Quantificar substâncias e actividades enzímicas. Diluição de
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Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Quantificar substâncias e actividades enzímicas. Diluição de soluções e problemas. 1. Introdução................................................................................................................................................................ 1 2. Grandezas extensivas mais usadas em Bioquímica .............................................................................................. 2 3. A concentração é uma grandeza intensiva: unidades de concentração .............................................................. 3 4. A actividade enzímica específica ............................................................................................................................ 4 5. Breves notas sobre doseamento de substâncias em Bioquímica.......................................................................... 5 6. Quantificação de actividades enzímicas ................................................................................................................ 6 7. A actividade enzímica molar .................................................................................................................................. 7 8. Anexo 1- Determinação de concentrações usando o espectrofotómetro............................................................. 8 9. Anexo 2- Massa atómica relativa de átomos com grande relevância em Bioquímica ..................................... 10 10. Exemplos de problemas propostos....................................................................................................................... 10 1.1. Problema 1 .................................................................................................................................................... 10 1.2. Problema 2 .................................................................................................................................................... 10 1.3. Problema 3 .................................................................................................................................................... 10 1.4. Problema 4 .................................................................................................................................................... 10 1.5. Problema 5 .................................................................................................................................................... 11 1.6. Problema 6 .................................................................................................................................................... 11 1.7. Problema 7 .................................................................................................................................................... 11 1.8. Problema 8 .................................................................................................................................................... 11 1.9. Problema 9 .................................................................................................................................................... 11 1.10. Problema 10 .................................................................................................................................................. 11 1.11. Problema 11 .................................................................................................................................................. 11 1.12. Problema 12 .................................................................................................................................................. 12 1.13. Problema 13 .................................................................................................................................................. 12 1.14. Problema 14 .................................................................................................................................................. 12 1.15. Problema 15 .................................................................................................................................................. 13 1.16. Problema 16 .................................................................................................................................................. 13 1.17. Problema 17 .................................................................................................................................................. 14 1.18. Problema 18 .................................................................................................................................................. 14 11. Propostas de resolução dos problemas propostos............................................................................................... 14 1. Introdução Este documento visa servir de guião duma aula prática a leccionar no ano de 2010, na unidade curricular de Bioquímica I do Mestrado Integrado em Medicina da FMUP1. Na primeira parte (Capítulos 2-7) são relembrados e sistematizados alguns conceitos teóricos sobre algumas grandezas com particular relevância em Bioquímica, que se presumem terem já sido, pelo menos em parte, apreendidos pelos estudantes na sua formação pré-universitária. No Capítulo 10 são apresentados exemplos de problemas relacionados com o tema e, no Capítulo 11, propostas de resolução e, sempre que se 1 No ano de 2010 está programada para a semana que se inicia no dia 1 de Novembro. Página 1 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes considerou útil, uma breve explicação. Os Anexos (Capítulos 8 e 9) são textos de consulta que, eventualmente, poderão ajudar a compreender melhor alguns aspectos referidos no restante texto ou apresentar tabelas com dados a usar na resolução dos problemas. 2. Grandezas extensivas mais usadas em Bioquímica Para quantificar substâncias podemos usar unidades diferentes que medem grandezas também diferentes embora relacionadas. Podemos falar de massa e usar unidades como o grama e os seus múltiplos e submúltiplos (kg, mg, g, ng e pg, por exemplo)2 mas também falar de quantidade de substância e usar o mole (mol) e os seus submúltiplos (mmol, mol e nmol, por exemplo). No caso de substâncias puras, 1 mole é a quantidade de substância que contém um número de partículas (átomos, moléculas, iões, etc.) igual ao que existe de átomos de carbono em 12 g de carbono 12 (12C); ou seja, um número de Avogadro de partículas (6,022 1023). A massa molar de uma substância pode ser calculada conhecendo a sua fórmula molecular e a massa atómica dos elementos que a compõem e exprime-se em g/mol. A massa molecular da glicose (C6H12O6) pode, por exemplo, ser calculada (6 12 g + 12 1 g + 6 16 g) e é de 180 g/mol; ou seja, a massa de um mole de glicose é 180 g. Se pensarmos numa quantidade 1 milhão de vezes inferior será adequado usar um submúltiplo, neste caso o mol: 1 “micromole” = 10-6 moles = 180 g no caso da glicose. Quando se trata de líquidos ou de gases (considerando uma dada pressão) podemos usar unidades de volume: L (= dm3) ou os seus submúltiplos (mL, L, nL, etc.). Em medicina, nomeadamente em Química Clínica, quando estão em causa iões, também é comum usar-se o Equivalente (Eq.) ou o seu submúltiplo o miliEquivalente (mEq. = 10-3 Eq.). Embora não seja expressamente referido a noção de Equivalente refere-se, na esmagadora maioria das vezes, a equivalentes de carga eléctrica. Por exemplo, em 1 mol de iões Cl- ou de Na+ (iões com carga -1 e +1) há 1 mol de cargas negativas ou positivas, mas em 1 mole de iões Ca2+ (ião com carga +2) há 2 moles de cargas positivas. Assim, 1 mol de Cl- = 1 Eq de iões cloreto, 1 mol de Na+ = 1 Eq. de iões Na+, mas 1 mol de Ca2+ = 2 Eq. de iões Ca2+. Do exposto é obvio concluir que, por exemplo, 1 Eq. de iões sulfato (SO42-) = 0,5 mol de sulfato. Embora o conceito de equivalente sem outro qualificativo se restrinja, na maioria das situações, ao caso dos iões poderá, eventualmente, ser útil estendê-lo ao caso dos dímeros e polímeros. Se admitirmos hidrólise completa da maltose (dímero com dois resíduos de glicose ligados por uma ligação glicosídica 1,4; C12H22O11) no tubo digestivo então 1 mol de maltose equivale a 2 mol de glicose. Porque a massa molar da maltose é 342 g/mol (= 180 2 – 18) isto significa que 342 g de maltose equivalem a 360 g de glicose (= 180 2). Quando se tratam problemas de osmolaridade uma unidade usada com frequência é o osmol. Se se dissolverem 58,5 g de NaCl (massa molar = 58,5 g/mol) num copo com água a quantidade de NaCl dissolvida nesse copo de água é de 1 mol. No entanto, quando as soluções são diluídas é uma boa aproximação à realidade admitir que, na solução, todos os átomos de sódio e de cloro estão ionizados e dissociados uns dos outros e que a quantidade de partículas dissolvidas é de 2 mol, 1 mol de iões Na+ + 1 mol de iões Cl-. Neste caso diríamos que a solução contém 2 osmol de partículas3. Na quantificação de enzimas, nomeadamente se estivermos a falar de uma enzima que foi purificada, também se poderá usar os conceitos de massa e de molaridade para a quantificar. No entanto, quando estamos a falar de uma enzima que está presente numa preparação biológica complexa (homogeneizado de fígado ou soro sanguíneo, por exemplo) é muito frequente que, na prática, seja impossível quantificar a enzima usando estas unidades. Admitamos que uma dada substância A é estável quando dissolvida num meio aquoso a pH 7 e à temperatura de 30º C. A presença de uma enzima E que cataliza a conversão AB pode ser detectada numa preparação biológica se, após adicionarmos a preparação biológica à solução acima referida, as moléculas de A começarem a desaparecer e começarem a aparecer moléculas de B. É fácil intuir que a velocidade com que A se converte em B dependa da quantidade de enzima E adicionada e que quanto mais enzima for adicionada maior seja a velocidade de conversão. Embora esta questão seja desenvolvida à frente neste texto (ver 2 Diz-se quilograma (kg = 103 g), miligrama (mg = 10-3 g), micrograma (g = 10-6 g), nanograma (ng = 10-9 g) e picograma (pg = 10-12g). 3 No caso de uma solução de NaCl 154 mM (soro fisiológico), por exemplo, a dissociação não é completa e, no cálculo da osmolaridade é introduzido um “factor de correcção” de 0,93. Página 2 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Capítulo 6), importa neste momento reter que a velocidade da conversão é uma medida da quantidade de enzima E adicionada. De facto, ao quantificar a velocidade da conversão AB catalisada pela enzima E estamos a falar não propriamente da quantidade de enzima mas da actividade catalítica da enzima4. Uma mesma quantidade de enzima E pode provocar diferentes velocidades na conversão AB se as condições de ensaio (concentração de A, volume de ensaio, temperatura, pH, etc.) variarem. No entanto, se não variarmos estas condições, quando ensaiada em condições adequadas5, existe proporcionalidade directa entre quantidade e actividade e, consequentemente, a actividade é uma medida da quantidade de enzima. Se admitirmos que a enzima E é uma enzima presente numa solução E e que ao adicionarmos, por exemplo, 1 L de solução E ao meio de ensaio a velocidade de conversão AB foi de 1 mol/min podemos deduzir que, se tivéssemos adicionado 2 L da mesma solução E (o dobro da enzima E), a velocidade seria o dobro, 2 mol/min. Estamos, de facto, a exprimir a quantidade de enzima (medida como actividade) como uma velocidade de conversão: dizemos que a quantidade de enzima E presente em 1 L de solução E era de 1 mol/min. Em enzimologia, existe uma unidade designada de UI (unidade internacional) para exprimir a quantidade de enzima que, adicionada a um meio de ensaio adequado, é capaz de fazer com que a velocidade de conversão seja 1 mol/min. Esta unidade inclui mesmo submúltiplos como a mUI (= 1 nmol/min) mas, de facto, é apenas uma unidade de velocidade de conversão e não acrescenta nenhuma ideia nova. Por este motivo, quando se quer quantificar uma quantidade de enzima, a UI é menos usada que as unidades que exprimem explicitamente velocidades de conversão: a quantidade de substrato convertido em produto por unidade de tempo. Será pertinente sublinhar que este modo de quantificar enzimas não tem a mesma universalidade que as unidades de massa ou de molaridade. Cada experimentador define as condições em que vai ensaiar a enzima (estudar a sua actividade catalítica) e, como estas condições afectam a velocidade de conversão, não será de estranhar se se obtiverem disparidades nos resultados6. 3. A concentração é uma grandeza intensiva: unidades de concentração Quando se realizam experiências em Bioquímica é necessário preparar soluções que contenham as substâncias que serão usadas no estudo. Os protocolos experimentais para além de definirem os procedimentos devem também definir de forma clara as soluções que vão ser utilizadas; ou seja, devem explicitar todas as substâncias contidas nessas soluções e as suas concentrações. Na maioria dos casos, exprime-se a concentração de um soluto num solvente como o resultado de uma divisão em que no numerador está a massa do soluto ou o número de moles e, no denominador, o volume da solução considerada. Assim podemos, por exemplo, dizer que, numa dada solução, a concentração de glicose é de 180 g/L (também se pode escrever 180 g L-1) para exprimir a ideia que, em 1 L dessa solução, estão dissolvidas 180 g de glicose; dado que a massa molar da glicose é 180 g, em termos de molaridade7, a concentração da glicose nesta solução seria 1 mol/L. Uma expressão corrente com o mesmo significado é escrever que a concentração é 1 M (diz-se 1 molar) de que também se usam os submúltiplos: mM (diz-se milimolar = 1 mmol/L), M, nM, etc. 4 Em termos quantitativos, a actividade enzímica (ou actividade catalítica da enzima) é o acréscimo de velocidade de conversão provocado pela adição de E ao sistema de ensaio. Por isso, no texto, tivemos o cuidado de referir que A era estável no meio de ensaio (sem enzima). Esta situação é muito frequente e por isso, se não se especificar o contrário, subentende-se, no presente texto, que a velocidade de conversão na presença de enzima corresponde à actividade enzimática. No entanto, em termos gerais, o valor da actividade enzimática é o que resulta do seguinte cálculo: velocidade de conversão (enzima presente) - velocidade de conversão (enzima ausente). 5 Uma destas condições é que a razão entre a concentração molar de enzima e a de substrato seja muitíssimo baixa. No entanto, porque, na prática, esta condição só pode deixar de ser respeitada quando se trabalha com enzimas purificadas e métodos extremamente sensíveis de detecção (compostos radioactivos) é frequentemente omitida. 6 Quando um laboratório comercial vende uma preparação (um liofilizado, por exemplo) que contém a enzima E e refere, por exemplo, que 1 mg dessa preparação contém 1 UI da enzima E, não será de esperar que, adicionando 1 mg dessa preparação a um meio de ensaio com condições diferentes das usadas por esse laboratório, se obtenha uma velocidade de conversão AB de 1 mol/min. Para obter essa velocidade teríamos de copiar em pormenor as condições usadas pelo laboratório comercial e é, quase sempre, difícil saber todos esses pormenores. 7 Um conceito relacionado com a molaridade é o de molalidade que se exprime em moles / kg de solvente. É pouco usado. Página 3 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Ao contrário das grandezas referidas no Capítulo 2 (grandezas extensivas), a concentração é uma grandeza intensiva: ou seja, não varia com a quantidade de material considerado. Se adicionarmos 1 L de solução 1 mM de glicose a 1 L de uma solução idêntica obtemos 2 L de solução e 2 mmol de glicose dissolvida (o volume e a quantidade de substância são grandeza extensivas) mas a concentração de glicose é 1 mM nas três soluções. A osmolaridade8 de uma solução de glicose 1 M (a glicose não se dissocia) será 1 osmol/L. No entanto, se se dissolver, por exemplo, 58,5 mg de NaCl (massa molar do NaCl = 58,5 g/mol) em água, a concentração molar será 1 mM mas a osmolaridade da solução será de 2 mosmol/L. Num boletim de análises clínicas podemos, eventualmente, ler que a concentração normal de cálcio no soro varia entre 4,26 e 5,26 mEq./L. Porque o Ca2+ tem carga 2 isto significa, convertendo para molaridade, que a variação normal tem como limites 2,13 mM e 2,63 mM. De forma análoga aos casos referidos acima também nos podemos referir à concentração de uma enzima exprimindo “actividade enzímica / volume de solução”. Se, por exemplo, a um meio de ensaio com 0,999 mL de volume adicionarmos 1 L de uma preparação enzímica que continha 1 UI de enzima E, a concentração de enzima E no meio de ensaio será 1 UI/mL (ou 1 mol min-1 mL-1). De notar que a grandeza concentração também pode ser expressa usando como divisor não um volume mas uma massa. Se, por exemplo, em 1 g de tecido hepático houver 100 UI de enzima E, podemos dizer que a concentração de enzima E no fígado é de 100 UI/g. Quando se preparam misturas de líquidos diferentes podem usar-se expressões que, à primeira vista, podem não ter um significado óbvio. Se se escrever que se preparou uma mistura água:etanol:dioxano na proporção 1:4:2 em volume quer-se dizer que os líquidos foram misturados nestas proporções volumétricas: por exemplo, 1 L de água + 4 L de etanol + 2 L de dioxano. 4. A actividade enzímica específica A actividade enzímica numa dada preparação pode ser expressa como uma concentração mas, porque as enzimas são proteínas, é comum usar uma outra grandeza intensiva designada de “actividade específica”. A actividade específica é a actividade dividida pela massa de proteína: se numa determinada preparação enzímica (por exemplo 1 mL de homogeneizado hepático) houver 10 mg de proteína e 10 UI de enzima E a actividade específica da enzima E nessa preparação será de 1 UI / mg de proteína (1 mol min-1 mg-1). A grandeza actividade específica é particularmente útil quando se faz purificação de enzimas. O processo de purificação consiste na eliminação das proteínas presentes na preparação de partida (por exemplo, homogeneizado hepático) que não são a enzima que se está a isolar. Esta eliminação significa diminuir o valor do divisor (a massa de proteínas) e, consequentemente, à medida que o processo avança, vai aumentando a actividade específica da enzima que está a ser purificada. Quando se fazem estudos enzimáticos em tecidos biológicos mais complexos também se pode usar uma base semelhante. Se o objectivo de um experimentador for comparar a actividade da enzima hepática E em dois indivíduos poderá, por exemplo, pesar cuidadosamente os fragmentos de fígado biopsados, tratá-los de forma idêntica para obter dois homogeneizados, ensaiar a actividade da enzima E nos dois homogeneizados e exprimir os dois resultados em UI / g de fígado. Se um dos indivíduos fosse suspeito de um deficit de enzima E e o valor obtido fosse mais baixo que o valor obtido no outro indivíduo (usado como controlo) poderia ter um dado a apoiar as suspeitas. No entanto, poderia dar-se o caso de o fígado do indivíduo suspeito ter quantidades muito mais elevadas de glicogénio (e água9) ou de gordura que o controlo e que a escolha da base “massa de fígado” para expressar o resultado fosse a causa da diferença. O doseamento paralelo das proteínas e da actividade enzímica poderia permitir calcular as actividades específicas da enzima E no fígado dos dois indivíduos e comparar os dois valores sem as objecções apontadas. 8 9 Um conceito relacionado com a osmolaridade é o de osmolalidade que se exprime em moles / kg de solvente. O glicogénio é uma molécula hidratada. Por cada grama de glicogénio acumulam-se paralelamente 3 gramas de água. Página 4 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Quando, em Química Clínica, se mede a actividade da enzima E presente no plasma sanguíneo (uma enzima sérica10), é comum usar uma medida de concentração em que a base é o volume de plasma ou soro: é habitual dizer-se que num dado soro a actividade da enzima E é, por exemplo, de 3 UI/mL de soro e que este valor se encontra (ou não) dentro dos limites do que se considera normal. 5. Breves notas sobre doseamento de substâncias em Bioquímica O rápido desenvolvimento científico e tecnológico tem trazido extraordinários avanços nos processos de doseamento de substâncias com interesse bioquímico e médico. Um exemplo é o aparelho usado pelos diabéticos para monitorizar a sua glicemia. A maioria dos sistemas usados actualmente para medir a glicemia tiram partido da especificidade de enzimas que catalisam reacções em que um dos substratos é a glicose (mas não outras substâncias, incluindo outros açucares) e do facto de as reacções redox gerarem corrente eléctrica (fluxo de electrões) que pode ser medida. Não é objectivo deste texto explicar o funcionamento destes aparelhos mas apenas sublinhar a ideia que a especificidade das enzimas está na base de muitos dos sistemas usados para o doseamento de substâncias com interesse bioquímico e médico. À semelhança do que acontece no caso dos sistemas de doseamento de outras substâncias, os sistemas de doseamento da glicose também contêm enzimas. Uma grande parte destes sistemas contém uma enzima de um bolor (Aspergillus niger) denominada oxídase da glicose que catalisa a oxidação da glicose pelo oxigénio (glicose + O2 gliconolactona + H2O2). Porque a enzima é específica para a glicose, só a glicose é que reage e, dependendo do sistema concreto, o sistema mede a quantidade total de H2O2 formado num período de tempo suficiente para oxidar toda (ou quase toda) a glicose presente na amostra ou a velocidade de formação de H2O2 num dado instante. No primeiro caso os sistemas são maioritariamente colorimétricos: o H2O2 formado reage, num segundo passo, com outro reagente oxidando-o; porque o produto desta segunda reacção tem cor (H2O2 + reagente incolor H2O + produto oxidado corado), a intensidade da cor no meio reactivo é uma medida da quantidade de glicose originalmente presente no meio reactivo. No segundo caso o H2O2 que se vai formando é oxidado numa cadeia de transporte de electrões e um sensor mede a velocidade desse fluxo electrónico. Quer num caso quer noutro, os sistemas foram optimizados de forma a que, tendo em consideração as concentrações de glicose que podem existir no sangue ou na urina de indivíduos sãos ou diabéticos, existe uma proporcionalidade directa entre o resultado (intensidade de cor ou velocidade de fluxo electrónico) e a concentração de glicose no sangue ou na urina. Usando o exemplo da glicose, referimos acima que a formação de cor num meio reactivo pode estar na base de sistemas de doseamento de substâncias. De facto, não é necessário que tenham cor se definirmos “cor” como uma característica que tem de ser observada pelo olho. Quando uma solução tem cor quer dizer que é transparente para determinados comprimentos da luz visível e que absorve outros. Algumas substâncias, como todas as que possuem anéis aromáticos (o NAD+ e o NADH, o ATP, a adenina, a fenilalanina, etc., por exemplo) absorvem radiação de determinados comprimentos de onda do ultravioleta e esta característica é explorada quer para o doseamento destas mesmas substâncias quer de muitas outras. Se uma dada substância X é oxidada pela acção catalítica de uma desidrogénase E (X + NAD+ Y + NADH) em que o oxidante é o NAD+ pode, em princípio, desenvolver-se um sistema de doseamento da substância X (ou da Y) baseado nesta característica. Ao contrário do NAD+, o NADH absorve radiação ultravioleta de 350 nm de comprimento de onda: se, a um sistema reactivo que contenha a enzima E e NAD+, adicionarmos X, X converte-se em Y e, concomitantemente, o NAD+ em NADH. A solução que era transparente para a radiação de 350 nm de comprimento passa a ficar mais ou menos opaca para este comprimento de onda e um sensor adequado pode medir esta modificação. As técnicas que se baseiam na absorção de radiação visível ou ultravioleta designam-se, habitualmente, de espectrofotométricas e são muito frequentemente usadas em Bioquímica e em Química Clínica. A espectrofotometria foi, por este motivo, escolhida para ser melhor explicada num anexo deste texto (ver Capítulo 8). A verdade é que a classificação de uma dada técnica como espectrofotométrica é apenas uma designação entre muitas outras possíveis: quase todas as técnicas actuais de doseamento de substâncias se 10 O soro sanguíneo obtém-se a partir do sangue que foi deixado coagular. Distingue-se do plasma sanguíneo porque já não contém as enzimas e proteínas que foram transformadas durante o processo de coagulação e ficaram encarceradas no coágulo. Página 5 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes baseiam em muitas sub-técnicas. Eventualmente a que parece mais relevante aos olhos de um determinado observador pode ser a espectrofotometria mas a espectrofotometria é apenas uma técnica de detecção da variação de uma característica da solução em análise: a absorvância para a radiação de um (ou vários) comprimentos de onda. O HPLC (high performance liquid chromatography) é uma técnica muito usada em investigação bioquímica. Baseia-se na utilização de colunas contendo materiais (escolhidos de acordo com o objectivo) com maior ou menor afinidade para determinadas substâncias. Se, por exemplo, uma determinada substância X tem grande afinidade para o material contido numa coluna e que as outras substâncias da mistura que se quer analisar têm menor afinidade, essa coluna poderá ser usada para separar a substância X das outras substâncias. Se a mistura em análise for introduzida na coluna e a seguir se fizer passar um líquido (chama-se eluente) através da coluna as outras substâncias vão sair da coluna antes da substância X. Esta sairá separada das outras substâncias e um sistema de detecção adequado colocado a jusante da coluna detectará a sua passagem. Se a substância X absorver radiação de um ou vários comprimentos de onda, eventualmente, uma técnica espectofotométrica pode ser adequada para detectar a sua passagem e fazer o seu doseamento. 6. Quantificação de actividades enzímicas Para dosear a actividade de uma enzima E que catalisa a interconversão AB é necessário dispor de um meio de ensaio onde essa enzima seja capaz de catalisar a reacção. Assim, se sabemos que a enzima E actua numa determinada faixa de valores de pHs será adequado escolher um pH de ensaio dentro dessa faixa e um tampão de pH que seja eficaz nesse pH. Algo semelhante pode ser dito relativamente à temperatura de ensaio: se sabemos que a enzima E não se desnatura entre determinados limites de temperatura será sensato escolher uma temperatura de ensaio que se situe dentro desses limites. Se a constante de equilíbrio da reacção AB for maior que 1 será conveniente utilizar A como substrato: se, sendo este o caso, usássemos B como substrato a reacção entraria em equilíbrio químico em fases precoces do processo reactivo e haveria uma desaceleração precoce da velocidade de reacção. Consideremos um sistema reactivo simples: um tubo de ensaio contendo 0,999 mL de solução de A (na concentração 1,001 mM, por exemplo) em tampão T (pH 7) e temperatura de 30º C. Admitamos que, no momento zero, adicionamos 1 L de uma preparação (homogeneizado hepático) que contém a enzima E (AB), que temos uma forma de ir seguindo as concentrações de A e de B ao longo do tempo e que o resultado foi o que se mostra na Fig. 1. O gráfico mostra que no tempo zero, [A] = 1 mM, [B] = 0 e que, ao longo do tempo de ensaio, a concentração do substrato foi diminuindo e a do produto aumentando. A velocidade média de reacção durante o primeiro minuto foi de 0,2 mM/min mas foi diminuindo ao longo do tempo11; entre o min 4 ([B] = 0,55 mM) e o min 5 ([B] = 0,61 mM), por exemplo, a velocidade média de reacção já foi apenas de 0,06 mM/min. É de realçar que enquanto no Capítulo 2, quando tratamos de grandezas extensivas, escrevemos que a actividade enzímica era a “velocidade de conversão”, usamos unidades (UI = mol/min) que são medidas da variação da quantidade substância (grandeza extensiva) por unidade de tempo. Aqui, estamos a usar uma quantidade intensiva, a variação de concentração (uma grandeza intensiva) por unidade de tempo, a unidade utilizada foi mM/min e em vez de “velocidade de conversão” escrevemos “velocidade de reacção”. Embora estas duas expressões sejam normalmente usadas como sinónimas, se seguirmos à risca as orientações do Comité de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica (NC-IUB)12 há uma pequena diferença entre elas: para obter a velocidade de conversão (actividade enzímica) a partir da velocidade de reacção há que multiplicar o valor desta última pelo volume do meio de ensaio. Assim, no exemplo em análise, a actividade enzímica (velocidade de conversão) foi de 0,2 mol/min (0,2 10-3 mol L-1 min-1 1 10-3 L) no primeiro minuto e, durante o segundo (entre o min 1 e o min 2) já tinha baixado para 0,15 mol/min. Se nos pedissem para dizer qual foi a quantidade de enzima adicionada ao meio de ensaio teríamos um problema: teriam sido 0,2 UI, 0,15 UI ou 0,12 UI (a velocidade média nos 5 min de ensaio; 0,61 mol / 5 min = 0,12 mol/min)? E qual foi a concentração de substrato utilizada? 1 mM (início do ensaio), 0,9 mM (a média durante o 1º minuto) ou outro qualquer valor entre 1 e 0,4 mM (ver Fig. 1)? 11 Entre os motivos que podem causar desaceleração nas reacções enzímicas destacam-se a diminuição da concentração de substrato e o aumento da concentração do produto (que pode aumentar a velocidade da reacção inversa ou/e inibir a reacção directa) mas não é esta questão que queremos enfatizar neste momento. 12 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/kinetics/ Página 6 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Se nos pedissem para enunciar as condições de ensaio que utilizamos não teríamos dúvidas em afirmar que, no início do ensaio, a concentração de substrato era 1 mM. Com rigor matemático também poderíamos dizer que a velocidade de conversão quando a concentração de substrato era 1 mM (a condição de ensaio definida) corresponde ao declive da curva a cheio na Fig. 1 no minuto zero e que o seu valor seria algo acima de 0,2 mol/min. Se o experimentador achasse que devia ser extremamente rigoroso poderia calcular uma estimativa para o declive da recta tangente à curva no ponto 0,0 e dizer que era essa a actividade enzímica nas condições em que o ensaio se iniciou. Esse valor, que se costume representar por v0 ou vinicial, é o que em rigor chamaríamos actividade enzímica nas condições de ensaio definidas (pH 7, 30º C, [A] = 1 mM). No entanto, assumindo que estava a cometer o que considerava ser um pequeno erro, também poderia considerar sensato que a velocidade média no primeiro minuto era uma razoável estimativa da actividade enzímica para as condições do início do ensaio. Neste caso, o experimentador poderia escrever no seu relatório que a actividade da enzima E contida em 1 L do homogeneizado hepático que lhe foi fornecido, ensaiada a pH 7, 30º C com 1 mM de A era de 0,2 UI (0,2 mol/min). Se num estudo de doseamento de proteínas no homogeneizado hepático em questão concluísse que em 1 L desse homogeneizado havia 0,01 mg de proteína escreveria também que a actividade específica da enzima E nesse homogeneizado era de 20 UI/mg de proteína (0,2 mol min-1 / 0,01 mg = 20 mol min-1 mg-1). Concentração de substrato A ou de produto B (mM) 1 0,9 B (mM) 0,8 A (mM) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 tempo de ensaio (min) Fig. 1: Evolução das concentrações de A e de B na reacção catalisada pela enzima hepática E. 7. A actividade enzímica molar Uma outra grandeza intensiva usada em estudos com enzimas purificadas é a actividade molar de uma enzima: a “actividade molar” de uma enzima é a actividade enzímica dividida pela molaridade dessa enzima (ou a molaridade dos centros activos se cada molécula de enzima contiver mais de um centro activo). Admitamos que num dado meio de ensaio havia 10 nmol da enzima E (com 1 centro activo / molécula) e que a actividade enzímica medida foi de 10 mol min-1 (10 UI): teríamos, neste caso, de concluir que a actividade molar era de 1000 min-1 (=10 000 nmol min-1 / 10 nmol de E). Isto significaria que, num minuto, cada molécula de enzima converteu 1000 moléculas de A em B (ou 167 por segundo). Este valor é a actividade catalítica molar; quando se usam, como foi o caso, as mesmas unidades para o número de moles de enzima e para o número de moles de substrato convertido por unidade de tempo também se chama, ao valor obtido, turnover number. O turnover number tem dimensões de tempo-1 e representa o número de ciclos catalíticos que uma molécula de enzima operou por unidade de tempo. Quando se usa a equação de Michaelis-Menten para expressar a actividade catalítica de uma enzima podemos escrever a equação 1. Página 7 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes v inicial Vmax A K m A (1) O Km é uma medida da afinidade da enzima para o substrato A e a razão A traduz apenas a Km A fracção (adimensional) de moléculas de enzimas ligadas ao substrato (e, consequentemente, envolvidas no processo catalítico num dado momento) quando a concentração do substrato tem o valor [A]. Se considerarmos uma concentração saturante de substrato (ou seja, [A]>> Km), vinicial = Vmax e todas as moléculas de enzimas presentes no meio de ensaio estão, num dado momento, envolvidas no processo catalítico ( A Km A 1). Para tornar mais fácil o que tencionamos explicar a seguir será esta a condição considerada: as condições de ensaio são tais que a enzima está saturada e todas as moléculas de enzima presentes no meio de ensaio estão envolvidas no processo catalítico. Admitamos agora que no meio de ensaio há 0,001 mol de moléculas da enzima E e que o turnover number = 1000 min-1. Será óbvio concluir que a actividade enzímica nesse ensaio era de 1 mol min-1 (1UI). Se escrevermos a expressão de Michaelis-Menten como na equação 2 em que Etotal representa o número de moles de enzima no meio de ensaio compreenderemos que Kcat (também designada por constante catalítica de uma enzima) não é mais que o turnover number. v inicial k cat E total A Km A (2) Se dividirmos ambos os termos da equação 2 pelo volume do meio de ensaio obtemos uma equação que habitualmente se escreve como a equação 3. v inicial k cat E total A Km A (3) Na equação 3, a quantidade de enzima Etotal presente na equação 2 foi substituída pela concentração de enzima no meio de ensaio [Etotal] e, obviamente, que embora esteja representada pelo mesmo símbolo (vinicial) os termos da esquerda nas equações 2 e 3 não têm exactamente o mesmo significado. Na equação 2, tal como na equação 1, a actividade enzímica é uma quantidade extensiva que pode ser expressa em quantidade de substância convertida por min (mol / min, por exemplo); na equação 3 vinicial é uma velocidade de reacção (1 mM/min, por exemplo) em que a variação de concentração se expressa nas mesmas unidades em que se exprimiu [Etotal] (mM, por exemplo). 8. Anexo 1- Determinação de concentrações usando o espectrofotómetro Não é objectivo deste texto explicar porque é que algumas substâncias quando dissolvidas conferem cor às soluções. No entanto, importa sublinhar que a cor dessas soluções resulta da capacidade das moléculas dissolvidas para absorver luz de determinados comprimentos de onda da gama do visível e não interferir com os outros. Se, ao compararmos duas soluções coradas de uma mesma substância X, observarmos que a cor é mais intensa na solução A que na solução B podemos concluir que a solução A é mais concentrada que a B. Se tivermos uma série de tubos transparentes com igual diâmetro em que colocamos concentrações conhecidas da mesma substância X e colocarmos em mais um tubo idêntico um pouco de solução A (ou B) podemos mesmo, comparando as intensidades de cor, estimar a sua concentração. Numa aproximação algo grosseira, é este princípio que é usado quando se fazem doseamentos espectrofotométricos. O espectrofotómetro usado com mais frequência em estudos de Bioquímica é um aparelho que, numa descrição simplificada, contém em sequência, uma lâmpada, um dispositivo capaz de separar os diversos comprimentos de onda da luz emitida, um sistema capaz de seleccionar a radiação electromagnética de comprimento de onda que se deseja (que pode ser da luz visível ou do ultravioleta), um compartimento onde colocar uma cuvete (feita com material transparente ao comprimento de onda seleccionado) contendo a solução em estudo, um detector da intensidade de luz que atravessou a solução e um sistema de leitura. Admitamos que a cuvete é, num primeiro passo, cheia com água (sem soluto) e se seleccionou luz de comprimento de onda de 570 nm (=570 nm). O espectrofotómetro também contém um dispositivo que permite ao experimentador introduzir a informação de que a intensidade de luz medida pelo sensor nestas Página 8 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes condições é a luz que pode ser medida na ausência de soluto (a substância cuja concentração se quer medir). Chamemos a esta intensidade de luz I0 e à àgua “branco”. Se agora repetirmos a operação colocando na cuvete, não água, mas uma solução em que o solvente é água e o soluto uma substância A que absorve luz de 570 nm observar-se-á que a intensidade de luz que atinge o sensor é menor. Se chamarmos a esta intensidade I, a razão I/I0 designa-se de transmitância. É intuitivo pensar que quanto maior for a concentração de A mais baixa será a transmitância medida. Por exemplo, se a concentração for nula (uso de água pura, o branco neste caso) a transmitância será, por definição, 1 (ou 100%); se a solução for de tal forma concentrada que praticamente nenhuma luz atravessa a solução o valor da transmitância aproximar-se-á de zero. No entanto, o gráfico que descreve a relação entre a concentração e a transmitância é uma curva pouco usada na prática diária. Se, em vez de transmitância, usarmos uma outra medida que é calculada a partir desta (a Absorvância) observa-se uma relação muito mais útil porque, em condições adequadas, existe uma proporcionalidade directa entre a concentração e esta medida derivada. A Absorvância (Abs) é o simétrico do logaritmo da transmitância (ver equação 4) e a lei que descreve a existência de proporcionalidade directa entre Abs e concentração designa-se lei de Beer (ver equação 5; onde k é uma constante de proporcionalidade que depende da substância em análise e do comprimento de onda utilizado e [A] é a concentração). I Abs log I0 (4) Abs = k [A] (5) Dado que os limites dos valores de transmitância são [0, 1], é imediato concluir que, teoricamente, a Abs varia entre + e zero. Como se pode deduzir da equação 5, teoricamente, o gráfico Abs versus [A] é uma recta que passa pela origem e em que o declive é k13. Na prática, dependendo da substância em análise e da gama de concentrações utilizadas, o gráfico só pode ser considerado uma recta (uma recta ser uma aproximação sensata à realidade) até um valor de concentração que há que definir experimentalmente para cada situação concreta. Como regra prática, porque o erro da leitura do próprio espectrofotómetro aumenta quando os valores de Abs aumentam, geralmente não se consideram aceitáveis valores de Abs maiores que 1, mas a construção do gráfico Abs versus [A] a partir de dados experimentais obtidos com soluções de A de concentrações conhecidas poderá impor um limite inferior como mais sensato. A escolha do comprimento de onda para dosear uma substância não é uma escolha aleatória. Se, por exemplo, a solução for incolor serão inúteis todos os comprimentos de onda da luz visível. No entanto, eventualmente, a substância absorve uma faixa de comprimentos de onda na zona do luz ultravioleta e, neste caso, um comprimento de onda dessa faixa poderá ser adequado. Na Fig. 2 são mostrados os espectros de Absorvância de duas substâncias A e B que absorvem luz ultravioleta: gráficos que relacionam a Absorvância com o comprimento de onda da radiação electromagnética utilizada. Admitamos que para construir estes gráficos usámos em ambos os casos (A e B) uma mesma concentração (100 M, por exemplo). Se, para estudar a actividade da enzima E (que catalisa a conversão AB) usássemos luz de 250 nm de comprimento para seguir o processo não observaríamos qualquer mudança mas, a simples observação dos dois espectros (ver Fig. 2) permite concluir que os valores de comprimento de onda entre 285 e 290 nm seriam boas escolhas. Neste caso, quando, antes da adição de enzima, o meio de ensaio ainda não continha moléculas de B a Abs. seria nula e, após a adição da enzima E, aumentaria à medida que se fossem formando moléculas de B. 13 Se [A] estiver expresso em mol/L o valor de k designa-se de coeficiente de extinção molar; ou seja, o valor de Abs que, teoricamente, seria medido se a concentração [A] fosse 1 M. Página 9 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Espectros de Absorvância 1 0,9 A 0,8 B Absorvância 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 230 240 250 260 270 280 290 300 Comprimento de onda (nm) Fig. 2: Espectros de Absorvância de soluções aquosas das substâncias A e B. 9. Anexo 2- Massa atómica relativa de átomos com grande relevância em Bioquímica Embora as massas atómicas de todos os elementos possam ser consultados em qualquer Tabela Periódica porque o grau de erro aceitável em Bioquímica é, normalmente, muito maior que em Química, para efeitos da resolução dos problemas que se apresentam nos capítulos seguintes apresentamos a seguir uma pequena Tabela com algumas massas atómicas aproximadas. Símbolo H C N O Na 10. Massa atómica 1 12 14 16 23 Símbolo Mg P S Cl K Massa atómica 24,3 31 32 35,5 39,1 Símbolo Ca Mn Fe Se Cu Massa atómica 40,1 54,9 55,8 79 63,5 Exemplos de problemas propostos 1.1. Problema 1 Que massa de cloreto de sódio tem de pesar para preparar 100 mL de soro fisiológico (solução aquosa de cloreto de sódio para uma concentração de 9 g/L)? 1.2. Problema 2 a) Que massa de ácido sulfúrico devo adicionar a 100 mL de uma solução de hidróxido de sódio 500 mM para que ocorra neutralização total? b) Se a densidade do ácido sulfúrico for 1,84 qual o volume de ácido sulfúrico adicionado? 1.3. Problema 3 Tem preparada uma solução (solução 1) da substância A (10 g/L) dissolvida em tampão T. O tampão T contém Tris-base 200 mM e MgCl2 1 mM e o seu pH é 10,4 e também já foi preparado. Como procederia, sem utilizar a balança, para preparar 2 mL de uma solução (solução 2) da substância A na concentração de 2 g/L em tampão T. 1.4. Problema 4 Com o objectivo de fazer uma série de experiências foi feita uma solução stock de lactose 100 mM. Página 10 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Para fazer uma experiência específica havia que diluir a solução stock 10 vezes e fazer 11 mL desta solução diluída. a) Como procederia? b) Qual a concentração de lactose na solução diluída expresso em termos de molaridade e em massa/volume? 1.5. Problema 5 Preparou-se uma solução stock de glicose dissolvendo 30 g de glicose em água para um volume final de 2 dL. Que volume desta solução stock há que adicionar a 100 mL de água para que a concentração final seja de 5 mM (uma concentração semelhante à do plasma sanguíneo de um indivíduo normal em jejum)? 1.6. Problema 6 Tem 2 soluções de MgCl2: 10 mL de solução A (1 mM de MgCl2 em tampão T) e 1 mL solução B (95,3 g /L em água). Além disso dispõe de 30 mL de tampão T. Precisa de 20 mL de solução de MgCl2 em tampão T mas em que a concentração de MgCl2 seja 2 mM. Além disso quer aproveitar toda a solução A já feita e não o preocupa que o tampão T fique ligeiramente mais diluído na solução final que na solução A. a) Como procederia? b) De acordo com o seu procedimento qual a razão entre a concentração do Tampão T na solução final relativamente à original? 1.7. Problema 7 Num boletim de análises clínicas lê-se que a concentração de bicarbonato sérico era de 25 mEq./L. Se todo o bicarbonato contido em 100 mL de soro for convertido (pela adição de ácido clorídrico) em CO2 que massa de CO2 se obtém? 1.8. Problema 8 Num tanque existem dois compartimentos iguais separados por uma membrana semipermeável ideal (que deixa passar água mas não os solutos). No compartimento A há 100 L de NaCl na concentração de 15 mM e, no compartimento B, um volume idêntico de uma solução de sacarose na concentração de 3,42 g /L. Admitindo que ambas as soluções são suficientemente diluídas para se admitir que a concentração de partículas é uma boa medida da osmolaridade, que massa de glicose devo adicionar à solução B para que haja equilíbrio osmótico (não haja, no balanço global, passagem de água entre os dois compartimentos). 1.9. Problema 9 A massa molar da glicose é de 180 g e um indivíduo A ingeriu 90 g de glicose. a) Pressupondo hidrólise de 100% que massa de amido deve um individuo B ingerir para que a quantidade de glicose formada no intestino seja igual à ingerida pelo indivíduo A? b) A farinha “Maizena” é amido de milho mas, em condições de armazenamento normal, 10% da sua massa é água. Que massa de farinha “Maizena” deveria, nos mesmos pressupostos, ingerir o indivíduo B? 1.10. Problema 10 Num volume final de 2,5 mL o meio de ensaio continha Hepes (100 mM, pH 7,5), ATP (1 mM), MgCl2 (2 mM) e homozeneizado hepático (1 g de proteína/mL). Sabendo que as soluções stock de cada um dos componentes utilizados eram os que se especificam na tabela calcule para cada caso o volume que foi adicionado ao meio de ensaio assim como a quantidade de água. Hepes, pH 7,5 ATP MgCl2 Homogenizado hepático 500 mM 5 mM 10 mM 50 g de proteína/mL 1.11. Problema 11 A partir de fígado de rato foi preparado um homogeneizado que contém a enzima E que catalisa a conversão AB. A actividade enzímica foi previamente determinada em condições especificadas (Hepes 50 Página 11 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes mM, pH 7; 25º C; [A]= 1 mM) tendo o valor de 200 UI/ mL de homogeneizado. Temos num tubo de ensaio 10 mL de meio de ensaio semelhante e vamos incubá-lo à mesma temperatura. Que volume de homogeneizado deve ser adicionado para que, em 5 min, haja conversão de 10% do substrato? 1.12. Problema 12 Tirando partido da sua experiência prévia com um dado homogeneizado de mucosa intestinal de rato que contém a enzima E (que catalisa a conversão AB), o experimentador já sabia que, nas condições que usava habitualmente ([A] = 1 mM; tampão Hepes 50 mM, pH 7,0; 30 ºC), era sensato admitir que a velocidade inicial de reacção se mantinha constante se a percentagem de conversão de substrato não excedesse os 10%. O experimentador informou um colega que a actividade específica da enzima no referido homogeneizado era de 1 UI/mg de proteína e que a concentração de proteínas era de 10 mg / mL. Será que, se este colega adicionar, nas mesmas condições de ensaio, 1 L de homogeneizado a 1 mL de meio de ensaio e incubar durante 1 hora é sensato admitir que a velocidade inicial se mantenha constante durante todo o ensaio? 1.13. Problema 13 Foi comprada uma solução (500 L) de enzima E purificada (A B) e, de acordo com o laboratório comercial que a vendeu, a concentração da enzima E é de 1 M. Sabendo-se que em condições especificadas (Hepes 100 mM, pH 7,5; 30º C e [A] = 10 mM) o Kcat é 10 000 s-1 quanto tempo será necessário esperar para que, usando um meio de ensaio idêntico com 1 mL e adicionando 1 L da solução de enzima E, 1% do substrato seja convertido em produto? 1.14. Problema 14 Uma enzima E catalisa a transformação AP. Num tubo de ensaio colocou-se A, tampão e ao minuto zero adicionou-se uma determinada quantidade de enzima E. Na figura representou-se a quantidade de P que se foi acumulando no tubo de ensaio ao longo do tempo. De notar que, na ausência de adição de E, a formação de P durante 30 min de incubação foi imperceptível. a) Qual a actividade da enzima E adicionada ao tubo de ensaio? Explique os cálculos e as opções que fez. b) Considerando que a enzima E é hepática, que a fonte de enzima usada na experiência era homogeneizado hepático e que a quantidade de homogeneizado adicionada ao tubo de ensaio correspondia a 2 mg de fígado calcule a actividade da enzima expressando o resultado em UI / mg de fígado. c) Admitindo que a percentagem de proteína no fígado é de 20%, calcule a actividade específica da enzima E. Página 12 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes 1.15. Problema 15 A enzima E está presente no soro sanguíneo e catalisa a reacção XY. Um tubo de ensaio A continha 1 ml de solução (contendo X, tampão a pH adequado e cofactores essenciais para a actividade da enzima E) e, no tempo zero, adicionou-se 1 l de soro sanguíneo. Ao longo do tempo de ensaio foi-se medindo a concentração de X no meio de ensaio (ver Figura). No caso do ensaio B, excepto no que se refere ao volume de soro sanguíneo adicionado, as condições foram as mesmas. a) Qual a actividade da enzima E no soro em análise? b) Qual foi, no ensaio B, o volume do mesmo soro adicionado ao tubo de ensaio? 1.16. Problema 16 Tabela I Absorvância min A 0 0,1 2 0,2 4 0,3 6 0,38 8 0,45 10 0,52 12 0,58 14 0,64 B 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,10 0,20 0,30 A substância P é o produto de uma reacção enzímica catalisada pela enzima E presente no fígado (SP). A substância P absorve luz do comprimento de onda que foi usado para fazer a curva de calibração que a Figura representa. Esta curva de calibração foi realizada com o objectivo de dosear a enzima E e, por isso, as condições usadas (nomeadamente o pH do meio) eram semelhantes às que se usaram quando se fez a leitura espectrofotométrica dos ensaios enzímicos. No estudo enzímico usaram-se 2 cuvetes (A e B). Na cuvete A, a mistura reactiva (1 mL) continha S, tampão e homogeneizado hepático (correspondente a 2,5 mg de fígado) medindo-se a Absorvância ao longo do tempo. De notar que, na cuvete A, o tempo zero correspondia à adição do homogeneizado hepático ao restantes componentes da mistura. Na cuvete B o ensaio decorreu na ausência de homogeneizado hepático e, no minuto 10, adicionou-se homogeneizado Página 13 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes hepático correspondente a 2,5 mg de fígado fazendo logo de seguida a leitura correspondente. A tabela I representam-se as leituras de Absorvância em diferentes tempos de ensaio nas cuvetes A e B. a) Qual a velocidade da reacção na ausência de homogeneizado hepático? b) Calcule a actividade da enzima E expressando o resultado na base massa de fígado. c) Admitindo que a actividade específica foi também calculada e era de 0,6 mol min-1 mg de proteína-1, calcule a percentagem de proteína no fígado (massa/massa). 1.17. Problema 17 Sabe-se que, em determinadas condições (Tampão MES 100 mM, pH 6,5, 37ºC) o Vmax da enzima sérica E (A + H2O B + C) é 100 nmol min-1 mL de soro-1, que o Km de A é 10 M e que o gráfico actividade versus [A] é uma clássica hipérbole rectangular. a) Calcule, nas condições especificadas, a actividade da enzima E se [A] = 10 M. b) Calcule, nas condições especificadas, a actividade da enzima E se [A] = 2 M. c) Calcule, nas condições especificadas, a quantidade de B formado quando a [A] = 2 M, admitindo também que a quantidade de soro adicionada ao meio de ensaio foi 2 L e o tempo de ensaio 1 min. d) Calcule a percentagem de A que se converte em B nas condições especificadas na alínea c) se o volume de ensaio for de 1 mL. e) Comente se considera plausível que, durante 1 min de ensaio, se tenham mantido condições de vinicial. f) E se em vez de 1 min fossem 30 min? 1.18. Problema 18 Um investigador estava a estudar a actividade de uma hidrólase E que catalisa a hidrólise de A que se converte em B + C com o objectivo de determinar o Km de A. Depois de ter concluído que a enzima E era estável a 30 ºC mas desnaturava quando incubada a 100 ºC durante 30 s e que o tampão Hepes 50 mM (pH 6,5) era adequado para o estudo da sua actividade catalítica descreveu o seu estudo nos seguintes termos. “ Foi preparada uma série de 6 tubos de ensaio contendo cada um deles num volume final de 1 mL, Hepes 50 mM (pH 6,5) e diferentes concentrações de A (0, 1 M, 2 M, 4 M, 8 M e 16 M). Os ensaios foram iniciados com a adição de E (1 mg de proteína/ensaio) e incubados a 30 ºC durante 10 min. A reacção foi terminada transferindo os tubos para um banho a 100 ºC durante 2 min. A concentração de B no final do processo foi determinada usando o método já descrito na secção anterior.” No capítulo Resultados foi escrito o seguinte: “Usando o método descrito em Métodos o Km de A e o Vmax de E foram calculados em 4 M e 1 nmol min-1 mg de proteína-1, respectivamente. O gráfico actividade versus [A] era uma hipérbole rectangular” O arbitro 1 (referre 1) que apreciou o artigo rejeitou-o por considerar que o método descrito e os resultados eram incompatíveis. Diga se concorda ou não com o referee 1 e explique a sua opinião. 11. Propostas de resolução dos problemas propostos Problema 1 Concentração = massa / volume; 100 mL = 0,1 L 9 g/L = X / 0,1 L X = 0,9 g Problema 2 a) Concentração = quantidade substância / volume substância. Página 14 de 19 Concentração volume = quantidade Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Em 100 mL de uma solução de hidróxido de sódio 500 mM existem 50 mmol de iões OH- (0,1 L 0,5 mol L ). A reacção do ácido sulfúrico com o hidróxido de sódio decorre de acordo com a estequiometria: H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 H2O Para fazer reagir 50 mmol de NaOH consumo 25 mmol de H2SO4. A massa molecular do H2SO4 é 98 g: donde 25 mmol correspondem a 2,45 g. 1 mol ------ 98 g 0,025 mol ------ X X = 2,45 g -1 b) O volume de ácido sulfúrico adicionado seria 1,33 mL. 1,84 g ------ 1 mL 2,45 g ------ X X = 1,33 mL Problema 3 Se, ao fazer uma diluição de uma solução contendo a substância A, o solvente adicionado não contém a substância A, a quantidade de substância A é igual na solução original e na solução diluída (conc.1 vol.1 = conc.2 vol.2). Para preparar 2 mL de solução 2 a partir da solução 1 tem de usar-se 0,4 mL desta solução e acrescentar tampão T (o solvente neste caso) até perfazer o volume final. 10 g/L X = 2 g/L 2 mL X = 0,4 mL Nota 1: Quando se misturam dois líquidos de natureza diferente (por exemplo água e metanol) a soma das partes pode não coincidir com o volume final mas não é este o caso. Neste caso, quer a solução de onde se parte (substância A, 10 g/L) quer “o solvente” (a solução tampão T) são soluções aquosas. Assim para calcular o volume de tampão T a adicionar aos 0,4 mL da solução original há apenas que fazer a subtracção: 2 mL - 0,4 mL = 1,6 mL. Nota 2: Um experimentador com alguma experiência talvez racionasse de forma diferente identificando a situação como um caso em que era necessário diluir a solução original 5 vezes (2g/L é 5 vezes menos concentrado que 10g/L). Assim dividiria mentalmente 2 mL por 5 e obteria o volume de solução original a utilizar (os 0,4 mL); para calcular o volume de tampão faria a subtracção já referida. Problema 4 a) Para fazer 11 mL de solução diluída, diluindo 10 vezes a solução stock havia que adicionar num tubo 1,1 mL (11 mL / 10 = 1,1 mL) e acrescentar com água até perfazer os 11 mL (ou seja adicionar 9,9 mL de água). b) A concentração na solução final era 10 mM (100 mM/10) ou, tendo em conta a massa molar da lactose (C12H22O11 342 g/mol), 3,42 g L-1. Problema 5 A concentração de glicose na solução stock é 150 g/L (30 g / 0,2 L) ou 0,8333 M (150 g/L / 180 g/mol). (Esta solução é 166,66 vezes mais concentrada que a que queremos preparar (833,3 mM / 5 mM)). O volume a adicionar pode ser calculado tirando partido da ideia que prevê constância na quantidade de substância nas duas soluções: 5 mM (100 mL + X) = 833,3 mM X X = 0,6036 mL Problema 6 Em 10 mL de solução A há 10 mol de MgCl2 (10 10-3 L x 1 10-3 mol L-1 = 10 10-6 mol). Página 15 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes A quantidade de MgCl2 na solução final deve ser 40 mol (2 10-3 mol L-1 x 20 10-3 L-1) e preciso, portanto, de adicionar 30 mol de MgCl2 à solução A. A massa molar de MgCl2 é 95,3 g/mol (24,3 + 35,5 2), donde a concentração molar na solução B é de 1 M (1 mol L-1). 30 mol de MgCl2 estão contidos em 30 L da solução B. 1 mol ------- 1 L -6 30 10 mol ------- X X= 30 10-6 L Assim para preparar a solução que pretendo adiciono: 10 mL de solução A + 0,03 mL de solução B + 9.97 mL de tampão T. b) Porque a solução B não contém tampão T, a solução final contém apenas 19,97 mL de tampão T. A concentração de tampão na solução final era 99,85 % da concentração original (19,97 / 20 = 0,9985). Problema 7 O HCO3- é um ião monovalente e, portanto, 25 mEq./L equivalem a 25 mM. Em 100 mL de soro há 2,5 10-3 moles de HCO3- (25 mmol L-1 0,1 L = 2,5 mmol). Pela adição de HCl, 2,5 mmol de HCO3- convertem-se estequimetricamente em 2,5 mmol de CO2. (H+ + HCO3- H2CO3 CO2 + H2O) A massa de 2,5 mmol de CO2 é 0,11g (0,0025 mol 44 g mol-1). Problema 8 A osmolaridade da solução 15 mM de NaCl é de 30 mosmol L-1 (0,03 osmol L-1). A massa molar da sacarose (C12H22O11) é 342 g/mol (ou, no caso da sacarose, 342 g/osmol). Logo, a osmolaridade da sacarose no compartimento B é de 0,01 osmol L-1 (3,42 g L-1/ 342 g osmol-1). Para aumentar a osmolaridade no compartimento B usando glicose há que adicionar glicose até que a osmolaridade seja 0,03 osmol L-1; ou seja, aumentá-la em 0,02 osmol L-1. Tendo o compartimento B 100 L há que adicionar 2 osmol de glicose; ou seja, 2 moles de glicose. A massa molar da glicose (C6H12O6) é 180 g/mol e 2 moles são 360 g de glicose (2 180 g). Problema 9 a) Uma molécula de amido contém vários milhares de resíduos de glicose ligados por ligações glicosídicas. A massa molecular da glicose (C6H12O6) é de 180 g/mol mas, à excepção de 1 resíduo (o “1º da cadeia” em que o seu carbono anomérico está livre), a massa molecular dos resíduos (C6H10O5) é de 162 g/mol. Este valor é uma excelente aproximação à massa molar dos resíduos de glicose do amido. 90 g ------- 180 g X ------- 162 g X= 81 g b) 81 g --------- 90% X --------- 100% X = 90 g Problema 10 Volume de Hepes = 100 mM/ 500 mM X 2,5 mL = 0,5 mL Volume de ATP = 1 mM/ 5 mM X 2,5 mL = 0,5 mL Volume de MgCl2 = 2 mM/ 10 mM X 2,5 mL = 0,5 mL Volume de homogenizado hepático = 1 g de proteína mL-1 / 50 g de proteína mL-1 X 2,5 mL = 0,05 mL Volume de água = 2,5 mL – 0,5 mL – 0,5 mL– 0,5 mL – 0,05 mL = 0,95 mL Página 16 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes Problema 11 O número de moles de A no meio de ensaio é 10 mol (0,001 mol/L x 0,01 L) e 10% deste valor é 1 mol. Para que, em 5 min, haja conversão de 1 mol a actividade de enzima adicionada deve ser de 0,2 UI (1 mol / 5 min = 0,2 mol/min). Dado que, no homogeneizado, a actividade da enzima E é 200 mol min-1 mL-1 o volume de homogeneizado a adicionar ao meio de ensaio terá de ser 200 mol min-1 -------- 1 mL 0,2 mol min-1 -------- X X = 0,001 mL = 1 L Nota: Poderia argumentar-se, com alguma razão, que, porque a concentração de A diminuía durante o ensaio (e consequentemente, a velocidade de reacção) que 1 L de homogeneizado não seria suficiente para fazer baixar a concentração de A de 1 mM para 0,9 mM. De facto, esta descida de concentração, só provocaria uma descida da velocidade da ordem de 10% se o Km de A fosse (muito) maior que 1 mM. A análise da equação 1 (página 8) permite compreender que se, por exemplo, o Km de A fosse, por exemplo, de 1 M a concentração de A manter-se-ia “saturante” durante todo o ensaio. De qualquer forma, mesmo quando se usam concentrações de substrato inferiores ao Km é costume admitir, até prova em contrário, que uma descida de concentração do substrato de 10% durante um ensaio, não é susceptível de provocar uma descida marcada na velocidade de reacção. No entanto, é altura de sublinhar a expressão “até prova em contrário”: eventualmente um dos produtos (neste caso o B) pode ter uma acção inibidora marcada. Com os dados disponíveis a solução proposta é a mais sensata. Problema 12 Em 1 mL de homogeneizado há 10 mg de proteína em 1 L há 10 g de proteína Em 1 mg de proteína há 1 mol/min de enzima E em 10 g há 10 nmol/min de enzima E. Logo, em 60 min (1 hora) de ensaio, a manter-se v0 ao longo do ensaio, converter-se-iam 600 nmol de A. Em 1 L de ensaio há 1 mmol de A em 1 mL há 1 mol de A (=1000 nmol). 600 nmol / 1000 nmol = 60%. 60% > 10% não seria de esperar que a velocidade se mantivesse constante ao longo dos 60 min de ensaio. Problema 13 Em 1 L de solução de enzima há 1 pmol de enzima E (1 10-6 mol L-1 X 1 10-6 L = 1 10-12 mol = 1 pmol) que é capaz de converter 10 000 pmol de substrato / segundo (1 pmol X 10 000 s-1); ou seja, 10 nmol s-1. No meio de ensaio há 10 mol de A (0,01 mol L-1 X 0,001 L) e 1% deste valor é 0,1 mol (= 100 nmol). Assim, em 10 s (100 nmol / 10 nmol s-1) ocorreria a conversão especificada no problema. Problema 14 a) A Figura mostra que velocidade com que P se acumulou no meio de ensaio diminuiu ao longo do tempo de ensaio: formaram-se 5 µmol de P nos primeiros 5 min mas apenas 4 µmol (9-5 mol) entre o min 5 e o min 10. A velocidade da reacção antes de se acumular P e consumir A (v0) seria, idealmente, o declive da curva P formado versus tempo no min zero. No entanto, no gráfico apresentado o valor experimental correspondente ao min 5 pode servir de base para uma boa estimativa de v0. Assim, vamos considerar que a velocidade média nos primeiros 5 min de ensaio como uma boa estimativa de v0. v0 = 5 mol de P / 5 min = 1 mol/min. [É de notar que, neste exemplo, se se tivesse escolhido a velocidade média nos primeiros 10 min de ensaio (9,5 µmol /10 min = 0,95 µmol/min) o resultado não seria muito diferente.] 1 UI é a quantidade de enzima que provoca uma velocidade de reacção de 1 mol/min: a actividade enzímica de E adicionada era 1 UI. Página 17 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes b) Dado que 1 UI era a actividade da enzima E em 2 mg de fígado então a actividade no fígado pode ser facilmente calculada (1UI / 2 mg) como 0,5 UI / mg de fígado. c) 20% de 1 mg = 0,2 mg de proteína. 0,5 UI / 0,2 mg de proteína = 2,5 UI / mg de proteína. Problema 15 a) Consideremos o ensaio A. O primeiro ponto experimental obtido no min 10 poderá servir de base para a estimativa de v0. [O ponto correspondente ao min 20 na linha A corresponde já a alguma lentificação da reacção pelo que só admitindo um erro mais grosseiro na estimativa o poderíamos considerar.] Nos primeiros 10 min de ensaio, a concentração de X passou de 100 para 90 mM, ou seja, a concentração de X diminuiu 10 mM (= 0,01 mol/L). Dado que o volume de ensaio era de 1 mL, a quantidade de X que foi convertida em Y pode ser calculada como sendo 10 mol (0,01 M X 0,001 L = 0,00001 mol). A velocidade de conversão nos primeiros 10 min de ensaio foi assim de 1 mol/min (= 10 mol /10 min) o que corresponde a 1UI. Porque o volume de soro adicionado ao ensaio foi 1 L então a actividade da enzima E no soro era de 1 UI / l soro. b) A actividade no tubo B pode ser facilmente calculada usando o mesmo raciocínio da alínea a) mas, na realidade, é intuitivo observar que no caso B o valor da velocidade da reacção é metade da do caso A. Nos primeiros 10 min de ensaio em vez de concentração de A baixar 10 mM baixou 5 mM. Assim a actividade no caso B era não 1 UI mas 0,5 UI. A velocidade de reacção observada em B foi metade da observada em A porque em B havia metade do número de moléculas da enzima E. Ou seja, em B o volume de soro foi, não 1 L, mas 0,5 L. Problema 16 a) De acordo com a tabela, na ausência de homogeneizado (cuvete B antes do minuto 10) a variação de absorvância foi nula: devemos deduzir que a velocidade de formação de P também o foi. b) Nos primeiros minutos de ensaio (entre o minuto 0 e o minuto 4) a velocidade de variação de absorvância na cuvete A era de 0,05 / min. Este resultado pode ser obtido usando, por exemplo, o valor tabelado correspondente ao min 2 (Abs_min_2 – Abs_min_zero) / 2 min = 0,05 min-1. [Tendo em conta que o gráfico absorvância versus tempo (que pode ser construído a partir dos dados da tabela) é uma recta até ao min 4, também se poderia usar o min 4 em vez do min 2 que o resultado seria exactamente o mesmo]. Usando a curva de calibração da Figura pode calcular-se que a 0,05 de absorvância corresponde uma concentração de 0,25 mM de P. O volume de ensaio era de 1 mL; logo o número de moles de P formados por minuto na presença de enzima era de 0,25 (1 10-3 L X 0,25 10-3 mol L-1 = 0,25 10-6 mol). O homogeneizado adicionado ao ensaio correspondia a 2,5 mg de fígado; assim a actividade da enzima era 0,25 mol min-1 / 2,5 mg = 0,1 UI mg de fígado-1. c) 0,1 UI mg de fígado-1 / 0,6 mol min-1 mg de proteína-1 = 0,167 mg de proteína / mg de fígado = 16,7%. Problema 17 a) Sendo [A] = Km de A é de concluir que vinicial = ½ Vmax (ver equação 1 na página 8). vinicial = 50 nmol min-1 mL de soro-1 b) Usando a equação 1: vinicial = 100 min-1 mL de soro-1 [2 M/(10 + 2) M] = 16,7 nmol min-1 mL de soro-1. c) Quantidade de B formada = 33,4 pmol (16,7 nmol min-1 mL de soro-1 1 min 0,002 mL de soro). d) A quantidade de A presente no início do ensaio era 2 nmol (2 10-6 mol L-1 X 1 10-3 L). A percentagem de A convertido em 1 min seria 1,67 % (33,4 pmol / 2000 pmol = 0,0167). e) Uma tão baixa percentagem de conversão de A em B (1,67%) permite pensar que a concentração de A quase não variou durante 1 min de ensaio. (Aplicando a equação 1 a actividade teria descido em 1 min menos de 1,67%). O facto de E ser uma hidrólase permite pensar que a constante de equilíbrio tem um valor Página 18 de 19 Quantificar_substancias_e_actividades_enzimicas – Rui Fontes muito superior a 1 M e portanto muito superior ao QR calculado para o final do ensaio (33,4 nM2 / (2000 nM – 33,4 nM) = 0,567 nM). A não ser que um dos produtos (B ou C) tenha um potente efeito inibidor ou que a enzima seja altamente instável nas condições de ensaio utilizadas é de presumir que a velocidade média no 1º min de ensaio não seja muito diferente de vinicial. f) Se em 1 min se converteu 1,67 % do substrato é de admitir que, a manter-se vinicil durante todo o ensaio, em 30 min se tivessem convertido 50,1 %. Dado que a concentração do substrato no inicio do ensaio (2 M) era inferior ao Km de A (10 M) estamos numa zona da curva actividade versus [A] em que a descida da concentração de A se reflecte numa descida da actividade que é quase proporcional. (A aplicação da equação 1 permite calcular que uma descida de 2 para 1 M na concentração de A faz descer a actividade de 16,7 nmol min-1 mL de soro-1 para 9,09 nmol min-1 mL de soro-1; uma descida de 45%). Logo, não é plausível que se tenham mantido durante o tempo de ensaio de 30 min condições que suportem uma velocidade constante de conversão igual à vinicial. Problema 18 Usando dados fornecidos (Vmax, Km, quantidade de E adicionada e concentrações de A nos diferentes tubos) é possível, usando a equação 1 (página 8), preencher as duas primeiras colunas da Tabela (ver abaixo). O tempo de ensaio e a velocidade permitem calcular as quantidades de A que teriam sido consumidas se os resultados correspondessem à realidade. A quantidade de A no início do ensaio (nmol) em cada um dos tubos pode ser calculada a partir das concentrações e do volume do meio de ensaio. A última coluna mostra que, a acreditar no investigador, em 3 dos tubos mais de 100 % do substrato adicionado (!) teria sido consumido nos 10 min do ensaio. De qualquer forma mesmo no caso do tubo em que a concentração de A era 16 M, a acreditar nos dados fornecidos, 50 % do substrato teria sido consumido nos 10 min de ensaio e, neste caso, não é verosímil que a velocidade calculada usando apenas um tempo de incubação [(16 nmol - 8 nmol) / 10 min)] pudesse ser considerada vinicial. Tabela [A] (M) 0 1 2 4 8 16 velocidade (nmol/min) 0 0,2 0,333333 0,5 0,666667 0,8 A consumido em 10 min (nmol) quantidade de A no início do ensaio (nmol) 0 2 3,333333 5 6,666667 8 0 1 2 4 8 16 percentagem de A consumido 200% 167% 125% 83% 50% Este texto foi preparado (em Julho e Agosto de 2010) por Rui Fontes que agradece todas as críticas que entendam fazer. Desde já um obrigado ao professor Nuno Alçada, à Joana Meireles Pinto e à Inês Fonte Rodrigues Martins. Página 19 de 19
