Microorganismos

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
1
Caracterização molecular de espécies do complexo
Burkholderia cepacia isoladas de Lactuca sativa
Maester, TC1; Pereira, MR1; Campanharo, JC1; Lemos, EGM1
Departamento de Tecnologia, Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,
Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: Burkholderia cepacia, Lactuca sativa, 16S rRNA, BOXA-1R, filogenia
O gênero Burkholderia possui mais de 40 espécies, sendo que grande parte pertence ao chamado complexo B.
cepacia. São grupos de estirpes diferentes genotipicamente, mas similares fenotipicamente e consideradas
espécies relacionadas. No entanto, é preciso realizar estudos mais detalhados sobre a distribuição das diferentes
espécies do complexo nos diferentes habitats. Várias espécies de Burkholderia podem ser utilizadas como agente
de biocontrole, apresentam potencial para biorremediação, possuem enzimas com potencial biotecnológico,
além de atuarem como RPCPs (rizobactérias promotoras de crescimento em plantas). É necessária uma
melhor caracterização das espécies pertencentes ao gênero Burkholderia, já que a caracterização genética de
microrganismos é de extrema importância para estudos taxonômicos e para conhecer melhor suas características
fisiológicas, ecológicas e econômicas. O objetivo do trabalho foi isolar e caracterizar taxonomicamente, por
técnicas moleculares, bactérias do complexo Burkholderia cepacia isoladas da raiz de Lactuca sativa (alface). Para
o isolamento e cultivo de bactérias, foram utilizadas raízes de alface- rizosfera e rizoplano-, e o solo ao redor
das raízes. Após incubação e crescimento das colônias, estas foram selecionadas de acordo com diferenças
morfológicas. Realizou-se a extração do DNA genômico de acordo com o protocolo desenvolvido por Sambrook et
al. (1989) sendo que o DNA estava em boa qualidade para desenvolvimento de análises futuras. Para a identificação
de espécies do complexo foi realizada Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com oligonucletídeos iniciadores
específicos (Burk3F e Burk4R) e, então, as cinco estirpes que obtiveram resultado positivo foram caracterizadas
pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA e pela análise do perfil eletroforético da PCR com o marcador molecular
BOXA-1R. O resultado do seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA possibilitou a separação a nível de gênero,
confirmando que todos os isolados pertencem ao gênero Burkholderia. Os perfis dos produtos de amplificação do
DNA das estirpes com o oligonucleotídeo iniciador BOXA – 1R apresentaram bandas polimórficas, permitindo a
separação dos isolados, mesmo estes pertencendo ao mesmo gênero. Os dados obtidos foram utilizados para a
confecção de uma matriz de similaridade e analisados pelo uso do método Neighbor-Joining, através do programa
BioNumerics. Apenas um isolado apresentou bandeamento mais próximo do controle positivo Burkholderia
cepacia- ATCC 25416-, resultando em uma alta similaridade entre elas. Conclui-se, portanto, que um isolado
se mostrou próximo de Burkholderia cepacia, enquanto os outros podem ser considerados novos isolados.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
2
Sinergia dos genes vip3A e cry1Fa em isolados
quitinolíticos de Bacillus thuringiensis podem promover
o aumento na mortalidade de larvas de S. frugiperda
(J. E. Smith) (Lepidoptera: noctuidae)
Lemes, ARN1; Vieira-Costa, JR2; Marucci, SC1; Horta, AB1; Alves, ECC1; Fernandes, OP3; Desidério, JA1
Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista
2
Laboratório de Genética e Bioquímica, Faculdade de Ciências Biológicas, Departamento de Genética, Universidade de Valência
3
Laboratório de Ecologia Aplicada, Departamento de Fitossanidade, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual
Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: PCR, genes cry, genes vip, quitinases, controle biológico.
A bactéria Bacillus thuringiensis é um importante patógeno que pode ser utilizado para reduzir a utilização de
agrotóxicos no campo. Deste modo, o isolamento, identificação e seleção de isolados efetivos contra insetos-praga
de difícil controle, como Spodoptera frugiperda, são etapas importantes e essenciais para inserí-lo no contexto
do manejo integrado. Além das endotoxinas de B. thuringiensis, como por exemplo, as da família Cry1, novas
proteínas têm sido estudadas recentemente, como as Vip (proteínas inseticidas vegetativas) e as Chi (quitinases).
Ambas são produzidas na fase de crescimento vegetativo como proteínas solúveis, sendo que a Vip atua ligandose mais rapidamente aos receptores da membrana das células epiteliais. Já as quitinases auxiliam na degradação
das membranas peritróficas dos insetos formando poros e, conseqüentemente, intensificando a toxicidade e a
defesa contra patógenos. Portanto, estes genes oferecem alternativas de controle e de estratégias de manejo de
possível surgimento da resistência de S. frugiperda às endotoxinas de B. thuringiensis, atualmente utilizadas. Novas
estratégias buscam a produção de plantas “piramidizadas”, com mais de um transgene, aumentando o nível de
controle dos insetos pelo modo de ação diferenciado dos mesmos. Assim sendo, este trabalho teve por objetivos
selecionar novos isolados de B. thuringiensis, a partir de uma coleção brasileira, que sejam portadores dos genes
vip3A, chi e cry1Fa, e verificar possíveis associações entre polimorfismos gerados por RFLP-PCR e mortalidade
de larvas de S. frugiperda. Para tanto, 114 isolados foram submetidos à técnica de PCR com base em iniciadores
específicos para detecção dos genes vip3A, cry1Fa e chi. Larvas neonatas de S. frugiperda foram submetidas
aos testes de bioensaios utilizando-se isolados onde apenas um dos genes estavam presentes, além de isolados
portadores de duas e três combinações de genes, comparando-se os resultados com as linhagens padrão HD-125
var. kurstaki, B. thuringiensis var. aizawai HD137, B. thuringiensis var alesti (controle positivo) e B. thuringiensis var.
tenebriones (controle negativo). Para a técnica de PCR-RFLP, os fragmentos amplificados foram analisados com base
nas enzimas de restrição PciI, KpnI, PstI, BstNI, HaeII, HaeIII K HpaII. Os isolados de B. thuringiensis, provenientes
de diversas regiões do território brasileiro apresentaram diferentes combinações de genes cry1Fa, vip3A e chi e, a
presença do gene vip3A parece ter atuado em sinergia com o gene cry1Fa, promovendo um aumento na mortalidade
das larvas de S. frugiperda. Não se detectou polimorfismos na região amplificada para os três genes em estudo,
não sendo possível a associação com a média de mortalidade de S. frugiperda frente aos mesmos. Estes isolados
poderão, dado o seu potencial inseticida, serem fontes de genes a serem empregados em programas específicos e
eficientes de controle biológico da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda) utilizando a cultura transgênica do milho.
Apoio financeiro: CNPq/PIBIC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
3
Utilização de linhagens de Lactococcus lactis invasivas
como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais,
codificando o antígeno Hsp65 de Mycobacterium
leprae, em linhagens celulares epiteliais humanas
Saraiva, TDL1; Pereira, VB1; Mancha-Agresti, P1; Zurita-Turk, M1; Azevedo, V1; Miyoshi, A1
Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: Vacina de DNA, pValac, Hsp65, Lactococcus lactis, Mycobacterium leprae.
Introdução: O uso de bactérias como veículo para a entrega de plasmídeos vacinais pela rota oral constitui uma
estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para isto, bactérias patogênicas atenuadas
como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, ainda que o risco de reversão da patogenicidade limite
seu uso em humanos. Lactococcus lactis é uma Bactéria Láctica modelo considerada GRAS (Generally Recognized
As Safe) que vem sendo extensivamente utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível
de mucosas. Nesse contexto, L. lactis representa uma alternativa atrativa para a entrega de plasmídeos vacinais
em relação a patógenos atenuados. Assim, linhagens invasivas de L. lactis foram desenvolvidas (FnBPA+) e um
plasmídeo de expressão eucariótica foi construído (pValac; Vaccination using Lactic acid bacteria). Desta forma, a
utilização de linhagens invasivas de L. lactis para a entrega do pValac produzindo a proteína do choque térmico de
65 kDa (Hsp65) de Mycobacterium leprae, um antígeno imunodominante poderá representar uma nova estratégia
para o controle da tuberculose, uma doença infecto-contagiosa que atinge 1/3 da população mundial na forma
latente. Objetivos: Utilização de linhagens de L. lactis invasivas (FnBPA+) como veículos para a entrega de um
plasmídeo vacinal (pValac), codificando o antígeno Hsp65 de M. leprae, em células de mamíferos. Métodos: A
seqüência codificadora de Hsp65 foi clonada no vetor Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen) e posteriormente no vetor
pValac. A construção final, pValac:hsp65, foi primeiramente obtida em E. coli TG1 e posteriormente transferida
para L. lactis FnBPA+ por eletroporação. Para a avaliação da produção de Hsp65, células da linhagem Caco-2 serão
transfectadas com o plasmídeos pValac:hsp65 e a capacidade invasora da linhagem L. lactis FnBPA+(pValac:hsp65)
também serão verificadas nesta linhagem celular. Resultados parciais: A ORF hsp65 foi amplificada por PCR, com
aproximadamente 1.626 pb. A ORF foi clonada primeiramente no vetor Zero Blunt® TOPO® em E. coli TOP10, e a
clonagem confirmada por PCR e digestão enzimática. O inserto foi então clonado no vetor pValac e transformado em
E. coli TG1. A construção pValac:hsp65 foi confirmada por PCR, digestão e seqüenciamento (ABI3130). Conclusões:
Este projeto constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas
baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração em mucosas; o que também
poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
4
Análise da expressão diferencial de proteínas
extracelulares de linhagens de Corynebacterium
pseudotuberculosis isoladas de diferentes hospedeiros
Silva, WM ¹; Seyffert, N¹; Pacheco, LGC¹; Ciprandi, A²; Santos, AV3; Castro, TLP¹; Pimenta, A 3; Silva, A²;
Miyoshi, A¹; Azevedo, V¹
¹ Laboratório de Genética Celular e Molecular – Dep. de Biologia Geral ICB/UFMG
² Laboratório de Polimorfismo de DNA – ICB/UFPA
3
Laboratório de Veneno e toxinas de animais – Dep. de Bioquímica ICB/UFMG
[email protected] / [email protected]
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, linfadenite caseosa, proteínas extracelulares, DIGE
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, intracelular e anaeróbia facultativa, sendo
o agente etiológico da linfadenite caseosa, doença que acomete caprinos e ovinos por todo o mundo. Dentre
os poucos fatores associados à virulência da C. pseudotuberculosis já conhecidos, destacam-se proteínas
extracelulares como a exotoxina Fosfolipase D e um sistema de aquisição de ferro ( fagB). Proteínas secretadas
são conhecidas como mediadores importantes na interação patógeno-hospedeiro e podem atuar no mecanismo
de patogenicidade. Com o intuito de identificar novas proteínas associadas à virulência, este trabalho tem como
objetivo comparar as proteínas secretadas de linhagens de C. pseudotuberculosis isoladas de hospedeiro caprino
(1002) e ovino (C231). Para isto, as bactérias foram crescidas em meio quimicamente definido a 37ºC até atingir
crescimento exponencial (DO600nm=1,3); posteriormente, foi utilizada a técnica Three-phase partitioning para
obter as proteínas secretadas. Também foi extraído RNA das culturas para posterior análise por PCR em tempo
real. Foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional diferencial (DIGE) para avaliar as proteínas
extracelulares. As diferentes amostras foram marcadas com os fluoróforos Cy3, Cy5 e Cy2. Após a marcação foram
separadas numa primeira dimensão em tiras de gel com gradiente de pH imobilizado de 3 a 10 N.L. A SDS-PAGE
foi feita no sistema vertical Ettan DALTsix.. Todo o experimento foi realizado em triplicata. Os géis preparativos
e analíticos foram digitalizados no scanner Ettan DIGE Imager (GE-Healthcare). As imagens foram analisadas
com o programa ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE-Healthcare). A análise computacional demonstrou 26 spots
exclusivos da linhagem 1002, 23 spots exclusivos da linhagem C231 e 52 spots comuns entre as duas linhagens. A
análise de expressão diferencial entre linhagens de C. pseudotuberculosis levará a melhor compreensão sobre os
determinantes moleculares de virulência deste patógeno. As proteínas identificadas neste trabalho representam
potenciais alvos para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico melhorados e vacinas mais eficazes.
Apoio: CAPES, FAPEMIG, FAPESPA e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
5
Construção de uma biblioteca de scFv para
identificação de proteínas imunogênicas de
Corynebacterium pseudotuberculosis com potencial
vacinal
Soares, SC¹; Almeida, SS¹; Seyffert, N¹; Silva, WM¹; Riberiro, D¹;Santos, FAA2;Prudencio, CR2; Miyoshi, A¹;
Goulart, LR2; Vieira, CU2; Azevedo V¹
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
Laboratório de Nanobiotecnologia - Instituto de Genética e Bioquímica, UFU, BH, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis,biblioteca de scFv, proteínas imunogênicas, Linfadenite Caseosa, vacina.
Introdução: Corynebacterium pseudotuberculosis caracteriza-se por ser um patógeno Gram-positivo, nãoesporulante e pleomórfico, pertencente ao grupo das actinobactérias e causador da Linfadenite Caseosa (LC).
A LC é caracterizada pela presença de necrose caseosa em glândulas linfáticas ou formação de abscessos em
linfonodos superficiais e tecidos subcutâneos de ovinos e caprinos. O tratamento da doença com antibióticos é
ineficiente e de alto custo. As vacinas comerciais licenciadas para ovinos não possuem a mesma eficiência para
caprinos fazendo-se necessária a confecção de novas vacinas. Desta forma, está sendo utilizado no presente
trabalho uma metodologia para a geração de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de anticorpos gerados
através de imunização de galinhas com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis. Objetivo: A biblioteca
de anticorpos scFv será utilizada na identificação de antígenos (epítopos) de interesse vacinal. Metodologia:
Foi extraído RNA total de baço de galinhas imunizadas com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis. Em
seguida, realizou-se reações de retrotranscrição seguida de amplificação (PCR) utilizando iniciadores específicos
das regiões variáveis dos anticorpos com a finalidade de se obter uma biblioteca com alta variabilidade do
repertório imune. Serão realizados ciclos de seleção dos clones scFv reativos às proteínas secretadas de C.
pseudotuberculosis e a afinidade dos mesmos será confirmada por imunoensaio (ELISA). Perspectiva: Os
anticorpos recombinantes scFv serão, então, utilizados para seleção e caracterização de epítopos miméticos
à proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis que possuam potencial antigênico para a obtenção de
antígenos candidatos a vacina e diagnósticos subclínicos mais acurados para o controle e erradicação da LC.
Agências financiadoras: CNPQ, CAPES, FAPEMIG-RGMG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
6
Diversidade bacteriana associada à planta carnívora
Utricularia gibba L.
Crescente, JG1; Storte-Santos, FC1; Miranda, VFO2; Araujo, WL1
Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes
Laboratório de Sistemática Vegetal, Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes
1
2
Palavra-chave: Filogenia; genes conservados; utrículos; Chromobacterium, Utricularia gibba.
O gênero Utricularia spp. é um dos mais representativos dentro das plantas carnívoras conhecidas, tendo a carnivoria
uma importância para a complementação de nutrientes. Segundo alguns autores, após captura, a presa é degradada
com o auxilio da comunidade bacteriana presente nos utrículos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi isolar e
identificar bactérias associadas aos utrículos de U. gibba, por meio do seqüenciamento dos genes 16S RNAr, gyrB
e rpoB. Os resultados apontam que a densidade bacteriana dos utrículos varia de 3 a 4 X 103 UFC∙. utrículo-1. Foi
observado também que esta comunidade bacteriana cultivável é formada principalmente por espécies pertencentes
aos filos β-proteobactéria e Firmicutes, mas especificamente aos gêneros Bacillus, Chromobacterium, Enterobacter,
Rhodospirillaceae e isolados com similaridade ao grupo denominado de Burkholderiales Genera incertae sedis. Além
desses gêneros, foram isoladas bactérias que não apresentam similaridade com gêneros/famílias conhecidas,
sugerindo que podem ser espécies ainda não descritas. De fato, poucos estudos foram realizados com a comunidade
bacteriana associada à espécies de plantas do gênero Utricularia, mostrando ser esta uma comunidade bacteriana
pouco explorada e ainda desconhecida. Tendo em vista que bactérias associadas às plantas desempenham
importante papel na disponibilização de nutrientes (solubilização de fosfato e fixação de nutrientes) e proteção
contra estresse biótico e abiótico, podemos incluir também que em U. gibba, estas bactérias poderiam também
disponibilizar nutrientes por métodos clássicos, mas também por meio da degradação das presas. Tendo em vista
que esta é a primeira descrição da comunidade bacteriana associada a U. gibba, a atenção foi dada aos aspectos
taxonômicos dos diferentes isolados obtidos, visto que novos genótipos bacterianos poderão ser descritos e no
futuro caracterizados quanto ao potencial biotecnológico e papel no desenvolvimento da planta hospedeira.
Apoio Financeiro: FAPESP (Proc. 07/58277-7)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
7
Identificação de desordem proteica em proteoma de
Corynebacterium pseudotuberculosis usando dados de
phage display
Almeida, SS1; Seyffert, N1; Prudêncio, CR2; Santos, FAA2; Soares, SC1; D’Afonseca, V1; Pinto, AC1; Santos,
AR1; Ribeiro, D1; Cassiano, AAM1; Faria, CL1; Miyoshi, A1; Moore, R3; Goulart, LR2; Azevedo, V1
Laboratório de Genética Celular e molecular (LGCM), Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),
Belo Horizonte – MG Brasil
2
Laboratório de Nanobiotecnologia. Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia. 3CSIRO Australian Animal
Health Laboratory
[email protected]
1
Palavras-chave: Phage Display, Corynebacterium pseudotuberculosis, Ph.D.™-12, peptídeos, vacina
Introdução: A Linfadenite caseosa (LC) é uma doença infecto-contagiosa crônica, causada pela bactéria
Corynebacterium pseudotuberculosis. Esta doença acomete principalmente caprinos e ovinos e é, responsável por
perdas econômicas na ovinocaprinocultura em todo mundo, incluindo o Brasil. A caracterização dos genomas
de duas linhagens de C. pseudotuberculosis 1002 e C231 está permitindo estudos pós-genômicos e de genômica
funcional. Estes dados podem ajudar na compreensão dos mecanismos moleculares, estrutura genômica, arranjo
gênico, bem como, mecanismos associados a virulência e patogenicidade desse microrganismo. Neste trabalho
está sendo feita uma abordagem proteômica através da análise de desordem protéica nestas duas linhagens, estudo
inédito para o gênero. É bem conhecida a forte relação entre a estrutura e a função protéica, entretanto vários
estudos tem demonstrado a existência de proteínas e domínios protéicos sem estrutura definida e sua relação
com diversas doenças. Muitas destas proteínas estão envolvidas com a regulação da divisão celular, transcrição e
tradução, transdução de sinais, fosforilação protéica, atividade chaperona e a regulação da montagem de grandes
complexos protéicos como o do ribossomo. Objetivo: Neste contexto, a identificação de tais regiões pode ajudar
na determinação da estrutura, alinhamento de sequências, e no desenho de drogas. Assim, este trabalho tem como
objetivo identificar e caracterizar regiões que apresentam desordem no proteoma predito de C. pseudotuberculosis
linhagens C231 e 1002. Métodos: Para tanto, foram avaliados quatro preditores de desordem protéica: IUPred,
GLOBPLOT, DisEMBL e RONN, que posteriormente serão relacionadas a proteínas que tiveram seus ligantes
identificados através de phage display. Resultados: Resultados preliminares mostraram que aproximadamente 30%
do proteoma de ambas as linhagens foi predito como apresentando desordem. Conclusão: Assim, nós esperamos
poder integrar a metodologia de predição de desordem protéica ao phage display de C. pseudotuberculosis
para investigar as características das interações de ligantes que envolvem as regiões desordenadas.
Suporte Financeiro: CNPq, FAPEMIG, VALLEE
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
8
The Quorum-sensing system down regulates the
diGMP cyclic activating the motility, production
of exopolysaccharide and virulence factors in
Xanthomonas axonopodis pv citri
Andrade, M1; Texeira, R1; Prado, F1; Amaral, A3; Farah, C1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
Centro APTA Citros - Sylvio Moreira
Email: [email protected]
1
2
Palavras-chave: rpf, quorum-sensing, diGMP cyclic, virulence factors, Xanthomonas.
Cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play a large role in regulating physiological process in
bacteria, including the formation and dispersal biofilms, and virulence. It have been showed the ability of Xanthomonas
incite disease depends on several factors, as well as the adhesins, synthesis of extracellular enzymes, T3SS effectors
and exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes,
EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a difussible
signal factor (DSF). The synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are involved the
two-component system comprising RpfC and RpfG, which are encoded within the same operon. When exist a great
number of cells in the medium RpfG is thought to be phosphorylated in its response regulator domain by RpfC.
RpfG phosphorylated has its phosphodiestarase domain HD-GYP active (Ryan et al., 2006 and 2010). This work was
prompted to by the observation HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF)
proteins of Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) (Andrade et al., 2006). For studies rpf signaling in XAC we
produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding GGDEF interacting-HD-GYP domain of RpfG,
cap like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coding
by XAC genome. Analysis by HPLC-MS/MS showed the deletion of rpfG, but not clp, has promoted an increase of
approximately four times in the second messenger diGMP cyclic concentration in the cell. Also we demonstrated
by EMSA that the binding of Clp to promoter of gene XAC0694 ( first gene in the operon coding the type 2 secretion)
is inhibited by high concentration of diGMP cyclic. The rpf genes and Clp knockouts have impaired motility,
reduction in exopolissacarides and extracellar enzymes production. Further we notice a significant decreasing in
the growth of rpfG and clp mutants in the host. Our results demonstrated that the signalization involving RpfFRpfC-RpfG–Clp in XAC is essential in regulates diGMP cyclic cellular pool, motility, EPS and virulence factors.
Financial support: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
9
Seleção e caracterização de linhagens de Bacillus
thuringiensis ativas contra pragas economicamente
importantes no Brasil
Scarpassa, JA1; Carvalho-Filho, CD2; Dragalzew, AC1; Fazion, FAP1; Leonel, LV3; Souza, GMD1; Ricieto,
APS1; Vilas-Bôas, LA1; Vilas-Bôas, GT1
Universidade Estadual de Londrina, Londrina/PR
Universidade Federal da Bahia, Salvador/BA
3
Centro Universitário Filadélfia (UNIFIL)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, PCR, genes cry, Lepidoptera, controle biológico.
No Brasil, inseticidas sintéticos têm sido efetivamente usado, porém seu uso tem ocasionados problemas em
função de uma ampla gama de fatores, causando um incremento no interesse no uso de produtos a base da
bactéria Bacillus thuringiensis (Bt). No entanto, no Brasil, muitos destes produtos necessitam ser importados
interferindo em seu preço final, bem como criando dependência tecnológica. Estas características têm levado a um
crescente aumento nas pesquisas com o objetivo de desenvolvimento de novos produtos a base de Bt bem como
a prospecção de linhagens mais eficientes que permitam o desenvolvimento de novos produtos para controle
biológico de pragas de lavouras. Este trabalho visou à caracterização de uma população de isolados naturais
de Bt quanto a presença de genes cry (codificante da toxina responsável pela característica entomopatogênica
do bacilo) cujos alvos principais seja insetos da Ordem Lepidoptera, onde temos importantes pragas agrícolas.
Vários isolados de Bt obtidos de amostras de solo e restos de silos de estocagem foram pesquisados quanto a
presença de genes cry1, cry2 e cry3. A maioria dos isolados apresentaram reação positiva através da PCR, quando
se utilizaram iniciadores específicos para os genes cry1 e cry2. Por outro lado, somente algumas linhagens
apresentaram amplificação quando se utilizou iniciadores específicos para o gene cry3. Estas linhagens serão
posteriormente bioensaiadas contra diferentes pragas agrícolas. Esta caracterização poderá identificar novas
linhagens com potencial uso em campo bem como identificar genes que possam ser empregados para uso em
plantas transgênicas resistentes a insetos entre outras aplicações em programas de manejo integrado de pragas.
Apoio: CNPq, CAPES, FAPESB-BA, FUNDAÇÃO ARAUCÁRIA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
10
Identification of Phaseolus vulgaris genes differentially
expressed during interaction with Rhizobium sp.
NGR234
Schreiner, PG1; Hauer V1; Bonato, P1; Monteiro, RA2; Souza, EM2; Pedrosa, FO2; Bonatto, AC1; Wassem, R1
Laboratório de Interação Planta-Bactéria, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
Núcleo de Fixação de Nitrogênio, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
2
Keywords: Rhizobium, Phaseolus vulgaris, Type III Secretion System, Nodulation, Differential expression.
Rhizobium sp. NGR234 is a symbiotic microorganism that is able to fix nitrogen when interacting with leguminous
plants. Signal exchange between partners promotes the formation of nitrogen fixing symbiotic root nodules. The
Type III Secretion System (TTSS) is one of the main factors affecting symbiotic nodule formation in Rhizobium strains.
TTSS transports a wide variety of proteins (Nop and Rhc) to the extracellular medium and directly into the eukaryotic
cells cytoplasm, influencing the nodulation process. NGR234 secretes at least eight proteins trough TTSS, which
are dependent on the RhcN protein, responsible for the input of energy to the secretion machine. When secretion
of these proteins is abolished, nodule formation can be affected in different ways: inhibited, reduced or not affected.
However, plant genes involved in the response to the secreted proteins from rhizobia are unknown. To indentify
candidate genes, we harvested nodules from Phaseolus vulgaris (common beans) induced by different mutant strains
of NGR234 and screened for differentially expressed genes. After inoculation of P. vulgaris with the wild type, rhcN-,
nopN-, nopJM- and nopJ- strains of NGR234, differences in nodulation efficiency between the strains were observed.
The plants inoculated with the mutant strains produced more nodules in their roots. Total RNA was extracted
from symbiotic nodules and converted into cDNA by reverse transcription. PCR reactions using cDNA and random
primers were performed to amplify differentially expressed genes. Candidate genes observed after PCR were cloned
and sequenced. Potential function and involvement with the interaction with the bacterial strains are under analysis.
Supported by: CNPq, INCT-FBNG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
11
Estudo do papel do operon opp na virulência
e patogenicidade de Corynebacterium
pseudotuberculosis
Moraes, PMRO1; D’afonseca, V1; Costa, MP2; Hirata Júnior, R3; Rocha, FS1; Oliveira, CAA1; Miyoshi, A1;
Azevedo, V1
Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Universidade Estadual do Ceará
3
Faculdade de Ciências Médicas – DMIP, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, Linfadenite Caseosa, Transportador de peptídeos, oppD, operon opp.
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, parasita intracelular facultativa, causadora
da linfadenite caseosa, uma doença crônica contagiosa que acomete pequenos ruminantes e acarreta sérias
perdas econômicas para as atividades de ovino e caprinocultura. A ampla ocorrência e importância econômica
da enfermidade estimulam estudos sobre as bases moleculares da virulência deste patógeno. Dentre os fatores
moleculares associados à virulência encontrados em bactérias patogênicas, tem-se destacado os internalizadores
de peptídeos, que são complexos protéicos multi-subunitários pertencentes à família dos ABC transportadores.
Localizados na membrana plasmática, essas permeases são comumente compostas por 5 proteínas e possuem a
função de internalizar oligopeptídeos presentes no meio extracelular. Esses transportadores são conhecidos por
possuírem papel crucial na aquisição de nutrientes, comunicação celular (quorum sensing), controle na expressão
de genes de virulência, dentre outras funções. Com o intuito de estudar o papel do transportador de oligopeptídeos
na virulência e patogenicidade de C. pseudotuberculosis um plasmídeo suicida, contendo um fragmento do gene
codificador da subunidade protéica responsável por fornecer energia ao processo de internalização de oligopeptídeos
através da hidrólise de moléculas de ATP (oppD), foi transformado em C. pseudotuberculosis a fim de gerar linhagens
mutantes por eventos de recombinação homóloga simples. A confirmação dos eventos de recombinação foi feita
através de PCR. A linhagem mutante obtida foi avaliada quanto ao potencial de crescimento em meio complexo,
em comparação com a linhagem selvagem, através da confecção de curvas de crescimento. Ambas as linhagens
apresentaram o mesmo padrão de crescimento, possivelmente pela disponibilidade e abundância de fontes de
carbono que podem ser incorporadas por mecanismos alheios ao sistema ao qual pertence o oppD. Um experimento
piloto de infecção de camundongos com a linhagem mutante, e posterior desafio com a linhagem virulenta mostrou
que o mutante além de possuir um potencial reduzido de causar a morte e lesão em camundongos ofereceu uma
proteção de 40% aos animais imunizados. Com o intuído de verificar se a deficiência desse transportador interfere
na capacidade de C. pseudotuberculosis em aderir e colonizar macrófagos, foram feitos testes in-vitro de viabilidade
intracelular e de interação microbiana em macrófagos murinos comparando as linhagens selvagem e mutante. Os
resultados mostraram que apenas houve redução da adesão e infecção durante a primeira hora de infecção. Outros
experimentos estão sendo realizados para avaliarmos se o internalizador de oligopetídeos está realmente relacionado
à virulência e a patogenicidade de C.pseudotuberculosis e em que fase da doença esse transportador é importante.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
12
Abordagem genômica, através de MLSA, no estudo da
epidemiologia do Vibrio cholerae na América Latina
Marín, MA; Thompson, CC; Vicente, ACP
Laboratorio de Genética Molecular de Microorganismods, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Vibrio cholerae, MLSA, abordagem genômica.
Em 1991, Vibrio cholerae O1 El Tor emergiu na América do Sul, causando graves epidemias em cidades litorâneas
do Peru, espalhando-se rapidamente para o interior e outros países da América Latina. Estudos de ribotipagem
e eletroforese de campo pulsado, mostram a presença de polimorfismos em linhagens V. cholerae O1 El Tor
(Dalsgaard et al, 1997). Além disso, variantes deV. cholerae O1 El Tor isolados no Peru apresentaram perdas de
regiões da VSP-II, evoluindo independentemente em pouco tempo (Nusrin et al, 2009). Por outro lado, estudos
de Multilocus Sequence Analysis (MLSA) permitem o acesso a diversidade genômica de diferentes espécies de
Vibrios considerando aos genes do genoma core (Thompson, et al, 2009). O objetivo deste trabalho foi estudar a
diversidade genômica de V. cholerae O1 na América Latina, baseados em uma abordagem genomica mediante o
sequenciamiento dos genes recA, pyrH e mdh, de uma coleção de isolados ambientais e clínicos de V. cholerae O1
isolados do Peru e de outros paises latinoamericanos. Segundo os resultados encontrados, observa-se um grupo
principal, formado por isolados clínicos O1, obtidos durante a década de 90, clonais com a linhagem pandêmica
N1696. Os outros agrupamentos mostram-se mais diversos incluindo isolados pré-epidêmicos e ambientais de
diferentes países. Somente os isolados do grupo principal carreiam os dois principais deteminantes de virulência
em V. cholerae, a VPI-1, onde encontra-se o cluster gênico codificador do fator de colonização TCP e o profago
CTX. Resumindo, as análises genômicas mostraram que independentemente dos polimorfismos presentes em
isolados de V. cholerae O1 El Tor da epidemia da América Latina, esta epidemia foi decorrente da expansão clonal
da linhagem da sétima pandemia de cólera.
Apoio financeiro: Instituto Oswaldo Cruz / CNPq / CAPPES
References
Dalsgaard, et al. J. Clin. Microbiol. 35:1151–1156.
Thompson CC, et al. Int J Syst Evol Microbiol. 2008 Mar;58(Pt 3):617-21.
Nusrin S, et al. J Med Microbiol. 2009 Mar;58(Pt 3):342-54.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
13
Análise genômica comparativa de especializações
metabólicas em Enterobacteriaceae
Hilário, HO1; Franco, GR1; Lobo, FP1
1
Universidade Federal de Minas Gerais
Palavras-chaves: genômica comparativa, enterobacteriaceae, nicho metabólico, kegg, metabolismo de carboidratos
Organismos procarióticos são encontrados ocupando diversos nichos distintos na natureza. Tal fato se dá em
parte devido à grande variabilidade metabólica observada nesses organismos, os quais possuem a vasta maioria
das vias metabólicas conhecidas e são, consequentemente, capazes de utilizar diversos compostos como fonte de
energia e nutrientes. Um táxon procariótico de grande variabilidade metabólica é a família Enterobacteriaceae, a
qual é composta por bacilos gram-negativos que apresentam metabolismo anaeróbio facultativo, sendo capaz de
fermentar diversos açucares para a produção de ácido lático e vários outros subprodutos. Uma vez que diversos
genomas desse táxon encontram-se sequenciados torna-se possível, assim, diversos tipos de análise genômica
comparativa para se evidenciar possíveis caracterísiticas genômicas específicas desse táxon de forma a se
acrescentar mais conhecimentos a essa família de grande interesse médico e industrial. Nesse contexto, estudouse a variabilidade metabólica presente nessa família quando comparada à de todos os genomas de bactérias
sequenciados de forma a se estudar como a diversidade metabólica desse táxon se correlaciona com o seu modo
de vida. Para tal, desenvolveu-se uma metodologia para a busca por grupos de homólogos significativamente mais
(ou menos) representados em Enterobacteriaceae quando comparados a Bacteria. Para a obtenção dos genomas
de Enterobacteriaceae e de Bacteria devidamente anotados em grupos de genes homólogos compartilhados
(ou não) entre esses táxons, utilizou-se o banco de dados KEGG (Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes), o
qual fornece um dicionário comum de grupos de genes homólogos por curadoria manual. No presente estudo
utilizamos o genoma de 107 enterobactérias e de 1005 bactérias. Para se avaliar um dado grupo de homólogos
como diferencialmente super (ou sub) representado em Enterobacteriaceae quando comparado a Bacteria,
quatro números são definidos: T (total de genomas em Enterobacteriaceae), t (total de genomas em Bacteria),
N (total de genomas em Enterobacteriaceae que possui o grupo em questão) e n (total de genomas em Bacteria
que possui o grupo em questão). De posse desses quatro números, um teste qui-quadrado é realizado para
determinar se as razões p0 (x/(n-x)) e p1 (X/(N-X)) derivam da mesma distribuição verificando-se a probabilidade
das hipóteses nula (H0, p0 = p1) e alternativa (H1, p0 ≠ p1). Valores p foram calculados como a probabilidade
da cauda superior de uma distribuição qui-quadrado com um grau de liberdade. Como resultados, observamos
que diversas características conhecidas do metabolismo das enterobactérias foram evidenciadas nesse trabalho.
A maioria dos grupos de homólogos encontrados como diferencialmente representados em Enterobacteriaceae
constituem genes envolvidos no metabolismo energético e de carboidratos. Diversos grupos de homólogos
associados à produção de lipopolissacarídeos, um traço fenotípico clássico de bactérias gram-negativas.
Agência financiadora: FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
14
Efeito de KerV sobre a regulação dos operons de
síntese de piocianina em Pseudomonas aeruginosa
PA14
Nascimento, APB; Baldini, RL
Departamento de Bioquímica – Instituto de Química – Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, percepção de quorum, virulência, metiltransferase, piocianina.
Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista, geralmente associado a infecções em ambientes hospitalares,
que tem se tornado cada vez mais resistente ao tratamento com antibióticos convencionais. P. aeruginosa PA14 é
uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção
de hospedeiros filogeneticamente distintos. KerV é uma proteína relevante para a virulência de P. aeruginosa e
apresenta um domínio de metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina. A linhagem com deleção de kerV
apresenta uma maior produção de piocianina e alterações em outros fenótipos regulados pela cascata de regulação
de percepção de quorum (QS), sugerindo a participação de KerV nesta cascata. QS está envolvido com a regulação
da expressão de diversos genes, entre eles os que codificam para a síntese de piocianina, um metabólito secundário
que confere cor azulada as culturas de P. aeruginosa. A maioria das enzimas responsáveis pela síntese deste
metabólito são codificadas por dois operons quase idênticos, phzA-G1 e phzA-G2. Na linhagem PAO1, dados da
literatura apontam que apenas o operon phz1 seja expresso em condições de laboratório, mas dados preliminares
sugerem uma regulação diferente na linhagem PA14, que é mais virulenta que PAO1 em diversos modelos de
hospedeiro. Com o objetivo de investigar o papel da proteína KerV na cascata de regulação de percepção de
quorum e na síntese de piocianina, fusões de transcrição foram construídas com as regiões promotoras de phz1 ou
phz2 com o gene repórter lacZ. No mutante kerV, a transcrição a partir de phz1 está aumentada cerca de 3 vezes e
a transcrição de phz2 está aumentada cerca de 2 vezes. Mutantes com inserção de transposon nos operons phz1
e phz2 foram analisados quanto a produção de piocianina ao longo da curva de crescimento. No mutante phzA1,
a produção é cerca de 2,5 vezes maior quando comparado à linhagem selvagem, enquanto no mutante phzA2 a
concentração de piocianina está diminuída na mesma proporção. Esses dados sugerem a hipótese de que, em
PA14, os dois operons responsáveis pela síntese de piocianina são funcionais, porém um mecanismo de regulação
distinto pode estar envolvido na expressão do segundo operon, phz2. A expressão desses operons em mutantes para
outros genes envolvidos em QS também está sendo analisada. Mutantes duplos kerV-phz1 e kerV-phz2 estão sendo
construídos e sua caracterização trará novos dados sobre a regulação da síntese de piocianina na linhagem PA14.
Apoio financeiro: CAPES e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
15
Peptídeos miméticos de antígenos do Mycobacterium
leprae reativos à imunoglobulinas g de pacientes com
hanseníase
Lima, MIS1,2; Dias Oliveira, JD3; Marangoni, K1; Almeida, JF1; Capparelli, FE1; Fujimura, PT1; Reis, CF1;
Goulart, IMB4; Costa, JML5; Goulart, LR6
Laboratório de Nanobiotecnologia-UFU
Mestranda em Biotecnologia CPqGM-FIOCRUZ
3
Professora adjunta da Universidade Federal do Tocantins
4
Coordenadora do Centro Nacional em Hanseníase e Dermatologia Sanitária-CREDESH/UFU
5
Pesquisador Titular do Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz-FIOCRUZ
6
Professor titular do Instituto de Genética e Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hanseníase, Imunoglobulina G, Bacteriófago, Diagnóstico.
A hanseníase, doença crônica estigmatizante com potencial de causar danos neurológicos, resulta da infecção
pelo Mycobacterium leprae. O Brasil ocupa o segundo lugar no mundo, com taxa de prevalência de 2,05 casos por
10 mil habitantes. A existência de manifestações clínicas variadas, considerando parâmetros imunopatológicos
e de carga bacilar, classifica os pacientes em Tuberculóides (TT), Dimorfo-tuberculóides (DT), Dimorfo-dimorfo
(DD), Dimorfo-virchovianos (DV) e Virchovianos (VV), e ainda encontra-se um grupo indeterminado, onde os
aspectos de diferenciação da hanseníase não se desenvolveram. Essas variações refletem em diferenças que
vão de uma forte resposta imune celular com controle do crescimento do bacilo, no pólo tuberculóide, a uma
anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano. Atualmente, o diagnóstico da
hanseníase considera o exame dermato-neurológico e a baciloscopia como o padrão ouro, entretanto a busca
de métodos com maior acurácia, com alta sensibilidade e especificidade tem sido alvo nas pesquisas. Dessa
forma, o objetivo desse trabalho foi selecionar e caracterizar peptídeos miméticos funcionais de antígenos do
Mycobacterium leprae reativos contra IgGs totais purificadas de pacientes com hanseníase, visando validar os
peptídeos como marcadores de risco e/ou desenvolvimento de novos métodos de imunodiagnóstico. Para a
seleção, foi utilizada a tecnologia de phage display, usando bibliotecas randômicas de peptídeos expressos em
fagos filamentosos (PhD-7, Biolabs). Foi realizada uma seleção com IgGs de pacientes Tuberculóides e outra com
IgGs de pacientes Virchovianos. A validação dos peptídeos foi realizada utilizando o imunoensaio ELISA e o teste
de redução de colônias. Foram encontradas, após a pré-validação e sequenciamento, 17 sequências válidas para
o pólo Vichorviano e 12 no pólo Tuberculóide. Dentre estas, 4 peptídeos (2 do pólo Tuberculóide, T03, T04 e 2
do pólo Virchoviano, V06 e V13) foram selecionados para ensaios ELISA posteriores com conjuntos de soros de
pacientes Tuberculóides, Virchovianos e Controles, considerando seus padrões de reatividade, especificidade e
frequência. Os clones V06 e V13 foram altamente reativos para a forma Virchoviana no ensaio de ELISA com soros
individuais, e as análises de bioinformática apresentam similaridades às estruturas lineares e conformacionais
de chaperones e proteínas de membrana. No Ensaio de redução de colônias V06 apresentou uma redução
de 82% no grupo de soros de pacientes Virchovianos contra 8% e 10% nos grupos Tuberculóides e Controles,
respectivamente, indicando esse peptídeo como mimotopo do M. leprae. Este estudo aponta perspectivas
para a identificação de novos antígenos e para um melhor entendimento da interação patógeno-hospedeiro e
da resposta imune, e propicia a descoberta de novos alvos biológicos com potencial diagnóstico e terapêutico.
Apoio: FAPEMA, CNPq, FINEP, FAPEMIG, DECIT-Ministério da Saúde e CREDESH-UFU
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
16
Caracterização quimiomolecular de Bacillus sp.
endofítico de Eremanthus erytropappus (Asteraceae) e
bioatividade de seus metabólitos
Frias, UA1; Reis, MP2; Nascimento, AMA2; Takahashi,JA3; Mendes-Costa, MC1
Laboratório de Pesquisa em Química - Laboratório de Pesquisa em Fungos, Departamento de Ciências Biológicas, Centro Universitário
de Lavras- UNILAVRAS
2
Laboratório de Genética de Micro-organismos, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG
3
Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios- Departamento de Química – UFMG
[email protected]
1
Palavras-chave: Bactéria endofítica, Atividade antimicrobiana, ITS-PCR, tDNA-PCR, Fatty Acid Methyl Ester
A bactéria em estudo foi isolada das folhas de Eremanthus erytropappus (DC.) Macleish (candeia) coletadas em
vegetação nativa na FLONA de Passa Quatro - MG, em 2005. Esta bactéria apresentou atividade antagônica contra
fitopatogênicos e endofíticos. Solventes utilizados na extração não foram capazes de matar a bactéria, mostrando
ser altamente resistente. As atividades biológicas já constatadas para essa bactéria justificam a continuação
dos estudos relativos à sua potencialidade biotecnológica, frente a outros grupos de organismos patogênicos e
sua identificação taxonômica. Para isto, avaliou-se a atividade antifúngica dos extratos acetoetílico (AcOEt)
e butanólico (ButOH) frente a linhagens do dermatófito Candida albicans e dos fitopatógenos Colletotrichum
musae, C.chum, C. lindemuthianum, Fusarium oxysporum e Rhyzoctonia solani e frente as bactérias Shigella
flexneri, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli e Bacillus cereus ATCC 11778. Na avaliação da atividade antifúngica, o
extrato AcOet apresentou atividade satisfatória para a inibição de Candida albicans, Colletothrichum chum e C.
lindemuthianum, enquanto o extrato ButOH apresentou sensibilidade no crescimento de R. solani inibindo em
paralelo o crescimento de Candida albicans e C. lindemuthianum. Em relação à atividade antibacteriana, o extrato
foi eficiente para a inibição de todas as cepas confrontadas. Para a identificação taxonômica da bactéria realizouse análises da sequência parcial do gene de 16S rRNA e do fingerprinting tDNA-PCR e ITS-PCR; bem como a
análise de ácidos graxos da membrana através de High-Resolution Gas Chromatography of Fatty Acid Methyl Ester
(FAME). Em todos os experimentos as linhagens tipo Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23892 , B. sphaericus ATCC
14577, B. mycoides LFB 1315, B. licheniformis ATCC 6348, B. cereus ATCC 11778, B. pumilus ATCC 7061 e B. subtillis
ATCC 6633 foram usadas como referência. A análise filogenética da sequência do gene de rRNA 16S afiliou esta
bactéria ao grupo Bacillus subtillis. Os perfis fingerprinting de tDNA-PCR e ITS-PCR foram idênticos à B. pumillus
e B. subtillis, respectivamente. Além disso, o perfil de ácidos graxos exibiu similaridade existente entre os ácidos
graxos da bactéria endofítica com B. subtillis ATCC e B. pumilus ATCC, corroborando os resultados da análise
molecular. Estes dados sugerem fortemente que esta bactéria endofítica pode ser uma nova espécie de Bacillus.
Apoio financeiro: FAPEMIG e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
17
Dados preliminares sobre o índice de positividade no
diagnóstico molecular de contatos intradomiciliares de
pacientes com hanseníase no município de Imperatriz,
Maranhão
Rodrigues, TMS1; Rivas, PMS1; Pinho, JD1; Soares, REP1; Almeida, LP1; Lima, MIS1; Sousa, ABP2; Nunes,
SPH1; Goulart, IMB3; Pereira, SRF1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LabGeM), Universidade Federal do Maranhão
Centro de Referência em Dermatologia Sanitária de Imperatriz
3
Centro de Referência Nacional em Hanseníase/ Dermatologia Sanitária (CREDESH)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hanseníase, Mycobacterium leprae, epidemiologia molecular, contatos domiciliares, PCR.
Introdução: A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa causada pelo parasita intracelular obrigatório
Mycobacterium leprae, que possui tropismo positivo para o sistema nervoso periférico e pele. Constitui um
problema de saúde pública no Maranhão, sendo hiperendêmica no município de Imperatriz (137,5 casos/10000
habitantes). Por se tratar de uma doença com período assintomático, faz-se necessária a utilização de métodos
mais sensíveis para detecção precoce do bacilo. Objetivo: Detectar Mycobacterium leprae pela técnica de PCR
em amostras de swab bucal e nasal de contatos de pacientes com hanseníse no município de Imperatriz (MA).
Métodos: 50 amostras de swab bucal e 49 de swab nasal de contatos de pacientes com hanseníase foram coletadas
no Centro de Referência em Dermatologia Sanitária de Imperatriz e processadas no LabGeM da UFMA. O DNA
total das amostras foi extraído e quantificado. A técnica de PCR foi realizada para amplificar 2 fragmentos: um
de 130pb do DNA do bacilo e outro de 200bp do gene N-ramp. Os amplicons foram separados por eletroforese
em gel de agarose 2%, corados com brometo de etídio, observados sob luz UV e fotodocumentados. Resultados:
2% das amostras de swab nasal apresentaram positividade para M. leprae. Em relação às amostras de swab
bucal, observamos o mesmo percentual de positividade (2,0%). Dentre esses contatos positivos, todos possuíam
caso índice classificado como multibacilar. Dentre os contatos negativos para M. leprae, 58,3% correspondem a
contatos domiciliares de pacientes multibacilares, 21,9% são contatos de pacientes paucibacilares e, 15,6% têm
classificação operacional indeterminada. Conclusões: A aplicação desta técnica para detecção de M. Leprae
em contatos permite detectar casos positivos antes do aparecimento dos sintomas clínicos, oportunizando o
tratamento precoce dos pacientes, sendo, dessa forma, uma ferramenta fundamental para o controle da doença.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
18
Transporte de L-glutamato e produção de goma
xantana em Xanthomonas axonopodis pv. citri
Nishidomi, Sa, Rojas, RGa, Nepomuceno, Ra, Campi, EOa;eFerreira, RCCa
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, Brasil
[email protected]
a
Palavras-chave: Xanthomonas, glutamato, transporte de nutrientes, goma xantana
Introdução: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é a causadora do cancro cítrico, infecção responsável por grandes
prejuízos à economia brasileira e mundial. Como muitos fitopatógenos, Xac produz polissacarídeos extracelulares
que são importantes durante a infecção, sendo o principal a goma xantana. A importância da goma xantana,
entretanto, não se restringe aos processos de infecção, sendo esta largamente utilizada na indústria principalmente
como emulsificante e estabilizadora em produtos alimentares, cosméticos e derivados. Objetivos: Analisar o
sistema de transporte ativo do aminoácido glutamato e seu envolvimento na produção de goma xantana em Xac.
Métodos: Para caracterização bioquímica do transportador de glutamato foram realizados ensaios de transporte
com substrato radioativo. Culturas de Xac foram crescidas em meio definido contendo diferentes concentrações
de glutamato, ácido gama-aminobutírico (GABA) e glicose (0mM, 1mM, 25mM, 50mM, 100mM e 250mM). A
produção de goma foi avaliada após precipitação por cloreto de potássio e etanol a partir do sobrenadante das
culturas. Resultados: Os ensaios bioquímicos mostraram que o transporte de glutamato em Xac é mediado por íons
e gradiente de prótons e dependente de ATP. Observou-se também significativo aumento na produção de goma
xantana em culturas crescidas em meio suplementado com ate 100 mM de L-glutamato em comparação com
GABA (aminoácido estruturalmente relacionado ao glutamato) ou mesmo glicose. Conclusões: A caracterização
bioquímica do transporte de glutamato em Xac, somada aos resultados relacionados com o aumento da produção
de goma xantana, sugerem que a produção do exapolissacarídeo esta relacionada com a captação de aminoácidos.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
19
Índice de positividade no diagnóstico molecular de
pacientes com hanseníse no município de São Luis Maranhão
Soares, RP; Rivas, PMS; Rodrigues, TMS, Diniz, JP; Almeida, LP; Lima, MIS; Aquino, DMC; Figueredo, IA;
Paiva, MFL; Nunes, SPH; Goulart, IMB; Pereira, SRF
Universidade Federal do Maranhão
[email protected]
Palavras-chave: Mycibacterium leprae, hanseníase, swab bucal, swab nasal, PCR.
A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, caracteriza-se como uma doença infecto-contagiosa de longa
duração que constitui um problema de saúde pública em diversos países. O Brasil ocupa o segundo lugar do
mundo em número absoluto de casos de hanseníase, sendo o primeiro das Américas. O Estado do Maranhão é
classificado como região hiperendêmica pelo Ministério da Saúde. Segundo a Secretária de Saúde do Maranhão,
o Estado registrou 6,26 milhões, no ano de 2007 e apresentou um índice médio de detecção de 6,7 casos por
10.000 habitantes. Dos 4.175 casos registrados, 384 estavam abaixo de 15 anos de idade (1,6 casos/10.000). Este
trabalho teve como objetivo detectar o DNA do M. leprae em amostras de swab bucal e nasal de pacientes da
cidade de São Luís-MA, utilizando o método de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), para gerar fragmentos
de 130pb da região RLEP3 (X17153). Os pacientes foram classificados de acordo com a classificação de Ridley
& Jopling. As mucosas de 25 pacientes foram coletadas no Ambulatorio de Dermatolgia do HU-UFMA e
processadas no LabGeM da UFMA. O DNA total das amostras foi extraído, quantificado e os fragmentos de
130pb do DNA de M. leprae foram separados por eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo de
etídio e fotodocumentados. Os pacientes foram classificados em Multibacilar (36%) e Paucibacilar (36%) e 7
nao tiveram sua classificacao operacional informada. Dos 25 pacientes avaliados, 4 (16%) foram positivos para
a presenca do bacilo, sendo que 3 destes foram classificados operacionalmente como Multibacilares e um não
teve sua classificacao informada. Em dois pacientes (8%) a positividade foi observada apenas em amostras de
swab nasal. Apesar de serem dados preliminares, este trabalho ja revela a importância da detecção do bacilo em
mucosas dos pacientes de modo a relacionar a presença do bacilo nessas regiões com a forma clínica da doença.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
20
Análise computacional da interação entre proteínas
FeSII e o complexo nitrogenase em bactérias fixadoras
de nitrogênio
Bitar, M; Lery, LMS; Costa, MGS; Bisch, PM
Laboratório de Física Biológica – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Proteção Conformacional, Fixação de Nitrogênio, Gluconacetobacter diazotrophicus, Modelagem Comparativa,
Dinâmica Molecular.
Gluconacetobacter diazotrophicus e Azotobacter vinelandii são bactérias aeróbicas fixadoras de nitrogênio.
O oxigênio, apesar de essencial para a sobrevivência dessas espécies, pode levar à degradação do complexo
nitrogenase, responsável pela fixação biológica do nitrogênio. Tendo em vista este aparente paradoxo,
mecanismos compensatórios foram desenvolvidos por esses organismos. Em Azotobacter vinelandii, um
mecanismo de proteção conformacional foi descrito, envolvendo a interação entre o complexo nitrogenase e uma
proteína FeSII dimérica. Estudos anteriores sugerem a existência de um sistema similar em Gluconacetobacter
diazotrophicus, porém, não descrevem a proteína envolvida neste mecanismo. Desta forma, este trabalho utiliza
ferramentas de bioinformática com o objetivo de identificar o gene codificador da proteína FeSII putativa no
genoma de Gluconacetobacter diazotrophicus e caracterizar em detalhes moleculares o mecanismo de proteção
conformacional em ambas as espécies. Após uma análise minuciosa considerando critérios de anotação, peso
molecular, presença de domínio funcional característico e padrão de enovelamento conservado, foi encontrado
um gene de Gluconacetobacter diazotrophicus que codifica uma proteína FeSII putativa nesta espécie (Gdia0615).
Em seguida, a técnica de modelagem comparativa foi empregada na geração de modelos estruturais das proteínas
FeSII (Azotobacter vinelandii), Gdia0615 e do complexo nitrogenase (Gluconacetobacter diazotrophicus), que não
possuíam estrutura tridimensional determinada experimentalmente. Todos os modelos gerados foram avaliados
quanto à sua energia e características estruturais e estereoquímicas. Os modelos selecionados das proteínas FeSII
e Gdia0615 foram submetidos à técnica de ancoramento molecular, gerando estruturas homodiméricas, que
interagem em uma região composta principalmente por resíduos hidrofóbicos e básicos com grande exposição
ao solvente na estrutura forma monomérica. Ambas as estruturas diméricas foram submetidas à simulações de
dinâmica molecular, apresentando comportamento estável em uma análise de 10 ns, o que corrobora a hipótese
de uma estrutura nativa na forma homodimérica estar atuando no mecanismo de proteção conformacional
nas duas espécies bacterianas estudadas. As estruturas diméricas foram submetidas à análises de ancoramento
molecular, para avaliar sua interação com o complexo nitrogenase em cada organismo. Resultados gerados em
Azotobacter vinelandii revelam uma interação proteica que ocorre na interface entre as duas enzimas que formam
o complexo nitrogenase. Esta conformação corrobora dados disponíveis na literatura e é capaz de explicar algumas
observações moleculares feitas anteriormente sobre o mecanismo de proteção conformacional. O ancoramento
molecular entre a proteína Gdia0615 e o complexo nitrogenase de Gluconacetobacter diazotrophicus está sob
análise e resultados preliminares apontam para um mesmo padrão de interação. Estes resultados revelam padrões
estruturais conservados envolvidos na interação proteica entre proteínas FeSII e o complexo nitrogenase em dois
organismos diazotróficos distintos. Assim, podemos concluir que esta é uma etapa inicial de uma caracterização
molecular detalhada do mecanismo de proteção conformacional.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
21
Caracterização da comunidade endofítica associada à
Xylella fastidiosa em Coffea arabica assintomático e
sintomático para a Atrofia do Ramo do Cafeeiro
Ciraulo, MB1; Brum, MCP1; Ferreira, AJ1; Lacava, PT2; Araújo, WL1; Azevedo, JL2
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP
Departamento de genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” –USP, Piracicaba, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, endófitos, ARC, Coffea arábica, isolamento de endófitos.
Atrofia dos Ramos do Cafeeiro (ARC) é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, a qual coloniza os vasos do xilema
de uma ampla variedade de espécies de plantas. Diferentes isolados deste fitopatógeno têm sido associados ao
desenvolvimento de patogênese em espécies de plantas com significativa importância econômica em toda a
América. Esta bactéria está disseminada em todas as áreas produtivas de cafeeiros do Estado de São Paulo e em
outros estados brasileiros. Foi observado que algumas plantas convivem com X. fastidiosa em seus vasos xilemáticos,
sem apresentarem sintomas da doença. Tendo em vista que estas plantas são geneticamente idênticas às plantas
afetadas, uma possível explicação para a resistência à ARC pode estar na comunidade endofítica presente na planta
hospedeira. Neste contexto, este trabalho tem como principal objetivo isolar e caracterizar a comunidade endofítica
do cafeeiro, Coffea arabica, cultivar Bourbon Amarelo em culturas assintomáticas e sintomáticas para a ARC e
avaliar a interação entre a comunidade endofítica do café e X. fastidiosa. Foram isolados 449 fungos e 207 bactérias
associadas às plantas sintomáticas e assintomáticas de C. arabica cv. Bourbon Amarelo. A densidade bacteriana
nas plantas avaliadas não foi significativamente diferente nas duas categorias de plantas, sendo aproximadamente
105 a 106 CFU g-1. Em relação ao isolamento de fungos endofíticos de C. arabica cv. Bourbon Amarelo, uma maior
frequência de infecção foi observada em isolamentos de fungos em folhas de culturas sintomáticas (0,71), quando
comparadas com a frequência de infecção de isolado de folhas de culturas assintomáticas (0,49). A frequência de
infecção em ramos não foi significativamente diferente nas duas categorias de plantas, sendo 0,84 em ramos em
culturas sintomáticas e 0,85 em ramos em culturas assintomáticas Por meio do sequenciamento do 16S rDNA,
foi observado que a comunidade bacteriana endofítica do cafeeiro é composta por pelo menos 20 gêneros, sendo
Actinomyces, Bifidobacterium, Campylobacter, Chryseobacterium, Curtobacterium, Luteibacter, Marinomonas,
Microbacterium, Pantoea, Patulibacter, Rhizobium, Thermus, Mycobacterium, Methylobacterium, Xanthomonasisolados
de culturas sintomáticas e Achromobacter e Agreia, isolados de culturas assintomáticas. Os gêneros Enterobacter.
Pantoea e Luteibacter foram encontrados em iguais proporções em culturas sintomáticas e assintomáticas.
Os resultados obtidos poderão fornecer subsídios para o controle das doenças provocadas por X. fastidiosa.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
22
Identificação de proteínas Cry de linhagens de Bacillus
thuringiensis visando a determinação da atividade
entomopatogênica
Fazion, FAP1; Dragalzew, AC1; Leonel, LV3; Carvalho-Filho, CD2; Scarpassa, JA1; Souza, GMD1 ; Ricieto, APS1;
Vilas-Bôas, LA1; Vilas-Bôas, GT1
Universidade Estadual de Londrina, Londrina/PR
Universidade Federal da Bahia, Salvador/BA
3
Centro Universitário Filadélfia (UNIFIL)
1
2
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, SDS-PAGE, proteínas Cry, controle biológico, bactéria entomopatogênica
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica e essa atividade é devido à formação de cristais
protéicos durante a esporulação. Estes cristais são compostos de proteínas denominadas Cry, codificadas
freqüentemente por genes plamidiais. Atualmente são conhecidos diferentes tipos de proteínas Cry, cujo
tamanho pode variar de cerca de 30 kDa a 130 kDa, sendo que proteínas Cry de tamanhos semelhantes podem
apresentar toxicidade a insetos pertencentes à mesma Ordem. Uma das principais linhas de pesquisa nesta área
é a prospecção de novas linhagens com perfis diferentes de ação e com maior potencial biotecnológico. Neste
sentido a Universidade Estadual de Londrina conta com um banco com linhagens de B. thuringiensis que vem
sendo caracterizadas geneticamente. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de proteínas
Cry de diferentes linhagens de B. thuringiensis do banco, utilizando a metodologia de eletroforese em gel de
poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE), visando direcionar a realização de bioensaios frente a diferentes
ordens de insetos. Foram identificadas proteínas Cry de diferentes tamanhos, incluindo 130 kDa, 60 kDa, 50
kDa e 40 kDa, entre outros. Os dados obtidos com cada linhagem estão sendo confrontados com dados obtidos
com a metodologia de PCR utilizando-se de iniciadores específicos para os genes cry, visando verificar a possível
ocorrência de proteínas Cry e/ou genes cry não identificados. Em acréscimo, os resultados obtidos estão sendo
empregados para o planejamento de experimentos de bioensaios contra diferentes insetos alvo, direcionandose a realização dos mesmos, conforme o tamanho das proteínas Cry ou o tipo de genes cry identificados.
Apoio financeiro: CNPq, UEL e FAPESB-BA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
23
Identificação molecular de bactérias láticas com
potencial probiótico isoladas de suínos
Alvim, LB1; Santos, DL2; Moreira, JLS1; Nicoli, JR3; Nunes, AC1
Laboratório de Genética Molecular de Protozoários Parasitas, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais
2
Médico veterinário, Microvet, Viçosa/MG
3
Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, probióticos, suínos.
Introdução: A criação de suínos ocupa lugar de destaque na matriz produtiva do agronegócio nacional com
mais de 3,0 milhões de toneladas deste produto em 2008 e um faturamento médio de US$ 93,3 milhões por ano.
Com a intensificação da produção suinícola os criadores passaram a adotar um desmame precoce dos leitões,
visando aumentar o potencial produtivo da matriz. Este fator impõe os animais às condições diferentes da que se
encontravam, promovendo a diminuição no consumo de alimento, redução de ganho de peso e frequentemente
diarréias, morbidez e morte. Os antibióticos tradicionalmente usados para o tratamento de diarréias algumas vezes
mostram-se ineficazes devido ao uso frequente de alguns princípios ativos, sendo observados casos de resistência.
Neste sentido, o uso de probióticos visando um melhor desempenho no crescimento e no índice de conversão
alimentar dos animais sem a utilização dos tradicionais promotores de crescimento pode ser visto como uma
alternativa eficaz, uma vez que permitem a eliminação de resíduos dos antimicrobianos nas carcaças, atendendo
as exigências do mercado para a exportação, além de outros benefícios relevantes, como o controle de diarréia
e a imunoestimulação. Objetivos: Isolar e identificar bactérias láticas de suínos para posterior utilização como
probióticos para suplementação alimentar e promoção de crescimento. Métodos: As amostras foram coletadas
das fezes e boca de seis leitões e duas porcas de uma granja da empresa Piglândia, localizada em Coimbra/MG.
Elas foram suspensas e homogeneizadas em função do peso, numa diluição 10-2 em salina estéril. As diluições
adequadas foram semeadas em placa de Petri contendo MRS e incubadas a 37o C, em câmara de anaerobiose
por 2 a 3 dias, sendo posteriormente realizada a enumeração e o isolamento. Para identificação dos isolados
foi realizada coloração de Gram, teste de catalase e PCR-ARDRA, a fim de identificar-los ao nível de espécie.
Resultados: Foram isolados 26 morfotipos, todos Gram positivos e catalase negativos. A partir da coloração
de Gram foram observados 14 bacilos, 9 cocos e 3 cocobacilos. A PCR-ARDRA demonstrou que os isolados
pertencem a 5 espécies, sendo 3 de Lactobacillus spp. (3 bandas), uma de Enterococcus spp. (2 bandas) e uma
de Streptococcus spp. (1 banda). Conclusões: Os resultados apresentados fazem parte dos dados preliminares
a serem utilizados na confecção de probióticos para suínos. Posteriormente serão realizados a identificação
das espécies por meio da observação do perfil de bandas pelo tratamento com enzimas de restrição além de
testes para caracterização do potencial probiótico destas espécies, como a resistência a sais biliares, adesão às
células gastrointestinais e antagonismo contra os principais patógenos de suínos com impacto na produção.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
24
Determinação dos fatores de transcrição e sinais
celulares envolvidos na regulação do gene cspC em
Caulobacter crescentus
Santos, JS; Silva, CAPT; Balhesteros, H; Italiani, VCS; Marques, MV
Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Caulobacter crescentus, cspC, fase estacionária, choque frio, regulação gênica As proteínas de choque frio pertencem a uma família de proteínas com um domínio altamente conservado,
denominado domínio de choque frio (CSD). Apresentam massa molecular similar (~7.4 kDa) e motivos RNP1
e RNP2, necessários a ligação a ácidos nucléicos de fita simples. Estão envolvidas a vários processos celulares,
incluindo adaptação a baixas temperaturas, estresse nutricional, crescimento celular e fase estacionária.
Caulobacter crescentus, uma α-proteobactéria Gram-negativa oligotrófica possui em seu genoma quatro genes
codificando CSPs: cspA, cspB, cspC e CspD. CspA e CspB são expressas durante o choque frio e apresentam um
único domínio CSD. CspC e CspD possuem dois CSDs e são expressas em fase estacionária. Este trabalho tem
como objetivo determinar os fatores de transcrição e sinais celulares envolvidos na regulação do gene cspC em C.
crescentus. Uma abordagem inicial utilizou a varredura de uma biblioteca de 4000 clones mutados com a inserção
do transposon Tn5, estes clones foram conjugados com Escherichia coli S17-1 contendo a construção PcspC/lacZ
(promotor de cspC clonado à frente do gene repórter lacZ no pRKlacZ290). Como controle positivo foi utilizado
a linhagem NA1000 de C. crescentus carregando o plasmídeo PcspC/lacZ e como controle negativo a linhagem
NA1000 de C. crescentus carregando uma construção onde a região presumivelmente ativadora do gene cspC está
ausente (PH2/lacZ). A seleção dos mutantes ocorreu inicialmente através de ensaios qualitativos de metabolização
de X-Gal e posteriormente se avaliou a expressão do gene cspC quantitativamente pelo ensaio de atividade de betagalactosidade. Foram selecionados 24 mutantes que apresentaram níveis mais baixos de expressão em relação ao
controle positivo. Através de seqüenciamento de DNA identificamos cinco dos mutantes selecionados: CC0001
(proteína hipotética); CC0086 ( fosforibosil aminoimidazole carboxamida formiltransferase); CC2101 (pequena
subnidade acetado lactato sintase); CC2428 (polimerase de polissacarídeo hfsC); CC3501 (NADPH- sulfito redutase).
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
25
Analysis of the role of iron in regulation of putative iron
starvation sigma factors from Caulobacter crescentus
Balhesteros, H1; Marques, MV1
Laboratório de Fisiologia de Micro-organismos, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Keywords: Iron, Iron starvation sigma factors, Fur, Gene regulation, Caulobacter crescentus.
Iron is an essential micronutrient for most organisms, participating on the structure of many proteins important
to energetic metabolism. However, given the toxicity and poor solubility of this metal in aqueous environments,
bacteria have developed several specific mechanisms for iron uptake. Among them, there are iron chelators
called siderophores, which are organic molecules that are secreted by several bacterial species. Also, there are
specific transport systems and regulation of genes according to iron availability in the environment. Part of
this gene regulation is made by specific sigma factors, denominated iron starvation sigma factors, which bind
to RNA polymerase core to transcribe siderophore transport or biosynthesis genes. These sigma factors are
usually regulated by Fur, a transcriptional repressor of genes involved in iron uptake, with Fe2+ necessary as a
co-repressor and signaling for iron availability. The genome of Caulobacter crescentus possesses four genes
encoding putative iron starvation sigma factors. Contrary to the model observed in other bacteria, there are
no Fur-binding sites upstream of these genes. The importance of these regulatory systems in the expression of
genes involved in siderophore synthesis or transport has not yet been determined in C. crescentus. In this work,
it was investigated if the putative iron starvation sigma factors genes of C. crescentus respond directly to iron. To
evaluate this, the promoter regions of three of these genes were amplified and cloned in transcriptional fusions
with the lacZ reporter gene, and expression were verified by beta-galactosidase activity assays in the presence
of ferrous sulphate or the iron chelator 2,2-dipyridyl. There was no induction of the genes in condition of iron
starvation, indicating that they are not directly regulated by iron availability. Additional assays were performed
employing a C. crescentus strain mutant for the fur gene as background. The obtained results showed that there
was no significant induction of these genes in this mutant, indicating that probably there is no Fur-mediated
regulation of expression for these sigma factors, differently from the regulation model observed in other bacteria.
Financial support: FAPESP and CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
26
Busca por alvos de regulação pelo segundo
mensageiro c-diGMP em Pseudomonas aeruginosa
PA14
Nicastro, GG; Baldini, RL
Instituto de Química, Departamento de Bioquímica, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, c-di-GMP, regulação gênica.
Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que atua como um patógeno oportunista,
causando infecções em pacientes imunocomprometidos, sendo o maior causador de infecções crônicas em
pacientes portadores de fibrose cística. O segundo mensageiro bis-(3›,5›)-di-guanosina monofosfato cíclico (c-diGMP) está relacionado com a patogenicidade e a adaptação de diversas bactérias, coordenando a expressão de
genes envolvidos com virulência, motilidade e formação de biofilme. O genoma de P. aeruginosa PA14 apresenta
vários genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo de c-di-GMP, o que pode indicar um amplo
papel regulatório deste nucleotídeo. Dentre essas proteínas, o regulador de resposta PvrR apresenta um domínio
EAL na porção carbóxi-terminal e está relacionada com a reversão de fenótipo de colônias pequenas (SCV), em
que as células são hiperpiliadas, para a morfologia normal. A diguanilato ciclase anotada como PA14_72420
apresenta uma alta atividade enzimática. Com o objetivo final de procurar por novos alvos de regulação gênica
mediados por c-di-GMP, linhagens em que os níveis de c-di-GMP podem ser controlados foram construídas. Os
genes pvrR ou PA14_71420 sob o controle do promotor araBAD foram integrados no cromossomo da linhagem
selvagem PA14, originando as linhagens RB210 e RB211. Analises fenotípicas dessas linhagens em condições de
indução confirmaram que a superexpressão de pvrR diminuiu a formação de biofilme e aumentou as motilidade
do tipo swarming e swimming, enquanto que a superexpressão de PA14_72420 apresentou fenótipo inverso, ou
seja, maior formação de biofilme e motilidade diminuída, corroborando dados relacionados com os níveis de
c-di-GMP. Essas linhagens foram utilizadas para a construção de bibliotecas pela inserção do transposon ISlacZ/
ha. Nesse transposon, o gene repórter lacZ não apresenta promotor e região de início de tradução. Assim, na
presença de X-gal, apenas inserções que originarem fusões de tradução apresentam colônias de coloração
azul. Até o momento, foram obtidos cerca de 1000 clones que apresentam colônias azuladas para ambas as
linhagens. Esses clones serão repicados na presença e ausência do indutor arabinose e aqueles que apresentarem
intensidades diferentes nas duas condições serão selecionados e os locais de inserção sequenciados. Esse tipo
de estudo poderá trazer não só uma maior compreensão do papel de c-diGMP na fisiologia destes organismos,
mas também poderá identificar prováveis alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-infectivas.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
27
Genômica comparativa e contexto genômico dos genes
purT e purN em procariotos
Santos, FB1; Alves, DF1; Marbach, PAS1
Laboratório de Genética e Evolução - Centro de Ciências Agrária, Ambientais e Biológicas, Universidade Federal do Recôncavo da Bahia
[email protected]
1
Palavras-chave: Biossíntese de purinas, Genômica comparativa, Evolução de vias Biossintéticas, correlação de genes.
Apesar do vasto conhecimento bioquímico da biossíntese de purinas ainda existem lacunas sobre a sua evolução
e diversidade estrutural em procariotos. Por exemplo, reações da terceira etapa desta via envolvem a participação
dos genes purN/purT. Alguns destes genes não estão presentes no genoma de linhagens eucarióticas, como plantas
e metazoários, portanto, podem ser alvos para fármacos antimicrobianos, contudo, sua distribuição nas linhagens
procarióticas ainda é desconhecida. O objetivo deste trabalho foi determinar a distribuição e o contexto genômico
dos genes purT e purN, em espécies do Domínio Archaea e Bacteria, assim como o estudo da anticorrelação destes
genes. A genômica comparativa dos referidos genes foi realizada por meio de buscas pelos genes purT e purN
nos genomas de microrganismos procariotos disponíveis na base de dados do NCBI. O Contexto Genômico foi
obtido para cada gene nas espécies da base de dados do BioCyc. A genômica comparativa revelou que purN, ao
contrário de purT, está presente no genoma da maioria das espécies procarióticas e, 38% das espécies que possuem
purT também possuem purN. O score de anticorrelação destes genes é de 0,27 indicando que apesar de serem
análogos eles não anticorrelacionam. Em 67% dos organismos purN está em operons que contém outros genes
da via, ao contrário de purT, somente 2% dos casos. Os resultados sugerem que purT é, geralmente, transferido
horizontalmente e que sua função na biossíntese de purinas pode ser secundária. Logo, apesar de purT estar
amplamente distribuído em β e γ-proteobacteria, grupos que possuem espécies patogênicas para metazoários,
ele pode não ser um alvo em potencial para fármacos antibacterianos. Os resultados indicam também que o gene
purN foi preferenciamente selecionado em relação a purT nas linhagens procarióticas.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
28
Analise da diversidade genética de bactérias
associadas à planta carnívora de Utricularia foliosa
(Lentibulariaceae)
Storte-Santos, FC1; Crescente, JG1; Miranda, VFO2; Araújo, WL1
LABMEM – Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das
Cruzes
2.
LFV – Laboratório de Sistemática Vegetal, Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes.
[email protected]
1.
Palavras-chave: Utricularia ssp., associação bactéria-planta, gene 16S rRNA, diversidade genética, biotecnologia.
Utricularia ssp. é um gênero da família Lentibulariaceae que apresenta folhas modificadas em armadilhas de
captura, denominadas de utrículos. Alguns autores sugerem que após a captura e morte por asfixia da presa,
bactérias presentes nos utrículos participam do processo de decomposição. Dessa forma, o objetivo desse trabalho
foi caracterizar a comunidade bacteriana cultivável associada aos utrículos e estolões de U. foliosa. Para isso,
bactérias associadas aos estolões e aos utrículos foram isoladas em meio de cultura TSB 5%, avaliadas quanto
a produção de amilase e solubilização de fosfato, e posteriormante identificadas por meio do sequenciamento
do gene 16S RNAr. Os resultados mostram que a densidade bacteriana em utrículos e estolões foi de 3,64 a 5,01
Log10 UFC.U-1, e 5,52 a 5,93 Log10 UFC.gtecido, respectivamente. Já a analise da similaridade pelo gene 16S rRNA
produziu quatro árvores filogenéticas, sendo que 75% dos isolados de utrículos pertencem ao filo Actinobacteria,
sendo Microbacterium resistens e Blastococcus sp. os grupos mais impotantes. Alem deste grupo, foram isoladas
de utrículo e estolões bactérias pertencentes ao filo Proteobacteria, incluindo as classes Alfaproteobacteria
(Rhizobium oryzae, Bradyrhizobium sp. e Methylobacterium radiotolerans), Betaproteobacteria (Pandoraea
spoturum, Herbasbirillum seropedicae) e Gamaproteobacteria (E. hormaechei, E. cancerogenus, E. asburiae E.
kobey, Kluyvera cryocrescens, Serratia plymuthica, Pseudomonas chlororaphis, P. moraviensis), e ao filo Firmicutes
(B. cereus, B. safensis, B. mycoides, Bacillus stratosphericus, B. subitilis, B. circulans, Paenibacillus illinoisensis, P.
barcinonensis e Staphylococcus succinus). Foi observado que alguns grupos estavam presentes em apenas utrículos
ou estolões, sugerindo que pode haver especificidade ao local da planta colonizado. Dessa forma, os resultados
obtidos sugerem que ocorrem diferenças fisiológicas entre as comunidades bacterianas do utrículo e do estolão
de U. foliosa, permitindo sugerir que esta variação possa estar associada aos diferentes nichos ocupados nestas
estruturas da planta hospedeira e ao seu papel do desenvolvimento e estabelecimento da planta no seu nicho.
Apoio Financeiro: FAPESP (Proc. 2007/58277-7) e FAEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
29
Atividade anti-cândida de bactérias endofíticas de
plantas arbóreas da Amazônia
Cunha-Lima, C1; Oliveira-Lira, AD1; Oliveira, ACL1; Souza, ADL2; Pereira, JO3; Souza, AQL de1
Laborátorio de Genética Humana da Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Amazonas
Depto de Química
3
Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas – DQ e FCA / UFAM
1
2
Palavras-chave: Plantas arbóreas da Amazônia, Bactérias endofíticas, Coloração de Gram, Antagonismo, Candida albicans.
As bactérias são microrganismos procariotos, unicelulares e cosmopolitas, colonizando inclusive as plantas,
habitando as partes aéreas externas e internas, como: as folhas, caules, flores e frutos, além das partes terrestres: raízes
e rizosfera. A biodiversidade microbiana é responsável pela produção de centenas de substâncias farmacêuticas, tais
como vacinas, enzimas e antibióticos, além de ser fonte de alimentos. Representam dezenas de bilhões de dólares
para o mundo. As Bactérias endofíticas não causam aparentes danos as suas hospedeiras e desempenham funções
importantes no processo de adaptação das plantas. A presente pesquisa foi realizada com bactérias endofíticas
de plantas da nativas da Floresta Amazônica. Os objetivos propostos foram: preservar e avaliar o potencial de
antagonismos contra Candida albicans de bactérias endofíticas isoladas de plantas arbóreas da Floresta Amazônica
pela metodologia de Christensen (cocultivo, também chamada de culturas pareadas). As bactérias utilizadas
na pesquisa são advindas de seis espécies de plantas Amazônicas: Rollinia sp., Duguetia stelechantha, Strychnos
sp., Pothomorpha peltata, Peperomia pellucida (ambas da família Piperaceae) e de Mauritia flexuosa. Durante
o isolamento de fungos endofíticos, amostras de tecidos das plantas acima citadas foram, após assepsia, com
hipoclorito 4%, plaqueadas em meio de cultura ISP2 e Aveia contendo cetoconozol 100µg/mL para amostragem
de bactérias endofíticas. Após o isolamento as bactérias foram purificadas pela metodologia de esgotamento com
estrias cruzadas em meio de cultura ISP2 ou Aveia de acordo com o meio utilizado para os seus isolamentos. As
conservações das bactérias endofíticas foram de três formas: em placas de petri com meio de cultura semi-sólido,
em dois vidros de penicilina com meio semi-sólido inclinado e em dois eppendorfs com meio líquido mais glicerol a
15%. Foram preservadas 188 bactérias endofíticas, sendo que 35 bactérias eram Gram positivas e 31 Gram negativas.
Das bactérias preservadas 80 mais um controle de Bacillus sp. foram avaliadas para antagonismo contra Candida
albicans. Destas foram 11 de Rollinia (I), 26 de D. stelechantha (II), 10 de Strychnos (III), 6 de P. peltata (IV), 23 de P.
pellucida (V) e 4 de M. flexuosa (VI) apresentaram os seguintes resultados: I = 0, 1; II = 0, 5; III = 0, 1; IV = 1, 0; V = 1, 2; VI = 1,
0; respectivamente para microparasitismo e antibiose. As bactérias endofíticas de D. stelechantha (II) apresentaram
o melhor resultado de antibiose contra C. albicans e apenas as bactérias isoladas de Piperaceaes e de M. flexuosa
apresentaram microparasitismo. Estes resultados sugerem que a biodiversidade de bactérias endofíticas de plantas
arbóreas da Amazônia pode ser uma rica fonte de antifúngicos e de outras substâncias de valor biotecnológico.
Suporte financeiro: FAPEAM & CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
30
Análise independente de cultivo da diversidade
bacteriana associada às plantas G. filiformis e U.
hidrocarpa utilizando o software Mothur
Caravieri, FA1; Ferreira, AJ1; Silva, CB1; Lima, FR 1; Araújo, WL 1
Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana- Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes-SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Diversidade, 16S rRNA, Utricularia, Mothur, Bactéria.
As plantas carnívoras apresentam armadilhas capazes de capturar diversos tipos de microrganismos, e em alguns
casos, até pequenos crustáceos. Entretanto existe uma comunidade microbiológica natural vivendo no interior
das armadilhas. Estes microrganismos podem estar envolvidos na digestão das presas capturadas pela planta
hospedeira. O método clássico de estudo da comunidade bacteriana tem se mostrado deficiente para estudos de
diversidade, visto que apenas uma parcela destes microrganismos pode ser cultivada em laboratório. Para evitar
esse problema, uma abordagem molecular utilizando 16S rRNA foi utilizada na tentativa de identificar e descrever
a diversidade bacteriana associada a duas espécies de plantas carnívoras da família Lentibulariaceae, Utricularia
hidrocarpa e Genlisea filiformis, sem a necessidade de isolamento e cultivo prévios. O DNA total foi extraído das
amostras utilizando o kit Ultra Clean Soil DNA e submetido a reações em cadeia da polimerase com primers
específicos para o domínio Bacteria, R1387 e F968, em seguida os amplicons foram clonados em vetores e uma
biblioteca 16S rRNA foi gerada para U. hidrocarpa e outra para G. filiformis. Por meio do programa mothur v.1.10.2,
as sequências foram alinhadas, filtradas quanto à presença de bases quiméricas, construídas curvas de rarefação
e por libshuff, analisada a estrutura das comunidades. Um total de 291 clones foram sequenciados e observouse que alguns grupos bacterianos presentes tanto em U. hidrocarpa, quanto em G. filiformis são pouco descritos
em estudos de diversidade bacteriana associada à plantas. Representantes do grupo Proteobacteria foram
muito frequentes nas duas bibliotecas, concebendo cerca de 45% das sequências de 16S rRNA. Outros grupos
identificados foram de Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteriodetes, Chlamydiae e Firmicutes. Foi observada
uma sequência com maior similaridade à uma bactéria do filo Chloroflexi em U. hidrocarpa. A análise por libshuff
apontou diferenças significativas entre as bibliotecas, entretanto análises pela construção de curvas de rarefação
indicam que o aumento da amostragem deve revelar novas OTUs, interferindo nos resultados atuais. A construção
de árvores fenéticas evidenciou a maior diversidade bacteriana dentro dos grandes grupos em U. hidrocarpa.
Apoio financeiro: FAEP/UMC e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
31
Caracterização intraespecífica de cepas de Yersinia
pestis através da análise de três seqüências
espaçadoras (CRISPRs)
França, CT1; Silva, JE1; Barros, MPS2; Leal-Balbino, TC1 Oliveira, MBM3; Almeida, AMP1
Departamento de Microbiologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ
Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
3
Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tipagem molecular; Yersinia pestis, PCR, CRISPR, Perfís genotípicos.
Introdução: A Yersinia pestis, agente causador da peste, é um bacilo Gram-negativo da família Enterobacteriaceae.
Diferentes técnicas moleculares empregadas no estudo de cepas brasileiras apresentaram baixo poder
discriminatório, revelando na maioria das vezes um padrão genômico idêntico entre cepas isoladas em diferentes
períodos, oriundas de diferentes focos e fontes de origem. A análise de seqüências espaçadoras relativamente
curtas ou “clustered regularly interspaced short palindromic repeats” (CRISPRs) revelou-se uma ferramenta eficaz
para tipagem e estudos filogenéticos em diferentes gêneros bacterianos e revelou diversidade intraespecífica em
cepas de Y. pestis de focos de outros países. Objetivos: Realizar a genotipagem de cepas brasileiras de Y. pestis através
da análise dos locos CRISPRs. Materiais e Métodos: Três seqüências CRISPRs (YP1, YP2 e YP3) foram analisadas
por PCR em 104 cepas de Y. pestis originadas de cinco focos brasileiros, diferentes fontes (humanos, roedores e
pulgas) isoladas de 1966 a 1986. As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra); os amplicons
foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2,0%, visualizados em transiluminador UV e digitalizados
em câmera digital Kodak® seguido de purificação, para seqüenciamento, utilizando o kit purelink PCR purification
(Invitrogen, Brasil). Resultados: Os três locos foram amplificados em todas as cepas. O loco YP1 gerou 18 segmentos
de 530 a 750 pares de base (pb), o YP2 gerou 12 segmentos de 450 a 600pb e o YP3 apenas três segmentos de 270 a
320pb. Os padrões de amplificação dos três locos permitiram agrupar as cepas em 45 perfis genotípicos (P1 a P45)
sendo o perfíl P38 encontrado com maior freqüência. Alguns perfis apresentaram ampla distribuição geográfica,
enquanto outros foram específicos de um determinado foco. As cepas isoladas de roedores apresentaram maior
diversidade de perfis, seguidas pelas cepas isoladas de humanos e pulgas. Conclusão: Os resultados revelaram a
existência de diversidade genética intraespecífica nas cepas brasileiras de Y. pestis. O polimorfismo observado
nos três locos deve-se ao número de seqüências espaçadoras contidas nessas regiões. Em continuação, os
amplicons obtidos e purificados estão sendo seqüenciados para melhor compreensão da estrutura de cada loco.
Apoio financeiro: CNPq, FACEPE
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
32
Produção e purificação de anticorpos de uma cisteíno
peptidase de Xanthomonas citri subsp citri para
diagnóstico do Cancro Cítrico
Zanetti, BF1; Henrique-Silva, F1
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
Palavras-chave: Cancro Cítrico, Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas axonopodis pv citri, CPXAC, ELISA, Anticorpos policlonais,
Diagnóstico molecular.
Introdução: A citricultura é um dos setores com maior potencial de crescimento no país, sendo que o Brasil é o maior
exportador de suco concentrado de laranja. Um dos fatores que mais afetam sua produtividade são os fitopatógenos,
como a Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Essa bactéria causa a cancrose cítrica asiática, que atinge todas as
espécies do gênero Citrus e aparentadas, causando lesões salientes e necrosadas em frutos, ramos e principalmente
folhas. A bactéria pode causar grandes danos à planta, levando a queda das folhas, redução da quantidade e
qualidade dos frutos e até mesmo o declínio geral da árvore. Como não há métodos de controle eficientes para
eliminar a doença, a procedimento utilizado é a erradicação das plantas, causando grandes prejuízos ao citricultor.
Objetivo: Produzir e purificar anticorpos policlonais para detectar a presença de uma cisteíno peptidase secretada
pela bactéria, CPXAC, em folhas de Citrus sp. contaminadas com o cancro cítrico, a fim de esclarecer a relação
dessa peptidase com a patogenicidade da bactéria e desenvolver um método diagnóstico para a doença. Métodos:
A peptidase foi expressa de maneira recombinante em Pichia pastoris e purificada por cromatografia de afinidade
por níquel e foi utilizada para a produção de anticorpos em camundongo e coelho. Estes anticorpos foram titulados
por ELISA e, os produzidos em coelho, foram purificados por cromatografia de adsorção thiofílica para a utilização
nos ensaios de ELISA Indireto, ELISA Sanduíche Indireto e Western blot, tendo como controle positivo a proteína
recombinante. Para a detecção da CPXAC nas amostras contaminadas com cancro cítrico, foi realizada extração
total das proteínas foliares. Resultados: A expressão e purificação da cisteíno peptidase obteve rendimento final
aproximado de 0,03 mg por litro de cultura. Os anticorpos produzidos mostraram-se específicos para a CPXAC
recombinante, apresentando títulos de 1:20.000 a 1:32.000. A purificação rendeu 2,7mg /mL de IgG purificado. O
limite máximo de detecção dos testes utilizados foi de 0,3µg /mL da proteína recombinante, porém não foi possível
detectar a CPXAC em plantas contaminadas, possivelmente devido à baixa expressão dessa peptidase nas folhas.
Conclusões: Os resultados mostram que a CPXAC deve ser expressa em baixa quantidade nas folhas de Citrus sp.,
provavelmente não detectável por ELISA ou Western blot. Isso demonstra que mesmo em pequenas quantidades, a
CPXAC contribui para o desenvolvimento dos sintomas na planta. Isso é corroborado por mutantes nocauteados
conseguidos em nosso laboratório, os quais causam menores danos quando em contato com as plantas. Os
anticorpos produzidos ainda poderão ser utilizados em métodos adaptados para o diagnóstico do cancro cítrico.
Apoio financeiro: Fundecitrus, UFSCar
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
33
Identificação e caracterização de genes vip3 em
isolados de Bacillus thuringiensis e avaliação
da toxicidade a larvas de Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera: Noctuidae)
Figueiredo, CS¹; Marucci, SC1; Paula, DR1; Alves, ECC1; Desidério, JA1; Fernandes, OA²
¹Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, da FCAV –
UNESP – Campus de Jaboticabal
²Laboratório de Ecologia Aplicada do Departamento de Fitossanidade da UNESP-FCAV, Campus de Jaboticabal
[email protected]
Palavras-chave: Bt, proteína Vip3, PCR, controle biológico, lagarta-do-cartucho
O Manejo Integrado de Pragas desempenha um papel fundamental no controle dos principais insetos-praga de
cada cultura, pois leva em conta fatores ecológicos, econômicos e sociais, visando interferir o mínimo possível no
ecossistema com uso de ferramentas como o controle biológico. A bactéria, Gram-positiva encontrada no solo,
Bacillus thuringiensis, destaca-se neste contexto pela patogenecidade e caráter especifico de suas proteínas. Essas
proteínas possuem atividade tóxica a insetos, nematóides, ácaros e protozoários. Por serem altamente específicas,
são inócuas à flora, não são poluentes e não atingem os inimigos naturais dos insetos-alvo. As proteínas Vip,
secretadas durante o crescimento vegetativo do B. thuringiensis, estão classificadas em três diferentes famílias
Vip1, Vip2, Vip3. As proteínas Vip1 e Vip2 atuam em larvas de coleópteros e as Vip 3 de lepidópteros. O gene
vip3A codifica uma proteína de 88,5 kDa que não compartilha homologia com qualquer outra delta-endotoxina
conhecida e tem demonstrado um amplo espectro inseticida. Entretanto, o potencial das Vip, inerente ao
controle de insetos, não tem sido amplamente explorado. Sendo que a alteração de aminoácidos pode causar
efeito significativo sobre a atividade inseticida desta proteína. Diante desta perspectiva, o presente trabalho
objetivou identificar a presença do gene vip3Aa em 1080 isolados de B. thuringiensis da coleção do Laboratório
de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada provenientes de diversas regiões do país, analisar a ocorrência
de polimorfismos e investigar a associação dos diferentes perfis com a mortalidade de Spodoptera frugiperda.
Amostras de DNA dos isolados foram extraídas e submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida
de clivagem por endonucleases. Foi possível detectar a presença do gene vip3Aa em 55 isolados por meio da
visualização do fragmento de 2370 pb, amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores vip5-vip6. As análises
de polimorfismo com a combinação de iniciadores internos ao gene evidenciaram perfil diferenciado em um
dos isolados e com a técnica PCR-RFLP observou se monomorfismo nas regiões do gene vip3Aa estudadas. A
avaliação de mortalidade de Spodoptera frugiperda, foi realizada por bioensaio, envolvendo 18 isolados com a
proteína Vip3Aa obtida do sobrenadante de culturas. Apresentaram toxicidade para as larvas desses insetos, 16
isolados, com sete, demonstrando mortalidade média superior a 80% dentre eles o isolado com perfil diferenciado.
O alto nível de atividade inseticida destes isolados torna os excelentes candidatos para o uso no campo.
Apoio Financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
34
Estudo da variabilidade genética de cepas de
Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) na
região oeste do Paraná
Hilgert, AR1; Santos, LL1; Vendruscolo, ECG1; Spohr, KAH1; Steffens, RS1
Laboratório de Genética,Universidade Federal do Paraná-Campus Palotina
[email protected]
1
Palavras-chave: MRSA 1, tipagem molecular 2, S.aureus 3.
Staphylococcus aureus é um dos microrganismos responsáveis por grande morbidade e mortalidade no homem e
em animais. Atualmente cepas multirresistentes são responsáveis por diversos surtos em todo o mundo e o arsenal
terapêutico tem ficado cada vez mais escasso. S. aureus, tanto os sensíveis como os resistentes à meticilina, podem
habitar as narinas das pessoas, especialmente as que convivem diariamente com animais, seja em ambiente
hospitalar ou em propriedades rurais, podendo causar diversas afecções nos animais e humanos. O objetivo
deste trabalho é verificar o perfil epidemiológico destas cepas na: equipe do hospital veterinário, nas pessoas que
trabalham diretamente na bovinocultura leiteira e, em bovinos leiteiros acometidos por inflamações na glândula
mamária, e assim conhecer o perfil dessas cepas. Foram coletadas amostras de 3 grupos distintos: I- 68 amostras
das narinas de componentes da equipe clínica do Hospital Veterinário e, II-128 amostras de leite de bovinos com
mastite e III- 22 amostras das narinas das pessoas que vivem em contato direto com esses animais, dando um
total de 218 amostras. Foi feita cultura e exame bacterioscópico das amostras, e elas foram também submetidas
aos testes da catalase em lâmina, coagulase em tubo e prova do VP para confirmação do agente. A caracterização
fenotípica quanto à sensibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelo método de disco difusão em meio sólido
para vários antimicrobianos. Dessas 218 amostras, 27 foram identificadas como S. aureus (12.4%) e o antibiograma
evidenciou três cepas resistentes à oxacilina (11%). A caracterização fenotípica tem algumas restrições, como o
tempo necessário para a obtenção dos resultados, a necessidade de bactérias viáveis, a interferência de outros
microorganismos e de fatores ambientais do meio de cultura que podem gerar resultados imprecisos. Métodos
moleculares como o PCR podem reduzir o tempo de obtenção e aumentar o grau de confiabilidade dos resultados.
Neste trabalho estão sendo usados três pares de primers para amplificação dos genes: mecA (específico para a
resistência à oxacilina), Coa (específico para S. aureus) e ribossomal 16S (universal de bactérias). Os resultados
da caracterização genotípica obtiveram uma correlação de 100% com a caracterização fenotípica, confirmando
assim a possibilidade da realização de técnicas moleculares para o estudo epidemiológico e controle do agente,
uma vez que esse método é muito mais rápido e está se mostrando eficiente e preciso. Para verificar a diversidade
genética entre as cepas isoladas foi realizado a análise por marcadores moleculares do tipo RAPD, produzidos pela
amplificação de primers aleatórios (Família OPAB). Dados preliminares demonstram que os marcadores poderão
ser usados para monitorar as cepas, além de possibilitar a distinção de indivíduos portadores de MRSA o que,
contribuirá para um melhor monitoramento, tomada de medidas para a prevenção da disseminação do agente e
implantação de práticas higiênicas mais adequadas.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
35
Estudo de um operon de Caulobacter crescentus
envolvido na resposta a antibióticos β-lactâmicos
Valencia, EY; Braz, VS; Marques, MV
Departamento de Microbiologia – Instituto de Ciências Biomédicas – USP – São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Caulobacter crescentus, regulador de transcrição, β-lactâmicos.
O processo de degradação ambiental devido a poluição industrial, esgoto doméstico e lixo, contaminam o meio
ambiente com produtos como detergentes, desinfetantes, metais pesados, compostos químicos orgânicos e
inorgânicos, agentes antimicrobianos, entre outros, favorecendo a adaptação e desenvolvimento de mecanismos
de defesa e sobrevivência nos microorganismos. O estudo genético de Caulobacter crescentus, uma bactéria gramnegativa oligotrófica de vida livre da família α-proteobacteria, encontrada em praticamente todos os ambientes
aquáticos (marinhos e de água doce) e em muitos tipos de solo, permitiu a identificação de duas linhagens mutantes
∆CC1637 e ∆CC1640 sensíveis a antibióticos β-lactâmicos. O presente trabalho tem por objetivo avaliar o envolvimento
dos genes que formam o operon CC1637 - CC1640, na resposta a esta classe de antibióticos. O gene CC1637 codifica
uma proteína hipotética conservada, o gene CC1638 uma provável oxidoredutase, o gene CC1640 um regulador de
transcrição e o gene CC1639 codifica uma proteína transmembrana com um domínio sensor extra citoplasmático
e um domínio peptidase citoplasmático que pertence a classe das metaloproteases (HEXXH) que ligam Zn2+.
Foram obtidos mutantes nulos por deleção em fase para todos os genes em estudo e ensaios de sensibilidade
por halo de inibição foram realizados, utilizando diversos antibióticos e a cepa controle NA1000. O resultado
mostra que a linhagem ∆CC1637 foi sensível aos antibióticos cefepinema, cefoperazone e cefazolin, e a linhagem
∆CC1640 foi sensível aos antibióticos cefoxitina, ticarcilina e cefepinema, enquanto que a linhagem selvagem
NA1000 não apresentou halo de inibição a estes antibióticos, concluindo que possivelmente estes genes poderiam
estar envolvidos no sistema de defesa a estes antibióticos. Outras análises estão em andamento para entender
melhor os mecanismos moleculares que levam à resposta destes genes na presença de antibióticos β-lactâmicos.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
36
Bactérias associadas à cana-de-açúcar: influência
de tecido vegetal na expressão de características
bacterianas envolvidas com a promoção de
crescimento vegetal
Farias, ARB1; Barbosa, MV1; Barros, MCS1; Andrade, PAM1; Lira-Cadete, L1; Ramos, APS2; Silva, MO2;
Freire, FJ2; Kuklinsky-Sobral, J1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: bactérias endofíticas, fixação de nitrogênio, fosfato inorgânico, interação bactéria-planta.
É cada vez mais explorado o potencial de bactérias associadas às plantas para a promoção do crescimento vegetal,
isso graças ao notável avanço da tecnologia e o amplo crescimento populacional. Dentre os mecanismos de
promoção de crescimento vegetal por bactérias, a fixação biológica de nitrogênio é uma das mais relevantes, pois
o nitrogênio é quantitativamente o elemento mais importante para a agricultura, por ser limitante ao crescimento
vegetal. Outra propriedade não menos importante é a solubilização de fosfato inorgânico pelas bactérias
associadas às plantas, isto porque apesar de diversas bactérias com esta característica estarem presentes no solo,
seu número não é suficiente para competir com outras bactérias de diferentes funções estabelecidas, o que limita
o aumento substancial do crescimento vegetal. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e selecionar
bactérias associadas a folhas e raízes de cana-de-açúcar com características envolvidas com a promoção de
crescimento vegetal. Para isto, foram avaliadas 131 linhagens bacterianas endofíticas, de folha e raiz, e epifíticas
de raiz (rizoplano) de plantas de cana-de-açúcar, isoladas em meio de cultura TSA. Para selecionar aquelas com
capacidade de fixar nitrogênio in vitro, foi realizada a inoculação das linhagens em meio de cultura semi-sólido sem
fonte nitrogenada, repetidas vezes. Para selecionar as bactérias solubilizadoras de fosfato inorgânico, as linhagens
foram inoculadas em meio de cultura sólido, contendo fosfato insolúvel. Além disso, o índice de solubilização (IS),
relação entre o diâmetro do halo de solubilização e do halo da colônia. A identificação das linhagens bacterianas
foi realizada por meio do seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA. Considerando que a fixação biológica de
nitrogênio tem sido um dos mecanismos mais explorados na interação microrganismos-planta, foi observado que
64% apresentaram capacidade de crescer em meio de cultura livre de nitrogênio. Ao se avaliar o tecido vegetal
do qual as bactérias foram isoladas, foi verificado que a raiz e o rizoplano apresentaram maior freqüência de
bactérias fixadoras, como observado em outros trabalhos. Em relação a solubilização de fosfato inorgânico, foi
observado que 56% foram capazes de solubilizar fosfato nas condições utilizadas. Contudo, quando analisado
o tecido vegetal, também foi verificado que a raiz e o rizoplano apresentaram maior freqüência de bactérias
solubilizadoras. Quando o Índice de Solubilização (IS) foi analisado, observaram-se algumas linhagens que se
destacaram, apresentando IS superior. A identificação das bactérias apresentou linhagens agrupadas com o gênero
Burkholderia, Enterobacter e Pantoea. Assim conclui-se que há interação entre os tecidos vegetais e a colonização por
diferentes genótipos bacterianos expressando características envolvidas com a promoção de crescimento vegetal,
tais como fixação de nitrogênio e solubilização de fosfato inorgânico, destacando-se a raiz da cultura em questão.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
37
Caracterização funcional de promotores específicos de
cassetes gênicos em integrons classe 1
Fonseca, EL1; Vicente, ACP1
Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos, Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, RJ
[email protected]
1
Palavras-chave: expressão de cassetes gênicos, integrons, real-time RT-PCR, resistência, Pseudomonas aeruginosa
Os integrons são elementos genéticos caracterizados pela capacidade de inserir, excisar e rearranjar cassetes
gênicos através de recombinação sítio-específico mediada pela ação de uma integrase. Os integrons são
considerados sistemas de expressão devido à presença de um promotor (Pc) que controla a transcrição dos
cassetes capturados. Os cassetes gênicos seriam estruturas desprovidas de região promotora e, portanto, a
transcrição ocorreria mediante atividade de Pc. Os integrons de classe 1 vêm sendo apontados como um dos
principais responsáveis pela emergência da resistência antimicrobiana, porém, pouco se sabe sobre a expressão
dos cassetes gênicos. Este estudo teve como objetivo verificar a expressão de cassetes gênicos de resistência
inseridos em integrons classe 1 na presença e na ausência de Pc. O arranjo gênico e as respectivas configurações
de Pc, presentes em integrons de classe 1 de diferentes isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa, foram
caracterizados por PCR e sequenciamento. Os arranjos gênicos presentes em cada um dos integrons foram
clonados na presença e na ausência de Pc para verificar a transcrição dos genes e a funcionalidade dos Pcs e de
promotores putativos. Após extração de RNA dos recombinantes, ensaios de real time RT-PCR foram realizados
para verificar a transcrição de cada cassete, e o gene ampR, presente no vetor como marcador seletivo de
resistência, foi utilizado como gene endógeno para normalização. Testes de suscetibilidade a antibióticos que
são substratos dos produtos dos genes do arranjo foram realizados para verificar a expressão dos cassetes. Os
arranjos (Pc forte) aacA4-blaOXA-2-gcu14, (Pc fraco) dfrB5-aacA4-blaOXA-2 e (Pc fraco) aadB-aacA4-blaCARB-4 foram
identificados e a configuração do Pc ( força de expressão) foi definida. Utilizando iniciadores específicos, estas
construções foram clonadas tanto na presença quanto na ausência de Pc. As análises de quantificação relativa
revelaram uma maior transcrição dos genes mais proximais de Pc em todas as construções onde este promotor
estava presente. Todos os recombinantes carreando arranjos sob o controle de Pc foram resistentes aos antibióticos
testados. Das três construções na ausência de Pc, duas não apresentaram transcrição e foram sensíveis a todos
os antibióticos nos testes de suscetibilidade, demonstrando a importância do Pc na transcrição destes genes.
Curiosamente, todos os genes da construção aadB-aacA4-blaCARB-4 foram transcritos mesmo na ausência de Pc,
indicando a presença de promotores específicos para estes cassetes. Análises in silico identificaram promotores
putativos para os genes aadB e blaCARB-4. De fato, blaCARB-4 foi o mais transcrito nesta construção apesar de ser
o terceiro cassete do arranjo, indicando a atividade de seu promotor e/ou o efeito sinérgico de PaadB+PblaCARB-4. O
recombinante carreando este arranjo foi resistente aos antibióticos testados, demonstrando a expressão destes
cassetes. Este trabalho foi original em determinar a funcionalidade de promotores dos cassetes aadB e blaCARB-4.
Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq e FIOCRUZ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
38
Utilização de peptídeos sintéticos de
C. pseudotuberculosis identificados por phage display
como potenciais alvos vacinais na erradicação da
Linfadenite Caseosa
Cassiano, AAM1; Almeida, SS1; Seyffert, N1; Prudencio, CR2; Santos, FAA2; Soares, SC1; D’afonseca, V1;
Ribeiro, D1; Faria, CL1; Miyoshi, A1; Goulart, LR2; Azevedo, V1
Laboratório de Genética Celular e molecular (LGCM), Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),
Belo Horizonte – MG Brasil
2
Laboratório de Nanobiotecnologia. Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
Palavras-chave: Phage Display, Corynebacterium pseudotuberculosis, Ph.D.™-12, peptídeos, imunização.
Introdução: Corynebacterium pseudotuberculosis é um patógeno intracelular facultativo responsável por ser o
agente etiológico da Linfadenite Caseosa (LC) em ovinos e caprinos, uma doença que provoca perdas econômicas
graves, principalmente no Nordeste do Brasil. Atualmente, nosso grupo de trabalho vem estudando o controle
da expressão gênica em C. pseudotuberculosis durante a infecção do hospedeiro, a fim de detectar novos genes
provavelmente envolvidos com virulência, para tal, foi utilizado no presente trabalho, a ferramenta Phage Display
o qual seleciona peptídeos, utilizando bacteriófagos geneticamente modificados para expressar aleatoriamente
seqüências de peptídeos na sua superfície. Estas bibliotecas têm sido utilizadas com sucesso para numerosas
aplicações, como mapeamento e mimetismo de antígenos reconhecidos por anticorpos, desenvolvimento de
vacinas, e em testes de imunogenicidade. Objetivo: Sintetizar dois peptídeos obtidos por phage display e testar
sua eficácia protetora induzida pela imunização, em camundongos BALB/c contra a infecção desafio com C.
pseudotuberculosis linhagens MIC6 e C231. Métodos: Foi utilizada uma biblioteca comercial de 12 peptídeos
lineares (Ph.D.™-12 Biolabs), e anticorpos da classe IgG purificados a partir de uma mistura de amostras de soro
de caprinos e ovinos infectados com C. pseudotuberculosis linhagem 1002. Foram realizados alinhamentos entre
os peptídeos e o proteoma predito de C. pseudotuberculosis 1002, e a reatividade e especificidade dos clones
isolados foram testadas por ELISA, dot-immunoblotting e Western blot contra IgGs de C. pseudotuberculosis
1002, a fim de confirmar a eficiência da seleção e quantificação da reatividade dos clones. Resultados: Após três
ciclos de seleção foram obtidos 480 sequências válidas, sendo que 116 são seqüências distintas. Após análise dos
resultados obtidos pelos imunoensaios e busca de similaridades, dois clones mais reativos foram selecionados
para síntese, e posterior imunização. Conclusão: A identificação de novos antígenos ou genes específicos de C.
pseudotuberculosis pode prover novos biomarcadores específicos potencialmente antigênicos para a obtenção
de antígenos candidatos à vacina e diagnósticos subclínicos mais acurados para o controle e erradicação da LC.
Suporte Financeiro: CNPq, FAPEMIG, VALLEE
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
39
Avaliação de três ambientes ecologicamente distintos
quanto à presença e diversidade genética de isolados
de Bacillus thuringiensis
Ricieto, APS1; Leonel, LV3; Dragalzew, AC1; Fazion, FAP1; Souza, GMD1;Scarpassa, JA1; Carvalho Filho, CD2;
Vilas-Bôas, LA1; Vilas-Bôas, GT1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina – Rodovia Celso Garcia Cid PR 445 km 380 Campus Universitário,
Caixa Postal 6001, Cep 86051-990, Londrina – PR
2
Universidade Federal da Bahia, BA
3
Centro Universitário Filadélfia, Londrina – PR
[email protected]
1
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, genes cry, controle biológico, bactéria entomopatogênica e prospecção.
Linhagens de Bacillus thuringiensis se caracterizam pela produção, no momento da esporulação, de cristais com
ação inseticida. Este bacilo compreende o organismo mais estudado e utilizado como forma de controle biológico
para diversas pragas agrícolas bem como vetores de doenças. Dentre as principais vantagens do uso de produtos à
base de B. thuringiensis destacam-se o amplo espectro de ação inseticida contra dípteros, coleópteros, lepidópteros,
alguns nematódeos e protozoários, ação específica e inocuidade a outros organismos além baixo impacto ambiental.
Uma das principais linhas de pesquisa nesta área é a prospecção de novas linhagens com perfis diferentes de ação
e com maior potencial biotecnológico. Neste sentido, este trabalho teve por objetivos isolar novas linhagens de
B. thuringiensis a partir de amostras de solo provenientes de três ambientes distintos: cultura de soja, pomar e
mata ciliar, ambos situados numa área localizada na cidade de Bela Vista do Paraíso na Região Norte do Estado
do Paraná. Ao todo foram coletadas e processadas 38 amostras de solo, tendo sido depositadas no banco, até o
momento, 35 novas linhagens, enquanto outras linhagens estão ainda em processo de cultivo para confirmação
da formação de cristais protéicos, típicos da espécie, e para eliminação de contaminantes. As linhagens foram
caracterizadas quanto ao formato de cristal protéico e quanto a presença de genes cry, codificantes para proteínas
Cry com ação entomopatogênica frente a insetos da Ordem Diptera e da Ordem Lepidoptera. Os dados obtidos com
as amostras de diferentes origens estão sendo tabulados e analisados estatisticamente, visando verificar o tipo de
ambiente em que é maior o índice da presença de linhagens de B. thuringiensis e a diversidade genética de linhagens
com o objetivo de direcionar outras etapas do programa de isolamento de novas linhagens de B. thuringiensis.
Apoio financeiro: CNPq, UEL e FAPESB-BA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
40
Biodiversidade de bactérias endofíticas de plantas
medicinais da Amazônia
Oliveira, ACL1; Muniz, EROP1; Souza, ADL2; Britto-Jr, A1; Cunha-Lima, C1; Souza, AQL1,2
Laboratório de Genética Humana da Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Amazonas – ESA/UEA
Departamento de Química da Universidade Federal do Amazonas – DQ/UFAM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Biodiversidade, Plantas medicinais da Amazônia, Bactérias endofíticas, Coloração de Gram, Metodologia de Christensen.
Os microrganismos endofíticos vivem no interior das plantas colonizando os tecidos sadios de partes aéreas
destas, sem lhes causar danos aparentes. As bactérias que apresentam esse tipo de comportamento podem
apresentar vantagens às plantas, ao homem e ao meio ambiente. Por ocuparem um nicho ecológico semelhante
àquele ocupado por patógenos, essas bactérias apresentam grande potencial para o controle biológico, através
da produção de metabólitos com potencial biotecnológico como medicamentos, por exemplo. Partindo desse
princípio, objetivou-se nesta pesquisa isolar as bactérias de três plantas medicinas da região Amazônica, corama
- Bryophyllum calycinum - da família Crassulaceae, crajiru - Arrabidea chica (H.B.K.) Verlot e quebra-pedra Phyllanthus orbiculatus. A coleta das plantas foi realizada na cidade de Manaus e tecidos da folha, raiz e caule
foram submetidos à assepsia superficial, depois fragmentos destes foram inoculados em placas de Petri contendo
meio de cultura ISP2 e LB acrescidos de cetoconazol 100µg/mL, cultivados em B.O.D a 26oC por 30 dias. Após 48
horas iniciou-se a transferência das colônias das bactérias que nasceram dos fragmentos para vidros de penicilina
com meios de cultura solft inclinado, as quais foram purificadas e conservadas. Foram preservadas 123 bactérias
endofíticas, das quais 37 foram advindas da planta corama, 39 de crajiru e 47 de quebra-pedra. De cada planta 10
bactérias foram selecionadas para ensaios culturas pareadas – testes Christensen (cocultivos) contra bactérias
patógenas humanas: Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus mutans; e 67 para análise de
moforfologia pela coloração de Gram. Das que foram submetidas à coloração de Gram foi possível encontrar as
seguintes morfologias: 20 cocos positivos e 7 negativos; 11 bacilos positivos e 4 negativos; 12 vibriões positivos
e 3 negativos; 3 diplococos positivos e 2 negativos; 2 estreptobacilos positivos e 3 estreptococos positivos.
Nenhuma das bactérias endofíticas testadas apresentaram antibiose. Todos os isolados foram conservados no
Laboratório do Grupo de Estudos de Espectrometria de Massas e Microrganismos da Amazônia da Universidade
Federal do Amazonas. A diversidade de bactérias endofíticas isoladas destas plantas medicinais da Amazônia
sugere quão grande é a biodiversidade microbiana amazônica e abre perspectivas de uso biotecnológico
sustentável pela gama de metabólitos produzidos e possível uso de genes de interesse biotecnológico.
Suporte financeiro: FAPEAM & CNPQ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
41
Identificação e caracterização de genes envolvidos
com a resistência à salinidade de organismos halófilos
isolados de solo salino – RN
Figueiredo, TC1; Farias, ST1; Bucciarelli-Rodriguez, M2
Departamento de Biologia Molecular, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microrganismos halófilos. Biblioteca genômica. Tolerância à salinidade.
A crescente perda de áreas agricultáveis é tida como um dos principais motivos de preocupação das agencias
ambientais, pois este fenômeno leva a uma diminuição global na produção de alimentos em um momento da
expansão populacional mundial. Dentre as diversas formas de degradação do solo, a salinização se destaca. Sendo
assim, a busca pela compreensão acerca dos mecanismos envolvidos na adaptação a salinidade, vem despertando
interesse, principalmente devido a potencialidade de manipulação de tais mecanismos para produção de
organismos modificados geneticamente com características de resistência a alta osmolaridade. Neste trabalho,
isolamos microrganismos halófilos da amostra de solo salino do município de Mossoró – RN e construimos
bibliotecas genômicas a fim de detectar possíveis genes envolvidos na tolerância ao sal. Foram feitas extrações
do DNA genômico dos microrganismos halófilos e posteriormente, a construção das bibliotecas genômicas
(digestão do DNA genômico e vetor com enzima de restrição, tratamento do vetor digerido com fosfatasealcalina, preparação de bactérias eletrocompetentes e transformação das bactérias hospedeiras com o DNA
recombinante). Na construção das bibliotecas genômicas foi utilizada a bactéria E. Coli MC1064 como hospedeira.
O sequenciamento dos insertos foi feito utilizando o sequenciador MegaBACE (Amersham Biosciences) e os
insertos sequenciados foram analisados no BLAST e ORF Finder. Verificamos que a E. coli não transformada com
o inserto de DNA do microrganismo halófilo cresce em meio com até 2,5% de NaCl. Foram triados e selecionados
os que receberam o plasmídeo com inserto das linhagens isoladas e que cresceram no meio com 5% de NaCl
(0,85M). Com isto, obtivemos os seguintes números de colônias transformadas no meio suplementado com 5%
de NaCl por 72 horas: 287 de uma biblioteca e 101 da outra. Destas, um inserto que apresentava entre 2 a 4kb foi
parcialmente sequenciado (1.059 pb). Como não sabemos o tamanho do genoma de cada linhagem, não podemos
estimar com segurança quantas vezes a biblioteca cobriu-o. Podemos estimar que clonamos 5700Kb (5,7Mb) e
4200Kb (4,2Mb) das linhagens. Comparando a sequência do inserto com o banco de dados do NCBI, observou-se
alta similaridade (80%), score 390 e E-value = -105 com a proteína cobre-ATPase encontrada no megaplasmídeo da
bactéria Ruegerie pomeroyi. Utilizando as ferramentas ORF Finder e Blastp, o resultado demonstrou a presença de
11 ORFs, sendo uma delas similiar a proteínas ATPase translocadora de cobre tipo P e proteínas transportadoras
de cátions. Os resutados apontam que a proteína translocadora de cobre pode estar atuando de forma inespecífica,
estando assim envolvida no efluxo de outros cátions, como por exemplo, o cátion Na+.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
42
Detecção do raquitismo da soqueira em Cana-deaçúcar pelas técnicas de PCR-específica e Nested-PCR
Crasto, CJTL1; Cavalcanti, FCN1; Lima, MLF1; Kido, LMH1; Barros, ACB 1
Laboratório de Diagnose e Fidelidade Genética – Biofábrica Governador Miguel Arraes, Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste
[email protected]
1
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, Raquitismo da soqueira, Diagnose, PCR-específica e Nested - PCR.
Introdução: A cana-de-açúcar é responsável por cerca de 70% do açúcar produzido no mundo. Uma das
principais doenças desta cultura, causada pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli é o raquitismo da soqueira,
assim denominado pelos sintomas apresentados em campo. As plantas apresentam sintomas quando a doença
já está em estágio avançado. O diagnóstico preciso da doença apresenta algumas dificuldades, pois nem sempre
os sintomas são específicos e podem ser confundidos com alguns efeitos decorrentes de déficit nutricional.
Deste modo, testes de diagnose devem incluir métodos que garantam a sanidade das plantas e o possível
diagnóstico da doença em plantas assintomáticas, como a técnica de PCR. Este trabalho teve como objetivo
realizar o diagnóstico do raquitismo da soqueira em diferentes variedades de cana-de-açúcar pela técnica de
PCR-específica e Nested-PCR. Métodos: Foram utilizadas 8 variedades de cana-de-açúcar provenientes da região
Nordeste. Seus DNAs foram extraídos segundo o método de MURRAY e THOMPSON, 1980. Para amplificação
foram utilizados os primers Cxx1, Cxx2 para PCR específica e 10 µL do produto de amplificação gerado no
primeiro diagnóstico, para Nested PCR com os primers RST59, RST60. Resultados: Obtivemos resultado positivo
para todas as variedades analizadas, fragmentos de 438 pb para PCR específica e 229 pb para o Nested-PCR.
Conclusão: A técnica mostrou-se sensível em detectar de maneira segura e reprodutível o raquitismo da soqueira.
Instituição de fomento: MCT, CNPq, FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
43
Produção heteróloga de Galectina-1 de camundongo
em sistema procariótico
Trabuco, AC1; Silveira, WA1; Del Cistia Andrade, C1; Dias-Baruffi, M1
Laboratório de Glicoimunologia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Clonagem, Galectina-1, Lectinas, Biotecnologia
Introdução: A Galectina-1 (Gal-1) humana, pertencente a uma família de proteínas multifuncionais que reconhecem,
especificamente, β-galactosídeos por meio de domínios de reconhecimento de carboidrato, é um homodímero de
14.900 daltons, pI = 5.6 e não apresenta peptídeo sinal. A Gal-1 humana e de camundongo possuem 88,15% de
homologia. Esta diferença pode refletir em suas características estruturais, físico-químicas e biológicas. A Gal-1
tem sido descrita com um potencial agente terapêutico para patologias imunológicas e degenerativas. Genes
heterólogos podem ser expressos em altos níveis para pesquisa básica ou para uso biotecnológico e terapêutico. As
proteínas heterólogas produzidas podem ser purificadas ou fracionadas por meio de diferentes métodos os quais
variam com o sistema escolhido. Objetivos: O presente trabalho visa à clonagem e expressão da Gal-1 de camundongo
(Gal-1c), obtendo-se, assim, uma nova ferramenta para investigações biológicas e terapêuticas, sobre essa lectina,
em modelos experimentais com camundongos. Métodos: O gene Lgals-1 foi obtido através isolamento de RNA de
tecido muscular de camundongos C57BL/6 pelo método de TRIzol, produção de cDNA utilizando-se SuperScript™ II
RT (Invitrogen), e amplificação por PCR. Foi propagado em plasmídeo PGEM-T (Promega) em cepa DH5α de E. coli,
clivado com enzima de restrição e subclonado na orientação correta através de ligação sitio-dirigida em plasmídio
pET29a (Novagen). As cepas BL21-DE3 e Rosetta de E. coli foram transformadas com o novo plasmídio contendo o
gene Lgals-1, e induzidas com isopropil β-D-tiogalacto-piranozídeo (IPTG). A Gal-1c foi então purificada através de
cromatografia em coluna de afinidade, e quantificada através de absorvância em 280nm. A atividade da Gal-1c foi
determinada através de ensaio de hemaglutinação. Resultados: Após a construção e sequenciamento dos vetores,
os clones obtidos mostraram-se capazes de expressar a Gal-1c, tanto em BL21-DE3 quanto em Rosetta. O lisado
bacteriano foi purificado em coluna de agarose-lactose, obtendo-se um perfil cromatográfico com um pico único
de eluição. A análise eletrotroforética demonstrou uma banda única de massa molecular aproximada de 14 kDa, na
produção da Gal-1c tanto em BL21-DE-3 quanto em Rosetta, indicando a produção da preparação homogênea de
Gal-1c. Obteve-se hemaglutinação até o título 5 μM. Assim, os resultados demonstraram que foi possível obter Gal1 recombinante homogênea e ativa, com rendimento de aproximadamente 18 mg/L em ambas as cepas utilizadas.
Conclusão: O presente trabalho proporcionou a produção de preparação solúvel, homogênea e ativa de Gal-1c.
Essa lectina poderá ser usada como uma importante ferramenta em estudos básicos e aplicados de glicobiologia.
Apoio Financeiro: CNPq e Capes
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
44
Construção de uma linhagem mutante para o fator
sigma C (sigC) de Corynebacterium pseudotuberculosis
para avaliar a contribuição deste na resposta a
diferentes condições de estresse e na virulência desta
bactéria
Domingueti, CP; Pacheco, LGC; Castro, TLP; Souza, BM; Miyoshi, A; Azevedo, V
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Instituto de Ciências Biológicas – Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, linhagem mutante, resposta a estresse, sigma C, virulência
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria gram-positiva, causadora da linfadenite caseosa em ovinos
e caprinos. Para causar uma infecção bem sucedida, este patógeno intracelular facultativo precisa responder
de modo eficiente às alterações do ambiente extracelular, sendo capaz de sobreviver às condições adversas
encontradas no organismo hospedeiro. Um dos principais mecanismos utilizados por bactérias patogênicas para
alcançar este objetivo consiste na ativação transitória de genes específicos de resposta ao estresse por fatores
sigma alternativos da RNA polimerase. Com o seqüenciamento do genoma de C. pseudotuberculosis pela Rede
Genoma de Minas Gerais e Rede Paraense de Genômica e Protêomica, foi possível identificar sete fatores sigma
alternativos de resposta ao estresse: sigB, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM e sigK. Dentre estes, destaca-se o fator
sigma C, o qual tem sido associado à resposta aos estresses térmico, oxidativo e de superfície em Mycobacterium
tuberculosis, contribuindo para a virulência desta bactéria. Neste trabalho, estamos construindo uma linhagem
mutante de C. pseudotuberculosis deficiente para sigC, a fim de avaliarmos a contribuição deste regulador
transcricional na resposta a diferentes condições de estresse e na virulência desta bactéria. Um fragmento central
do gene sigC foi amplificado e inserido no plasmídeo pCR®2.1TOPO®, não-replicativo em Corynebacterium. Após a
confirmação dos clones obtidos para Escherichia coli TOP10, os plasmídeos foram extraídos e transformados em
C. pseudotuberculosis, para gerar mutantes sigC por eventos de recombinação homóloga simples. Até o momento
foram obtidas algumas colônias transformadas de C. pseudotuberculosis crescidas na presença de canamicina, e
cuja interrupção do gene sigC deverá será comprovada por PCR. Estudos comparativos com a linhagem selvagem
deverão auxiliar na avaliação do papel do fator sigC na resposta ao estresse e na virulência de C. pseudotuberculosis.
Agências Financiadoras: FAPEMIG, CNPq/MAPA (edital 64), CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
45
Seleção e caracterização genética de linhagens de
Bacillus thuringiensis para controle de Aedes aegypti
(Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae)
Dragalzew, AC 1; Scarpassa, JA 1; Leonel, LV 1; Ricieto, APS1; Carvalho-Filho, CD 3; Fazion, FAP 1; Souza,
GMD 1; Vilas-Bôas, LA 2; Vilas-Bôas, GT 2
Laboratório de Bioinseticida, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina/PR
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas,Universidade Estadual de Londrina, Londrina/PR
3
Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal da Bahia, Salvador/BA, Brazil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis var. israelensis, Aedes aegypti,controle biológico, bioinseticida, genes cry e cyt
Aedes aegypti se trata do principal vetor do vírus da dengue e febre amarela urbana, representando um importante
problema de saúde pública no Brasil. O rápido aumento na resistência do inseto aos vários inseticidas químicos
utilizados para controle, tem levado a incrementos na pesquisa com controladores biológicos, sobretudo com
aqueles baseados na bacteria Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti). No Brasil, o uso de produtos a base de
Bti é ainda incipiente. A maioria dos produtos são importados, causando conseqüente incremento no custo
além de dependência tecnológica. Estes fatos levam a uma crescente necessidade de se desenvolver tecnologia
que levaria a geração de produtos baseados nestes microrganismos com fins de utilização em programas de
controle biológico do principal vetor da dengue. Neste trabalho, 28 isolados ambientais de Bacillus thuringiensis
foram caracterizados por PCR utilizando iniciadores específicos para genes cry e cyt que codificam para
proteínas ativas contra insetos da ordem Diptera (Cry4B, Cry10, Cry11, Cyt1 e Cyt2). Do total avaliado, 33%
apresentaram amplificação para todos os genes estudados. Outros genes cry serão investigados visando a total
caracterização, como determinação de formato de cristal e estas linhagens serão posteriormente direcionadas
para bioensaio, com o objetivo de otimizar o processo de prospecção de linhagens para utilização em programas
de controle de vetores de doenças, bem como desenvolvimento de novos produtos a base deste microrganismo.
Apoio: CAPES e CNPq, FAPESB – BA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
46
Detecção de gene putativo de saxitoxina em
cianobactérias planctônicas isoladas de reservatórios
brasileiros
Hoff, C1; Crespim, E1; Werner, VR2; Fiore, MF1
Universidade de São Paulo, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Laboratório de Ecologia Molecular de Cianobactérias, 13400-970,
Piracicaba, SP, Brasil
2
Fundação Zoobotânica e Museu de Ciências Naturais do Rio Grande do Sul, (MCN/FZBRS), Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: sxtI, neurotoxina, Anabaena, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis.
Algumas cianobactérias comumente encontradas em águas de reservatórios de abastecimento público são
produtoras de neurotoxinas que causam sérios riscos aos humanos e animais. A neurotoxina, saxitoxina, geralmente
apresenta toxicidade 30 minutos após a ingestão, iniciando-se com uma crescente sensação de formigamento
ou ardor nos lábios, língua e garganta e dormência total do rosto. Outros sintomas podem incluir transpiração,
vômitos e diarréia. Em casos de intoxicação aguda, a dormência pode se espalhar para o pescoço e extremidades
e progredir para fraqueza muscular, perda de coordenação motora e, finalmente, a paralisia. A dose letal (1 mg)
de saxitoxina geralmente resulta na insuficiência cardiovascular devido à paralisia dos músculos respiratórios.
No presente estudo, linhagens dos gêneros Anabaena, Cylindrospermopsis e Raphidiopsis (Nostocales) isoladas de
reservatórios brasileiros foram avaliadas para a presença do gene da saxitoxina por meio de análise molecular. A
triagem de linhagens produtoras de saxitoxinas foi feita por meio da amplificação por PCR de sequências do gene
sxtI, que codificam O-carbamoiltransferase (OCTase), usando o conjunto de iniciadores OCT-F/OCT-R. Fragmentos
de tamanho esperado (~ 900 pb) foram obtidos para sete cianobactérias planctônicas: A. planctonica CENA209 e
CENA 210, isoladas do Lago da ESALQ, Piracicaba-SP, A. torques-reginae ITEP-024 e ITEP-026 isoladas da Lagoa dos
Patos, Porto Alegre-RS, C. raciborskii CENA216 e R. brookii 338-T2, isoladas do braço Taquacetuba do Reservatório
da Billings, São Paulo-SP e C. raciborskii CENA217, isolada do Lago de Lajeado, Porto Alegre-RS. Os fragmentos de
sxtI dessas sete linhagens foram seqüenciados e comparados por análise BLAST com outras sequências do gene
sxtI depositadas no GenBank e apresentaram similaridades variando entre 98 – 99% com a sequência de OCTase
da C. raciborskii 339-T3 isolada do braço Taquacetuba do reservatório da Billings. Entretanto, a porcentagem de
cobertura foi baixa (variou de 88 a 91%) indicando que existem diferenças entre elas. A análise filogenética agrupou
os fragmentos do gene sxtI das linhagens estudadas com sequências do gene sxtI de outras cianobactérias já
conhecidas como produtoras de saxitoxina, em um clado com valor de reamostragem de 71%. Além disso, as
sequências inéditas obtidas neste estudo ficaram agrupadas em um clado interno formado somente com
cianobactérias brasileiras, com valor de reamostragem de 98%. As cianobactérias planctônicas foram identificadas
por meio da combinação de descrição morfológica com sequenciamento do gene RNAr 16S e análise filogenética.
Apoio financeiro: CNPq, Capes, Fapesp
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
47
Role and regulation of two proteins important for
stationary phase viability
da Silva, CAPT; Balhesteros, H; Mazzon, RR; Marques, MV
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, Brazil
[email protected]
Keywords: stationary-phase, response regulator, cspd, cspc, ppgpp.
Caulobacter crescentus is an aquatic Gram-negative bacterium, which is a major model system for studying the
bacterial cell cycle and cell differentiation, and the molecular mechanisms have been detailed extensively in recent
years. C. crescentus genome possesses four genes that encode Cold Shock Proteins (CSP) containing Cold Shock
Domains (CSD). cspA and cspB have only one CSD and are induced upon cold shock while cspD and cspC possess
two CSDs and are induced at the onset of stationary phase. Like in other bacteria, the roles of cspC and cspD in
adaptation to nutrient starvation and stationary phase are not well known in C. crescentus. We investigated the
importance of cspC and cspD at stationary phase, and a null mutant of cspD showed no alterations in viability at
30ºC in comparison to the wild type. However, when both cspD and cspC are deleted, there is a pronounced cell
death at late stationary phase, and this phenotype is more severe in this mutant than in a mutant lacking only cspC.
The cspD mutant does not show alterations in morphology, but many cells of cspCD mutant present increased
length and curved shapes that are more aberrant than the morphologies observed in cspC mutant. These results
indicate that cspC and cspD are probably involved in cell adaptation and survival to long periods in stationary
phase. A library of 7,500 Tn5 mutants was screened for lower cspD levels of expression. We identified a strain with
a transposon insertion into a gene encoding a response regulator of a two-component system that showed no
induction of cspD at stationary phase. However, the levels of expression of cspC were not altered in this strain. The
expression analysis of cspD and cspC in a spoT mutant, which does not produce the second messenger ppGpp,
showed decreased levels of cspD expression while cspC expression was not affected. This indicates that cspC and
cspD are regulated independently, and that ppGpp is a positive factor regulating the induction of cspD expression.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
48
Análise in silico de vias metabólicas e reanotação de
genes do patógeno de cana-de-açúcar Leifsonia xyli
subsp. xyli
Soares, RC 1; Camargo, LEA 3; Paulino, LC 1; Monteiro-Vitorello, CB 2
Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH), Universidade Federal do ABC (UFABC)
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ – Universidade de São Paulo)
3
Departamento de Fitolatolologia e Nematologia, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ – Universidade de São Paulo)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Leifsonia, raquitismo da soqueira, análise comparativa, genoma.
Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), bactéria Gram-positiva pertencente ao filo Actinobacteria, é o agente causador do
raquitismo da soqueira, sendo responsável por grande perda econômica na produção de cana-de-açúcar. Estudos
da biologia de Lxx e análises genéticas e funcionais são dificultados pelo crescimento fastidioso da bactéria in
vitro, mesmo em meio de cultura considerado rico em nutrientes. O sequenciamento completo do genoma de
Lxx revelou um grande número de pseudogenes, sugerindo um processo de decaimento genômico associado à
restrição de nicho ecológico desta bactéria. A deleção ou interrupção de genes com consequente perda de função
poderiam estar associados ao crescimento lento da bactéria in vitro. A disponibilidade da sequência completa do
genoma e a predição funcional dos genes tornaram possível a análise das vias metabólicas e criação de hipóteses
sobre auxotrofias. Com o objetivo de identificar possíveis auxotrofias em Lxx que estariam associadas ao seu
crescimento lento in vitro, foram analisadas e descritas todas as vias de biossíntese de aminoácidos, vitaminas
e cofatores desta bactéria, comparando-as a organismos filogeneticamente próximos: Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis (Cmm) e Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms), patógenos de tomate e batata,
respectivamente. Assim como para Lxx, as sequências completas dos genomas de Cmm e Cms também estão
disponíveis. As análises consistiram na verificação da presença ou ausência de genes preditos para a biossíntese
de cada aminoácido, vitamina ou cofator, utilizando-se os bancos de dados KEGG (Kyoto Enciclopédia de Genes
e Genomas), LBI (Laboratory for Bioinformatics – Leifsonia xyli subsp. xyli Genome Project), GenBank (NCBI),
Protein (NCBI), Uniprot e BRENDA; a ferramenta BLAST e base na literatura. As análises mostraram que Lxx
é possivelmente auxotrófica para tiamina, biotina e nicotinato, além de metionina e cisteína (previamente
descrito). Um panorama compreensivo das vias de biossíntese analisadas foi construído incluindo todas as
interligações possíveis entre os substratos e produtos das diferentes vias. Análises comparativas permitiram a
reanotação de diversos genes. Onze genes com função até então desconhecida ou parcialmente conhecida
foram reanotados e associados a vias metabólicas. Além destes, 20 genes previamente anotados, porém sem
função atribuída nas vias analisadas foram incluídos a passos enzimáticos das vias. O trabalho realizado
poderá facilitar os estudos para o desenvolvimento de um meio de cultura para crescimento in vitro de Lxx.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
49
Diagnóstico e quantificação de Xanthomonas
axonopodis pv. passiflorae em folhas de maracujá doce
por Real-Time PCR
Munhoz, CF; Vieira, MLC
Universidade de São Paulo, ESALQ, Departamento de Genética
[email protected]
Palavras-chave: Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae; Bacteriose; Maracujá; Real-Time PCR; Quantificação relativa.
A bacteriose do maracujazeiro, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, é considerada uma
das principais doenças da parte aérea, sendo um fator limitante à produção de frutos, pois reduz o período de
exploração comercial e de vida das plantas infectadas. As espécies comerciais de maracujá (Passiflora edulis, o
maracujá roxo; P. edulis f. flavicarpa, o maracujá amarelo; P. alata, o maracujá doce) são suscetíveis a essa doença.
Para o desenvolvimento de variedades resistentes e o manejo adequado dos pomares, é importante que se tenha um
melhor conhecimento sobre o processo de infecção e o tempo necessário para a colonização dos tecidos da planta.
O objetivo deste trabalho foi analisar a proliferação de X. axonopodis pv. passiflorae no tecido foliar de maracujá
doce, a partir da quantificação relativa da bactéria por Real-Time PCR. Plantas foram inoculadas com o isolado
Abj5-3 (suspensão de 108 UFC/ml) e avaliadas após 5, 12 e 19 dias, usando-se três folhas por data de avaliação.
Para as análises de qPCR, foi desenhado um par de primers (qXapas) a partir da sequência da região intergênica
16S-23S rRNA a fim de diagnosticar a presença do patógeno. Para a normalização da reação, foi utilizado o par de
primers EF-1α que amplifica um fator de elongação de Passiflora spp. Cada reação foi feita em um volume final de
12,5 µl, contendo 40 ng de DNA da folha inoculada, 1X de SYBR Green Rox Plus (LGC) e 0,1 µM de cada primer,
nas condições: 95 °C por 15 min., 40X 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min., e após os ciclos de amplificação foi feita
a curva de melting (1X 60 °C a 95 °C, com leituras da fluorescência a cada 0,3 °C), em termociclador Step One
(Applied). As reações foram feitas em triplicata, adotando-se dois controles: sem DNA template e com DNA da
planta sadia. A determinação das eficiências e dos níveis de amplificação foram feitas usando o software LinReg
(Ramakers et al., Neurosci. Lett., 2003). A amplificação dos primers qXapas foi normalizada com a amplificação dos
primers EF-1α para cada amostra. Daí foi calculada a média por data, sendo cada média comparada àquela do
primeiro período de avaliação. A análise mostrou que a quantidade de bactérias aumentou 29X do 5° ao 12° dia
e 34X do 5° ao 19° dia após a inoculação. A Real-Time PCR permitiu a detecção precoce do patógeno (aos 5 dias
após a inoculação), ainda no período assintomático, e a análise de sua proliferação nos períodos subseqüentes.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
50
Caracterização da resposta de macrófagos frente à
Pseudomonas aeruginosa PA14 e linhagens mutantes
para o sistema de dois componentes RcsCB
Kaihami, GH1; Baldini, RL1; de Almeida, SR2
1
2
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
Departamento de Analises Clinicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, Resposta imune, Macrófagos, Sistema de dois componentes, Ilha de patogenicidade
Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama encontrada em diversos ambientes, o qual pode atuar
como patógeno oportunista. Os fatores de virulência desta bactéria já foram extensamente estudados, como toxinas,
enzimas extracelulares, sistemas de secreção e a resistência intrínseca de antibióticos. A capacidade de crescer sob
a forma de biofilme facilita a colonização de diversas superfícies como cateteres, ventiladores, lentes de contato,
e próteses, sendo responsável por 10-20% de todas as infecções hospitalares. Estes fatores tornam as infecções
por P. aeroginosa uma das principais causas de mortalidade e complicações em pacientes imunocomprometidos.
A linhagem P. aeruginosa PA14 apresenta uma ilha de patogenicidade, na qual estão localizados os genes rcsCB,
que codificam um sistema de dois componentes.Este sistema é composto pela histidina quinase RcsC e pelo
regulador de resposta RcsB. Estudos demonstraram que a mutação em cada um destes genes proporciona uma
redução de quase 70% da mortalidade no modelo de queimadura em camundongos. A função que este sistema
pode exercer sobre a fisiologia da bactéria durante a infecção ainda não está esclarecida, bem como a resposta
mediada pelo hospedeiro no intuito de controlar a infecção. Como no modelo de queimadura, os camundongos
apresentam-se neutropênicos, o sistema imune deve controlar o inicio da infecção via macrófagos. Para verificar
se a resposta dos macrófagos é importante no controle da infecção e se o sistema de dois componentes RcsCB tem
papel nessa interação, macrófagos J774.A1 foram incubados com a linhagem selvagem PA14 e com mutantes nos
genes rcsC ou rcsB. Enquanto PA14 sobrevive extracelularmente e está presente em menor número no interior dos
macrófagos, quando comparado aos mutantes rcsC e rcsB, sendo que o mutante rcsB apresenta um perfil mais
elevado de fagocitose. Apesar da linhagem selvagem ser menos citotóxica, como avaliado pela liberação de lactato
desidrogenase pelos macrófagos, ela promove uma maior liberação de TNF-alfa, uma citocina pró-inflamatória e
pró-apoptótica, em relação às linhagens mutantes. Não foi detectada a liberação da citocina anti-inflamatória IL10 pelos macrófagos incubados com quaisquer das linhagens em estudo. Esses dados mostram que os macrófagos
são um modelo adequado para o estudo do sistema RcsCB na ativação do sistema imune inato e novas análises
estão em andamento para o melhor entendimento deste processo, trazendo novas perspectivas sobre o papel dos
genes presentes na ilha de patogenicidade PAPI-1 na alta virulência da linhagem PA14.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
51
Caracterização morfofisiológica e genética de bactérias
endofíticas isoladas de raízes de diferentes genótipos
de milho (Zea mays L.)
Ikeda, AC1; Hungria, M2; Steffens, MBR3; Glienke, C1; Kava-Cordeiro, V1; Bassani, LL1; Adamoski, D1;
Stringari, D1; Galli-Terasawa, LV1
Departamento de Genética, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Soja.
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Zea mays L. Bactérias endofíticas. Fixação Biológica de Nitrogênio. BOX-PCR. Gene 16S rDNA.
Introdução: A cultura do milho (Zea mays L.) tem relevante expressão no cenário mundial e o Estado do Paraná
desempenha importante papel como maior produtor de milho no Brasil. Assim, todas as estratégias que permitam
otimizar a produção deste importante cultivo são importantes para a pesquisa aplicada. Bactérias endofíticas
apresentam alto potencial na elevação dos índices de produtividade, por mecanismos como a fixação biológica
do nitrogênio, a promoção do crescimento de plantas pela produção de fitohormônios, o controle de patógenos,
entre outros. Objetivos: Isolar bactérias que se associam endofiticamente com diferentes genótipos de milho
(linhagens e híbridos) e caracterizá-las quanto a diversas propriedades morfofisiológicas e genéticas. Métodos:
Inicialmente foi estabelecida uma coleção de 217 isolados de bactérias endofíticas de raízes de milho e destes,
98 foram mantidos em condições de laboratório. Foram realizadas caracterizações morfofisiológicas, incluindo
morfologia de colônias, diversos testes bioquímicos (crescimento em diferentes meios de cultura, redução do
nitrato, urease, catalase, tolerância intrínseca a antibióticos) e avaliação da capacidade de fixação do nitrogênio
in vitro. Como etapa subsequente, avaliou-se o perfil genético das bactérias através da amplificação do DNA
com o primer BOX-PCR, relacionado a regiões repetitivas e não codificantes do DNA. Foi realizado, ainda, o
sequenciamento parcial do gene 16S RNAr de bactérias representantes dos principais agrupamentos obtidos com
os dados morfofisiológicos, sendo identificados os gêneros Pantoea, Bacillus, Burkholderia e Klebsiella. Resultados:
Foi observada alta variabilidade entre os isolados obtidos em todos os parâmetros analisados, confirmando que
populações com elevado grau de diversidade morfofisiológica e genética se estabelece endofiticamente com o
milho. É interessante constatar que essa diversidade ocorre mesmo em linhagens e híbridos de milho obtidos
em condições normais de melhoramento para a gramínea, que não consideram a capacidade de associação com
bactérias endofíticas. Conclusão: O estabelecimento dessa importante coleção, com microrganismos pertencentes
a gêneros pouco estudados com a cultura do milho no Brasil permitirá a condução de estudos para a avaliação
da capacidade promotora de crescimento ou mesmo fixação biológica de nitrogênio nesses isolados bacterianos.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
52
Busca por sinais para a indução da expressão da
fímbria cupD de Pseudomonas aeruginosa PA14
Boechat, AL1; Baldini, RL1
1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, USP
Palavras-chaves: pseudomonas aeruginosa, fímbria, construções repórteres, sigmas ecf, biblioteca de superexpressão.
Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, capaz de infectar diversos hospedeiros, incluindo
humanos imunocomprometidos. O genoma da linhagem PA14 contém, entre outras regiões variáveis entre
linhagens, uma ilha de patogenicidade, codificando pelo menos dezenove fatores de virulência. Nessa ilha, entre
duas repetições diretas, localizam-se dois operons, pvrSR e rcsCB, codificando sistemas de dois componentes e um
provável operon, cupD1-5, que codifica uma fímbria montada pelo sistema chaperone-usher. RcsC e RcsB atuam de
forma inversa na regulação de cupD, enquanto PvrS e PvrR parecem atuar de forma positiva e indireta no promotor
de cupD. Entretanto, a expressão de cupD é baixa nas condições laboratoriais e somente atinge níveis mais intensos
quando seu regulador positivo RcsB é superexpresso in trans. Os sinais ambientais para a indução da expressão
desses reguladores e, por conseqüência, da fímbria são desconhecidos, assim como a participação de produtos de
outros genes que atuem upstream a pvrSR e rcsCB ou independentemente desses operons. A presença de genes
codificando fímbrias específicas no genoma de bactérias tornam-nas capazes de aderir e colonizar superfícies,
um fator importante na sua virulência. Com o objetivo de encontrar condições para a expressão dos sistemas
de dois componentes que regulam cupD, foram criadas linhagens repórteres de tradução e transcrição baseadas
nos vetores pUC18-mini-Tn7T-Gm-LacZ20 e Mini-CTX_lacZ, respectivamente, integrados no cromossomo. Para a
obtenção das linhagens de tradução, o protocolo de eletroporação foi otimizado em PA14, pois o método descrito
na literatura se mostrou ineficiente. Após vários ensaios, foi determinado que o crescimento das culturas antes
da eletroporação em meio mínimo M63 promove o aumento na eficiência de transformação de PA14. Assim, foi
possível obter as linhagens com as construções realizadas no pUC18-mini-Tn7T-Gm-LacZ20, que necessita da
transformação simultânea da bactéria hospedeira com este plasmídeo suicida e um plasmídeo helper, que codifica
a transposase responsável pela integração sítio-específica. Sequências do vetor foram posteriormente excisadas
do cromossomo com a Flp recombinase, expressa pelo pFLP2 (todos os vetores e helpers foram gentilmente
cedidos pelo Dr. H.P. Schweizer). Utilizando-se das linhagens repórteres construídas e ensaios de atividade de
β-galactosidase, foi observado que a expressão de pvrSR era mais baixa no início da fase estacionária do crescimento,
enquanto rcsCB revela um aumento de expressão nessa fase. Paralelamente, cinco prováveis fatores sigma ECF
foram superexpressos a partir de um promotor induzível por arabinose nessas linhagens, porém nenhum efeito
foi observado na expressão dos sistemas de dois componentes. Portanto, a busca por genes importantes para a
ativação desses operons está sendo feita pela seleção de colônias positivas numa biblioteca de superexpressão
baseada no transposon mini-Tn5.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
53
Isolamento do gene da α-galactosidases de
Debaryomyces hansenii UFV-1 e análises in silico da
sequência.
Ascencao, CFR; 1Gonçalves, TA; 1Rezende, ST; 1Guimarães, VM; 1Oliveira, LO
1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Brasil
[email protected]
1
Palavras–chave: α-galactosidases, rafinose, estaquiose, soja, Debaryomyces hansenii, clonagem molecular
α-Galactosidases catalisam a hidrólise de vários α-D-galactosídeos. São enzimas com aplicação em processos
biocatalíticos, sendo utilizadas na indústria de alimentos, papel e açucareira. Uma aplicação de destaque é
o seu uso na hidrólise de oligossacarídeos de soja, convertendo-os em açúcares digeríveis e assim melhorando
as propriedades nutricionais de produtos derivados de soja. O presente trabalho teve como objetivo o
isolamento e a clonagem do gene da α-galactosidase da levedura Debaryomyces hansenii UFV-1. Foi realizada
a extração do RNA total e, por meio da técnica de RACE, obtido o cDNA com tamanho de 1373 pb, utilizando
para isso, um primer sintetizado a partir do sequenciamento do N-terminal da α-galactosidase purificada.
O fragmento foi clonado e posteriormente seqüenciado sendo obtido um alto índice de similaridade com
α-galactosidases presentes no banco de dados (BLAST). A seqüência do gene foi traduzida utilizando o
algorítimo SIXFRAME (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html) e obtida uma possível Open reading
frame (ORF); que quando alinhada com a seqüência de aminoácidos de várias α-galactosidases apresentou
considerável similaridade e 100% de identidade nas posições dos resíduos catalíticos. Com uso do algorítio
PROTPARAM (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html) foram estimados o peso molecular (43,89 kDa) e
o ponto isoelétrico (4,15), que se mostraram similares aos dados experimentais obtidos coma a enzima nativa.
Apoio: Fapemig
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
54
Differential gene expression during the Blastocladiella
emersonii sporulation and analysis of the cyclic GMP
signaling pathway
Vieira, ALG1; Linares, E2; Augusto, O2; Gomes, SL1
Laboratório de Regulação da Expressão Gênica em Microrganismos, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
Laboratório de Bioquímica de Oxidantes e Radicais Livres e EPR.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Blastocladiella emersonii, fungus, sporulation, gene expression, cyclic GMP
In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus
Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615
genes were up-regulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The over-represented
functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+
binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization
(only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories
were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data
were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great
number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also
investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during
B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and
degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding
distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit
high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four
transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when
zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the
enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical
nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+- •NO-cGMP signaling pathway.
Supported by: FAPESP and CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
55
Estudo da expressão de genes de virulência regulados
pelo repressor fur em Klebsiella pneumoniae
Ferraz, LFC1,a; Leite, RO1; Mota, LP1; Stuchi, LP;1; Gomes, AEI1; Ribeiro, ML2; Pedrazzoli Jr, J2; Vicentini, R3
Laboratório de Pesquisa, Universidade São Francisco, Bragança Paulista, SP
Laboratório de Biologia Molecular, UNIFAG, Universidade São Francisco, Bragança Paulista, SP
3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas, SP.
a
[email protected]
1
2
Palavras-chaves: Klebsiella pneumoniae, regulador transcricional Fur, genes de virulência, regulação gênica.
Klebsiella pneumoniae é uma bactéria Gram negativa que causa uma variedade de infecções, tais como pneumonia,
meningite e septicemia. Assim como na maioria das bactérias patogênicas, a capacidade de K. pneumoniae em
captar ferro constitui-se em um importante fator determinante de sua patogenicidade. Em muitas bactérias, o
sistema de homeostase de ferro é regulado pelo repressor transcricional Fur. Em ambientes ricos em ferro o regulador
Fur forma um complexo com íon ferroso e este complexo se liga a seqüências regulatórias, chamadas boxes Fur,
localizadas na região promotora dos genes alvos, levando à repressão da transcrição destes genes. Este trabalho
teve por objetivo a identificação e caracterização de genes associados à virulência em Klebsiella pneumoniae cuja
expressão é regulada por Fur. Neste sentido, uma matriz consenso construída a partir de sítios regulatórios de Fur
de outras bactérias foi utilizada para identificar prováveis boxes Fur na região promotora de genes de virulência. O
papel do repressor Fur na regulação da expressão desses genes foi investigado por meio do ensaio FURTA, no qual
células de E. coli linhagem H1717 transformadas com vetores contendo os prováveis boxes Fur foram plaqueadas
em meio de cultura MacConkey contendo ferro (100µM de FeSO4). Foram identificados boxes Fur em genes com
possíveis implicações na patogenicidade de K. pneumoniae, tais como genes que codificam: sistema de captação de
ferro mediado por sideróforos dos tipos catecolato (genes fepD, entC e ybiL) e hidroxamato (gene fhuA), resistência
ao estresse oxidativo (gene sitA), biossíntese de fímbrias (gene fimZ), bombas de efluxo de drogas (gene hlyD) e
no próprio gene que codifica para o repressor Fur (gene fur). Todos os boxes Fur identificados foram validados
por meio do ensaio FURTA. O papel do repressor Fur na regulação da expressão desses genes foi investigado por
meio de PCR em tempo real a partir de células de K. pneumoniae cultivadas em meio de cultura contendo ferro
(FeSO4) e em meio com privação de ferro (contendo o quelante dipiridil). O presente trabalho revelou que Fur
é um regulador global que em Klebsiella pneumoniae controla a expressão não apenas de genes envolvidos na
homeostase de ferro, mas também de genes que determinam a patogenicidade nesta bactéria, tais como genes
do mecanismo de captação de ferro, formação de biofilme, resposta ao estresse oxidativo e resistência a drogas.
Apoio Financeiro: FAPESP.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
56
Estudo da variabilidade genética em bactérias que
nodulam o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.)
proveniente dos centros de diversidade Andino e
Mesoamericano
Oliveira, JP1; Szilagyi-Zecchin, VJ1; Glienke, C; Kava-Cordeiro, V1; Terasawa, LVG1
Laboratório de Genética de Microrganismos - LabGeM, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná.
[email protected]
1
Palavras-chave: Feijoeiro, Rizóbio, Diversidade Genética, Centros de Origem e Diversificação, FBN.
A cultura do feijoeiro no Brasil apresenta importância destacada nos sistemas produtivos vinculados à agricultura
familiar. Dentro deste contexto, destaca-se a necessidade do desenvolvimento de tecnologias de baixo custo
capazes de melhorar os níveis de produtividade dos pequenos agricultores, responsáveis pela quase totalidade da
produção desta leguminosa, essencial na dieta de grande parte da população brasileira. A inoculação com bactérias
do grupo dos rizóbios é uma alternativa que pode substituir, ainda que parcialmente, a adubação nitrogenada,
resultando em benefícios ao pequeno produtor. Os rizóbios pertencem à ordem Rhizobiales e são capazes de
formar estruturas altamente específicas na raiz da planta hospedeira, conhecidas como nódulos, onde ocorre a
conversão de nitrogênio atmosférico a amônia, conhecida como “Fixação Biológica do Nitrogênio”. A investigação da
variabilidade genética de rizóbios amplia a perspectiva de seleção de bactérias com maior potencial simbiótico. Isto
possibilita a identificação de combinações mais eficientes com a planta hospedeira na simbiose, para subseqüente
produção de inoculantes comerciais. O presente trabalho teve por objetivo investigar a variabilidade genética
de bactérias que nodulam o feijoeiro comum, representativo dos centros de origem andino e mesoamericano,
por meio de caracterizações morfofisiológicas e genéticas. Quatro cultivares de feijão foram utilizadas, duas
de cada centro de origem, como plantas isca. Após aproximadamente quatro semanas de cultivo, foi realizado
o isolamento das bactérias presentes nos nódulos radiculares. Na análise morfofisiológica foram consideradas
características de morfologia da colônia, absorção do corante vermelho Congo em meio YMA, alteração de pH
em meio contendo azul de bromotimol e coloração de Gram. Os isolados que apresentaram as características
morfofisiológicas comuns aos rizóbios foram selecionados para a análise genética, sendo que seus DNAs foram
submetidos a reações de amplificação por BOX-PCR, e analisados quanto à diversidade. Os resultados encontrados
demonstraram alta variabilidade genética, sendo que foi verificada maior diversidade entre as bactérias capturadas
pelas cultivares de origem mesoamericana. Além disso, não ocorreu a formação de agrupamentos específicos
que indiquem a quais espécies pertencem os isolados. Estes resultados demonstram a necessidade de serem
realizados estudos mais abrangentes, que permitam a classificação de espécie e avaliação da eficiência simbiótica
para uma possível seleção de linhagens que possam ser disponibilizadas na confecção de inoculantes comerciais.
Apoio financeiro: Labgen, Semilia, Embarapa Soja e CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
57
O fator sigma alternativo σE é necessário para a
resposta ao estresse nitrosativo e virulência de
Corynebacterium pseudotuberculosis
Pacheco, LGC1; Castro, TLP1; Moraes, PM1; Dorella, FA1; Carvalho, NB2; Slade, SE3; Meyer, R4; Miyoshi, A1;
Oliveira, SC2; Dowson, CG3; Azevedo,V1
Departamento de Biologia Geral
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
3
Department of Biological Sciences, University of Warwick, United Kingdom
4
Instituto de Ciências das Saúde, Universidade Federal da Bahia, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, fator sigma alternativo, linhagem mutante, óxido nítrico, proteômica, virulência.
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria patogênica intracelular facultativa, causadora da linfadenite
caseosa em pequenos ruminantes. Para causar uma infecção de sucesso, esta bactéria precisa resistir às condições
de estresse encontradas dentro das células hospedeiras. A ativação transiente de genes específicos de resposta ao
estresse por fatores sigma (σ) alternativos da RNA polimerase é uma forma utilizada por bactérias patogênicas
para responder rapidamente a tais condições adversas. Neste estudo, foi avaliada a contribuição de um fator σ de
resposta ao estresse extracitoplasmático, o fator σE, para a resistência de C. pseudotuberculosis a diferentes agentes
geradores de estresse, para a regulação do proteoma extracelular e para a virulência desta bactéria. O gene sigE de
C. pseudotuberculosis foi isolado e foi gerada uma linhagem mutante (ΔsigE) por recombinação homóloga. Após
comparar a resistência desta linhagem a diferentes condições de estresse in vitro com a da linhagem tipo-selvagem
(wt), foi possível identificar um papel para o fator σE na resistência de C. pseudotuberculosis ao estresse gerado pelo
agente óxido nítrico (NO). Além disso, a linhagem mutante ΔsigE de C. pseudotuberculosis mostrou-se muito mais
virulenta após infecção de camundongos deficientes para a enzima óxido nítrico sintase indutível (iNOS-∕-) do que
de animais C57BL∕6, indicando a importância deste fator também para a resistência ao estresse nitrosativo in vivo.
Uma análise proteômica comparativa do proteoma extracelular das linhagens wt e ΔsigE de C. pseudotuberculosis,
crescidas sob condições normais ou submetidas a uma concentração biologicamente relevante do agente
NO, mostrou que o fator σE contribui para as alterações do exoproteoma bacteriano em resposta ao estresse.
Enquanto as alterações observadas na linhagem wt foram pequenas e indicativas de uma resposta específica ao
estresse nitrosativo, o exoproteoma da linhagem mutante variou significativamente, e o conjunto de proteínas
variantes é indicativo de uma resposta compensatória ao NO, aparentemente desencadeada pela falta do fator σE.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEMIG, Medical Research Fund
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
58
Taxonomia de vibrios usando genomas completos
Thompson, CC1*; Vicente, ACP1; Vasconcelos, ATR2; Thompson, FL3
Instituto Oswaldo Cruz (IOC-FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil
Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), Petrópolis, RJ, Brasil. 3Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), RJ,
Brasil.
*e-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Taxonomia, Taxonomia Gênomica, Vibrios
Desenvolvemos o primeiro estudo acerca da taxonomia genômica de vibrios. O objetivo central deste estudo
foi estabelecer um sistema de classificação e identificação informatizado utilizando sequências de genomas
completos. Foram utilizadas as ferramentas Multilocus Sequence Analysis (MLSA), super-árvore, Average Amino
Acid Identity (AAI), assinatura genômica, uso de códons, matrix proteômica, BLAST atlas, core e pangenoma
para explorar as relações taxonômicas entre 43 genomas de vibrios. O pangenoma de vibrios apresenta 26.504
genes. O core e pangenoma de V. choleraee consiste de 1.520 and 6.923 genes, respectivamente. Genes do
pangenoma possibilitariam que linhagens de V. cholerae habitem diferentes nichos ecológicos. As análises
de MLSA e super-árvore apresentaram relações taxonômicas similares, com uma evidente diferenciação
entre quatro grupos de vibrios (Vibrio core, V. cholerae-V. mimicus, Aliivibrio spp. e Photobacterium spp.). Uma
espécie de vibrio é definida como um grupo de linhagens que compartilham > 95% de similaridade no MLSA e
nas sequências dos genes da super-árvore, > 96% de similaridade no AAI, > 61% de similaridade no proteoma
e ≤ 10 de dissimilaridade na assinatura genômica. Linhagens da mesma espécie e espécies do mesmo gênero
formam grupos monofiléticos com base nas análises de MLSA e super-árvore. A taxonomia genômica
online de vibrios, permitirá a identificação de isolados através de um servidor da web. Esta nova abordagem
resultará em um avanço significativo na caracterização, descrição e entendimento da diversidade bacteriana.
Apoio financeiro: Instituto Oswaldo Cruz (IOC-FIOCRUZ), CNPq e CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
59
Análise do transportador ABC de glutamina/glutamato
em Streptococcus mutans
Guimarães, KS 1*; Nepomuceno, RSL1; Rojas, RLG1; Ferreira, RCC1
Universidade de São Paulo, Instituto de Ciências Biomédicas II, São Paulo, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Glutamina, Glutamato, Streptococcus mutans, ABC transportador, knockout.
A glutamina em conjunto com o glutamato são aminoácidos que apresentam grande relevância para os seres
procariotos atuando no metabolismo bacteriano; no crescimento em condições limitantes de amônia; na
síntese de aminoácidos, parede celular, ácidos nucléicos, açúcares aminados e outras moléculas biologicamente
importantes. A internalização destes aminoácidos se deve em grande parte a presença de transportadores ativos
do tipo ABC. Neste trabalho avaliamos o sistema de transporte ativo de captação de glutamina/glutamato em
S. mutans, agente etiológico da cárie dental. Análises in silico revelam a presença de dois operons que codificam
estes sistemas de transportes, o operon gln previamente caracterizado e um operon policistrônico predito
composto pelos genes smu.1179c, que forma o canal transmembrânico, smu.1178c, componente que hidrolisa
ATP e o componente ligador de glutamina, smu.1177c, responsável pela afinidade e especificidade do sistema.
A similaridade entre os componentes desse sistema em relação aos do operon gln variou entre 26% e 45%, sendo
mais conservado o componente ATPásico. Com relação à ortólogos do gênero Streptococcus observamos valores
maiores de similaridade com destaque para 66% de similaridade entre smu.1179c e componente transmembrânico
de S. pneumoniae D39. O perfil de crescimento da cepa selvagem UA159 em meio definido FMC demonstrou uma
redução no tempo de geração na ausência de glutamina e/ou de glutamato. Foi construído um mutante de S.
mutans pela técnica de mutagênese sítio-dirigida por inserção de um cassete de eritromicina e knockout do operon
smu.1179c-1177c. A taxa de crescimento do mutante foi reduzida em relação à cepa selvagem seja em meio rico
(BHI) ou meio definido (FMC) na presença ou ausência de glutamina e/ou glutamato. Com relação a capacidade
de produção de biofilme, aspecto essencial para a patogênese desta bactéria, a cepa mutante apresentou aumento
de produção em relação a cepa UA159. Os presentes resultados indicam que o operon smu.1179c-1177c apresenta
papel importante na fisiologia e patogênese de S. mutans sendo esse relacionado a capacidade de internalização
de aminoácidos aromáticos.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
60
Avaliação da capacidade protetora de uma linhagem
mutante de Corynebacterium pseudotuberculosis como
promissora vacina no combate à linfadenite caseosa
em caprinos
Rocha, FS1; Dorella, FA1; Moraes, PMRO1; Costa, KM1; Nascimento, AC1; Domingueti, CP1; Miyoshi, A1;
Azevedo, V1
Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Minas Gerais.
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, Linfadenite caseosa, Vacina, Transposon, Resposta Imune.
A linfadenite caseosa é uma doença que acomete caprinos e ovinos e tem como agente etiológico a bactéria
Corynebacterium pseudotuberculosis. Apesar da ampla distribuição mundial desta doença e de sua grande
importância econômica, a imunoprofilaxia contra a infecção causada pela C. pseudotuberculosis ainda não é
eficaz na redução da incidência da doença, e os mecanismos moleculares da virulência e patogenicidade desta
bactéria ainda não estão bem definidos. Recentemente, o nosso grupo obteve, através de mutagênese aleatória
utilizando o TnFuZ, linhagens recombinantes de C. pseudotuberculosis. Após testes de imunização iniciais em
camundongos foi possível selecionar um mutante atenuado, denominado Cp13. O mutante Cp13 possui uma
interrupção em um gene que codifica uma proteína secretada que participa do sistema de transporte de ferro,
devido à inserção do transposon TnFuZ. Em geral, proteínas relacionadas ao transporte de ferro são bastante
utilizadas por bactérias patogênicas para “perceber” condições limitantes de ferro do hospedeiro e como um
sinal ambiental para induzir a expressão de fatores de virulência. Em ensaios de imunização em camundongos,
o mutante em questão foi capaz de conferir proteção de mais de 80% no modelo murino contra a infecção
pela linhagem selvagem da bactéria. O presente projeto é uma continuidade aos estudos já iniciados usando a
linhagem CP13 em busca de uma alternativa vacinal no combate à linfadenite caseosa. Já foram realizados
novos ensaios de testes de imunização em camundongos visando melhorias nos protocolos de imunização e
coletas de soro e células esplênicas e para validar estatisticamente os resultados. Concomitantemente, foram
realizados os testes inicias com o vetor a ser empregado na confecção de uma vacina livre de marcadores
externos. Os plasmídeos foram transformados em linhagens eletrocompetentes de C. pseudotuberculosis para que
pudéssemos verificar sua funcionalidade nesta espécie antes de iniciarmos a excisão. Testes em caprinos foram
iniciados e em breve teremos os primeiros resultados de imunização no hospedeiro caprino desta enfermidade.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
61
Characterization of the polyamine uptake system of
Streptococcus mutans
Nepomuceno, RSL1*; Luz, DE 1; Lemos, JA2; Ferreira, RCC1
Universidade de São Paulo, Instituto de Ciências Biomédicas II, São Paulo, Brazil.
University of Rochester, Center for Oral Biology, Rochester, USA
*[email protected]
1
2
Keywords: ABC transporter, Spermidine, Putrescine, Streptococcus mutans, active transport.
Polyamines are policationic molecules required for optimal growth of bacteria and eukaryotic cells, due to their role on
a number of biological reactions, such as biosynthesis of macromolecules (DNA, RNA and proteins) and maintenance.
The ability to transport polyamines from the outside medium to the cell cytoplasm as well as endogenous synthesis
are required for the optimal grow and expression of virulence associated factors in a great number of bacterial
species. In bacteria, the main polyamine transport system (Pot) belongs to a family of ABC transporters including
four cistrons: potA, encoding the ATP-binding component which provides energy for the transport process, potB and
potC, encoding pore-forming proteins, and potD encoding the polyamine-binding protein. In this work we evaluate
the physiological role of the pot system of Streptococcus mutans, the etiological agent of tooth decay. Two S. mutants
knockout mutants were constructed by site-direct-mutagenesis by insertion of an erythromycin (insertion into the
potD gene) or a kanamycin (deletion of the pot operon) encoding gene cassette. The S. mutans mutants did show
a slight impairment on the growth rate in defined media (FMC), which was completed reversed by the addition
of both spermidine and putrescine to the growth media. Despite the important physiological roles of polyamines
in bacteria, we could not detect any difference on cell surface hydrophobic behavior of pot mutants with regard
to the wild type strain. Another trait evaluated was the transformation frequency which showed no significant
alteration in the S. mutans pot mutants. The uptake of [H3+]spermidin was reduced 124 fold in the pot mutants when
compared to the wild type strain. Taken together the present results indicate that the Pot system does not play a
significantly physiological role in of S. mutans possibly due to the internal endogenous synthesis of these molecules.
Supported by FAPESP and CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
62
Caracterização de cepas de Wolbachia em espécies do
complexo Anastrepha fraterculus (Diptera, Tephritidae)
pela análise de locos múltiplos (MLST)
Prezotto, LF1; Perondini, ALP1; Marino, CL2; Selivon, D1
1.Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
2. Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP-Botucatu
[email protected]
Palavras-chave: bactéria, moscas-das-frutas, gatB, coxA, hcpA, ftsZ, fbpA
Wolbachia é uma bactéria intracelular encontrada tanto nos tecidos somáticos quanto nos reprodutivos de
diversas espécies de artrópodes e nematódeos. Estudos filogenéticos baseados nos genes 16S e ftsZ indicaram
que o gênero Wolbachia congrega seis supergrupos taxonômicos (“A” a “F”). Infestações por Wolbachia têm
sido associadas a diversas alterações na reprodução de seus hospedeiros, p. exemplo, a incompatibilidade
citoplasmática (IC), partenogênese, feminização de machos genéticos e morte dos machos. A identificação das
diferentes cepas da bactéria é mais precisa quando a análise de locos múltiplos (MLST) é aplicada. Infecção
por Wolbachia foi descrita em diversas espécies de moscas-das-frutas da familia Tephritidae, Bactrocera ascita,
Rhagoletis cerasi, Ceratitis capitata, nas quais a bactéria induz a incompatibilidade citoplasmática. No gênero
Anastrepha, endêmico do Continente Americano, infecção por Wolbachia foi descrita em várias espécies pela
análise do gene wsp, existindo também a indicação de que IC mediada por Wolbachia ocorra entre duas espécies
do grupo fraterculus. A ocorrência de IC aliada a sugestão do emprego da Wolbachia em programas de controle
populacional das moscas-das-frutas, impõem a necessidade de uma caracterização mais precisa das diferentes
cepas da Wolbachia. No presente trabalho foram amplificados e sequenciados fragmentos dos genes gatB, coxA,
hcpA, ftsZ e fbpA, que integram a metodologia de MLST. Foram analisadas diversas amostras populacionais das
três entidades do complexo de espécies críptica de Anastrepha fraterculus. Análise das sequências de cada um
dos genes isoladamente, mostrou em geral as mesmas relações entre os haplótipos e amostras populacionais.
As sequências dos cinco genes concatenadas, com 2081 pb, foram analisadas tendo sido encontrados 13
haplótipos, com distâncias variando de 0,001 a 0,070. A análise filogenética isolou os haplótipos de Wolbachia
em clados distintos, demonstrando que diferentes linhagens da Wolbachia estão presentes nesses hospedeiros.
Haplótipos diferentes ocorreram em diferentes espécies de hospedeiros que, por outro lado, congregaram
mais que uma cepa de Wolbachia em uma mesma amostra populacional. Um dos haplótipos foi detectado
em duas espécies do complexo e é, também, o mais comumente encontrado (ST1) em diferentes organismos.
Apoio: FAPESP, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
63
Identificação, filogenia molecular e análise de
expressão de genes envolvidos na resposta ao
estresse ácido em Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20
Ferreira, AB1; Freitas, FS1; Oliveira, MNV1; Conceição, LL1; Alfenas-Zerbini, P1; Queiroz, MV1; Borges, AC1;
Moraes, CA1
Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: Lactobacillus, probióticos, estresse ácido, expressão de genes
Linhagens de Lactobacillus utilizadas como probióticos são expostas a diversos tipos de estresse, como baixo
pH, que pode afetar a sobrevivência durante a passagem pelo trato gastrointestinal. A reação de descarboxilação
de aminoácidos é um dos sistemas mais importante para a manutenção do pH intracelular em condições de
estresse ácido. Nesta reação, um aminoácido é transportado para dentro da célula, um próton é consumido e
o produto, uma amina, é exportado da célula. O resultado do consumo de um próton é o aumento do pH
intracelular. Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 apresenta características probióticas e potencial para uso em
alimentos fermentados. Este trabalho teve como objetivo identificar os genes que codificam as proteínas ornitina
descarboxilase e permease de aminoácidos em Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20. Essas proteínas fazem parte
do mecanismo de descarboxilação de aminoácidos e, em algumas Bactérias do Ácido Láctico, contribuem para
a tolerância ao ácido. O DNA total extraído a partir de L. delbrueckii UFV H2b20 foi submetido à reação de PCR
com primers construídos baseados nas seqüências dos genes que codificam as proteínas ornitina descarboxilase e
permease de aminoácidos de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. Os DNAs amplificados foram clonados,
transformados e seqüenciados. Árvores filogenéticas foram reconstruídas por inferência Bayseiana, utilizando
genes ortólogos capturados do NCBI (National Center for Biotechnology Information). A expressão desses dois
genes em resposta ao estresse ácido foi feita pelo método de PCR em tempo real. As seqüências de 1143 e 808 pares
de bases revelaram genes homológos aos da ornitina descarboxilase e permease de aminoácido, respectivamente,
confirmando a presença desses dois genes em L. delbrueckii UFV H2b20. Estas seqüências apresentaram alto valor
de identidade e agruparam na análise filogenética, com os respectivos genes de L. delbrueckii subsp. bulgaricus
ATCC 11842. A expressão desses genes foi alterada quando a bactéria em estudo foi exposta ao pH 3,5, indicando
uma resposta ao estresse ácido. A demonstração do papel desses genes na resposta ao estresse ácido é importante
para o desenvolvimento de culturas probióticas com melhores características de resistência as condições inibitórias
presentes no trato gastrointestinal.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
64
Prevalência de infecção por Neisseria gonorrhoeae
na região da Tríplice Fronteira do Alto Solimões,
Amazonas, Brasil
Leturiondo, AL1; Dutra, DLR1; Benzaken, AS2
Laboratório de Biologia Molecular, Fundação Alfredo da Matta
Gerência de DST, Fundação Alfredo da Matta
[email protected]
1
2
Palavras-chaves: Gonorréia, prevalência, DST, Captura Híbrida, Alto Solimões
A gonorréia é uma das DST bacterianas com manifestações clínicas variadas tanto no homem quanto na mulher.
Formas assintomáticas são encontradas em cerca de 10% dos homens e 70% das mulheres, sendo importante
causa o seu alto potencial de transmissibilidade. O controle da gonorréia tornou-se um grande desafio devido à
necessidade de antibióticos eficientes para erradicar a infecção, reduzir a transmissão e evitar o desenvolvimento
de complicações. O objetivo desse trabalho foi colher informações sobre dados comportamentais, epidemiológicos
e laboratoriais em populações alvo da região do Alto Rio Solimões no estado do Amazonas. O estudo foi baseado na
metodologia SASH (Situational Analysis for Sexual Health), para o planejamento de um programa de intervenção.
Foram mapeados bares, discotecas e pontos de encontro com oferecimento de convites para comparecimento
nas unidades de saúde dos 3 municípios (Benjamim Constant, Atalaia do Norte e Tabatinga) que fazem fronteira
com Colômbia e Peru. Participaram do estudo 598 voluntários e foram coletadas amostras uretrais e cervicais e
submetidas posteriormente à técnica de Captura Híbrida para identificação do gonococo. Esta técnica consiste na
hibridização do DNA alvo com um coquetel de sondas específicas de RNA-GC, complementar a 0,5% do genoma
da Neisseria gonorrhoeae. Participaram do estudo, 285 homens e 308 mulheres entre 14 e 64 anos. A prevalência
encontrada nos três municípios foi de 0,7%, distribuídos em Tabatinga 0,33% (1/300), Benjamim Constant 1%
(2/199) e Atalaia do Norte 1% (1/99). 43% dos voluntários (171/398) declararam nunca ou raramente terem usado
camisinha. Os quatro voluntários positivos (3 homens e 1 mulher) estavam na faixa etária de 17 a 27 anos. A
voluntária se encontrava na forma assintomática da doença e dos três voluntários, apenas um não apresentava
sinais e sintomas clássicos da doença. A prevalência encontrada é semelhante aos diferentes grupos de outras
regiões do Brasil. É preocupante o grande percentual de indivíduos que raramente usam ou nunca usaram
camisinha. Campanhas educacionais sobre as DST precisam focalizar este grupo populacional.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
65
Pirossequenciamento, genômica comparativa e
filogenia de cepas de Xylella fastidiosa
Santana, WO1; Beckedorff, FCF1; Amaral, MS1; Coletta-Filho, HD2; Souza, AA2; Machado, MA2; Almeida,
LGP3; Vasconcelos, ATR3; Verjovski-Almeida, S1; da Silva, AM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo
Centro APTA Citros, Cordeirópolis
3
Laboratório Nacional de Computação Científica, Petrópolis
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fitopatógeno, Clorose Variegada dos Citros, pirossequenciamento, genômica comparativa, filogenia
Xylella fastidiosa (Xf) é uma bactéria gram-negativa que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas
e silvestres em várias partes do mundo. Diferentes cepas de Xf já foram isoladas e caracterizadas, sendo que destas,
seis tiveram seus genomas completa ou parcialmente elucidados: a 9a5c isolada de laranjeira no Estado de São
Paulo, agente causal da Clorose Variegada dos Citros (CVC) e as cepas norte-americanas Temecula-1, isolada de
videira e agente etiológico da doença de Pierce; Dixon, M12 e M23, associadas à escaldadura da amendoeira e
Ann-1, agente causal da escaldadura da espirradeira. A comparação dos genomas destas cepas entre si e com
genomas de outros fitopatógenos, associada a abordagens de genômica funcional e de genética molecular, têm
corroborado a hipótese de que patogenicidade e virulência de Xf compreendem múltiplos fatores, entre estes a
formação do biofilme que promoveria a oclusão dos vasos xilemáticos das plantas e consequente estresse hídrico.
Presume-se a existência de mecanismos adicionais potencialmente importantes para colonização específica e
seletiva de hospedeiros vegetais e insetos por este fitopatógeno, os quais permanecem desconhecidos ou pouco
explorados. Neste trabalho temos como objetivo a análise de genes potencialmente associados a aspectos
evolutivos, de adaptação e virulência de Xf, através do sequenciamento de novos genomas deste fitopatógeno
e de sua comparação com genomas já conhecidos. Para tal realizamos o sequenciamento do genoma das
cepas U24d e Fb7, isoladas de laranjeiras com sintomas de CVC, respectivamente do Estado de São Paulo e da
Argentina, e da cepa 3124, isolada de cafeeiro com sintomas de escaldadura foliar. Utilizamos a metodologia
de pirossequenciamento de DNA implantada no Centro Avançado de Tecnologias em Genômica do IQ/USP. O
número de leituras obtidas para cada um dos genomas variou de 150.000 a 500.000, as quais tiveram tamanho
médio de 400 pares de base. As montagens das sequências mostram que obtivemos cobertura de ~93% do
genoma referência (cepa 9a5c) e que estratégias adicionais são necessárias para fechamento completo destes
três novos genomas. Análises comparativas de genes relacionados com virulência e patogenicidade foram
realizadas e algumas diferenças identificadas correlacionaram-se às características fenotípicas exibidas pelas
cepas U24d, Fb7 e 3124. O sequenciamento destes genomas possibilitou a construção de árvores filogenéticas
baseadas em múltiplos lócus, as quais separam, como esperado, as cepas norte e sul-americanas em grupos
distintos e sugerem a ocorrência de maior frequência de recombinação genética entre as cepas sul-americanas.
Apoio financeiro: FAPESP, FINEP, CAPES e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
66
Desvendando a complexidade do transcriptoma:
sequenciamento de nova geração aplicado ao
extremófilo Halobacterium salinarum
Koide, T1; Vêncio, RZN2; Pan, M3; Baliga, NS3
Departamento de Bioquímica e Imunologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,
Brasil
2
Departamento de Genética – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil
3
Institute for Systems Biology, Seattle, EUA
1
Palavras-chave: transcriptoma, sequenciamento de nova geração, rnas não codificantes, bioinformática, regulação gênica
Introdução: Abordagens sistêmicas para a compreensão global da célula vêm sendo amplamente utilizadas na era
pós-genômica. A utilização de ferramentas computacionais, matemáticas e estatísticas aliadas a novas tecnologias
em Biologia permitem o desenvolvimento de modelos globais com capacidades preditivas. Usualmente, modelos
utilizando níveis globais de mRNAs e proteínas têm sido desenvolvidos. Entretanto, uma importante classe de
moléculas regulatórias que ainda não são contempladas nesses modelos globais são os RNAs não-codificantes.
Para identificar a sua influência nas redes de regulação gênica, propõe-se o estudo dessas moléculas em
Halobacterium salinarum, um extremófilo modelo em Biologia Sistêmica. Pelo menos 61 RNAs não-codificantes
foram identificados neste organismo, utilizando tiling arrays durante uma curva de crescimento. Objetivos: Neste
trabalho, iniciamos um levantamento em larga-escala dos transcritos expressos em H. salinarum utilizando novas
tecnologias de sequenciamento. A comparação com resultados dos tiling arrays deverá permitir a identificação de
novos transcritos e melhorar a resolução na determinação de suas extremidades. Metodologia: Para a construção
de bibliotecas de transcriptoma total, foi necessário o desenvolvimento de metodologia para a remoção dos
RNAs ribossomais das preparações de RNA total para H. salinarum. Duas réplicas biológicas foram utilizadas
para a construção das bibliotecas, construídas e sequenciadas conforme instruções da Illumina. Os reads foram
alinhados utilizando-se o pipeline ELAND/GERALD e a análise dos dados experimentais conduzidas utilizando
a linguagem estatística R. Resultados e conclusões: A metodologia empregada para o enriquecimento de mRNAs
foi efetiva, removendo aproximadadmente 80% dos rRNAs. Os dados de sequenciamento utilizando a plataforma
Solexa (Illumina) permitiu a identificação de novas moléculas de RNA, além de aprimorar a determinação das
extremidades dos transcritos com melhor resolução. A correlação entre as réplicas biológicas foi de R2 = 0.97 e há
alta conconrdância com os dados obtidos utilizando tiling arrays. A determinação precisa das extremidades 5’e
3’dos transcritos deverá permitir experimentos de caracterização funcional de alguns ncRNAs.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
67
Identificação molecular de bactérias endofíticas e
epifíticas isoladas de maracujá (Passiflora edulis f.
flavicarpa) com potencial de produção de sideróforos
Rodrigues, TF1; Ferreira, MTB1; Silva, ND1; Souza, AN1; Olivares, FL2; de Souza Filho, GA1
Laboratório de Biotecnologia
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro
E-mail:[email protected]
1
2
Palavras-chave: Promoção do crescimento, 16SRNA, Sequênciamento, Sideróforos, Maracujá
A agricultura tradicional, baseada no uso intensivo de fertilizantes químicos e defensivos agrícolas tem se mostrado
nociva ambientalmente, além da representar importante componente dos custos de produção. Uma alternativa
viável tanto sob o ponto de vista econômico quanto sob o prisma ambiental é a utilização da interação de bactérias,
endofíticas ou epifíticas, com plantas com a finalidade de promover crescimento vegetal. Dentre os efeitos
benéficos decorrentes de tais interações está a promoção de crescimento vegetal, potencializada pela capacidade
de tais bactérias em realizar fixação biológica de nitrogênio, solubilização de nutrientes, controle de fitopatógenos,
produção de fitohormônios e produção de sideróforos. Sideróforos são pequenos compostos quelantes de íons ferro
férrico secretados por microrganismos, potencialmente capazes de influenciar e inibir a atividade de fitopatógenos.
A seleção e caracterização das cepas mais eficientes como promotoras de crescimento é um passo fundamental no
desenvolvimento dessa importante tecnologia. O presente trabalho tem como objetivo a identificação molecular
de bactérias isoladas de maracujá capazes de produzir sideróforos. Trinta e dois isolados foram testados via
análise colorimétrica com o reagente Cromo Azurol S (CAS). O DNA das estirpes positivas foi amplificado com
primers para a região do gene 16S rRNA via PCR, e seqüenciado, através de um seqüenciador capilar ABI PRISM
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), visando a identificação molecular. Na análise da seqüência da região
16S, em comparação com seqüências depositadas no GenBank (NCBI), observou-se o agrupamento com as
espécies do gênero de Pseudomonas,Bacillus e Stenotrophomonas maltophilia. A partir destas análises foi possível a
identificação de organismos promissores para futuros testes de promoção de crescimento em plantas de maracujá.
Apoio financeiro: FINEP, FAPERJ e UENF.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
68
Clonagem e expressão de uma enzima de restrição
tipo II de Xylella fastidiosa
Virgilio, S¹; Takita, MA²
¹Universidade Federal de São Carlos – UFSCar – Campus Araras
2
Laboratório de Biotecnologia - Centro APTA Citros Sylvio Moreira - Instituto Agronômico de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: Xylella fastidiosa, enzima de restrição, metilase, clonagem, indução da expressão da proteína.
A bactéria Xylella fastidiosa tem grande importância para o agronegócio citrícola brasileiro, uma vez que é causadora
da doença clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Vive restrita aos vasos xilemáticos
da planta, causando oclusão dos mesmos devido à formação de agregados da bactéria, impedindo o transporte
de água e nutrientes para a copa das árvores. Após o sequenciamento muitos estudos funcionais estão sendo
desenvolvidos para permitirem um maior conhecimento da biologia desta bactéria e dos mecanismos associados
à sua patogenicidade, porém a transformação do isolado 9a5c de X. fastidiosa tem se mostrado complicada. Um
dos possíveis fatores responsáveis por esta observação poderia ser a proteção contra fatores exógenos, mediada
pelos sistemas de restrição-modificação (R-M). Esses sistemas enzimáticos são constituídos por endonucleases
específicas associadas à DNA metiltransferase, responsáveis pela modificação do DNA, protegendo-o da clivagem
pela endonuclease. O sistema RM do tipo II é o mais simples e mais comum, sendo a metiltransferase e endonuclease
codificadas por duas proteínas separadas de ação independente, que reconhecem o mesmo sítio no DNA. Para melhor
compreender o sistema de proteção da linhagem 9a5c foi realizada a clonagem e expressão de uma enzima de restrição
do tipo II, presente no genoma de X. fastidiosa, que, interessantemente, não aparece no isolado Temecula de Xf. Para
tanto, a enzima de restrição e metilase que compõem este sistema do tipo II foram isolados do genoma bacteriano
e clonados primeiramente em pJET1.2 sendo a metilase, sob controle de seu próprio promotor, transferida para o
vetor pACYC184. Já a enzima de restrição associada foi clonada em pBAD24 para fim de expressão em Escherichia
coli. Células competentes da linhagem DH10B e DH10B portando pACYC184/metilase foram transformadas com
a mini-preparação pBAD24/enzima de restrição, obtendo-se transformantes para ambas as bactérias. Foram feitas
induções da expressão da proteína com L-arabinose, em diferentes concentrações, e visualizadas em SDS-PAGE.
A proteína de 31 KDa, referente a enzima de restrição, foi mais expressa no tempo de 2 horas, quando comparado
ao de 1 e 4 horas, e as concentrações de 300 e 400 μg/mL de arabinose apresentaram um pequeno aumento na
indução quando comparado com a concentração de 200μg/mL. A proteína se apresenta tanto na parte solúvel,
em menor quantidade, quanto na parte insolúvel, sendo o padrão de indução o mesmo para as diferentes
construções, mas a indução sem a construção pACYC184/metilase apresentou uma expressão ligeiramente maior.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
69
Peptídeos miméticos a proteínas de Ralstonia
solanacearum selecionados por phage display
Souza, GRL1; Beltrame, RA2; Vieira, CU3; Fujimura, PT3; Goulart, LR3
Universidade Federal de Goiás, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Espírito Santo, Departamento de Produção Vegetal
3
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Murcha bacteriana, Biblioteca de peptídeos, Mimetopos, Phage display.
Este trabalho descreve uma metodologia rápida e robusta para a caracterização de antígenos de microorganismos
patogênicos, uma abordagem importante na seleção de alvos utilizados no desenvolvimento de metodologias para
o diagnóstico e controle da murcha bacteriana, doença causada pela bactéria Ralstonia solanacearum, considerada
uma das bactérias fitopatogênicas mais importantes do mundo, em virtude dos grandes prejuízos causados, de sua
ampla distribuição geográfica, da extensa gama de hospedeiros e dificuldade de controle. Para isso utilizamos uma
biblioteca de peptídeos recombinantes apresentados em bacteriófagos filamentosos, selecionada pela afinidade a
anticorpos policlonais gerados pela imunização de galinhas com uma suspensão de bactérias vivas. O objetivo foi a
seleção de peptídeos recombinantes epítopo-específicos, miméticos aos antígenos totais de superfície do patógeno.
Os fragmentos gênicos codificadores dos peptídeos recombinantes no genoma dos fagos foram seqüenciados e
as seqüências obtidas foram submetidas ao programa DNA2PRO12 (http://relic.bio.anl.gov) para a tradução da
seqüência de DNA em seqüências protéicas (peptídeos). Um total de 62 clones foi seqüenciado e as seqüências
foram alinhadas utilizando o programa MOTIF2 que identifica motivos protéicos descontínuos, mas conservados
entre a população de peptídeos analisados. Os peptídeos randômicos presentes na biblioteca permitem a
identificação de vários clones diferentes, mas com alguns aminoácidos compartilhados independente da sua
posição nos peptídeos. A alta freqüência desses aminoácidos nas referidas posições de diferentes peptídeos indica
um provável motivo apresentado nos clones selecionados. Motivos comuns em vários peptídeos sugerem uma
estrutura conservada reconhecida pelos anticorpos gerados a partir de antígenos do patógeno, evidenciando uma
similaridade linear ou estrutural entre antígenos naturais e sintéticos (mimetopos). As sequências de aminoácidos
dos peptídeos reativos aos anticorpos revelaram a predominância do peptídeo PAWLLWR e o motivo PxxLL na
maioria dos peptídeos selecionados. Várias proteínas transmembranares foram identificadas pela análise Blastp,
com as duas Leucinas centrais no peptídeo (LL) presentes na grande maioria das sequências de R. solanacearum
presentes nos bancos de dados protéicos. Com os dados gerados por esta macro análise, podemos identificar
possíveis alvos protéicos com funções anotadas e sua importância para o desenvolvimento da bactéria, norteando
assim a busca por metodologias mais eficientes para o controle ou diagnóstico do patógeno.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
70
Identificação de genes de Burkholderia sp. associados
ao antagonismo a bactérias patogênicas
Umezaki, SA1; Neves, AAC1; Araújo, WL1
LABMEM, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: endófitos, bactérias patogênicas, antibiose, compostos antimicrobianos, análise genética.
Ao longo dos anos, houve um crescente interesse a identificação de novas moléculas, as quais poderiam ser
utilizadas como alternativa para o controle de doenças infecciosas e/ou prospecção de novas moléculas de
interesse farmacêutico e industrial. Espécies do gênero Burkholderia apresentam grande potencial para a
produção de metabólitos antimicrobianos, como os policetídeos. Com base nesses estudos o presente trabalho
teve por objetivo avaliar a capacidade de Burkholderia sp., isolada de cana-de-açúcar, em inibir o crescimento
in vitro das bactérias Enterobacter aerogenes, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e do fungo leveduriforme
Candida albicans. Além disso, genes envolvidos na síntese de agentes antimicrobianos produzidos por essa
bactéria estão sendo identificados por meio da análise de mutantes obtidos por inserção aleatória do tranposon
TN5. Os resultados obtidos mostraram que o isolado 115R-B8, foi capaz de inibir o crescimento in vitro de E.
aerogenes, E. coli e S. aureus, mas não interferiu no crescimento de Candida albicans. Este isolado foi utilizado
para a geração de uma biblioteca de mutantes contendo 1300 clones. Desta biblioteca, 200 clones já foram
caracterizados quanto à perda da capacidade de inibição das bactérias E. aerogenes, E. coli e S. aureus, sendo
observado que 30% (60) destes clones apresentaram uma diminuição significativa do halo de inibição, indicando
que algum gene envolvido na inibição pode ter sido inativado pela inserção do transposon. Entretanto, para
elucidar o mecanismo de inibição, o gene destes clones com mudança no padrão de inibição juntamente com
clones que perderam a capacidade de inibir estes patógenos estão sendo clonados e identificados. Este resultado
permitirá inferir quanto ao modo de funcionamento desses genes e o papel dos mesmos na síntese e secreção
destes metabólitos, bem como interação entre diferentes produtos gênicos na determinação deste fenótipo.
Apoio Financeiro: FAPESP (Processo 08/52407-9)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
71
Expressão heteróloga do gene cry1Ac7 pela bactéria
endofítica Pantoea agglomerans 33.1 e seu potencial
no controle de Diatraea saccharalis
Tsui, S¹; Quecine, M¹; Pizzirani-Kleiner, AA¹
¹Laboratório de Genética de Microrganismos “Prof João Lúcio de Azevedo”, Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura
“Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: gene cry1Ac7, Pantoea agglomerans, expressão heteróloga, Diatraea saccharalis
Por meio da biotecnologia vários métodos alternativos vem sendo desenvolvidos visando o biocontrole dos
insetos-pragas que destroem inúmeras culturas, trazendo sérios prejuízos à agricultura. Atualmente, o uso de
organismos geneticamente modificados (OGM), tem sido freqüente para diminuir os prejuízos na agricultura.
Microrganismos podem ser modificados e funcionarem como agentes de controle biológico. Porém a metodologia
biológica representa apenas 1% do total utilizado no controle de pragas, sendo que 98% desse total correspondem
ao uso de Bacillus thurigiensis (Bt). Tal fato se explica pela faixa restrita de hospedeiro, à rápida ação dos cristais
protéicos, denominadas proteínas Cry, contra a praga alvo e à facilidade de obtenção destes cristais, tornando
economicamente viável a sua utilização. Mas algumas características limitam a sua aplicação, como a incapacidade
de controlar pragas que se alojam no interior das plantas. Assim sendo, a fim de minimizar os problemas, diversos
organismos geneticamente modificados expressando as proteínas Cry vem sendo desenvolvidos, destacando-se
os microrganismos endofíticos que colonizam o mesmo nicho do inseto-praga. Dessa forma, a bactéria endofítica
Pantoea agglomerans foi geneticamente modificada com o gene cry1Ac7, para efeitos de controle da praga de
cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis. Posteriormente, com a confirmação da inserção do gene de interesse no
cromossomo bacteriano pela técnica de Southern Blot, foram conduzidos os bioensaios de controle da praga D.
saccharalis pela linhagem 33.1: pJTT em dieta artificial. Verificando a potencialidade da bactéria no controle da
praga, foi desenvolvida uma metodologia de bioensaio, com colmos de cana-de-açúcar colonizados com linhagens:
testemunha (33.1) e mutante com gene cry1Ac7 (33.1: pJTT), os quais serviam de alimento para as lagartas. Os
resultados mostraram que a linhagem 33.1:pJTT foi capaz de aumentar a taxa de mortalidade das lagartas D.
saccharalis em dieta artificial e em colmos de cana-de-açúcar, sendo observado inclusive, um retardamento do
desenvolvimento larval até o estágio de pupa, além da diminuição do peso larval. Por re-isolamento foi observado
que a linhagem 33.1: pJTT foi capaz de sobreviver nos colmos e também provado que esta linhagem é capaz de
infectar e colonizar naturalmente as mudas de cana-de-açúcar, demonstrando assim o potencial da aplicação
da bactéria P. agglomerans (33.1) expressando a proteína Cry no controle biológico da praga D. saccharalis.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
72
Sequenciamento e comparação do genoma de uma
cepa não-virulenta de Xylella fastidiosa
Pierry, PM1; da Silva, PIP1; Santana, WO1; Beckedorff, FCF1; Amaral, MS1; Teixeira, DC2; Almeida, LGP3;
Vasconcelos, ATR3; Verjovski-Almeida, S1; da Silva, AM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo
Fundo de Defesa da Citricultura, Araraquara
3
Laboratório Nacional de Computação Científica, Petrópolis
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fitopatógeno, Clorose Variegada dos Citros, Pirossequenciamento, Genômica comparativa.
Xylella fastidiosa é uma bactéria que coloniza o xilema de diversas espécies vegetais e é transmitida às plantas
hospedeiras por insetos vetores. Após o trabalho pioneiro de sequenciamento e anotação do genoma da cepa
9a5c de X. fastidiosa, a qual foi isolada de laranjeira e posteriormente comprovada como agente causal da Clorose
Variegada do Citros (CVC), genomas de outras cinco cepas isoladas de plantas na América do Norte foram
também sequenciados. Todas estas cepas exibem fenótipo virulento tanto em seus hospedeiros naturais como em
hospedeiros utilizados como modelos de infecção. A partir da análise do repertório de genes codificados no genoma
de X. fastidiosa, múltiplos mecanismos de patogenicidade e determinantes de virulência foram sugeridos, alguns
destes já experimentalmente testados. Por outro lado, as características genômicas de cepas de X. fastidiosa não
virulentas têm sido pouco estudadas. Em trabalho anteriormente realizado em nosso grupo, foram identificadas,
utilizando-se hibridização de microarranjos de DNA, diferenças significativas na composição gênica da cepa
virulenta 9a5c e da cepa J1a12, a qual exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco. Entre as diferenças
estão a ausência ou alta divergência de 14 sequências codificadoras no genoma de J1a12, as quais podem estar
correlacionadas com seu fenótipo menos virulento, o qual foi confirmado em ensaios de infecção em Nicotiana
clevelandii. Neste trabalho tivemos como objetivo sequenciar o genoma da cepa J1a12, visando aprofundar sua
comparação com genomas de cepas virulentas, em particular, cepas associadas à CVC. Utilizamos a metodologia
de pirossequenciamento de DNA implantada no Centro Avançado de Tecnologias em Genômica do IQ/USP. Foram
obtidas 290.000 leituras as quais tiveram tamanho médio de 380 pares de base. As montagens das sequências
mostram cobertura de ~93% do genoma referência (cepa 9a5c) e que estratégias adicionais são necessárias para
fechamento completo do genoma da J1a12. Os resultados que obtivemos confirmam as diferenças anteriormente
observadas entre os genomas destas duas cepas, as quais foram apontadas pela técnica de microarranjos de
DNA. O sequenciamento possibilitou também a identificação de diferenças adicionais entre os genomas de J1a12
e 9a5c, incluindo sequências que aparentemente são exclusivas de J1a12. Entre estas diferenças destacamos a
presença de um plasmídeo adicional de 27.258 pb ainda não descrito em outros isolados de citros, o qual apresenta
extensa identidade com o plasmídeo descrito recentemente em cepas de X. fastidiosa isoladas de amoreiras.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP, FAPESP e USP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
73
DNA microarray analyses of Xylella fastidiosa strains
isolated from coffee plants
Barbosa, D; Santos, DS; Alencar, VC; Santana, CAO; Nunes, LR; Costa de Oliveira, RL
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Brazil
Corresponding authors: [email protected]; [email protected]
Keywords: Xylella fastidiosa, DNA microarray, structural genomics, coffee plants, pathogenicity
Xylella fastidiosa (Xf) is a Gram-negative bacillus which develops into xylem vessels of wide range of hosts and its
different strains are causative agents of economically relevant diseases like Pierce’s disease (PD) in grapevines,
citrus variegated chlorosis (CVC), coffee leaf scorch (CLS) and plum leaf scald. Our group has compared different
Xf strains and has found a consistent pattern with the modern theories about the prokaryotes evolution which
propose that bacterial genomes are divided in a core gene pool and a flexible gene pool, this latter mostly
composed by horizontal transferred genes. Considering CVC and CLS are responsible for significant economical
losses in Brazil, a great interest has raised about the existence of a possible pathosystem. We compared Xf
isolates from coffee trees to the typical CVC strain 9a5c, through competitive hybridization experiments aiming
to identify structural similarities, absent genes or high number copy genes, including pathogenicity related
factors. Even though the genomic structure of Xf from coffee plants and their phylogenetic relationship with Xf
strains from citrus plants are partially elucidated, just a little is known about the cross infection mechanisms
and its possibility to occur. Results obtained from our experiments suggest that the great genetic similarity
between the coffee and 9a5c Xf strain is due to recombination events. In addition, one Xf isolate from coffee has
similar genes to those found in pXF51, a megaplasmid of Xf 9a5c strain, which may corroborate the hypothesis
of intense gene flow. Currently, our efforts include sequencing and implementing computational platforms
to identify exclusive pathogenicity related genes in CLS isolates representative of host specificity mechanisms.
Finantial support: FAEP, FAPESP.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
74
Presence of plasmid in Enterobacteriaceae isolated
from toothbrushes
Curcio, JS¹; Melo, WA¹; Araújo, RB²; Bataus, LAM²; Carneiro, LC²
¹Universidade Estadual de Goiás (UEG)
²Instituto de Ciências Biológicas – Laboratório de Biologia Molecular - Universidade Federal de Goiás (UFG)
Keywords: plasmid, antibiotics, Escherichia colli, Salmonella spp and enterobacterial
The enterobacteriaceae family is represented by Gram-negative rods bacterial, representatives of these genera are
Escherichia colli and Salmonella spp. The toothbrush is the instrument most commonly used to oral hygiene for
biofilm control, however it can be a source of contamination intre and interindividual. This research examines the
packaging of enterobacterial on toothbrushes in Drª. Gertrude Lutz Morrinhos-GO basic education. The brushes
were placed in three differents forms, being 1/3 in door on Cardboard, 1/3 in the door plastic broach and 1/3 on the
door brush cardboard with pulverization of sodium hypochlorite 1%, where the samples were collected and stored
in a test tube containing peptone water. After toothbrushes microbiological characterization by culture means,
Gram stain, was observed, the external morphology of the bacteria, antibiotic resistance, the action of sodium
hypochlorite, verification of plasmid presence and analysis of knowledge on the subject oral hygiene. The results
showed with 72.5% of interviewed reported visiting the dentist every six months, 10% annually and 12.0% said they
would go to the dentist only when they feel pain. During verification of resistance to 10 mcg ampicillin antibiotics and
30 mcg ceftriaxone antibiotics, were observed with all samples were resistant to two drugs. Among the three types
of packing the brushes, brush the cardboard door open was the one with the largest number of countless colonies,
making a total of thirteen samples. The plastic door brush showed the largest number of colonies of Salmonella and
Escherichia colli being seven and eight totally samples respectively. The X² test to analyze the contamination degree
in different packaging relief that only the door brush Cardboard and plastic spray with sodium hypochlorite 1%;
showed no difference in the pollution degree (X ² = 0> P 0.05). The door brush, which was less effective against bacterial
contamination was the cardboard open (86.6%), however the door plastic brush (33.4%) and cardboard with a spray
hypochlorite (33.4%) had equal proportions, both of which could be used as alternatives to reduce the contamination.
Financial support: UEG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
75
Uso de marcadores ARDRA (Amplified Ribosomal DNA
Restriction Analysis) para análise de polimorfismo
genético de espécies do gênero Candida
Alves, MB¹; Santos, MCL¹; Barbosa, LV¹; Vale, INF¹; Junior, AD²; Terças, ALG²; Andrade-Monteiro, C¹
¹Laboratório de Biologia Geral; Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Maranhão
²Laboratório de Micologia; Centro Universitário do Maranhão
[email protected]
Palavras-chave: Candida, ARDRA, rDNA, infecção hospitalar, polimorfismo
Nas últimas décadas as infecções fúngicas tornaram-se importantes causas de infecções hospitalares, principalmente
em pacientes imunocomprometidos e assim compreendem, atualmente, um grave problema médico-social, e
a sua prevenção e controle representam um desafio. As espécies do gênero Candida têm sido os agentes mais
freqüentemente isolados e correspondem cerca de 80% das infecções fúngicas de origem hospitalar. O uso de rDNA
para identificação de espécies microbianas é altamente sensível devido ao fato do gene que codifica rDNA estar
presente em múltiplas cópias (50 a 100 cópias) no genoma de Candida spp., quando comparado a outros ensaios
de PCR que utilizam genes presentes como única cópia. Além disso, entre as subunidades altamente conservadas
do rDNA estão presentes as regiões espaçadoras internas que contêm sequencias únicas para cada espécie de
Candida. Objetivou-se a identificação de espécies diferentes de leveduras do gênero Candida, provenientes de
amostras hospitalares e isoladas de diferentes sítios anatômicos, por meio da amplificação por PCR de uma região
genômica englobando o rDNA e subsequente análise dos fragmentos de restrição do produto da PCR gerados pela
clivagem com DdeI (ARDRA). Os Isolados clínicos provenientes de sítios anatômicos diferentes foram cultivados
em meio RPMI por 24 horas a 37ºC, centrifugados e o “pellet” recuperado ressuspendido em 600 microlitros de
tampão de lise contendo SDS como detergente biológico. Após maceração, as amostras são incubadas à 65oC
por 10 minutos e posteriormente extraídas uma vez com clorofórmio-alcool isoamílico (24:1). O sobrenadante foi
precipitado com etanol absoluto gelado por quatro horas em “freezer”. O DNA genômico precipitado foi lavado
com etanol 70% e ressuspendido em 40 microlitros de água pura. A quantificação do DNA obtido foi feita pelo
método visual em gel de agarose corado com brometo de etídio. Uma alíquota com 10 nanogramas de DNA foi
utilizada para as reações de amplificação por PCR. A sequência de oligonucleotídeos utilizada como iniciadores
nas reações de amplificação anelam a porção inicial do gene rDNA 5S (iniciador “foward”) e à porção inicial
do gene rDNA 28S (iniciador “reverse”). A análise por ARDRA mostrou polimorfismos únicos para as espécies
diferentes de leveduras. Os resultados evidenciam a não reprodutibilidade por meio da técnica molecular ARDRA
dos dados previamente obtidos da identificação das espécies de Candida por métodos fenotípicos. Isto corrobora
a importância da execução da técnica molecular para um diagnóstico mais confiável, rápido e preciso de agentes
de infecções fúngicas. As análises dos dados moleculares foram compatíveis com os mapas de restrição deduzidos
pela análise in silico das sequencias de bases da região amplificada anteriormente por PCR o que demonstra a
fidedignidade da técnica. Conclui-se que o método PCR-RFLP pode ser uma abordagem molecular rápida e eficaz
no diagnóstico de espécies de Candida.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
76
Utilização de linhagens de Lactococcus lactis invasivas
como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais,
codificando o antígeno Ag85A de Mycobacterium
tuberculosis, em linhagens celulares epiteliais
humanas
Mancha-Agresti, P1; Pfeiffer, VN; Saraiva, TDL1; Zurita-Turk, M1; Pereira, VB1; Azevedo, V1; Miyoshi, A1.
Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: Vacina de DNA, pValac, Ag85A, Lactococcus lactis, Mycobacterium tuberculosis.
Introdução: A utilização de bactérias como veículo para a entrega de plasmídeos vacinais pela via oral fornece uma
estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para cumprir com este objetivo, bactérias
patogênicas atenuadas como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, apesar de apresentarem risco de
reversão ao seu fenótipo selvagem, o que limita seu uso em humanos. Lactococcus lactis é uma Bactéria Láctica
modelo considerada GRAS (Generally Recognized As Safe) que vem sendo vastamente utilizada para a produção e
entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Diante disso, L. lactis representa uma opção atrativa para a
entrega de plasmídeos vacinais em relação à patógenos atenuados. Assim, foram desenvolvidas linhagens invasivas
de L. lactis (FnBPA+) e um plasmídeo de expressão eucariótica foi arquitetado (pValac; Vaccination using Lactic
acid bacteria). Desta forma, a utilização de linhagens invasivas de L. lactis para a entrega do pValac expressando
o antígeno Ag85A (FnBPA) de Mycobacterium tuberculosis, poderia representar uma nova e promissora estratégia
para o controle da tuberculose, doença infecto-contagiosa que atinge 1/3 da população mundial na forma
latente. Objetivos: Utilização de linhagens de L. lactis invasivas (FnBPA+) como veículos para a entrega de pValac,
codificando o antígeno Ag85A de M. tuberculosis, em células de mamíferos. Métodos: A seqüência codificadora
de Ag85A será amplificada por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis linhagem H37Rv para clonagem
no vetor Zero Blunt® TOPO® e em seguida no vetor pValac. A construção final, pValac:Ag85A, será inicialmente
obtida em E. coli TG1 e posteriormente transferida para L. lactis FnBPA+ através de eletroporação. Para avaliar
a produção de Ag85A, células da linhagem Caco-2 serão transfectadas com o plasmídeos pValac:Ag85A e a
capacidade invasora da linhagem L. lactis FnBPA+(pValac:Ag85A) serão também verificadas nesta linhagem celular.
Resultados parciais: A ORF Ag85A foi amplificada por PCR, com aproximadamente 1017pb, clonada no vetor Zero
Blunt® TOPO® em E. coli TOP10. PCR, digestão enzimática e seqüenciamento (ABI3130) confirmam a primeira
clonagem. Feito isto a ORF Ag85A foi clonada no pValac e o mesmo foi transformado em E. coli TG1. Conclusões:
Este projeto estabelece um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas
baseadas em Bactérias Lácticas geneticamente modificadas, por via de administração em mucosas; o que também
poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
77
Análise e descrição de bactérias isoladas da
biodiversidade do cerrado de interesse biotecnologico
Passini, MRZ¹; Sá, FVJ¹; Jorge, MB;¹ Guerra, OG¹
¹Laboratório de Biologia Molecular e de Microrganismo/Biotecnologia, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul
[email protected]
Palavras-chave: isolamento, solo, linhagens de bactérias, amilase e biotecnologia
A biotecnologia buscando sempre facilidade operacional e diminuir gastos na fabricação de produtos vem
aumentando o número de processos industriais que utilizam microrganismos. A aplicação desses ocorrem,
por exemplo, nas indústrias têxteis, papel e celulose, bebidas destiladas, panificação, farmacêutica, médica e
químico-analítica. O Cerrado por ser um enorme bioma contém muitas espécies desses seres microscópicos,
sendo que ainda grande parte é desconhecida, dessa forma é fundamental que seja realizado estudos nessa
região objetivando melhorias nas atividades industriais. O presente trabalho teve o objetivo de isolar e descrever
linhagens de bactérias produtoras de amilase da biodiversidade do solo do Cerrado, no intuito de contribuir
com a obtenção de novas amostras com potencial industrial. Para o isolamento das linhagens de bactérias com
atividade amilolítica, coletei em quinze pontos diferentes amostras de solo no município de Três Lagoas / MS.
As amostras foram cultivadas em meio M9 acrescido de 0,5% de amido. Após o aumento em meio liquido elas
foram plaqueadas em meio M9 sólido que difere do liquido apenas por adicionar 2% de Ágar. Posteriormente
ao seu crescimento nas placas elas foram classificadas morfologicamente através de coloração de Gram. Todas
as amostras apresentaram colônias com atividade enzimática capaz de expressar e excretar in vitro a amilase.
A degradação do amido foi eficiente nas quinze amostras, demonstrando que as linhagens de bactéria da
biodiversidade do solo do Cerrado metabolizaram de forma eficiente o amido. Após a visualização das linhagens
que degradaram o amido, foi realizada coloração de Gram em cada uma das colônias e em seguida observadas
em microscópio óptico comum. Através desta análise verificou-se que das colônias bactérias isoladas a maioria
foi de Cocos gram positivo 40%, Bacilos gram positivo 31%, Cocos gram negativo 18% e Bacilos gram negativo
11%. Neste estudo possibilitou concluir que existem linhagens de bactérias na biodiversidade do Cerrado que
produzem algum tipo de enzima amilolítica e que puderam ser expressas e excretadas in vitro. Todas as amostras
foram hábeis na produção de amilase e entre as colônias as mais encontradas foram de Cocos gram positivo.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
78
Diversidade bacteriana associada às armadilhas da
planta carnívora Utricularia breviscapa
Lima, FR1; Silva, CB1; Ferreira, AJ1; Caravieri, FA1; Araújo, WL1.
Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana – Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes.
[email protected]
1
Palavras-chave: Utricularia, planta carnívora, diversidade bacteriana, ecologia microbiana
Apesar da alta complexidade dos vegetais superiores é necessário que estes estabeleçam uma relação com
outros organismos, como bactérias e fungos. Os microrganismos podem atuar tanto como benéficos quanto
maléficos para as plantas. Alguns deles, conhecidos como endófitos, habitam o interior da planta sem causar,
aparentemente, qualquer dano ao seu hospedeiro. A relação endófito-planta é geralmente mutualística, onde a
planta hospedeira atua como protetora e também como fonte de nutrientes, enquanto o endófito pode produzir
compostos químicos que atuam como agentes controladores de microrganismos patogênicos e de insetos
pragas, promovendo crescimento, auxiliando na nutrição, melhorando aproveitamento hídrico e conferindo
maior resistência à planta. Plantas carnívoras apresentam diferentes adaptações morfológicas para capturar
e digerir a presa, sendo que esta última pode ser auxiliada pela secreção de enzimas de bactérias e fungos
presentes na planta hospedeira. A espécie Utricularia breviscapa pertence à família Lentibulariaceae, a qual
é composta por três gêneros de plantas carnívoras. O gênero Utricularia apresenta uma estrutura denominada
utrículo, armadilha altamente especializada capaz de capturar sua presa através de sucção por meio de pressão
hidrostática interna negativa. A espécie Utricularia breviscapa é uma planta aquática suspensa que possui
estruturas preenchidas com parênquima aerífero, o que lhe permite flutuar. Dessa forma, o objetivo deste trabalho
foi caracterizar e avaliar a diversidade bacteriana associada à planta carnívora Utricularia breviscapa. Para
alcançar estes objetivos, a coleta do material vegetal foi realizada no município de Santo Antônio de Leverger,
Estado do Mato Grosso. As bactérias associadas aos utrículos e aos estolões foram isoladas e identificadas por
meio de seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA. Foi observado que a densidade bacteriana nos utrículos foi
de 5,6117 UFC/unidade, e em estolões de 7,3216 UFC/gramas de tecido. A análise molecular indicou a ocorrência
de 21 gêneros de bactérias, entre eles Sphingomonas (42,07%), Aquitalea(14,49%) e Bacillus (7,24%). Análises
fisiológicas serão realizadas, para uma melhor caracterização dessa comunidade e o papel na planta hospedeira.
Apoio Financeiro: FAPESP (Proc. 07/58277-7)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
79
Estudo da arquitetura genômica de duas linhagens do
patógeno Corynebacterium pseudotuberculosis e seu
estilo de vida
Pinto, AC1; D’Afonseca, V1; Santos, AR1; Almeida, SS1; Soares, SC1; Faria, CJ1; Magalhães, A1; Ruiz, JC2;
Miyoshi, A1; Azevedo, V1
Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Laboratório de Parasitologia, Centro de Pesquisas René Rachou
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, arquitetura genômica, linfadenite caseosa, sintenia gênica, in silico
Corynebacterium pseudotuberculosis é um patógeno Gram-positivo, intracelular facultativo, agente etiológico
causador da Linfadenite Caseosa (LC). Esta enfermidade acomete principalmente caprinos e ovinos sendo de
grande importância econômica mundial devido às perdas anuais causadas. Por essa razão, diversos estudos
sobre as bases moleculares ligadas à patologia desenvolvida por C. pseudotuberculosis tem sido realizados. No
intuito de aumentar o conhecimento genômico, acerca de C. pseudotuberculosis, foi sequenciado o genoma de
duas linhagens de C. pseudotuberculosis (Cp1002 – isolada de caprino e CpC231 – isolada de ovino), tendo como
objetivo caracterizar diferenças e semelhanças na arquitetura genômica da espécie, que reflitam o estilo de vida do
patógeno e forneça conhecimento acerca da patologia por ele causado. Para tal foi utilizado o programa Artemis,
que permitiu a visualização total da estrutura do genoma. Para as análises comparativas de plasticidade genômica,
rearranjos, inversões, entre outros eventos, foram utilizados os programas Mauve, ACT, Artemis e BLAST- NCBI.
Como resultados foram caracterizados os dois genomas das linhagens C. pseudotuberculosis 1002 e C231, os
quais compartilharam diversas características em sua composição: conteúdo G+C de ambas apresentou cerca
de 50%; 85% do genoma é codificante; o tamanho médio dos genes foi de 929 pb (Cp1002) e 949 pb (CpC231).
Contudo, houve diferenças entre as linhagens: CpC231 apresentou 2105 genes e dentre eles, 66 são pseudogenes.
Já em Cp1002 foram preditos 2098 genes sendo que 53 são pseudogenes. Tratando-se de plasticidade genômica,
os genomas mostraram alta conservação sintênica entre si com poucos pontos da perda de sintenia. Além disso,
C. pseudotuberculosis também possui conservação sintênica com C. diphtheriae e C. jeikeium, ambos patógenos
humanos, reforçando dados da literatura que indicam a conservação da composição genômica e ordem gênica
dentro do gênero. Com relação à arquitetura genômica, este estudo indicou que C. pseudotuberculosis tem
um dos menores genomas do gênero (2,2Mb), com o menor conteúdo GC, menor número de exemplares de
tRNAs (cerca de 50 em cada linhagem), com a presença de apenas um operon de rRNA, elevada perda gênica
em relação à espécies não-patogênicas, baixo número de proteínas vinculadas ao metabolismo secundário e
elevado número de pseudogenes. Todas essas características da composição do seu genoma reforçam seu estilo
de vida como parasita intracelular facultativo, com evidências genômicas de eventos evolutivos tendenciando a
um genoma mínimo, principalmente devido ao fato do elevado número de pseudogenes. Todas as informações
geradas no presente trabalho nos auxiliam na compreensão de como o genoma de C. pseudotuberculosis tem
sido modulado ao longo do tempo, para que o patógeno possa desencadear a LC. Esse conhecimento pode
ajudar na descoberta de potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias mais efetivas no controle da LC.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
80
Influência do genótipo e fase fenológica de cana-deaçúcar sobre bactérias endofíticas produtoras de ácido
indol acético
Ramos, APS1,2; Farias, ARB1; Barbosa, MV1; Barros, MCS1; Costa, DP1; Lira-Cadete, L1; Silva, MO2; Freire,
FJ2; Andreote, FD3; Kuklinsky-Sobral, J1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
3
Departamento de Ciência do Solo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: auxinas, gene 16S rRNA, interação bactéria-planta, promoção de crescimento vegetal.
A produção de cana-de-açúcar tem sido destaque no país, não só pela demanda internacional da produção
como também pela utilização de seus subprodutos como uma nova forma de desenvolvimento sustentável. Para
aumentar a produtividade dos canaviais e suprir esta demanda, é necessário o emprego de novas tecnologias que
tragam este incremento, sem prejudicar o meio ambiente. Bactérias endofiticas produzem o ácido indol acético
(AIA), que é um hormônio utilizado pelas plantas pertencente ao grupo das auxinas, responsável pela divisão
celular, induzindo ao alongamento celular, e também é produzido pelos vegetais. Bactérias endofíticas de raiz
produtoras AIA podem contribuir diretamente com o aumento do sistema radicular, tanto em tamanho quanto
em quantidade, beneficiando a planta, pois um sistema radicular mais desenvolvido implica em aumento da
absorção de água e nutrientes. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e selecionar bactérias endofíticas
de raiz de plantas de cana-de-açúcar, cultivadas em Pernambuco, com capacidade de produzir AIA. Para as
análises, foram utilizadas 84 linhagens de bactérias endofíticas isoladas de raízes de plantas de cana-de-açúcar
das variedades RB92579, RB867515 e RB863129, aos 4 e 10 meses após o plantio. A análise foi realizada por meio
de um método colorimétrico (reagente de Salkowski) que caracteriza a produção de AIA. A identificação das
linhagens bacterianas foi realizada por meio do seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA. Foi observado que 69%
das linhagens avaliadas apresentaram capacidade de produzir AIA. A produção deste fitohormônio foi observada
por meio da intensidade da coloração apresentada, que variou do róseo ao rosa escuro, onde quanto mais escura
a coloração, maior a concentração de AIA, quando comparada ao controle. Em relação à fase fenológica da planta
hospedeira, aos quatro meses, as linhagens obtidas da variedade RB863129 foram as que apresentaram maior
freqüência de produtoras de AIA (84,2%), enquanto que as linhagens obtidas das outras variedades apresentaram
menor freqüência, 66,7% para a variedade RB92579 e 64,3% para a variedade RB867515. Para as bactérias isoladas
de plantas com dez meses de desenvolvimento, foi observada uma inversão, pois as linhagens obtidas da variedade
RB863129 apresentaram a menor freqüência de produtoras de AIA, com apenas 28,6%, enquanto que as linhagens
obtidas da variedade RB867515 apresentaram 78,6% de produtoras de AIA e as da variedade RB92579 se manteve
semelhante ao resultado anterior, com 62,5%. A identificação das bactérias apresentou linhagens agrupadas
com o gênero Burkholderia, Enterobacter, Pantoea e Pseudomonas. Portanto, o presente trabalho mostrou
que as bactérias endofíticas obtidas de raízes de variedades de cana-de-açúcar, cultivadas em Pernambuco,
apresentaram alta freqüência de linhagens produtoras de AIA, tendo influência do genótipo vegetal e da fase
fenológica da planta hospedeira, podendo ser exploradas em programas de desenvolvimento de inoculantes.
Agências de Fomento: CNPq e FACEPE.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
81
Caracterização da diversidade molecular de
cianobactérias do rio Pará na região de Abaetetuba e
Barcarena – Pará, Amazônia, Brasil
Souza, RS¹; Alves, FAS¹; Santos, ECO; Jesus, IM¹; Sá, LLC¹
¹Laboratório de Microbiologia Ambiental, Seção de Meio Ambiente, Instituto Evandro Chagas (IEC)
[email protected]
Palavras-chave: Cianobactérias, rRNA 16S, CYA, Diversidade Molecular,Metagenômica.
As cianobactérias são o elemento dominante da fitoplâncton em ambientes de água doce e marinhos muitas
podem formar florações. A atenção é geralmente maior para as espécies que formam colônias e possuem vesículas
de gás que as tornam flutuante e, portanto, acumulam na superfície. Estas espécies podem fixar N2 e ser tóxicas e
podem causar graves problemas ambientais e socioeconômicos. Este estudo visa à caracterização da diversidade
molecular de cianobactérias do rio Pará localizado no município de Abaetetuba e Barcarena (PA) utilizando técnicas
moleculares. As amostras foram coletadas no Rio Pará em uma grande área portuária entre os dois municípios.
As amostras foram coletadas nos pontos:P3 (Abaetetuba); P7 (entre os municípios de Abaetetuba e Barcarena) e
P13 (Barcarena), de todos os pontos foram coletadas amostras de marés enchentes e vazantes. As amostras foram
coletadas com arrastos na sub-superfície da água com auxílio de redes de plâncton, com abertura de malha de 20,
64, 120 µm. As amostras foram alíquotadas em tubos falcon de 50 ml, congeladas em freezer -70º C e posteriormente
liofilizadas. Em seguida foi extraído DNA metagenômico do material liofilizado com o kit – Wizard Genomic DNA
Purification Kit (Promega), seguindo-se as recomendações dos fabricantes. A integridade e qualidade do DNA
metagenômico extraído foi analisada em espectrofotômetro (NANODROP® ND-2000), e em gel de agarose. O
material foi amplificado por PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos para genes que codificam rRNA 16S
e uma região específica para cianobactérias (CYA). A re-amplificação do produto de PCR (Nested-PCR) foi feita com
primers específicos para cianobactérias (CYA 106F, CYA359F e CYA 781R) de aproximadamente 700pb do gene para
rRNA 16S. Após a re-amplificação, foi realizada a clonagem dos amplicons, utilizando-se o Kit de clonagem “pGEM®-T
EasyVector Systems”( Promega). A pureza do DNA foi calculada usando um espectrofotômetro (NANODROP® ND2000) através da relação A 260 /A280 mostrando contaminantes de proteínas (relação, 1,8). A qualidade do DNA com
um elevado grau de pureza foi observado em todas as amostras ambientais. Os amplicons resultantes foram de
aproximadamente 1600pb para o gene que codifica rRNA 16S e de 400pb a 600pb para CYA, conforme o esperado.
Até o presente momento foi construída uma biblioteca contendo 20 clones que serão seqüenciados para se analisar
a diversidade genética de cianobactérias da região. Conclusões: Os primer CYA mostram-se ser específico para
cianobactérias. O método molecular para a identificação de cianobactérias é essencial para a rápida e precisa
análise dos membros de uma população e para a elucidação da diversidade molecular de cianobactérias. Após
o seqüenciamento destes clones e comparação com trabalhos de caracterização morfológica de cianobactérias
realizado em nosso laboratório teremos a real clareza da diversidade de cianobactérias na região em estudo.
Apoio Financeiro: PIBIC/ IEC/ CNPq, TAC IRCC/MPE-PA/FIDESA/IEC e Recursos Próprios Instituto Evandro
Chagas
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
82
Detecção e diagnóstico do Mycoplasma Haemofelis e
Candidatus Mycoplasma Haemominutum através da
técnica da pcr em gatos do município de Lages, SC,
Brasil
Paludo, E1; Gonçalves, DS2; Jark, PC2; Saito, ME2; Lima-Rosa, CAV1
Laboratório de Análises Genéticas – DNA/UDESC, Departamento de Produção Animal e Alimentos, Centro de Ciências Agrárias,UDESC,
Lages, SC
2
Laboratório de Patologia Clínica, Hospital de Clínica Veterinária “Professor Lauro Ribas Zimmer”, Departamento de Medicina Veterinária,
Centro de Ciências Agrárias, UDESC, Lages, SC
[email protected]
1
Palavras-chave: Gatos; Mycoplasma spp; Mycoplasma haemofelis; Candidatus Mycoplasma haemominutum; Diagnóstico
Através da técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), foi avaliada a prevalência de Micoplasmose em
gatos na cidade de Lages, SC, Brasil. Também foi comparada a eficácia do diagnóstico pela PCR com o diagnóstico
por meio de análise em esfregaço sanguíneo (diagnóstico convencional), e se a presença de sinais clínicos da
doença (dentre eles, a anemia, presente em 16 animais da amostra) ocorre em todos os animais contaminados.
Foi utilizado como amostra o sangue, e o DNA, de 155 gatos. Esta é composta de animais da rotina clínica do
Hospital de Clínica Veterinária da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC) (animais hospitalizados) e
de coletas feitas a campo (animais sadios). O diagnóstico por meio da análise de esfregaço sanguíneo foi realizado
no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital de Clínica Veterinária, e foi positivo para duas amostras (3,5%)
das 155 amostras analisadas. O diagnóstico pela PCR foi realizado no Laboratório de Análise Genética da UDESC.
Utilizou-se para este diagnóstico a amplificação de um segmento do gene 16S do RNA ribossomal que detecta a
presença de Mycoplasma spp. Cinqüenta e sete gatos (36,7%) formam positivos para a presença de Mycoplasma
spp. Para diferenciar Mycoplasma haemofelis de Candidatus Mycoplasma haemominutum, foram utilizadas as
enzimas de restrição HaeIII e EcoRI nos produtos da PCR. Somente o amplificado do Mycoplasma haemofelis é
clivado com a enzima HaeIII, em dois sítios, e somente o amplificado do Candidatus Mycoplasma haemominutum é
clivado pela enzima EcoRI, em um sítio. Desta forma, obteve-se um resultado de 20 animais diagnosticados apenas
com Mycoplasma haemofelis, 32 animais contaminados apenas com Candidatus Mycoplasma haemominutum
e cinco animais infectados com ambos os micoplasmas. Entre os animais anêmicos, apenas seis (37,5%)
apresentaram diagnóstico positivo. Assim, a técnica da PCR se mostrou bem mais eficaz para o diagnóstico de
Micoplasmose do que a técnica convencional, e a presença de anemia não foi determinante para o diagnóstico
positivo da doença, sendo necessário exame complementar para o diagnóstico, devido à baixa sensibilidade da
pesquisa dos hemoparasitas no esfregaço sanguíneo e a alta prevalência de animais não anêmicos infectados.
Apoio financeiro: CNPq/PRONEX; FAPESC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
83
Modulação da expressão gênica na resistência a
compostos antimicrobianos e formação de células
persistentes em biofilme de Xylella fastidiosa
Olivato, JC1; Muranaka, LS1,2; Takita, MA1; Machado, MA1; De Souza, AA1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC; 2Universidade Estadual de Campinas-Unicamp
[email protected]
1
Palavras-chave: microarranjo de DNA, móduloTA, Morte Celular Programada.
Xylella fastidiosa (Xf) é o agente causal da clorose variegada dos citros. Seu mecanismo de patogenicidade consiste
na colonização do xilema pela formação de biofilme, cuja estrutura apresenta maior resistência a compostos
antimicrobianos. Recentemente foi verificado, através de microarranjos, que um grande número de genes
envolvidos com resistência a multidrogas (MDR) é induzido em Xf em biofilme. Além disso, foi observado RNA
de qualidade em experimentos utilizando doses inibitórias de antibiótico em biofilme de Xf, além de pequena
atividade metabólica, sugerindo células vivas no biofilme após adição destes compostos. Isto sugere a ocorrência
de células persistentes, que são células dormentes com um baixo nível de tradução e tolerância a multidrogas
(MDT). Em Escherichia coli, a expressão de genes das células persistentes foi associada ao módulo toxina-antitoxina
(TA), e a genes que codificam proteínas que inibem funções celulares como tradução, conduzindo à MDT. O
módulo TA consiste em dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina instável que interfere na
ação da toxina. Ele também está associado à morte celular programada em bactérias (PCD), que são mecanismos
genéticos ativados para eliminar células em excesso ou com dano para preservar outras células da população. O
objetivo deste trabalho foi identificar genes associados à MDT e às possíveis células persistentes no biofilme de
Xf em condições inibitórias de cobre e tetraciclina. Métodos: Células de Xf em biofilme maduro foram cultivadas e
adicionadas doses inibitórias de cobre e tetraciclina. Foi feita extração de RNA das amostras para análise de genes
diferencialmente expressos por microarray (NimbleGen). Após analisar a expressão dos genes, foram selecionados
aproximadamente 10 deles para avaliação por RT-qPCR. Com a adição de 7 mM de cobre, 868 (30,57%) genes foram
diferencialmente expressos. Destes, 407 (14,33%) foram reprimidos, sendo grande parte relacionados a fimbrias do
tipo IV, síntese protéica e energética, e 461 (16,24%) foram induzidos, com destaque a genes associados a reguladores
transcricionais, fagos, detoxificação de cobre, patogenicidade, virulência e adaptação e 2 genes relacionados ao
módulo TA. Com adição de 800 µg/ml de tetracilcina 160 (5,65%) genes foram diferencialmente expressos. Destes,
114 (4,02%) foram reprimidos como genes relacionados fimbrias do tipo IV e síntese protéica. Um total de 46 genes
(1,62%) foi induzido, como os envolvidos no transporte ABC, efluxo de multidrogas e um relacionado ao módulo
TA. A expressão de alguns destes genes foi também confirmada por RT-qPCR. A resistência do biofilme de Xf
submetido à concentração inibitória de cobre e tetraciclina pode ocorrer pela ativação de transporte de efluxo de
drogas, diminuição da motilidade celular e síntese protéica. A repressão de genes relacionados ao metabolismo e
tradução sugere a ocorrência de PCD em XF que é suportada pela ocorrência de indução de diferentes módulos TA.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
84
Obtenção de mutantes e estudo da regulação das
ferritinas de Caulobacter crescentus
Rodrigues, MM; da Silva Neto, JF; Marques, MV
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Metabolismo de ferro, Ferritinas, RNA regulatório, Caulobacter crescentus.
Ferro é um micronutriente essencial aos organismos vivos, e as bactérias utilizam várias estratégias para a
administração dos níveis deste metal. Dentre estas, utilizam proteínas intracelulares de estocagem de ferro
( ferritinas) que permitem acesso ao metal quando este está em baixa quantidade. O controle de consumo de ferro
é feito regulando-se a expressão destas ferritinas. Em muitas bactérias essa regulação do metabolismo de ferro é
mediada pela proteína Fur em associação a ferro, agindo diretamente, ou indiretamente por meio de um pequeno
RNA (sRNA). Este trabalho tem por objetivo o estudo de duas ferritinas e seus mecanismos regulatórios, incluindo
a identificação em C. crescentus de um sRNA relacionado ao metabolismo de ferro. Foram deletadas as regiões
codificantes das duas ferritinas (bfr e dps, separadamente) e feita a construção do mutante duplo para esses genes,
por meio da dupla recombinação homóloga. Também foi realizada uma análise da expressão dos genes das ferritinas
e do sRNA em resposta à homeostase de ferro e ao estresse oxidativo, através da clonagem das regiões regulatórias
dos genes à frente de um gene repórter de transcrição lacZ, seguidos de ensaios de atividade de β-galactosidase.
Os ensaios de β-galactosidase mostraram aumento de expressão de bfr em excesso de ferro, e que este gene é
positivamente regulado por Fur; a expressão de dps teve aumento em carência de ferro; o promotor do pequeno RNA
apresentou indução em carência de ferro, e possui desrepressão da regulação no mutante Fur. Os resultados obtidos
nos ensaios de atividades dos promotores dos genes foram condizentes com o esperado, atuando Fur positivamente
como ativador de bfr, e negativamente como repressor do sRNA. A continuidade dos experimentos, com ensaios
de expressão dos genes das ferritinas nos mutantes do sRNA e fur, permitirá definir a rede regulatória destes genes.
Também serão analisados os fenótipos dos mutantes e avaliado o papel de cada ferritina no acúmulo de ferro. Assim,
esses dados ajudarão a melhor caracterizar a regulação da estocagem de ferro intracelular em Caulobacter crescentus.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
85
Produção de ácido indol acetico por bactérias
diazotróficas associadas a diferentes variedades de
cana-de-açúcar
Barbosa, MV1; Barros, MCS1; Costa, DP1; Andrade, PAM1; Farias, ARB1; Lira-Cadete, L1; Silva, MO2; Freire,
FJ2; Kuklinsky-Sobral, J1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Auxina, interação bactéria-planta, nitrogênio, promoção de crescimento vegetal.
O conhecimento da diversidade de microrganismos e as suas diversas funções quando em associação com as
plantas podem auxiliar a exploração destes microrganismos em diferentes áreas, como a biologia, medicina,
agricultura e indústria. Neste contexto, a fixação biológica de nitrogênio e os diferentes mecanismos de interação
microrganismos-planta são alvo de estudos para o aumento da produtividade agrícola com sustentabilidade.
Portanto, o objetivo deste trabalho foi selecionar e identificar bactérias diazotróficas associadas a variedades de
cana-de-açúcar quanto à capacidade de produzir ácido indol acético (AIA) in vitro. Para tanto, foram avaliadas 140
linhagens de bactérias diazotróficas endofíticas, de folhas e raízes, e do rizoplano de plantas de três variedades
(RB92579, RB867515 e RB 863129) de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) com 4 e 10 meses de desenvolvimento,
cultivadas em Pernambuco. A seleção de bactérias produtoras de AIA, um regulador de crescimento vegetal da
classe das auxinas, foi realizada por um método colorimétrico e específico (corante de Salkowski) que caracteriza
a produção do fitohormonio. A identificação foi realizada por meio do seqüenciamento parcial e análise do gene
16S rRNA. Foi observado que 76% das linhagens bacterianas avaliadas apresentaram a capacidade de produzir
AIA in vitro. Considerando-se o estádio fenológico das plantas hospedeiras das quais as bactérias foram isoladas,
foi observado pouca diferença entre a freqüência de linhagens positivas, pois 77,5% das linhagens avaliadas
oriundas de plantas com 4 meses de cultivo e 73,3% das linhagens avaliadas oriundas de plantas com 10 meses
de cultivo foram capazes de produzir AIA. Em relação ao nicho de colonização das bactérias dizotróficas
produtoras de AIA, houve uma escala crescente na freqüência de bactérias positivas na direção das folhas ao
rizoplano. Contudo, os genótipos da cana-de-açúcar apresentaram grande influência na seleção de bactérias
diazotróficas com a capacidade de produzir AIA, pois as variedades RB867515 e RB92579 apresentaram 41,5 e
38,7% de linhagens positivas, respectivamente. Enquanto que a variedade RB863129 apresentou apenas 20%
de linhagens diazotróficas capazes de produzir AIA. A identificação das linhagens diazotróficas produtoras
de AIA agrupou-as aos seguintes gêneros: Enterobacter, Klebsiella e Pseudomonas. Portanto, os resultados
obtidos poderão auxiliar a compreensão da interação bactéria/cana-de-açúcar e as linhagens obtidas poderão
ser exploradas em programas de manejo para a promoção de crescimento vegetal com sustentabilidade.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
86
Identificação dos isolados bacterianos obtidos de
fermentos lácteos pela análise do polimorfismo da
região espaçadora no locus de rDNA
Santos, BM1; Lucena, BTL1; Morais Jr, MA1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected], [email protected], [email protected]
Palavras-chave: ARDRA; Bactérias lácticas; fermentos lácteos; identificação molecular; rDNA
Introdução: A taxonomia de bactérias foi por muito tempo dependente das técnicas baseadas em critérios
morfofisiológicos e bioquímicos, tais como a análise do padrão de fermentação de carboidratos, padrão de resistência
a diferentes concentrações de NaCl, crescimento em diferentes tipos de meios e em diferentes temperaturas e na
resistência a antibióticos. Atualmente a taxonomia bacteriana utiliza também características genômicas a análise de
marcadores de DNA que aliadas às características fenotípicas compõem a chamada taxonomia polifásica, útil para
a discriminação tanto intra como interespecífica. Objetivo: utilizar a técnica da análise do polimorfismo de restrição
da região espaçadora 16S-23S do locus de rDNA amplificado (ARDRA) para identificar bactérias provenientes de
fermentos lácteos comercializados para a produção de iogurtes e bebidas lácteas. Métodos: Amostras de seis
fermentos distintos foram reidratados em solução fisiológica estéril para a concentração final de 0,5 g/mL, diluídas
a 10-4 e semeadas em meio MRS acrescido de ciclohexamida. As placas foram incubadas em jarras de anaerobiose a
37ºC. Após o crescimento, as colônias foram caracterizadas segundo a sua morfologia, sendo utilizadas colônias de
cada morfologia para identificação molecular. A identificação dos isolados foi realizada através da análise do perfil
de ARDRA utilizando 12 enzimas de restrição seguindo o protocolo descrito por Moreira et al (2005). Resultados: Nos
Fermentos 1 e 2 foram observadas colônias com duas morfologias, porém com o perfil de amplificação iguais com
um único espaçador. Observando os resultados da digestão e comparando com o banco de dados, os isolados foram
identificados como sendo Streptococcus thermophilus. No fermento 3, os isolados apresentaram duas morfologias
e foram identificados como Lactobacillus delbruckii e Staphilococcus epidermidis. Os Fermentos 4 e 5 apresentaram
colônias brancas e lisas cujos isolados foram identificados nos dois fermentos como sendo da espécie Lactococcus
lactis. Adicionalmente, no fermento 5 foi detectadas colônias transparentes lisas que apresentaram perfis de
restrição distintos dos demais. A análise de sequenciamento de DNA do gene 16S os isolados daquela morfologia
apresentaram 93%, 96% e 91% de similaridade com Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp hordiniae
e Lactococcus lactis subsp lactis, respectivamente. Na análise do Fermento 6 foram observadas colônias com três
morfologias diferentes cujos perfis de digestões obtidos não constavam no banco de dados e, portanto, foram
submetidas a análises de seqüenciamento de DNA do gene 16S. As sequências de nucleotídeos apresentaram
94% de similaridade com a seqüência da linhagem tipo de Lactobacillus helvetivus depositada no GeneBank. Este
resultado sugere que se trata de uma espécie nova bacteriana, pois tem sido sugerido o limite de similaridade
igual ou superior a 97% para a identificação molecular de um isolado bacteriano (Gevers et al 2005). Conclusão:
A metodologia da ARDRA mostrou-se em geral rápida e precisa para a distinção das espécies bacterianas na
medida em que se consolide um banco de dados adequado referendado pela análise genômica e morfofisiológica.
Apoio Financeiro: FACEPE, CNPq e CAPES/PROCAD-NF
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
87
Resistência bacteriana a ampicilina em ambientes
aquáticos do Rio de Janeiro induzida por transferência
gênica lateral
Coutinho, FH¹; Vieira, RP¹; Silveira, CB¹; Monteiro, VA¹; Albano, RM²; Martins, OB¹
¹Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro
²Instituto de Bioquímica, Universidade Estadual do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Antibióticos, Transferência gênica lateral, Plasmideo, Bibliotecas 16S rRNA.
Introdução: O surgimento de linhagens bacterianas patogênicas resistentes a antibióticos é uma questão de saúde
pública. Este processo é resultado do uso indevido destas substâncias durante o tratamento de infecções. O uso de
antibióticos de espectro estendido sem um conhecimento adequado da biologia do patógeno gera uma forte pressão
seletiva que privilegia as linhagens resistentes e multi-resistentes, que toleram concentrações cada vez mais altas
de antibióticos. O ambiente representa um local de extensa troca gênica, por conta da abundância e diversidade
de organismos que habitam os solos e os ambientes aquáticos. Nesses locais, linhagens originalmente sensíveis são
capazes de receber genes, muitas vezes codificados em plasmídeos, que lhes conferem resistência a antibióticos,
não só nos níveis clínicos, mas também em concentrações extremamente elevadas constituindo um grau de superresistência. Objetivos: Estudar a diversidade de bactérias, cultiváveis, resistentes a ampicilina, patogênicas e não
patogênicas, em três ambientes aquáticos distintos (Barra da Tijuca, Baía de Guanabara e Canal da Maré), com
níveis diferenciados de poluição. O isolamento de cepas bacterianas que contém plasmideos de resistência também
foi realizado como forma de melhor compreender como os eventos de transferência gênica lateral que ocorrem
entre diferentes grupos taxonômicos. Métodos: isolamento de bactérias da água da Baía de Guanabara, região que
sofre com despejos de esgoto hospitalar e doméstico, em meio de cultura LB contendo ampicilina, tetraciclina ou
canamicina. Construção de bibliotecas genômicas do gene 16S rRNA para a análise metagenômica dos organismos
resistentes a crescentes concentrações de ampicilina (0 mg/L; 20 mg/L; 1g/L e 12g/L) dos três ambientes estudados
do litoral do Rio de Janeiro. Sequenciamento seguido de identificação, edição das sequências e montagem de uma
árvore de diversidade com uso de ferramentas de bioinformática. Conclusões: Uma grande diversidade de bactérias
resistentes é encontrada nesses ambientes, e essa habilidade pode ser transferida entre linhagens, via plasmídeo
como demonstrado experimentalmente. Observa-se uma mudança clara da diversidade quando comparadas às
bibliotecas referentes aos meios de cultura com e sem antibiótico, demonstrando que os organismos resistentes
não necessariamente são os mais bem-sucedidos em um ambiente em que os antibióticos estão ausentes. O
seqüenciamento completo de todas as bibliotecas e a realização de antibiogramas mais abrangentes com os isolados
fornecerá mais informações sobre o comportamento destes organismos e de seus genes no ambiente aquático.
Apoio Financeiro: UFRJ, CNpQ e FAPERJ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
88
Biogeografia e diversidade de cominidades bacterianas
de um lago natural
Lima-Bittencourt, CI; Costa, OS; Reis, MP; Castro, WC; Barbosa, FAR; Chartone-Souza, E; Nascimento,
AMA.
Departamento de Biologia Geral, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, Belo Horizonte, Minas Gerais,
Brazil.
[email protected]
Biogeografia microbiana, gradiante eufótico, ARDRA, Gene de rRNA 16S, Lagoa Carioca
A Biogeografia estuda a distribuição espacial e temporal das espécies de seres vivos e tenta compreender os fatores
que controlam a abundância dos organismos. O Parque Estadual do Rio Doce constitui o maior fragmento de Mata
Atlântica de Minas Gerais, sendo que o seu sistema hídrico corresponde a 6% de sua área. Esta pesquisa avaliou a
diversidade e biogeografia das comunidades bacterianas e sua possível associação com parâmetros abióticos e/
ou temporais na Lagoa Carioca, situada nesse parque. Amostras de água, ao longo do gradiente eufótico da zona
limnética, foram coletadas na estação de seca, em junho e agosto 2007. Bactérias foram recuperadas em meio
PTYG e identificadas a partir da análise de seqüências dos genes de rRNA 16S. Também foram realizadas medições
de variáveis abióticas. A fim de comparar a diversidade bacteriana e a estrutura das comunidades nas amostras
de água, 648 isolados bacterianos foram submetidos à ARDRA, usando duas enzimas de restrição (AflIII e AluI).
O dendrograma gerado exibiu 357 perfis distintos. A partir da análise filogenética das seqüências do gene rRNA
16S, foram identificados cinco filos (Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria e DeinococcusThermus), representados por 26 gêneros. Observou-se alteração de perfis quanto ao espaço e tempo, sugerindo
a presença de um ambiente dinâmico submetido a várias sucessões de espécies dentro de uma comunidade.
Apoio financeiro: FAPEMIG e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
89
Prevalência de infecção por Chlamydia trachomatis na
região de tríplice fronteira do Alto Solimões, Amazonas
Dutra, DLR1; Leturiondo, AL1; Benzaken, AS2
Laboratório de Biologia Molecular, Fundação Alfredo da Matta
Gerência de DST, Fundação Alfredo da Matta
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Captura Híbrida, Clamídia, DST, SASH, Doença Inflamatória Pélvica
A infecção causada por Chlamydia trachomatis é a DST bacteriana de maior prevalência no mundo desenvolvido
e provavelmente também o seja em países em desenvolvimento, causando processos inflamatórios do trato
reprodutivo masculino e feminino. Em mulheres C. trachomatis pode provocar a Doença Inflamatória Pélvica,
causando como sequelas a gravidez ectópica e a dor pélvica crônica. Entretanto, grande parte dos homens e
das mulheres infectados por este agente não apresentam sintomas, o que torna difícil seu diagnóstico clínico e,
consequentemente, seu controle. O objetivo deste trabalho foi elaborar diagnóstico situacional da infecção por
Clamídia na tríplice fronteira do Alto Solimões, nos municípios de Tabatinga (TB), Benjamin Constant (BC) e
Atalaia do Norte (AN), Amazonas. A amostragem foi realizada pelo método Situational Analysis for Sexual Health
- SASH, mapeando-se primeiramente os “pontos quentes” do circuito “beber e lazer” dos três municípios para, em
seguida, distribuir os convites para comparecimento dos frequentadores às Unidades Básicas de Saúde. Esfoliados
uretral e ecto/endocervical foram coletados no período de janeiro a julho de 2009, a partir de 285 pacientes do sexo
masculino e 314 do sexo feminino, com o auxílio do kit UCM (QIAGEN). A detecção de DNA de C. trachomatis foi
realizada por meio de ensaio de Captura Híbrida (QIAGEN), utilizando coquetel de sonda de RNA complementar
ao plasmídeo críptico completo e a 4% do DNA cromossômico do agente. Foi encontrada uma prevalência global
de 3,2% para os três municípios estudados, sendo que de 3,7% (11/301) para TB, 1,5% (3/199) para BC e 5,1% (5/99)
para AN. Considerando os gêneros, a prevalência de Clamídia foi em média duas vezes e meia maior no sexo
feminino (4,7% em comparação com 1,7% nos homens), tendo alcançado uma taxa quatro vezes e meia maior
em TB (5,9% para as mulheres x 1,3% para os homens). 89,5% dos pacientes positivos encontravam-se na faixa
etária abaixo dos 30 anos. 47,4% dos pacientes positivos apresentaram queixa de corrimento, 31,6% de dor pélvica
e 21,1% de dor durante a relação sexual. Nenhum dos homens positivos para infecção apresentou sintomas. Os
resultados obtidos corroboram com estudos publicados que demonstram uma prevalência maior em mulheres
do que em homens. No entanto, as taxas observadas no presente estudo são consideradas baixas. Não foi possível
correlacionar a sintomatologia observada com a ocorrência da infecção nos casos positivos para C. trachomatis uma
vez que os pacientes negativos apresentaram queixas numa média 16 vezes maior do que os pacientes positivos.
Apoio financeiro: FAPEAM, FUAM.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
90
Caracterização de grupos filogenéticos de Escherichia
coli nas águas do Complexo Portuário Maranhense
Mendes, MBP¹; Costa, BRR¹; Santos, BRC¹; Nascimento, AR³; Monteiro-Neto, V4; Costa, CFM²; Kuppinger, O¹;
¹ Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão
² Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Mestrado em Biodiversidade e Conservação, Universidade Federal do Maranhão
³ Pavilhão de Controle de Qualidade da Água e Alimentos, Departamento de Tecnologia Química, Universidade Federal do Maranhão
4
Professor titular do Centro Universitário do Maranhão, UniCEUMA
[email protected]
Palavras-chave: Enterobactéria; Técnicas Moleculares de Filotipagem; Água Portuária; Linhagens Patogênicas; Linhagens Filogenéticas
O Complexo Portuário Maranhense é um dos maiores da América do Sul estando situado na Baía de São Marcos,
Maranhão, Brasil, em área periurbana. É possível que navios sirvam como vetores para a introdução de espécies
exóticas e patogênicas de microorganismos causadores de doenças entéricas. Escherichia coli é uma bactéria
simbionte relativamente comum no trato intestinal de animais de sangue quente, incluindo humanos. Podem
apresentar cepas patogênicas causadoras de diversas doenças dentro e fora do intestino, sendo sua principal via de
contaminação a ingestão de água ou alimentos contaminados com resíduos fecais. Dessa forma, a identificação de
cepas virulentas de E. coli em águas costeiras não tratadas, bem como sua prevalência, apresentam um importante
significado sanitário. Considera-se que a distinção de cepas patogênicas e não-patogênicas revela importantes
informações acerca da diversidade genética, extensão de recombinação e distribuição espacial desses organismos. A
filotipagem de colônias de E. coli é reconhecida como metodologia molecular alternativa para estudos filogenéticos
desses microorganismos, possibilitando a identificação de linhagens patogênicas. Nesse sentido, é possível
classificar, mediante chave ausência/presença de fragmentos dos genes chuA, yjaA e TSPE4.C2, quatro principais
grupos filogenéticos A, B1, B2 e D, dentre os quais se enquadram as cepas comensais e patógenos oportunistas. O
foco do trabalho é identificar e caracterizar filogeneticamente cepas de E. coli com potencial tóxico e patogênico
presentes em águas do Complexo Portuário Maranhense, na Ilha de São Luís. A metodologia utilizada consistiu
na aplicação de técnicas de cultivo e isolamento de cepas em meios seletivos para coliformes e a identificação
bioquímica a nível específico através da análise do Sistema Bactray (Laborclin) e Software Bactray. A suspensão das
cepas foi feita em água estéril para posterior análise molecular utilizando o método Hot-Start de Reação em Cadeia
de Polimerase (PCR). Dentre as 98 colônias identificadas, 51 eram representantes de E. coli. Que foram classificadas
quanto a linhagem filogenética, 8 foram positivas para os genes chuA e yjaA. Cinco cepas apresentaram positividade
para o gene chuA e foram negativas para o gene yjaA. Das cepas restantes, 33 não apresentaram as sequências alvo
do gene chuA nem para o marcador TSPE4.C2. Sete não apresentaram o gene chuA, mas amplificaram o fragmento
TSPE4.C2. Dessa forma, oito das 51 cepas de E. coli foram identificadas como do grupo B2, cinco do grupo D, 33
dos grupos filogenéticos A, e sete são do grupo B1. A positividade para identificação de grupos possivelmente
relacionados à contaminação fecal revela a existência provável de potencial patogênico em águas portuárias
e aponta o risco de estas bactérias diarreiagênicas serem transportadas via água de lastro para outros países.
Apoio Financeiro: UFMA; UNIVIMA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
91
Identificação molecular de bactérias produtoras de
ácido lático
Bernardo, MP1; Coelho, LF1; De Lima, CJB1; Rodovalho, CM2; Bacci, M2; Contiero, J1
Departamento de Bioquímica e Microbiologia. Instituto de Biociências de Rio Claro-Unesp
Centro de Estudos de Insetos Sociais(CEIS) Instituto de Biociências de Rio Claro- Unesp
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bactérias láticas, identificação molecular, Lactobacillus , ácido lático
O ácido lático tem um grande potencial químico, podendo ser usado como preservativo, flavorizante e acidulante
quando usado na indústria alimentícia; tem ampla aplicação na indústria farmacêutica, como na produção de
cosméticos e pomadas. Além da indústria química atuando na produção de bases químicas. Os isômeros D(+) e L(-),
produzidos por via fermentativa, são utilizados na síntese do polilactato (PLA) que é usado na regeneração de tecidos,
suturas cirúrgicas, fixação de fraturas, ligamentos e implantes, no reparo de cartilagens, menisco, reposição óssea e
cirurgias orais, sendo empregados na forma de parafusos, pinos, grampos e placas. As grandes vantagens das próteses
e implantes de poli ácido lático estão no fato desse composto ser altamente resistente, não causar rejeição e ser
completamente reabsorvível, o que torna desnecessário novas cirurgias para retirada dos implantes dos pacientes.
Identificar bactérias láticas, isoladas de diversas origens, através da determinação da composição de bases do DNA
e o seqüenciamento de DNA ribossomal 16S. 19 bactérias foram submetidas à fermentação por 24 horas para a
obtenção de biomassa. A extração de DNA foi realizada pelo método de TNES. A amplificação do material genético
se deu por PCR utilizando o kit Pure Taq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) e os primers 27 FA e 27 FC ambos a
10 pmol/ µL. Para a purificação do produto do PCR foi empregado o kit PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE
Healthcare). Para a reação de seqüenciamento foi usado o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (applied
Biosystems)segundo recomendações do fabricante e as amostras foram aplicadas em sequenciador automático
ABI 3500. As sequencias Forward e reversa foram alinhadas com o programa BioEdit. O isolado foi identificado em
nível de espécie pela comparação da seqüência obtida com uma seqüência conhecida do GenBank, usando BLAST
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). A análise das sequencias revelou que 21,0% dos isolados são da espécie Weissella
paramesenteroides, 15,7% Lactobacillus casei, 15,7% Pediococcus pentasaceus, 15,7% Leuconostoc lactis, 15,7 %
Enterococcus faecium 5,2% Lactobacillus rhamnosus, e 5,2% Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides,5 , 2 %
Streptococcus equinus. Conclusões: A identificação molecular foi eficiente para a identificação dos 19 isolados.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
92
Utilização de marcadores microssatélites no estudo de
Xanthomonas patogênicas a citros
Coelho, M1; Jaciani, FJ 1,2; Belasque Jr, J1
Departamento Científico, Fundo de Defesa da Citricultura - Fundecitrus, Araraquara, SP
Departamento de Tecnologia, FCAV/UNESP, Jaboticabal, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chaves: Cancro cítrico, diversidade genética, polimorfismo, PCR, SSR.
Introdução: O gênero Xanthomonas compreende um grupo de bactérias fitopatogênicas de grande importância
econômica em todo o mundo. A cultura dos citros, em particular, é afetada por três espécies diferentes: X. citri
subsp. citri (tipos A, Aw e A*), X. fuscans subsp. aurantifolii (tipos B e C) e X. alfalfae subsp. citrumelonis (tipo E). Há
diferenças entre essas espécies quanto a gama de hospedeiros, região geográfica de ocorrência e patogenicidade,
sendo X. citri subsp. citri (tipo A) a mais importante. Microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats) correspondem
a seqüências de DNA em que um pequeno número de pares de bases (1-6) são repetidas em tandem. Dentre os
marcadores moleculares utilizados na avaliação da diversidade genética de fitopatôgenos os microssatélites
destacam-se por se tratar de uma técnica altamente informativa e de fácil utilização. Objetivo: Desenvolver
marcadores SSR para avaliar a diversidade genética de isolados de Xanthomonas patogênicas a citros. Métodos:
Cinco pares de primers foram construídos a partir do software in silico (http://insilico.ehu.es/microsatellites/
index2.php) utilizando como molde as seqüências nucleotídicas do isolado 306 de X. citri, seqüenciado pelo projeto
genoma/FAPESP. Para análise do polimorfismo utilizou-se 30 isolados de Xanthomonas (19 da subsp. citri, 10 da
subsp. aurantifolii e um da subsp. citrumelonis). Após amplificação via PCR, os amplicons foram analisados através de
gel de agarose 2%. Resultados: Todos isolados de citri amplificaram com os primers testados, sendo dois específicos
para esta espécie (Micro_5 e 19). Observou-se polimorfismo entre os isolados de citri com os primers Micro_4,
10 e 19. A maior diversidade foi obtida com o Micro_10, o qual permitiu a identificação de três perfis genéticos
diferentes. Para os isolados de aurantifolii e citrumelonis ocorreu amplificação com apenas dois pares de primers
(Micro_3 e 10 para aurantifolii; e Micro_3 e 4 para citrumelonis), todos monomórficos. A amplificação com um dos
primers (Micro_3) apresentou fragmentos de tamanhos específicos para cada espécie de Xanthomonas, mas não
identificou polimorfismo entre isolados da mesma espécie. Conclusão: A utilização de marcadores microssatélites
mostrou-se eficaz na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros, porém com baixo potencial
em estudos de diversidade genética desses patógenos quando originários da mesma espécie e região geográfica.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
93
Detecção de genes de virulência em cepas de
Escherichia coli em águas do Complexo Portuário
Maranhense
Mota, MCB¹; Monteiro-Neto2, V; Nascimento, A3; Alves, MS1; Silva-Junior, MP¹; Costa, CFM1; Kuppinger,O1
¹ Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão
2
Laboratório de Microbiologia, Centro Universitário do Maranhão, UniCEUMA
³ Laboratório de Controle de Qualidade da Água e Alimentos, Departamento de Química, Universidade Federal do Maranhão
[email protected]
Palavras-chave: E. coli, cepas patogênicas, água de lastro, ETEC, EAEC
O complexo portuário Maranhense é o segundo maior complexo do Brasil, recebendo navios de vários continentes.
É possível que navios possam funcionar como vetores para a introdução de enterobactérias patogênicas através
de água de lastro, tendo em vista que o complexo localiza-se em área periurbana onde ocorre despejo esgoto e
dejetos domésticos, o que põe em risco a saúde animal e humana. Dentre esses microorganismos patogênicos,
os mais frequentemente transmitidos pela água são aqueles que causam infecções no trato intestinal com cepas
de Escherichia coli que possuem genes de virulência. Em virtude da existência das cepas patogênicas de E. coli,
faz-se necessário a diferenciação de tais cepas daquelas da flora normal do intestino humano. 51 cepas de E. coli
foram isoladas de águas do Complexo Portuário Maranhense. A metodologia utilizada se deu através da aplicação
de técnicas básicas de microbiologia para cultivo e isolamento de cepas em meios seletivos para coliformes e
a identificação bioquímica a nível específico através da análise do Sistema Bactray (Laborclin). A suspensão
das cepas foi feita em água estéril. Para a identificação de cepas diarréicas de E. coli foram estudados genes
de virulência stx, elt, est, aggR, CVD432, ipaH e eae, associados a cepas enterohemorrágicas, enterotoxigênicas,
enteroagregativas, enteroinvasivas e enteropatogênicas a partir da Hot Start Polimerase Chain Reaction (PCR).
Duas cepas amplificaram a sequência alvo do gene elt, presente em E. coli enterotoxigênicas (ETEC) representando
uma frequencia de 3,92%. O produto desse gene está elacionado em sua estrutura e função à toxina colérica,
diminuindo assim a absorção de fluídos e eletrólitos pelo lúmen intestinal. Além disso, foi identificada ainda uma
E. coli enteroagregativa (EAEC) que apresentou a região alvo para o CVD432, representando uma frequencia de
1,96%. Portanto, as amostras de águas do Complexo Portuário Maranhense revelaram a existência de potencial
patogênico, demonstrando que isso representa um risco epidemiológico de doenças gastrointestinais e outras
infecções. A identificação de cepas patogênicas de E.coli com genes de virulência torna possível a hipótese que
essas possam ser transportadas através de água de lastro para outros paises.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
94
Estudo da diversidade genética de linhagens de
Bacillus thuringiensis provenientes de amostras de
solo
Leonel, LV1; Carvalho-Filho, CD3; Dragalzew, AC2; Fazion, FAP2; Souza, GMD2; Vilas-Bôas, LA2; Scarpassa,
JA2; Ricieto, APS2; Vilas-Bôas, GT2
Centro Universitário Filadélfia (Unifil)/Londrina, PR
Universidade Estadual de Londrina, Londrina/PR
3
Universidade Federal da Bahia, Salvador/BA, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: RAPD, Bacillus thuringiensis, genes cry, controle biológico, bactéria entomopatogênica.
Linhagens de Bacillus thuringiensis são utilizadas no controle biológico de insetos pragas e vetores de doenças.
Trata-se de uma bactéria Gram-positiva, esporulante, aeróbia, de distribuição cosmopolita. A característica
entomopatogênica é devido à síntese de uma proteína denominada Cry, codificada por genes também
denominados cry. Estudos com isolamento de B. thuringiensis tem identificado diversos sorotipos que
apresentam ação sobre diversas ordens de insetos de acordo com a presença de genes cry. O uso de marcadores
moleculares possibilita a caracterização genética e sua correlação com diferentes características. Assim, a
técnica de RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) foi utilizada neste trabalho para a caracterização
genética de 39 linhagens de B. thuringiensis provenientes de amostras de solo de várias regiões do Estado do
Paraná, que fazem parte do banco de linhagens entomopatogênicas da Universidade Estadual de Londrina. Os
resultados obtidos foram aplicados na correlação com a origem das linhagens, a ação entomopatogênica e a
caracterização do banco. Foram utilizados 10 primers aleatórios, gerando um perfil de amplicons que possibilitou
a elaboração de uma matriz binária para a construção de um dendograma por neighbor-joining através do
programa Treecon. Analisando o dendograma, pode-se observar a formação de dois grupos bem definidos de
acordo com a ação inseticida caracterizada pela presença do gene cry. A comparação com dados de bioensaio
indicou que linhagens que apresentam ação sobre insetos da ordem Diptera e Lepidoptera tem prevalência
de localização em grupos distintos. Foi observada, também, a ausência de linhagens geneticamente idênticas.
Apoio financeiro: CNPq, UEL e FAPESB-BA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
95
Bactérias halotolerantes associadas ao feijão caupi
(Vigna unguiculata): isolamento, identificação e
interação bactéria-planta
Lira-Cadete, L1; Farias, ARB1; Barbosa, VB1; Andrade, PAM1; Costa, DP1; Freire, FJ2; Kuklinsky-Sobral, J1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bactérias endofíticas, nitrogênio, auxinas, fosfato, gene 16S rRNA.
A espécie Vigna unguiculata, uma fabácea, vulgarmente conhecida como feijão-de-corda ou feijão caupi, é uma
cultura bastante rica do ponto de vista nutricional, apresentando um alto teor protéico e baixo valor calórico.
Além disso, apresenta fácil adaptação a solos de baixa fertilidade e com períodos de seca prolongada, como o
semi-árido brasileiro. Esta cultura possui um ciclo curto, baixa exigência hídrica e capacidade de tolerar estresse
térmico e salino. Atualmente, a preocupação em promover a transição dos sistemas agrícolas convencionais
para uma agricultura de base sustentável tem despertado a exploração e o conhecimento dos mecanismos de
interação bactéria-planta para serem utilizados em sistemas de manejo que busquem uma produção sustentável.
Baseado nisto, este trabalho teve como objetivos: isolamento, identificação e a prospecção por características
envolvidas na interação bactéria-planta de bactérias halotolerantes associadas ao feijão caupi. Para tanto, foram
isoladas bactérias endofíticas de caules e raízes e bactérias do rizoplano de plantas de feijão caupi, cultivadas
no município de Brejão, PE, (latitude 901’47,29’’S e longitude 36034’’28,28’’O), 45 dias após o plantio, em meio
de cultura com 50g/L de NaCl. Isolados representativos de grupos morfológicos diferentes foram purificados
e submetidos a identificação pelo seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA e avaliados quanto a capacidade
de fixar nitrogênio, produzir ácido indol acético (AIA) e solubilizar fosfato inogânico in vitro, características
envolvidas com a promoção de crescimento vegetal. A densidade populacional da comunidade bacteriana
halotolerante, de folha e raiz, e do rizoplano variou de 103 a 107 UFC/g. Foi possível observar interação entre a
colonização bacteriana e os tecidos da planta hospedeira, pois, a análise dos dados mostrou que a densidade
bacteriana diminuiu na direção rizoplano>raiz>caule. Foram analisadas 38 linhagens quanto à capacidade de fixar
nitrogênio, produzir AIA e solubilizar fosfato inorgânico. Foi observado que 60% foram capazes de crescer em meio
semi-sólido livre de nitrogênio. Em relação a capacidade de produzir o regulador de crescimento vegetal, AIA, 76%
das linhagens foram positivas e 91% foram capazes de solubilizar fosfato inorgânico. Em relação ao nicho do qual
as bactérias foram isoladas, foi verificado que a raiz apresentou maior porcentagem relativa de linhagens com as
características avaliadas. Além disso, foi observado que todas as linhagens isoladas do caule e raiz foram capazes
de solubilizar fosfato. É importante ressaltar, que 37% das linhagens avaliadas apresentaram as três características
simultaneamente, sendo promissoras candidatas ao desenvolvimento de inoculantes. A identificação das
linhagens halotolerantes agrupou-as aos seguintes gêneros: Enterobacter, Klebsiella, Methylobacterium,
Pseudomonas e Sphingomonas. Portanto, os resultados obtidos no presente trabalho podem contribuir para um
melhor entendimento da interação bactéria-planta, abrindo perspectivas para a utilização destes microrganismos
em programas de manejo integrado de feijão caupi, com incremento do crescimento vegetal e produção de grãos.
Apoio Financeiro: FACEPE e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
96
Utilização de linhagens de Lactococcus lactis invasivas
como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais,
codificando o antígeno ESAT-6 de Mycobacterium
tuberculosis, em linhagens celulares epiteliais
humanas
Pereira, VB1; Saraiva, TDL1; Mancha-Agrest, P1; Zurita-Turk, M1; Azevedo, V1; Miyoshi, A1
Laboratório de Genética Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: Vacina de DNA, pValac, ESAT-6, Lactococcus lactis, Mycobacterium tuberculosis.
Introdução: O uso de bactérias como veículo para a entrega de plasmídeos vacinais pela rota oral constitui
uma estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para isto, bactérias patogênicas
atenuadas como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, ainda que o risco de reversão da
patogenicidade limite seu uso em humanos. Lactococcus lactis é uma Bactéria Láctica modelo considerada
GRAS (Generally Recognized As Safe) que vem sendo extensivamente utilizada para a produção e entrega de
antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Nesse contexto, L. lactis representa uma alternativa atrativa para a
entrega de plasmídeos vacinais em relação à patógenos atenuados. Assim, linhagens invasivas de L. lactis foram
desenvolvidas (FnBPA+) e um plasmídeo de expressão eucariótica foi construído (pValac; Vaccination using
Lactic acid bacteria). Desta forma, a utilização de linhagens invasivas de L. lactis para a entrega do pValac
expressando o antígeno ESAT-6 (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) de Mycobacterium tuberculosis, poderia
representar uma nova estratégia para o controle da tuberculose, uma doença infecto-contagiosa que atinge 1/3
da população mundial na forma latente. Objetivos: Utilização de linhagens de L. lactis invasivas (FnBPA+) como
veículos para a entrega de um plasmídeo vacinal (pValac), codificando o antígeno ESAT-6 de M. tuberculosis,
em células de mamíferos. Métodos: A seqüência codificadora de ESAT-6 será amplificada por PCR (polymerase
chain reaction) a partir do DNA genômico de M. tuberculosis linhagem H37Rv para clonagem no vetor Zero Blunt®
TOPO® (Invitrogen) e posteriormente no vetor pValac. A construção final, pValac:ESAT-6, será primeiramente
obtida em E. coli TG1 e posteriormente transferida para L. lactis FnBPA+ por eletroporação. Para a avaliação
da produção de ESAT-6, células da linhagem Caco-2 serão transfectadas com o plasmídeos pValac:ESAT-6 e
a capacidade invasora da linhagem L. lactis FnBPA+(pValac:ESAT-6) também serão verificadas nesta linhagem
celular. Resultados parciais: A ORF ESAT-6 foi amplificada por PCR, com aproximadamente 300pb. ESAT-6 foi
clonado primeiramente no vetor Zero Blunt® TOPO® em E. coli TOP10, e a clonagem confirmada por PCR, digestão
enzimática e sequênciamento (ABI3130). O inserto ESAT-6 foi então clonado no vetor pValac e transformado
em E. coli TG1. A construção pValac:ESAT-6 foi confirmada por PCR, digestão e sequênciamento. Conclusões:
Este projeto constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas
baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração em mucosas; o que também
poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
97
Influência de KlRox1p no metabolismo fermentativo de
Kluyveromyces lactis
Colombo, LT1; Harami, T1; Diniz, RHS1; Bao, W2; Passos, FML1
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária Bioagro - Dept. Microbiologia Universidade Federal de Viçosa
Institut de Génétique et Microbiologie - Université Paris
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Kluyveromyces lactis, KlROX1, metabolismo fermentativo, expressão gênica
Introdução: As leveduras respondem à variação de concentração de oxigênio molecular transcrevendo
diferencialmente genes do metabolismo aeróbio versus anaeróbio. Na levedura modelo predominantemente
fermentativa Saccharomyces cerevisiae, a regulação dessa expressão envolve alguns reguladores transcricionais bem
descritos: Hap1p, Rox1p e Mot3p. Hap1 é conhecida por ativar genes expressos em condição aeróbia. Rox1p e Mot3p
reprimem sob condições aeróbias genes que são expressos em condições limitantes de oxigênio ou anaeróbias.
Em busca de uma melhor compreensão dessa regulação na levedura respiro-fermentativa Kluyveromyces lactis,
estudos mostraram que KlHap1p tem efeito repressor sobre KlRAG1, que codifica o transportador de glicose de
baixa afinidade, de modo que sua ausência leva a um metabolismo mais fermentativo. E, trabalhos com mutantes
KlROX1 evidenciaram também um direcionamento para o metabolismo mais fermentativo. Objetivo: Estudar a
influência de KlRox1p no metabolismo fermentativo de K. lactis pela realização de ensaios enzimáticos da álcool
desidrogenase (ADH) e avaliação da expressão dos genes KlADH1, KlHAP1 e KlRAG1, na condição de transição
aerobiose-hipoxia. Métodos: Linhagens K. lactis MW270-7B e sua mutante derivativa K. lactis MW270-7B rox1∆
foram cultivadas em YNB (Yeast Nitrogen Base) e glicose em regime contínuo (D= 0,1 h-1) sob aerobiose e, em
seguida, submetidas à hipoxia por 9 horas; amostras foram coletadas a cada 3 horas para análise da atividade da
álcool desidrogegase (ADH) e da expressão dos genes KlADH1, KlHAP1 e KlRAG1 por PCR em tempo real. KlADH1
codifica a alcool desidrogenase 1, enzima qe tem função na formação de etanol. Resultados: Durante transição
aerobiose-hipoxia, o metabolismo mais fermentivo de K. lactis foi confirmado pela atividade enzimática da ADH,
que foi significativamente maior na linhagem mutante rox1∆ em relação ao controle, no tempo 0 hora em aerobiose
e, após 6 e 9 horas, em hipoxia; e, pela expresão relativa Kl rox1∆∕ Kl MW270-7B do gene KlADH1, que foi de 1,84,
4,83, 4,37 e 1,80 para os tempos 0, 3, 6 e 9 horas, respectivamente. Níveis de transcritos de KlHAP1 e KlRAG1 foram
maiores no mutante, sendo a expressão relativa Kl rox1∆∕ Kl MW270-7B do primeiro de 1,69, 1,8, 5,39 e 4,47 e, do
segundo, de 4,59, 5,07, 4,47 e 3,76, ambos para os tempos 0, 3, 6 e 9 horas, respectivamente. Conclusões: A atuação
de KlRox1p sobre os genes KlADH1, KlHAP1 e KlRAG1, de maneira desconhecida ainda, sugere a influência de
KlRox1p no controle em pontos chaves do metabolismo fermentativo: na entrada da glicose, que determinará o
fluxo para a manutenção de uma via fermentativa, bem como no final, para culminar com a produção de etanol.
Apoio financeiro: CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
98
Levantamento e distribuição do fungo Guignardia
citricarpa no estado do Paraná
Muehlmann-Fischer, JM1; Adamoski, D1; Torques, AA1; Senkiv, CC; Schuh, R1; Stringari, D1; Kava-cordeiro,
V1; Galli-terasawa, LV1; Rinaldi, DAMS2; Glienke, C1
Laboratório de Genética de Microrganismos, Universidade Federal do Paraná
Divisão de Defesa Sanitária Vegetal da Secretaria de Abastecimento e Agricultura do Estado do Paraná (SEAB/PR); Núcleo Regional de
Maringá
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Guignardia citricarpa, Mancha Preta dos Citros, Guignardia mangiferae, sanidade vegetal, PCR.
A Mancha Preta dos Citros (MPC), (Agente Causal: fungo Guignardia citricarpa Kiely, anamorfo: Phyllosticta citricarpa)
é responsável por perdas na citricultura - devido à queda prematura e depreciação visual dos frutos. Considerada
uma doença quarentenária A1 nos Estados Unidos e União Européia, a exportação dos frutos in natura produzidos
no Brasil estão submetidos a barreiras fitossanitárias por parte destes países. A identificação do patógeno se dá em
parte por isolamento do fungo a partir de lesões em frutos. Tais lesões são, também, colonizadas por outro fungo,
G. mangiferae Roy (Anamorfo: Phyllosticta capitalensis), de grande similaridade morfológica, entretanto sem relatos
de malefício algum para a planta ou frutos. Frente a tal fato, uma abordagem molecular de diagnóstico torna-se
necessária. No Paraná a produção de citros é dividida em duas regiões, sendo que não há relatos oficiais de presença
da doença em pomares das regiões norte e noroeste. Sabe-se da presença do fungo somente na região conhecida
como Vale do Ribeira. Assim o presente trabalho tem como objetivo avaliar a sanidade e indicar possíveis regiões
livres do patógeno no Estado do Paraná, já que o fungo pode estar presente muitos anos antes do aparecimento dos
sintomas da MPC. Folhas de diversos pomares aparentemente sadios (aproximadamente 1% do total de plantas de
cada pomar) estão sendo coletadas e enviadas pela Secretaria do Estado de Agricultura e Abastecimento (SEABPR) ao laboratório, para a realização do isolamento de fungos endofíticos através de metodologia convencional
de cultivo. Morfotipos do gênero Guignardia são selecionados para análise. Os isolados obtidos passaram por um
screening prévio com o marcador morfológico do Meio Aveia – no qual colônias de G. citricarpa formam um halo
amarelado no meio. Posteriormente, extração de ácidos nucléicos com o UltraClean Microbial DNA Isolation Kit
(MoBio), seguida de PCR com primers espécie-específicos para G. citricarpa e G. mangiferae, numa reação multiplex,
visando confirmar a identificação para subseqüente seqüenciamento de diversos genes. Foram analisadas 400 folhas
de citros (laranja e tangerina), oriundas de 9 diferentes propriedades, localizadas principalmente na região norte e
noroeste paranaense. Os isolados do morfotipo Guignardia foram submetidos à análise molecular dos quais apenas
6 confirmaram-se como G. mangiferae. Nestas amostras, não foi identificada G. citricarpa. Com os dados obtidos a
partir das plantas analisadas, sugere-se que os pomares avaliados não apresentam o fungo G. citricarpa de forma
latente. Desta forma, o levantamento da distribuição deste fungo é importante para adoção de medidas preventivas
da disseminação da doença, bem como na indicação de possíveis áreas livres deste patógeno no Estado do Paraná.
Apoio financeiro: CNPq-MAPA, UFPR, Fundação Araucária.
Agradecimentos: SEAB/PR.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
99
Comparative genome and in silico analysis of genes
possibly regulated by the bZIP AP-1 transcription factor
in dermatophytes
Peres, NTA1; Sanches, PR1; Rossi, A2; Martinez-Rossi, NM1
Departamento de Genética
Departamento de Bioquímica e Imunologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
e-mail: [email protected]
1
2
Keywords: gene expression, transcription factor, bZIP, dermatophytes, computational analysis.
Regulation of gene expression is essential for all organisms, and guarantee that the right set of genes is expressed
during different times of development, homeostasis, adaptation to environmental changes, and pathogenicity of
some microorganisms. Eukaryotic gene expression regulation is very complex, and involves several components,
including the transcription factors (TF), key players in signal transduction pathways, being the last link between
signal flow and expression of target genes. TFs promote gene expression by binding to specific sites in the
promoter region of the target genes, however, their functionality depends on many factors, and their involvement
in a particular signaling pathway is sometimes difficult to predict. The bZIP (basic leucine zipper) family of TF is
an exclusively eukaryotic class of enhancer-type transcription factor that encloses several proteins, such as the
Pap1/AP-1. This TF binds to consensus sequences 5’-TTACGTAA-3’ or 5’-TTAGTAA-3’, playing an important role
in multidrug resistance, osmotic and oxidative stress in fungi. Dermatophytes are filamentous fungus that causes
cutaneous infections in humans and animals, being an important public health problem worldwide. Recently, the
Broad Institute of Harvard and MIT released the genome sequence of several dermatophytes, enabling comparative
genome analysis that will be time saving in the designing of experimental assays for functional genomics. Given
this, our bioinformatics group developed a domain search software that allowed in silico analyses of dermatophytes
genome. Using this software, we searched for genes possibly regulated by the bZIP AP-1 TF, by looking for its DNA
binding site at 1000 bp upstream of the predicted ORF sequences from four different dermatophytes. This analysis
revealed around 400 or 130 genes presenting, respectively, the 7 or 8 bp consensus binding sequences of this TF in
their promoter region, and some of these genes present both consensus sequence. Moreover, about 100 of these
putatively AP-1 regulated genes were shared between 2 or more dermatophytes, and 19 genes were found in the four
fungi studied, making them candidate genes for further analyses in a Trichophyton rubrum AP-1 knockout strain
that is being obtained by our group. Interestingly, most of the genes found were shared between the two species of
Trichophyton or Microsporum. In conclusion, this in silico analysis and comparative genome data performed here
will be very valuable in the study of the gene set regulated by the bZIP AP-1 TF, directing our study about the gene
expression regulation by this TF in the dermatophyte T. rubrum, during several types of environmental stimulus.
Financial support: FAPESP, CAPES, CNPq, and FAEPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
100
Nova espécie de Glomerella co-infectando plantas de
feijoeiro com C.lindemuthianum?
Barcelos, Q1; Souza, EA1; Vaillancourt, L2
Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças e Genética Molecular - Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
Vaillancourt Lab - Department of Plant Pathology, College of Agriculture, University of Kentucky
[email protected]
1
2
Palavras-chave: antracnose, Colletotrichum lindemuthianum, Glomerella, feijoeiro, análise filogenética.
O fungo Colletotrichum lindemuthianum ( fase teleomórfica Glomerella cingulata f.sp. phaseoli) é o agente
causador da antracnose no feijoeiro (Phaseolus vulgaris), doença que leva a graves perdas econômicas no Brazil
e no mundo. A resistência genética é a melhor forma de controlar a doença, porém o alto grau de variabilidade
genética dificulta o melhoramento de cultivares com resistência durável. A ocorrência de recombinação sexual
aumenta a probabilidade do patógeno quebrar a resistência do hospedeiro. Foram obtidos isolados teleomóficos
de Glomerella a partir de lesões de antracnose em plantas de feijoeiro no Brasil. Nas mesmas lesões foi possível
obter isolados anamórficos. Foi observado que durante a infecção, os isolados anamórficos e teleomórficos
tem comportamento similar com relação os eventos de pré-penetração. No entanto, plantas inoculadas com
ascosporos de Glomerella desenvolvem sintomas brandos quando comparados com sintomas com inoculações
com conídios dos isolados anamórficos. Foram realizadas análises filogenéticas com base na região ITS (internal
transcribed spacer) do DNA ribossômico e no grupo de alta mobilidade HMG (high mobility group) sequencia
codificadora do gene mating type MAT1-2. Os dados filogenéticos sugerem que os isolados teleomórficos de
Glomerella não são relacionados com os de Colletotrichum lindemuthianum, e que podem representar uma nova
espécie co-infectando lesões de antracnose com C.lindemuthianum. Análises citológicas utilizando transformantes
expressando proteínas fluorescentes tem sido feitas para elucidar como estes isolados de Glomerella
interagem com o feijoeiro e como eles se comportam na presença de C.lindemuthianum durante a infecção.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
101
Avaliação da compatibilidade sexual de linhagens de
Glomerella cingulata f. sp. phaseoli
Mota, SF1; Pereira, R1; Pinto, JMA1; Souza, EA1
Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, Setor de Genética e Melhoramento de Plantas, Departamento de Biologia,
Universidade Federal de Lavras
[email protected]
1
Palavras-chave: Antracnose, Colletotrichum lindemuthianum, Glomerella cingulata f. sp. phaseoli, compatibilidade sexual, heterotalismo.
Introdução: A fase assexual do agente causal da antracnose do feijoeiro comum é denominada Colletotrichum
lindemuthianum (Sacc. e Magnus) Briosi & Cavara. C. lindemuthianum é um patógeno altamente variável, fato que
dificulta a obtenção de cultivares resistentes em condições de campo. Um dos principais mecanismos que geram
essa ampla variabilidade é a reprodução sexual. Na sua fase sexual, o fungo é classificado na classe dos Ascomicetos,
sendo denominado Glomerella cingulata f. sp. phaseoli. O controle genético da reprodução sexual nesta espécie ainda
é obscuro e os genes que determinam essa compatibilidade sexual permanecem ainda desconhecidos. Objetivo:
A determinação do controle genético da reprodução sexual é importante para o entendimento da estrutura
populacional em G. cingulata f. sp. phaseoli, o que auxiliará na escolha de estratégias de melhoramento adequadas
no controle da antracnose do feijoeiro. Material e Métodos: Noventa isolados de G. cingulata f. sp. phaseoli foram
coletados em Lavras e Lambari, Minas Gerais no ano de 2009. As linhagens monoascospóricas foram obtidas sem
o uso de indutores, a partir de folhas e vagens de feijoeiro infectadas naturalmente com sintomas característicos
de antracnose do feijoeiro comum. As linhagens foram classificadas como homotálicas, quando na ausência de um
parceiro sexual, houve produção de peritécios férteis. As linhagens compatíveis sexualmente, isto é, que formaram
peritécios férteis na linha de contato entre si foram consideradas heterotálicas. Resultados: De 90 linhagens avaliadas
23,3% foram classificadas como homotálicas, com produção de peritécios férteis sem a necessidade da presença de
um parceiro compatível. 61% das linhagens apresentaram produção de peritécios férteis na linha de contato em uma
ou mais combinações, sendo classificadas como linhagens heterotálicas. 14,4% das linhagens foram classificadas
em ambas as classes, ou seja, produziram peritécios férteis isoladamente e em determinadas combinações.
Conclusões: A obtenção de uma população de G. cingulata f. sp. phaseoli com ampla variabilidade, apresentando
linhagens homotálicas e heterotálicas, permitirá a realização de estudos sobre o controle genético da sexualidade
nesta espécie, contribuindo também para o entendimento da reprodução sexual no gênero Colletotrichum.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
102
Análise da estrutura de virulência de isolados de
Colletotrichum lindemuthianum
Pereira, R1; Mota, SF1; Pinto, JMA1; Ishikawa, FH1; Souza, EA1
Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, Setor de Genética e Melhoramento de Plantas, Departamento de Biologia,
Universidade Federal de Lavras
[email protected]
1
Palavras-chave: Antracnose, Colletotrichum lindemuthianum, Índice de Simpson, Índice de Gleason, Índice de complexidade.
Introdução: A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. and Magn.) Scribner,
destaca-se como uma das principais doenças do feijoeiro comum. C. lindemuthianum é um patógeno altamente
variável, fato que dificulta a obtenção de cultivares resistentes em condições de campo. A redução na vida útil
destas cultivares tem exigido esforços para detecção dessa diversidade genética e patogênica em condições de
campo, visando o emprego de estratégias para a redução da doença. Objetivo: Avaliar a diversidade e a estrutura
de virulência de isolados de C. lindemuthianum coletados em Lambari, Minas Gerais, Brasil. Material e Métodos:
Trinta e seis isolados de C. lindemuthianum foram coletados em Lambari, Minas Gerais nos anos de 2008-2009.
Os isolados foram obtidos a partir de folhas e vagens de feijoeiro infectadas naturalmente por C. lindemuthianum.
Para realização do teste de patogenicidade foi utilizado o conjunto de doze cultivares diferenciadoras, sendo que
os isolados monospóricos foram inoculados em vagens permanecendo incubados por 10-15 dias a 22°C no escuro
para obtenção da suspensão de conídios (1,2 x 106 conídios/mL). As plantas inoculadas permaneceram em câmara
de nebulização a 22°C com 95% de humidade e fotoperíodo de 12 horas por 48 horas. A avaliação foi feita em
casa de vegetação, após 7-10 dias da inoculação, utilizando a escala de notas de 1 a 9. As plantas que receberam
notas de reação à doença entre 1 e 3 foram consideradas resistentes enquanto que aquelas que receberam notas
de 4 a 9 foram consideradas suscetíveis ao patógeno. A diversidade fenotípica foi estimada utilizando os índices
de Simpson, Gleason e de complexidade. Resultados: Foram identificadas seis raças diferentes (1, 64, 65, 66, 73
e 81) entre os 36 isolados utilizados neste estudo. As estimativas para os índices de diversidade de Simpson e
Gleason foram de 0.235 e 1.395, respectivamente e para o índice de complexidade foi de 2.139. As raças 73 e 81
foram as mais complexas causando reação de suscetibilidade em três cultivares diferenciadoras, demonstrando
que a seleção estabilizadora pode estar agindo em favor das raças mais simples com um menor número de
genes de virulência desnecessários. Conclusões: Os resultados obtidos neste estudo reafirmam a existência de
variabilidade nesta espécie, demonstrando a importância de monitorar a variabilidade patogênica visando auxiliar
os melhoristas na escolha das fontes de resistência mais adequadas para o controle da antracnose do feijoeiro.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
103
Caracterização do gene Regulador Global de Nitrogênio
(MpNR) em Moniliophthora perniciosa e sua possível
relação com alterações no nível de nitrogênio no cacaueiro
durante a progressão da doença vassoura de bruxa
Negri, VA1; Teixeira, PA1; Sodek, L2; Pereira GAG1
Laboratório de Genética e Expressão, Departamento de Genética e Evolução e Bioagentes , Instituto de Biologia, Universidade Estadual
de Campinas
2
Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: vassoura-de-bruxa; basidiomiceto; nitrogênio; asparaginase
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente etiológico da doença vassoura de bruxa do cacaueiro
(Theobroma cacao), doença responsável pela grande queda na produção nacional de cacau a partir do fim da
década de 80. M. perniciosapossui ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas fases distintas (biotrófica e
saprotrófica) que se desenvolvem em paralelo aos sintomas desenvolvidos pela planta infectada. O sucesso da
colonização deste fitopatógeno sobre o cacaueiro está diretamente relacionado à sua capacidade de adquirir
fontes de nutrientes necessárias para seu desenvolvimento no hospedeiro. Acredita-se que a disponibilidade de
nitrogênio no apoplasto da planta seja limitada, o que induziria o patógeno a expressar uma variedade de genes
que atuam na obtenção de fontes de nitrogênio secundárias, ou alternativas. Esta regulação é mediada pelo fator
de transcrição denominado “regulador global de nitrogênio”, cuja atividade relaciona-se diretamente à variação
nos níveis de nitrogênio disponíveis para o patógeno na planta hospedeira. Além de controlar o metabolismo
de nitrogênio em fungos, este fator de trancrição possui importante participação na expressão de fatores de
patogenicidade em fitopatógenos. Adicionalmente, a atividade do regulador global também está relacionada
com o evento de transição da fase biotrófica para a saprotrófica em alguns fungos fitopatógenos hemibiotróficos.
Neste contexto, acredita-se que o regulador global de nitrogênio possa exercer importante papel na biologia
de M. perniciosa durante a progressão da vassoura de bruxa. Com o objetivo de verificar a disponibilidade e as
alterações no conteúdo de nitrogênio em cacaueiros infectados, realizou-se a medição por cromatografia líquida
de alta afinidade (HPLC) de amostras de fluído apoplástico coletadas de plantas em diferentes estágios da doença
vassoura de bruxa. Além disso, realizou-se a caracterização e a análise de expressão por Real Time PCR do regulador
global de nitrogênio de M. perniciosa (MpNR). Uma vez que grandes quantidades de asparagina foram detectadas
em plantas infectadas, duas asparaginases (MpASN1 e MpASN2), possivelmente responsáveis por metabolizar este
aminoácido, também foram analisadas Especula-se que o aumento de asparagina esteja relacionado com uma
possível remobilização de nitrogênio que antecederia a morte do tecido infectado como uma tentativa da planta
de deter o patógeno. A possibilidade de esta remobilização atuar como sinal para transição para a fase saprotrófica
do patógeno e a possível participação do gene MpNR neste evento está sendo verificada. Caso a disponibilidade
de nitrogênio realmente influencie na transição de fase em M. perniciosa, a manipulação desse nutriente
no apoplasto através de adubação poderá ser uma interessante forma de controlar a progressão da doença.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
104
Clonagem da lectina ArtinM em vetores para expressão
heteróloga em Saccharomyces cerevisiae
Abbad, SV1,2; Luche, DD1; Roque-Barreira, MC3; Goldman, MHS1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Depto de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade
de São Paulo – USP
2
PPG- Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP
3
Depto. Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
Palavras-chave: ArtinM, clonagem, vetores, expressão.
ArtinM é uma lectina de sementes de Artocarpus integrifolia (jaca), que apresenta importantes atividades
biológicas, destacando-se a indução de migração de neutrófilos, a proteção contra infecção por Leishmania major,
bem como efeito terapêutico contra infecção por Paracoccidioides brasiliensis, entre outros. Para aprimoramento
dos estudos in vitro e in vivo com essa proteína, torna-se necessária a obtenção de ArtinM recombinante em larga
escala, a qual existe em baixa quantidade nas sementes. Em seu estado nativo, ArtinM apresenta-se na forma de
um homotetrâmero de massa molecular de 52kDa, constituído por quatro monômeros de 13kDa cada. Estudos
prévios de expressão heteróloga da proteína indicam que ArtinM purificada a partir de Escherichia coli apresentase na forma monomérica, a qual não é capaz de reproduzir todas as atividades biológicas já descritas. Dessa
forma, a utilização de modelos eucarióticos para a expressão da proteína se torna uma ferramenta importante
na tentativa de obtenção de ArtinM oligomérica e com características semelhantes à nativa. Para isso, foram
construídos os seguintes vetores de expressão em S. cerevisiae: - com origem de replicação epissomal, centromérica,
bem como integrativo; - sob o controle dos promotores: GAL (promotor forte e induzível), GPD (gliceraldeído-3fosfato desidrogenase, promotor médio e constitutivo), e TEF (“translation elongation fator 2 alpha”, promotor
fraco e constitutivo). O cDNA de ArtinM foi amplificado por PCR e clonado nos vetores acima, obtendo-se um
total de nove diferentes vetores para sua expressão heteróloga. Até o presente momento, a expressão dos vetores
epissomais, sob o controle dos 3 diferentes promotores (GAL, GPD e TEF), foram analisados comparativamente.
Os níveis de expressão obtidos com a indução do promotor GAL foram similares ao obtido com o vetor pYES
(Invitrogen), também epissomal. A expressão sob o promotor constitutivo GPD mostrou-se comparável ao obtido
para GAL, apenas sutilmente inferior, surpreendentemente. Da mesma forma, o promotor também constitutivo
TEF, notoriamente um promotor fraco, produziu um nível de expressão pouco inferior ao obtido por GPD, de
modo até inesperado. As análises da expressão, a partir dos vetores centroméricos e integrativos, ainda não
foram concluídas, porém os resultados acima descritos já representam alternativas bastante interessantes para a
expressão de ArtinM. A construção de vetores de expressão, a partir de sequências de uso livre pela comunidade
científica, constitui um importante passo para a produção de ArtinM em larga escala, para fins biotecnológicos.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
105
Diversidade genética em populações de Sclerotinia
sclerotiorum na cultura de soja
Cunha, CPR¹; Nascimento, LB¹; Oliveira, MB¹; Inocêncio, APM¹; Lobo Junior, M²; Petrofeza, S¹
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás
Embrapa Arroz e Feijão, GO-462 km 12, C.P. 179, 75375-000, Santo Antônio, Goiás
[email protected]
1.
2.
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum; mofo branco; microssatélite, enzimas hidrolíticas, grupo de compatibilidade micelial.
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, é um fungo fitopatógeno de ampla distribuição mundial, com pelo
menos 408 espécies de plantas hospedeiras já descritas. A principal via de disseminação da doença é através de
sementes infectadas e não há resistência genética efetiva na grande maioria das cultivares disponíveis de feijão,
soja, algodão, dentre outras culturas, sendo que perdas de até 100% da produção podem ser observadas. No
processo de patogenicidade, este fungo desenvolve dois mecanismos essenciais à infecção, a síntese e a secreção
de ácido oxálico e enzimas hidrolíticas, entre estas Poligalacturonases, Celulases e Xilanases, que facilitam o
processo de invasão degradando componentes da parede celular da planta. A estrutura genética de 50 isolados
de S. sclerotiorum, representando populações de campo da cultura de soja nos Estados de Goiás, Paraná e Minas
Gerais, foi determinada baseada em: (a) Variabilidade genética, estimada através de cinco loci microssatélites;
(b) Grupos de compatibilidade micelial (GCM), e (c) agressividade baseada na produção de enzimas hidrolíticas:
poligalacturonases, celulases e xilanases. Moderado nível de diversidade genética foi observado para as populações
regionais. A diversidade genotípica não diferiu significativamente entre as populações. O teste de Mantel revelou que
a taxa de variabilidade não foi espacialmente correlacionada entre diferentes campos ou atividade das diferentes
enzimas avaliadas. Embora tenham sido identificados vários GCM, a maioria deles consistiu de poucos isolados.
Apoio financeiro: FAPEG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
106
Mitose e comportamento do núcleo em conídios e hifas
de Colletotrichum lindemuthianum utilizando núcleo
marcado com GFP
Ishikawa, FH1*; de Souza, EA1; Read, ND2; Roca, MG2
Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, Setor de Genética e Melhoramento de Plantas, Departamento de Biologia,
Universidade Federal de Lavras
2
Fungal Cell Biology Group, Institute of Cell biology, Rutherford Building, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3JR
* [email protected]
1
Palavras-chave: Proteína fluorescente; fusão de hifas; Microscopia confocal; anastomoses de conídio; migração nuclear.
Introdução: A utilização de proteínas fluorescentes e análise de células vivas têm permitido um grande avanço no
estudo da dinâmica nuclear em fungos filamentosos. Durante os estágios iniciais de desenvolvimento da colônia,
conídios podem germinar e/ou fundir-se por meio de tubos de anastomoses de conídios (CATs). Este fenômeno
tem sido observado em espécies como Neurospora crassa e Colletotrichum lindemuthianum. Acredita-se que os
CATs tenham um importante papel no desenvolvimento da colônia, assim como na transferência de material
genético entre indivíduos diferentes. Posteriormente, as hifas se desenvolvem formando o micélio. Em fungos
filamentosos como N. crassa, Ashbya gossypii, Aspergillus nidulans e Ceratocystis fagacearum são relatados diferente
padrões de divisão mitótica nas hifas vegetativas. Trabalhos desta natureza com C. lindemuthianum são escassos
e os já realizados utilizaram células fixadas, o que dificulta o entendimento da dinâmica nuclear nesta espécie.
Objetivo: Analisar o comportamento de núcleos de C. lindemuthianum em diferentes estágios de desenvolvimento,
utilizando análise de células vivas e núcleo marcado com GFP. Material e Métodos: A divisão mitótica e movimento
nuclear foram analisados em conídios não germinados, conídios germinados e nas hifas. Protoplastos do isolado
LV115 (raça 65) de C. lindemuthianum, foram transformados utilizando o plasmídeo pMF357 (possui o gene de
histona H1-eGFP e para resistência à higromicina). Para quantificação de núcleos por célula germinada e/ ou
em fusão foram amostrados 300 conídios por repetição, em um total de três repetições. Suspensão de conídios
em água destilada (1,2 x 106 conídios/ml) foi colocada em lâminas de cultura de oito células (LabTek II, Nunc)
e incubadas por 24-48 h à ± 20° C. Para avaliação das hifas foi utilizado método do bloco de ágar invertido. As
imagens foram analisadas em microscópio confocal sistema Radiance 2100 equipado com lasers de diodo azul e
íons de argônio (Bio Rad) montados em microscópio invertido (Nikon TE 2000U Eclipse). Resultados: Conídios não
germinados mostraram-se uninucleados (~99%) e não necessariamente sofrem mitose para germinação (~11%
uninucleados) ou fusão (~6% uninucleados). A mitose em conídios fundidos mostrou-se assincrônica e o núcleo
pode migrar através dos CATs logo após a mitose. A movimentação dos núcleos normalmente é lenta, sendo
que exatamente na divisão é que ocorre a maior movimentação. Já a divisão mitótica nas hifas segue diferentes
padrões. A mitose pode ser sincrônica ou parassincrônica (em onda) na ponta das hifas. Na região intercalar da
hifa a mitose ocorre sincronicamente dentro de cada célula, que pode se ramificar e os novos núcleos migrarem
através dessas ramificações. Conclusões: Mitose não é necessária para germinação ou fusão, no entanto, apresenta
importante papel na migração nuclear através dos CATs. Diferentes padrões de divisão ocorrem nas hifas
dependendo do tipo de célula (ponta ou intercalar), padrões semelhantes são descritos para diferentes espécies.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
107
Estudo in silico de enzimas lipase em fungos do
gênero Malassezia: possível participação no processo
patogênico da caspa e dermatite seborréica
Crippa, TO¹; Monteiro-Vitorello, CB², Paulino, LC¹
¹Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC (UFABC)
²Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luís de Queiroz (ESALQ – USP)
[email protected]
Palavras-chave: caspa, dermatite seborréica, lipase, Malassezia, genoma.
Introdução: A pele humana abriga um complexo ecossistema composto por diversas espécies de bactérias e fungos
unicelulares que sob determinadas condições podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento de
doenças de pele, como a caspa e a dermatite seborréica. O desenvolvimento dos sintomas destas doenças está
relacionado a fatores ambientais, estresse e susceptibilidade individual, além da presença de leveduras lipofílicas
do gênero Malassezia. Foi proposto que o papel destes fungos no desenvolvimento das doenças estaria relacionado
a compostos metabólicos derivados da atividade de lipases, que seriam irritantes à pele e ao couro cabeludo.
Objetivos: Contribuir para a compreensão do processo patogênico da caspa e dermatite seborréica através do
estudo in silico de lipases do gênero Malassezia. Métodos: Genes que codificam lipases em Malassezia restricta
foram identificados na sequência parcial de nucleotídeos do genoma da espécie disponível no “Genome Survey
Sequences Database”, através da comparação com a sequência completa do genoma de M. globosa utilizando-se
o algoritmo tBLASTn. Os “contigs” de M. restricta foram analisados utilizando a ferramenta ORF Finder. Lipases
de outras espécies de Malassezia foram obtidas no GenBank e as sequências foram comparadas com o genoma
parcial de M. restricta utilizando tBLASTn ou BLASTp. As lipases identificadas foram classificadas em famílias
considerando a presença de “motifs” característicos e a identidade entre sequências. Reconstruções filogenéticas
foram realizadas com base nas sequências de aminoácidos das lipases, analisando-se espécies do gênero
Malassezia e outros grupos de fungos. Resultados: Foram encontradas sete proteínas diferentes identificadas como
lipases no genoma de M. globosa, cada uma delas apresentando duas cópias idênticas. Quatro pertencem à família
LIP (apresentaram o “motif ” GYSGG) e três à família 3 (“motifs” GHSLG e GHSQG). Foram encontradas ainda
58 proteínas com função ainda não determinada, cujas sequências apresentaram similaridade com lipases. Na
espécie M. restrita, foram identificados quatro genes que possivelmente codificam lipases (cada um com duas
cópias idênticas), sendo que 3 das proteínas correspondentes foram classificadas como membro da família 3 e uma
como da família LIP. Análises filogenéticas revelam principalmente agrupamentos de sequências pertencentes às
mesmas famílias de lipases. Conclusões: Os resultados indicam que há diferenças nas enzimas lipases comparandose espécies do gênero Malassezia. Tais diferenças podem ajudar a explicar a associação das diversas espécies com
as doenças. O trabalho contribuiu também com a anotação de proteínas com função até então desconhecida,
e abrirá portas para novos estudos visando elucidar o processo patogênico da caspa e dermatite seborréica.
Apoio Financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
108
Loss-of-function mutations in the intronic region of
the palB gene of Aspergillus nidulans affected the
pre-mRNA splicing
Trevisan, GL1; Oliveira, EHD2; Peres, NTA2; Vieira, CA1; Martinez Rossi, NM2; Rossi, A1
Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
[email protected]
1
2
Keywords: fungi, gene expression, pH, mRNA splicing, adaptative response
The fungus Aspergillus nidullans grows over a wide pH range and a regulatory system ensures that genes encoding
extracellular enzymes are produced under conditions where they can function effectively. The pH signaling
transduction pathway is mediated by the zinc-finger transcription factor PacC (that acts in metabolic events
involved in the adaptive response to ambient pH) and by the products of the six pal genes (A, B, C, F, H e I), which
are putative members of a cascade promoting the PacC proteolytic activation. The first signaling proteolysis is
mediated by PalB, a cysteine protease, in a pH dependent manner. Loss-of-function mutations in the pacC or in
the pal genes lead to a defective regulation of the adaptive response to extracellular pH or to nutrient availability.
This study evaluated the expression of the palB gene of A. nidulans in response to culture conditions. Parental
pabaA1 and mutant pabaA1 palB7 strains were cultivated for 17 hours, in YAG (yeast extract) or minimal medium
or under limiting or sufficient phosphate, both cultures at acid (5.0) or alkaline (8.0) pHs. The sequencing of palB7
allele revealed the presence of 5 nucleotide substitutions distributed in intron and exon regions. These mutations
evidenced changes in the secondary structure of the mutant pre-mRNA as compared to the control. To assess the
effect of these mutations in the expression of gene palB, we performed qualitative RT-PCR assays using primers
surrounding the mutated intronic sequence. The pabaA1 palB7 strain showed two mRNA products (a pre-mRNA
form and a spliced one) in minimal medium under limiting or sufficient phosphate, and in YAG medium under
sufficient phosphate (both cultures at acidic or alkaline pH). In YAG medium under limiting phosphate no intron
processing was observed. The parental strain presented only the spliced form in minimal medium. In YAG medium
the unspliced form was present under sufficient phosphate (pH 5.0), while in sufficient (pH 8.0) or limiting
phosphate (pH 5.0 or 8.0) two products were observed: one unspliced and one spliced mRNA. These results suggest
that mutations in the intron sequences are affecting the palB mRNA processing, depending on the culture condition.
Financial support: FAPESP, CNPq, CAPES and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
109
Caracterização morfológica e molecular do patógeno
da fusariose de pimenta-do-reino no Brasil
de Barros, AP; Pessoa, EC; de Souza, CRB; Darnet, S¹
¹Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA
[email protected]
Palavras-chave: Filogeografia, Fusarium solani f. sp. piperis; ITS; TEFα; Calmodulina.
Fusarium solani f. sp. piperis é o agente causal da podridão-das-raízes e do secamento-dos-ramos da pimenteirado-reino (Piper nigrum). A doença é uma ameaça a regiões de exploração econômica da cultura, visto que ocasiona
significativas perdas de produção, por reduzir o ciclo de vida da planta. O conhecimento da estrutura da população
deste patógeno é relevante para investigar os mecanismos através dos quais essas populações respondem às
barreiras agronômicas e estabelecer estratégias de melhoramento da pimenteira-do-reino. Neste sentido, este
trabalho objetivou caracterizar morfológica e geneticamente amostras oriundas das principais áreas produtivas
de pimenta-do-reino no Estado do Pará e Espírito Santo. Plantas infectadas coletadas em 16 localidades foram
utilizadas para o isolamento do patógeno. Para avaliar o polimorfismo genético dos isolados utilizou-se marcadores
moleculares para a região do Espaçador Interno Transcrito (ITS) 1 e 2 e a região 5,8S do DNA ribossômico nuclear,
Fator de elongação da tradução (TEF1-alfa) e gene da calmodulina (Cmd) e fez-se o alinhamento múltiplo destas
seqüências com seqüências disponíveis nos banco de dados. A análise filogenética das seqüências mostrou pouca
variação nucleotídica indicando proximidade genética entre os patógenos isolados a partir de pimenteiras-do-reino.
E o alinhamento com seqüências obtidas dos bancos de dados mostrou uma proximidade filogenética de Fusarium
solani f. sp. piperis com outros fusários encontrados no Brasil (Fusarium brasiliensis, phaseoli e cuneirostrum), que
também são patógenos de plantas cultivadas de importância econômica, reforçando a inclusão da espécie no clado
3, endógeno da América do Sul, proposto nos trabalhos anteriores de taxonomia do gênero Fusarium. A partir
destas análises confirmou-se a existência de uma única cepa do patógeno distribuída pelo Brasil, indicando que sua
disseminação foi realizada junto com a propagação das mudas das plantas. Os resultados sugerem que este patógeno
poderia ser endógeno da América do sul que se adaptou a planta, tornando-se patógeno especifico da mesma.
Apoio Financeiro: CNPq e UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
110
Estudo da diversidade de Mycosphaerella Fijiensis
por meio de Retrotransposon-microssatelite amplified
polymorphysm (REMAP)
Paixão, RV1,3; Queiroz, CB1; Gasparotto, L2; Sousa, NR 1; Miranda, EC1,3; Silva, GF1
Laboratório de Biologia Molecular - Embrapa Amazônia Ocidental- CPAA
Laboratório de Fitopatologia - Embrapa Amazônia Ocidental- CPAA
3
Universidade do Estado do Amazonas – UEA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sigatoka-negra, REMAP, diversidade, retrotransposons, Mycosphaerella fijiensis
A sigatoka-negra é uma doença foliar da bananeira (Musa spp.) causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis
Morelet que causa a necrose do limbo foliar e inibe a capacidade fotossintética da planta, afetando o crescimento
e a produtividade das bananeiras provocando perdas de até 100% da produção. A melhor forma de combater a
doença é o melhoramento visando à resistência, que por sua vez pode ser auxiliado pelo estudo da diversidade
do patógeno por meio de marcadores moleculares. O marcador REMAP (Retrotransposon-microsatellite amplified
polymorphism) é baseado na amplificação entre retrotransposons e microssatélites e apresenta alto grau de
polimorfismo devido à grande abundância destes elementos transponíveis nos genomas bem como a sua habilidade
de criar novas cópias. Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo analisar a diversidade de M. fijiensis
de diferentes estados brasileiros por meio da técnica REMAP. Foram analisados 36 isolados de sete Estados (AM,
SP, MT, PA, RR, RO, AC) por meio de três combinações retrotransposon-microssatélite. As amplificações foram
realizadas usando um par de primer LTR, descritos para M. fijiensis (LTR Mf F GCGCTTAGCGTTAGGCTAACT
e LTR Mf R- CGTGTAGCCTCTTTGGCCCTA) e três diferentes sequências de microssatélites (ISSR): 808 (AG)8C;
835 (AG)8YC; 864 (ATG)6. Foram obtidas 63 bandas, 58 polimórficas, apresentando assim um percentual de
polimorfismo de 92 %. As combinações usando os primers 808 e 864 apresentaram 96 e 95,4 % de polimorfismo
respectivamente. Em contrapartida, a interação com o microssatélite (AG)n foi a menos polimórfica com um
percentual de 81,25% de polimorfismo. Os valores da similaridade genética estimados pelo coeficiente de Jaccard
variaram de 0,37 a 0,94. O dendrograma gerado agrupou os isolados em quatro grandes grupos sem completa
discriminação por região de coleta. Exceto por um subclado gerado apenas por isolados provenientes de Roraima.
A partir dos dados obtidos, o marcador REMAP mostrou-se eficiente em detectar diferenças entre os indivíduos
analisados, confirmando ser uma técnica promissora para estudos de diversidade genética de M. fijiensis.
Fonte Financiadora: EMBRAPA e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
111
Análise da diversidade da população de Mycosphaerella
fijiensis do Brasil por meio do polimorfismo entre
microssatélites (AG)n, (ACC)n e (ATG)n
Souza, RF1,4; Miranda, EC1,4 ; Gasparotto, L2; Hannada, RE3; Sousa, NR1; Silva, GF1
Laboratório de Biologia Molecular - Embrapa Amazônia Ocidental – CPAA
Laboratório de Fitopatologia - Embrapa Amazônia Ocidental – CPAA
3
Instituto de Pesquisa da Amazônia – INPA
4
Universidade do Estado do Amazonas - UEA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sigatoka-negra, ISSR, diversidade, Mycosphaerella fijiensis, bananicultura.
A importância da cultura da bananeira deve-se à sua relevância tanto social quanto econômica para o país, visto
que representa uma fonte de alimento para a população e de trabalho para pequenos e grandes produtores. O fungo
Mycosphaerella fijiensis Morelet é o agente causal da Sigatoka-negra que atualmente é considerada como a principal
doença limitante da produtividade da bananicultura no mundo. O objetivo do trabalho foi analisar a diversidade de
isolados coletados em sete Estados do Brasil por meio do polimorfismo entre microssatélites dinucleotídeo (AG)
nT e, trinucleotídeos (ACC)n e (ATG)n. No total foram estudados 189 isolados dos Estados do Acre (AC), Amazonas
(AM), Mato Grosso (MT), Para (PA), Roraima (RR), Rondônia (RD) e São Paulo (SP). Inicialmente foram utilizados
três oligonucleotídeos UBC 807, 861 e 864. As reações de PCR foram realizadas segundo Pereira e colaboradores
(2008) em volume total de 15µL com 0,3µM de primer, 50ng de DNA, 2mM de MgCl2, 0,5mM de dNTP e 1U de Taq
DNA-polimerase. As condições de amplificação foram: 94ºC por 3 min, 40 ciclos a 94ºC por 30 s, anelamento de
acordo com cada primer por 1 min e 72ºC por 2 min, extensão final a 72ºC por 7 min. O número de bandas por
repetição analisada variou de nove (9) a treze (13) com percentual de polimorfismo de 100%. A similaridade genética
estimada pelo coeficiente de Jaccard variou de 0,35 a 1,00. Com base na análise do dendrograma os isolados foram
estruturados em 10 grupos compostos por indivíduos de diferentes regiões sem nenhuma aparente correlação
entre similaridade genética e Estados de coleta dos isolados. O polimorfismo foi capaz de diferenciar 89,4% dos
isolados, apesar de ter sido considerado somente três diferentes oligonucleotídeos. Os resultados preliminares
sugerem que o marcador ISSR poderá ser aplicado para detectar diferenças entre isolados brasileiros de M. Fijiensis.
Financiador: CNPq.
Apoio: Embrapa da Amazônia Ocidental - CPAA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
112
Caracterização de isolados de Mycosphaerella fijiensis
de diferentes regiões do Brasil por meio de VNTR
Paixão, RDV1; Gasparotto, L2; Hannada, RE 3; Sousa, NR1; Silva, GF1
Laboratório de Biologia Molecular - Embrapa Amazônia Ocidental - CPAA
Laboratório de Fitopatologia - Embrapa Amazônia Ocidental- CPAA
3
Instituto de Pesquisa da Amazônia - INPA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sigatoka-negra, VNTR, diversidade, Mycosphaerella fijiensis, minisatélites.
A sigatoka-negra da bananeira (Musa spp.) é causada pelo fungo Mycosphaerela fijiensis Morelet, que destrói a
área foliar inibindo a capacidade fotossintética da planta, acarretando em baixa produção de frutos, tornandose assim a mais importante doença da banana no mundo. Para auxiliar na seleção de plantas resistentes é de
fundamental importância o conhecimento da diversidade do patógeno, que por sua vez podem ser avaliados com
o auxilio de marcadores moleculares. Marcadores baseados em locos hipervariáveis de minisatélites ou Variable
Number of Tandem Repeat (VNTR) possui um caráter altamente polimórfico e tem sido amplamente empregado
no melhoramento de plantas e analises de diversidade de microrganismos. Deste modo o objetivo deste estudo foi
caracterizar indivíduos de M. fijiensis de diferentes regiões do Brasil utilizando o marcador VNTR. Foram analisados
184 isolados de sete estados (AM, SP, MT, PA, RR, RO, AC) por meio de seis locis de VNTR desenvolvidos para M.
fijiensis: 3959, 3831-2, 3786, 1333, 0705, 0252. Cada reação de PCR foi realizada em volume final de 20µL, contendo
50ng de DNA genômico, 5 µM de cada primer, tampão 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP e 0,2 U de Taq
Polymerase. As reações foram realizadas utilizando o seguinte programa: Desnaturação inicial de 94ºC por 1 min, 30
ciclos de 94ºC por 30 s, 65ºC por 30 s, 72ºC por 30 s, seguidos de um alongamento final de 10 min a 72ºC e os produtos
da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%. Foi obtido um total de 16 alelos com padrões de
bandas que variavam de 100 a 500 pares de base. Os minissatélites 1333, 3786, 3831-2 e 3959 apresentaram 3, 4, 4 e 3
alelos respectivamente. Entretanto os loci 0252 e 0705 não apresentaram polimorfismo na população em estudo. Os
valores da similaridade genética estimados pelo coeficiente de Jaccard variaram de 0,36 a 1. O dendrograma obtido
pelo método UPGMA distribuiu os isolados em cinco grupos sem discriminação por região. Baseados nestes dados,
não existem padrões óbvios da distribuição geográfica dos isolados, assim como o alto nível de similaridade entre
os isolados de diferentes Estados do país corrobora a hipótese de sua disseminação partir da região norte do Brasil.
Fonte Financiadora: EMBRAPA e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
113
Caracterização genética de Botrytis cinerea em
vinhedos de Castilla y León na Espanha
Costa, TMM 1; Guijarro, R2; Hernández, M2; Zabalgogeazcoa, I3; Benito, EP1
Centro Hispano Luso de Investigaciones Agrarias (CIALE). Universidad de Salamanca. Campus Villamayor. C. Río Duero, 12. 37185.
Villamayor. Salamanca. España
2
Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León. Ctra. De Burgos, km. 119. Finca Zamadueñas. 47071. Valladolid
3
Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología, CSIC. Apartado 257, 37008 Salamanca. España
[email protected]
1
Palavras-chave: Botrytis cinerea, AFLP, elementos transponíveis, genética de populações e fungo fitopatógeno
Introdução: Botrytis cinerea é um fungo necrotrófico que ataca mais de 200 espécies de plantas e causa a enfermedade
conhecida como mofo cinzento. Na Espanha, na comunidade autónoma de Castilla y León, esse fungo é responsável
por perdas, em alguns anos, de até 50% na produção de uva. Para um controle eficiente desse fungo fitopatogênico,
é necessário estudar sua diversidade genética e a estrutura genética das populações naturais do patógeno. Para
responder a essas questões, analizamos 286 isolados de Botrytis cinerea coletados em cinco Denominações de
Origem do Vinho (D.O.) (Ribera de Duero, Rueda, Toro, Cigales, Arribes del Duero) e outra região (Sierra de Francia)
que ainda não tem o certificado de D.O. As uvas coletadas provinham de 8 variedades de uva e foram coletadas em
2002 e 2007. Para a caracterização da diversidade genética usamos os marcadores moleculares AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) e os elementos transponíveis (Boty e Flipper). Usamos três combinações de
iniciadores que geraram 388 marcadores. A análise indica que existe um grau de variação genética muito elevada, pois
(1) 98.72% dos marcadores são polimórficos; (2) Entre os 286 indivíduos, identificamos 283 haplótipos e (3) O valor
de diversidade genética de Nei (h) é muito elevado (aproximadamente 0,24). Apesar da elevada diversidade genética
sugerir pouca incidência de clonalidade, obtivemos evidências de reprodução clonal, porque foram observados
em todos os vinhedos grande atividade de esporulamento do micélio do mofo cinzento, também foi detectado
desequilíbrio de ligamento através da análise do Índice de Associação e foram encontrados algumas linhagens
clonais na mesma planta ou no mesmo vinhedo. Para a análise AMOVA, as amostras foram separadas segundo as
populações por 6 regiões, 8 variedades de uva e por dois anos de coleta de amostras. Quando comparamos o ano de
coleta e as variedades de uva, o resultado foi pouca diferenciação genética (Fst=0.03 e Fst=0.042, respectivamente).
Na análise por D.O. o resultado do Fst=0.0503, mostra uma tendência a uma diferenciação genética moderada.
Também valoramos a presença ou ausência de dois tipos de retrotransposons, Boty e Flipper. A maioria dos
isolados apresentam transposones: mais de 60% dos isolados eram do tipo Boty, e que 37% eram do tipo Transposa
(Boty + Flipper). Identificamos apenas 2 isolados do tipo Flipper e apenas 1 isolado do tipo Vacuma (que não tem
nenhum dos transposons). Esses resultados podem indicar que a variabilidade genética observada pode estar
relacionada com a presença e atividade dos elementos transponíveis, que causam importantes variações evolutivas.
Apoio financeiro: ITACyL SA-02-C2-1
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
114
Avaliação da expressão de uma O-manosiltransferase
em função do pH ambiente e fonte de nutriente no
dermatófito Trichophyton rubrum
Mendes, NS1; Peres, NTA1; Jacob, TR1; Martinez-Rossi, NM1; Mazucato, M1 ; Rossi, A2
Departamento de Genética
Departamento de Bioquímica e Imunologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Trichophyton rubrum, manosiltransferase, pH, expressão gênica.
O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo patogênico e o principal agente infeccioso isolado de lesões de pele
e unhas em humanos. Nos estágios iniciais da infecção, o fungo deve se adaptar ao microambiente hospedeiro,
inclusive ao pH ácido da pele, e ativar genes que possibilitem a utilização de macromoléculas presentes no tecido.
Desta maneira, durante a infecção e em resposta ao meio ácido da pele, os dermatófitos ativam a expressão de
genes que codificam enzimas com atividade ótima em pH ácido. Estas enzimas degradam substratos queratinosos
ou não, liberando peptídeos cuja metabolização leva à alcalinização do meio. Em resposta ao pH alcalino, ocorre
então uma ativação de genes cujos produtos apresentam atividade em pH alcalino, e repressão daqueles com
atividade em pH ácido. Em Aspergillus nidulans e em Neurospora crassa, a resposta adaptativa ao pH ambiente
leva à glicosilação da fosfatase alcalina secretada. Além disso, a linhagem mutante palB7 de A. nidulans secreta
uma fosfatase ácida com nível reduzido de manose e N-acetilgalactosamina em relação à linhagem controle.
Ainda, o gene que codifica para uma manosiltransferase foi regulado negativamente nesse mutante, sugerindo
que o gene palB, um dos componentes da via de sensoriamento do pH, tenha um papel no processamento póstranscricional de enzimas secretadas pelo fungo. Dada a importância clínica do T. rubrum e o envolvimento
das modificações pós-traducionais na adaptabilidade ao pH ambiente, o objetivo deste trabalho foi avaliar a
relação entre o processo de glicosilação e a resposta ao pH extracelular em T. rubrum, analisando inicialmente
a expressão do gene que codifica a enzima O-manosiltransferase (O-Man), por meio da análise da transcrição
reversa em tempo real por PCR (qRT-PCR). Após germinação em meio Sabouraud por 72 h, no qual o pH era
aproximadamente 7,0, o micélio foi transferido para meio mínimo pH 5,0, contendo glicose e glicina. Após 30
min e 24h observou-se que o pH do meio era alcalino, enquanto que nos tempos de 3 e 6h o meio continuava
ácido. Estes resultados sugerem que após 30 min o fungo ainda estava respondendo ao meio neutro em que se
encontrava, sugerindo uma resposta adaptativa tardia ao sensoriamento do pH extracelular. Em contrapartida,
após 24h a alcalinização do meio foi consequente da metabolização da glicina. Observou-se ainda uma maior
expressão da O-Man nos tempos de 30 min e 24 h, em relação aos tempos intermediários. Quando o meio foi
tamponado em pH 5,0, o perfil de expressão se manteve, porém em níveis mais baixos. Estes resultados sugerem
que a metabolização da glicina induz uma maior expressão do gene da O-manosiltransferase, possivelmente
contribuindo para os processos de glicosilação das enzimas secretadas em resposta à fonte de carbono e pH ambiente.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq e FAEPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
115
Efeito da Hiperexpressão da Dihidrolipoil
Desidrogenase na Estabilidade do DNA Mitocondrial de
Saccharomyces cerevisiae
Santos-Silva, NF1; Tahara, EB2; Kowaltowski, AJ2; Barros, MH1
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNA mitocondrial; dihidrolipoil desidrogenase; Saccharomyces cerevisiae.
O DNA mitocondrial, multi-cópia, de Saccharomyces cerevisiae é caracterizado por um alto conteúdo de A+T e um
baixo conteúdo de C+G (aproximadamente 30%), organizado sob a forma de nucleóides, uma associação entre o
material genético e um conjunto de proteínas que promovem estabilidade a esse genoma. O DNA mitocondrial
contém, além de um grande número de ORFs, os genes que codificam uma série de proteínas mitocondriais: as
subunidades I, II e III da citocromo c oxidase; as subunidades 6, 8 e 9 da ATP sintase; o apocitocromo b; e uma
proteína ribossomal (Var1p). Como sete dessas oito proteínas estão relacionadas com i) o transporte de elétrons pela
cadeia mitocondrial, com ii) a formação do gradiente eletroquímico e com iii) a fosforilação oxidativa, a perda da
funcionalidade desse genoma implica na exibição de um fenótipo repiratório-incompetente em S. cerevisiae. Dessa
forma, decidimos estudar a influência da inativação e da hiperexpressão da dihidrolipoil desidrogenase (uma das
proteínas que participam do complexo nucleóide) na estabilidade do DNA mitocondrial desse organismo. Para tal,
utilizando a linhagem BY4741 de S. cerevisiae, determinamos a porcentagem de colônias respiratório-competentes
formadas pelos transformantes WT + YEp351 e WT + YEp351/LPD1, e pelo mutante lpd1D – todos cultivados por até
28 dias em YPD líquido (extrato de levedura 2%; peptona 2%; glicose 2 ou 0,5%) - através da replicação das colônias
formadas em meio YPD sólido (YPD líquido suplementado com ágar bacteriológico 2%) em YPEG sólido (extrato
de levedura 2%; peptona 2%; etanol 2%; glicerol 2%; ágar bacteriológico 2%), um meio seletivo para respiração. Os
controles para a verificação da presença do plasmídeo YEp351 foram devidamente realizadas replicando-se as
colônias em meio WO sólido (base nitrogenada 0,67%; glicose 2%; ágar 2%) suplementado com His, Met e Ura, já que
a marca de seleção do plasmídeo é Leu. Verificamos que a alta instabilidade do DNA mitocondrial proporcionada
pela ausência da dihidrolipoil desidrogenase, sobretudo nos primeiros 14 dias de cultura, e a instabilidade basal
observada em uma levedura selvagem, são totalmente revertidas pela hiperexpressão dessa proteína. Podemos
concluir, portanto, que a hiperexpressão da dihidrolipoil desidrogenase, uma dentre as mais de vinte e duas proteínas
que participam do complexo nucleóide, é capaz de aumentar a estabilidade do genoma mitocondrial de S. cerevisiae,
indicando o seu papel central na manutenção funcional do fenótipo respiratório-competente nessa levedura.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
116
Identificação de chaperones moleculares do fungo
aquático Blastocladiella emersonii
Georg, RC1,2; Gomes, SL1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
2
Palavras-chave: chaperones moleculares, proteínas de choque térmico, EST, cDNA, Blastocladiella emersonii.
As chaperones moleculares constituem um grupo de proteínas relacionadas pela sua função de auxiliar o
enovelamento protéico na célula, tanto em condições fisiológicas quanto em condições de estresse. As chaperones
podem ser classificadas em quatro famílias protéicas: as proteínas de alto peso molecular, que variam entre 83-90
kDa; a família das Hsp70, variando entre 66-78 kDa; a família das Hsp60, e um grupo diversificado variando entre
15-40 kDa, que são conhecidas como proteínas de baixo peso molecular (sHsp). Com o intuito de identificar quais
chaperones B. emersonii possui e compreender melhor a biologia deste fungo, utilizamos dados de seqüenciamento
em larga escala de cDNAs (ESTs) de B. emersonii previamente obtidos pelo nosso grupo. Para este projeto de
sequenciamento foram construídas bibliotecas de cDNAs a partir de mRNAs de células de B. emersonii mantidas
em condições fisiológicas ou em condições de estresse. Realizamos uma busca por ESTs codificando chaperones
moleculares no transcriptoma parcial de B. emersonii utilizando a ferramenta blastX. Através desta análise
identificamos 78 unigenes codificando chaperones moleculares, sendo detectados representantes das quatro
principais famílias. A família das Hsp40, que é constituída por proteínas que possuem um domínio J, apresentou
17 membros distintos. A família das Hsp40 conjuntamente com a família de PPIases (Peptidil-prolil-cis-transisomerases) foram as que apresentaram o número mais diverso de membros. Dentre os membros da família das
Hsp60 encontrou-se as chaperoninas Hsp60 e Hsp10, além de todas as oito subunidades da chaperone mitocondrial
TriC/CCT, o complexo eucariótico homólogo às chaperoninas Hsp60/10 presentes no citoplasma. A família das
Hsp70 apresentou 10 membros distintos, similar ao observado em Saccharomyces cerevisiae. Observamos também
a presença de uma Hsp90 de retículo endoplasmático que ainda não havia sido descrita em fungos. Dos 78
unigenes associados com chaperones moleculares, 51 foram observados nas bibliotecas de cDNA de estresse, 69
nas bibliotecas de cDNA normais (condições fisiológicas) e 41 em ambas. Considerando que foram seqüenciadas
bem menos ESTs das bibliotecas de estresse (37%) do que das bibliotecas normais (63%), esses dados sugerem
que houve um enriquecimento de ESTs de chaperones moleculares nas bibliotecas de estresse, como esperado.
Conclusões: B. emersonii possui pelo menos 78 unigenes codificando chaperones moleculares que compreendem
todas as famílias conhecidas. Acreditamos que com o seqüenciamento do genoma de B. emersonii novas chaperones
serão identificadas pois para a nossa análise foi utilizado apenas dados do transcriptoma parcial do fungo.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
117
Caracterização do gene Clmfs1 que codifica uma
proteína transportadora da Principal Superfamília
Facilitadora (MFS) em Colletotrichum lindemuthianum
Santos, CMA1; Pereira, MF1*; Castanon, FS1; Araújo, EF1; Queiroz, MV1; Bazzolli, DMS1
Laboratório de Genética Molecular de Micro-organismos, Departamento de Microbiologia, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa-UFV.
[email protected]
1
Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum; antracnose; transportadores de membrana MFS.
Introdução: Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose no feijoeiro. Na natureza, os fungos
fitopatógenos são constantemente expostos a uma grande variedade de compostos tóxicos, requerendo estratégias
para se proteger da exposição a essas substâncias. Neste contexto, proteínas transportadoras de membrana, como as
pertencentes à família MFS, podem estar envolvidas na prevenção ou minimização da toxicidade desses compostos
à célula do fungo. Objetivos: Este trabalho teve como objetivo isolar, caracterizar e analisar a regulação do gene
mfs1, que codifica uma proteína transportadora da família MFS em C. lindemuthianum. Metodologia e resultados:
O gene mfs1 foi isolado a partir da triagem de um banco genômico de C. lindemuthianum LV49 (raça fisiológica
81), utilizando uma sonda homóloga de DNA com 408 pb que codifica uma sequência parcial do transportador
MFS. Foram isolados sete fagos recombinantes, dos quais dois foram selecionados para caracterização, lClmfs1
e lClmfs7. O fago recombinante lClmfs7 apresentou um fragmento de DNA de 7.2 kb SalI que continha o gene
Clmfs1. Este fragmento foi purificado e subclonado em vetor pBluescript II KS- e submetido ao sequenciamento.
O gene apresentou um tamanho de 2600 pb, com uma região promotora apresentando cis elementos importantes
envolvidos com a regulação da transcrição em genes fúngicos e é cópia única no genoma de C. lindemuthianum, como
foi observado pela técnica de Southern blotting. A sequência deduzida da proteína Clmfs1 apresentou similaridade
com transportadores MFS de Aspergillus furmigatus (67%) e Aspergillus flavus (80%), nos indicando se tratar de uma
possível proteína transportadora de açúcar com 12 domínios transmembrana. A técnica de RT-PCR foi utilizada para
analisar a expressão de Clmfs1 e houve diferença no perfil de expressão do gene Clmfs1 quando o fungo foi cultivado
em meio BDA e BDA com extrato de folhas do feijoeiro ao longo de 12 horas de cultivo. Conclusão: O avanço nos estudos
com transportadores MFS em C. lindemuthianum permitirá um melhor conhecimento dessas proteínas, visto que na
literatura temos poucos trabalhos sobre transportadores em fungos fitopatógenos e estes podem estar diretamente
ligados à viabilidade do fungo e desta forma assegurar a capacidade destes em causar doença no hospedeiro.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
118
Análise de leveduras isoladas na Lagoa Maior em Três
lagoas/MS capazes de produzir amilases
Souza, CP²; Sá, FVJ¹; Passini, MRZ¹; Blini, RC¹; Guerra, OG¹
¹Laboratório de Genética Molecular e Microorganismos/ Biotecnologia, Departamento de Ciências Naturais, Campus de Três Lagoas,
Universidade Federal Do Mato Grosso do Sul
²Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Ciências Naturais, Campus de Três Lagoas, Universidade Federal Do Mato
Grosso do Sul
[email protected]
Palavras-chave: Amilase, Biodiversidade do cerrado, Biotecnologia, Leveduras, Solo.
As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande importância na biotecnologia
atual, pois, elas apresentam amplo campo de aplicações. As amilases ocorrem amplamente em animais, plantas
e microrganismos. Entretanto, devido às vantagens que oferecem, como menor tempo de produção, as amilases
microbianas têm a preferência do mercado de enzimas. Dentre os microrganismos estão, as leveduras, que
compõem um dos grupos mais importantes de microorganismos utilizados em processos biotecnológicos.
A variação de espécies de microorganismos da biodiversidade do Cerrado ainda é pouco estudada, mais é
extremamente diversificada, e suas ocorrências ainda são poucos explorados cientificamente. Objetivou-se
com este trabalho o isolamento de linhagens de leveduras da biodiversidade do Cerrado que forem capazes de
degradar amido como única fonte de carbono. Foram coletados 250 g de solo em cinco pontos diferentes da Lagoa
Maior, em Três Lagoas/MS, para que ocorresse o isolamento leveduras produtoras de amilases. Colocaram-se
dez gramas de cada uma das cinco amostras de solo separadamente em 100 ml de meio mínimo (meio S) líquido
para levedura, acrescido de antibiótico, utilizando como única fonte de carbono o amido cru, em concentração
de 5%. Após a semeadura, as amostras foram acomodadas em temperatura ambiente e agitadas manualmente
em intervalos de meia em meia hora em período diurno por 72 horas. Após incubação, transferiu-se 500 µl do
sobrenadante de cada amostra para nova incubação em meio mínimo liquido, estes também foram acomodados
em temperatura ambiente e agitados manualmente em intervalos de meia em meia hora em período diurno
por 72 horas. Posteriormente, foram plaqueados 100 µl de cada amostra a em meio mínimo (meio S) sólido para
levedura. As placas foram incubadas em estufa BOD a 28ºC por 3 dias. Após o crescimento as placas foram abertas
e emborcadas sobre outra contendo cristais de iodo sublimado. As linhagens de bactérias que promoverem a
degradação do amido geraram um halo incolor ao redor das colônias, sendo que o meio de amido não degradado
encontrava-se azul violeta. Todas as amostras apresentaram halos evidenciando a produção de amilases,
entretanto houve variação no número e forma das colônias crescidas. A amostra 4 apresentou alta atividade
enzimática, exibindo potencial biotecnológico. Concluiu-se que existem linhagens de levedura isoladas da
biodiversidade do Cerrado que produziram algum tipo de amilases que puderam ser expressas e excretadas in vitro.
Apoio financeiro: UFMS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
119
Monitoramento da população de leveduras presente
nos processos de fermentação alcoólica industrial por
meio de marcadores moleculares
Soares, ML1; Barbosa Neto, AG1,4; Silva, PKN1; Souza, RB4; Menezes, JAS4; Morais Jr., MA3,4; Brasileiro, BTRV2,4
Estudante do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas, do Centro de Ciências Biológicas e Saúde - Universidade Católica de
Pernambuco
2
Professora do Centro de Ciências Biológicas e Saúde – Universidade Católica de Pernambuco
3
Professor do Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco – Recife/PE
4
Genetech Bioprodutividade - Desenvolvimento, Pesquisa e Consultoria em Biotecnologia
[email protected]
1
Palavras-chave: Tipagem genética, PCR-fingerprinting, (GTG)5, Acompanhamento microbiológico, Leveduras industriais
A demanda do etanol, como importante combustível renovável, vem aumentando ao longo dos anos, e o
aperfeiçoamento e o monitoramento da fermentação se tornam essenciais para a otimização do processo. Nosso
grupo aperfeiçou o uso de uma série de marcadores moleculares baseados em análise de DNA e o objetivo do
presente trabalho foi o de comprovar a eficiência dos mesmos a partir da análise das leveduras presentes em
processos industriais de diferentes destilarias nas safras 2008/2009 e 2009/2010. Os resultados de identificação
molecular foram relacionados com a análise da capacidade fermentativa da biomassa industrial com vistas a
comprovação da eficiência desses marcadores no monitoramento industrial. As coletas do mosto fermentado
foram realizadas em diferentes destilarias e as amostras transportadas para o laboratório da empresa Genetech,
Recife-PE. Após a diluição, as amostras foram semeadas em placas de Petri contendo o meio WLN com verde
de bromocresol e antibióticos, e incubadas a 33ºC por cinco dias. As colônias de levedura foram classificadas
quanto à morfologia e fotografadas, cultivadas em meio YPD e submetidas à extração de DNA total pelo método
do fenol-clorofórmio. As análises moleculares foram realizadas pelos métodos de DNA-fingerprinting utilizando
o iniciador (GTG)5 e ribotipagem por PCR. Em paralelo, a biomassa daquelas amostras foi coletada, lavada e
submetida a ensaios fermentativos conduzidos em mosto sintético a 33ºC sem agitação por seis horas, sendo
avaliadas quanto aos parâmetros industriais e a capacidade de conversão sacarose-etanol. Os resultados de
tipagem molecular revelaram a presença de diferentes perfis de Saccharomyces cerevisiae e de diferentes espécies
de levedura contaminante que foram distintos nas diferentes destilarias utilizadas. Não houve relação entre as
populações de destilarias que utilizaram apenas caldo de cana, assim como a especificidade para as destilarias
que utilizaram melaço. Dentre as espécies contaminantes do processo destacou-se a Dekkera bruxellensis que
apresentou episódios de contaminação com contagem celular superior a de S. cerevisiae em várias amostras.
Entretanto, os ensaios fermentativos indicaram que a presença de leveduras contaminantes selvagens nem sempre
foi relacionada com a queda da eficiência da fermentação da biomassa. Os resultados possibilitaram concluir que
a tipagem genética constitui excelente ferramenta na identificação e acompanhamento das leveduras residentes,
auxiliando na otimização do processo industrial com a indicação das leveduras que realmente causam problemas
de queda de rendimento e auxiliando na separação dos fatores bióticos e abióticos que podem levar a quedas no
rendimento fermentativo industrial.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
120
Caracterização de mutantes Burkholderia sp. TN5
quanto ao antagonismo a microrganismos patogênicos
Neves, AAC1; Mano, ET1; Umezaki, SA1; Ferreira, A2; Araújo, WL1
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP, Brasil.
Departamento de Genética, ESALQ/USP, Piracicaba, SP
E-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: agentes de biocontrole, produção de antibióticos, análise genética
O crescente interesse por microrganismos produtores de antibióticos envolve a utilização como agente no
biocontrole e a descoberta de novos compostos mais eficazes que os existentes atualmente. Portanto, ferramentas
de biologia molecular aplicada a estudos de agentes de biocontrole, podem apresentar um papel importante na
elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na síntese, secreção e modificação de moléculas de interesse
farmacêutico e industrial. Sendo assim, neste trabalho, foi selecionado um isolado de Burkholderia sp. (115R-B8),
endofíticos de cana-de-açúcar capaz de inibir o fungo Fusarium oxysporum, Ceratocystis paradoxa, Coletotrichum
sp., e o oomiceto Phytophora parasidica. A partir deste isolado 115R-B8, foram obtidos 1788 mutantes por meio
da inserção aleatória do transposon Tn5, destes 479 já foram submetidos ao teste fenotípico e 14 mutantes que
deixaram de inibir Fusarium oxysporum foram selecionados. Posteriormente, estes 14 clones foram avaliados
quanto à capacidade de inibir os demais microrganismos. Foi observada mudança no padrão de inibição contra
cada microrganismo testado, alguns sendo defectivos para a inibição de alguns microrganismos, mas não para
outros. Em todos os 14 mutantes a inserção do Tn5 foi confirmada por PCR. Atualmente, a sequência do DNA
onde ocorreu a integração do Tn5 está sendo identificada. Tendo em vista que foram observados mutantes
com variações no padrão de inibição, pode ser sugerido que diferentes moléculas poderiam estar associadas
ao antagonismo de Burkholderia sp. a esses microrgansimos, ou que a mutação em diferentes genes poderiam
resultar em níveis diferentes da mesma molécula. Dessa forma, os resultados obtidos permitem inferir que mais
de um gene está envolvido na produção desta(s) molécula(s), porém ainda não é possível inferir quanto ao modo
de funcionamento desses genes, podendo compor uma mesma via ou ainda, interações de vias metabólicas
diferentes formando um complexo ativo que desempenha uma função na produção de antimicrobianos.
Apoio financeiro: FAPESP (Proc. no. 08/52407-9 e 08/56505-5)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
121
Avaliação do potencial biotecnológico de fungos
endofíticos associados a Banisteriopsis anisandra
(Adr. Jussieu) Gates (Malpighiaceae)
Souza, SR1; Costa, MCM1
Laboratório de Pesquisas em Fungos- Centro Universitário de Lavras-UNILAVRAS
[email protected]
1
Palavras-chave: Potencial biotecnológico, antagonismo, bioprospecção
Espécie comum em formações florestais no município de Lavras - MG, Banisteriopsis anisandra ocorre,
preferencialmente, em bordas, utilizando outros vegetais como suporte. Trabalhos com espécies de Banisteriopsis
demonstraram sua atividade antimicrobiana, em especial contra Staphylococcus aureus. O aumento da resistência
bacteriana aos antibióticos usuais é uma preocupação cada vez mais presente, assim como o uso indiscriminado
de agrotóxicos no controle de fitopatógenos os quais são deixados no ambiente. A busca de artefatos controladores
tornou-se uma necessidade. Os fungos endofíticos podem ser uma alternativa para a busca de novas substâncias
bioativas. São considerados micro-organismos endofíticos aqueles que habitam o interior dos tecidos sadios das
plantas durante todo o seu ciclo de vida ou somente parte dele, sem causar-lhes danos. Produzem metabólitos
secundários que auxiliam o hospedeiro no combate à herbivoria e ao ataque por outros micro-organismos. Com
o objetivo de avaliar o potencial antagonístico dos fungos frente a fitopatógenos, os endófitos foram isolados e
testados em ensaios de pareamento. A taxa de colonização foi de 60,7% no total de 420 fragmentos incubados de
caule e folha. Os fungos isolados foram distribuídos em morfo-espécies revelando grande diversidade destacandose espécies do gênero Xylaria. O pareamento foi executado com 30 isolados diferentes de B. anisandra. Quatro
isolados apresentaram atividade antagonística frente aos fitopatógenos, Colletotrichum musae e Colletotrichum
lindemuthianum. Nos demais pareamentos foram observadas interações como competição por espaço e morte
celular em áreas de contato entre os endófitos e os patógenos. Os resultados sugerem a presença de substâncias
bioativas que evidenciam o potencial biotecnológico dos fungos endofíticos isolados de B. anisandra.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
122
Avaliação da atividade fungicida de b-defensinas em
levedura industrial
Almeida, ML1, 2; Crovella, S2; Morais Jr., MA1, 2
Núcleo de Engenharia Metabólica, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras chave: Defensina, β-defensina, D. bruxellensis, S. cerevisiae, leveduras industriais
As defensinas são pequenos peptídeos catiônicos de 10 a 15 KDa, que cumprem um papel chave no sistema imune
inato nos organismos e já foram descritas em bactérias, fungos, plantas, invertebrados, vertebrados. Dada sua
natureza catiônica, essas moléculas atuam pela interação com componentes da parede celular microbiana e com
os lipídeos de membrana dos microrganismos alvo. A atividade biocida dessas moléculas já foi testada em contra
diferentes espécies bacterianas Gram-negativas e Gram-positivas e em Candida albicans causadoras de infecções
em humanos mostrando o grande potencial desses pepídeos para a formulação de medicamentos que previam ou
combatam essas infecções. Nesse sentido, esses peptídeos poderiam também ser utilizados para o combate das
contaminações bacterianas e até das contaminações por leveduras nos processos industriais. Nesse sentido, o
presente trabalho teve como objetivo investigar a atuação de β-defensinas humanas e de primatas contra Dekkera
bruxellensis que se apresenta como a principal levedura contaminante da fermentação alcoólica industrial. A
linhagem de Saccharomyces cerevisiae BY 4741 foi utilizada como referência. As células dessas leveduras foram
cultivadas até a fase exponencial de crescimento (DO600nm = 0,5) e a concentração celular foi determinada por
espectrofotometria. Essas culturas foram diluídas 1:50 em meio YPD, e distribuídas 100 µL em microtubos. As
β-defensinas foram utilizadas a diferentes concentrações de acordo com os valores inicialmente descritos na
literatura. As culturas foram incubadas por 24 h para a S. cerevisiae e 48 h para D. bruxellensis para se determinar o
crescimento a partir de medida espectrofotométrica. Os resultados mostraram que nenhuma das cinco defensinas
testadas foi capaz de inibir o crescimento das células de S. cerevisiae. Por outro lado, duas dessas classificadas como
(hBD1 e hBD2) apresentaram um boa redução de crescimento, de aproximadamente 53% e 65% respectivamente
na levedura D. bruxellensis. Conclusões: O presente estudo mostra pela primeira vez o potencial de defensinas
quimicamente sintetizadas na inibição da levedura D. bruxellensis, uma das principais contaminadoras da produção
de bioetanol. Essa evidência poderá auxiliar no desenvolvimento de uma estratégia de controle microbiológico do
processo industrial, com a possibilidade de desenvolvimento de linhagens de S. cerevisiae capazes de sintetizar e
secretar esses peptídeos no meio de fermentação.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
123
Caracterização da variabilidade patogênica de isolados de
Pseudocercospora griseola coletados em Minas Gerais
Balbi, BP1; Sanglard, DA1; Ribeiro, CAG1; Barros, EG1,2; Moreira, MA1,3
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mancha angular, feijão, variedades diferenciadoras, patótipos, fontes de resistência.
A mancha angular incitada pelo fungo Pseudocercopsora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, destaca-se como
uma das principais doenças que acometem o feijoeiro (Phaseolus vulgaris). Estimativas de perdas na produção
causadas pelo patógeno atingem 70%, dependendo das condições ambientais e do uso de cultivares suscetíveis.
Diante disso, verifica-se a importância do conhecimento sobre a variabilidade patogênica de cada região visando à
seleção de fontes de resistência eficazes. A variabilidade patogênica de P. griseola tem sido determinada mediante
a reação de um grupo de variedades diferenciadoras que contém genótipos de dois acervos genéticos do feijão,
andinos e mesoamericanos. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar em patótipos 31 isolados de P. griseola
advindos das seguintes cidades de três importantes regiões produtoras do Estado de Minas Gerais: Lagoa Formosa
(Triângulo Mineiro/Alto Paranaíba); Paracatu e Unaí (Noroeste); Alto Jequitibá, Canaã, Coimbra, Manhumirim, São
Miguel do Anta e Viçosa (Zona da Mata). Para a obtenção de culturas monospóricas foi utilizado o isolamento direto
e o inóculo foi obtido pela multiplicação dos isolados em placas de petri contendo uma mistura de água destilada,
molho de tomate, ágar, CaCO3 e antibiótico. As placas foram incubadas por 10 dias a 24o C para a produção de
conídios. Foram inoculadas doze plantas de cada variedade diferenciadora utilizando uma suspensão contendo 2,0
x 104 conídios/mL. Após a inoculação, as plantas foram transferidas para uma câmara úmida (20 ± 1o C e > 95% de
umidade relativa) onde permaneceram por 48 horas, sob fotoperíodo de 12 horas. Em seguida, foram transferidas
para casa-de-vegetação onde permaneceram até o aparecimento de sintomas. A severidade da doença foi avaliada
visualmente aos 15, 18 e 21 dias após a inoculação, utilizando-se uma escala com nove graus de severidade. Plantas
que receberam notas de 1 a 3 foram consideradas resistentes e plantas com notas de 4 a 9, suscetíveis. Foram
identificadas 15 patótipos distintos (3.23, 7.15, 15.7, 23.23, 31.4, 31.7, 47.39, 63.6, 63.7, 63.15, 63.23, 63.31, 63.39, 63.47
e 63.63), o que confirma a alta variabilidade patogênica do fungo em Minas Gerais. Dos 15 patótipos obtidos, o
63.63 foi detectado em sete das nove cidades visitadas e também o foi o mais freqüente com 12 dos 31 isolados
caracterizados. O patótipo 63.23 ocorreu em três cidades com a freqüência de três isolados; os patótipos 63.7, 47.39 e
15.7 ocorreram em duas cidades cada um, com uma freqüência de dois isolados, sendo que, os demais ocorreram em
uma única cidade com a freqüência de um isolado. Os resultados obtidos neste trabalho são de relevante importância
para programas de melhoramento, pois a caracterização de patótipos direciona os trabalhos de identificação
de fontes de resistência à mancha angular, além de possibilitar o entendimento da distribuição do patógeno.
Apoio Financeiro: CAPES e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
124
Análise de interações transcricionais no dermatófito
Trichophyton rubrum em resposta ao pH ambiente
durante o processo de degradação de queratina
Silveira, HCS1; Cazzaniga, RA1; Marques, MC1 ; Evangelista AF1; Sanches, PR1; Passos, GAS1; Rossi, A2;
Martinez-Rossi, NM1
Departamento de Genética, FMRP-USP
Departamento de Bioquímica e Imunologia, FMRP-USP, Ribeirão Preto, Brasil
1
2
Palavras-chave: PACC, PH ambiente, microarrays, redes transcricionais, Trichophyton rubrum
Os dermatófitos como o Trichophyton rubrum são fungos patogênicos que secretam enzimas proteolíticas para o seu
estabelecimento no hospedeiro. A secreção de enzimas que participam dos mecanismos de instalação e manutenção
da infecção são provavelmente dependentes direta ou indiretamente do monitoramento do pH ambiente. Além
disto, T. rubrum é dependente do pH ácido inicial do meio para o seu crescimento, atingindo valores de pH alcalino,
em função do tempo de cultivo, produzindo um ambiente no qual a maioria das proteases tem atividade ótima.
A secreção de queratinases pelo T. rubrum é de alguma forma controlada pelo regulador transcricional PacC, da
conservada via de sinalização do pH ambiente. Ainda, PacC tem uma diversidade de funções metabólicas em
respostas para ambos pH ácido ou alcalino. Com o objetivo de elucidarmos os mecanismos moleculares que
envolvem PacC em T. rubrum, e se este gene participa de redes transcricionais, utilizamos a metodologia dos cDNA
microarrays, comparando o perfil transcricional das linhagens selvagem e mutante pacC-1. Os RNAs de T. rubrum
utilizados para as hibridações foram obtidos em diferentes tempos de cultivo, durante o processo de degradação
de queratina. Para a construção das redes gênicas utilizamos o programa genenetwork que utiliza um algoritmo
de engenharia reversa, baseado em um modelo de estatística linear que é adequado para experimentos temporais.
Somente os dados normalizados dos genes diferencialmente expressos após análise estatística utilizando o
programa SAM (significance analysis of microarrays) com FDR 3% (False Discovery Rate), foram incluídos nos cálculos
do programa genenetwork. Dessa forma, 122 genes que apresentaram significativa diferença de expressão entre as
linhagens selvagem e mutante pacC-1 foram revelados. Após a construção das redes transcricionais, obtivemos vários
nós gênicos, um deles constituído pelo fator de transcrição MBF1 (multiprotein bridging factor 1), um conservado
co-ativador transcricional. Este transcrito apresenta possíveis interações em função dos níveis transcricionais de
alguns genes, sendo diferente na linhagem selvagem comparado ao mutante pacC-1. Dentre as interações de MBF1
foi encontrada uma interação positiva com a fosfatase alcalina na linhagem selvagem, enquanto no mutante pacC1 não foi observada essa interação. Sabe-se que em Aspergillus nidulans a proteína PacC induz a transcrição de
fosfatase alcalina. Na análise da região promotora (1000 pb upstream) do gene MBF1 verificou-se a presença de um
sítio consenso (GCCARG) de reconhecimento do fator transcrição PacC, sugerindo uma interação entre PacC e MBF1.
Suporte Financeiro: FAPESP, CNPq, FAEPA e CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
125
Estudo in silico da ocorrência EST-SSRs no genoma do
fungo Oidiodendron maius
Barbosa, LV¹; Santos, MCL¹; Andrade-Monteiro, C¹
¹Laboratório de Biologia Geral; Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Maranhão
[email protected]
Palavras-chave: Marcadores moleculares, Oidiodendron maius, EST-SSR, Bioinformática, SSRLocator.
A obtenção de marcadores moleculares da classe dos microssatélites (SSRs) é uma ferramenta útil em diversas
análises genéticas dos fungos. Quando feito em laboratórios, a partir de protocolos convencionais, pode
resultar em tarefas demoradas com custos elevados. Nos últimos anos, os projetos genoma e o surgimento de
novas metodologias de seqüenciamento propiciaram a redução dos custos e o aumento expressivo do número
de seqüências depositadas nos bancos de dados de DNA (GenBank / NCBI), gerando oportunidades para a
identificação de microssatélites, pela estratégia de exploração desse banco. Com isso, várias iniciativas utilizam a
técnica conhecida como cDNA para o seqüenciamento de RNAs que, posteriormente, são depositados em bancos
de dados conhecidos como ESTs (Expressed Sequence Tags). A eficiência de SSRs desenvolvidos a partir de ESTs
reside na vantagem de permitir a localização de marcas mais próximas dos genes de interesse no mapa genético
por se tratar de seqüências expressas. No caso do fungo Oidiodendron maius, poucos locos de microssatélites
foram descritos até o momento. Este estudo objetivou verificar a ocorrência de microssatélites a partir de ESTs
no genoma do fungo Oidiodendron maius passíveis de serem utilizados como marcadores moleculares através
de buscas em bancos de dados. As seqüências de ESTs foram obtidas a partir do website do NCBI, as quais foram
depositadas em arquivos no padrão FASTA e analisadas para a presença de microssatélites utilizando o programa
computacional SSRLocator (MAIA, 2007). As configurações para os motivos (arranjo dos microssatélites) a serem
localizados, compreenderam arranjos formados entre dois e dez pares de bases com repetições mínimas de 2x10,
3x8, 4x5, 5x5, 6x4, 7x3, 8x3, 9x3 e 10x3, respectivamente, para dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros,
heptâmeros, octâmeros, nonâmeros e decâmeros. Foram analisadas todas as sequências ESTs depositadas no NCBI
totalizando 218 sequências, das quais apenas uma (sequência 106) apresentou a ocorrência de microssatélites. O
motivo da repetição encontrada foi o trinucleotídeo GCA repetido 8 vezes ao longo da sequência. Dessa forma, este
trabalho ratifica que o conhecimento da ocorrência de seqüências repetidas nos genomas é importante não apenas
para um entendimento de sua distribuição, mas, também, para direcionar o desenvolvimento de marcadores SSR
específicos para uso em análises genéticas. Espera-se com a continuação do estudo, verificar a ocorrência de ESTSSR em outros fungos do mesmo gênero e validar os locos de microssatélites in vitro para diferenciação de espécies.
Apoio financeiro: IFMA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
126
Variabilidade enzimática de fungos endofíticos
associados a planta medicinal
Teixeira, KS; Souza, SR; Mendes-Costa, MC¹
¹Laboratório de Pesquisas em Fungos - Centro Universitário de Lavras – UNILAVRAS
[email protected]
Palavras-chave: Enzimas, Fungos Endofíticos, Banisteriopsis anisandra, Atividade enzimática, Potencial Biotecnológico.
Depois dos antibióticos, as enzimas constituem o mais importante grupo de produtos biológicos de necessidade
humana. Vários processos industriais, sendo a maior parte deles na área de biotecnologia industrial, ambiental e
alimentícia, utilizam a tecnologia das enzimas em várias de suas etapas. E entre as alternativas mais viáveis para a
obtenção dessas enzimas estão os fungos endofíticos, que vêm sendo objeto de grande estudo neste âmbito. Para
contribuir com o conhecimento da diversidade enzimática em fungos endofíticos, o presente trabalho teve como
objetivos: verificar se os fungos endofíticos isolados da planta medicinal Banisteriopsis anisandra (Malpighiaceae)
são capazes de produzir e secretar enzimas; quantificar a produção enzimática através da medida dos halos
formados em substratos semi-sólidos e selecionar os fungos mais promissores na produção de enzimas lipolíticas,
amilolíticas e proteolíticas. Foram testados 28 fungos sendo que 19 destes foram coletados na época chuvosa e os
outros 9 na estação de seca. Os fungos foram repicados em meios de cultura semi-sólidos acrescidos de 0,2% de
amido solúvel, 1% de Tween 20 e 8% de gelatina para o teste das atividades amilolítica, lipolítica e proteolítica,
respectivamente, segundo metodologia proposta por Hankin e Anagnostakis (1975). Placas com os substratos
enzimáticos foram avaliados semi-quantitativamente para presença ou ausência de atividade enzimática que
foi determinada através da mensuração do diâmetro do halo formado em torno das colônias, representada pela
seguinte escala: 0, não produção de enzima; 1, diâmetro do halo entre 1-5 mm; 2, diâmetro entre 5-10 mm; 3,
diâmetro entre 10-20 mm; 4, diâmetro entre 20-30 mm; e 5, diâmetro superior a 30 mm. Os resultados foram
diversificados mostrando variabilidade entre os fungos endofíticos quanto à produção enzimática. Dentre as três
atividades testadas nos fungos da época de chuva, destaca-se a atividade proteolítica, onde a maioria dos fungos
foi classificado na escala 5. Em contra partida os fungos da época de seca, apesar de estarem em menor número,
não foram bons produtores, sendo que sua melhor atividade ficou na escala 2 para a atividade amilolítica. Concluise que os fungos endofíticos são produtores de enzimas e os fungos da época de chuva de maneira geral são
melhores produtores, principalmente quanto às enzimas proteolíticas. Os resultados contribuem com o avanço
do conhecimento das potencialidades dos fungos endofíticos, uma vez que existe a possibilidade de utilizá-los em
vários aspectos e produtos de interesse biotecnológico.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
127
Obtenção de produtos de PCR dos principais fungos
causadores de doenças no cacaueiro visando estudos
filogeneticos e taxonômicos
Santos, RMF1; Lemos, LSL1; Juca, FF1; dos Santos, MVO3; Kruschewsky, MC1; Ganem, RS3; Clement, D3,4;
Micheli, F2,4; Gramacho, KP3
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular
Universidade Estadual de Santa Cruz
3
CEPEC/CEPLAC
4
CIRAD
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ITS, sequenciamento, Phytophthora, Theobroma cacao, Ceratocystis
Onde é cultivado, o cacaueiro (Theobroma cacao L.) é alvo de várias doenças de grande impacto econômico.
Entre estas estão a vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa), podridão-parda (Phytophthora spp.), monilíase
(Moniliophthora roreri) e a murcha de Ceratocystis (Ceratocystis cacafunesta). O conhecimento da biologia destes
fitopatogenos é essencial para estabelecer um manejo eficiente das doenças. As limitações metodológicas para
seqüenciamento de genes de interesse têm sido a extração do DNA e a amplificação de regiões especificas com
qualidade satisfatória, ou seja, que permitam o uso com sucesso dos produtos da amplificação em reações de
seqüenciamento e em métodos moleculares comparativos. Nesse sentido, nosso objetivo foi determinar as
condições ótimas das reações de PCR para amplificação de regiões ribossomais, dentre outras, as quais vêm sendo
usadas rotineiramente no FITOMOL no auxilio da taxonomia molecular e filogenia destes fitopatogenos. Isolados
de quatro espécies de fungos em estudo (M. perniciosa, Phytophthora spp., M. roreri e Ceratocystis cacaofunesta)
tiveram seu DNA extraído segundo protocolos específicos para cada espécie. O DNA foi quantificado e determinado
sua qualidade utilizando gel de agarose a 1%. A otimização das condições da PCR foi avaliada segundo dois aspectos:
concentração final do DNA template na reação (10, 25 e 50 ng/ul) e concentração dos primers (4, 10 e 20 pmol/ul) em
reações com volumes finais de 20 ul e 50 ul. Os resultados demonstram que as condições ótimas para amplificação
das regiões em estudo é uma reação com volume final de 20 ul, 10 ng/ul de DNA template e concentração do primer
a 4 pmol/ul, Os resultados mostram que uma menor concentração de DNA deve ser utilizada, o que é desejável
levando em consideração as dificuldades de obtenção de micélio e extração do DNA em fungos, bem como uma
economia em relação aos reagentes utilizados na PCR. Esta abordagem provou ser de sucesso para amplificação
de regiões ribossomais utilizados na rotina de identificação e genotipagem de fungos no nosso laboratório.
Apoio financeiro: Fapesb, CNPq e CEPLAC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
128
Uso de marcadores PCR-RFLP como ferramenta na
diferenciação de isolados de Guignardia citricarpa
e Guignardia mangiferae, provenientes de tecidos
assintomáticos de Laranja ‘Azeda’ (Citrus aurantium)
Pereira, FD1; Wickert, E2; Giuliatti, S3; Goes, A1
Laboratório de Fitopatologia, Departamento de Fitossanidade, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal - UNESP
Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina - EPAGRI
3
Laboratório de Bioinformática, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Guignardia citricarpa, Guignardia mangiferae, Mancha Preta dos Citros, marcadores PCR-RFLP.
O fungo Guignardia citricarpa é um patógeno responsável pela Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença
quarentenária A1 para os países da União Européia e Estados Unidos da América. Todas as variedades de
laranjas doces, assim como limões, tangerinas e outros são suscetíveis ao patógeno. Esta doença deprecia os
frutos comercialmente para o mercado in natura e restringe a possibilidade de exportação. Além disso, provoca
a queda prematura dos frutos e eleva o custo de produção devido à necessidade de controle. A laranja ‘Azeda’
(Citrus aurantium), segundo a literatura internacional, constitui-se em uma das raras exceções dentre as espécies
cítricas que se mostram resistentes. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência do uso de marcadores
PCR-RFLP como ferramenta auxiliar na diferenciação de isolados de G. citricarpa e Guignardia mangiferae,
provenientes de tecidos assintomáticos de Laranja ‘Azeda’, auxiliando assim, a identificação destas espécies.
Foram analisados oito isolados, sendo seis identificados como G. mangiferae e dois como G. citricarpa, segundo
o teste do meio aveia-agar e o primer especifico GCP1/GCP2, desenhados e desenvolvidos por Blanco (1999), os
quais amplificam uma banda exclusiva de G. citricarpa, da ordem de 373 pb. Os marcadores PCR-RFLP foram
desenvolvidos a partir da amplificação da região 18S, seguida pela clivagem com enzimas de restrição previamente
identificadas através de restrição virtual a partir de sequências do banco de dados GeneBank, com verificação
dos produtos por eletroforese em gel de agarose. Os resultados obtidos revelam que o uso de marcadores
moleculares do tipo PCR-RFLP é eficiente para distinguir isolados de G. mangiferae de isolados de G. citricarpa.
Apoio financeiro: Fapesp
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
129
Interconnection between PacC and bZIP/Cys-3
transcription factors: possible regulators of virulence
factors in the dermatophyte Trichophyton rubrum
Santos, RS1; Cruz, AHS1; Peres, NTA1; Persinoti, GF1; Martinez-Rossi, NM1; Rossi, A2
Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
Department of Biochemistry and Immunology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
[email protected]
1
2
Keywords: Trichophyton rubrum, bZIP-Cys-3, PacC, transcription factor, bioinformatics, gene expression.
Trichophyton rubrum is a cosmopolitan dermatophyte that affects humans, being the most prevalent cutaneous
mycosis worldwide. During infection, the ambient pH is raised from acidic to alkaline values due to the
metabolization of keratinized substrates present in the host environment. This pH shift in response to the acidic pH
of the skin appears to be an important step for the success of the infectious process. Several genes involved in the
ambient pH signaling pathway, such as the transcription factor pacC, and in the environmental stress adaptation,
like the transcription factor bZIP/cys-3, have been identified in the fungus T. rubrum. The bZIP (basic leucine zipper)
represent the largest family of transcription factors in eukaryotic cells and are involved in the regulation of gene
expression, controlling several cellular processes. These regulators bind to specific sequences in the DNA, showing
an affinity for sequences that have a motif TTACGTAA (domain G-box ACGT), and displaying preferences for the
bases flanking the ACGT motif, which defines the specificity of the interaction bZIPs-DNA. Aiming to evaluate the
role of the bZIP/Cys-3 in regulating genes involved in pH sensing in T. rubrum, and its hierarchical relationship
with PacC, in silico analysis were performed using the T. rubrum structural genome database released by the
Broad Institute of Harvard and MIT and the bioinformatics programs Gene Runner, Expasy, Pfam and Domain
Search Tool. In the present study, the genomic and cDNA sequences coding for bZIP/Cys-3 of T. rubrum were
identified and characterized. The cDNA contains 900 bp and encodes a protein with 300 amino acids; predicted
molecular mass of 33 kDa and pI of 5.3. The genomic sequence contains two exons interrupted by only one intron.
Bioinformatics analysis revealed that bZIP/Cys-3 displays in its 5’UTR region two consensus sites (GCCA (R) G)
for PacC binding, thereby giving insights into its involvement in the pH sensing pathway. Moreover, the protein has
the leucine zipper domain in the amino acid position 199-213 similar to the Cys-3 regulatory protein family, and
also presents sites of phosphorylation and glycosylation. Furthermore, the screening of genes possibly regulated
by the bZIP/Cys-3 of T.rubrum revealed 151 genes that showed the binding site for this bZIP in the 1000 base pairs
upstream the predicted ORF. Most of these genes are involved in metabolic activities essential for cell growth,
sporulation, drug resistance, DNA repair and cell cycle control. These in silico analysis revealed aspects that are
attractives to carry out additional studies to characterize the molecular function of the bZIP/Cys-3, as for example
the evaluation of its role in pH sensing and regulation of virulence factors and thus in the pathogenicity of T. rubrum.
Financial support: FAPESP, CNPq, CAPES and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
130
Inactivation of gene pacC attenuates the virulence of
the dermatophyte Trichophyton rubrum through the
regulation of genes required for keratin degradation
Cazzaniga, RA1; Silveira, HCS1; Evangelista, AF1; Marques, MMC1; Sanches, PR1; Passos, GAS1; Rossi, A2;
Martinez-Rossi, NM1
Departamento de Genética, FMRP-USP
Departamento de Bioquímica e Imunologia, FMRP-USP, Ribeirão Preto, Brasil
e-mail: [email protected]
1
2
Keywords: trichophyton rubrum, microarray, queratina, ph ambiente, pacc
Trichophyton rubrum is a cosmopolitan and anthropophilic fungus that infects human skin and nails, being the
most prevalent dermatophyte worldwide. During its growth on keratin occurs the secretion of some proteolytic
and keratinolytic enzymes, shifting the extracellular pH from acidic to alkaline, being an efficient strategy for
its successful infection and maintenance in the host. PacC is a transcription factor involved in the pH signaling
pathway in fungi, whose inactivation in T. rubrum leads to a decreased keratinolytic activity and deficiency in
infecting nails in vitro. Thus, aiming the identification of genes regulated by PacC during growth on keratin as the
only nutrient source, we performed a time-course gene expression analysis between the T. rubrum wild type (ATCC
MYA 3108) and pacC-1 mutant strains, by cDNA microarrays methodology. During T. rubrum growth on keratin
medium by the period of 24, 36, 48 and 60 hours, we observed in both strains that conidia germination and hyphal
formation were accompanied by a gradual increase in the extracellular pH, ranging from 6.5 to 8.5. Microarrays
platform containing 1700 cDNA, obtained from different physiologic and stress conditions, were hybridized against
total RNA extracted from T. rubrum strains after the growth periods indicated above. Quantification data of the
expressed genes were statistically analyzed by Significance Analysis of Microarray (SAM), using the multiclass
comparison between wild type and pacC-1 mutant throughout the growth times, resulting in 122 differentially
expressed genes. The analysis showed an outstanding difference in the global gene expression profile of T. rubrum
control and pacC-1 strains during this time-course study. Moreover, one of the down-regulated genes in the pacC-1
strain after 48h of growth, in which the extracellular pH was 7.8, was the palA gene, one of the components of the
pH response pathway, suggesting that this gene is required for growth in keratin and is regulated by PacC. These
genes identified here are involved in several cellular processes; their regulation during keratin degradation and
pH sensing may be an important step in the initial stages of the dermatophyte infection or in its maintenance
in the host tissue. Furthermore, our results suggest the participation of the transcription factor in regulating
genes possibly involved in the metabolism of keratin, playing a role in the pathogenicity of this dermatophyte.
Financial support: FAPESP, CNPq, CAPES and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
131
Selection of appropriate housekeeping genes for gene
expression studies by qRT-PCR in the dermatophyte
Trichophyton rubrum
Jacob, TR1; Peres, NTA1; Rossi, A2; Martinez-Rossi NM1
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Bioquímica e Imunologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Key words: Trichophyton rubrum, dermatophytosis, qRT-PCR, housekeeping genes.
Trichophyton rubrum is an anthropophilic filamentous fungus that became the most prevalent microorganism
isolated from clinical cases of dermatophytosis worldwide. Its infection can be restricted to superficial regions
of the infected tissues or be more invasive in immunocompromised patients, such as those infected by the virus
that causes Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), submitted to chemotherapy treatments, or even
patients with leukemia. Given its importance, T. rubrum genome has recently been sequenced and annotated by
the Broad Institute of Harvard and MIT, which improved the functional genomics studies that seek to identify
the genetic machinery used by this pathogen to establish itself and cause disease in humans. Among the several
molecular techniques used for gene expression analysis, Reverse Transcription quantitative PCR (qRT-PCR)
has been highlighted in comparative studies. However, due to its high sensitivity, the results obtained from this
methodology must be previously normalized to avoid errors between samples, like different RNA and/or cDNA
initial quantities, different efficiencies in the cDNA synthesis, technical errors in the experimental design or
any other random variation that can contribute negatively to obtain highly reliable results. Recent studies
demonstrate the need for previous evaluation of housekeeping genes to be used as normalization in gene
expression studies using qRT-PCR as a molecular tool. The objective of this study was to analyze the expression
of a group of eight candidate genes (18S rRNA, gapdh, top2, atpD, actin, chs1, rpb2 and tubulin) as housekeeping
genes for T. rubrum, grown under different culture conditions, to find genes capable of providing more reliable
data analysis. Thus, the experiment consisted of analyzing the expression of these genes in nine different samples
derived from T. rubrum grown on malt extract medium, keratin medium, and fungal interaction with human nail
fragments. The results obtained from the stability analysis with the geNorm and NormFinder programs show
that actin, tubulin and top2 (DNA topoisomerase II) genes are the most suitable for reliable data normalization
of qRT-PCR in gene expression studies in the dermatophyte T. rubrum. These findings will allow further
analysis of T. rubrum gene expression under a wide range of conditions, with improved accuracy and reliability.
Financial support: CNPq, FAPESP, CAPES and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
132
Prediction of novel biochemical functions of the Sub3
keratinase from Trichophyton rubrum
Cruz, AHS1; Santos, RS1; Cazzaniga, RA1; Peres, NTA1; Martinez-Rossi, NM1; Rossi, A2
Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
[email protected]
1
2
Keywords: Sub3, Trichophyton rubrum, Dermatophytes, Bioinformatic, keratinase.
Dermatophytes are fungi that invade keratinized tissues causing superficial infections. Most studies aiming to
identify virulence factors have focused on proteases, including keratinases. Our group identified a sub3 keratinase
transcript during growth of Trichophyton rubrum in keratin cultures. Bioinformatic analyses (www.broadinstitute.
org; http://www.generunner.net; http://expasy.ch) of gene SUB3 and protein Sub3 of T. rubrum (CBS_118892) were
undertaken aiming the prediction of novel biochemical functions for this protein. The TrSUB3 gene has three
introns with an ORF of 1194bp, corresponding to a protein with 397 amino acid residues (41 kDa) and a pI of
8.51. The following protein motifs were identified: subtilisin-like serine proteases, transactivation domain-9aa
TAD, serine proteases active site, transmembrane helices, phosphorylation, myristoylation and glicosylation sites,
endoplasmic reticulum (ER) addressing motif, I9 inhibitor domain (subtilisin propeptide), and insulin-like growth
factor-binding protein (IGFBP) (N-terminal domain), EGF-like domain, and anaphylatoxin domain signatures.
Thus, the subtilisin sub3 is a probable transmembrane protein glicosylated in ER, with possible actions in different
sensing mechanisms, including adhesion and cellular signaling. The 9aa TAD represents the smallest known
denominator for a broad range of transcription factors; this domain mediates conserved interactions with general
transcriptional cofactors. The inhibitor I9 (Peptide proteinase inhibitors) suggests a post-translational modification
since this domain prevents access of the substrate to the active site, being necessary the remotion of the propeptide
for enzyme activation (to activating the enzyme). The insulin-like growth factors (IGF-I and IGF-II) bind to specific
proteins in extracellular fluids with high affinity. These growth factors prolong the half-life of the IGFs and inhibit
or stimulate the growth effects of the IGFs on cell cultures. They may alter the interaction of IGFs with their cell
surface receptors. The epidermal growth factor (EGF) is present in a large number of proteins. EGF first binds with
high affinity to specific cell-surface receptors and then induces a signal transduction that results in DNA synthesis
and cell proliferation. Since a common feature of all EGF-like domains is that they are found in the extracellular
domain of membrane-bound proteins, the presence of EGF-like domain signature in sub3 suggests the influence
of this enzyme in T. rubrum mitosis. The anaphylatoxins are fragments (C3a, C4a and C5a) produced as part of
the activation of the complement system and are glycoproteins that have important functions in the immune
response and host defense. The presence of anaphylatoxin domain signature suggests the participation of sub3 in
response to the host defense. The results obtained in bioinformatic analyses suggest that sub3 act as a keratinase,
as well as in the T. rubrum virulence mechanisms, probable through overlapping signal transduction pathways.
Financial support: FAPESP, CNPq, CAPES and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
133
Uso do retrotransposon MpSaci de Moniliophthora
perniciosa, agente causal da vassoura de bruxa no
cacaueiro (Theobroma cacao), como marcador molecular
Santana, MF1; Souza, JT2, Mizubuti, ESG3; Araújo, EF1; Queiroz, MV1
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Microbiologia Agrícola, Viçosa, MG
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das Almas, BA
3
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Fitopatologia, Viçosa, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: retrotransposon, Moniliophthora perniciosa, marcadores moleculares, IRAP, REMAP.
O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é afetado por várias doenças de grande importância econômica. No Brasil, a
vassoura de bruxa, causada por Moniliophthora (=Crinipellis) perniciosa (Stahel), é a doença mais devastadora. Um
dos processos conhecidos que podem gerar variabilidade em fungos fitopatogênicos é a atividade de elementos
transponíveis. Esses elementos podem ser utilizados como marcadores para traçar o perfil de populações e para
rastreamento e identificação de raças específicas de patógenos. Com o advento do sequenciamento do genoma
de M. perniciosa fomentado pelo Projeto Genoma de M. perniciosa (www.Ige.ibi.unicamp.br/vassoura), foi possível
encontrar, no genoma desse fungo, seqüências de representantes dos diferentes grupos de elementos transponíveis.
Um dos elementos encontrados foi um retrotransposon do grupo Gypsy/Ty3 denominado de MpSaci. Devido a
ampla distribuição de elementos transponíveis no genoma de M. perniciosa, o objetivo deste trabalho foi avaliar o
uso de MpSaci para estudo populacional com os marcadores moleculares IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified
Polimorphism) e REMAP (REtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism). Foi analisada a diversidade
genética de 70 isolados de M. perniciosa de diferentes biótipos e origens geográficas. Foram amplificados 43 locos.
Os índices de Nei mostraram diferenças significativas entre as populações de M. perniciosa divididas em relação
ao biótipo e origem geográfica, demonstrando que as populações se encontram estruturadas em relação a origem
geográfica e ao hospedeiro (biótipo). Pela análise de agrupamento de diferentes regiões geográficas do biótipo C
foram observados dois grandes grupos que evidenciam duas principais entradas do patógeno no estado da Bahia.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
134
Clonagem e expressão funcional da oxidase alternativa
de Moniliophtora perniciosa, agente etiológico da
vassoura-de-bruxa no cacaueiro
Zaniboni, GF; Thomazella, DPT; Cabrera, OG; Pereira, GAG
Instituição: Universidade Estadual de Campinas
Palavras-chave: oxidase alternativa, moniliophtora perniciosa, sacharomyces cerevisiae, vassoura-de-bruxa, cadeia respiratória.
Moniliophtora perniciosa é um fungo basidiomiceto, causador da doença vassoura de bruxa do cacaueiro. Com o
surgimento dos fungicidas que atuam na cadeia respiratória mitocondrial, a enzima oxidase alternativa (AOX)
tornou-se um alvo interessante para o combate de muitos fitopatógenos. Visando uma melhor caracterização das
funções da AOX de M. perniciosa, propôs-se transformar a levedura Sacharomyces cerevisiae com o gene aox deste
fungo (Mp-aox). Para isto, este gene foi isolado a partir de um pool de cDNAs de M. perniciosa e clonado em vetor
de clonagem pGEM. Paralelamente, o vetor de expressão pYADE, que será utilizado para expressão da AOX em
S. cerevisiae, foi devidamente digerido com as enzimas de restrição EcoRI e SmaI. O gene Mp-aox foi então ligado
ao plasmídeo pYADE. As etapas subseqüentes deste trabalho incluem a transformação da linhagem Nvsc1 de S.
cerevisiae com o vetor pYADE-Mp-aox e a caracterização fenotípica da levedura transformada. Adicionalmente, esta
linhagem de levedura contendo o gene aox de M. perniciosa será também utilizada para o screening de moléculas
que tenham potencial de inibirem esta enzima e, possivelmente, se tornarem potentes fungicidas.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
135
Caracterização das endopoligalacturonases de
Moniliophthora perniciosa e sua possível importância
na vassoura-de-bruxa do cacaueiro
Bassalo, MC¹; Oliveira, BV¹; Pereira, GAG¹
¹Laboratório de Genômica e Expressão (LGE) – Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
Palavras-chave: Vassoura-de-bruxa, Moniliophthora perniciosa, endopoligalacturonases, pectina, parede celular
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro,
doença considerada como um dos principais problemas fitopatológicos do Brasil. Tal fungo possui um ciclo de
vida com duas fases fisiológica e morfologicamente distintas: uma biotrófica (intercelular) e outra necrotrófica
(intracelular). Durante a fase biotrófica, foi verificado por experimentos de microarranjos de DNA e pela análise de
bibliotecas de ESTs que diversos genes relacionados à glicólise estão reprimidos, enquanto genes que codificam
pectinases estão expressos, sugerindo uma possível utilização da pectina como fonte alternativa de carbono
nessa fase. Além de disponibilizar nutrientes para o fungo, a ação dessas pectinases poderiam também viabilizar
o acesso de enzimas que degradam outros componentes da parede celular, etapa essencial para a progressão
da doença durante a fase necrotrófica do fungo. Entre as pectinases, destacam-se as endopoligalacturonases
(endoPGs), as quais degradam o domínio homogalacturano da pectina da parede celular durante a interação
planta-patógeno; tais enzimas sao essenciais para a fitopatogenicidade de vários fungos, visto que linhagens
mutantes para esses genes mostraram uma reduzida capacidade infectiva em varios casos analisados. O
sequenciamento genômico do fungo M. perniciosa acusou a presença de três sequências possivelmente codantes
para endoPGs, sugerindo um importante papel dessas enzimas no mecanismo de patogenicidade desse fungo.
Dessa forma, esse trabalho tem como objetivo caracterizar as endoPGs de M. perniciosa e avaliar a importância
dessas enzimas na doença Vassoura-de-bruxa. Culturas in vitro do fungo induzidas com ácido poligalacturônico
foram utilizadas no estudo. A expressão gênica e atividade das endoPGs foram detectadas por Real-Time PCR e
por ensaios enzimáticos, respectivamente. As ORFs das três EndoPGs foram amplificadas a partir do cDNA do
fungo. EndoPG1 foi clonada no vetor pGEM-T Easy (Promega) e subclonada no vetor de expressão pETSUMO
(Invitrogen) para posterior expressão heteróloga. As enzimas obtidas serão caracterizadas através de ensaios
de atividade em substratos específicos. Além disso, inibidores de endoPGs serão testados contra essas enzimas
como uma possível estratégia de controle da doença, visto que a confecção de plantas transgênicas expressando
inibidores de endoPGs tem se mostrado uma estratégia capaz de reduzir a capacidade infectiva de vários fungos.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
136
Biodiversidade e Freqüência de Fungos Endofíticos de
Ipomoea purpurea (L) Roth (Convolvulaceae) na Amazônia
Mendes, MGS¹; Melo, LS2; Koolen, HHF2; Almeida, MFO2; Souza, ADL2; Souza, AQL de1,3
Mestrado em Biotecnologia da Universidade do Estado do Amazonas (MBT/UEA)
Depto de Química da Universidade Federal do Amazonas (DQ/UFAM)
3
Laboratório de Genética Humana da Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Amazonas (ESA/UEA).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Biodiversidade, Ipomoea purpurea, Fungos endofíticos, Taxa de colonização & Convolvulaceae.
A planta Ipomoea purpurea, conhecida como glória da manhã ou corda-de-viola é nativa do México (América Central)
e ocorre também na Amazônia brasileira (América do Sul). Pertence a família Convolvulaceae reconhecidamente
produtoras de alcalóides do ergort, cujas substâncias tem ação sobre o sistema nervoso central, são usadas como
medicamento e entorpecentes. Por esses motivos I. purpurea foi coletada para o isolamento de fungos endofíticos
a fim de se conhecer a biodiversidade destes e calcular a freqüência de ocorrência na hospedeira e em seus tecidos.
A coleta foi realizada na marginal do KM 35 da BR174. Os tecidos foram submetidos a assepsia superficial e depois
foram isolados 82 linhagens de fungos endofíticos, agrupados pela macromorfologia, posteriormente a partir
da observação das estruturas microscópicas vegetativas (hifas e micélios) e das sexuais (corpo de frutificação)
foi possível identificar os seguintes gêneros: Pestalotiopsis, Fusarium, Colletotrichum, Lasiodiplodia, Aspergillus,
Penicilium, Taxonomyces e mais oito gêneros não identificados. A taxa de colonização de I. purpurea foi estabelecida
pelo calculo de 108 fragmentos inoculados e 82 colônias isoladas (75,92%). A frequência de isolados das flores foi de
10,97% (9 isolados), do caule 54,88% (45), das folhas 29,27% (24) e das raízes 4,88% (4), contribuindo com uma maior
colonização o caule seguido da folha. Este resultado da raiz vai de encontro com os dados da literatura, uma vez
que a raiz é um dos órgãos vegetais mais colonizados. Esta é a primeira pesquisa sobre a biodiversidade de fungos
endofíticos de I. purpurea e também o segundo relado do gênero Taxonomyces isolado no mundo o que corrobora
sobre a necessidade do conhecimento sobre a biodiversidade microbiana Amazônica. Estudos adjacentes sobre a
produção de metabolitos secundários estão em andamentos e dos extratos de Penicillium e de outras duas linhagens
não identificadas foram detectados a presença de flavonóides que serão isolados a fim de identificá-los e avaliar o
potencial biológico contra insetos e como anti-oxidantes, propriedades estas atribuídas a este grupo de moléculas. Na
continuidade desta pesquisa espera-se testar Pestalotiopsis e Taxonomices contra linhagens de células cancerígenas.
Apoio: FAPEAM, CAPES & CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
137
Avaliação da ocorrência do Sistema Mating Type na
população de Mycosphaerella fijiensis no Brasil
Miranda, EC1,3; Gasparotto, L2; Hannada, RE4; Sousa, NR 1; Paixão, RV1,3; Silva, GF1
Laboratório de Biologia Molecular - Embrapa Amazônia Ocidental - CPAA
Laboratório de Fitopatologia - Embrapa Amazônia Ocidental- CPAA
3
Universidade do Estado do Amazonas – UEA
4
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sigatoka-negra; fitopatógeno; Mat1.1; Mat1.2; compatibilidade sexual.
A sigatoka-negra, causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis Morelet, é a doença mais importante da bananeira
(Musa spp.) na atualidade. O fungo danifica a área foliar e reduz a capacidade fotossintética da planta. Dada a recente
detecção de M. fijiensis no Brasil (1998) e as condições ambientais aqui encontradas, o risco da evolução do patógeno
pode ser avaliado pelo tipo de reprodução realizada, de modo que o estudo da distribuição temporal e espacial
do sistema de mating type (Mat1.1 e Mat1.2) é importante para a predição do tipo predominante de reprodução
(sexuada ou assexuada) e suas correlações com a diversidade genética e o risco da evolução do patógeno. Desse
modo, o objetivo do trabalho foi analisar a ocorrência e distribuição do Mat1.1 e Mat1.2 na população de M. fijiensis
isolada em diferentes Estados do Brasil. As duas formas idiomórficas foram analisadas para cada isolado via PCR. As
reações foram feitas para um volume final de 15µL, usando 50ng de DNA; 1X de tampão; 2mM MgCl2; 0,15mM de cada
dNTP; 0,25 µM de cada primer; 0,4U de Taq-DNA polimerase. A população é composta por um total de 136 isolados
coletados nos Estados do Acre (AC), Amazonas (AM), Mato Grosso (MT), Pará (PA), Rondônia (RO), Roraima (RR) e
São Paulo (SP). A análise da população total apresentou 47,0% Mat1.1, 49,3% Mat1.2 e 3,7% com ambas idiomorfas,
indicando que esses isolados não estavam puros. A distribuição dos genes Mat1.1 e Mat1.2 na população apresentou
uma razão de 0,94, a qual não tem diferença significativa (P <0.05) da proporção esperada 1:1 com base no teste de
χ2. A distribuição de ambos os mating se manteve conforme o esperado em todos os Estados analisados, exceto no
Acre onde todos os isolados analisados contém apenas o Mat1.2. Os dados aqui observados sugerem a habilidade
de recombinação sexual entre os isolados e consequentemente maior capacidade adaptativa do patógeno.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
138
Uso dos marcadores IRAP e REMAP, baseados
em retrotransposons, para análise da diversidade
molecular de Colletotrichum lindemuthianum, agente
causal da antracnose em Phaseolus vulgaris
Santos, LV1,2; Santana, MF1,2; Araújo, EF1,2; Queiróz, MV1,2
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária – BIOAGRO
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, retrotransposon, IRAP, REMAP, antracnose
O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose
do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), se caracteriza por possuir uma alta variabilidade genética, comprovada
pela presença de inúmeras raças fisiológicas. Esta notória variabilidade genética, e consequentemente patogênica,
apresentada por C. lindemuthianum, representa um dos mais sérios obstáculos ao combate a este importante
patógeno, pois ela impossibilita o uso em longo prazo de cultivares de feijoeiro resistentes. A análise do perfil
de elementos transponíveis tem sido usada com êxito para o monitoramento de populações de patógenos.
Esses elementos podem ser utilizados como marcadores moleculares para estudos de estrutura populacional
e epidemiológico. Utilizando uma sequência de retrotransposon de Colletotrichum lindemuthianum, foram
construídos oligonucleotídeos para o emprego das técnicas IRAP (inter-retrotransposon amplified polymorphism)
e REMAP (retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism). O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso
desses marcadores moleculares baseados em retrotransposons para estudar a diversidade genética inter e
intraespecífica de Colletotrichum. Foram utilizados 57 isolados de Colletotrichum lindemuthianum, de diferentes
raças e origens geográficas. Foram amplificados 45 locos. Os índices de Nei mostraram diferenças significativas
entre as populações de C. lindemuthianum divididas em relação à raça e à origem geográficas, demonstrando
que as populações se encontram estruturadas em relação à origem geográfica e patótipo. Nenhuma correlação
clara entre as marcas moleculares geradas por IRAP e REMAP com caracterização patogênica foi encontrada.
C. lindemuthianum possui alta diversidade genética, sendo que a análise de variância molecular demonstrou
que 96,46% da variabilidade se encontram entre as populações de diferentes regiões geográficas. Os resultados
encontrados colaboram para o melhor entendimento da estrutura populacional de C. lindemuthianum
e consequentemente para o estudo de novas estratégias de controle da antracnose no feijoeiro comum.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
139
In silico analysis of potential genes regulated by the
transcription factor Ace2 in dermatophytes
Silva, LG; Peres, NTA; Sanches, PR; Cazzaniga, RA; Martinez-Rossi, NM
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo
Keywords: cell wall, dermatophytes, transcription factor Ace2, comparative genomics and computational analysis
Dermatophytes are pathogenic fungi that infect keratinized tissues of humans and animals, such as skin,
hair and nails. Recently, the genome of several dermatophytes was sequenced by the Broad Institute /
NIH, enabling comparative genomic analyses among the genomes of these dermatophytes species, guiding
studies about the regulation of the expression of genes related to pathogenicity, virulence and environmental
adaptation. The transcription factor Ace2 belonging to the C2H2 zinc finger family presents 5’-CCAGCC-3’
as the consensus sequence and participates in the regulation of genes involved in cell wall biogenesis and cell
cycle control. With the aim of finding a set of genes possibly regulated by the transcription factor Ace2 in the
different dermatophytes, in silico analysis of the 1000bp upstream promoter region of the genome of these
fungi was carried out. Our analysis showed genes related to the formation and integrity of the cell wall, such
as chitin synthetase, endochitinase, endoglucanases, β-1,3 glucanosyltransferase, β-1,3 glucan synthase and
β-1,3 endoglucanase, as well as genes related to cell division, among other processes. Interestingly, these genes
possibly regulated by this transcription factor are present in all dermatophytes tested, suggesting a conservation
in the regulation of these genes by Ace2. These results assist in delineating the molecular strategies to be used
to study the expression of these genes during fungal adaptation to different environmental conditions and
their regulation by this transcription factor, and also their involvement in cell wall remodeling in physiological
conditions and environmental stress, such as the presence of cytotoxic agents and different sources of nutrient.
Financial support: FAPESP, CNPq, CAPES and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
140
Design and validation of a molecular diagnostic through
ciPCR using SCARs for Guignardia citricarpa detection
Adamoski, D1; Kava-Cordeiro, V1; Christo, D1,2; Galli-Terasawa, LV1; Montenegro, DH1; Stringari, D1; Glienke, C1
Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)
Unibrasil, Curitiba, Paraná
[email protected]
1
2
Keywords: Guignardia, Citrus Black Spot, Molecular Diagnostic, ciPCR, SCAR.
Introduction: Citric orchards are a very important parcel of Brazilian agricultural trade balance – a fundamental
part of national economy. However, citriculture has several diseases, particularly Citrus Black Spot (CBS etiological
agent: fungi Guignardia citricarpa Kiely; Anamorph: Phyllosticta citricarpa), which causes substantial money losses
due to the need of pulverization with fungicides for the control. There is a considerable depreciation in the value
of fruits with CBS in the in natura market, with strong opposition to its importation by the European Union, which
is currently Brazil’s most important consumer. But, as expected, the endophytic universe is large and many other
fungi can be found in the same CBS lesion, including another one from same genus and morphologically similar, G.
mangiferae Roy (Anamorph: P. capitalensis). To distinguish them, morphological characters are not enough, and a
molecular approach is necessary. Regarding pathogen slow growth and the necessity of premature detection, methods
cannot have growth-waiting steps. Thus, a ciPCR (culture-independent Polymerase Chain Reaction) approach is
essential for the premature detection of disease, and is a vital step to ensure national orchards health. Objectives:
Design and validate an efficient and sensible assay using SCARs (“Sequence Characterized Amplified Region”) from
RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”) - obtained from pathogenic G. citricarpa strains - for the ciPCR
approach, utilizing DNA from citrus leaves. Methods: DNA from mycelia was obtained with MoBio UltraCleantm
Microbial DNA Isolation kit, followed by RAPD technique, analysis and selection of species-specific fragments,
purification and cloning, sequencing, primer designing, optimization and validation. Then, an optimization of
reaction sensitivity for a ciPCR with DNA extracted from leaves of symptomatic plants was performed, using the
same method described above. Results: Two unique sequences of G. citricarpa were obtained and one primer pair
designed for each. After all tryouts, just one was specific enough for use, with mycelia or leaves. Conclusion: The
designed molecular diagnostic is a viable way to distinguish the causal agent from other endophytical associated
species. Also, the optimized assay was specific and sensitive enough to detect G. citricarpa by ciPCR approach.
Financial support: CNPq-MAPA, UFPR
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
141
Análise da diversidade genética de Puccinia psidii
Winter em Eucaliptus sp. através do marcador
molecular RAPD
Kettener, K1,2; Fernandes, MA1; Furtado, EL3 ; Marino, CL1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Bolsista CNPq
3
Departamento de Defesa Fitossanitária, FCA, UNESP-Botucatu, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Puccinia psidii, RAPD, variabilidade e Eucalyptus sp.
A ferrugem nas Mirtáceas é causada pelo fungo Puccinia psidii e consiste num grande problema para o plantio
de diversas espécies, em várias regiões brasileiras, sendo o conhecimento da existência de polimorfismo
molecular entre diferentes cepas da espécie, uma estratégia importante para o entendimento de como a planta
responde aos diferentes patógenos e para o melhoramento de plantas resistentes. Com o objetivo de conhecer
a existência de polimorfismo molecular entre as cepas deste fungo, coletou-se folhas infectadas em árvores de
Eucalyptus sp. e foram extraídos uredósporos do fungo em pústulas de eucalipto. O DNA foi extraído pelo uso
da resina Chelex® e as reações de PCR, realizadas com primers RAPD (Operon®) pertencentes aos kits OPM e
OPX. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%. Dos primers analisados, foram
encontradas 11 marcas polimórficas, sendo três marcas em OPM-16 e oito em OPX-6, gerando indícios preliminares
de variabilidade entre os fungos existentes nos diferentes clones de Eucaliptus sp. A partir da obtenção dos
iniciadores polimórficos, análises de diversidade e distância genética serão realizadas com o software PopGene
1.32, gerando um dendograma com base na análise de UPGMA baseado na matriz de distância genética de Nei,
1978, abrindo uma perspectiva favorável ao desenvolvimento de marcadores específicos para diferentes raças de
ferrugem, podendo fornecer subsídios para a escolha de novas estratégias de melhoramento de plantas resistentes.
Apoio financeiro: Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”; FibriaCelulose e Papel; CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
142
Detecção molecular do Paracoccidioides brasiliensis
em teias de aranhas
Rizzo, JA1; Macoris, SAG1; Queiroz-Telles, F2; Bagagli, E1
Departamento de Microbiologia e Imunologia, Unesp, Botucatu/SP. 2Departamento de Saúde Comunitária, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, Teia de aranha, Aerossóis, Ecologia, Biologia molecular.
Paracoccidioides brasiliensis (Ajellomycetaceae, Ascomicota) é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose
(PCM), micose sistêmica mais importante na América Latina. A infecção inicia-se nos pulmões, pela inalação
de conídias assexuadas produzidas pela forma saprofítica do patógeno. No entanto, esta fase ambiental do
fungo, como também outros aspectos de sua ecologia são ainda pouco conhecidos, o que impede a adoção de
medidas preventivas. O presente trabalho objetivou avaliar a ocorrência do P. brasiliensis em amostras aerossóis
de teias de aranhas, as quais possuem características peculiares em aderir partículas em suspensão, agindo como
um filtro natural de ar. As teias de aranhas estão distribuídas em praticamente todos os ambientes, inclusive
em aberturas de tocas de tatus Dasypus novemcinctus, hospedeiros naturais do patógeno. As amostras foram
coletadas na Mata da Piscicultura localizada na Fazenda Lageado, Botucatu- SP, em locais onde a ocorrência do
fungo já foi confirmada pelo seu isolamento em tatus. Teias de aranhas foram obtidas utilizando-se palitos de
madeira, acondicionados em tubos (ambos estéreis) e também em lâminas de microscopia. No laboratório, as
amostras foram processadas para análises microscópica, molecular e cultivo em Mycosel. Foram confeccionadas
lâminas das teias obtidas coradas com lactofenol-azul-algodão para a observação, análise e fotodocumentação em
microscópio óptico. A detecção molecular das amostras foi efetuada em reações de PCR com primers universais
para fungos (ITS4 e ITS5) e Nested-PCR com primers específicos para P. brasiliensis (PbITSE e PbITSR), seguido de
sequenciamento. O cultivo foi feito através do rolamento do palito de madeira contendo a amostra sobre o meio
de cultura; as placas foram incubadas em temperatura ambiente e a 35-37ºC. As colônias de aspectos semelhantes
ao P. brasiliensis foram subcultivadas e melhor avaliadas individualmente, quanto aos aspectos microscópicos,
macroscópicos e presença de dimorfismo térmico. Foi feita análise molecular das colônias obtidas através de
PCR com os primers ITS4 e ITS5 e posterior sequenciamento. Foram analisadas 47 amostras de teias de aranhas,
das quais 12 foram avaliadas diretamente por PCR e Nested-PCR e 35 processadas para cultivo, seguido de PCR
da cultura. A análise microscópica das teias evidenciou a presença de diferentes esporos fúngicos aderidos;
e a pesquisa por Nested-PCR mostrou amplificação positiva em 4 amostras, das quais 2 foram seqüenciadas,
apresentando 99-100% de similaridade com P. brasiliensis, segundo análise comparativa pelo blastn. Pelo cultivo
das amostras, obteve-se o crescimento de colônias com diferentes aspectos e colorações. Apesar da detecção
molecular positiva, não foi possível isolar colônias de P. brasiliensis em cultura. Porém, dentre as colônias avaliadas,
confirmou-se a ocorrência de fungos pertencentes aos gêneros Blastobotrys, Candida e Sporothrix, sendo os dois
últimos fungos de importância médica. Amostras de teias de aranhas representam uma simples e eficiente
estratégia para obtenção de bioaressóis contendo partículas infectantes de fungos patogênicos e/ou oportunistas.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
143
In silico analysis of short ESTs from the dermatophyte
Trichophyton rubrum reveals two putative microRNAs
Persinoti, GF; Peres, NTA; Sanches, PR; Martinez-Rossi, NM
Laboratório de Genética e Biologia Molecular de Fungos, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo.
[email protected]
Key words: Trichophyton rubrum, Gene Expression, microRNA, Dermatophytes, Computational Analysis
The dermatophyte Trichophyton rubrum is an anthropophilic fungus that infects human skin and nails being the most
prevalent etiologic agent isolated in cases of human dermatophytoses. In order to assess differential gene expression of
this fungus against various environmental conditions, such as different stages of development, response to cytotoxic
drugs, extracellular pH sensing, and response to different carbon sources (lipids, keratin and keratinocyte medium KGM) thirteen ESTs libraries were constructed. The ESTs obtained were compared with the dermatophytes’ genomes
Trichophyton rubrum, Arthroderma benhamiae, Microscoporum canis, Microscoporum gypseum, Trichophyton
equinum, Trichophyton tonsurans, and Trichophyton verrucosum. Analysis of a subset of 716 ESTs obtained from
these libraries, with less than 80 bp length, generated 680 unigenes, being 35 contigs and 645 singlets after the
assembly using the CAP3 algorithm. In our results, 56 unique sequences were identified with similarity to T. rubrum
databases. Twenty-five of these sequences showed similarity to proteins of this fungus, being 19 of them conserved
among the seven sequenced dermatophytes. Twenty sequences had similarity to T. rubrum predicted genes and 11
with its genome. Comparing the same set of ESTs to the microRNA database mirBase, allowed the identification
of two sequences expressed in the KGM library with similarity to the Mus musculus microRNA miR-2138 and an
EST that showed similarity with the Ciona intestinalis microRNA miR-4171-5p. MicroRNAs play important roles in
silencing and regulation of gene expression. Thus, the availability of the genomes of these dermatophytes allowed the
annotation of short ESTs and identification of two putative microRNAs possibly involved in the regulation of genes
important for adaptive response to physiological and stressing conditions that this micro-organism was exposed.
Financial support: FAPESP, CNPq, CAPES, and FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
144
Identificação de mutantes letais sintéticos em combinação
com o mutante dfg16∆ de Saccharomyces cerevisiae
Bentivoglio,EC1; Barros, MH2; Ferreira-Júnior,JR1
Escola de Artes, Ciências e Humanidades, Universidade de São Paulo
Laboratório de Biogênese Mitocondrial, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, biogênese mitocondrial, letal sintético, DFG16, mitocôndria.
No organismo eucarioto Saccharomyces cerevisiae a proteína Ssn6p é um repressor transcricional dos genes
ativados na presença de glicerol, uma fonte de carbono não fermentável. Nosso laboratório obteve um alelo de SSN6
(ssn6E359) que causa o fenótipo de deficiência de crescimento nesse meio de cultura. Experimentos de supressão
mostraram que o crescimento das células que possuem esse alelo pode ser parcialmente recuperado, quando o
gene DFG16 é superexpresso. Como Ssn6p encontra-se no núcleo e, Dfg16p, na membrana citoplasmática, não
está muito claro como essas proteínas interagem. Logo, para saber como tal interação ocorre, o objetivo deste
trabalho foi construir ferramentas para realizar varredura de genes letais sintéticos, que poderiam auxiliar
no entendimento das prováveis interações genéticas de DFG16 com outros genes, envolvidos na biogênese
mitocondrial. Tais ferramentas são o vetor pMW29-DFG16 e a linhagem aYMW2 dfg16D. Para a construção de
pMW29-DFG16 foram necessárias três etapas, onde o gene DFG16 foi transferido do vetor YIplac211 para o
vetor pYES2 e, finalmente, de pYES2-DFG16 para o vetor pMW29. Necessitou-se, igualmente, para a obtenção
da linhagem aYMW2 dfg16D, de três etapas, que consistiram em PCR do cassete de rompimento dfg16::KanMX,
transformação do mesmo em levedura e seleção dos transformantes em geneticina. Com as ferramentas construídas,
o próximo passo do trabalho será a varredura de genes letais sintéticos em combinação com o mutante dfg16D.
Apoio Financeio: CNPq, FAPESP, USP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
145
Bioinformática aplicada à Bioenergia: Anotação
Genômica Probabilística do fungo Neurospora crassa
Saso, AM1; Vêncio, RZN1
Laboratório de Processamento de Informação Biológica (LabPIB) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: SIFTER, Redes Bayesianas, Anotação gênomica probabilística, Neurospora crassa, Biocombustíveis, Bioenergia
Introdução: Neurospora crassa é um fungo modelo pertencente ao filo Ascomycota, eficiente na degradação
da parede celular de plantas e que tem grande potencial para ser utilizado na produção de biocombustíveis de
segunda geração. O sequenciamento completo do seu genoma foi concluído em 2003 por um consórcio liderado
pelo instituto Broad Institute do MIT nos EUA. O fungo N. crassa possui 9761 genes identificados, sendo 51,03%
ainda sem anotação funcional atribuída. O objetivo deste trabalho de Iniciação Científica é avaliar a performance
do método conhecido como SIFTER - Statistical Inference of Function Through Evolutionary Relationships (Barbara
E. Engelhardt et al, PLoS Comp. Bio. 2005), o qual permite a caracterização probabilística e automatizada de
genes utilizando a técnica de Inteligência Artficial conhecida como Redes Bayesianas. O N. crassa, por ser um
organismo amplamente estudado, possibilitará uma avaliação do desempenho do método de forma controlada.
Ainda, servirá como gold-standard para os projetos desenvolvidos no LabPIB que pretendem propor novas
metodologias de Bioinformática para anotação funcional. Materiais e Métodos: O presente trabalho dividese em duas etapas: a primeira envolveu a criação de um gold-standard no qual organizou-se as informações
funcionais disponíveis para todos os genes em termos da ontologia Gene Ontology (GO), disponíveis na base de
dados do Broad Institute. Foi crucial obter não só as anotações, mas também os Evidence Code associados a elas,
o que, para cada gene aponta com que tipo de evidência experimental/computacional uma função foi inferida.
Apesar de disponíveis no site do Broad Institute, essas informações encontram-se dispersas. Para consolidá-las
desenvolveu-se uma ferramenta, conhecida em Computação como robot, para navegar automaticamente e de
forma não-interativa no site do Instituto, armazenando todas as anotações GO disponíveis. Com o auxílio desse
robot, desenvolvido em Shell Script no sistema operacional Linux, a tabela de anotações foi gerada, evitando uma
busca manual e exaustiva pelos dados. Com a fase inicial concluída, a segunda etapa se inicia com a aplicação do
método SIFTER sobre os dados do organismo N. crassa para prever de forma probabilística as funções de cada
um de seus genes. A avaliação de desempenho do método se dará pela comparação entre os seus resultados e
os dados encontrados no gold-standard obtido na etapa inicial. Resultados: A primeira etapa do projeto foi
concluída de forma satisfatória com a construção de um robot eficiente para obtenção não-interativa e filtragem
das informações do organismo N. crassa, encontradas no site do Broad Institute. O robot e as informações de
anotação GO com Evidence Code estão disponíveis no site do LabPIB em: http://labpib.fmrp.usp.br/~asasso/
robot/. Conclusões: Com a primeira etapa finalizada, a segunda terá início e espera-se conseguir avaliar
satisfatoriamente o método SIFTER, com ajuda da tabela gerada, aplicado sobre os dados do fungo N. crassa.
Apoio Financeiro: CNPq, por meio do programa PIBIC e Projeto Universal
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
146
Variabilidade genética e resistência a carbendazin de
isolados de Colletotrichum spp provenientes de plantas
da vegetação espontânea no estado de São Paulo
Bini, AP1; Waculicz-Andrade, CE1; Adamoski, D1; Fabris, J1; Kava-Cordeiro, V1; Galli-Terasawa, LV1; Spósito, M2;
Glienke, C1
Laboratório de Genética de Microrganismos, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná (UFPR)
Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endofítico, Vegetação espontânea, Colletotrichum spp, Queda Prematura dos Frutos Cítricos e PCR espécie-específica.
Introdução: A “Queda Prematura dos Frutos Cítricos” (QPFC) é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum
acutatum (Simmonds) e ocorre nos trópicos e subtrópicos úmidos das Américas. No Brasil, atualmente, está presente
em diversos estados e seu modo de disseminação e a estratégia de sobrevivência entre as floradas são desconhecidos.
As plantas da vegetação espontânea presentes nos pomares podem abrigar microorganismos patogênicos de forma
endofítica e assim constituir-se em reservatório de inóculo. Estratégias de controle da doença incluem a utilização
de fungicidas, tais como o Carbendazin. Entretanto, a sua utilização tem causado o aparecimento cada vez mais
freqüente de linhagens resistentes. Objetivos: Identificar espécies de Colletotrichum colonizando endofiticamente
plantas da vegetação espontânea em sistemas de produção de citros no Estado de São Paulo; verificar a presença
de C. acutatum como endofítico, sendo fonte de inoculo; verificar a presença de isolados resistentes ao fungicida
Carbendazin. Métodos: Foram investigadas 22 espécies vegetais provindas de 5 isolamentos de pomares da região
de Rincão/SP. A identificação dos isolados foi feita por PCR espécie-específica utilizando os pares de primers
CaInt/ITS4, CgInt/ITS4 e Col1/ITS4, para as espécies C. acutatum C. gloeosporioides e C. boninense respectivamente
e por seqüenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 com o par de primers LS266 E V9G . O teste de resistência ao
fungicida foi realizado através de repique em meio BDA pH6,8 contendo 10 ppm de Carbendazin. Resultados:
Foram obtidos 69 isolados, todos identificados por PCR espécie-específica e sequenciamento como Colletotrichum
gloeosporioides. No teste de resistência ao Carbendazin, 35% dos isolados apresentaram-se resistentes a 10ppm do
fungicida. Conclusões: Todos os isolados foram identificados como pertencentes à espécie C. gloeosporioides. Não
foi observado o fungo C. acutatum causador da QPFC habitando endofiticamente as plantas analisadas. Entretanto,
há necessidade de investigação em novas amostras de isolados de hospedeiros alternativos para se verificar a
possibilidade de serem fontes de inóculo do agente etiológico desta doença. A utilização de Carbendazin em pomares
cítricos tem levado ao aparecimento de linhagens de Colletotrichum resistentes em plantas da vegetação espontânea.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
147
Variabilidade genética e resistência a carbendazin
de isolados de Colletotrichum spp provenientes de
pomares cítricos do estado de São Paulo
Waculicz- Andrade, CE1; Bini, AP1; Adamoski, D1; Stringari. D1; Kava-Cordeiro, V1; Galli-Terasawa, LV1;
Spósito, MB2; Glienke, C1
Laboratório de Genética de Microrganismos - Departamento de Genética - UFPR
Fundo de Defesa da Citricultura – FUNDECITRUS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endofítico, Colletotrichum spp, Queda Prematura dos Frutos Cítricos, PCR espécie-específica e sequenciamento.
Introdução: A “Queda Prematura dos Frutos Cítricos” (QPFC) doença causada pelo fungo Colletotrichum acutatum
(Simmonds) ocorre nos trópicos e subtrópicos úmidos das Américas. No Brasil, atualmente, está presente em
diversos estados e seu modo de disseminação é desconhecido. A identificação das espécies de Colletotrichum
patogênicas a uma determinada espécie hospedeira, bem como a determinação de sua variabilidade são
fundamentais para o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de controle, além de propiciar um melhor
entendimento da epidemiologia da doença. Estratégias de controle da doença incluem a utilização de fungicidas,
tais como o Carbendazin. Entretanto, a sua utilização tem causado o aparecimento cada vez mais frequente de
linhagens resistentes. Objetivos: identificar espécies de Colletotrichum spp endofíticos de plantas cítricas em culturas
do Estado de São Paulo; verificar a presença de C. acutatum como endofítico, e assim constituir-se como fonte de
inóculo para a disseminação da doença; verificar a resistência dos isolados ao fungicida Carbendazin. Métodos:
Foram realizados 2 isolamentos em plantios de 1994 e 1999 de laranja “Valência”, enxertada sobre limão “Cravo”
provenientes das Fazendas Oriçanga em Mogi Guaçú e Califórnia em Barretos, respectivamente. Para o diagnóstico
molecular dos isolados obtidos utilizou-se PCR espécie-específica com os primers CaInt/ITS4, CgInt/ITS4 e Col1/
ITS4 para amplificação de C. acutatum C. gloeosporioides e C. boninense respectivamente e sequenciamento da
região ITS1-5,8S-ITS2 do rDNA com o par de primers LS266/V9G. O teste de resistência ao fungicida foi realizado
através de repique em meio BDA pH6,8 contendo 10 ppm de Carbendazin. Resultados: Foram obtidos 69 isolados,
todos identificados por PCR espécie-específica e sequenciamento como Colletotrichum gloeosporioides. O teste de
resistência ao Carbendazin demonstrou que 37 isolados (31%) são resistentes a 10ppm do fungicida. Conclusões:
Não foi observado o fungo C. acutatum causador da QPFC como endofítico nas plantas analisadas no Estado de
São Paulo, o que sugere não ser esta uma estratégia de sobrevivência do patógeno entre as floradas. A utilização
em pomares cítricos do fungicida Carbendazin tem levado ao aparecimento de linhagens de Colletotrichum
resistentes. A análise do sequenciamento permitiu verificar uma grande variabilidade dos isolados, mostrando que
o complexo C. gloeosporioides provavelmente abriga diferentes espécies não resolvidas utilizando-se sequências ITS.
Apoio Financeiro: CNPq /FAPESP /CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
148
Análise da expressão gênica através de PCR em tempo
real da Enzima Piruvato Descarboxilase em linhagem
industrial da levedura Dekkera bruxellensis
Liberal, ATS; Torres, RRNB; Morais Jr, MA
Laboratório de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética, UFPE
[email protected]
Palavras-chave: Fermentação alcoólica, Dekkera bruxellensis, PDC, ARO 10, Expressão gênica.
Introdução: Nos diversos processos fermentativos, inclusive na fermentação das destilarias de álcool combustível,
a principal levedura contaminante é a Dekkera bruxellensis. A adaptação dessa levedura ao processo industrial pode
ser explicada através da identificação e análise dos genes responsáveis pelas vias do metabolismo central e genes
relacionados que vem sendo feito pelo nosso grupo de pesquisa a partir do banco de dados do seqüenciamento
desta levedura. Identificamos recentemente dois genes na D. bruxellensis, 2774ARO10Db e 3332ARO10Db, ambos
relacionados ao gene PDC que codifica enzimas da família piruvato descarboxilase, responsáveis pelo ponto chave
no metabolismo fermentativo da glicose em Saccharomyces cerevisiae. Nas leveduras o piruvato é descarboxilado
a acetaldeído pela piruvato descarboxilase e, subsequentemente, a etanol pela álcool desidrogenase no processo
conhecido como fermentação alcoólica. Objetivos: Analisar a expressão gênica dos dois genes PDC identificados
na D. bruxellensis, através da PCR em tempo real. Métodos: Foi utilizada a linhagem industrial GDb248 da
levedura D. bruxellensis, isolada da fermentação alcoólica. O cultivo celular desta levedura foi submetido a dois
experimentos, um de resposta rápida (cultivo e coleta após 1 hora) e um de resposta lenta ( foram coletadas
alíquotas do cultivo em 0,1DO e 1DO de concentração celular durante aproximadamente 24horas), e em ambos
foram utilizados dois meios de cultivo YNB sem aminoácidos e sem sulfato de amônia com 2% de glicose, sendo
que no primeiro, foi adicionado 5g/L de sulfato de amônia e no segundo 3,06g/L de fenilalanina. Todas as amostras
coletadas foram submetidas à extração de RNA (Kit Total RNA isolation – NucleoSpin RNA II). A partir do RNA
extraído foi sintetizado o cDNA (kit ImProm-II™ Reverse Transcription System Promega II). Os ensaios de PCR em
Tempo Real foram realizados na plataforma ABI Prism 7300 Applied Biosystems (kit SYBR Green PCR Master Mix).
Resultados: Nos dois experimentos os genes 2774ARO10Db e 3332ARO10Db apresentaram maior expressão no
meio suplementado com fenilalanina e repressão no meio suplementado com sulfato de amônia. No experimento
de resposta rápida o gene 3332ARO10Db foi 28 vezes mais expressso que o gene 2774ARO10Db. Enquanto que no
experimento de resposta lenta o gene 2774ARO10Db é que foi 5 vezes mais expresso que o gene 3332ARO10Db.
Conclusões: Os dois genes PDC encontrados na D. bruxellensis respondem positivamente ao meio com fenilalanina
adicionada. Além disso, o gene 3332ARO10Db é responsável pela resposta rápida, enquanto o gene 2774ARO10Db
é responsável pela resposta lenta, quando a D. bruxellensis é cultivada em meio suplementado com fenilalanina.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
149
Análise filogenética de isolados de Colletotrichum
gloeosporioides associados à antracnose em mangueiras
Souza, A1; Vieira, VC1; Goes, A2; Lemos, EGM1
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,
Universidade Estadual Paulista
2
Laroratório de Fitopatologia, Departamento de Fitossanidade, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual
Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: Análise filogenética, Antracnose, Colletotrichum sp., ITS, Mangifera indica.
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas e, dentre elas, a manga figura como uma das mais consumidas em
todo o mundo. Porém, as perdas quantitativas e qualitativas ocasionadas pela antracnose, doença causada pelo fungo
Glomerella cingulata (anamorfo Colletotrichum gloeosporioides), representam um grande entrave à produtividade,
restringindo principalmente as exportações. O fungo ocorre em todos os órgãos da planta, sendo que nos frutos
ocasiona lesões necróticas, inviabilizando o consumo da fruta. O controle da doença baseia-se essencialmente no
uso de fungicidas e está se tornando cada vez mais difícil, o que sugere a formação de grupos de especialização
patogênica. Devido a dificuldades na caracterização de espécies de Colletotrichum por meio da análise de caracteres
morfológicos, técnicas moleculares têm sido utilizadas na identificação de várias espécies desse gênero. Assim, a
fim de realizar um estudo filogenético de uma coleção de 40 isolados de Colletotrichum sp., foram obtidas sequências
de DNA da região ITS1-5.8S-ITS2, uma região conservada dos fungos, utilizando-se o par de primers ITS1/ITS4 e
um sequenciador ABI3100 (Applied Biosystems). Os isolados que compõem a coleção são provenientes de sete
municípios do Estado de São Paulo e um de Pernambuco, obtidos de folhas, inflorescências e frutos, de diferentes
variedades de mangueiras com sintomas de antracnose. As sequências da região ITS1-5.8S-ITS2 obtidas nesse
estudo apresentaram de 99 a 100% de similaridade com aquelas pertencentes à espécie C. gloeosporioides do banco
de dados (GenBank). Para a realização da análise filogenética as sequências de DNA dos isolados foram alinhadas
com sequências do banco de dados, de Colletotrichum e de outros gêneros que constituíram o grupo externo. Na
árvore filogenética os isolados separaram-se em dois grupos distintos. Observou-se que a formação dos grupos
por similaridade genética não foi condicionada à origem dos isolados, como região geográfica, parte da planta ou
variedade das mangueiras. A distância genética entre os isolados variou de 0.004 a 0.022, enquanto que a distância
genética entre as sequências de C. gloeosporioides desse estudo e as de outras espécies de Colletotrichum se situaram
na faixa de 0.101 a 0.100. Assim, concluiu-se que a análise da região ITS1-5.8S-ITS2 foi eficiente na identificação
dos isolados em espécie e mostrou que há pequena variabilidade genética entre isolados de C. gloeosporioides
independente da região dos quais provieram. Assim, estudos utilizando marcadores moleculares fazem-se
necessários para uma análise mais aprofundada da variabilidade genética entre isolados dessa espécie de fungo.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
150
Cell cycle determination and characterization of the
promastigote stage of Leishmania (L.) amazonensis
Monteiro, JP1; da Silva, MS1; da Silveira, RCV1; Perez, AM1; Golim, MA2; Elias, MCQB3; Cano, MIN1
Laboratório de Telômeros, Depto. de Genética, IBB – UNESP (Botucatu, SP, Brazil)
Laboratório de Citometria de Fluxo, Hemocentro, Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP – Botucatu, SP, Brazil)
3
Laboratório de Parasitologia, Instituto Butantan (São Paulo, SP, Brazil)
1
2
Palavras-chave: Leishmania amazonensis, cell cycle, flagellum, kinetoplast, nucleus
The eukaryotic cell cycle is a precisely controlled phenomena involving the replication and segregation of
organelles culminating in the production of two identical daughter cells. In kinetoplastid protozoa, the cell cycle is
characterized by the duplication of the kinetoplast (mitochondrion), the nucleus and growth of an extra flagellum
prior to cytokinesis. We present in this study the morphological events and the timing of these events during the cell
cycle of Leishmania amazonensis promastigotes. L. amazonensis is the protozoan parasite that causes tegumentar
leishmaniasis, an important neglected disease in Brazil. Cell cycle characterization was done using culture
synchronization with hrydroxyurea treatment followed by flow cytometry analysis, DAPI DNA staining, flagellum
labeling, bromodeoxyuridine incorporation, and indirect immunofluorescence analysis. Results showed that DNA
replication takes around 6-7 hours with the nucleus generally completing division shortly after the kinetoplast. The
new flagellum is formed during late S phase and G2, reaching its final size during the final stages of the cycle (G2/M).
Complete separation of daughter cells may take up to 2 hours after the cycle is completed. During S phase, replication
protein A subunit 1 colocalized with bromodeoxyuridine incorporation confirming that this protein participates in
the DNA replication machinery in the nucleus. Successful synchronization using hydroxyurea treatment allowed us
to determine for the first time the timing and order of the various events that compose the cell cycle in L. amazonensis.
The determination of telomere and kinetoplast DNA replication in synchronized parasites is currently under way.
Apoio financeiro FAPESP, CNPQ e PROPe (UNESP)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
151
Divergência genética em populações naturais de
Lutzomyia longipalpis (diptera: psychodidae) com
diferentes padrões fenotípicos de manchas nos tergitos
de machos
Costa, BRR1; Silva, MH2; Nascimento, MDSB3; Leonardo, FS4; Pinheiro, VC5; Rebêlo, JMM1; Pereira, SRF1
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão, Avenida dos Portugueses S/N Campus do Bacanga, São Luís, Maranhão, Brasil
Mestrado em Biodiversidade e Conservação. Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão, Avenida dos Portugueses
S/N Campus do Bacanga, São Luís, Maranhão, Brasil
3
Departamento de Patologia, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, Maranhão, Brasil
4
Técnico em Entomologia da Fundação Nacional de Saúde. Codó, Maranhão, Brasil
5
Departamento de Biologia, Universidade Estadual do Maranhão, Caxias, Maranhão, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lutzomya longipalpis, Diversidade fenotípica, Polimorfismo genético, RAPD, Leishmaniose Visceral
Introdução: Lutzomyia longipalpis é um inseto de grande importância médica uma vez que é vetor da Leishmania
chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral (LV) nas Américas. O Maranhão é um dos Estados endêmicos
da doença sendo que os Municípios de Raposa, Caxias e Codó apresentam-se, de acordo com dados do Ministério
da Saúde, como de transmissão intensa. Inquéritos entomológicos têm registrado a ocorrência de populações
morfologicamente distintas de Lu. longipalpis nesses municípios, caracterizadas por diferenças no padrão de
manchas nos tergitos dos machos. Algumas populações apresentam um par de manchas claras (1M) localizada
no quarto tergito enquanto outras populações apresentam-se com dois pares de manchas (2M) localizadas no
terceiro e quarto tergitos. Objetivo: Avaliar o grau de divergência genética existente entre quatro populações de
Lu. longiplapis morfologicamente distintas em diferentes áreas endêmicas de LV no Maranhão, que apresentam
características fitogeográficas distintas. Métodos: O DNA de 10 machos de Lu. longipalpis de cada uma das quatro
populações estudadas foi extraído individualmente, em seguida essas populações foram analisadas usando-se
marcadores do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Assim, foram selecionados os primers OPA 03,
OPA 04, OPA 09 e OPA 15 de acordo com a qualidade das bandas geradas e reprodutibilidade dos experimentos.
Foi utilizada a matriz binária no programa STATISTIC versão 7.1 com o método Unweighted pair-group average
(UPGA) para construção do dendograma. Calculou-se também a porcentagem de polimorfismo obtida com cada
primer. Resultados: Um total de 35 loci foram obtidos, sendo 30 polimórficos. O primer OPA 4 apresentou maior
polimorfismo, produzindo 11 perfis diferentes. A análise de agrupamento, realizada pelo método UPGA, produziu
um dendrograma que permitiu a clara separação dos genótipos em dois clados principais de acordo com o número
de manchas nos tergitos abdominais dos machos. Um agrupamento reuniu as populações cujos machos possuem
apenas um par de manchas, provenientes dos municípios de Caxias e Codó, enquanto o outro agrupamento
reuniu as populações com duas manchas, dos municípios da Raposa e Codó. Conclusão: A presença de divergência
genética existente entre as populações com padrões fenotípicos diferentes permite a clara separação dos
genótipos em dois clados principais de acordo com o número de manchas nos tergitos abdominais dos machos.
Fonte Finaciadora: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
152
Silencing of 28 kinases in the anhydrobiotic nematode
P. superbus through RNAi and the effects on survival
Araujo, TF1; Tyson, T2; Burnell, A2; Tunnacliffe, A3; Pereira, TC1
1 - Lab. de Genética Molecular da Anidrobiose, Depto de Biologia, FFCLRP - USP
2 - Department of Biology, National University of Ireland, Maynooth, Ireland
3 - Institute of Biotechnology, University of Cambridge, United Kingdom
[email protected]
Keywords: anhydrobiosis, RNAi, viability, kinase, P. superbus
Introduction: anhydrobiosis (life without water) is a state of biological organisation that provides high stability and
is achieved by certain species when exposed to intense water stress. Anhydrobiotes are able to remain viable after
extreme desiccation and rehydration cycles. Currently, a new area of research named “Anhydrobiotic Engineering”
aims at making cells and other biological samples resistant to water stress, i.e, a long term dry storage. The molecular
process that allows anhydrobiosis is unknown and identification of genes involved in this process is a central target
in this study. Objectives: To evaluate the effects of silencing 28 candidate genes (kinases) in the viability within 24
hours. Materials and Methods: We used the anhydrobiotic nematode P. superbus as model species and C. elegans
as a control, both were grown on NGM plates covered with E. coli. A set of 28 kinase cDNAs, cloned in pDNRLib vector, were amplified via PCR using T7promoter-flanked primers. T7-Amplicons were subjected to in vitro
transcription to produce dsRNAs and subsequently treated with DNase I. DsRNAs were resuspended in buffer to final
concentration of 1 mg/mL. Approximately 200 worms were immersed for 24 hours in the dsRNA solutions. After this
period, worms were evaluated by microscopy to determine viability. Total RNA extraction was performed using the
TRIzol reagent, gene silencing analysis was done via RT-PCR using gene specific primers. Results: Almost all clones
generated single amplicons of the expected size, all amplicons generated transcripts (dsRNAs) of the expected size
as well. In 24 hours no dsRNAs led to dramatic changes of viability (greater than 30%). All analysed genes were
silenced as judged by RT-PCR and densitometry. Conclusions: We achieved successful silencing of each one of the
28 kinases, none of them generated lethal effect on the worms within 24 hours. These results are important for the
future studies, assessing those kinases cDNAs as candidate genes in the process of in anhydrobiosis through RNAi.
Supported by: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
153
Identificação e classificação de ncRNAs em
Trypanosoma cruzi
Grynberg, P1; Bitar, M2; Paschoal, AR3; Durham, AM3; Franco, GR1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ
3
Instituto de Matemática e Estatística – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, RNAs não codificantes, predição in silico
A predição de RNAs não codificantes (ncRNAs) tornou-se um vasto campo de pesquisa e diversas classes de
ncRNAs, com as mais variadas funções regulatórias, catalíticas e estruturais já foram descobertas. Nos últimos
anos, alguns genomas de kinetoplastídeos foram finalizados e estudos de predição de ncRNAs em Leishmania
braziliensis e Trypanosoma brucei foram publicados. De forma semelhante, este trabalho tem por objetivo
predizer e classificar ncRNAs no genoma completo de Trypanosoma cruzi. Para alcançar este objetivo, utilizamos
um algoritmo chamado eQRNA, capaz de empregar análises comparativas em sequências biológicas e realizar
inferência probabilística em alinhamentos genômicos. Os genomas completos de T. brucei e T. cruzi foram
utilizados na geração de alinhamentos iniciais, submetidos à análise do eQRNA. Como resultado, 4.195 sequências
de ncRNAs candidatas (com comprimento maior ou igual à 30 nucleotídeos) foram encontradas. Após a realização
de um blastx (com limite superior de e-value de 10e-05) contra as proteínas anotadas de T. cruzi, 2.813 candidatos
foram identificados como sequências codificadoras de proteínas e, portanto, falsos positivos. As 1.382 sequências
restantes foram submetidas à um pipeline que inclui buscas contra 25 bases de dados diferentes para ncRNAs,
busca estrutural e ferramentas de predição ab initio. 1.301 candidatos não apresentaram evidência alguma quando
comparados com bases de dados de ncRNAs. 49 candidatos correspondem a tRNAs ou rRNAs. 29 candidatos
mostraram similaridade com sequências de ncRNAs de diversas bases de dados. Três foram posteriormente
consideradas falsos positivos. Como próximo passo, pretende-se identificar supostos ncRNAs regulatórios, os quais
podem ser direcionados à elementos presentes nas regiões UTR de RNAs mensageiros. Para tanto, as sequências
de ncRNAs serão comparadas a uma lista de sequências de UTRs 3’ e 5’ obtidas através do processamento de
informações de transcritos de T. cruzi e da base de dados de ESTs. Abordagens in silico estão sendo desenvolvidas
para testar a validade destas sequências de ncRNAs de acordo com parâmetros de energia e estrutura secundária.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
154
Uso da tecnologia de SPOT-Synthesis para caracterizar
SmZF1, uma proteína contendo dedos de zinco de
Schistosoma mansoni
Drummond, MG1; Valadares, DG1; Rocha, EA1; Ávila, RAM1; Silva, CEC2; Granier, C3; Olortegui, CC1; Franco, GR1
Laboratório Genética Bioquímica, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de
Minas Gerais
2
Centro de Pesquisas Renné Rachou, Fundação Oswaldo Cruz. 3Centre de Pharmacologie et Biotechnologie pour la Santé
[email protected]
1
Palavras-chave: SmZF1, Schistosoma mansoni, dedos de zinco, SPOT-Synthesis
Arranjos de peptídeos produzidos através da técnica de SPOT-syntesis são amplamente utilizados para investigar
uma variedade de interações moleculares. SmZF1 é uma proteína contendo dedos de zinco que funciona como
um fator de transcrição no parasito Schistosoma mansoni. Estudos da regulação gênica neste parasito são de suma
importância devido ao seu ciclo de vida complexo, com alternância de fases e ambientes. No presente trabalho,
um arranjo de setenta e seis peptídeos contendo quinze aminoácidos cada e sobrepostos por treze aminoácidos
foi utilizado com o objetivo de incrementar os conhecimentos acerca da proteína SmZF1. Inicialmente, o arranjo
foi utilizado de maneira inovadora para identificar regiões da proteína responsáveis pela sua interação com
moléculas de DNA. A região de interação compreende a α-hélice do terceiro dedo de zinco da proteína, o que
corrobora os resultados já encontrados para outras proteínas dedos de zinco classicamente estudadas. Além
disso, as regiões mais antigênicas de SmZF1 foram também verificadas, e uma parte do segundo dedo de zinco
foi reconhecida como a preferencial para a ligação a anticorpos policlonais específicos anti-SmZF1. O peptídeo
representando tal região foi sintetizado e utilizado para purificar um soro de coelho contendo anticorpos antiSmZF1. A especificidade e reatividade destes anticorpos foram testadas e os mesmos serão agora utilizados
em experimentos objetivando estender o conhecimento a respeito desta importante proteína de S. mansoni.
Apoio Financeiro: Capes e Fapemig
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
155
Epidemiologia Molecular da Giardíase em Uberaba e
padronização de técnicas de purificação de cistos e
extração de DNA
Silva, BC1; Lages-Silva, E 2; Alkmim Oliveira, SM 2
Programa de pós-graduação em Genética, Departamento de Biologia Geral – Instituto de Ciências Biológias (ICB)/Universidade Federal
de Minas Gerais (UFMG) Laboratório de Genética Molecular de Protozoários Parasitas
2
Departamento de Ciências Biológicas - Disciplina de Parasitologia - Universidade Federal do Triângulo Mineiro- UFTM - Uberaba-MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Giardia duodenalis, isolamento de cistos, extração de DNA, região IGS do rDNA, genótipos
Giardíase é uma doença que tem como agente etiológico o protozoário Giardia lamblia que tem como sinônimos G.
intestinalis e G.duodenalis. A infecção ocorre através da ingestão dos cistos e pode ocorrer transmissão por contato
pessoa-a-pessoa ou através da ingestão de alimentos ou água contaminados. O parasita habita o intestino delgado
e trato biliar, e se apresenta sob as formas de trofozoítos que são as formas ativas vivendo e se reproduzindo no
hospedeiro e os cistos que são as formas infectantes e de resistência. A giardíase possui distribuição mundial sendo
mais prevalente nas crianças que vivem em áreas com saneamento básico deficiente. No Brasil sua freqüência varia
de 4 a 30%. O ser humano atua como hospedeiro na cadeia epidemiológica de transmissão, assim como animais
selvagens e domésticos, principalmente os cães. Dados na literatura relacionados com a caracterização genética
tem demonstrado o potencial zoonótico e antroponótico da giardíase humana associado a diferentes genótipos
do parasito. Métodos moleculares baseados na PCR têm demonstrado que a G. duodenalis possui no mínimo
sete genótipos diferentes (A-G), sendo o genótipo A infectante apenas para o homem, possuindo um potencial
antroponótico. O genótipo A pode ser dividido em dois subgrupos I e II. O genótipo B, por outro lado, é infectante
ao homem e a outros mamíferos, apresentando um potencial zoonótico. O presente trabalho teve como objetivos
caracterizar os genótipos Giardia duodenalis circulantes na população humana e correlacioná-los com a possílvel
forma de transmissão desta infecção na região. Avaliamos também a eficiência de quatro técnicas de isolamento de
cistos (Sheater`s 1, Sheater`s 2, Willis e método do anel) e comparamos diferentes técnicas de extração de DNA de
cistos. Foram coletadas 16 amostras de indivíduos com exame parasitológico de fezes positivo para G. duodenalis
provenientes de quatro laboratórios em Uberaba. O método do anel apresentou maior média de cistos isolados,
no entanto, sem significância estatística (p=0,96) quando comparados aos demais e o método de Willis menor
número de cistos recuperados. A técnica de extração de DNA que apresentou maior eficiência foi a lise alcalina
com posterior purificação em coluna do kit QIAGEN. Neste trabalho, a caracterização genotípica de G. duodenalis
foi realizada pela amplificação da região IGS do rDNA. Das 16 amostras, apenas oito apresentaram resultados
positivos para PCR, 50% (4/8) amplificaram o fragmento de 319 pb correspondente ao genótipo B (zoonótico),
37,5% (3/8) amplificaram um fragmento de 261 pb correspondente ao genótipo A2 (antroponótico), e 12,5% (1/8)
apresentaram bandas correspondentes aos dois genótipos associados com uma infecção mista. O predomínio do
genótipo zoonótico nas amostras estudadas sugere a participação dos cães e bovinos na cadeia epidemiológica
de transmissão da giardíase em Uberaba, Minas Gerais, que deve ser melhor avaliada em uma maior amostragem.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
156
Validação da PCR no Diagnóstico da Leishmania
donovani em cães de Palmas Tocantins
Teles, NMM1; Bigeli, JG1; Agostini, MAP1; Noleto, RV2; Fernandes, ISM1; Dias-Oliveira, JD1; Oliveira-Junior, WP1
Laboratório de Biotecnologia - LABIOTEC, Universidade Federal do Tocantins
Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Tocantins, Coordenação de Biossegurança e Qualidade – LACEN/TO, Palmas, TO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: leishmaniose canina; diagnóstico molecular; endemia; k-DNA; linfonodo.
A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença crônica grave, endêmica no Brasil. O Tocantins foi
colocado como a segunda maior prevalência da região norte do País. Em Palmas, a doença se disseminou
pela capital adquirindo uma característica de transmissão claramente urbana. Quanto ao diagnóstico, várias
técnicas podem ser utilizadas, os métodos de amplificação gênica por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
têm se mostrado cada vez mais úteis tanto no diagnóstico como na identificação das espécies de leishmania,
ainda assim técnicas como a demonstração do parasito através de métodos parasitológicos em material de
biópsia ou punção aspirativa são necessárias para um diagnóstico definitivo. Objetivou-se avaliar a ocorrência
de Leishmania donovani em cães do município de Palmas utilizando e comparando dados diagnósticos obtido
por PCR e por diagnóstico parasitológico. Foram coletadas amostras de aspirado de linfonodo de 72 cães, estes
foram ainda analisados clinicamente e classificados como assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos.
Parte das amostras coletadas foram utilizadas na preparação de esfregaços destinados ao exame parasitológico
direto e parte foi destinada à PCR para a pesquisa de DNA de Leishmania donovani, utilizando o par de primers
RV1 (5’ – CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG G – 3’) e RV2 (5’ – CCA CCT GGG CTA TTT TAC ACC A – 3’)
correspondentes à sequência alvo de 145 pb do fragmento LT1, situado no minicírculo do kDNA, do grupo L.
donovani . Os dados foram analisados estatisticamente pelo coeficiente de Kappa, foram calculados ainda copositividade (CP), co-negatividade (CN) e concordância bruta (CB) entre as técnicas. Do total de cães, 10 (14%)
foram classificados como assintomáticos 29 (40%) como oligossintomáticos e 33 (46%) como sintomáticos. Apenas
cerca de 60% dos cães sintomáticos e 50% dos oligossintomáticos foram diagnosticados como positivos por ambas
as técnicas e 30% dos assintomáticos, o que corresponde a três cães foram diagnosticados como positivos, sendo
2 somente por PCR e 1 somente por parasitológico. A concordância estatística entre as técnicas foi classificada
como boa (kappa= 0.73; p-valor=0,0001), a (CP) e (CN) entre as técnicas foram de 74% e 73%, respectivamente,
com uma (CB) de 74%. Conclusões: A clínica foi avaliada como insuficiente quanto ao diagnóstico laboratorial.
A PCR se mostrou sensível no diagnóstico de cães assintomáticos entre os quais diagnosticou como positivos
cães que foram negativos pelo exame parasitológico, sendo o contrário encontrado somente em um indivíduo;
fato esse que pode ser explicado pela possibilidade de infecção por outra espécie de Leishmania, uma vez que
a PCR do presente estudo utilizou primers específicos para o complexo Leishmania donovani. De maneira
geral, as técnicas parasitológica e molecular apresentaram a concordância esperada e se mostraram eficientes
quanto ao diagnóstico. A PCR mostrou-se como boa alternativa para auxiliar na identificação do parasita.
Apoio financeiro: CNPq e Secretaria de Ciência e Tecnologia do Tocantins
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
157
Avaliação de proteínas recombinantes identificadas por
analises proteômicas como candidatos a vacina para
leishmaniose visceral
Rinco, MSO1; Pereira, DHD1; Machado, LFM1; Santos, MS1; Gazzinelli, RT2; Jardim,A3; Fux, B1; Fernandes, AP1
Laboratório de Biologia Molecular – Departamento de Análises Clínicas Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de
Minas Gerais
2
Laboratório de Imunoparasitologia – Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais
3
Institute of Parasitology, McGill University
[email protected]
1
Palavras-chave: leishmaniose, vacina, análise proteômica, análise genômica, A2, IMPDH
Embora seja uma doença negligenciada, a leishmaniose cada vez mais constitui um grave problema de saúde
pública principalmente em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento. Assim, é necessária a persistência
na busca de antígenos altamente imunogênicos para confecção de novas vacinas ou reforço na proteção de
vacinas já existentes. Nosso grupo objetiva a caracterização molecular e imunológica de novos antígenos de
Leishmania chagasi, tendo sido estes identificados por meio de análises genômica e proteômica, e utilizálos como possíveis candidatos à vacina. Estudos de predição nos indicaram proteínas que apresentaram
epítopos com homologia ao complexo MHC Classe I de camundongos que apresentam haplótipos Db e Dd.
Sete proteínas foram obtidas na forma recombinante e selecionadas para caracterização, a saber: Peroxina 5
(Pex 5), Peroxina 7 (Pex 7), Peroxina 14 (Pex 14), Hipoxantina guanina fosforibosiltransferase (HGPRT), Xantina
fosforibosiltransferase (XPRT), Aldolase, Inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH) e GMPredutase. Foram
inicialmente quantificadas pelo método Bradford e submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida para
confirmação do peso molecular. A proteína A2, que já havia sido caracterizada anteriormente como forte
candidato a vacina, foi empregada como controle. Cinco das proteínas foram selecionadas para o teste de
proteção in vivo utilizando camundongos BALB/c. CPG (20 ng) foi utilizado como adjuvante. Dois grupos de
animais foram usados como controle e receberam CPG ou PBS e outros cinco foram imunizados com duas doses
de 50 ng, pela via subcutânea, com intervalo de seis semanas, das proteínas Pex 5, HGPRT, XPRT, Aldolase e
IMPDH. Os camundongos imunizados foram então desafiados, 3 semanas após a segunda dose, com culturas
puras de Leishmania chagasi (1x106). A quantificação de parasitas no baço e fígado foi realizada, utilizando ensaio
de diluição limitante, 2 meses após o desafio. A carga parasitária foi comparada com aquela apresentada pelos
grupos controle. Em conclusão, camundongos imunizados com IMPDH apresentaram capacidade de controlar a
multiplicação dos parasitas no baço e, portanto, a IMPDH pode ser considerada como um antígeno candidato à
vacina. No entanto, estudos adicionais se fazem necessários, especialmente em camundongos com haplótipos Db.
Suporte: FAPEMIG, CNPq, INCTV-CNPq (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
158
Produção recombinante e avaliação da
imunogenicidade do antígeno A2Rel de Leishmania
(Leishmania) chagasi para o desenvolvimento de
vacinas e alternativas em diagnóstico
Machado, LFM1; Pereira, DHD1; Rinco, MSO1; Gazzinelli, RT2; Fux, B1; Fernandes, AP1
Laboratório de Biologia Molecular – Departamento de Análises Clínicas Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de
Minas Gerais
2
Laboratório de Imunoparasitologia – Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: leishmaniose, Leishmania, saúde pública, imunogenicidade, clonagem molecular, antígeno, imunização, A2Rel, vacina,
proteína recombinante
A Leishmaniose é uma doença infecto-parasitária, causada pelo protozoário do gênero Leishmania, que é
transmitido através da picada das fêmeas de flebotomíneos. Formas promastigotas do parasita, após terem sido
introduzidas na pele dos hospedeiros definitivos, permanecem no interior de células do sistema mononuclear
fagocitário na forma de amastigotas. Na leishmaniose visceral, as células parasitadas são principalmente
encontradas em órgãos linfóides, como medula óssea, baço, fígado e linfonodos causando uma doença crônica
de alta letalidade. Tal problema de saúde pública, por sua gravidade, demanda o desenvolvimento de uma vacina
segura e eficaz capaz de evitar a transmissão do parasita e/ou a evolução e progressão da doença. Baseados
em estudos de predição de epítopos e estudos sobre identificação de genes associados à visceralização do
parasita, selecionamos o antígeno A2Rel para avaliação da sua imunogenicidade e capacidade de indução de
proteção contra a leishmaniose. A partir da seqüência A2Rel extraída do banco de dados do Centro Nacional de
Informação Biotecnológica (NCBI) foram delineados oligonucleotídeos que permitiram a amplificação por PCR
do fragmento (900 pb), contendo os epítopos para células T CD8 identificados pela análise in silico. O produto
de PCR obtido foi inserido no vetor pGEM e utilizado para transformar a cepa XL1Blue de Escherichia coli. O
sistema de ligação foi então extraído e utilizado para seqüenciamento e confirmação do fragmento desejado.
A clonagem do trecho responsável pela codificação do antígeno A2Rel em vetor de expressão permitirá a
produção recombinante do antígeno de interesse. A posterior purificação do mesmo nos fornecerá em grande
quantidade a molécula a fim de caracterizarmos a resposta imune celular em camundongos imunizados, além
de permitir a avaliação dos níveis de proteção induzidos pela imunização contra a infecção por L. (L.) chagasi.
Suporte: FAPEMIG, CNPq, INCTV-CNPq (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
159
The Involvement of Replication Protein A-1 with
Telomere Damage Response in Leishmania
Silveira, RCV 1; da Silva, MS1; Golim, MA2; Perez, AM 1;Pavani, R and Cano, MIN 1*
1
2
Departamento de Genéticas, Instituto de Biociências
Hemocentro do HC da Faculdade Medicina UNESP - Botucatu, São Paulo, Brazil
Palavras-chave: replication protein a-1, rpa, telômero, leishmania, telomero de leishmania
Replication protein A is a complex of single-stranded DNA-binding proteins implicated in DNA metabolism,
including DNA repair and telomere maintenance. In Leishmania the subunit RPA-1 (LaRPA-1) binds and co-localizes
in vivo with telomeres. In yeast and humans RPA also works as a telomerase recruiter and as a DNA damage sensor
at telomeres. Its involvement with the DNA damage repair triggers its hyperphosphorylation and the recruitment
of proteins from the RAD51 group. We thought to determine if in Leishmania RPA is also required to protect
chromosome ends from being detected by the DNA damage. Thus, we checked the expression of LaRPA-1 and some
repair proteins in parasites treated and non-treated with sub-lethal doses of the DNA-damaging agent phleomycin.
Phleomycin treatment induced G1/S cell cycle arrest, culture synchronization and caused DNA double-stranded
breaks in L. amazonensis promastigotes. The expression of LaRPA-1 slightly diminished in parasites treated with
phleomycin whereas a gradual increase in the expression of RAD51 occurred probably in response to DNA damage.
Moreover, more LaRPA-1 was immediately recruited to the G-rich telomere strand upon phleomycin-induced
damage, compared with the C-rich telomeric strand, suggesting that the presence of LaRPA-1 may prevent loss of
single-stranded telomeric DNA and also elicit activation of a local response.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
160
Caracterização molecular de proteínas do cinetoplasto
de Crithidia deanei, um tripanosomatídeo que contém
endossimbionte
Souza, SS1,3; Vasconcelos, ATR2; Souza, R2; Gonzaga, L2; De Souza,W3; Motta, MCM3 Silva, R1
UFRJ/ IBFCCF: 1Laboratório de Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro
2
Laboratório Nacional de Computação Científica. UFRJ/ IBCCF .
3
Laboratório de Ultrestrutura Celular Hertha Meyer
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Crithidia deanei, genoma, cinetoplasto.
A família Trypanosomatidae abriga protozoários que parasitam plantas, animais e insetos, sendo os gêneros
Leishmania e Trypanosoma causadores de doenças humanas. Entretanto a maioria das espécies são monoxênicas,
ou seja habitam somente um hospedeiro invertebrado, em geral um inseto, durante todo o seu ciclo de vida. Entre
os tripanosomatídeos monoxênicos, há cinco espécies que contém uma bactéria simbiótica no citoplasma, são
elas: Crithidia deanei, C. oncopleti, C. desouzai, Blastocrithidia culicis e Herpetomonas roitmani. Esta simbiose é
mutualística, ou seja, a bactéria e o tripanosomatídeo não existem separadamente na natureza, sendo assim
excelente modelo para o estudo da origem de organelas e da evolução celular. Uma característica única nesta
família é a presença do DNA mitocondrial que está localizado em uma região alargada da mitocôndria chamada
cinetoplasto (kDNA). A presença da bactéria simbiótica está associada a mudanças ultraestruturais no
protozoário hospedeiro e o cinetoplasto nestes parasitas apresenta um formato arredondado, contendo kDNA
com um arranjo mais largo e frouxo quando comparado ao dos demais tripanosomatídeos. Não há ainda estudos
sobre o cinetoplasto atípico destes protozoários monoxênicos que abrigam o endossimbionte. Em colaboração
com o Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC) realizamos o primeiro sequenciamento de
genoma de monoxênicos: de C. deanei, que encontra-se em fase final de anotação e o genoma de B. culicis.
Nosso objetivo neste estudo é identificar no genoma destes protozoários proteínas associadas ao cinetoplasto
(KAPs) e proteínas envolvidas no processo de replicação do kDNA, comparando os dados obtidos com aqueles
já descritos para outros tripanosomatídeos. Após o uso do sequenciador 454 Roche®, obtivemos sequências que
foram armazenadas e analizadas no sistema SABIA (http://www.sabia.lncc.br). A cobertura do sequenciamento
de C. deanei equivale a 23X, resultando em mais de 51milhões de pares de bases. Resultados importantes foram
obtidos: o conteúdo C+G aproximadamente 48% , a região codificante: 45%, com 17,762 ORFs de tamanho médio
de 1320pb, sendo que 81% das ORFs foram anotadas com o KEGG. Após pesquisa de similaridade, a proteína
que reconhece a origem de replicação do minicírculo (UMSBP) de T. cruzi e KAPs de C. fasciculata apresentaram
identidade positiva superior a 70% quando comparadas as de C.deanei. A partir dos nossos resultados será
possível avaliar o nível de expressão dessas proteínas em C. deanei e comparar com T. cruzi, C. fasciculata e
outros tripanosomatídeos e obter informações relevantes sobre o genoma de protozoários monoxênicos.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ, LNCC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
161
Building up the Leishmania spp. telomeric complex:
a preliminary view
da Silva, MS1; Perez, AM1; Silveira, RCV1; Monteiro, JP1; Madeira, PVM1; Cano, MIN1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP - Botucatu, São Paulo, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: Leishmania spp., telomeres, telomeric proteins, LaRPA-1, LaRbp38
In most eukaryotes, telomere binding proteins such as POT1 and TRF2 play crucial roles in telomere biology by
interacting with several other telomere regulators to ensure proper telomere maintenance and to form high order
complexes known as telosome or shelterin. Leishmania spp. telomeres are composed by the conserved TTAGGG
repeats which are maintained by telomerase. The basic Leishmania telomeric protein complex is formed by the
proteins LaRPA-1 and LaRbp38, which bind in vitro and in vivo, with high affinity, to the G-rich single-stranded
DNA, and by proteins that interact with the double-stranded region of telomeres such as the recently described
TRF homologue. The Leishmania spp. genome, like other trypanosomatid, lacks many of the conserved singlestranded telomeric proteins found in other eukaryotes, such as the CDC13 and POT1 protein homologues. Thus,
we speculate that the Leishmania RPA-1 homologue may play the same roles as POT1/CDC13 at parasite telomeres,
although it can also bind to other single-stranded DNA with high affinity and in a sequence-independent manner.
LaRPA-1 together with the multifunctional LaRbp38 protein, which also interacts with a wide range of GT-rich
sequences, including telomeres, seems to form part of a parasite telomeric complex that resembles the recently
described CST complex. The CST complex is being considered a second telomere capping mode occurring in a broad
variety of species, except budding yeast, and is mainly formed by RPA-like proteins. In this report we used different
approaches to show that LaRPA-1 interacts with both LaRbp38 and with telomerase, and that these protein:protein
interactions seem to occur in a cell-cycle independent manner. In addition, LaRPA-1 partially co-localizes with both
proteins, probably reflecting its functions in DNA metabolism. We speculate whether these protein interactions
reflect the entire telomeric complex or the presence of functionally distinct subcomplexes at parasite telomeres.
Apoio Financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
162
Expressão e caracterização do gene que codifica
uma proteína do tipo Sm associado à U6 snRNA de
Trypanosoma cruzi
Gundi, JS1; Kian, D1; Kataoka, TY1; Longhi, C1; Yamada-Ogatta, SF1; Santos, MRM2; Franco da Silveira, J3;
Silva, JS4; Yamauchi, LM1
Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos, Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina
Universidade Bandeirante de São Paulo
3
Universidade Federal de São Paulo
4
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, Spliceossoma, caracterização, expressão, tripanosomatídeos.
O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, uma patologia que acomete a população
da América Latina. O ciclo de vida desse parasito é caracterizado pela presença de várias formas encontradas em dois
hospedeiros: um vertebrado e outro invertebrado. As formas epimastigotas e amastigotas são replicativas e as formas
tripomastigotas são infectantes. Os tripanosomatídeos apresentam uma característica peculiar, o processamento
dos transcritos por trans-splicing, que consiste na adição de um mini-éxon no terminal 5’ de todos os transcritos. A
proteína Sm associado à U6 snRNA participa do complexo denominado spliceossoma sendo responsável por esse
processamento. Para a caracterização do gene, o DNA genômico de T. cruzi cepa Y foi digerido com 6 diferentes
endonucleases. O DNA foi separado por eletroforese em gel de agarose TBE 0,8%, transferido para filtro de náilon
e hibridado com a sonda radioativa do gene B.1. No ensaio de Northern blot, os RNAs totais de diferentes formas
do parasito foram separados em um gel de agarose 1% em condições denaturantes e transferidos para filtro de
náilon hibridado com a sonda B.1. O gene foi seqüenciado e expresso utilizando-se o vetor pQE30. A proteína
recombinante foi purificada em presença de uréia e utilizada na imunização de camundongos BALB/c. A seqüência
do gene B.1 revelou uma similaridade de 35% com a proteína Sm associado à U6 snRNA. A caracterização do gene
mostrou que esse apresenta um perfil de hibridação simples, sugerindo um baixo número de cópias no genoma,
além disso, o gene é expresso em todas as formas apresentando uma maior expressão nas formas tripomastigotas.
A proteína recombinante foi expressa, na forma insolúvel, em bactérias E. coli M15, tendo um tamanho aproximado
de 15 kDa. A proteína foi purificada em presença de uréia e utilizada para imunizar camundongos BALB/c
para a produção de anticorpos policlonais mono específicos. O soro dos animais reconheceu uma proteína de
aproximadamente 35 kDa na forma epimastigota. Conclusões: O gene apresenta um perfil simples na análise do
genoma sendo transcrito em todas as formas evolutivas. A proteína expressa em sistema heterólogo apresenta
um tamanho menor do que a proteína nativa podendo, então, apresentar alguma modificação pós-transducional.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, Fundação Araucária e ProPPG-UEL
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
163
Mapping of DNA binding site of LaRbp38, a
multifunctional protein of Leishmania amazonensis
Perez, AM1; Da Silva, MS1; Silveira, RCV1; Ribeiro, JA1; Monteiro, JP1; Cano, MIN1
Departamento de Genética, Instituto de Biociencias, UNESP- Botucatu, São Paulo, Brasil
1
Palavras-chave: leishmania amazonensis, telomeric proteins, larbp38, binding site, protein
Rbp38 is a protein exclusively expressed in trypanosomatid parasites, including the etiologic agents of leishmaniasis,
an endemic disease that affect millions of people around the world and in several regions of Brazil. The protein is
encoded by a nuclear gene and it was first described as a mitochondrial RNA stabilizing protein that appears to be
also involved in mitochondrial DNA replication. It seems to be multifunctional since in Leishmania amazonensis,
LaRbp38 interacts in vivo with GT-rich DNA, which includes kDNA and single and double-stranded telomeric
sequences. This study aims to show that LaRbp38 has different subcellular localizations and to map its DNA–
binding domain. To determine its subcellular localization, we first used nuclear and mitochondrial protein extracts
from L. amazonensis, which were subjected to Western blot and revealed with anti-LaRbp38 serum. The results
showed that the protein is present in both compartments being enriched in the mitochondrial fraction. By indirect
immunofluorescence using anti-LaRbp38 serum, the protein was mainly localized in the kinetoplast, showing an
antipodal distribution, but it was also present to a lesser extent, in the nucleus and in some cells it was possible to
visualize the protein at the same time in both compartments. Altogether, these results suggest that LaRbp38 may
play functions in both organelles. In order to map the LaRbp38 DNA binding domain, we cloned overlapping regions
of the LaRbp38 gene and each deletion mutant was heterologous expressed to obtain recombinant polypeptides.
The purified polypeptides were tested in vitro for protein-DNA interactions against GT-rich DNAs (kinetoplast and
telomeric DNAs) using electrophoretic mobility shift assays (EMSA). Our results suggest that the DNA binding site
of LaRbp38 comprises the central region of the protein, between amino acid residues 141 to 235, and is divided in
subdomains with different binding preferences. The implications of these results for are discussed.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
164
Caracterização genética de cistos de Giardia
duodenalis presentes em amostras clínicas e
ambientais através do gene Glutamato Desidrogenase
Durigan, M1; Zucchi, MI2; Franco, RMB3; Souza, AP1
Laboratório de Análise Genética e Molecular, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
APTA-Pólo Centro-Sul, Piracicaba
3
Laboratório de Protozoologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Giardia duodenalis, caracterização genética, Glutamato Desidrogenase
Giardia duodenalis é um protozoário flagelado reemergente que parasita o homem e diversos animais provocando
a giardiose, uma das mais comuns doenças de veiculação hídrica. A prevalência é bastante elevada em países em
desenvolvimento e também em países desenvolvidos, com milhões de casos anuais. Os principais sintomas da
doença são diarréia e dor abdominal embora também possa ser assintomática. A análise de genes conservados
revelou que a espécie G. duodenalis apresenta grande diversidade genética de maneira que foi estruturada em sete
distintos grupos genéticos. Enquanto os grupos A e B parasitam diversos hospedeiros e apresentam potencial
zoonótico, os grupos C, D, E e F apresentam maior especificidade quanto ao hospedeiro parasitado. Este projeto teve
como objetivo caracterizar molecularmente cistos de G. duodenalis obtidos de amostras clínicas e ambientais entre
os sete diferentes grupos genéticos. Após a coleta, as amostras clínicas foram identificadas com o método de Faust e
purificadas através de gradiente de sacarose. Já as amostras ambientais foram filtradas em membranas de celulose
e visualizadas por reação de imunofluorescência direta. A purificação foi realizada por separação imuno-magnética
(IMS). Foram testados seis kits de extração de DNA. Em seguida, a espécie G. duodenalis foi confirmada através de
amplificação de fragmento do gene β-giardina. A identificação dos grupos genéticos foi feita através da amplificação
e sequenciamento de fragmento do gene Glutamato Desidrogenase. As sequências consenso foram comparadas
com sequências de referência, obtidas no GenBank, dos sete distintos grupos genéticos e também de outros
protozoários e fungos. As análises de reconstrução filogenética foram realizadas com os métodos estatísticos de
Máxima Verossimilhança, Neighbour-joining, Statistical Parsimony e Máxima Parcimônia. Até o presente momento
foram identificadas 103 amostras positivas sendo que os genótipos encontrados pertencem aos grupos A, B e D.
Uma amostra com nucleotídeos pertencentes a dois distintos grupos foi identificada, o que sugere a existência de
uma infecção mista ou evento de recombinação. Os resultados permitem que sejam conhecidos os grupos genéticos
que estão presentes na região trabalhada bem como identificados possíveis fontes de contaminação do parasito.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
165
Mapeamento de epítopos CD8 em antígenos de
leishmania como parâmetro para seleção de
candidatos à vacina
Pereira, DHD1; Rinco, MSO1; Machado, LFM1; Fux, B1; Fernandes, AP1
Laboratório de Biologia Molecular – Departamento de Análises Clínicas Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de
Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: leishmaniose, Leishmania, saúde pública, vacina, resposta imune, imunogenicidade, epítopos, MHC-I
A Leishmaniose é um problema grave de saúde pública nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A
resposta imune celular mediada por células T CD4 é essencial para a resistência contra patógenos intracelulares
como a Leishmania. No entanto, existem evidências que células T CD8 também contribuem para controle da
proliferação parasitária, tanto via atividade citotóxica, quanto pela produção de IFN-γ. Vários antígenos de
Leishmania já foram identificados e testados como candidatos à vacina. Muitos foram capazes de induzir
resposta imunológica e oferecer proteção parcial contra infecção por diferentes espécies de Leishmania, embora
pouco se saiba sobre a presença nesses antígenos de epítopos do Complexo Principal de Histocompatibilidade
MHC-I e, portanto para células T CD8. Nesse estudo, procurou-se identificar, por análises in silico, a presença de
epítopos MHC I para camundongos BALB/C e C57BL/6 em antígenos anteriormente avaliados como possíveis
candidatos a vacina contra leishmaniose. Para isso, as seqüencias de aminoácidos dos antígenos de interesse
foram obtidas do banco de dados do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) e submetidas à
pesquisa de peptídeos nonâmeros com homologia à molécula MHC classe I dos haplótipos Db e Dd. Após
a aplicação de algorítimos e coeficientes descritos pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas
(NIAID) por meio do programa de predição online Bimas (http://www-bimas.cit.nih.gov) os epítopos de maior
“score” foram classificados para cada antígeno candidato a vacina. Os resultados da análise in silico foram
comparados com os dados publicados na literatura sobre imunogenicidade e habilidade de induzir proteção nos
camundongos citados. Nossas análises sugerem que há uma correlação entre a presença de epítopos MHC I nos
antígenos e a habilidade destes de induzir proteção. Portanto, a predição de epítopos MHC I é uma ferramenta
adicional importante na seleção de candidatos a vacina e melhora da eficácia de proteção contra leishmaniose.
Suporte: FAPEMIG, CNPq, INCTV-CNPq (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
166
Estudo da prevalência de malária em populações
silvestres de Mycteria americana (Aves, Ciconiiformes)
amostradas em duas regiões brasileiras
Villar, CM1; Del Lama, SN1
Laboratório de Genética de Aves, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
Palavras-chave: Malária aviária, PCR, Plasmodium, Haemoproteus, ninhegos.
As características migratórias da espécie de ave aquática Mycteria americana e o habitat de água doce ocupado
pelas colônias reprodutivas no Brasil são fatores que favorecem a ocorrência de malária aviária. Nesse estudo,
a técnica de PCR foi utilizada para detecção de malária aviária em ninhegos de M. americana para verificar se
integrantes de colônias posicionadas nas regiões subtropical (Pantanal) e tropical (Amapá) estão infectados e
apresentam índices diferentes de prevalência. O diagnóstico foi feito pela amplificação de fragmentos de DNAmit
que codificam a subunidade pequena do RNA ribossomal (RNA 18 S) do Plasmodium spp e do Haemoproteus
spp. As amplificações positivas do fragmento não identificam qual dos dois gêneros de parasitas está presente.
Indivíduos positivos para o DNAmit foram testados com iniciadores específicos para citocromo B de Plasmodium
spp. Foram analisados cerca de 200 amostras de ninhegos provenientes de oito colônias do Pantanal e de quatro
do Amapá, usando-se o DNA extraído de amostras de sangue. No Pantanal, dentre os 141 indivíduos analisados,
14 foram diagnosticados positivos para malária e 127 foram negativos (9,9% de prevalência). No Amapá, dentre os
73 indivíduos analisados, 6 foram diagnosticados como postivos para malária e 67 negativos (8,2% de prevalência).
Os fragmentos amplificados com os iniciadores do citocromo B de sete indivíduos foram sequenciados e a
análise de homologia no Genebank revelou similaridade com a sequência do citocromo B do Plasmodium spp
(92 – 98%). Essa é a primeira vez que é detectada malária em ninhegos na espécie, cuja distribuição se estende
desde o sudeste dos EUA até o norte da Argentina. Conclusões: Os ninhegos da espécie de M. americana com 2
– 4 semanas já estão infectados. Níveis semelhantes de prevalência dos dois protozoários causadores de malária
aviária foram detectados em ninhegos das duas regiões brasileiras. Os resultados revelam que as diferentes
condições climáticas parecem não influenciar significativamente o nível de infestação dessas populações.
Apoio financeiro: FAPESP (2009/54618-0)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
167
Differential processing and Half Life of Transcripts
Generated by a Polymorphic Locus in Trypanosoma cruzi
Simas, CRS¹; Ürmenyi, TP¹; Rondinelli, E2; Silva, R¹*
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro
*[email protected]
1
2
Keywords: Trypanosoma cruzi, mRNA stabilization and RNA processing.
Trypanosoma cruzi belongs to a group of medical relevance eukaryotes and presents unique molecular
characteristics such as production of policistronic transcripts whose transcriptional units are expressed at different
patterns and the gene expression control is mostly post-transcriptional. It was characterized in our laboratory the
TcUMSBP locus which presents in its intergenic region a insertion / deletion (INDEL) polymorphism of 62pb. The
indel present in the locus generates a differential processing of the RNAs derived from these alleles and results in
the production of two distinct polyadenylation sites and differential accumulation of the policistronic RNA from
each allele. When the policistronic RNA is processed the indel remains in the 3’UTR of the gene corresponding
to beta-5 proteasome subunit (B5PS). It was observed by reporter gene assays with the enzyme chloramphenicol
acetyl transferase (CAT), using transient transfection, that the presence of this insertion of the 62pb in the 3’UTR
reporter gene increased production of the CAT enzyme in relation with the deleted allele. To better characterize
this process it was built permanent strains of epimastigotes of CLBrener clone in which the CAT reporter gene
is present in a plasmid vector flanked by the intergenic region of the glyceraldehyde 3 Phosphate desidrogenane
(GAPDH) gene, in the 5 ‘ position, and the polymorphic intergenic region of TcUMSBP, in the 3’ position, which
are maintained in the parasite genome episomaly using G418 selection. We are characterizing these strains for
further experiments. It has been demonstrated that the 3’UTR RNA sequences of trypanosomatids presents signals
to the control of expression of various RNAs including throw the interaction with proteins. The process has not
been fully described for these parasites yet. We have characterized two proteins, TcRRM1 and TcRRM2, which
have two RNA binding motifs each and their sequence is very similar to the Tbp34 and Tbp37 proteins which are
organized in tandem with alternate copies with a gene (Tcp28) of unknown function. The level of TcRRM transcripts
is higher in amastigotes while the Tcp28 is higher in trypomastigotes. Preliminary immunofluorescence assay
showed that TcRRM is located in the cytoplasm in epimastigotes and in the perinuclear region in amastigotes.
Western blot assays with antibodies to TcRRM are underway to analyze the expression of these proteins during
the three phases of development, and if this expression is consistent with the mRNA levels seen previously.
Support by CNPQ, FAPERJ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
168
Redução da expressão do vírus da hepatite C em
cultura de células por extrato bruto de Syzygium
aromaticum
Carneiro, BM¹; Braga, ACS¹; Yokosawa, J²; Rahal, P¹
1 – Laboratório de estudos Genômicos – UNESP/IBILCE – São José do Rio Preto/SP – Brasil
2 – Laboratório de Virologia – Universidade Federal de Uberlândia – Uberlândia/MG – Brasil
[email protected]
Palavras-chave: vírus da hepatite C, JFH-1, cravo-da-índia, Syzygium aromaticum, Huh-7
A Hepatite C é a inflamação do fígado causada pela infecção pelo vírus da hepatite C (VHC), transmitido através
do contato com sangue contaminado. Essa inflamação ocorre na maioria das pessoas que adquire o vírus e,
dependendo da intensidade e tempo de duração, pode levar a cirrose e câncer do fígado. Naturalmente o VHC não
é capaz de se replicar in vitro, entretanto por meio da utilização do replicon genômico pJFH-1, contendo o genoma
completo do VHC, é possível analisar a replicação do vírus da hepatite C em cultura de células Huh-7. O extrato de
Cravo-da-índia (Syzygium aromaticum) é comercialmente utilizado como agente anti-microbiano, entretanto não
se sabe a sua ação ante o vírus da hepatite C. Este trabalho teve como objetivo analisar a capacidade de inibir a
replicação do vírus da hepatite C utilizando-se extrato bruto de S. aromaticum em cultura de células. Dez gramas
do botão floral seco de S. aromaticum foram misturadas em etanol 80% e deixadas sob agitação à temperatura
ambiente por 20 horas. O extrato bruto foi então centrifugado brevemente e o sobrenadante deixado em estufa
a 37°C para a evaporação do solvente. O soluto foi pesado e resuspendido em PBS na concentração de 5mg/ml.
Aproximadamente 104 células Huh-7 infectadas pelo vírus da hepatite C (JFH-1) foram transferidas para placas
de cultura de 12 orifícios. Logo após a transferência, aplicou-se o extrato de cravo-da-índia no meio de cultura das
células e foram analisadas quatro diferentes concentrações do extrato: 25µg/ml, 15µg/ml, 10µg/ml e 5µg/ml. O
RNA total das células foi extraído após três dias e verificou-se a presença ou ausência do vírus por meio de nested
PCR com primers desenhados para a amplificação da região 5’UTR do vírus da hepatite C. Foi possível detectar
a presença do vírus nas amostras com menor concentração (5µg/ml), demonstrando que baixas concentrações
do extrato não são capazes de inibir a replicação viral. Entretanto, verificou-se que nas concentrações de 25,
15 e 10µg/ml o extrato de S. aromaticum foi capaz de reduzir a replicação do VHC a níveis abaixo daqueles
detectáveis pela técnica de nested PCR. Este trabalho demonstrou que o extrato bruto de S. aromaticum é
capaz de inibir in vitro a replicação do vírus da hepatite C sendo esta uma descoberta importante, facilitando o
desenvolvimento e o esboço terapêutico contra a hepatite C. Outros testes mais sensíveis são necessários para
detalhar os níveis de inibição viral, sendo também necessário verificar diferenças na expressão das proteínas virais.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
169
HPV prevalence and co-factors in women from Ouro
Preto, MG, Brazil with normal cervical cytology
Miranda, PM¹; Pitol, BCV²; Moran, MS²; Felix, PM¹; Silva, IDCG³; Carneiro, C²; Martins, DBG4; Lima-Filho,
JL4; Lima, AA²; Beçak, W¹; Stocco, RC¹
¹ Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil
² Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG, Brasil
³ Laboratório de Tocoginecologia, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
4
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil
Keywords: papilomavirus, human papilomavirus, co-factors, cytology, hpv prevalence
Abstract: We have analyzed the prevalence of human papillomavirus (HPV) types in 398 (18-65 years), sexually
active women, attending routine gynecological evaluation in Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil. In this region,
bracken fern (Pteridium aquilinum) is included in human diet. Cytology analysis was done according to Bethesda,
2001. Endocervical samples were tested for HPV DNA with L1 primers MY09 and MY11, RFLP and sequencing.
Univariate risk factor analysis was performed by chi-square test using SPSS software version 15.0.Table 1 and
Figure 1 summarize the results. HPV was detected in 11% of all women (44, of which 32 with only one viral type).
Twelve HPV types were found: the most frequent types were HPV16, HPV6, HPV61, HPV66 and HPV83, different
from other regions in Brazil. The presence of high-risk HPV infection occurs more frequently in younger age,
later sexual initiation, less children, single women, with many sex partners, urban residence and, surprisingly,
it is not increased with bracken fern consumption. The analysis of codon 72 p53 polymorphism showed lower
frequency of Proline homozygotes. Further studies mapping the distribution of HPV types worldwide and cofactors considering the characteristics of each population are necessary to direct future vaccine development.
Financial support: FACEPE, CNPq, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
170
Quantificação de Micobacteriófagos pela PCR
Quantitativa em Tempo Real
Silva, JL; Bastos, GM; Lima-Neto, LG; Luchessi, AD; Souza, WA; Hirata, RDC; Hirata, MH
Laboratório de Biologia Molecular Aplicado ao Diagnóstico, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Micobacteriofagos, Micobacterias, QPCR, Padronização, Clonagem
Micobacteriófagos são fundamentais na elucidação de mecanismos de resistência aos antibióticos, funções de
genes em micobactérias e desenvolvimento de novas técnicas para o diagnóstico da tuberculose. A quantificação
de micobacteriófagos, importante no desenvolvimento de pesquisas, pelo método tradicional é laboriosa, requer
uma grande quantidade de insumos e tem baixa reprodutibilidade. Neste trabalho, foi desenvolvida uma técnica
de quantificação de micobacteriófagos utilizando-se a PCR quantitativa em tempo real (qPCR). 100pb do gene
LysA do micobacteriófago D29 foi amplificada e o produto da PCR clonado no plasmideo pGEMT-easy vector.
A clonagem foi confirmada por restrição enzimática e sequenciamento de DNA. Plasmídeos recombinantes
purificados foram quantificados em triplicata em espectrofotômetro nanodrop e a massa molecular (g/M) de
cada plasmideo calculada no programa Oligo Calculator (http://www.pitt.edu/~rsup/OligoCalc.html). Para
determinação do número de cópias (Nc) em 1µl de cada alíquota utilizou-se a fórmula Na x A2 = Nc x A1, onde:
Na = número de Avogrado, A2 = peso, em ng, da alíquota de plasmideo, A1 = peso, em ng, correspondente a 1 mol
de plasmideo, Nc = número de cópias do plasmideo. Para construção da curva padrão, uma alíquota contendo
108 cópias de plasmideos foi diluida de 10-1 a 10-8. O coeficiente de variação (CV) intra ensaio foi obtido a partir da
quantificação, no mesmo dia, de 9 replicatas de todas as diluições da curva padrão. As diluições foram mantidas
a 4oC e os ensaios repetidos em diferentes dias para avaliação da reprodutibilidade e estabilidade das amostras.
Fagos D29, em concentrações desconhecidas, foram quantificados pela qPCR e os resultados comparados com os
dados obtidos pela técnica convencional. O CV intra e inter ensaio da quantificação em tempo real foi inferior a
3% demonstrando uma alta reprodutibilidade e estabilidade da curva padrão. Ambas as técnicas apresentaram
resultados semelhantes na quantificação de fagos em amostras com titulação desconhecida. Porém, a qPCR
forneceu resultados em 3 hs e a técnica tradicional em 24 hs. O uso de plasmídeos facilitou a manipulação de DNA
para construção da curva padrão, pois a produção de plasmídeos em E. coli é mais simples e rápida (18 h) que a
produção de DNA de micobacteriófagos em alta concentração (72 hs). Adicionalmente, a titulação de estoques de
fagos declina rapidamente, não permitindo o uso de uma curva padrão por um tempo prolongado.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
171
Estudo da variabilidade genética dos fragmentos
gênicos S1 e S2 do vírus da bronquite infecciosa das
galinhas no estado de Minas Gerais
Santos, CEF1; Mourão, MM2; Resende, JS3; Abreu, JT4; Franco, GR1
Laboratório de Genética Bioquímica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz
3
Laboratório de Doenças de Aves, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais
4
Departamento de Medicina Veterinária, Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: vírus da bronquite infecciosa das galinhas, glicoproteína S1, glicoproteína S2, variabilidade genética, análise molecular
e filogenética
O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) do gênero Coronavírus, é o agente etiológico de uma doença
altamente contagiosa que afeta globalmente a avicultura causando grandes perdas econômicas para o setor.
O IBV possui um genoma de RNA fita simples positiva com aproximadamente 27,6 Kb, o qual codifica quatro
proteínas estruturais: glicoproteína da espícula (S), do núcleocapsídeo (N), glicoproteína de membrana integral
(M) e a proteína associada à membrana (E). A glicoproteína da espícula do IBV está presente em uma forma clivada
a qual é composta por duas subunidades (duas a três cópias de cada): a aminoterminal S1 e a carboxiterminal
S2, com 500 e 600 resíduos de aminoácidos, respectivamente. A subunidade S1 é ancorada ao envelope viral
através de interações não-covalentes com a subunidade S2 e apresenta determinantes antigênicos indutores
de anticorpos de neutralização viral e indutores de imunidade celular. A classificação de sorotipos tem sido
efetuada a partir de estudos sobre a subunidade S1. O desenvolvimento da vacinas vivas ou inativadas contra a
bronquite infecciosa das galinhas é baseado no estudo prévio dos sorotipos circulantes da região para a escolha
das estirpes ideais para o programa de vacinação. Para investigar quais estirpes estão circulando no estado de
Minas Gerais, amostras teciduais de surtos da bronquite infecciosa na região foram processadas e propagadas
em cavidades alantóideas de ovos livres de patógenos específicos para isolamento e amplificação do título viral.
Após extração do RNA total do líquido alantóide e transcrição reversa, foram feitas amplificações dos fragmentos
gênicos S1 e S2 para sequenciamento direto no equipamento MegaBACE-1000(GE Healthcare). Foi feita a
tradução in silico das sequências e estas foram em seguida alinhadas e, a partir dos alinhamentos, diagramas de
árvores filogenéticas foram construídas com o programa ClustalW utilizando o algoritmo Neighbor Joining. A
partir da análise das sequências protéicas foram detectados isolados semelhantes e distintos das estirpes de
referência incluindo estirpes vacinais, independente da época em que os mesmos foram obtidos. Baseando-se
nas sequências obtidas do fragmento S1 foi observado que houve eventos de recombinação entre estirpes virais
de diferentes origens, gerando novas variantes de S1. Uma alta identidade foi observada entre alguns isolados
mais recentes e isolados mais antigos, sugerindo uma possível relação de ancestralidade entre eles. Sequências
distintas do fragmento gênico S2 foram observadas em diferentes tecidos de aves do mesmo lote, sendo que nos
diagramas de árvores filogenéticas foi observada uma separação entre sequências obtidas a partir de tecidos do
sistema respiratório e tecidos do sistema digestório. Isto demonstra a existência de tropismo tecidual do IBV.
Apoio financeiro: CAPES, BIOVET, FAPEMIG e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
172
Prevalência dos marcadores sorológicos e detecção do
DNA do vírus da Hepatite B por Reação em Cadeia da
Polimerase em pacientes atendidos em clínica de DST
Barbosa, TC1; Sampaio, MR1; Dutra, DLR1; Leturiondo, AL1
Laboratório de Biologia Molecular, Fundação Alfredo da Matta
[email protected]
1
Palavras-chave: VHB, HBsAg, Anti-HBc total, PCR, região S
A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) continua sendo um grave problema de saúde pública, com uma prevalência
mundial estimada em 350 milhões de portadores crônicos. A Hepatite B crônica é responsável por 1 milhão de
mortes por ano mundialmente, sendo a maior causa de cirrose de fígado e carcinoma hepatocelular. Técnicas
moleculares têm ganhado destaque na investigação clínica para o entendimento da relação parasita-hospedeiro.
Foi estimado a prevalência dos marcadores sorológicos HBsAg e Anti-HBc total e a detecção do DNA do vírus
da Hepatite B por PCR nos pacientes positivos atendidos em clínica de DST em Manaus-AM. Amostras de soro
foram analisadas para o antígeno de superfície (HBsAg) e anticorpos anti-core (Anti-HBc total) em 621 pacientes
atendidos em clínica de DST em Manaus-AM, no período de outubro de 2008 a maio de 2009. O método utilizado
foi a técnica de ELISA, utilizando kits comerciais. A detecção do DNA viral foi pela técnica da PCR, utilizando
primers específicos para a região S do VHB nas amostras positivas para HBsAg e nas 46 amostras positivas isoladas
para o Anti-HBc total, estocadas a -200C. As amostras positivas para DNA viral foram testadas novamente por PCR
para confirmação do resultado, sendo visualizadas em gel de agarose 1% corado com SYBR Safe. Participaram do
estudo, 385 homens e 236 mulheres entre 17 e 59 anos. Foi observada uma prevalência do HBsAg de 0,5% (3/621)
e anti-HBc total de 17,4% (108/621). A presença de DNA viral foi detectada em dois pacientes HBsAg positivos
e em um paciente Anti-HBc total positivo. A prevalência do HBsAg foi baixa, apesar de tratar-se de um grupo
de risco. No entanto foi alta a prevalência do anti-HBc total, corroborando com outros estudos que relatam a
alta endemicidade para Hepatite B na região Norte. A presença de DNA viral na maioria das amostras positivas
para HBsAg confirma, como em outros estudos, a presença do vírus, quando este marcador está presente. Não foi
possível confirmar a ocorrência de hepatite B oculta no único paciente anti-HBc total positivo que apresentou
DNA viral.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
173
Bovine papillomaviruses in the peripheral blood of
cattle: expression in lymphocytes
Campos, SRC¹; Carmo, ACV¹; Carvalho, RF¹; Comenale, G¹; Diniz, N¹; Ferraz, OP¹; Giovanni, DNS¹;
Mazzuchelli de Souza, J¹; Melo, TC¹; Miranda, PM¹; Mori, E²; Brandão, PE²; Richtzenhain, LJ²;
Tofanello, WS¹; Zucateli, R³; Beçak, W¹; Stocco, RC¹
¹ Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil
² Depto. de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, FMVZ-USP, São Paulo, SP, Brasil
³ Laboratório de Parasitologia e Entomologia, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil
Keywords: papillomavirus, bovine papillomavirus, chromosome aberrations, viral expression, papillomatosis
Abstract: Bovine papillomavirus presence in whole blood and in cultivated lymphocytes was first described by
us and the increased levels of chromosome aberrations verified in the lymphocytes were considered as evidence
of the virus action on host chromatin. In the present report, we compare cutaneous lesions (warts), primary cell
cultures from samples of cutaneous lesions and short term lymphocyte cultures analyzing virus expression by RTPCR and chromosome aberrations. Presence of different BPV DNA sequences, BPV 1, 2 and 4, were simultaneously
found in lesion samples, and respective cell cultures and peripheral blood, supporting our previous hypothesis of
activity of these sequences in different tissues and now also showing how they are maintained in different passages
of cell cultures. Specific same viral mRNA was detected in lesion samples and peripheral blood. Chromosome
aberrations detected in the different cells were also similar: BPV persist and is maintained in an active status
in the bloodstream, in particular in the lymphocytes, indicating its importance for viral propagation in the host.
Financial Support: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
174
Sequenciamento genético e análise molecular do
Papilomavírus humano 16 isolado na Amazônia
Barbosa-Filho, RAA1; Rocha, DAP1; Santos, CMB1; Astolfi-Filho, S1
Programa Multi-Institucional de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
1
Palavras-chave: HPV-16; Genoma; Diversidade genética; Região Amazônica; NCR, L1, e6 e E7
O Papillomavirus Humano é responsável por lesões no trato urogenital masculino e feminino, transmitidas
por contato direto ou indireto com a pele infectada ou através de relações sexuais. Na mulher essas infecções
podem evoluir para um câncer de colo do útero, cuja estimativa de incidência para a região Norte, no ano de
2010, foi a maior do Brasil. O HPV 16 é o tipo viral prevalente em lesões do colo do útero e a natureza de suas
infecções depende do grau de integração do DNA viral com o DNA do hospedeiro associada, principalmente,
às oncoproteínas E6 e E7 do HPV. Atualmente o desenvolvimento de vacinas contra o HPV utiliza partículas
“pseudo-virais” formadas pela proteína L1 do capsídeo viral. Contudo, é necessário que o desenvolvimento de tais
vacinas antivirais também considere a grande diversidade das variantes dos tipos de HPV existentes, uma vez que
diferenças entre as regiões genômicas dessas variantes podem influenciar o grau de suas infecções. As análises
das variantes de um determinado tipo de HPV são realizadas por meio do estudo da Região Não Codificadora
viral. Este trabalho descreve o sequenciamento completo do genoma de uma variante do HPV 16, detectado no
Estado do Amazonas, utilizando técnicas de Engenharia Genética, bem como a análise desse genoma através de
ferramentas de Bioinformática. Observou-se, pela análise de distâncias genéticas, que o genoma dessa variante
corresponde a um ancestral do exemplar identificado na literatura como “variante africana tipo 1”, e as análises
filogenéticas, realizadas a partir da Região Não Codificadora, reforçam essa hipótese. Além disso, também foram
detectadas várias mutações ao longo do genoma obtido, resultando em alterações nas posições e na quantidade
de sítios de restrição de sua sequência. As maiores diferenças entre as regiões gênicas do genoma sequenciado e
as correspondentes nas variantes africanas foram observadas ao longo de E7. Porém, os resultados obtidos pela
modelagem molecular neste trabalho não foram conclusivos quanto a alterações significativas na conformação da
estrutura terciária das proteínas E6, E7 e L1.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
175
Diversidade genética de isolados do vírus do amarelo
letal do mamoeiro (Papaya lethal yellowing virus, PLYV)
no Estado do Rio Grande do Norte
Pereira, AJ1; Cascardo, RS1; Andrade, EC2; Zerbini, FM1
Dep. de Fitopatologia/BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mamão, amarelo letal, Papaya lethal yellowing virus, diversidade genética
O mamão (Carica papaya) é uma fruteira de grande importância econômica para o Nordeste do Brasil, região
responsável por 60% da produção nacional. Nesta região, a cultura do mamão é afetada de forma restrita pelo vírus
do amarelo letal do mamoeiro (Papaya lethal yellowing virus, PLYV). Atualmente, este vírus encontra-se disseminado
nas principais regiões produtoras de mamão dos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. O genoma completo do
vírus ainda não foi sequenciado, e poucos estudos foram realizados até o presente sobre a variabilidade genética de
diferentes isolados virais. Os objetivos deste trabalho incluem o sequenciamento do genoma completo e a geração
de informações sobre a variabilidade genética do PLYV. Amostras foliares foram coletadas no Rio Grande do Norte
e o RNA total foi extraído utilizando-se o reagente Brazol. Um par de oligos degenerados foi utilizado em reações
de RT-PCR, levando à amplificação de um fragmento de 900 pares de bases correspondente à região central do
genoma viral, que foi clonado e sequenciado. A análise das sequências indicou identidade com os sobemovírus Rice
yellow mottle virus (RYMV), Sesbania mosaic virus (SeMV) e Southern bean mosaic virus, confirmando a classificação
do PLYV como uma espécie do gênero Sobemovirus. A comparação das sequências dos isolados de PLYV do RN
indicou identidade de 98-100%. Entretanto, quando os isolados do RN foram comparados com um isolado do
Ceará, a identidade variou de 91 a 95%, indicando a existência de um grau elevado de variabilidade genética.
Com base na sequência do fragmento de 900 pb, oligos específicos foram desenhados para, em combinação com
novos oligos degenerados, amplificar fragmentos correspondentes às regiões 5’ e 3’ do genoma viral. A clonagem
e sequenciamento desses fragmentos, completando a sequência do genoma completo do vírus, encontram-se em
andamento.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
176
Caracterização funcional de uma nova proteína que
interage com a serina/treonina fosfatase do tipo 1 em
Dictyostelium discoideum
Farage, L; Feitosa, OR; Da Silva, AM
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: serina/treonina fosfatase; Dictyostelium discoideum; estresse oxidativo
A serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) participa de vários processos celulares vitais tais como apoptose, ciclo
celular e metabolismo de glicogênio. A especificidade pelo substrato, localização celular e funções desempenhadas
pela subunidade catalítica da PP1 (PP1c) é determinada por subunidades reguladoras. Utilizando ensaios de duplohíbrido em levedura, identificamos vários genes que codificam prováveis subunidades reguladoras da PP1 na ameba
Dictyostelium discoideum. Este eucarioto haplóide alterna em seu ciclo de vida uma fase unicelular (crescimento),
em que se alimenta predominantemente de bactérias, e uma fase multicelular (desenvolvimento) desencadeada em
resposta à carência nutricional. Ambas as fases de seu ciclo de vida envolvem processos característicos de eucariotos
complexos, incluindo a fagocitose, quimiotaxia e diferenciação multicelular. Como estratégia para identificar papéis
biológicos da PP1 em D. discoideum, realizamos o nocaute do gene de uma das potenciais subunidades reguladoras
da PP1c. Comparativamente às células selvagens, as células da linhagem nocaute formam alguns aglomerados
disformes durante o crescimento em meio líquido quando observadas por microscopia de contraste de fase e confocal.
Curvas de crescimento das células selvagem e mutante em condições de estresse térmico, osmótico e oxidativo
demonstram uma maior sensibilidade do mutante ao estresse oxidativo induzido por 1mM de H2O2. Entretanto
a sensibilidade aos estresses térmico e osmótico não foi alterada na linhagem nocaute. Nossos resultados levam
a supor a participação desta nova proteína que interage com a PP1 em vias que respondem ao estresse oxidativo.
Apoio financeiro: CAPES, CNPQ e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
177
Caracterização genética de um novo isolado de
Ehrlichia canis no sudeste brasileiro
Alves, RN1; Borges, NA2*; Ueira-Vieira, C2; Rieck, SE1,3; Silva, RP2; Beletti, ME1
Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Morfologia, Laboratório de Histologia, Universidade Federal de Uberlândia
Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia
3
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Triângulo Mineiro, Campus Uberlândia
* [email protected]
1
2
Palavras-chave: Ehrlichia canis, gene dsb, gene p28, clonagem gênica, polimorfismo genético
Ehrlichia canis é o principal agente etiológico da erliquiose monocítica canina (EMC), uma das mais importantes
doenças infecciosas de cães no Brasil. A presença de polimorfismos gênicos entre diferentes isolados de E. canis,
explicaria, pelo menos parcialmente, a ampla variação de quadros clínicos e hematológicos característica da
doença. Porém a quantidade de informações a respeito desta variabilidade genética permanece insuficiente Assim,
o presente estudo relatou o primeiro isolamento e cultivo de E. canis utilizando células DH82 em Uberlândia, a
partir de um cão naturalmente infectado. Após a extração de DNA, primers espécie-específicos para E. canis foram
utilizados para amplificar um fragmento de 365 bp (pares de bases) do gene 16S rRNA da amostra sanguínea
do cão infectado. Sequências parciais dos genes dsb e p28 deste novo isolado de E. canis foram obtidas após a
clonagem utilizando o vetor plasmidial pGEM-T Easy (Promega, Fitchburg, WI, USA) e alinhadas com sequências
correspondentes de outras cepas acessíveis no GenBank. A nova cepa, designada como isolado Uberlândia,
apresentou 99‒100% de similaridade com sequências do gene dsb de outros isolados de E. canis provenientes de
diferentes áreas geográficas, incluindo: Brasil, África e América do Norte. Por outro lado, a sequência parcial do gene
p28 de E. canis Uberlândia diferiu em vários nucleotídeos das sequências correspondentes em E. canis provenientes
do Brasil, Venezuela e América do Norte. Através dessas variações o índice antigênico previu determinantes
antigênicos dos isolados de E. canis, sendo observadas similaridades e algumas diferenças nos epítopos, sugerindo
que esta proteína é antigenicamente diferente entre cepas, independentemente da origem. Estes achados
sugerem que novos estudos são necessários para avaliar a utilidade deste antígeno no sorodiagnóstico da EMC.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
178
Estudo metagenômico de solos de floresta e cultivados
com cana-de-açúcar
Macedo, HS1; Pedrinho, EAN1; Moreira, WMQ1; Val-Moraes, SP1; Souza, JAM1; Lemos, EGM1
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de
Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: 16S rDNA, bactérias, comunidade microbiana, diversidade genética, metagenômica.
BIOTA é um programa científico brasileiro que tem por objetivo principal estudar e resgatar a biodiversidade no
estado de São Paulo. A diversidade microbiana do solo tem importantes implicações sobre aspectos agronômicos,
ciclos biogeoquímicos, emissões de gases de efeito estufa, mudanças climáticas globais e prospecção biotecnológica.
Sendo assim, a metagenômica é um caminho promissor na busca de informações sobre a diversidade genética dos
microrganismos encontrados no solo, já que apenas cerca de 1% dos mesmos podem ser cultivados in vitro. Nesse
trabalho, a técnica da metagenômica foi utilizada para o estudo da diversidade genética, por meio da clonagem e
sequenciamento de fragmentos 16S rDNA de dois sistemas de solo no estado de São Paulo: mata nativa e cultura
de cana-de-açúcar. Fragmentos 16S rDNA foram amplificados, clonados em vetor pGEM-T easy e sequenciados
para análise do grupo bacteriano. As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com sequências do banco
de dados (GenBank), permitindo assim a identificação das bactérias existentes nos solos estudados. Para a análise
filogenética as sequências de DNA obtidas foram alinhadas e analisadas no software Bionumerics (6.0.1 - Applied
Maths). Os dados revelaram que as comunidades bacterianas do solo de floresta pertenciam predominantemente
aos filos Acidobacterium, Verrucomicrobium, Proteobacterium, Firmicutes, Actinobacterium, enquanto
que em solo cultivado com cana-de-açúcar foram encontradas bactérias pertencentes aos filos Firmicutes e
Proteobacterium. Assim, conclui-se que em solos de floresta há uma maior diversidade bacteriana em relação
a solos cultivados com cana-de-açúcar. Desta forma, estudos complementares fazem-se necessários para
o melhor entendimento das comunidades microbianas existentes em solos de floresta e solos cultivados.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
179
Prospecção de genes de celulase presente em
biblioteca metagenomica
Rodrigues, GR1; Pizauro, JM1; Lemos, EGM1 ;Picchi, SC1 e Pereira¹, MR.
¹Laboratório de Enzimologia Aplicada – Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas Universidade Estadual Paulista, Dep.
De Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Via de Acesso Professor Dr. Paulo Castellane s/n, CEP 14884-900
Jaboticabal,S.P.
[email protected]
Palavras-chave: diversidade microbiana, solo, celulose, celulase e biblioteca metagenomica
Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais
na manutenção de ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na
mineralização da matéria orgânica. Devido a esses importantes fatores, a busca por enzimas que possam ser
utilizadas nos diversos setores industriais esta aumentando. A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela é
formada por um complexo multienzimático, denominado celulosomo, constituído por endoglucanase (EC 3.2.1.4),
exoglucanase (EC 3.2.1.91) e β-glucosidase (EC 3.2.1.21), capaz de hidrolisar celulose através da quebra da ligação
β,1-4. No presente trabalho foi realizada uma busca de gene relacionado com hidrólise da celulose em biblioteca
metagenômica de solo de arboreto de eucalipto, pertencente ao Laboratório de Bioquímica de Microrganismos
e Plantas (LBMP) do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, FCAVUNESP – Câmpus de Jaboticabal (SP). Para a identificação dos clones foram realizados testes bioquímicos e
após a identificação de possíveis clones positivos o DNA cosmidial foi extraído de segundo Sambrook, 1989, e
posteriormente quantificação. Para identificação de genes para β-glucosidase foi necessária a construção de um
par de oligonucleotídeo iniciadores degenerado. Em seguida foram realizados reações em cadeia da polimerase
(PCR), eletroforeses que permitiram a identificação de um único clone para a construção da sub-biblioteca. Onde
foram obtidas 14 placas (mega-titer plates” 96 poços), que foram submetidas a extração DNA pasmidial segundo
Sambrook, 1989, quantificação e sequenciamento (ABI 3700 DNA Analyzer-Applied Biosystems), posteriormente
as sequências foram analisadas pelo pacote phredPhrap/Consed. Através das análises foi possível identificar
um operon correspondente a cellulose synthase.Conclusões: Todo os testes realizados foram eficientes, mas é
necessário estudo mais abrangente das seqüências obtidas através do pacote phredPhrap/Consed para obter
mais informações sobre o operon encontrado e possíveis seqüencias ainda não identificadas.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
180
Isolamento e Caracterização Parcial da Microbiota
Intestinal do Mosquito Aedes Aegypti Mantido em
Codições Estéreis
Machado, SH1; Rodrigues, RCC1; Aguiar, TFC1; Gaio, AO1; Monesi, N2; Lemos, FJA1
1
2
Laboratório de Bioctenologia, UENF, Campos dos Goytacazes, RJ, Brazil
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil
Palavras-chave: Aedes aegypti, intestino médio, divertículo ventral, microbiota, DNA ribossomal.
As interações entre microorganismos e insetos vetores de doenças pode ser um fator importante para controlar a
transmissão de patógenos. O estudo da microbiota e seu papel na fisiologia de insetos vetores podem levar a novas
estratégias para o controle de doenças humanas transmitidas por insetos. O objetivo deste trabalho foi isolar e
caracterizar a microbiota do intestino de Aedes aeygpti mantidas sob condições assépticas. Inicialmente, as pupas
foram higienizadas em solução de hipoclorito de sódio e transferidas para gaiolas hermeticamente fechadas e
autoclavadas. Em intervalos específicos, as fêmeas foram dissecadas higienizadas a fim de obter o intestino médio
e os divertículos intestinais ventral. Quinze diferentes isolados bacterianos foram obtidos através de técnicas de
isolamento microbiológico, onde nove isolados foram obtidos a partir do intestino médio e seis do divertículo ventral.
Todos os isolados foram Gram-negativos e em forma de bastão. Foi possível observar que alguns isolados foram capazes
de incorporar hemina, lisar glóbulos vermelhos, icorporar hemoglobina e produzir ácidos orgânicos. As seguintes
espécies foram identificadas através da análise de seqüência do DNA ribossomal: Serratia sp., Serratia plymuthica,
Aquitalea magnusonii, Klebsiella oxytoca., Burkholderia sp., Aquitalea. sp., Chryseobacterium sp., Pectobacterium sp., e
Pseudomonas sp. Nossos resultados sugerem que estas espécies de bactérias são transmitidas de pupa para a fase adulta.
Instiuição de fomento: FAPERJ, CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
181
Identificação de micro-organismos de solos das
margens dos rios Negro e Solimões pela análise das
regiões ITS
Santos, EKN1; Honda, RT2; Nozawa, SR1; Ferreira-Nozawa, MS1
Laboratório de Expressão Gênica, Centro Universitário Nilton Lins, Manaus, Amazonas, Brasil
Laboratório de Macromoléculas Biológicas, Centro Universitário Nilton Lins, Manaus, Amazonas, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Região ITS1, Região ITS2, Gene 5.8S rDNA, Micro-organismos de solo, Solos amazônicos.
Os solos inundáveis das margens dos rios Negro e Solimões possuem características geoquímicas distintas, como
pH e concentração de carbono solúvel. O conhecimento da comunidade microbiológica constitui mais um fator
na caracterização desses dois ambientes. A abordagem molecular através do sequenciamento e da análise das
regiões intergênicas ITS1 e ITS2 (Internal Transcribed Spacer) e do gene 5.8S rDNA tem sido descrita para o estudo
de comunidades fúngicas em diferentes áreas, como no diagnóstico de infecções em humanos e na diversidade
microbiológica de solos. O presente estudo objetivou identificar micro-organismos de solos das margens dos rios
Negro e Solimões em área sem influência antrópica. Foram coletadas três amostras de solo para a margem do
Rio Solimões (03°13’20.4”S 059°59’16.6”W) e para a margem do Rio Negro (03º08’12.1”S 60º08’04.9”W) a montante
da confluência dos rios. O DNA genômico foi extraído diretamente do solo coletado. As regiões ITS1 e ITS2 e o
gene 5.8S rDNA foram amplificados por PCR (Polimerase Chain Reaction) com os oligonucleotídeos iniciadores
ITS1 e ITS4. O produto da PCR foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, utilizando-se Escherichia coli (Mos blue) para
transformação. Os clones foram sequenciados e, após a eletroforese capilar, submetidos ao programa Sequencing
Analysis 5.3.1. As sequências foram processadas (Phred / Phrap / Consed) gerando-se contigs. Após a remoção
do vetor, utilizando-se a ferramenta VecScreen, os contigs foram submetidos à consulta de similaridade de
nucleotídeos na base de dados não redundante do NCBI (National Center for Biotecnology Information), por meio
da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). O total de clones sequenciados foi 237. Para margem
do Rio Solimões, 53 clones apresentaram sequências válidas (Phred ≥ 20) e 17 contigs foram gerados, dos quais
seis apresentaram similaridade com a sequência completa de ITS1, do gene 5.8S rDNA e de ITS2. Dois contigs
foram similares à sequência de Botryosphaeria dothidea (100% e 99% de similaridade), dois foram similares a
Fusarium proliferatum (87% e 82%), um a Coriolopsis caperata (95%) e um contig foi similar a um Basidiomiceto
não cultivado (81%). Para margem do Rio Negro, 57 clones apresentaram sequências válidas e 15 contigs foram
gerados. Um apresentou similaridade com Lacazia loboi (76%) e um com fungo ectomicorrízico não cultivado
(81%). Os resultados sugerem a presença de Botryosphaeria dothidea, Coriolopsis caperata e Fusarium proliferatum
em solo da margem do Rio Solimões e de Lacazia loboi em solo da margem do Rio Negro, micro-organismos
relevantes do ponto de vista biotecnológico e para a ecologia microbiana. Outros micro-organismos precisam
ser, progressivamente, identificados a fim de contribuir com o conhecimento da microbiologia amazônica.
Apoio financeiro: FAPEAM, CNPq, CAPES, UNINILTON LINS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
182
Identificação de novos genes de esterase/lipase em
biblioteca metagenômica de consórcio microbiano
degradador de óleo diesel
Pereira, MR1; Paixão, DAA1; Maester, TC1; Campanharo, JC1; Lemos, EGM1
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, Departamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: metagenoma, lipase, esterase
Há uma longa tradição no uso de microrganismos e enzimas microbianas para o processamento de materiais
naturais. Atualmente na manufatura, industrialização alimentícia e produção de detergentes, as enzimas servem
como “chaves” de ativação de componentes presentes nos mesmos. A maior parte dos microrganismos que compõe
a biosfera ainda não foi estudada, o que foi confirmado pelas estimativas da complexidade do DNA e descoberta
de várias seqüências únicas dos genes DNA/RNA ribossomal 16S e 18S de várias fontes do ambiente. A fim de
acessar o recurso genético da maioria das espécies microbianas, a abordagem metagenômica passou a ser usada, e
estudos demonstraram que resultados metagenômicos oferecem uma combinação quase ilimitada para encontrar
novos genes codificadores de produtos gênicos relevantes como lipases e esterases. Em função do enorme
potencial biotecnológico, as enzimas lipolíticas vêm atraindo atenção no mercado global. As lipases microbianas
apresentam baixa toxidade, são facilmente biodegradáveis e trabalham em condições amenas, destacando-se pela
quimioseletividade, o que reduz os efeitos colaterais dos fármacos. O objetivo do trabalho foi o de prospectar genes
para a produção de lipases e esterases em biblioteca metagenômica de fosmídeo de um consórcio microbiano
degradador de óleo diesel, de aproximadamente 5000 clones. A busca na biblioteca pela atividade lipolítica foi feita
em meio Luria-Bertani (LB) suplementado de 1% tributirina, 0.1% goma arábica, 12.5 μg/mL chloramphenicol
e 0.001% arabinose. As células ficaram à 37ºC por 48h e depois foram transferidas a 4ºC. O desenvolvimento foi
analisado e trinta clones tiveram formação de halo ao redor da colônia, sendo que dois tiveram halos maiores que os
demais. Estes dois clones foram selecionados, sub-clonados em vetor puC19 e seqüenciados no ABI 3100 (Applied
Biosystems – CA, USA). O contig completo de ambos os clones foi analisado no ORF Finder do Nacional Center
for Biotechnology Information (NCBI) e as orfs geradas foram comparadas com o próprio banco. Os alinhamentos
foram feitos usando o programa Clustal W e as árvores filogenéticas construídas através do MEGA. Para o primeiro
clone foi identificada uma orf de esterase/lipase de 399 aminoácidos, 78% identidade com uma possível esterase/
lipase. Já o segundo clone apresenta quatro orfs congruentes de esterase/lipase, sugerindo que todos estão
envolvidos na codificação da enzima, sendo que, para uma das orfs, há 94% identidade com uma possível lipase/
esterase de bactéria não cultivada, e os alinhamentos indicam uma nova enzima lipolítica dentro da família V.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
183
Caracterização de microrganismos halófilos isolados
de solo salino
Seravalli, JN¹; Figueiredo, TC¹; Bucciarelli Rodriguez, M²; Lima Bittencourt, CI²; Farias, ST¹
¹Depto. Biologia Molecular, CCEN, Universidade Federal da Paraíba
²Depto. Biologia Geral, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais
Palavras-chave: tolerância, regulação osmótica, microorganismos halófilos, 16S RNAr, teste bioquímico.
O aumento da salinização de solos tem tornado cada vez mais necessário o estudo da tolerância ao sal e de
mecanismos de regulação osmótica. Buscando exemplos de mecanismos de tolerância ao sal foram isolados e
caracterizados microorganismos halófilos. Foi feita a caracterização de sete microorganismos isolados de uma
salina em Mossoró, RN, Brasil, os quais eram capazes de crescer em 2,56M NaCl (15% w/v). Inicialmente, analisamos
as taxas de crescimento dos microrganismos em diferentes condições de estresse salino. Todas as linhagens
cresceram em uma concentração até 15% de NaCl, portanto, obtiveram crescimento similar aos microrganismos
moderadamente halófilos. Diante dos resultados, as linhagens ISO 5.15 e ISO 6.15 foram as únicas que apresentaram
característica de dependência a altas concentrações de NaCl. Estas, não cresceram em meio sem sal e, sempre que
foi utilizado concentração elevada de KCl esses organismos não obtiveram sucesso no crescimento. Sendo assim,
parece que as duas linhagens precisam de certa concentração de NaCl para o desenvolvimento. Posteriormente,
os isolados foram submetidos ao teste de GRAM utilizando-se como controle positivo a Staphylococcus aureus e
como controle negativo a Escherichia coli. Dentre os sete isolados, três apresentaram característica gram-positiva
(ISO 2.15, ISO 4.10 e ISO 7.15), três apresentaram característica gram-negativa (ISO 5.15, ISO 6.15 e ISO 9.10) e
um apresentou característica tanto para gram-positivo como para gram-negativo (ISO 1.15). A amplificação do
gene 16S RNAr utilizando primers bacterianos mostrou que apenas os isolados que apresentaram característica
gram-positiva tiveram seu 16S RNAr amplificado. Com base nesses resultados pudemos concluir que estes
microorganismos gram-positivos pertencem ao Domínio Bacteria, enquanto que para os microorganismos gramnegativos o resultado mostrou ser inconclusivo. Adicionalmente, foram feitos testes bioquímicos usando o kit
API-20E (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) para caracterizar a habilidade dos isolados em empregar diferentes
compostos como fonte de energia. O teste foi realizado com açucares e aminoácidos. Dentre os açucares testados
(glicose, manitol, inositol, sorbitol, ramnose, sacarose, melibiose, amygdalin e arabinose), o resultado revelou
ser positivo em todas as sete linhagens para a arabinose em solução salina a 10%. Em solução salina a 0,85%, o
teste foi positivo para os açucares glicose, manitol e amydalin na linhagem ISO 7.15 e para os açucares glicose e
inositol na linhagem ISO 4.10. Dentre os aminoácidos, em cinco linhagens (ISO 1.15, ISO 2.15, ISO 4.10, ISO 7.15
e ISO 9.10) o resultado foi positivo para a urease, em três linhagens (ISO 4.10, ISO 5.15 e ISO 6.15) foi positivo
para o triptofano deaminase, em uma linhagem (ISO 2.15) foi positivo para a β-galactosidase e em uma linhagem
(ISO 1.15) foi positivo para a arginina dihidrolase, acetoina e gelatinase. Estes dados mostram que organismos
halófilos formam um grupo diverso de organismos que apresentam um metabolismo complexo e particular.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
184
Clonagem molecular do gene sintético da lectina
recombinante rBVLI de Bauhinia variegata visando sua
utilização como insumo biotecnológico
Moreira, GMSG1; Klafke, GB2; Pereira, JL2; Conceição, FR1; Dellagostin, OA3; Pinto, LS2
Laboratório de Imunologia Aplicada, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas
3
Laboratório de Biologia Molecular, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: clonagem molecular, lectinas, Bauhinia variegata, bioinformática, proteômica.
Lectinas são proteínas de origem não imune capazes de se ligarem de maneira reversível a carboidratos
desempenhando papéis biológicos em processos celulares como comunicação celular, infecção parasitária,
metástase tumoral, regeneração e atividade anti-HIV. Dentre as lectinas vegetais com potencial biotecnológico,
podemos destacar a lectina BVL de Bauhinia variegata, que já foi isolada e parcialmente caracterizada pelo
nosso grupo, sendo identificadas duas isoformas: BVLI e BVLII. Essa lectina é oriunda de uma planta, o que
dificulta sua obtenção para aplicações em larga escala. Por ser uma glicoproteína, o processo de cristalização
para a determinação de sua estrutura tridimensional é, também, dificultado. O desenho de um gene sintético
para expressão dessa lectina, portanto, tem a finalidade de resolver esses problemas, facilitando sua produção
e purificação para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos. Para isso, o gene que codifica para a lectina
BVLI foi construído in silico, com o auxílio do programa Vector NTI (Invitrogen). A sequência de nucleotídeos
foi desenhada para conter códons otimizados para Pichia pastoris e sítios para enzimas de restrição nas duas
extremidades. A síntese do gene foi realizada pela empresa Epoch Biolabs® (USA), que procedeu a clonagem do
gene no plasmídeo pUC18. Este plasmídeo foi digerido com BamHI para a liberação do fragmento de interesse.
A ligação do gene foi procedida nos vetores pAE e pET32a de expressão em E. coli. Paralelamente, o pUC18
foi digerido com EcoRI e XbaI para clonagem no vetor pPICZαB de expressão em P. pastoris. Os produtos das
ligações foram transformados em células de E. coli TOP10 e as colônias resultantes foram selecionadas para a
identificação dos clones recombinantes. Os plasmídeos resultantes pAE-bvlI, pET32a-bvlI e pPICZαB-bvlI,
foram caracterizados por PCR, digestão enzimática e sequenciamento, procurando-se verificar a integridade
das construções. Após a confirmação da qualidade dos recombinantes, cepas de expressão de E. coli e P. pastoris
serão transformadas e submetidas a testes para a confirmação da presença da lectina rBVLI. A rBVLI resultante
da levedura será estruturalmente semelhante à original, podendo ser aplicada de maneira ativa. Já a resultante
de E. coli não sofre o processo de glicosilação, permitindo que as lectinas obtidas pela expressão desse gene
sintético sejam cristalizadas e gerem informações sobre a estrutura tridimensional da BVLI. Quando obtida de
maneira ativa, seja de E. coli ou P. pastoris, a rBVLI será usada em diferentes ensaios de atividade biológica da
lectina, tais como: inibição do crescimento de fungos e bactérias; bioterapia anticâncer; e regeneração tecidual.
Apoio financeiro: Capes
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
185
Bioprospecção de genes de resistência à eritromicina e
doxiciclina do metagenoma oral
Venturini, AM1; Saito, D1
Laboratório de Microbiologia e Imunologia, Departamento de Diagnóstico Oral, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade
Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Metagenômica, Resistência bacteriana, Eritromicina, Doxiciclina, Biofilme dentário
A metagenômica consiste na análise simultânea dos genomas presentes em comunidades complexas através de
abordagens independentes de cultivo e permite um novo enfoque na detecção de genes de resistência bacteriana,
um dos principais problemas atuais para a saúde pública. Nesse sentido, a diversidade de microrganismos presente
no biofilme dentário possui grande potencial para a prospecção de novos genes de resistência. Eritromicina e
doxiciclina são antibióticos de amplo espectro frequentemente utilizados na prática clínica. A eritromicina
pertence ao grupo dos macrolídeos e seu mecanismo de ação promove a inibição da síntese protéica das bactérias
suscetíveis ao ligar-se de maneira reversível à subunidade 50S do ribossomo. A doxiciclina é um antibiótico
semi-sintético derivado da tetraciclina que ao ligar-se com a subunidade 30S dos ribossomos impede a ligação
do aminoacil-tRNA, também inibindo a síntese protéica. Amostras de biofilme dentário foram coletadas de 10
pacientes portadores de periodontite agressiva selecionados na Clínica Odontológica da Faculdade de Odontologia
de Piracicaba. O DNA metagenômico foi extraído, seguido de digestão por endonucleases, análise em eletroforese
em gel e ligação de fragmentos de DNA em vetor plasmidial. As moléculas recombinantes foram transformadas
em Escherichia coli DH5-α. Os clones resistentes foram caracterizados fisiologicamente por antibiogramas para
eritromicina e doxiciclina. No total, 853 clones foram isolados. 417 clones foram isolados em placas contendo
eritromicina e 18 (4,3%) apresentaram resistência. Dentre os resistentes, 16 também apresentaram resistência
a doxiciclina. 436 clones foram isolados em placas contendo doxiciclina, dos quais 34 (7,80%) apresentaram
resistência. Destes, 27 também apresentaram resistência à eritromicina. Os resultados indicam que uma
parcela significativa da microbiota do biofilme dentário possui genes de resistência aos antibióticos utilizados
no estudo. Ademais, a alta prevalência de clones duplamente resistentes sugere que os genes de resistência
estejam presentes em elementos genéticos relativamente próximos no genoma dos microrganismos doadores.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
186
Oligonucleotídeos iniciadores para a detecção da
diversidade de microinvertebrados em água doce
Suleiman, AKA1; Roesch, LFW1
Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA) – Campus São Gabriel
[email protected]
1
Palavras-chave: diversidade; microinvertebrados; qualidade ambiental; espaço intergênico;
Introdução: As espécies de microinvertebrados em água doce ainda são pouco conhecidas e uma das possibilidades
para a análise da diversidade de microinvertebrados aquáticos é o uso de metodologias baseadas em biologia
molecular que possibilitem o estudo das comunidades de forma mais rápida e precisa. Objetivos: Desenvolver uma
metodologia para a detecção rápida da diversidade de microinvertebrados de água doce para utilizar os resultados
como indicadores de qualidade ambiental. Métodos: Amostragens serão realizadas com o auxílio de duas redes
de plâncton. Uma rede terá abertura de malha de 0,2 mm que servirá para a retirada dos macroinvertebrados da
amostra e a outra menor que 0,2 mm para a captura dos microinvertebrados. Após a coleta, as amostras serão
lavadas com álcool etílico e o DNA dos microinvertebrados será extraído e utilizado para a amplificação do
espaço intergênico ribossomal entre os genes 18S e 28S, pois como cada espécie de microinvertebrado apresenta o
comprimento do espaço intergênico distinto, é possível detectar a presença de diferentes espécies em uma amostra.
Para isso foram selecionados dois oligonucleotídeos iniciadores por meio de pesquisa realizada na literatura e
pela análise de sequências disponíveis em bancos de dados. Os fragmentos amplificados serão analisados por
eletroforese e as comunidades serão comparadas pela presença ou ausência de fragmentos no gel. Resultados:
Inicialmente foi selecionado, por meio de pesquisa realizada na literatura, o oligonucleotídeo iniciador EUK1209
(5’-CAGGTCTGTGATGCCC-3’) que codifica a região final do 18S entre as posições 1431 e 1446. Essa sequência é
capaz de detectar aproximadamente 37.217 organismos eucarióticos. O oligonucleotídeo iniciador que codifica a
região inicial do 28S foi desenhado obtendo-se 17.686 sequências de DNA do banco de dados arb-silva do filo Metazoa.
Essas foram reduzidas para 9.651 excluindo-se as espécies repetidas e as que não são encontradas em água doce.
Após isso, foi realizado um agrupamento com 97% de similaridade com o programa CD-HIT onde foram geradas
5.463 sequências representativas. Depois dessa etapa, as sequências foram visualizadas e analisadas no programa
MEGA e o oligonucleotídeo iniciador que amplifica a região inicial do 28S entre as posições 1 e 100 foi desenhado
levando-se em conta os táxons mais encontrados em água doce. O oligonucleotídeo iniciador selecionado foi o
EUK1210 (5’- TCCTCCGCTTANTNAT-3’) sendo que por meio de uma pesquisa realizada no Blast e no Microbial
Ecology evidenciou-se que esse é capaz de detectar pelo menos 1.382 organismos eucarióticos, mas principalmente
de invertebrados. Conclusões: Com base nas informações contidas nos bancos de dados genéticos foi possível
selecionar dois oligonucleotídeos iniciadores adequados para a detecção e amplificação de microinvertebrados
aquáticos. A captura dos microinvertebrados e remoção dos outros organismos das amostras são essenciais como
primeira etapa do trabalho. Contudo, testes serão realizados para a confirmação e adequação da metodologia.
Apoio Financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
187
Clonagem e expressão do gene da toxina beta de
Clostridium perfringens tipo B e sua aplicação na
imunização de animais
Almeida, MO; Siqueira, FF; Carmo, AO; Lobato, FCF; Kalapothakis, E
Universidade Federal de Minas Gerais
Palavras-chave: Clostridium perfringens; toxina beta; gene cpb; enterotoxemia; expressão em E.coli; vacina
A toxina beta produzida por Clostridium perfringens tipos B e C está relacionada com enterotoxemias que acometem
animais e humanos, principalmente cordeiros neonatos, bezerros, caprinos e equinos. As doenças possuem
caráter agudo ou super agudo, causando morte súbita e grandes perdas econômicas para a pecuária. Devido à
rápida evolução da doença, medidas para tratamento são ineficientes. O controle e a profilaxia devem basear-se
em medidas adequadas de manejo e eficientes vacinações sistemáticas de todo o rebanho. A orf codificante da
toxina beta de Clostridium perfringens tipo B, obtida a partir do gene cpb, foi clonada no vetor pCR2.1-TOPO e
subclonada no vetor pET-11a. A linhagem de Escherichia coli BL21 DE1 foi utilizada para a expressão. Após a etapa
de purificação, a quantificação protéica através do método de Bradford permitiu a estimativa de sua concentração
em aproximadamente 0,3 mg/mL na fração solúvel e 5 mg/mL na fração insolúvel. A toxina recombinante
não apresentou letalidade quando foi inoculada em camundongos e apresentou similaridade antigênica com
a toxina nativa no Western blot com soro anti-toxina beta nativa. Anticorpos contra a toxina recombinante
foram produzidos em coelhos e apresentaram grande reconhecimento em relação à toxina nativa no teste de
imunogenicidade ELISA. Esses resultados mostram que o toxóide foi obtido em grande quantidade, com alto grau
de pureza, dispensando etapas adicionais de inativação da toxina e induziu a produção de altos níveis de anticorpos
em animais vacinados. A confecção de vacinas toxóides tradicionais é bastante dispendiosa e trabalhosa e, muitas
vezes, não apresentam qualidade de acordo com os critérios do MAPA. Diante de várias vacinas ineficientes contra
Clostridium perfringens disponíveis no mercado, esses resultados demonstram que a toxina beta recombinante
é uma forte candidata para a produção de uma vacina de toxóide polivalente contra Clostridium perfringens.
Agências financiadoras: FAPEMIG, CNPq, Capes