experienced during the migrations from Asia to America or
within the American continent. Within CD80 promoter SNPs, -387T>C presented the highest heterozigosity (22%
to 48%). CD86 1057*G was the most frequent allele in all but the Japanese-Brazilian population and reached highest
frequencies in the Guarani groups. All CD80 promoter polymorphisms are in absolute linkage disequilibrium (D’=1).
We observed the four allelic combinations already described plus a new one, found in an African immigrant. We
named this allele promoter 5. It is either an intermediate allele or was originated by recombination between the
alleles known as promoter 3 and promoter 4. The origin of the CD80 promoter alleles was hypothesized, and either
promoter 2 (-557_-561*del,-454*C,-387*C,-232*G,-79*C,-7*T,5*C) or promoter 3 (-557_-561*del,-454*C,-387*T,-232*G,79*C,-7*T,5*C) is most likely the ancestral allele. The diversity found in Amerindians for the CD80 and CD86 genes is
usually lower and linkage disequilibrium is more pronounced than in non-Amerindians, as expected for historically
small and isolated populations.
Financial support: CNPq, Fundação Araucária, CAPES.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Polimorfismos funcionais do gene MBL2 e
susceptibilidade à infecção pelo HTLV-1
Campos, AV1; Kamada, AJ1; Brandão, LAC1; Guimarães, RL1; Loureiro, P2; Souza, PRE3; Crovella, S1; Arraes, LC4
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE
Fundação HEMOPE
3
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
4
Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HTLV-1, Imunidade Inata, MBL2, SNP, PCR em tempo real
O HTLV-1 foi o primeiro retrovírus humano a ser descrito e associado a doenças graves como neuropatias e
leucemias. Atualmente, pouco se conhece sobre o envolvimento da Imunidade Inata contra essa infecção. O Sistema
Imune Inato inclui proteínas, como a Lectina Ligadora de Manose (MBL), que atuam na eliminação de patógenos,
células transformadas e apoptóticas, através do reconhecimento de carboidratos. O objetivo do presente estudo
foi avaliar se polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) presentes no éxon 1 do gene MBL2 que afetam os níveis
funcionais séricos da MBL estão relacionados à suscetibilidade à infecção pelo HTLV-1. A população de estudo,
proveniente de Recife-PE, consistiu de 109 indivíduos infectados e um grupo controle com 162 indivíduos saudáveis
escolhidos aleatoriamente. Os SNPs, agrupados no alelo O, foram detectados através de PCR em tempo real. O alelo
selvagem foi denominado de A. As frequências alélicas, genotípicas e o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) foram
determinados pelo software Genotype Transposer. A suscetibilidade à infecção foi verificada pelo Teste Exato de
Fisher com o software R (versão 2.8.1). Os dois grupos avaliados estavam em equilíbrio de HW. Foi observado que a
freqüência do alelo O nos indivíduos infectados foi significativamente maior do que nos indivíduos controle (40%
VS. 26%; p=0.0004; OR=1.93; IC de 95%= 1.32-2.84). Analogamente, a freqüência do genótipo O/O nos indivíduos
com HTLV foi maior do que nos controles saudáveis (18% VS. 6%, respectivamente; p=0.0017). Dessa maneira, foi
demonstrada a importância dos SNPs do MBL2 na suscetibilidade à infecção. De fato, a presença do alelo mutante
confere um fator de risco de 1.93 para a infecção, provando assim a importância da imunidade inata contra o HTLV1. A descoberta de outros fatores de suscetibilidade a ou proteção contra o vírus contribuirão no aperfeiçoamento
de métodos diagnósticos e no desenvolvimento de tratamentos terapêuticos das doenças associadas ao HTLV-1.
Apoio Financeiro: FACEPE, UFPE-LIKA, CNPq, IMIP.
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Variante no gene DARC e suscetibilidade ao HIV/AIDS
Bomfim, TF1; Machado, TMB1,6; Brites, C3; Acosta, AX1,4; Galvão-Castro, B1,5; Abé-Sandes, K1,2,6
Laboratório Avançado de Saúde Pública - LASP/CPqGM/FIOCRUZ; 2 – Universidade do Estado da Bahia – UNEB; 3 – Laboratório de
Retrovirologia -Hospital Universitário Professor Edgard Santos – HUPES/UFBA; 4 – Faculdade de Medicina – UFBA; 5- Escola Baiana de
Medicina – FBDC; 6 – Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular – Instituto de Ciências da Saúde – ICS/UFBA.
[email protected]
Palavras-chave: Gene DARC; HIV-1; Ancestralidade; Variante T-46C; AIDS
A variante T-46C no gene DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines), presente em quase 100% dos africanos, foi
selecionada na África por conferir aos seus portadores resistência a infecção por Plasmodium vivax. Recentemente
pesquisadores demonstraram que esta mesma variante em homozigose aumenta em 40% as chances de infecção
pelo HIV. Entretanto, uma vez infectados, esses indivíduos têm uma progressão mais lenta para AIDS e vivem em
média dois anos a mais. Estima-se que este genótipo seja responsável por cerca de 11% dos africanos infectados
pelo HIV-1. O fato de ser muito frequente nas populações africanas e pouco frequente em europeus e ameríndios,
este variante é também utilizada como marcador informativo de ancestralidade. O objetivo do presente estudo foi
determinar a freqüência do genótipo -46C/C em portadores do HIV-1 e em não portadores da Bahia e estimar risco
populacional para infecção por HIV-1 mediada por DARC. Foram genotipados 507 indivíduos infectados pelo HIV-1
da Bahia e 1234 indivíduos não infectados da população geral de Salvador, para a variante T-46C do DARC, por PCR
em tempo real. As freqüências observadas para a variante T-46C foram 41,7% e 46,9% e a freqüência do genótipo
-46C/C foi 20,1% e 24,2% na população infectada e na população não infectada, respectivamente. Estes valores
são intermediários aos valores descritos em africanos, europeus e ameríndios confirmando a miscigenação da
população da Bahia. A análise de ancestralidade genômica mostrou que nos homozigotos -46C/C as contribuições
africanas, européias e ameríndias foram 69,3%, 27,5 e 3,2, respectivamente. As freqüências de 20,1% e 24,2% do
genótipo -46C/C observadas na população da Bahia sugere maior susceptibilidade à infecção pelo HIV-1 mediada
pelo DARC, desta população, quando comparada às populações européias e ameríndias e risco menor quando
comparada à população africana.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde; FAPESB
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Genotypic profile of human immunodeficiency virus type 1
- infected children and adolescents in Rio Grande do Sul
de Toni, EC1; Lambert, APF2; Becker, IM3
Faculdade de Farmácia, Universidade de Caxias do Sul/RS
Universidade de Caxias do Sul/RS
3
Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde, Laboratório Central do Estado do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Keywords: HIV-1, pediatric, subtype, mutations, drug resistance
In world more than 65 millions of people are infected by AIDS. Among this population, 3.2 millions are represented
by children under 15 years old. More than 15 millions of children have become “orphans of AIDS”. Taken in
consideration that many studies about AIDS/HIV are made only with adults and the necessity of information
about the infection developing and drug treatment in underage population, particularly in Brazil, our objective
was to draw the genotypic profile of the human immunodeficiency virus type 1 infected children and adolescents
in Rio Grande do Sul. Genotyping tests of 28 children and adolescents were analyzed between April to September
of 2006. Through these tests were identify the subtypes of HIV 1, the mutations suffered by the virus and the high
levels of drugs resistance. Subtype B was prevalent (37%), followed by subtype C (29%). The frequency of resistance
mutations found in the class of the Nucleotides Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTI´s) were: D67N, V118I e
M184V; in the class of the Not Nucleotides Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTI´s): K103N, G190A, A98G and in
the Inhibitors of Protease (IP´s): M36I, L63P, L90M. High levels of resistance to drugs used on antiretroviral therapy
were also observed, principally related to NRTI´s class. High levels of drugs resistance mutations were showed by
HIV 1 virus. This trend grows with lower speed when compared to the number of new drugs introduced on the
market. This fact gets worse when the hit population was composed to children and adolescents. The genotyping
tests, through the demonstration of the drug effectiveness, helps to choice the best drugs to get success on therapy.
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Prevalence of HPV-16 and HPV-18 in women infected
with human immunodeficiency virus and in controls
from Goiania, GO, Brazil
Saddi, VA1,5; Vaz, LP1; Lima, FC2; Rabelo-Santos, SH2; Alves, RRF1,3; Serafim Filho, J3; Milki, MV1, 4; Araujo,
WCC1; Mühlbeier, DFM1; Carneiro, MAS2; Ayres, FM1
Universidade Católica de Goiás; 2 Universidade Federal de Goiás; 3 Santa Casa de Misericórdia de Goiânia; 4 Centro de Apoio ao Doente
com AIDS; 5 Associação de Combate ao Câncer em Goiás.
[email protected]
1
Keywords: HPV-16, HPV-18, HIV-infected women, HPV-detection, PCR
This study aimed to compare the prevalence of HPV infection and its possible risk factors in HIV-positive and
HIV-negative women, from the city of Goiania-GO. The study group included 60 HIV-positive women assisted by
CADA (Centro de Apoio ao Doente com AIDS), and 60 HIV-negative women assisted by a public health organization.
Detection of HPV genome in cervical cell samples was achieved by using polymerase chain reaction (PCR), with
generic HPV primers GP5+/GP6+, and genotyping employed specific primers for HPV-16 and HPV-18. Both groups
were similar in regard to social demographics and behavioral characteristics, however, significant differences were
observed among their marital status, household income, and education, number of sexual partners, prostitution
history and tobacco smoking. In the group of HIV-positive women, the prevalence of HPV infection was 64.3%,
and in the group of HIV-negative women, it was 32.5%. HPV-16 was the most prevalent genotype in both groups,
corresponding to 67.5% of the HIV-positive women and 32.5% of the HIV-negative women. Among the women who
presented with CIN I, all them were HIV-positive and among those who presented CIN II/CIN III, 85.7% were HIVpositive. The combination of HPV-16 and HPV-18 genotypes was present in 72.2% of the HIV-positive women, and
in 27.8% of the HIV-negative women. Our study demonstrated a greater prevalence of HPV infection in the group of
HIV-positive women. HPV-16 was most common genotype found in both groups; however, co-infection with HPV16 and HPV-18 was significantly more prevalent in those women infected with HIV. Herein we conclude that HIV
infection represents a significant risk factor for HPV infection.
This study was supported by: CNPq, CAPES, FAPEG.
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Association between polymorphisms of region -1082
of gene human interleukin 10 and HPV susceptibility in
women with squamous intraepithelial lesion
de Sá Filho, AL1,3; Fernandes, MCM1; Santos, SM1,3; Lima Júnior, SF¹; Crispino, AFCA1; Heráclio, SA2; Proa,
RTB1; Maia, MMD1, Souza, PRE1
¹Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA – Universidade Federal Rural de Pernambuco. 2Instituto de Medicina
Integral Prof. Fernando Figueira. 3Universidade de Pernambuco-UPE
Keywords: HPV, squamous intraepithelial lesion, IL-10, interleukin, ARMS-PCR
Human papillomavirus (HPV) infection is the most important risk factor for cervical cancer. The genetic
background and the host immune response are believed to be important determinants in the relation between HPV
persistent infection and carcinogenesis. The IL-10 is an inflammatory cytokine able to inhibit the cellular immune
response making the person more susceptible to infections. Many investigators have used cytokine secretion
profiles to estimate the immune responses to HPV infection. The IL-10 -1082 polymorphism but not the other two
polymorphisms (-819 e -592) were found to determine different risks for cervical cancer. In accordance with the
Instituto Nacional do Câncer (INCA), about 25% women are infected by HPV in Pernambuco. There is no published
work in the entire northeast linking of IL-10 polymorphisms and susceptibility to HPV. This study investigated the
relationship of the single base change polymorphic variants identified in the promoter region of interleukin-10
(-1082 A/G) and HPV susceptibility in patients attended in the Instituto Materno-Infantil (IMIP). The group was
composed by 36 women presenting squamous intraepithelial lesions (SIL). The positively to HPV was based in the
technique of PCR using universal primers MY09 and MY11. The genotyping for the human cytokines IL-10-1082A/G
was performed by Amplification Refractory Mutation System (ARMS-PCR) technique. Comparisons between
groups were performed using 2x2 contingency (X2 a two-tailed Fisher Exact Probability Test) and was calculated
using the VassarStats web site for statistical computation. The results of PCR analysis showed that 12 pacientes
were positive and 24 negative for HPV infection. The genotype frequencies 16%GG, 49%AG and 35%AA x 33%GG,
49%AG and 18% AA (respectively HPV positive and HPV negative) are significantly different p= 0,03364 (95%IC
0.28-0.95, OR 0,5860962). Also, allelic frequency are significantly different in HPV positive subjects if compared to
negative group (p=0,003794). Our data confirm the association between the presence of the mutated IL-10 -1082
(allelo A) and HPV infection in women with squamous intraepithelial lesions.
Support: CNPq
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Polimorfismo no gene SLC11A1 associado à
susceptibilidade em pacientes portadores de
tuberculose pulmonar do Estado do Pará
Carvalho, DC1; Silva, CB1; Fernandes, DCRO1; Santos, NPC1; Paiva, SC1; Fernandes, MR1; Ribeiro dos
Santos, AKC1; Silva, CA1; Santos, SEB1
Universidade Federal do Pará, Instituto Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica
[email protected]
1
Palavras-chave: SLC11A1; Tuberculose; Susceptibilidade; Polimorfismos; PCR
A tuberculose é um importante problema de saúde pública, sendo responsável pela morte anual de cerca de 1,8
milhões de pessoas em todo mundo. Do ponto de vista da genética, a tuberculose pode ser considerada como uma
doença complexa, que resulta da interação entre o hospedeiro, o patógeno e o ambiente. Diversos trabalhos recentes
têm demonstrado evidências claras de que fatores genéticos do hospedeiro são importantes na determinação
da susceptibilidade a tuberculose.O componente genético que contribui para a susceptibilidade e progressão de
tuberculose pulmonar provavelmente envolve uma interação entre múltiplos alelos localizados em diferentes genes
e cromossomos. Neste tipo de investigação muita atenção tem sido dirigida a fatores potencialmente envolvidos
na resposta imune à tuberculose. O gene SLC11A1, anteriormente conhecido como NRAMP1 (resistência natural
do macrófago) é um dos fatores genéticos relacionados à susceptibilidade a tuberculose e outras doenças
infecciosas. Diversos trabalhos na literatura especializada associa a resposta ao bacilo a polimorfismos genéticos
no gene SLC11A1, particularmente a uma deleção de quatro pares de nucleotídeos TGTG 3´UTR (1729+55del4).
O objetivo deste estudo foi investigar associação da deleção TGTG 3´UTR na susceptibilidade ou resistência a
tuberculose pulmonar. A amostra investigada para deleção descrita é composta de 135 pacientes, diagnosticados
como portadores de tuberculose, em tratamento no Hospital Universitário João de Barros Barreto e 152 indivíduos
sadios (não portadores de tuberculose) considerados como grupo controle, todos residentes no estado do Pará. A
investigação da deleção no gene SLC11A1 foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida
de eletroforese em gel de poliacrilamida 7%. Os dados relativos ao gene SLC11A1 demonstram que 16 indivíduos
(10,5%) sadios da população do estado do Pará são heterozigotos para a deleção ( freqüência alélica = 0.0526).
Entre os indivíduos portadores de tuberculose 14 (10.4%) são heterozigotos para a deleção ( freqüência alélica
= 0.0518). As análises estatísticas mostraram que não existem diferenças significativas (tanto da freqüência do
genótipo heterozigotos como da freqüência alélica) nos dois grupos considerados. As diferenças observadas não
são significativas do ponto de vista estatístico, mesmo quando se analisa (através de regressão logística múltipla) os
dados em conjunto com as seguintes variáveis independentes: ancestralidade; comorbidade e HIV (OR=1,017;95%,
CI: 0,477-2,17; P=0,561).
APOIO FINANCEIRO: CNPq; Institutos do Milênio.
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Estudo associação entre diferentes SNPs na região
promotora do gene de IL-10 e tuberculose
Spinasse, LB1; Lopes, MQP1; Miranda, AB2; Lapa e Silva, JR2, Suffys, PN1; Santos, AR1
Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria - Oswaldo Cruz Institute - (FIOCRUZ)
University Hospital Clementino Fraga Filho - Federal University of Rio de Janeiro - UFRJ
[email protected]
1
2
Keywords: Polymorphism (SNPs), Interleukin - 10, Tuberculosis
Tuberculosis (TB) is one of the oldest infectious diseases which affect humankind. According to the World Health
Organization (WHO 2008), there are 9.2 million new patients a year. Brazil is the 16th nation in the list of 22
countries responsible for 80% of TB cases in the world. The infection by Mycobacterium tuberculosis (M. tb) depends
on a complex immune response which can control the whole infection process or can permit the tuberculosis
progress from latent to the active disease. As previously described in a number of studies, the interindividual
variations in the production of these molecules particularly in the cytokine genes are directly related to the genetic
background. Interleukin-10 (IL-10) is an important anti-inflammatory regulatory cytokine involved in several areas
of the immune system, and genetic variations such as polymorphisms (SNPs), mainly in the promoted region, can
influence its production. In the present study, the mapping of part of the gene promoted region which codifies
to IL-10 in DNA samples from 492 individuals was done, being 221 patients and 271 healthy control subjects,
not related and without previous TB history, all of them living in Rio de Janeiro, and the possible polymorphism
found with different results in tuberculosis in 139 pulmonary TB patients, 43 extra-pulmonary TB patients and 271
control subjects were investigated, being 126 positive (TST+) and 145 negative (TST-) in the tuberculin intradermic
test. After genotyping, thirteen polymorphisms (SNP) were identified in the promoted region of IL-10, 7 of them
(SNPs) have not yet been described in the literature. In the association study, based in the comparison of allelic,
genotypic and haplotypic frequencies, there is a strong association with tuberculosis susceptibility, SNPs in the
-1189, -840 and -464 positions. In the outcome associated to the protection, SNPs in the -750 position was found.
The most studied and characterized SNPs (positions -1117, -854, -627, also reported respectively as -1082, -819
and -592), did not present any association with analyzed results, as well as with the other described SNPs. Three
haplotypes with the highest allelic frequencies were analyzed for the study of the association, and there was no
haplotypic association with the susceptibility per ser, gravity or protection to tuberculosis.
Financial Support: Faperj/Pronex: Proc: E-26/170.0003/2008. Adalberto Rezende Santos and Philip Noel Suffys are
fellow from CNPq. Grant numbers 308786/2005-0 and 312165/2006-4 respectively.
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Índice parasitário em pacientes com malária não está
associado à polimofismos nos genes TLR2 e TLR4
Soares, SC1; Nascimento Filho2, VB; Silva, DCO3
Mestra em Ciências Médicas pela Universidade de São Paulo; 2Especialista em Didática do Ensino Superior pela Faculdade Tahíri
Docentes da Universidade do Estado do Amazonas;3Graduanda pela Universidade do Estado do Amazonas
[email protected]
1
1,2
Palavras-chave: Polimorfimos, Malaria, Plasmodium, TOLL, TLR
Adachi et al (2001) verificaram que a infecção pelo P. berghei em camundongos induz a ativação da via de sinalização
TLR-MyD88 conduzindo a produção de IL-12, uma potente citocina pró – inflamatória que estimula linfócitos T
(CD8) citotóxicos hepáticos a secretar perforinas e granzimas levando a destruição de hepatócitos infectados e
não infectados e posterior destruição do fígado. Sabe-se que alterações genéticas associadas aos TLRs suprimem a
resposta imune inata, podendo levar a deficiências na resposta imune adaptativa mediada pela hepatoxicidade de
linfócitos em pacientes com malária e, dessa forma, impediria a destruição de hepatócitos infectados, aumentando
a parasitemia. No presente estudo analisamos se os índices de parasitemia apresentados por pacientes com malária
estão associados com polimofismos que ocorrem nos genes TLR2 e TLR4 que se expressam preferencialmente em
células apresentadoras de antígenos (APCs), com duas linhagens do parasita, P. vivax e P. falciparum, em uma
população de 100 pacientes e 100 indivíduos saudáveis da região do Baixo–Amazonas/Pará. Os polimorfismos
Arg677Thp e Arg753Gln para o gene TLR2 foram analisados por PCR - sequenciamento direto e Asp299Gly para
o gene TLR4 foi analisado por PCR-RFLP. Verificou-se nesse estudo uma baixa freqüência de Arg677Thp (5%) e
de Arg753Gln (4%) em heterozigose no gene TLR2 e de Asp299Gly (6%) também em heterozigose no gene TLR4
em pacientes infectados com P. falciparum. E uma baixa freqüência de Arg677Thp (4%) e de Arg753Gln (2%) em
heterozigose no gene TLR2 e de Asp299Gly (4%) também em heterozigose no gene TLR4 em pacientes infectados
com P. vivax. Esses resultados, baixa freqüência, demonstram que não há qualquer associação entre os níveis de
parasitemia com a presença ou ausência de polimorfismos dos genes TLR4, FY e CR1 nos pacientes analisados,
infectados com P. falciparum ou P. vivax, uma vez que tais índices apresentam-se variáveis, independente da
presença ou ausência dos polimorfismos analisados.
Apoio Financeiro: CAPES
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Fatores geneticos do hospedeiro e susceptibilidade
à malária
Cardoso, GL; Diniz, IG; Souza, CRT; Amaral, LSC; Sant’anna, CC; Guerreiro, JF
¹Laboratório de Genética Humana e Médica - Instituto de Ciências Biológicas – UFPA
[email protected]
Palavras-chave: malária, Duffy, TNF-alfa, G6PD, HbS
Apesar dos esforços da comunidade internacional, a malária continua sendo um sério problema de saúde pública,
especialmente em regiões de clima tropical. Anualmente, estima-se a ocorrência de 300 a 500 milhões de casos
clínicos de malária, resultando em aproximadamente um milhão de óbitos. Na Amazônia Brasileira o Plasmodium
vivax tem sido a causa mais comum dessa doença nos últimos anos. Historicamente, esse mal tem resultado
na seleção de centenas, se não milhares, de variantes genéticas que conferem algum grau de resistência inata
contra esta doença. Entre essas variantes genéticas estão o sistema sanguíneo Duffy, TNF-alfa, glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD) e a hemoglobina S (HbS). A identificação de cada um desses polimorfismos tem o potencial
de elucidar algum aspecto da relação hospedeiro-parasita. Além disso, suas freqüências em uma população podem
ser interpretadas como fatores de influência na prevalência de malária nesta população. Considerando o exposto,
buscou-se investigar os polimorfismos genéticos de quatro sistemas (Duffy, TNF-alfa, G6PD e HbS) em áreas de
transmissão de malária (comunidades de São Luiz do Tapajós, no município de Itaituba, PA e Três Boeiras, no
município de Trairão, PA). Para tanto, foi feita a reação em cadeia da polimerase e, após a separação dos fragmentos
por meio de eletroforese, foi feita a análise dos genótipos de cada um dos sistemas. Posteriormente, esses dados
foram comparados com o diagnóstico (gota espessa e molecular) da malária. As freqüências observadas dos alelos
relacionados à resistência contra a infecção malárica em São Luiz do Tapajós e em Três Boeiras, respectivamente,
foram as seguintes: alelo FY*0 33,15% e 30,04% (sistema sanguíneo Duffy); TNFa*G 88,31% e 97,74%, TNFa*A 11,68%
e 2,25% (TNF-alfa); G6PD*A 1,08% e 0% (G6PD); HBS 2,41% e 0% (HbS). Cabe ressaltar as freqüências polimórficas
do alelos FY*0, em particular em São Luiz do Tapajós, uma comunidade na qual 56% dos indivíduos relatam nunca
terem tido malária que em Três Boeiras e São Luiz do Tapajós 23,6% e 55,7% dos indivíduos, respectivamente,
relataram nunca terem tido malária.
Apoio Financeiro: CAPES/CNPQ
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Relationshp between the complement factor H (CFH)
promoter polymorphism C-257T, gene expression levels
and dengue hemorrhagic fever development protection
Pastor, AF; Acioli-Santos, B; Nascimento, EJM; Calzavara-Silva, CE; Gomes, AL; Silva, AM; Cordeiro, M;
Braga-Neto, U; Gil, LHVG; Crovella, S; Marques Jr, ETA
Department of Virology and Experimental Therapy
Aggeu Magalhães Research Center- CPqAM/FIOCRUZ, Recife, Brazil. ADDR: Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães CPqAM/Fiocruz Av.
Professor Moraes Rego, s/n Cidade Universitária - Recife - PE - Brasil CEP 50.670-420 Caixa Postal: 7472.
[email protected]
Keywords: Dengue hemorrhagic fever, factor H, gene polymorphism
Introduction. Dengue fever (DF) has become one of the most important worldwide arthropod-borne diseases
affecting around 100 endemic countries. Occasionally, DF progresses to dengue hemorrhagic fever (DHF), a
potentially life-threatening illness associated with thrombocytopenia, vascular leakage, haemorrhage, and
hypovolemic shock. Despite the fact that DHF pathogenesis is only partially understood, it is known that host
genetic factors play a role on susceptibility/resistance to DHF. Recent data suggest that flavivirus have an immune
evasion mechanism by sequestering the complement factor H (encoded by CFH gene), a regulatory molecule of
alternative pathway of complement system. Goals. The aim of this work was to study the biological consequences
of CFH promoter C-257T polymorphism over gene transcription/translation and assess the relationship between
this allele variant over clinical outcome in a dengue cohort established in Recife, Brazil. Methodology. Genotyping
of the CFH promoter (dengue and control population) was carried out using partial gene sequencing and TaqMan
genotyping approach. CFH transcription was assessed using qRT-PCR (Sybr Green) in total RNA isolated from
patient-harvested PBMCs, whereas the translation was measured using ELISA, in plasma samples from genotyped
patient volunteers. Results. The allele distribution over dengue-infected patients cohort was in Hardy-Weinberg
equilibrium, 0.53 CC, 0.42 CT and 0.05 TT and a significant correlation was found between the CFH -257T
polymorphism (TT/TC) and resistance to developing DHF (OR = 2,44; p = 0.0531). The genotype TT/TC was
associated with higher levels of mRNA and factor H levels during convalescent phase. Molecular analyzes also
indicate that the -257T SNP is located in a NF-kB, a transcription factor, binding site, thus suggesting that this
allelic variation can alter the NF-kB affinity, increasing its ability to respond to NF-kB. Conclusions. Here is shown
a significant correlation among -257T CFH promoter polymorphism and elevated levels of factor H and resistance
to developing DHF. These data supports a role of factor H during DHF development, and further strengthening the
hypothesis that the dengue clinical outcome is also highly dependent on the host genetic background.
Financial support. CNPq, NIH U19, FIOCRUZ.
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Influência da mistura étnica na resposta da
Intradermorreação de Montenegro em uma localidade
de Rondônia
Fioretti, AP1,2; Santos, FAB1,2; Ferreira, RGM1,2; Garrido, LM1,2; Kawamata, CEM1,2; Pereira, LC1,2; La Luna,
A1,2; Camargo, LMA1,2; Krieger, H1,2
¹ Universidade de São Paulo – Departamento de Parasitologia – ICB
² INAGEMP – Instituto Nacional de Genética Médica Populacional
Palavras-chave: epidemiologia genética, mistura étnica, leishmania, intradermorreação, fenótipo
O teste da intradermorreação (IRM) é um meio eficaz de determinar a resposta imune celular para leishmaniose
cutânea ou tegumentar. O objetivo deste trabalho foi verificar a possível existência de correlação entre os
componentes individuais de mistura étnica e os valores da IRM. O antígeno de Montenegro foi obtido a partir
do extrato antigênico de L. amazonensis e injetado no antebraço de 313 indivíduos pertencentes à comunidade
rural do município de Monte Negro, RO, (10° 15’ S, 63° 18’ W). Após 48 a 72 horas mediu-se o diâmetro da pápula
eritomatosa resultante. Indivíduos com diâmetro maior ou igual a cinco milímetros foram considerados positivos
para IRM (Rey, L. Parasitologia 3ed. Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 2001). Estudos similares já foram realizados,
entre os quais podemos citar o de Ettinger et al (Ann Hum Genet. 2009 May;73(Pt 3):304-13). Neste trabalho foram
estudados indivíduos afetados por L. chagasi, sendo que o autor não verificou relação entre os fenótipos de doença
e normal com a composição étnica populacional, porém verificou excesso de ancestralidade européia em uma
região do cromossomo 22, indicando haver possíveis genes nesse local relacionados à infecção por L. chagasi.
O componente de mistura étnica individual foi obtido usando metodologia adaptada daquela desenvolvida por
Krieger et al. (Ann Hum Genet., v. 29, p. 113-125, 1965). Os cálculos numéricos foram realizados pelo software TC
3.0 e as análises de correlação pelo SPSS. A distribuição do fenótipo na amostra foi estudada de três maneiras. Uma
delas foi obtida a partir de dados qualitativos (MN_qualit_padrão), outra foi dividida em três classes (zero, um a
quatro e maior ou igual a cinco) (MN3_Padrão) e a última obtida por dados quantitativos (MN_Padrão). Os valores
das três variáveis foram corrigidos para sexo e idade e padronizados. Condizendo com os resultados de Ettinger et
al (op. cit.), não foi verificado correlação entre as três variáveis com os componentes étnicos individuais.
MN_Padrão
MN3_Padrão
MN_qualit_padrão
r
P
r
P
r
P
Europeu
-0,001
> 0,05
0,000
> 0,05
0,008
> 0,05
Africano
-0,030
> 0,05
-0,005
> 0,05
-0,006
> 0,05
Ameríndio
0,021
> 0,05
0,003
> 0,05
-0,005
> 0,05
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Associação entre o sistema histo-sanguíneo Lewis e
infecção por Toxoplasma gondii em gestantes
Nakashima, F1,2; Brandão de Mattos, CC2; Ferreira, AIC2; Cintra, JR2; Spegiorin, LCJF3; Meira, CS4;
Pereira-Chioccola, VL4; Mattos, LC2
Departamento de Biologia – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE–UNESP
Laboratório de Imunogenética – Departamento de Biologia Molecular – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
3
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
4
Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos - Instituto Adolfo Lutz - São Paulo
[email protected]/[email protected]
1
2
Palavras-chave: sistema histo-sanguíneo Lewis, FUT3, FUT2, Toxoplasma gondii, toxoplasmose, gestante
Introdução: O sistema histo-sanguíneo Lewis caracteriza-se pela síntese dos antígenos Lea e Leb que compõe os
fenótipos Le(a+b-), Le(a-b+) e Le(a-b-). Estes antígenos constituem potenciais receptores para microrganismos
patogênicos no trato gastrintestinal e em outros tecidos. Sua expressão resulta da fucosilação do oligossacarídeo
precursor tipo 1 (Galβ1→3GlcNacβ1−R), controlada pela ação conjunta das enzimas FUTII e FUTIII codificadas
pelos genes FUT2 (Secretor) e FUT3 (Lewis), respectivamente. Mutações no gene FUT3 levam à expressão do
fenótipo Le(a-b-). A infecção por Toxoplasma gondii, além da elevada freqüência populacional, atrai a atenção
devido aos riscos de transmissão congênita. Este parasito, além de utilizar como rota de infecção o mesmo local de
expressão dos antígenos Lewis, também infecta grande variedade de células nucleadas. Estes eventos biológicos
aparentemente independentes podem estar relacionados entre si. Objetivo: Investigar se o sistema Lewis está
associado à infecção por T. gondii. Material e Métodos: Cento e cinco amostras de soro e de DNA genômico de
gestantes atendidas no Ambulatório de Gestação de Alto Risco do Hospital de Base de São José do Rio Preto foram
analisadas. O teste ELISA foi empregado para detectar anticorpos IgG específicos (cepa RH do T. gondii) e compor
os grupos “reagente” e “não reagente”. As mutações G428A (FUT2) e T202C e C314T (FUT3) identificadas por
PCR-RFLP e PCR-SSP respectivamente, foram utilizadas para inferir os fenótipos Lewis. O teste exato de Fisher foi
usado para comparar as proporções dos fenótipos entre reagentes e não reagente. Resultados: Das 105 amostras
analisadas, 70 (66,7%) mostraram-se reagentes e 35 (33,3%) não reagentes. Entre as reagentes, 20 (28,6%) eram
Le(a+b-), 40 (57,1%) Le(a-b+) e 10 (14,3%) Le(a-b-). Das não reagentes, 8 (22,8%) eram Le(a+b-) e 27 (77,2%) Le(a-b+).
A frequência do fenótipo Le(a-b-) mostrou diferença estatisticamente significante entre os grupos “reagente” e
“não reagente” [Le(a-b-) X Le(a-b+): p=0,01; Le(a-b-) X (Le(a+b-) + Le(a-b+): p=0,02]. As demais comparações não
foram significantes [Le(a-b-) X Le(a+b-): p=0,08; Le(a+b-) X Le(a-b+): p=0,35]. Conclusão: Os resultados sugerem
que o sistema histo-sanguíneo Lewis esta associado à infecção por T. gondii com maior suscetibilidade do fenótipo
Le(a-b-). É possível que a ausência de fucosilação do oligossacarídeo precursor tipo 1 pela enzima FUTIII influencie
a infecção por T. gondii no trato gastrintestinal. A habilidade do T. gondii infectar grande variedade de células
nucleadas parece resultar de sua adaptação em se ligar a um receptor único. Como o oligossacarídeo precursor
tipo 1 é um componente comum das membranas de células nucleadas pode contribuir, pelo menos em parte, com
a infecção por este parasito.
Apoio Financeiro: Capes, BAP-FAMERP
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Seleção sexual pós-copulatória MHC-dependente
em humanos, perdida ou ainda não encontrada?
Silva, JS; Bicalho, MG
LIGH, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
Palavras-chave: MHC, HLA, seleção pós-copulatória, heterozigosidade
A hipótese de seleção pós-copulatória MHC-dependente sugere que, indivíduos os quais possuam alguma
similaridade com o genótipo MHC do parceiro, estariam sujeitos a algum mecanismo que reduziria a probabilidade
da formação de embriões homozigotos para esses genes. Isto também se aplicaria a todos os demais genes que
estivessem segregando, em desequilíbrio de ligação com o MHC, onde o heterozigoto também apresentasse
um maior valor adaptativo. Este mecanismo poderia atuar nas seguintes etapas: no momento da fertilização;
na segunda divisão meiótica do óvulo, que seria influenciada pelo haplótipo do espermatozóide; no início do
desenvolvimento e implantação do embrião. O objetivo do presente estudo foi investigar se, em casais que possuem
alguma similaridade nos genes MHC, estaria ocorrendo algum destes mecanismos, cuja conseqüência seria a
freqüência reduzida de descendentes homozigotos para estes genes. Para atender aos objetivos de nosso estudo,
foram selecionadas famílias onde o casal apresentava alguma similaridade HLA, pois somente nestas famílias
poderia ocorrer a formação de filhos homozigotos. Dentre as 64 famílias do banco de dados do Laboratório de
Imunogenética e Histocompatibilidade (LIGH-UFPR), todas tipadas para os genes HLA-A e HLA-B (MHC humano),
apenas 32 atendiam ao critério de similaridade HLA. O próximo passo foi analisar trios formados por pai, mãe
e filho. Naquelas famílias que tinham mais de um filho, as mesmas contribuíram com trios adicionais, tanto
quantos eram os filhos presentes. No total foram analisados 123 trios. Conhecendo-se o haplótipo HLA dos pais, foi
calculada a probabilidade de formação de um filho homozigoto para cada trio (por estes genes estarem fortemente
ligados comportam-se como o esperado pela Primeira Lei Mendeliana). Esses trios foram estratificados em dois
grupos: um grupo com probabilidade de 25% de gerar filhos homozigotos (n=86 trios) e outro com probabilidade
de 50% de gerar filhos homozigotos (n=37 trios). Essas probabilidades esperadas de 25% e 50%; foram comparadas
com as observadas, 16 e 17 filhos, respectivamente, através do Teste de Qui-quadrado χ²=1,876 (p=0,171) e
χ²=0,243 (p=0,622) respectivamente. Estes resultados permitem sugerir a não ocorrência de desvio em favor dos
heterozigotos, rejeitando, assim, a hipótese de seleção pós-copulatória MHC-dependente na amostra estudada.
Uma hipótese explicativa para este fato seria a de que, em espécies onde ocorre cópula forçada, infanticídio ou
mesmo maior “promiscuidade”, mecanismos de seleção pós-copulatória estariam atuando, pois desta forma, a
heterozigosidade na prole (maior valor adaptativo) seria proporcionada mesmo não ocorrendo uma seleção de
parceiros MHC diferente. A hipótese de seleção gamética, apesar de bastante atraente, não foi corroborada em
nosso estudo mas, nos permitiu formular a seguinte questão: “Seleção sexual pós-copulatória MHC-dependente
em humanos, perdida ou ainda não encontrada?” cuja resposta dependerá de muitos outros estudos.
Apoio Financeiro: CONVÊNIO FUNPAR-LIGH
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Immunogenetical model against autoimmune disorders
on brazilian patients
Brandão, LAC1; Guimarães, RL1; Pontillo, A2; Segat, L2; Arraes, LC3; Lima-Filho, JL1,; Crovella, S1,4
Laboratório de Virologia - Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA)/UFPE
Laboratorio di Genetica medica, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico materno-infantile - IRCCS “Burlo Garofolo” (Trieste,
Italy)
3
Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP)– Hospital dia
4
Universidade Federal de Pernambuco – Dep. de Genética
1
2
Keywords: autoimmune disorder, innate immunity, SNP, MBL2 and NALP3
Autoimmune diseases, such as type 1 diabetes (T1D), celiac disease (CD) and dermatitis atopic (DA), are multifactorial
disorder elicited by a complex interplay between environmental, immunological and genetic factors. In fact, genetic
susceptibility can be inherited. Until now, all genetic factors involved in production of an autoimmune process
remain obscure. The aim of our study was to construct an immungenetic model against autoimmune disorder
using genes involved on innate immune and inflammatory response. We tested 9 single nucleotide polymorphisms
(SNPs) - 1 in MBL2 gene, 3 in DEFB1 gene, 2 in NALP1 gene and 3 in NALP3 gene - in patients from the North Eastern
region of Brazil affected with T1D (n=214), CD (n=59) and AD (n=165). SNP detection was performed through real
time PCR (ABI platform) or direct sequencing (MegaBace platform). All analyzed group were according to HardyWeinberg equilibrium to each SNP. MBL2 mutant allele were more frequent (p= 2exp-3) on autoimmune patients
(32%), globally considered, than in health individuals (20%). In addition, NALP3 “G” polymorphism (rs10754558)
were also significant (p=7exp-3) higher on autoimmune patients globally considered (36% vs 1%). The other 7
SNP were not associated with autoimmune disorder (p>0.05), despite -44 DEFB1 “G” allele (rs1799946) and NALP3
“A” allele (rs35829419) that was quite present only in celiac patients than in health individuals (p: 2exp-5 and
3exp-5 respectively). Our results ratify and display the crucial role of MBL2 and NALP3 genes on predisposition to
autoimmune diseases; moreover we found that DEFB1 and NALP1 genes were associated specifically to CD. Our
autoimmune model relies on the MBL and NALP3 systematic effect on human organism, instead organ-specific
disease. The studied SNPs of MBL2 and NALP3 affect the levels of functional proteins on serum, actually, low levels
of MBL proteins decrease the clearance of apoptotic cells and high levels of NALP3 increase the production of IL-1b
and consequently the power of inflammatory response. Both events are previously associated with autoimmune
disorder. Thus, we hypostatize that patient carrying both mutant alleles of MBL2 and NALP3 (rs10754558) gene
posses an elevated risk to acquire autoimmune disorder on Brazilian patient.
Financial support: FACEPE AND LIKA/UFPE
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Allelic frequencies of HLA-A*, -B* and -DRB1* genes in a
sample of women with recurrent spontaneous abortion
Silva, FF2; Sadalla, LFCR2; Patricio, FJB2; Santos, A2; Santos, AM3; Brito, LMO4; Chein, MBC4, Freire, GIM6;
Martins, MG5; Leal-Mesquita, ER1
Departamento de Biologia da UFMA; Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade (LEGH), HUUFMA; Centro de
Pesquisa Clinica (CEPC), HUUFMA. 2Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade (LEGH), HUUFMA. 3Departamento
de Saúde Pública da UFMA; Centro de Pesquisa Clinica (CEPC), HUUFMA. 4Departamento de Medicina III da UFMA; Programa de
Pós-Graduação em Saúde Materno Infantil da UFMA. 5Departamento de Medicina III da UFMA; Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do
Hospital Universitário – Unidade Materno Infantil (HU-UMI-UFMA). 6Serviço de Ginecologia da Unidade de Saúde José Carlos Macieira
[email protected]; [email protected]
1
Keywords: Abortion, RSA, HLA gene, allelic frequencies, Immunology
Recurrent spontaneous abortion (RSA) is defined as three or more consecutive spontaneous pregnancy losses
before the 20th week of gestation, a situation that that occurs in 1 to 2% of women of reproductive age. Genetic,
anatomical, endocrine, infectious and immunological factors, through mechanisms that relate to the Major
Histocompatibility Complex (MHC) and the presence of certain HLA (Human Leukocyte Antigens) are associated
to RSA. The HLA gene is located on the short arm of chromosome 6, is inherited as a haplotype and expressed in
co-dominance. The basic function of HLA molecules is to promote the recognition of antigens by T lymphocytes
and is also important in the modulation and induction of maternal tolerance during pregnancy. The aim of this
study was to compare the allelic frequencies of loci HLA-A*, HLA-B* and HLA-DRB1* in women that undergo or
not RSA. The research was approved by the Ethics Committee of HUUFMA. We examined 200 women (100 for
each group) between 18 and 35 years of age. All samples were typified by the PCR-SSO method (PCR-Sequence
Specific oligonucleotides). The most frequent alleles observed in the group of women with RSA were: HLA-A*02
(56%), *01 (18%), *30 and *31 (14%); HLA-B*: *15 (32%), *35 and *51 (16%), *40 (15%); HLA-DRB1*: *13 (31%), *04
(26%), *07 (24%). In the sample of women without RSA, the most frequent alleles were: HLA-A*: *02 (49%), *24
(25%), *01 (16%); HLA-B *: *35 (41%), *15 (30%), 51 (13%); HLA-DRB1*: *13 (39%), *11 (26%), *01 (23%). Studies
show that the HLA-A*02 may contribute to maternal immune responses both in normal pregnancies and in the
RSA. The significantly lower frequency of HLA-B35 in patients with unexplained recurrent abortion in some studies
suggests that the Th2-associated immune reactions may be lacking in such patients, as it has been reported that an
enhanced Th2 response in conjunction with a decreased Th1 response is a common immune reaction in HLA-B35positive individuals. In studies related to HLA-DRB1*, some authors found an association between RSA and alleles
* 01 and *03, other authors found this association only for the * 03 allele, which was not found in this study. Further
genetic epidemiology research, including studies that relate to other HLA genes like HLA-G, is indispensable to
clarify the role of HLA antigens and/or its connection to other genes as a risk factor for RSA.
Financial Support: FAPEMA
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Análise da frequência do polimorfismo GLN27GLU no
Gene β2adrenoreceptor em indivíduos asmáticos
Ferreira, FC2; Sousa, FM2; Silva, CMAC2; Nunes, BA2; Santos, A2; Costa, MRSR3; Leal-Mesquita, ER1
Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade (LEGH) - Hospital Universitário da Universidade Federal do Maranhão
(HUUFMA); Departamento de Biologia – UFMA. 2Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade (LEGH) - Hospital
Universitário da Universidade Federal do Maranhão (HUUFMA). 3Programa de Assistência ao Paciente Asmático (PAPA) – Hospital
Universitário da Universidade Federal do Maranhão (HUUFMA); Departamento de Medicina II.
[email protected]
1
Palavras-chave: Asma, Gene β2adrenoreceptor, Polimorfismo Gln27Glu, Frequencia alélica, Frequencia genotípica
A asma é definida como uma desordem inflamatória crônica das vias aéreas. Caracterizada pela hiperresponsividade das mesmas, pela obstrução variável do fluxo aéreo e por sintomas recorrentes de tosse, sibilância,
dispnéia e aperto torácico. O gene β2 adrenoreceptor (b2AR-ABDR2) é um receptor acoplado a proteína G (GPCR).
Está localizado no cromossomo 5 (5q31-32), uma região geneticamente relacionada com a asma. É um gene
que vem sendo associado a esta doença devido sua influência nos mecanismos efetivos para a broncodilatação.
Constam na literatura nove polimorfismos (SNPs) neste gene, onde o Gln27Glu é um dos mais frequentes em
pacientes asmáticos. Este polimorfismo tem uma substituição de glutamina (Gln-27) por ácido glutâmico (Glu27), o qual influencia no feedback negativo na resposta do receptor ao agonista. O presente estudo teve como
objetivo analisar as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo Gln16Glu no gene β2-adrenoreceptor em
pacientes asmáticos. Foram coletadas amostras de sangue periférico de 22 indivíduos asmáticos encaminhados
pelo Programa de Assistência ao Paciente Asmático (PAPA) do HUUFMA. As amostras foram submetidas a PCRRFLP e PAGE (Eletroforese em Gel de Poliacrilamida). Os resultados mostraram uma frequência maior do alelo
Glu27 (65,22%) em relação à frequência do alelo Gln27 (34,78%). As freqüências genotípicas encontradas foram:
60,86% homozigotos para Glu27 (Glu/Glu), 8,7% heterozigotos (Gln/Glu) e 30,44% homozigotos para Gln27 (Gln/
Gln). Conclui-se que o estudo do SNP Gln27Glu é importante para o entendimento da predisposição genética
para asma. Sugere-se, portanto, um amplo estudo tipo caso-controle com o polimorfismo Gln27Glu. E, ainda,
considerando a associação do referido polimorfismo com o SNP Arg16Gly também presente no gene b2AR.
Apoio Financeiro: HUUFMA/FINEP/FAPEMA/PPSUS- DECIT/SCTIE/MS
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Associação do polimorfismo MTHFR C677T ao
desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico em um
estudo caso controle na população de Santa Catarina
Coêlho, CC; Ribeiro, ER; Farias, T; Canto, LM; Cunha, PA; Medeiros, MD; Back, LKC; Mello, FM; Souza,
RR; Pereira, IA; Zimermann, A; Souza, IR
Universidade Federal de Santa Catarina
Palavras-chave: lúpus eritematoso sistêmico, MTHFR, polimorfirmo, PCR-RFLP, autoimune
O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune de etiologia complexa ainda desconhecida que
pode afetar vários órgãos do corpo, em especial a pele, as articulações e os rins. É caracterizado por variadas
combinações de sintomas como pericardite, nefrite, anemia, trombocitopenia e doença do sistema nervoso
central e pode vir a desenvolver sérios problemas cardiovasculares, sendo que a arteroesclerose cardiovascular
é mais freqüente nos pacientes que na população em geral. Embora a arteroesclerose no LES seja multifatorial,
níveis elevados de homocisteína estão associados com trombose, derrame e arteroesclerose nos pacientes lúpicos.
A homocisteína é um aminoácido que não pode ser obtido pela dieta e é produzido no ciclo de metilação, que
é crítico não apenas para sua formação, como também para sua remoção. A metileno tetrahidrofolato redutase
(MTHFR) participa da homeostase do folato e da homocisteína, reduzindo o ácido fólico para sua forma ativa
logo após sua ingestão. Em condições fisiológicas normais, o fluxo metabólico remove homocisteína do plasma
sanguíneo, mantendo baixa sua concentração. Polimorfismos no gene MTHFR, como a transição C→T na posição
677, diminuem a atividade enzimática, retardando essa via metabólica, acarretando o acúmulo de homocisteína
plasmática. O objetivo do estudo foi avaliar a possível associação do polimorfismo MTHFR 677C→T com a
susceptibilidade de desenvolver o LES e averiguar as freqüências alélicas (variantes C e T), e a distribuição dos
genótipos entre casos e controles, em uma amostra de pacientes com LES (n = 108) e controles (n = 129) do
Estado de Santa Catarina. Para a identificação da variabilidade de DNA, utilizou-se a técnica PCR-RFLP. Através
dos genótipos obtidos, estimou-se as frequências alélicas e testou-se o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para análise
de associação do polimorfismo à doença, foi utilizado o cálculo de odds ratio (OD), que estima quantas vezes
maior é o risco de um genótipo ou alelo estar associado ao desenvolvimento da doença em questão. As frequências
alélicas e desvios padrões nos casos e controles foram de 0,375±0,033 e 0,395±0,030, respectivamente (MTHFR
677T). Foram encontradas freqüências genotípicas homogeneamente distribuídas entre casos e controles, não
sendo encontrada associação estatisticamente significativa entre a presença deste polimorfismo e o risco de
desenvolvimento de LES, com OD = 0,802, p = 0,654 e CI entre 0,377-1,695. O polimorfismo analisado neste trabalho
não se mostrou associado ao desenvolvimento de LES nesta população, porém outros polimorfismos da enzima
devem ser analisados em estudos futuros.
Apoio Financeiro: CAPES/CNPq/UFSC/FAPESC
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88
Análise da relação do polimorfismo no éxon 2 do gene
FYB (Fyn Binding Protein) com a susceptibilidade ao
Lupus Eritematoso Sistêmico
Addobbati, CJC¹; Brandão, LAC¹;Guimarães, RL¹; Pancotto, JAT2; Donadi, EA2; Sandrin-Garcia, P¹;
Crovella, S1,3
Laboratório de Imunologia Keizo Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Depto de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo (USP)
3
Depto de Genética/Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: FYB, Lupus Eritematoso Sistêmico, auto-imunidade, SNP e PCR em tempo real
O Lupus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença auto-imune multifatorial que afeta diversos órgãos e sistemas.
Inflamações crônicas na pele, rins, cérebro e articulações, assim como a produção de auto-anticorpos reativos
contra uma variedade de componentes intracelulares, são as principais características dessa doença. De fato, o
LES é uma doença complexa com forte influência genética que envolve a ativação de células B e T auto-reativas.
Assim, o gene FYB (Fyn Binding Protein) foi considerado importante para este estudo, já que codifica uma proteína
sinalizadora da cascata de células T e a modulação da expressão de interleucina-2A. O presente estudo investigou a
associação do SNP (polimorfismo de base única) [A/G] localizado no éxon 2 do gene FYB com a susceptibilidade ao
LES. As genotipagens foram realizadas através da PCR em tempo real, utilizando a tecnologia de sondas TaqMan
e o Rotor Gene 3000 como plataforma (Uniscience, Corbett Research). O grupo de estudo foi composto por 103
pacientes com LES provenientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o grupo
controle, a partir de 103 pessoas saudáveis. As frequências obtidas foram analisadas estatisticamente pelo teste do
χ² e teste exato de Fisher para avaliar o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e a associação ao LES respectivamente.
Ambos os grupos estavam de acordo com as leis de HW. Não foram observadas diferenças significativas (p=0,38)
entre as frequências alélicas do grupo controle (A=2%) e dos pacientes com LES (A=4%). Os resultados sugerem que
apesar do papel do FYB na auto-imunidade, não há correlação entre tal polimorfismo e o desenvolvimento do LES,
mostrando assim a necessidade de novos estudos, inclusive de outros SNPs no FYB, para ajudar na compreensão
da fisiopatologia da doença e, consequentemente, possibilitar o desenvolvimento de novos testes diagnósticos e
tratamentos.
Apoio Financeiro: FACEPE/CNPq (DCR-0089-2.02/08 e APQ-0087-2.02/08)
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89
FYB (Fyn Binding Protein) gene and Systemic Lupus
Erythematosus (SLE) susceptibility: lack of association
with [A/T] SNP at exon 19
Sandrin-Garcia, P1; Guimarães, RL1; Brandão, LAC1; Cavalcanti, CAJ1; Pancotto, JAT2; Donadi, EA2;
Crovella, S1,3
Laboratório de Imunopatologia Keizo Azami (LIKA)/Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Depto de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo (USP).
3
Depto de Genética/Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
[email protected]
1
2
Keywords: Systemic Lupus Erythematosus (SLE), Single Nucleotide Polymorphism (SNP), Fyn Binding Protein (FYB), Autoimmune
Disease, Real Time PCR
Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is a classical autoimmune disease that affects multiples organs and
displays a complex spectrum of clinical and immunological manifestations Susceptibility to SLE is associated
with various factors, including immunological and genetics. Genetic studies of autoimmune disease have been
focused on identifying genes related with disease susceptibility or specific phenotypes. The increase of knowledge
of genes association with autoimmune disorders suggests that certain alleles or haplotypes may contribute to
the susceptibility. Fyn Binding Protein (FYB) gene has been associated to modulation of T cells and codifies the
protein fyb-120/130, which acts as an adapter protein for the gene, signaling cascade of T cells, that modulates the
expression of IL-2. Since T cells dysfunction is considered to be the hallmark of SLE pathogenesis the FYB gene is
a strong candidate to participate in the pathogenesis of SLE. To determine association between polymorphisms
at FYB gene and the increased risk to develop SLE, we analyzed the SNP [A/T] in exon 19 of gene in SLE patients
by Real Time PCR. Samples DNA from 143 patients with SLE and 143 caucasian controls were obtained from
peripheral blood whole by salting out protocol. Genotyping of FYB gene in exon 19 was performed using real time
PCR by Rotor Gene RG3000 (Corbett Research-Uniscience) with taqman probe technology. Statistical comparison
between patients and controls, P values and odds ratio were calculated by Hardy Weinberg equilibrium and Fisher´s
Test. The percentage of distribution of allele A were 31% in SLE patients and 26% in caucasian controls, and allele
T were 69% and 74% respectively. Observed genotypic frequencies in SLE patients were: 10% (A/A), 43% (A/T) and
47% (T/T) and 4%, 44% and 52% respectively in controls. P values were p = 0.16 from genotypic and p = 0.19 from
allelic frequencies. There was no significant difference between the two groups either in the distribution of the
A/A, A/T and T/T alleles. All alleles tested in both groups were in Hardy-Weinberg equilibrium. In conclusion, the
genetic frequencies for SNP studied should not be associated with increased risk of SLE patients. According this
study is unlikely that FYB gene plays a major role in the pathogenesis of SLE.
Financial Support: FACEPE/CNPq (DCR-0089-2.02/08 and APQ-0087-2.02/08)
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90
Polimorfismos da região promotora do gene da
interleucina-18 em pacientes com lúpus eritematoso
sistêmico e indivíduos controles no estado de Santa Catarina
Back, LCK1; Mello, FM1; Farias, T1; Galiotto, D1; Sereia, AFR1; Zimermann, A2; Pereira, IA2; Souza, IR1
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética/CCB e 2Hospital
Universitário/CCS da Universidade Federal de Santa Catarina –
Florianópolis/SC.
1
Palavras-chave: Polimorfismos, SNP, região promotora, LES, Auto-imunidade
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune sistêmica, clinicamente heterogênea, caracterizada
pela perda de tolerância ao próprio. A produção de auto-anticorpos contra um amplo espectro de antígenos
nucleares e de superfície celular causa uma destruição tecidual imuno-mediada. É uma doença complexa em
que alguns fatores ambientais podem estar contribuindo para a patogênese. No entanto, cada vez mais estudos
demonstram que fatores genéticos, como alguns polimorfismos localizados em genes que codificam citocinas,
apresentam importante papel no mecanismo imunopatológico do LES. A IL-18 (Interleucina 18) é uma citocina
indutora de interferon-gamma, primariamente produzida por monócitos ou macrófagos e possui importante
papel na polarização da resposta Th1/Th2, ativação da resposta inflamatória e das células *natural killers*. Alguns
estudos demonstram níveis elevados dessa citocina em pacientes com LES. Polimorfismos localizados na região
promotora do gene *IL18* podem contribuir para diferenças inter-individuais na regulação da produção e função
dessa molécula podendo assim, apresentarem um papel na susceptibilidade ao desenvolvimento de diversas
patologias. Por esta razão, o presente estudo teve como objetivo a existência de associação entre a variabilidade
no gene *IL18* e o desenvolvimento de LES em um estudo caso-controle, no estado de Santa Catarina. Para esse
estudo foram selecionados dois polimorfismos de base única localizados na região promotora do gene (*IL18
-607*C→A e *IL18 -137*G→C) e que alteram a sua atividade transcripcional. Foram obtidas amostras de sangue
periférico de indivíduos controles (n=142) e pacientes diagnosticados com LES (n=106) de acordo com os critérios
da ACR (*American* *College* *of Rheumathology*), coletadas no Hospital Universitário da Universidade Federal
de Santa Catarina. Para a identificação da variabilidade foram utilizadas as técnicas de PCR seguida de clivagem
com endonuclease de restrição (PCR-RFLP) e PCR com iniciadores alelo específicos (PCR-SSP). A distribuição
genotípica dos polimorfismos estudados encontra-se em equilíbrio de *Hardy-Weinberg*. A freqüência do alelo
*IL18 -607A* foi de 42% em indivíduos controles e 42,4% em pacientes (OR=1,02; IC95%0,56-1,9; *p *=1,00), e do alelo
IL18-137C foi de 28% nos controles e 26,7% nos pacientes (OR=0,92; IC95%0,47-1,79; *p*=0, 908), não apresentando
assim diferenças estatisticamente significativas. Também não foram encontradas diferenças significativas entre
os diferentes genótipos em pacientes e controles. Assim, o estudo sugere que esses polimorfismos localizados
na região promotora do gene IL18 parecem não influenciar a susceptibilidade ao desenvolvimento de LES na
população avaliada.
APOIO: CAPES/CNPq/UFSC
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91
Determinação da frequência de alelos HLA predisponentes
em pacientes celíacos e seus parentes de primeiro grau e
rastreamento sorológico para determinação da freqüência
de DC entre os parentes de celíacos.
Martins, RCA1; Almeida, RC1; Gandolfi, L1; Pratesi, R1
Centro de Pesquisa em Doença Celíaca, Faculdade de Medicina de Universidade de Brasília - UnB, Brasília, DF, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Doença Celíaca, HLA, parentes, PCR
A Doença celíaca (DC) é uma enteropatia crônica, imuno-mediada e induzida pela intolerância permanente a
proteínas do glúten, que em indivíduos geneticamente predispostos, se caracteriza por lesões histológicas jejunais
típicas que mostram atrofia vilositária, hiperplasia das criptas e infiltração linfocitária, resultando em sérios
problemas na função absortiva intestinal. Os alelos do HLA-DQ2 (DQA1*0501 e DQB1*0201) são encontrados
em 80 a 100% dos casos de DC. Nos casos DQ2 negativos pode-se encontrar o HLA-DQ8 que está associado ao
haplótipo DR4 (DRB1*04). A pesquisa desses alelos entre parentes de celíacos é uma importante ferramenta na
seleção de indivíduos susceptíveis à doença. Dentro dessa perspectiva, o estudo teve como objetivos determinar,
por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction), a frequência dos alelos HLA-DQ2
e DRB1*04 entre pacientes celíacos e seus parentes de primeiro grau e, por rastreamento sorológico (determinação
de anticorpos IgA anti-transglutaminase - IgA-tTG e IgA anti-endomísio - IgA-EMA), a freqüência de DC entre
os parentes de celíacos. Foram pesquisados 90 pacientes celíacos e 207 de seus parentes de primeiro grau. Os
parentes com resultados positivos foram submetidos à biópsia intestinal. O HLA-DQ2 foi encontrado em 87% dos
celíacos do estudo, os demais, apresentaram pelo menos um dos alelos do HLA-DQ2 (DQA1*0501 ou DQB1*0201)
ou apenas o alelo DRB1*04, sendo que, um celíaco não apresentou nenhum dos alelos pesquisados. No grupo
de parentes de celíacos pesquisados, 57% apresentaram o HLA-DQ2 e 13% apresentaram o alelo DRB1*04, seja
isoladamente ou concomitantemente com o alelo DQA1*0501 ou DQB1*0201. Os testes para a detecção dos
anticorpos IgA-tTG e IgA-EMA foram positivos em 7% (14/207) parentes de celíacos, os quais foram diagnosticados
como DC. Desses, 93% (13/14) apresentavam o HLA-DQ2. O único parente diagnosticado como celíaco HLA-DQ2
negativo, apresentou isoladamente o gene DQB1*0201, sendo também positivo para o gene DRB1*04. Dos demais
parentes com resultados sorológicos negativos, 66% (128/193) apresentaram HLA-DQ2 ou DRB1*04. Observa-se
que a alta freqüência de alelos do HLA predisponentes em parentes de celíacos é similar à relatada em outros
estudos e que os parentes de celíacos constituem-se em grupo de risco para DC. Conclui-se que a determinação da
susceptibilidade à DC por meio da PCR é útil na definição da população que seria excluída de monitorização para
a DC e na identificação de casos que necessitem de futuro acompanhamento.
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92
Polimorfismos nos genes das moléculas
coestimuladoras CD80, CD86, CTLA4 e CD28 e
susceptibilidade à doença auto-imune pênfigo foliáceo
Dalla-Costa, R; Beltrame, MH; Pincerati, MR; Braun-Prado, K; Petzl-Erler, ML
Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: pênfigo foliáceo, polimorfismo genético, doença auto-imune, susceptibilidade genética, moléculas coestimuladoras
Pênfigo foliáceo (PF) é uma doença auto-imune da epiderme que é caracterizada pela produção de auto-anticorpos
contra a molécula desmogleína 1, expressa nos queratinócitos. Essa doença é de etiologia multifatorial, ou seja,
envolve múltiplos fatores genéticos e ambientais, e é endêmica no Brasil. As moléculas CD80 e CD86 são expressas
na superfície das células apresentadoras de antígeno e ligam-se aos receptores CD28 e CTLA-4 nos linfócitos T,
modulando a progressão da resposta imunológica. Diferenças interindividuais de susceptibilidade e/ou resistência
podem ser influenciadas por variantes dos genes que codificam estas moléculas co-estimuladoras. Em um estudo
caso-controle, utilizando as técnicas PCR-SSOP e PCR-RFLP, nós investigamos a associação entre o PF e os
genes CD80, CD86, CTLA4 e CD28. Foram genotipados 271 pacientes e 240 indivíduos controle para um indel de
cinco pares de base (posição -558) na região promotora do gene CD80 e para 13 polimorfismos de nucleotídeo
único (SNPs) localizados em regiões codificadoras e reguladoras desses genes (1057G>A no exon 8 do gene CD86;
-454A>C, -387C>T, -232A>G, -79G>C, -7C>T 5C>A na região promotora do gene CD80; -372G>A na região promotora
do gene CD28 e -1722T>C, -1577G>A, -318C>T, 49A>G e 6320G>A no gene CTLA4). As freqüências alélicas do gene
CD86 diferem significativamente entre pacientes e controles (p=0,001), sendo, a freqüência do alelo 1057*A 19% e
28%, respectivamente. Observamos uma associação negativa com o genótipo A/A, cuja freqüência é de 11,8% nos
controles e de apenas 4,8% nos pacientes (OR=0,34; p=0,002). A presença do alelo 1057*G está relacionada com
susceptibilidade aumentada tanto em homozigose (OR=2,96; p=0,002) quanto em heterozigose (OR=2,15; p=0,037).
O SNP do exon 8 do gene CD86, leva a uma substituição não sinônima (Ala304Tre) na molécula CD86, que insere um
potencial sítio fosforilativo no domínio citoplasmático desta molécula. Esse novo sítio fosforilativo pode alterar os
processos de sinalização intracelular controlados pela molécula CD86 durante a resposta imune, como a secreção
de citocinas e outras moléculas de sinalização celular, atuando, dessa forma, na patogênese do PF. As freqüências
das demais variantes polimórficas analisadas se assemelham em pacientes e controles, não estando, portanto,
associadas a maior ou menor susceptibilidade ao desenvolvimento do PF. Embora nenhuma associação tenha sido
encontrada entre o PF e as variantes analisadas nos genes CD80, CTLA4 e CD28, não se descarta o envolvimento
dessas moléculas na resposta à doença.
Apoio financeiro: CNPq; Fundação Araucária,PR; CAPES
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Análise polimorfica dos genes CYP1A1, GSTT1 e
GSTM1 na susceptibilidade a patogênese tiroideana
Reis, AAS¹; Monteiro, CD²; Oliveira, JC3; Curado, MP3; Silva, DM³; Saddi, VA4; Cruz, AP1,2
¹Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular (Doutorado) Instituto de Ciências Biológicas - Universidade Federal de
Goiás (ICB-UFG)
2
Núcleo de Pesquisas Replicon, Departamento de Biologia - Universidade Católica de Goiás
3
Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia-GO – Associação de Combate ao Câncer em Goiás
4
Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Araújo Jorge – Associação de Combate ao Câncer em Goiás
[email protected]
Palavras-chave: CYP1A1m1, Glutationa S-tranferase, patogênese tiroideana, nódulos tiroideanos malignos e benignos
A suscetibilidade de cada indivíduo ao câncer é caracterizada por alterações na expressão de oncogenes e de genes
supressores de tumores, além da associação com o polimorfismo de genes específicos responsáveis pela regulação
da ação de enzimas metabólicas. Os polimorfismos metabólicos estão sendo associados de forma mais consistente
ao aumento do risco de câncer, incluem as enzimas da superfamília citocromo P450 (CYPs), as glutationa Stransferase (GSTs) e as N-acetiltransferases (NATs). O objetivo do presente estudo foi estabelecer o perfil alélico do
gene CYP1A1m1 e dos genes GSTM1(null) e GSTT1(null) em grupos caso-controle para investigar a suscetibilidade
de pacientes diagnosticados com patologias da tiróide, incluindo 35 casos de nódulos neoplásicos malignos (NNM),
20 nódulos neoplásicos benignos (NNB) e 67 nódulos não neoplásicos (NNN). Os perfis alélicos de CYP1A1m1 e
GSTT1/GSTM1 foram estabelecidos por RFLP- PCR e por PCR multiplex, respectivamente. A associação entre o
polimorfismo de CYP1A1, GSTM1(null) e GSTT1 (null) na susceptibilidade ao câncer de tireóide foi mensurada por
Odds Ratio (OR) com intervalo de confiança de 95%. O perfil alélico de CYP1A1m1 dos pacientes classificados em
NNM, NNB, NNN, 46%, 65%, 70% eram homozigotos selvagem (T/T); 43%, 30% e 23% eram heterozigotos (T/C) e
11%, 5% e 7% eram homozigotos mutantes (C/C), respectivamente. Para o grupo controle, 28,5% eram T/T, 55,1%
eram T/C e 16,4% eram C/C. A comparação das freqüências obtidas entre os grupos caso e controle demonstra a
ausência da associação com a susceptibilidade ao câncer de tiróide e a doenças tiroideanas benignas (p>0,05). As
freqüências genotípicas positivas observadas para os genes GSTM1 e GSTT1 foram de 34,3% (12/35), 30% (6/20),
20,8% (14/67) e 37,2% (13/35), 5% (1/20), 35,8% (24/67) para os pacientes com NNM, NNB e NNN, respectivamente.
No GP as freqüências genotípicas foram 49,0% (24/49) e 51,0% (25/49). Para a avaliação dos genótipos GSTM1 (nulo)
e GSTT1 (nulo), foram encontrados nos grupos caso 65,7% (23/35) NNM, 70% (14/20) NNB e 79,2% (53/67) NNN.
O grupo controle apresentou os valores 51,0% (25/49) e 40,8% (20/49). O teste OR foi aplicado para verificar se a
presença dos genótipos nulos está relacionada com a susceptibilidade aos nódulos malignos e benignos da tireóide.
A comparação das freqüências demonstrou que a ausência do genótipo GSTT1 em NNB promove uma provável
susceptibilidade a neoplasias benignas sendo OR; IC 95%, p: 27.55; 3.41-222.75, p=0.001. Enquanto a ausência do
mesmo genótipo para NNM e NNN, a análise estatística demonstra uma tendência p=0.07. Estudos funcionais
envolvendo as enzimas codificadas por estes genes também devem ser realizados para a obtenção de resultados
mais significativos no estudo de associação dos genes CYP1A1, GSTM1 e GSTT1 com a patogênese tiroideana.
Apoio Financeiro: CNPq.
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94
Associação entre polimorfismos funcionais do gene
MBL2 e doença auto-imune da tireóide
Rodrigues, FF1; Fonseca, AMS1; Guimarães, RL2; Brandão, LAC2; Crovella, S1
Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
[email protected]
1
2
Palavras-chave: tireoidite auto-imune, lectina ligadora de manose, polimorfismos gênicos, hipertireoidimo, hipotireoidismo
A tireoidite auto-imune ou doença auto-imune de tireóide é a endocrinopatia auto-imune mais freqüente na
população. Ela compreende a Tireoidite de Hashimoto (hipotireoidismo) e Doença de Graves (hipertireoidismo), que
são considerados os pólos da doença. Esta doença caracteriza-se pela presença de auto-anticorpos moduladores da
função tireoidiana. Eles podem ser tantos ativadores como inibidores da glândula. Durante a última década, devido
ao seu papel na imunidade inata, surgiu um maior interesse na Lectina Ligadora de Manose (MBL) e na associação
entre polimorfismos funcionais do gene MBL2 e algumas doenças auto-imunes. Estudos recentes demonstram
que indivíduos portadores do alelo mutante do MBL2 estão sob maior risco de desenvolver doenças auto-imunes.
O presente trabalho mostra os dados preliminares do estudo da associação de polimorfismos do MBL2 e tireoidite
auto-imune. O grupo de estudo foi composto de 52 pacientes ATPO positivos, e o grupo controle formado por
165 indivíduos saudáveis. Foram investigados os SNPs presentes no éxon 1 do gene MBL2 (códons -52,-54 e -57)
através da curva de melting, utilizando o termociclador Rotor Gene 3000 Real Time PCR (Uniscience, Corbett
Research) como plataforma. Através da PCR em tempo real foi possível realizar a genotipagem dos pacientes. Os
três polimorfismos do MBL2 foram agrupados em uma única categoria (alelo 0), enquanto que a combinação de
três alelos selvagens foram agrupados como alelo A. As freqüências obtidas foram analisadas estatisticamente
através do teste exato de Fisher. As freqüências genotípicas do MBL2 não mostraram diferenças significativas
entre o grupo ATPO positivos e controle, respectivamente: AA (51% vs. 50%), AO (40% vs. 41%) e OO (8 % vs. 7%)
com o p-value de 0.11. As freqüências alélicas, apesar de também não mostrarem diferença significativa entre os
grupos, apresentaram uma tendência para a correlação com a doença, sendo observado através do p-value de
0.07. No presente estudo, esperava-se encontrar uma associação entre os polimorfismos no éxon 1 do MBL2 com
o aumento da susceptibilidade à tireoidite auto-imune, todavia não houve diferença significativa entre o grupo de
estudo e o controle (p-value>0,05). Porém, o p-value alélico (0.07) apresentou uma tendência para correlação dos
polimorfismos do MBL2 com a doença. Nosso grupo de pesquisa pretende ampliar o número de pacientes para
que haja uma representatividade estatística da população e elucidar o papel destes polimorfismos no mecanismo
de desencadeamento da doença. Esta é a primeira descrição dos SNPs do exon 1 deste gene em pacientes com
doença auto-imune da tireóide.
Apoio financeiro: FACEPE e CNPq.
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Associação de mutações no exon 7 do gene Receptor
de andrógeno com defeitos espermáticos quanto ao
número e motilidade dos espermatozóides
Silva, CTX1; Frare, AB1; Mesquita, WEJC1; Bordin, BM1; Silva, DM1,2; Silva, RCPC1; Jesuíno, RSA3; Moura,
KKVO1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Universidade Católica de Goiás – Goiânia – GO – Brasil
Professora Doutora da Universidade Católica de Goiás – Goiânia – GO – Brasil
3
Professora Doutora da Universidade Federal de Goiás – Goiânia – GO – Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: infertilidade masculina, receptor de andrógeno, gene RA, oligozoospermia, azoospermia
O receptor de andrógeno é uma proteína transcrional codificada pelo gene Receptor de andrógeno-RA, que
está localizado Xq11.12. O gene RA possui 8 exons que codificam três grandes domínios da proteína: domínio
aminoterminal (TAD), domínio de ligação ao DNA (DBD) e domínio de ligação ao andrógeno (DBL). Defeitos
no gene RA está associado a uma série de desordens, como a síndrome de insensibilidade ao andrógeno e
infertilidade masculina. A infertilidade masculina está relacionada a defeitos na espermatogênse, sendo este
processo dependente de hormônios, os andrógenos. Os hormônio exercem sua função na espermatogênese
associando a proteína receptor de andrógeno (RA) que transloca-se para o núcleo para ativar a transcrição gênica e
progressão do ciclo celular, dando continuidade a maturação dos espermatozóides. O presente trabalho verificouse a presença ou ausência de mutações no exon 7 do gene RA em pacientes com infertilidade masculina. Foram
coletadas amostras de sangue ou sêmen de 111 homens com espermograma alterado, 31 oligozoospérmicos,
23 astenozoospérmicos, 33 teratozoospérmicos e 24 azoospérmicos. Como controles foram coletadas amostras
de sangue ou sêmen de 95 homens com espermograma normal submetidas à extração de DNA e subsequente
amplificação do DNA por PCR, e os dados obtidos análisados estatísticamente. Verificou-se que 30,5% dos pacientes
inférteis estutados apresentaram mutação no exon 7, destes 22,6% são oligozoospérmicos, 37,5% azoospérmicos,
e 34,8% astenozoospérmicos, sendo significante estatisticamente (P=0,012). Foi encontrado relação estatística
significante entre o etilismo e a presença de mutações no exon 7 (P=0,044). Os resultados encontrados foram
relevantes mostrando que não só mutações no exon 1 do gene RA podem está relacionados a defeitos numéricos
espermáticos, e ainda foi possível encontrar um causa genética para astenozoospermia, um defeito comum mais
pouco estudado nos ambitos genéticos.
Apoio Financeiro: FAPEG,UCG e CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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96
Associação entre a presença do polimorfismo do gene
da eNOS na posição 786 e 894 e hipertensão arterial
em adultos
Malagrino, PA1; Sponton, CHG1; Esposti, RD1; Fernandes, RA1; Resende, TM1; Simões, NS1;
Franco-Penteado, C2; Costa, FF2; Bacci Jr, M3; Rodovalho, C3; Zanesco, A1
Laboratório de Atividade Física e Saúde, Instituto de Biociências de Rio Claro - UNESP
Centro de Hematologia e Hemoterapia, Unicamp
3
Centro de Estudos de Insetos Sociais – Unesp Rio Claro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: polimorfismos da eNOS, hipertensão
Introdução: O Óxido Nítrico (NO) formado a partir da enzima NO sintase (NOS) desempenha importante papel
no sistema cardiovascular, entre elas, vasodilatação e inibição da agregação plaquetária. Atualmente, a presença
de polimorfismos no gene da NOS endotelial (eNOS) tem sido associado ao desenvolvimento de doenças
cardiovasculares, entre eles, o single nucleotide polymorphism (SNP) localizado na região promotora na posição
786 com alteração de T para C (T-786C) e o outro SNP no éxon 7 na posição 894 com alteração de G para T (G-894T).
No entanto, nenhum trabalho avaliou essa relação na população brasileira. Objetivo: Assim, nossa hipótese foi
examinar se a incidência de hipertensão arterial era positivamente associada à presença dos polimorfismos para
o gene da eNOS nas duas posições (786 e 894) em adultos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi correlacionar a
existência de polimorfismos T-786C ou G-894T (separadamente ou conjuntamente) com a presença de hipertensão
arterial. Métodos: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNESP. Quarenta voluntários
foram avaliados com média de idade de 54,93 ± 1 anos. Leucócitos foram isolados do sangue para a extração do
DNA, o qual foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e digerido por duas enzimas, T-786 por MspI
e G-894T por MboI. A pressão arterial foi analisada seguindo as diretrizes da Sociedade Brasileira de Hipertensão.
Para a análise estatística foi feita uma regressão logística binária (razão de chance e intervalo de confiança de 95%),
e o histórico familiar foi usado como fator de confusão no modelo ajustado de regressão. Resultados: Quatorze
voluntários apresentaram o genótipo TT + GG para as posições 786 e 894 (35%) enquanto que vinte e seis possuíam
polimorfismo para uma ou para as duas posições (65%). Além disso, nossos resultados mostram uma razão de
chance quatro vezes maior de um indivíduo com presença de um dos dois polimorfismos, ou ambos, apresentarem
hipertensão arterial. Conclusão: A presença de polimorfismo T-786C e G-894T da eNOS mostrou relacionar-se
positivamente com a hipertensão arterial em adultos, agravando a incidência desta.
Apoio Financeiro: CNPq/FAPESP
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A associação entre o polimorfismo RsaI do gene receptorbeta de estrógeno com a infertilidade masculina
Barbosa, AM1; Bordin, BM1; Frare, AB1; Silva, CTX1; Silva, RCPC1,2; Moura, KKVO1
Núcleo de Pesquisas Replicon – Depart. De Biologia – Universidade Católica de Goiás
Laboratório de Reprodução Humana – Hospital das Clínicas – Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
2
Palavras-chave: polimorfismo RsaI, gene REβ, infertilidade masculina, tabagismo, espermatogênese
O gene Receptor β de estrogênio (REβ) desempenha um papel importante na regulação da fertilidade tanto
em homens e mulheres. O polimorfismo RsaI no éxon 5 do REβ tem-se mostrado associada com infertilidade
masculina em caucasianos. O objetivo deste estudo foi investigar a freqüência deste polimorfismo na etiologia
da infertilidade idiopática masculina e sua correlação com o tabagismo, etilismo, contato com xenobióticos e
caxumba. Nós analisamos 287 brasileiros, incluindo 161 inférteis e 126 homens férteis para avaliar a associação do
polimorfismo RsaI do gene REβ com a infertilidade masculina. Os alelos variantes do polimorfismo RsaI (AA, AG
ou GG) foram determinadas pela reação em cadeia da polimerase alelo-específica. Em comparação com um grupo
controle (homens normozoospérmicos), a freqüência do genótipo heterozigoto RsaI-AG foi quatro vezes maior em
homens inférteis (9,94 vs. 2,38%, P = 0,01), cinco vezes maior em azoospérmicos (11,36 vs. 2,38%, P = 0,02) e sete
vezes maior em teratozoospérmicos (17,79 vs. 2,38%, P = 0,001). A freqüência do genótipo heterozigoto RsaI-AG foi
três vezes maior nos fumantes inférteis (23,8 vs. 7,4%, P = 0,038) em comparação com não fumantes inférteis e nove
vezes maior em fumantes azoospérmicos (66,7 vs. 6,9%, P = 0,035), comparado com não fumantes azoospérmicos.
O polimorfismo RsaI no gene REβ pode ter efeitos sobre a modulação da espermatogênese humana. Parece haver
uma associação consistente entre o polimorfismo RsaI e tabagismo em homens inférteis.
Apoio Financeiro: UCG, CNPq.
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Pesquisa de polimorfismos do gene INHA em pacientes
com insuficiência ovariana prematura
Teles, JS; Pinheiros, FS; Christofolini, DM; Bianco, B; Barbosa, CP
Disciplina de Genética e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia
Faculdade de Medicina do ABC - FMABC
[email protected]
Palavras-chave: INHA, Polimofismo, falência ovariana prematura, insuficiência ovariana, menopausa
Introdução: A Falência ovariana prematura (FOP), mais apropriadamente denominada Insuficiência ovariana
prematura (IOP), é um processo pelo qual a queda gradativa das funções ovarianas resulta na falência da
foliculogênese antes dos 40 anos de idade. Caracteriza-se pela ausência de menstruação por um período maior que
6 meses (amenorréia secundária), mas pode manifestar-se antes da menarca, levando à amenorréia primária. As
inibinas são dímeros de glicoproteínas predominantemente produzidas nas gônadas. Atuam de forma a inibir o eixo
hipotálamo-hipófise-gônadal na regulação da secreção do FSH no ciclo menstrual normal, processo que permite a
ovulação programada de um único folículo maduro. Dois estudos prévios, Shelling et al (2000) e Marozzi et al (2002)
sugeriram o envolvimento do gene INHA na etiologia da IOP (insuficiência ovariana prematura). No entanto, ainda
não é clara a relação entre polimorfismos do gene INHA e a redução da expressividade da inibina. Estudos recentes
em populações da Nova Zelândia, Eslovênia, Índia e Itália observaram diferenças significativas quanto a freqüência
de alelos promotores do gene INHA entre grupos com IOP e controles, e concluiram que tais variantes relacionavamse com a manifestação da IOP. Sendo assim, este trabalho teve o objetivo de estudar o polimorfismo no exon 2 do
gene INHA (G769A), em mulheres com amenorréia secundária diagnosticadas com IOP idiopática. Materiais e
métodos: Foram estudadas, até o momento, 28 pacientes com insuficiência ovariana prematura provenientes do
Ambulatório de Infertilidade da FMABC e um grupo controle composto de 50 mulheres acima de 40 anos, férteis,
com menstruação regular ou que haviam entrado em menopausa após os 40 anos. O polimorfismo no exon 2
do gene INHA (G769A) foi investigado por RFLP-PCR, eletroforese em gel de agarose e visualização em luz UV
Resultados: A média de idade entre as participantes foi 34,3 anos. Os sintomas mais comumente referidos durante
as consultas foram: sensação de fogachos, infertilidade, diminuição da libido e atrofia do trato genito-urinário. A
média dos níveis de FSH foi de 64,3 mUI/ml. De acordo com a análise molecular das amostras coletadas, nenhuma
das 28 pacientes apresentou o polimorfismo G769A do gene INHA. Com relação ao grupo controle, a média de
idade entre as participantes foi de 48 anos e também não foi encontrado polimorfismo no gene. Conclusâo: Apesar
do pequeno número de pacientes estudadas até o momento, os resultados sugerem que o polimorfismo G769A do
gene INHA não está relacionado com a insuficiência ovariana prematura em mulheres Brasileiras.
APOIO NEPAS (Núcleo de Estudos, Pesquisas e Assessoria em Saúde da Faculdade de Medicina do ABC).
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Polimorfismos do receptor de estrogênio-α e sua
eventual correlação com o hormônio folículoestimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH)
em mulheres na pós-menopausa
Lima, EK1; Massad-Costa, AM1; Nogueira-de-Souza, NC1; Carvalho, CV1; Silva, ID1
Laboratório de Ginecologia Molecular – Depto de Ginecologia. Campus São Paulo – UNIFESP
[email protected]
1
Palavras-chave: Hormônio folículo-estimulante, Hormônio luteinizante, menopausa, polimorfismo, receptores de estrogênio- α.
A menopausa é uma fase marcada pelo comprometimento funcional progressivo dos ovários. Como consequência
é interrompido o ciclo fértil da mulher decorrente a diminuição dramática da produção de hormônios sexuais
femininos como o estrogênio e a progesterona. A redução progressiva do estrogênio na menopausa está relacionada
ao desenvolvimento de doenças crônicas e degenerativas. Essa fase é marcada também por sinais de elevado
nível sérico de hormônio folículo-estimulante e altos níveis do hormônio luteinizante. Alguns estudos mostram
associações genéticas entre esses sintomas e alguns polimorfismos genômicos. Assim sendo, Propusemo-nos
a analisar os níveis de FSH e LH no período da pós-menopausa e correlacioná-los com os polimorfismos do
Receptor de Estrogênio- α. Foram incluídas 95 mulheres pós-menopausadas atendidas no Setor de Climatério do
Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. As pacientes
tiveram seus DNAs extraídos a partir 5ml de sangue periférico. As regiões polimórficas foram amplificadas pela
técnica de PCR e, em seguida, genotipadas por meio de técnicas de digestão enzimática. As freqüências dos
diferentes genótipos foram avaliadas estatisticamente buscando relacioná-las aos níveis séricos de LH e FSH obtidos
através de dosagens realizadas no plasma do sangue coletado das mulheres. Os valores de p encontrados para os
polimorfismos confrontados com FSH foram ERxbaI = 0,196 e ERpvuII = 0,014, enquanto o p dos polimorfismos
confrontados com LH foram ERxbaI = 0,127 e ERpvuII = 0,125. Desta forma concluímos que o polimorfismo ERpvuII
apresentou significância estatística quando confrontado com os valores de nível sérico de FSH nas mulheres na
pós-menopausa.
Apoio: FAPESP e CNPq
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100
Análise de metilação no promotor do Gene MMP3 em
células epiteliais bucais e de tecido gengival em indivíduos
com periodontite crônica fumantes e não-fumantes
Damm, GR; Oliveira, NFP; Salmon, C; de Souza, AP
FOP – UNICAMP
Palavras-chave: tabaco, metilação, periodontite, MMP-3, epigenética
Nosso objetivo foi investigar o padrão de metilação nas posições CpG -686 e -635 do promotor do gene MMP3 em
células epiteliais da mucosa bucal e células do tecido gengival e os níveis de expressão de RNAm da MMP-3 no
tecido gengival. Os voluntários foram divididos em três grupos: indivíduos com periodonto saudável não fumantes,
indivíduos com periodontite crônica fumantes e indivíduos com periodontite não-fumantes. DNA foi obtido de
células epiteliais bucais e células de tecido gengival normal e com periodontite crônica.. RNA total foi purificados de
células gengivais obtidas de biópsias de tecido gengival normal e com periodontite crônica. O padrão de metilação
nas posições -686 e -635 do promotor do gene da MMP-3 foi investigado utilizando as enzimas de restrição sensíveis
à metilação HpaII e HpyCH4IV, respectivamente. Em seguida foi realizada a PCR e eletroforese. Amostras metiladas
apresentaram amplificação positiva e amostras não-metiladas não apresentaram amplificação pela PCR. A análise
estatística entre o padrão de metilação encontrado nas amostras dos diferentes grupos foi realizada pelo teste de
c2 ao nível de 5%. A expressão relativa da MMP-3 foi realizada em aparelho real time PCR e as diferenças analisadas
pelo teste de Kruskal-Wallis ao nível de 5%. Não observamos diferença no padrão de metilação na posição -686 do
gene da MMP3 nos diferentes grupos, porém a posição -635 foi observada não metilada com frequência significante
no grupo periodontite fumante. Concluímos que há diferença entre o padrão de metilação encontrado na posição
-635 entre os grupos estudados, havendo uma frequência significativamente maior de indivíduos apresentando
desmetilação na posição -635 no grupo periodontite fumante.
Apoio Financeiro: FAPESP
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101
Análise de metilação em ilha CpG no promotor do gene
TLR-2 em células de tecido gengival de indivíduos com
periodontite crônica
Oliveira, NFP*; Damm, GR; Andia, DC; Pardo, APS
Laboratório de Biologia Molecular- Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP
[email protected]
Palavras-chave: periodontite, metilação de DNA, TLR-2, epigenética, fumantes
A doença periodontal consiste num grupo de infecções que leva à inflamação da gengiva e a destruição
dos tecidos periodontais. Sabe-se que a periodontite envolve tanto a genética do hospedeiro quanto fatores
ambientais, tais como: microbiota bucal e hábito de fumar, sendo assim, uma doença multifatorial. O fumo pode
alterar o metabolismo das células do microambiente tecidual e tem potencial para alterações químicas no DNA
genômico. Estudos revelam que em particular, a bactéria anaeróbia gram negativa Porphyromonas gingivalis
tem um importante papel no desenvolvimento da doença. O lipopolissacarídeo (LPS) presente na parede desses
microrganismos são reconhecidos por receptores de membrana denominados receptores Toll-like-2 (TLR-2).
Esses receptores fazem parte de uma família que apresentam diferentes especificidades e são expressos por vários
tipos celulares, participando dessa maneira da resposta imune inata e adaptativa. Sabe-se também, que um dos
mecanismos de controle da expressão gênica é a metilação de DNA. Esse, é um mecanismo epigenético, que pode
indicar a atividade de um gene, sendo que hipermetilação pode levar à diminuição ou até a repressão gênica, e a
hipometilação à indução da expressão. Com base nesses fatos, nosso objetivo foi estudar o padrão de metilação
do gene TLR-2 em células gengivais de indivíduos fumantes e não fumantes com periodontite crônica, a fim de
associar o padrão de metilação nessas células com a periodontite. Amostras de DNA foram extraídas de células
de tecido gengival de indivíduos saudáveis e com periodontite crônica fumantes e não fumantes. Posteriormente,
o DNA foi digerido com enzimas de restrição sensíveis à metilação: HhaI, HpaII e HpyCh4IV. Após a digestão, as
amostras foram amplificadas por PCR e visualizadas em gel de poliacrilamida corado com SYBR Gold. A análise
estatística pelo X2 não revelou diferenças entre os grupos, sendo que todos eles apresentaram hipermetilação nas
posições -83, -77, -72, -65, -20, -16, -10 e +24 da região promotora do gene TLR-2. Assim, conclui-se que não há
associação entre o padrão de metilação e a periodontite crônica.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP
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Association of polymorphisms in the Carbonic
Anhydrase 6 gene with salivary buffer capacity, dental
Plaque pH, and caries index in children aged 7-9 years
Mofatto, LS2; Camargo, G2; Cortellazzi, K3; dos Santos, MN1; Bergamaschi, CC4; Peres, RCR1; Line, SRP2
Department of Pediatric Dentistry, Piracicaba Dental School, State University of Campinas, Sao Paulo, Brazil
Department of Morphology, Piracicaba Dental School, State University of Campinas, Sao Paulo, Brazil
3
Department of Preventive Dentistry and Public Health, Piracicaba Dental School, State University of Campinas, Sao Paulo, Brazil
4
Department of Physiological Sciences, Piracicaba Dental School, State University of Campinas, Sao Paulo, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: buffer capacity; carbonic anhydrase 6; caries; saliva; plaque dental
Carbonic Anhydrase VI (CAVI) is a secreted enzyme that catalyzes the hydration of carbon hydroxide in saliva and
other body fluids. This enzyme has been implicated in taste and gastrointestinal dysfunctions, tooth erosion and
caries. The purpose of this study was to analyze the allele and genotype distribution of three polymorphisms in
the coding sequences of (CA6) gene and check for possible associations with salivary buffer capacity, number of
decayed, missing and filled teeth in deciduous and permanent teeth (dmft/DMFT), plaque index (PI) and the plaque
pH variation (∆pH) in children aged 7 to 9 years. Two hundred and forty-five children from both genders, residents
in area with fluoridated water (Piracicaba, São Paulo, Brazil) were divided in 2 groups: caries-free (CF) and with
caries (C). The clinical examinations were conducted by a single previously calibrated examiner (kappa= 0.91) in
an outdoor setting using a mirror and a probe, according to WHO criteria index (dmft/DMFT). Approximately two
hours after the first daily meal, the buffer capacity (BC) and the plaque pH were analyzed by means of a pH meter
and an ion selective electrode. Plaque pH was measured immediately and 5 minutes after a mouth rinse with a 10%
sucrose solution. The data was submitted to Chi-Squared (c2), Student’s and Mann-Whitney tests (α=0.05). The
PI and ∆pH the upper and lower teeth were significantly higher in the carious group than control (p<0.05). There
was no difference between the groups in relation to buffer capacity. There was no association between the alleles
and genotypes distributions for polymorphisms in the CA6 gene exons 2 and 3 and caries experience (p>0.05).
There was a positive association between buffer capacity and the rs2274327 (C/T) polymorphism. The allele T and
genotype TT were significantly less frequent in individuals with the highest buffer capacity (p=0.023 and p=0.045,
respectively). This finding encourages future studies relating CA6 gene polymorphisms and their association with
malfunctions, such as taste and gastrointestinal alterations, or the differential effect of chemical modulators on the
protein products originated from the distinct genotypes of the CA6 gene.
Financial Support: CAPES and FAPESP
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Avaliação da importância do polimorfismo -1031T>C
do gene TNFA para o diabetes mellitus tipo I e a
periodontite severa
Santos, ECL1; Oliveira, LS2; Ribeiro, MSM2; Pacheco, R2; Gomes, MB5; Fischer, RG2; Macedo, JMB1
1
2
Laboratório de Biologia Molecular, Dpto. de Bioquímica, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes UERJ
Faculdade de Odontologia, UERJ
Palavras-chave: Doença Periodontal. TNF-a. Polimorfismo Genético. Diabetes. DMI. Periodontite.
Diabetes melittus e doenças periodontais são altamente prevalentes na população mundial. Doenças Periodontais
(DPs) compreendem um grupo de condições crônicas inflamatórias induzidas por microorganismos que levam à
inflamação gengival, à destruição tecidual periodontal e à perda óssea alveolar. Já o diabetes melittus (DM) é o termo
utilizado para descrever um grupo de desordens metabólicas associadas à tolerância à glicose e ao metabolismo
inadequado de carboidratos. Uma vez que DPs poderiam agir de forma similar a outros estados infecciosos
sistêmicos, aumentando, assim, a severidade do diabetes, uma possível relação entre ambas as doenças tem sido
considerada. A importância de fatores de natureza genética tem sido avaliada para as duas patologias, com especial
interesse em relação aos polimorfismos nos genes determinantes de algumas citocinas, tais como o TNF-a. Neste
estudo, o polimorfismo genético de um único nucleotídeo (SNP) localizado na região promotora do gene TNFA
-1031T>C foi avaliado e sua importância para a doença periodontal destrutiva e DMI foi avaliada. Para isso, foram
coletadas amostras de sangue e/ou esfregaço bucal de um grupo de pacientes diabéticos tipo I (D, n=58) e de
indivíduos não diabéticos (ND, n=73), todos residentes na região metropolitana do Rio de Janeiro. Após a extração
do DNA genômico e amplificação da região de interesse por PCR (Polymerase Chain Reaction), o polimorfismo
TNFA -1031T>C foi analisado por BbsI RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Os produtos da digestão
com a enzima de restrição foram visualizados após corrida eletroforética em gel de poliacrilamida 8% e coloração
com brometo de etídeo. Os grupos de estudo obedecem ao princípio de Hardy-Weinberg. No grupo ND, as seguintes
frequências genotípicas foram encontradas: 78,1% (T/T); 20,5% (T/C) e 1,4% (C/C), enquanto no grupo D foram:
42,4% (T/T); 37,3 (T/C) e 20,3% (C/C). A frequência do alelo T no grupo diabético (D) foi de 0,610 ao passo que no
grupo ND foi de 0,884. Não foi possível observar uma relação entre o polimorfismo -1031T>C do gene TNFA e a
presença de periodontite em diabéticos tipo I. Entretanto, o polimorfismo estudado se mostrou significativamente
relacionado (p>0,0001 e OR=4.85 95%IC 2,271- 10,338) à presença do diabetes tipo I, independentemente do grupo
étnico considerado.
Apoio Financeiro: FAPERJ, UERJ.
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104
Polimorfismos do gene NALP1 não apresentam
associação com diabetes tipo 1 em população do
nordeste brasileiro
Serafim-Silva, SP1; Coelho, AVC1; Brandão, LAC1; Guimarães, RL1; Pontillo, A2; Crovella, S1,2
Laboratório de Imunopatologia Keiso Asami, UFPE, Recife-PE
IRCCS Burlo Garofolo, University of Trieste, Trieste, Italy
[email protected]
1
2
Palavras-chave: NALP1, polimorfismo, doenças auto-imunes, diabetes tipo 1, PCR em tempo real.
NALP1 é um gene que codifica uma proteína apoptótica do membro da família do Ced-4. É um gene expresso numa
grande variedade de tecidos, mais particularmente no timo e no baço, desempenhando um papel funcional no
sistema imune. Essas proteínas, conhecidas como NALP se associam com outras proteínas formando complexos
de multiproteínas citoplasmáticas, conhecidos como inflamasomas que promovem apoptose de células infectadas
por patógenos. A superexpressão deste gene foi demonstrada por induzir apoptose em células. Descobertas recentes
fornecem evidências do papel crítico do gene NALP1 na imunidade inata e doenças inflamatórias, e também na
predisposição a doenças autoimunes. Uma vez que tem sido relatado que a IL-1beta tem um efeito sistêmico da
perda da tolerância imunológica, temos hipótese de que as variações no NALP1 poderia contribuir para doenças
auto-imunes predisposição genética tendo em vista seu papel central na ativação de inflamossomas e da produção
desta citocina pró-inflamatória. Nós testamos a possível associação de 2 polimorfismos de único nucleotóideo (ou
do inglês, single nucleotide polymorphisms-SNP) em NALP1 em pacientes da região Nordeste do Brasil afetados
por diabetes tipo-1 (TD1). Nosso grupo de estudo foi composto por 196 pacientes e um grupo controle de 96
pacientes saudáveis. Os SNPs foram detectados por PCR em tempo real (sondas TaqMan). As freqüências alélicas
e genotípicas, equilíbrio de Hardy-Weinberg e de análise estatística foram avaliados pelo software R (versão 2.80.1).
Obtido um p-value > 0,05 nossos resultados demonstraram que SNPs no NALP1 não foram associados a TD1,
especificamente para a população brasileira. Apesar da sua forte associação com TD1 em pacientes norueguêses,
NALP1 não foi associada a TD1, nesta população brasileira.
Apoio Financeiro: FACEPE, LIKA-UFPE
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105
NALP3 gene polymorphism involved in type 1 diabetes
mellitus
Kamada, AJ1; Pontillo, A2; Campos, AV1; Brandão, LAC1; Guimarães, RL1; Araújo, J3; Crovella, S2,4.
1. Laboratório de Virologia - Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE, Recife.
2. Medical Genetic Service, Institute for Maternal and Child Health - IRCCS Burlo Garofolo (Trieste, Italy)
3. Hospital das Clínicas, UFPE, Recife.
4. Departamento de Genética, UFPE, Recife.
[email protected]
Keywords: NALP3, T1DM, SNP, Real Time PCR, Inflammasome
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic autoimmune disease with a strong inflammatory component which
contributes to destruction, functional suppression and inhibition of β‑cell regeneration that deregulate human
insulin production. Inflammasomes are cytoplasmic multiprotein complexes that mediate the activation of
inflammatory caspases-1 and -5, promoting the maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin-1β (IL1β), IL-18, and IL-33. Assembly of inflammasomes depends on NOD-like receptor (NLR) family members such
as NALPs. Recent findings provide evidence of the critical role of NALP3 gene in innate immunity, inflammatory
diseases and also in the predisposition to autoimmune disorders. We investigated the association of 3 single
nucleotide polymorphisms (SNP) in NALP3 gene, rs35829419 (Q705K, C→A), rs10754558 (3’UTR, C→G) and
rs10802501 (3’UTR, T→A), in 196 patients affected by T1DM from the public healthcare system of Recife (Hospital
das Clínicas, Instituto de Medicina Integrada Prof. Fernando Figueira, Hospital da Restauração) and 96 healthy
subjects used as controls (HC). Genomic DNA was extracted from peripheral blood in both groups using the Wizard
genomic DNA purification kit (Promega). Genotyping was performed using Real Time PCR by ABI7900HT II Fast
Real-Time instrument (Applied Biosystems) through TaqMan assays. Hardy-Weinberg equilibrium was verified
using the Genotype Transposer software and genetic risk predisposition were analyzed by Exact Fisher test. Our
results demonstrated that NALP3 rs10754558 SNP was associated to T1DM in the Brazilian population. C allele was
significantly more frequent when compared to the HC (261/392, 0.67, vs 103/192, 0.54; p=0.01246; OR=1.722, 95%
CI=1.210-2.450). Since it has been reported that IL-1β has a systemic effect in the lost of the immunologic tolerance,
we hypothesized that variations in NALP3 could contribute to T1DM genetic predisposition due to its central role
in the activation of inflammasome and the production of this pro-inflammatory cytokine.
Supported by: FACEPE, UFPE-LIKA, IRCCS Burlo Garofolo and IMIP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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SNPs do gene TFC7L2 relacionadas com Diabetes
Mellitus tipo II no distrito de Canaã, Triunfo,
Pernambuco
Maranhão, RMA¹; Lyra, R¹; Balbino, VQ¹; Silva, RS¹; Cezar, NJB¹; Neves, CA¹; Campos, AVC²; Mauricio-daSilva, L¹
¹ Laboratório de Genética Molecular Humana- Universidade Federal de Pernambuco.
² Laboratório de Virologia - Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA).
[email protected]
Palavras-chave: Diabetes Mellitus, TCF7L2, SNP, endocruzamento, freqüência do alelo de risco
A Diabetes Mellitus é um importante e crescente problema da saúde mundial. Há um consenso internacional de
que a freqüência de Diabetes vem aumentando nas últimas décadas, mas que a Diabetes tipo 2 vem adquirindo
características de epidemia. O número de pessoas com esse tipo da doença deverá duplicar nos próximos 10 a 25
anos, particularmente nos países em desenvolvimento ou recentemente industrializados. O fator de transcrição
2 semelhante ao 7 (TCF7L2) está localizado no cromossomo 10 em 10q25 e está envolvido na via de sinalização
Wnt. Este gene tem sido fortemente associado com o aumento de risco da diabetes mellitus tipo 2 em populações
européias, mas até o momento quase não existem estudos a respeito dessa associação nas populações sulamericanas. No distrito de Canaã, município de Triunfo – PE, foi realizado um levantamento dos dados das famílias
locais a fim de estabelecer a prevalência de Diabetes Mellitus 2 na população e identificar os indivíduos afetados
pela doença. Numa amostra de diabéticos foi analisada a ocorrência de quatro SNPs (Polimorfismos de Única
Base) do gene TCF7L2: rs7903146; rs7901695; rs12255372 e rs11196205, através da genotipagem por Real-Time
PCR, utilizando-se sondas TaqMan. A prevalência de diabéticos em Canaã foi de 3% acometendo 60 indivíduos.
A prevalência encontrada para o sexo masculino foi de 1,2% e para o feminino foi de 1,8%. Foram estabelecidas as
freqüências genotípicas para cada SNP e as freqüências dos alelos de risco foram: 0,39 para rs7903146; 0,35 para
rs7901695 e rs12255372, e 0,52 para rs11196205. Altos coeficientes de endocruzamento foram encontrados para
todos SNPs, com o maior, F=0,54 encontrado no rs7901695. Foi observada também uma alta relação homozigotos/
heterozigotos. O alto valor do coeficiente de endocruzamento e o maior número de homozigotos em relação aos
heterozigotos poderiam evidenciar que os indivíduos diabéticos de Canaã estão acasalando uns com os outros,
aumentando dessa forma as chances de seus descendentes desenvolverem a doença.
Apoio financeiro: CNPQ e LGMH
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Detecção das mutações do gene TCF7L2 relacionadas
com Diabetes Mellitus tipo II no distrito de Jericó,
Triunfo, Pernambuco
Cezar, NJB; Lyra, R; Balbino, VQ; Silva, RS; Maranhão, RMA; Kamanda, AJ; Campos, AVC; Mauricio-daSilva, L
Laboratório de Genética Molecular Humana - Departamento de Genética - Universidade Federal de Pernambuco.
[email protected]
Palavras-chave: Diabetes,TCF7L2, SNPs, Real-Time PCR, freqüência do alelo de risco
O relacionamento das mutações do gene TCF7L2 com Diabetes Mellitus tipo II (DM2) é bastante estudado. O
produto deste é um grupo de alta mobilidade contendo um fator de transcrição implicado na homeostase da
glicose sangüínea sugerindo-se que o TCF7L2 atue na regulação do pró-glucagon reprimindo este gene nas células
entero-endócrinas. Conseqüentemente, é preciso verificar a sua ocorrência em nossas populações para que sirva
como elemento diagnóstico e apoiador de iniciativas de saúde pública além do acompanhamento mais efetivo
das pessoas. Foram determinadas as freqüências dos principais SNPs do gene TCF7L2 relacionadas à DM2 em 14
indivíduos, o que corresponde a 32,56% do total de diabéticos da população de Jericó, Triunfo-PE. Para verificar
a ocorrência dos principais SNPs foi realizada genotipagem por Real-Time PCR, utilizando-se sondas TaqMan. A
leitura foi feita através do software Rotor-Gene versão 6 build 41, o qual fornece a informação do alelo amplificado,
normal ou mutante, através da fluorescência emitida pelos marcadores da sonda (VIC ou FAM). Para cada SNP
foram calculadas freqüências genotípicas, freqüência do alelo de risco e coeficiente de endocruzamento (F). Na
rs7901695 as freqüências genotípicas foram:T/T=0,64 T/C=0,21 e C/C=0,14 a freqüência do alelo de risco C foi 0,25
e F=0,4. Na rs7903146 as freqüências genotípicas foram: T/T=0,30 C/T=0,30 C/C=0,38 a freqüência do alelo de risco
T foi 0,45 e F=0,4. Na rs12255372 as freqüências genotípicas foram: T/T=0,27 G/T=0,45 e G/G=0,27 a freqüência
do alelo de risco T foi 0,50 e F=0,1. Para a rs11196218 as freqüências genotípicas foram: A/A=0,18 G/A=0,18 e G/
G=0,64 a freqüência do alelo de risco G foi 0,73 e F=0,5. De acordo com esses dados, foi observado que 85,7% dos
diabéticos apresentaram o alelo de risco em pelo menos uma das quatro SNPs, estando esse alelo expresso em
homozigose em 71,43% dos indivíduos estudados, 28,6% dos indivíduos apresentou o alelo de risco em homozigose
para duas das quatro SNPs avaliadas, em 29% das amostras o alelo de risco foi detectado em todas quatro SNPs.
Com isso, pode-se sugerir uma possível relação entre a ocorrência dos alelos de risco e a manifestação da DM2. Os
coeficientes de endocruzamento para três dos quatro SNPs se apresentaram com valores relativamente elevados,
podendo haver indícios de endocruzamento nesta população.
Apoio Financeiro: Facepe e LGMH.
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Análise de polimorfismos genéticos nas proteínas
desacopladoras (UCP2-UCP3) e sua relação com o
diabete mellitus tipo 2
Macedo, GS 1,2; Sortica, DA2; Canani, LH2; Callegari-Jacques, SM; Crispim, D2
¹Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
2
Hospital de Clínicas de Porto Alegre-Serviço de Endocrinologia.
[email protected]
Palavras-chave: diabete mellitus tipo 2, Proteínas desacolpladoras, polimorfismos
O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma doença metabólica comum caracterizada pela hiperglicemia crônica
resultante de defeitos na ação e/ou secreção de insulina. Numerosos estudos têm demonstrado que o DM2 é uma
doença multifatorial influenciada por diversos fatores genéticos e ambientais. As proteínas desacopladoras 2 e 3
(UCP2 e UCP3) estão presentes na membrana mitocondrial interna e desacoplam a oxidação dos substratos da
síntese de ATP, conseqüentemente diminuindo a produção desta molécula pela cadeia respiratória mitocondrial.
Esse desacoplamento tem diversas funções, entre elas: modulação do metabolismo de ácidos graxos (UCP2
e UCP3), diminuição do estresse oxidativo (UCP2 e UCP3) e regulação negativa da secreção de insulina pelas
células-beta pancreáticas (UCP2). Alguns estudos têm sugerido que polimorfismos nos genes UCP2 e UCP3 estão
associados com a patogênese do DM2 e/ou da obesidade; entretanto, esses resultados não foram replicados
em outras populações. Sendo assim, o objetivo principal desse estudo foi avaliar a associação entre o DM2 e as
seguintes variantes nos genes UCP2 e UCP3: -866G/A, Ala55Val, Ins/Del de 45bp e +5399A/G, todos no gene
UCP2, e -55C/T, +3057A/G, +3854C/T, +6689G/A no gene UCP3. Foram analisados 779 pacientes com DM2 e 461
indivíduos não-diabéticos, descendentes de europeus. As genotipagens dos polimorfismos estudados foram feitas
por PCR convencional ou PCR em tempo real, dependendo do polimorfismo. As frequências alélicas e genotípicas
foram comparadas entre os grupos pelo teste do qui-quadrado e uma medida de magnitude de efeito foi calculada
através da razão de chances (RC) e intervalo de confiança (IC) de 95%. A análise dos haplótipos constituídos
pelos oito polimorfismos nos genes UCP2 e UCP3 foi realizada usando-se o programa Phase 2.1. Não houve
diferença estatisticamente significativa nas frequências alélicas e genotípicas em nenhum dos polimorfismos
estudados entre o grupo de pacientes e de não-diabéticos (p<0.050). Além disso, as frequências dos 22 haplótipos
observados também não diferiram significativamente entre os dois grupos de amostras (p=0,600). No entanto,
após separarmos os pacientes com DM2 de acordo com o índice de massa corporal (IMC) acima ou abaixo de
30kg/m2 (ponto de corte para diagnóstico de obesidade), observou-se que indivíduos com o genótipo +6689A/A
apresentam uma frequência menor de obesidade (66,9%) do que indivíduos com os genótipos +6689G/A (74,2%)
ou +6689G/G (80,8%) (p= 0.012). Da mesma maneira, a presença do alelo +6689A parece conferir uma proteção
contra o desenvolvimento de obesidade quando comparado com o genótipo +6689G/G (RC=0,605; IC 95% 0,4030,907; p=0,019). Portanto, os polimorfismos nos genes UCP2 e UCP3 não parecem ser um fator de risco para DM2
na população do sul do Brasil, mas o polimorfismo +6689G/A no gene UCP3 parece estar associado à obesidade
(IMC ³ 30kg/m2), um característica importante associada com resistência insulínica no DM2.
Apoio Financeiro: FAPERGS, CNPq e FIPE-HCPA.
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Relação do polimorfismo funcional –509C>T no gene
do TGFB1 com a retinopatia e nefropatia diabéticas em
pacientes com diabetes mellitus tipo 2
Manica, MB1; Santos, JB1; Gonçalves, MH1; Crispim, D2; Canani, LH2; Santos, KG1,3
Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA). 2Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas
de Porto Alegre (HCPA). 3Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
[email protected]
1
Palavras-chave: diabetes mellitus tipo 2, retinopatia diabética, nefropatia diabética, polimorfismo, TGFB1
O fator de crescimento transformante b1 (TGFB1) é uma citocina multifuncional que regula a proliferação,
diferenciação, formação da matriz extracelular e outras funções em vários tipos celulares. Um desequilíbrio na
ativação e sinalização do TGFB1 pode levar à apoptose. O polimorfismo –509C>T na região promotora do gene do
TGFB1 altera a expressão gênica, com a presença do alelo T resultando no aumento dos níveis plasmáticos desta
proteína, e pode estar envolvido na patogênese das complicações crônicas do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Assim,
o objetivo deste estudo de caso-controle é analisar a associação do polimorfismo –509C>T no gene do TGFB1 com a
presença de retinopatia (RD) e nefropatia (ND) diabéticas, em pacientes com DM2. Até o momento, 854 caucasóides
com DM2 (473 com e 205 sem RD; 515 com e 260 sem ND) foram genotipados para o polimorfismo –509C>T por
meio de PCR em tempo real, utilizando “primers” e sondas contidas em ensaio comercial de discriminação alélica
específico para a genotipagem desta variante (TaqManÒ, Applied Biosystems, EUA). As análises estatísticas foram
realizadas por meio do teste de qui-quadrado e da regressão logística no programa SPSS. O alelo –509T foi mais
freqüente entre os pacientes com ND do que entre os pacientes sem esta complicação (41% contra 35%, p=0,018).
Da mesma forma, a freqüência de heterozigotos e homozigotos para o alelo –509T foi maior nos pacientes com
ND do que nos normoalbuminúricos (62% contra 53%, p=0,025), sendo que o alelo –509T estava associado ao
aumento no risco de ND (OR=1,26, IC 95% 1,03–1,55). No entanto, após o ajuste multivariável para as demais
variáveis clínicas associadas à ND, o alelo –509T não se constituiu em um fator de risco independente para esta
complicação (OR=1,58, IC 95% 0,96–2,59; p=0,072). Em relação à RD, as freqüências alélicas e genotípicas obtidas
para o polimorfismo –509C>T não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre os pacientes com
e sem esta complicação (p>0,05 para todas as comparações). Portanto, nossos resultados sugerem que o alelo
–509T, associado com a maior atividade do gene do TGFB1, poderia ser um fator de risco para o desenvolvimento
de ND em pacientes com DM2. Entretanto, outras análises com um tamanho amostral maior são necessárias para
elucidar o papel desse polimorfismo na patogênese da ND.
Apoio financeiro: CNPq.
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110
Variantes genéticas da alfa aducina e fatores de risco
na hipertensão arterial sistêmica
Zangerolamo, SG1; Gollino, Y1; Mamede, MP1; Sousa, GF1; Pinhel, MAS1; Nakazone, MA1; Melo, RV1;
Cipullo, JP2; Martin, JFV2; Souza, DRS1,
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular, Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hipertensão arterial sistêmica, α-Aducina, Polimorfismo genético.
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma doença complexa que envolve uma gama de fatores fisiológicos,
ambientais e genéticos. Destacam-se como fatores de risco sedentarismo, dieta rica em sal e excesso de peso.
Além disso, fatores genéticos associados à reabsorção tubular renal de sal, como o gene que codifica a α-aducina,
podem influenciar na pressão arterial. O polimorfismo Gly460Trp para α-aducina tem sido relacionado com HAS.
Há evidência da associação entre a variante 460Trp e alteração da homeostase celular do sal, prejuízo no manejo
renal do sal e pressão sanguínea sistólica sensível ao sal. Os objetivos deste estudo foram analisar o polimorfismo
genético da α-aducina em pacientes com HAS no estágio 1 (leve) comparado àqueles no estágio 2 ou 3 (moderado/
grave), e caracterizar os grupos de acordo com sua distribuição por sexo, idade e índices antropométricos. Foram
estudados 60 indivíduos com HAS sendo 19 pertencentes ao estágio 1, definida por pressão arterial sistólica
(PAS) de 140-159 mmHg e pressão arterial diastólica (PAD) de 90-99 mmHg e 41 indivíduos no estágio 2 ou 3 (PAS
≥160mmHg ou PAD ≥100 mmHg). O DNA genômico foi extraído de leucócitos e submetido à amplificação por
reação em cadeia da polimerase (PCR), cujos produtos foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida
6%, corado com brometo de etídeo e visualizado em luz UV. A avaliação antropométrica incluiu índice de massa
corporal (IMC=peso/altura2) e medida de cintura abdominal. Para análise estatística foram aplicados teste de
Fisher e teste t. Admitiu-se nível de significância para P < 0,05. O alelo G se destacou em G1 e G2 (0,90; 0,93;
P=0,723, respectivamente), o mesmo ocorreu para o genótipo GG (89,5%, 85,4%, respectivamente; P=1,0). Houve
predominância do sexo feminino em G1 (74%) e G2 (61%; P=0,395). A idade em G1 variou de 42 a 77 anos (62,3±11,5
anos) e em G2 de 61 a 80 anos (59,8±11,3 anos; P=0,430). Níveis preferencialmente aumentados de IMC foram
observados em ambos os grupos, com valores médios classificados como sobrepeso em G1 (29,3±5,2 kg/m2) e G2
(28,4±4,9 kg/m2; P=0,513). Para a circunferência abdominal destacaram-se valores acima do limite recomendado
em G1 (97,5±12,8cm) e G2 (94,2±14,8cm; P=0,4079). Em conclusão, o alelo T para a-aducina, considerado fator de
risco para HAS, não diferencia os estágios 1, 2 ou 3 para a doença. Além disso, a idade, em torno de 60 anos, e o sexo,
prevalecendo o feminino, não distinguem os grupos. Em adição, níveis elevados de IMC e valores aumentados de
cintura abdominal se destacam em ambos os grupos, sugerindo associação com HAS, independente da gravidade
da doença.
Apoio Financeiro: FAMERP/PIBIC/CNPq
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Análise da frequencia alélica do polimorfismo I/D
no gene da ECA em uma amostra caso-controle de
hipertensos afro-descendentes do estado da Bahia
Araujo, LJ1; Pereira, JF1; Oliveira, JS2; Santos, JS2; Barbosa, AAL2; Sousa, SMB3; Rios, DLS1,4.
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (UEFS/FIOCRUZ-BA), 2Departamento de Ciências Biológicas - UESB, 3Departamento de
Ciências Biológicas - UESC 4Departamento de Ciências da Vida – UNEB,.
[email protected]
1
Palavras-chave: Afro-descendente, Enzima Conversora de Angiotensina I (ECA), Hipertensão, Polimorfismo.
A hipertensão arterial (HAS) é uma doença comum no Brasil e com forte impacto na saúde pública, decorrente
do seu custo médico social, isto, devido ao seu papel no risco de outras doenças como, doença cérebro-vascular,
insuficiência cardíaca, e doença arterial coronariana. A enzima conversora da angiotensina I (ECA) faz parte do
sistema renina-angiotensina, que tem sido identificado como uma via crítica para o controle da pressão sangüínea
e funções renais. A ECA está envolvida em muitas condições patológicas incluindo a vasoconstrição e tem sido
associada com a HAS na maioria das populações. A clonagem e seqüenciamento do gene da ECA revelaram
um polimorfismo de Inserção/Deleção de 287pb no íntron 16 que parece afetar as atividades séricas da enzima.
Este estudo teve como objetivo verificar a associação do polimorfismo I/D no gene da ECA com a HAS em uma
amostra de Afro-descendentes do estado da Bahia. Foi avaliada uma amostra composta de 385 indivíduos Afrodescendentes, os pacientes que apresentaram níveis de Pressão Arterial Sistólica ≥ 140mmHg e/ou Diastólica ≥
90 mmHg e/ou que estiverem em uso de medicações anti-hipertensivas foram considerados como casos e aqueles
cujos níveis tensionais foram normais (>140X90 mmHg) e que não façam tratamento com medicações antihipertensivas foram incluídos na amostra controle. O DNA genômico foi extraído segundo protocolo de LAHIRI
& NURNBERGER (1991). O estudo do polimorfismo do gene da ECA foi realizada pela técnica da PCR. O produto
da PCR foi analisado em gel de poliacrilamida 8% seguido de coloração com brometo de etídio; as bandas foram
visualizadas com luz ultravioleta. As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o programa SPSS ver. 10 e
as freqüências alélicas foram comparadas entre os grupos utilizando o teste do c2. As freqüências genotípicas
observadas do polimorfismo da ECA estavam de acordo com as esperadas para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Houve diferenças significantes nas freqüências do polimorfismo I/D no gene da ECA entre Afro-descendentes
hipertensos e normotensos. As freqüências do alelo I no gene da ECA no presente estudo foram de 41% nos
hipertensos e de 29% nos normotensos, foi observada então uma diferença significante (p< 0,001). Este resultado
apesar de contradizer estudos prévios na literatura, mostra-se altamente significante e pode ser comparado a
estudos anteriores realizados com amostras da população brasileira (KOYAMA et al., 2009, MORAES et al., 2008).
Entretanto, mais estudos em Afro-descendentes são necessários para confirmar estes resultados neste grupo
étnico.
Apoio Financeiro: CAPES e FAPESB.
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MMP-9 haplotypes are not related to left ventricular
hypertrophy in hypertensive patients
lacchini, R1; Coeli, FB2; Jacobs, AL1; Vasconcellos, V3; Sales, ML4, Ferreira-Sae, MC4; Schreiber, R4; Nadruz
Jr, W4; Tanus-Santos, JE3
Department of Pharmacology, Faculty of Medical Science, UNICAMP
Molecular Biology and Genetic Engeneering Centre (CBMEG) – Biology Institute - UNICAMP
3
Department of Pharmacology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, USP
4
Department of Internal Medicine, Faculty of Medical Science, UNICAMP
[email protected]
1
2
Keywords: Metalloproteinase-9, MMP-9, left ventricular hypertrophy, pharmacogenetics, haplotypes
Introduction: Hypertension is one of the most important issues in health care system nowadays. The progression of
disease leads to cardiovascular remodeling process, which is characterized by increase in wall thickness of arterial
vessels, end organ damage, cardiac hypertrophy, and other hazardous effects. The cardiac remodeling leads to
hypertrophy in myocardium, which may be concentric or eccentric, being the first associated to high cardiovascular
mortality. Matrix Metalloproteinase–9 (MMP-9) is a protease that is responsible for degrading extracellular matrix
proteins, and it’s involved on the cardiovascular remodeling process. The plasmatic levels of MMP-9 have been
associated to hazardous cardiovascular events, as sudden death, rapid coronary artery disease progression and
cardiac failure. Two functional polymorphisms (C–1562T and micro satellite (CA)13–25) in the promoter region of the
MMP-9 gene have been associated with several diseases. The aim of this study is to examine whether these MMP-9
polymorphisms and haplotypes are linked with left ventricular hypertrophy (left ventricular mass index >51g/m2,7), or
alterations in other echocardiographic parameters (such as final diastolic diameter, posterior wall thickness,, septal
wall thickness, and relative wall thickness) in hypertensive patients. Materials and Methods: In this study were included
172 hypertensive patients from Hospital de Clínicas of UNICAMP. Blood was collected and used for DNA extraction
with salting out method. Polymorphism C–1562T was genotyped by Restriction Fragment Length Polymorphism,
and microsatellite (CA)13–25 was genotyped through Polimerase Chain Reaction (PCR), where micro satellite alleles
were divided in High (~25 copies) and Low (~14 copies). Digestion and PCR products were visualized on 12% (w/v)
Polyacrilamide gels stained with AgNO3. All patients were sent to echocardiography analysis with a skilled physician,
following current guidelines. This study was approved by Human Research Ethics Committee of FCM-UNICAMP
(process number: 181/2005). Haplotypes were estimated using Mlocus software. Statistical analysis was made using
χ2, student´s t test and one way ANOVA with Tukey´s post test, when necessary. It was considered significant a
P<0.05, except in haplotipic frequencies comparison, when P was corrected for multiple comparisons (P<0.00625).
Results and Discussion: On 172 patients included in this study, only 19 didn’t have LVH. Genotypic frequencies found
were: CC (72,5%), CT(27,5%) TT (0%) and HH (37%), HL (43%), LL (20%), for C–1562T and microsatellite (CA)13–25,
respectively. Haplotypes frequencies were: HC (45,3%), HT (13%), LC (40,9%) and LT (0,8%). There were no differences
in haplotypes distributions between patients with or without left ventricular hypertrophy. There were no differences
between genotypic and haplotypes groups among all echocardiographic parameters. This results suggests that C–1562T
and microsatellite (CA)13–25 polymorphisms are not related to left ventricular hypertrophy in hipertensives, and don’t
have an substantial power to alter other echocardiographic parameters per se, although it can’t be discarded the
possibility of additive effect with other polymorphisms involved in susceptibility to LVH. More hypertensive patients,
and a group of healthy volunteers will be included in the short-term future.
Support: CNPQ, CAPES, FAPESP
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Variação genética nos genes alfa e beta do fibrinogênio
e o risco de trombose venosa
Gorziza, RP¹; Roisenberg, I¹; Bandinelli, E¹
¹Departamento de Genética, Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Palavras-chave: fibrinogênio alfa, fibrinogênio beta, trombose venosa, polimorfismo, hemostasia.
A trombose venosa (TV) é uma patologia decorrente de fatores genéticos e adquiridos. Alterações na hemostasia,
que causam hipercoagulação, são fatores de risco para o desenvolvimento dessa doença. O fibrinogênio é uma
proteína plasmática que atua nos mecanismos de coagulação e de adesão e agregação plaquetárias. Altos níveis
de fibrinogênio têm sido relacionados com o desenvolvimento de TV. Existem vários polimorfismos nos genes
que codificam suas cadeias α, ß e γ, que poderiam modular a quantidade da proteína no sangue. O objetivo desse
trabalho é verificar o papel dos polimorfismos HaeIII (-455G>A) e BclI, localizados na cadeia ß, e TaqI e Thr312Ala,
situados na cadeia α, no desenvolvimento da trombose venosa. Foram estudados 222 pacientes pareados por
sexo e idade com um grupo controle, sendo que todos os indivíduos são euro-descendentes. Os polimorfismos
foram identificados pela técnica de PCR/FRLP, utilizando-se as enzimas de restrição HaeIII, BclI, TaqI e RsaI,
respectivamente. Todos os polimorfismos estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg, para ambos os grupos. As
diferenças nas freqüências genotípicas e alélicas entre pacientes e controles, para os polimorfismos HaeIII, BclI e
Thr312Ala, não foram estatisticamente significativas, sugerindo que não há associação entre esses polimorfismos
e a patologia. Para o polimorfismo TaqI, a freqüência de homozigotos para o alelo T2 foi de 0,10 no grupo de
pacientes e 0,06 no grupo de controles. Na análise univariada, a “odds ratio” para o genótipo T2T2 foi 2,09 (IC95%
1,02 – 4,29, p= 0,045), indicando que a homozigose para este alelo seria um fator de risco para TV. Entretanto, em
análise multivariada, controlando-se para a presença do Fator V Leiden e para a mutação no gene da protrombina,
o resultado obtido não foi estatisticamente significativo (OR=2,0 [IC95% 0,94 – 4,29, p= 0,073]). Assim, os resultados
obtidos sugerem a ausência de associação entre o polimorfismo TaqI e a TV. O papel desses polimorfismos nos
níveis de fibrinogênio e no desenvolvimento de TV ainda não está esclarecido. Trabalhos anteriores relatam a
associação independente dos polimorfismos BclI, HaeIII e Thr312Ala com a doença. Outros estudos não detectaram
associação entre as quatro variantes genéticas e a TV. Desse modo, mais estudos são necessários para elucidar a
importância do fibrinogênio na etiologia desta patologia.
Apoio: CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
114
O genótipo -768CC do gene eNOS está associado com
um nível maior de disfunção do sistema cardiovascular
em pacientes críticos
Romero, MM1; Aguiar, CC¹; Fraga, LR1; Dias, FS2; Paludo, FJO¹; Alho, CS¹
¹ Laboratório de Genética Humana e Molecular – Faculdade de Biociências – PUCRS
2
Unidade de Terapia Intensiva Geral – Hospital São Lucas - PUCRS
[email protected]
Palavras-chave: Sintase Endotelial do Óxido Nítrico, pacientes críticos, disfunção orgânica, polimorfismo, óxido nítrico.
As Unidades de Terapia Intensiva (UTI), constituídas por uma população heterogênea de pacientes clínicos e
cirúrgicos que, apresentam um quadro patológico crítico e complexo, decorrente de fragilidades fisiológicas
graves, possuem altas taxas de infecções bem como de mortalidade. Nos Estados Unidos 50.000 pessoas morrem
a cada ano decorrente de doenças críticas manifestadas em UTI’s. O entendimento da regulação fisiológica, bem
como dos fatores envolvidos no controle do tônus vascular, tanto genéticos quanto bioquímicos, faz-se importante
para a compreensão da fisiologia dos pacientes críticos. Uma enzima importante para a homeostase no sistema
cardiovascular (SCV) é a Sintase Endotelial do Óxido Nítrico (eNOS), um importante vasodilatador que age
diretamente no endotélio. A eNOS possui um polimorfismo, -768T>C, na região promotora, cujo o alelo -768C seria
responsável por uma redução da atividade promotora. Para investigar o efeito da herança dessa variante sobre a
condição do SCV estudamos 276 pacientes em estado crítico de saúde por um período de até 15 dias a partir da
admissão em Unidade de Tratamento Intensivo. O nível diário de disfunção no SCV dos pacientes foi avaliado pela
Pressão Arterial (PAM) e pela necessidade do uso de drogas para mantê-la. A cada dia o paciente era agrupado em
uma das cinco categorias crescentes de disfunção dependentes da PAM e do uso de drogas [seguindo o escore SOFA;
Vincent et al, 1996]: 1- PAM≥70mmHg; 2- PAM<70mmHg; 3- Dopamina ou Dobutamina ≤5mg; 4- Dopamina >5mg
ou Adrenalina ≤ 0,1mg ou Noradrenalina ≤ 0,1mg; 5- Dopamina >15mg ou Adrenalina >0,1mg ou Noradrenalina
> 0,1mg. Os genótipos foram determinados com a técnica de PCR-RFLP. Ao longo das duas primeiras semanas
de internação da UTI, pacientes portadores do genótipo -786CC apresentaram escores superiores de disfunção
no SCV [média (desvio padrão) 1,25(1,7)] se comparados aos outros genótipos -786TC e -786TT [média (desvio
padrão) 1,07(1,6); 0,79(1,5); respectivamente, Teste Mann-Withney; p < 0,001]. Bem como, quando separamos em
duas categorias segundo o genótipo: TT+TC (n = 241) e CC (n = 35) [média (desvio padrão) 0,94(1,6); 1,25(1,7);
respectivamente, Teste Mann-Withney; p = 0,001]. Com esses resultados, sugerimos que o polimorfismo -768T>C
do gene eNOS influencia a disfunção no SCV.
Apoio Financeiro: FIJO e CNPq.
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115
Efeito do genótipo 894TT do gene eNOS sobre o nível
de disfunção no sistema cardiovascular: estudo diário
em 585 pacientes críticos durante duas semanas
Fraga, LR¹; Romero, MM¹; Dias, FS2; Paludo, FJO¹; Alho, CS¹
¹ Laboratório de Genética Humana e Molecular – Faculdade de Biociências – PUCRS
2
Unidade de Terapia Intensiva Geral – Hospital São Lucas - PUCRS
[email protected]
Palavras-chave: Sintase Endotelial do Óxido Nítrico, Pacientes Críticos, Disfunção Orgânica, Polimorfismo.
Pacientes críticos internados em uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI) caracterizam-se por apresentarem um
quadro clínico crítico e complexo, decorrente de fragilidades fisiológicas graves. Um grande número de fatores
interfere na evolução do quadro clínico do paciente. Entre esses fatores estão os herdados geneticamente, que
não apenas influenciam isoladamente, mas possuem, também, variantes gênicas que interferem nas respostas a
diferentes tratamentos. Uma enzima importante para a homeostase no sistema cardiovascular (SCV) é a Sintase
Endotelial do Óxido Nítrico (eNOS), um importante vasodilatador que age diretamente no endotélio. A eNOS possui
um polimorfismo na região 894G>T (alteração protéica: Glu298Asp), no qual o alelo 894T é menos funcional. Para
investigar o efeito da herança desta variante polimórfica sobre a condição do SCV estudamos 585 pacientes em
estado crítico de saúde por um período de até 15 dias a partir da admissão em Unidade de Tratamento Intensivo. O
nível diário de disfunção no SCV dos pacientes foi avaliado pela Pressão Arterial (PAM) e pela necessidade do uso
de drogas para mantê-la. A cada dia o paciente era agrupado em uma das cinco categorias crescentes de disfunção
dependentes da PAM e do uso de drogas [seguindo o escore SOFA; Vincent et al, 1996]: 1- PAM≥70mmHg; 2PAM<70mmHg; 3- Dopamina ou Dobutamina ≤5mg; 4- Dopamina >5mg ou Adrenalina ≤ 0,1mg ou Noradrenalina
≤ 0,1mg; 5- Dopamina >15mg ou Adrenalina >0,1mg ou Noradrenalina > 0,1mg. Os genótipos foram determinados
com a técnica de PCR-RFLP. Ao longo das duas primeiras semanas de internação da UTI, pacientes portadores do
genótipo 894TT apresentaram escores superiores de disfunção no SCV se comparados a indivíduos 894TC+894CC
(Teste Mann-Withney; p=0,027). Uma análise discriminada revelou que a primeira semana de internação na UTI
foi a que mostrou ser mais significativa na relação de associação entre a herança e o nível de disfunção no SCV
(Teste Mann-Withney; p=0,010). O nível de SCV manteve-se estabilizado, sem sofrer efeito da herança genética,
após a primeira semana de tratamento intensivo (Teste Mann-Withney; p=0,957). Com esses resultados, sugerimos
que o polimorfismo 894G>T do gene eNOS influencia a disfunção no SCV, ainda que essa possa ser revertida com
tratamento intensivo.
Apoio Financeiro: BPA-PUCRS e CNPq.
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Estudo de associação dos polimorfismos genéticos
das metaloproteinases de matriz 1, 3 e 9 com níveis
séricos e hemorragia intra-placa da carótida
Silvello, D1; Narvaes, LB2; Albuquerque, LC2; Maurer, L3; Santos, KG1,4; Rohde, LE5
Centro de Pesquisas, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
Divisão de Cirurgia Cardiovascular Adulta, Hospital São Lucas, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS).
3
Serviço de Patologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
4
Centro de Pesquisa em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA).
5
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
1
2
Palavras-chave: Aterosclerose Carotídea, Metaloproteinases de Matriz (MMP), Polimorfismos, Níveis Séricos e Hemorragia intra-placa.
A doença oclusiva cerebrovascular é causada principalmente por aterosclerose carotídea e tem incidência e
prevalência crescentes no Brasil. Atualmente se reconhece que os eventos cerebrovasculares são determinados,
ao menos parcialmente, pela instabilização das placas ateroscleróticas. Placas vulneráveis são caracterizadas
pela presença de necrose ou de hemorragia intra-placa, além de outras alterações em áreas específicas. As
metaloproteinases de matriz (MMP) 1, 3 e 9 são enzimas proteolíticas que degradam diferentes componentes
da matriz extracelular, levando à instabilidade estrutural das placas vulneráveis. Polimorfismos funcionais nos
genes das MMPs podem promover alterações nos níveis séricos destas enzimas e identificar pacientes propensos a
sangramento intra-placa na artéria carótida. Neste contexto, pretendemos analisar a associação dos polimorfismos
nos genes MMP-1 (–1607 1G/2G), MMP-3 (–1612 5A/6A) e MMP-9 (–1562 C/T) com os níveis séricos e a ocorrência
de hemorragia intra-placa na artéria carótida. Para isso, foram avaliados 82 pacientes consecutivos submetidos à
endarterectomia de carótida. A presença de sangramento intra-placa foi avaliada por meio de ressonância nuclear
magnética (RNM) e análises histológicas. Os níveis séricos das metaloproteinases (MMP-1, MMP-3 e MMP-9) foram
dosados por ELISA, utilizando-se ensaios comerciais. A genotipagem dos polimorfismos foi realizada pela reação
em cadeia da polimerase seguida por clivagem enzimática (PCR-RFLP). As análises estatísticas foram realizadas no
programa estatístico SPSS. Os pacientes estudados eram predominantemente homens (63%) e hipertensos (88%)
com idade média de 67 ± 9 anos. A hemorragia intra-placa foi identificada por histologia em 56 (68,3%) pacientes e
classificada como aguda em 29 (35,4%), recente em 21 (25,6%) e tardia em 6 (7,3%) pacientes; 26 (31,7%) pacientes
não apresentaram sinal histológico de hemorragia. Os níveis séricos da MMP-9 foram mais elevados nos pacientes
que apresentaram sangramento intra-placa detectado na RNM comparados com os pacientes sem hemorragia
intra-placa (245 ± 172 versus 162 ± 112, respectivamente; p=0,031). Esses resultados também foram observados na
análise histológica (244 ± 173 versus 157 ± 102, respectivamente; p=0,006). No entanto, não foi observada associação
entre os níveis séricos das MMP-1 e 3 com a hemorragia intra-placa. Em relação aos polimorfismos nos genes
das MMPs, 80% dos pacientes apresentavam o alelo de risco 2G (MMP-1), 69% apresentavam o alelo de risco 5A
(MMP-3) e 29% apresentavam o alelo de risco T (MMP-9). Não houve associação dos alelos de risco com os níveis
séricos e sinais de sangramento intra-placa, tanto por RNM quanto por análise histológica (p>0,05 para todas as
comparações). Portanto, nossos resultados indicam que os níveis séricos da MMP-9 podem estar relacionados aos
eventos que levam à hemorragia intra-placa em pacientes submetidos à endarterectomia de carótida.
Apoio Financeiro: CNPq e FIPE-HCPA.
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117
Relação dos polimorfismos funcionais dos genes das
metaloproteinases de matriz 1 e 3 com insuficiência
cardíaca em pacientes com disfunção sistólica
Cohen, CR1; Santos, KG1,2; Velho, FM3; Silvello, D1; Martinelli, NC1; Biolo, A3; Salvaro, RG3; Clausell, N3;
Rohde, LE3
Centro de Pesquisas, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA)
3
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Insuficiência cardíaca, Metaloproteinases de matriz (MMPs), Polimorfismos, Etiologia isquêmica, Remodelamento.
A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica com herança multifatorial caracterizada por remodelamento
cardíaco. Neste processo, ocorre uma reestruturação da matriz extracelular realizada pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs). Vários estudos têm evidenciado que variantes genéticas das MMPs estão envolvidas em processos
patológicos como a aterosclerose e o infarto agudo do miocárdio (IAM). Dentre elas, destacam-se os polimorfismos
nas regiões promotoras dos genes da MMP-1 (-1607 1G/2G) e da MMP-3 (-1171 5A/6A) que afetam a expressão
desses genes. Sugere-se que os alelos 2G e 5A podem estar relacionados com a susceptibilidade à IC e com
mortalidade nos pacientes com IC. Assim, o objetivo do presente estudo é avaliar o papel desses polimorfismos
genéticos na patogênese da IC em pacientes ambulatoriais do Estado do Rio Grande do Sul. Para isso, foram
estudados 316 pacientes consecutivos com IC (casos) do Ambulatório de Insuficiência Cardíaca e Transplante
Cardíaco do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com IC por disfunção sistólica e fração de ejeção do
ventrículo esquerdo (FEVE) ≤45%. Destes pacientes, 220 eram caucasianos e 92 afro-descendentes. Também foram
analisados 283 indivíduos brancos e 83 negros (controles) provenientes do Centro de Hemoterapia do HCPA,
sem história pessoal ou familiar de doença cardíaca ou morte súbita. A genotipagem foi realizada utilizando a
técnica de PCR-RFLP. As freqüências genotípicas dos dois polimorfismos analisados estavam em equilíbrio de
Hardy-Weinberg e foram semelhantes entre casos e controles em ambos os grupos étnicos (p>0,05 para todas
as comparações). As freqüências dos alelos de risco -1607 2G (MMP-1) e -1171 5A (MMP-3) encontrados nos
caucasianos foram similares entre casos (0,51 e 0,43, respectivamente) e controles (0,51 e 0,44, respectivamente)
(p>0,05). Da mesma forma, nos indivíduos afro-descendentes as freqüências alélicas foram semelhantes entre os
grupos (casos: 0,57 e 0,33; controles: 0,52 e 0,26, respectivamente) (p>0,05). No entanto, entre os pacientes brancos,
observou-se que a IC de etiologia isquêmica e o IAM foram mais freqüentes nos portadores do alelo 2G (MMP-1)
do que nos homozigotos para o alelo 1G (47% contra 27%, p=0,013; 42% contra 21%, p=0,011, respectivamente).
Por outro lado, o desfecho de interesse (morte súbita cardíaca ou por progressão da IC) foi mais freqüente nos
pacientes 1G1G do que nos portadores do alelo 2G (brancos: 30% contra 14%, p=0,014; negros: 46% contra 14%,
p=0,016, respectivamente). Os polimorfismos dos genes da MMP-1 (-1607 1G/2G) e da MMP-3 (-1171 5A/6A) não
parecem estar associados com a susceptibilidade para a IC. No entanto, nossos resultados sugerem que o alelo 2G
(MMP-1), relacionado com a maior atividade da MMP-1, poderia ser um fator de risco para eventos isquêmicos
agudos. Do mesmo modo, o genótipo 1G1G parece estar envolvido com a mortalidade nos pacientes com IC.
Apoio financeiro: CNPq e FIPE-HCPA
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118
Polimorfismos da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS
T-786C, VNTR 4a/b e Glu298Asp) na insuficiência
cardíaca
Martinelli, NC1; Santos, KG1,2; Velho, FM3; Silvello, D1; Cohen, CR1; Marson, P1; Biolo, A3; Salvaro, RG3;
Clausell, N3; Rohde, LE3
Centro de Pesquisas, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA). 3Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de
Porto Alegre (HCPA).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Insuficiência cardíaca, óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), polimorfismos.
A enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) produz um vasodilatador endógeno, o óxido nítrico (NO), que é
importante na modulação do sistema cardiovascular. Entre os polimorfismos localizados no gene da eNOS, uma
substituição de base na região promotora (T-786C), uma repetição de 27pb no intron 4 (VNTR 4a/b) e uma troca
de aminoácido no éxon 7 (Glu298Asp) podem alterar a atividade desta enzima, resultando em níveis diminuídos
de NO. Além disso, a variante 298Asp tem sido associada a um pior prognóstico na IC. Portanto, este trabalho
tem como objetivo avaliar a relação dos polimorfismos T-786C, VNTR 4a/b e Glu298Asp no gene da eNOS com a
susceptibilidade e com a mortalidade nos pacientes com IC. Foram analisados 295 pacientes com IC por disfunção
sistólica (205 caucasianos e 90 afro-descendentes), acompanhados no Ambulatório de Insuficiência Cardíaca
e Transplante Cardíaco do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Participaram do grupo controle 277
indivíduos doadores de sangue (214 caucasianos e 63 afro-descendentes) atendidos no Serviço de Hemoterapia
do HCPA. A análise dos polimorfismos foi realizada pela técnica de PCR (intron 4) ou PCR-RFLP (promotor e éxon
7). As freqüências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo T-786C não diferiram entre pacientes e
controles afro-descendentes. Entre os caucasianos, embora o alelo C tenha sido mais freqüente nos controles do
que nos pacientes (42% versus 35%, p=0,042, respectivamente), o mesmo não ocorreu entre os genótipos (p>0,05).
Em relação à variante 4a/b (intron 4), as freqüências alélicas e genotípicas foram semelhantes entre os diferentes
grupos (p>0,05). Quanto ao polimorfismo Glu298Asp, as freqüências alélicas e genotípicas não diferiram entre
os casos e controles caucasóides (p>0,05). Porém, a freqüência do alelo Asp foi menor entre os pacientes afrodescendentes do que entre os indivíduos controles da mesma etnia (17% versus 30%, p=0,009, respectivamente).
Os pacientes foram analisados quanto ao sexo, idade, etiologia da IC, entre outras variáveis clínicas. Entre os
afro-descendentes, a freqüência dos portadores do alelo C (T-786C) foi maior nos pacientes com IC de etiologia
isquêmica do que naqueles pacientes com IC de outras etiologias (63% versus 29%, p=0,004). Além disso, a
freqüência dos portadores do alelo 4a (intron 4) foi maior nos pacientes afro-descendentes hipertensos do que nos
normotensos (47% contra 8%, p=0,017). Contudo, estas variantes não influenciaram na sobrevida dos pacientes em
um seguimento de 94±71 meses em ambos os grupos étnicos (p>0,05). Estes polimorfismos parecem ter influência
nas patologias subjacentes que levam à IC e suas comorbidades, e embora a insuficiência cardíaca seja uma
síndrome multifatorial complexa e de grande importância clínica, existem poucos estudos que analisaram estes
polimorfismos quanto ao seu papel na IC. Portanto, são necessários estudos com tamanho amostral maior para
elucidar o papel destas variantes nas diferentes etiologias da IC.
Apoio financeiro: CNPq e FIPE-HCPA.
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119
Estimativa de mistura genética em indivíduos com
síndrome do intestino irritável do estado da Bahia
Lopes, MPP1; Abe-Sandes, K1,2,3; Machado, TMB1,2; Guedes, J 4; Meyer, R1; Lemaire, DC1,3
Instituto de Ciências da Saúde - Laboratório de Imunologia – UFBA – Bahia
Laboratório Avançado de Saúde Pública – LASP/CPqGM/FIOCRUZ
3
Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da Bahia –UNEB
4
Faculdade de Medicina- Universidade Federal da Bahia
1
2
Palavras-chave: ancestralidade genômica, síndrome do intestino irritável, marcadores informativos de ancestralidade (AIMs), mistura
populacional, heterogeneidade genética
A população brasileira apresenta alta heterogeneidade genética resultado do processo de miscigenação entre
ameríndios, europeus e africanos, sendo a contribuição africana preponderante na Bahia. A Síndrome do
Intestino Irritável (SII) é uma desordem funcional do trato gastrointestinal caracterizada por dor abdominal e
alteração da motilidade e sensibilidade intestinal, acompanhada por desconforto. Pode manifestar-se na forma
diarréica, obstipante ou mista. A patogenia da SII é complexa e pouco entendida. Estudos genéticos estão sendo
desenvolvidos com o objetivo de identificar possíveis marcadores desta doença. Até o momento nenhum estudo
foi realizado com objetivo de associar marcadores informativos de ancestralidade (AIMs) com SII. O objetivo deste
trabalho é estimar a ancestralidade genômica dos pacientes com SII e de um grupo controle e verificar se pacientes
e controles são homogêneos do ponto de vista genético. A população do estudo foi constituída por 40 pacientes
atendidos no Ambulatório Magalhães Neto do Hospital Universitário Edgard Santos (HUPES), todos diagnosticados
com SII baseados nos critérios clínicos de Roma III e 116 controles, doadores de sangue, provenientes do Serviço
de Transfusão Sanguínea (STS). O DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico pelo método
de Salting-out (extração salina) e a genotipagem foi feita por PCR convencional e PCR-RFLP, para os AIMs AT3I/D, APO, SB19.3, PV92, GC e RB2300. As análises estatísticas foram realizadas no programa GENEPOP versão 3.4
online e ADMIX. As frequências do alelo *1 encontradas nos pacientes foram 0,57; 0,80; 0,61; 0,22; 0,48; 0,39, para
os marcadores AT3-I/D, APO, SB19.3, PV92, GC e RB2300, respectivamente. Para os controles estas frequências
foram 0,42; 0,82; 0,63; 0,28; 0,45; 0,44, respectivamente. A estimativa de mistura populacional do grupo de pacientes
foi 36,5% européia, 25,4% ameríndia e 38,1% africana. Já nos controles foi 35,5% européia, 33,0% ameríndia e 31,5%
africana. Comparando essas estimativas não observou-se diferenças estatisticamente significantes. Mas a análise
de diferenciação populacional mostrou diferença significativa para o marcador AT3-I/D. As duas populações
diferem do ponto de vista genético, tanto pela diferença na contribuição africana, sendo maior nos pacientes,
como por conta do marcador AT3-I/D, de origem africana, também mais frequentes nos pacientes.
Apoio Financeiro: FAPEX
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120
Analysis of APOA1 and APOA5 Polymorphisms and
Haplotypes in a Brazilian elderly Cohort
Furuya, TK1; Mazzotti, DR1; Chen, ES1; Ota, VKA1; Araújo, L2; Ramos, LR2; Cendoroglo, MS2; Burbano, RR1;
Smith, MAC1
Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia e Genética, UNIFESP/EPM; 2Disciplina de Geriatria, Departamento de Medicina,
UNIFESP/EPM;
[email protected]
1
Keywords: apolipoproteins, polymorphisms, age-related diseases, haplotypes.
APOA1/C3/A4/A5 gene cluster, located on 11q23, plays an important role in lipoprotein metabolism. Polymorphisms
within this cluster have been investigated and associated to dyslipidemia and age-related diseases. In the current
study, we analyzed the association of APOA1 [-2500C>T (ENSSNP498814), -75G>A (rs670), +83C>T (rs5069) and PstI
(rs12721026)] and APOA5 [S19W (rs3135506) and -12238T>C (rs1729408)] polymorphisms and their haplotypes
with major age-related diseases and serum levels variables in a Brazilian elderly cohort composed of 361 individuals
from the Elderly Longitudinal Study (EPIDOSO). This cohort was composed of individuals of European (89.2%),
Japanese (3.3%), Middle Eastern (1.8%), mixed and/or other (5.7%) origins. Genotyping was performed by PCRRFLP. Descriptive statistics, logistic regression analysis, χ2 test and Student´s t-test were performed using SPSS® 16.0.
Linkage disequilibrium between the studied polymorphisms and haplotype association analysis were performed
by LDA and Haploview softwares. We found that all polymorphisms followed the Hardy-Weinberg equilibrium and
their allelic frequencies were similar to those observed in other European population. We detected association of
-75G allele with hypertension (p=0.001) and +83C allele with lower glycated haemoglobin levels (p=0.026), with
obesity (p=0.040) and with hypertension in the presence of cardiovascular disease (p=0.047). Moreover, SNP4C
allele was associated with higher glycated haemoglobin (p=0.020) and HDL (p=0.022) levels, and it had a protective
effect against neoplasia as well (p=0.013). In addition, our haplotype analyses showed associations with obesity,
hypertension, neoplasia and depression. In conclusion, our findings suggest that these polymorphisms are risk
factors for these age-related diseases and they might clarify the role of APOA1 and APOA5 in lipid and protein
metabolisms.
Funding: CNPq, CAPES and FAPESP.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Association of APO3 and APOA4 polymorphisms with
age-related diseases and alterations on lipid serum
profile
Ota, VKA1; Chen, ES1; Furuya, TK1; Mazzotti, DR1; Araújo, LMQ2; Ramos, LR2; Cendoroglo, MS2; Burbano,
RR1; Smith, MAC1
Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia, UNIFESP/EPM. 2 Disciplina de Geriatria, Departamento de Medicina, UNIFESP/
EPM
1
Keywords: APOC3 polymorphisms; APOA4 polymorphisms; elderly population; lipid levels; age-related diseases
Diseases involving cardiovascular system are the most important cause of mortality worldwide. Alterations in lipid
metabolism have been linked to cardiovascular diseases development and, therefore, it is crucial the investigation
of genetic variants of genes involved in lipid metabolism. In the current study, we aimed to investigate associations
of APOC3 (3238C>G, -482C>T, 1100C>T) and APOA4 (Gln360His, Thr347Ser) polymorphisms in 382 individuals
from a Brazilian Elderly cohort with major age-related morbidities and with lipids and proteins serum levels.
Whole sample was genotyped by PCR-RFLP. Descriptive statistics, logistic regression analyses and Student’s t-test
were used. 1100T allele carriers presented lower triglycerides (p = 0.035) and VLDL levels (p = 0.041) than non-T
carriers. Moreover, 360His allele was associated with increased triglycerides (p = 0.007) and VLDL (p = 0.007) levels
and reduced HDL levels (p = 0.0001) as well as with obesity (p = 0.038) and depression (p = 0.006). Our data suggest
that 1100T allele is correlated with a favorable serum profile, and thus, may confer protection to cardiovascular
diseases. On the other hand, 360His allele might be a risk marker for obesity and depression. In conclusion, both
1100T and 360His may be important biomarkers for these diseases and might have implications for prognosis and
treatment.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Associação do polimorfismo C677T do gene MTHFR na
Doença de Alzheimer em pacientes de Vitoria-ES
Camporez, D1; Almeida, LD1; Almada, BVP1; Morelato, RL2,3; Louro, ID1; Paula, F1;
1 Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
(UFES). 2 Escola de Medicina da Santa Casa de Misericordia de Vitória (EMESCAM). 3 Hospital da Santa Casa de Misericórdia (HSCM).
Palavras-chave: Doença de Alzheimer; MTHFR; Vitória-ES
A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurológica progressiva. Já a DA esporádica (DAE) apresenta
geneticamente um quadro de herança multifatorial. Vários genes estão sendo estudados para verificar a
possibilidade de atuarem como um fator de risco ou proteção para o desenvolvimento da DA, entre eles o
Metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR), que apresenta um papel central no complexo metabolismo do folato
(ácido fólico). O presente trabalho é um estudo de associação que analisou o polimorfismo C677T do gene MTHFR
em pacientes e controles de Vitória-ES. Foram estudados 264 indivíduos não consangüíneos incluindo 82 pacientes
com diagnostico de DAE de acordo com os critérios NINCDS-ADRDA e 182 controles pareados em relação á idade
e sexo, a proporção sexual entre pacientes foram 54 mulheres e 28 homens com idade média de 80.28 ± 7.44 e entre
controles 132 mulheres e 50 homens com média de idade de 78.18±8.29. As amostras foram submetidas ao método
PCR-RFLP, analisados em gel de poliacrilamida 7% com a enzima de restrição HinfI e coradas com nitrato de
prata. As freqüências dos alelos C e T foram 0.66 e 0.34, respectivamente. Não foi observado valor estatisticamente
significante para o alelo T (OR=0.8738; 95% IC.:0,5945-1,284; p=0.4906) nem para o genótipo TT (OR=0.4977; 95%
IC.:0,1620-1,529; p=0.3251). Contudo, o genótipo CT mostrou valores estatisticamente significativos (OR=1.852;
95% IC.:1,084-3,162; p= 0.0243) sugerindo que o alelo T se comporta como um fator de risco para a Doença de
Alzheimer na população de Vitória-ES, entretanto com um efeito pequeno na etiologia da doença. Provavelmente,
não foi encontrado valor estatisticamente significativo para o genótipo TT por ser um alelo raro na amostra
analisada (pacientes TT= 4, controles TT=17). Diferentes estudos mostram que o polimorfismo C677T se comporta
de diferentes formas (proteção/risco/nulo) em diferentes populações. Trabalhos realizados com a população
japonesa Wakutani e col. (2004) demonstram que o polimorfismo é fator de proteção, Silva e col. (2006) mostram
que na população do nordeste o polimorfismo citado é fator nulo, e no trabalho apresentado o polimorfismo é um
fator de risco. Polimorfismos de risco para doenças multifatoriais podem se comportar como um polimorfismo
neutro dependendo do grupo populacional estudado em função do perfil genético de cada grupo étnico. Assim,
estudos de diferentes populações são importantes para identificar os alelos de risco. Nesse estudo os resultados
sugerem que o polimorfismo C677T do gene MTHFR apresenta associação com DAE atuando como fator de risco
em pacientes de Vitória-ES.
Agência financiadora: FACITEC, Arcelor Mital Brasil, FAHUCAM. Apoio: UFES, EMESCAM e HSCM.
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Influência dos polimorfismos dos genes ECA e CATD
em pacientes com doença de Alzheimer em Vitória-ES
Almada, BVP1; Moraes, MVD1; Morelato, RL2,3; Perrone, AMS1; Louro, ID1; Paula, F1
1 Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
(UFES)
2 Escola de Medicina da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM)
3 Hospital da Santa Casa de Misericórdia (HSCM)
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Doença de Alzheimer; ECA; CATD; Vitória-ES; PCR-RFLP; Doença Multifatorial
A Doença de Alzheimer (DA) é a mais importante doença neurodegenerativa da atualidade. Caracteriza-se pelo
déficit progressivo da função cognitiva, com maior ênfase na perda de memória e interferência nas atividades
sociais e ocupacionais. A DA esporádica (DAE) geneticamente apresenta um quadro de herança multifatorial. De
acordo com recentes estudos além do gene da APOE, outros genes poderiam estar associados ao desenvolvimento
da DAE entre eles o gene da enzima conversora de angiotensina (ECA) e a catepsina D (CATD), estes genes
associados ou não com o alelo e4 do gene APOE, acelerariam o estabelecimento da doença. Este trabalho estudou
os polimorfismos dos genes ECA e CATD em 264 indivíduos não aparentados incluindo 82 pacientes com
diagnóstico de DAE segundo os critérios da NINCDS-ADRDA e 182 controles pareados em relação ao sexo e idade.
Após amplificação por PCR, as amostras dos genes CATD foram submetidas à digestão com as endonucleases
Mwo I. Com relação ao gene CATD, a freqüência do alelo C foi a maior tanto em pacientes como em controles
(92,0% e 91,8% respectivamente) e o genótipo mais observado em ambos os grupos foi o CC seguido pelo genótipo
CT, no entanto não houve diferença estatística significante entre eles (p=0,928). O genótipo TT não foi observado
nesta população. O alelo D do gene ECA foi o mais freqüente em ambos os grupos (54,3% e 53%, respectivamente),
no entanto não foi observado risco relativo estatisticamente significante (p=0,863) de acordo com a freqüência
alélica entre pacientes com DAE e controles. O genótipo mais freqüente em pacientes com DA foi o ID (67,3%),
seguido pelo genótipo DD (20,7%), enquanto que para o grupo controle os genótipos mais freqüentes foram ID
(68,7%) e DD (18,7%). Os genótipos não diferiram estatisticamente. Também não houve correlação na freqüência
alélica e genotípica para ambos os genes de acordo com a idade. Nossos resultados mostram o primeiro estudo
realizado sobre o gene da CATD e ECA relacionado à DA na população brasileira. Os dados desta pesquisa, não
confirmam a hipótese que estes genes estão associados a DA, no entanto é possível que deva haver alguma via para
o desenvolvimento da doença em que estes polimorfismos atuem, mas neste estudo, o efeito foi aparentemente
pequeno contrastando com os resultados de outros autores.
Agência fnanciadora: FACITEC, Arcelor Mittal Tubarão, FAHUCAM. Apoio: UFES, EMESCAM e HSCM.
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Estudo do gene LRP1 em pacientes com Doença de
Alzheimer de Vitória-ES
Pozzatto, EN¹; Almada, BVP¹; Morelato, RL2,3; Perrone, AMS1; Louro, ID; Paula, F¹
¹Laboratório de Genética Humana e Molecular - Instituto de Ciências Humanas e Naturais - Departamento de Ciências Biológicas Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
²Hospital da Santa Casa da Misericórdia, Vitória-ES
³Escola de Medicina da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM)
Palavras-chave: Doença de Alzheimer, LRP1, Vitória
A Doença de Alzheimer Esporádica (DAE) é um complexo neurodegenerativo desordenado do cérebro e é a
forma mais comum de demência que acomete a população. Seu desenvolvimento deve-se ao acúmulo de eventos
ambientais e genéticos, sendo que a típica característica do distúrbio ocorre com herança complexa envolvendo
fatores de risco ou multifatorial, que levam ao estabelecimento da afecção em diferentes graus de gravidade.
Segundo estudos prévios (Kang e Cols, 1997), um polimorfismo C766T no exon 3 do gene LRP1, possui uma
associação com a DAE. Embora esta associação seja confirmada em alguns estudos, a intensidade de sua relação
com a DAE é contestada como não significativa ou de menor risco. Devido à inexistência de estudos de correlação
entre o gene LRP1 e a DAE em Vitória-ES, torna-se necessário a obtenção de dados por meio de estudo genético.
Com o objetivo de analisar a freqüência do referente polimorfismo C766T na população, foi realizado um estudo
de associação (caso: controle), por meio da técnica de PCR-RFLP, com a enzima de restrição RsaI, em eletroforese
com Gel de Poliacrilamida 10% corado com Nitrato de Prata. Foram coletadas amostras de 82 pacientes com DAE,
sendo a média de idade de 81,16 ±7,47 e 182 controles sem DAE, com média de idade de 78,27 ±8,34. Todos foram
avaliados por um geriatra através do critério NINCDS-ADRDA. A população de vitória apresentou freqüências
alélicas de 0.91 e 0.09 (Odds Ratio {OR}= 0.9903 [95% CI: 0.5220-1.879], P= 1.0000), respectivamente, para o alelo C
e T e de 0.82 e 0.18 (OR= 0.9893 [95% CI: 0.5036-1.943], P= 1.0000), para os genótipos CC e CT, respectivamente. O
alelo T apresentou uma freqüência muito baixa, assim, não foram identificados genótipos TT. Em nosso espaço
amostral, também não foram identificadas associações entre os alelos C e T e entre os genótipos CC e CT. Quando
a amostra foi estratificada por gênero e faixa etária (65-75, 74-85, e >85 anos) os resultados também não foram
significativos. Devido ao fato do gene APOE atuar como o maior fator de risco para a DAE, os resultados de LPR1
foram analisados em relação aos polimorfismos de APOE, entretanto, não encontramos relação significativa. Logo,
o nosso estudo mostra que não há associação entre os polimorfismos do gene LRP1 e a DAE na população de
Vitória-ES. Estes resultados podem estar relacionados com algum padrão genético próprio da população Capixaba,
devido à miscigenação, como propõe Beffert, 1998, em estudos com populações caucasianas. A conclusão deste
trabalho proporciona bases para estratégias mais eficientes de apoio à pacientes com DAE em Vitória e contribui
para um melhor entendimento da afecção.
Agência financiadora: FACITEC, FAPES E Arcelor-Mittal Brasil. Apoio: UFES, EMESCAM E HSCM
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Estudo do polimorfismo H2 no gene APOC1 na Doença
de Alzheimer em pacientes de Vitória-ES
Almeida, LD1; Camporez, D1; Almada, BVP1; Morelato, RL2,3; Louro, ID1; Paula, F1
1 Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais
(CCHN), Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).
2 Escola de Medicina da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM). 3 Hospital da Santa Casa de Misericórdia (HSCM).
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Doença de Alzheimer; APOC1; APOE; Vitória-ES
A DA é uma afecção irreversível que acarreta, principalmente, perda de memória e deficiência cognitiva. É
considerada a causa mais comum de demência e pode ocorrer de forma esporádica ou herança mendeliana. A
doença de Alzheimer esporádica (DAE) é muito comum, com mais de 15 milhões de pessoas afetadas mundialmente.
O desenvolvimento da Doença de Alzheimer deve-se ao acúmulo de eventos genéticos e ambientais. Cada um
desses eventos contribui com pequenos efeitos que resultam, em conjunto, no estabelecimento da doença com
diferentes graus de gravidade. O presente trabalho é um estudo de associação que analisou o alelo H2 do gene
APOC1, apontado em estudos anteriores como fator de risco para a DAE, em pacientes e controles de Vitória-ES.
Foram estudados 264 indivíduos não consangüíneos incluindo 82 pacientes com diagnostico de DAE de acordo
com os critérios NINCDS-ADRDA e 182 controles pareados em relação á idade e sexo. A proporção sexual entre
pacientes foi 54 mulheres e 28 homens com idade média de 80.28 ± 7.44 e entre controles 132 mulheres e 50
homens com média de idade de 78.18±8.29. As amostras foram submetidas ao método PCR-RFLP com a enzima de
restrição HpaI, analisadas em gel de poliacrilamida a 7% e coradas com nitrato de prata. As freqüências dos alelos
H1 e H2 foram de 0.80 e 0.20, e dos genótipos H1/H1, H1/H2 e H2/H2 foram de 0.64, 0.32 e 0.04, respectivamente. Os
resultados estatísticos preliminares mostram que o alelo H2 apresentou resultados estatisticamente significativos
(Odds Ratio [OR]=2.119; 95% CI:1.365-3.290; p=0.0009), sugerindo que este alelo se comporta como fator de risco
para a DAE na população de Vitória-ES. O estudo dos genótipos H1/H1 (OR= 0.4219; 95% CI:0.2465-0.7220; P=0,002),
H1/H2 (OR=1.966; 95% CI:1.139-3.392; p=0,0161) e H2/H2 (OR=3.513; 95% CI:0.9635-12.809; P=0,0745), também
mostrou diferenças estatisticamente significativas entre pacientes e controles na amostra estudada, com exceção
do genótipo H2/H2 que apresentou valores limiares de significância. Outro gene muito estudado em pacientes
com DAE e que participa como fator de risco para a doença é o APOE. Os genes, APOE e APOC1, são ligados.
Assim, para analisar os resultados de APOC1 minimizando os efeitos de risco de APOE, as amostras do presente
trabalho foram estratificadas de acordo com a presença dos polimorfismos de APOE, previamente caracterizados.
Foram feitas análises de acordo com a presença do alelo APOE-e4. Pacientes e controles portadores de pelo menos
1 alelo APOE-e4 não apresentaram valores estatisticamente significativos para os genótipos H2/H2, H1/H2 e H1/
H1. Estes dados não foram alterados quando foram estudados indivíduos que não são portadores de alelos e4 do
gene APOE. Os dados preliminares sugerem que polimorfismos dos genes APOC1 e APOE apresentam associação
com a DA na população de Vitória-ES.
55º Congresso Brasileiro de Genética
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Relação entre apolipoproteína e e perfil lipídico
na Doença de Alzheimer e demência vascular em
casuística brasileira
Pinhel, MAS¹; Soares, S2; Oliveira, ALC¹; Tognola, WA3; Cação, JC2; Nakazone, MA1; Godoy, MR2; Sousa,
GF1; Godoy, MF1; Souza, DRS1
Núcleo de Pesquisa em Bioquímica e Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto. 2Departamento de Clínica
Médica I. 3Departamento de Ciências Neurológicas
[email protected]
1
Palavras-chave: Doença de Alzheimer, Demência Vascular, Apolipoproteína E, Perfil Lipídico
A apolipoproteína E (apo E) tem efeito no metabolismo lipídico e na doença de Alzheimer (DA), com possível
relação entre ambos e risco para DA e também demência vascular (DVa), pela sua associação com complicações
ateroscleróticas. Esse estudo teve como objetivo avaliar a distribuição do polimorfismo da apo E e sua relação com
perfil lipídico na DA e DVa. Foram estudados 161 indivíduos (72±5,8 anos): 63 pacientes com DA (G1); 38 pacientes
com DVa (G2); 60 controles (G3). Os indivíduos foram submetidos à coleta de sangue periférico para análise do
polimorfismo da apo E (alelos APOE*2, APOE*3 e APOE*4) e perfil lipídico [colesterol total (CT), fração de colesterol
de lipoproteína de baixa (LDLc), alta (HDLc) e muito baixa densidade (VLDLc) e triglicérides (TG)]. Admitiu-se
nível de significância para P<0,05. Como resultados APOE*4 prevaleceu em G1 [0,27 versus 0,10 (G3); P=0,004),
enquanto G2 (0,14) equiparou-se a G1 e G3. O genótipo APOE*3/4 destacou-se em G1 [41,3% versus 15,0% (G3);
P=0,002], seguido de G2 (18,4%). O perfil lipídico mostrou-se alterado em todos os grupos, particularmente em G2
para CT e LDLc na presença de APOE*4 (300,3±61,3; 223,6±57,7mg/dL respectivamente) e TG em portadores de
APOE3/3 (275,9±95,9mg/dL), comparado a G1 (236,8± 45,7; 169,3±38,7; 200,4±50,9 mg/dL, respectivamente) e G3
(220,3±33,6;142,7±29,2; 214,3±79,0mg/dL, respectivamente) (P<0,01, para ambos os grupos). G1 e G3 apresentaram
valores recomendados apenas de HDLc e VLDLc, enquanto níveis de HDLc mostraram-se reduzidos em G2,
principalmente para APOE*3/3 (36,9±12,9mg/dL versus G1=51,3±17,5mg/dL e G3=51,5±14,1mg/dL; P=0,0002).
Genótipos heterozigotos para APOE*4 prevaleceram em pacientes com DA e níveis aumentados de CT, LDLc e
TG em relação a G3 e reduzidos de HDLc, comparado a G2. Em conclusão, confirma-se o efeito de APOE*4 na
DA e sua relação apenas com níveis elevados de CT, LDLc e TG e reduzidos de HDLc, em relação aos controles
e DVa, respectivamente, sugerindo sua influência no metabolismo lipídico principalmente na DA. DVa, nesse
caso, embora se assemelhe a DA, exceto para HDLc, também não se diferencia de controles, sugerindo expressão
reduzida de APOE*4 em relação a DA, como também presença de outros fatores para DVa, a serem investigados,
em relação àqueles sem a doença.
Apoio Financeiro: FAMERP
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127
Análise dos polimorfismos 677C>T e 1298A>C no
gene da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)
como moduladores do risco de desenvolvimento da
Doença de Alzheimer
Baldi, FJR1; Laks, J2; Motta, LB3; Borges, MB2; Santos, JM1; Pimentel, MMG1; Santos-Rebouças, CB1
Departamento de Genética, IBRAG, UERJ; 2 Centro de Doença de Alzheimer, IPUB, UFRJ; 3 Núcleo de Atenção ao Idoso, UNATI, UERJ;
[email protected]
1
Palavras-chave: doença de Alzheimer, homocisteína, MTHR, folato, epigenética
A Doença de Alzheimer (DA) é considerada a forma mais comum de demência senil com uma progressiva
degeneração de neurônios no encéfalo. Estudos epigenéticos demonstram que a deficiência de folato, em
decorrência de seu consumo insuficiente e/ou devido à presença de polimorfismos gênicos que diminuem a sua
biodisponibilidade, está associada à hipometilação global do DNA e à expressão gênica anormal. Além disso,
polimorfismos em genes participantes do metabolismo do folato podem gerar acúmulo de homocisteína (Hcy),
que quando presente em altas concentrações promove disfunção neuronal. Dentre os principais genes envolvidos
direta ou indiretamente no metabolismo do folato, está o gene da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR). O
objetivo deste estudo foi analisar a influência dos principais polimorfismos no gene MTHFR (677C>T e 1298A>C)
sob os níveis plasmáticos de Hcy e o risco de desenvolvimento da DA. Amostras de DNA foram extraídas a partir do
sangue periférico de 135 pacientes com DA, diagnosticada segundo os critérios do NINCDS-ADRDA e de 85 idosos
clinicamente saudáveis. A genotipagem foi realizada pela técnica de PCR-RFLP, seguida de digestão enzimática e
eletroforese dos fragmentos digeridos em géis de poliacrilamida corados com prata. Os níveis plasmáticos de Hcy
foram avaliados pelo método de imunofluorescência polarizada e comparados entre as duas amostras através do
teste de Mann-Whitney. As distribuições genotípicas encontradas para a posição 677 e 1298 do gene MTHFR nas
amostras caso e controle foram comparadas através do teste do qui quadrado e teste exato de Fisher, revelando
que não houve diferenças significativas entre as duas amostras, mesmo quando combinamos os heterozigotos com
os homozigotos raros (c2(1)= 0,31; IC= 95%; P=0,96 e c2(1)= 0,04; IC=95%; P= 0,99, respectivamente). Entretanto,
os níveis de Hcy encontraram-se significativamente maiores nos pacientes com DA em relação aos controles
(P=0,0001). Nossos resultados sinalizam que níveis aumentados de Hcy podem ser considerados um fator de risco
independente substancial para o desenvolvimento da doença (DA) em nossa população. No entanto, a média dos
níveis de Hcy nos indivíduos com DA homozigotos raros para os dois polimorfismos não demonstrou ser maior
do que aquela observada nos indivíduos controle homozigotos comuns (MTHFR 677: P=0,7920 e MTHFR 1298:
P=0,1516), provavelmente em decorrência do pequeno número de indivíduos com os genótipos homozigotos raros
encontrados até o momento. Consideramos imprescindível uma exploração mais detalhada destes polimorfismos
e o aumento do número de indivíduos analisados, em adição à investigação dos níveis de folato, tendo em vista
que a ingestão adequada deste micronutriente poderia neutralizar os efeitos bioquímicos negativos de alguns dos
polimorfismos gênicos envolvidos em seu metabolismo.
Apoio Financeiro: PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ, CNPq, CAPES, CEPUERJ.
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Análise do gene APOE e sua relação com a doença de
Alzheimer e a predisposição aumentada à demência
em indivíduos com Síndrome de Down e suas mães
Gonçalves, AP¹; Corrêa, JC¹; Santos, JM¹; Laks, J²; Motta, LB³; Borges, MB²; Souza, DRS4; Pinhel, MAS4;
Pimentel, MMG¹; Santos-Rebouças, CB¹.
¹Departamento de Genética – Universidade do Estado do Rio de Janeiro
²Instituto de Psiquiatria – Universidade Federal do Rio de Janeiro
³Núcleo de Atenção ao Idoso – Universidade do Estado do Rio de Janeiro
4
Departamento de Biologia Molecular – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto
[email protected]
Palavras-chave: APOE, Doença de Alzheimer, Síndrome de Down, cromossomo 21, peptídeo b-amilóide
Estudos genômicos recentes demonstram que o alelo ε4 do gene da apolipoproteína E (APOE) é o principal fator de
risco para a Doença de Alzheimer (DA) e está ligado ao aumento da deposição do peptídeo β-amilóide, produzido
pela proteína precursora amilóide (APP), localizada no cromossomo 21. Já foi comprovado que a grande maioria
dos indivíduos com a Síndrome de Down (SD), causada pela trissomia do 21, acima dos 40 anos, desenvolvem DA,
provavelmente por um aumento dose-dependente na produção de APP. Curiosamente, também já foi observado
que mulheres jovens, que tiveram filhos com SD, antes dos 35 anos, possuem uma predisposição aumentada para
a DA, sugerindo uma relação entre as duas etiologias, mesmo na ausência de um cromossomo 21 extra. Neste
estudo, investigamos a freqüência do alelo APOE ε4 em três grupos caso-controle: 100 pacientes com SD e 110
controles; 110 mães jovens com filhos com SD e 114 mães controles da mesma idade; 182 indivíduos com DA e 124
controles clinicamente saudáveis de mesma idade. A análise molecular foi realizada através da reação em cadeia
da polimerase, seguida da digestão dos produtos amplificados pela endonuclease HhaI, e eletroforese em géis de
poliacrilamida corados por prata. As distribuições genotípicas nas amostras caso e controle encontraram-se em
Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foi observado um aumento na freqüência do alelo APOE ε4 em pacientes com
DA em relação aos seus controles (OR=3.40, p<0.0001), enquanto que freqüências similares para este alelo foram
observadas entre as mães e indivíduos com SD e seus respectivos grupos controles (OR=1.19, p=0.70; OR=1.29,
p=0.50, respectivamente). Sendo assim, nossos resultados corroboram dados da literatura que evidenciam que
o alelo APOE ε4 é um grande fator de risco para a DA, enquanto que o mesmo não pode ser relacionado a uma
predisposição aumentada à DA em indivíduos com SD e em suas mães.
Apoio financeiro: PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ, FAPERJ, CAPES, CNPq, CEPUERJ.
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Genotyping of patients with electrocardiographic
criteria for Long-QT Syndrome
Curty, E1,3; Lima, F1; Silva, R2; Ürmeniy, TP2; Carvalho, ACC2; Cruz, FES3,4; Rondinelli, E1,3;
1- Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Medicina, UFRJ
2- Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
3- Laboratório de Biologia Molecular – Instituto Nacional de Cardiologia (INC)
4- Laboratório de Eletrofisiologia – INC
Palavras-chave: Genotyping, LQTS, ECG, Channelopathies, sudden cardiac death
The congenital long QT syndrome (SQTL) is a genetic disease of the channelopathies group with autosomal
dominant inheritance and an estimated prevalence at 1:2,000. It is a major cause of sudden cardiac death in young
people with a structurally normal heart. Genetic studies allowed this pathology to be classified into 7 different types
according to the affected gene. Over 600 mutations have been described in genes coding for potassium channels
(KCNQ1, KCNH2) and sodium channel (SCN5A) and been associated with SQTL types 1, 2 and 3, respectively.
Nonetheless, in about 30% of the patients no mutation has been found in genes related to ion channels. Prognosis
and treatment vary depending on the affected gene, and electrocardiographic changes are insufficient to diagnose
the type of LQTS, making the molecular diagnosis important. Therefore, this project aims to investigate KCNQ1,
KCNH2 and SCN5A gene polymorphisms in patients with clinical diagnosis of SQTL. Patients with suspected
SQTL referred to the outpatient Cardiac Arrhythmias Service of the National Institute of Cardiology were included
in this study. Patients and family members were classified clinically and electrocardiographically according to
the Schwartz criteria. Genomic DNA was obtained and the complete coding regions of genes KCNQ1, KCNH2
and SCN5A were amplified by PCR and subjected to automated sequencing. Four families have been included
to date, totaling 23 individuals. Genotyping of the patient with an implanted cardioverter-defibrillator and the
highest Schwartz score revealed a KCNH2 polymorphism (G1714A) previously described as associated with SQTL.
The patient was heterozygous for the polymorphism and sequencing of the family showed co-segregation of the
allele with the phenotype under study. Genotyping of patients from two other families is currently under way. The
methodology could be used as a complementary diagnostic method in patients with suspected SQTL, helping the
diagnosis, therapy and providing genetic counseling of families.
Financial Support: CAPES, CNPq, FAPERJ
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Influência de polimorfismo no gene do transportador
da serotonina na epilepsia do lobo temporal
Schenkel, LC 1; Bianchin, MM 2; Leistner-Segal, S 1
Laboratório de Genética Molecular - Serviço de Genética Médica do HCPA
Serviço de Neurologia - HCPA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Epilepsia do Lobo Temporal, depressão, serotonina, 5-HTT, 5-HTTLPR
A epilepsia é a segunda causa mais comum de problemas mentais em adultos jovens, sua etiologia envolve
uma condução iônica anormal ou um desbalanço entre neurotransmissão excitatória e inibitória. Transtornos
psiquiátricos são encontrados em 25-50% das pessoas com epilepsia. A depressão é o transtorno psiquiátrico
mais freqüente, sendo mais comum em pacientes com epilepsia parcial do lobo temporal ou frontal. O provável
envolvimento do neurotransmissor serotonina (5HT) na epilepsia do lobo temporal (ELP) sugere um mecanismo
para os sintomas depressivos em pacientes com epilepsia, já que a falta de 5HT no cérebro está relacionada a
muitos problemas psiquiátricos. Além disso, a 5HT contribui com o neurodesenvolvimento e a plasticidade
do cérebro e está envolvida no balanço excitatório/inibitório, participando em processos patológicos como a
epilepsia. O transportador da serotonina (5-HTT) é importante na regulação da neurotransmissão serotoninérgica.
Um polimorfismo no promotor deste gene (5-HTTLPR), caracterizado pela inserção/deleção de 44 pb contendo
um SNP A-G, está relacionado com alteração funcional do gene, sendo os genótipos classificados como de alta
(LaLa), média (LaS e LaLg) e baixa (SS e LgS) atividade trancricional do gene. Objetivo: Análise do 5-HTTLPR
na predisposição à ELT e às alterações psiquiátricas relacionadas. Métodos: Pacientes foram diagnosticados para
ELT por neurologistas e entrevistados por psiquiatras para avaliar a presença ou não de transtornos psiquiátricos.
Amostras de DNA genômico foram extraídas dos pacientes e de controles, e então utilizadas para análise
molecular. A região promotora do gene contendo o polimorfismo 5-HTTLPR (L/S) foi amplificado por PCR. O
produto da reação foi digerido com a enzima de restrição MspI, permitindo assim a detecção do SNP A/G, que foi
visualizado em gel de agarose 3%. Resultados: Dos pacientes com ELT, 24% apresentaram Transtorno de Ansiedade
e 43% Transtorno de Humor. Pacientes com Transtorno de Humor tiveram uma maior freqüência do genótipo
de baixa atividade quando comparado com pacientes sem o Transtorno (33% e 23%, respectivamente), mas o
dado não foi estatisticamente significativo. Quando comparada a freqüência dos genótipos entre pacientes com
ELT e controles sadios, não houve diferença entre os dois grupos. Discussão: Até o momento não foi encontrada
associação do 5-HTTLPR com ELT e com os transtornos psiquiátricos relacionados. Mais estudos genéticos e
moleculares são necessários para avaliar o papel do gene 5HTT na susceptibilidade a ELT, assim como a análise de
outros marcadores e também o estudo em populações diferentes.
Apoio financeiro: FIPE- HCPA e CNPq
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Determinação da frequência alélica e genotípica
do polimorfismo SNP211037 do gene GABRG2 em
indivíduos epilépticos do estado de Alagoas
Silva, LRP1; Almeida, DH1; Marques, TEBS2; Gitaí, LLG3; Machado, LCH4; Gameleira, FT3; Andrade, TG2;
Gitaí, DLG1
Setor de Genética e Biologia Molecular, ICBS, UFAL, Maceió.
Laboratório de Biologia Molecular e Expressão Gênica, UFAL, Arapiraca.
3
Setor de Neurologia, HUPAA, UFAL, Maceió.
4
Setor de Histologia e Embriologia, ICBS, UFAL, Maceió.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Epilepsia Mioclônica Juvenil, polimorfismos genéticos, RFLP, SNP e GABRG2.
Epilepsia é uma desordem neurológica caracterizada pela presença de crises espontâneas e recorrentes, que afeta
2 a 3% da população mundial. As crises epilépticas refletem atividade elétrica anormal e paroxística, que podem
ser causadas por inúmeras patologias estruturais ou neuroquímicas. Por ser de natureza complexa e multifatorial,
a epilepsia apresenta diferentes etiologias, sejam associadas a lesões cerebrais específicas, como no caso das
epilepsias sintomáticas; ou a alterações genéticas, como no caso das epilepsias idiopáticas. No entanto, postula-se
que, em ambas as situações, um limiar genético de susceptibilidade é essencial para o estabelecimento das crises
epilépticas. Assim, a identificação de variantes alélicos associados a este limiar é fundamental para o entendimento
dos mecanismos moleculares envolvidos na predisposição ou proteção às crises. Uma abordagem para identificação
desses alelos baseia-se na análise direta do material genético, através de estudos de associação. Neste contexto,
exploramos o Banco de DNA de indivíduos epilépticos e não-epilépticos da UFAL para investigar se o polimorfismo
SNP211037 (Asn196Asn) do gene que codifica a subunidade γ2 do receptor do ácido γ-aminobutírico (GABRG2)
está associado à Epilepsia Mioclonica Juvenil. A genotipagem está sendo realizada por RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) que possibilita a detecção dos variantes C ou T (SNP211037). Até o presente momento,
40 amostras de DNA de indivíduos com Epilepsia Mioclônica Juvenil foram analisadas. O variante (SNP211037)-C
do gene GABRG2 apresentou uma freqüência de 71% (57 alelos) e o variante (SNP211037)-T de 29 % (23 alelos).
As freqüências genotípicas dos homozigotos CC e TT e do heterozigoto CT foram as seguintes: 50%, 7.5% e 42.5%,
respectivamente. Embora estes dados ainda não tenham sido confrontados com os dos indivíduos não-epilépticos
da população alagoana, a freqüência mais elevada do variante (SNP211037)-C na população estudada é bastante
sugestiva desde que estudos populacionais têm relatado que o alelo T apresenta uma maior prevalência. Além do
mais, análises independentes em outras populações demonstraram uma associação do variante (SNP211037)-C
à Epilepsia Idiopática Generalizada. A comparação das freqüências alélicas e genotípicas entre as populações
epiléptica e não-epiléptica do Estado de Alagoas permitirá avaliarmos se o variante polimórfico SNP211037 do
gene GABRG2 está associado ao limiar genético de susceptibilidade ou proteção – especificamente - à Epilepsia
Mioclônica Juvenil, uma das síndromes epilépticas idiopáticas mais freqüentes no Estado de Alagoas.
Apoio financeiro: FAPEAL e CNPq
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Análise citogenética por bandamento GTG
convencional e em alta resolução das regiões 2q37 E
22q13 em doenças do espectro autístico
Bossolani-Martins, AL1; Barbosa-Gonçalves, A2; Fett-Conte, AC3
(1)Depto. de Biologia, IBILCE/UNESP, S. J. do Rio Preto, SP.
(2) Depto. de Biologia, IBILCE/UNESP, S. J. do Rio Preto, SP.
(3) Depto. de Biologia Molecular, Serviço de Genética - FAMERP/FUNFARME, S. J. Rio Preto, SP.
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, bandamento GTG, 2q37, 22q13 e Doenças do Espectro Autístico
As Doenças do Espectro Autítisco (DEA) são doenças psiquiátricas graves e comuns na população, com
manifestações muito semelhantes, o que dificulta o diagnóstico diferencial. Se manifestam na infância e se
caracterizam por comportamento ritualístico, estereotipias, dificuldade de comunicação, além de problemas graves
de relacionamento social, entre outros. A etiologia é bastante discutida, devido a sua variação e complexidade.
Podem ocorrer em comorbidade com várias doenças de etiologia genética e há descrições de associação com
muitas mutações gênicas e alterações cromossômicas. Em DEA também foram descritos alguns casos de alterações
subteloméricas, particularmente deleções nas regiões 2q37 e 22q13. Este trabalho teve como objetivo a investigação
cariotípica convencional e das regiões 2q37 e 22q13 por bandamento GTG em alta resolução, em indivíduos com
DEA. Foram estudadas metáfases obtidas do cultivo de linfócitos do sangue periférico, em bandamento GTG
convencional e em alta resolução, de 26 indivíduos com DEA (projeto piloto). Em casos de suspeita de deleção
foi utilizada a técnica de Fluorescence in situ Hybridization (FISH) com a utilização de sondas específicas para as
regiões analisadas. O estudo cariotípico convencional por banda GTG não detectou qualquer alteração. A avaliação
citogenética em alta resolução de um paciente com diagnóstico de Síndrome de Asperger foi sugestiva de deleção
2q37, observada em um dos cromossomos do par 2 em todas as metáfases analisadas. A análise por FISH com a
sonda específica mostrou os dois sinais normais esperados. Porém, pode ser que a perda sugerida pela análise
em alta resolução envolva outra região próxima de 2q36. Todos os pacientes, portanto, apresentaram resultados
normais para as regiões estudadas, dentro do limite de resolução das técnicas utilizadas. A introdução da análise
destas regiões no protocolo de exames genéticos em DEA depende do estudo com casuísticas maiores.
Apoio Financeiro: Capes, BAP/FAMERP.
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Análise do gene MECP2 em uma amostra de meninas
com diagnóstico de transtornos do espectro autista
sem características sindrômicas
Godoy, BA1; Longo, D1; Bau, CHD1,2; Riesgo, RS3; Vargas, FR4; Menezes, AN4; Faccini, LS1,2
1 - Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
2 - Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
3 – Departamento de Pediatria, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
4 – Instituto Nacional do Câncer, Rio de Janeiro, Brasil
Palavras-chave: transtornos do espectro autista, MECP2, Síndrome de Rett, mutações patogênicas, características clínicas
Introdução: A Síndrome de Rett (SR) é um transtorno grave do desenvolvimento neurológico infantil que ocorre
mais frequentemente em meninas, com prevalência de 1 caso em 10.000. Os Transtornos do Espectro Autista
(TEA) e a SR compartilham muitas características fenotípicas, como prejuízos severos na comunicação e interação
social, acompanhados por movimentos repetitivos e estereotipados. Os critérios diagnósticos diferenciais para SR
incluem perda do uso funcional das mãos e microcefalia progressiva acompanhadas ou não por irregularidades
respiratórias, ataxia, espasticidade, escoliose e bruxismo. A SR é associada a mutações no gene MECP2, no entanto,
há um número crescente de estudos encontrando mutações patogênicas em pacientes com diagnóstico de TEA
sem características clínicas da síndrome. O objetivo deste trabalho é investigar o gene MECP2 em um grupo de
40 meninas com diagnóstico prévio de TEA e descrever seu quadro clínico com relação aos critérios diagnósticos
para SR. Material e métodos: Foram avaliadas quarenta pacientes do sexo feminino com diagnóstico de Transtorno
Autista, Transtorno de Asperger ou Transtorno Global do Desenvolvimento não especificado provenientes do Rio
Grande do Sul, sem características sindrômicas. A avaliação clínica incluiu a análise de características associadas
a SR, conforme descrito na literatura. O DNA genômico foi obtido de amostras de sangue periférico e a região
codificante do gene (éxons 2, 3 e 4), bem como as regiões de junção éxon/íntron, foram amplificadas por PCR
e posteriormente seqüenciadas. As variantes de sequência foram consideradas novas quando não referidas no
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou no RettBASE (http://MECP2.chw.edu.au). Resultados e discussão: No
íntron 3 de 6 pacientes foram encontradas 4 variantes, sendo 3 delas descritas como polimorfismos de nucleotídeo
simples (SNP) (rs2075597, rs3850326, rs2071569), e uma transição C>T, ainda não descrita, na posição g.71114
(NG_007107.1). Outra variação de seqüência na região N-terminal da proteína MeCP2 (rs61754435) também
foi observada em uma paciente, correspondendo a uma mutação sinônima (p.P56P) não associada à SR. Duas
pacientes (5%) portavam mutações patogênicas em MECP2: a primeira apresentou mutação c.763C>T (p.R255X) terceira mais freqüente em pacientes com SR; a segunda, dois eventos in/del no éxon 4, ainda não descritos. Essas
pacientes não mostravam sintomas característicos de SR, mas tinham histórico de retardo no desenvolvimento
e fala, típicos de casos previamente relatados de TEA não sindrômicos com mutações em MECP2. Conclusão:
Os critérios diagnósticos propostos para SR não parecem bons indicadores de mutações em MECP2 em casos
de pacientes com TEA. Baseado nas características clínicas das nossas pacientes portadoras de mutações
patogênicas em MECP2, bem como nos resultados de estudos prévios, sugerimos que o sequenciamento desse
gene seja cogitado, senão em todas as meninas com TEA, ao menos para aquelas que apresentarem atraso no
desenvolvimento social e comunicativo.
Apoio financeiro: FIPE-HCPA, CNPq, CAPES, FAPERGS, DECIT/SCTIE/MS e CNPq-Institutos do Milênio.
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Study of the Serotonin Transporter Gene
Polymorphisms IN AUTISTIC trios and healthy
individuals
Coprerski, B1; Tavares, CR1; Carmo, LF1; Brunoni, D2,3; Costa, APP1
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo, SP
Programa de Pós-graduação em Distúrbios do Desenvolvimento, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Presbiteriana
Mackenzie, São Paulo, SP
3
Departamento de Morfologia, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, SP
1
2
Keywords: Autism, Serotonin transporter (5-HTT), HTT polymorphisms, SLC6A4, genetic diversity
Autism is a heterogeneous syndrome defined by impairment in reciprocal social interaction, language and
communication and by the presence of repetitive and stereotypic patterns of behavior and interests. Although the
etiology of autism is unknown; evidence indicates that genetic factors play a major role in the disorder. Its genetic
basis is complex and multiple genes are involved. The serotonin transporter (5-HTT) gene has long been considered
likely to play a role in autism. The 5-HTT gene, SLC6A4, is located in chromosome region 17q11.2 and contains 14
exons encompassing over 35 kb, with its two first exons (1a and 1b) alternatively transcribed. Some evidence for
genetic linkage has been observed between autism and markers covering the 17q11.2 region and the SLC6A4 gene.
Two common polymorphisms of the SLC6A4 gene have been described: a 44-bp insertion/deletion polymorphism
in promoter region, known as 5-HTTLPR, and a 17-bp variable number of tandem repeats (VNTR) in intron 2a.
Variants of SLC6A4 have been reported to influence the severity of autistic behavior. In this work, the genotype and
allele frequencies of 5- HTTLPR and VNTR polymorphisms of the 5-HTT gene were determined in Brazilian healthy
individuals and complete trios of patients (subjects fulfilling criteria for autism and their parents) belonging to
diverse ethnic backgrounds. The frequency of the long allele of the 5-HTTLPR was higher in male than in female
in the control and patient sample. The genotype L/L is more frequent only in males despite ethnic backgrounds.
For other hand, the genotype L/S is the most frequent, in both genders, occurring at a slightly higher frequency in
samples with no European backgrounds. For the intron 2 VNTR of 5-HTT the 12 copy allele occurred at a higher
frequency in the patient sample and the control group, independent of gender and the ethnic background. The
genotype 12/12 is more frequent in males. The genotype 12/10 is equally frequent in both genders but the genotype
10/10 is less frequent in females. The 9 copy allele was not observed in our samples. This is the initial gathering
of data to explore whether variants of two functional polymorphisms of SLC6A4 were related to specific autistic
behavioral characteristics. Further studies will be accomplished to investigate the genetic variants of the serotonin
transporter gene implications and their relations with the etiology of autism and possible subgroups of patients.
Supported by: Fundo MackPesquisa, CCBS, UPM
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Análise genética de neurotransmissores em pacientes
brasileiros com autismo
Santana, DCR1; Mota, APZ1; Passoni, CRMS1; Pereira-Ferrari, L1
1- Laboratório de Genética da Faculdades Integradas do Brasil (UNIBRASIL), Curitiba-PR/Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Gene SLC6A4, Receptor de Serotonina, 5-HTT, Autistas.
O termo autismo vem do grego “autós”, que significa “de si mesmo”. Trata-se de uma doença genética, que afeta
o sistema nervoso, funções neurológicas e funções motoras, sendo predominante no sexo masculino. Vários
marcadores genéticos têm sido descritos como desencadeadores dos sinais clínicos do autismo, porém a relação
genótipo X fenótipo ainda não está completamente esclarecida. Avaliando-se o fenótipo de crianças autistas,
poderemos encontrar diferentes “graus” de atenuantes, apresentando-se de forma mais grave ou leve, às vezes quase
imperceptíveis. Diversas investigações genéticas apontam anormalidades cromossômicas na região codificadora
da família dos genes NLGN (neuroligina) como candidatos para o envolvimento do retardo do desenvolvimento
e no autismo. Recentemente um estudo comprovou o polimorfismo de seis nucleotídeos e consequentemente
a associação as proteínas transmembranas caderinas CDH10 e CDH9 gene NLGN3 já foi inclusive rastreado em
famílias com histórico de autismo. Outro gene importante é o SLC6A4, que codifica o receptor de serotonina
(5-HTT), e media a recaptação de serotonina (5-HTRs) na sinapse este gene tem sido apresentado como forte
candidato a modulador do autismo. Em geral os genes que codificam neurotransmissores e seus receptores, por
serem genes que codificam proteínas participantes do sistema serotoninérgico, estão envolvidos em sinais clínicos
como depressão, epilepsia, comportamento obsessivo-compulsivo, esquizofrenia, distúrbios de comportamento e
transtorno bipolar. No Brasil, até o momento, não existia análise molecular em pacientes autistas. Os resultados
obtidos neste estudo nos permitem sugerir que os sinais clínicos mais característicos da forma clássica de autismo,
ou seja, movimento repetitivo com a cabeça para frente e para traz e quadro de movimento repetitivo e torção de
dedos, estão presentes somente nos pacientes que apresentam o alelo S no seu genótipo (S/S ou L/S), sugestionando
uma associação entre o alelo S e a forma clássica de autismo e corroborando o observado por HARIRI & BROWN,
(2006), que afirmam que o alelo “S” associa-se a uma redução de aproximadamente 50% na expressão da proteína
transportadora de serotonina e consequentemente na recaptação de serotonina. Este estudo também contribui
para o marco inicial das pesquisas moleculares do autismo no Brasil e sugere evidências de que, além das caderinas
recentemente mencionadas como associadas ao autismo, o polimorfismo da região promotora do gene SLC6A4
pode estar envolvido na modulação clínica do autismo, além de ressaltar a necessidade de uma pesquisa mais
aprofundada e ampliada do tema nos pacientes brasileiros.
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Heterogeneidade alélica no gene DRD4 revela
associação entre variantes raras e transtorno de déficit
de atenção e hiperativiadade (TDAH)
Tovo-Rodrigues, L1; Roman, T1; Bau, CHD1; Callegari-Jacques, SM1,2; Hutz, MH1
Departamento de Genética; Instituto de Biociências; Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Estatística; Instituto de Matemática; Universidade Federal do Rio Grande do Sul
1
2
Palavras-chave: TDAH, DRD4, VNTR, heterogeneidade alélica, haplótipos.
O gene DRD4 codifica o receptor de dopamina D4. O seu terceiro éxon contém uma região de VNTR de 48 pb
(variações de 2 a 11 repetições em humanos) e SNPs internos a esse VNTR. O alelo de sete repetições é descrito
como o alelo mais importante desse locus por estar possivelmente sob seleção positiva e por apresentar
funcionalidade reduzida quando comparado com a atividade ótima do alelo de quatro repetições, mais comum na
população mundial. Outro aspecto de interesse nesse alelo diz respeito a sua associação, em diversos estudos, com
transtornos psiquiátricos, principalmente com o TDAH. Entretanto, os resultados observados até o momento não
são consistentes quanto à associação, não sendo suficientes para esclarecer a contribuição desse polimorfismo no
TDAH. Dessa maneira, seria importante que os SNPs internos também fossem avaliados pois possíveis diferenças
de seqüências podem estar relacionada com as dificuldades de determinar se há ou não associação entre esse alelo
e TDAH. Visando a determinar as seqüências de SNPs do VNTR do éxon III do gene DRD4 de ameríndios, afrobrasileiros, descendentes de europeus e indivíduos com TDAH do sul do Brasil e comparar a variabilidade entre o
grupo caso (indivíduos com TDAH) e controle (afro e euro-descendentes) quanto aos haplótipos observados, foram
analisados 20 alelos de euro-descendentes (adicionados a 69 alelos de euro-descendentes descritos na literatura),
6 de afro-descendentes (adicionado a 1 descrito na literatura), e 62 de indivíduos com TDAH. A amplificação do
alelo 7R foi realizada pela técnica de PCR e o seqüenciamento através da empresa Macrogen Inc. Os haplótipos
foram derivados pelo método Bayesiano implementado no programa Phase 2.1. A comparação da distribuição dos
alelos entre casos e controles foi feita por Teste Exato de Fisher. Quanto à freqüência de variantes raras, 0,210 foi
observado em indivíduos com TDAH e 0,073 no grupo controle, enquanto 0,194 das variantes protéicas codificadas
por esses alelos foi observada em indivíduos com TDAH e 0,073 no grupo controle. A distribuição dos alelos nos
dois grupos se mostrou diferente (P=0,010), assim como a distribuição das variantes protéicas (P=0,034). Através
de um teste de Kruskal Wallis verificou-se que a quantidade de substituições não sinônimas também é elevada
no grupo caso (P=0,015). Os resultados sugerem que a heterogeneidade alélica pode estar contribuindo para a
associação entre o gene DRD4 e o TDAH e que as variantes raras possam ter um efeito confundidor nos estudos
de associação com o transtorno. Isso levanta questionamentos sobre a hipótese atual de etiologia do transtorno
(variantes comuns-doenças comuns), sendo a hipótese de variantes raras-doenças comuns mais condizente com
os resultados. Assim, é possível supor que os valores de associação considerando apenas o tamanho do alelo
estejam subestimados.
Apoio financeiro: CNPq, Institutos do Milênio, PRONEX E FAPERGS
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Efeito de três polimorfismos no gene ADRA2A sobre o
transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (TDAH)
e características de personalidade
Cerqueira, CCS1; Polina, ER1; Contini, V1; Marques, FZC1; Grevet, EH2; Salgado, CAI2; Belmonte-de-Abreu, P2;
Bau, CHD1, 2.
Departamento de Genética/Instituto de Biociências - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre – RS, Brasil.
Ambulatório de Déficit de Atenção e Hiperatividade em Adultos - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre – RS, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Comportamento, Dimensões do temperamento, Evitação de dano, Persistência e Procura de novidades.
O TDAH é um transtorno multifatorial influenciado pelo efeito de fatores ambientais e genéticos e possui
herdabilidade estimada em 76%. O gene ADRA2A localiza-se no cromossomo 10q24-q26 e variações no mesmo têm
se mostrado associadas a características do comportamento, tais como o TDAH e o tabagismo. O gene codifica
uma proteína chave no controle do sistema que regula atenção, vigilância, memória, bem como outras funções
cognitivas. Este trabalho almejou descrever o efeito dos três principais polimorfismos no gene ADRA2A (-1291
C>G MspI, -262 G>A HhaI, 1780 C>T DraI) sobre o TDAH e sobre as dimensões de personalidade em indivíduos
com o transtorno. A amostra deste estudo caso-controle é composta por 434 casos de TDAH provenientes do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre e de 236 controles brasileiros procedentes do Hemocentro do Rio Grande do
Sul. O processo diagnóstico seguiu os critérios do DSM-IV, e as dimensões de personalidade foram avaliadas com
o Inventário de Temperamento e Caráter (TCI). A genotipagem foi realizada pelas técnicas de PCR-RFLP (MspI)
ou PCR em tempo real – TacMan (HhaI e DraI). A comparação das freqüências alélicas e genotípicas entre as
amostras foi realizada por meio do teste do Qui-quadrado, e as associações com características de personalidade
através da ANOVA. Todas as freqüências estavam em equilíbrio de HW e não foi encontrada nenhuma diferença
significante entre as freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos analisados entre os casos de TDAH e
controles. Entretanto, foram observadas associações entre o polimorfismo MspI com evitação de dano e DraI com
procura de novidades e persistência. O haplótipo contendo os alelos GGT (MspI-HhaI-DraI) apresentou escores
mais baixos em persistência e mais elevados em procura de novidades quando comparado aos demais haplótipos.
O achado relacionando os polimorfismos do ADRA2A com dimensões do temperamento é inédito. Esse resultado
poderia explicar a inconsistência nos resultados de associação direta envolvendo o gene com fenótipos tais como
o próprio TDAH e o tabagisApoio Financeiro: CNPq, FAPERGS, PRONEX, Decit/SCTIE/MS.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
138
Avaliação da influência do gene do transportador
de dopamina (DAT1) na respota terapêutica ao
metilfenidato em adultos com transtorno de déficit de
atenção e hiperatividade (TDAH)
Contini, V1; Victor, MM2; Bertuzzi, GP1; Grevet, EH2; Salgado, CAI2; Belmonte-de-Abreu, PS2; Bau, CHD1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências e 2Departamento de Psiquiatria, Faculdade de Medicina, UFRGS, Porto Alegre, RS,
Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: TDAH, DAT1, metilfenidato, farmacogenética
O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um transtorno comum em adultos e está associado
com uma vida profissional irregular, prejuízo nas relações sociais e econômicas. O tratamento do TDAH envolve
intervenções farmacológicas, sendo os estimulantes a medicação de primeira escolha e, entre eles, o metilfenidato.
O mecanismo de ação do metilfenidato envolve o bloqueio dos transportadores de dopamina e noradrenalina e a
hipótese inicial para os efeitos terapêuticos relaciona a melhora dos sintomas com a função dopaminérgica. No
entanto, aproximadamente 30-50% dos pacientes adultos não respondem positivamente ao tratamento. Abordagens
farmacogenéticas fornecem uma nova metodologia para ajudar a desvendar a heterogeneidade de resposta
aos medicamentos e, com relação à farmacogenética do metilfenidato, os resultados são bastante preliminares.
Numerosos estudos de neuroimagem e genéticos sugerem o envolvimento do gene do transportador de dopamina
(DAT1) no TDAH, especialmente do polimorfismo do tipo VNTR na região 3´UTR do gene. Os primeiros estudos
farmacogenéticos com este polimorfismo evidenciaram uma associação entre o alelo de 10 repetições e uma pior
resposta à medicação. No entanto, tais resultados não se confirmaram posteriormente, impedindo uma conclusão
consistente sobre o efeito deste polimorfismo. O objetivo deste trabalho é avaliar a influência do gene DAT1 na
resposta ao metilfenidato em uma amostra de 171 adultos com TDAH, diagnosticados através do DSM-IV. Os
pacientes foram avaliados antes do uso da medicação e um mês após o início da mesma, através da aplicação
da escala SNAP-IV, instrumento utilizado para avaliação dos sintomas do transtorno. Foi considerado critério de
melhora a redução de pelo menos 30% nos sintomas na escala. Os polimorfismos do tipo VNTR na região 3´UTR e
no íntron 8 do gene foram genotipados com a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) e o polimorfismo
-839 C>T através do sistema de discriminação alélica TaqMan. As análises estatísticas foram realizadas através
do programa estatístico SPSS e envolveram testes de regressão logística, para a análise categórica de resposta ao
tratamento (respondedores X não-respondedores), e ANOVA, para a avaliação longitudinal de resposta através da
variação nos escores da escala SNAP-IV. Segundo o critério de melhora de redução de 30% nos sintomas na escala
SNAP-IV, 136 pacientes foram classificados como respondedores e 35 como não-respondedores. Não foi observada
diferença estatisticamente significativa nas freqüências genotípicas entre respondedores e não-respondedores
em nenhum dos polimorfismos (3´UTR VNTR, P=0.25; VNTR íntron 8, P=0.58; -839 C>T, P=0.93). Da mesma
forma, nenhum efeito dos polimorfismos analisados foi encontrado na resposta ao tratamento avaliada através da
variação dos escores da escala SNAP-IV. Nossos resultados sugerem que os polimorfismos analisados não possuem
um papel relevante na resposta terapêutica ao metilfenidato em adultos com TDAH.
Apoio financeiro: CNPq, PRONEX, FAPERGS, CAPES, HCPA, DECIT/SCTIE/MS/PPSUS.
.
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Polimorfismo no gene do receptor mineralocorticóide e
o transtorno de déficit de atenção e hiperatividade em
adultos
Polina, ER*1; Kortmann, GL1; Hendler, EM1; Belmonte-de-Abreu, P2; Grevet, EH2; Salgado, CAI2; Contini, V1;
Bau, CHD1.
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
Ambulatório de Déficit de Atenção e Hiperatividade em Adultos, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil.
* [email protected]
1
2
Palavras-chave: TDAH, Cortisol, Estresse, MRI180V, herança multifatorial
O receptor mineralocorticóide (MR) é um dos principais envolvidos no controle e modulação da secreção de cortisol,
um hormônio responsável pelas respostas fisiológicas relacionadas ao estresse. O polimorfismo MRI180V é um
SNP G>A localizado no éxon 2 do gene MR, ocasionando a troca de uma Isoleucina por uma Valina, a qual diminui
a afinidade deste receptor pelo cortisol. Além disso, este polimorfismo tem sido associado com a depressão e com
o aumento da biodisponibilidade desse hormônio após eventos de estresse. O transtorno de déficit de atenção/
hiperatividade (TDAH) acomete crianças e continua durante a adolescência na maioria dos casos, atingindo
uma prevalência de aproximadamente 4,4% em adultos. Supõe-se que a hiperatividade/impulsividade possa ser
influenciada também pela resposta ao estresse. O objetivo deste trabalho é verificar uma possível associação
entre o polimorfismo MRI180V e o TDAH. A amostra de adultos com TDAH é composta por 445 indivíduos eurodescendentes, diagnosticados segundo os critérios do DSM-IV, provenientes do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre. O grupo controle é formado por 238 doadores de sangue euro-descendentes do sexo masculino. O DNA foi
extraído de sangue periférico e a genotipagem foi realizada pelo sistema de discriminação alélica Taqman (Applied
Biosystems). As freqüências alélicas (TDAH: fA= 0,9; fG=0,1 e controles: fA=0,85; fG=0,15) estão de acordo com o
esperado para o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Nossos resultados demonstram uma associação do polimorfismo
MRI180V com o TDAH em adultos (χ2gl= 8,95; p= 0,01). Entretanto não encontramos associação deste polimorfismo
com variáveis específicas de comportamento hiperativo/impulsivo, o que demanda cautela na interpretação dos
achados.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, HCPA, FAPERGS, DECIT/SCTIE/MS/PPSUS.
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Estudo de associação entre o polimorfismo TaqIA
da região DRD2/ANKK1 e o Transtorno de Déficit de
Atenção e Hiperatividade
Nuss, A1; Akutagava-Martins, GC1; Genro, JP1; Polanczyk, G2; Zeni, C3; Rohde, LAP3; Hutz, MH1; Roman, T1.
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Department of Psychology and Neuroscience, Duke University.
3
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
1
2
Palavras-chave: TDAH, DRD2, ANKK1, sistema dopaminérgico, suscetibilidade
Um dos transtornos psiquiátricos mais comuns encontrados em crianças e adolescentes é o transtorno de déficit
de atenção e hiperatividade (TDAH), que afeta em torno de 5% das crianças em idade escolar. Três tipos clínicos
de TDAH podem ser reconhecidos, conforme a presença de um mínimo de seis sintomas nas áreas de desatenção,
hiperatividade/impulsividade ou ambas: predominantemente desatento, predominantemente hiperativo/
impulsivo e combinado. Etiologicamente, o TDAH é considerado uma doença complexa, com herdabilidade
estimada em torno de 76%. A provável transmissão desse transtorno ocorre através de vários genes de pequeno
efeito, que conferem suscetibilidade, e seu desenvolvimento depende da interação destes genes entre si e com
diversos fatores ambientais. Considerando-se as evidências neurobiológicas, genes que codificam componentes
do sistema dopaminérgico parecem estar entre os principais candidatos para estudos moleculares com essa
patologia, e entre eles, o gene que codifica o receptor D2 de dopamina (DRD2). Um polimorfismo do tipo SNP,
TaqIA (rs1800497), originalmente descrito na região flanqueadora 3’ do DRD2 mas localizado no gene ANKK1
(ankyrin repeat and kinase domain containing 1), é forte candidato para estudos com transtornos psiquiátricos
caracterizados por comportamentos impulsivos. O objetivo do presente trabalho é investigar a hipótese de
associação deste polimorfismo com o TDAH. A amostra é composta por 388 crianças e/ou adolescentes
diagnosticados com TDAH pelo Programa de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (ProDAH-HCPA) seguindo diretrizes do DSM-IV, e seus pais biológicos. O polimorfismo foi genotipado por
PCR seguido de clivagem com endonuclease de restrição TaqIA, sendo a hipótese de associação verificada por
um método baseado em famílias, através do programa TRANSMIT. As freqüências gênicas obtidas foram 0,210
para o alelo A1 e 0,790 para o alelo A2, o que está de acordo com o descrito na literatura para esse grupo étnico. As
freqüências genotípicas (não apresentadas) encontram-se em Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Não houve evidência
de transmissão preferencial de alelos quando se analisou a amostra total (P = 0,070). Já para o grupo de pacientes
com o subtipo clínico combinado, detectou-se excesso de transmissão do alelo A2 (P = 0,046). Apesar da associação
positiva, é necessário um maior estudo dessa região genômica para confirmar seu papel como de suscetibilidade
ao TDAH, através do aumento da amostra, do estudo de outros polimorfismos no gene DRD2 e, ainda, análises de
desequilíbrio de ligação e estudo de haplótipos.
Apoio financeiro: PROPESQ, FAPERGS.
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141
Gene do receptor D4 de dopamina: possível
associação com o Transtorno de Déficit de Atenção e
Hiperatividade
Akutagava-Martins, GC1; Ferraz, GR1; Genro, JP1; Polanczyk, G2; Zeni, C3; Schmitz, M3; Rohde, LAP3; Hutz,
MH1; Roman, T1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Department of Psychology and Neuroscience, Duke University.
3
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
1
2
Palavras-chave: TDAH, DRD4, associação, polimorfismos, doença complexa.
O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos psiquiátricos mais comuns
da infância e adolescência, afetando em torno de 5% das crianças em idade escolar. Etiologicamente, o TDAH
é considerado uma doença complexa, pois tanto fatores genéticos quanto ambientais são necessários para a
manifestação da doença. A herdabilidade é estimada em 76%, uma das mais altas observadas em transtornos
psiquiátricos. Considerando-se evidências neurobiológicas, genes que codificam componentes do sistema
dopaminérgico são os principais candidatos para estudos moleculares do TDAH. Entre esses genes, o mais
intensamente estudado é o gene do receptor D4 de dopamina (DRD4), altamente polimórfico e estruturalmente
complexo, com resultados positivos em metanálises. O presente estudo tem como objetivo investigar uma possível
associação entre o gene DRD4 e o TDAH em uma amostra composta por 488 crianças e/ou adolescentes com a
doença, diagnosticados pelo Programa de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (ProDAH-HCPA) seguindo diretrizes do DSM-IV, e seus pais biológicos. Quatro polimorfismos com possível
implicação funcional foram estudados: três deles estão localizados na região promotora, sendo uma duplicação
de 120pb e dois SNPs -616C>G (rs747302) e -521C>T (rs1800955). O quarto polimorfismo consiste em um VNTR
de 48pb, presente no terceiro exon. Os polimorfismos foram genotipados por PCR seguido de clivagem com
endonucleases de restrição quando necessário. A hipótese de associação foi verificada por um método baseado
em famílias, através do software FBAT. Não houve evidência de associação entre qualquer dos polimorfismos
estudados e a amostra total (valores de P entre 0,200 e 0,974). Entretanto, quando a análise foi restrita às
famílias cujo probando apresentava o subtipo combinado da doença, o alelo de duas repetições (2R) do VNTR
foi preferencialmente não transmitido (P=0,032). O estudo de haplótipos não demonstrou nenhuma transmissão
preferencial (valores de P entre 0,063 e 0,9769). O resultado observado indica que o alelo 2R pode estar conferindo
uma proteção ao surgimento do TDAH na presente amostra. Considerando que o alelo sugerido na literatura como
de risco é o de sete repetições (7R), é possível que outros alelos do VNTR estejam atuando no sentido oposto, ou
seja, contribuindo para o não desenvolvimento da doença. Entretanto, esse resultado deve ser interpretado com
cautela, devendo ser investigado através de outras abordagens, tais como análises dimensionais. Ainda, é possível
que os resultados sejam devidos à complexidade estrutural do DRD4 que, certamente, deve ser compreendida para
que a associação do mesmo com o TDAH seja melhor caracterizada.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS.
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142
Mutações no exon 31 do gene LRRK2 não constituem
um fator genético de suscetibilidade à Doença de
Parkinson em pacientes brasileiros
Silva, MM; Moura, KCV; Abdalla, CB; Santos, JM; Campos Jr., M; Santos-Rebouças, CB; Pimentel, MMG
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Departamento de Genética, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Doença de Parkinson, LRRK2, exon 31
A Doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum, afetando 1-2% de indivíduos
com 60 anos ou mais. A perda de neurônios dopaminérgicos e a consequente diminuição na produção de
dopamina no cérebro acarretam os principais sinais clínicos da doença: bradicinesia (lentidão dos movimentos),
tremor, rigidez e/ou instabilidade postural. Além da degeneração neuronal na substantia nigra pars compacta,
outra característica patológica é a formação de corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes.
Por se tratar de uma doença crônica e progressiva, os sintomas tendem a aumentar com o tempo, mesmo que
seja feito tratamento medicamentoso adequado. Até o presente, foram identificados nove genes relacionados à
DP. Destes, o LRRK2 constitui o principal fator genético de suscetibilidade à doença. Já foram descritas inúmeras
mutações, sendo sete de caráter patogênico. O LRRK2 possui 51 exons, dentre os quais o exon 31 é um dos hotspots
mutacionais. Três mutações missense nesse exon, p.R1441C, p.R1441G e p.R1441H, todas de caráter patogênico,
tem sido identificadas numa alta frequência em casos esporádicos e familiares da DP em populações bascas
e do norte e sul da Espanha. O exon 31, juntamente com os exons 29 e 30, codifica o domínio Roc-GTPase da
proteína LRRK2. A ocorrência de uma mutação p.R1441C/G/H no domínio Roc compromete a atividade quinase
da proteína, levando à degeneração neuronal. Considerando que estudos genéticos relativos ao gene LRRK2 na
população brasileira são raros, o objetivo do presente estudo foi realizar o rastreamento de mutações no exon
31 deste gene em 243 pacientes brasileiros diagnosticados com DP (196 casos isolados e 47 casos familiares;
faixa etária 33 a 90 anos), oriundos de hospitais do Estado do Rio de Janeiro. O DNA foi extraído de leucócitos
do sangue periférico e, posteriormente, amplificado pela técnica de PCR. Os produtos da PCR foram purificados
e sequenciados em ambas as direções usando o sistema ABI 3730. Não detectamos a presença de mutações em
nenhum dos 242 pacientes analisados. Nossos resultados corroboram os estudos realizados em populações norteamericanas, italianas, alemãs, portuguesas, indianas, russas e chilenas, e reforçam que mutações no exon 31 do
gene LRRK2 são raras e, provavelmente, restritas a populações bascas e espanholas.
Apoio financeiro: PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ, CNPq, FAPERJ, CEPUERJ
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143
Relevância de variantes genéticas de enzimas
antioxidantes em pacientes com Doença de Parkinson
Gregório, ML1; Pinhel, MAS1; Sousa, GF1; Silva, GM1; Nakazone, MA1; Pascuotte, F1; Oliveira, FN2; Souza,
DRS1; Tognola, WA2
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular, Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.
Ambulatório de Neurogeriatria e Distúrbios do Movimento - Hospital de Base de São José do Rio Preto
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Doença de Parkinson, Variantes Genéticas, Enzimas Antioxidantes
A patogênese da doença de Parkinson (DP) permanece incompletamente compreendida, mas parece envolver
tanto a suscetibilidade genética quanto fatores ambientais na degeneração das células dopaminérgicas da
substância negra que se projetam ao estriado, a partir do acúmulo de substâncias tóxicas associadas às variantes
genéticas das enzimas glutationa S-tranferases (GSTs). As GSTs são uma família de proteínas diméricas de fase
II que apresentam caráter polimórfico, envolvidas no metabolismo de xenobióticos. O sistema nervoso central
é particularmente vulnerável ao estresse oxidativo, devido à presença de alguns fatores como níveis elevados de
oxigênio e baixa concentração de antioxidantes e enzimas relacionadas, o que pode levar a neurodegeneração
observada na DP. Com isto, há um desbalanço de dopamina no estriado, alterando o circuito motor responsável
pelo movimento normal, resultando em alterações motoras características da DP. Este estudo teve como objetivo
analisar a influência da nulidade de GSTs, incluindo GSTM1 e T1 em pacientes com DP. Foram estudados 42
pacientes com DP (GE) e 42 indivíduos sem a doença (GC), apresentando média de idade de 62,3±10,9 e 61,9±11,3
anos, respectivamente. Nesse contexto incluiu-se a análise das variantes M1 e T1 para GSTs por Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR) convencional em gel de agarose 1,5%, seguida de coloração com brometo de etídeo. A análise
estatística considerou teste exato de Fisher, com nível de significância para P<0,05. Nulidade para GSTM1 e GSTT1
prevaleceu no GC (48 e 21%, respectivamente) comparado ao GE (38%, P=0,57 e 14%, P=0,50; respectivamente). A
distribuição semelhante de variantes genéticas para GSTs em portadores de DP e controles sugere ausência de
relação entre nulidade de GSTT1/M1 e a doença.
Apoio Financeiro: FAMERP/FAPESP
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Análise de mutações no gene ATP13A2 em pacientes
brasileiros com Doença de Parkinson de início precoce
Diniz, KRS1; Pestana, CP1; Santos, AV1; Campos Jr, M1; Abdalla-Carvalho, CB1; Santos, JM1; SantosRebouças, CB1; Pimentel, MMG1
Departamento de Genética, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
Palavras-chave: ATP13A2, Doença de Parkinson, Manifestação Precoce, Mutação, ATPase tipo-P da subfamília P5
A Doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum, afetando aproximadamente
2% na população com mais de 60 anos. Suas características patológicas incluem a perda seletiva dos neurônios
dopaminérgicos na substância nigra pars compacta e a presença de inclusões intracelulares (corpúsculos de Lewy)
nos neurônios sobreviventes. Pouco se sabe sobre os mecanismos patogênicos da DP, contudo mutações em vários
genes têm sido associadas à doença e o estudo das proteínas codificadas por esses genes pode trazer um maior
entendimento sobre os mecanismos moleculares associados a neurodegeneração. Acredita-se que defeitos nas vias
de degradação de proteínas, tal como via de degradação do sistema ubiquitina proteossomo, sistema endossomo
lisossomal, pode levar a um acúmulo de proteínas truncadas ocasionando a morte neuronal. Recentemente, um
novo gene, ATP13A2, tem sido associado a casos de parkinsonismo de início precoce. Esse gene está situado no
1p36 e codifica a proteína ATPase tipo-P da subfamília P5, de localização lisossômica, que é expressa em diversos
tecidos, principalmente no cérebro. Mutações nesse gene levam à formação de proteínas truncadas que ficam
retidas no reticulo endoplasmático e posteriormente são degradadas pelo proteossomo, podendo causar a disfunção
proteossômica, decorrente da sobrecarga gerada pela proteína mutante, ou causar a disfunção lisossômica, ambas
gerando agregação tóxica. Este trabalho tem como objetivo realizar a análise molecular do gene ATP13A2 em uma
amostra de 110 pacientes brasileiros com DP, sendo 20 casos esporádicos e 90 casos familiares, de manifestação
precoce (< 50 anos), de forma a avaliar se mutações neste gene representam um fator de risco para a DP. O DNA foi
extraído a partir de leucócitos do sangue periférico e a triagem dos exons 13, 14 e 16, bem como, dos limites íntronexons foi realizada por sequenciamento direto dos produtos da PCR. Identificamos duas variantes de seqüência:
a variante intrônica c.1306+42_1306+43insC no intron 13, e a variante silenciosa c.1617G>T, localizada no exon
16. Ao utilizarmos a ferramenta eletrônica spliceview, verificamos uma possível deleção de um sítio aceptor de
encadeamento e, desta forma, a mutação pode afetar o processo de encadeamento do íntron 13, embora estudos
in silico complementares sejam necessários. Consideramos, neste momento, a importância de estender nossas
análises para uma amostra maior, assim como, ampliar a análise das regiões codificantes do gene ATP13A2, de
forma a avaliar o papel deste gene como causa da DP em nossa população.
Apoio financeiro: PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ, CNPq, FAPERJ, CEPUERJ.
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Estudo da interação entre as vias de sinalização dos
estrógenos e fatores de crescimento no controle da
transcrição dos genes PAWR e PHLDA1
de Bessa Garcia, AS; Pereira, MC; Nagai, MA
Laboratório de Genética Molecular do Câncer - Disciplina de Oncologia - Departamento de Radiologia - Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: câncer de mama, E2, EGF, Real-Time PCR e interação entre vias de sinalização.
A interação entre as vias de sinalização dos estrógenos e dos fatores de crescimento está relacionada ao aumento da
proliferação e sobrevivência das células mamárias tumorais e ao desenvolvimento da resistência aos tratamentos
hormonais. Inicialmente, mostramos a ação do E2 (17b-estradiol) no controle negativo da transcrição do PAWR
(12q21), gene pró-apoptótico. Dados da literatura mostram que a retirada de fatores de crescimento promovem
o aumento da expressão deste gene. Outro gene de interesse do laboratório é o PHLDA1 (12q15) cuja função
parece estar relacionada ao processo de apoptose, sendo sua expressão induzida pelo E2. Baseado nestes dados, o
presente trabalho teve como objetivo verificar a possível interação entre as vias de sinalização dos estrógenos e do
fator de crescimento epidermal (EGF) no controle da transcrição dos genes PAWR e PHLDA1 utilizando a linhagem
celular de adenocarcinoma de mama MCF-7 tratada com E2 (10nM), ICI 182,780 (ICI, antiestrógeno puro, 1μM)
e EGF (50ng/ml). As análises de expressão gênica foram realizadas utilizando a técnica de Real-Time PCR. Os
resultados obtidos até o momento mostraram que o tratamento com EGF-24h promoveu uma diminuição de 1,5
vez na expressão do PAWR. O tratamento com ICI por 24h resultou em um aumento de 2,5 vezes na expressão deste
gene. Nos tratamentos com ICI+E2 e ICI+EGF por 24h observou-se uma diminuição significativa da expressão
deste gene em relação às células tratadas com o ICI-24h, porém não suficiente para retomar a expressão observada
nos tratamentos com E2 ou EGF por 24h. Para o gene PHLDA1, observou-se que os tratamentos com E2-6h e
EGF-2h promoveram um aumento de expressão maior que 2,0 vezes enquanto os tratamentos com ICI por 2h e
6h diminuíram em 2,0 vezes a expressão deste gene. Os tratamentos com ICI+E2 por 2h, 6h e 24h mantiveram a
expressão semelhante aos tratamentos com ICI isoladamente enquanto os tratamentos com ICI+EGF por 2h e
24h não promoveram variação significativa da expressão do PHLDA1 em relação aos respectivos tratamentos com
EGF. Portanto, sugere-se que o efeito do E2 no controle da transcrição destes genes ocorre predominantemente
via ER (receptor de estrógeno). Porém, a via do ER parece não interferir no efeito produzido pelo EGF no controle
da transcrição do PHLDA1 ao contrário do observado para o gene PAWR. Os inibidores das vias do PI3K, p38MAPK
e ERK serão utilizados para investigar as vias de sinalização responsáveis pela interação entre o E2 e o EGF no
controle da transcrição do PAWR e determinar a cascata de sinalização pela qual o EGF atua sobre a transcrição do
PHLDA1. Nossos resultados sugerem a existência de uma interação entre as vias de sinalização do ER e do EGF na
regulação da transcrição do PAWR, mas não do PHLDA1.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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Relação entre mutações no gene GIGYF2 e a Doença
de Parkinson
Pestana, CP1; Santos, AV1; Campos Jr, M1; Santos, JM1; Diniz, KRS1; Abdalla, CB1; Santos-Rebouças, CB1;
Pimentel, MMG1
Departamento de Genética - Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes - Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
Palavras-chave: Doença de Parkinson, GIGYF2
A doença de Parkinson (DP) é a desordem neurodegenerativa motora mais comum, com uma prevalência de,
aproximadamente, 1% entre indivíduos com mais de 60 anos de idade, aumentando para 4 a 5% entre os indivíduos
com idade superior a 85 anos. Esta condição é caracterizada pela perda seletiva dos neurônios dopaminérgicos e
pela presença de inclusões protéicas nos neurônios da substância negra, conhecidas como corpúsculos de Lewy.
Pouco se sabe sobre a etiologia e a patogênese da DP. A maioria dos casos aparece esporadicamente e podem
estar associados a diversos fatores de risco ambientais ou genéticos. Na última década, estudos de ligação têm
identificado 13 loci cromossômicos (PARK1 a PARK13) relacionados à DP. O mais recente gene associado à
disfunção dopaminérgica é o GIGYF2 (Grb10-Interacting GYF Protein) localizado no locus PARK11, em 2q36-37.
Mutações de ponto neste gene foram descritas em pacientes europeus com DP, reforçando a relação do GIGYF2
com a doença. Com o objetivo de avaliar se este gene é um fator significante de predisposição para a DP, 110
pacientes brasileiros com DP idiopática, idade de manifestação inferior a 50 anos de idade, não aparentados, de
ambos os sexos, foram triados para presença de mutações neste gene. O DNA genômico dos pacientes foi extraído
a partir do sangue periférico e a análise molecular dos exons 2, 8, 9 e 10 foi conduzida por sequenciamento direto
dos produtos da PCR. Neste estudo identificamos 6 variantes de seqüência e uma deleção, todas intrônicas, e
1 variante missense exônica. As alterações c.397 + 103C>T, c.397 + 129C>A, c.397 + 202C>T e a deleção c.171 +
180­_181delCA estão localizadas no segundo intron do gene e as alterações c.713 - 47A>G, c.713 - 59T>C, c.713
- 169T>C foram identificadas no sétimo intron. Através da análise destas variantes pela ferramenta Spliceview
vimos que apenas a deleção c.171 + 180­_181delCA pode estar influenciando o processo de encadeamento do
segundo íntron. A variante de sentido trocado c.1268C>T foi encontrada em 3 pacientes e está localizada no exon
10. Esta alteração resulta na substituição do aminoácido conservado, prolina, pelo aminoácido leucina na posição
423 da proteína. Utilizando o programa Polyphen, esta alteração foi predita ser provavelmente patogênica. Nossos
resultados corroboram os achados do primeiro estudo do gene GIGYF2 em indivíduos europeus com DP, o qual
identificou mutações possivelmente patogênicas neste gene. Desta forma, não descartamos a importância do
GIGYF2 como fator de risco para a DP, entretanto, a realização de estudos em amostras controle normais e análise
de segregação nas famílias dos pacientes é necessária para concluirmos o envolvimento de tais variantes na DP e
o papel deste gene na etiologia da doença.
Apoio Financeiro: PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ, CNPq, FAPERJ, CEPUERJ.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Investigação de mutações no gene GBA como fator
de risco para Doença de Parkinson de manifestação
precoce na população brasileira
Santos, AV1; Pestana, CP1; Almeida, RM1; Diniz, KRS1; Campos Jr, M1; Santos, JM1; Santos-Rebouças, CB1;
Pimentel, MMG1
Departamento de Genética, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
Palavras-chave: GBA, Doença de Parkinson, N370S, L444P, Glicocerebrosidase
A doença de Parkinson (DP) é a desordem neurodegenerativa motora mais freqüente no mundo, sendo
caracterizada por tremores de repouso, rigidez muscular, bradicinesia e instabilidade postural, além da perda
seletiva de neurônios dopaminérgicos, com a formação de corpúsculos de Lewy. Apesar de sua etiologia complexa,
está cada vez mais claro que fatores genéticos desempenham um papel importante na patogênese da DP. Neste
contexto, destacam-se mutações no gene da glicocerebrosidase (GBA) que têm emergido como um fator de
susceptibilidade à DP. Este gene localiza-se em 1q21 e é composto por 11 exons, que codificam a enzima lisossomal
glicocerebrosidase (EC.3.2.1.45). Neste estudo, analisamos a presença das cinco mutações mais comuns presentes
no gene GBA, em pacientes com DP de manifestação precoce, em comparação com uma amostra controle, a fim
de investigar se estas alterações constituem um fator de predisposição para esta desordem na população brasileira.
A amostra deste estudo foi composta por 110 pacientes com DP (20 casos familiares e 90 casos isolados), não
aparentados, de ambos os sexos (74 homens e 36 mulheres; faixa etária: 21 a 96 anos), que manifestaram a doença
com idade ≤50 anos [idade de manifestação (IM): 41,5 ± 7,5]. A extração do DNA foi realizada a partir de sangue
periférico ou de saliva e a presença de mutações no gene GBA foi avaliada através de PCR-RFLP e confirmadas por
sequenciamento direto dos produtos da PCR. Foram identificadas duas mutações (N370S e L444P) em 5 pacientes
(~4,5%). A mutação N370S foi identificada em 2 indivíduos do sexo masculino, sendo um deles heterozigoto e o
outro homozigoto (IM: 42 e 39 anos, respectivamente). A alteração L444P foi identificada em heterozigose em 3
pacientes, sendo dois do sexo feminino (IM: 45 e 43 anos) e um do sexo masculino (IM: 40 anos). A análise por
sequenciamento revelou que uma destas pacientes e sua irmã (IM: 51 anos), possuem, além da mutação L444P,
as variantes exônicas D409H, A456P e V460V e as variantes intrônicas c.1388+141A>G, c.1389-101C>T e c.138968T>C. A outra paciente com a mutação L444P também apresentou a variante intrônica (c.1388+141A>G). Até o
momento, nossos resultados, apóiam a hipótese de que mutações no gene GBA podem desempenhar um papel
significativo como fator de risco hereditário para o desenvolvimento da DP. Paralelamente, a análise de segregação
das mutações nas famílias dos pacientes, bem como, a análise de uma amostra controle são de extrema importância
para que possamos estabelecer o grau de relevância deste gene na etiologia da DP em nossa população.
Apoio financeiro: PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ, CNPq, FAPERJ, CEPUERJ.
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Associação de polimorfismo do gene UFD1L com idade
de acometimento da esquizofrenia
Belangero, SIN1; Ota, VKA1; Bellucco, FTS1; Christofolini, DM1; Cernach, MC2; Mari, JJ3; Bressan, RA3;
Melaragno, MI1; Araripe Neto, AGA3; Smith, MAC1
Disciplina de Genética; 2Disciplina de Biologia do Desenvolvimento do Departamento de Morfologia; 3 Departamento de Psiquiatria,
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
1
Palavras-chave: esquizofrenia, gene UFD1L, polimorfismos
A síndrome da deleção 22q11.2 representa o principal fator de risco conhecido para o desenvolvimento da
esquizofrenia. Estima-se que cerca de 25% das crianças com deleção 22q11.2 desenvolverão esquizofrenia na
adolescência ou na idade adulta. Além disso, há um aumento de 20 a 80 vezes na prevalência da deleção 22q11.2
em pacientes com esquizofrenia em relação à da população geral. Os genes de 22q11.2, que potencialmente podem
estar envolvidos na gênese da esquizofrenia, são genes relacionados ao neurodesenvolvimento e à maturação
cerebral. Assim, mutações nesses genes poderiam determinar alterações neuroestruturais nas substâncias cinzenta
e branca, importantes na fisiopatologia da esquizofrenia. O gene UFD1L (Ubiquitin Fusion Degradation 1-Like),
localizado na região 22q11.2, codifica uma proteína envolvida em uma via metabólica da degradação de proteínas
ubiquitina-dependentes. Dados da literatura revelaram associação do alelo A do polimorfismo rs5992403 do gene
UFD1L com a esquizofrenia, em relação a indivíduos controles. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar
130 pacientes com esquizofrenia quanto ao polimorfismo rs5992403 do gene UFD1L em relação à idade de início
da doença uma vez que tem sido sugerido que fatores genéticos contribuem para a idade de acometimento de
sintomas psicóticos em indivíduos com esquizofrenia. Para tanto, os pacientes foram divididos em três grupos de
acordo com a idade de acometimento da doença (Grupo I: até 18 anos, Grupo II: de 18 a 28 anos e Grupo III: mais
de 28 anos). A genotipagem foi realizada por meio da técnica de RFLP. Para a análise estatística foi utilizado o teste
de qui-quadrado. Comparando-se os três diferentes genótipos desse polimorfismo e os grupos, foi observada uma
tendência de associação (p = 0,069). Ao analisar os alelos individualmente com a idade de acometimento, também
foi detectada associação, sendo que o alelo A estava mais presente em indivíduos do grupo I (p = 0,025). Assim,
o alelo A seria mais frequente em indivíduos que desenvolveram a doença até os 18 anos enquanto que o alelo G
predomina nos que desenvolveram a doença após os 28 anos. Esses dados sugerem que o alelo A seria um fator de
risco para esquizofrenia, uma vez que contribui para o acometimento precoce da doença. A análise em relação à
idade de acometimento ainda é preliminar, mas já sugere um papel desse polimorfismo na contribuição genética
para a esquizofrenia.
Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES
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Searching for new genetic risk factors for
neuropsychiatric disorders in expression databases
Oliveira, JRM1,2; Lemos, RR1; Souza, MBR1; Castelletti, CH1; Gomes da Cunha, JE1; Marques, ET3,4; Lima
Filho, JL1
1-Keizo Asami Laboratory (LIKA) – Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil.
2-Neuropsychiatry Department - Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil.
3-Virology and Experimental Therapy Laboratory, Aggeu Magalhães Research Center, CPqAM/FIOCRUZ, Recife, Brazil
4-The Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD, USA
[email protected]
Keywords: genetic variations, Bioinformatics, expression databases, neuropsychiatric disorders; neurogenetics
Genetic variations might contribute to differences in protein activities and gene expression levels observed in
complex genetic traits, like neuropsychiatric disease. This finding motivated the development of original approaches
using expression studies to guide the finding of new genetic variations, which might include SNPs, deletions and
insertions of a few base pairs, microdeletions or even major chromosomal changes. In this analysis we extended
this approach to new genes selected from microarrays studies of brain samples of patients with Alzheimer diseaseAD (CA1 and Inferior parietal lobe), major depressive disorder-MDD (anterior cingulated cortex), bipolar affective
disorder-BPD (left dorsolateral prefrontal cortex) and sporadic Creutfeldt-Jakob disease-CJD (prefontal cortex). The
CLCbio Workbench Combined® version 3.6.2. was initially used to build ESTs and mRNA files retrieved respectively
from the Goldenpath (UCSC) and NCBI databases and latter to perform multiple batches of Smith-Waterman
alignments. The total of 542 ESTs sequences were selected after proper stringent parameters were applied to the
first set of mismatches. The annotation revealed various classes of variations, most of them deletions (569), but also
transitions (253), transversions (52), synonymous (51), non synonymous (502) and SNPs in UTRs (57). Deletions
ranging from 1 to 10 pb were the most common finding and were present in coding regions 5’ and 3’UTR regions.
Deletions are often associated to major genetic syndromes with dysmorphic features, however, various recent
studies show that common micro-deletions might be highly associated with common neuropsychiatric disorders
such as schizophrenia, autism, mental retardation or even in various ethnicities, detected in whole genome
sequencing experiments.
Funding: FACEPE, CNPq, CAPES, Propesq-UFPE.
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150
Val66Met polymorphism on BDNF gene: frequencies in
patients with Huntington disease and normal controls
Gheno, TC1,2; Kiehl, MF1,3; Jardim, LB1,4; Saraiva-Pereira, ML1,2,3
1) Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisa Experimental e Serviço de Genética Médica – Hospital de Clínicas de Porto
Alegre, Porto Alegre, Brazil.
2) Departamento de Bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.
3) Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.
4) Departamento de Medicina Interna – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.
Keywords: Huntington disease, BDNF gene, Val66Met, TaqMan, CAG expansion.
Huntington disease (HD) is a neurodegenerative disorder of autosomal dominant trait caused by an unstable CAG
repeat expansion in the IT15 gene. HD onset is in adulthood age and is mainly related to length of CAG expansion
tract. However, others factors might influence the beginning of symptoms manifestations. Among them, brainderived neurotrofic factor (BDNF) has been reported to play an important role in modulating age at onset (AO)
and the severity of motor dysfunction by controlling survival of striatal projection neurons. The aim of this work
was to determine frequency of Val66Met polymorphism on bdnf gene in patients with HD and normal controls.
We have studied 53 patients and 100 normal controls. Number of CAG repeats in the IT15 gene was determined by
PCR using fluorescent primers followed by capillary electrophoresis in ABI 3130xl equipment in all samples tested
in this study. Val66Met polymorphism of bdnf gene was performed using TaqMan® system assay (rs6265). Alleles
distribution was as follows: 86 Val and 22 Met in the group of HD patients and 173 Val and 27 Met in controls.
Frequencies of Val and Met alleles were then established to be 0.79 and 0.21 in HD, and 0.86 and 0.14 in controls,
respectively. Frequencies of Val66Val, Val66Met and Met66Met genotypes were established to be 0.66, 0.26 and
0.08 in patients with HD and 0.74, 0.25 and 0.01 in controls. These frequencies were compared and no statistically
significant difference in bdnf genotypes was observed between patients with HD and controls. According to our
data, there is no difference in frequencies of bdnf Val66Met polymorphism in HD and controls. These data indicate
that this polymorphism do not as a genetic modifier in our sample of patients with HD. However, additional studies
are required to further investigate effects of other polymorphisms on bdnf gene or functional studies of BDNF
protein on HD phenotype.
Financial support: CNPq, PIBIC-UFRGS, FAPERGS.
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Diagnóstico molecular de doença de Huntington (HD)
em paciente já confirmado por diagnóstico clínico
e neurológico no município de Linhares – ES
Soares, LA¹; Nunes, RRA²; Freitas, WR³
¹Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Ciências Biomédicas do Espírito Santo – Faculdade Pio XII.
²Laboratório de Genética Animal da Universidade Federal do Espírito Santo – UFES.
³Universidade Estadual do Norte Fluminense - UENF
Palavras-chave: Doença de Huntington, Neurodegenerativa, Movimentos, Coréia, IT15
A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa, de ordem gênica com padrão autossômico
dominante de repetição. Ela envolve a síntese da proteína Huntingtina que é expressa pelo gene IT15, localizado no
cromossomo 4, braço curto, lócus 16 (4p16), sendo que esse produz 3.144 aminoácidos. Em geral, a doença começa
a manifestar os seus sintomas clínicos após a idade fértil (em torno dos 40 anos), o que torna o diagnóstico tardio.
Outro fator de interesse na doença é que a mesma tem a tendência de levar os seus afetados a mudança súbita de
humor, distúrbios psíquicos, resultando, assim, em um grande número de suicídios. A verificação da HD pode ser
realizada de forma preditiva (quando não se encontram sinais e sintomas) ou diagnóstica (quando há caso próximo
na família, com apresentação dos primeiros sintomas). Visando essas considerações o presente trabalho apresenta
um panorama da HD, com sua sintomatologia, aspectos genéticos, epidemiologia e tratamento. O mesmo descreve
o caso clínico de um paciente, sexo feminino, de 66 anos de idade, com apresentação dos primeiros sinais clínicos
aos 51 anos, em conjunto da análise do heredograma da família da paciente. Em pacientes considerados normais
encontram-se de 9 a 35 repetições da trinca de nucleotídeos CAG (Citosina – Adenosina – Guanina), com média de
19. Já no presente estudo, revelaram-se 42 trincas de nucleotídeos CAG, responsáveis pela mutação nessa paciente
e conseqüente diagnóstico positivo para HD. Outro fator discutido foi o possível motivo pelo qual a paciente
apresenta maior prognóstico da doença do que seus irmãos já falecidos, correlacionando com o número de trincas
CAG, que é relatado em algumas literaturas. A HD, como uma doença neurodegenerativa de expressão tardia
apresenta seus principais agravantes na quantificação das trincas de nucleotídeos CAG. Pacientes com maior
quantidade desses nucleotídeos podem apresentar aumento na intensidade dos sinais clínicos e antecipação no
aparecimento desses. Entretanto, mais importante que essa quantidade, é o paradigma existente no diagnóstico
de uma pessoa não afetada, mas com parentes geneticamente afetados.
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Regulation of transcription in Huntington’s disease
Denovan-Wright, EM; Hogel, M; Alves-Costa, FA
Department of Pharmacology, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada, B3H 1X5
Keywords: Huntington’s disease, Gene expression, Gene regulation, Promoter analysis, LInker-scanning mutagenesis
Huntington’s disease (HD) is caused by the inheritance of one copy of mutant huntingtin, which encodes huntingtin
protein containing a polyglutamine repeat within the amino terminus. Over decades, many changes occur in cells
of the brain and body of HD patients during the long, slow and unrelenting progression of this physically, mentally
and intellectually devastating disease. One of the earliest detectable changes during progression of the disease is
a decrease in transcription of specific genes in distinct regions of the brain. Based on the nuclear accumulation of
N-terminal mutant huntingtin (N-mHtt) and the demonstration that mHtt can physically associate with a large
number of proteins, it has been hypothesized that N-mHtt interacts with transcription factors, co-activators and
components of the basal transcription machinery to repress transcription. It is not known N-mHtt affects specific
genes but not others. We have defined the spatial distribution, onset and rate of decline, and final steady-state
mRNA levels of several genes that are affected by N-mHtt in young transgenic HD mice and other genes that
are resistant to N-mHtt. In vivo cell-type-specific promoters, transcription start sites, and the effect of N-mHtt on
promoter and start site utilization were defined for several genes. Using deletion analysis, we mapped the general
promoter regions affected by mHtt in striatal cell lines stably transfected with mHtt and in cells that transiently
expressed N-mHtt with different CAG repeat lengths. Comparison of the minimal promoters that were active and
affected by N-mHtt revealed that there were no common transcription factor recognition elements among these
promoters that were absent from N-mHtt-resistant promoters. Based on this evidence, it did not appear that single
transcription factors conferred N-mHtt-dependent regulation. We directly tested whether N-mHtt binds to and
sequesters transcription factors from promoters. There were no differences in DNA-binding activity of transcription
factors as measured by in vitro DNase I footprinting or by an extensive survey of the activity of 350 transcription
factors in gel-shift analysis. N-mHtt did not directly bind DNA nor did it bind to any of the transcription factors
tested, which would have resulted in a larger protein/DNA complex in EMSA in the presence of mHtt, similar to
what would be observed in a supershift assay. Collectively, our data do not support the widely held hypothesis that
N-mHtt sequesters transcription factors from promoters. Currently, we are defining gene-specific transcriptional
complexes that interact with N-mHtt protein and decrease transcription of specific promoters in vivo and in cell
culture models of HD.
Support: CIHR
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Análise dos genes Gabbr1 e Gabbr2 em um modelo
animal de dependência etílica
Frozino, AR; 2Chiavegatto, S;3Correia, D; 3Boerngen-Lacerda, R; 1Brunialti Godard, AL
1
Departamento de Farmacologia-UFPR/PR 2Departamento de Farmacologia-USP/SP
Departamento de Biologia Geral-ICB-UFMG/MG.
3
1
Objetivo: O receptor GABAB, que compõe a principal via neurotransmissora inibitória do cérebro, é formado
pelas subunidades codificadas pelos genes Gabbr1 e Gabbr2 e parece sofrer modulação pelo efeito do etanol. Além
disso, o uso do agonista desse receptor tem demonstrado eficácia em reduzir o consumo voluntário de etanol em
humanos e ratos, evidenciando uma possível relação com o comportamento de dependência. Na tentativa de
se delinear o envolvimento desses genes nessa patologia foram avaliados os níveis de seus transcritos no córtex
pré-frontal, hipocampo, estriado e hipotálamo de animais expostos a um tratamento por livre escolha. Métodos:
Camundongos heterogêneos Swiss, machos, 20-30g, foram alojados individualmente e expostos a um modelo de
dependência dividido em 4 fases: 1.Aquisição (10 semanas, se) entre água, etanol 5% ou 10% v/v; 2.Abstinência (2
se); 3.Reapresentação das soluções etílicas (2 se); 4.Adulteração com quinino das soluções etílicas (2 se). Um grupo
controle (C) teve acesso apenas à água. Após, os camundongos foram classificados conforme o consumo individual
das soluções etílicas: consumidor adicto (grupo A: preferência pelo etanol, consumo de etanol g/kg alto e sem
queda), consumidor pesado (grupo P: preferência pelo etanol, consumo de etanol g/kg alto com queda), consumidor
leve (grupo L: preferência pela água, consumo de etanol g/kg baixo). Após, os animais foram eutanasiados e as
regiões foram dissecadas. O RNA total foi extraído com TRizol® e os cDNAs confeccionados conforme protocolo do
fabricante (Invitrogen®) utilizando oligo(dT). A integridade do RNA foi averiguada visualmente por gel de agarose
2% e a razão 260/280nm foi mantida acima de 1,7. Os níveis de transcritos foram quantificados por PCR em tempo
real utilizando SYBR® Green com iniciadores desenhados para anelarem em éxons diferentes. Foram utilizados 3
genes (B-actina, Gadph, Ciclofilina) para normalização dos dados e subseqüente quantificação relativa. Resultados:
o grupo A apresentou maior nível normalizado de mRNA para ambos os genes no córtex (Gabbr1=A:1,33; P:0,62;
L:0,55; C:0,35; Gabbr2=A:0,96; P:0,11; L:0,74; C:0,37,p<0,05) e no estriado apenas para o Gabbr1 (A:1,74; P:0,64; L:0,64;
C:0,86,p<0,05). No hipocampo, o grupo A teve menor nível normalizado de mRNA do Gabbr1 (A:0,36; P:0,75; L:0,82;
C:0,53,p<0,10) atingindo significância apenas para o Gabbr2 (A:0,11; P:0,45; L:0,94; C:0,71,p<0,05). Não foi observada
diferença na região do hipotálamo, (ANOVA-Newmann Keuls). Conclusão: Os animais do grupo A apresentaram
alteração nos níveis de mRNA dos genes Gabbr1 e Gabbr2 em áreas cerebrais importantes para a dependência. Isso
denota uma estreita relação com a manutenção do comportamento de procura pela droga e não apenas com um
consumo elevado do etanol, uma vez que nenhuma alteração foi observada nos animais do grupo P.
Apoio Financeiro: CNPQ - FAPEMIG
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Rastreamento de mutações no gene JARID1C
em homens com retardo mental idiopático
Fintelman-Rodrigues, N; Campos Jr, M; Santos, JM; Pimentel, MMG; Santos-Rebouças, CB.
Departamento de Genética - Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes - Universidade do Estado do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: JARID1C, RMLX, cromossomo X, epigenética, mutação sem sentido.
O retardo mental (RM) é caracterizado por um funcionamento intelectual significantemente abaixo da média, com
limitações em pelo menos duas áreas das habilidades adaptativas ou cognitivas aplicáveis: comunicação, cuidado
consigo mesmo, convivência em casa, habilidades sociais, vida em comunidade, orientação, saúde e segurança,
faculdades funcionais, lazer e trabalho. A prevalência de RM varia entre estudos epidemiológicos, sendo estimada
em 2-3% da população mundial, constituindo, assim, um dos mais importantes problemas de saúde pública.
Apesar dos recentes avanços nos instrumentos de investigação, a etiologia do RM permanece desconhecida em
30 a 50% dos casos. Entretanto, há um consenso geral de que o RM é mais comum no sexo masculino, um achado
atribuído às numerosas mutações nos genes encontrados no cromossomo X, levando ao retardo mental ligado
ao X (RMLX). Dentre os genes presentes no cromossomo X o Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) foi
recentemente identificado como um potencial candidato a causador de RM, quando mutado. O JARID1C é um gene
evolutivamente conservado localizado em Xp11.22, que codifica uma proteína que atua como uma desmetilase da
lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Neste estudo, investigamos mutações
no gene JARID1C através do rastreamento do exon 15, um dos mais comumente mutados, em 97 homens de
famílias com RM provavelmente ligado ao X, nas quais pelo menos dois homens afetados estavam presentes. O
DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e as amostras foram amplificadas pela técnica de PCR,
seguida da análise por seqüenciamento direto bidirecional. Foram identificadas duas variantes de seqüência
entre os 97 pacientes analisados. A primeira é a variante intrônica 2243+11 G>T, que esteve presente em 76 (78%)
dos pacientes analisados. A segunda variante foi a mutação sem sentido c.2172C>A, que introduz um códon de
parada pré-maturo na posição 724 da proteína (p.Cys724X). Até o momento, a mutação c.2172C>A não havia sido
encontrada em meninos com RMLX. Este trabalho expande o número de mutações conhecidas no gene JARID1C
e reforça a importância da triagem de mutações neste gene em homens portadores de retardo mental familiar de
origem idiopática.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ, CEPUERJ.
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Mapeamento de deficiência mental sindrômica de herança
ligada ao cromossomo X e busca do gene mutado
Oliveira-Santos, J; Vieira LCZ; Vianna-Morgante, AM
Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo,
São Paulo, SP
[email protected]
Palavras-chave: Retardo Mental, Cromossomo X, Array CGH, Microssatélites, Genes Candidatos
Estima-se que cerca de 10% dos casos de deficiência mental no sexo masculino sejam causados por mutações em
genes localizados no cromossomo X. Entretanto, os genes do cromossomo X até o momento relacionados a DM,
com exceção de alguns poucos, são responsáveis cada um deles por pequena fração dos casos, restando, portanto
identificar genes que possam explicar os 10% de DM de herança ligada ao X. Numa família em que a DM sindrômica
é transmitida segundo padrão compatível com a herança recessiva ligada ao X, identificamos uma microdeleção
em Xp11.23, utilizando hibridação genômica comparativa com um array de clones espaçados aproximadamente
1 Mb. A deleção segregava com a DM na família. Com a utilização de marcadores do tipo microssatélite e SNP
a extensão máxima dessa deleção foi delimitada em 124 Kb. Os genes contidos nesse segmento SSX6, SPACA5,
ZNF182 e ZNF630 foram considerados candidatos para a DM na família. Entretanto, a região em que a deleção
foi mapeada contém variação de número de cópias (CNV) e a deleção detectada foi encontrada também em
homens fenotipicamente normais. Esses achados nos levaram a indagar outros segmentos do cromossomo X
como responsáveis pela DM na família. Inicialmente consideramos candidato o gene ZNF81, já relacionado a
DM e localizado próximo ao segmento deletado. O seqüenciamento da região traduzida desse gene não revelou
alterações patogênicas. A estratégia seguinte foi o mapeamento da DM utilizando marcadores de microssatélites
distribuídos ao longo do cromossomo X. A estrutura da família não permitia o estudo clássico de ligação e utilizamos
o mapeamento por exclusão. Um segmento de aproximadamente 17 Mb herdado pelos afetados de um ancestral
comum foi identificado entre Xp11.22 e Xp21.1, incluindo, portanto, a microdeleção. Dentre aproximadamente
150 genes não deletados situados nesse segmento, consideramos como principais candidatos PQBP-1, SDSX,
FGD1, HADH2, SYN1 e JARID1C, baseando-se no fato de serem genes já relacionados a DM ou de serem expressos
em cérebro e leucócitos. Esse último critério de inclusão decorreu da observação de inativação completamente
desviada do cromossomo X em mulher portadora certa da mutação causadora de DM na família, o que permite
deduzir que haja seleção contra as células em que a mutação está ativa. Esse padrão de inativação é freqüente em
mulheres portadoras de mutações causadoras de DM com herança recessiva ligada ao X.
Apoio Financeiro: CAPES
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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156
Avaliação da contribuiçâo de mutações
no cromossomo X para a deficiência mental baseada
no padrão de inativaçâo do cromossomo X em mães
de homens afetados
Coqueti, KN; Otto, PA; Morgante, AMV.
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva - Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: inativação do cromossomo X, deficiência mental ligada ao cromossomo X, desvio de inativação.
A inativação de um dos cromossomos X é um processo aleatório que ocorre nas células somáticas das fêmeas
de mamíferos no início do desenvolvimento embrionário, como mecanismo de compensação, entre os sexos, da
dose dos produtos codificados pelos genes do cromossomo X. Em mulheres certamente portadoras de mutações
causadoras de deficiência mental (DM) de herança recessiva ligada ao X, verificou-se aumento significativo de
desvio em relação à inativação aleatória 50:50, 30% delas apresentando padrão de inativação ≥ 90:10, em sangue
periférico, contra 2% desse padrão entre mulheres não portadoras (Plenge e col. 2002; Am J Hum Genet 71:168).
A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com o gene normal está ativo explica esse desvio
do esperado. Com base nas freqüências da síndrome do cromossomo X frágil entre famílias em que a DM tem
herança recessiva ligada ao X (25%) e entre homens com DM (2,5%), estima-se que 10% da DM no sexo masculino
decorram de mutações no cromossomo X. Entretanto, essa freqüência está longe de explicar o excesso de 30%
de homens em relação a mulheres com DM. Neste estudo utilizamos o padrão de inativação do cromossomo X
das mães de afetados como parâmetro para avaliar a freqüência de DM causada por mutações no cromossomo X
no sexo masculino. Selecionamos 76 pacientes do sexo masculino, casos isolados de DM, com cariótipo normal
e teste molecular negativo para a síndrome do cromossomo X frágil, cujas genitoras se mostraram heterozigotas
quanto à repetição CAG do gene AR; o padrão de metilação dos alelos nesse lócus foi utilizado para determinar
o padrão de inativação do X nessas mulheres. Doze delas (16%) mostraram desvio total de inativação (100:0),
frequência muito acima do esperado em relação à freqüência < 2% desse desvio entre mulheres da população
geral. Diante da tendência de as mulheres mais velhas apresentarem maior freqüência de desvio de inativação do
X, comparamos as idades das mulheres com desvio total (média 39±7,11) com as daquelas que não apresentaram
esse desvio (média 37.7±8,82) e a diferença não foi significativa (Kruskal-Wallis: P = 0,65). Admitindo que todas
as mulheres com desvio total da inativação do X são portadoras de mutações causadoras de DM em genes do
cromossomo X, presentes em seus filhos, a frequência de DM ligada ao X, em nossa amostra de 76 pacientes, não
incluindo a síndrome do cromossomo X frágil, é de 16% (IC 95% = 0,083 –0,256). Essa frequência, entretanto pode
ser uma subestimativa, diante da observação de que apenas cerca de um terço das portadoras dessas mutações
apresentam padrão de inativação do cromossomo X com desvio extremo.
Apoio financeiro: FAPESP (CEPID 9814254-2) e CNPq (Bolsa de Mestrado)
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157
X-linked genetic factors associated with mental
retardation in brazilian males: analysis of MECP2, ARX,
FMR1 and FMR2 genes
Campos Jr, M; Santos, JM; Abdalla-Carvalho, CB; Santos AV; Pestana, CP; Diniz, KRS; Santos-Rebouças,
CB; Pimentel, MMG.
Serviço de Genética Humana, Departamento de Genética, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil.
Keywords: XLMR; mental retardation; MECP2; FMR1; FMR2; ARX
More than 280 genes have been associated with mental retardation (MR) and a significant part is located in the
X chromosome, which presents a particular high concentration of genes involved in cerebral development and
function. Among these genes, the MECP2, ARX, FMR1 and FMR2 were reported to be of particular research interest.
In this study we have accessed the individual contribution of mutations in each of these genes as a cause of MR in
males. Trinucleotide repeat expansions in the FMR1 and FMR2 genes were analyzed by PCR methods previously
described. The analysis of point mutations in the other genes was performed by direct sequencing of the PCR
products and by SSCP analysis. For the submicroscopic duplication screening, we have established a quantitative
PCR method to measure the relative MECP2 copy number. Through the screening of 825 male patients for FRAXA
expansions, 69 individuals with the expanded allele were identified, representing approximately 8% of the tested
sample. Four small deletions were also found within the 5’UTR of the FMR1. The patients that were negative were
divided into groups selected by particular clinical features additional to MR and analyzed for mutations in MECP2,
ARX, and FMR2. No trinucleotide expansion in the FMR2 gene was found in a sample of 116 patients, however,
one deletion within the 5’UTR was observed (~0,9%). The analysis of the ARX gene in 202 patients revealed one
pathogenic small duplication (~0,5%). Lastly, three potentially pathogenic mutations were identified by sequencing
of the MECP2 gene in 285 patients (~1%), however, duplications of the entire MECP2 gene causing its overexpression
were observed in 2% of the analyzed individuals (3/150). In conclusion, of the tested genes, trinucleotide expansion
in the FMR1 was the most frequent cause of MR in Brazilian males as reported also for other populations. In
patients negative for FMR1 expansions, the recently described whole MECP2 gene duplications accounted for 2%
of the cases, representing also a significant cause of MR in our population in contrast to point mutations in MECP2
and ARX genes.
Acknowledgements: CAPES; CNPq; FAPERJ; CEPUERJ;
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Aspectos estruturais, funcionais e de dinâmica
molecular da Hb S-São Paulo [b6 (A3) GluàVal; b65 (E5)
LisàGlu] – uma nova variante da hemoglobina humana
Jorge, SEDC1; Kimura, EM1; Oliveira, DM1; Suemasu, CN1; Caire, L2; Martinez, L2; Costa, FF3, Skaf, MS2;
Sonati, MF1.
Laboratório de Hemoglobinopatias- Depto. de Patologia Clínica- FCM-UNICAMP
Laboratório de Dinâmica Molecular- Depto. de Físico-Química- IQ- UNICAMP
3
Centro de Hematologia e Hemoterapia- UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hemoglobinopatias hereditárias, variante estrutural, beta globina, HbS, população brasileira
A HbS [b6 (A3) GluàVal], da anemia falciforme, é a variante estrutural da hemoglobina humana mais conhecida.
Nós descrevemos aqui uma nova variante de cadeias beta que além da substituição GluàVal (GAGàGTG) na
posição 6 tem também a substituição LisàGlu (AAGàGAG) na posição 65 da mesma cadeia. De acordo com a
origem de seu portador, ela foi denominada Hb S-São Paulo. O paciente é uma criança do sexo masculino, de 18
meses de idade, com os seguintes dados hematológicos: GV=3,97(106/mm3), Hb=9,4g/dL, Ht=29,9%, VCM=75,3fL,
HCM=23,7pg, RDW=18,8%, reticulócitos=1,51%. Na eletroforese de Hb em pH alcalino essa Hb variante migrou
mais rápido que a Hb A, e em pH ácido (gel de ágar) apresentou mobilidade eletroforética semelhante à Hb S. Na
focalização isoelétrica uma banda mais rápida foi observada (pi= 6,68), além das Hb A (pi=6,91), Hb F(pi=6,98) e
Hb A2 (pi=7,54). O teste de solubilidade foi compatível com a heterozigose da Hb S e a quantificação desta variante
foi de 29.6%, a qual eluiu como Hb D, na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de troca catiônica (HPLC). Na
HPLC de Fase Reversa (RP-HPLC), além das cadeias globínicas normais, detectou-se uma cadeia beta anômala
(RT=50,331 minutos). Funcionalmente, essa variante mostrou afinidade reduzida pelo O2, diferentemente da Hb S.
O sequenciamento do gene beta identificou duas mutações diferentes, nos códons correspondentes às posições
6 e 65 da cadeia beta. Metodologia computacional para estudo de dinâmica molecular da variante protéica, feita
a partir da forma nativa da hemoglobina depositada no Protein Data Bank, demonstrou que a mutação beta-65
altera a estrutura da globina e dificulta a entrada de oxigênio, favorecendo a forma desoxigenada da molécula.
A caracterização completa desta variante é de suma importância uma vez que a reduzida afinidade pelo O2,
conferida pela mutação beta-65, pode facilitar a polimerização da hemoglobina e, consequentemente, levar a uma
crise de falcização a um indivíduo heterozigoto.
Suporte financeiro: FAPESP/CNPq
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Caracterização de cinco novas deleções
alfa-talassêmicas por MLPA
(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
Suemasu, CN1; Kimura, EM1; Oliveira, DM1; Bezerra, MAC2; Costa, FF2; Sonati, MF1
Laboratório de Hemoglobinopatias, Departamento de Patologia Clínica-Faculdade de Ciências Médicas–UNICAMP
Centro de Hematologia e Hemoterapia-HEMOCENTRO-UNICAMP
1
2
Palavras-chave: talassemia alfa, MLPA, deleção, doença da Hb H.
A talassemia alfa constitui um grupo de doenças hereditárias causadas pela deficiência de síntese das cadeias alfa
da hemoglobina. Os genes dessas cadeias são duplicados (alfa-2 e alfa-1) e estão localizados em 16p13.3, próximos à
região telomérica. As deleções são as principais causas da doença, podendo afetar um ou ambos os genes no genoma
haplóide ( formas alfa+ e alfa0, respectivamente). A gap-PCR é a técnica mais utilizada na detecção das deleções
mais comuns, mas as deleções novas e raras, especialmente aquelas de grande extensão, não são identificadas,
permanecendo os seus portadores sem um diagnóstico definitivo. Nós caracterizamos cinco novas deleções
alfa-talassêmicas (todas alfa0), em indivíduos não relacionados, empregando a técnica de MLPA, recentemente
adaptada ao estudo das hemoglobinopatias. Para isso, foram utilizadas 45 sondas, cujos comprimentos variaram
de 94 a 409 pb. Quatro dos casos estudados são de pacientes com doença da Hb H em que a deleção alfa0 encontrase associada à deleção alfa+3,7, identificada pela metodologia convencional. Um é de heterozigose simples da
talassemia alfa0. Em quatro casos as deleções comprometem uma região de grande extensão que inclui todo o
cluster alfa e seu principal elemento regulatório (alfa-Major Regulatory Element), duas delas entre o telômero e
a posição 171054 do UCSC Genome Browser, removendo minimamente 170 kb de DNA, e as outras duas entre o
telômero e as posições 451410 e 583598 (tamanhos entre 190 e 450 e 450 e 580 kb, respectivamente). Em um caso,
a deleção remove somente o alfa-MRE, deixando os genes alfa intactos, porém sem expressão (entre as posições
43625 - 132952 do UCSC Genome Browser). Sondas adicionais serão desenhadas e empregadas para um maior
refinamento da extensão e na tentativa de caracterização dos breakpoints das novas deleções encontradas.
Suporte Financeiro: FAPESP/CAPES.
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160
Envolvimento de polimorfismos do gene da lectina de
ligação à manose em pacientes com anemia falciforme
Santos, BP¹; Silla, LM da R2; Silva, MAL da2; Vargas, AE¹; Chies JAB¹
¹Laboratório de Imunogenética, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) – RS – Brasil
2
Serviço de Hematologia e Transplante de Medula Óssea do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) – RS - Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Haplótipo, Hemoglobinopatia, Imunidade inata, Inflamação, Sistema complemento.
Anemia falciforme (SCD) é uma doença determinada pela homozigose do gene da hemoglobina S e apresenta
uma ampla variedade de sintomas que não pode ser explicada somente pela mutação no gene da β-globina. Nos
últimos anos têm se cogitado que fatores inflamatórios poderiam interferir na gravidade dos sintomas da SCD. Para
contribuir na identificação de fatores genéticos que modulam esse perfil, estudamos o gene da lectina de ligação
à manose (MBL), uma importante proteína sérica envolvida na imunidade inata e que participa no combate a
infecções e promoção da inflamação. Neste trabalho analisamos os seguintes SNPs: na região promotora, variante
H (rs11003125), na posição -550; variante X (rs7096206), na posição -221; e no éxon 1, variante D (rs5030737), que
troca uma arginina por uma cisteína no aminoácido 52; variante B (rs1800450), que troca uma glicina por um
aspartato no aminoácido 54; variante C, que troca uma glicina por glutamato no aminoácido 57 (rs1800451). A
nomenclatura de alelo A é usada para a condição selvagem simultânea nos três SNPs do éxon 1 citados, e alelo O
refere-se à presença de qualquer uma das variantes. Foram analisados 97 pacientes afrodescendentes com SCD (50
homens e 47 mulheres) e 96 indivíduos controle afrodescendentes, saudáveis, doadores de sangue. As variantes do
promotor foram genotipadas por PCR alelo-específico e visualizadas em gel de agarose 2% enquanto que as outras
variantes foram genotipadas por PCR-RFLP e visualizadas em gel de acrilamida 6%. Os haplótipos promotor-éxon
foram montados de acordo com o desequilíbrio de ligação apresentado entre as variantes. As frequências das
diferentes variantes alélicas foram, nos controles 0,196; 0,220; 0,025; 0,076; 0,134 e nos pacientes SCD, 0,224; 0,161;
0,026; 0,083; 0,160, respectivamente para as variantes H, X, D, B e C. Nossos resultados sugerem que as variantes
avaliadas não estão diretamente associadas a manifestações clínicas severas (classificação baseada na freqüência
de crises vaso-oclusivas) e infecções em pacientes com SCD. Porém, mostram uma nítida diferença em relação ao
gênero do paciente: a freqüência da variante H está aumentada nos homens com SCD (P=0,011) e diminuída em
mulheres SCD (P=0,033) quando comparados aos respectivos controles saudáveis. A comparação entre homens
e mulheres SCD revelou uma menor freqüência do alelo O em homens SCD (P=0,036). Quando separamos os
haplótipos de acordo com os níveis séricos de MBL, conforme literatura, vimos que os homens possuem uma
maior freqüência de haplótipos relacionados a níveis séricos mais elevados (P=0,028). Mais estudos devem ser
realizados para avaliar o papel dessas variantes em outras características clínicas da SCD bem como o papel de
outros genes que modulam respostas imunológicas.
Apoio financeiro: Edital MCT/CNPq/MS-SCTIE-DECIT – Nº 026/2006.
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161
Analysis of the role of PEDF gene polymorphism in the
sickle cell retinopathy
Cruz, PRS1; Sonati, MF2; Costa, FF3; Gil, GP1; Tavares, A1; Zaccariotto, TR2; Mitsuushi, FN4; Melo, MB1
Human Genetics Laboratory – Center of Molecular Biology and Genetic Engineering – CBMEG, State University of Campinas, Campinas,
São Paulo, Brazil.
2
Clinical Pathology Department, Faculty of Medical Sciences – FCM, University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
3
Hemocentro - University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
4
Otorhinolaryngology and oftalmology Department, Faculty of Medical Sciences – FCM, University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
1
Keywords: Sickle, Cell, Retinopathy, Polymorphism, Angiogenesis
The ocular manifestations in sickle cell disease are represented by orbital, conjunctival, uveal, papillary and retinal
changes. Retinopathy account for most cases of progressive vision loss in the affected individuals, especially in the
proliferative form, characterized by pre-retinal neovascularization, which may result in retinal detachment. Recent
studies indicate that this phenomenon is mediated by the balance between angiogenic and antiangiogenic factors.
This study evaluates a polymorphism in the PEDF gene (SNP -358G/A), that encodes for an antiangiogenic factor, and
its relation to the development of sickle cell retinopathy. The investigation was performed by means of PCR-RFLP
(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) in 55 individuals with sickle cell anemia
and hemoglobinopathy SC, of which 13 were diagnosed with sickle cell retinopathy. The polymorphism was observed
in one non-affected individual. The data so far suggests that this variation is not common in Brazilian population.
Support: PIBIC
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162
Haplótipos Beta S e Talassemia lfa em pacientes com
anemia falciforme de Porto Alegre, RS
Lindenau, JD1; Wagner, SC1,2; Gonzalez, TP1; Santin, AP3; Castro, SM3; Hutz, MH1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências,
Centro Universitário Feevale – NH
3
Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anemia falciforme, haplótipos, Hb S, talassemia alfa, hemoglobina
A anemia falciforme é causada pela homozigose da hemoglobina S (Hb S), que é o resultado de uma única
mutação no sexto códon do gene da globina beta. Os genes que codificam a cadeia beta da globina encontram-se
em um agrupamento que inclui 5 genes expressos diferencialmente ao longo do desenvolvimento e também dois
pseudogenes. Diversos polimorfismos foram descritos neste agrupamento e é observada a existência de haplótipos
que, associado com fatores genéticos (tais como a talassemia alfa e níveis de hemoglobina fetal) e ambientais,
contribuem para a variabilidade clínica da anemia falciforme. Cinco haplótipos principais são descritos,
denominados de acordo com suas diferentes origens geográficas: Bantu, Benin, Senegal, Camarões e Árabe-Indiano.
As talassemias alfa se caracterizam pela diminuição ou ausência da produção de cadeias alfa-globínicas como
resultado de mutações de ponto ou deleções nos genes da globina alfa. A mutação mais freqüente em populações
mediterrâneas e africanas é -a3,7. O objetivo desse trabalho é determinar a prevalência destes haplótipos e das
principais deleções que causam a talassemia alfa em 110 pacientes com anemia falciforme no Estado do Rio
Grande do Sul. A amostra é constituída de indivíduos encaminhados para confirmação diagnóstica pelo Serviço
de Referência em Triagem Neonatal do Estado do Rio Grande do Sul ou por médicos e serviços de saúde. O DNA
foi extraído pelo método de salting out a partir de sangue periférico, a determinação dos haplótipos foi realizada
por PCR-RFLP, através da análise de 5 sítios polimórficos. As deleções que determinam a talassemia alfa (-a3,7, -a4,2,
-a20,5, -SEA e –MED) foram identificadas através de PCR-multiplex. O haplótipo Bantu foi o mais frequente (67,3%),
seguido pelos haplótipos Benin (25%), Camarões (0,9%) e Senegal (0,5%). Além disso, 6,4% dos cromossomos não
apresentaram padrões de clivagem correspondentes aos haplótipos conhecidos, sendo, por isso, considerados
atípicos. Estes resultados estão de acordo com as frequências haplotípicas encontradas na população brasileira.
Com relação a talassemia alfa, foi encontrada apenas a deleção -a3,7, com uma frequência alélica de 0,14. Esta
freqüência é semelhante à encontrada em afrodescendentes, não havendo, portanto um aumento da freqüência
desta característica nestes pacientes.
Apoio financeiro: CNPq, Instituto do Milênio, PRONEX e FAPERGS
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Perfil hemoglobínico no Rio Grande do Sul
Wagner, SC1,2; Castro, SM3; Gonzalez, TP1; Santin, AP3; Henderson, S4; Old, J4; Hutz, MH1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil,
Centro Universitário Feevale, Novo Hamburgo, RS, Brasil,
3
Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
4
Laboratório Nacional de Referência em Hemoglobinopatias, Hospital Radcliffe, Oxford, Reino Unido.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hemoglobinopatias, Triagem neonatal, Hemoglobinas variantes, Hb S, Hb C.
Hemoglobinopatias são desordens genéticas da globina, resultantes da presença de hemoglobinas variantes e/ou
talassemias, que apresentam manifestações clínicas variáveis, desde a morte na infância até uma ausência total de
sintomas. Atualmente, mais de mil hemoglobinas variantes já foram descritas, sendo a hemoglobina S (Hb S) e a
hemoglobina C (Hb C) as mais frequentes. Estudos realizados no Brasil mostram alta prevalência de heterozigotos
para Hb S e Hb C. O presente estudo avaliou a prevalência dos padrões hemoglobínicos no estado do Rio Grande
do Sul obtidos de recém nascidos atendidos pela rede de saúde pública. 437.787 amostras de sangue de foram
coletadas em papel filtro entre janeiro de 2004 e dezembro de 2007 e analisadas por focalização isoelétrica e/ou
HPLC. Quando necessário, uma amostra de sangue total foi solicitada para extração de DNA e realização de PCR
e sequenciamento das cadeias alfa e beta da globina. Dentre as amostras analisadas, 6.400 (1,46%) apresentaram
padrão hemoglobínico alterado: 5.237 FAS, 837 FAC, 199 FAD, 33 FS, 6 FC, 1 FSD, 7 FS/beta talassemia e 80
heterozigotos para variantes raras. Obteve-se amostra de material genético para análise de 52 dos 80 portadores
de variantes raras. A partir do sequenciamento, foram observadas 23 variantes de cadeia alfa (3 Hb Woodville, 1
Hb Chad, 2 Hb Hasharon, 3 Hb G-Phil, 4 Hb G-Pest e 10 Hb Stanleyville) e 18 de cadeia beta (11 Hb E-Sakatoon,
1 Hb Osu-Christianborg, 1 Hb Richmond, 1 Hb O-Arab, 1 Hb Shelby, 1 Hb Beckman e 2 Hb Hope). Dentre estas
hemoglobinas, 70% estão sendo identificadas pela primeira vez no Brasil. Onze casos continuam em investigação.
A triagem neonatal permite o diagnóstico precoce das síndromes falciformes e a inclusão dos portadores em
programas de prevenção e tratamento. O alto número de heterozigotos observados demonstra a necessidade
de aconselhamento genético e investigação de membros da família. O diagnóstico correto das hemoglobinas
variantes raras previne a aplicação de procedimentos e terapias equivocadas e ainda fornece material para o
estudo de aspectos estruturais, funcionais e antropológicos. A variabilidade de perfis hemoglobínicos identificados
nesta amostra refletem a heterogeneidade da população do sul do país e também pode fornecer dados sobre a
composição étnica e graus de miscigenação.
Apoio financeiro: CNPq e Instituto do Milênio, PRONEX, FAPERGS
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Polimorfismos genéticos usados no diagnóstico
indireto da Hemofilia A
Massaro, JD1; Wiezel, CEV1; Muniz, YCN1; Rego, EM2; Oliveira, LCO2; Mendes-Junior, CT3; Simões, AL1.
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto-SP, Brasil.
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto-SP, Brasil.
3
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto-SP,
Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: População brasileira, Fator VIII, haplótipos, Hemofilia A, diagnóstico indireto e microssatélites.
A Hemofilia A é uma doença sanguínea ligada ao cromossomo X. É causada pela deficiência parcial ou total
da atividade do Fator VIII (FVIII), uma glicoproteína plasmática cuja função é necessária para a coagulação
normal do sangue. Devido às dificuldades encontradas para o reconhecimento direto da mutação no gene do
FVIII, o diagnóstico indireto usando marcadores polimórficos, localizados dentro ou próximo do gene é usado
como alternativa para determinar a segregação do haplótipo que acompanha a mutação na família sob estudo
e assim detectar o estado de portadora e/ou auxiliar no diagnóstico pré-natal. O presente estudo caracterizou
as freqüências alélicas e haplotípicas, diversidade genética, diferenciação populacional e desequilíbrio de
ligação de cinco microssatélites (Intron 1, Intron 13, Intron 22, Intron 25.3 e IKBKG) em amostras de indivíduos
normais de São Paulo, Rio Grande do Sul, Pernambuco e pacientes com Hemofilia A, para determinar o grau de
informatividade desses microssatélites no diagnóstico da doença. Os parâmetros de diversidade interpopulacional
mostram diferenças entre as amostras populacionais analisadas. Tais diferenças regionais nas freqüências alélicas
devem ser levadas em conta quando o diagnóstico indireto da Hemofilia A estiver sendo realizado. Com exceção
do IKBKG, todos os demais microssatélites apresentaram altas taxas de heterozigose. Usando tais marcadores, o
diagnóstico foi possível em 10 das 11 famílias analisadas. Os microssatélites Intron 22, Intron 1, Intron 13, Intron
25.3 e IKBKG foram informativos em 63,6% (7/11), 54.5% (6/11), 54.5% (6/11), 45.5% (5/11) e 18.2% (2/11) dos
casos, respectivamente, demonstrando a eficácia do uso desses microssatélites no diagnóstico pré-natal e na
identificação de portadoras na população brasileira.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP, FAEPA.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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165
Validação de quatro novos marcadores microssatélites
para o diagnóstico indireto de portadores de mutação
no gene F8
Machado, FB1,3; Alves da Silva, AF2,3; Medina-Acosta E3
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
Hospital Escola Álvaro Alvim.
3
Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
1
2
Palavras-chave: Gene F8, Hemofilia A, Microsatélites, QF-PCR, teste genético.
Em países com recursos limitados, a detecção direta de mutações no gene codificador do fator VIII de coagulação
sanguínea (F8) em famílias de hemofílicos é inviabilizada pelo alto custo. A análise de ligação com microssatélites
intragênicos ou em regiões adjacentes ao F8 possibilita a detecção indireta de alelos patogênicos. Nos ensaios
multiplex para o diagnóstico indireto, a heterozigose acumulada raramente atinge 100% e os marcadores
extragênicos se distanciam até 3 cM do F8 aumentando a chance de erro por recombinação. O objetivo do presente
estudo foi determinar a informatividade de quatro novos marcadores microssatélites para o diagnóstico indireto
de mutações no gene F8. Foram genotipadas 100 mulheres saudáveis não relacionadas com quatro marcadores,
dois dinucleotídeos intragênicos (F8Int21 e F8Int9.2) e dois tetranucleotídeos extragênicos (TMLHEInt1.3 e
TMLHEInt1.1) distantes 0,15cM do F8 previamente descritos pelo nosso grupo como potencialmente polimórficos.
A genotipagem foi realizada pela técnica da reação quantitativa por fluorescência em cadeia da polimerase (QFPCR). Foram determinadas a heterozigose e a freqüência alélica para cada marcador. A heterozigose observada
para os marcadores F8Int21, F8Int9.2, TMLHEInt1.3 e TMLHEInt1.1 foi de 0,53, 0,37, 0,58, 0,59 respectivamente.
Exceto o marcador F8Int9.2, os outros novos marcadores validados exibiram heterozigose similar àquela dos
marcadores intragênicos amplamente utilizados. O número de alelos observados variou de seis (F8Int9.2, F8Int21
e TMLHEInt1.3) a onze (TMLHEInt1.1). A informatividade acumulada dos quatro marcadores genotipados foi de
86%, com pelo menos um marcador em heterozigose; com apenas os marcadores intragênicos a informatividade
foi de 63%. Os novos marcadores serão úteis no diagnóstico indireto de mutações no F8, e poderão ser combinados
com marcadores já validados buscando aumentar o poder de informação dos ensaios indiretos.
Apoio financeiro: FAPERJ E Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular - NUDIM.
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O polimorfismo -318G>A no gene TNFA e o risco de
desenvolvimento de inibidores em pacientes com
hemofilia A grave
Agostini-Pezzini, D1; Bandinelli, E2; Leiria, LB1; Luft, CK2; Salzano, FM1, 2.
1
2
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Palavras-chave: TNFA, inibidores, hemofilia A, fator VIII, polimorfismo
A hemofilia A é uma doença hemorrágica hereditária causada pela redução da atividade do fator VIII da
coagulação (FVIII). Uma das principais complicações no tratamento de hemofílicos é o desenvolvimento de
anticorpos (inibidores) contra o FVIII administrado, o que leva à diminuição da qualidade e expectativa de vida
dos pacientes. O desenvolvimento de inibidores contra o fator VIII é uma resposta imune multifatorial complexa,
envolvendo tanto fatores de risco genéticos quanto não-genéticos. A produção dos mesmos pode variar conforme
a idade, a origem étnica, a dose e frequência de FVIII infundido, presença de infecções virais e tipos de mutação
no gene do FVIII. Além disso, genes que influenciam o funcionamento do sistema imune podem ser importantes
na formação desses inibidores. A TNF-α é uma importante citocina com potentes funções pró-inflamatórias e
imunomodulatórias, e polimorfismos no seu gene têm sido associados com doenças autoimunes mediadas por
anticorpos. Vários polimorfismos foram identificados no gene TNFA, localizado em 6p21. O polimorfismo mais
estudado com efeitos patofisiológicos é o TNFA -308G>A, na região promotora. Este polimorfismo está associado
com níveis aumentados de TNF-α em doenças inflamatórias e com a formação de anticorpos em pacientes com
miastenia gravis no início da doença. O objetivo do nosso trabalho é estudar a associação entre este polimorfismo
do TNFA e o desenvolvimento de inibidores em pacientes com hemofilia A grave. Foram investigados 148 pacientes
com hemofilia A grave, dentre os quais 49 apresentavam inibidores. O polimorfismo foi identificado por PCR/RFLP.
As frequências foram comparadas pelo teste χ2. As prevalências genotípicas mostram, tanto o grupo de pacientes
com inibidores quanto no sem inibidores, que os valores estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. No grupo com
inibidores e no sem inibidores as frequências alélicas encontradas foram, respectivamente: -308A = 0,08 e 0,13 e
-308G = 0,92 e 0,87. As diferenças nessas frequências entre os dois grupos não foram significativas. Ao analisar
os dados levando em consideração a presença da inversão do intron 22 não houve alteração nos dados obtidos.
Nossos resultados não estão de acordo com o trabalho realizado por Astermark et. al. (Blood, 108: 3739-44, 2006),
no qual foi encontrada associação entre o genótipo -308AA e a ocorrência de inibidores em hemofílicos A. Logo,
mais estudos são necessários para que o papel deste polimorfismo na etiologia desta complicação seja esclarecido.
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Análise da densidade de microvasos em tumores
metastáticos e não-metastáticos da mama por meio da
imunodetecção do antígeno relacionado ao Fator VIII
Souza-Leal, CBQ1; Mühlbeier, DFM1; Abreu, DCB2; Almeida, FM1; Araújo, WCC1; Barcelos, LP1; Andrade,
SB1; Manoel WJ2; Caixeta, GN2; Saddi, VA1,2
Programa de Mestrado em Genética e Departamento de Biomedicina da Universidade Católica de Goiás;
Hospital Araújo Jorge, Associação de Combate ao Câncer em Goiás.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: angiogênese, antígeno relacionado ao fator VIII; câncer de mama; densidade de microvasos, prognóstico.
A angiogênese tumoral consiste na formação de novos capilares a partir da rede vascular existente em volta e dentro
do tumor, sendo essencial para o crescimento tumoral e para o desenvolvimento de metástases. A densidade de
microvasos tumorais é frequentemente avaliada por meio da imunodetecção do antígeno relacionado ao Fator VIII
e representa uma forma comum de quantificação da angiogênese tumoral. Em pacientes com câncer de mama,
além de servir como potencial marcador de angiogênese, o antígeno relacionado ao Fator VIII parece contribuir
diretamente para a formação de metástases e, potencialmente, possibilita a seleção de pacientes com câncer
inicial de mama que necessitariam de tratamento mais agressivo. O objetivo do nosso estudo foi avaliar a possível
correlação entre a densidade de microvasos e o potencial metastático em tumores de mama. A partir de registros
do Setor de Anatomia Patológica do Hospital Araújo Jorge, em Goiânia-GO, foram selecionados 175 casos de câncer
de mama, sendo 90 (51,4%) linfonodos negativos e 85 (48,6%) linfonodos positivos. A densidade de microvasos foi
avaliada pela detecção imuno-histoquímica do antígeno relacionado ao Fator VIII, utilizando anticorpos policlonais
A0082 (DAKO) e o método da estreptoavidina-biotina-imunoperoxidase (LSAB2, DAKO). Os aspectos clínicopatológicos das pacientes foram coletados, tabulados e analisados por estatística descritiva e comparativa. Dentre
os 175 tumores de mama analisados, 41 (23,4%) apresentavam angiogênese leve, 75 (42,9%) moderada e 59 (33,7%)
intensa. A análise comparativa dos grupos revelou uma diferença estatisticamente significativa para os tumores
metastáticos, ou seja, os tumores linfonodos positivos apresentaram maior densidade de microvasos quando
comparados aos tumores linfonodos negativos (x²=6,33; p=0,042). Pacientes com intensa angiogênese, definida
pela marcação intensa do fator VIII, apresentaram maior risco de desenvolvimento de metástases axilares, tanto
em relação às pacientes com leve angiogênese (OR = 2,7), quanto moderada angiogênese (OR = 1,9), implicando em
pior prognóstico para o grupo.
Apoio: CNPq; PROPE/UCG.
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Estudo das mutações do gene FANCC em pacientes
com quadro clínico de anemia de Fanconi
Sinicato, NA1; Gonçalves, CE1; Santos, RO1; Bonadia, LC1, Bertuzzo, CS1
Laboratório de Genética Molecular – Depto Genética Médica. FCM-UNICAMP
[email protected]
1
Palavras-chave: Anemia de Fanconi, Fancc, Instabilidade cromossômica, Hipersensibilidade celular e Grupos de complementação.
A Anemia de Fanconi (AF) é uma doença autossômica recessiva, associada a instabilidade cromossômica,
caracterizada por heterogeneidade genética e fenotípica, que inclui falência medular, múltiplas malformações
congênitas, além de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda, câncer e hipersensibilidade celular a agentes
formadores de ligações cruzadas (cross-linking) de DNA como a mitomicina e o diepoxibutano. A mais importante
das características clínicas é a manifestação hematológica, responsável pelo grande número de morbidade e
mortalidade em portadores de AF. A incidência da AF em todo o mundo é de aproximadamente 3 0/000 e a frequência
de heterozigotos é estimada em 1:300 na Europa e Estados Unidos. No Brasil não há dados sobre a prevalência da
doença. Foram descobertos até o momento 13 grupos de complementação (FANCA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M
e N). Os 13 genes foram clonados e pelo menos 11 estão relacionados ao distúrbio. Os pacientes são acometidos
por mutações principalmente, nos genes FANCA (60-70%), FANCC (5-15%) e FANCG (8-10%). O presente estudo
teve como objetivo a análise das principais mutações do gene FANCC (IVS4+4A>T, Q13X, W22X, delG322, R185X,
L496R, L554P, e R548X) em pacientes com quadro clínico compatível para AF e triar mutações neste gene por
meio da técnica SSCP, em pacientes que apresentarem mutações em apenas um alelo. A análise foi feita por meio
de técnicas de PCR e digestão enzimática com enzimas específicas para as mutações mais freqüentes e a triagem
de mutações em heterozigotos foi realizada pela técnica de SSCP. Foram analisados 121 indivíduos. Na amostra
encontramos 14% de indivíduos heterozigotos e 4% de indivíduos homozigotos para as mutações mais freqüentes
do gene FANCC. As mutações mais prevalentes foram: IVS4+4A>T com 6,6% dos alelos analisados, com freqüência
similar à encontrada na literatura, resultando em um fenótipo grave com múltiplas anomalias congênitas e início
precoce de distúrbios da medula óssea. A segunda mutação mais frequente foi a delG322 (2,47%), que resulta num
fenótipo leve. Essas duas mutações acometem cerca de 90% dos casos de AF do grupo C. A terceira mutação mais
freqüente foi a Q13X (1,23%). Na triagem de mutações por SSCP foram analisados os 14 éxons do gene FANCC nos
17 indivíduos heterozigotos para as 8 mutações mais prevalentes neste gene e seis alterações foram detectadas
nos éxons um, quatro, e seis. Esses fragmentos serão submetidos a sequenciamento a fim de determinar se as
alterações encontradas são polimorfismos neutros ou se realmente podem ser alterações implicadas na doença.
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Considerações citogenéticas no registro de Anemia
de Fanconi do Instituto Fernandes Figueira - FIOCRUZ
(RAFIFF/FIOCRUZ/RJ)
Serrão, ALV; Mulatinho, MV; Moura, VLS; Soares, ALBT; Nesi, FF; Moraes, LFM; Llerena Jr, JC.
Laboratório de Citogenética da Divisão de Genética Médica José Carlos Cabral de Almeida - Instituto Fernandes Figueira - FIOCRUZ.
Palavras-chave: Anemia de Fanconi, DEB Teste, instabilidade cromossômica, malformação congênita, anemia aplástica idiopática
A Anemia de Fanconi (AF) é uma doença genética caracterizada por anomalias congênitas, instabilidade
cromossômica, predisposição às neoplasias em idade precoce e distúrbios hematológicos, invariavelmente
culminando com uma falência da medula óssea. Suas manifestações clínicas são variáveis e sobrepõem-se a outras
doenças genéticas tornando o diagnóstico clínico difícil. O agente alquilante 1,3-Butadiene Diepoxide (DEB) se
mostrou um marcador celular específico para diagnóstico da AF, permitindo um diagnóstico citogenético preciso.
Sua característica celular é a incapacidade em reparar danos no DNA provocados pela formação de pontes
interfilamentosas na dupla fita produzidos pelos agentes clastogênicos. A alta sensibilidade e especificidade
semelhante a drogas como mitomicina-C (MMC), nitrogênio mustarda, cisplatina, tem sido utilizada na
citogenética da AF. O resultado da exposição das células de pacientes com AF a estes agentes é o excesso de
quebras e rearranjos cromossômicos quando comparados aos controles normais. A heterogeneidade genética
na AF aponta para 13 genes relacionados ao sistema de reparo do DNA - supercomplexo BRAFT. O laboratório
de Citogenética Clínica do Departamento de Genética Médica do IFF é considerado centro de referência para
diagnóstico clínico e citogenético da AF. No período entre 1991-2008, 585 indivíduos foram encaminhados para
estudo citogenético através do DEB-teste. Culturas de sangue periférico foram expostas a 0,1mg/ml de DEB por
72h e processadas segundo protocolos convencionais. Foram analisadas 25-50 metáfases em cada caso através
da coloração convencional (Giemsa) e calculou-se o número de quebras cromossômicas por célula. Lacunas
cromatídicas e cromossômicas não entraram no cálculo final. Rearranjos, incluindo trirádio e quadrirádio, foram
considerados como duas quebras cada. Obtivemos resultados positivos em 80 casos (13,67%) agrupados nos
seguintes grupos nosológicos: 1) anemia aplástica idiopática (AAI) - 48,75% (#39), 2) anomalias congênitas - 30%
(#24), 3) distúrbios hematológicos com anomalias congênitas - 17,5% (#14), 4) indicação não disponível - 3,75%
(#3). Os casos com AF apresentaram 0.90 - 23.9 quebras cromossômicas DEB-induzidas por célula comparados
a 0.00 - 0.10 quebras cromossômicas DEB-induzidas por célula nos casos considerados normais. Enfatizamos a
importância do diagnóstico citogenético utilizando o DEB-teste já que 21,25% dos casos afetados apresentavam
número normal de quebras cromossômicas espontâneas. O registro clínico para a AF torna-se essencial nos
desdobramentos envolvendo a supervisão hematológica visando minimizar efeitos primários e secundários da
AA assim como diagnosticar complicações hematológicas associadas as leucoses. O monitoramento precoce das
lesões pré-cancerígenas da mucosa oral, assim como a supervisão dos tumores ginecológicos, torna-se prioritário.
Do ponto de vista genético, a identificação de um dos 13 grupos de complementação permitirá orientar o estudo
molecular e, em conseqüência, oferecer diagnóstico pré-natal visando tanto o estudo para AF como o HLA na
identificação dos prováveis doadores.
Apoio Financeiro: Fundo de pesquisa da DGM IFF/FIOCRUZ
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Estudo da mutação mitocondrial A1555G em indivíduos
com Neuropatia Óptica Hereditária de Leber
Ramos, PZ¹; Miranda, PMAD¹; Svidnicki, MCCM¹; Salloum, PM¹; Fernandes, MSA¹; Maciel-Guerra, AT²;
Sartorato, EL¹.
¹ Laboratório de Genética Molecular Humana – CBMEG – UNICAMP
² Depto de Genética Médica – Faculdade de Ciências Médicas – UNICAMP
Palavras-chave: LHON, MTRNR1, A1555G, Leber, Neuropatia Óptica.
Mutações mitocondriais têm sido descritas em associação com síndromes bem definidas, como por exemplo, a
Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON). A LHON é caracterizada pela perda repentina da visão em um
ou em ambos os olhos, devido a uma degeneração do nervo óptico. Atualmente, cerca de 17 mutações associadas
a LHON foram registradas, onde três dessas mutações representam 95% dos casos e são denominadas mutações
primárias (G11778A, T14484C e G3460A). A co-ocorrência de mutações patogênicas no mtDNA associadas com
diferentes doenças não parece ser freqüente. A mutação mitocondrial A1555G, no gene MTRNR1 que codifica a
subunidade 12S rRNA, associada a suscetibilidade a perda auditiva induzida por aminoglicosídeos, por sua vez,
foi previamente descrita em duas famílias com LHON. Essa mutação trata-se da troca de uma adenina por uma
guanina na posição 1555 do gene, que altera a estrutura secundária da subunidade 12S rRNA, tornando-a mais
semelhante à molécula 16S rRNA da bactéria e aumentando a suscetibilidade ao aminoglicosídeo. Dessa forma, o
objetivo do presente estudo foi rastrear a mutação A1555G no gene MTRNR1 em pacientes com LHON, a fim de
se avaliar um possível efeito sinérgico dessa mutação no fenótipo dos indivíduos estudados. Amostras de DNA de
20 pacientes que apresentavam hipótese diagnóstica de LHON, foram rastreadas quanto à presença das mutações
primárias e posteriormente, nos casos positivos para essas mutações foi estudada a mutação A1555G. A mutação
A1555G não foi observada em nenhum dos casos analisados. Portanto, não foi possível concluir a existência de
algum efeito modulador provocado por essa mutação no fenótipo da LHON, apesar dos achados observados
previamente na literatura.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq.
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Estudo molecular da Neuropatia Óptica Hereditária
de Leber
Miranda, PMAD¹; Andrade, PB¹; Callefo, F¹; Zanchetta, LM¹; Fernandes, MSA¹; Maciel-Guerra, AT²;
Sartorato, EL¹.
¹ Laboratório de Genética Molecular Humana – CBMEG – UNICAMP
² Departamento de Genética Médica – Faculdade de Ciências Médicas – UNICAMP
[email protected]
Palavras-chave: LHON, Leber, Neuropatia Óptica, mutações primárias e mutações secundárias
A mitocôndria é uma organela que apresenta DNA próprio. O DNA mitocondrial (mtDNA) é organizado de
maneira circular, apresentando 16.569 pares de bases e pode sofrer mutações diversas, que podem interferir no seu
funcionamento. Mutações mitocondriais têm sido descritas em associação com síndromes bem definidas, como
por exemplo, a Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON). A LHON é caracterizada pela perda rápida da
visão devida a uma degeneração do nervo óptico causada possivelmente por um processo apoptótico generalizado
das células gliais. A LHON afeta geralmente adultos jovens com uma idade de início média situada entre 18 e 35
anos de idade. A perda de visão ocorre geralmente em um dos olhos, de forma súbita, em menos de uma semana
ou de forma progressiva, ao longo de 2-3 meses. O outro olho pode ser afetado quase simultaneamente em cerca de
50% dos casos, ou posteriormente, por vezes, com um intervalo que pode atingir nove meses. Atualmente, 17 das
principais mutações associadas à LHON foram registradas, onde 3 delas representam 95% dos casos (mutações
primárias) e as 14 subseqüentes representam apenas 5% do total (mutações secundárias). Não foram relatados,
até o presente momento, estudos referentes à população brasileira sobre a freqüência relativa das mutações
entre portadores da LHON, nem estudos populacionais indicando a prevalência dessas mutações em nosso
meio. Por isso, no presente estudo foram estudados 40 pacientes com hipótese diagnóstica de LHON ou com
neuropatia óptica adquirida de origem desconhecida. Foram rastreadas as mutações primárias (G11778A, G3460A
e T14484C) e mutações secundárias nos genes MT-ND1 (T4160C e C4171A), MT-ND4 (T11253C e G11696A), MTND4L (T10663C), MT-ND5 (A13637G e G13730A), MT-CYB (G15257A) e MT-ND6 (G14459A, C14482G, A14495G,
T14898C, C14568T e A14596T). O rastreamento foi realizado por análise de restrição para detectar as mutações
primárias e seqüenciamento direto para detectar as mutações secundárias naqueles indivíduos nos quais as
mutações primárias não foram observadas. As mutações primárias foram encontradas em 17 pacientes, sendo
12 deles portadores da G11778A, 4 portando a T14484C e apenas 1 portador da G3460A. Não foram encontradas
mutações secundárias nos pacientes estudados, porém foram detectadas as alterações G11719A em 17 pacientes
e G14560A em 2 casos, mas, segundo dados da literatura, essas alterações são consideradas polimorfismos, pois
estão presentes em mais de 1% da população normal.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES.
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Variabilidade mitocondrial e doenças genéticas no
interior da Bahia
Machado, TMB1,4; Acosta, AX1,3; Abé-Sandes, K1,2,4
Laboratório Avançado de Saúde Pública – LASP/CPqGM/FIOCRUZ;
Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da Bahia –UNEB;
3
Faculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia – FAMEB;
4
Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia – ICS/UFBA
[email protected]/[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNAmt; PKU; MPSVI; HC.
O município de Monte Santo está localizado no semi-árido da Bahia, com população composta por 52.249
habitantes, estando sua maioria distribuída em cerca de 150 povoados. Estudos preliminares realizados neste
município mostraram a presença de doenças genéticas raras com alta prevalência, como Mucopolissacaridose tipo
VI (MPSVI), Fenilcetonúria (PKU) e Hipotireoidismo Congênito (HC). A maioria das doenças observadas possui
padrão de herança autossômico recessivo. Dados genealógicos preliminares (obtidos através de entrevista com
as famílias) revelam elevado grau de endogamia e endocruzamento. As doenças identificadas até o momento e
avaliadas neste estudo foram: Fenilcetonúria (PKU), Mucopolissaridose do tipo VI (MPSVI), Surdez Hereditária
não Sindrômica (SHNS), Hipotireoidismo Congênito (HC), Osteogênese Imperfeita (OI) e Síndrome de Treacher
Collins (STC). Na tentativa de identificar a origem ancestral das mutações causadoras destas doenças, analisouse a região HVS-I do DNA mitocondrial por PCR-sequenciamento em 2 pacientes com PKU, 6 com MPSVI, 37
com SHNS, 1 com STC, 3 com HC e 3 com OI, totalizando 52 amostras. Destas 25 pertencem a haplogrupos de
origem africana (48%), 10 a ameríndios (19,2%), 2 a europeus (3,8%) e 10 ainda não foram identificados (19,2%). Em
todos os grupos estudados há um predomínio de haplogrupos de origem africana, com exceção dos pacientes com
MPSVI que apresentam 66% de haplogrupos de origem ameríndia. Estes resultados demonstram alta contribuição
materna africana, seguida de ameríndia. Na PKU, a mutação observada, causadora da doença, é de origem européia
em contraste com o DNA mitocondrial em sua maioria de origem africana sugerindo que a entrada da mutação
nesta população ocorreu através dos homens. Estes achados corroboram dados de outros estudos em populações
brasileiras e também dados históricos sobre o povoamento e miscigenação desta população, ressaltando a
assimetria entre a contribuição uniparental, sendo mais freqüente contribuição materna de origem africana e
ameríndia e contribuição paterna de origem européia.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Análise dos complexos da cadeia respiratória
em linhagens celulares cíbridas com mutações
no DNA mitocondrial
Rodrigues, ADS; Tengan, CH
Disciplina de Neurologia Clínica, Departamento de Neurologia e Neurocirurgia
Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina
[email protected]
Palavras-chave: cadeia respiratória, mitocôndria, complexos respiratórios, doenças mitocondriais, DNA mitocondrial
Introdução: Existe uma grande dificuldade no diagnóstico das doenças mitocondriais, pois a maior parte delas não
apresenta alterações à biópsia muscular. O melhor método para o diagnóstico destas formas de doença mitocondrial se
baseia na análise das atividades dos complexos respiratórios por espectrofotometria, sendo este um método de difícil
realização. Objetivo: avaliar os complexos da cadeia respiratória utilizando métodos de análise protéica. Materiais
e métodos: foram estudadas 4 linhagens celulares cíbridas contendo DNA mitocondrial (DNAmt) normal (143B), e
mutações no DNAmt em homoplasmia: A8344G, A3243G e uma deleção de 7,5kb, (del-7,5kb). O complexos foram
avaliados pela técnica de BN-PAGE (blue native polyacrylamide gel electrophoresis) seguido de Western blotting (BNPAGE-Western), BN-PAGE seguido de detecção da atividade no gel (BN-PAGE- atividade “in gel”) e Western blotting
multiplex (análise simultânea dos 5 complexos utilizando anticorpos para uma subunidade de cada complexo
respiratório). Resultados: A análise pelo BN-PAGE Western mostrou a ausência ou redução dos complexos I, III e IV
nas linhagens com as mutações. Pelo BN-PAGE-atividade “in gel” observamos ausência da atividade dos complexo
I e IV em todas as linhagens com mutações, além de presença de bandas adicionais com atividade para complexo
V. O Western blotting multiplex mostrou redução ou ausência das subunidades dos complexos I, III e IV em todas
as linhagens com mutações. Conclusão: Os três métodos detectaram alterações nos complexos com subunidades
codificadas pelo DNAmt (complexos I, III, IV e V) nas linhagens com mutações, sugerindo que sejam bons métodos
auxiliares para o estudo de pacientes com doenças mitocondriais.
Apoio Financeiro: FAPESP E CAPES
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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174
Study of TRMU and MTO1 modifiers genes
in the phenotype of A1555G mitochondrial mutation
in deaf individuals
Borsari, NG1; de Moraes, VC1; Pinto, DO1; Maciel-Guerra, AT2; Sartorato, EL1
1
2
Molecular Biology and Genetic Engineering Center (CBMEG), State University of Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
Keywords: Hearing loss, Mutations, Nuclear modifier genes, Mitochondrial genes, A1555G, MTO1, TRMU.
Nonsyndromic sensorioneural hearing loss is the most common human sensory disorder, affecting 1 in 1000 births.
A number of distinct mutations in the mitochondrial DNA (mtDNA) have been found to be associated with both
syndromic and non-syndromic forms of hearing loss. Mitochondrial DNA mutations account for at least 5% of cases
of postlingual, nonsyndromic hearing impairment. The most common of these mutations is the A1555G substitution
which is located in the region of small ribosomal RNA that is highly conserved from bacteria to mammals. This
mutation is a primary factor underlying the development of deafness but is not sufficient to produce deafness
phenotype. However, nuclear modifier genes have been proposed to modulate the phenotypic manifestation
of human mitochondrial 12S rRNA A1555G mutation associated with deafness in many families world-wide.
The nuclear modifier genes TRMU and MTO1 encode a highly conserved mitochondrial protein related to tRNA
modification, developing an important role in the phenotypic expression of sensorioneural hearing loss induced
by A1555G mitochondrial mutation. The aim of this work is to characterize the both putative nuclear modifiers
genes TRMU and MTO1 in 10 individuals carrying the A1555G mitochondrial mutation. The G28T mutation of
TRMU gene was detected in 1 individual in heterozygosis. A mutation screening of MTO1 nuclear gene revealed
three different SNPs in 8 individuals. Our findings suggest that is improbable the G28T mutation is modulating the
A1555G mitochondrial mutation since G28T mutation was found in heterozygosis. No pathogenic mutations were
found in the MTO1 gene. Therefore, further studies are necessary to conclude that the SNPs found in MTO1 gene are
modulating the phenotypic manifestation of the deafness-associated A1555G mitochondrial mutation.
Finacial support: FAPESP and CNPq.
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Análise de associação de polimorfismos nos genes TGF
e ECA com a variabilidade clínica da Fibrose Cística
MARTINS, RS1; HIGA, L2; CABELLO, PH1; CABELLO, GMK1
Laboratório de Genética Humana - Instituto Oswaldo Cruz - Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Fernandes Figueira - Fundação Oswaldo Cruz
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fibrose Cística; Genes moduladores; Enzima Conversora da Angiotensina 1 (ECA); Fator de Transformação de
Crescimento (TGFb).
A Fibrose Cística é uma doença multissistêmica, comum em populações caucasianas, com padrão de herança o
autossômico recessivo. Ocorre em conseqüência de mutações no gene CFTR, que possui 230 Kb e está localizado
no cromossomo 7q31.2. A doença se inicia na infância, e como conseqüência se manifesta com insuficiência
pancreática, insuficiência gastro-intestinal que levam a deficiências nutricionais, ocasionada pela inabilidade
de secretar enzimas. O aspecto mais grave da doença é a progressão de doenças pulmonares que resulta em
prognóstico ruim. Estudos de polimorfismos de genes candidatos, tais como os do Fator de Transformação de
Crescimento (TGFb) e os da Enzima Conversora da Angiotensina 1 (ECA) podem fornecer informações importantes
na identificação de fatores genéticos que atuam como moduladores da Fibrose Cística, contribuindo assim para
melhor compreensão da patogênese, assim como o agravamento da função pulmonar. O objetivo do estudo é
descrever a distribuição das freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos do Fator de Transformação de
Crescimento (TGFb) e os da Enzima Conversora da Angiotensina 1 (ECA) numa amostra de pacientes com Fibrose
Cística do Instituto Fernandes Figueira/Fiocruz, e posteriormente relacionar com a gravidade dos sintomas dos
pacientes que apresentam tais polimorfismos. As análises dos polimorfismos foram realizadas através da técnica
de PCR para o gene TGFβ1 e o gene ECA. Para o gene TGFβ1 foi analisado o códon 25 que apresenta dois alelos
TGFβ1*C e TGFβ1*G sendo o TGFβ1*G o alelo selvagem e o de maior freqüência, aparecendo em 93% dos
cromossomos. O polimorfismo do gene ECA consiste na inserção (I) ou deleção (D) de um fragmento de DNA
de 250 pares de base. Nos resultados obtidos com a análise do polimorfismo I/D do gene ECA em nossa amostra
foi observado maior freqüência do alelo D (55%), porém o genótipo mais frequente foi o heterozigoto ID cuja
freqüência observada foi igual a 48,7%. Uma alta produção do genótipo (DD) de ECA em pacientes FC foi descrita
na literatura como estando associada com a idade do paciente no qual o FEV1 se torna menor do que 50% do valor
previsto e com desenvolvimento de cirrose hepática. Novas análises estão sendo realizadas para definir melhor os
parâmetros de associação com a progressão da doença.
Apoio Financeiro: FAPERJ
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Polimorfismo D/I no gene ACE candidato a modificador
na Fibrose Cística e sua associação com a gravidade
do quadro clínico
Bertuzzo, CA¹; Marson, FAL²; Ribeiro, JD²; Bonadia, LC¹; Ribeiro, JD².
Laboratório de Genética Médica – Faculdade de Ciências Médicas/UNICAMP. ² Departamento de Pediatria – Faculdade de Ciências
Médicas/UNICAMP.
[email protected]
1
Palavras-chave: genótipo, fenótipo, variabilidade, mucoviscidose, genes modificadores
Introdução: A Fibrose Cística(FC) é uma doença genética causada por mutações no gene CFTR. A principal causa
de morbidade e mortalidade é decorrente da inflamação e infecção crônicas do trato respiratório. O gene CFTR
está localizado na região 7q3.1 e consiste em 27 exons que codificam a proteína CFTR expressa na membrana
apical das células epiteliais de vários órgãos, constituindo-se como um canal de cloro. Existe baixa correlação
entre o tipo de mutação do gene CFTR e o quadro clínico dos pacientes, assim estudos de fatores ambientais e
genéticos podem contribuir para o melhor entendimento da fisiopatologia desta doença. O gene ACE codifica a
enzima conversora de angiotensina que se relaciona com a resposta pró-inflamatória presente no parênquima
pulmonar de pacientes com FC. Este gene apresenta um polimorfismo denominado de D/I, sendo o alelo D
caracterizado pela deleção de 287pb no intron 16 e responsável pela maior expressão do gene. OBJETIVO: Verificar
se existe associação entre o polimorfismo D/I no gene ACE com as seguintes variáveis clinicas e laboratoriais de
pacientes com FC: Escore de Kanga e Shwachman(ES), Índice de Massa Corpórea(IMC), idade ao diagnóstico,
inicio dos sintomas pulmonar e digestivo, microrganismos presentes, espirometria e saturação de oxigênio.
MÉTODO: 137pacientes, 72(52,6%) do sexo masculino, idade média: 15anos. Para a análise do polimorfismo D/I
se utilizou da técnica de PCR. A análise estatística foi realizada pelo software Statistical Package for the Social
Sciences(SPSS), versão 10.0. A análise dos dados quantitativos sem distribuição normal foi realizada pelo teste de
Kruskal-Wallis e dos dados com distribuição normal pela ANOVA. Os dados qualitativos foram analisados através
do teste do qui-quadrado, utilizando, se necessário, correção de Yates ou teste Exato de Fisher. Quando possível
se calculou o Odds Ratio(OR). Foi estabelecido um nível de significância de 5%. Resultados e discussão: Para os
pacientes portadores do alelo D o diagnóstico foi realizado em média antes que o três anos de idade, quando
comparado a indivíduos homozigotos II, (p=0,04; OR:3,07; IC=1,1 a 2,61). O mesmo ocorreu para o inicio do quadro
digestivo(p=0,05; OR:8,2; IC=1,4 a 1,46). Quanto ao ES, principal marcador de gravidade clínica na FC, foi observado
um maior um número de pacientes portadores do genótipo DD com escore classificado como grave(p=0,02; OR:6,8;
IC=1,19 a 34,21). Esses resultados sugerem que a maior expressão do ACE decorrente do genótipo DD leva ao
maior dano pulmonar devido à inflamação. Porém o genótipo DD parece proteger contra a infecção crônica o
que pode ser observado pela presença de maior número de pacientes com genótipo II infectados pela bactéria
Achromobacter xylosoxidans(p=0,03; OR:4,5; IC=1,20 a 17,05). CONCLUSÃO: O polimorfismo D/I no gene ACE age
como modificador na FC atuando na resposta inflamatória e na infecção crônica por microrganismos patogênicos.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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A importância dos polimorfismos do gene MBL
na modulação da Fibrose Cística
Pereira, CB1; Cabello, PH1; Cabello, GM1; Higa, L2
Laboratório de Genética Humana - Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz.
Instituto Fernades Figueira
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fibrose Cística, CFTR, MBL2, PCR-SSP
A Fibrose Cística (FC) é umas das doenças genéticas mais comuns e fatais em populações caucasóides. Ela é uma
desordem hereditária de caráter autossômico recessivo que resulta na alteração do transporte de íons e água pela
membrana plasmática das células. Os fibrocísticos apresentam diminuição na secreção de cloro e aumento na
absorção de sódio em suas células epiteliais. Os pacientes podem adquirir doenças hepáticas, diabetes mellitus e
desnutrição, podem ter um funcionamento anormal das glândulas sudoríparas e glândulas da mucosa pulmonar,
podendo desenvolver bronquite crônica, destruição do parênquima pulmonar e infecções bacterianas. A FC decorre
de mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmenbrane Regulator) que sintetiza uma proteína transmembranar
reguladora no transporte de íons localizada nas células epiteliais de tecidos exócrinos. Acredita-se que a FC possa ser
modulada pelos polimorfismos da Lectina Ligante de Manose (MBL), uma proteína sérica sintetizada pelo fígado e
possui afinidade a resíduos de manose de algumas bactérias, leveduras e vírus aumentando a fagocitose destes. Ela
pertence à classe das colectinas, ativando o sistema complemento e promovendo a fagocitose. Os polimorfismos
identificados ocorrem pela substituição de apenas um nucleotídeo (SNP) no éxon 1: no códon 54 (G àA), no 57 (G
àA) e no 52 (C à T). O alelo selvagem é denominado como variante A, os outros são B, C e D, respectivamente. Há
também outras mutações: duas na região promotora, uma na posição -550 e outra na -221, e uma na região não
traduzida UTR na posição +4. Os polimorfismos da região promotora mostram um forte desequilíbrio de ligação
com os alelos da região codificante e parecem estar associados à variabilidade de expressão da doença. O objetivo
desse projeto é genotipar os polimorfismos da região promotora, da não traduzida e da codificante do gene MBL2,
além de estudar o possível efeito modulador das variantes gênicas. Foram avaliadas amostras de pacientes através
de testes clínicos, confirmados por testes moleculares e posterior análise de população controle. Extraiu-se o DNA
dos pacientes a partir de sangue total pelo Kit Qiagen. Para a identificação de polimorfismos foi feita a PCR-SSP
(Polymerase Chain Reaction with Sequence Specific Primer). Os alelos foram detectados em gel de agarose 1,5%.
Para controle da reação de PCR foi utilizado um par de oligonucleotídeos para o gene da betaglobina. Na região
codificante o alelo com maior frequência é o A (79%), seguido do D (10%), B (6,25%) e C (4,6%). Na região promotora
H/L o alelo L é o de maior frequência com 73,9% e o H tem apenas 26%. Na região promotora X/Y o alelo Y é o
mais frequente com 65,4% e o X é o segundo com 34,6%. A futura análise da população controle poderá permitir a
correlação genótipo-fenótipo.
Apoio Financeiro: FAPERJ.
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Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTP1 e sua
associação com as formas clínicas da Fibrose Cística
Fonseca, ACP¹; Higa, L²; Cabello, PH¹; Cabello, GMK¹
¹ Laboratório de Genética Humana – IOC
² Instituto Fernandes Figueira – IFF
[email protected]
Palavras-chave: Fibrose Cística, GSTM1, GSTP1, Genes moduladores e polimosfismos.
A fibrose cística é uma doença hereditária mais comumente encontrada em populações caucasianas. Tendo como
padrão genético de transmissão autossômico recessivo, a doença é conseqüência de mais de 1600 mutações no
gene CFTR. O gene mapeado no cromossomo 7q31.2 possui 230 Kb e codifica uma proteína de 1,480 aminoácidos.
A sua morbidade inclui insuficiência pancreática, insuficiência gastro-intestinal com deficiências nutricionais,
incluindo a inabilidade de secretar enzimas e, com maior gravidade, a progressão de doenças pulmonares.
Portanto, estudos de polimorfismos de genes, tais como os das Glutationas-S-Transferases (GSTM1, GSTP1), entre
outros polimorfismos de genes ligados aos mecanismos de defesa do organismo podem oferecer informações
importantes na identificação de fatores genéticos que atuam como moduladores da Fibrose Cística, contribuindo
assim para melhor compreensão da patogênese da doença. O propósito deste estudo é descrever a distribuição
das freqüências alélicas e genotípicas de polimorfismos genéticos das enzimas GSTM1 e GSTP1 em uma amostra
de pacientes com Fibrose Cística; e correlacionar a gravidade dos sintomas dos pacientes com a presença destes
polimorfismos. Foram analisadas amostras de pacientes com diagnóstico de Fibrose Cística oriundos do Instituto
Fernandes Figueira/Fiocruz. Para a análise dos polimorfismos foi utilizada a técnica de PCR alelo específico para
ambos os genes e posterior digestão com a enzima de restrição BsmAI dos produtos de amplificação dos alelos
do gene GSTP1. O gene GSTM1 é polimórfico, sendo possível detectar três possíveis alelos: GSTM1*0, GSTM1*A e
GSTM1*B. De acordo com os resultados obtidos, o alelo mais freqüente foi o alelo Nulo (0/0 = 45%) que é um alelo
não funcional, enquanto que o alelo A apresenta-se em 36%, o alelo B em 15% e os heterozigotos A/B em apenas
4% dos cromossomos analisados. O lócus GSTP1 é polimórfico apresentando-se em quatro alelos, GSTP1*A-D,
que diferem funcionalmente e estruturalmente. Estes alelos diferentes estão relacionados à combinação de dois
polimorfismos identificados no gene GSTP1, o c.313A>G (p.I105V) e o c.341C>T (p.A114V). Em nosso estudo o
haplótipo mais freqüente foi o GSTP1*B, que é formado por V105 e A114 (49%). O haplótipo GSTP1*A apresenta
uma freqüência de 46%, o GSTP1*C apresenta uma freqüência de 3%, enquanto que o GSTP1*D apresenta uma
freqüência de 2%. Novas análises estão sendo realizadas para distinguir os indivíduos A/0, B/0 dos indivíduos A/A
e B/B, para isso a técnica de PCR-longo está sendo utilizada. Somente após a definição dos genótipos heterozigotos
e homozigotos acima é que as análises dos dados poderão fornecer resultados mais precisos.
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Polimorfismos nos genes candidatos a modificadores
GCLC e GST (M1, T1 e P1) em pacientes com Fibrose
Cística e sua associação com a gravidade clínica
Marson, FAL¹; Ribeiro, AF¹; Bonadia, LC²; Bertuzzo, CA²; Ribeiro, JD¹
¹Departamento de Pediatria – Faculdade de Ciências Médicas/UNICAMP.
2
Laboratório de Genética Médica – Faculdade de Ciências Médicas/UNICAMP.
[email protected]
Palavras-chave: genótipo, fenótipo, variabilidade, mucoviscidose, genes modificadores
A Fibrose Cística(FC) é uma doença genética que cursa principalmente com manifestações pulmonares e
pancreáticas. A correlação genótipo-fenótipo na FC é motivo de muitos estudos e é mais frequente quando há
insuficiência pancreática. Genes modificadores podem influenciar a gravidade do fenótipo dos fibrocísticos por
vários mecanismos. Para o presente estudo foram escolhidos genes candidatos a modificadores relacionados com
o mecanismo de atuação da glutationa, importante antioxidante presente no organismo, incluindo o parênquima
pulmonar, onde ocorrem infamação e infecção crônicas. Associar a presença de polimorfismos dos genes GST(M1,
T1 e P1- conjugadores de agentes que causam estresse oxidativo com a glutationa) e GCLC(codifica uma subunidade
da enzima glutamato-cisteína ligase, limitante na síntese da glutationa) com o grau de gravidade. 137pacientes,
72(52,6%) do sexo masculino, idade média: 15anos. Foi utilizada a técnica de Polymerase Chain Reaction(PCR)
nos genes GSTM1 e T1(polimorfismos de deleção de fragmentos), para os genes GSTP1(polimorfismo 313A/G)
e GCLC(polimorfismos 129C/T e 350A/G) foi realizada ainda digestão enzimática. Os dados obtidos foram
correlacionados com: Escore de Kanga(EK) e Shwachman(ES), Índice de Massa Corpórea(IMC), idade ao
diagnóstico, inicio dos sintomas(pulmonar e digestivo), microrganismos isolados, espirometria e saturação de
oxigênio(SaO2). Análise estatística realizada pelo software SPSS v.10.0 por meio dos testes: Kruskal-Wallis, MannWhitney, ANOVA, Teste-T, Qui-quadrado, Exato de Fisher. Quando possível foi calculado o Odds Ratio (OR) e
o Risco Relativo (RR). Nível de significância: 5%. Para os genes GSTM1, GCLC (polimorfismo 129C/T) e GSTP1
não houve correlação estatisticamente significativa com os marcadores clínicos. Para o gene GSTT1 indivíduos
portadores de pelo menos um alelo codificante foram classificados como baixo peso para o IMC (p=0,01, OR:3,08,
IC=1,35-7,09; RR:1,41, IC=1,05-1,91). Quando os genes GSTM1 e T1 foram analisados simultaneamente, indivíduos
portadores de pelo menos um alelo codificante foram classificados como baixo peso no IMC (p=0,05, OR:1,52,
IC=1,1-2,70). Pacientes com ambos genes(M1 e T1) com alelos nulos apresentaram menores valores na SaO2
(p=0,04), OR:4,27 (IC=1,2-20,09) e pior classificação no ES (p=0,03), OR:9,0 (IC=1,47-55,07), RR:5,57 (IC=1,56-19,88),
sendo esse escore o principal marcador de gravidade clínica na FC. Quanto à colonização bacteriana a associação
do alelo nulo para T1 e do codificante para M1 foi relacionada à presença de Pseudomonas aeruginosa não mucóide
e mucóide (p=0,01, OR:3,1, IC=1,28-7,56; RR:1,72, IC=1,04-2,85; p=0,003, OR:4,8, IC=1,69-13,74; RR:2,8, IC=1,24-6,23,
respectivamente). Para o polimorfismo GCLC350(A/G) do gene GCLC foi encontrada associação do genótipo A/A
com a prova SaO2 (p=0,0001, RR:5,8, IC=2,31-14,54) e este genótipo foi associado com pior classificação para o
EK(p=0,02) e para os dados da espirometria [menor valor de FEF25-75% (p=0,01) e na razão VEF1/CVF (p=0,02) e
maior gravidade referente ao VEF1 (p=0,01), OR:4,6 (IC=1,3-5,2), RR:2,24 (IC=1,04-4,82)]. Os genes GSTM1, GSTT1 e
GCLC (polimorfismo 350A/G) atuam como modificadores na FC.
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Rastreamento da mutação R334W em crianças
atendidas no serviço de pediatria do Hospital Infantil
Cosme e Damião Porto Velho - RO
Guimarães, M1,2; Cantanhêde, LM1; Alves, PH1,2; Farias, JD1,2; Krauze, A1,2; Andrade Casseb, A1,2; Jano, M1;
Engracia, V1,2
1
2
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
Palavras-chave: R334W, CFTR, Mutação, Fibrose Cística, Pediatria
Fibrose Cística é uma doença autossômica recessiva com expressividade variável, caracterizada principalmente
por infecção e obstrução das vias aéreas, e por má digestão. As obstruções provocam doença pulmonar crônica
grave em crianças e responde pela maioria dos casos de insuficiência pancreática exócrina. Estudos moleculares
evidenciaram a existência de mais de 1.500 mutações do gene CFTR (Cystic Fibrosis Mutation Database, 2008).
Dados da literatura sugerem a existência de uma correlação entre o genótipo e o fenótipo clínico da Fibrose Cística
principalmente por alteração e função da proteína CFTR, contribuindo para a heterogeneidade clínica. O objetivo
deste trabalho foi analisar a freqüência da mutação R334W em crianças atendidas no serviço de pediatria do
Hospital Infantil de Porto Velho-RO com sintomas clínicos de alterações gastrintestinal e respiratória. DNA foi
extraído de sangue periférico pela metodologia de Hguchi (1989) seguindo-se amplificação pela técnica da PCR
utilizando - se primers específicos para as regiões de interesse. O fragmento obtido de 358pb foi digerido com
a enzima MspI e o produtos foi submetido a eletroforese vertical em gel de poliacrilamida corado com nitrato
de prata a 10%. Até o momento foram analisados 608 cromossomos e a freqüência da mutação R334W foi de
0.006, detectada em heterozigose em apenas dois indivíduos. (04 cromossomos). A mutação R334W apresenta
freqüências polimórficas em populações caucasianas. Mesmo se Porto Velho recebeu um grande contingente de
indivíduos proveniente do Sul e Sudeste brasileiros, a constituição miscigenada da população brasileira pode ser a
responsável pelo resultado obtido.
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181
Incidência de Fibrose Cística causada pela mutação
∆F508 no estado de Santa Catarina
Nascimento, MA1,2; Ocampos, M 3; Neto, NL4; Menezes, ME 1
Laboratório de Pesquisa e Análise do Gene - DNAnálise, Florianópolis, SC
UFSC- Universidade Federal de Santa Catarina – Centro de Ciências Biológicas, Florianópolis, SC
3
Instituto de Biotecnologia Aplicada - IBIOTECNO
4
Hospital Infantil Joana de Gusmão, Florianópolis, SC
1
2
Palavras-chave: Fibrose Cística, triagem neonatal, gene CFTR, mutação ∆F508, incidência
Fibrose Cística chamada também de Mucoviscidose é a doença autossômica recessiva mais freqüente na
população branca, sendo conseqüente de mutações do gene CFTR, localizado no cromossomo 7. Este gene está
envolvido no transporte de íons em membranas das mucosas, e sua disfunção acarreta alterações gastrointestinais
e respiratórias. Conforme estabelecido pelo Ministério da Saúde, Santa Catarina está na fase III de implantação
do Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) (portaria 822 de 06/06/2001), sendo então apta para detectar
mutações no gene CFTR. Os indivíduos que apresentam imunotripsina reativa (IRT) positivas e teste de suor
alterado, são encaminhados ao Laboratório DNAnálise, para a investigação molecular da mutação genética ∆F508
no gene CFTR. Foram analisados 165 indivíduos (77 masculinos e 88 femininos), destes, 30 eram heterozigotos
para ∆F508 (18.2%) e 13 homozigotos (7.9%). Analisando a freqüência da mutação por alelo, verifica-se que 83%
são selvagens e 17% mutados. Sabe-se que a origem étnica da população influi significativamente na freqüência do
gene mutado, tendo altos índices para populações caucasóides (70% dos pacientes com Fibrose Cística tem origem
caucasóide) e baixos para populações portuguesas ou negras. Isso pode ser evidenciado entre os 88 pacientes que
informaram sua origem, 34 eram açorianos, 31 alemães e italianos, 8 italianos, 9 alemães e 6 pacientes de outras
origens. A escolha da mutação ∆F508 para diagnosticar a doença é baseada na sua freqüência, chegando a 70% dos
afetados brancos europeus. Entretanto, esta mutação apresenta uma grande variabilidade em diferentes regiões
geográficas e distintos grupos étnicos. Em Santa Catarina essa miscigenação contribuiu para diminuir a freqüência
da mutação ∆F508, o que não significa diminuição da freqüência de indivíduos com mucoviscidose, e sim que há
maior heterogeneidade de mutações. Portanto, considerando-se a miscigenação, deveríamos ampliar o espectro
de mutações a serem analisadas para suprir a necessidade que populações altamente miscigenadas têm para um
diagnóstico efetivo para Fibrose Cística.
Apoio financeiro: Laboratório de Pesquisa e Análise do Gene - DNAnálise
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Resultados preliminares da análise molecular no gene
IDS de paciente com síndrome de Hunter com suspeita
de apresentar um rearranjo complexo
Abrahão, L; Brusius-Facchin, AC; Silva, CZ; Schwatrz, IV; Giugliani, R; Leistner-Segal, S
Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
[email protected]
Palavras-chave: Mucopolissacaridose, síndrome de Hunter, rearranjo, análise molecular
A mucopolissacaridose do tipo II (MPS II ou síndrome de Hunter) é uma doença lisossômica de depósito (DLD) de
herança recessiva ligada ao X, causada pela deficiência da L-iduronato-2-sulfato sulfatase (iduronato-sulfatase ou
IDS). A IDS é uma das enzimas responsáveis pela degradação dos glicosaminoglicanos heparan (HS) e dermatan
sulfato (DS). O gene que codifica a IDS foi mapeado no cromossomo Xq28.1, é composto por 9 éxons e 8 introns
e tem um tamanho aproximado de 24 kb. Um pseudogene altamente homólogo aos exons II e III e aos íntrons
2,3 e 7 do gene IDS, localiza-se 20kb do gene ativo e está sabidamente envolvido em um processo de mutação
aonde ocorre uma inversão comum entre estas seqüências homólogas. Até o momento o DNA de 86 pacientes foi
analisado no Serviço de Genética Médica/HCPA para a identificação da mutação causadora da doença, através
da amplificação por PCR de toda região codificadora e junções exon/íntron seguido de SSCP (polimorfismo de
conformação de fita simples). O paciente apresentado aqui possui um padrão de bandas alterados quando da
análise dos amplicons dos exons 4 a 9. Não houve amplificação da região analisada para detecção da inversão
comum entre gene e pseudogene, nem da região que engloba os exons 2 e 3, incluindo o pseudogene. Esta alteração
sugere uma inserção ou um rearranjo complexo e deverá ser analisada através do estudo de DNA complementar.
De acordo com a literatura esses rearranjos ocorrem em cerca de 20% dos pacientes com Síndrome de Hunter.
Apoio: CNPQ/FIPE-HCPA
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Análise do gene Arilsulfatase B em pacientes
com Mucopolisacaridose tipo VI de Monte Santo/BA
e seus familiares
Costa-Motta, FMM1,2; Bender, F1; Schwartz, IV1; Giugliani, R1,4; Acosta, AX3,4; Leistner-Segal, L1,2
Laboratório de Genética Molecular, Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas, Rio Grande do Sul, Brasil
3
Faculdade de Medicina da Bahia, UFBA, Bahia, Brasil
4
Instituto Nacional de Genética Médica Populacional, INAGEMP, Brasil
1
2
Palavras-chave: MPS VI, ARSB, Mucopolisacaridoses, Análise molecular, Brasil
Mucopolissacaridose tipo VI (Síndrome de Maroteaux-Lamy - MPS VI) é uma doença autossômica recessiva,
causada pela deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-4-sulfatase gerando acúmulo de dermatan sulfato nos
lisossomos. No Brasil, a ocorrência de MPS VI é rara, sendo estimada em 1:1.298.469 nascidos vivos. O Município
de Monte Santo compreende uma área de 3.298 Km2, está a uma distância de 352 km de Salvador, Capital da
Bahia, e possui aproximadamente 56.602 habitantes. Nesse município têm sido diagnosticadas diversas doenças
genéticas (monogênicas) autossômicas recessivas. Esta observação sugere uma estrutura reprodutiva endogâmica
da população. Foram identificados em Monte Santo 10 casos de MPS VI, gerando frequências muito elevadas
quando comparadas com a literatura, sendo possível a existência de outros casos na região ainda não registrados.
Através de levantamento familiar, há relatos de várias ocorrências cujos pacientes já foram a óbito. O objetivo deste
trabalho é identificar as mutações presentes nestes pacientes, bem como dos possíveis portadores nas famílias e
definir haplótipos utilizando polimorfismos intragênicos de sequencia única (SNPs) nos familiares e pacientes,
para a identificação de uma possível origem comum do alelo mutado nesta população. Nas análises até então
realizadas, os 10 pacientes apresentaram a mutação p.H178L em homozigose. Em 2007 foi relatado um único caso
dessa mutação sendo o paciente brasileiro, até então não relacionado aos pacientes de Monte Santo, e portador da
mutação em heterozigose. Os nossos resultados junto com a análise do heredograma sugerem um efeito fundador,
tendo em vista que todos os pacientes possuem uma relação de parentesco.
Apoio: CAPES, CNPq e FIPE-HCPA
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Is there association between BDNF Val66Met
polymorphism and Machado-Joseph disease?
Fitarelli-Kiehl, M1,2; Emmel, VE1,2; Bock, H1,2; Jardim, LB3; Saraiva-Pereira, ML1,2,4
Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisa Experimental – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Laboratório de Genética Molecular – Serviço de Genética Médica – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
3
Departamento de Medicina Interna – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
4
Departamento de Bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Keywords: Machado-Joseph disease, BDNF, Val66Met polymorphism, real-time PCR
Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is an autosomal dominant
neurodegenerative condition, characterized by cerebellar ataxia and several associated symptoms. The disease is
mainly caused by an unstable expansion of the CAG repeat in MJD gene (locus 14q32.1), that results in an abnormal
expansion of a polyglutamine (polyQ) tract in the ataxin-3 protein. However, other factors can be acting as disease
modifiers. The brain-derived neurotrophic factor (BDNF) plays an important role in the development and maintenance
of adult neurons, and previous studies suggest that a polymorphism in the sequence of proBDNF (Val66Met) can have
an effect in neurodegeneration. Therefore, the aim of this work was to evaluate whether Val66Met polymorphism on
BDNF gene may influence age of onset of MJD patients. We have studied 100 unrelated MJD patients and 100 normal
controls. MJD patients were diagnosed by determining number of CAG repeats by PCR using fluorescent primers
followed by capillary electrophoresis in ABI 3130xl Genetic Analyzer. Val66Met polymorphism from BDNF gene was
genotyped using TaqMan® SNP Genotyping Assay (rs6265). We have then identified 74 homozygotes carrying Val
allele, 25 heterozygotes and 1 homozygote carrying Met allele in the control group. The patient group was composed
by 71 homozygotes Val, 26 heterozygotes and 3 homozygotes Met. The genotype distribution in both groups was
compared and we did not find any statistically significant difference between these groups (p=0.5823). We have also
analyzed for Hardy-Weinberg equilibrium and no deviation was observed. Frequencies of alleles Val and Met were
established to be 0.840 and 0.160 in MJD patients, and 0.865 and 0.135 in the controls, respectively. Allelic frequencies
were also compared and no statistically significant difference was observed between MJD patients and controls
(p=0.5727). We have also used multiple regression models to test the effect of Val66Met genotypes on age at onset in
affected individuals, while correcting for the predictive effect of CAG repeats length. We have then found a variation
effect of 72.4% on age at onset of both BDNF genotype and CAG repeats length together (p<0.001). However, effect
of the BDNF genotype alone was not statistically significant (p=0.277). The data shown here suggest no association
between BDNF Val66Met polymorphism and age at onset of MJD.
Financial Support: CNPq, FAPERGS and FIPE-HCPA.
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Mucopolissacaridose tipo VI no Brasil:
Analise molecular e distribuição geográfica
Bender, F; Costa, FM; Schwartz, IV; Giugliani, R; Leistner-Segal, S
Laboratório de Genética Molecular, Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
Palavras-chave: MPS VI, ARSB, Brasil, distribuição geografica, analise molecular
Mucopolissacaridose tipo VI (Síndrome de Maroteaux-Lamy - MPS VI) é uma doença autossômica recessiva,
causada pela deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (ARSB), que causa o acúmulo nas células
e excreção aumentada na urina de dermatan e coindroitin sulfatos. Num estudo prévio (Petry et al., 2003), nosso
grupo descreveu uma mutação comum (1533del23) no gene ARSB que estava presente em pacientes brasileiros
(18,4%). No Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre temos atualmente 80 amostras de
DNA de pacientes com MPS VI. Dentre estes, 68 são brasileiros com uma maior freqüência no Sudeste (47%) seguida
do Nordeste (35%). Destes, foi possível detectar mutação em ambos os alelos de 23 pacientes e em apenas um alelo
em 7 pacientes. Destes 30 pacientes (casos índices) onde pelo menos um dos alelos mutantes foi encontrado,
foram detectadas 13 diferentes mutações. A mutação com maior freqüência nesta amostra foi a 1533del23 com
28,3% dos alelos mutados. A mutação IVS5-8t>g estava presente em 6 indivíduos (3 homozigotos e 3 heterozigotos)
com uma freqüência alélica de 16,9%. Se considerarmos as quatro mutações (1533del23, IVS5-8t>g, IVS5-1g>c e
R315Q) mais freqüentes nos 30 pacientes com mutações detectadas desta amostra conseguimos um total de 69,7%
dos alelos mutados. A mutação 1533del23 foi analisada nos 80 pacientes mantendo a freqüência de 18,75% e se
encontra distribuída pelo Brasil. Já a mutação IVS5-1g>c (13,2%) foi encontrada somente em pacientes do estado
de Pernambuco. Os resultados obtidos confirmam a grande heterogeneidade genética entre pacientes com MPS
VI e justificam a dificuldade na análise de correlação entre genótipo e fenótipo nesta doença. A analise dos demais
pacientes encontra-se em andamento.
Apoio: FIPE – HCPA e Rede MPS Brasil
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Família brasileira do nordeste apresentando
co-ocorrência de MPS VI e Albinismo
Costa, MI1; Sabatini, R; Pesquero, JB; D’Almeida, V; Martins, AM; Soares, VRX4; Giovannetti, D4
Centro de Re-habilitação Infantil (CRI) Natal, Rio Grande do Norte, Brazil
Departmento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo, Brasil
3
IGEIM Instituto de Genética e Erros Inatos do Metabolismo, Universidade Federal de São Paulo, Brasil
4
BioMarin Brasil
1
2
Palavras-chave: MPS VI, Albinismo.
Introdução: A mucopolissacaridose tipo VI é uma doença autossômica recessiva rara devido à atividade deficiente
da N-acetilgalactosamina 4-sulfatase levando a um acúmulo progressivo de glicosaminoglicanos (GAG). Objetivo:
Discutir a herança e ocorrência de MPS VI em duas pacientes brasileiras, primas em primeiro grau e a co-ocorrência
de albinismo em uma delas e sua respectiva análise molecular para MPS VI. Material e Métodos: Paciente 1: GFTF,
nascida de pais jovens não consangüíneos, apresenta albinismo e MPS VI. Paciente 2: EKFST prima em primeiro
grau da paciente 1. Foi orientada pela família a procurar avaliação genética por apresentar sinais e sintomas
compatíveis com MPS VI sendo a mesma confirmada por ensaio enzimático. Resultados: Foram identificadas no
gene ARSB três mutações relevantes nas duas pacientes: GFTF, exon 2 (c427del G) e exon 5 (V375M), e EKFST,
exon 5 idêntica à primeira paciente e outra no exon 8 (c1533del 23). Discussão: A ocorrência da doença nas duas
pacientes relacionadas sem história de consangüinidade associada com presença de três mutações distintas no
ARSB chamou nossa atenção. Quando consideramos a co-ocorrência de albinismo em uma delas, isso pareceu
ainda mais inesperado. Quando coletamos informações sobre a etiologia do albinismo, encontramos um tipo cuja
ocorrência é devido a uma mutação no cromossomo 5 (5p13.3). A distância entre as duas mutações, (a mutação
para MPS VI localizada no 5q11-q13) torna o linkage improvável, o que faz deste um caso único na literatura.
Apoio Financeiro: BioMarin Brasil Farmacêutica Ltda.
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Deleção em região promotora do gene IDS em dois
pacientes com mucopolissacaridose tipo II
Brusius-Facchin, AC1; Abrahão, L2; Schwartz, IV2; Zanetti, A3; Tomanin, R3; Lourenço, CM4; Scarpa, M3;
Giugliani, R2; Leistner-Segal, L 1,2
Programa de pós-graduação em Medicina: Ciências Médicas-UFRGS
Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Universidade de Padova-Itália
Universidade de Ribeirão Preto
[email protected]
Palavras-chave: Mucopolissacaridose, Síndrome de Hunter, IDS, região promotora, deleção.
A mucopolissacaridose do tipo II (MPS II ou síndrome de Hunter) é uma doença lisossômica de depósito (DLD) de
herança recessiva ligada ao X, causada pela deficiência da L-iduronato-2-sulfato sulfatase (iduronato-sulfatase ou
IDS). A IDS é uma das enzimas responsáveis pela degradação dos glicosaminoglicanos heparan (HS) e dermatan
sulfato (DS). O gene que codifica a IDS foi mapeado no cromossomo Xq28.1, é composto por 9 éxons e 8 introns e
tem um tamanho aproximado de 24 kb. O promotor contém duas seqüências consenso do tipo GC Box, indicando
que os níveis de transcrição são baixos e que este é um housekeeping gene. O objetivo desse trabalho é determinar
a mutação patogênica nos pacientes com MPS II que foram previamente submetidos à análise de toda a região
codificadora do gene IDS, na tentativa de estabelecer a relação genótipo-fenótipo e permitir a identificação de
possíveis portadoras nas famílias. Após análise molecular de toda região codificadora e junções exon/íntron de
oitenta e seis pacientes com diagnóstico bioquímico para MPS II, foi encontrada a mutação patogênica na maioria
dos pacientes. Entretanto, em dez pacientes a mutação não foi detectada. Para esses pacientes, decidimos fazer
a análise da região promotora, a qual foi dividida em dois fragmentos sobrepostos e amplificada através da PCR
utilizando primers específicos, descritos por nós. Dois pacientes com características clínicas leves, apresentaram
uma grande deleção do segundo fragmento, detectada após eletroforese em gel de agarose. O fragmento
amplificado foi seqüenciado e uma deleção de 178pb foi observada. Ambas as mães e uma irmã foram analisadas
para a deleção e mostraram não serem portadoras. Os outros oito pacientes encontram-se em investigação através
de sequenciamento de toda a região promotora. Com isso, sugerimos que pacientes com MPS II sem mutação
detectada na região codificadora do gene IDS sejam analisados para mutações na região promotora.
Apoio: CNPQ/FIPE-HCPA
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Identificação e caracterização molecular do gene ABCD1
em famílias com adrenoleucodistrofia ligada ao X
Pereira, FS1; Giugliani, R1,3,5; Blank, D3; Matte, US1; Jardim, LB2, 3, 4
Centro de Terapia Gênica,
Laboratório de Medicina Genômica,
3
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre,
4
Departamentos de Medicina Interna e Departamento de Genética e Biologia Molecular
5
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
1
2
Palavras-chave: Adrenoleucodistrofia ligada ao X, X-ALD, gene ABCD1, Peroxissomos, VLCFA
A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é uma doença genética do metabolismo dos peroxissomos, na qual
a degradação dos ácidos graxos saturados muito longos (VLCFA) encontra-se impedida ou limitada. A X-ALD
afeta principalmente a córtex adrenal, a mielina do sistema nervoso central e os axônios centrais e periféricos.
O gene da X-ALD (ABCD1), contém 10 exons e ocupa 20 kb do DNA genômico no braço longo do cromossomo
X (Xq28). Mais de 200 mutações foram identificadas e a maioria delas (58%) é “privada”. O objetivo deste estudo
é caracterizar, do ponto de vista molecular, o gene ABCD1 em famílias com X-ALD atendidas no HCPA. Para
identificação da mutação no caso-índice de cada família, foi realizada amplificação dos 10 éxons do gene ABCD1
pela técnica da PCR e posterior triagem de mutações por SSCP. Até o momento, foram encontradas 17 mutações
em 33 famílias. A mutação p.Arg518Gln (descrita por Koike et al., 1995) ocorre em 2 famílias não relacionadas. As
demais mutações encontradas foram p.Pro623Lys, p.Glu577X, p.Glu477fs, p.Arg538_Met539ins27, p.Leu628Glu,
p.Trp137_Lys138insC, p.Ala232_Arg236del e p.Ile481Phe (não descritas na literatura) e p.Tyr296Cys (descrita
por Takano et al., 1999), p.Thr632Pro (descrita no site www.x-ald.nl), p.Trp601X (descrita por Gartner et al.,1998),
p.Trp326X (descrita por Barcelo et al., 1996), p.Ser358X (descrita por Coll et al., 2005) e p.Arg554His (descrita
por Korenke et al., 1997). As mutações novas serão anaçisadas por estudos de expressão para verificação do seu
caráter patogênico.
Apoio: FIPE-HCPA, CNPq.
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Análise dos genes SMN e NAIP em pacientes com
suspeita clínica de Atrofia Muscular Espinhal
Santos, FL1; Ramos, VG1; Araújo, APQC2; Cabello, PH1.
Laboratório de Genética Humana – Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ).
Instituto de Pediatria e Puericultura Martagão Gesteira – Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Nested PCR, SMN, NAIP, neurônio motor, diagnóstico molecular.
A Atrofia Muscular Espinhal (AME) é uma doença caracterizada pela degeneração de células do corno anterior
da medula espinhal. É a segunda mais comum desordem autossômica recessiva fatal depois da Fibrose Cística
(1:6000 nascidos vivos) afetando aproximadamente 1 em 10.000 nascimentos. O diagnóstico é baseado na fraqueza
proximal e simétrica com atrofia muscular.A classificação mais usada para as AMEs é a de Dubowitz (1978), que
as divide em Tipo I (Werdnig-Hoffmann), Tipo II ( forma intermediária) e Tipo III (Kugelberg-Welander). Com
o avanço da genética molecular, o gene das AMEs (I, II e III) foi localizado no braço longo do cromossomo 5,
quase simultaneamente, por três grupos independentes de pesquisadores. Em 1995 identificaram um gene que
denominaram SMN (gene de sobrevivência do neurônio motor) e simultaneamente identificaram um outro gene
NAIP (gene da proteína inibitória de apoptose neuronal). Os dois grupos de pesquisadores encontraram deleções
nestes genes em pacientes afetados pela AME, porém com uma freqüência bem maior no gene SMN. Esses
achados foram extremamente importantes e vários grupos, no mundo inteiro, começaram estudar esses genes
em pacientes. Entretanto, o mecanismo que leva à degeneração neuronal permanece desconhecido. Portanto
estudos de correlação genótipo-fenótipo são fundamentais para melhorar a compreensão acerca dos mecanismos
moleculares responsáveis pelas AMEs. O presente estudo tem o objetivo principal de diagnosticar pacientes com
suspeita clínica de Atrofia Muscular Espinhal, utilizando técnicas da biologia molecular, através da pesquisa de
deleção nos éxons 7 e 8 do gene SMN e éxons 5 e 6 do gene NAIP. As amostras dos pacientes com suspeita clínica
de AME são provenientes do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da Universidade Federal do
Rio de Janeiro. O DNA foi obtido através do protocolo adaptado de Lahiri & Nuremberg, a partir de uma alíquota
de sangue periférico. Para os éxons 7 e 8 do gene SMN, foi utilizado Nested PCR, seguido de digestão enzimática e
análise em gel de poliacrilamida 12%. Para os éxons 5 e 6 do gene NAIP, o produto da PCR foi analisado em gel de
agarose 2%. Dos 86 pacientes analisados, 26 apresentaram deleções compatíveis com a Atrofia Muscular Espinhal.
Destes, 3 foram diagnosticados clinicamente com AME I, 9 com AME II e 14 com AME III. A maioria dos pacientes
por nós estudados nasceu de primeira gestação, o que reforça ainda mais a importância do diagnóstico correto
para o aconselhamento genético nas futuras gestações do casal.
Apoio Financeiro: FAPERJ e CNPq.
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Diagnóstico molecular das principais doenças
neuromusculares na população do Rio de Janeiro
Ramos, VG1; Santos, FL1; Araújo, APQC2; Cabello, PH1
Laboratório de Genética Humana - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ).
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SMN, NAIP, DMD, diagnóstico molecular,
Dentre a infinidade de doenças de origem genética conhecida, existem algumas que são degenerativas e que
acometem os tecidos mais importantes. Neste trabalho são estudadas doenças neuromusculares frequentes na
população mundial: Distrofia Muscular de Duchenne e Becker, Distrofia Miotônica de Steinert e Atrofia Muscular
Espinhal. A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), que afeta 1/3.500 homens, é a mais grave das distrofias
hereditárias e sua herança é recessiva ligada ao cromossomo X. O gene DMD tem aproximadamente 2,3 milhões
de pares de bases distribuídos em 79 éxons, maior gene conhecido em seres humanos. A Distrofia Muscular de
Becker (DMB), que difere da DMD pela evolução lenta, trata-se de uma afecção mais benigna, de início tardio. A
clonagem destes genes mostrou que as duas doenças são de fato causadas por mutações diferentes no mesmo
locus. A Distrofia Miotônica de Steinert (DMS) é a forma mais comum dentre as distrofias musculares que afetam
indivíduos adultos, observa-se um incremento da gravidade clínica, de início cada vez mais precoce ao longo das
gerações, pois apresenta mutação dinâmica, que consiste no aumento da unidade repetitiva de uma geração a
outra. As manifestações mais comuns são: distrofia muscular, miotonia, fraqueza progressiva. O gene responsável
foi totalmente identificado, sendo denominado DMPK, é constituído por 14 éxons, nos pacientes, foi verificado que
no alelo 1 ocorre um aumento em seu comprimento, ao passo que o alelo 2 mantém constante o seu tamanho. A
partir de análises, foi observado que o aumento no tamanho do alelo 1 refletia o aumento da sequência repetitiva
CTG e com base em estudos de diversos alelos normais, estabeleceu-se que, em geral, o número de repetições
variava de 5 até 27. Com uma prevalência de 1/10.000 nascimentos, as Atrofias Musculares Espinhais (AMEs), são
doenças hereditárias do segundo neurônio motor, que causam fraqueza muscular progressiva: a AME I, a forma
mais grave, a Intermediária ou tipo II e a Juvenil ou tipo III. Elas são diferentes com relação à idade de início, à
gravidade e aos músculos afetados. Dois genes foram associados, o gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN)
e o da proteína inibitória de apoptose neuronal (NAIP). O principal objetivo deste trabalho é fazer o diagnóstico
diferencial dessas doenças através de técnicas moleculares, tendo em vista a grande dificuldade em estabelecer
o diagnóstico clínico correto, já que essas desordens apresentam um quadro clínico bastante semelhante. Até
o momento foram diagnosticados 119 pacientes, dentre os quais 47 com DMD, 59 com AME, 6 com DMS e 7
ainda inconclusivos. A caracterização molecular de cada doença específica, no menor tempo possível, propicia o
tratamento mais adequado, acarretando uma melhora na qualidade de vida.
Apoio Financeiro: Faperj e CNPq
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Análise de alelos mutantes longos nos genes de ATXN2
e ATXN7 em pacientes com suspeita clínica de ataxia
espinocerebelar
Furtado, GV1; Emmel, VE1,2; Jardim, LB3,4; Saraiva-Pereira, ML1,4,5
Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisa Experimental – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Departamento de Medicina Interna – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
4
Serviço de Genética Médica – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
5
Departamento de Bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
1
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Palavras-chave: ataxias espinocerebelares, análise molecular, mutações dinâmicas, SCA2, SCA7, TP-PCR.
As ataxias espinocerebelares tipo 2 (SCA2) e tipo 7 (SCA7) são doenças neurodegenerativas causadas por mutações
dinâmicas. Essas patologias são transmitidas de forma autossômica dominante e se caracterizam por apresentar
repetições trinucleotídicas CAG nos genes ATXN2 (locus 12q24.13) e ATXN7 (locus 3p21.1-p12), respectivamente.
Nos dois casos, expansões dessas repetições CAG é a causa primária das doenças e, o diagnóstico convencional, se
baseia na detecção da mutação (expansão trinucleotídica) no gene mutante pela reação em cadeia da polimerase
(PCR). Porém, em indivíduos com um grande número de repetições, a PCR convencional pode não ser eficiente
na amplificação do alelo longo, dando origem a um resultado falso negativo. Uma alternativa a ser aplicada nesses
casos é a técnica do triplet repeat primed PCR (TP-PCR). O objetivo deste estudo foi identificar a existência de
alelos mutantes longos através de TP-PCR e eletroforese capilar em amostras de pacientes com suspeita clínica
de uma ataxia espinocerebelar. As análises foram realizadas em 88 indivíduos com suspeita clínica de SCA2 e em
89 indivíduos com suspeita clínica de SCA7, todos eles com resultado de indivíduo homozigoto normal na região
de análise através de PCR convencional. De todos os pacientes, uma amostra de sangue foi coletada e o DNA foi
isolado e armazenado a –200C. As amostras de DNA foram submetidas à técnica de TP-PCR, a qual utiliza três
primers em uma mesma reação. Após a amplificação, as amostras foram submetidas a eletroforese no analisador
genético ABI 3130xl (Applied Biosystems) e os tamanhos das sequências amplificadas foram calculados pela
comparação com o marcador de peso molecular GS500-LIZ, através do programa GeneMapper (Applied Biosystems).
Dois controles heterozigotos com um alelo mutante, um controle heterozigoto com alelos normais e um controle
homozigoto com o alelo normal foram utilizados para a padronização da técnica. Amostras homozigotas para
alelos com 22 repetições CAG no gene ATXN2 foram incluídos no trabalho e não foi encontrado nenhum indivíduo
com o alelo mutante longo. No caso do gene ATXN7, a distribuição das amostras foi mais heterogênea, sendo que
81% das amostras eram homozigotas para alelos com 10 repetições CAG. Também nessa análise (gene ATXN7)
todas as amostras foram confirmadas com não portadoras de um alelo mutante longo. Concluindo, este estudo
proporcionou a introdução de uma análise mais específica para a eventual identificação de alelos mutantes longos
nos genes ATXN2 e ATXN7. A mesma metodologia pode ser adaptada para identificação de alelos mutantes longos
em outros genes. Com a análise descrita nesse trabalho, a metodologia laboratorial para diagnóstico de SCA2 e de
SCA7 foi melhorada, o que irá evitar a ocorrência de resultados falsos negativos através da aplicação isolada da
PCR convencional.
Apoio Financeiro: FAPERGS, CNPq e FIPE-HCPA.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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192
Análise da prevalência da Doença de Machado-Joseph
no Estado do Rio Grande do Sul- Brasil
Camargo, Ga,b,e; Rodrigues, CSMd,b; Godoy, BAc; Jardim, LBb,d; Schüler- Faccini, La,b,c,e
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular- UFRGS;
Serviço de Genética Médica – HCPA;
c
Universidade Federal do Rio Grande do Sul;
d
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas – UFRGS;
e
Instituto Nacional de Genética Médica Populacional – INAGEMP
a
b
Palavras-chave: Machado-Joseph, neurogenética, prevalência, cidades, Rio Grande do Sul
Doença de Machado-Joseph (DMJ) ou ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3) é uma desordem neurodegenerativa
de início tardio e de herança autossômica dominante que caracteriza-se principalmente por ataxia, espasticidade
e movimento ocular anormal. A DMJ é uma doença de origem açoriana com uma prevalência nas ilhas de Flores
e São Miguel de 8,2:100.000 e 27,1:100.000 respectivamente. No RS, devido a forte imigração vinda dos Açores,
encontramos uma alta prevalência da DMJ que é de aproximadamente 3,5:100.000, maior que em Portugal
(continente) que é de 1:100.000. A história da doença no Estado do Rio Grande do Sul e no Brasil aponta para um
possível efeito fundador que iniciou com as primeiras imigrações açorianas para o país. É relevante ressaltar que o
estado do RS parece ter uma maior incidência da doença em relação ao restante do Brasil, o que torna os estudos
clínicos e populacionais acerca da DMJ no Estado de grande importância. O principal objetivo deste trabalho é
verificar quais são as cidades do RS onde existe maior prevalência da DMJ visando um direcionar um trabalho
de aconselhamento genético específico nestas cidades. Foram utilizados para esta análise, até o momento, 367
indivíduos (110 famílias) provenientes dos Ambulatórios de Neurogenética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
Destes, 137 (37%) são oriundos da própria cidade de Porto Alegre e das cidades de Viamão (33 indivíduos – 9%),
Canoas (16 indivíduos – 4,3%). Quando se analisa a cidade de nascimento estes números são de 109 (30%) para
Porto Alegre, 17 (5%) para Santa Maria, 14 (4%) para Palmeira das Missões e 13 (3,5%) para Viamão e São Jerônimo.
Quando consideramos as famílias como unidade, verificamos que Porto Alegre (n=29 - 26,5%), Santa Maria (n=7
- 6,5%), General Câmara (n=3 – 2,8%) e Cruz Alta, (n=3 – 2,8%) são as cidades onde aparece o maior numero de
famílias. Como era esperado, a maior parte destas cidades tem história de colonização Portuguesa. Calculando a
prevalência mínima da DMJ em algumas cidades como, General Câmara (100:100.000), São Jerônimo (54:100.000),
Palmeira das Missões (30:100.000) e Cruz Alta (10:100.000), notamos que essas prevalências estão muito acima
daquelas esperadas para o Estado do Rio Grande do Sul, assim como para Portugal (continente) e Ilhas dos Açores.
O próximo passo deste trabalho é buscar um possível parentesco e/ou relação entre essas famílias.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES.
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193
Investigação da mutação 35delG/GJB2 em pacientes
com deficiência auditiva não sindrômica provenientes
de uma pequena cidade do nordeste da Bahia
Manzoli, GN1; Abe-Sandes, K1,2; Sann-Dias,
Acosta, AX1,3
DS2; Paulon, RMC2; Salles, C4; Fernandes, LC2;
Laboratório Avançado de Saúde Pública – LASP/CPqGM/FIOCRUZ;
Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da Bahia –UNEB;
3
Faculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia – FAMEB;
4
Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública – EBMSP/FBDC
1
2
Palavras-chave: 35DELG, GJB2, Deficiência auditiva, Bahia, Brasil
Estudos preliminares realizados no município de Monte Santo – BA, mostraram a presença de doenças genéticas
raras com alta prevalência associadas a elevado grau de endogamia e endocruzamento. A população deste
município é composta por 52.249 habitantes e a maioria reside na zona rural distribuídos em 150 povoados. A
deficiência auditiva (DA) é o déficit sensorial mais comum e resulta na restrição da habilidade de se comunicar
pela linguagem falada. Mutações no gene GJB2 são implicadas como uma das principais causas de DA genética,
sendo a mutação 35delG a principal causa de DA genética não sindrômica em europeus, com padrão de herança
autossômico recessivo. Para verificar a contribuição desta mutação nos pacientes com DA na região de Monte
Santo, analisou-se 53 amostras, correspondendo a 31 famílias. A análise foi realizada por PCR, seguida de digestão
pela enzima BstNI e visualização em gel de poliacrilamida 6% corado com prata. Observou-se que 15 pacientes
(28,3%) foram homozigotos para a mutação 35delG, 2 (3,8%) heterozigotos e 36 (67,9%) homozigotos selvagem.
A freqüência do alelo mutante foi de 22,9%. Entre os pacientes que possuiam a mutação a idade média foi de
23,7 anos, variando de 3 a 55 anos, cerca de 67% foram do sexo masculino, 93% possuiam familiares com DA, 58%
relataram consangüinidade entre os pais, todos os pacientes com a mutação e que foram questionados quanto ao
período de aquisição da DA relataram que esta foi congênita, cerca de 57% autodenominaram-se em relação a cor/
raça como brancos e todos relataram DA bilateral. Comparando os pacientes com e sem a mutação encontrouse resultados estatisticamente significantes para as variáveis “período de aquisição” e “autodenominação raça/
cor”, provavelmente devido a maior ancestralidade européia nestes indivíduos. Através deste estudo foi possível
confirmar DA genética, causada pela mutação 35delG/GJB2, em seis famílias. Confirmando a contribuição da
mutação 35delG nos casos de DA em Monte Santo-BA. A freqüência de homozigotos mutantes é mais elevada
nesta população quando comparada com outros estudos realizados no Brasil sugerindo efeito da endogamia e
endocruzamento. Entretanto esta freqüência é menor quando comparado com estudos realizados na Itália e
França, possivelmente devido à miscigenação nesta população.
Apoio Financeiro: Universidade do Estado da Bahia - UNEB
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Análise molecular dos genes GJB2, GJB6 E MTRNR1
em uma amostra de indivíduos surdos com etiologia
não definida
Svidnicki, MCCM1; de Moraes, VC1; Silva-Costa, SM1; Miranda, PMAD1; Pomilio, MCA2; Pereira, T2; Costa,
KC; Sartorato, EL1.
¹ Laboratório Genética Molecular Humana – CBMEG, UNICAMP.
2
Associação Terapêutica de Estimulação Auditiva e Linguagem – ATEAL.
Palavras-chave: Perda auditiva, Conexina 26, Conexina 30, MTRNR1, GJB2.
A perda auditiva é o mais comum dos defeitos sensoriais. Pode ser classificada em genética ou não-genética;
neurossensorial, condutiva ou mista. A perda auditiva neurossensorial, não-sindrômica de herança autossômica
recessiva é a mais freqüente dentre as de origem genética, sendo que as mutações no gene GJB2, o qual codifica a
proteína conexina 26, representam aproximadamente 80% dos casos. A mutação 35delG tem sido encontrada com
alta freqüência em muitos grupos étnicos, além de também ter sido observada em heterozigose em 10 a 42% dos
indivíduos afetados. Uma das hipóteses inclui a possibilidade de herança digênica, com a atuação do gene GJB6, que
codifica a proteína conexina 30. Além de mutações em genes nucleares, mutações em genes mitocondriais também
podem levar o indivíduo à perda auditiva. No gene MTRNR1A, a mutação mitocondrial A1555G (subunidade 12S
rRNA) foi o primeiro defeito molecular identificado como causa de surdez não-sindrômica, e tem sido reportada
em muitas famílias com padrão de herança materno e também em indivíduos que fizeram uso de antibióticos
aminoglicosídeos. Outra mutação mitocondrial relacionada à perda auditiva é a A827G, localizada no sítio A da
subunidade 12S rRNA do gene MTRNR1. Acredita-se que esta mutação sozinha não é suficiente para causar o
fenótipo da surdez e parece depender de fatores modificadores para a expressão do fenótipo em questão, assim
como de diferentes haplótipos, genes nucleares modificadores ou aminoglicosídeos. O objetivo deste estudo foi
rastrear algumas das principais alterações genéticas associadas à surdez não-sindrômica em 58 pacientes que
apresentam perda auditiva com etiologia não definida provenientes da Associação Terapêutica de Estimulação
Auditiva e da Linguagem - ATEAL, de Jundiaí SP. O estudo genético foi realizado no CBMEG a partir da extração
do DNA de leucócitos de sangue periférico. Inicialmente rastreou-se a mutação 35delG, e a seguir, por meio de
PCR multiplex, as deleções ∆(GJB6-D13S1830) e ∆(GJB6 D13S1854) envolvendo o gene GJB6. No gene MTRNR1,
foram detectadas as mutações mitocondriais A1555G por meio da técnica de PCR seguida digestão enzimática e
a mutação A827G por seqüenciamento automático. O gene GJB2 também foi completamente seqüenciado para
verificação de outras alterações. Dos indivíduos estudados, 10,3% apresentaram a mutação 35delG (gene GJB2) em
homozigoze. Não foram encontradas deleções envolvendo o gene GJB6. No gene MTRNR1 houve apenas um caso
da mutação A1555G e 8,6% dos pacientes apresentaram a mutação A827G. Outras mutações no gene GJB2 foram
também identificadas. Os resultados desse trabalho indicaram que a realização de testes genéticos para resolução
da etiologia da perda auditiva tem grande importância, já que esclareceram 10,3% dos casos, e portanto, podem
reduzir os custos de outros exames diagnósticos disponíveis na busca da causa da surdez.
Apoio: FAPESP, CNPq
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195
Detection of IVS 1+1 G>A/GJB2 mutation in Brazilian
deaf individuals using MLPA method
Silva-Costa, SM1; Coeli, FB1; Lincoln-de-Carvalho, CR2; Marques-de-Faria, AP2; Kurc, M3; Pereira, T4;
Pomilio, MCA4; Sartorato, EL1
Laboratório de Genética Molecular Humana – CBMEG – UNICAMP
Cidade Universitária Zeferino Vaz s/n, Barão Geraldo, Campinas-SP 13083-970,Brazil.
2
Departamento de Genética Médica – FCM – UNICAMP
3
Hospital Albert Einstein – São Paulo
4
Associação Terapêutica de Estimulação Auditiva e Linguagem - ATEAL
[email protected]
1
Keywords: Hearing loss, Mutation, GJB2, Connexin, MLPA.
Mutations in GJB2 gene are the most common cause of nonsyndromic sensorineural recessive hearing loss. One
specific mutation, c.35delG, is the most frequent in the majority of Caucasian populations and may account for
up to 70% of all GJB2 mutations. However, 10 to 40% of patients carry only one pathogenic mutation in the GJB2
gene which causes a problem in molecular diagnostic and genetic counseling. Deletions del(GJB6-D13S1830) and
del(GJB6-D13S1854), truncating the GJB6 gene have been detected in GJB2 heterozygous patients in different
populations. The IVS 1+1 G>A splice site mutation in the non-coding region of the GJB2 gene has been found
in heterozygous state in addition to c.35delG mutation. This mutation has not been reported in Brazilian deaf
patients. In the present study we investigated the presence of the IVS 1+1 G>A mutation by Multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) in 185 unrelated Brazilian patients with autosomal recessive nonsyndromic
sensorineural hearing loss (43 heterozygous patients and 142 without any pathogenic mutation in the GJB2 coding
region). We have found two patients (4,6%) carrying the IVS 1+1 G>A mutation in compound heterozygous with
c.35delG mutation.
Support: CNPQ
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196
Estudo da frequência da mutação A827G
em indivíduos ouvintes
Callefo, F¹; de Moraes, VCS¹; Miranda, PMAD¹; Tazinazzio, TG2; Colella-Santos, MF2; Sartorato, EL¹
¹Laboratório de Genética Molecular Humana – CBMEG – UNICAMP
2
Centro de Estudo e Pesquisa em Reabilitação “Gabriel Porto” – CEPRE - UNICAMP
[email protected]
Palavras-chave: Surdez, Mutação mitocondrial, A827G, Aminoglicosídeos, Polimorfismo.
A perda auditiva é um dos distúrbios sensoriais humanos mais comuns e pode se manifestar em qualquer faixa
etária, podendo ser adquirida ou hereditária. Quando hereditária, pode ser sindrômica ou não-sindrômica.
Estima-se que em até 2% dos casos de surdez não-sindrômica o padrão de herança seja materno, portanto
relacionado ao DNA mitocondrial (mtDNA). Estudos revelam que o uso de medicamentos aminoglicosídeos
somado a mutações em genes mitocondriais com eventual associação a genes moduladores nucleares estão
intimamente relacionados à modulação da expressividade e penetrância da surdez em humanos. Uma
específica mutação foi rastreada neste trabalho, a mutação mitocondrial A827G, que está localizada no sítio A
da subunidade menor 12S rRNA do ribossomo mitocondrial. A mutação A827G altera a estrutura terciária ou
quaternária do rRNA mitocondrial, podendo levar à disfunção mitocondrial e, desempenhando assim um papel
na patogenicidade da perda auditiva e na hipersensibilidade a aminoglicosídeos. A penetrância incompleta da
perda auditiva indica que a mutação A827G sozinha não é suficiente para produzir o fenótipo clínico da surdez,
necessitando do envolvimento de fatores modificadores, como os aminoglicosídeos. O uso desses antibióticos
pode levar a alterações nos sistemas auditivos e vestibulares, ocasionando concentração de líquidos da orelha
interna, gerando danos irreversíveis. No presente estudo, a mutação mitocondrial A827G foi estudada em
indivíduos ouvintes sem histórico de uso de antibióticos para estudar a freqüência dessa alteração em nosso
meio e avaliar se esta alteração trata-se de um polimorfismo na população. Foram estudados 120 indivíduos, dos
quais 8 apresentaram a mutação A827G, correspondendo a 6,66%. A mutação mitocondrial A827G trata-se de um
polimorfismo, uma vez que foi encontrada em mais de 1% na população. Apesar da patogenicidade da mutação
ainda não estar perfeitamente estabelecida, a alta incidência dessa alteração em nosso meio recomenda cautela
quanto ao uso de aminoglicosídeos em indivíduos portadores da mutação.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq
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New mutation in the MYOC gene,
c.1187_1188insCCCAGA, segregates with juvenile
open-angle glaucoma in a brazilian family
Braghini, CA1; Vasconcellos, JPC2; Soardi, FC1; Tavares, A1; Pião Jr, SRE1; Gil, GP1; Costa, VP2; Melo, MB1.
Laboratory of Human Molecular Genetics, Center of Molecular Biology and Genetic Engineering. 2Department of Ophthalmology, Faculty
of Medical Sciences, State University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
[email protected]
1
Keywords: MYOC gene, juvenile open-angle glaucoma, primary open-angle glaucoma, myocilin, olfactomedin domain.
Mutations in the MYOC gene account for most cases of autosomal dominant juvenile open-angle glaucoma (JOAG),
an earlier and more severe form of primary open-angle glaucoma (POAG), as well as in approximately 3% of late
onset POAG. Gain of function is the mechanism proposed to glaucoma development due to myocilin misfolding
leading to the increase of intraocular pressure (IOP) caused by congestion of the trabecular meshwork secretory
pathway. Missense mutations represent 85,9% of disease-causing variants while only 4,2% are small insertions.
The purpose of this study was to evaluate the MYOC gene in a four generation family with JOAG. A comprehensive
ophthalmic examination was performed. POAG was defined as untreated IOP over 21 mmHg, with characteristic
optic nerve and visual field glaucomatous damage. The MYOC gene coding regions and intron/exon boundaries
were evaluated through direct sequencing. A new mutation, c.1187_1188insCCCAGA, between the second and
third bases of amino acid 396 was observed, segregating with the disease in four individuals from three generations
and absent in 120 chromosomes from normal controls. This insertion leads to the inclusion of two amino acids,
aspartic acid and proline, in the olfactomedin domain. Although it does not truncate the protein, according to
secondary structure prediction programs, this mutation occurs just after a beta-sheet and within a casein kinase II
phosphorylation motif. The c.1187_1188insCCCAGA insertion is probably involved in JOAG etiology in this family.
Its location, close to conserved regions among members of the OLF-domain family, predicted to be involved in the
formation of beta-strands, might compromise the secondary structure and hence proper folding of the OLF-domain
as well as myocilin affinity for its extracellular ligands. The secretion status of a previously described mutation,
396INS397 demonstrated that this variant remained sequestered within the two cell lines assayed. Functional
studies should reveal if this mutation, as many others in the MYOC gene, impairs the secretion of normal myocilin.
Supported by FAPESP, grant #02/11575-0.
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Exclusion of 9 candidate LOCI for primary open angle
glaucoma in brazilian families
Santos, BAC1; Tavares, A1; Vasconcellos, JPC2; Costa, VP2; Lopes-Cendes, I3; Maurer-Morelli, CV3; Secolin,
R3; Bet de Moraes, MR4; Costa, FF5; Melo, MB1.
Laboratory of Human Molecular Genetics, Center of Molecular Biology and Genetic Engineering (CBMEG), State University of Campinas,
Campinas, São Paulo, Brazil. 2Department of Ophthalmology, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas, São Paulo, Brazil.
3
Laboratory of Human Molecular Genetics, Department of Medical Genetics, State University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
4
Department of Ophthalmology and Otorhinolaryngology, State University of Botucatu, Botucatu, São Paulo, Brazil.
5
Department of Clinical Medicine, Hemocentro, State University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil.
[email protected]
1
Keywords: MYOC gene, primary open-angle glaucoma, microsatellite.
Glaucoma is one of the major causes of irreversible blindness worldwide, characterized by progressive loss of optic
nerve ganglion cells, associated with correspondent visual field damage. Primary open-angle glaucoma (POAG)
is the most common form of glaucoma in the white, Hispanic and Afro-Caribbean populations. The increase of
intraocular pressure (IOP) and age are the two most important risk factors for the development of POAG and also
the contribution of genetic factors has been established. There are at least 13 loci (GLC1A – GLC1M) associated
with POAG identified from genetic mapping studies, most of them involving families that follow a Mendelian
inheritance pattern but only three genes were identified. The first described gene was myocilin (MYOC – GLC1A),
followed by optineurin (OPTN or Optic Neuropathy Induced Protein – GLC1E) and WD Repeat-Containing Protein
36 (WDR36 – GLC1G) genes. The purpose of this study is to evaluate nine candidate loci associated with POAG in
Brazilian families through linkage analysis. Comprehensive ophthalmic evaluation was conducted and genomic
DNA obtained from seven Brazilian families (121 individuals - 47 affected) with POAG. Thirty three microsatellite
markers were used to genotype nine candidate regions linked to POAG (GLC1A – GLC1I). Two-point linkage
analysis was performed using the MLINK program of the LINKAGE package. Among the seven families, two (28.6%)
presented mutations (Cys433Arg) in the MYOC gene (GLC1A) segregating with the POAG. The remaining 5 families
did not show evidence of linkage in GLC1C, GLC1E (OPTN gene), GLC1F, and GLC1G (WDR36 gene) with LOD scores
< -2.00. The data related to loci GLC1B, GLC1D, GLC1H and GLC1I were inconclusive (LOD score between +3.00 and
-2.00) being necessary the genotyping of additional microsatellite markers to narrow the candidate regions. MYOC
gene alterations appears to contribute to the development of POAG among Brazilian families with autosomal
dominant pattern of inheritance. However, the analysis of the remaining families support the heterogeneity of
POAG and stresses the importance of the evaluation of additional families in order to search for different loci and
predisposing genes to better understand the genetic basis of glaucoma.
Supported By FAPESP.
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Análise de variações de número de cópia
por SNP-arrays de tumor neuroendócrino pancreático
em paciente com a síndrome de von Hippel-Lindau
Laus, AC1; Pellegrino, R1; Vidal, JP1; Barreto, E1; Romano, S2; Brabo, EP3; Silveira, V3; Guaraldi, S4; Casalida-Rocha, JC1
Banco Nacional de Tumores e DNA, Instituto Nacional de Câncer - INCA, Rio de Janeiro, RJ.
Divisão de Patologia, Instituto Nacional de Câncer - INCA, Rio de Janeiro, RJ.
3
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, Rio de Janeiro, RJ.
4
Serviço de Endoscopia Digestiva, Instituto Nacional de Câncer - INCA, Rio de Janeiro, RJ.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Síndrome de von Hippel-Lindau, tumor neuroendócrino pancreático, SNP-array, câncer hereditário, gene VHL.
A síndrome de von Hippel-Lindau (VHL) é uma doença hereditária, causada por mutações no gene VHL (3p2526), que predispõe o portador a desenvolver tumores benignos e malignos em vários órgãos. O início dos sintomas
pode ocorrer a partir da infância e incluem angioma de retina (AR), hemangioblastoma (HB) de sistema nervoso
central, feocromocitoma (FE), carcinoma renal do tipo células claro (CR) e cistos múltiplos renais, pancreáticos,
hepáticos e de epidídimo. Os portadores de VHL têm aproximadamente 90% de chance de desenvolver diversos
tipos de tumores durante toda a vida, sendo que 12,3% desenvolvem tumores neuroendócrinos pancreáticos
(TNEP). As alterações genéticas secundárias à mutação germinativa no gene VHL envolvidas no desenvolvimento
dos tumores de pâncreas ainda não são bem conhecidos. Nesse estudo descrevemos a aplicação da técnica de
SNP-Array de alta resolução (em tumor pancreático de um paciente com diagnóstico de VHL cuja mutação
germinativa foi determinada por seqüenciamento em estudo do nosso laboratório (mutação frameshift no éxon
3 – 778delG). O paciente foi diagnosticado, aos 32 anos, com um carcinoma renal do tipo células claras no rim
direito, concomitantemente com um angiomiolipoma no rim esquerdo e um tumor de cabeça de pâncreas. Todos
os tumores foram removidos cirurgicamente, analisados pela patologia e armazenados no Banco Nacional de
Tumores e DNA do Instituto Nacional de Câncer, após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Foi então realizada a análise genômica global do tumor de pâncreas e do tecido pancreático normal, utilizando
o GeneChip Human Mapping 50K Set Xba240 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) com o intuito de identificar
variações de número de cópia de DNA (CNVs). A análise dos dados foi realizada pelo software Genotyping Console
(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), que detectou regiões de deleção nos cromossomos 3, 6, 8, 9, 17 e 21, e regiões
de ganho nos cromossomos 7, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19 e 22. Na literatura não há relato de nenhum estudo que
utilizou a técnica de SNP-array em TNEP de pacientes com VHL e, em tumores esporádicos, apenas um estudo
aplicou essa metodologia para detecção de CNVs. Pesquisas recentes têm apontado a importância das CNVs na
etiologia das doenças humanas, principalmente em tumores, os quais apresentam alta instabilidade genômica,
e rearranjos cromossômicos são de especial interesse. Sendo assim, este estudo contribui para o entendimento
dos mecanismos biológicos envolvidos no processo de carcinogênese dos TNEPs, uma vez que os CNVs descritos
podem indicar potenciais oncogenes e genes supressores de tumor que estariam envolvidos no desenvolvimento
desse tipo de tumor.
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200
Identificação de mutações germinativas no gene VHL
em famílias com a doença de von Hippel-Lindau
Barreto, EA1; Azevedo, MCGM1; Vidal, JP1; Gomy, I2; Casali da Rocha, JC1
1
2
Banco Nacional de Tumores e DNA, Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro – RJ
Serviço de Genética Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.
Palavras-chave: gene VHL, diagnóstico molecular, doença de von Hippel-Lindau.
A doença de von Hippel-Lindau é uma síndrome de câncer familiar multissistêmica causada por mutações
germinativas no gene VHL, um supressor de tumor localizado na região 3p25-26. Os sintomas podem aparecer em
qualquer faixa etária e em geral são: angioma de retina, hemangioblastoma de sistema nervoso central, carcinoma
renal de células claras, tumor de saco endolinfático, feocromocitoma e cistos múltiplos renais, pancreáticos,
hepáticos e de epidídimo. A doença é de padrão autossômico dominante, com incidência aproximada de 1 a cada
36000 nascimentos, com uma penetrância alta de 97% até os 60 anos. O diagnóstico da doença baseia-se em critérios
que consideram a história familial e a apresentação clínica das lesões, além da análise molecular das mutações
germinativas. O objetivo do estudo é identificar as mutações germinativas em pessoas diagnosticadas como
portadoras de VHL de acordo com as suas manifestações clínicas e, então, oferecer o teste preditivo aos familiares
assintomáticos. Para participar do estudo os pacientes assinaram o termo de consentimento do Comitê de Ética
em Pesquisa local autorizando a realização do mesmo. A análise do gene VHL foi feita a partir do DNA extraído
de sangue periférico com o uso de kit comercial. Em seguida foi feita a reação de PCR para a amplificação dos três
éxons do gene VHL e sequenciamento direto dos mesmos no sequenciador semi-automático ABI377. As sequências
foram analisadas com auxilio de um software específico, a procura de mutações pontuais, que correspondem a 80%
dos casos. Quando não encontrada a mutação, a pesquisa se concentrava na análise de grandes deleções, que
correspondem a 20% das mutações. A ferramenta utilizada para análise de grandes deleções é o MLPA (Multiplex
Ligation Probe Amplification). Esta consiste em uma PCR multiplex capaz de detectar mudanças no número de
cópias das diferentes sequências amplificadas. Foram analisados 82 indivíduos pertencentes a 23 famílias com VHL
incluídas a partir de 2006. Foram encontradas 20 mutações diferentes nos 23 probandos, sendo 90% de mutações
pontuais e o os outros 10% de grandes deleções. As mesmas mutações detectadas nos probandos também foram
encontradas em cinco familiares afetados. O teste preditivo foi oferecido a 54 familiares assintomáticos, sendo que
em 10 deles a mutação foi detectada e estes foram encaminhados para o programa de rastreamento de lesões. Os
resultados desse estudo contribuem para uma melhor compreensão da doença, além de oferecer um diagnóstico
precoce importante para a avaliação de riscos, orientação de medidas preventivas e aplicação da melhor terapia,
aprimorando a atenção dada as famílias dos portadores de VHL. A pesquisa molecular do gene VHL continua a ser
oferecida no INCA, atualmente cinco famílias estão em análise.
Apoio: INCA e CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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201
Avaliação das mutações somáticas no gene VHL em
carcinomas renais de células claras associados à
síndrome de von Hippel-Lindau
Vidal, JP1; Laus, AC1; Barreto, E1; Pellegrino, R1; Romano, S2; Casali da Rocha, JC1
Banco Nacional de Tumores e DNA, Instituto Nacional de Câncer - INCA, Rio de Janeiro, RJ.
Divisão de Patologia, Instituto Nacional de Câncer - INCA, Rio de Janeiro, RJ.
Palavras-chave: carcinoma renal, celulas claras, VHL, mutações somaticas, cancer hereditario.
Introdução: A síndrome de VHL é uma doença hereditária, multissistêmica e de apresentação clínica variada. É
caracterizada pela inativação do gene VHL, um gene supressor de tumor. A síndrome apresenta a combinação de
tumores malignos e benignos em diversos órgãos, sendo que aproximadamente 25.3% dos portadores apresentam
o carcinoma renal de células claras (CRC). Nos casos de CRC associados à síndrome de VHL, é frequente a
associação de múltiplos tumores, além do acometimento de ambos os rins. Nesses tumores é sugerido que as
mutações somáticas sejam independentes e não clonais. Mutações somáticas e perda de heterozigose envolvendo
o gene VHL são achados freqüentes no CRC associado com a doença VHL (45-90%), ao passo que eventos
epigenéticos, como metilação, são observados com menor freqüência (5-19%). Objetivos: O objetivo desse projeto
é correlacionar as mutações somáticas existentes nos múltiplos tumores de um mesmo paciente portador de
CRC e confirmar se essas são independentes ou clonais. Metodologia: Análise de 41 amostras de tecido (34 CRCs
e 7 rim normal) provenientes de 7 pacientes está em curso. Todas as amostras foram removidas cirurgicamente,
revistas pelo Serviço de Patologia e armazenadas no Banco Nacional de Tumores e DNA do Instituto Nacional de
Câncer (INCA). O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA e todos os pacientes
participantes assinaram o Termo de Consentimento. As amostras foram microdissecadas e o DNA foi extraído
utilizando-se kit comercial disponível. Os três éxons do gene VHL foram amplificados por PCR com a utilização de
primers específicos, seguido por seqüenciamento direto em um seqüenciador semi-automático ABI377. Análise das
mutações foi realizada utilizando-se software especifico. Para a avaliação do status de metilação, PCR específica
de metilação (MSP) foi utilizada onde alíquotas dos DNAs extraídos foram tratadas com bisulfito (com utilização
de um kit comercial) e amplificadas com primers específicos da região promotora do gene VHL. Resultados: Até
o presente momento, dois pacientes já tiveram as mutações somáticas diagnosticadas: perda de heterozigose em
quatro tumores distintos em um dos pacientes e mesma mutação pontual em quatro tumores no segundo paciente.
O sequenciamento do gene VHL do restante dos pacientes encontra-se em fase final de análise. Quanto ao status
de metilação, todas as amostras dos pacientes participantes foram testadas, não sendo encontrado nenhum grau
de metilação presente. Conclusão: Os resultados preliminares encontrados sugerem uma mudança no paradigma
das mutações somáticas no gene VHL em CRC. Ao contrário do que era sugerido, as mutações somáticas nos
múltiplos tumores de um mesmo paciente parecem não se tratarem de eventos independentes e há indícios de
que esses tumores sejam clonais.
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202
Detecção de uma possível mutação causadora da
Osteogênese Imperfeita em um paciente no estado do
Espírito Santo
Quirino, GA¹; Moraes, MVD¹; Rebouças, MRGO²; Sipolatti, V²; Nunes, VRR²; Akel, ANJ²; Perrone, AMS¹;
Louro, ID¹; Paula, F¹
¹Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).
²Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (HINSG), ES.
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Osteogênese Imperfeita, colágeno tipo I, COL1A1, triagem de mutações, correlação genótipo X fenótipo.
A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença predominantemente autossômica dominante, caracterizada
por fragilidade e deformidade óssea. É causada por mutações principalmente nos genes COL1A1 e COL1A2,
codificadores das cadeias de pró-colágeno alfa 1 e 2 do colágeno tipo 1. A OI apresenta grande variabilidade clínica,
com casos de manifestação leve, com pouca ou nenhuma fratura, até morte intra-útero. O estudo molecular é
importante para identificar o perfil de mutações em pacientes com OI e definir o diagnóstico molecular. O objetivo
desta pesquisa foi estudar os exons 20, 21 e 22 da região central do gene COL1A1 em pacientes com OI no Espírito
Santo por meio de PCR-SSCP e sequenciamento. Foram analisadas amostras sanguíneas de 29 pacientes não
consaguíneos atendidos no Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (HINSG) no município de Vitória (período
de coleta: 2006 a 2008), além de 107 amostras de controles normais. O DNA foi extraído e amplificado por PCR,
utilizando primers descritos por Körkkö et al.(1998). A triagem de mutações foi feita pelo método comparativo de
Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (SSCP) descrito por Orita et al (1989), com gel de poliacrilamida
de 5%. Em três pacientes (C8, C12 e C57) foram detectadas alterações em gel de SSCP. Após sequenciamento,
foram observadas nos pacientes C12 e C57 substituições distintas no mesmo ponto do intron 19, sendo C>G em
C12 (c.1299 – 8C>G) e C>T em C57 (c.1299 – 8C>T). Cinco controles normais apresentaram o mesmo padrão de
bandas que C12 e C57, o que sugere a presença de uma das substituições também nesses controles. A frequência
dessas alterações na população não afetada pela OI (4,7%) sugere que seja um caso de polimorfismo normal, dado
que será confirmado pelo sequenciamento posterior das cinco amostras. O dado mais significativo observado
neste estudo foi a substituição, no paciente C8, de uma guanina por uma adenina 52 nucleotídeos antes do início
do exon 20 (c.1299 - 52 G>A). O paciente C8, do sexo masculino, foi diagnosticado como portador da OI tipo IV,
a forma moderada da doença. Com nove anos de idade, tem 28Kg e 1,12m e, até o momento, já sofreu mais de
70 fraturas. A alteração verificada neste paciente não foi encontrada nos 107 indivíduos normais. Assim, devido
à localização e à freqüência da alteração, sugere-se que seja um caso de mutação de splicing, possivelmente
responsável pela OI neste paciente. Através de estudos mais aprofundados, como a análise do mRNA, será possível
confirmar se esta alteração é mesmo causadora da OI no paciente. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem
novas informações sobre os aspectos genéticos da OI, o que é fundamental para o aconselhamento genético e para
definir-se, futuramente, estratégias para o diagnóstico molecular e o tratamento mais adequado.
Patrocínio: ArcelorMittal Tubarão, FAHUCAM, FACITEC e FAPES.
Apoio: HINSG, UFES, CNPq.
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203
Detecção de uma nova mutação no gene COL1A1 em
uma família com Osteogênese Imperfeita Tipo I
Moraes, MVD1; Quirino, GA1; Almada, BVP1; Rebouças, MRGO2; Sipolatti, V2; Nunes, VRR2; Akel, ANJ2;
Perrone, AMS1; Louro, ID1; Paula, F1
Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória de Vitória – ES (HINSG).
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Osteogênese Imperfeita, colágeno tipo I, COL1A1, correlação genótipo: fenótipo, aconselhamento genético.
A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma desordem Mendeliana do tecido conjuntivo caracterizada por fragilidade
óssea e suscetibilidade a fraturas. A OI Tipo I é resultante de mutações nos genes COL1A1 ou COL1A2, que
codificam as cadeias de pró-colágeno alfa-1(I) e alfa-2(I) do colágeno Tipo I, respectivamente. A expressão reduzida
de uma das cadeias de pró-colágeno alfa-1(I) ou a expressão de cadeias de pró-colágeno alfa-1(I) defeituosas são
fatores determinantes para a OI Tipo I. Este trabalho teve como objetivo o estudo molecular do gene COL1A1 em
indivíduos de uma mesma família (mãe e filho) com fenótipos clínicos característicos de OI Tipo I. A partir do
gDNA extraído de 5mL de sangue periférico, fragmentos de exons e regiões flanqueadoras de todo o gene COL1A1
do paciente, e fragmentos dos exons 37 e 40 do gene COL1A1 da mãe, foram amplificados por PCR, submetidos à
triagem de mutações por Single Strand Conformation Polymorphisms (SSCP), sequenciamento automatizado dos
fragmentos alterados e análise, de acordo com as seqüências de referência do gene COL1A1 GenBank NG_007400.1
(gDNA) e GenBank NM_000088.3 (cDNA), para fins de correlação genótipo: fenótipo. A análise molecular do gene
COL1A1 no paciente OI tipo I, atendido no Hospital Infantil N. Sra. da Glória, Vitória/ES-Brasil, do sexo masculino,
16 anos, 154 cm, 40 kg, IMC/I = P3, P/I < P3, E/I < P3, com histórico de 2 fraturas, escoliose, esclerótica azulada
e comprometimento auditivo, revelou a presença da mutação patogênica inédita c.2750delG (exon 40), além do
polimorfismo não patogênico p.Pro823Ala (exon 37), previamente descrito por Mackay et al. (1993). A análise
molecular de fragmentos dos exons 37 e 40 do gene COL1A1 na mãe, 45 anos, 164 cm e 72 kg, que apresentou
esclerótica azulada, comprometimento auditivo e um histórico de 9 fraturas, revelou a presença das mesmas
alterações, sugerindo um padrão de herança autossômico dominante. O pai (II-3), com 43 anos de idade, e os tios
maternos do paciente (seis homens e duas mulheres), com idade média de 36 anos (DP=10,50), não apresentaram os
sinais ou sintomas típicos da doença. Contudo, os familiares assintomáticos também deverão ser analisados uma
vez que a variabilidade fenotípica intrafamiliar em OI Tipo I é frequente e significativa, o que pode comprometer
o aconselhamento genético familiar e a prevenção do surgimento de novos casos da doença. A deleção de um
aminoácido guanina codificante (c.2750delG) no gene COL1A1 resulta na interrupção precoce da síntese de uma
das cadeias de pró-colágeno alfa-1(I) pela formação de um códon de parada prematuro (p.Gly917AspfsX191), o que
corrobora com os achados literários em OI tipo I associados à haploinsuficiência do gene COL1A1. Assim, estudos
moleculares em Osteogênese Imperfeita visam uma melhor compreensão da etiologia genética e variabilidade
clínica da doença.
Apoio Financeiro: Arcelormittal Tubarão, FAHUCAM, FACITEC e FAPES.
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204
Mutational analysis of TGIF and SIX3 genes in patients
with new syndrome observed within the frontonasal
dysplasia spectrum
Pola, L1; Bertolacini, CD1; Zechi-Ceide, RM2; Richieri-Costa, A2; Ribeiro, LA1.
Molecular Laboratory, Hospital of Rehabilitation of Craniofacial Anomalies (HRAC), University of São Paulo, Bauru, SP.
Department of Clinical Genetics, Hospital of Rehabilitation of Craniofacial Anomalies (HRAC), University of São Paulo, Bauru, SP.
[email protected]
1
2
Keywords: morning glory. TGIF. SIX3. medline defects. agenesis of the corpus callosum. basal encephalocele. ocular abnormalities.
spectrum of frontonasal dysplasia syndrome.
There are several syndromes involving the frontonasal process and one of them is characterized by medline defects,
agenesis of the corpus callosum, basal encephalocele syndrome and ocular abnormalities and it is considered
member of the spectrum of frontonasal dysplasia syndrome (DFN). The abnormalities observed in this condition
are related to embryologic development period, therefore, occur at the same critical period of time. Until the
moment there is no evidence of any particular gene involved at the etiology of present condition, however, it is
already known there are several genes exerting effects during the cited period. The aim of this work was verify
whether genes SIX3 and TGIF mutations are involved in the etiology of this new syndrome observed within the
DFN spectrum in 7 patients whose causes of their abnormalities were not yet clarified. To assess the candidate
genes, it were executed procedures of DNA extraction from peripheral blood lymphocytes, gene amplification
followed by purification, sequencing and amplicons analysis of genes SIX3 and TGIF. For SIX3 gene, all patients
in the sample presented normal sequences for 2 analyzed amplicons. For TGIF gene, all patients presented the
274A>C polymorphism (rs 238132); the patient 3 presented the new missense mutation T151A in exon 3 and the
P163S (rs 4469717) polymorphism; patient 5 presented P140P (rs 2229331) and P163L (rs 2229333) polymorphisms.
No association was found among SIX3 and TGIF genes and the spectrum of frontonasal dysplasia syndrome in
the studied sample. We propose the molecular analysis for more genes involved in the formation of craniofacial
structures.
Apoio Financeiro: CNPq
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205
Alport syndrome: study of brazilian families with
different genetic inheritance patterns
Noronha, E¹; Raskin, S²; Santos, W¹; Pereira-Ferrari, L¹
¹ UNIBRASIL - Laboratório de Genética –Escola de Saúde - Faculdades Integradas do Brasil. Curitiba, PR.
²GENETIKA – Laboratório e Centro de Aconselhamento de Genética – Curitiba, PR
[email protected]
Keywords: Alport syndrome, hematuria, COL4A3, COL4A4, COL4A5.
Alport syndrome is known as hematuria, nephropathy, sensorineural deafness, ocular anomalies and nephropathy
or hemorrhagic familial nephritis. This syndrome can be characterized by glomerular basement membrane
abnormalities leaving it closer than a normal individual. The disease is caused by a mutation at genes that encodes
the collagen. The inheritance pattern depends on the involved gene, it can be X-linked (COL4A5 gene) and recessive
or dominant autossomal inheritance (COL4A4/COL4A3 genes). The incidence in population 1:5000. Women usually
express light signs and men express serious symptoms with quick progression. The syndrome’s physiopathogenesis
is associated to the incapacity of the affected individual to encode all the components of glomerular basement
membrane collagen. The main of this work is to study the clinical manifestations and molecular aspects of Alport
syndrome, presenting a bibliographic review showing the different inheritance observed. On this research was
done a study of families subjected to molecular evaluation using Polymerase Chain Reaction (PCR) and gene
sequencing techniques to confirm the diagnose of Alport syndrome. Three families were analyzed, with different
inheritance patterns: Family B presents Alport syndrome with recessive inheritance X-linked; family C is a case of
Alport syndrome with dominant inheritance X-linked and family K is carrier of Alport syndrome with autossomal
inheritance. The analysis of these families allowed observing that independently where the mutation is located, the
symptoms and diagnosis are the same, with the possibility to be lighter or more pronounced.
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206
Síndrome de Christ-Siemens-Touraine (Displasia
Ectodérmica Hipoidrótica): relato de caso
Ferraz, IPRP 1; Ribeiro-Paes, JT 2; Borges, A1; Villa, RT1; Bedin, V1
1 Fundação Educacional Souza Marques/Fundação Pele Saudável – São Paulo, SP
2 Depto. Ciências Biológicas – UNESP – Campus de Assis, SP
Palavras-chave: displasia ectodérmica, hipoidrose, alopecia, atelia, oligodontia, atrofia de glândulas écrinas
A displasia ectodérmica hipoidrótica (DEH) ou Síndrome de Christ-Siemens-Tourraine é uma anomalia
heredofamiliar com padrão de herança recessivo ligado ao X. A incidência estimada é de 1 para 100.000 nascidos. A
síndrome caracteriza-se, basicamente, pela tríade: hipoidrose, oligodontia e hipotricose. Outros traços fenotípicos
comuns incluem a hipoplasia ou ausência de mamilos (atelia), febre recorrente na infância e graus variáveis
de xerose. Relata-se, nesta comunicação, o caso clínico de uma jovem de 16 anos com história clínica de bom
desenvolvimento neuromotor, com freqüentes episódios febris na infância, notado (pela mãe) sobretudo aos 3
anos de idade, sudorese escassa, unhas distróficas e alopecia. Ao exame clínico apresenta: eczema em palmas das
mãos, xerose difusa, estrabismo convergente, raiz nasal baixa e larga, ausência de comissura labial, microdontia,
atelia, pelos pubianos escassos, pterígio ungueal, sindactilia parcial entre 3o e 4o quirodáctilos. A biópsia de pele
apresentou atrofia epidérmica e de glândulas écrinas. A paciente apresenta performance intelectual adequada para
a sua faixa etária, com bom desempenho escolar Os achados fenotípicos e resultados laboratoriais são compatíveis
com a hipótese diagnóstica de DEH. È importante o acompanhamento da paciente, com suporte clínico visando
tratamento dermatológico e odontológico. Deve-se, também, considerar o esclarecimento de pacientes afetados
e mulheres portadoras de DEH, quanto aos riscos de transmissão, bem como atenção para o diagnóstico precoce
nos descendentes, a fim de se instituir o pronto atendimento nos episódios de hipertermia, evitando-se, dessa
forma, danos neurológicos e/ou morte súbita das crianças acometidas pela síndrome.
Apoio financeiro: Fundação Pele Saudável – São Paulo, SP.
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Análise mutacional em natimortos com síndrome de
Melnick-Needles e identificação de mutação nova no
éxon 22 do gene FLNA
Pereira, L1; Santos, HH2; Garcia, PP3; Leão, LL2; Aguiar, RAPL4; Lana, AMA3; Aguiar, MJB2,5; Carvalho, MRS1
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
Serviço Especial de Genética do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
3
Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
4
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
5
Departamento de Pediatria da Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
[email protected]/ [email protected]
1
2
Palavras-chave: Melnick-Needles, FLNA, Otopalatodigital, filamina A, éxon 22
Síndrome de Melnick-Needles (MNS) é uma condição rara com padrão de herança dominante ligado ao X,
sendo letal no sexo masculino. MNS é causada por mutações no gene FLNA, que codifica a proteína filamina
A. Foram descritas três mutações, relacionadas com MNS, no éxon 22 do gene FLNA que causam substituições
de aminoácidos (D1184E, A1188T e S1199L). Mutações no mesmo gene são responsáveis pelas Síndromes
Otopalatodigital tipo 1 e tipo 2 e Displasia Frontometafiseal. Nosso objetivo nesse estudo foi detectar mutações
no éxon 22 do gene FLNA em dois natimortos com diagnóstico post-mortem de MNS e respectivas mães com
diagnóstico clínico de MNS. Os DNAs utilizados nas análises foram extraídos de tecido incluso em parafina dos
natimortos e de sangue periférico das mães. A análise do DNA das mães foi realizada através de reação em cadeia
da polimerase e sequenciamento direto. O sequenciamento do DNA dos natimortos foi realizado após PCR heminested e clonagem em plasmídeo TOPO2.1 (Invitrogen). Através da análise genético-molecular foi confirmado o
diagnóstico clínico de todos os indivíduos. Foi identificada, em um dos casos, a mutação 3845C→T (NM 001456.3)
no éxon 22 que substitui um aminoácido serina por um leucina na posição 1199. No outro caso foram identificados
dois nucleotídeos mutados (3776G→A e 3777G→T - em relação à sequência de referência NM 001456.3) que levam
à substituição do aminoácido glicina por ácido aspártico na posição 1176. A mutação 3845C→T, que havia sido
descrita na literatura apenas nas mães de afetados ou em homens mosaicos, foi identificada pela primeira vez
em um natimorto afetado, confirmando seu papel no desenvolvimento do fenótipo. A outra mutação (G1176D)
foi identificada pela primeira vez neste estudo, estando presente também na mãe e natimorto. A substituição de
um aminoácido pequeno e neutro por outro grande e ácido nos faz supor um ganho de função da proteína. Numa
próxima etapa deste trabalho, vamos desenvolver estudos bioinformacionais para melhor caracterizar o efeito
desta mutação.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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Chromosome rearrangements detected by
Affymetrix Mapping 50K SNP-array in a patient with
Neurofibromatosis type I associated with de novo
Jaffe-Campanacci syndrome
Pellegrino, R; Casali da Rocha, JC
Instituto Nacional do Câncer
Banco Nacional de Tumores
Keywords: Neurofibromatosis 1, SNP-array, copy number variation, Jaffe-Camapanacci, genetic alterations.
Neurofibromatosis type 1 (NF1), also known as von Recklinghausen syndrome, is one of the most common
autosomal dominant diseases and its incidence is around 1/3,000–4,000 live people. Patients with NF1
microdeletion often show variable facial dimorphisms, mental retardation, developmental delay, and increased
number of neurofibromas per age. In 1942, Jaffe and Lichtenstein first described nonosteogenic fibroma (now
known as nonossifying fibroma) of bone as a frequently benign fibrous lesion of the long bones. Subsequently, in
1958, Jaffe described a rare clinical entity in which multiple nonossifying fibromas occurred in association with
café-au-lait spots and axillaries freckling, but without accompanying neurofibromas which was suggested as a
unusual form of neurofibromatosis. In the present study, we show the relationship between NF1 microdeletion
and Jaffe-Campanacci syndrome. We followed-up one patient with NF1 phenotype and clinical signals of JaffeCampanacci syndrome. The NF1 diagnosis was confirmed by Fluorescence in situ Hybridization (FISH) analysis
performed by Nichols Institute at Baylor College of Medicine (Kleberg Cytogenetic Lab), Houston, Texas, which
shows a deletion involving the NF I critical region on chromosome 17. Our purpose was to confirm FISH findings
and search for other germline rearrangements. The study protocol was approved by the local ethical committee
at INCA and CONEP (National committee of research). The DNA from blood cells was isolated using DNEasy
Blood and Tissue kit following the manufactures recommendations. Array experiment was performed according to
the Affymetrix GeneChip Mapping 50K array XbaI-cleaved DNA (250ng) standard protocol (Affymetrix Inc., Santa
Clara, CA, USA), detecting 58.960 SNPs. We used Genotyping Console (Affymetrix) for Copy Number data analysis.
We fully described here one patient with de novo Jaffe-Campanacci syndrome, including clinical and molecular
aspects of the disease. A genomic deletion of 2.3 MB involving the NF1 critical region using the Affymetrix Mapping
50K Xba single-nucleotide polymorphism array was detected. We also found losses and gains in other regions
from chromosome 1, 7, 15 and 16. The recent findings that large (>1 kb) insertions and deletions of DNA segments
contribute significantly to human genome variation have focused the attention of human geneticists on the role
of CNVs in the etiology of human genetic disease. Disclose the NF1 and Jaffe-Campanacci may be associated
with other germline rearrangements we are investigating the genes involved in deletions and amplifications and
preparing their validation by Real-Time PCR.
Support: FAF
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Análise functional in vivo e in vitro das isoformas
normal e mutada (Q128X) da proteína UBE2A humana
revela possível mecanismo de auto-modulação por
auto-ubiquitinação e degradação proteassômica
Nascimento, RMP1; Monteiro, G1; Vieira NM1; Netto LES1; Vianna-Morgante, AM1
1 Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP.
Palavras-chave: UBE2A, RAD6, ubiquitinação de proteínas, deficiência mental, cromossomo X.
A ubiquitinação de proteínas é uma modificação pós-traducional que consiste na adição de uma ou mais
moléculas de ubiquitina a proteínas específicas, alterando sua função, localização celular ou direcionando-as
para a degradação no proteassoma, havendo evidências de seu papel no desenvolvimento neuronal. Em 2006,
descrevemos uma mutação no gene UBE2A, codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de
nova síndrome de Deficiência Mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de uma
mutação em uma enzima conjugadora de ubiquitina como causa de uma patologia em humanos. Recentemente,
uma nova mutação neste gene foi relacionada à DM, evidenciando sua importância no neurodesenvolvimento.
O gene UBE2A é um dos homólogos humanos do gene RAD6 de Saccharomyces cerevisiae. Em humanos e outros
mamíferos, o gene RAD6 está duplicado, com uma cópia autossômica (UBE2B) e uma ligada ao X (UBE2A), ambas
capazes de complementar os fenótipos apresentados pela levedura mutante quanto ao gene ortólogo (RAD6).
A mutação encontrada em nossos pacientes (C.382C-T) introduz um códon de parada prematura que elimina
os últimos 25 aminoácidos da proteína que originalmente tem 152. Visando compreender como a mutação de
nossos pacientes afeta a função de UBE2A, realizamos estudos funcionais in vivo em S. cerevisiae, e avaliamos a
capacidade de a proteína mutada ubiquitinar histonas H2A in vitro. Os dados de complementação funcional em
linhagem selvagem e delta-RAD6 de S. cerevisiae revelaram que a proteína mutada não é capaz de restaurar os
fenótipos da levedura mutante, além de ser tóxica para essa linhagem. O fenótipo de toxicidade não foi observado
após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Western blotting dos extratos protéicos das linhagens de S.
cerevisiae após a expressão do gene humano e de células de tecido adiposo de um dos pacientes revelou, apenas na
linhagem delta-RAD6, a presença da proteína UBE2A mutada, sugerindo que a mesma seria degradada na linhagem
selvagem e nas células do paciente. As análises de atividade in vitro mostraram que a proteína UBE2A normal é
capaz de se auto-ubiquitinar principalmente na ausência de substrato. Ainda, confirmamos a incapacidade de
a proteína mutada ubiquitinar histonas H2A. Em conjunto, esses dados nos levaram a considerar um possível
mecanismo de ubiquitinação e degradação da proteína mutada in vivo, mediado pela ortóloga RAD6 nas células
da levedura selvagem e pela paráloga UBE2B nas células do paciente. A ausência do ortólogo funcional resultaria
em seu acúmulo na linhagem delta-RAD6, explicando o fenótipo de toxicidade. Apoiando essa hipótese, a inibição
do proteassoma nas células do paciente resultou também em acúmulo da proteína UBE2A mutada. Nossos dados
apontam para um mecanismo in vivo de auto-regulação das parálogas UBE2A e UBE2B por auto-ubiquitinação ou
ubiquitinação recíproca seguida de degradação proteassômica.
Apoio Financeiro: FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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210
Uma nova mutação no gene KAL1 (Trp204Stop)
El-Husny, AS1,2; Moraes, MR1; Fernandes-Caldato, MC2; Ribeiro-dos-Santos, AKC 1
Laboratório de Genética Humana e Médica – Universidade Federal do Pará. 2Universidade do Estado do Pará.
[email protected]
1
Palavras-chave: síndrome de Kallmann, stop codon, mutação, gene KAL1, anosmina-1
A associação de hipogonadismo com déficit olfativo configura a síndrome de Kallmann (SK). Esta desordem
genética apresenta grande heterogeneidade clínica e afeta aproximadamente 1:10.000 homens. A síndrome
de Kallmann com herança ligada ao X (X-SK) apresenta, de forma geral, alteração no gene KAL1 localizado no
cromossomo Xp22.3. Várias mutações foram descritas neste gene, todas capazes de alterar a formação ou função
da proteína anosmina-1 que está envolvida na migração de neurônios olfatórios e de neurônios produtores do
hormônio liberador de gonadotrofina. Com o objetivo de elucidar a falha molecular existente em uma família
que apresentava esta patologia, foi realizada a coleta de sangue venoso de 16 indivíduos (quatro probandos e
doze de seus familiares), seguida da extração de DNA, amplificação dos éxons 5, 6 e 9 do gene KAL1 e posterior
seqüenciamento das amostras. Como resultado da análise molecular, foi identificada em todos os afetados uma
mutação ainda não descrita na literatura, a transversão de G para A na posição 762 do éxon 5 do gene KAL1. Esta
mutação origina um códon de parada na posição 204 da proteína anosmina-1, no lugar do aminoácido Triptofano.
Foram identificadas também cinco portadoras assintomáticas na família, com a mesma mutação, o que indica
a necessidade de aconselhamento genético familiar pela possibilidade de transmissão da mutação para a prole.
Em conclusão, o estudo clínico e molecular realizado serve de base para o adequado aconselhamento genético
que esclarece aos pacientes e familiares sobre a doença e suas repercussões, em especial o comprometimento
reprodutivo, assim como para o risco de recorrência familiar, orientando o diagnóstico precoce de futuros afetados
para que o tratamento seja viabilizado no período ideal
Apoio Financeiro: UFPA, FADESP, FINEP e CNPq.
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211
Alterações no gene SHOX em pacientes com Síndrome
de Leri-Weill
Lima, R1,2; Michelatto, DP1; Coeli, FB1; Maciel-Guerra, AT2; Mello, MP1
1
2
Laboratório de Genética Molecular Humana, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética -CBMEG, UNICAMP.
Depto. de Genética Médica, FCM, UNICAMP.
Palavras-chave: câncer de mama, single nucleotide polymorphisms, XRCC1, genes de reparo, Santa Catarina
O gene SHOX esta localizado na região pseudo-autossômica dos cromossomos sexuais, e transcreve duas proteínas
(SHOXa e SHOXb) expressas durante o desenvolvimento embrionário e envolvidas com a ossificação endocondral.
Sua haploinsuficiência está ligada a problemas de baixa estatura e/ou anomalias esqueléticas. A redução em 50%
da atividade protéica do complexo SHOXa/SHOXb devido a alterações em um dos alelos, em geral, leva a uma
heterogeneidade fenotípica que é atribuída ao background dos efeitos genéticos que envolvem vários genes e suas
relações protéicas. Isto é constantemente observado em trabalhos que relacionam a alteração do gene à baixa
estatura e deformidades esqueléticas, sendo o gene e sua região downstrean investigadas em casos de pacientes
que apresentam baixa estatura idiopática e Síndromes de Leri-Weill e Langer. Em geral a deficiência do gene SHOX
é responsável pelo fenótipo observado. O presente trabalho traz um estudo do gene SHOX realizado com um grupo
de indivíduos com Síndrome de Leri-Weill nos quais foram analisadas deleções do gene e/ou da região downstrean
a este. Os indivíduos que apresentaram os dois alelos foram seqüenciados para verificação de mutações. Em nosso
estudo, assim como na maioria dos estudos realizados, observamos alterações que envolvem a deleção do gene
SHOX, ou mutação no mesmo, assim como deleção da região downstrean ao gene. As regiões estudadas antecedem
a região DXY233, sendo esta a região 3’ mais distante do gene analisada. Com relação à região downstrean ao
gene do nosso estudo podemos dizer que a maioria dos indivíduos estudados apresentou heterozigose da região
DXYS233 e DXYS10083 o que sugere a presença destes dois marcadores nos dois alelos, isto não concorda com
dados encontrados na literatura que descrevem nesta região um intervalo comum deletado na maioria dos
pacientes estudados, sugerindo, que a região próxima a 800 pb tenha um enhancer que interage com o promotor no
exon 2. Neste estudo, foram também encontradas quatro mutações ainda não descritas, estas foram consideradas
as possíveis causas do fenótipo observado nos indivíduos portadores.
Órgão financiador: FAPESP
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212
Estudos de mapeamento em família com uma nova
síndrome de agenesia/hipoplasia fibular associada à
ectrodactilia
Thiele-Aguiar, RS; Santos, SC; Lezirovitz. K; Kok, F; Otto, PA; Mingroni-Netto, RC
Centro de Estudos do Genoma Humano, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São
Paulo
[email protected]
Palavras-chave: ectrodactilia, agenesia/hipoplasia fibular, estudos de ligação.
A ectrodactilia ou SHFM (split-hand/split-foot malformation) é uma malformação congênita de membros
caracterizada por uma fenda mediana profunda das mãos e/ou pés devido à ausência dos raios centrais das
extremidades. Já foram descritos quatro locos autossômicos associados à ectrodactilia de herança dominante
e em apenas um deles o gene foi identificado numa variante associada a outros defeitos (TP63). A agenesia ou
hipoplasia fibular é um defeito que ocorre ao longo do desenvolvimento da fíbula, podendo estar associada a outros
sinais clínicos como malformações em membros superiores (ectrodactilia, defeitos na ulna e fêmur, etc.). Alguns
genes foram indicados como possíveis responsáveis pela condição, tais como o GDF5 e o TBX3, nos quais foram
encontradas mutações em indivíduos afetados por hipoplasia fibular associada a outros sinais. Recentemente foi
descrita uma família em que segrega uma nova síndrome, uma forma de agenesia/hipoplasia fibular associada à
ectrodactilia de possível herança autossômica dominante, como a família na qual ocorreram esses casos é altamente
endocruzada, o padrão de herança autossômico recessivo não pode ser descartado (Santos e col., Am J Med Genet
A;146A:3126-31, 2008). A família, de origem caucasóide e residente em Riacho de Santana, no estado do Rio Grande
do Norte é constituída de 91 indivíduos, dos quais seis são afetados por quadro com grande variabilidade clinica.
O objetivo do presente estudo é mapear o gene responsável por essa nova síndrome. Nossa estratégia inicial foi a
realização de estudos preliminares de ligação com microssatélites próximos às quatro regiões cromossômicas já
associadas a malformações de membros, como a ectrodactilia (SHFM1, SHFM3,SHFM4 e SHFM5) e uma região
previamente mapeada pelo nosso grupo candidata a conter o gene da ectrodactilia associada a hemimelia tibial
(SHFLD3 - OMIM #612576). Os resultados dos estudos de ligação foram analisados por meio do cálculo de lod
scores de dois e de múltiplos pontos. Os resultados das análises de lod scores para os cinco locos autossômicos não
mostraram evidências de ligação, considerando-se o padrão de segregação dos haplótipos e os valores negativos
dos lod scores que foram obtidos nas análises paramétricas. Tanto no modelo de herança autossômica dominante
(taxa de penetrância 0.32) como no modelo de herança autossômica recessiva os valores de lod score calculados
foram muito baixos e não revelaram resultados estatisticamente significativos. Esses resultados indicam que o
gene responsável por essa nova síndrome não se encontra nas regiões já mapeadas contendo genes relacionados à
ectrodactilia. Desse modo as cinco regiões analisadas são improváveis como candidatas a conter o gene responsável
pela doença em questão, reforçando a idéia de que se trata, realmente de uma nova síndrome causada por uma
mutação em um gene ainda não mapeado.
Apoio: FAPESP e CNPq.
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Síndrome de Townes-Brocks: herança autossômica
recessiva?
Zandoná-Teixeira, AC; Agostinho, MAB; Jesus, AN; Rodrigues, MG; Rodini, ESO
Ambulatório e Laboratório de Genética - Depto de Ciências Biológicas. Campus Bauru- UNESP
[email protected]
Palavras-chave: Síndrome de Townes-Brocks; micropênis, anormalidades renais, agenesia dos polegares, retardo de crescimento.
A Síndrome de Townes-Brocks é uma condição genética rara com menos de 100 casos descritos na literatura. O
modo de herança referido é o autossômico dominante com expressividade variável, cujo gene SALL1 localiza-se
no cromossomo 16q12.1. Casos envolvendo casais consanguíneos são ainda menos frequentes. É caracterizada
pela presença das seguintes alterações fenotípicas: ânus imperfurado, estenose anal, anormalidades dos dedos
dos pés ou das mãos incluindo agenesia dos polegares, orelhas malformadas, perda auditiva, anormalidades
renais, cardiopatia congênita, malformações genitais e retardo de crescimento. O diagnóstico diferencial inclui,
principalmente, as síndromes de Holt-Oram, Nager e Okihiro. No presente trabalho, relatamos um caso atendido
no Ambulatório e Laboratório de Genética (ALAGe) da Faculdade de Ciências Unesp-Bauru. Paciente do sexo
masculino, nascido de pais consanguíneos que não apresentavam histórico anterior de malformações familiais,
com peso e comprimento ao nascimento inferior ao percentil 3. Ao exame genético-clínico com 15 meses
apresentou ausência bilateral de polegares, baixa estatura, rim pélvico, micropênis e orelhas malformadas. O
estudo citogenético revelou cariótipo normal 46,XY. As características clínicas são compatíveis com a síndrome
de Townes-Brocks. Embora essa condição seja descrita na literatura pertinente como de etiologia autossômica
dominante, o presente caso não exclui o modo recessivo, tendo em vista a consanguinidade dos pais, o que poderia
significar heterogeneidade genética. Ressalta-se a importância de investigação de malformação auricular e de
ouvido interno em membros da família, o que pode representar sinais menores da síndrome, dados importantes
para o aconselhamento genético.
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Detection of c.-77C>T polymorphism in the VHL gene
by single strand conformation polymorphism (SSCP) in
von Hippel-Lindau disease patients
Lima-Júnior, CA; Azevedo, PR; Santos, A; Leal-Mesquita, ER.
Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade, Hospital Universitário (HUUFMA), Universidade Federal do Maranhão. São
Luís – MA.
[email protected], [email protected]
Keywords: von Hippel-Lindau syndrome; cancer; PCR, SSCP, polymorphism analysis.
Von Hippel-Lindau (VHL) syndrome is a dominantly inherited disorder with an estimated incidence of 1 in 45,500
live births. Disruption of VHL gene results in an abnormal expression of genes such as vascular endothelial growth
factor (VEGF), platelet derived growth factor (PDGF), erythropoietin (EPO), and transforming growth factor alpha
(TGF-a) due to the stabilization of the Hipoxia-Inducible Factor (HIF). VHL disease has been characterized
by a variety of neoplasms including hemangioblastomas of the central nervous system, renal cell carcinomas,
pheochromocytomas, and cysts involving the pancreas, kidney and epididymis. Polymerase chain reaction singlestrand conformation polymorphism (PCR-SSCP) is a simple method that allows that rapidly determines differences
between short sequences of single stranded DNA. In this method, the primary sequence and the length of a single
stranded DNA fragment determine its conformation when it is loaded in a nondenaturing polyacrylamide gel
(PAGE). Even single-base differences can cause different secondary or tertiary structures which results in different
migration rates of the DNA single strands. The aim of this study was to identify the presence of the c.-77C>T
polymorphism in 23 patients related to six individuals with histologically proven cancers associated to the
syndrome. DNA of these 23 patients and 23 control samples (without VHL syndrome) were extracted and the PCR
was performed in a previous study. The conditions used for SSCP were: five microliters of amplified DNA was diluted
in 45 mL of 0.1% SDS and 10 mM EDTA, followed by dilution of 5 µL of above diluted PCR products mixed with 5
µL of loading buffer (99% formamide, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol). After that, the denaturation
was made by heating the samples at 99ºC for 10 minutes and cooled rapidly in an ice bath. Electrophoresis was
performed by using a 15% nondenaturing polyacrylamide gel with 5% glycerol, running at 150V in a 20ºC room for
7h and then the gels were silver stained. This method showed mobility changes in the banding pattern that were
96% equal to the sequencing results of our previous study. This result indicates a high precision of the SSCP method.
The next step of our research project is a more detailed clinical screening for a genotype-phenotype correlation,
including qPCR analysis for identification of large deletions.
Financial support: CNPq, PIBIC – UFMA, FAPEMA
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Hiperplasia congenita adrenal: triagem de mutações
provenientes do pseudogene
Pedrosa, D1; Guaragna, MS1; Michelatto, DP1; Lemos-Marini, SHV2; Coeli, FB1; Soardi, FC1; De Mello, MP1
Laboratório de Genética Humana, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-CBMEG, UNICAMP.
Depto. de Endócrino-Pediatria, Hospital das Clínicas, UNICAMP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hiperplasia congenita adrenal, 21-OH, CYP21A2, CYP21A1P, HCA
A Hiperplasia Congênita da Adrenal (HCA) é provocada por deficiência da atividade de qualquer uma das enzimas
necessárias para a síntese de cortisol. Os resultados dessas deficiências enzimáticas são a diminuição da produção
de cortisol com o aumento da secreção de ACTH, e conseqüentemente, hiperplasia da glândula (NEW, 1998). A
deficiência de 21-OH, devido alterações no gene CYP21A2, é responsável por cerca de 95% dos casos de Hiperplasia
Congênita Adrenal (HCA). Clinicamente, a HCA é classificada em forma clássica, presente ao nascimento e a forma
não clássica (NC), responsável pelo bloqueio parcial tardio da atividade enzimática. A forma clássica é subdividida
em perdedora de sal (PS), forma mais grave em que os indivíduos afetados, além da virilização, apresentam perda
de sal devido à deficiência da síntese de aldosterona, e na forma virilizante simples (VS) onde não há perda de sal.
O gene CYP21A2 apresenta o pseudogene CYP21A1P que possui mutações deletérias, responsáveis por cerca de
60% dos casos de HCA quando transferidas para o gene CYP21A2. Neste trabalho foram estudados 22 pacientes (n
alélico=43), dos quais 2 pacientes são meio irmãos, provenientes do HC–UNICAMP (12 PS, 3 VS e 7 NC). O objetivo
deste estudo foi a busca de mutações que justifiquem o fenótipo. Todos os pacientes foram analisados por Southern
Blot para verificar a presença de deleções, duplicações e/ou conversões, sendo que 11 alelos (25,6%) apresentaram
estas alterações. A triagem de mutações mais freqüentes foi realizada através de PCR alelo específico. Foram
encontradas as mutações IVS12-13A/C>G em 11 alelos (25,6%), que cria um sítio alternativo de splicing fazendo
um deslocamento do quadro de leitura na tradução da proteína, V281L em 10 alelos (23,25%), Q318X e R356W
em 2 alelos cada (4,65%). As mutações I172N e as combinações I172N + V358I e Del8 + V281L foram encontradas
em apenas um alelo cada (2,32%). Ficaram indeterminados 4 alelos (9,30%) que serão encaminhados para
sequenciamento. Assim, através desta análise foi esclarecido o genótipo responsável por HCA em 18 pacientes.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Ocular findings in a patient with a pathogenic mutation
in the PTCH gene
Quiezi, RG1,2; Richieri-Costa, A1; Ribeiro, LA1
Serviço de Genética, Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brazil.
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP, Brazil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: PTCH, ocular anomalies, holoprosencephaly, mutation, Basal Cell Naevus Syndrome(BCNS)
Holoprosencephaly (HPE) is a common developmental defect affecting both the forebrain and the face. It is
characterized by the incomplete separation of the cerebral hemispheres into distinct right and left halves. Eye
anomalies are part of the clinical spectrum of the HPEs, ranging from cyclopia to variable structural eye defects
with the most extreme variant represented by bilateral anophthalmia. Eye anomalies mainly represented by
microphthalmia and orbital cyst was recently reported in a girl with BCNS (Basal Cell Naevus Syndrome) or
Gorlin syndrome (MIM#109400) and that presented a stop codon mutation within exon 10 of the PTCH gene.
Here we report on the eye findings in a patient with the brain findings (HPE) previously reported and presenting
a pathogenetic mutation in exon 15 in the PTCH gene. The occurrence of HPE and severe eye involvement in the
patient here reported supports that besides tumorigenesis the PTCH gene also plays an important role in eye and
neural plate development.
Fapesp Grant: 06/60973-9
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Analysis of polymorphism in the promoter region
of MMP-1 and MMP-3 genes in individuals with
temporomandibular joint disorder
Planello, AC; Campos, MIG; Souza, AP
Departament of Morphology, Dental School of Piracicaba, State University of Campinas, Piracicaba, SP, Brazil.
Keywords: polymophism, promoter region, MMP-1, MMP-3, temporomandibular joint disorder
The Temporomandibular Joint Disorder (TMJD) is the main cause of non-dental pain on orofacial region
and may be affected by inflammatory process that leads proteolitic degradation of joint tissues. The Matrix
metalloproteinases (MMPs) are the most common group of enzymes that has been detected in the synovial fluid
from TMJ of individuals with TMJD. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been shown to up-regulate
the expression of these enzymes and are related with several diseases, including osteoarthritis and periodontits.
The aim of this study was to investigate whether the MMP-1 (-1607 2G/1G) and MMP-3 (-1171 5A/6A) SNPs in
the promoter region are associated with TMJD. DNA was obtained from 95 individuals with signs and symptoms
of TMJD confirmed by magnetic resonance imaging and 102 controls without any symptoms on this region. An
analysis of DNA was carried out using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP); the product was electrophoresed in a 10% polyacrylamide gel and visualized through the silver stained.
Genotype distributions and alleles frequencies of MMP-1 and MMP-3 were compared between the groups. There
were significant differences regarding the genotype distribution of MMP-1 polymorphism (p = 0.01), the allele
frequencies were not significant different (p = 0.07).The MMP-3 genotype distribution and allele frequencies did
not differ between the groups. (p >0.05). These findings suggest that the -1607 2G/1G polymorphism in the MMP-1
gene may increase the risk to temporomandibular joint disorder.
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African and European contribution to Brazilian CL/P
patients: is admixture mapping a good strategy to
identify genes for CL/P?
Brito, LA1,2; Rocha, KM2; Bueno, DF1,2; Aguena, M1,2; Alonso, N3; Zechi-Ceide, R4; Geza, U5; Franco, D;
Meyer, D1; Bueno, MRP1,2
1 Instituto de Biociências - USP
2 Centro de Estudos do Genoma Humano (CEGH) – USP
3 Hospital das Clínicas –FMUSP
4 Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais - USP, Bauru.
5 Hospital Dr Martagão Gesteira, Salvador-BA
Keywords: cleft lip/palate, admixture mapping, multifactorial inheritance, complex disease, african and european contributions.
Non syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) is one of the most common congenital malformations
(~1:1000 in Europeans; 0.3:1000 in Africans) and follows a multifactorial inheritance. The main objective of the
present study is to estimate African and European contributions to the constitution of Brazilian NSCL/P patients
in order to evaluate the potential of admixture mapping as a tool to find candidate genes for NSCL/P. Admixture
mapping, a recently developed method for identifying genetic risk factors involved in complex diseases, is not
biased by population stratification. We selected 29 insertion/deletion ancestry informative markers located in
chromosomes 1 and 21, that are being analysed by PCR and the Megabace sequencing apparatus with the software
Genetic Profiler 2.2. The average allelic frequency difference between European and African control populations at
these markers was 27%. The patients have been ascertained through Human Genome Center (USP), Hospital de
Reabilitação Bauru (USP), Martagão Gesteira (Salvador) and at Operation Smile Missions. The sample is currently
constituted by a total of 984 patients: Santarém-PA (100), Barbalha-CE (76), Fortaleza-CE (260), Maceió-AL (218)
Salvador-BA (30), Rio de Janeiro-RJ (80), Bauru-SP (70) and São Paulo/SP (150). So far, we have typed 19 informative
markers in 189 NSCL/P patients. All the markers are in Hardy-Weinberg equilibrium. We have estimated through
the use of the statistical software Admix that the average European contribution in this population is 0.827, while
the average African contribution is 0.173 (standard error = 0.05). The proportion of admixture seems to fall within
the window of values considered as adequate for the use of admixture mapping, however the use of this strategy
will be evaluated once upon conclusion of genotyping the whole sample.
Support: FAPESP, CNPq.
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Investigação de polimorfismos do gene GSTM1 em
portadoras de endometriose
Frare, AB1; Silva, CTX1; Arruda, JT1; Júnior, CLR1; Moura, KKVO2
Núcleo de Pesquisas Replicon – Universidade Católica de Goiás – Goiânia – Go – Brasil
Professora Doutora da Universidade Católica de Goiás – Goiânia – Go – Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: dor pélvica, endométrio, infertilidade, glutationa S-transferase, GSTM1
A endometriose é uma das patologias que mais desafiam a prática do ginecologista. É uma doença ginecológica
benigna muito freqüente na atualidade e está relacionada ao número elevado de menstruações e corresponde
ao implante do endométrio fora da cavidade uterina. Várias teorias tentam explicar as causas da endometriose
sem, contudo, elucidar definitivamente a etiologia do processo. A endometriose é uma doença multifatorial cuja
susceptibilidade possui um componente genético. Apesar disso, o número de genes envolvidos e a natureza
exata do processo são desconhecidos. Um número cada vez maior de pesquisas tem sido realizado na procura
por associações entre a endometriose e alterações-polimorfismo em genes candidatos. A endometriose é uma
patologia que afeta aproximadamente 10% das mulheres em idade reprodutiva, atingindo cerca de 80% das
pacientes com dor pélvica crônica. Polimorfismos de genes que codificam enzimas responsáveis pelo metabolismo
de carcinógenos, como as do sistema da glutationa s-transferase (GST), estão relacionados com desenvolvimento
de vários tipos de câncer. Até o presente momento, pelo menos 5 genes diferentes, mu, alfa, pi, teta e sigma, foram
identificados como causadores de alteração na atividade enzimática. Existem várias evidências de que a ausência
de uma ou mais de uma forma de GST ou variantes alélicas que expressam diferentes combinações de herança
étnica destas enzimas (polimorfismo hereditário) são mais susceptíveis de sofrer stress químico. Entre os genes
GSTs esta o GSTM1, que apresenta relação com tumores malignos como de pulmão e cólon, podendo nesses
casos ser utilizados como marcador tumoral. O gene GSTM1 esta localizado no cromossomo 1p13.1 e apresenta
polimorfismo de presença/ausência, o que resulta na falta das proteínas ativas, estudos mostram que a enzima
GSTM1 ativa é responsável pela detoxificação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e solventes como o
benzeno. Com o aumento no número de mulheres portadoras de endometriose torna-se importante descobrir
genes que podem atuar como marcador molecular para o diagnóstico precoce de endometriose, e o GSTM1 é
um candidato. Através de amplificação por PCR, foram analisados amostras de DNA de 36 pacientes, com idade
entre 27 e 37 anos, todas portadoras de endometriose, sendo que 18 inférteis e 18 férteis, destas 8 (22%) inférteis
e 10 (28%) férteis apresentaram genes nulos para o gene GSTM1. O teste x2 mostrou que este resultado não é
significativo, sugerindo que o gene GSTM1 pode não estar relacionado com endometriose e infertilidade.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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220
Estudo do polimorfismo +1730 G/A do gene receptor
de estrogênio -ERß - em mulheres portadoras de
endometriose
Brandes, A; Mafra, FA; Teles, J; Christofolini, D; Bianco, B; Barbosa, CP
Disciplina de Genética e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia
Faculdade de Medicina do ABC - FMABC
[email protected]
Palavras-chave: receptor de estrogênio, er beta, endometriose, polimorfismo, infertilidade
Introdução: O endométrio sofre constantemente a ação de hormônios, principalmente estrógeno e progesterona. O
receptor beta de estrógeno (ERß) parece ser um dos fatores mais importantes no mecanismo de ação do estrógeno
e estudos têm mostrado associação entre polimorfismos do gene ERß e a progressão da endometriose. Dessa forma,
o objetivo do presente estudo foi a análise do polimorfismo +1730 G/A no gene do receptor de estrogênio (ERß)
em portadoras de endometriose e no grupo controle com o intuito de contribuir para o melhor conhecimento
das características clínicas e genéticas das portadoras da endometriose. Materiais e métodos: Foram estudadas
108 pacientes inférteis portadoras de endometriose provenientes do Ambulatório de Endometriose da FMABC e
um grupo controle composto de 210 mulheres férteis submetidas à laqueadura provenientes do Ambulatório de
Planejamento Familiar da FMABC. As pacientes foram classificadas de acordo com o grau de endometriose e o
polimorfismo +1730 G/A no gene ERß foi identificado RFLP-PCR. Resultados: Das pacientes com endometriose,
45,4% tinham endometriose grau I/II e 54,6% grau III/IV. Os genótipos GG, GA e AA do polimorfismo +1730 G/A
no gene ERß apresentaram freqüência de 50,9%, 47,2% e 1,9%, respectivamente, nas portadoras de endometriose.
Das mulheres com endometriose grau I/II, 47,0% apresentaram o genótipo homozigoto normal GG; 51,0% o
genótipo heterozigoto GA, e 2,0% o genótipo homozigoto mutado AA. Das portadoras de endometriose grau III/IV
os genótipos GG, GA e AA estavam presentes em 54,3%, 44,0% e 1,7%, das pacientes, respectivamente. Em relação
ao grupo controle, 74,3% (156/210) apresentaram o genótipo homozigoto normal, 24,3% (51/210) o genótipo
heterozigoto e 1,4% (3/210) o genótipo homozigoto mutado. Conclusâo: Os resultados sugerem que o polimorfismo
+1730 G/A no gene ERß está relacionado com a predisposição a endometriose, independente do grau da doença.
Apoio: NEPAS (Núcleo de Estudos, Pesquisas e Assessoria em Saúde da Faculdade de Medicina do ABC).
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Análise de polimorfismos do gene NAT2 em pacientes
com câncer de bexiga
Cilião, HL1; Maniezzo, NM1; Kuasne, H1; Rodrigues, IS1; Lengert, AH1; Losi-Guembaroyski, R1; Grando,
JPS2; Fuganti, PE2; Gregório, EP2; Rodrigues, MAF3; Libos-Junior, F2; Cólus, IMS1.
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.
Instituto do Câncer de Londrina, Londrina-PR.
3
Departamento de Cirurgia, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de bexiga, gene NAT2, polimorfismos, xenobióticos, acetilação
O câncer de bexiga é o principal exemplo de carcinogênese de contato, pois os compostos carcinogênicos
absorvidos pelo organismo e que são eliminados pela urina, podem causar lesões superficiais que podem progredir
para o câncer de bexiga. Este tipo de câncer é mais freqüente em homens e na maioria dos casos pode apresentar
recorrência. O principal fator de risco é o tabagismo, acompanhado pelo aumento da idade e o contato com
aminas aromáticas e heterocíclicas; sua prevalência varia entre as etnias e entre os diferentes países. O gene NAT2
é um importante gene polimórfico da família das N-acetiltransferases, principal responsável pela metabolização
de drogas pré-carcinogênicas e outros agentes xenobióticos. O polimorfismo do gene NAT2 causado pela variação
de base única em sua região codificadora, modifica a capacidade da enzima em realizar a acetilação do substrato.
Os genótipos quanto a esta característica podem ser classificados de lento, intermediário ou rápido, o que vai
modificar a ocorrência de efeitos colaterais e o risco para o desenvolvimento de câncer de bexiga. O objetivo deste
trabalho foi determinar as freqüências alélicas dos polimorfismos de base única localizados nas posições 191(rs
1801279), 282 (rs 1041983), 590 (rs 1799930) e 857 (rs 1799931) da região codificadora do gene NAT2 em um grupo
de 100 pacientes com confirmação histopatológica de carcinoma de bexiga e em 100 controles saudáveis. Para
realizar a análise dos quatro SNPs do gene NAT2 foi utilizada a técnica de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorfism-Polimerase Chain Reaction) com diferentes enzimas de restrição. Os resultados mostraram que as
variantes polimórficas deste gene não parecem influenciar o risco para a doença (G®191A OR=0,62 (IC95% 0,341,11); C®282T OR=1,73 (IC95% 0,95-3,14); G®590A OR=1,56 (IC95% 0,84-2,90); G®857A OR=1,22 (IC95% 0,66-2,26).
Os resultados obtidos sugerem uma ausência de associação positiva ou negativa entre quatro variantes alélicas
polimórficas do gene NAT2 e câncer de bexiga nesta amostra.
Apoio Financeiro: CNPQ/PQ; CAPES/DS
Apoio: Hospital do Câncer de Londrina
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Identificação da possível associação entre o
polimorfismo XRCC1Arg194Trp e o câncer de mama
em uma população de mulheres do estado de Santa
Catarina, Brasil
Sereia, AFR1; Galliotto, D1; Coêlho, CC1; Ribeiro, ER1; Farias, T1; Moreti, T1; Back, LKF de1; Oliveira, MLG1;
Ferandes, BL2; Traebert, EE2; Ribeiro, MCM1; Souza, IR de1
1
2
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética/CCB – Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
Hospital Universitário/CCS – Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) e Maternidade Carmela Dutra (Florianópolis/SC)
Palavras-chave: câncer de mama, Single Nucleotide Polymorphisms, XRCC1.
O câncer de mama é a neoplasia maligna mais comum entre as mulheres. No Brasil, o número estimado de novos
casos para o ano de 2009 é de 49.400 com uma taxa de incidência 51/100.000 habitantes. Genes envolvidos no
reparo de DNA são bons candidatos como genes de baixa penetrância que poderiam modificar a susceptibilidade
ao câncer de mama, sendo os polimorfismos tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) uma das alterações mais
significativas nesses genes. XRCC1 é uma proteína do sistema de reparo por excisão de bases (BER) que atua como
“proteína suporte”, regulando o tempo e força da interação entre múltiplas proteínas do BER. O SNP analisado
nesse trabalho é uma transição de C para T no éxon 6 que leva a troca de aminoácidos Arg194Trp (rs1799782)
e poderia influenciar na maquinaria do BER por alterar a interação proteína-proteína, entre XRCC1 e outras
proteínas envolvidas nesse sistema de reparo. O objetivo desse trabalho foi investigar, em um grupo de mulheres
do estado de Santa Catarina (estudo caso-controle), a hipótese de que o SNP XRCC1Arg194Trp poderia modificar a
susceptibilidade ao câncer de mama. Um total de 133 mulheres diagnosticadas com câncer de mama no Hospital
Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (HU-UFSC) e na Maternidade Carmela Dutra (MCD),
sem tratamento quimioterápico ou radioterápico prévios e 124 mulheres controles, sem câncer de mama e sem
histórico da doença em parentes de primeiro grau, provenientes de grupos de voluntários do HU-UFSC foram
selecionadas para o estudo. Foram coletados 8ml de sangue periférico de todos os indivíduos para realização de
extração de DNA através do método Fenol-Clorofórmio. O SNP XRCC1 Arg194Trp foi detectado por PCR-RFLP
e eletroforese em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. A Odds Ratio (OR) foi calculada através de
regressão logística binária (SPSS Inc., versão 12.0), utilizando intervalo de confiança de 95% e p=0,05 como limite de
significância. As distribuições genotípicas encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg, tanto em casos como
em controles (p=1,000 para ambos). As freqüências alélicas obtidas foram de 0,079±0,017 e 0,089±0,018 para o alelo
variante T em casos e controles, respectivamente, sendo que foram encontrados 112 indivíduos com o genótipo
C/C, 21 com C/T e nenhum com o genótipo T/T nos casos e 103 indivíduos C/C, 20 C/T e apenas 1 indivíduo T/T
no grupo de controles. A OR calculada para o genótipo C/T (tendo C/C como referência) foi de 0,918 (0,495-1,884) e
para a OR calculada tendo como fator de risco a presença do alelo variante T (C/C vs. C/T + T/T) obteve-se o valor
de 0,920 (0,475-1,782) não havendo associação estatisticamente significativa (p=0,918 e p=0,804, respectivamente)
entre a presença do genótipo C/T ou do alelo T e a susceptibilidade ao câncer de mama.
Apoio Financeiro: FAPESC/UFSC/CNPq e CAPES.
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Câncer de cabeça e pescoço: avaliação do
polimorfismo CYP2E1
Russo, A1; Ruiz, MT1; Galbiatti, ALS1; Cury, NM1; Raposo, LS2; Maniglia, JV2; Pavarino-Bertelli, EC1,3; GoloniBertollo, EM1,3
Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular – UPGEM, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
3
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, citocromo P450, polimorfismo genético.
A suscetibilidade ao câncer de cabeça e pescoço é resultante da interação entre fatores genéticos e ambientais. Alguns
indivíduos podem apresentar risco aumentado de desenvolver o câncer devido às diferenças no biometabolismo
e ao consumo de fumo e álcool. Abordagens recentes têm associado polimorfismos de genes metabolizadores
de xenobióticos, tais como os membros da super-família do citocromo P450 (CYPs), enzimas oxidativas da Fase
I, que convertem muitos compostos a metabólitos potencialmente carcinogênicos. Polimorfismos em genes
que codificam essas enzimas podem alterar sua expressão ou função, alterando a ativação ou detoxificação de
compostos carcinogênicos, com a carcinogênese de cabeça e pescoço. Este estudo teve como objetivo comparar a
freqüência do polimorfismo DraI do gene CYP2E1 em pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço
e indivíduos sem história de neoplasia, e relacionar a presença do polimorfismo com características clínicas e
fatores de risco (tabagismo e etilismo), visando identificar biomarcadores de suscetibilidade deste tipo de câncer.
Foram analisados 200 pacientes com câncer de cabeça e pescoço e 200 indivíduos sem história de neoplasia. Para
o estudo molecular, o DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e o polimorfismo investigado por
PCR-RFLP com a utilização da enzima de restrição DraI. A análise dos fatores sociodemográficos e características
epidemiológicas mostrou o predomínio de pacientes do sexo masculino (86%), tabagistas (89%) e etilistas (77,5%).
Em relação aos parâmetros clínicos, o sítio anatômico primário mais freqüente foi cavidade oral (36,50%), em
relação à classificação de tumores malignos 29% pertencem à categoria T4 e 32,5% apresentam comprometimento
dos linfonodos. Na análise das freqüências genotípicas não foram encontradas diferenças estatisticamente
significantes (OR 0,98; IC (95%) = 0,49-1,93; p = 0,9436) entre o grupo de pacientes e grupo controle. Em relação
aos parâmetros clínicos extensão tumoral, comprometimento de linfonodos e agressividade nenhuma associação
foi encontrada. Em nosso estudo foi possível estabelecer a influência do polimorfismo DraI do gene CYP2E1 na
carcinogênese em cabeça e pescoço.
Fonte de Financiamento: Fapesp, CNPq e Capes; apoio FAMERP/FUNFARME
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Câncer de laringe e polimorfismos dos genes GSTM1,
GSTT1, CYP1A1 A4889G e CYP1A1 T6235
Zanetti, A; Lourenço, GJ; Chone, CT; Lima, CSP
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Ciências Médicas,
Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: câncer de laringe, polimorfismo, GSTM1, GSTT1, CYP1A1
Introdução: O carcinoma epidermóide (CEC) de laringe está associado a agentes químicos presentes em bebidas
alcoólicas e no tabaco. As glutationas s-transferases (GSTs) e o citocromo P450 CYP1A1 são enzimas que atuam na
detoxificação e bioativação de carcinógenos, respectivamente. Os genes GSTM1 e GSTT1 podem estar deletados
de forma homozigótica em indivíduos saudáveis. Já os alelos variantes G e C dos polimorfismos A4889G e T6235C
do gene CYP1A1 parecem produzir enzimas mais eficazes na ativação de carcinógenos. Objetivo: Avaliar se os
genótipos destes genes influenciam o risco de CEC de laringe em nossa região. Métodos: O DNA genômico de 96
pacientes (88 homens, 8 mulheres; idade mediana: 59 anos, variação: 39 a 92 anos; 87 caucasóides, 9 negróides)
com CEC de laringe e de 190 controles (174 homens, 16 mulheres; idade mediana: 53 anos, variação: 49 a 60 anos;
171 caucasóides, 19 negróides) foram avaliados por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex e
PCR e digestão enzimática, respectivamente. O significado estatístico das diferenças entre grupos foi calculado
por meio do teste do chi-quadrado ou da probabilidade exata de Fisher. Resultados: As freqüências da deleção
homozigótica do GSTM1, do GSTT1 e combinada dos genes em pacientes com CEC de laringe foram similares às
observadas em controles (42,7% vs 43,2%, P= 0,88; 25,0% vs 16,8%, P= 0,30; 12,5 vs 6,8%, P= 0,19; respectivamente).
Riscos de ocorrência da doença de 1,05 (IC95%: 0,59-1,83), 1,45 (IC95%: 0,72-2,90) e 1,92 (IC95%: 0,73-5,06) foram
observados em indivíduos com as deleções isoladas e combinada dos genes, respectivamente. A freqüência do
genótipo combinado 4889AG e 4889GG do gene CYP1A1 foi similar em pacientes e controles (22,9% versus 27,9%;
P= 0,52). Risco de ocorrência da doença de 0,81 (IC95%: 0,43-1,53) foi observado em indivíduos com o alelo G. De
forma inesperada, a freqüência do genótipo selvagem 6235TT do gene CYP1A1 foi maior em pacientes com CEC de
laringe do que em controles (75,0% versus 62,1%; P= 0,007). Portadores do genótipo selvagem estiveram sob risco 2,4
vezes (IC 95%: 1,27-4,56) maior de apresentar CEC de laringe do que os portadores do alelo variante C. Freqüências
similares de todos os genótipos estudados combinados foram similares entre pacientes e controles. Conclusões:
Nossos resultados sugerem que a deleção homozigótica dos genes GSTM1 e GSTT1 e o polimorfismo A4889G do
gene CYP1A1, parecem não influenciar o risco de ocorrência da doença em indivíduos de nossa região. Entretanto,
o genótipo selvagem do polimorfismo T6235C do gene CYP1A1 parece aumentar o risco do CEC de laringe em
nossa população. Assim, portadores do genótipo selvagem do gene merecem receber orientações adicionais para
evitar a exposição a bebidas alcoólicas e ao tabaco e seguimento clínico para a prevenção ou diagnóstico precoce
da doença.
Suporte financeiro: FAPESP e CNPq
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Estudo dos polimorfismos dos genes GSTM1/GSTT1
e CYP1A1 em cânceres mamários esporádicos em
Blumenau
Damiani, M1; Moretto, G2; Cavalli, IJ 3
Laboratório de Genética, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Regional de Blumenau – FURB. 2 – Laboratório de
Genética, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Regional de Blumenau - FURB. 3 – Departamento de Genética, Setor de
Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná - UFPR
[email protected]
1-
Palavras-chave: polimorfismos, câncer de mama, GSTM1/GSTT1, CYP1A, PCR+RFLP.
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, por isso é responsável por uma alta
mortalidade, principalmente entre mulheres. O desenvolvimento de câncer depende de uma série de fatores, como
a intensidade da exposição à carcinógenos exógenos e endógenos e a suscetibilidade genética do indivíduo. A
biotransformação de carcinógenos é dividida em duas etapas: fase I – oxidação e biossíntese; fase II – degradação
ou detoxificação. Polimorfismos gênicos responsáveis pela codificação de enzimas envolvidas nestes processos
influenciam diretamente a resposta individual a carcinógenos. Este trabalho teve como objetivo realizar um
estudo tipo caso-controle, procurando verificar a associação de polimorfismos nos genes do biometabolismo
GSTM1, GSTT1, e CYP1A1 com a carcinogênese mamária. A amostra estudada foi composta por 40 pacientes com
carcinomas mamários e 40 controles, pareadas por faixa etária (±5 anos) e por etnia. O DNA foi extraído pelo
método de salting-out a partir do sangue periférico de pacientes e controles. Os polimorfismos genéticos foram
analisados por PCR e PCR+RFLP, seguida de visualização em gel de agarose 1.5%. A média de idade das pacientes
foi de 58,60+12,14 e para os controles foi 47,52+10,18, sendo que não houve diferença estatisticamente significativa
entre elas (t=4,41; P>0,05). Não houve associação entre os genótipos estudados e a susceptibilidade ao câncer de
mama. A análise de fatores de risco relacionados à exposição ao estrogênio foi realizada entre todas as pacientes
e controles e entre pacientes e controles com genótipos de risco. Os resultados estatisticamente significativos
encontrados foram: a idade da menopausa (t=0,39; P>0,05), e o tempo de exposição exógena (t=2,25; P<0,05). Já
para o genótipo GSTM1-nulo nenhum dos parâmetros apresentou diferenças estaticamente significantes entre
pacientes e controles. E para o genótipo GSTT1-nulo apenas a média da idade da menarca (t=2,55; P<0,05) foi
estatisticamente distinta. Sendo assim, os resultados sugerem que, para este estudo, os polimorfismos estudados
não contribuíram para o risco de desenvolvimento do câncer de mama.
Apoio financeiro: GENOLAB, PIPe/Art.170, DCN.
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226
Análise do polimorfismo do gene CYP1A1m2 em
pacientes com carcinoma espinocelular da laringe
Silva, DC1; Amancio, AP1; Melo, COA1,2; da Silva Jr, RL1; da Cruz, AD1,2
1
2
Universidade Católica de Goiás – Departamento de Biologia – Núcleo de Pesquisas Replicon, Goiânia, GO.
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Mestrado em Genética, Universidade Católica de Goiás.
Palavras-chave: suscetibilidade, xenobióticos, laringe, CEC e CYP.
O carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço é uma das neoplasias mais comuns e é responsável por uma grande
incidência de óbitos em todo o mundo. A incidência elevada do câncer de cabeça e pescoço está relacionada ao
aumento do consumo de fumo e álcool em conjunto com a suscetibilidade genética individual. Compostos prócarcinógenos são convertidos a metabólitos altamente reativos pelas enzimas da superfamília do citocromo P450
(CYPs). Polimorfismos genéticos nos genes codificadores destas enzimas podem levar à alteração no processo de
ativação dos pró-carcinógenos e, conseqüentemente, ao aumento do risco para câncer. O presente estudo teve como
objetivo comparar a freqüência do polimorfismo CYP1A1m2 (A4889 à G) em pacientes com carcinoma espinocelular
da laringe e em indivíduos controle, na tentativa de relacionar a presença do polimorfismo e a suscetibilidade ao
câncer. Foram analisados 26 pacientes com câncer de laringe e 20 indivíduos sem história de neoplasia prévia.
Para o estudo molecular, o DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e o polimorfismo investigado
pela técnica de PCR-RFLP com a utilização da enzima de restrição BsrDI. Os dados foram armazenados em uma
planilha do software Excel® (2005) junto aos dados de prontuários clínicos dos pacientes estudados. O teste do Quiquadrado foram usados para comparação entre os resultados obtidos pelo polimorfismo do gene CYP1A1m2. As
freqüências alélicas do gene CYP1A1 para os alelos A e G foram, respectivamente, de 0,79 e 0,21 para os pacientes
com carcinomas laríngeos, e de 0,80 e 0,20 para o grupo controle. Não foi observado diferença estatisticamente
significativa entre as freqüências alélicas. Quanto à análise genotípica foi observada uma freqüência de 0,65 para
o genótipo A/A, 0,27 para heterozigotos A/G e 0,08 para os homozigotos G/G em pacientes com CEC de laringe.
No grupo controle o genótipo A/A apresentou 0,60 presente entre os indivíduos, sendo 0,40 heterozigotos A/G
e nenhum genótipo homozigoto mutante (G/G) foi observado entre os pacientes controles. A análise do Quiquadrado apontou diferença estatisticamente significativa entre as freqüências genotípicas dos dois grupos (p =
0,002). As amostras do grupo caso e controle encontram-se em desequilíbrio de Hardy-Weinberg. A avaliação desta
alteração genética em um maior número de indivíduos poderá fornecer dados mais concretos na tentativa de
estabelecer uma relação direta entre o papel deste polimorfismo e a carcinogênese da laringe.
Apoio Financeiro: PROPE/UCG.
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Papel do gene CYP2D6 na suscetibilidade a Leucemia
Linfoblástica Aguda
Butinhão, E1,2; Hatagima, A2
1
2
Curso Ciências Biológicas Modalidade Médica – Universidade Plínio Leite – Niterói - RJ
Laboratório de Genética Humana, IOC – FIOCRUZ – RJ
Palavras-chave: polimorfismos, CYP2D6, câncer, leucemia, PCR
A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é o tipo de câncer mais freqüente em crianças. É uma doença heterogênea
caracterizada pela predominância de linfoblastos ou precursores hematopoiéticos imaturos. Sua etiologia ainda
não foi totalmente esclarecida, mas sabe-se que a exposição ambiental e a suscetibilidade genética podem ter um
papel importante. O benzeno, radiação ionizante e terapia citotóxica são algumas das causas propostas para a
leucemia aguda. Indivíduos com deficiência na habilidade para lidar com estas exposições seriam mais suscetíveis
a desenvolver o câncer. Essa habilidade envolve fatores genéticos como, por exemplo, as enzimas ativadoras e
desintoxicadoras de carcinógenos. Os xenobióticos em geral são metabolizados por várias famílias de enzimas,
de fase I e fase II, e quando ocorrem falhas nesse processo as chances de desenvolver o câncer podem aumentar.
Os genes codificadores destas enzimas exibem polimorfismos que levam a variabilidade interindividual de
metabolizar carcinógenos ambientais. O Citocromo P450 2D6 (CYP2D6) é uma das enzimas da fase I, importante
para o metabolismo de xenobióticos. A CYP2D6 está envolvida no metabolismo de drogas e de diversos substratos
endógenos. A identificação da transição G → A no primeiro nucleotídeo do éxon 4, resulta em uma mudança no
sítio do splicing e a introdução prematura de um códon de término. A proteína mutante resultante não possui
nenhuma atividade funcional. Indivíduos que possuem a transição G → A são classificados como metabolizadores
lentos (PM), enquanto que indivíduos que não possuem a transição são classificados como metabolizadores
extensivos (EM). Vários estudos têm descrito associação entre o fenótipo EM e a incidência de câncer de pulmão,
mama e bexiga, entre outros. Esse trabalho teve como objetivo determinar os polimorfismos do gene CYP2D6
(transição G → A no primeiro nucleotídeo do éxon 4) numa amostra caso-controle e avaliar sua influência no risco
de LLA. Os polimorfismos na CYP2D6 foram determinados no DNA genômico de 115 pacientes e 465 doadores de
sangue utilizando a técnica PCR-RFLP. As amostras amplificadas foram digeridas com a enzima de restrição BstNI
e posteriormente visualizados em géis de agarose a 2,5%, corados com brometo de etídeo sob luz UV. A distribuição
genotípica observada para casos e controles foi similar entre os dois grupos (p=0,203) e a análise de risco não
detectou associação entre genótipo PM e o risco de desenvolver leucemia linfoblástica aguda. Os resultados deste
estudo caso-controle sugerem que variantes do CYP2D6 (transição G → A no primeiro nucleotídeo do éxon 4) não
influenciam o desenvolvimento da leucemia linfoblástica aguda em amostra da população do Rio de Janeiro.
Financiamento do Projeto: CNPq e Convênio FIOCRUZ-FAPERJ.
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SNPs do Projeto Genoma Humano do Câncer: validação
em pacientes com câncer de cabeça e pescoço
Ruiz, MT1; Maniglia, JV2; Pavarino-Bertelli, EC1; Goloni-Bertollo, EM1.
Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular – UPGEM –Departamento de Biologia Molecular - Faculdade de Medicina de
São José do Rio Preto – FAMERP
2
Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço - Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
[email protected]
1
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, polimorfismos, tabagismo, etilismo.
O câncer de cabeça e pescoço é responsável por uma alta incidência de óbitos. O tabagismo e o etilismo são
os principais fatores etiológicos desta doença. Os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) constituem
a variação mais comum do genoma humano e estão associados à base molecular do câncer. O objetivo deste
trabalho foram avaliar a freqüência de SNPs não sinônimos nos genes KiSS-1 (A/G), NINJ1 (A/C), TAX1BP1 (T/A)
e LAD1 (A/G) gerados no Projeto Genoma Humano do Câncer em pacientes com câncer de cabeça e pescoço;
comparar suas freqüências em uma população controle e analisar a associação desses SNPs com os parâmetros
clínicos investigados. Foram analisados os dados epidemiológicos como sexo, idade, etnia, tabagismo e etilismo de
656 indivíduos (243 pacientes com câncer de cabeça e pescoço e 413 indivíduos sem história de neoplasia). Foram
também analisados os parâmetros clínicos (sítio primário, estadiamento) dos pacientes. A análise molecular foi
realizada com DNA genômico, extraído a partir de sangue periférico e foram utilizadas as técnicas de PCR-SSCP
(gene KiSS-1), PCR-RFLP (genes NINJ1 e TAX1BP1) e sequenciamento automático (gene LAD-1). A análise dos dados
epidemiológicos mostrou predominância de pacientes do sexo masculino (86%), tabagistas (89,71%) e etilistas
(77,37%). O sítio anatômico primário mais freqüente foi a cavidade oral (37,45 %). Na análise das freqüências
genotípicas não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes. Na análise dos parâmetros clínicos,
para o sítio anatômico primário do tumor, foi encontrada uma freqüência aumentada do alelo polimórfico na
laringe (OR = 2,32; IC 95% 1,12 – 4,82; p = 0,02) para o gene KiSS-1; uma freqüência aumentada do polimorfismo do
gene NINJ1 em cavidade oral (OR = 1,86; IC 95% 1,05 -3,30; p = 0,03) e diminuída na laringe (OR = 0,40 IC 95% 0,220,74; p =0,003). Para o gene TAX1BP1 foi encontrado um aumento do polimorfismo na cavidade oral (OR =2,25; IC
95% 1,20-4,21; p =0,01). Em relação ao estadiamento do tumor, há uma freqüência menor do polimorfismo do gene
LAD1 em tumores com estádios III e IV (OR = 0,39 IC 95% 0,18-0,83; p = 0,01). Os resultados não mostram relação
entre os polimorfismos estudados e o desenvolvimento do câncer de cabeça e pescoço.
Apoio Financeiro: CNPq, FAMERP/FUNFARME, FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Associação do polimorfismo do códon 72 no gene
TP53 em pacientes com carcinomas tiroideanos
Reis, AAS¹; Monteiro, CD²; Silva, DM2; Oliveira, JC3; Curado, MP3; Saddi, VA4; Cruz, AD1,2
¹Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular (Doutorado) Instituto de Ciências Biológicas - Universidade Federal de
Goiás (ICB-UFG).
2
Núcleo de Pesquisas Replicon, Departamento de Biologia - Universidade Católica de Goiás.
3
Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia-GO – Associação de Combate ao Câncer em Goiás.
4
Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Araújo Jorge – Associação de Combate ao Câncer em Goiás.
[email protected]
Palavras-chave: polimorfismo TP53, susceptibilidade genética, arginina, prolina e câncer de tiróide
As recentes descrições das alterações genéticas relacionadas aos carcinomas de tiróide iniciaram a caracterização
da patogênese molecular dos carcinomas e seus subtipos. As desordens genéticas desses tumores envolvem várias
vias heterogêneas na carcinogênese. O polimorfismo do gene supressor de tumor TP53, no códon 72, tem sido
investigado extensivamente para associação com vários cânceres, inclusive os carcinomas tiroideanos. Apenas
três estudos estão descritos na literatura envolvendo o polimorfismo no códon 72 do gene TP53 em tumores
tiroideanos. O presente estudo teve como objetivo analisar a freqüência do polimorfismo arginina (Arg) e prolina
(Pro) do códon 72 de TP53 em 256 amostras. No grupo casos foram avaliados 122 pacientes, destes 35 (28,7%)
apresentaram nódulos neoplásicos malignos (NNM), 20 (16,4%) eram portadores de nódulos neoplásicos benignos
(NNB) e 67 (54,9%) possuíam nódulos não neoplásicos (NNN). O grupo controle (GP) foi constituído por 134
indivíduos saudáveis. A detecção do polimorfismo Arg e Pro foi realizada pela Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR). A associação entre o polimorfismo de P53 e a susceptibilidade ao câncer de tireóide foi avaliada por Odds
Ratio (OR) com intervalo de confiança de 95%. Dentre os pacientes com NNM, NNB, NNN, 18%, 35%, 47% eram
homozigotos Arg/Arg; 60%, 45% e 45% eram heterozigotos Arg/Pro e 23%, 20% e 9% eram homozigotos Pro/
Pro, respectivamente. Para o GP, 57% eram homozigotos Arg/Arg, 30% eram heterozigotos Arg/Pro e 13% eram
homozigotos Pro/Pro. As freqüências alélicas de Arg foram 47%, 57% e 68% e de Pro 53%, 43% e 32% para NNM,
NNB e NNN, respectivamente. O GP apresentou 72% Arg e 28% Pro. A freqüência genotípica Arg/Pro foi a mais
prevalente nos casos, demonstrando que os portadores desse genótipo apresentam uma provável susceptibilidade
genética para o câncer de tireóide (OR; IC95% p: 3.6;1.7 - 7.9; p=0.0014). Já o genótipo Arg/Arg parece proteger
contra à carcinogênese tiroideana (OR; IC 95% p: 0.15; 0.06-0.4 p<0,0001). Por outro lado, a freqüência genotípica
de Pro/Pro, em ambos os grupos, não apresentou valores estatisticamente significativos (p>0,005). Assim, visando
uma melhor compreensão sobre o comportamento molecular do câncer de tireóide, novos estudos devem ser
realizados sobre o polimorfismo do TP53 no códon 72, em portadores de doenças tiroideanas benignas e malignas.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Polimorfismos nos genes de reparo XRCC1 e APEX1 e
suscetibilidade ao câncer de próstata
Lengert, AH1; Kuasne, H1; Rodrigues, IS1; Cilião, HL1; Reis, MB1; Losi-Guembarovski, R1; Rodrigues, MAF2;
Gregório, EP3; Fuganti, PE3; Libos-Junior, F3; Cólus, IMS1
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina (PR).
Departamento de Cirurgia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual de Londrina (PR).
3
Hospital do Câncer de Londrina (ICL), Londrina, Paraná.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de próstata, polimorfismos, genes de reparo, APEX1, XRCC1
O câncer de próstata é o mais comum em todas as regiões do Brasil, desconsiderando os tumores de pele não
melanoma. Os métodos de rastreamento disponíveis atualmente, como o PSA (prostate-specific antigen), não
mostraram, até o momento, sucesso em reduzir a mortalidade, além de levarem a muitas cirurgias desnecessárias,
causando prejuízos tanto financeiros, quanto em qualidade de vida. Assim, existe uma necessidade urgente de
se identificarem novas metodologias para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata. Alterações nas vias
utilizadas pelos genes de reparo por excisão de bases (BER) têm sido extensamente estudadas em associação com
vários cânceres humanos, sendo empregadas como alvos para detecção de células neoplásicas. Os genes XRCC1 e
APEX1 estão envolvidos neste tipo de reparo, podendo representar alvos efetivos para a busca de marcadores. Para
investigar a relação entre os polimorfismos destes genes e a suscetibilidade ao carcinoma de próstata, aplicamos
um estudo do tipo caso-controle que incluiu 172 pacientes que apresentaram confirmação histopatológica de
carcinoma de próstata e 172 indivíduos controle, com PSA menor que 2ng/ml. O DNA do sangue periférico
dos indivíduos foi extraído pela técnica de Salting out e para a diferenciação das variantes alélicas dos genes
XRCC1 (G→A, Arg399Gln, rs: 25487) e APEX1 (T→G, Asp148Glu, rs: 1130409) foi realizada a técnica de PCR-RFLP
(polymerase chain reaction-restriction fragmente length polymorphism) com o uso das enzimas de restrição Hpa II
e BfaI, respectivamente. Além disso, os genes foram avaliados quanto a parâmetros histopatológicos e clínicos.
As análises demonstraram que existe relação entre o polimorfismo estudado do gene APEX1 (OR=1,68 IC95%
1,10-2,58) e o câncer de próstata. Não houve risco alterado para o SNP estudado do gene XRCC1 (OR=0,82 IC95%
0,53-1,27) e nem na análise combinada dos genes (OR=1,27 IC95% 0,79-2,05). Nenhuma das variantes mostrou-se
relacionada a graus mais agressivos do processo tumoral. Em resumo, nossos resultados sugerem que o genótipo
raro do gene APEX1 pode exercer um aumento no risco do câncer de próstata, podendo ser utilizado como um
marcador de suscetibilidade a este tipo de tumor maligno.
Apoio Financeiro: Fundação Araucária, CAPES/DS e CNPq-PQ
Apoio: Hospital do Câncer de Londrina, UROLIT
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Polimorfismos do gene de E-caderina e o risco de
câncer de próstata em uma população da Bahia
Santos, LM1; Fernandes, JS2; Carvalho, LF2; Sousa, SMB3; Santos, FR3; Di Pietro, G4; Barbosa, AAL4;
Corrêa, RX5
Mestrando do curso de Genética e Biologia Molecular. Laboratório de Farmacogenômica e Epidemiologia Molecular-UESC, BA.
[email protected]
2
Estudantes de Iniciação científica que auxiliam no projeto.
3
Co-orientadores
4
Colaboradores
5
Orientador
1
Palavras-chave: polimorfismo, CDH1, carcinogênese, E-caderina e próstata.
Mundialmente, o câncer causa mais mortes do que AIDS, tuberculose e malária juntos. Uma em cada oito mortes
no mundo inteiro é devido ao câncer. (GARCIA M. et. al., 2007). No Brasil, os tipos mais incidentes, com exceção do
câncer de pele do tipo não melanoma, são os cânceres de próstata e de pulmão, no sexo masculino, e os cânceres
de mama e de colo do útero, no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada no mundo
(INCA, 2009). A caracterização de polimorfismos genéticos que afeta a síntese de proteínas de membrana envolvidas
com adesão, formação e manutenção de tecidos sólidos constitui alvo relevante no estudo de carcinomas de
tecidos sólidos. Algumas mutações no promotor do gene CDH1, codificador da E-caderina, estão associadas ao
risco de câncer de próstata em populações européias, norte americanas e asiáticas. Neste projeto objetivou-se
avaliar os padrões alélicos de polimorfismos do gene CDH1 em uma população da Bahia, visando testar a hipótese
de diferenças alélicas entre pacientes afetados e não-afetados por câncer de próstata, aliado a fatores ambientais.
Para isso, foi utilizada uma amostra total de 200 indivíduos, distribuídos em amostras e controles, dos quais foi
amplificado o DNA pela técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), a qual permitiu
distinguir os principais tipos de mutações documentados na literatura. Os primeiros resultados com 71% dos
casos mostram que entre os pacientes portadores de câncer de próstata, 7,1% fumam ou fumaram por mais de 5
anos e 19,7% bebem ou beberam por mais de 5 anos e 61,9% que beberam e fumaram por mais de 5 anos. Entre
o histórico familiar ressalta-se que 32,4% dos portadores de câncer apresentaram histórico familiar da doença e
64,8% não alegaram haver histórico familiar. Estes dados corroboram com a literatura demonstrando a influência
do ambiente e consolidada ao caráter hereditário do câncer. A identificação de fatores genéticos e ambientais
envolvidos na carcinogênese fornecerá ferramentas para: identificar grupos de indivíduos de alto risco, desenvolver
estratégias para prevenir a doença, auxiliar assim no seu diagnóstico.
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Investigação do polimorfismo G1958A do gene
MTHFD1 na carcinogênese de cabeça e pescoço
Silva, LMRB1; Ruiz, MT1; Galbiatti, ALS1; Raposo, LS2; Maníglia, JV2; Pavarino-Bertelli, EC1,3; GoloniBertollo, EM1,3
Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular – UPGEM, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
3
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, Metilenotetrahidrofolato desidrogenesase 1, polimorfismo, metabolismo do folato.
Alterações no metabolismo do folato podem contribuir para o processo de carcinogênese por influenciar as reações
de metilação do DNA e a estabilidade genômica. Polimorfismos em genes que codificam enzimas envolvidas
neste metabolismo podem alterar a atividade enzimática e, consequentemente, interferir nas concentrações
de homocisteína, S-adenosilmetionina e outros produtos importantes para a síntese de DNA e reações de
metilação celular. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência do polimorfismo 1958 (G→A) do gene
Metilenotetrahidrofolato desidrogenesase 1 (MTHFD1), envolvido na via metabólica do folato, no risco para o câncer
de cabeça e pescoço e, verificar a associação entre este polimorfismo e os parâmetros clínicos (tamanho do tumor
e presença de linfonodos), bem como com a localização anatômica primária do tumor. Foram analisados os dados
epidemiológicos como gênero, idade, tabagismo e etilismo de 98 indivíduos (49 pacientes com câncer de cabeça e
pescoço e 49 indivíduos sem história de neoplasia). O polimorfismo foi investigado por meio da técnica de Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) e Análise de Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (PCRRFLP) utilizando-se a enzima MspI. A análise estatística foi realizada pela análise de regressão logística múltipla
pelo programa Bio Estat. Os resultados mostraram que o sítio anatômico primário, extensão, comprometimento
de linfonodos e estadiamento do tumor não foram associados com a presença do polimorfismo MTHFD1. Na
casuística avaliada até presente, o hábito tabagista (OR=48,95; IC 95% = 9,13-262,64; p<0,0001) foi associado ao
câncer de cabeça e pescoço, enquanto etilismo (OR=0,77; IC 95% = 0,14-4,37; p=0,77), gênero (OR=1,10; IC 95%
= 0,22-5,64; p=0,90) e idade (OR=1,17; IC 95% = 0,38-3,59; p=0,78) não mostraram associação. Dos 49 indivíduos
sem história de neoplasia, 14,29% apresentaram o genótipo polimórfico MTHFD1AA, 61,22% foram heterozigotos
(MTHFD1GA) e 24,49% homozigotos selvagem (GG). Dos 49 pacientes, 14,30% apresentaram o genótipo polimórfico
MTHFD1AA, 44,90% o genótipo GA e 40,80% o genótipo GG. Portanto, as frequências genotípicas não diferiram
significantemente entre os grupos (p=0,2). Conclui-se que houve uma associação do câncer de cabeça e pescoço
com o hábito tabagista, mas não foi possível estabelecer associação entre o polimorfismo MTHFD1G1958A e o
desenvolvimento com o câncer de cabeça e pescoço na casuística avaliada.
Apoio: FAPESP, CNPq, FAMERP-FUNFARME.
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Associação entre os polimorfismos MTR (A2756G),
MTHFR (C677T) e CBS (844ins68) da via do folato e o
câncer de cabeça e pescoço
Galbiatti, ALS1; Ruiz, MT2; Raposo, LS3; Maníglia, JV3; Pavarino-Bertelli, EC4; Goloni-Bertollo, EM4.
Mestranda da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP (UPGEM). 2Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia
Molecular – UPGEM, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP. 3Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de
Cabeça e Pescoço, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP. 4Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de
Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
[email protected]
1
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, polimorfismos, metabolismo do folato.
O câncer de cabeça e pescoço compreende tumores de cavidade oral, laringe e faringe, representam 10% dos
tumores malignos e apresenta incidência de cerca de 200 mil casos novos por ano. Mais de 90% dos casos
constituem-se do carcinoma espinocelular e destacam-se pela agressividade local e ocorrência de tumores
secundários. Fatores como tabagismo e etilismo estão relacionados ao desenvolvimento da doença. Polimorfismos
em genes que participam do metabolismo do folato têm sido associados ao desenvolvimento de vários tipos de
cânceres, incluindo o sítio anatômico cabeça e pescoço, devido a alterações nos níveis de folato que podem induzir
anormalidades cromossômicas, quebra da fita de DNA e alterações nas reações de metilação intracelulares,
promovendo a carcinogênese. Este estudo investigou: a freqüência dos polimorfismos MTR (A2756G), MTHFR
(C677T) e CBS (844ins68) envolvidos no metabolismo do folato em 651 indivíduos, 254 com câncer de cabeça e
pescoço e 397 sem história de neoplasia; e a associação da doença com todos os dados investigados; características
clínicas e fatores de risco. A técnica de PCR-RFLP foi realizada para genotipagem dos polimorfismos MTR A2756G
e MTHFR (C677T) e para o polimorfismo CBS (844ins68) utilizou-se o PCR convencional. Os achados moleculares
e as informações sobre os fatores de risco foram avaliados estatisticamente por meio dos programas Instat e Stat
Directs. As distribuições genotípicas estão de acordo com o Equilíbrio de Hardy Weinberg nos grupos de pacientes
e controles. Os resultados mostraram que tabagismo (P<0,0001) e o polimorfismo MTR A2756G (P=0,0071) são
preditores da doença, enquanto que idade (p= 0,4502), gênero (p= 0,9382), etilismo (p= 0, 0013), polimorfismo
MTHFR (P= 0, 9779) e polimorfismo CBS 844ins68 (p= 0,3608) não se mostraram preditores. Não se observou
relação dos polimorfismos em relação aos parâmetros clínicos, sítios primários, agressividade, comprometimento
de linfonodos e extensão do tumor. Em conclusão, houve uma associação do câncer de cabeça e pescoço com o
hábito tabagista e com o polimorfismo MTR A2756G, o que confirma a importância do estudo dos fatores de risco
e polimorfismos envolvidos no metabolismo do folato no processo de carcinogênese.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes, Fapesp.
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Risco de câncer gástrico associado com polimorfismo
-954G/C do gene NOS2 e fatores ambientais
Jorge, YC1; Silva, AE1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: polimorfismos, NOS2, tumor gástrico, gastrite, Helicobacter pylori.
Os fatores ambientais mais fortemente relacionados ao câncer gástrico e a gastrite são os hábitos tabagista e
etilista e, principalmente, a infecção pela Helicobacter pylori. Esta bactéria estimula a expressão do gene NOS2,
codificante da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), responsável pela produção de óxido nítrico (NO),
através da conversão de L-arginina em L-citrulina. O NO pode bloquear a apoptose, ativar a angiogênese e inibir
enzimas de reparo do DNA, assim podendo atuar na carcinogênese do estômago. Neste estudo, foram avaliadas as
freqüências dos polimorfismos 608C/T no éxon 16 (Ser608Leu), -954G/C e -1173C/T da região promotora (alteração
da expressão gênica), pela técnica de PCR-RFLP em 150 pacientes com câncer gástrico, 160 com gastrite crônica
e 164 indivíduos saudáveis (controles), assim como sua interação com os hábitos tabagista, etilista e infecção pela
H. pylori. As freqüências observadas para os alelos selvagens 608C, -1173C e -954G e polimórficos 608T, -1173T
e -954C encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg e foram, respectivamente, de: 0,83, 1,0 e 0,71; 0,17; 0 e
0,29 para o grupo de tumor gástrico; 0,77; 1,0 e 0,82; 0,33; 0 e 0,18 para gastrite e 0,81; 1,0 e 0,82; 0,19; 0 e 0,18 para
o grupo controle, não tendo sido detectadas diferenças significantes entre os grupos. Deve ser destacado que o
alelo polimórfico –1173T não foi encontrado nos grupos avaliados, sendo considerado como raro em algumas
populações. Quanto às freqüências genotípicas foi observada diferença estatisticamente significante apenas entre
os grupos de tumor e controle para a variante -954GC (p=0,0008) devido à prevalência do alelo polimórfico C em
heterozigose ou homozigose no grupo de tumor. Da mesma forma constatou-se no grupo de tumor interação
desse polimorfismo com tabagismo (p=0,0002) e etilismo (p=0,0000) em comparação ao grupo controle. O grupo
de gastrite apresentou associação com tabagismo (p=0,0073) e etilismo (0,0006), mas não para o polimorfismo
-954GC, em relação ao grupo controle. No entanto, a comparação entre os grupos de gastrite e tumor evidenciou
diferenças significantes para o polimorfismo -954GC (p=0,0004), devido prevalência de indivíduos –954GC e CC no
grupo de tumor, como também para infecção pela H. pylori (p=0,0012), que foi mais freqüente no grupo de gastrite.
Estes dados são inéditos, ainda não havendo descrição de associação do polimorfismo –954GC na literatura com
câncer gástrico, mas principalmente associação da variante polimórfica –954C, que acarreta aumento na expressão
da enzima iNOS e conseqüentemente de NO, em pacientes com malária. Portanto, estes achados evidenciam
associação entre o polimorfismo -954GC do gene NOS2 e os hábitos tabagista e etilista como fator de risco na
carcinogênese gástrica, bem como a associação entre os hábitos tabagista e etilista para o desenvolvimento da
gastrite.
Apoio financeiro: Bolsa PIBIC/CNPq
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Polimorfismos no gene MTHFR e TYMS e o risco de
leucemia linfoblastica aguda infantil no Rio de Janeiro
Coutinho, PC1,4; Fraga, A1; Solza, C2; Land, M3; Hatagima, A1
Laboratório de Genética Humana, IOC – FIOCRUZ - RJ,
Dpto Clínica Medica – Hematologia –UERJ,
3
Departamento de Pediatria – UFRJ,
4
Programa de Pos Graduação em Biologia – UERJ
1
2
Palavras-chave: leucemia linfoblastica aguda, MTHFR, TYMS, folato, suscetibilidade
A leucemia é o câncer infantil mais comum, representando 30-35% do total de doenças malignas na infância, e
a leucemia linfoblástica aguda (LLA), cujo pico de incidência ocorre entre 3-4 anos, representa cerca de 75% dos
casos de leucemia. A etiologia desta doença ainda não foi totalmente esclarecida, mas dentre os vários fatores
de risco sugeridos para LLA, há a hipótese do envolvimento do metabolismo do folato que é essencial para a
síntese de DNA e proteínas e para a metilação do DNA. Defeitos neste processo poderiam ocasionar alterações
genéticas, incluindo as translocações, muito comuns na leucemia. Como as enzimas MTHFR e TYMS são peças
chave no metabolismo do folato, alterações funcionais observadas em alguns polimorfismos genéticos podem ter
um papel importante na suscetibilidade à leucemia. Este estudo descreve a distribuição das freqüências alélicas
e genotípicas dos polimorfismos MTHFR C677T, MTHFR A1298C e TSER avaliando sua influência no risco de
desenvolver LLA. Os genótipos foram determinados usando a técnica de PCR e PCR-RFLP em amostras de DNA
extraído do sangue periférico de 129 pacientes pediátricos com LLA e 447 controles, doadores de sangue sem
histórico de câncer, do Rio de Janeiro. As distribuições da frequência genotípica de MTHFR C677T, MTHFR A1298C
e TSER, entre casos e controles, foram similares e nenhuma associação foi observada entre esses polimorfismos
e o risco de LLA na infância. A freqüência alélica em casos e controles foi de 0,74 e 0,72 para MTHFR 677C; 0,75
e 0,79 para MTHFR 1298A e 0,42 e 0,41 para TYMS 2R, respectivamente. A análise dos haplótipos MTHFR C677T/
MTHFR A1298C foi realizada utilizando o programa estatístico PHASE v2.1 e os resultados não evidenciaram
diferença estatisticamente significativa nas suas freqüências entre casos e controles. Estes resultados sugerem que
os polimorfismos genéticos MTHFR e TYMS não influenciam o risco de desenvolver LLA infantil no Rio de Janeiro.
Financiamento do Projeto: CNPq, Convênio FIOCRUZ-FAPERJ e CAPES.
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Characterization of molecular markers of malignancy in
Renal Cell Carcinoma
Vilella-Arias, SA1; Fachel, AA1; Valenzuela-Rodriguez, CN1; Rocha, RM2; Soares, FA2; Verjovski-Almeida, S1;
Reis, EM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo; 2Departamento de Anatomia Patológica, Hospital A.C.
Camargo, São Paulo, SP, Brasil
1
Keywords: noncoding RNA, Renal Cell Carcinoma, gene expression, tissue microarrays, real time
Renal Cell Carcinoma (RCC) is the most common renal cancer in adults, representing about 3% of all cancer in the
world. Despite all research in molecular biology of RCC, at the present time there are few molecular biomarkers
available for diagnosis or prognosis of the disease. Recently, our group identified through microarray gene expression
analysis a novel set of molecular marker candidates for RCC subtype clear cell, that includes noncoding RNAs
(ncRNAs) expressed in intronic regions of protein-coding genes (Brito et al, Mol. Carcinog. 2008, 47:757-67). In this
present study, Real Time PCR approach was used to validate the gene expression microarray results of a selected
subset of 10 genes and to extend their differential expression analysis in 10 additional paired patient samples
comprising four RCC subtypes. The candidate gene set included protein-coding mRNAs up-regulated (ARNTL) or
down-regulated (CASP7, CTSB, EPAS1, MAP3K7IP1, PRKAG1, UQCRH, VRK2) in tumor samples and two intronic
ncRNAs down-regulated in tumor samples, mapping to genes ACTN4 and HDAC5. Total RNA extraction from renal
tissue was followed by DNAse treatment to eliminate any genomic DNA contamination. Reverse transcription
was performed with oligo-dT (30bp) primers. We have detected the relative expression of MAP3K7IP1, PRKAG1,
ACTN4 and HDAC5 as down-regulated (p<0.01) in clear cell as well in three other RCC subtypes analyzed (papillary,
chromophobe and sarcomatoid). ARNTL and VRK2 showed variability in relative expression depending of the
subtype RCC analyzed. Additionally, the two intronic non-coding transcripts were analyzed by strand-specific RTPCR to determine their orientation relative to the protein-coding gene encoded in the same loci. This experiment
indicated that intronic ACTN4 and HDAC5 are predominantly sense and antisense, respectively, compared to the
corresponding protein-coding gene. Similar to the intronic ncRNAs from the same loci, relative expression of
ACTN4 and HDAC5 protein-coding mRNAs was found to be down-regulated in tumor samples (p<0.1 and <0.01
respectively) as compared to non-tumor adjacent tissue. This result suggests that these intronic ncRNAs may act in
cis to modulate the abundance of the protein coding gene expressed in the same loci. We are currently investigating
the protein levels of CASP7, CTSB, MAP3K7IP1, ACTN4 and HDAC5 by tissue microarrays comprising 117 RCC
samples, 18 of which are paired samples of tumor and non-tumor adjacent renal tissue from the same patient.
Work supported by FAPESP and CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
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Expressão gênica e protéica de BAD e ATM e sua
relação com prognóstico desfavorável em pacientes
com câncer de mama
Canevari, RA1; Abreu, FB2; Caldeira, JRF3; Soares, FA4; Domingues, MAC5; Rogatto, SR6
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, UNIVAP, São José dos Campos, SP.
Centro de Pesquisa, Hospital AC Camargo, SP.
3
Departamento de Mastologia, Hospital Amaral Carvalho, Jaú, SP.
4
Departamento de Patologia, Hospital AC Camargo, SP.
5
Departamento de Patologia, HC-FMB, UNESP-Botucatu, SP.
6
Departamento de Urologia, HC-FMB, UNESP-Botucatu, SP; Departamento de Pesquisa Hospital AC Camargo, SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de mama, BAD, ATM, expressão gênica, qRT-PCR, expressão protéica, tissue microarray
O câncer de mama é uma doença extremamente complexa e heterogênea, tanto do ponto de vista histológico
quanto clínico, sendo a recorrência e a metástase as responsáveis pela maioria da morbidade. Atualmente, os
critérios anátomo-patológicos e os marcadores moleculares disponíveis são insuficientes para uma classificação
adequada da doença e um prognóstico seguro. O gene BAD codifica uma proteína relacionada com a morte
celular, enquanto que o ATM codifica uma proteína reguladora de proteínas envolvidas no ciclo celular, como as
supressoras de tumor TP53 e BRCA1. Foi utilizada análise de expressão dos genes por qRT-PCR em 50 amostras.
A análise de expressão protéica foi realizada em quatro plataformas de microarranjos de tecidos contendo
amostras de 1277 pacientes com carcinoma mamário. As análises de expressão dos transcritos BAD e o ATM não
apresentaram associação significativa com características de pior prognóstico. Entretanto, foi observada diferença
estatisticamente significativa entre a proteína BAD e a presença de metástase à distância (P=0,026 e P=0,010,
respectivamente). A maioria das pacientes com metástase apresentou ausência ou diminuição de expressão da
proteína BAD, enquanto que a maioria das pacientes com expressão elevada não desenvolveu metástase ou recidiva
tumoral. A análise da proteína ATM mostrou uma diminuição da expressão na maioria das pacientes com presença
de metástase (P=0,0001) quando comparadas com o grupo de pacientes com bom prognóstico sem metástase. Os
resultados indicaram que os genes BAD e ATM estão envolvidos no desenvolvimento e/ou progressão do câncer de
mama, podendo ser considerados marcadores biológicos putativos envolvidos na carcinogênese mamária.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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Polimorfismo no gene do receptor AT2 e sua eventual
associação ao câncer de mama
Cecato, GZ1; Correa, SA1; Linhares; JJ1; Massad-Costa, AM1; Nakaie, CR2; Carvalho, CV1; Silva, ID1
Laboratório de Ginecologia Molecular – Depto de Ginecologia. Campus São Paulo – UNIFESP
Laboratório de Biofísica – Depto de Biofísica. Campus São Paulo – UNIFESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: polimorfismo, câncer de mama, sistema renina angiotensina, receptor AT2, angiotensina II
O sistema renina angiotensina (SRA) está relacionado à gênese e manutenção da hipertensão arterial e tem um
papel essencial no equilíbrio cardiovascular. A Angiotensina II (AII) regula uma série de respostas fisiológicas nos
sistemas cardiovascular, endócrino e neuronal, além de produção de aldosterona e participação na mitogênese e
proliferação celular. Os componentes do SRA estão associados a vários tipos de câncer (pancreático, renal, pulmonar
e mamário) pela atuação na angiogênese ou diretamente na célula cancerosa, ativando o receptor AT1. A respeito
do câncer de mama, há uma evidência para uma associação entre a Angiotensina II e o risco da doença, uma vez
que a AII estimula a proliferação de células mamárias, embora tais funções não estejam totalmente esclarecidas.
O AT2 é um receptor que induz a apoptose e inibe a proliferação de células através dos caminhos incomuns da
sinalização que não envolvem a ligação às proteínas G. Este receptor funciona principalmente neutralizando os
efeitos do receptor AT1. O gene do receptor AT2 está localizado no cromossomo Xq 22 e é constituído por três éxons
e dois introns, com toda a codificação localizada no éxon 3. Neste gene encontramos polimorfismos intrônicos
que se localizam no início do intron 1 em aproximadamente 29 pb, antes do começo do éxon 2, próximo de uma
região importante para o processo de transcrição. Uma vez que até o momento não sabemos o papel efetivo da
angiotensina II na angiogênese e conseqüentemente no câncer de mama, propusemo-nos a realizar um estudo
molecular direcionado ao polimorfismo do receptor AT2 buscando detectar eventuais correlações com o carcinoma.
O estudo foi realizado com material biológico proveniente de 156 mulheres brasileiras com câncer de mama
cirúrgico histologicamente confirmado e de 133 mulheres saudáveis para controle. O material biológico foi obtido
no Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo-Francisco Morato de Oliveira (HSPE-FMO) e também no
Setor de Climatério do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). A extração
do DNA das pacientes foi feita a partir de células sanguíneas. Este material foi amplificado através da técnica de
PCR e genotipados por meio de digestão enzimática. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente
buscando uma relação com o câncer de mama. O polimorfismo G-1332A não mostrou significância estatística até
o momento, não se correlacionando com a doença.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq
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Influência dos polimorfismos de nucleotídeo único
(SNPs) Pvu II (T-397int1C) e Xba I (A-351int1G) do
gene do receptor de estrogênio alfa (REα) no risco do
desenvolvimento do câncer de mama (CAM)
Madeira, KP; 1Araujo, KL; 1Daltoé, RD; 1Sirtoli, GM; 1Paes, MF; 2Carvalho, AA; 1,4Silva, IV; 1,3Rangel, LBA
1
Programa de Pós graduação em Biotecnologia; 2Dept. Patologia; 3Dept. Ciências Farmacêuticas; 4Dept. Morfologia - Universidade
Federal do Espírito Santo
1
Palavras-chave: polimorfismos de nucleotideo único, PvuII, XbaI, receptor de estrogênio alfa, câncer de mama
Introdução: O câncer de mama (CAM) é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais freqüente
entre mulheres. A relação de polimorfismos genéticos do REα com o risco de doenças gera grande interesse,
pois tal receptor parece estar ligado às doenças associadas ao envelhecimento da mulher. Objetivo: Investigar a
influência dos SNPs PvuII e XbaI no risco do desenvolvimento do CAM, na expressão do REα nessa doença, bem
como na resposta ao tamoxifeno. Métodos e resultados: Selecionamos um grupo com 64 amostras parafinadas de
CAM e para grupo controle obtivemos amostras de sangue periférico de 72 pacientes livres de neoplasias, ambas
com TCLE assinado. Essas amostras foram amplificadas por PCR e forneceram fragmentos de 119pb. Posterior
digestão com as enzimas de restrição PvuII e XbaI forneceram fragmentos de 78/41 e 88/31 pb, respectivamente
Após análise dos genótipos observamos que houve diferença estatísticamente significante entre os genótipos PP,
Pp e pp no grupo CAM e no controle (X2, p=0,02). A ocorrência do alelo P presente nos genótipos PP e Pp, foi
mais frequente em pacientes com CAM se comparada àquela no grupo controle. Em contrapartida, a ausência
completa do alelo P, como visto no genótipo homozigoto recessivo pp prevalece em pacientes controle (Fisher,
p=0,0004). Pacientes portadoras do alelo P no genótipo têm 5,14 vezes mais chances de desenvolver CAM do
que aquelas que não apresentam a característica (Odds Ratio IC95%). Ademais, analisando apenas os genótipos
homozigotos PP e pp, observou-se diferença estatisticamente significativa entre tais genótipos e o risco inerente
de desenvolvimento de CAM (Fisher, p=0,02). Ademais, constatamos que o genótipo PP confere um risco 4,68
vezes maior de desenvolvimento de CAM do que o pp (Odds Ratio IC95%). Não houve diferença significativa entre
os genótipos XX, Xx e xx nos grupos estudados. Observou-se também que não houve diferença na freqüência
dos alelos do gene do REα para os SNPs PvuII e XbaI entre os CAM positivos e negativos para expressão desse
receptor. Ademais, o genótipo pp foi somente observado em pacientes com CAM responsivos ao tamoxifeno
(p>0,05). Conclusão: Este estudo concluiu que os genótipos PP, Pp e pp interferem na incidência do CAM. Ademais,
a presença do alelo P nos genótipos das pacientes aumenta em 5,14 vezes a chance de desenvolvimento de CAM
e analisando também os genótipos PP e pp pode-se notar que a ausência desse sítio (PP) aumenta em 4,68 vezes
a mesma chance supracitada. Dessa maneira, acreditamos que o alelo P pode ser considerando um candidato
a biomarcador de risco para o desenvolvimento de CAM. Além disso, portadoras do genótipo pp apresentaram
melhor prognóstico para o CAM.
Apoio Financeiro: FAPES-FUNCITEC.
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240
Análise de polimofismo dos genes RE-β e PROGINS em
pacientes com clínica de endometriose associado à
infertilidade
Souza, SR1; Silva, CTX1; Frare, AB1; Silva, RCPC1,2; Costa, IR1,3; Bordin, BM1; Júnior, CLR1; Moura, KKVO 1,3
Núcleo de Pesquisas Replicon – Universidade Católica de Goiás (UCG).
Laboratório de Reprodução Humana – Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás. 3Departamento de Biomedicina – UCG.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: endometriose, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, polimorfismo e infertilidade
A endometriose é definida pelo aparecimento de focos de tecido endometrial com características glandulares
e/ou estromais idênticos aos da cavidade uterina em outras localizações, que não o endométrio. É uma doença
estrógeno-dependente, uma vez que o estrógeno se faz necessário para o desenvolvimento da doença. Inúmeros
autores já demonstraram a expressão exagerada de receptor-beta de estrógeno (REß) e defeitos nos receptores de
progesterona (PROGINS) P1/2 ou P2/2 nos implantes de endometriose. Em processos proliferativos do endométrio
estudos demonstram uma maior freqüência do polimorfismo RsaI AG do gene REß, assim da inserção Alu de 306 pb
no gene PROGINS. Objetivo: Verificar se o polimorfismo dos genes REβ e PROGINS está associado à endometriose,
e sua correlação com a infertilidade. Métodos: Foram analisadas 52 amostras de pacientes entre 25 e 35 anos com
endometriose, utilizando a análise molecular através da técnica da PCR (polymerase chain reaction). Resultados:
A média de idade das pacientes analisadas foi de 30 anos. Foi diagnosticada a endometriose apartir dos exames
clínicos e laparoscópicos num total de 52 pacientes. Onde 40,7% são homozigotos (GG) para o polimorfismo RsaI do
gene REß e 48,1% são heterozigotos (AG). Na análise do PROGINS observamos que 66,67% das pacientes apresentam
o tipo selvagem para ambos alelos (P1/1), 31,37% são heterozigotos (P1/2) e 1,97% apresenta homozigoze (P2/2)
com inserção de Alu em ambos alelos. Conclusão: a etiopatogenia da endometriose ainda é pouco conhecida,
entretanto parece existir uma relação desta patologia com os polimorfismos RsaI do gene REß e PROGINS.
Apoio Financeiro: FAPEG E UCG.
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241
Análise do polimorfismo do gene receptor de
progesterona –PROGINS - em mulheres portadoras de
endometriose
Mafra, FA; Brandes, A; Rosset, V; Christofolini, DM; Bianco, B; Barbosa, CP
Disciplina de Genética e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia
Faculdade de Medicina do ABC - FMABC
[email protected]
Palavras-chave: endometriose, polimorfismo, PROGINS, gene do receptor de progesterona, infertilidade
Introdução: Estudos recentes têm sugerido associação entre o polimorfismo PROGINS do gene receptor de
progesterona e à susceptibilidade à endometriose, uma vez que a progesterona atua aumentando as células que
revestem a parede uterina, acentuando o espessamento do endométrio e fazendo com que ele seja intensamente
invadido por vasos sangüíneos. No entanto, os resultados da literatura ainda são controversos. Dessa forma, o objetivo
do presente estudo é a análise do polimorfismo PROGINS em portadoras de endometriose e no grupo controle
com o intuito de contribuir para o melhor conhecimento das características clínicas e genéticas das portadoras
da endometriose. Materiais e métodos: Foram estudadas 108 pacientes inférteis portadoras de endometriose
provenientes do Ambulatório de Endometriose da FMABC e um grupo controle composto de 190 mulheres
férteis submetidas à laqueadura provenientes do Ambulatório de Planejamento Familiar da FMABC. As pacientes
foram classificadas de acordo com o grau de endometriose e o polimorfismo PROGINS (P1 e P2) foi identificado
por PCR, eletroforese em gel de agarose e visualização em luz UV. Resultados: Das pacientes com endometriose,
47,2% tinham endometriose grau I/II e 52,7% grau III/IV. Os genótipos P1P1; P1P2 e P2P2 do polimorfismo
PROGINS apresentaram freqüência de 54,6%, 38,9% e 6,5%, respectivamente, nas portadoras de endometriose.
Das mulheres com endometriose grau I/II, 66,7% apresentaram o genótipo homozigoto normal P1P1; 29,4% o
genótipo heterozigoto P1P2, e 3,9% o genótipo homozigoto mutado P2P2. Das portadoras de endometriose grau
III/IV os genótipos P1P1, P1P2 e P2P2 estavam presentes em 42,1%, 49,1% e 8,8%, das pacientes, respectivamente.
Em relação ao grupo controle, 90,5% (172/190) apresentaram o genótipo homozigoto normal P1P1, 8,5% (16/190) o
genótipo heterozigoto P1P2 e 1,0% (2/190) o genótipo homozigoto mutado. Conclusâo: Os resultados sugerem que
o polimorfismo PROGINS está relacionado com a predisposição e progressão da endometriose.
Apoio: NEPAS (Núcleo de Estudos, Pesquisas e Assessoria em Saúde da Faculdade de Medicina do ABC).
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A influência dos polimorfismos de nucleotídeo único
PvuII e XbaI do receptor de estrogênio alfa (ESR1) no
risco associado à doença e na expressão protéica do
ESR1 no câncer de ovário (OVCA)
Araújo, KL; Souza, LS; 2,4Paes, MF; 2,4Madeira, KP; 2,4Daltoé, RD; 1,2Coitinho, LB; 3Carvalho, AA; 2,4Rangel,
LBA; 1,2Silva, IV
1,2
Dept. Morfologia;
Programa de Pós-graduação de Biotecnologia;
3
Dept. Patologia;
4
Dept. Ciências Farmacêuticas - Universidade Federal do Espírito Santo
e-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de ovário, polimorfismos, PvuII, XbaI
Introdução: O OVCA representa a 9ª malignidade entre as mulheres, porém a 5ª causa de morte por câncer entre
elas. A relação de polimorfismos genéticos do ESR1 com o risco de desenvolvimento de doenças gera grande
interesse, pois tal receptor parece estar ligado às doenças associadas ao envelhecimento da mulher, como o câncer
de mama. Objetivo: Investigar se os SNPs PvuII e XbaI estão associados ao risco de desenvolvimento do OVCA e
relacionar esses polimorfismos com a expressão do ESR1 no OVCA. Métodos e Resultados: O grupo selecionou,
aleatoriamente, 106 OVCAs, 9 tumores de baixo potencial de malignidade (BPM) e 19 adenomas (ADE). Para as
amostras controle, obteve-se 6 ovários normais e 71 amostras de sangue de mulheres sem diagnóstico de OVCA
e sem história prévia de neoplasias. Este estudo apontou diferença significativa na média de idade ao diagnóstico
entre as mulheres acometidas por OVCA e ADE, 55,71±11,58 e 40,47 ± 15,8, respectivamente (Teste t não pareado,
p<0,0001). A maioria das pacientes (84%) acometidas por OVCA foi ao óbito e apresentaram mediana de sobrevida
de 11 meses. As amostras parafinadas forneceram DNAs degradados, porém o sucesso de amplificação foi de
80%, fornecendo fragmentos de 119pb. Posterior digestão com as enzimas de restrição PvuII e XbaI forneceram
fragmentos de 78/41 e 88/31 pb, respectivamente. Após a análise dos genótipos, observou-se que houve diferença
significativa na freqüência dos genótipos PP, Pp e pp entre o grupo controle e o grupo OVCA (X2, p=0,02). O genótipo
xx foi detectado apenas em pacientes com OVCA (18%). Observou-se diferença significativa na frequência dos
alelos X e x (X2, p=0,009) quando foram comparados os grupos OVCA e o controle. Em outros agrupamentos,
entretanto, essa diferença não foi detectada. Não houve diferença significativa entre as frequências dos alelos
P e p entre os grupos estudados. Os genótipos xx(AA)/Xx(AG) aumentam em 2,60 vezes a chance da paciente
desenvolver OVCA (Fisher p=0,046, Odds Ratio IC95%). A imunohistoquímica foi realizada em 4 plataformas de
Tissue Microarray, totalizando 64 OVCA, 04 BPM e 13 ADE. O ESR1 não foi detectado em amostras de BPM ou
ADE, entretanto 14% das amostras de OVCA mostraram expressão desse receptor. Observou-se que não houve
diferença na freqüência dos alelos do gene do ESR1 para os SNPs PvuII e XbaI entre os OVCA positivos e negativos
para expressão do ESR1. Conclusões: Este estudo concluiu que os genótipos PP, Pp e pp interferem na incidência
do OVCA. Além disso, a presença do alelo x aumenta em 160% a chance de a mulher desenvolver OVCA, podendo
esse alelo ser um biomarcador de risco para essa doença. Não houve correlação significativa entre os alelos P, p, X
e x e a expressão do ESR1 em OVCA.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPES, FACITEC e DECIT.
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TP53 – marcador de susceptibilidade para o
desenvolvimento do câncer em populações expostas
ao urânio
Brasil-Costa, I1; Pessoa, IA1; Alencar, DO1; Raiol-Moraes, M1; Burbano, RR2; Santos, SEB1; Ribeiro-dosSantos AKC1
¹Laboratório de Genética Humana e Médica - Instituto de Ciências Biológicas/UFPA.
2
Laboratório de Citogenética Humana - Instituto de Ciências Biológicas/UFPA.
[email protected]
Palavras-chave: urânio, radioatividade, TP53, sequenciamento direto e susceptibilidade genética.
O urânio é um elemento radioativo que pode provocar danos a molécula de DNA, como quebra de fita simples
ou dupla, assim como alterações nucleotídicas. O acúmulo destes danos pode conduzir ao desenvolvimento de
neoplasias. O efeito da radiação apresenta maior relevância quando atinge genes responsáveis pela manutenção
da integridade genômica, como os genes supressores de tumor. O TP53 é um dos principais genes de supressão
tumoral, é responsável pela parada do ciclo celular, ativação de genes de reparo de DNA e apoptose. Mutações
neste gene podem produzir uma susceptibilidade aumentada ao desenvolvimento de neoplasias. Os éxons 5, 6, 7
e 8 detêm cerca de 94% de todas as mutações descritas. Além destes, o éxon 4 possui um dos polimorfismos mais
estudado no gene, presente no códon 72 (G à C), o qual troca o aminoácido (AA) arginina por prolina. O município
de Monte Alegre possui a maior área mineradora de urânio do mundo, esta se estende para os municípios de
Alenquer e Prainha, todos localizados no Estado do Pará. Buscando correlacionar possíveis alterações nucleotídicas
com os efeitos genotóxicos da radiação, foram investigados 151 indivíduos de três municípios correspondentes a
área de afloramento do urânio, por meio do seqüenciamento direto dos éxons 4, 5, 6, 7 e 8 e íntrons adjacentes do
gene TP53. Os resultados apresentaram: i) uma alteração de troca de AA no éxon 4 (Arg72Pro); ii) duas mutações
sinônimas - uma no éxon 5 (His179His) e outra no éxon 6 (Arg213Arg); e iii) quatro mutações em íntrons - três no
íntron 7 (C à T na posição 13.436; C à T na posição 13.491, T à G na posição 13.511) e uma no íntron 8 (T à G na
posição 13.958). De modo geral, as alterações se encontraram em equilíbrio de Hardy-Weinberg e suas freqüências
não apresentaram diferenças significantes em relação às descritas no banco de dados genéticos (GenBank/NCBI)
(p>0,05). O polimorfismo do códon 72 quando em homozigose, apresentou-se como fator de risco importante para
o desenvolvimento de câncer (p=0,023; OR=6,52; IC: 1,29 – 32,94), ajustado pelos fatores idade e tabagismo. As
freqüências alélicas observadas nas três populações em relação às descritas na literatura sugerem a ausência de
pressão seletiva nas regiões gênicas estudadas. Entretanto, a associação positiva do polimorfismo do códon 72 com
o desenvolvimento de câncer preocupa a saúde dos indivíduos susceptíveis, residentes nos municípios estudados
em relação aos efeitos da exposição ao urânio
Apoio Financeiro: FINEP, CAPES E CNPq.
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Association between tumor necrosis factor (TNF)-α
G-308A gene polymorphism and the susceptibility for
HPV infection in women with neoplasia intraepithelial
Fernandes, MCM1; Santos, SM1,3; Lima Júnior, SF¹; Medeiros, JAP1; Heráclio, SA2; de Sá Filho, AL1,3;
Fontes, KFLP1, Maia, MMD1; Souza, PRE1
¹Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA – Universidade Federal Rural de Pernambuco. 2Instituto de Medicina
Integral Prof. Fernando Figueira. 3Universidade de Pernambuco-UPE.
[email protected]
Keywords: HPV, TNF-alpha, polymorphism, neoplasia intraepithelial
Tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) is a cytokine proinflammatory that plays an essential role in the
immunological system. Investigating genetic host factors and immune responses could help to understand the
association between genital HPV infection and the susceptibility of intraepithelial neoplasia. TNF-α was originally
identified as a macrophage-derived serum protein that mediates necrosis of solid tumors in vitro and in vivo.
In addition, TNF has been shown to mediate carcinogenesis through induction of proliferation, invasion, and
metastasis of tumor cells. Several investigators have studied the polymorphisms within the TNF-α promoter
region to estimate the immune responses to a wide range of cancers, but the results have been contradictory. The
objective of this study was to investigate the biallelic polymorphism in the -308 promoter region of the TNF-α
gene and examined its relationship to the development of intraepithelial neoplasia among women HPV positive
and negative. The group was composed by 30 women presenting squamous intraepithelial lesions (SIL). The
positivity to HPV was based in the technique of PCR using universal primers MY09 and MY11. The genotyping of
the -308 promoter region of the TNF-α gene was performed by Amplification Refractory Mutation System (ARMSPCR) technique. The allele frequency of the -308 TNF-α polymorphism was compared between the patients and
control groups using the X2 test and Exact Fisher test; a p value of less than 0.05 was considered statistically
significant. The results of PCR analysis showed that 09 patients were positive and 21 negative for HPV infection.
The genotype frequencies 25%GG, 50%AG and 25%AA x 41%GG, 46%AG and 13% AA (respectively HPV positive
and HPV negative) are significantly different (p= 0,02064 95% IC OR 3,1173; C.I 1.27- 7.96). Also, allelic frequency
are significantly different in HPV positive subjects when compared to negative group (p=0,008065).. Our data
confirm the association between the presence of the mutated TNF alpha (allele A) and HPV infection in women
with squamous intraepithelial lesions.
Supported by: FACEPE.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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245
Investigação de suscetibilidade ao câncer gástrico e
gastrite crônica em associação com os polimorfismos
–511C>T e –31C>T do gene IL-1β
Bizari, DC1; Silva, AE1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de São
José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: câncer gástrico, interleucina-1b, Helicobacter pylori, PCR-RFLP, polimorfismos.
O câncer gástrico do tipo intestinal progride por meio de um processo de múltiplas etapas a partir de inflamação
da mucosa gástrica ocasionando a gastrite crônica e atrofia glandular, freqüentemente, desencadeadas pela
bactéria Helicobacter pylori. A associação desta bactéria e de outros fatores como tabagismo e etilismo com o
perfil genotípico do indivíduo pode acarretar em um maior risco para o desenvolvimento desta neoplasia. Dentre
os fatores genéticos que podem contribuir encontram-se as variantes polimórficas em genes como os codificantes
de citocinas. Relatos na literatura têm associado polimorfismos no gene da interleucina-1β (IL-1β), uma citocina
pró-inflamtória, com um risco aumentado para o câncer de estômago. As variantes -511C>T e -31C>T da região
promotora do gene IL-1β são relacionadas a um aumento na síntese da proteína acarretando em um quadro de
hipocloridria e consequente atrofia gástrica. Com isso, a ocorrência desses polimorfismos juntamente a outros
fatores de estilo de vida podem intensificar o risco de desenvolver a malignidade. Portanto, este estudo teve por
objetivos avaliar as freqüências desses polimorfismos em grupos de indivíduos com adenocarcinoma gástrico
e gastrite crônica e a associação com um risco aumentado para essas doenças, assim como a interação desses
com fatores ambientais (tabagismo, etilismo e infecção pela H. pylori). Foram avaliados pela técnica de PCR-RFLP
(polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição) cerca de 450 indivíduos (149 com câncer, 154 com
gastrite e 152 controles). As freqüências alélicas de ambos polimorfismos encontram-se em equilíbrio de HardyWeinberg. Para a variante -511 C>T não foram observadas diferenças significantes entre os grupos casos e controle
tanto para as freqüências genotípicas como alélicas. Enquanto que, para a variante -31C>T foram observadas
diferenças significantes entre os grupos de tumor comparado ao controle (p = 0,0017) e gastrite com controle
(p=0,0003), devido uma freqüência maior do alelo polimórfico T no grupo controle. A avaliação da interação dos
referidos polimorfismos com os hábitos tabagista, etilista e infecção pela H. pylori mostraram apenas associações
entre o alelo polimórfico -31T com os indivíduos não fumantes e não etilistas, quando se comparou os grupos de
câncer e gastrite com o grupo controle, desta forma sugerindo que a variante -31T na ausência de hábitos tabagista
e etilista deve exercer um efeito protetor contra a manifestação dessas doenças. De acordo com os dados obtidos,
os alelos polimórficos -31T e -511T da região promotora do gene IL-1β, não se encontram relacionados com risco
aumentado para o desenvolvimento de gastrite crônica e câncer gástrico.
Apoio financeiro: CNPq
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246
Associação do gene polimorfico IL1-RN ao risco de
gastrite crônica e câncer gástrico
Oliveira, JG1; Silva, AE1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, UNESP -Universidade Estadual Paulista, Campus de São
José do Rio Preto, SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: câncer gástrico, gastrite, polimorfismo, IL1-RN.
O câncer gástrico é uma doença multifatorial associada a fatores genéticos e ambientais, destacando-se a
infecção pela bactéria Helicobacter pylori. A interação entre estes fatores e variantes genéticas polimórficas do
hospedeiro pode determinar maior suscetibilidade individual ao desenvolvimento desta neoplasia. Em particular,
polimorfismos gênicos em fatores envolvidos no processo inflamatório, como as citocinas, têm sido implicados
no processo carcinogênico. Entre estas, encontra-se a citocina anti-inflamatória IL1-ra (antagonista do receptor
endógeno IL-1) que competitivamente se liga aos receptores de IL-1 mas não induzem uma resposta, modulando os
seus efeitos danosos. O gene codificador dessa citocina, IL-1RN, apresenta uma repetição penta alélica em tandem
de 86 pb, resultando em um alelo curto (IL-1RN*2, com duas repetições) ou alelos longos (IL-1RN*L, com três a seis
repetições). O alelo 2 (IL-1RN*2) está associado com aumento da secreção da IL-1β (citocina pró-inflamatória),
com inflamações crônicas e condições auto-imunes. Alguns estudos têm demonstrado uma associação significante
deste alelo com risco aumentado de câncer gástrico, embora os dados sejam controversos. O objetivo deste
estudo foi investigar a associação dos polimorfismos em tandem no gene IL1-RN com risco de câncer gástrico
ou gastrite crônica e a sua interação com fatores ambientais como tabagismo, etilismo e infecção pela H. pylori.
Os polimorfismos foram genotipados pela técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) em cerca de 500
indivíduos (175 com câncer gástrico; 160 com gastrite crônica e 173 indivíduos saudáveis - controle). As freqüências
dos alelos IL1-RN*L e IL1-RN*2 estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (0,66 e 0,34 no grupo de câncer; 0,73 e
0,27 no grupo de gastrite e 0,83 e 0,17 no grupo controle), sendo observadas freqüências significantemente maiores
do alelo curto IL1-RN*2 nos grupos de câncer (p<0,0001) e gastrite (p=0,004) em comparação ao grupo controle.
As freqüências genotípicas para IL1-RN*L/*L, IL1-RN*L/*2 e IL1-RN*2/*2 nos grupos de câncer (44,5%, 42,8% e
12,5%), gastrite (57,5%, 31,8% e 10,6%) e controle (69,3%, 26,5% e 4,0%) também foram estatisticamente diferentes
devido maior freqüência do alelo 2 polimórfico no grupo de câncer gástrico quando comparado ao grupo controle
(p<0,0001). Também foram observadas interações positivas do alelo IL1-RN*2 com os hábitos tabagista (p=0,001) e
etilista (p=0,000) no grupo de câncer em relação ao controle. Da mesma forma estas interações foram observadas
entre os grupos de gastrite e controle devido maior freqüência de tabagismo (p=0,004) e etilismo (p=0,001) no
grupo de gastrite. Neste último grupo também se constatou freqüência estatisticamente maior de infecção pela H.
pylori (p=0,000) em comparação ao grupo de câncer gástrico. Portanto, estes resultados indicam associação entre
o alelo curto IL1-RN*2 e os hábitos tabagistas e etilistas na suscetibilidade ao câncer gástrico e gastrite crônica em
uma amostra da população brasileira.
Apoio financeiro: Bolsa CAPES
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247
O papel controverso da IL-8 em carcinomas
metastáticos
Leonel, C1; Castro, R1; Moschetta, MG1; Regiani, VR1; Perea, SA2; Cury, PM3; Bordin Jr, NA2; Zuccari, DAPC1
Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular – UPGEM - Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de Base de São José do Rio Preto.
3
Departamento de Patologia do Hospital de Base de São José do Rio Preto.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Interleucina-8, Imuno-histoquímica, câncer, mama e metástase.
A Interleucina-8 (IL-8) pertence a um grupo de citocinas quimiotáticas (quimiocinas), que são uma família de
pequenos peptídeos. É uma citocina inflamatória produzida por uma enorme variedade de células em resposta a
diferentes estímulos inflamatórios, e estudos sugerem que a sua função no câncer seria a estimulação da invasão
e metástase, funcionando assim como ativador do fenótipo metastático e também da angiogênese. Foi observado
que os tecidos mamários neoplásicos apresentam altos níveis de IL-8, quando comparados à mama normal. O papel
da IL-8 no desenvolvimento e progressão do câncer de mama em mulheres está associado ao status hormonal,
especificamente com a presença de receptores de estrógeno. Na busca por um número maior e confiável de
imunomarcadores, realizamos um estudo retrospectivo com testes de Imuno-histoquímica com o anticorpo antiinterleucina-8 em 19 mulheres com câncer de mama apresentando estadiamento clínico 2 atendidas no Hospital
de Base de São José do Rio Preto. Após a finalização da técnica, as lâminas foram observadas em microscopia
óptica e sua expressão protéica foi analisada e classificada em cruzes de acordo com a intensidade da marcação
realizada pela ação do cromógeno DAB. Os resultados foram analisados estatisticamente pelo Teste Exato de
Fisher com o auxílio do programa Instat. Após a análise para esse pequeno número de amostras foi observado
que pacientes com metástase apresentaram uma baixa expressão da proteína IL-8, com p=0,054. Por este estudo
podemos considerar que a IL-8 exerça um papel protetor, pois quando subexpressa se relaciona com a presença
de metástase. O mecanismo que explica a expressão de IL-8, na maioria dos casos, necessita ser elucidado. Assim,
nossos resultados são controversos, pois não houve correlação entre a superexpressão da IL-8 e o carcinoma de
mama metastático e ao contrário, a subexpressão de IL-8 pode ser considerada como uma possível ação supressora
tumoral pela sua baixa expressão nos casos de pior prognóstico. Podemos inferir que a expressão elevada da IL-8 e
da forte marcação imuno-histoquímica desta proteína estaria associada a um melhor prognóstico, sem propensão
para metástases. O estudo encontra-se em andamento sendo esses dados parciais e com um n inicial mínimo,
podendo esse resultado ser alterado em função de um número maior de pacientes no final do projeto.
Apoio Financeiro: Agência FAPESP
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248
Análise de instabilidade de microssatélites nos
tumores de endométrio
Leite, VP1; Chaves, CBP1; Silva, BP1; Moreira, FCB2; Ramalho, DMP3; Casali da Rocha, JC1
Banco Nacional de Tumores e DNA – INCA.
Divisão de Patologia – INCA.
3
Serviço de Análise de Informação em Pesquisa – INCA.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: regiões microssatélites, câncer de endométrio e genes de reparo, Bioanalyser, câncer esporádico.
Os tumores ginecológicos constituem uma das principais causas de óbito em mulheres no Brasil. O câncer de
endométrio constitui cerca de 11% destes e o tipo mais comum é o adenocarcinoma. Esta neoplasia pode surgir
de forma esporádica ou ter o caráter hereditário. Alterações nos genes de reparo do DNA do tipo mismatch levam
a instabilidade genômica, inclusive das regiões chamadas microssatélites, que são seqüências repetitivas de 1-5pb
no DNA. Este estudo teve por objetivo a análise dessas regiões em tecido tumoral de 86 pacientes portadoras
de adenocarcinoma de endométrio esporádico matriculadas e tratadas no Instituto Nacional de Câncer (INCA)
no ano de 2003, e em tecido normal de endométrio das mesmas, a fim de se identificar e classificar a presença
da instabilidade microssatélite nestas amostras. Para o desenvolvimento do projeto, seis regiões microssatélites
(BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346, D17S250 e BAT-40) do tecido normal e tumoral (ambos arquivados em bloco
de parafina) foram amplificadas por técnica de PCR e comparadas para identificação e classificação da presença
de instabilidade microssatélites (MSI) por Bioanalyser (Agilent). A MSI foi identificada em 18 pacientes (20,9%).
O subtipo histológico endometrióide foi diagnosticado em 71 casos (81.6%) e MSI estava presente em 23.5%
(16) deles; subtipos seroso e/ou células claras foram detectados em 16.3% (14) e MSI em 16.7% (2) deles. O Teste
estatístico Exato de Fisher foi aplicado para MSI nos dois grupos (endometrióide e seroso/células claras) e não
houve associação da presença de MSI nos grupos. Estes são resultados preliminares e a avaliação completa das
pacientes tratadas em nossa instituição entre os anos de 2000 e 2004 encontra-se em andamento.
Apoio: INCA e CNPq
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249
Specific peptide ligand to thyroid carcinoma
Reis, CF1; Santos, APC1; Ueira-Vieira, C2; Souza, MA3; Capparelli, FE2; Sena, AAS2; Fujimura, PT2; Silva, SJ4;
Alcântara, TM4; Goulart, LR2; Ward, LS1
Laboratory of Cancer Molecular Genetics, Faculty of Medical Sciences - UNICAMP, Campinas-SP, Brazil1;
Laboratory of Nanobiotechnology, Institute of Genetics and Biochemistry - UFU, Uberlandia-MG, Brazil2;
Laboratory of Molecular Biology - UFU, Uberlandia-MG, Brazil3;
Clinical Hospital, UFU, Uberlandia-MG, Brazil4.
Keywords: cancer, phage display, peptide, molecular marker, thyroid carcinoma
The search for ligands that may play a role as markers or drug carriers to Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) is highly
desirable and presents a great potential for exploration. One of the most powerful technologies to accomplish such
objective is the Phage Display (PhD), which is based on the expression of random recombinant peptides fused to the
pIII protein of the filamentous bacteriophage capsid that are selected against specific targets. The main objective
of the present study was the discovery of novel peptides that could be used as biomarkers or drug carriers for the
PTC. A 12-mer random peptide (PhD-12, Biolabs) were submitted to three rounds of selection against the cell line
NPA (papillary carcinoma) and against a normal cell (primary cell of patient with goiter). The selected clones were
translated, characterized by bioinformatics, pre-validated with ELISA assays, and the most reactive one was prevalidated by immunohistochemistry. The 96 selected clones generated 55 valid sequences of different peptides. The
ELISA tests of the clone 12 presented a high reactivity against tumor tissues and similarities were found with zinc
fingers, transcriptional regulatory proteins, epithelial cadherin, and others. Preliminary immunohistochemistry
assays showed for clone 12 demonstrated a very high reactivity to tumor tissues in relation to the benign and
normal tissues. Additional immunoassays and others tests will be performed in order to validate the highly reactive
clones and to confirm their possible clinical application as diagnostic, prognostic and therapeutic tools for the
PTC.
Financial supporting: FAPESP, CNPq, CAPES, FAPEMIG, UNICAMP, UFU.
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250
Avaliação da atividade antitumoral do extrato
bruto metanólico de Erytrhoxylum tortuosum
(Erytrhoxylaceae) pelo teste de exclusão por Azul de
Tripano em células K-562
Pires, WC1; Batista, MP1; Aguiar, SS1; Mello, FMS1; Pereira, EB1; Lima, AP1; Pereira, FC1; Rezende, MRM1;
Ribeiro, ASBB1; Vilanova-Costa, CAST1; Menezes, ACS2; Silveira-Lacerda, EP1.
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.
Centro de Ciências Exatas e Naturais, Universidade Estadual de Goiás.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Galianthe ramosa, atividade citotóxica, Azul de Tripano, viabilidade celular, K562
Certas espécies de plantas do gênero Erythroxylum (Erythroxylaceae) são utilizados na medicina tradicional para
tratar a amenorréia, hemorragia, distúrbios renais, gripe, sinusite, chateado e estômago, para combater a fadiga
e a sensação de fome, e como estimulantes. Extratos de Erythroxylum sp mostraram atividade biológica, tais
como antiinflamatório, analgésico e efeito antimicrobianos, no entanto, sua ação anticancerígena não tem sido
muito estuda. A espécie Erythroxylum tortuosum conhecida popularmente como mercúrio-do-campo, apresenta
propriedade medicinais, sendo que a casca do caule utilizada como chá em casos de disenteria e diarréia. No
presente trabalho, foi avaliada a ação antitumoral do extrato bruto etanólico (EBE) de Erytrhoxylum tortuosum,
frente células de leucemia mielóide crônica, K-562, através do método colorimétrico Azul de Tripano. Assim, o
EBE de E. tortuosum foi diluído em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e testado nas
concentrações de 0,001 mg.mL-1, 0,01 mg.mL-1, 0,1 mg.mL-1 e 1 mg.mL-1. A linhagem tumoral K-562, fornecida pelo
Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás
(UFG), foi mantida em cultura segundo protocolo da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram
plaqueadas em microplacas de 96 poços. Em seguida, foram tratadas com o EBE e incubadas por 24h em estufa a
37°C contendo 95% de ar e 5% CO2. Ao fim da incubação, realizou-se a quantificação com azul de tripano para medir
a viabilidade celular. Utilizou-se 10μL de células para 40μL azul de tripano, obtendo um fator de diluição igual a 5.
Posteriormente, uma alíquota de 10μL dessa solução de célula e azul de tripano foi transferida para a Câmera de
Neubauer, para quantificação. Verificou-se que para as respectivas concentrações testadas, citadas acima, temos
uma viabilidade celular superior a 80% perante as células de leucemia mielóide crônica, K-562. Portanto, faz-se
necessário a continuação dos estudos com esse extrato em células tumorais e normais, para assim elucidarmos os
mecanismos de ação do extrato bruto metanólico de E.tortuosum.
Apoio financeiro: LGMC/UFG/UEG/FAPEG/FINEP/CNPq
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251
Silenciamento gênico com sequência de siRNA contra
telomerase induz citotoxicidade em Sarcoma 180
Oliveira-Júnior, RJ1; Silva, SVS; Vieira, CU1; Goulart, LR1; Morelli, S1
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia. [email protected]
1
Palavras-chave: RNA de interferência; telomerase; MTT; câncer; camundongo.
RNA de interferência (RNAi) é um potente mecanismo de silenciamento gênico sequência-específico, sendo um
processo de repressão gênica a nível pós-transcricional. Os efetores do RNAi são curtas moléculas de RNA dupla
fita (siRNA). Estes siRNA (small interfering) são resultantes do processamento de uma grande molécula de dsRNA
por uma ribonuclease citoplasmática chamada Dicer. Os siRNAs também podem ser sintetizados quimicamente
e transfectados diretamente nas células. A perspectiva de se usar siRNAs como uma potente molécula inibidora
de genes proporciona um novo caminho terapêutico para muitas doenças intratáveis, incluindo doenças virais
crônicas como hepatite C e AIDS, doenças neurodegenerativas e câncer. A telomerase é uma ribonucleoproteína
responsável pela síntese das seqüências terminais de nucleotídeos (TTAGGG) presentes em cromossomos lineares,
que são responsáveis pela formação dos telômeros. Em humanos a telomerase é expressa somente em algumas
células, como células embriogênicas e linfócitos ativos, enquanto que em 90% dos nos tumores esta enzima possui
atividade detectável. Desta maneira o controle da expressão da telomerase é um alvo na terapia contra o câncer. O
presente trabalho objetivou testar a citotoxicidade causada pela inibição da telomerase em Sarcoma 180 (linhagem
tumoral murina) mantida em cultura, por meio da transfecção de uma seqüência de siRNA contra a enzima. A
síntese dos siRNAs foi realizada com o kit T7 ribomax (promega). Foram sintetizadas três seqüências de siRNAs
com 19 nucleotídeos, sendo que duas foram utilizadas como controle negativo (genes: GFP e luciferase) e uma
como sequência alvo complementar ao gene da telomerase. Cada sequência foi testada em três concentrações (5,
10 e 15 µM) em quadriplicata. O agente transfectante utilizado foi a lipofectamina 2000 (invitrogen) e o teste de
citotoxicidade realizado foi o MTT (Sigma). A análise dos dados revelou que o tratamento das células tumorais
com a sequência de siRNA contra a telomerase foi citotóxico. Foi observada uma citotoxicidade dose dependente
significativa (p< 0,05 pelo test-t de student), uma vez que a viabilidade celular diminuiu com o aumento das
concentrações de siRNA contra a telomerase. Tanto as sequências de siRNAs utilizadas como controle negativo
(luciferase e GFP) quanto as células tratadas apenas com o agente transfectante (lipofectamina), não demonstraram
citotoxicidade significariva. Isto indica que Sarcoma 180 é um tumor dependente da telomerase, sendo que este
pode ser um dos mecanismos pelo qual a linhagem tumoral consegue driblar a barreira imposta pelo encurtamento
telomérico (limite de hairflick), possuindo assim um potencial mitótico indefinido. Desta maneira, como a maioria
das células somáticas humanas não possuem expressão da telomerase, o silênciamento gênico desta enzima via
siRNA pode consistir em uma boa ferramenta para o desenvolvimento de novos tratamentos antineoplásicos.
Apoio Financeiro: CAPES; UFU; FAPEMIG; CNPq.
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252
Busca de marcadores moleculares relacionados com
predisposição ao desenvolvimento de tumores de
cabeça e pescoço utilizando SNPS, Microarranjos de
CDNA e abordagem proteômica
Tajara, EH1,2; Dias Neto, E3; Severino, P4; Nunes, FD5; Moyses, RA6; Michaluart Jr, P6; Wünsch-Filho, V7;
Silva, AMA8; Polachini, GM1; Head and Neck Genome Project/GENCAPO9
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto/FAMERP, SP, Brasil
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, USP, São Paulo, SP, Brasil.
3
Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina, USP, São Paulo, SP, Brasil
4
Centro de Pesquisa Experimental, Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein, São Paulo, SP, Brasil
5
Departamento de Estomatologia, Faculdade de Odontologia, USP, São Paulo, SP, Brasil
6
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, USP, São Paulo, SP, Brasil
7
Departamento de Epidemiologia, Faculdade de Saúde Pública, USP, São Paulo, SP, Brasil
8
Laboratório de Biologia Molecular, Hospital Heliópolis, São Paulo, SP, Brasil
9
Lista completa dos autores no endereço: http://ctc.fmrp.usp.br/clinicalgenomics/cp/group.asp.
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, genômica, proteômica, polimorfismos, educação.
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma neoplasia comum no Brasil. Sua freqüência aumenta
com a idade, especialmente em indivíduos fumantes e etilistas crônicos. Entretanto, alguns estudos relatam elevação da
incidência em jovens, mesmo entre aqueles que nunca fumaram ou consumiram álcool. A ausência de fatores de risco
nesses casos é sugestiva da participação de mecanismos hereditários no desenvolvimento do CECP. O presente estudo
teve como objetivo investigar polimorfismos genéticos em pacientes não-tabagistas/não-etilistas. O estudo também
avaliou, por técnicas de genômica e proteômica, diferenças nos perfis de expressão gênica e protéica entre carcinomas de
pacientes com e sem referência de exposição a fatores de risco, e desenvolveu um plano piloto de educação pública sobre
CECP. Foram selecionadas amostras pareadas de tumores e margens cirúrgicas de não-tabagistas/não-etilistas (NTNE)
e tabagistas/etilistas (TE) a partir de um conjunto de mais de 1500 portadores de CECP. Também foram selecionadas
amostras de sangue desses dois grupos entre mais de 1000 controles. As faixas etárias com freqüência maior de pacientes
NTNE foram as de 20 a 39 anos e 70 a 99 anos, ou seja, esse grupo exibiu uma proporção maior de casos nos extremos de
idade, principalmente de carcinomas de cavidade oral. Quatro polimorfismos em genes relacionados com os processos
de angiogênese (ANG, FGF2 e TIMP3) e destoxificação (GSTP1) mostraram associação positiva com NTNE. Em relação
ao padrão de expressão gênica global, não foram observadas diferenças entre os dois grupos de pacientes. Apesar disso,
foram identificados alguns genes com expressão diferencial, como PDCD6IP, ADARB1, ZIC1 e GALNT12, que estão
relacionados com processos biológicos importantes, incluindo apoptose, processamento de RNA, supressão tumoral e
metástase. Da mesma forma que a análise genômica, a abordagem proteômica revelou um perfil protéico similar nos
NTNE e TE, com algumas diferenças de expressão em relação a proteínas envolvidas em processos biológicos relevantes
para a tumorigênese, tais como modificação pós-traducional, organização de citoesqueleto, apoptose, transdução de
sinais, adesão celular e resposta imune. Entre elas estão ciclofilina-A, aldolase-A, cofilina-1, galectina-7 e paraplegina-7.
Algumas dessas proteínas já possuem um papel conhecido no processo neoplásico. É o caso da enzima glicolítica
aldolase-A e da ciclofilina-A, que mostram níveis mais elevados em vários tumores e são induzíveis por hipóxia. Em
conclusão, alguns polimorfismos genéticos mostram diferenças significativas entre portadores de CECP fumantes e não
fumantes, enquanto a avaliação dos padrões de expressão gênica e protéica não é capaz de segregar os dois grupos,
sugerindo que os efeitos globais do tabagismo são modestos quando comparados com a variabilidade geral na expressão
do tecido. Entretanto, a análise de proteínas e genes específicos pode ajudar a identificar mecanismos de tumorigênese
distintos e assim contribuir para a compreensão do carcinoma em pacientes não fumantes.
Agências de fomento: CNPq, CAPES, FAPESP.
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Avaliação da influência de alterações na região
promotora do gene BRCA1 observadas em pacientes
com câncer de mama hereditário na expressão de
gene repórter
Fernandes, LR1,2; Costa, ECB2; Moreira, MAM1
Divisão de Genética - Instituto Nacional de Câncer
Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: BRCA1, região promotora, 5’UTR, expressão gênica e câncer de mama hereditário.
Introdução: Mutações germinativas no gene BRCA1 podem ser identificadas por sequenciamento direto em
aproximadamente 64% das famílias que apresentam síndrome de predisposição ao câncer de mama e/ou ovário.
Outros fatores que foram associados ao desenvolvimento do câncer de mama são alterações que não afetam
a função do gene BRCA1, mas sua expressão. Estudos têm relatado que até 33% dos casos de câncer de mama
esporádico foram associados ao baixo nível de expressão do gene BRCA1 devido a hipermetilação da região
promotora, sugerindo que o perfil de expressão do RNA mensageiro esteja associado ao desenvolvimento do tumor.
A região promotora de BRCA1 apresenta dois promotores, Alfa (α), que apresenta maior atividade transcricional
para o gene BRCA1, e Beta (β), cada um com dois éxons iniciais alternativos, 1A e 1B, respectivamente. Os éxons
1A e 1B transcrevem duas regiões não traduzidas (UTR, Untransleted Region) chamadas 5’UTR-a e 5’UTR-b,
respectivamente. Até o momento não foram descritas alterações na região promotora de BRCA1 que afetasse seu
padrão de expressão em casos de câncer de mama hereditário. Objetivos: Avaliação da influência de variações na
região promotora de BRCA1 na transcrição e tradução de gene repórter em linhagem celular eucariótica. Material
e Métodos: As alterações g3800C>T, g3988A>C, g3777G>A, g3292 T>C e g3593 G>A foram detectadas na região
promotora do gene BRCA1 (GenBank L78833) em 5 pacientes participantes do Programa de Aconselhamento
Genético em Câncer de Mama e/ou Ovário do Instituto Nacional de Câncer. Estas regiões promotoras variantes,
assim como a região selvagem, foram clonadas em vetor pGL3-basic. Os plasmídeos recombinantes construídos
foram co-transfectados com vetor pRL-CMV em linhagem celular MCF7, através de lipofectamina e o perfil de
expressão das construções foi analisado através de luminometria. A atividade de luciferase observada em cada
construção foi normalizada através da atividade de renilla. Resultados: A atividade relativa de luciferase observada
em cada região promotora com alteração foi comparada à região promotora selvagem, mas a diferença não foi
significativa em nenhuma avaliação (p>0,05). Para avaliar a significância das diferenças foi utilizado o teste t
pareado. Conclusões: Ao contrário do descrito na literatura em casos de câncer esporádico, as alterações avaliadas
nesse estudo não modificaram o perfil de expressão do gene repórter. Mas podem, ainda, influenciar a expressão de
BRCA1 associada a outros fatores no indivíduo que não puderam ser reproduzidos in vitro, já que foram encontradas
em pacientes que não apresentaram mutação na região codificante do gene. Por exemplo: é necessário avaliar a
influência dessas alterações na região promotora na expressão do gene repórter na presença de estrogênio em
linhagens celulares, que expressam e não expressam receptor de estrogênio alfa.
Apoio Financeiro: INCA, MS, FAF, CAPES, FAPERJ.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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254
Relevância clínica da co-expressão de HLA-DRα,
CD74/Ii e NFkB em câncer de ovário (OVCA):
identificação de candidato a biomarcador prognóstico
e terapêutico
Daltoé, RD; 1Araújo, KL; 1Madeira, KP; 1Coitinho, LB; 1Sirtoli, GM; 1Azevedo, MS; 2Carvalho, AA; 3Silva, IV;
Rangel LBA
1
4
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFES; 2 Departamento de Patologia, UFES; 3 Departamento de Morfologia, UFES,
Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFES.
Email: [email protected]
1
4 Palavras-chave: Câncer de ovário. HLA-DRα. HLA-DRβ. CD74/Ii. NFkB.
Introdução: O OVCA configura um dos grandes desafios à medicina. Representa o 9º tipo de câncer entre mulheres;
no entanto, é o 5º em causa de morte. Os genes HLA-DRA e HLA-DRB, que codificam as cadeias α e β do complexo
HLA-DR são superexpressos no OVCA e outros cânceres. No entanto, a expressão de HLA-DRβ está suprimida
no OVCA. Além da expressão membranar de HLA-DRα, o OVCA mantém expressão membranar de CD74/Ii,
molécula chaperona indispensável para o amadurecimento do MHC de classe II, como o HLA-DR. Ademais, foi
demonstrado que CD74/Ii pode interagir com o NFkB, molécula relacionada à proliferação celular, angiogênese,
metástase e diminuição da resposta à quimioterapia. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi analisar a relevância
clínica da expressão de HLA-DRα, CD74/Ii e NFkB no OVCA. Métodos: Plataformas de tissue array contendo
tecidos ovarianos neoplásicos (benignos, borderline e malignos) foram estudadas por imunohistoquímica
utilizando anticorpos primários anti HLA-DRα, HLA-DRβ, CD74/Ii e NFkB. Resultados: Observou-se expressão
membranar (m) de HLA-DRα e CD74/Ii estritamente nos OVCA. Tumores com o perfil proteômico de interesse
(HLA-DRα,CD74/Ii (c,m); HLA-DRβ -/c; NFkB (c,n), c=citoplasmático e n=nuclear) representaram 42% dos casos
(n= 38) e mostraram-se mais agressivos do que tumores com outros perfis. A relação entre o número de tumores
pouco/bem a moderadamente diferenciados foi maior em tumores com o perfil HLA-DRα,CD74/Ii (c,m); HLADRβ -/c; NFkB (c,n). Esses têm risco seis vezes maior de recidivar do que tumores com outros perfis (OR= 6,531,
CI 95%). Além disso, tendem a ser menos sensíveis à platina nos estádios iniciais (I/II) da doença: 33% foram
sensíveis, contra 71% de tumores sensíveis com outros perfis. A sobrevida maior que 15 meses entre pacientes nos
estádios I/II foi de 33% dos casos que apresentaram o perfil mais agressivo e de 88% nos demais perfis. Ademais,
correlacionamos positivamente a expressão de HLA-DRα à expressão de CD74/Ii (70,3% dos casos expressaram
ambas ou não expressaram nenhuma das moléculas e 29,7% expressam somente HLA-DRα ou CD74/Ii) (p< 0,0001).
Cumpre notar que espécimes de tumores benignos e de malignidade limítrofe (tumores borderline) ovarianos se
mostraram negativos para o perfil de interesse. Conclusão: Embora mais estudos devam ser realizados, a maior
agressividade de tumores com o perfil HLA-DRα,CD74/Ii (c,m); HLA-DRβ -/c; NFkB (c,n) e a menor resposta à
platina observadas sugerem que tal perfil possa ser introduzido na rotina clínica do OVCA, como biomarcador
prognóstico e de responsividade à platina. Ainda, com base no conceito de que células cancerosas direcionam
seu gasto energético para a expressão de moléculas que favorecem seu potencial proliferativo, metastático e de
viabilidade celular, e na observância da co-expressão de HLA-DRα e CD74/Ii, propomos que o desenvolvimento
do OVCA pode depender de via sinalizadora acoplada a estas duas moléculas.
Auxílio Financeiro: FACITEC, FAPES, DECIT/FAPES, CNPq, Petrobrás
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255
EXpressão gênica de NOS2, HGF, c-MET, TFF1 e k-RAS
em metaplasia intestinal, úlcera gástrica e câncer
gástrico
Duarte, MC1; Babeto, E1; Miyazaki, K2; Rahal, P1; Silva, AE1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de São
José do Rio Preto, SP
2
Serviço de Endoscopia, Hospital de Base, São José do Rio Preto, SP
email: [email protected]
1
Palavras-chave: metaplasia intestinal, úlcera gástrica, câncer gástrico, H. pylori, expressão gênica, PCR-real time
Alterações nos padrões de expressão de genes que participam da regulação do ciclo celular e reparo do DNA têm sido
estudadas em uma variedade de neoplasias. Em alguns casos o câncer pode progredir a partir de lesões benignas
pré-existentes, assim o estudo molecular destas lesões pré-cancerosas pode levar a uma melhor compreensão
do processo carcinogênico. O adenocarcinoma gástrico tipo intestinal apresenta um modelo de progressão de
múltiplas etapas bem caracterizado que pode se iniciar a partir de uma gastrite crônica, geralmente acompanhada
de infecção pela bactéria Helicobacter pylori, atrofia gástrica, metaplasia intestinal, displasia e carcinoma. Outra
via bastante discutida e também associada a H. pylori é por meio da úlcera péptica, que constitui uma lesão précancerosa importante do estômago. Deste modo, este trabalho teve por objetivos avaliar os padrões de expressão
dos genes HGF, c-MET, NOS2, TFF1 e k-RAS em biópsias de 37 pacientes com metaplasia intestinal (MI), 30 com
úlcera gástrica (UG) e 11 com câncer gástrico (CG) e respectivas mucosas normais, utilizando a técnica de PCR
em tempo real. No grupo de MI foi observado um aumento moderado de expressão dos genes NOS2 (1,75±3,54)
e HGF (0,22±2,22) e expressão diminuída dos genes TFF1 (-0,51±2,69), c-MET (-1,81±7,01) e k-RAS (-0,636±2,875),
que foram detectados em 69,4%, 56,7%, 56,7%, 56,8% e 54,1% dos casos, respectivamente. No grupo de UG todos os
genes apresentaram diminuição de expressão em comparação com a mucosa normal, sendo NOS2 (-0,120±4,011),
HGF (-0,433±3,891), c-MET (-7,36±5,962), TFF1 (-1,209±3,606) e k-RAS (-1,384±6,175) os quais encontraram-se
menos expressos em, respectivamente, 56,7%, 70%, 83,3%, 83,3% e 70% dos casos. Em CG, os genes com média
de expressão aumentada foram NOS2 (3,503±3,475), HGF (0,051±3,327) e c-MET (0,008±1,814) e reduzida foram
TFF1 (-4,826±3,122) e k-RAS (-0,510±1,309) em 81,8%, 45,4%, 45,5%, 90,9% e 63,6% dos casos, respectivamente. A
análise estatística revelou padrões de expressão semelhantes entre CG e MI para os genes NOS2, HGF, c-MET, TFF1
e k-RAS e entre CG e UG para os genes HGF, TFF1 e k-RAS. Quando se avaliou o nível de expressão gênica com
os fatores como idade, sexo, tabagismo, etilismo e infecção por H. pylori, não foi verificada nenhuma associação
estatisticamente significante. Portanto, os resultados indicam padrões alterados de expressão destes genes em
lesões pré-cancerosas como metaplasia e úlcera, deste modo, podendo manifestar papel importante nas etapas
iniciais da carcinogênese do estômago.
Apoio Financeiro: FAPESP
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WNT signaling pathway and epithelial mesenchimal
transition (EMT)-related genes are associated with
distant metastasis in oral squamous cell carcinoma
Silva, SD; Cunha, IW; Carraro, DC; Soares, FA; Brentani, HP; Rogatto, SR; Kowalski, LP
Hospital AC Camargo - Fundação Antônio Prudente
Palavras-chave: Câncer oral, via de sinalização WNT, processo de transição mesênquima epitélio, metástase, carcinoma epidermóide
High mortality and poor prognosis in oral squamous cell carcinomas (OSCC) have been associated with
locoregional recurrences and distant metastases. The study aimed to identify pathways and transcription factors
associated with aggressiveness. Altered gene expression profiles were analyzed using a 2.3K customized cDNA
microarray containing biological pathway reconstruction, which identified 49 upregulated and 52 downregulated
genes. The protein expression of 12 selected candidate genes was evaluated by immunohistochemistry in a tissue
microarray containing metastasized and non-metastasized tumors. Patients in advanced clinical stage showed
reduced E-cadherin and catenin beta-1 expression and increased vimentin and MMP-9 expression. Absence of
E-cadherin, APC and catenin (beta-1, gamma) expression were associated with lymph node metastasis. Patients
with positive lymph nodes showed increased VEGF-A, KI-67, vimentin, MMP-2 and MMP-9 expression. Absence
of E-cadherin, catenin beta-1 and CD44 expression occurred in invasive cancer. Greater expression of vimentin,
MMP-2, MMP-9, VEGF-A and KI-67 were observed in patients with lung metastasis. Significantly lower survival
rates were associated with negative catenin beta-1 and APC expression. Overall, these data revealed potential
markers involved in signaling networks in adhesion and invasive processes critical to metastasis. Additionally,
WNT pathway and EMT-related genes provide a potential basis for improving current understanding of OSCC
progression.
Apoio Financeiro: FAPESP
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257
Análise proteômica em linfonodos e fluidos corporais
de pacientes com câncer de cabeça e pescoço
Vidotto, A1; Leopoldino, AM2; Cury, PM3; Maniglia, JV4; de Carvalho, MB5; Michaluart-Júnior, P6; Head
and Neck Genome Project/GENCAPO (lista completa de autores no link: http://ctc.fmrp.usp.br/
clinicalgenomics/cp/); Tajara, EH1,7
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP, São Paulo, Brasil.
Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP, Ribeirão Preto, SP,
Brasil.
3
Departamento de Patologia e Medicina Legal, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP, São Paulo, Brasil.
4
Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP,
São Paulo, Brasil.
5
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital Heliópolis, São Paulo, Brasil.
6
Divisão de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina, USP, São Paulo, Brasil.
7
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências – USP, São Paulo, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, linfonodos, metástase, fluidos corporais, proteômica.
O comprometimento de linfonodos regionais por células neoplásicas é atualmente o indicador de prognóstico
mais utilizado em carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECC). Apesar disso, o entendimento detalhado
dos mecanismos envolvidos na formação de metástases linfáticas ainda não foi completamente atingido. A busca
por abordagens menos invasivas na definição de marcadores de prognóstico tem levado ao estudo de saliva e soro
desses pacientes com alguns resultados bastante promissores. No presente trabalho, foi avaliado o perfil protéico de
linfonodos metastáticos e não metastáticos, bem como de amostras de saliva e soro de 62 pacientes e 29 controles,
utilizando eletroforese bidimensional, espectrometria de massas por MALDI-Q-TOF e experimentos de validação
por Western blot. Os resultados mostraram várias proteínas com expressão elevada em amostras tumorais em
relação às não tumorais, como stratifina, glutathiona S-transferase pi, apoliproteína A-I, alpha-1-microglobulina,
dissulfeto isomerase, galectinas, citoqueratinas, imunoglobulinas, transtirretina e proteínas de ligação ao cálcio
( família S100) e a ácidos graxos (FABP). De forma inversa, as proteínas calreticulina, tropomiosina 3, triofosfato
isomerase, piruvato quinase, anidrase carbônica, gama actina, peroxiredoxina 2, profilina 1, gliceraldeido 3-fosfato
desidrogenase e proteínas de choque térmico mostraram níveis reduzidos em linfonodos metastáticos ou em
saliva e soro de pacientes. Essas proteínas, cuja expressão já foi associada com diferentes tipos de câncer, estão
envolvidas em processos de desenvolvimento epidérmico, proliferação e adesão celular, apoptose, migração,
resposta de defesa e inflamatória e metabolismo de xenobióticos. Em relação ao ambiente metastático, os dados
obtidos revelaram a associação de algumas proteínas (S100-A7, A-FABP, galectin-1 e dissulfeto isomerase) com
hipóxia que, em condições intermitentes como aquelas presentes na periferia do tumor, parecem estimular
o espalhamento de células neoplásicas pelos vasos linfáticos. Outro achado que merece destaque é o fato das
proteínas piruvato kinase, triofosfato isomerase e gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase atuarem na via glicolítica,
uma assinatura bioenergética de diferentes neoplasias.
Apoio financeiro: FINEP, FAPESP, CAPES, CNPq and LNLS.
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258
Genes candidatos a marcadores tumorais na
progressão do adenocarcinoma de próstata
Gambarini-Paiva, GHR1; Linde, SAD2; Santos, RM1; Trindade-Filho, JCS3; Trindade, JCS3; Camargo, JLV4;
Soares FA2; Rogatto, SR2,3
Depto de Genética, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu – SP; 2Centro de Pesquisa, Hospital do Câncer AC Camargo, SP; 3Depto
de Urologia; Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu, SP; 4Depto de Patologia, Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu, SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: Câncer de próstata, metástase, CGH, expressão gênica, marcadores tumorais
Atualmente, estudos genéticos em cânceres visam a identificação de novos marcadores capazes de discriminar a
evolução diferencial da doença. Neste estudo, foram avaliadas por HR-CGH-cromossômico amostras pareadas de
câncer de próstata (CaP) e metástases de 11 pacientes e CaP de 5 pacientes que apresentaram seguimento clínico
favorável por mais de 10 anos. Perdas e ganhos genômicos foram detectados em todos os cromossomos. Foram
identificadas alterações exclusivas dos CaP metastáticos (perda em 7q22 e 13q12-13) e dos CaP de pacientes com
prognóstico favorável (ganhos de 7q11.2, 12q12-13 e 13q13). Padrões específicos de alterações foram observados
para cada tipo de metástase (ósseas, linfonodais e testiculares). Com base nos resultados de HR-CGH comparados
aos de CGH-array, realizado previamente num subgrupo das amostras, foram selecionados os genes ARID1A,
MTSS1, NME1, S100A4 e TOP2A para validação por qRT-PCR em: 74 CaP, 6 hiperplasias nodulares de próstata, 19
tecidos adjacentes ao tumor e 2 amostras de próstatas normais. Em CaP, níveis normais ou diminuídos da expressão
do ARID1A em CaP estavam associados significativamente à recorrência bioquímica (P=0,0074) e à diminuição do
tempo de sobrevida livre de doença (P=0,0131; HR=2,706; IC95%=1,320-10,70). Níveis mais baixos de MTSS1 mostraram
associação com os níveis mais altos de PSA pós-prostatectomia (≥0,2ng/mL) (P=0,0376). Não foram observadas
associações significativas entre a expressão do NME1 e os indicadores prognósticos atuais. Níveis mais altos de
S100A4 estavam associados à presença de extensão extra-prostática nos tumores (P=0,020; HR=5,66, IC95%=1,17127,37). O aumento da expressão do TOP2A estava associado aos maiores escores de Gleason (P=0,0006). Em relação
aos diferentes tecidos prostáticos avaliados, os níveis de expressão gênica foram semelhantes aos observados
para os CaP, exceto para o gene S100A4: tecido adjacente e HPB apresentaram níveis significativamente mais
altos de transcritos que CaP (P=0,021). Esses resultados evidenciam que, embora considerado histologicamente
normal, o tecido adjacente ao tumor poderia conter células tumorais não detectadas morfologicamente. Os níveis
mais baixos de ARID1A e MTSS1 e os níveis mais altos de TOP2A e S100A4, associados à características de pior
prognóstico, mostram que estes poderiam ser marcadores relacionados à detecção de tumores com caráter mais
agressivo, permitindo uma conduta clínica mais adequada aos pacientes.
Apoio financeiro: FAPESP
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259
Triagem genômica e molecular em angiofibromas
nasofaríngeos juvenis: Interação entre o componente
vascular e fibroblástico
Silveira, SM1; Silva, SD2; Domingues, MAC3; Brentani, MM4; Butugan, O5; Rogatto, SR1,6
Centro de Pesquisa, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo, São Paulo, SP;
Departamento de Cabeça e Pescoço, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo, São Paulo, SP;
3
Departamento de Patologia, FMB, UNESP, Botucatu, SP;
4
Departamento de Radiologia, FMUSP, USP, São Paulo, SP (LIM24);
5
Departamento de Otorrinolaringologia, USP, São Paulo, SP;
6
Departamento de Urologia, FMB, UNESP, Botucatu, SP, Brazil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Angiofibromas Nasofaríngeos Juvenis; estroma; endotélio; HR-CGH; qRT-PCR.
O angiofibroma nasofaringeal juvenil (ANJ) é uma neoplasia de origem mesenquimal benigna, que apresenta
crescimento lento podendo progredir para lesões avançadas e invasivas. A Hibridação Genômica Comparativa
de Alta Resolução (HR-CGH) foi utilizada para a identificação de alterações genômicas em nove casos de ANJ,
microdissecados à laser nos componentes endotelial e estromal. Em adição, foi avaliado o padrão de expressão
gênica pela metodologia de RT-PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) em18 amostras de ANJs. A análise
comparativa entre os dois componentes avaliados demonstrou aproximadamente 90 regiões genômicas alteradas.
Os ganhos foram mais prevalentes nas células endoteliais do que nos fibroblastos, e envolveram 1q, 2p, 2q, 3p, 4q,
5q, 6q, 7q, 8q, 11q, 13q, 14q e 20q. As perdas foram detectadas em 1p, 4p, 12q e 16p. Nos fibroblastos os ganhos
foram observados em 2q, 5q, 6q, 7q, 10q, 11p e Yq e as perdas em 1p, 4p, 6p, 7p, 11p, 11q, 12q, 16p, 16q, 19p, 19q,
e Xq. Considerando-se as regiões genômicas consistentemente alteradas pela HR-CGH e dados em literatura de
ANJs, foram selecionados 11 genes para análise de expressão gênica quantitativa: CTNNB1 (B-catenina), CDH1
(E-caderina), AR (receptor de andrógeno), ABCC1, ASPM, GATA3, SUPT16H, AURKB, RERG, FGF18 e ACVR1. Embora,
a maioria dos genes avaliados tenha apresentado um padrão similar de expressão entre os dois componentes,
quatro genes apresentaram níveis significantes de expressão que variaram entre os dois componentes tumorais.
No componente vascular foi observada uma diminuição significativa na expressão dos genes SUPT16H (P=0.0092) e
AR (P=0.0244). Para o componente estromal, níveis de expressão significativamente aumentados foram observados
para os genes AURKB e FGF18 (P=0.0244 e P=0.0441, respectivamente), e expressão diminuída de SUPT16H
(P=0.0179). Foram observadas alterações em genes associados com a regulação do ciclo celular, transcrição e
tradução do DNA, sinalização e proliferação celular em ambos os componentes. O perfil similar de alterações
genômicas e moleculares observado no estroma e endotélio corroboram dados da literatura que sugerem uma
origem comum para estes componentes. Em adição, a alteração da expressão de genes envolvidos com crescimento
e proliferação tumoral, incluindo FGF18 e AURKB, no estroma sugere que a matriz estromal pode ser responsável
pelo recrutamento das células endoteliais e, consequentemente, contribuir para a tumorigênese dos ANJs.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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260
Specific subset of miRs involving in invasion and
apoptosis in glioblastomas
Cortez, MA1; Nicoloso, MS2; Rossi, S2; Carlotti, GC3; Tirapelli, DP3; Neder, L4; Brassesco, MS5; Borges, KS1;
Morales, AG1; Moreno, DA1; Scrideli, CA5; Tone, LG5; Zhang, W6; Calin, GA2
Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Brazil
Department of Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX
3
Department of Anatomy, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of Sao Paulo, Brazil
4
Department of Pathology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of Sao Paulo, Brazil
5
Department of Pediatrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of Sao Paulo, Brazil
6
Department of Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX
[email protected]
1
2
Keywords: microRNAs; microarray; invasion; apoptosis; glioblastoma
Glioblastomas (GBMs) are the most frequent and malignant brain tumors which have an elevated proliferative
capacity with a diffuse pattern of brain infiltration. The resistance to apoptosis and ability to invade the adjacent
tissue is the main cause of tumor recurrence and treatment failure. MicroRNAs (miRNAs) have been implicated in
cancer initiation, yet the role of miRNAs in regulating cellular invasion and apoptosis remains poorly understood
in GBMs. In this study, we investigate miRNA expression profiling in GBMs and neural stem cells (NSCs) and the
role of a selected subset of miRNAS in invasion and apoptosis. We analyzed by miRNA microarray the expression
profile of patients with GBM compared to normal brain samples. We selected the miRNAs let7-g, miR29b, miR101, miR125a, miR-149, miR-125a, miR-181a, miR192 and miR-215 to validate the microarray results by qRT-PCR.
We also validated the results using In Situ hybridization (ISH) with Exiqon probes for miR-125a in a tissue array
composed by GBMs and normal brain plotted samples. We assessed the expression profile of the selected miRNAs
in neural stem cells CD133+ (NSC2) and their respective counterparts by qRT-PCR. We analyzed the function of
miR-29b, miR-101, miR-125a and miR-181a in invasion and apoptosis by transfection of miRNAs mimics to GBMs
cell lines U87, U251 and LN319. We observed a down-regulation of miR-29b (P=0.03), miR-125a (P=0.001), miR149 and miR-181a in GBMs compared to normal brain. MiR-101 and miR-192 are up-regulated in glioblastomas,
whereas let7-g and miR-215 presented no differences in expression fold change between GBMs and normal brain.
MiR-149 is the most significantly down-regulated in NSC2-CD133+ cells compared to CD133- (P=0.014). In LN319
transfected cells was observed a reduction of approximately 40% in invasion rate in miR-29b transfected cells. For
miR-101, 125a and 181a it was observed smaller reduction in invasion rates (20.7, 23.7 and 18.4%, respectively). For
U251 cells was observed a reduction of invasion rates in all transfected samples. Nonetheless, it was observed a
greater reduction for miR-101, 125a and 181a (67.5, 56 and 58.5%, respectively). In apoptosis assay was observed
more apoptotic cells in miR-29b transfected U87 cells (p=0.003). This was not observed for TP53 mutant cells as
U251 line. Taken together, these results suggest that miR-29b, miR-101, miR-125a and miR-181a are involved in
invasion regulation in GBMs. Moreover, miR-29b may present an important participation in TP53 regulation in
apoptosis process and the study of molecular pathways by which it regulates this process may contribute for new
therapy approaches for this incurable disease.
Support: The university of Texas M. D. Anderson Research
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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261
5-Aza-2′-deoxicitidina restaura a expressão da
E-caderina em linhagens de glioblastoma
Borges, KS1; Moreno, DA1; Gomes, MVM2; Cortez, MAF1; Morales, AG1; Queiroz, RP; Carlotti-Jr, CG3;
Scrideli, CA2; Tone, LG1,2
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP
Departamento de Puericultura e Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
3
Departamento de Cirurgia Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
1
2
Palavras-chave: 5-AZA-2′-Deoxicitidina, E-caderina, glioblastoma, expressão, metilação
O Glioblastoma (astrocitoma grau IV) é o mais freqüente e agressivo tumor cerebral em adultos. Apesar dos
tratamentos atuais que consistem em cirurgia e radioterapia pós-operatória, a sobrevida dos pacientes continua
baixa, principalmente devido a radio- e quimioresistência deste tumor. Recentemente, foi relatado que astrocitomas
de alto grau (III-IV) apresentam hipoexpressão da E-caderina quando comparados a astrocitomas de baixo grau
(I-II). A E-caderina, codificada pelo gene CDH1, é uma molécula de adesão celular, que inibe a invasão, sendo
considerada também um marcador de prognóstico em diversos tipos de neoplasias. A hipermetilação das ilhas CpG
na região promotora do gene CDH1 tem sido mostrado ser responsável pela redução da expressão da E-caderina
em muitos tumores, e agentes demetilantes estão sendo utilizado como a opção de tratamento para algumas
neoplasias humanas. Contudo, não há relatos deste tipo em glioblastoma. O presente estudo foi desenvolvido
para testar a hipótese de que o agente demetilante 5-aza-2’-deoxicitidina (5-AZA) pode restaurar a transcrição da
E-caderina em linhagens celulares de glioblastoma. Metodologia: Foram utilizadas duas linhagens adultas (U87
e U251) e uma pediátrica (SF188) de glioblastoma. Todas foram tratadas com o agente demetilante 5-AZA nas
concentrações de 1 μM e 10μM por quatro dias. Após o tratamento, a expressão do gene CDH1 foi verificada por
Real Time PCR. Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Resultados: Todas as linhagens restauraram
a expressão do mRNA da E-caderina de uma maneira dose dependente. Conslusão: Estes resultados indicam que
provavelmente, em glioblastoma, as ilhas CpG do gene CDH1 estão metiladas, o que pode está desempenhado
um papel importante na hipoexpressão da E-caderina. Isto sugere também, que agentes demetilantes podem
constituir como uma opção de tratamento para o glioblastoma, onde poderiam ser utilizados para inibir a invasão
deste tumor em tecidos adjacentes..
Apoio Financeiro: CAPES, CNPQ E FAEPA
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262
Hypermethylation at histone desacetylase genes
(HDACS) Is involved in the etiology of gliomas
Gomes, MV1; Borges, KS2; Queiroz, RA1; Carlotti Jr., CG 3; Scridelli, CA1; Tone, LG1,2
Department of Puericulture and Pediatrics – School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Brazil.
Department of Genetics - School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Brazil.
3
Department of Surgery – School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Brazil
1
2
Keywords: Epigenetics, methylation, desacetylation, gliomas, epigenetic therapy.
Gliomas are the most common primary brain tumor in children and adults. Epigenetic modifications (DNA
methylation or histone modifications) have been frequently observed in these tumors. Histone deacetylases
participate in epigenetic mechanisms removing acetyl from histone tails (deacetylation), consequently altering
the access of transcriptional factors to DNA and promoting loci-specific transcriptional repression. In the present,
we aimed to study the involvement of DNA methylation in the control of HDAC genes in gliomas. Methylation
at promoter regions of HDAC4, HDAC5 and HDAC6 genes of 29 tumor samples (10 astrocytomas grade I, 2
astrocytomas grade III, and 17 glioblastomas), five nontumor brains (negative controls), five glioblastoma cell
lines (U87, U251, U343, SF188, and T98G) non-treated and treated in vitro with the demethylating agent 5-aza
2-deoxycitine and DNA from peripheral blood of one individual were analyzed by the methylation specific enzymatic
digestion quantitative PCR method (MSED-qPCR). Methprimer software was used for identification of CpG islands
at promoter regions of HDAC genes. The effect of the treatment with 5-aza 2-deoxycitine (1mM and 10mM) in the in
vitro cell survival was observed by clonogenic assay. The GraphPad Prism (Kruskall-Wallis test) was used for statistic
analysis. Statistically significant increased methylation was observed in HDAC5 of gliomas when compared to nonneoplastic brain samples (p<0.01) and to the cell lines analyzed (p<0.05). Difference in methylation at HDAC4,
HDAC5 or HDAC6 was not associated to tumor subgroups (p>0.05). A heterogenic methylation pattern (mainly
for HDAC4 and HDAC5) was observed when compared the five distinct glioblastoma cell lines. Treatment with
5-aza 2-deoxycitine demonstrated to affect methylation pattern at HDAC genes and the cell reproductive death.
Our results suggest that abnormal methylation at promoter regions of HDAC genes (especially HDAC5) could be
involved in the etiology of gliomas. Furthermore, the treatment with the demethylating agent 5-aza 2-deoxycitine
demonstrated to affects methylation pattern at HDAC genes and the in vitro cell survival indicating a potential
effectiveness of this epigenetic therapy in gliomas.
Financial support: CAPES
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263
SPARC desregulado em lesões endometrióticas
Meola, J1,2; Dentillo, DB2; Rosa e Silva, JC1; Paz, CCP2; Ferriani, RA1; Martelli, L2
1
2
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto– USP.
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP.
Palavras-chave: endometriose, endométrio, SPARC, expressão gênica, real time PCR.
A endometriose é uma doença ginecológica benigna, estrógeno dependente, de etiologia complexa e multifatorial.
É caracterizada pela presença de tecido histologicamente semelhante ao endométrio fora da cavidade uterina.
Afeta de 10 a 15% da população feminina. Alguns eventos são necessários para o estabelecimento da endometriose,
tanto para a implantação como para manutenção do tecido ectópico como: fluxo menstrual retrógrado seguido
de escape do sistema imune pelas células endometrióticas, adesão, invasão, proliferação celular, inibição de
apoptose, angiogênese, produção local de estrógenos e resposta à lesão. O SPARC é uma proteína matricelular
anti-adesiva que media as interações entre a matriz extracelular e as células. Tal gene está envolvido em vários
processos biológicos incluindo remodelamento tecidual, adesão celular, angiogênese, proliferação, migração e
invasão tumoral. Buscando entender mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia desta
doença, analisamos a expressão do SPARC por PCR em tempo real, em endométrio de mulheres saudáveis (n=10)
e nos tecidos eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrioma ovariano) de 17 mulheres com diagnóstico
de endometriose. Uma maior expressão do gene (P=0,0039) foi encontrada nas lesões endometrióticas quando
comparada com o endométrio eutópico das mesmas pacientes. Além disso, uma maior expressão do gene
(P=0,0116) foi detectada nas lesões peritoniais quando comparada com endometrioma ovariano. Nenhuma
diferença significativa foi encontrada quando comparados o endométrio de mulheres sem endometriose com o
endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Sugerimos que a expressão desregulada do SPARC nas lesões
endometrióticas favorece o estabelecimento e manutenção dos implantes endometrióticos, devido a participação
de gene nos mecanismos de invasão e angiogênese.
Suporte Financeiro: FAEPA (HCFMRP-USP) e FAPESP
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264
Identificação de perfis diferenciais de metilação do
DNA na endometriose
Zimbardi, D1; Silva, A2; Poppe, AC2; Rogatto, SR3; Abrão, MS2; Rainho, CA1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, UNESP – Botucatu;
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, USP – São Paulo;
3
Laboratório Neogene, Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina, Unesp - Botucatu e Hospital do Câncer A.C. Camargo, São
Paulo.
1
2
Palavras-chave: endometriose, epigenética, metilação do DNA, MS-AP-PCR, marcador molecular.
A endometriose constitui uma doença de etiologia incerta, caracterizada pelo implante ectópico de tecido
endometrial. É uma causa comum de morbidade, atingindo aproximadamente 10% das mulheres em idade
reprodutiva. Estudos recentes sugerem o envolvimento de alterações epigenéticas na etiopatogenia desta doença.
Entretanto, estes estudos foram baseados numa abordagem do tipo gene candidato e um número reduzido de genes
foi efetivamente investigado. Entre as modificações epigenéticas, a metilação do DNA é a mais estudada, sendo
caracterizada pela adição de grupos metil às citosinas dos dinucleotídeos CpG geralmente presentes na região
promotora de genes específicos. A alta densidade de metilação nas ilhas CpG correlaciona-se com a inativação
gênica e potencialmente, afeta vários locus simultaneamente, alguns dos quais podem ser cruciais para o início e/
ou progressão da endometriose. O presente trabalho avaliou o perfil diferencial de metilação em duas amostras
pareadas de endométrio eutópico e ectópico de mulheres com endometriose profunda intestinal, pela triagem
de fragmentos genômicos diferencialmente metilados pela metodologia de MS-AP-PCR (Methylation-Sensitive
Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction). Uma das pacientes tinha 32 anos, apresentava quadro clínico de
dismenorréia incapacitante, dor pélvica acíclica severa, esterilidade, sangramento e dor intestinal e urinária,
dispareunia de profundidade e endometriose grau 4. A outra paciente tinha 31 anos, apresentava quadro clínico
de dismenorréia moderada, esterilidade, constipação intestinal, dispareunia de profundidade e endometriose grau
3. Nos dois casos, as pacientes possuíam antecedentes pessoais de mioma e ciclo menstruais regulares. Na MSAP-PCR o DNA foi digerido com a enzima de restrição HpaII, sensível à metilação do DNA e sua isosquizômera
MspI, seguido de amplificação pela PCR usando-se oligonucleotídeos randômicos. A detecção de fragmentos
diferencialmente metilados ocorreu pela comparação direta do conjunto de fragmentos amplificados a partir do
endométrio eutópico com o conjunto de fragmentos amplificados a partir do tecido endometriótico pareado após a
separação por eletroforese em gel de poliacrilamida e detecção não isotópica. Em uma análise preliminar, um total
de nove bandas diferencialmente metiladas foram observadas, sendo quatro bandas hipermetiladas e cinco bandas
hipometiladas na endometriose. Esses fragmentos foram recortados do gel e novamente amplificados, entretanto
em apenas três a recuperação foi realizada com sucesso. Dessa forma, mesmo com as dificuldades técnicas na
recuperação dos fragmentos, pode-se concluir que a obtenção de perfis exibindo fragmentos diferencialmente
metilados entre endometriose e endométrio normal pela MS-AP-PCR, uma técnica sensível e rápida, indica que
alterações epigenéticas são adquiridas durante o desenvolvimento da doença e podem levar à identificação de
novos biomarcadores para a endometriose. Esses fragmentos encontrados como diferencialmente metilados serão
clonados e identificados após o sequenciamento.
Apoio Financeiro: Fapesp
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265
Estudos genéticos e epigenéticos no gene CDH1 em
tumores do sistema nervoso humano
Pinto, LC¹; Borges, BN¹; Costa Júnior, CA1; Brito, JRN²; Harada, ML¹; de Oliveira, EHC³; Anselmo, NP¹
¹Laboratório de Biologia Molecular da UFPA.
²Hospital Ofir Loyola.
³Laboratório de Citogenética da UFPA.
[email protected]
Palavras-chave: CDH1, metilação, polimorfismo, SNH, população paraense.
O gene da E-caderina (CDH1) codifica uma importante glicoproteína transmembrana que age como um supressor
tumoral e a sua perda está associada à tumorigênese e ao aumento do potencial metastático. O silenciamento do
CDH1 pode ser desencadeado por inúmeras alterações seja em nível de modificação epigenética, especialmente
pela hipermetilação da sua região promotora, ou por mutações de ponto. O polimorfismo C:A no sítio -160,
localizado junto ao sitio de inicio da transcrição do CDH1, está relacionado com expressão deste gene, sendo
que o alelo A demonstrou um declínio na eficiência transcricional quando comparado com o C. Em vista disso,
o polimorfismo é considerado um possível marcador genético de suscetibilidade ao câncer. O objetivo principal
deste trabalho foi realizar uma análise do polimorfismo -160 C/A e do perfil de metilação da região promotora
do CDH1 em tumores de Sistema Nervoso Humano (SNH). Foram coletadas 29 amostras tumorais do SNH no
Hospital Ofir Loyola (Belém–PA). O DNA foi extraído pelo método fenol-clorofórmio e modificado pelo tratamento
com Bissulfito de Sódio supersaturado (solução 3M). A partir destas amostras foram feitas PCRs com iniciadores
específicos para a região promotora do CDH1, seguida de seqüenciamento pelo método direto. As seqüências
obtidas foram alinhadas através do Bioedit e analisadas com o auxílio do programa BIQ Analyzer. Foram
analisados um fragmento com aproximadamente 300pb da região promotora do CDH1, contendo 22 sítios CpG’s
e englobando o sitio polimórfico -160. Nossa análise revelou um valor global de metilação de 8,44% considerando
cada sítio metilado, e dessas 3,44% se encontravam hipermetiladas. As amostras de tumores metastáticos
apresentaram o menor valor de metilação (3,49%) o que contrastou com os achados sobre metilação do CDH1
na literatura, o que sugere inativação por outros mecanismos não epigenéticos ou um reflexo das diferenças
entre as metodologias empregadas, uma vez que as análises encontradas na literatura eram feitas de maneira
qualitativa e a nossa é quantitativa. Detectou-se ainda que os gliomas apresentaram o maior valor de metilação
(13%). Verificou-se que o sítio CpG 17 se encontra metilado em 57% dos casos de tumores astrocísticos e em
28% nos casos de Schwanoma, o que não foi observado nos demais tipos tumorais analisados, podendo indicar
um possível marcador epigenético para os astrocitomas. Quanto à relação entre a metilação e o polimorfismo,
observamos que 31% das amostras metiladas apresentaram o polimorfismo para o alelo A, apesar de não ter
diferido significativamente em comparação aos alelos C metilados (P≤ 0,005). Entretanto ainda se faz necessário
aumentar o nosso número amostral para se realizar maiores inferências a cerca desta relação e do papel real do
padrão de metilação no silenciamento do CDH1 nos tumores de SNH.
Apoio Financeiro: UFPA, Fapespa
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266
Avaliação do padrão de metilação da DMR
(Differentially Methylated Region) do gene H19 (miR675) em carcinomas uroteliais
Ramos, PMM1; Negraes, PD1; Camargo, JLV2; Rainho, CA1
1
2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências - IBB UNESP- Botucatu-SP
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina - FMB UNESP - Botucatu-SP
Palavras-chave: imprinting genômico, metilação do DNA, gene H19, marcador prognóstico
O câncer de bexiga está entre os que mais recorrem e sua incidência aumenta diretamente com a idade. Estudos
prévios documentaram altos níveis de expressão do gene H19 em carcinoma de bexiga recorrentes. Este gene
está localizado em 11p15.5 e codifica um transcrito não codificador de proteínas (micro RNA miR-675). O gene
H19 é controlado por imprinting juntamente com o gene IGF2 (insulin-like growth factor 2 – somatomedin A). Uma
DMR (Differentially Methylated Region) foi sugerida como um domínio chave que atua de forma coordenada na
determinação do imprinting recíproco e na expressão mutuamente exclusiva destes genes. Esta região encontrase não metilada no homólogo materno e metilada no homólogo paterno. A DMR contém sete regiões de ligação
da proteína CTCF (proteína bloqueadora do acentuador), que é sensível a metilação do DNA. Dados da literatura
mostraram que somente o sexto sítio de ligação do fator CTCF apresentava metilação parental específica e
correlacionava-se com o padrão de expressão dos genes IGF2 e H19 em câncer de bexiga. Desta forma, considerandose que a hipermetilação das ilhas CpG na região promotora estaria envolvida na inativação da expressão gênica,
e que esta alteração epigenética é considerada um marcador molecular potencial para progressão e recorrência
tumoral, este estudo teve como objetivo avaliar o padrão de metilação do sexto sítio de ligação do fator CTCF
da DMR do gene H19 em 52 amostras de carcinomas uroteliais (45 das quais pareadas com amostras adjacente
ao tumor mostrando epitélio morfologicamente normal após avaliação histopatológica). Essas amostras foram
coletadas junto ao Serviço de Urologia do Hospital Amaral Carvalho de Jaú-SP. O padrão de metilação aleloespecífico da DMR foi analisado por MSRE (Methylation Specific Restriction Enzyme). Esta análise baseia-se no uso
de enzimas de restrição sensíveis a metilação do DNA, como a HpaII, e sua isosquizômera (MspI), que reconhece
o mesmo sítio e cliva o DNA independente da metilação. Após a amplificação pela PCR, desvios do imprinting da
DMR foram identificados em indivíduos heterozigotos para um marcador neutro (RFLP HhaI que identifica o SNP
rs10732516). Foram identificados 29 heterozigotos, 14 homozigotos para ausência do sítio e nove homozigotos
para presença do sítio. Dos 29 casos informativos, 27 (93,1%) apresentaram padrão normal de metilação e em dois
casos (6,9%) houve perda de imprinting, sendo que em um caso a metilação bialélica foi detectada somente no
tecido tumoral, enquanto que no outro o tecido normal adjacente também se mostrou bialelicamente metilado.
Estudos adicionais serão realizados para a melhor caracterização da perda do imprinting da DMR do gene H19 em
carcinomas uroteliais visando a avaliação do potencial prognóstico deste marcador.
Apoio Financeiro: FAPESP
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267
Análise do padrão de metilação somático e constitutivo
da região DMRH19 do cromossomo 11 em pacientes
com BWS e Tumor de Wilms
Pereira, HS1; Cardoso, LCA1,2; Vargas, FR1,3
Divisão de Genética – Instituto Nacional de Cãncer/INCA;
Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ;
3
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro/UniRio
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tumor de Wilms, imprinting, metilação, domínio H19, enzima de restrição.
O tumor de Wilms é o tumor renal maligno mais freqüente na infância, com uma incidência 1:10.000 afetados. É
uma doença primordialmente esporádica, e que pode associar-se a malformações congênitas tais como: síndrome
de WAGR, síndrome de Denys-Drash e síndrome de Beckwith–Wiedemann (SBW). As freqüentes alterações de
SBW envolvem mudanças no status do imprinting dos genes IGF2 e H19, presentes em 11p15. Nesta região há
um domínio telomérico que apresenta os genes imprintados IGF2, que codifica um fator de crescimento fetal e é
expresso somente no alelo paterno, e H19 que codifica um RNA cuja função ainda é incerta e é expresso somente
no alelo materno. A expressão desses genes é regulada pelo domínio diferencialmente metilado H19 (DMRH19) que
geralmente é metilado somente no alelo paterno. A perda de imprinting de IGF2 resulta numa aberrante ativação
do alelo materno, normalmente reprimido por uma proteína. Esta ativação ocorre devido a hipermetilação da
região DMRH19. A perda da heterozigosidade ou a perda do imprinting em 11p15 é observada em cerca de 40%
dos tumores de Wilms e os genes candidatos nesta região incluem IGF2 e H19. Desse modo, neste trabalho,
epimutações constitutivas e somáticas, da região DMRH19 foram investigadas a partir de ensaio com enzimas de
restrição sensíveis a metilação em portadores de tumor de Wilms e em pacientes com SBW. Para isso, o padrão
de metilação alelo-específico foi avaliado pela metilação diferencial do polimorfismo presente em HhaI, mapeado
na região DMRH19, após a digestão do DNA genômico e tumoral com a enzima HpaII e amplificação por PCR. Os
alelos foram visualizados a partir da eletroforese em gel de agarose 2%. O estudo de metilação foi desenvolvido em
49 amostras controle, 57% delas mostraram-se heterozigotas, ou seja, informativas para o RFLP de HhaI, enquanto
43% foram homozigotas, não informativas. Foi feita uma análise comparativa da metilação, de amostras de DNA
genômico e tumorais, de três pacientes. Os pacientes 16 e 18 mostraram-se não informativos para o RFLP, tanto
no DNA genômico, quanto no tumoral. Já no paciente 11, na amostra de DNA genômico, digerido por HpaII e
HhaI, foi observada a presença de apenas um dos alelos enquanto a amostra não digerida com HhaI mostrou-se
informativa para o RFLP. Já no DNA tumoral deste paciente foi constatada uma hipermetilação com a presença
dos dois alelos. Os casos não informativos serão avaliados pela metilação diferencial do polimorfismo presente
em AvaI, também mapeado na região DMRH19. O método usado neste trabalho é eficiente e rápido, ajudando a
desvendar os mecanismos que levam a origem do tumor e a compreender as alterações constitutivas e somáticas
existentes nos pacientes.
Órgão Financiador: Ministério da Saúde; FAPERJ; CNPq; CAPES.
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268
Análise da perda de heterozigose na região 3p em
fibroadenomas mamários humanos
Torrezan, GT¹; Lima, RS²; Urban, CA²; Ribeiro, EMSF¹; Cavalli, IJ¹.
Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná.
Hospital nossa Senhora das Graças, Curitiba/PR.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Doenças Benignas da Mama, Fibroadenoma, LOH, Braço Curto do Cromossomo Três, Microssatélites.
Fibroadenoma (FA) é o tipo mais frequente de lesão benigna da mama em mulheres de 15 a 30 anos de idade. A
ocorrência desta lesão é um fator de risco para o câncer de mama, sendo que as suas características histológicas
(complexidade e presença de hiperplasia) são importantes na determinação do risco de desenvolvimento do
câncer. Acredita-se que a progressão de células normais a estágios hiperplásicos e neoplásicos seja causada por
um acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas. A perda de heterozigose no braço curto do cromossomo 3 é
uma alteração genética frequentemente observada em neoplasias e lesões pré-malignas mamárias, o que indica
a existência nesta região de genes supressores de tumor envolvidos na tumorigênese mamária. O objetivo deste
trabalho foi determinar a frequência de perda de heterozigose (LOH) em 111 fibroadenomas mamários em sete
marcadores de microssatélites na região 3p (D3S1274, D3S1079, D3S1300, D3S1581, D3S1286, D3S1263 e D3S1307).
Os dados epidemiológicos das pacientes foram obtidos através da avaliação dos laudos histopatológicos e dos
prontuários médicos. Para a análise de perda de heterozigose foram utilizadas amostras de sangue periférico e de
tecido tumoral das pacientes. As análises de LOH foram realizadas através de amplificação por PCR com iniciadores
fluorescentes e corrida eletroforética em sequenciador capilar Megabace 1000. Foram observadas LOHs com baixa
frequência nos sete locos analisados, variando de 4,0% para o marcador D3S1300 a 9,1% para o marcador D3S1079.
No entanto, considerando a presença de LOH em pelo menos um dos marcadores, a frequência observada foi de
25,2%. As frequências de LOH e MOH (manutenção da heterozigose) distribuíram-se homogeneamente entre os
marcadores (c2(6) = 1,67; p=0,95). Nas comparações realizadas entre fibroadenomas e em carcinomas mamários,
previamente analisados pelo nosso grupo para os mesmos marcadores de microssatélites, observou-se em todos
os marcadores uma maior proporção de LOH estatisticamente significativa nos carcinomas (p variando de 0,0167
a <0,0001), inclusive na análise conjunta dos marcadores (c2(1)corr. = 29,46; p<0,0001). A partir de nossos resultados,
concluímos que devido à baixa frequência de LOH observada nos casos analisados, a LOH para marcadores na
região 3p não é uma alteração de importância mais significativa na etiologia dos fibroadenomas mamários.
Apoio Financeiro: CAPES e CNPq.
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269
Análise de perda de heterozigose (LOH) no braço curto
do cromossomo 9 (9p) em pacientes com carcinomas
primários de mama
Oliveira, SFV1; Oliveira, MMC1; Cavalli, IJ1; Urban, CA2; Lima, R3; Ribeiro, EMSF1
Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética – Universidade Federal do Paraná
Hospital Nossa Senhora das Graças
3
Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer de mama. Perda de heterozigose. Instabilidade de microssatélites. 9p. Epidemiologia.
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, e o mais comum entre as mulheres.
Nestes tumores perdas alélicas são frequentemente observadas, e trabalhos sobre a perda de heterozigose (LOH)
em regiões cromossômicas como a 9p21-p13, sugerem o envolvimento de genes supressores de tumor no início
e progressão do câncer de mama, como o gene CDKN2A. Neste estudo, analisamos a LOH e a instabilidade de
microssatélites (IM) em 229 pacientes com tumor primário de mama utilizando cinco marcadores microssatélites
localizados em 9p21-p13: D9S169, D9S171, D9S200, D9S1748, D9S1749. LOH e IM foram analisadas pelo software
Fragment Profiler 2.1, após amplificação por PCR com os marcadores microssatélites em amostras de DNA obtidas
de tecido tumoral congelado e sangue periférico (amostra normal) das pacientes, seguida de corrida eletroforética
em sequenciador capilar de DNA Megabace 1000. Os seguintes testes estatísticos foram utilizados para analisar os
resultados de LOH e os parâmetros clínicos e histopatológicos, comparação com outros trabalhos da literatura e
caracterização epidemiológica da amostra: qui-quadrado, teste exato de Fisher, teste G, teste t, análise da variância
e coeficiente de regressão. Foram observadas baixas frequências de LOH em todos os locos analisados, variando
de 10,29% (D9S169) a 15,97% (D9S1749). A IM também foi observada em todos os locos, com freqüências entre
1,29% (D9S200) a 3,68% (D9S169). Em relação às freqüências de LOH e os parâmetros clínicos e histopatológicos,
apenas os tamanhos dos tumores com LOH no marcador D9S200 apresentaram média superior a dos tumores
sem LOH (t=2,81; p<0,05). Os tumores classificados como de outros subtipos histológicos apresentaram, em média,
tamanho menor do que os carcinomas ductais e lobulares (F=4,84; P<0,05). Os diferentes graus histológicos não se
distribuíram igualmente nos diferentes subtipos histológicos (c24= 18,24; p<0,001). Todos os carcinomas lobulares
da amostra eram positivos para o RE, havendo diferenças quanto à distribuição das frequências de RE+/- entre os
subtipos (c22= 6,81; p<0,01). A média dos tamanhos dos tumores foi maior entre as pacientes que apresentaram
metástases em linfonodos axilares (t= 3,70; p<0,05), e a média de idade foi menor (t= 6,42;p<0,001). A presença ou
ausência de metástases em linfonodos axilares não se distribuíram igualmente nos diferentes graus histológicos
dos tumores (c22= 9,34; p<0,001). Com base nos nossos resultados, concluímos que a LOH é um dos mecanismos
envolvidos na inativação de genes supressores de tumor em 9p21-p13, juntamente com os epigenéticos e mutações
gênicas. Porém, parece não apresentar nos tumores mamários, a mesma relevância observada em outros tumores,
como por exemplo, aqueles de cabeça e pescoço. Apoio Financeiro: CAPES, CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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270
Fronte de invasão em carcinomas de células
escamosas de laringe: uma nova perspectiva
Ambrosio, EP1; Villacis, RAR2; Coelho, MM1; Sacomano, VS1; Domingues, MAC3; Coudry, RA4; Tagliarini,
JV5; Kowalski, LP6; Rogatto, SR2,7
Instituto de Biociências UNESP - Botucatu, SP; 2Centro de Pesquisa, Hospital AC Camargo - São Paulo, SP; 3Depto de Patologia, FMB,
UNESP - Botucatu, SP; 4Depto de Patologia, Hospital AC Camargo - São Paulo, SP; 5Depto de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, FMB,
UNESP - Botucatu, SP; 6Depto de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital AC Camargo - São Paulo, SP; 7Depto de Urologia, FMB,
UNESP - Botucatu, SP.
1
Palavras-chave: fronte de invasão, carcinomas de células escamosas de laringe, HR-CGH, alterações cromossômicas, perda de heterozigose.
O carcinoma de células escamosas de laringe (CCEL) representa a segunda neoplasia mais comum entre os
carcinomas de cabeça e pescoço. Quando diagnosticado em estágios iniciais, 75% dos pacientes apresentam
taxa de sobrevida de cinco anos. Em CCEL, a agressividade do tumor é imprevisível e o prognóstico depende
de vários fatores clinico-patológicos. A invasão tumoral é um parâmetro crucial associado ao prognóstico e há
relatos indicando genes diferencialmente expressos nas bordas tumorais e no fronte de invasão. No presente
estudo foi utilizada a técnica de Hibridação Genômica Comparativa de Alta Resolução (HR-CGH) para identificar
regiões de ganhos e perdas cromossômicas em 35 amostras de CCEL fixadas e em blocos de parafina. Foi utilizada
microdissecção a laser para obter separadamente as células da borda tumoral e do fronte de invasão. Embora
alterações cromossômica comuns foram encontradas em ambas as áreas, os ganhos foram mais freqüentes na
região superficial do tumor e as perdas na região do fronte de invasão. As alterações cromossômicas mais comuns
na região superficial foram: perdas em 3q25 (54%), 8p12 (48%), 8q23 (57%), 9q32-q33 (60%), 20q12 (51%), 22q12 (54%)
e ganhos em 2q22 (31%), 3p14 (28%) e 6q27 (28%) e no fronte de invasão foram: perdas em 1p32 (74%), 3p25-p26
(65%), 5q35 (57%), 8q24.1-24.2 (77%), 9q22 (57%), 2013.2 (74%) e ganhos em 2q21 (25%), 4q21 (31%), 6p12 (31%),
9p13 (31%), 9q21 (25%), 11q13 (35%) e 12q13 (25%). Estes dados sugerem que genes específicos estão envolvidos
em diferentes áreas tumorais e, possivelmente estão relacionadas com a agressividade tumoral e evolução da
doença. Para validar as perdas em 3q26 e 18q23, foram selecionados marcadores de microssatélites para investigar
eventos de perda de heterozigoze em um conjunto independente de amostras. Três marcadores mapeados em
3q26 confirmaram perdas em 25% dos CCEL e dois marcadores mapeados em 18q23 confirmaram perdas em 15%
dos casos. Este estudo mostrou que alterações genômicas específicas são freqüentemente observadas tanto em
células do tumor como em seu fronte de invasão. As regiões cromossômicas envolvidas em ganhos ou perdas são
candidatas para posteriores validações funcionais e podem conduzir à identificação de novos genes associados ao
prognóstico em carcinomas de laringe.
Apoio financeiro: Fapesp e Cnpq
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271
Identificação de variações do número de cópias de
DNA em leiomiomas uterinos por CGH-ARRAY
Cirilo, PDR1; Busso, AF1; Krepischi-Santos, ACV1; Marchi, FA2; Pontes, A3; Rogatto, SR1,4
Centro de Pesquisa, Hospital AC Camargo - São Paulo, SP.
Depto de Imagem, Instituto de Matemática e Estatística, USP- São Paulo -SP.
3
Depto de Ginecologia e Obstetrícia, FMB, UNESP - Botucatu, SP.
4
Depto de Urologia, FMB, UNESP - Botucatu, SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Leiomioma uterino, CGH-array, oligonucleotídeos, variação do número de cópias, desequilíbrios genômicos
A variação no número de cópias (CNVs) de DNA representa uma parcela importante da variação genômica
humana e já foi associada com doenças complexas como o câncer. Nosso objetivo foi determinar a relevância
das CNVs na etiologia dos leiomiomas uterinos (LU). O LU é o tumor benigno mais prevalente em mulheres em
idade reprodutiva e representa um grande problema de saúde pública. Em um estudo prévio utilizando CGH
(Hibridação Genômica Comparativa) cromossômico, foram detectadas perdas genômicas envolvendo as regiões
3q26-29, 7p22-15, 11p15, 11q23-25 e 15q25-26. Para o nosso conhecimento um único relato em literatura utilizando
uma plataforma BACs CGH-arrays em quatro leiomiomas uterinos (Cho et al, Gynecol Oncol 99: 545, 2005) revelou
perfis genômicos normais. No presente estudo, o DNA tumoral foi extraído de 10 LUs e foi realizado CGH-array
na plataforma Human 4X44K oligoarray (Agilent). Foi utilizado o scanner da Agilent e os dados foram extraídos
utilizando o programa Feature Extraction 10.1.1.1. Os dados processados foram analisados utilizando o software
DNA Analytics 4.0. Os desequilíbrios genômicos foram considerados utilizando-se os seguintes parâmetros: pelo
menos cinco sondas consecutivas com log ratio aberrante e algoritmo com threshold 6.7. Foram identificadas
perdas nas regiões 1p36.33-36.11, 1q42.12-44, 1p36.33-31.2, 1q32.2-44, 7q22.1-31.1, 7q32.3-33, 11q21-22.3, 11q23.223.3, 11q13.1-13.2, 16p12.2, 19p13.3 e ganhos nas regiões 1p36.11-q42.12, 11p15.5, 17q25.3 e 19p13.12. Nestas regiões
estão mapeados genes que codificam moléculas de adesão e ciclinas, proteínas de matriz extracelular, proteínas
que atuam na fibrinogênese, na síntese de esteróides e nas vias do TGF beta. Para o nosso conhecimento, este é o
primeiro estudo que identifica variações no número de cópias genômicas por CGH-array de oligonucleotídeos em
leiomiomas uterinos.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPQ
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272
Avaliação de ganhos e perdas genômicas em tumores
de glândulas salivares por hibridação genômica
comparativa de alta resolução
Coelho, MM1; Silveira, SM2; Santos, FP2; Bérgamo, NA3; Kowalski, LP4; Rogatto, SR2,5
Departamento de Genética, IB, UNESP, Botucatu, SP.
Centro de Pesquisa, Hospital AC Camargo, São Paulo, SP.
3
Depto de Genética, Universidade Federal de Goiânia, Goiânia, GO.
4
Depto de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital AC Camargo, São Paulo, SP.
5
Depto de Urologia, FMB, UNESP, Botucatu, SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: tumores de glândula salivar, citogenética, HR-CGH.
Os tumores de glândulas salivares (TGS) são lesões entre as neoplasias de cabeça e pescoço. Neste estudo foi
utilizada a técnica de hibridação genômica comparativa de alta resolução (HR-CGH) em 60 amostras de TGS,
incluindo: 27 adenomas pleomórficos (AP); 11 tumores de Warthin (TW); 2 oncocitomas (ON); 6 carcinomas
adenóides císticos (CAC); 4 carcinomas mucoepidermóides (CME); 2 carcinomas epiteliais-mioepiteliais (CEM); 3
carcinomas ductais salivares (CDS); 3 adenocarcinomas (ACAR); 1 fibroma condromixóide (FCM) e 1 carcinoma
espinocelular (CEC). Estas amostras foram microdissecadas previamente aos protocolos de amplificação e
marcação por técnica baseada na PCR (SCOMP). Uma biblioteca de casos normais foi utilizada para comparação
entre os casos. Perdas genômicas foram observadas mais freqüentemente do que ganhos. Foi detectada deleção da
região 12q24.2 em 17/21 AP e nos 11 TW analisados, em concordância com estudos prévios de CGH nestes tipos
tumorais. Nesta região encontra-se mapeado o gene Harakiri (12q24.22), que tem papel importante na regulação
da apoptose e parece estar envolvido no desenvolvimento de cânceres de gástricos, colos-retais e prostáticos.
Deleções em 12q23-q24 foram freqüentes entre a maioria dos tipos tumorais analisados (20/27 AP; 11/11 TW; 3/3
CDS; 4/6 CAC; 2/2 CEM; 2/4 CME; 1/1 CEC e 1/1 FCM). Nesta região está mapeado o gene DUSP6 (12q22-q23),
que foi relatado como candidato a supressor tumoral em carcinomas pancreáticos. Ganhos em 4q23-q24 foram
observados em 8/27 AP; 4/11 TW; 2/2 CEM e 2/6 CAC; nesta região está mapeado o gene SCYE1 que atua no
microambiente tumoral participando da evasão do sistema imune. Os achados permitiram a identificação de
alterações genômicas não casuais, bem como potenciais genes candidatos relacionados à fisiopatologia dos
diferentes tipos histológicos de TGS, que deverão ser validados em um grupo independente de amostras.
Apoio financeiro: CAPES e FAPESP
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273
Análise genotípica de meduloblastoma e
neuroblastoma por Hibridização Genômica
Comparativa (CGH)
Carvalho,TV1; Vargas, FR1,2; Seuánez, H1,3
Divisão de Genética - Instituto Nacional do Câncer, RJ
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, RJ
3
Departamento de Genética - Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: meduloblastoma, neuroblastoma, hibridização genômica comparativa, CGH e alterações cromossômicas
Meduloblastoma é o tumor embrionário do sistema nervoso central mais comum na infância. Apresenta uma grande
variedade de padrões histopatológicos, é altamente maligno e as modificações genéticas que contribuem para sua
patogênese permanecem indefinidas. O neuroblastoma é o tumor infantil extracraniano mais frequente e muitas
alterações cromossômicas estão relacionadas a ele. É uma neoplasia pediátrica com complexas combinações de
alterações genéticas adquiridas. Mais da metade desse tipo de tumor é classificado como de alto risco e com alto
índice de recorrência. O percentual de crianças que sobrevivem ainda é menor que 40%. A Hibridização Genômica
Comparativa (CGH) permite detectar alterações cromossômicas, não necessitando de conhecimento prévio
sobre qualquer alteração na amostra examinada. Mostrando, assim, regiões que podem ter importante papel na
progressão de tumores. Estudos realizados por CGH têm confirmado estas descobertas citogenéticas e identificado
novas regiões de amplificações e deleções. Para este estudo, analisamos por CGH o genoma de células tumorais
de meduloblastoma e neuroblastoma a fim de detectar alterações cromossômicas ainda não identificadas. O
DNA genômico de dois pacientes com neuroblastoma e um paciente com meduloblastoma foi isolado. Os DNAs
tumorais e de controle foram marcados com fluorocromos verde e vermelho, respectivamente, pela técnica de
Nick Translation e hibridizados. O resultado foi analisado através do programa computacional específico para
CGH (Quips Lab Managerâ). A razão de intensidade de fluorescência verde/vermelha foi medida ao longo do
eixo cromossômico onde o valor 1 (um) foi definido como padrão. Razões de intensidade de fluorescência verde/
vermelha no intervalo de 0,8 a 1,2 foram consideradas normais. Razões médias menores que 0,8 foram interpretadas
como deleções. Razões médias maiores que 1,2 foram interpretadas como amplificações. As razões médias de
intensidade de fluorescência foram analisadas em ideogramas, mostrando as regiões deletadas ou amplificadas
de cada cromossomo correspondente. Os ideogramas resultantes da análise do paciente de meduloblastoma
mostraram amplificações nas regiões cromossômicas 1p e 10p. Os resultados deste trabalho geraram novos dados
a respeito deste tipo de tumor e divergem de achados da literatura onde estudos sobre meduloblastoma revelaram
alterações envolvendo o cromossomo 17 e a região 10q. Os ideogramas resultantes da análise dos dois pacientes
de neuroblastoma não apresentaram qualquer alteração genética embora a literatura descreva amplificações no
gene N-MYC. Estes resultados demonstram que a Hibridização Genômica Comparativa é eficiente na detecção de
alterações cromossômicas, além de contribuir para o prognóstico de pacientes, principalmente nos casos em que
a citogenética convencional não é bem sucedida.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde
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274
Investigação oncogenética na estratégia de saúde da
família: favorecendo o diagnóstico precoce
Silva, PM1; Alvarenga, LM1; Cenzi, CM1; Mackevicius, SB1; Silva, TBC1; Nascimento, LC1; Floria-Santos, M1.
Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (EERP/USP)
[email protected]
1
Palavras-chave: câncer, genética, genômica, Estratégia de Saúde da Família, enfermagem.
Introdução: Em Ribeirão Preto, assim como no território nacional, o câncer figura como a segunda causa de morte
por doença. É importante distinguir os tumores esporádicos dos agrupamentos familiais e das síndromes de câncer
hereditário, as quais segregam nas famílias, geralmente seguindo um padrão de herança autossômica dominante,
e os familiares de indivíduos afetados podem apresentar maior risco genético para desenvolvimento de tumores.
Objetivos: Conhecer e analisar a história familiar de câncer em famílias cadastradas junto à Estratégia Saúde da
Família, em um município do interior paulista. Material e métodos: Trata-se de um estudo-piloto, com abordagem
quantitativa iniciado em fevereiro/2009. Após aprovação do CEP/CSE foram realizadas visitas domiciliares para
coleta de dados, por meio de questionário estruturado. Analisou-se dados sociodemográficos, clínicos e classificouse a casuística de câncer nas famílias visitadas. Resultados: A amostra do projeto principal é composta por 3.780
famílias e 41 foram estatisticamente selecionadas para o piloto. Já foram visitadas 34 famílias, sendo que 41%
possuíam história familiar de neoplasias. Observou-se sete agrupamentos familiais de câncer, seis casos de tumores
esporádicos e um caso que preenche critérios clínicos para a síndrome de Li-Fraumeni. Conclusão: Os tumores que
compõem os agrupamentos familiares, de acordo com a literatura, estão relacionados ao uso de álcool e tabaco,
ficando evidente a necessidade de intensificar os programas de prevenção e de diagnóstico precoce. A família que
apresentou critérios para síndrome de câncer hereditário, exemplifica a urgência dos profissionais que atuam na
atenção básica conhecerem e estarem despertos para a questão do câncer como doença genética/hereditária.
Desta forma, a identificação precoce de indivíduos em alto risco na comunidade poderá causar significativos
impactos econômicos e nas taxas de morbi-mortalidade por neoplasias.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
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275
Amplificação dos oncogenes NMYC e MDM2 em
amostras tumorais de pacientes com retinoblastoma
Reis, AHO1; Barbosa, RH1; Braggio, E1; Andrade, AFB1; Bonvicino, CR1; Vargas, FR1
Divisão de Genética, Instituto Nacional de câncer (INCA)
[email protected]
Palavras-chave: Retinoblastoma, MDM2, NMYC, amplificação, tumor
O retinoblastoma é um tumor maligno intra-ocular infantil originado das células precursoras de fotorreceptores
da retina, retinoblastos. A incidência estimada é de um caso para cada 15.000/20.000 nascidos vivos. O tumor
pode se manifestar unilateralmente ou bilateralmente, apresentando um ou múltiplos focos. A sua ocorrência
pode ser na forma esporádica, quando se deve a mutações somáticas, não hereditárias (60% dos casos), ou na
forma hereditária (40% dos casos), quando se deve a mutações germinativas nos progenitores ou mutação pószigótica. A maioria dos retinoblastomas unilaterais é esporádico e os retinoblastomas bilaterais são hereditários.
As formas hereditária e esporádica da doença são causadas por mutações no gene RB1, localizado na região
13q14. Segundo a hipótese de Knudson (1971), são necessárias duas mutações para que o retinoblastoma se
manifeste: a primeira herdada da linhagem germinativa dos progenitores e a segunda nas células precursoras
de fotorreceptores da retina -casos hereditários- ou ambas as mutações ocorrendo nas células precursoras
de fotorreceptores da retina -casos esporádicos. Além do gene RB1, outros genes foram propostos de estarem
envolvidos na progressão do retinoblastoma, tais como MDM2 (codifica proteína que regula negativamente o gene
RB1 e o gene P53, envolvidos na supressão tumoral) e NMYC (codifica proteína que age como fator de transcrição e
pode regular a transcrição de genes envolvidos na ativação ou supressão do câncer). Amplificações dos oncogenes
MDM2 e NMYC foram sugeridas como fatores prognósticos e potenciais alvos terapêuticos para alguns tipos de
câncer. Dada a importância de se caracterizar outros fatores envolvidos no retinoblastoma, nós nos propusemos a
pesquisar a amplificação dos oncogenes MDM2 e NMYC em amostras tumorais. Para este propósito, utilizamos a
metodologia de Hibridização in situ sob fluorescência (FISH) para os genes MDM2 e NMYC em núcleos interfásicos
de amostras tumorais emblocadas em parafinas, obtidas de seis pacientes com retinoblastoma, enucleados no
Instituto Nacional de Câncer. Estes pacientes haviam sido previamente analisados quanto à presença ou ausência
de mutações germinativas no gene RB1, sendo encontrada mutação em quatro deles. Para o gene NMYC não foram
encontradas amplificações, mas o gene MDM2 foi encontrado amplificado em um paciente. Este paciente possuía
retinoblastoma bilateral, embora não tenha sido encontrada mutação constitutiva em RB1. A histopatologia do
globo ocular deste paciente mostrou que a neoplasia invadiu focalmente a coróide. O fato de 1/6 dos pacientes
apresentar amplificação de MDM2 pode sugerir um possível papel deste gene na progressão do retinoblastoma.
Outros pacientes estão sendo analisados para se delinear melhor a representatividade da amplificação dos genes
MDM2 e NMYC dentro do retinoblastoma como marcadores citogenéticos ou de prognóstico.
Apoio financeiro: Ministério da saúde, FAPERJ
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Investigação de marcadores moleculares envolvidos na
tumorigênese de pulmão
Henrique, T1; Polachini, GM1; Vidotto, A1; Rodrigues-Lisoni, FC1; Cury, PM2; Zanelato, P2; Cury, FA3; Tajara, EH1,4
Departamento de Biologia Molecular,
Departamento de Patologia,
3
Departamento de Cirurgia Toraxica, Faculdade de Medicina, São José do Rio Preto;
4
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, USP, São Paulo, SP, Brasil.
1
2
Palavras-chave: Cancer de pulmão, marcadores moleculares, sage, proteômica, espectrometria de massa
O câncer de pulmão é um dos tumores mais freqüentes na população mundial e seu principal fator etiológico é
o consumo de derivados do tabaco. Quando restritos ao pulmão, esses tumores possuem chances elevadas de
cura. Entretanto, o diagnóstico precoce não é simples em função das dificuldades de acesso à lesão e dos limites
de sensibilidade das técnicas utilizadas. Por esse motivo, o entendimento dos eventos moleculares relacionados
ao processo neoplásico é muito importante para a identificação de marcadores de rastreamento de grupos de
risco, de diagnóstico e de prognóstico. No presente trabalho, foi investigado o perfil de expressão gênica e protéica
de tumores de pulmão, utilizando técnicas de RT-PCR, PCR quantitativa, dados públicos de bibliotecas SAGE,
eletroforese uni e bidimensional e espectrometria de massa por MALDI-Q-TOF. A análise de 5 amostras frescas
e 11 emblocadas em parafina de adenocarcinoma de pulmão revelaram a utilidade de material arquivado para
estudo de expressão gênica mas não protéica. Realmente, embora os géis unidimensionais tenham exibido bandas
de vários tamanhos, a análise por espectrometria de massa dos peptídeos de amostras arquivadas não obteve
sucesso, evidenciando a degradação de proteínas, provavelmente em função dos procedimentos de fixação e
armazenamento de espécimes cirúrgicos. Na análise de tecidos frescos, foram identificadas alterações de expressão
das proteínas peroxirredoxina, catepsina B, catepsina D, galectina 1, alfa-enolase 1, superóxido dismutase, peptidilprolil cis-trans isomerase A e polipeptídeo ativador de adenilato ciclase. Essas proteínas, algumas previamente
associadas com processos malignos de pulmão, atuam na resposta a estímulos externos, apoptose, proliferação
celular, transcrição e transdução de sinais. Em relação à expressão de transcritos, o RNA obtido de amostras
parafinadas apresentou boa qualidade e permitiu amplificação gênica em reações de RT-PCR e PCR quantitativa
de segmentos inferiores a 100pb. Dos nove genes selecionados entre os 240 com maiores diferenças de expressão
entre bibliotecas SAGE de adenocarcinomas e tecidos normais de pulmão, a catepsina B, da mesma forma que nos
experimentos de proteômica, mostrou aumento de expressão em tumores frescos. O produto desse gene parece
atuar na regulação negativa da apoptose e na indução de migração celular e pode, portanto, apresentar um papel
relevante no processo tumorigênico de pulmão.
Financiamento: FAPESP, FINEP, CAPESP, CNPq.
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277
Caracterização do gene PHF21B como supressor
tumoral em carcinomas de cabeça e pescoço
Bertonha, FB1; Busso, AF1; Abreu, FB1; Marchi, FA2; Rainho, CA3; Nishimoto, IN4; Kowalski, LP4; Rogatto, SR1,5
[email protected]
1
Centro de Pesquisa, Fundação Antônio Prudente, Hospital A.C.Camargo, São Paulo, SP;
2
Departamento de Imagem, Instituto de Matemática e Estatística, USP, São Paulo, SP;
3
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP;
4
Departmento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, SP;
5
Departamento de Urologia,FMB, UNESP, Botucatu, SP.
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço; PHF21B; história familial; gene supressor tumoral; sequenciamento direto; metilação.
Os carcinomas de células escamosas constituem 90% de todos os cânceres de cabeça e pescoço, sendo o sexto tumor
mais incidente na população brasileira. Pouca atenção tem sido dada a fatores hereditários envolvidos em sua
etiologia, embora estudos revelem que o carcinoma oral tende a se agregar em famílias. Evidências adicionais são
fornecidas pela ocorrência de múltiplos tumores primários em pacientes com carcinomas de células escamosas de
cabeça e pescoço (CCECP), pela associação de história familial, aparecimento precoce da doença e por membros
afetados sem hábitos tabagista e etilista. O gene PHF21B (PHD finger protein 21B), mapeado em 22q13.31, codifica
uma proteína reguladora da transcrição e, por isso, foi selecionado como gene candidato a supressor tumoral
associado a predisposição familial ao câncer. Resultados prévios de PCR quantitativa em tempo real mostraram
associação estatisticamente significativa entre a perda gênica e história de câncer em parentes de 1º grau (P<0,0001)
e com história de câncer em parentes com qualquer grau de parentesco (P=0,001). Para investigar a hipótese de
inativação de um gene supressor tumoral, 30 pacientes com CCECP e com/sem história familial de câncer foram
investigados quanto à presença de mutação, pela metodologia de sequenciamento direto para os éxons 3, 6, 7, 8,
9 e 11. Os critérios adotados para história familial positiva incluíram: parentes de primeiro/segundo graus com
câncer; não-fumantes e não-consumidores de álcool; idade igual ou inferior a 56 anos ao diagnóstico da doença. A
análise dos éxons revelou ausência de alterações significativas. Entretanto, foram detectadas variações intrônicas
não descritas no dbSNP. Também foram avaliados, pela qPCR e sequenciamento, sete pacientes com critérios
clínicos para a Síndrome de Lynch e quatro pacientes para a Síndrome de Li-Fraumeni/Li-Fraumeni like. Estas
famílias foram selecionadas por haver história de parente afetado por CCECP. Os casos com Síndrome de Lynch
não apresentavam mutações para os genes de reparo a danos no DNA, MLH1 e MSH2 e os casos com Síndrome
de Li-Fraumeni não apresentavam mutações para o gene TP53. Resultados preliminares revelaram que 3/7 casos
com síndrome de Lynch e que 2/4 casos com síndrome de Li-Fraumeni apresentaram perda para o gene PHF21B.
Não foram observadas mutações nos éxons avaliados. Além disso, quatro linhagens celulares derivadas de CCECP,
cultivadas com o agente desmetilante, 5-aza 2´desoxicitidina, foram avaliadas pela qRT-PCR, para avaliação de
uma ilha de CpG putativa presente na região promotora do gene, éxon 1 e parte do éxon 2. Duas destas linhagens
apresentaram aumento de expressão após o tratamento com o agente desmetilante, sugerindo a presença de
uma ilha de CpG controlada por metilação. Os resultados obtidos sugerem que o PHF21B é um supressor tumoral
regulado por metilação e que a deleção do gene pode estar associada a risco aumentado de cânceres humanos.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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278
Estudo da amplificação do gene PIK3CA em tumores
hipofisários
Murat, CB¹; Fortes, MAHZ1; Corrêa-Giannella, MLC; Giorgi, RR¹
¹ Laboratório de Endocrinologia Celular e Molecular – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (LIM
25 – HCFMUSP)
Palavras-chave: oncogene PIK3CA, adenomas hipofisários, amplificação gênica, PCR quantitativa em tempo real
Os tumores hipofisários são adenomas monoclonais e representam de 10 – 15% das neoplasias intracranianas, mas
os mecanismos de formação e desenvolvimento tumoral neste tipo de tecido ainda não estão bem esclarecidos.
Uma das principais vias de sinalização intracelular que induz o crescimento celular envolve a quinase do
fosfatidilinositol 3 (PIK3), um grupo de quinases lipídicas que atua ativamente no crescimento, proliferação,
motilidade e sobrevivência celular. É formada por uma subunidade reguladora (p85) e uma catalítica (p110-α);
esta última é codificada pelo proto-oncogene PIK3CA, localizado no cromossomo 3q26.32. As PIK3s ativam
diretamente a proteínoquinase B (PKB) (também conhecida como Akt), mantendo o sinal de sobrevivência celular.
Amplificações gênicas e mutações pontuais são as causas mais reportadas de alterações genéticas na via PIK3/
Akt e possuem papel importante na tumorigênese e patogênese de diversos tipos de tecidos tumorais humanos.
Este estudo visou analisar a amplificação do gene PIK3CA em 35 tumores hipofisários de diferentes subtipos
secretores e não secretores por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Para cada reação de amplificação
foram utilizados: pool de tecido hipofisário normal (calibrador), linhagem MCF-7 (controle positivo) e controle
negativo; todas as amostras foram realizadas em duplicata. O gene de controle interno COL7A1 foi utilizado como
gene de referência. As amostras foram quantificadas através do modelo matemático 2-DDCt e amplificações positivas
do gene PIK3CA foram definidas pelo número de cópias ≥ 3. Nós encontramos 12 amostras com amplificação
positiva em 25 estudadas, correspondendo a 34,2% dos casos. Em tumores secretores de GH foram encontradas
quatro amostras amplificadas de um total de cinco (80%), em tumores secretores de ACTH foi verificado que três
amostras apresentavam amplificação positiva dentre seis estudadas (50%), em tumores não funcionantes houve
cinco amostras amplificadas de um total de 15 estudadas (33,3%) e em tumores secretores de PRL e TSH não foi
encontrado nenhum caso de amplificação gênica. Estudos demonstrados por Grossman e Korbonits (2004) e Lin et
al (2009) evidenciam a expressão elevada do gene PIK3CA em tumores hipofisários, bem como Musat et al (2005),
que reportaram a via Akt hiperativada neste mesmo tipo de tecido; dados que podem ser explicados pelo aumento
do número de cópias do PIK3CA observados no presente estudo; portanto, células tumorais adquirem vantagem
sob as células normais quanto à proliferação. Lin et al também encontraram de 20 – 40% de amplificação gênica
do PIK3CA em tumores hipofisários de pacientes chineses, corroborando com nosso estudo (34,2%), apesar da
diferença étnica (oriental x ocidental), o que poderia causar divergência dos resultados. Portanto, amplificações
do gene PIK3CA são frequentes em tumores hipofisários e, de acordo com outros estudos realizados em diversos
cânceres humanos, a via de sinalização PIK3/Akt mostra-se um alvo estratégico e potencial para o desenvolvimento
de terapias futuras.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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279
Characterization of WT1 gene expression and
evaluation of its role on the tumorigenicity of glioma
cells
Dos Santos, WG 1; Clark, AJ 2; Ware, JL2; Chen, MY2; Graf, MR2; Van Meter, TE2; Fillmore; HL2; Broaddus, WC2
Universidade Federal de Goiás- UFG/CAJ, Jataí, GO- Brazil
Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia, USA
Keywords: WT1, GLIOBLASTOMA MULTIFORME, CANCER, GENE SILENCING, BRAIN TUMOR
Wilms’ tumor 1 (WT1) is overexpressed in many human cancers and is an indicator of poor prognosis in patients
with acute leukemia and breast cancer. However few studies have been done to elucidate the role of WT1 in brain
tumors including glioblastoma multiforme. Here, we examined WT1 expression in a large sample of human gliomas
and characterized which WT1 isoforms was expressed in human gliomas of different grades. Furthermore, studies
of non-glioma cell lines demonstrate that WT1 promotes cell proliferation and survival. However this has not been
rigorously studied in glioblastoma. Therefore, we tested the efficacy of two sequences of short hairpin RNA (shRNA)
directed against WT1 in U251MG human glioblastoma cells and found that one sequence was capable of stably
silencing WT1 expression. Stable WT1 shRNA expression significantly decreased the proliferation of U251MG cells
in vitro demonstrated by both ATP-based viability assay and tritiated thymidine uptake. Furthermore, stable WT1
silencing caused significantly slower growth after inoculation of tumor cells subcutaneously in the flanks of athymic
nude mice and was associated with an increased latency period. The results showed that WT1 is expressed in
human glioblastoma tumors and that downregulation of WT1 causes decreased tumorigenicity of a glioblastoma
cell line in vitro and in vivo, and suggest that WT1 may be a promising target for novel glioblastoma molecular
therapies perhaps in combination with standard treatment modalities.
Support: MCV Foundation
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280
Identification of polymorphisms and germline
mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer
patients indicated for genetic test
Escobar, KA; Maistro, S; Diz, MDPE; Pasini, FS; Mangone, FRR; Snitcovski, IML; Brentani, MM; Federico, MHH.
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Keywords: BRCA1, BRCA2, CÂNCER, MAMA, HEREDITÁRIO
Mutation of BRCA1 and BRCA2, known as tumor suppressors genes, has been linked to the majority of hereditary
breast and ovarian cancer. Screening for BRCA1 and BRCA2 mutation is common in the United States, Canada,
much of western Europe, Poland and Israel, but is rare in most of Latin American countries. Currently, there are
no standard criteria for recommending or referring someone for BRCA1 or BRCA2 mutation testing and with the
exception of specific ethnic groups, there is no predominant mutation responsible for the majority of cases of
hereditary breast cancer. In order to identify the genetic alterations of breast cancers due to BRCA1 and BRCA2
mutations in Brazil, we conducted a direct sequencing of these genes, in 60 breast cancer patients from Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, that were selected for genetic testing
according to Frank, Evans and BRCAPRO tests (risk >10%). Our preliminary data from 43 patients showed 47
alterations for BRCA1 gene: 11 missense mutations that include 1 deleterious mutation (R71G) and 5 without
clinical significance, 6 synonymous mutations (4 of no clinical significance) and 30 intronic variants (6 of no clinical
significance). BRCA2 gene showed 25 alterations: 6 missense mutations (2 of no clinical significance), 9 synonymous
mutation (6 of no clinical significance), 8 intronic variants (1 of no clinical significance) and 2 frameshift mutations
(5844del5 and 6635del5, both leading to a premature termination and showing a pathogenic effect). Both genes
show some alterations that have not been described on literature. At the moment, our data show a small number of
patients with hereditary breast cancer syndrome by pathogenic mutations in BRCA1 or BRCA2 genes confirmed by
direct sequencing. Maybe the criteria adopted on Frank, Evans and BRCAPRO tests, designed for other populations
of a different genetic background, cannot be applied for Brazilian patients. Other possibilities are the presence
of many alterations of unknown clinical significance and the fact that, in spite of direct sequencing is the best
method for screening genes mutations, some kind of alterations cannot be detectable, like gene rearrangements.
Screening methodology for hereditary syndromes on Brazilian patients needs to be refined and this program must
to be continued in order to establish a profile of genetic alterations of BRCA1 and BRCA2 genes in our population.
Supported by FAPESP (08/51619-2).
Support: FAPESP
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281
Mutações nos genes BRCA em pacientes com câncer
de mama e ovários hereditários da Bahia
Abe-Sandes, C1,2; Abe-Sandes, K1,3; Machado, TMB; Toralles, MBP1,4; Nascimento, LM1,6; Romeo, M4;
Canguçú, AKF4; Freire, SM1; Garicochea, B5; Meyer, R1; Nascimento, ILO1
Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular, Universidade Federal da Bahia - UFBA, Salvador, BA; 2Universidade Católica do
Salvador; 4Serviço de Oncogenética, Hospital Universitário Professor Edgar Santos, UFBA, Salvador, BA; 3Departamento de Ciências
da Vida, Universidade do Estado da Bahia, UNEB, Salvador, BA; 5Departamento de Medicina Interna, Faculdade de Medicina, Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul, PUC, RS; 6Faculdade de Tecnologia e Ciências, FTC
[email protected]
1
Palavras-chave: BRCA1; BRCA2, inserção Alu, câncer de mama; câncer hereditário
Introdução: Cerca de 5 a 10% dos casos de câncer de mama são hereditários e 80% destes são devido a mutações
germinativas pontuais e/ou grandes rearranjos genômicos, nos genes BRCA1 e BRCA2. Os grandes rearranjos
como: grandes deleções, duplicações, deleções/inserções e inserção Alu correspondem de 8% a 40% de todas as
mutações no gene BRCA1, mas apenas sete rearranjos foram descritos no BRCA2 em famílias com história positiva
para câncer de mama e/ou ovário. Estima-se que uma em 600 mutações causadoras de doenças são inserções
Alu. A inserção Alu c. 156_157insAlu no gene BRCA2, é o rearranjo mais freqüente em pacientes portugueses com
câncer de mama e ovários hereditários e foi considerada por Machado (2007) como uma mutação fundadora
portuguesa. Objetivo: Identificar mutações nos genes BRCA em pacientes com câncer de mama, com história
familiar sugestiva, atendidas no Ambulatório de Oncogenética do Hospital Universitário Professor Edgar Santos
(HUPES-UFBa). Material e métodos: Todas as pacientes foram avaliadas pelo geneticista clínico, pelo psicólogo e
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, antes da coleta do material biológico. O DNA genômico,
foi extraído a partir de 5 ml de sangue periférico, com o auxilio do Gentra Blood Kit® segundo as recomendações do
fabricante e estocado à -20C. Todos os éxons foram amplificados por PCR (Polimerase Chain Reaction). A técnica
de SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) foi utilizada para triagem mutacional. Resultados: Foram
avaliadas até o momento 63 pacientes que apresentaram risco elevado para presença de mutações nos genes
BRCA, após analise clínica com geneticista. Foram sequenciados o éxons 2, 11 e 20 do gene BRCA1 e 11 do BRCA2
de todas pacientes, além de todos aqueles que apresentaram padrão alterado no SSCP. Foi investigada também
a inserção Alu no éxon 3 do BRCA2. Foram encontradas 14 mutações no BRCA1 (10 no éxon 11, 2 no éxon 17 e 2
no éxon 18) e 7 em BRCA2 (2 no éxon 10, 4 no éxon 11 e 1 no éxon 14). Em nenhuma das amostras analisadas foi
observada a presença da inserção Alu. Conclusão: Apenas uma das mutações encontradas até o momento está
associada clinicamente ao câncer de mama, segundo dados do BIC (Breast cancer information core). A ausência
da inserção Alu nesta amostra possivelmente é devido a efeito fundador, visto que nossa população apresenta
significante contribuição portuguêsa.
Apoio Financeiro: CNPq; FAPEX; FINEP
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282
Polimorfismo da região promotora do gene Survivina
em pacientes com carcinoma gástrico do Estado do
Pará
Borges, BN1; Anselmo, NP1; Burbano, R2; Harada, ML1
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará.
Laboratório de Citogenética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará.
E-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Survivina, Polimorfismo, Câncer gástrico, População Paraense, Tumorigênese.
Apoptose, ou morte celular programada, é um mecanismo importante no controle do crescimento e divisão
celular. Um dos genes responsáveis pela regulação desse processo é a Survivina, membro da família de Inibidores
de Apoptose (IAP), localizada no cromossomo 17q25. Este gene apresenta-se altamente expresso em tecidos
embrionários, sendo que em tecidos adultos ela não é normalmente observada. No entanto, são vários os
relatos da expressão da Survivina em tecidos tumorais, indicando alteração na sua regulação durante a via da
tumorigênese. Dentre os vários mecanismos que desencadeiam esse processo e são relacionados a diversos tipos
de tumores, destaca-se um polimorfismo localizado na região promotora (-31 C/G), que ocorre no sítio de ligação
dos repressores CDE/CDH. O objetivo do presente trabalho foi analisar a presença do polimorfismo -31 G/C em
pacientes com carcinoma gástrico do Estado do Pará. Para isso, amostras de mucosa gástrica foram coletadas
de pacientes submetidos à gastrectomia atendidos nos hospitais João de Barros Barreto e Ofir Loiola, além de
amostras de sangue, usadas para controle, de indivíduos atendidos pelo Laboratório de Análises Clínicas da UFPA.
O DNA foi obtido através de extração usando-se kit comercial e o polimorfismo -31 C/G foi investigado pela técnica
de seqüenciamento. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística no programa BioEstat 5.0, pela
comparação dos alelos obtidos com dados histopatológicos dos pacientes. Até o momento foram analisadas 54
amostras do grupo controle e 47 amostras de pacientes com tumores gástricos. Destas, 24 são do tipo Intestinal e
23 do tipo Difuso. Não houve diferença na freqüência dos alelos C e G entre as amostras controle e tumoral (0.38
e 0.62, respectivamente). No entanto, ao analisarmos apenas as amostras tumorais, observamos que o alelo G
parece influenciar na gênese de tumores do tipo difuso em cerca de 3,5x. Além disso, o alelo G é mais freqüente em
pacientes abaixo dos 50 anos de idade (OR: 3.3600) e em tumores que se desenvolvem na porção distal do estômago
(OR: 2.0800). Não foi observada diferença entre os alelos em relação ao grau de invasão tumoral e metástases a
distância. Nossos dados estão de acordo com o observado em pacientes com tumores gástricos na população
chinesa e sugerem que o polimorfismo -31 G/C da região promotora do gene da Survivina está relacionado à via de
tumorigênese em carcinomas do tipo Difuso e em tumores localizados na porção distal do estômago.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESPA e UFPA
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283
Análise da função dos MicroRNAs na expressão dos
genes DNMT3B/Dnmt3b e MECP2/Mecp2 em células
tronco embrionárias humanas e células tumorais
murinas
Schoof, CRG1,2; Molognoni, F1; Fraga, AM2; Jasiulionis, MG1; Pereira, LV2; Vasques, LR1
1
2
Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP/SP
Universidade de São Paulo, USP/SP
Palavras-chave: epigenética, metilação do DNA, DNMT3B, MECP2, microRNAs
A metilação do DNA em mamíferos é uma importante modificação epigenética. A proteína MeCP2 é o elo de
ligação entre a metilação do DNA, realizada pelas DNA metiltransferases (como por exemplo a DNMT3B), e a
desacetilação de histonas, já que MeCP2 reconhece DNA metilado, recruta desacetilases de histonas, que retiram
grupos acetil das histonas, aumentando sua afinidade pelo DNA. Isto provoca alterações na conformação da
cromatina, impedindo a transcrição. Alterações nos padrões de expressão de DNMT3B e na metilação do DNA
encontradas em diferentes tipos de tumores, e a temporalidade de expressão de Dnmt3b e de Mecp2 durante
ondas de desmetilação e de metilação, que ocorrem no início do desenvolvimento embrionário, podem auxiliar
a identificação de outros fatores envolvidos no estabelecimento e manutenção do padrão de metilação do DNA.
Por sua vez, uma nova classe de pequenos RNAs, os microRNAs, envolvidos com a regulação da expressão gênica
pós-transcricional, têm grande importância na manutenção do estado diferenciado dos diferentes tipos celulares.
Trabalhos recentes também mostram que há alterações nos padrões de expressão de microRNAs entre tecidos
normais e tumorais. Assim, foi objetivo deste trabalho identificar possíveis miRNAs envolvidos na modulação da
expressão dos genes DNMT3B/Dnmt3b e MeCP2/Mecp2 em linhagens de células de melanócitos murinos (Melan-a)
e linhagem de melanoma derivada de melan-a (4C3+), bem como em células-tronco embrionárias humanas (hES)
indiferenciadas e diferenciadas. A expressão do RNA de Dnmt3b e Mecp2 na linhagem de melanoma apresentou-se
reduzida em 60% e 40%, respectivamente, em relação à linhagem não transformada, tendo o nível protéico também
diminuído. O nível de metilação da célula transformada corresponde à cerca de metade do nível da célula normal.
Após seleção in silico de dois microRNAs candidatos, miR-29b e miR-203, preditos para o alvejamento destes
genes a partir de 5 sites de predição distintos, a expressão destes foi averiguada e apresentaram-se, da mesma
forma, diminuída em cerca de 98% nas células transformadas. Este resultado contrapõe-se aos da literatura, onde
foi observada uma relação inversa entre expressão de DNMT3B e do microRNA-29b em dois diferentes tipos de
linhagem celular: NSCLC (Non-small cell lung cancer) e AML (acute myeloid leukemia). Em hES, o RNA de DNMT3B
e MeCP2 encontra-se menos expresso nas diferenciadas em relação às indiferenciadas, o mesmo ocorrendo com
os microRNAs miR-29b e miR-203, mais uma vez não demonstrando clara evidência de alvejamento de DNMT3B e
MeCP2 por estes miRNAs. Uma possível explicação para este fato é a de que, sendo a regulação pós-transcricional
através de microRNAs o resultado de uma fina orquestração, na qual diversos microRNAs podem alvejar um único
RNA e um mesmo microRNA pode alvejar diversos RNAs, estas relações podem ser bastante complexas e variar
entre os diferentes tipos celulares.
Apoio financeiro: Fapesp, Capes e CNPq
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284
MicroRNA-mRNA network controlling the promiscuous
gene expression in the thymus of NOD (Non Obese
Diabetic) mice: Implications in the emergence of type 1
diabetes mellitus
Marques, MMC1; Fornari, TA1; Octacilio-Silva, S1; Evangelista, AF1; Junta, CM1; Pignata, LFM2; Giuliatti, S2;
Passos, GAS1.
Molecular Immunogenetics Group, Department of Genetics, Faculty of Medicine USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
Laboratory of Bioinformatics, Department of Genetics, Faculty of Medicine USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
E-mail: [email protected]; [email protected]
1
2
Keywords: microRNA, miRNA-mRNA interaction, gene network, microarrays, autoimmune diseases, promiscuous gene expression
MicroRNAs (miRNAs) represent a novel class of endogenous ~22-nucleotide non-coding RNAs that negatively
regulate gene expression by inhibiting translation of target mRNAs. Although the precise molecular biology of
miRNAs is not totally understood, recent evidences have linked the activity of these molecules to diverse biological
processes including cancer to immune response. Our hypothesis for the present study is that deregulation in specific
miRNAs and their tissue-specific antigen (TSA) mRNAs targets might plays a role in auto-immune diseases such as
type-1 diabetes mellitus (DM-1). Thus we focus the miRNA-mRNA interactions of promiscuous gene expression of
TSAs in the thymus of NOD mice, during the emergence of DM-1. Hybridizations on oligo-microarrays were used
to investigate the expression of 640 miRNAs and on cDNA-microarrays to investigate the expression of 4500 TSA
mRNAs. The data were analyzed by using dedicated bioinformatics programs (SAM and Cluster-Tree View), which
allowed sample discrimination (pre-diabetic from diabetic NOD mice) by means of the hierarchical clustering of
respective miRNA or TSA mRNA expression signatures. Considering that the post-transcriptional control of the
gene expression is depending on miRNA-mRNA interactions, we used the GenMir and CytoScape softwares to
reconstruct a network between these RNA species. The results allowed visualization of miRNA-mRNA interactions
in cascades as for example mmu_miR_134-Bclaf1 and mmu_miR_547-Benc1 pinpointing the control over mRNAs
that code for autoantigens implicated in the auto-immune attack. Deregulation in the expression of these mRNA in
the thymus might lead to failure of negative selection of auto-reactive thymocytes in the thymus and consequently
lead to an auto-immune disease as DM-1. These findings are important to a better understanding of the role of
miRNAs in the control of self-non-self discrimination and onset of auto-immune diabetes mellitus.
Financial support: FAPESP and CNPq
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285
Stable RNA interference with lentiviral vectors
Lenz, G.
Departamento de Biofísica, UFRGS, Porto Alegre, Brasil.
[email protected]
Keywords: RNA interference, RNAi, lentivirus, cancer and gliomas
RNA interference (RNAi) is a transient process that last around 10 days in the majority of eukaryotic cells. Therefore,
the ability to stably insert a sequence into the genome that produces a short hairpin RNA (shRNA) with the capacity
to produce long lasting RNAi is desirable or even necessary in several research strategies. One of the most efficient
ways to obtain this stable insertion is the use of lentiviral vectors. We set out to use commercial or home made
lentiviral vectors to silence genes involved in the etiology and sensitivity to chemotherapeutic drugs of glioma cell
lines. Lentiviral vectors were constructed by direct insertion of dsDNA into pLL3.7 or obtained from the Mission
shRNA library (Sigma-Aldrich). Lentiviruses were constructed by co-transfecting the lentiviral vector with three
helper plasmids in Hek293T cell line, target cells were tranduced and selected by cloning of GFP positive cells or
puromycin resistance. RNAi efficiency was assessed by RT-PCR and western blots. We have used this system in
human (U87 gliomas and HEK293T), rat (C6 gliomas) and mouse (GL261 gliomas, GRX) cells to silence different
genes such as caspase inhibitors (XIAP and Survivin), a kinase involved in DNA repair (Nek1), a cytotoxic receptor
(P2X7) and an ecto-enzyme (5’NT). The reduction in protein expression ranged from 40 to more than 90% and
different shRNAi sequences presented different silencing levels. No alteration in silencing efficacy was observed
over a period of 7 years. Empty vectors or vectors containing shRNAs supposedly not targeting any known human
or mouse gene were used and presented some unwanted effects. U87 gliomas silenced for Nek1, XIAP or Survivin
presented increased sensitivity to chemotherapeutic agents and C6 cells with silenced 5´NT presented a marked
reduction of glioma growth in vivo. Stable RNAi obtained by shRNA lentiviral transduction and selection with
puromycin is a good tool for studying long range effects of the reduction in expression of genes on cell properties
both in vitro and in vivo.
Funding: CNPq, FAPERGS, CAPES and NIH.
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286
Stem cell therapy with bone marrow mononuclear cells
in an experimental model of pulmonary emphysema
Faria, CA1; Camargo, ICC2; Nogueira, MFG1; Bitencourt, R1; Ribeiro-Paes, JT1
Laboratório de Parasitologia e Genética Humana – Departamento de Ciências Biológicas – Campus de Assis – UNESP
Laboratório de Histologia – Departamento de Ciências Biológicas – Campus de Assis – UNESP
[email protected]
1
2
Keywords: emphysema, elastase, animal modeling, cell therapy and BMMC (bone marrow mononuclear cells)
The main characterisc of the emphysema is the obstruction of the airflow, within the destruction of the alveolar
walls and enlargement of the air spaces distal to the terminal bronchioli, leading to a progressive dyspnea. Although
the development achieved by the introduction of new therapeutic approaches, an effective treatment has not
yet been established. Among these new approaches, with a high applicability potential, is the cell therapy with
adult stem cells. The main goal of this study was the standardization of an experimental model of Bone Marrow
Mononuclear Cells (BMMC) transplant in C57Bl/6 mice with induced emphysema by an intranasal instillation
of elastase (1,5 IU per animal). The control and experimental groups were comparatively analyzed, considering
morfometric parameters in histological glasses. The means of the alveolar diameter were calculated through the
mean linear intercept on an optical microscope (200x). The mean linear intercept was calculated for each animal
and then the results were statistically compared between the groups. Trough this histological analysis, an evident
improvement tendency on the histopathological conditions of the animals treated whit BMMC was verified. Thus,
it is possible to say that the BMMC therapy shows promising perspectives and a great applicability potential in
COPD, yet further studies are needed.
Financial support: CNPQ
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Effect of enzyme replacement therapy on the
secondary sexual development of MPSVI patients
Giovanetti, D2; Ribeiro, M1; Barros, D1; Correia, P1; Paiva, I1; Souza, M1; Bezerra, I1; Guimarães, M1; Correa
Neto, J3; Soares, VRX2; Norato, DYJ3
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira – Federal University of Rio de Janeiro – Brazil, 2 BioMarin Brasil, 3 Hospital e
Maternidade Celso Pierro, PUC-Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil
1
Palavras-chave: ERT, Enzyme Repalcement, MPSVI.
Introduction: Mucopolysaccharidosis type VI (MPS VI) is a progressive, chronic multisystemic lysosomal storage
disease. Clinical and biochemical improvements have been reported in patients on galsulfase® ERT with little data
about pubertal development. In galsulfase® clinical studies, patients that had puberty delay at baseline, progressed/
completed puberty on ERT. Objectives: To describe the occurrence of pubertal development after galsulfase® ERT in
2 Brazilian MPS VI patients with baseline pubertal development delay. Material and methods: Follow up of two MPS
VI patients on ERT. Results: Patients started ERT at 23 yo(JC), and at 16 yo (MDS), both are females, caucasian, had
first symptoms at age 2 and 3 and were diagnosed as a severe form of MPS VI at age 4. They had baseline pubertal
development delay, showed progression in the first month of ERT and presented menarche respectively on the
60th and 80th week of ERT. Conclusion and discussion: In MPS VI, delayed puberty could be due to several causes.
Malnutrition in other chronic diseases is the proposed mechanism for puberty delay pathophysiology. Besides
endocrinological dysfunction, malnutrition and absorption deficits are described in other forms of MPS, and can
be considered as factors for puberty delay. Once the patient recuperates nutritional status when on therapy, the
puberty progression could be explained by the resolution of the nutritional deficit.As there are no studies on MPS
VI patients nutrition and hormonal status, a longitudinal follow-up study could clarify if pubertal delay is due to
endocrinological dysfunction or nutritional status.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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288
Desenvolvimento de modelo animal e construção de
partículas adenovirais com código para shRNAs contra
o RNA do gene E2f1 para estudo de melanoma
Oliveira, MT¹; Pujiz, RS¹; Strauss, BE²; Vasques, LR¹
¹Depto de Bioquímica – Universidade Federal de São Paulo
²Instituto do Coração – Faculdade de Medicina – Universidade de São Paulo
Palavras-chave: adenovírus, E2F1, RNAi, melanoma.
E2F1 é um fator de transcrição com papel fundamental na progressão do ciclo celular em mamíferos, pois ativa genes
que participam da síntese de DNA. A disfunção de sua via de regulação pode acarretar em proliferação exacerbada,
onde a superexpressão de E2F1 é um fator comum em diferentes tipos de tumores, incluindo melanomas. A inibição
da expressão de E2F1 através de RNA de interferência como tratamento para a diminuição da proliferação de tais
células é bastante promissora. Deste modo, foram objetivos deste trabalho: (a) desenvolver partículas adenovirais
para a inativação do gene E2f1, por RNA de interferência (AdshE2f1); (b) validar a construção das partículas
adenovirais com código para shE2f1; (c) desenvolver modelo animal para o tratamento de melanoma, utilizando
células B16mCAR, derivadas de melanoma de camundongos C57/BL6 e que superexpressam o receptor CAR, que
media a entrada das partículas adenovirais. As partículas adenovirais foram produzidas através da transfecção
do plasmídeo pAdRSVLacZ em células empacotadoras HEK293. Sucessivas passagens de vírus foram obtidas por
amplificação até a obtenção da passagem P4, onde seu título foi mensurado. A partir de seqüências previamente
validadas em trabalho anterior, iniciou-se a construção de plasmídeos pAdshE2f1 e pAdshGFP (controle), com
código para shRNA contra o gene E2f1 e GFP respectivamente, obtendo-se partículas virais dos mesmos, como o
descrito acima. A eficiência da construção AdshE2f1 em inativar o gene E2f1 foi verificada em células SMC-aorta,
a análise da expressão de E2f1 mostrou que houve uma diminuição em cerca de 40% a 50%, quando comparada
com o controle (qRT-PCR), demonstrando que os vetores virais construídos são competentes para promover a
diminuição da expressão gênica. No entanto, a transdução viral ainda deve ser melhorada, para que haja aumento
da eficiência da inativação. Para tanto, nova produção viral foi obtida e a eficiência de transdução foi averiguada em
células B16mCAR, com AdRSVLacZ, onde observou-se uma melhora na mesma, já que aproximadamente 90% das
células foram transduzidas. Assim, estão em andamento os experimentos utilizando-se a nova produção viral para
AdshE2f1. Para o desenvolvimento do modelo animal foram selecionados camundongos machos da linhagem C57/
BL6, com 10 semanas de idade. Uma curva de crescimento de células de melanoma in vivo foi realizada, a fim de se
padronizar a quantidade ideal de células a serem injetadas em uma das patas posteriores, e as patas contralaterais
foram utilizadas como controle. Para tanto, diferentes quantidades de células foram injetadas 5x104, 105, 5x105 e
106 nos animais; e pôde-se determinar a quantidade ideal em 5x105 células/animal, para acompanhamento do
crescimento tumoral. Desta forma, a função de E2f1 pode ser averiguada no sistema desenvolvido neste trabalho,
bem como o mesmo pode contribuir para estudos futuros de outros genes relacionados à proliferação celular.
Apoio financeiro: FAPESP e CAPES
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289
Análise histomorfológica óssea de animais modelo
(Mus musculus) para a Síndrome de Marfan
Cardoso, CQ1; Freitas, FRS2; Fernandes, GR1; Lima, BL1; Massironi, SMG3; Gouveia, CHA2; Pereira, LV1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, USP.
Departamento de Anatomia, Instituto de Ciências Biomédicas, USP.
3
Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, USP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Síndrome de Marfan; Modelo Animal; Histomorfologia óssea.
A Síndrome de Marfan (SMF) é um distúrbio generalizado do tecido conjuntivo, caracterizada por manifestações
nos sistemas ósseo, cardiovascular e ocular. É herdada de forma autossômica dominante, com penetrância
completa. Mutações no gene FBN1, que codifica a proteína fibrilina-1, causam a SMF. Através de recombinação
homóloga em células ES, foi gerado um animal knockout com uma deleção dos éxons 19 a 25 do gene Fbn1
(mutação Fbn1mgΔneoloxP). Atualmente o alelo Fbn1mgΔneoloxP se encontra em dois backgrounds isogênicos:
129/Sv, onde os heterozigotos manifestam o quadro ósseo da SMF com diferentes graus de gravidade e idade
de acometimento inferior a três meses; e C57BL/6, onde os heterozigotos também apresentam a manifestação
óssea, porém com variabilidade mínima e com idade de acometimento superior a 6 meses de idade. Assim, o
objetivo desse trabalho foi fazer uma análise histomorfológica óssea desses animais modelo (Mus musculus) para
a Síndrome de Marfan. Foram utilizados animais com 3, 6 e 9 meses de idade, heterozigotos afetados e selvagens,
das linhagens 129/Sv e C57BL/6, e observadas alterações quanto a: morfologia, resistência óssea e histologia da
Placa Epifisária de Crescimento (PEC) do fêmur. Os nossos resultados preliminares mostram que para a análise
morfológica, realizada através da medida do comprimento do fêmur, não houve diferença estatística entre afetados
e selvagens em ambas linhagens. Quanto à resistência óssea, analisada através de teste biomecânico, a resiliência
e a tenacidade estavam aumentadas (p=0,0007 e p=0,0151, respectivamente), e a rigidez diminuída (p<0,0001)
para os animais afetados da linhagem 129/Sv. A carga máxima, resiliência e rigidez estavam diminuídas (p=0,0266;
0,0277 e <0,0001, respectivamente) nos animais afetados C57BL/6. Para a histologia da PEC, nos animais de 3
meses, foi observado um desvio da diferenciação das células mesenquimais de osteoblastos para adipócitos, na
medula óssea. Esse desvio é maior nos animais C57BL/6 quando comparados aos 129/Sv, porém, para ambas
linhagens, os animais afetados possuem mais células adiposas que os selvagens. Esses resultados sugerem que, os
animais 129/Sv devem ter tido aumento da expressão de outras proteínas da matriz óssea, para compensar a perda
da fibrilina, o quê promoveu o aumento da tenacidade e resiliência, mas não foi capaz de aumentar a rigidez. Já
nos animais C57BL/6, a qualidade óssea foi prejudicada pela falta da fibrilina, causando um comprometimento da
síntese óssea, o quê levou a uma menor resistência óssea.
Apoio Financeiro: FAPESP e CAPES.
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290
Análise de genes modificadores em um modelo
animal para a Síndrome de Marfan – quantificaçào da
gravidade dos fenótipos
Fernandes, GR1; Lima, BL¹; Cardoso, CQ1; Massironi, SMG2; Pereira, LV1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, USP
Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas, USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SMF, Síndrome de Marfan, modelo animal, Genes modificadores
A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença autossômica dominante do tecido conjuntivo, cujas principais
manifestações clínicas envolvem alterações nos sistemas esquelético, cardíaco e ocular. Apesar de ter penetrância
completa, a SMF apresenta grande variabilidade clínica inter e intra familiar. Mutações no gene FBN1, que codifica
a proteína fibrilina-1, foram associadas a essa síndrome. Através de recombinação homóloga em células ES, foi
gerado um animal knockout com uma deleção dos exons 19 a 25 do gene Fbn1 (alelo Fbn1mgΔneoloxP). Esse alelo
encontra-se em dois backgrounds isogênicos: 129/Sv e C57BL/6. Enquanto heterozigotos 129/Sv apresentam
alterações ósseas (cifose), pulmonares (enfisema com aumento dos espaços aéreos alveolares e destruição das
paredes dos bronquíolos) e vascular (espessamento da parede da aorta com fragmentação e desorganização das
fibras elásticas) já aos 3 meses de idade, os animais da linhagem C57BL/6 só desenvolvem fenótipos equivalentes
a partir dos 6 meses de idade. Essa variabilidade nos fenótipos indica a existência de genes modificadores do
fenótipo Marfan nas duas linhagens. Para identificarmos esses genes, animais das duas linhagens foram cruzados
para gerar os animais híbridos F1 e esses intercruzados para gerar os animais F2. Os animais da F1 com 3 meses
apresentam manifestações ósseas, vasculares e pulmonares homogêneas equivalentes aos animais 129/Sv. Os
animais heterozigotos da F2 com 3 meses de idade reproduzem toda a variação observada nas linhagens parentais,
sendo que os cada um dos sistemas apresentam manifestações leves, graves, muito graves ou ausência destas.
Entretanto a concordância observada anteriormente nas linhagens isogênicas não foi mantida nestes animais,
indicando a existência de genes modificadores específicos para cada sistema afetado. A quantificação da gravidade
de cada fenótipo é fundamental para o mapeamento desses genes modificadores. Assim, desenvolvemos métodos
quantitativos para classificar a gravidade das manifestações dos sistemas, ósseo (relação entre a distancia linear
e o comprimento da porção cervical+torácica da coluna), vascular (diferença entre a circunferência externa e
interna da aorta) e pulmonar (razão entre área de tecido pulmonar e espaços alveolares por contagem de pixel).
Esses métodos nos permitiram classificar de forma objetiva os animais em diferentes grupos de acordo com a
gravidade de cada fenótipo. Concomitantemente, está se realizando o mapeamento utilizando-se um conjunto de
64 marcadores microssatélites selecionados no banco de dados MGI (Mouse Genome Informatics), sendo que o
mapeamento fino destes animais será realizado, posteriormente a classificação, utilizando-se microarray de SNPs.
Apoio: FAPESP; CAPES; CNPq
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291
Myostatin and follistatin expression in skeletal muscles
of rats with chronic heart failure
Guizoni, DM; Lima, ARR1; Martinez, PF1; Okoshi, K1; Zornoff, LAM1; Campos, DHS1; Oliveira Jr, SA1;
Bonomo, C; Dal Pai-Silva, M2; Okoshi, MP1
Department of Internal Medicine, Botucatu Medical School, State University of Sao Paulo.
Department of Morphology, Botucatu Biosciences Institute, State University of Sao Paulo – UNESP
1
2
Keywords: cardiac failure, myostatin, follistatin, skeletal muscle, PCR, myocardial infarction
Skeletal muscle abnormalities can contribute to decreased exercise capacity and fatigue in heart failure (HF).
Although muscle atrophy is a common alteration in HF, the mechanisms responsible for muscle mass reduction
are not clear. Myostatin, a member of TGF-β family (transforming growth factor), regulates muscle growth and
mass. Several studies have shown a negative correlation between myostatin expression and muscle mass. The
aim of this study was to evaluate myostatin expression in skeletal muscles of rats with chronic HF. As myostatin
gene expression can be modulated by follistatin, we also evaluated its expression. HF was induced by myocardial
infarction (MI, n= 8); results were compared to the Sham-operated group (n= 8). Cardiac structure and ventricular
function were assessed by transthoracic echocardiogram. Myostatin and follistatin gene expression was analyzed
by real-time PCR and protein levels by Western blotting in the soleus and gastrocnemius muscles; fiber trophism
was evaluated by morphometric analysis in haematoxylin and eosin stained sections. MI group presented HF
evidence such as pleural effusion and right ventricular hypertrophy. Left ventricular dilation and dysfunction were
observed in MI compared to Sham group. In the soleus muscle, cross-sectional area (Sham 3,572 ± 378; MI 2,982 ±
323 μm2; p = 0.006) and follistatin protein expression (Sham 1.00 ± 0.36; MI 0.18 ± 0.06 arbitrary units; p = 0.03) were
lower in MI and there was a trend for follistatin gene expression to be lower in MI group (p = 0.085). There was no
change in myostatin expression between groups. In the gastrocnemius, all MI group parameters were statistically
similar to the Sham. In conclusion, our data show that during chronic heart failure, decreased skeletal muscle
trophism is combined with unchanged myostatin and reduced follistatin expression.
Financial support: FAPESP, CNPq and Fundunesp.
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292
Epigenetic modulation of embryonic development in
Homo sapiens, Mus musculus and Gallus gallus as
observed by the systems biology
Feltes, BC; Poloni, JF; Bonatto, D
Laboratório de Genética Toxicológica
Instituto de Biotecnologia
Universidade de Caxias do Sul
Palavras-chave: Homo sapiens, mus musculus, gallus gallus, systems biology, epigenetic.
Epigenetics effects are part of the mechanisms related to embryonic development and senescence in different cells
types. These effects include DNA and histones methylation, the replacement of nucleosomes, remodeling of higher
levels of chromatin, silencing of chromatin, and genomic stability. Among the main proteins of DNA methylation it
can be cited DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. Recent studies suggest that epigenetic regulation in embryonic stem
cells is one of the essential factors for tissue differentiation and body patterns formation. The HOX genes comprise
a multigenic family that controls the embryonic development in metazoan. The most fascinating properties of
HOX genes is its evolutionary conservation as genic clusters and the manner as the cluster are expressed according
to the time and space during the embryonic anterior-posterior axis formation. To evaluate the interplay between
the epigenetic mechanisms with HOX proteins, a study using tools of systems biology was developed. To prospect
the proteomics data, String 8.0 [http://string.embl.de], Gene Cards [www.genecards.org] and iHop [www.ihop-net.
org] were used. For topological analysis of protein networks, the program Cytoscape 2.5.0 with the plugins MCODE
[http://chianti.ucsd.edu/cyto_web/plugins/index.php] ( for clusters analysis), and BINGO 2.3 [http://chianti.ucsd.
edu/cyto_web/plugins/index.php] ( for ontological processes analysis) were applied. The system biology data
indicated that in mammals the DNMTs complex interacts with the histone deacetylases SUZ12 and EZH2, which
is associated with various HOX proteins during embryogenesis. Moreover, the protein-protein interaction data
also showed an association between SIRTs, DNMTs and SUZ12/EZH2/EED, indicating that these proteins could
act in the control of HOX gene expression. However, for G. gallus, the HOX proteins showed no association with
histone deacetylases or SIRTs. In M. musculus and H. sapiens other proteins related to embryonic development,
such as Pax2 and p300, appear to be important mediators of the HOX expression, and have been associated with
SUZ12/EZH2/EED complex. The data gathered by systems biology allows us to observe a change in the interaction
patterns of epigenetic mechanisms during vertebrate evolution, where DNMTs becomes associated to different
proteins needed for processes related to embryonic development in mammals.
Apoio Financeiro: CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO
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293
Analysis of epigenetic alterations and gene expression
profile associated with viral infections in the etiology of
common acute lymphoblastic leukemia
Vasconcelos, GM; Beserra, BA; Cordeiro, SNS; Zhong, S; Silva, FA; Wiemels, JL; Pombo-de-Oliveira, MS
Instituições: Molecular Epidemiology Laboratory, University of Califórnia, San Francisco, Califórnia. Programa de hematologia e oncologia
pediátricos, Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: ALL, epigenetic, metilation, viral infections.
Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the main pediatric cancer subtype and, despite of success in treatment
its cause remains enigmatic. Common ALL (c-ALL) is the most prevalent subtype and it has a peak of incidence
between 2-5 years of age. It is believed that the onset of c-ALL in children is based in a two hit model: the first
hit would promote mutations or epigenetic alterations that create a pre-leukemic clone during intrauterine life
and the second one, possibly post-natal, would precipitate ALL through a proliferative expansion of this clone.
There are evidences that infections influence the leukemogenesis process. Virus infections would cause the first
hit through insertion of viral DNA in cell genome or promote the expansion of pre-leukemic clone through an
abnormal immune response to infection. In this sense, it is proposed that leukemias related to infections will
harbor more methylated genes due to a natural cell mechanism of defense against viruses. Parvovirus B19 (PVB19)
infection is an important cause of cytopenia in children and its role in ALL is under debate. Some studies suggest
that PVB19 infection is a precursor event of ALL. We investigated the role of PVB19 infection in c-ALL etiology. We
analyzed the methylation status of DAPK, IGFBP5 and STAT1 genes by methylation specific PCR (MSP); evaluated
the expression levels of some genes related to JAK/STAT pathway by real time PCR; and correlated these molecular
results with the presence of PVB19 identified by the measure of IgM and IgG anti- PVB19 levels by ELISA and
confirmed by PCR. Samples at diagnosis of 121 childhood ALL, classified as pro-B, common and pre-B were used.
Thirty percent of the ALL samples were positive for the presence of PVB19 antibodies. DAPK and IGFPB5 were
found methylated in 52% and 88% of total samples, respectively, while STAT1 was non-methylated in all cases. An
association between PVB19 infection and methylation of DAPK was observed (P<0,05). We didn’t see any difference
across leukemia subtypes regarding methylation status nor gene expression. IgM positive cases presented higher
expression of DAPK and STAT1. Cell’s response to viral infection leads to expression of interferon stimulated-genes
and also activation of methylation processes in efforts to control viral gene expression. Our expression profiling
results suggest that somehow immune response is related to c-ALL. The methylation of DAPK has been seen
associated with hematological malignancies in adult and children patients. The methylation status of DAPK gene
in c-ALL, found in our study, may be a signature of its association with PVB19 infection. This study provides some
clues that inflammation and epigenetic modifications may have a role in the development of childhood leukemia.
Órgão financiador: Capes
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294
Análise da regulação epigenética da expressão de
genes candidatos a supressores tumorais em 3p21.3
Prando, EC; 1Zimbardi, D; 1Aguiar, G; 2Cavalli, LR; 1Rainho, CA
1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP - Botucatu, SP.
Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University Medical Center - Washington DC.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de mama, regulação epigenética, qRT-PCR em tempo real, RASSF1, HYAL1, HYAL2, HYAL3.
A perda de sequências gênicas e de marcadores moleculares mapeados em 3p21.3 é bastante frequente em
carcinomas humanos, sugerindo a presença de vários genes supressores tumorais nesta região. Adicionalmente,
tem-se demonstrado que essas regiões de perdas genômicas no câncer estão, em geral, em concordância com os
sítios de hipermetilação do DNA. A perda da expressão do supressor tumoral RASSF1 constitui um dos exemplos
de genes inativados tanto por mecanismos genéticos quanto epigenéticos em vários tipos de cânceres humanos.
Este gene codifica uma proteína com domínio de associação a RAS com função na regulação da fase G1/S do
ciclo celular, transdução de sinal, trocas e transporte de íons, apoptose e morte celular. A hipermetilação da ilha
CpG presente na sua região promotora foi detectada em até 90% dos carcinomas mamários. Os genes HYAL1,
HYAL2 e HYAL3 codificam as hialuronidases, que são endoglicosidases que degradam o ácido hialurônico, um
dos maiores glicosaminoglicanos presentes em alguns tecidos, na matriz extracelular e em fluídos corpóreos.
Estes genes encontram-se mapeados upstream ao gene RASSF1, a uma distância de aproximandamente 41Kb,
23Kb e 48Kb, respectivamente, e possuem ilhas CpGs características nas suas regiões promotoras. A função
das hialuronidases no câncer é desconhecida, sendo controverso se as mesmas atuam como promotores ou
supressores do desenvolvimento tumoral. Os loci demonstrando padrões alterados de metilação constituem
um dos mais promissores marcadores moleculares para o uso no diagnóstico e prognóstico do câncer. Com a
finalidade de investigar a provável regulação epigenética desses genes, os níveis de expressão dos genes alvos
(RASSF1, HYAL1, HYAL2 e HYAL3) foram quantificados utilizando a técnica de qRT-PCR (quantitative real time
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), em duas linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários,
MCF7 e MDA-MB-231, tratadas ou não com 5-aza-2’-desoxicitidina, um agente desmetilante, e tricostatina A
(TSA), um inibidor das desacetilases de histonas. O gene da beta actina (ACTB) foi usado como controle endógeno
e a quantificação relativa foi obtida pelo método ∆∆Ct. Em ambas as linhagens, os dados mostraram aumento na
expressão dos genes: após o tratamento com a 5-aza-2’-desoxicitidina houve aumento de expressão de 17,78; 1,09;
1,07 e 1,74 vezes na linhagem MCF7 e 4,80; 1,20; 3,25 e 1,88 vezes na linhagem MDA-MB-231, dos genes HYAL1,
HYAL2, HYAL3 e RASSF1, respectivamente. Com o tratamento combinado de 5-aza-2’-desoxicitidina e TSA houve
aumento de expressão de 9,19; 0,60; 1,15 e 1,26 vezes na linhagem MCF7 e 5,09; 1,36; 2,80 e 3,10 vezes na linhagem
MDA-MB-231, dos genes HYAL1, HYAL2, HYAL3 e RASSF1, respectivamente. O aumento da expressão gênica após
os tratamentos selecionados, fornece fortes indícios de que esses genes, prováveis supressores tumorais, sofram
regulação epigenética por meio da metilação do DNA.
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SMARCA5 methylation and expression in gastric
cancer
Gigek, CO1; Lisboa, LCF1; Leal, MF1; Silva, PNO1; Lima, EM2; Assumpção, PP3; Burbano, RR4; Smith, MAC1
Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia e Genética, Universidade Federal de São Paulo, SP, Brasil.
Departamento de Biologia, Campus Ministro Reis Velloso/Parnaíba, Universidade Federal do Piauí, PI, Brasil.
3
Serviço de Cirurgia, Hospital Universitário João de Barros Barreto, Universidade Federal do Pará, PA, Brasil.
4
Laborátorio de Citogenética Humana e Genética Toxicológica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, PA, Brasil.
[email protected]
1
2
Keywords: Gastric cancer, SMARCA5, methylation, protein expression
Gastric cancer is the fourth most prevalent cancer in the world. However, due to its poor prognosis, gastric cancer
is the second most common cause of death from cancer. The early detection of gastric cancer is very important for a
good prognosis. DNA methylation is the most common epigenetic alteration and is associated with gene silencing.
SMARCA5, is a member of SWI/SNF chromatin remodelling family of proteins, which has a helicase and ATPase
activity. This protein is important for gene expression, DNA replication, DNA repair and maintenance of chromatin
structure. SMARCA5 promoter and exon 1 have a 1 kb CpG island with CG content up to 60%. This CpG island
contains binding sites of methylation-sensitive transcription factors, as Sp1, Myb, CREB, AP1 and MZF1. These data
suggest that SMARCA5 expression may be regulated by DNA methylation. Here we evaluated SMARCA5 expression
and promoter methylation in gastric carcinogenesis. Immunohistochemistry was analyzed in 54 gastric cancer and
18 normal gastric mucosa samples. 92 gastric cancer and 47 normal mucosa samples were investigated through
methylation specific PCR. This is the first study evaluating SMARCA5 expression and promoter methylation status
in gastric carcinogenesis. We observed higher immunoreactivity of SMARCA5 in gastric cancer samples than in
normal mucosa. Moreover, SMARCA5 promoter methylation was associated with absence of protein expression.
In conclusion, our data suggest that SMARCA5 immunoreactivity, as a potential marker of proliferation and
malignization, may be used to help diagnosis in gastric cancer or could be an interesting therapeutic target.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
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296
Pesquisa do padrão de metilação da região
controladora de imprinting KvDMR em placentas de
pacientes com pré-eclâmpsia
Coelho, K; Araújo, FM; Araújo, A; Oliveira, JC; Duarte, G; Gomes, MVM; Galerani, MAV; Ramos, ES
Departamento de Genética; Departamento de Ginecologia e Obstetrícia. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP, Ribeirão Preto,
São Paulo.
Palavras-chave: Pré-eclâmpsia, KvDMR, imprinting genômico.
A pré-eclâmpsia (PE) é caracterizada pelo aumento da pressão arterial e proteinúria, após a 20ª semana de gestação.
Sua potencialidade para complicações, a qualifica como um dos mais sérios agravos à saúde da mulher neste
período. A etiologia ainda é desconhecida, mas foi sugerido que alterações no imprinting genômico poderiam estar
envolvidas no desenvolvimento da doença. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se genes importantes
para o desenvolvimento fetal e placentário, como o gene CDKN1C, que são regulados por regiões controladoras de
imprinting (ICR) como a KvDMR. Defeitos na expressão do gene CDKN1C podem acarretar proliferação anormal
do trofoblasto, freqüentemente associada com PE. Assim, alterações no padrão de metilação da KvDMR poderiam
também estar associadas com a PE. O objetivo do trabalho foi verificar a associação de PE com modificações do
perfil de metilação da KvDMR em tecido placentário. Foram selecionadas 18 placentas de pacientes com PE e 20 de
mulheres sem história pessoal ou familial de PE (grupo controle). Após a extração do DNA de tecido placentário, foi
realizada a análise quantitativa do padrão de metilação pelo método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação
Associada à PCR em Tempo Real, que consiste na análise quantitativa da metilação pela comparação da quantidade
amplificada por PCR em Tempo Real do DNA digerido e do DNA não digerido pela enzima sensível à metilação
HpaII. Todas as amostras foram também digeridas separadamente com a enzima não sensível à metilação MspI,
que possui o mesmo sítio de restrição da HpaII. Analisando quantitativamente o perfil de metilação da região
KvDMR, verificou-se que o material das 20 placentas controles apresentaram uma média de metilação normal
de 48%. Considerando-se 2DP (± 9), os valores normais foram estipulados como variando entre 30 e 65%. Dentre
as placentas de PE analisadas, foram observadas hipermetilação da KvDMR em 22,2% (4/18), com valores de
metilação de 67%, 72%, 79% e 97%. Assim, embora o número de pacientes seja pequeno, verificamos alteração
no perfil de metilação da KvDMR em placentas de pacientes com PE. Esse fato poderia acarretar alterações de
regulação de genes importantes para o desenvolvimento placentário, que poderiam resultar no quadro de PE.
Apoio: FAEPA; FAPESP (2007/05982-5; 2005/00616-5); CNPq (408856/2006-8).
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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297
Molecular dynamics simulations of the nuclear
receptor complex RXRA-PPARG interacting with the
DNA response element
Hansson, A1; Polikarpov, I2; Skaf, MS1
Instituto de Quí­mica, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo - USP
[email protected]
1
2
Keywords: Molecular Dynamics, Nuclear Receptors, RXRA, PPARG, PPRE
The nuclear receptor (NR) superfamily comprises of proteins that act as transcription factors. The peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPARG) is a key receptor in the regulation of cell differentiation and
proliferation. However it is also associated with type II diabetes, involved in inflammatory and immune responses
and is highly expressed in various types of cancer. PPARG binds to the deoxyribonucleic acid (DNA) response
element (PPRE) as a heterodimer with the obligated partner retinoid X receptor alpha (RXRA). The natural ligand
of RXRA is 9-cis retinoic acid, while PPARG can accommodate various types of ligands, mostly agonists. Ligand
binding induces conformational changes of the NRs that causes an exchange of the associated corepressors
to coactivators which activates the target gene transcription. Experimental techniques to determine crystal
structures of NRs and to identify novel ligands and are quite advanced. Nevertheless, very little is known about NRs
activity and dynamics at a molecular level. Computational methods, such as molecular dynamics (MD), enable
investigations of molecular mechanisms and receptor activation processes on time scales of nanoseconds. Until
very recently, only fragments of the NR were experimentally resolved. So when Chandra et al. crystallized the intact
heterodimer RXRA-PPARG structure including the PPRE (Nature Nov. 2008), new opportunities opened to study
previously neglected receptor cooperation and domain interaction in the binding and transcription process of
DNA. Here we present (to our knowledge) the first MD study based on this structure. The major part of this work
involves the derivation of required force field (FF) parameters and preparation of the initial structure (containing
about 140 thousand atoms) for the MD simulations. Unresolved atoms and missing residues are added to the
crystal structure which includes the ligands 9-cis retinoic acid and rosiglitazone. It is confined in an orthorhombic
box with periodic boundary conditions and a solvent of water, magnesium, sodium, and chloride ions. The MD
simulations are performed at 25 °C with the CHARMM27 FF. Novel FF parameters for the ligands have been
developed with RHF/6-31G(d) level of theory using the Merz-Singh-Kollman scheme for the partial charges. Full
electrostatic interactions are summed up with the particle mesh Ewald algorithm, while the van der Waals forces
are truncated at 14 Å. With state-of-the-art MD methods applied on the intact NR heterodimer crystal structure,
we gain significant insights in the complex dynamical process involving the DNA binding and transcription.
Financial support: FAPESP
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298
Expressão protéica dos receptores de estrógeno alfa e
beta e de progesterona em Leiomiomas Uterinos
Cirilo, PDR1,2; Reis-Rosa, LA1,2; Linde, SAD2,3; Domingues, MAC4; Soares, FA2; Pontes, A5; Rogatto, SR2,3
Instituto de Biociências, UNESP – Botucatu, SP.
Centro de Pesquisas, Hospital AC Camargo – São Paulo, SP.
3
Depto de Urologia, HC-FMB, UNESP - Botucatu, SP.
4
Depto de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP – São Paulo – SP.
5
Depto de Ginecologia e Obstetrícia, UNESP - Botucatu, SP.
1
2
Palavras-chave: Leiomiomas uterinos, tissuemicroarray, receptor estrogeno beta, receptor estrogeno alpha, receptor de progesterona
Leiomioma uterino (LU) é a neoplasia benigna mais comum do aparelho reprodutor feminino, sendo a principal
indicação para histerectomia. É considerado um importante problema de saúde pública por esta razão e pelos
sintomas observado nas pacientes. O estrógeno e a progesterona são hormônios esteróides associados diretamente
com o desenvolvimento dos LU. Neste estudo, foi construída uma plataforma de microarranjos de tecidos (TMA)
contendo 74 casos de LU e 19 casos de miométrio normal adjacente (MM). Nós investigamos por imunohistoquímica
(IHQ) o status dos receptores de estrógeno alfa e beta (ESR1 e ESR2, respectivamente) e de progesterona (PR).
Foram avaliados a intensidade (escores 0 a 3) e a extensão (escores 0 a 5) da imunocoloração resultando em escores
de 1 a 3. Para o ESR1, 60% dos casos mostraram escore de intensidade 3; 79% dos casos mostram escore 1 para o
ESR2; e 41% mostraram escore 2 para o PR. A comparação com miométrio normal adjacente mostrou para ESR1
escore 2: 45% dos LU versus 68% dos MM; escore 3: 41% dos LU versus 21% no MM (P=0.2295). Para o ESR2, 9% dos
LU apresentaram ausência de imunocoloração versus 50% dos MM e escore 1 foi observado em 90% dos LU versus
45% dos MM (P=0.0054). Para o PR a distribuição foi mais homogênea em relação ao MM, porém foi observado
que 31% dos LU apresentaram escore 2 versus 13% dos MM (P=0.5207). Os achados de IHQ foram comparados aos
dados clínicos. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na comparação entre os dados
clínicos e padrão de expressão de ESR1 e ESR2, contudo para o PR foi detectada associação com fase do ciclo
menstrual (P=0.0077). O escore 2 para PR no LU foi mais frequente entre as mulheres com ciclo menstrual regular
(23/53 – 43%) em relação as mulheres menopausadas (3/10 – 30%). Estes achados revelaram ações opostas dos
receptores de estrógeno e ação moderada do receptor de progesterona nos LU. Aparentemente a expressão de PR é
mais relevante em LU de mulheres que ciclam em relação às mulheres menopausadas. Para o nosso conhecimento,
este é o primeiro estudo em larga escala avaliando a expressão dos receptores de estrógeno e progesterona em
amostras de LU em pacientes brasileiras.
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299
TNF-A e IL-1B induzem a transcrição de GATA3
em células progenitoras hematopoéticas CD34+
independente da via NF-KB
Schiavinato, JLS1; Oliveira, LHB1; Carlos, CD1; Araujo, AG1; Covas, DT1; Zago, MA1; Panepucci, RA1
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular – INCTC. Centro Regional de Hemoterapia do Hospital
das Clínicas e Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP, Universidade de São Paulo - USP.
[email protected]
1
Palavras-chave: SCU, CTH CD34+, NF-κB, diferenciação T-linfocítica, GATA3
Uma maior produção de linfócitos T está associada a transplantes que utilizam sangue de cordão umbilical (SCU),
comparados ao uso de medula óssea (MO). Em parte isto se deve a diferenças intrínsecas das células tronco
hematopoéticas CD34+ (CTH). Num estudo anterior comparando os promotores de genes diferencialmente
expressos entre CTH de MO e SCU, identificamos uma acentuada sinalização constitutiva da via NF-κB nas CTH de
SCU. Adicionalmente, genes com papéis importantes na diferenciação T-linfocítica (como USF1, RUNX1 e GATA3)
foram identificados como potenciais alvos transcricionais da via NF-κB. Concordante com estes resultados, TNF-α
e IL-1β (agonistas da via NF-κB) promovem a diferenciação de linfócitos T a partir de CTH CD34+. Com isto em
mente, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel da via NF-kB no controle transcricional de USF1, RUNX1
e GATA3, em CTH CD34+. Para isso, CTH CD34+ foram obtidas imunomagnéticamente a partir de SCU. Para
determinarmos a concentração dos fatores necessários para uma ativação mensurável da via NF-κB, CTH CD34+
foram incubadas por 1 hora em meio de cultura com TNF-α ou IL-1β em concentrações variando de 0,1 a 50ng/mL.
Como indicador da ativação da via NF-κB, a expressão do alvo transcricional TNFA, foi avaliada por PCR em tempo
real. Da mesma forma, a expressão de USF1, RUNX1 e GATA3 foram avaliadas em paralelo. Uma concentração de
5ng/mL, para ambos agonistas, foi considerada suficiente para ativar a via, causando um aumento na expressão de
TNFA. Adicionalmente, TNF-α e IL-1β nesta mesma concentração, causaram o aumento da expressão de GATA3,
mas não de USF1 ou RUNX1. Utilizando 5ng/mL de TNF-α, uma nova avaliação foi realizada para determinação
da concentração da droga BAY11-7082 necessária para inibição da via NF-κB. Para isso, CTH CD34+ foram préincubadas com diferentes concentrações do inibidor (de 2,5 a 15nM) antes de serem incubadas com TNF-α. Uma
concentração de 5nM do inibidor foi suficiente para impedir completamente a transcrição de TNFA, após 1 hora de
incubação. Finalmente, a participação direta da via NF-κB na expressão de GATA3, induzida por TNF-α e IL-1β foi
avaliada. Para isso, CTH CD34+ foram tratadas ou não com 5nM do inibidor BAY11-7082 e foram então incubadas
na presença de 5ng/mL dos agonistas TNF-α e IL-1β. Interessantemente, a indução de GATA3 por ambos os fatores
foi confirmada, porém esta foi inalterada pela presença do inibidor. Nossos resultados indicam que a indução de
GATA3 por TNF-α e IL-1β pode responder, em parte, pela promoção da diferenciação T linfocítica induzida por
estes fatores, e que a via NF-κB não atua diretamente nesta indução, ao menos nas condições avaliadas. Este estudo
contribui para o entendimento das diferenças moleculares, envolvidas na diferenciação T linfocítica, existentes
entre CTH CD34+ de MO e SCU.
Apoio FAPESP e CNPQ.
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300
Analysis of allele-specific gene expression reveals
random X chromosome inactivation pattern in human
term placenta
Mello, JCM1; Stabellini, R1; Araújo, ESS1; Hernandes, LM1; Vidal, DO2; Souza, JSS2; Camargo, AA2; Pereira, LV1
Instituto de Biociências, USP;
Ludwig Institute for Cancer Research – São Paulo Branch
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Placenta, X crhomosome Inactivation, Imprinted inactivation, Random inactivation, Allele-specific gene expression
In mammals, transcriptional silencing of all but one X chromosome present in somatic cells ensures dosage
compensation for X-linked genes among females (XX) and males (XY) in a process called X chromosome
inactivation (XCI). XCI can be random, where the inactive X in each cell is chosen by chance; or imprinted, where
the X chromosome activity depends on its parental origin. In marsupial female embryonic cells and in rodent extraembryonic tissues, XCI is imprinted and the paternal X is always inactivated. In contrast, in embryonic cells of
eutherian mammals, either the paternal or the maternal X chromosome is randomly inactivated. In human extraembryonic tissues, results concerning XCI patterns are still controversial, and are mostly based on the analysis
of only one or two X-linked genes in different cell types. We have used 18 SNPs in expressed regions of 16 genes
along the entire X chromosome to investigate the patterns of XCI in human placenta. Using direct sequencing of
cDNA, allele-specific expression was analyzed in 23 full-term placental fragments. Using the PickPeaker software
(Genome Research, 2005. 15:1584-91), we were able to quantify the contribution of each allele in gene expression,
and determined that nine samples presented monoallelic expression of X-linked genes submitted to inactivation,
indicating a completely skewed pattern of XCI. Only one placenta, however, displayed biallelic expression of every
gene examined, suggesting random XCI. Other two samples showed skewed XCI, where for every gene examined
one allele had higher level of expression than the other. Classification of additional seven samples was not clear
due to a heterogeneous expression pattern among different genes. As results varied greatly among samples we
wondered if the placenta behaves as a mosaic concerning the X`s parental origin, and tested this hypothesis in
different fragments collected in three distinct regions of the same placenta. The allele-specific gene expression
analysis revealed that the pattern of XCI in this organ is random, and indeed occurs as a mosaic of relatively large
patches of cells with either maternal or paternal XCI. The variability of the data on individual samples can explain
the lack of agreement among studies described in the past as a result of the small number of genes investigated.
Our model of the placenta as a mosaic of large patches proposes a solution to the puzzling results of previous
studies which used few samples and loci.
Órgão Financiador: FAPESP, CNPq
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301
Perfil de expressão das PIP quinases durante a
diferenciação eritróide humana in vitro
Zaccariotto, TR1; Lanaro, C2; Albuquerque, DM2; Santos, MNN1; Costa, FF2; Sonati, MF1
1
2
Laboratório de Hemoglobinopatias - Departamento de Patologia Clínica, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP
Laboratório de Hemoglobina e Genoma - HEMOCENTRO, UNICAMP
Palavras-chave: fosfatidilinositol-fosfato quinases, diferenciação eritróide, hemoglobinopatias, expressão gênica, qRT-PCR
As fosfatidilinositol-fosfato quinases (PIPKs) são uma família de enzimas lipídio quinases, responsáveis pela
produção do segundo mensageiro PI4,5P2 ( fosfatidilinositol 4,5 bifosfato) que tem um importante papel em
diversos processos celulares. As PIPKs são classificadas em 3 subfamílias - PIPK I (a, b, g), PIPK II (a, b, g) e PIPK
III – que parecem apresentar distintas funções e localização celular. Recentemente, em estudo realizado em nosso
laboratório, observou-se que o gene da enzima PIP5K IIa estava diferencialmente expresso em reticulócitos de
pacientes com Doença de Hb H de uma mesma família, com genótipo -a3,7/-SEA, de forma que o paciente com
maior quantidade de Hb H apresentava também os maiores níveis desse transcrito, bem como de globina b. Estes
resultados sugeriram que a proporção mais elevada de Hb H se deve a uma maior taxa de transcrição de globina b,
e que, de alguma forma, sua expressão está relacionada à da PIPK IIa. Na tentativa de melhor compreender o papel
dessas quinases nas células eritróides, avaliamos, por PCR em Tempo Real (qRT-PCR), o perfil de expressão dos
genes das PIPKs (I e II, com suas isoformas a, b, g, e III) durante a diferenciação eritróide humana em cultura de
células CD34+ de 7 indivíduos sadios e, adicionalmente, de 2 pacientes com hemoglobinopatias (1 a-talassêmico
e 1 β-talassêmico), comparando-os com o perfil de expressão dos genes das globinas (a, b, g) (dias 7, 10 e 13 da
cultura eritróide). Os resultados revelaram que a expressão de todas as PIPKs aumenta à medida que as células se
tornam mais diferenciadas, mas cada uma delas apresenta um perfil característico. O perfil de expressão da PIPK
IIa foi o que mais se aproximou daquele dos genes de globina, praticamente coincidindo com ele. Em relação aos
pacientes, o paciente com talassemia a apresentou níveis de expressão de PIPK IIa bastante elevados (@ 24 vezes
a expressão do controle), corroborando o resultado anteriormente encontrado, enquanto o paciente β-talassêmico
apresentou o oposto, com expressão reduzida em relação ao controle (@ 3 vezes menor). Embora parciais, esses
achados apóiam a hipótese de que a enzima PIPK IIa está de alguma forma relacionada à expressão dos genes de
globina e, em particular, à do gene da globina β.
Apoio Financeiro: FAPESP/CAPES/CNPq
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302
Cloreto de cobalto induz parada do ciclo celular em
G2/M e ativação de NF-κB em células leucêmicas
Baumont, AC 1,2; Freitas, MB2; Zanotto-Filho, A3; Delgado-Cañedo, A2; Roman, T1
Departamento de Genética, UFRGS
Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular, Instituto de Cardiologia de Porto Alegre
3
Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Departamento de Bioquímica, UFRGS
1
2
Palavras-chave: hipóxia, cloreto de cobalto, leucemias, NF-kappaB, ciclo celular
A hipóxia é uma condição que, em diversas linhagens tumorais, pode causar alterações na expressão gênica que
contribuem para a progressão tumoral e potencial invasivo e metastático. No entanto, em outras linhagens tumorais,
poderia bloquear o ciclo celular e induzir apoptose e necrose. O Fator-1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um importante
regulador da resposta celular à privação de oxigênio, modulando a expressão de genes pró-apoptóticos, como p53,
Ndrg-1, Bax e Fas, e/ou anti-apoptóticos, como Bcl-2. Outros fatores transcricionais, como o fator nuclear kappaB
(NF-κB), também demonstraram acionar respostas diretas ou indiretas à hipóxia. Recentemente, foi descrita uma
associação entre as espécies reativas de oxigênio (ROS) e esses fatores transcricionais. Nesse sentido, cloreto de
cobalto (CoCl2), um agente mimetizante das condições hipóxicas, que também parece aumentar a formação de
ROS, poderia intensificar a atividade de ambos fatores. Estudos recentes apontam para possível utilização do CoCl2
no tratamento de leucemias, porém seus efeitos em células leucêmicas ainda não foram elucidados. Assim, os
objetivos deste estudo foram investigar os efeitos da hipóxia mimetizada por CoCl2 na proliferação ou morte de
linhagens celulares leucêmicas, considerando as conseqüências sobre o ciclo celular; e investigar o papel do NF-κB
na mimetização de hipóxia e na relação entre hipóxia e geração de ROS. Três linhagens celulares leucêmicas foram
utilizadas: K562, derivada de leucemia mieloblástica crônica, U937, derivada de leucemia mieloblástica aguda, e
Jurkat, derivada de leucemia linfocítica aguda. As células foram tratadas com CoCl2 em concentrações crescentes
(10 μM a 500 μM) e diferentes tempos (12h, 24h e 48h). Avaliou-se a morte celular e apoptose através de marcação
com PI e Yopro-1. O ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo, e a geração de ROS por fluorimetria. A
atividade de ligação ao DNA do NF-κB foi investigada por EMSA. Verificamos que a mimetização de hipóxia
por CoCl2 inibe o crescimento celular e promove bloqueio do ciclo celular na transição G2/M nas três linhagens
celulares, mas desencadeia apoptose apenas nas linhagens U937 e Jurkat. Concomitantemente, a hipóxia por CoCl2
gera ROS nas três linhagens, confirmando a relação entre estresse oxidativo e hipóxia. Finalmente, a mimetização
de hipóxia aumenta a ligação do NF-κB ao DNA, evidenciando a participação desse fator transcricional nas
respostas celulares verificadas. Sugerimos que o NF-κB poderia atuar conjuntamente com o HIF-1 na modulação
da expressão gênica durante a hipóxia acarretando, direta ou indiretamente, bloqueio no ciclo celular em G2/M
em células leucêmicas.
Apoio financeiro: CAPES e FAPERGS
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303
Estudo de expressão gênica entre os sexos e suas
implicações na busca por genes candidatos para as
fissuras lábio-palatinas não-sindrômicas
Kobayashi, GS; Sunaga, DY; Bueno, DF; Aguena, M; Passos-Bueno, MR
Laboratório de Estudo de Genes do Desenvolvimento
Instituto de Biociências – USP
[email protected]
[email protected]
Palavras-chave: fissura lábio-palatina, expressão gênica, células-tronco mesenquimais, sexo, genes candidatos
As fissuras lábio-palatinas não-sindrômicas (FLP/NS) são uma das malformações congênitas mais comuns. É
considerada uma doença de etiologia multifatorial, tendo influência de vários loci e fatores ambientais, sendo
duas vezes mais prevalente no sexo masculino em relação ao feminino. As FLP/NS podem ser originadas em
decorrência de distúrbios de migração, proliferação, diferenciação celular e/ou apoptose durante o desenvolvimento
embrionário. Há um esforço mundial na tentativa de se identificar genes de predisposição e compreender a sua
etiologia e patogenia, porém, o entendimento desta doença continua relativamente pobre. Considerando-se que as
células-tronco mesenquimais (CTMs) correspondem a um tipo celular mais indiferenciado e de fácil obtenção, e
as mais próximas às células presentes no embrião, um dos objetivos de nosso grupo é identificar genes associados
às FLP/NS por meio da comparação entre os perfis de expressão gênica de CTMs de indivíduos portadores de
FLP/NS e controles. Porém, para tanto, é necessário averiguar se o sexo interfere no perfil de expressão gênica.
Atualmente tem-se relevado a importância da arquitetura genética e regulação gênica sexo-específica, e seu efeito
no fenótipo. Discute-se que estudos que ignoram estes fatores poderiam falhar em identificar uma proporção
significativa de genes de risco para doenças complexas (Ober et al., Nature Reviews Genetics 9, 2008). Portanto,
com o objetivo de verificar se o sexo interfere no perfil de expressão gênica e na análise de identificação dos genes
candidatos às FLP/NS, foram estabelecidas 12 culturas de CTMs de polpa dentária de crianças normais (6 meninos
e 6 meninas), segundo protocolo previamente estabelecido (Costa&Bueno et al., 2008). O RNA total foi extraído com
o kit NucleoSpinII (MACHEREY-NAGEL) e hibridado em chips Human Gene 1.0 ST de microarray da Affymetrix. Os
dados foram normalizados com o método Robust Multi-Array Average (RMA). Os genes diferencialmente expressos
(GDEs) foram selecionados por 2 métodos distintos: Limma e RankProd, ambos com p-valor < 0.05 ajustados por
False Discovery Rate (FDR). Foram identificados 1270 GDEs com o Limma e 103 GDEs com o RankProd, sendo 29
GDEs comuns entre os dois resultados. A análise funcional com os programas Ingenuity Pathway Analysis (http://
www.ingenuity.com/) e DAVID Bioinformatics Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) indicou o envolvimento
destes genes com funções de resposta imune, regulação transcricional, e espermatogênese. Ainda com o Ingenuity
foi possível identificar uma via de sinalização relacionada ao sistema imune e desenvolvimento embrionário
contendo 13 genes up-regulated no sexo masculino. Além disso, 19 dos 29 GDEs se localizam em autossomos,
indicando uma variação natural não só inerente aos cromossomos sexuais. Uma vez mais estudados e validados
com outras metodologias, esses dados auxiliarão na interpretação do perfil de expressão observado em indivíduos
com FLP/NS e controles, e poderão ser importantes para outros grupos utilizando CTMs como ferramenta de
estudo.
Apoio: CEPID/FAPESP, CNPq
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304
Identificação de um elemento regulatório intrônico
capaz de ativar a expressão gênica induzida por
estímulo mecânico através de MEF2 em cardiomiócitos
Judice, CC1; Cardoso, AC1; Deckmann, AC1; Clemente, CFMZ1; Xavier-Neto, J2; Pereira, GAG3; Franchini,
KG1
1- Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas. Campinas, SP. 2Universidade de São Paulo. São Paulo, SP. 3- Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas. Campinas, SP.
[email protected]
Palavras-chave: expressão gênica, MEF2, hipertrofia cardíaca, microrna, Pln
Os fatores de transcrição MEF2 têm sido descritos como mediadores da hipertrofia patológica do ventrículo esquerdo
do coração, porém ainda é limitado o conhecimento de seus genes alvos. Neste estudo buscou-se identificar novos
genes regulados por MEF2 em células do miocárdio. Inicialmente, foi confirmada a observação prévia de que MEF2
é ativado no ventrículo esquerdo de rato submetido à sobrecarga pressórica aguda (induzida por coartação da
aorta durante 1h). Em seguida, ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) foram realizados com anticorpo
anti-MEF2 e extratos nucleares, permitindo a identificação de uma seqüência de DNA de 182pb localizada no
intron 1 do gene phospholamban (Pln), denominada pln-i1. Nessa região foi encontrado um sítio de ligação para o
fator MEF2, conservado em humano, rato, camundongo e cão. Ensaios de gel shift mostraram que a sonda pln-i1
interage preferencialmente a proteínas de extrato nuclear de animais submetidos à sobrecarga pressórica em
relação ao controle. Esta interação foi reduzida quando se empregou sonda pln-i1 mutada no sítio de MEF2. O
papel regulatório de pln-i1 foi explorado através de sua inserção nos plasmídios ptk-LUC e ptk-EGFP, portadores
dos genes repórter luciferase e GFP, respectivamente. Ensaios de transfecção destes plasmídios e seus mutantes
para MEF2 foram realizados em cardiomiócitos de ratos neonatos submetidos a estímulo mecânico (estiramento
cíclico). Os dados demonstraram que o estiramento aumenta a expressão do gene repórter e que o sítio de MEF2 é
suficiente para controlar a expressão gênica nas condições basal e de estiramento. Ensaios de ChIP para repressores
de MEF2 mostraram que HDAC5, mas não HDAC4, também está associado a pln-i1, porém a interação ocorre mais
fortemente em amostras controle e não naquelas submetidas à sobrecarga. Na tentativa de compreender melhor
o papel regulatório de pln-i1, foi feita uma análise do intron 1 para buscas de possíveis microRNAs. Análises no
banco de dados miRBase indicaram a predição de um microRNA dentro do intron e situado a 750pb de pln-i1. O
silenciamento de MEF2 (>80%) em cardiomiócitos resultou em queda na expressão deste microRNA, avaliada por
PCR em tempo real, em relação ao controle (células tratadas com siRNAGFP). Estes resultados indicam que a região
intrônica pln-i1 atua como um enhancer e poderia influenciar a regulação da expressão gênica em resposta ao
estresse mecânico através dos fatores de transcrição MEF2, em especial em relação aos possíveis genes alvos do
microRNA identificado.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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305
Analysis in silico of transcription factors associated to
differentially expressed genes in glioblastoma cell lines
treated with cisplatin
Donaires, FSa; Mello, SSa,b; Sakamoto Hojo, ETa,c
Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto – USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil;
Institute of Biomedical Sciences – USP, São Paulo, SP (current address); cDepartment of Biology, Faculty of Philosophy, Sciences and
Letters – USP, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
[email protected]
a
b
Keywords: bioinformatics, cDNA microarray, hierarchical clustering, transcription factors, glioblastoma.
Genome-wide approaches require bioinformatics tools to analyze the large amount of data set produced in
DNA microarray experiments. Our purpose was to study cis-regulatory regions and identify transcription
factors associated to significant modulated genes in glioblastoma (GBM) under condition of cell treatment
with antitumoral agents. The data set analyzed in silico was obtained in experiments performed by our group,
in addition to some other data set available in a public database (ArrayExpress). As a first step, we applied the
hierarchical clustering method to the normalized microarray data; the most relevant clusters related to treatment
response (i.e. apoptosis mechanism, cell cycle control and DNA repair) were chosen and the genes in each cluster
were identified; biological functions were also studied, based on the literature data. After defining the biological
processes associated to each gene cluster, a third step consisted in identifying cis-regulatory regions, following the
establishment of their association with the significantly induced/or repressed genes (as indicated in the microarray
experiments). Transcription factors (TFs) such as HEB, TCF-4, TFIIA, FOX, MEF-2 and Nkx2-5 were associated to
the clusters. Many of these TFs were previously associated to different types of tumors in the literature. The results
presented here may provide useful information to understand the molecular mechanisms involved in cell response
to anticancer agents, aiming, as a last resort, to provide a direct contribution for the reformulation of more effective
therapeutic strategies. Thus, the TFs indicated in the present study can be tested for the development of more
efficient treatments based on molecular targets.
Financial support: FAPESP
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306
Identificação do Promotor basal do gene da Miostatina
comum a amniotos
Grade, CVC1; Dietrich, S2; Salerno, MS3; Alvares, LE1
Departamento de Histologia e Embriologia – Universidade Estadual de Campinas
Department of Craniofacial Development – King´s College London
3
Animal Genomics – AgReserch – Ruakura Research Centre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Miostatina, promotor, regulação gênica.
A Miostatina é um regulador negativo da deposição de massa muscular esquelética e mutações no gene que
codifica essa proteína são responsáveis pelos fenótipos de musculatura dupla observados em diversas espécies
animais, resultados de uma hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares. A estrutura e a função desta proteína
são conservadas em diversas espécies, incluindo humanos, onde os níveis de Miostatina circulante no sangue se
encontram aumentados durante condições de distrofia e na caquexia que acompanha alguns tipos de câncer e a
AIDS. Com o intuito de melhor entender os mecanismos que coordenam a regulação da Miostatina, realizamos
um alinhamento genômico da região upstream a região codificadora entre humano, camundongo e galinha e
identificamos uma região evolutivamente conservada contendo 260 pb. Devido à sua posição e alta identidade
de seqüência, a região provavelmente possui um papel funcional como promotor basal do gene da Miostatina,
comum aos organismos amniotos. Para melhor entender o papel desse segmento de DNA, realizamos uma busca
por sítios de ligação para fatores transcricionais conservados e observamos a presença de um sítio TATA, que
reforça a hipótese de que essa região corresponde ao promotor basal do gene da Miostatina. Além deste sítio, foram
encontrados ainda sítios conservados para a ligação dos fatores Meis1, FXR, NF-Y e para os membros da família
CREB. Estes últimos sugerem que uma via de sinalização mediada por cAMP possa estar envolvida na regulação
do gene da Miostatina. A funcionalidade do promotor basal foi comprovada in vitro, através da transfecção de uma
construção contendo a respectiva seqüência de camundongo upstream ao gene repórter da luciferase em células
C2C12. Esse ensaio mostrou que o promotor basal é capaz de dirigir a atividade do gene repórter. Em seguida,
foram realizados ensaios de eletroporação in ovo de embriões de galinha, usando uma construção contendo o
segmento do promotor basal de galinha upstream ao gene repórter eGFP. As análises de fluorescência provenientes
desse experimento mostraram que o promotor basal do gene da Miostatina não só é capaz de dirigir a transcrição,
como também confere especificidade espacial ao gene repórter, sendo capaz de ativar sua transcrição apenas no
domínio hipaxial dos somitos. Este achado está de acordo com o padrão de expressão observado para a Miostatina.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq, FAEPEX, CAPES.
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307
A expressão de proteínas relacionadas ao Receptor
de Células B Potencialmete influencia os Níveis de
Genes Relacionados com Proliferação e Apoptose na
Leucemia Linfocítica Crônica
Careta, FP; Panepucci, RA; Matos, DM; Araujo, FS; Proto-Siqueira, R; Araujo, AG; Silva-Júnior, RP; Falcao,
RP; Zago, MA.
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Expressão Gênica, Expressão Protéica, Sinalização Celular, Marcador de Prognóstico, Leucemia Linfocítica Crônica
O aumento da expressão de ZAP70 e a ausência de mutações na cadeia pesada da imunoglobulina (IgVH) são
marcadores de mau prognóstico na Leucemia Linfocítica Crônica de células B (LLC). Esses componentes estão
relacionados com a via de sinalização do Receptor de Células B (RCB) e influenciam na proliferação e sobrevivência
dos linfócitos B leucêmicos, estabelecendo uma ligação funcional entre esses marcadores e a biologia dos grupos
de prognóstico na LLC. OBJETIVO: Identificar novos mecanismos moleculares relacionados aos diferentes
prognósticos da LLC. MATERIAL E MÉTODOS: Linfócitos B de 3 pacientes com mutações em IgVH e de 3 pacientes
sem essas mutações foram separados imunomagneticamente e o transcriptoma foi analisado por SAGE (Serial
Analysis of Gene Expression). A porcentagem de células ZAP70+ e CD72+ foi avaliada por citometria de fluxo em
células CD19+CD5+ de 24 pacientes. Os casos positivos (+) para ZAP70 e CD72 foram definidos usando um cut-off
de 30 e 40%, respectivamente. PCR em Tempo Real foi usado para quantificar a expressão dos genes AKT, RELB
e Beta-Catenina (CTNNB) em 15 amostras de LLC enriquecidas (pureza de linfócitos B>90%). RESULTADOS: A
análise do SAGE revelou que as amostras não mutadas possuem aumento significativo de expressão de CD72, uma
glicoproteína que está envolvida com a sinalização do RCB. Em acordo, a citometria de fluxo demonstrou que a
porcentagem de células que expressam CD72 é maior nos casos ZAP70+ quando comparado com ZAP70- (mediana
de 82% e 39%, respectivamente, p=0,0029). Além disso, a expressão protéica de CD72 e ZAP70 foi correlacionada
positivamente (r=0.5930 e p=0.0009). Todas as amostras classificadas como ZAP70+ (n=11) também foram CD72+,
enquanto que seis amostras ZAP70- foram CD72+ e sete ZAP70- foram CD72-. Nenhuma diferença de parâmetros
laboratoriais foi observada entre esses 3 grupos (glóbulos brancos, porcentagem de linfóciots, hemoglobina,
hematócrito e número de plaquetas). No entanto, os níveis dos transcritos RELB, CTNNB e AKT, todos relacionados
com sobrevivência e proliferação na via do RCB, foram significantemente mais expressos nos casos ZAP70+CD72+
(n=7), quando comparados com ZAP70-CD72+ (n=4). Interessantemente, CTNNB e AKT foram mais expressos
nos casos ZAP70-CD72- (n=4) quando comparados com ZAP70-CD72+. CONCLUSÃO: Nós mostramos que a
expressão de CD72 e ZAP70 é correlacionada e que CD72 pode ser um futuro candidato a marcador de prognóstico
na LLC, além de ter um papel potencial na sinalização do RCB. Ainda, os altos níveis dos genes analisados no
grupo ZAP70-CD72-, comparados ao ZAP70-CD72+, indicam que na ausência de ZAP70, CD72 pode atuar como
regulador negativo do RCB. Finalmente, altos níveis desses transcritos em ZAP70+CD72+, comparados ao ZAP70CD72+, corroboram ao modelo proposto de ZAP70 na proliferação e sobrevivência na via de sinalização doRCB.
Esse trabalho foi Órgãos Financiadores: FAPESP, CNPq e FINEP
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308
Avaliação da expressão gênica diferencial entre
pacientes com pênfigo foliáceo e controles através de
microarranjos de oligonucleotídeos e RT-PCR
Malheiros, D1; Panepucci, RA2; Roselino, AM3; Araújo, AG2; Zago, MA2; Petzl-Erler, ML1
Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética – UFPR. 2Laboratório de Hematologia – FMRP/USP. 3Divisão de
Dermatologia – FMRP/USP.
[email protected]
1
Palavras-chave: pênfigo, microarranjos, expressão gênica diferencial, PCR em tempo real
O pênfigo foliáceo (PF), endêmico no Brasil, é uma doença autoimune complexa caracterizada por bolhas
intraepidérmicas e pela presença de anticorpos contra a desmogleína 1, resultando na perda de adesão entre
os queratinócitos. Com o objetivo de identificar alterações moleculares que contribuem para a patogenia da
doença ou que resultam dessa, utilizou-se a tecnologia de microarranjos, com 55.000 sondas representativas
do genoma humano total para verificar o perfil de expressão gênica diferencial entre linfócitos T CD4+ isolados
imunomagnéticamente do sangue periférico de pacientes e controles. Biópsias de pele de tecido lesado e nãolesado também foram utilizadas para a avaliação da expressão. Quinze genes diferencialmente expressos foram
selecionados para validação dos resultados, utilizando-se PCR em tempo real (RT-PCR). Os perfis obtidos dos
pacientes com a forma generalizada do PF e sem tratamento imunossupressor foram comparados com os
linfócitos de: indivíduos controles, pacientes com a forma generalizada, porém sob tratamento, e pacientes com a
forma localizada da doença. Estas três comparações resultaram em 135, 55 e 65 genes diferencialmente expressos,
respectivamente. Destes, 122, 14 e 49 estavam induzidos, enquanto o restante, inibido. Adicionalmente, os perfis
obtidos de pacientes com PF e com pênfigo vulgar foram comparados com os controles. Aproximadamente 30% dos
genes diferencialmente expressos em relação aos controles foram compartilhados por essas duas formas de pênfigo.
Os genes identificados como diferencialmente expressos em todas as comparações são relacionados com adesão e
migração de linfócitos (por exemplo, CX3CR1, CD9, CD33, RAC1, GCA e FCGR1A), apresentação de antígenos (entre
os quais HLA-DMA, HLA-DMB e CD1D), e apoptose e proliferação celular (incluindo TNFSF9, TNFSF10, TNFSF13B,
RAB31, IFI3, CDA, BCL2A1). A análise por RT-PCR revelou que, com exceção de dois genes, todos os demais
avaliados apresentaram diferenças de expressão estatisticamente significantes (no entanto, mesmo para estes
genes, foi verificada uma tendência na mesma direção à encontrada nos microarranjos). A região cromossômica
19q13 contém o maior número de genes diferencialmente expressos e pode ser considerada uma região candidata
a conter genes de susceptibilidade ao PF. Nesta, estão representados genes que compartilham expressão entre
células T CD4+ e células NK e TNK, implicando o papel destas células na doença, o que não havia sido sugerido até o
momento. Nas biópsias de pele de tecido lesado e não-lesado de pacientes, os genes diferencialmente expressos são
característicos do envolvimento de células T reguladoras, indicando que estas células podem atuar no controle da
doença. Estes resultados contribuem para a compreensão da patogenia molecular subjacente ao desenvolvimento
do PF, apontam genes que participam do curso e agravamento da doença e também para possíveis alvos para
terapias mais específicas.
Apoio Financeiro: CNPq, Fundação Araucária.
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309
Transcriptome analysis in stem cells of a patient
with Auriculo Condylar Syndrome (ACS1) during
Condrogenesis
Tavares, VLR1; Sunaga, DY1; Bueno, DF1; Passos-Bueno, MR1
1
Laboratório de Genes do Desenvolvimento Humano – Instituto de Biociências - USP
Keywords: auriculo condylar syndrome, chondrogenesis, expression microarray, craniofacial syndrome, transcriptome analysis
Auriculo condylar syndrome (ACS) is an autosomal dominant disorder characterized by auricular malformations
giving a question mark appearance to the ear, jaw malformations, abnormal temporomandibular joint and
mandibular condyle hypoplasia. We mapped a first ACS locus to 1p21.1-q23.3 (ACS1), which encompasses 63 Mb
and at least 950 genes. Considering the large candidate region and the lack of additional families, we are proposing
a new approach to identify this mutation which involves transcriptome analysis in stem cells of a patient with ACS1
during chondrogenesis. We obtained primary lineages of mesenchymal stem cells from Orbicular Oris muscle of an
ACS1 patient and a control. Through flow citometry, we observed that the cells were positive for 5 mesenchymal
cell markers and negative for hematopoietic and endothelial markers. We induced ACS1 and control cells to in vitro
chondrogenesis and extracted mRNA at 0, 4, 9 and 21 days during this differentiation process, which were used in
expression microarray assays with Affymetrix GeneChip® Human Gene 1.0 ST Array. We compared the expression
profiles of affected and control mRNAs during the differentiation process. The data were normalized with the
Robust Multi-Array Average (RMA) method implemented in BioConductor analysis package. We obtained the
differentially expressed genes (DEGs) using Limma and RankProd (considered p-value < 0.05) and we considered
only the DEGs common in both analysis. We found a total of 473 DEGs present. Of these, only 15 DEGs are located
in the candidate region for ACS1. Among these genes, it is included Cathepsin K (CTSK), which is mutated in
pycnodysostosis, an autosomal recessive disease mainly characterized by osteogenesis alteration, suggesting that
we can detect candidate genes for mendelian disorders with bone/chondrogenesis metabolism alteration through
this approach. Moreover two other interesting transcripts were identified: one related to osteoblast differentiation
and the other with vascularization. We thus considered these two genes as potential candidates for ACS1 and we
are currently sequencing them to evaluate if one of them carry a pathogenic mutation in ACS1 patients.
CEPID/FAPESP, CAPES, CNPq
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310
Expressão do antígeno Ki67 e da proteína caspase-3
em lesões benignas e carcinoma esofágico e
associação com a expressão alterada da proteína p53
Bellini, MF1; Mataruco, MM1; Cury, PM2; Silva, AE1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de São
José do Rio Preto, SP;
2
Laboratório de Colorações Especiais e Imuno-histoquímica, Setor de Patologia, Hospital de Base- FAMERP- Faculdade de Medicina de
São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: CPP32, Ki67, megaesôfago chagásico, esofagite crônica, carcinoma esofágico.
O desbalanço entre proliferação e morte celular é um dos fatores chave da tumorigênese. A desregulação desses
mecanismos fisiológicos, devido uma taxa de proliferação celular aumentada não contra-balanceada com morte
celular pode levar ao acúmulo de células alteradas, assim contribuindo para o desenvolvimento de hiperplasia e
câncer. A proteína p53 desempenha papel importante na regulação do ciclo celular atuando na ativação da apoptose
e mecanismos de reparo do DNA, portanto a perda de função dessa proteína pode promover um desequilíbrio
da homeostase celular, fornecendo forte vantagem no crescimento de células tumorais. Em carcinoma esofágico,
alterações na expressão do antígeno de proliferação celular Ki67 e da proteína caspase-3 (CPP32) ativada durante
o processo de apoptose, têm sido utilizadas como marcadores de prognóstico. A carcinogênese do esôfago segue
o modelo de progressão de múltiplas etapas com a participação de lesões benignas como a esofagite crônica e o
megaesôfago chagásico em conseqüência da doença de Chagas. Portanto, o presente estudo teve por objetivos
avaliar a ocorrência de alterações nos níveis de proliferação celular e apoptose em lesões benignas esofágicas
em comparação com o carcinoma esofágico e estabelecer associações com a expressão da proteína p53. Ensaios
de immuno-histoquímica foram realizados para o antígeno Ki67 e proteínas CPP32 e p53 em mucosa esofágica
de pacientes com Doença de Chagas sem (CD) e com megaesôfago (CM), esofagite crônica (CE) e carcinoma de
células escamosas de esôfago (ESCC) em comparação com mucosa histologicamente normal (NM). O índice de
marcação de Ki67 foi similar nos grupos NM (30,1%) e CD (30,9%) e mais elevado nos grupos CM (42,3%); CE
(44,6%) e ESCC (48,4%), apesar de não serem observadas diferenças significantes. Cem porcento dos casos dos
grupos NM, CD, CE e ESCC foram classificados como Ki67 positivos, pois apresentaram imuno-positividade maior
que 10%, enquanto que no grupo CM 91,3% dos casos eram Ki67 positivos. A frequência de positividade de CPP32
foi similar nos grupos CD (30,8%), CM (30,4%) e CE (34,8%), mas aumentada em ESCC (55,5%), embora também
sem diferenças significantes. Quanto à expressão da proteína p53, pode ser constatado um aumento crescente de
casos p53 positivos a partir do grupo CD (7,7%), CM (26,1%), CE (52,2%) e ESCC (100%), sendo estas freqüências
estatisticamente diferentes. Dessa forma evidenciando alterações na expressão desta proteína deste as etapas
iniciais da carcinogênese do esôfago, progressivamente conforme a severidade das lesões. Entretanto, não foram
observadas associações entre os níveis de Ki67, CPP32 e expressão da proteína p53 nos diferentes grupos avaliados.
Portanto, não há evidências de alterações significantes nos níveis de proliferação celular e apoptose nas lesões
benignas do esôfago estudadas, que possam conferir maior risco de malignidade.
Apoio financeiro: Auxílio FAPESP e Bolsa CNPq
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Analysis of transcription factor binding sites affecting
DARPP-32 promoter activity in striatal cell lines
expressing the amino-terminus of mutant huntingtin
Alves-Costa, FA1,2; Hogel, MI1; Sears, A1; Denovan-Wright, EM 1
Dalhousie University, Department of Pharmacology, Laboratory of Molecular Neurobiology, Halifax, Nova Scotia, Canada, B3H 1X5,
[email protected]; 2 UNESP, Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia. Botucatu, São Paulo, Brasil, fa_alves2003@yahoo.
com.br
1
Keywords: Huntington’s disease, DARPP-32 promoter, PCR linker-scanning, dual luciferase assay
Huntington’s disease (HD) is an autosomal, dominant neurodegenerative disorder caused by the inheritance
of a single copy of the huntingtin gene with a trinucleotide CAG repeat expansion within exon 1. It has been
hypothesized that the amino terminal of mutant huntingtin (N-mHtt) accumulates in the nucleus and interacts with
transcription factors, co-activators and components of the basal transcription machinery to repress transcription.
One of the earliest cellular changes observed in HD is that transcription of a subset of genes is decreased in a
cell-specific manner. Previously, we demonstrated that N-mHtt decreases transcription from the dopamine- and
cyclic AMP- regulated phosphoprotein (DARPP-32) promoter. The goal of this study was to determine whether
deletion of transcription factor binding sites would alleviate N-mHtt-dependent transcriptional repression of the
DARPP-32 gene. To achieve this goal, seven regions associated with transcription factor recognition elements of the
DARPP-32 promoter were replaced by PCR linker-scanning mutagenesis. Mutated DARPP-32 promoter constructs
were transfected into striatal cell lines derived from rat that express no human huntingtin (ST14A), or express
N-terminal human huntingtin with a normal (N548wt) or a pathological number of CAG repeats (N548hd). The
activity of non-mutated and mutated DARPP-32 promoters in each cell type was obtained using a dual luciferase
assay. Replacement of one region containing the recognition sequences for neuron-restrictive silencing factor, E2F
cell cycle regulator and transcription factor IIB with a linker-sequence resulted in decreased activity compared
to the non-mutated DARPP-32 promoter in N548WT and N548HD cell lines suggesting that N-mHtt interacts
with a protein that binds this promoter region and that polyglutamine expansion inversely relates to promoter
activity. Deletion of this region did not affect DARPP-32 promoter activity in ST14A cells demonstrating that this
recognition element does not contribute to transcriptional regulation in the absence of N-mHtt. In future, we will
determine whether N-mHtt is physically associated with this promoter region and whether over expression of
proteins that could interact with this sequence would alleviate the repressive effect of N-mHtt. This work will
contribute to our understanding of general mechanisms of transcription and neuron-specific gene regulation.
Financial support: Canadian Institute of Health Research (CIHR)
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312
Quantitative expression analysis of HOX members
of homeobox genes family in oral squamous cell
carcinoma cell lines
Destro, MFSS1; Rodini, CO1; Rodrigues, RV2; Head and Neck Genome Project/GENCAPO3; Tajara, EH4;
Okamoto, OK5; Nunes, FD1
Laboratório de Patologia Molecular da Disciplina de Patologia Bucal, Departamento de Estomatologia, Faculdade de Odontologia da
USP – FOUSP, São Paulo, Brasil
2
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências da USP - IB/USP, São Paulo, Brasil
3
Lista completa de autores no endereço http://ctc.fmrp.usp.br/ClinicalGenomics/cp/
4
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP, São Paulo, Brasil
5
Disciplina de Neurologia Experimental, Departamento de Neurologia/Neurocirurgia, UNIFESP, São Paulo, Brasil
1
Keywords: carcinoma epidermóide oral, genes homeobox, família HOX, QPCR, linhagens celulares
Homeobox genes are responsible for the codification of nuclear proteins that act as transcription factors during
embrionary development. Although these genes are classically associated to the control of proliferation and
differentiation events necessary for cellular and tissue morphogenesis, recent studies have shown their participation
in biological events important to eukaryotic adult cell in normal conditions as well as in oncogenesis. Among these
genes, HOX members of homeobox genes family are involved in crucial cellular processes as cell cycle control,
differentiation and apoptosis. The expression of HOX genes has already been related to the development of many
types of neoplasms, including breast, ovary, prostate, kidney, lung, skin, leukemia and, more recently, oral cancer.
Oral squamous cell carcinoma is a malignant and aggressive epithelial neoplasm frequently associated with poor
prognosis and low survival rate. Currently, molecular studies are being conducted in order to characterize the
several biological events involved in the carcinogenesis processes, and also being directed to the search of specific
molecular markers that may result in important contribution to diagnosis, prognosis and therapy of the disease.
In view of this, the presence study aimed to analyze by quantitative real time PCR (qPCR) the expression profile
of HOXC9, HOXC13, HOXD10 and HOXD11 genes in oral squamous cell carcinoma cell lines (SCC4, SCC9, SCC15 e
SCC15). Relative quantification of gene expression was performed according to Pfaffl method, using SYBR Green
fluorescence and the normalization factor generated by Genorm algorithm using the expression of four reference
genes (ACTB, GAPDH, TUBA1B and HPRT) and HaCat (normal immortalized keratinocyte) cell line as calibrator
sample. The criteria for the definition of cut off values to identify differentially expressed genes among cell lineages
was based of expression ratio, considering 2- fold change (ratio ≥2 or ≤ 0,5). HOXC9 gene was overexpressed in
SCC9, 15 e 25 cell lines, while HOXD10 gene was presented higher expression levels in SCC25. On the other hand,
HOXC13 gene was underexpressed in SCC4, 9 and 15 cell lines, while HOXD11 gene presented low expression levels
in SCC9. This results suggest that the altered expression of some HOX genes family members may be associated to
the development and/or progression of oral squamous cell carcinoma.
Support: FAPESP
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313
transcriptional gene network regulation and
transcription factors in the control of cell fate of
human mesenchymal stem cells to normal osteogenic
differentiation or carcinogenesis
Evangelista, AF1,2; Fontana, V1,2; Dernowsek, JA1,2; Junta, CM2; Marques, MMC1,2; de Souza Bernardes, LA2;
Simões, BP3; Bombonatto-Prado, KF1; Oliveira, PT1; Rosa, AL1; Sakamoto-Hojo, ET2; Guiliatti, S2; Passos,
GAS1,2
1-Department of Morphology, Faculty of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP)
2-Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, (USP)
3-Bone Marrow Transplantation Unit, University Hospital, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, (USP)
[email protected] and [email protected]
Keywords: mesenchymal stem cells, osteogenic differentiation, carcinogenesis, microarrays, gene networks, transcription factors
There are evidences that stem cells can originate cancer, with involvement of self-renewal pathways and an abnormal
differentiation process. A large number of groups have isolated and characterized stem-like cells from tumors.
Considering this presumption, our aim was to construct a temporal model-system for transcriptional analysis
of genes involved with carcinogenesis during in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells (MSC) in
osteoblasts. The MSC were collected from the umbilical cord or from the bone marrow of adult healthy donors
who were operated for bone marrow transplantation purposes (according to their signed consent and local Ethical
Committee approval), and cultured in α-MEM medium with 20% and 10% FBS, respectively. The differentiation
medium containing B-glycerolphosphate, dexamethazone and ascorbic acid and culture was performed for 24
h, 48 h and 7 days. Total RNA was prepared from undifferentiated and differentiated MSCs. The Cy3/Cy5 cDNA
probes generated from total RNA were hybridized with a cDNA microarray containing 4,500 target sequences.
The normalized data were analyzed using the Cluster-Tree-View program (cutoff 80%, Pearson correlation). We
found 136 genes involved with cancer and osteogenic differentiation in common between umbilical cord and bone
marrow MSCs. To evaluate the possible interactions in cascade between these genes (mRNA transcripts), the
GeneNetwork software was used to reconstructing networks using gene expression values from actual microarray
data. We observed a connection core of 30 gene nodes, including: (1) extracellular matrix, BGLAP and COL1A2; (2)
adhesion focal system, ALCAM, NRCAM and FN1; (3) AKT signalization, PI3KR1 and PI3KR3; (4) HRAS oncogene
and tumor suppressor TP53; (5) MINA target of c-MYC oncogene; (6) cell cycle regulators, CDK6 and PRKDC; and
(7) genes involved with cellular migration, as for example SPRY2. To confirm the significance of the interactions
obtained, we performed a search for transcription factors binding motifs in the upstream sequences of the gene
nodes using MEME software. We found structural possibility for transcription factors SP1 and MAZ regulate most
of the genes involved with osteogenesis and cancer processes. These results strongly suggest that MSCs have a suit
transcriptional regulation controlling cell fate to normal differentiation or cancer.
Financial Support: CNPQ/MS/MCT, CAPES and FAPESP.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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314
Avaliação da expressão dos genes KRT6A, KRT19,
MSLN e KLK8 por RT-PCR quantitativa em tempo real
em linhagens celulares de cabeça e pescoço
Souza, CF1; Carregaro, F1; Sandoval, FTB1; Rodrigues, RV1; Klingbeil, MFG; Mathor, MB; Tajara, EH1
Laboratório de Marcadores Moleculares e Bioinformática Médica (LMMBM) – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.
[email protected]
1
Palavras-chave: linhagens celulares, RT-PCR quantitativa em tempo real, queratina 6A, mesotelina, calicreína 8
Os carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço (CECP) são doenças heterogêneas que resultam do acúmulo de
mutações somáticas em genes relacionados com proliferação e morte celular, levando a um fenótipo maligno. Os
CECPs são clinicamente importantes devido à sua incidência e também por causa da morbidade e de suas altas
taxas de mortalidade. Em função disso, o entendimento das vias moleculares envolvidas em iniciação e progressão
desses tumores não é somente importante para o conhecimento da biologia dos CECPs, mas também para o
desenvolvimento de abordagens preventivas e terapêuticas mais eficazes. No presente trabalho, foi investigado
pela técnica de qPCR em tempo real o padrão de expressão dos genes de queratinas (KRT6A, KRT19), mesotelina
(MSLN) e calicreína (KLK8), em quatro linhagens de células epiteliais neoplásicas, Hep-2, FaDu, UM-SCC-38, SCC9, originalmente descritas como procedentes de tumores de laringe, orofaringe, tonsila pilar e língua. As reações
de qPCR utilizaram o sistema TaqMan e três genes normalizadores (ACTB, GAPDH, HPRT1) selecionados pelo
programa GeNorm. Esses genes, que foram previamente identificados como tendo expressão diferencial a partir
de bibliotecas SAGE de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, estão relacionados com citoesqueleto e
processos de diferenciação (KRT6A, KRT19), proliferação celular (KLK8), adesão (MSLN) e proliferação celular
independente de ancoragem (MSLN). Os resultados obtidos mostraram redução dos níveis das queratinas e da
calicreína nas linhagens celulares estudadas em relação a queratinócitos normais derivados de mucosa bucal. O
gene MSLN, ao contrário, exibiu aumento de expressão nas células Hep-2 e FaDu e diminuição em UM-SCC-38. Esses
achados sugerem que as linhagens estudadas apresentam alteração nos processos de diferenciação, proliferação e
adesão celular e nos componentes estruturais do citoesqueleto. Considerando que nem todas as funções dos genes
estudados são bem conhecidas, os dados obtidos no presente trabalho podem auxiliar futuros estudos funcionais
utilizando abordagens de indução/bloqueio de expressão.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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315
Hiperexpressão de genes associados ao controle do
ciclo celular em linhagens de glioblastoma
Morales, AG1; Moreno, DA1; Cortez, MA1; Borges, KS1; Castro-Gamero, AM1; Queiroz, RGP2; Scrideli, CA2;
Tone, LG12.
Departamento de Genética, 2Departamento de Pediatria - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, SP,
Brasil. E-mail: [email protected]
1
Palavras-chave: expressão gênica, BUB, linhagem celular, glioblastoma, ciclo celular.
De acordo com Organização Mundial de Saúde os tumores do Sistema Nervoso Central podem ser classificados
em diferentes graus (de I a IV) dependendo da agressividade. O glioblastoma (glioma de grau IV) é o tumor mais
freqüente nos adultos e a sobrevida média é inferior a 1 ano. O mau prognóstico dos pacientes é, em grande parte,
devido à característica invasiva, radioresistência e quimioresistência do tumor. Diversos estudos têm procurado
identificar novos alvos terapêuticos para tratamento do câncer, e os genes da família BUB (budding uninhibited
by benzimidazolet) são considerados importantes candidatos, devido ao seu papel no ciclo celular. Estes genes
participam do ponto de checagem do fuso mitótico, prevenindo a separação prematura das cromátides irmãs. A
expressão alterada destes genes tem sido relacionada à instabilidade genômica e ao desenvolvimento de diversos
tipos de tumores, demonstrando ser uma área promissora na pesquisa e tratamento do câncer. Os objetivos deste
trabalho foram analisar a expressão dos genes BUB e BUBR1, em quatro linhagens celulares de glioblastoma (SF188,
U87, U251 e U343) e comparar com sete amostras de substância branca extraídas de tecido não neoplásico. A
análise da expressão gênica foi realizada pela técnica de PCR em Tempo Real (qRT-PCR). Todos os genes estudados
apresentaram aumento da expressão nas linhagens comparando com amostras de substância branca. O gene
BUB1 mostrou uma expressão de 12.97, 25.31, 17.59 e 52.78 vezes mais nas linhagens SF188, U87, U251 e U343,
respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os genes relacionados ao ponto de checagem
do fuso mitótico podem representar futuros alvos terapêuticos no tratamento de glioblastoma.
Apoio Financeiro: Capes - Faepa
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FEZ family proteins involved in neuronal development
display a high degree of evolutionary conservation of
the structure and the protein interaction network
Alborghetti, MR1,2; Silva, JC1,3; Furlan, AS1,2; Torriani, ICL1,3; Kobarg, J1,2
Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CEBiME) and Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) – Associação Brasileira de
Tecnologia de Luz Síncrotron (ABTLuS).
2
Instituto de Biologia – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
3
Instituto de Física “Gleb Wataghin” – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
1
Keywords: fasciculation and elongation protein zeta 1 FEZ1, neuronal development, molecular evolutionary conservation, protein-protein
interaction, saxs
The FEZ ( fasciculation and elongation protein zeta) family designation was first purposed by Bloom and Horvitz
in 1997 by genetic analysis of C. elegans unc-76. The 376 and 385 amino acid forms of the UNC-76 protein showed
no strong similarity to any previously characterized proteins, but similar human sequences were identified in the
expressed sequence tag database as FEZ1 and FEZ2. The unc-76 function is necessary for normal fascicle structure
and is required specifically for axon-axon interactions in C. elegans. Indeed, the loss of UNC-76 function results in
defects in axonal transport. It is predicted that FEZ1 is involved in the axon guidance machinery in mammals by
interacting with PKCζ. It was demonstrated that FEZ1 is a cellular substrate of PKCζ and is translocated from the
plasma membrane to the cytoplasm by activation of PKCζ. The human FEZ1 protein has been shown to rescue
the defects caused by unc-76 mutations in nematodes, indicating that both UNC-76 and FEZ1 are evolutionarily
conserved on their functional and structural bases. Until today, little is known about FEZ2 protein function. The
mRNA of FEZ2 is ubiquitously in rat tissues meanwhile FEZ1 is almost exclusively expressed in the rat brain. Our
group has identified FEZ1 interactions with itself in two regions – in the C-terminal and in the N-terminal. The
C-terminal interaction is predicted through coiled-coil interactions, but the molecular basis of the N-terminal region
is only now being revealed. Both regions are conserved through the homologues. In this work we demonstrate nonand conserved evolutionary features of FEZ family, from structure to function. We were able to get purified samples
of a fragment of the FEZ1 protein (amino acids 92-194), which is probably the protein dimerization region. We also
performed reduction and native gel assays followed by Small Angle X-ray Scattering measurements. Our results
show that FEZ1 dimerizes via its N-terminal through a disulfide bond. The protein FEZ1 (92-194) presents only one
cysteine, in the position 133, that is involved in this interaction and is conserved among the homologues. Through
yeast two-hybrid system we were able to: (A) identify new protein-protein interactions (PPI) to UNC-76 (248-372),
FEZ1 (221-392) and FEZ2 (207-353), suggesting new functions for the FEZ family, (B) classify the FEZ family as a
hub family by the high number of PPI for UNC-76, FEZ1 and FEZ2, (C) get clues about evolutionary relationships
into the FEZ family by largely overlapping PPI patterns for FEZ1 and UNC-76 and extended PPI for FEZ2, (D)
provide explanation to the ability of FEZ1 to rescue the defects caused by unc-76 mutations in nematodes by the
same PPI pattern to FEZ1 and UNC-76.
Supported by: FAPESP, CNPq and ABTLuS
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317
Criação de um banco de DNA de indivíduos epilépticos
e não-epilépticos provenientes do estado de Alagoas
Almeida, DH1; Silva, LRP1; Gitaí, LLG3; Gameleira, FT3; Andrade, TG2; Machado, LCH4; Gitaí, DLG1.
Setor de Genética e Biologia Molecular, ICBS, UFAL, Maceió.
Setor de Genética e Biologia Molecular, UFAL, Arapiraca.
3
Setor de Neurologia, HUPAA, UFAL, Maceió.
4
Setor de Histologia e Embriologia, ICBS, UFAL, Maceió.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Epilepsia Mioclônica Juvenil, polimorfismos genéticos e GABRG2.
A epilepsia é uma desordem neurológica caracterizada pela presença de crises epilépticas recorrentes, que acomete
cerca de 1 a 2% da população mundial. As crises epilépticas são manifestações clínicas provocadas por distúrbios
na atividade eletrofisiológica do Sistema Nervoso Central. A determinação dos tipos de crises combinada a dados
clínicos, eletrofisiológicos e estruturais é utilizada para a definição do tipo de epilepsia ou síndrome epiléptica.
Por ser de natureza complexa e multifatorial, a epilepsia apresenta diferentes etiologias, no entanto, postula-se
que um limiar genético de susceptibilidade é essencial para o estabelecimento das crises. Assim, a identificação
de variantes alélicos associados a este limiar é fundamental para o entendimento dos mecanismos moleculares
envolvidos na predisposição ou proteção à epilepsia. Uma abordagem para este tipo de investigação baseia-se na
análise direta do material genético, através de estudos de associação. Neste contexto, com o objetivo de gerar uma
ferramenta indispensável para essas análises, construímos bancos de DNA de pacientes epilépticos e de indivíduos
não-epilépticos provenientes do Estado de Alagoas. Para isto, os pacientes epilépticos atendidos no Ambulatório
de Epilepsia do HU-UFAL foram submetidos à avaliação segundo modelo estabelecido no protocolo clínico. Os
dados obtidos foram analisados para classificar o(s) tipo(s) de crise(s) e de síndromes epiléticas de cada paciente,
segundo os critérios da International League Against Epilepsy. Os pacientes com diagnóstico confirmado foram
submetidos à coleta de sangue periférico, do qual o DNA genômico foi extraído e devidamente armazenado. O banco
de DNA da população não-epiléptica foi construído a partir de indivíduos pareados para idade, sexo, localização
geográfica de origem e etnia. Para este grupo, adotamos como critério de exclusão ter parentesco até segundo
grau com diagnóstico de qualquer síndrome epiléptica; histórico de patologias sistêmicas, câncer e meningite; e
histórico de crises convulsivas febris. Até o presente momento, o banco de DNA de indivíduos epilépticos contém
166 amostras agrupadas de acordo com o tipo de epilepsias. As epilepsias generalizadas idiopáticas correspondem
a 62,6 % (104) e estão representadas pelas seguintes síndromes: Epilepsia Mioclônica Juvenil (54), outras epilepsias
generalizadas primárias com crises convulsivas tônico-clônicas (34), Epilepsia Ausência da Infância (4), Ausência
Juvenil (3) e síndromes criptogênicas ou sintomáticas: síndrome de West (2) e não classificadas (7). As epilepsias
focais correspondem a 37,4% (62) e estão representadas pelos seguintes tipos: epilepsias do lobo temporal (16),
Epilepsias do lobo frontal (07) e epilepsias associadas a hamartomas hipotalâmicos (02), epilepsias sintomáticas
com crises parciais complexas do lobo temporal ou frontal (15), Epilepsia Indeterminada (5) e não classificadas
(17). O Banco de DNA de indivíduos não-epilépticos contém 110 amostras. Tais bancos estão sendo rotineiramente
expandidos pela inclusão de novos dados e vem sendo explorados na investigação de alterações genéticas
associadas a diferentes aspectos do processo epileptogênico.
Apoio financeiro: FAPEAL e CNPq
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Genotipagem do SNP 3751385 C>T no gene da
Conexina 26 pela técnica tetra-primer ARMS PCR
Medrano, RFV; Oliveira, CA
NUCISA/Núcleo de Ciências da Saúde do Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS
[email protected]
Palavras-chave: SNP, Conexina 26, tetra-primer ARMS PCR, Deficiência Auditiva.
O gene GJB2 está localizado no cromossomo 13q12, no locus DFNB1. Esse gene codifica a proteína conexina 26, e
as suas mutações são as principais causas de deficiência auditiva não sindrômica, sendo a 35delG a mutação mais
freqüente nesse gene. SNPs (Single Nucleotide Polimorphism) podem alterar a expressão gênica e exercer um papel
direto ou indireto no fenótipo. Um estudo recente descreveu um novo haplótipo no locus DFNB1 em famílias com
deficiência auditiva, que segrega a mutação 35delG em heterozigose com o SNP 3751385 C>T em homozigose para
o alelo T e apresentava a expressão do gene GJB2 reduzida. Estudos de SNPs necessitam de uma grande quantidade
de marcadores e serão beneficiados pelo uso de métodos rápidos, de simples execução e de baixo custo. Um
método envolvendo apenas uma única reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida por eletroforese, é a técnica
tetra-primer ARMS PCR, que possui princípios da técnica tetra-primer PCR e do sistema Amplification Refractory
Mutation System (ARMS). A especificidade de cada alelo é conferida pelo missmatch entre o oligonucleotídeo da
porção terminal 3´ do inner primer e o DNA molde e também pelo segundo missmatch na posição -2 do inner primer.
Através do posicionamento de cada um dos outer primers em distâncias diferentes do SNP, os dois amplicons dos
inner primers se discriminam em tamanho. Este trabalho tem como objetivo avaliar a eficácia da técnica tetraprimer ARMS PCR na genotipagem do SNP 3751385 em 43 amostras de indivíduos ouvintes, e determinar através
dessa técnica a freqüência dos alelos polimórficos. Para avaliar a eficácia do método tetra-primer ARMS PCR foi
realizado PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Lenght Polimorphism) nas mesmas 43 amostras e comparado os
resultados das técnicas. O genótipo determinado pela tetra-primer ARMS PCR foi consistente com o obtido pela
análise de fragmentos de restrição em todas as amostras. A freqüências genotípicas (CC=58,13; CT=41,87; TT=0)
e alélicas (C=0,79;T=0,21) estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg [p=0,221]. As técnicas atuais para genotipagem
de SNPs de médio a baixo custo são baseadas na PCR, mas envolvem manipulação pós-PCR, como o uso de
enzimas de restrição e de rádio-isótopos. Para o desenvolvimento de pesquisas novos métodos mais rápidos e
econômicos precisam ser desenvolvidos e métodos antigos aprimorados. Assim a técnica utilizada neste trabalho
supera os limites de muitos métodos antigos, já que não há manipulação pós-PCR, e atende as expectativas das
novas metodologias, permitindo a investigação do SNP 3751385 de uma maneira rápida, eficiente e com custo
relativamente baixo. Até o presente momento este estudo demonstrou que a freqüência do alelo T em homozigose
em indivíduos ouvintes é muito baixa. Este fato, se utilizado em estudos com indivíduos portadores de surdez,
ajudará a elucidar a influência dos SNPs na deficiência auditiva de origem genética.
APOIO FINANDEIRO: PIBIC/CNPq e NUCISA/UNIARARAS
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Quimioresistência da Leucemia Linfóide Aguda
Pediátrica mediada pela IGFBP7
Laranjeira, ABA; Vasconcellos, JF; Sodek, L; Spago, MC; Fornazim, MC; Brandalise, SR; Nowill, AE; Yunes,
JA
UNICAMP
Palavras-chave: IGFBP7, quimioresistência, L-asparaginase, LLA, estroma da medula óssea
A interação das células de Leucemia Linfóide Aguda (LLA) com o estroma da medula óssea tem um impacto
positivo na resistência destas células ao tratamento quimioterápico. Holleman et al. (2004) através de testes de
sensibilidade in vitro com células de LLA, listaram genes possivelmente associados á resistência e sensibilidade
destas células a quimioterapia. Investigamos se estes genes estariam envolvidos na regulação da resistência das
células de LLA a ação da L-asparaginase mediado pelo contato com o estroma. Células primárias de LLA foram
cultivadas com estroma e alterações na expressão gênica foram quantificadas por PCR em Tempo Real. Os genes
relacionados à sensibilidade apresentaram queda de expressão (GPR56, MAN1A1); enquanto que IGFBP7, gene de
resistência, apresentou aumento de expressão nas células de LLA cultivadas com estroma. O aumento de expressão
de IGFBP7 foi confirmado no nível protéico, onde o número de células CD19(+)/IGFBP7(+) e a intensidade de
fluorescência foi maior nas células co-cultivadas (P < 0,05). Foi observado (ELISA) que a quantidade de IGFBP7
no sobrenadante da co-cultura apresentou-se maior em relação ao das células cultivadas sem estroma (P < 0,05);
dado este correlacionado com a quantidade de células CD19(+)/IGFBP7(+) (r = 0,81; P < 0,05) e a intensidade de
fluorescência (r = 0,76; P < 0,05). O plasma da medula óssea de pacientes com LLA ao diagnóstico também apresentou
níveis mais elevados de IGFBP7 em comparação às amostras de medula normal (P < 0,0001). Para verificar se o
aumento nos níveis de IGFBP7 implicava em uma vantagem biológica positiva para células leucêmicas, foram
realizados ensaios de viabilidade in vitro (MTT). As células de LLA foram submetidas à ação da L-asparaginase e
aos tratamentos foram adicionadas rhIGFBP7 e/ou seus ligantes (IGF1, IGF2 ou insulina). Nota-se que a presença
de rhIGFBP7 mais um dos seus ligantes atenuou o efeito citotóxico da L-asparaginase quando as células de LLA
foram co-cultivadas com as células estromais (P < 0,05); fato que não ocorreu quando as células de LLA foram
cultivadas sozinhas. Este efeito se deve em parte ao aumento de expressão de asparagina sintetase nas células
estromais, que respondem positivamente ao tratamento com rhIGFBP7 mais ligantes (P < 0,05) aumentando a
produção de asparagina como observado no sobrenadante de cultura após 48 horas de cultura (HPLC de fase
reversa). Análise da expressão de IGFBP7 em 136 amostras de pacientes ao diagnóstico indicou que altos níveis
de IGFBP7 estão associados a pior prognóstico (P = 0,04). Portanto, as células estromais estimulam as células de
LLA a aumentarem a expressão de IGFBP7, um fator secretado que por sua vez estimula a expressão de asparagina
sintetase e conseqüente produção de asparagina pelas células estromais, contribuindo assim para a proteção das
células de LLA contra os efeitos da L-asparaginase.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Different methodological approaches to diagnose the
Androgen Insensitivity Syndrome: case report in a
public service of genetics
Melo, COA1,3; Silva, DM1,2,3; Ribeiro CL1; Silva, GP 2; Silva, DC1; de Melo, AV1; Costa, EOA 1,3; da Silva, CC1,2;
da Cruz, AD1,2,3
1
Universidade Católica de Goiás – Departamento de Biologia – Núcleo de Pesquisas Replicon, Goiânia, GO.
LaGene – SuLeide, Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular- Superintendência Leide das Neves Ferreira Secretaria Estadual de Saúde de Goiás, Goiânia, GO.
2
3
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Mestrado em Genética, Universidade Católica de Goiás.
[email protected]
Keywords: Androgen Receptor, Androgen Insensitivity Syndrome, infertility, FISH, PCR.
The disorders that affect the genetic sex can cause many types of problems to individuals and their families. The
Androgens Insensitivity Syndrome (AIS) is a disorder linked to chromosome X and caused by mutations in the
gene of Androgen Receptor (AR). Mutations that severely affect the quantity, structure and function of AR cause
CAIS (Complete Androgens Insensitivity Syndrome) phenotype, also known as Testicular Feminization Syndrome.
All XY individuals with CAIS are infertile. In this context, in the year of 2008, the patient M. C. J., 15 years old, was
referred to the Laboratory of Human Cytogenetics and Molecular Genetics of the city of Goiânia showing poorly
developed breasts and primary amenorrhea. Her medical history showed that when she was a newborn, some
doctors removed an abdominal mass, which was diagnosed as an umbilical hernia. Thus, the G-band karyotyping
of this patient showed the result 46, XY. It was concluded that the mass withdrawal from the abdomen of the
patient was, in fact, testes and that the patient had a condition known as cryptorchidism, a reproductive change
characterized by a failure of the displacement of one or both testes to the abdominal cavity to the scrotum. We
performed the methods of PCR and FISH to verify mutations of the exons 1, 4, 6, 7 and 8 of the AR gene and to
detect the AR gene, respectively. We prepared a culture of T-lymphocytes in the medium RPMI 1640, supplemented
with 20% of bovine fetal calf and 2% of phytohemagglutinin. Metaphasic preparations were made by conventional
methodology. The use of slides for FISH were prepared with a micropipette, dripped about 15 µL of the material
set. Only the slides of good quality (in terms of metaphases), were selected by phase contrast microscope and
were subjected to the method of FISH using the probe LSI Androgen Receptor SpectrumOrange (Xq12) (Vysis ®,
Abbott Park, Illinois, USA). For PCR, primers were used for the exons 1, 4, 6, 7 and 8 of AR. By PCR, it was possible
to observe that the patient did not present the exons 1, 4 and 7 of AR, but despite of that, the probe hybridized
the AR region. This could be explained by the size of the probe (380 kb), which was higher than the AR gene (90
kb), indicating that the deletions of some exons did not influence the hybridization of the probe. So, these results
showed that the probe used in our lab, to diagnose AIS, has to be associated to PCR to detect mutations (deletions)
of some regions in the AR gene, being the appropriate tools to diagnose cases of AIS.
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321
Comparative analysis between RFLP-PCR technique
and DNA sequencing for diagnostic of HPV types
Lima Júnior, SF¹; Heráclio, SA; de Sá Filho³, AL; Fontes, KFLP1; Medeiros, JAP¹; Souza, PRE¹,³; Diniz,
MMD¹
¹Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA – Universidade Federal Rural de Pernambuco.
2
Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira.
3
Universidade de Pernambuco-UPE.
[email protected]
Keywords: HPV, RFLP, DNA sequencing, typing, genotyping
Human papillomavirus (HPV) is a common sexually transmitted pathogen which is considered to play an important
role in the pathogenesis of genital cancer. This virus has been classified in the family Papillomaviridae and it has an
icosahedral virus, not enveloped and a genome of double-stranded DNA. The numbers of men and women infected
with HPV is increasing considerably in the last years. Nowadays, HPV is found in approximately 10% of all human
cancers, as well as in precancerous conditions. To date, more than 100 different HPV types have been described.
About 35 types infect are anogenital tract. HPVs are divided into three groups: low-risk (mainly 6, 11, 42, 43 and 44),
intermediate-risk (mainly 31, 33, 35, 51, 52 and 58) and high-risk (mainly 16 and 18). The PCR is a highly sensitive
method for detection of viral DNA. The genotyping HPV types are a most important tool for a precocious preventive
treatment. The aim of this study was to do a comparative analysis between the RFLP technique and automated DNA
sequencing. Samples were obtained from patients with intra epithelial injury who attended the “Instituto Materno
Infantil de Pernambuco (IMIP)”.Sixteeen samples of DNA were obtained from anal secretion and amplification
was performed in a final volume of 25 μL containing 1X PCR buffer (PROMEGA); 1.5 mM MgCl2, 100 mM of each
dNTP, 1pmol/μL of each specific primer (MY09 and MY11), 0.2 U of Taq DNA polymerase (PROMEGA) and 200ng of
DNA. The thermal cycle were performed according to Gasperov et al. (2008). For RFLP analysis were utilized seven
restriction enzymes according to Bernard et al. 1994. The sequencing reactions was performed with “DyEnamic
ET Dye Terminator Cycle sequencing kit” (AMERSHAM), using MegaBACE 1000 DNA Sequencer according to
manufacturer. The results of digest with restriction enzymes showed that patient 1 had HPV type 6b, patient 2 had
HPV type 53, patient 3 had HPV type 54 and patient 4 had HPV type 58. The BLASTN (NCBI) was used for identify
the HPV types obtained from results of DNA sequencing. These results showed differences between PCR-RFLP and
DNA sequencing for HPV types obtained from patient 1 (HPV type 6) and patient 3 (HPV type 70). These HPV types
were not expected according to Bernard et al. 1994. These data suggest the DNA sequencing as the more robust
method for detection of HPV types.
This study was supported by: CNPq.
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322
Detecção do genoma de HPV em pacientes com
carcinoma espino-celular da laringe: comparação entre
os ensaios de PCR convencional e em tempo real
Cunha, DMC1; Silva, AMTC1; Curado, MP2; da Silva, CC1; da Cruz, AD1
1
2
Núcleo de pesquisas Replicon; departamento de biologia; universidade católica de Goiás
Hospital Araujo Jorge/Associação de Combate ao Câncer em Goiás
Palavras-chave: HPV, PCR, PCR em tempo real, câncer, vírus
A interação do genoma do HPV com o genoma da célula hospedeira ou de proteínas virais com proteínas celulares
necessárias ao controle do ciclo celular desencadeia a morte celular ou age como fator de iniciação e progressão
de processos malignos. Diversos trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de associar a infecção de HPV aos
cânceres de cabeça e pescoço. O objetivo do presente estudo foi comparar a detecção do genoma de HPV em
pacientes com CEC da laringe, considerando os ensaios de PCR convencional e em tempo real. O grupo amostral foi
constituído de 15 pacientes do Registro de Câncer de Base Populacional da ACCG. Das peças cirúrgicas, foi obtido
DNA total, usado na investigação molecular, para detecção do genoma de HPV, utilizando os primers genéticos
GP05/06, que detectam todos os tipos de HPV. O genoma de HPV foi amplificado em 30% dos casos por PCR
convencional e no ensaio de PCR em tempo real apresentaram amplificação em 46,7% das amostras, evidenciando
uma diferença em 40%. Os estudos de associação entre o HPV e os cânceres da laringe são importantes no sentido
de ampliar o conhecimento acerca dos mecanismos de infecção, iniciação e promoção tumoral potencializada por
estes vírus.
Apoio financeiro: FP/PROPE/UCG.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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323
Comparison of three different primer systems for HPV
detection in HIV-positive and HIV-negative women
Cunha, BCR1; Lima, FC1; Vaz, LP1; Rabelo-Santos, SH2; Alves, RRF1,3; Serafim Filho, J3; Milki, MV1,4; Araújo,
WCC1; Mühlbeier, DFM1; Carneiro, MAS2; Paganini, J1; Saddi, VA1,5
Programa de Mestrado em Genética, Universidade Católica de Goiás;
Faculdade de Farmácia e Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás;
3
Santa Casa de Misericórdia de Goiânia;
4
Centro de Apoio ao Doente com AIDS;
5
Setor de Anatomia Patológica, Hospital Araújo Jorge, Associação de Combate ao Câncer em Goiás
[email protected]
1
2
Keywords: HPV-detection; PCR; GP5+/GP6+; PGMY09/11; MY09/11;
The well known relationship between HPV and the development of cervical cancer requires the constant
improvement of HPV molecular tests applied into gynecological routine. Two different groups of methods are
available for HPV detection, including direct hybridization (Southern blot, dot blot, hybrid capture and in situ
hybridization) and gene amplification (PCR based assays). Consensus PCR based assays allow the detection of a
great number of HPV types in a single reaction. The aim of this study was to compare three PCR based methods
commonly used in HPV detection, including GP5+/GP6+ general primers assay, MY09/11 degenerated primers
assay and PGMY09/11 consensus primers assay using 120 cervical scrapes (60 obtained from HIV positive women
and 60 from a control group). HPV detection achieved by PCR methodology, using the GP5+/GP6+ primer set
resulted in a detection rate of 27/57 (47%) for HIV positive women and 15/57 (26%) for HIV negative women; by
using MY09/11 primer set, the detection rate was 35/57 (61%) for HIV positive women and 17/57 (30%) for HIV
negative women; and finally, with the PGMY09/11 primer set, a detection rate of 41/57 (72%) and 21/57 (37%) for
HIV positive and HIV negative women, respectively, was obtained. Among the three methods evaluated in this
study, the PGMY09/11 system gave the highest HPV detection rates for both groups of patients.
This study was supported by: CNPq; CAPES; PROPE/UCG
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The sumoylation of Stanniocalcin-1 may have a role for
its acquisition of extended functions in tetrapodes
Santos, MT1,3; Trindade, DM2,3; Kobarg, J1,2,3
Genetics and Molecular Biology dept.– Biology Institute – UNICAMP – Campinas, SP - Brazil
Biochemistry dept. – Biology Institute – UNICAMP – Campinas, SP – Brazil
3
Brazilian Synchrotron Light Laboratory – CeBiME – Campinas, SP – Brazil
1
2
Keywords: Stanniocalcin-1; SUMO-1; SUMOylation
Stanniocalcin-1 (STC1) is a very conserved protein, first described in fish, present in the corpuscles of Stannius,
where it is involved in the regulation of the calcium homeostasis. STC1 has been found in all vertebrata species.
Although its function is well studied in fish, in the others vertebrate, especially in mammals, STC1 seems to have
acquired more pleitropic functions, involving angiogenesis regulation, stress responses and is even associated to
diseases such as cancer. To get some clues about its functions in human cells, a yeast two-hybrid assay using
the human stanniocalcin-1 sequence as a bait was carried out. We identified 22 interactive partners and one of
the most interesting was the protein SUMO-1. The SUMO family of proteins are covalently attached to certain
Lysine residues in a post-translational modification called SUMOylation. SUMOylated proteins can be involved
in nuclear – cytosolic transport, transcriptional regulation, apoptosis, protein stability, response to stress, and
progression through the cell cycle. Using the program SumoPlotTM, the human Stanniocalcin-1 showed one motif,
with a very good score (0.79), for SUMO attachment in its protein sequence. We decide to check out the other
organisms and found that there are 46 sequence entries in the NCBI database for the Stanniocalcin-1 protein
from 17 different chordate species. All of them were analyzed for the SUMO motif in the same place of the human
motif and we observe that all tetrapode species (including amphibians, reptiles, birds and mammals) have this
sumoylation motif, whereas all the others chordates and tunicates, do not have it. We confirmed the interaction
between human Stanniocalcin-1 and SUMO-1, by in vitro GST pull down assay and by an immuno-precipitation of
the endogenous proteins from HEK293 cells. A mapping study, using the N- and C-terminus of STC-1 fragments
was done in yeast and we observed that the interaction of both proteins occurs in the N-terminus region, the same
region that contains the predicted SUMO motif. Concluding, we may infer that stanniocalcin-1 evolved from fish to
upper vertebrates, making only small alterations in its protein sequence, but may have acquired new functions and
involvement in new pathway, in addition to calcium homeostasis, including apoptosis, angiogenesis and hormonal
signaling. It is tempting to speculate at this point that the acquisition of a motif for SUMOylation may have been
important for stanniocalcin-1 in the context of the acquisition of the new cited functions. Mass spectrometry
analysis of the endogenous immuno-preciptated stanniocalcin-1 are ongoing to confirm the exactly site of the
SUMOylation and nuclear and cytoplasmic fractions will be analyzed to determine the localization SUMOylated
and non-SUMOylated fractions of STC1.
Supported by: FAPESP, CNPq and ABTLuS
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Tecnologias de amplificação de DNA por LAMP e PCR
na determinação Pré-Natal do sexo fetal
Rocha, BG123; Chiari, MF23; Medaglia, A12; Matheucci, EJ123; Araujo-Moreira, FM2
¹DNA Consult Genética e Biotecnologia – São Carlos
2
PPG Biotec - UFSCar
3
QGene – São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Sexagem fetal, DNA fetal, PCR (Polymerase Chain Reaction) e LAMP (Loop-mediated isothermal amplification).
Novas técnicas de biologia molecular têm proporcionado testes diagnósticos rápidos e eficientes, a partir de
amostras mínimas de tecido. Em 1998, Lo et al., demonstraram que, já no primeiro trimestre de gestação, 3,4% do DNA
livre plasmático materno pertence ao feto. Utilizando esta informação foram desenvolvidos testes para sexagem
e diagnóstico fetal precoce utilizando a amplificação por PCR. A amplificação isotérmica do DNA, denominada
LAMP (Loop Mediated-Isothermal Amplification) tem-se mostrado útil na identificação de quantidades mínimas
de DNA, na ordem de picogramas, utilizando apenas um banho-seco. Neste projeto desenvolvemos metodologia
diagnóstica para a sexagem fetal precoce utilizando LAMP. Além disso, comparamos a eficiência do PCR e LAMP
amplificando diferentes segmentos do cromossomo Y: DSY-14, com cópia única e TSPY, que se apresenta em
múltiplas cópias por cromossomo. Nossos resultados demonstram que a amplificação por LAMP é mais eficiente
do que o PCR, por exemplo: utilizando como molde segmento de DSY-14, o limite de detecção é de 10 pg e 0,1 pg,
para o PCR e o LAMP, respectivamente. Para obter sinal de amplificação por PCR que seja equivalente ao LAMP é
necessário utilizar nested PCR. Concluímos que a amplificação utilizando LAMP é mais rápida (75 minutos), não
requer equipamentos sofisticados para reação, e é mais eficiente partindo de quantidades de DNA da ordem de
picogramas.
Financiado por Qgene.
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Padronização da reação de minisequenciamento em
formato multiplex para estudo de genes associados à
obesidade
Queiroz, EM1,2; Santos, AM1,2; Coelho, FAO1,2; Castro, IM1; Freitas, RN2
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas, DEFAR/EF, Universidade Federal de Ouro Preto;
Laboratório de Epidemiologia Molecular, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas, DENCS/ENUT, Universidade Federal de Ouro
Preto.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Minisequenciamento, SNPs, Obesidade, Genética Humana, Epidemiologia Molecular
O recente aumento da incidência e prevalência da obesidade no mundo chamou a atenção de pesquisadores para
um melhor entendimento desta enfermidade. Sabe-se que a obesidade é determinada pela interação entre fatores
ambientais e genéticos. Entretanto, pouco se conhece sobre a maquinaria genética que atua determinando a
manifestação do fenótipo da obesidade. Recentemente, Rankinen e colaboradores (2006) publicaram uma revisão
relatando a existência de 138 genes associados à obesidade e mais de 1000 mutações envolvidas. Diante disso,
nosso grupo se propôs a estudar a associação de 13 polimorfismos de nucleotídeos simples - SNPs (rs2011162
SLC6A14, rs1137101 LEPR, rs680 IGF2, rs1801282 PPARG, rs5219 KCNJ11, rs2236418 GAD2, rs659366 UCP2,
rs8192678 PPARGC1, rs17300539 e rs266729 APM1, rs1042713 e rs1042714 ADRB2 e rs28932472 POMC) e o fenótipo
da obesidade em populações miscigenadas de Minas Gerais, utilizando a metodologia de minisequenciamento.
Para tanto, nós desenhamos iniciadores para a amplificação das regiões gênicas dos polimorfismos para gerar
fragmentos com uma diferença de tamanho de pelo menos 30 nucleotídeos. Os iniciadores foram testados
individualmente; a concentração de DNA molde foi definida pela melhor amplificação utilizando 100, 150 e 200ng
de DNA teste e a temperatura de anelamento dos iniciadores foi determinada após a amplificação a 52, 54 e 56°C.
Posteriormente, foram realizadas amplificações dos fragmentos gênicos para o ajustamento das concentrações
dos iniciadores na PCR multiplex. Para a reação de minisequenciamento, nós desenhamos iniciadores contendo
uma cauda neutra T7 de tamanho diferenciado para a identificação de cada SNP. A reação utilizou o produto
da PCR previamente purificado como DNA molde (Carvalho e Pena, 2005) e ddCTP marcado com fluoresceína
(Fluorescein-12-ddCTP, NEL400, PerkinElmer Life). Os iniciadores foram testados individualmente utilizando-se
um pool de DNA de indivíduos para aumentar a heterozigosidade e permitir a localização dos alelos de todos
os SNPs. Posteriormente, nós agrupamos os SNPs em painéis e ajustamos as concentrações dos iniciadores na
reação de minisequenciamento. Nossos resultados mostram que a amplificação das regiões gênicas do estudo foi
mais eficiente quando se utilizou 100ng de DNA molde, temperatura de anelamento a 54°C e concentrações dos
iniciadores entre 5µM e 0,05µM. Na reação de minisequenciamento, as concentrações dos iniciadores variaram
entre 0,5µM e 0,01µM. A metodologia permitiu a identificação dos alelos de todos os SNPs do estudo, demonstrando
ser uma eficiente ferramenta para o estudo populacional.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES e UFOP.
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Modulação da expressão de aquaporina-3 (AQP-3) pelo
extrato de picão preto (Bidens pilosa): possível papel
na hidratação da pele
Degelo, GC1; Velazquez Pereda M del C2; Colombi, D1
¹Laboratório de Parasitologia - Instituto de Biociências de Botucatu.
2
Chemyunion
[email protected]
Palavras-chave: AQP3, expressão, queratinócitos, pele humana
A indústria de cosméticos tem grande importância para a economia brasileira. Neste ramo, o desenvolvimento de
novas tecnologias para serem incorporadas aos produtos, é importante para que a competitividade dos produtos
seja mantida. Um importante papel dos cosméticos na diminuição dos sinais de fotoenvelhecimento é a hidratação
da pele via modulação da expressão da aquaporina 3 (AQP3), principal aquaporina descrita na epiderme. Esta é
uma proteína integral de membrana que participa do controle da permeabilidade a água e pequenos solutos,
com importante função na hidratação da pele. Existem ativos da flora nacional que são capazes de modular a
expressão da AQP3, sendo foco de grande interesse das indústrias de cosméticos. A espécie Bidens pilosa possui
ácido fitânico, composto semelhante ao ácido retinóico, capaz de aumentar a expressão de AQP3. O objetivo
deste estudo consiste em avaliar se a Bidens pilosa é capaz de modular a expressão da AQP3. Para tanto, o extrato
hidroglicólico da Bidens pilosa (EHBP) foi extraído por percolação e cedido pela empresa Chemyunion Química
Ltda. A seguir, co-culturas de queratinócitos e melanócitos foram testadas quanto a seus efeitos sobre a expressão
da AQP3, utilizando-se para isto a técnica de PCR em Tempo Real. Foram realizados tratamentos com o EHBP
0,50% em culturas de células nos tempos de 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 24 horas e, no tratamento de 6 horas foi observado o
maior pico de expressão da AQP3, que volta a níveis basais após 12 horas. A seguir foram realizados tratamentos
com diferentes concentrações do extrato vegetal (0,25%; 0,50% e 1,0%) e, o tratamento de 0,50% continuou sendo o
que acarretava em uma maior expressão da AQP3 (4,36 vezes). A validação dos resultados de PCR em Tempo Real
se dará através de ensaios de western-blot e imunohistoquímica. A análise destes resultados preliminares sugere
que o uso do extrato de Bidens pilosa pode modular positivamente a expressão da AQP3 minimizando os efeitos
causados por deficiência no transporte de água em células epidermais. Além da AQP3, testamos outros genes
relacionados à hidratação da pele e, vimos que o tratamento com Bidens pilosa aumenta a expressão dos genes da
aquaporina 9, fibronectina e involucrina.
Apoio Financeiro: CNPq
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328
Leishfiler: sistema de marcadores de DNA para
diagnóstico diferencial de espécies de Leishmania
Andrade, CCF1,2,3; Marota, ECC2; Machado, FB2,3; Medina-Acosta, E2,4
Parque de Alta Tecnologia do Norte Fluminense – TecNorte, Campos dos Goytacazes, RJ.
Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes,
RJ.
3
Laboratório de Genética Bioquímica/Departamento de Genética. Universidade de São Paulo, Riberão preto, SP.
4
Hospital Escola Álvaro Alvim, Campos dos Goytacazes, RJ.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Diagnóstico molecular diferencial, Leishmaniose, microsatélites, PCR multiplex, análises In silico.
O diagnóstico diferencial das espécies do gênero Leishmania, protozoários causadores de importantes doenças
em humanos e animais, exige a utilização de diversas metodologias laboratoriais, que requerem isolamento e
cultivo das parasitas. Tais metodologias, porém, não são suficientemente sensíveis para utilização na rotina de
acompanhamento clínico, por exemplo, durante o tratamento. Testes moleculares baseados na amplificação
específica de sequências de DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir de amostras biológicas
complexas (sangue, tecido) constituem o principal avanço em diagnóstico molecular em outras doenças. O presente
trabalho objetivou a identificação de sequências repetidas em tandem (microsatélites, STR) espécies-específicas,
visando ao desenvolvimento de um sistema (LEISHFILER) de marcadores polimórficos para a rápida diferenciação
das espécies de Leishmania. As sequências alvo foram repetições tetranucleotídicas e pentanucleotídicas, cuja
tipagem é mais acurada do que das repetições dinucleotídicas. Para mineração de microsatélites foram utilizadas
as sequências dos genomas de referência, programas de computação para identificação de STR e desenho de
iniciadores específicos. Alvos selecionados foram validados experimentalmente mediante a tipagem de DNA
referência e a otimização de ensaios de amplificação por PCR. Os produtos de amplificação foram separados por
eletroforese capilar e analisados em sequenciador automático. Na mineração inicial foram identificados 809 locos
candidatos, com a seguinte distribuição: 35% di-; 16% tri-; 6,6% tetra-; 0,9% penta-; 41,5% hexanucleotídicas. Destes,
foram selecionados 45 locos (77,8% di-; 6,7% tri-; 11,1% tetra-; 4,4% pentanucleotídicas). Para o desenho do sistema
multiplex LEISHFILER foram escolhidos dez STR localizados em diferentes cromossomos (P1-Chr1; P2-Chr7; P3Chr8; P4-Chr10; P5-Chr15; P6-Chr16; P7-Chr18; P8-Chr19; P9-Chr22; P10-Chr29). Oito pares de iniciadores foram
otimizados. As condições de amplificação para os iniciadores P2, P3, P4, P5 e P6 possuíram concentração de MgCl2
de 1,0 mM e TA em 60,5º C, formando assim uma PCR pentaplex. Para os primers P1, P7 e P8 a melhor concentração
de MgCl2 foi 1,5 mM e TA em 63º C, e estes fazem parte de ensaio triplex. A genotipagem do DNA de Leismania
major gerou produtos de amplificação de tamanho comparáveis aos preditos pelas análises in silico. Os iniciadores
selecionados para compor o sistema LEISHFILER utilizados possuem alta especificidade para Leishmania major,
uma vez que não amplificaram DNA de Leishmania infantum e Leishmania brasiliensis.
Apoio Financeiro: TECNORTE/UENF-NUDIM
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Characterisation of RNAi-immune transcripts
Pereira, TC1; Moraes, ML1; Pascoal, VDB 1; Lopes-Cendes, I1
Dept of Medical Genetics, School of Medicine,
State University of Campinas, UNICAMP
1
Keywords: RNAi, siRNA, suppression, virus, defence
RNA interference (RNAi) is a natural post-transcriptional gene silencing process that mediates antiviral defense,
control of transposon mobilisation, heterochromatin formation and regulation of gene expression. RNAi is
triggered by lond double-stranded RNA molecules (dsRNAs), which are recognised by an enzyme named DICER
and processed into small interfering RNAs (siRNAs). These short RNA dupluxes are transferred into a complex
named RISC, where one strand is destroyed (reffered as to the passenger strand) while the other is kept (reffered
as to the guide strand). Loaded RISC then patrols the cytoplasm searching for perfect complementary sequences,
which are then cleaved (i.e., silenced). Using computational simulations and thermodynamic analyses we found
that “RNAi-immune transcripts”, i.e., sequences not amenable for RNAi silencing due to thermodynamic features,
are restricted to 10 nucleotides in length. This finding shows that no naturally occuring viral or transposon-derived
sequence can systematically evade RNAi system through thermodynamic modifications. Their occurrence in viral
transcripts may reflect sites involved in counter-defence mechanisms. We describe here a new mechanism of RNAi
evasion, based on synonymous mutations which convert the sense strand into the guide strand, hindering an
effective antiviral response. Such phenomenon should be taken in account when applying siRNAs to control viral
infection and in analyses of reverse genetics.
Supported by: FAPESP, CNPq
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Multiplex PCR e minisequenciamento de SNPs – um
modelo utilizando cromossomo Y, visando estudos
populacionais
Bonecker, STB1; Teixeira, RLF1; Moura-Neto, RS de2; Cabello, PH1
Fundação Oswaldo Cruz
Universidade Federal do Rio de Janeiro
1
2
Palavras-chave: PCR-Multiplex, minisequenciamento, polimorfismo de base única, estudos populacionais, genotipagem
A população brasileira é etnicamente miscigenada, com contribuição européia, ameríndia e africana e contou em
sua formação com a participação de outros grupos, como sírios, libaneses e japoneses. A constituição da população
brasileira já foi estudada de diferentes maneiras, utilizando marcadores clássicos e marcadores de evolução rápida,
como os microsatélites, porém esses não delineiam com segurança a origem e as rotas migratórias de populações
ancestrais. Os ideais para estudo de ancestralidades são os marcadores de evolução lenta, como é o caso dos
polimorfismos de base única (SNPs) que, por possuírem baixas taxas mutacionais, permitirão uma visão mais
consistente da contribuição de cada grupo étnico na população masculina de indivíduos brasileiros. Para um melhor
entendimento das raízes filogenéticas foram utilizados neste estudo, os marcadores bi-alélicos do cromossomo Y,
uma vez estes não sofrem recombinação e são transmitidos na forma de haplótipo de pai para filho. Sendo assim, o
objetivo deste estudo foi a padronização da técnica da PCR-Multiplex e da técnica do SNaPshot para a genotipagem
de vários SNPs em uma mesma reação, para posterior análise da estrutura genética da população do Rio de Janeiro.
Assim, foram selecionados 15 SNPs para a determinação dos sete haplogrupos encontrados no cromossomo Y, que
melhor caracterizam cada grupo étnico parental. O DNA genômico de 200 indivíduos não aparentados e naturais
do estado do Rio de Janeiro foram escolhidos aleatoriamente, entre participantes de estudos de paternidade, para
inclusão nesse estudo. Cada par de primers teve a sua eficiência testada em uma reação de PCR-Singleplex, cada um
com uma padronização específica, onde variou-se a concentração de MgCl2, temperatura de anelamento e adição
de aditivos, como: Triton (0,1%), BSA (10μL/mL), formamida (5%), DMSO (5%) e glicerol (10%). A temperatura de
anelamento que se mostrou ideal para a maioria das amplicações foi à de 55ºC e foi esta a temperatura utilizada na
PCR-Multiplex. Em seguida, foi realizado o sequenciamento desses produtos de PCR confirmando a amplificação
correta da região de interesse portadora do SNP. A padronização do PCR-Multiplex, contendo os SNPs de interesse
foi realizada posteriormente e até o momento padronizou-se a amplificação de nove fragmentos de PCR em uma
mesma reação. Alguns desses fragmentos já foram padronizados e genotipados através do SNaPshot, o qual se
mostrou eficiente para essa aplicação. A utilização dessa abordagem para genotipagem múltipla de marcadores
que reflitam características particulares da nossa população é uma ótima ferramenta para estudos populacionais.
Os resultados deste estudo deverão enriquecer os conhecimentos sobre as raízes filogenéticas da população e
sua estrutura atual, permitindo que os estudos relativos ao rastreamento de mutações responsáveis por diversas
doenças sejam mais racionais e econômicas, pois eles seriam mais direcionados e específicos para nossa população.
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331
Padronização para identificação molecular do
polimorfismo CYP2D6*4
Caxito, FA1; Gonçalves, MS1,2; Malta, FSV1; Braga, LC2; Ferreira, ACS1; Pardini, VC1
Instituto Hermes Pardini - Departamento de Genética Humana
Centro Universitário UNA – Faculdade de Ciências Biológicas e Saúde
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Frequência alélica, CYP2D6*4, PCR-RFLP, Identificação molecular, polimorfismo
O CYP2D6 é uma das monooxigenase que fazem parte do citocromo P450 dependente destas enzimas. Essa enzima
é responsável pelo metabolismo de vários neurolépticos, anti-depressivos triciclos, inibidores da re-captação
seletiva de serotonina e B-bloqueadores. Em geral a maioria de tais drogas são metabolizadas extensivamente,
no entanto de 5-10% dos Caucasianos e 1-4% dos indivíduos da maioria dos grupos étnicos são considerados
metabolizadores com atividade enzimática reduzida e sofrem o risco de intoxicarem-se. Em contraste, 1-7% dos
Caucasianos e acima de 20% da população do leste europeu (middle eastern) são metabolizadores ultra-rápidos
e não atingem a concentração terapêutica da droga no plasma sob o mesmo tratamento. A genotipagem do alelo
*4 pode ser capaz de predizer aproximadamente 82% dos metabolizadores com atividade enzimática reduzida
em algumas populações. Indivíduos que possui uma mudança de base de G1934A na junção do íntron 3 com éxon
4, alteram a transcrição da proteína, modificando sua estrutura molecular interferindo na ligação do substrato.
Deste modo indivíduos que possuem esta mutação não conseguem manter a concentração da droga na corrente
sanguínea. A técnica molecular para identificação deste polimorfismo foi desenvolvida em nosso laboratório e
consiste na amplificação de uma seqüência do gene responsável por este fenótipo através da PCR e posteriormente
a clivagem por uma enzima de restrição. Este produto de PCR-RFLP e visualizado no gel de poliacrilamida. Foram
analisados 94 indivíduos e a frequência dos alelos selvagens e mutantes para o polimorfismo CYP2D6*4 nessa
população foram estimados como sendo 0,82 e 0,15 respectivamente. A técnica de PCR-RFLP aplicada aos estudos
do polimorfismo CYP2D6*4 apresentou-se adequada para a identificação da mutação 1934 G > A, devido à perda do
sitio de restrição da enzima BstNI e garantiu assim a confirmação