1 universidade federal da paraíba centro de ciências - TEDE
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS HERMANN FERREIRA COSTA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA DE Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO AGUDA E CRÔNICA. JOÃO PESSOA – PB 2013 2 HERMANN FERREIRA COSTA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA DE Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO AGUDA E CRÔNICA. Teses apresentada ao Programa de PósGraduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS, área de concentração - Farmacologia. Orientadora: Profa. Dra. Marcia Regina Piuvezam JOÃO PESSOA – PB 2013 3 HERMANN FERREIRA COSTA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA DE Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO AGUDA E CRÔNICA. Aprovado em _______________ BANCA EXAMINADORA: ________________________________________ Profa. Dra. MARCIA REGINA PIUVEZAM Departamento de Fisiologia e Patologia-UFPB (Orientadora) ________________________________________ Prof. Dr. FREDERICO BARBOSA DE SOUSA Departamento de Morfologia-UFPB (Membro Titular Externo ao PgPNSB/UFPB) ________________________________________ Prof. Dra JANEUSA TRINDADE SOUTO Departamento de Microbiologia e Parasitologia-UFRN (Membro Titular Externo ao PgPNSB/UFPB) ________________________________________ Prof. Dra LIANA CLÉBIA DE MORAIS PORDEUS Departamento de Fisiologia e Patologia-UFPB (Membro Titular Externo ao PgPNSB/UFPB) ________________________________________ Prof. Dra SANDRA RODRIGUES MASCARENHAS Departamento de Fisiologia e Patologia-UFPB (Membro Titular Interno ao PgPNSB/UFPB) 4 Aos meus pais Edilza e Antonio, exemplo e contraexemplo, que ainda me moldam. 5 AGRADECIMENTOS -A benevolência de Deus que me permite a caminhada. -Aos meus irmãos Helane Ferreira Costa e Hearle Ferreira Costa (in memorian) estejam onde estiverem sempre apoiaram a continuação do trabalho. -Aos meus pais Maria Edilza Ferreira Costa e Antonio Costa da Mota. -Aos meus familiares que sempre direta e indiretamente me auxiliaram e, com isso, foi possível chegar até aqui. -A profa Márcia Regina Piuvezam, pela orientação, paciência e paciência, compreensão, exemplo de dedicação e ética. -Ao profº Dr. Cláudio Roberto Bezerra dos Santos pelo tempo e auxílio intelectual na exportação desses resultados. -Aos companheiros do laboratório de imunologia, que criam um ambiente descontraído-tenso onde é possível o crescimento técnico e intelectual. Destacar um ou outro seria imprudente e, em verdade, excludente. -As todos os laboratórios vizinhos, sem ser excludente, todos mesmo, que nunca me fecharam a porta e pelo contrário sempre deixaram que eu percorresse onde a educação do “com licença” permitisse, inclusive os da química. -Aos professores da pós-graduação, aos novos e antigos. Aprendi a dizer que só posso enxergar mais longe por estar sobre os ombros de gigantes -Aos funcionários do C. Biotec nas pessoas de José Crispin Duarte e Mônica Rodrigues da Silva não só pelo braço forte, mas também pela mão amiga nos momentos necessários. -Aos colegas da turma da pós-graduação pela ajuda durante as disciplinas e pelo apoio com reforço positivo diariamente. -As professoras da banca de qualificação, Sandra Mascarenhas, Leônia Batista e Marianna Castelo-Branco que se utilizaram além de ciência na leitura e pré-correção deste trabalho. 6 -A Glageane da Silva Souza, companheira de todas as horas, por me suportar mesmo quando nem eu suporto mais. -Ao Dante, meu filho, pela compreensão abusada, pelo encorajamento a minha evolução e treino da minha atenção periférica. -Ao CNPQ pelo apoio financeiro. 7 "Abre a mente ao que eu te revelo e retém bem o que eu te digo, pois não é ciência ouvir sem reter o que se escuta." Dante Alighiere, no Paraiso, sobre o conhecimento. 8 RESUMO Infusões das raízes da planta Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) são utilizadas, pela medicina popular, no Nordeste Brasileiro , para o tratamento de doenças do trato respiratório e digestório. Estudos prévios demonstram que o extrato hidroalcoólico das folhas (AFL) da planta e a warifteina (W), alcaloide bisbenzilisoquinolínico, apresentam efeitos anti-inflamatórios e antialérgicos. Esse estudo avaliou, portanto, o efeito do tratamento oral de camundongos com W e a metil-warifteina (MW) na formação do edema de pata induzido por agentes flogísticos, no extravasamento vascular e na migração celular em modelos de inflamação aguda e o efeito do tratamento oral com a AFL e seus alcaloides (W e MW) na inflamação crônica representada pelo modelo experimental de alergia alimentar (camundongos BALB/c sensibilizados com ovalbumina - OVA). O tratamento com a W reduziu o edema de pata induzido por carragenina, por histamina ou prostaglandina E2, efeito esse não observado com o tratamento com MW. A warifteina e a metil-warifteina também reduziram o extravasamento vascular, contudo sem inibir a migração celular associada à inflamação. No modelo experimental de alergia alimentar o tratamento com W induziu ganho de peso dos animais com diminuição da diarreia. A metilação da warifteina, embora não tenha induzido o ganho de peso diminuiu a diarreia durante os desafios com o alérgeno. Todavia o tratamento com AFL não induziu o ganho de peso e nem inibiu a diarreia alérgica. Diferentemente, os tratamentos com o AFL e com os alcaloides reduziram os títulos de IgE específica para ovalbumina (OVA), aumentaram a proporção de linfócitos T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico. A proporção de linfócitos T reguladores foi aumentada no linfonodo mesentérico pelos tratamentos em estudo. Os experimentos in vitro, com células do linfonodo mesentérico de animais sensibilizados, demonstraram que W e MW inibiram a secreção de interleucina (IL-)12 e IL-10, sem alteração nos níveis de interferon-γ (IFN-γ) e IL-13. Esses resultados demonstraram que o tratamento oral com warifteina apresentou atividade anti-inflamatória por inibir a ação de mediadores da inflamação e que a metilação da molécula não potencializou seu efeito. Também, os tratamentos com AFL, W e MW apresentaram efeitos imunomoduladores na alergia alimentar com aumento de células Treg e com diminuição de citocinas oriundas de células do mecanismo imune inato independente das do mecanismo imune adaptativo. Palavras-chave: Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae), warifteina, agentes flogísticos, alergia alimentar, citometria de fluxo, Treg. 9 ABSTRACT Root bark infusions of the plant Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) are used in folk medicine, in Northeast Brazil, for the treatment of diseases of the respiratory and digestive tracts. Previous studies showed that the hydroalcoholic extract of the leaves (AFL) of the plant and warifteine (W), alkaloid bisbenzylisoquinolinic, presented anti-inflammatory and anti-allergic effects. This study evaluated the effect of the oral treatment of mice with W and methyl warifteine (MW) in the paw edema formation induced by phlogistic agents, vascular leakage and cell migration in acute inflammatory models and the effect of oral treatment with AFL and its alkaloids (W and MW) in chronic inflammation represented by the experimental model of food allergy (BALB / c mice sensitized with ovalbumin - OVA). Oral treatment with W reduced the paw edema induced by carrageenan, histamine and prostaglandin E2, an effect not presented in MW treatment. The warifteine and methyl-warifteine also reduced the vascular leakage, however without inhibiting cell migration associated with inflammation. In the experimental model of food allergy the treatment with W induced weight gain in animals with decreased of diarrhea. Methylation of warifteine did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea during the allergen challenge. However treatment with AFL did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea. In contrast, treatment with the AFL or its alkaloids reduced the IgE specific for ovalbumin (OVA) titer, increased the proportion of CD4 + or CD8+ T lymphocytes in mesenteric lymph nodes. The proportion of regulatory T lymphocytes in the mesenteric lymph nodes was also increased by the treatments. In vitro experiments, with cells from mesenteric lymph nodes of sensitized animals, demonstrated that W and MW inhibited the secretion of interleukin (IL-) 12 and IL-10 with no change in the interferon-γ (IFNγ) and IL- 13 levels. These results demonstrated that the oral treatment with warifteine presented anti-inflammatory activity by inhibiting the action of mediators of inflammation and the methylation of the molecule did not improve this effect. Also, the treatment with AFL, W and MW showed immunomodulatory effects in food allergy with increased of Treg cells and decreased of cytokines derived from cells of the innate immune mechanism independent of that of the adaptive immune mechanism. Key words: Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae), warifteine, phlogistic agents, food allergy, flow cytometry, Treg. 10 LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS AA ácido araquidônico. AFL extrato hidroalcoólico das folhas “alcoholic fraction from leaves” AFR extrato hidroalcoólico de raízes “alcoholic fraction from roots” AMPc monofosfato cíclico de adenosina BAL lavado bronco-alveolar BK Bradicinina COXs Ciclooxigenases cPGES PGES citosólica CTR- Controle negativo CTR+ Controle positivo DEXA Dexametasona DL50 dose letal para 50% FcεRI, receptor de alta afinidade para IgE FAE follicles-associated epithelium GM-CSF fator estimulante de colônias de granulócitos-monócitos i.p. via intraperitoneal IC 50 Concentração inibitória 50% IFN Interferon Ig Imunoglobulina IL Interleucina ICAM-1 Molécula 1 de adesão intercelular “intercelular adhesion molecule-1” kg, Kilograma LPS Lipopolisacarídeo MAPK tirosinacinase ativada por mitógeno mg Miligrama min Minuto mL Mililitro mM milimolar mPGES-1 PGE sintase-1 microssomal MW metil-warifteina NFκB fator nuclear κB nm Nanômetro 11 OVA Ovalbumina PBS solução de tampão fosfato PGES PGE2 sintase PGs Prostaglandinas ROS reativos intermediários do oxigênio rpm Rotação por minutos SBF Soro Bovino Fetal TNF‐α Fator de Necrose Tumoral TLRs Receptors semelhantes ao toll “toll like receptors” Treg Linfócitos T regulatórios ATP trifosfato de adenosina v.o. por via oral VCAM-1 Molécula 1 de adesão ao endotélio vascular “Vascular adhesion molecule-1” W Warifteina μg Micrograma μM microMolar 12 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Folhas da planta Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae)................. 36 Figura 2 Estrutura química da warifteina e da metil-warifteina......................................... 38 Figura 3 Desenho esquemático do protocolo experimental para a indução de alergia alimentar experimental e tratamentos.................................................................. 49 Figura 4 Microfotografias dos jejunos, corado com Azul de toluidina, dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar....................................................... .... 69 Figura 5 Microfotografias dos jejunos, corados com Hematoxilina&Eosina., dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar...................................................... ..... 70 Figura 6 Microfotografias dos jejunos, corados com ácido periódico de Shiff, dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar............................................ .. 71 13 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1. Efeito da warifteina e metil-warifteina na formação do edema de pata em camundongos Swiss desafiados com carragenina ou lipopolissacarideo (LPS)... 56 Gráfico 2. Efeito da warifteina e da metil-warifteina na formação do edema de pata de camundongos Swiss desafiados com histamina, prostaglandina E2 e bradicinina........................................................................................................ 59 Gráfico 3. Efeito da warifteina e metil-warifteina no extravasamento de líquido para o peritônio de camundongos Swiss desafiados com ácido acético......................... 61 Gráfico 4. Efeito da warifteina e metil-warifteina na migração de células da inflamação para o peritônio de camundongos Swiss desafiados com zimosan...................... 63 Gráfico 5. Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina no peso corporal durante os desafios com o alérgeno e no ganho de peso corporal em modelo experimental alergia alimentar................................................................ .......... 65 Gráfico 6 Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na diarreia provocada pelos desafios com o alérgeno em modelo experimental alergia alimentar................................................................................................ ........... 66 Gráfico 7 Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na presença de células inflamatórias em modelo experimental alergia alimentar........................ 69 Gráfico 8 Efeito do AFL ou alcaloides warifteina e metil-warifteina na produção de IgEOVA específica no modelo experimental de alergia alimentar ........................... 73 Gráfico 9 Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na proporção de células T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico (MLN)................................ 75 14 Gráfico 10 Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na proporção de células T CD25 e FoxP3 no linfonodo mesentérico (MLN)................................ 76 Gráfico 11 Efeito do alcaloide warifteina na produção de citocinas em células de linfonodo mesentérico de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina....................................................................................... ......... 78 Gráfico 12 Efeito do alcaloide metil-warifteina na produção de citocinas em células de linfonodo mesentérico de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina............................................................................................. . 79 15 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. ......... 17 1.1 Inflamação..................................................................................... ..................... 17 1.2 Inflamação aguda........................................................................................ ........ 20 1.3 Inflamação crônica..................................................................................... ......... 22 1.4 Mediadores da inflamação........................................................................... ........ 24 1.5 Alergias..................................................................................................... ......... 30 1.6 Alergia Alimentar....................................................................................... ........ 31 1.7 Plantas, compostos e inflamações................................................................. ....... 34 1.8. A planta Cissampelos sympodialis e seus alcaloides........................................... 36 2. OBJETIVOS........................................................................................................ ........ 41 2.1 Geral.......................................................................................................... ........ 41 2.2 Específicos.................................................................................................. ....... 41 3. MATERIAL E METODOS.................................................................................. ....... 42 3.1 Lista de reagente químicos e biológicos.............................................................. 42 3.2 Lista de material plástico e equipamentos...................................................... ...... 43 3.3 Local de pequisa................................................................................................................. 44 3.4 Animais experimentais....................................................................................................... 44 3.5 Preparação do extrato e das soluções dos alcaloides........................................... .. 44 3.6 Edema de pata induzido por agentes flogísticos e mediadores da inflamação....... 45 3.7 Avaliação da permeabilidade vascular.......................................................... ....... 46 3.8 Avaliação da migração de células da inflamação induzida por zimosan................ 47 3.9 Indução de alergia alimentar experimental.......................................................... 47 3.10 Avaliação do peso corporal........................................................................ ....... 49 3.11 Coleta de sangue para retirada de soro....................................................... ........ 49 3.12 Titulação de IgE-OVA-específica por de Anafilaxia Cutânea Passiva................ 49 3.13 Coleta de tecido e morfometria.......................................................................... 50 3.14 Citometria de fluxo para análise do fenótipo dos linfócitos T....................... ..... 50 3.15 Cultura celular e coleta de sobrenadante....................................................... ..... 52 3.16 Dosagens de citocinas................................................................................ ....... 52 16 3.17 Análises estatísticas................................................................................... ....... 53 4. RESULTADOS................................................................................................... ......... 55 4.1 Efeito da warifteina e metil-warifteina no edema de pata induzido por carragenina ou lipopolissacarídeo............................................................................. 55 4.2 Efeito da warifteina e da metil-warifteina no edema de pata induzido por mediadores da inflamação, histamina, prostaglandina E2 (PGE2) ou bradicinina..... .. 58 4.3 Efeito da warifteina e metil-warifteina na permeabilidade vascular induzida por ácido acético....................................................................................................................................... 61 4.4 Efeito da warifteina e metil-warifteina na migração de células inflamatórias induzida por zimosan........................................................................................................................ 63 4.5 Efeito do extrato de Cissampelos sympodilais (AFL) e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina no peso corporal em modelo experimental de alergia alimentar.... . 64 4.6 Efeito dos tratamentos com AFL ou com os alcaloides warifteina e metil warifteina na diarreia alérgica............................................................................ ....... 66 4.7 Efeito do tratamento com AFL ou com os alcaloides warifteina e metil warifteina na produção de muco e infiltrado de eosinófilos e mastócitos................. .. 68 4.8 Efeitos dos tratamentos com AFL e os alcaloides warifteina e metil -warifteina na produção de IgE............................................................................................ ....... 73 4.9 Efeito do tratamento com AFL ou com os alcaloides warifteina e metil warifteina na proporção de células T................................................................... ...... 74 4.10 Efeitos dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na produção de citocinas........................................................................................................... ........ 77 5. DISCUSSÃO................................................................................................. ...... 80 6. CONCLUSÕES.................................................................................................. 90 7. REFERENCIAS.................................................................................................. 8. ANEXOS............................................................................................................. 17 1. INTRODUÇÃO 1.1. INFLAMAÇÃO A inflamação é uma resposta fisiológica em reação a um corpo estranho ou lesão tecidual e é dividida em padrões agudos e crônicos. A inflamação é considerada aguda por possuir duração relativamente curta e ser auto limitada podendo durar minutos, horas ou alguns dias, e é caracterizada por vasodilatação, exsudação de líquido plasmático rico em proteínas e migração de células para o local da lesão (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004). A inflamação é considerada crônica por apresentar maior tempo de duração e estar histologicamente associada à presença de linfócitos e de macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibrose e necrose tecidual (FUJIWARA e KOBAYASHI 2005). A inflamação aguda tem um papel fisiológico importante na defesa do hospedeiro e reparação dos tecidos, contudo se esse processo é exacerbado pode levar à lesão tecidual excessiva podendo evoluir para um processo crônico. A inflamação crônica, resultado do estímulo inflamatório do modo contínuo, apresenta consequências mais graves como o câncer, o diabetes, as doenças cardiovasculares, pulmonares e neurológicas. Para evitar a progressão da inflamação para o processo crônico é necessário limitá-lo desde a fase aguda com a redução do infiltrado celular e de liberação e ação de seus produtos potencialmente tóxicos (BALKWILL e COUSSENS, 2004; AGGARWAL et al., 2006). Uma grande variedade de eventos, incluindo danos mecânicos, infecções, queimaduras por substâncias químicas ou radiação e injúria tecidual podem induzir a inflamação aguda (SCHMID-SCHONBEIN, 2006). O processo inflamatório agudo é iniciado a partir da ativação de células dos tecid os (células endoteliais e dendríticas, macrófagos e mastócitos) e de células migratórias (neutrófilos, monócitos, eosinófilos e linfócitos) que realizam papéis essenciais na inflamação desde os mecanismos de proteção até as ações de lesão tecidual (SIMON e GREEN, 2005; SCHMID-SCHONBEIN, 2006). As células presentes respondem a substâncias geradas no local da lesão ou infecção tais como aumento de íons potássio, hialuronato ou sulfato de heparan da matriz extracelular, proteína de alta mobilidade HMGB-1 e moléculas de 18 trifosfato de adenosina, essas substâncias são denominadas de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) cuja ação resulta em aumento da inflamação. Outro grupo de substâncias de origem normalmente infecciosa são os padrões moleculares associados a patógeno nos quais incluem-se o lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, peptídeos formilados (fMLP) e β -glicanas (TANG et al., 2012). Em reposta a essas substâncias são liberados mediadores que favorecem a inflamação dentre eles o Fator de Necrose Tumoral (TNF‐α), Interleucina-1 (IL‐ 1β), prostaglandinas (PGs), cininas (SALLUSTO et al., 1995; SCHNURR et al., 2000) e outras citocinas, tais como IL-6 e IL-12 liberadas dos macrófagos tissulares (CAMPOREALE e POLI, 2012). Os mediadores liberados na inflamação atuam localmente e/ou sistematicamente colaborando para o aparecimento dos sinais cardinais característicos desse processo, ou seja, dor, calor, rubor e tumor, acompanhados ou não da perda de função do tecido ou órgão afetado (ROCHA e SILVA, 1994). É possível determinar e confirmar o mecanismo de ação de substâncias anti-inflamatórias já utilizadas na clínica e também descobrir novas substâncias a partir de modelos experimentais que mimetizam os sinais da inflamação pela administração de compostos com ação pro - inflamatória denominados agentes flogísticos (VASCONCELOS et al., 2012). Dentre os modelos experimentais empregados há os que utilizam substâncias de origem natural como a carragenina, composto derivado de algas vermelhas (Chondrus crispus), amplamente usado para melhorar a textura e a solubilidade de produtos alimentícios como as fórmulas infantis. Entretanto essa substância tem sido utilizada na indução de inflamação em modelos animais para testar a efetividade de anti-inflamatórios (MURAI et al., 2003). A carragenina é molecularmente semelhante aos glicosaminoglicanos sulfatados da matriz extracelular sendo capaz de ligar ao receptor semelhante ao Toll-4 (TLR- Toll like receptors) (BHATTACHARYYA et al., 2008). Após a administração de carragenina, nos animais, ocorre a liberação, no local da inoculação, de diferentes mediadores da inflamação iniciando -se com moléculas pequenas tais como óxido nítrico, histamina e serotonina, no período de até 4 h, após esse período ocorre uma segunda fase em que há a liberação de citocinas, dentre as quais TNF‐α e IL‐1β e após 24 h a inflamação é mantida em 19 consequência da presença de células migratórias como neutrófilos e macrófagos (MURAI et al., 2003; KHAN et al.,2013) O zimonsan representa outra substância bastante empregada na pesquisa inicial de novas drogas com potencial anti-inflamatório e no estudo dos mecanismos fisiológicos da inflamação (CHOI et al., 2011; HUNG et al., 2011). O zimosan é um polissacarídeo rico em glicose, extraído da parede celular d e fungos Saccharomyces cerevisiae, capaz de se ligar a receptores TLR-2 e Dectin-1 na membrana de fagócitos induzindo a ativação dessas células (IKEDA et al., 2008). Após a administração de zimosan é possível mensurar diversos eventos inflamatórios como o edema, secreção das citocinas tais como TNF‐α e IL‐1β e migração celular (GIL et al., 2010), a fagocitose também pode ser avaliada usando o zimosan como marcador (BANG et al., 2012) A administração de lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano é rotineiramente empregada em modelos experimentais para estudo de substâncias anti inflamatórias (FU et al., 2012). O LPS possui o mecanismo de ação bem determinado sendo dependente da ligação ao TLR-4 que ativa os mediadores intracelulares como o MyD88 resultando na secreção de TNF-α e IL-1β que podem agir de modo local induzindo edema e migração celular ou de modo sistêmico induzindo aumento de temperatura corporal (SIMON et al., 2010) Os modos de ação mais específicos para a indução dos eventos inflamatórios como edema e dor, podem ser encontrados em modelos que utilizam diretamente os mediadores encontrados na inflamação dentre eles histamina, PGE2 e bradicinina (CHAVES et al., 2013; TRIVELLATOGRASSI et al., 2013), definindo dessa forma contra qual substância inflamatória a droga testada está agindo, seja inibindo sua liberação/secreção, ligação ao receptor ou aos mediadores intracelulares responsáveis pelos efeitos finais. A indução contínua do processo inflamatório, entretanto, resulta em inflamação crônica cujos mecanismos de gênese e de tratamento são estudados em modelo experimentais que auxiliam a compreensão da sua patofisiologia (ANDERSON, 1996). Um modelo de inflamação crônica é o de artrite reumatóide que pode ser reproduzido pela administração de sais de urato monossódico que se acumulam nas articulações lesionando-as induzindo a migração inicial de neutrófilos e monócitos. Essa migração torna-se contínua pela presença de linfócitos T, que sustentam a inflamação crônica a partir da secreção de citocinas 20 como os Interferons (IFN) ou interleucina (IL)-17 (GHAEMI-OSKOUIE e SHI, 2011). Outros modelos de inflamação crônica podem ser observados pelo uso de uma substancia antigênica associado a um adjuvante. O adjuvante induz a inflamação aguda (HORNUNG, 2008) e a presença contínua do antígeno resulta em inflamação crônica no sítio anatômico onde o mesmo persiste. Um exemplo de inflamação crônica pode ser observado nos modelos de hipersensibilidades como a asma alérgica à ovalbumina (OVA) (FUCHS e BRAUN, 2008), no qual a OVA, após sensibilização, induz lesão aos pulmões se administrada por instilação nasal ou aerossol (LLOYD et al., 2001), ou no modelo de alergia alimentar no qual ocorre dano ao trato gastrointestinal caso o antígeno seja administrado por via oral (BRANDT et al. 2003). Na inflamação crônica associada a hipersensibilidade tipo I a lesão tecidual é sustentada pela presença dos mastócitos, eosinófilos e os linfócitos T secretores de IL-4 e IL-5 (VIEIRA, R. P. et al., 2007; FUCHS e BRAUN, 2008). Essas células ativadas liberam seus produtos de desgranulação (proteases e agentes quimiotáticos entre outros) que são responsáveis pela destruição tecidual e perda de função (DAS et al., 2006, DAHLIN et al., 2011) 1.2. INFLAMAÇÃO AGUDA O conjunto de células que migram para o sítio inflamatório durante o processo inicial da inflamação é constituído principalmente de neutrófilos e de monócitos/macrófagos (CHOI et al., 2009; INGERSOLL et al., 2011) Os neutrófilos constituem cerca de 50-70 % dos leucócitos no sangue periférico e circulam por cerca de 10 horas e depois morrem. Eles patrulham os vasos sanguíneos e, na presença dos sinais inflamatórios, deixam de circular e migram para os tecidos inflamados sendo as primeiras células a extravasarem para os sítios inflamatórios (CHOI et al., 2009). A vida útil dos neutrófilos durante a inflamação é reforçada pela expressão de sinais de sobrevivência, dentre eles a survivina, retardando a apoptose (ALTZNAUER et al., 2004). Contudo, após cerca de três dias, os neutrófilos sofrem apoptose e são removidos por macrófagos (LAUBER et al., 2003; TAN et al., 2006). A permanência dos neutrófilos, em número excessivo, nos tecidos exacerba a inflamação pela liberação de reativos intermediários do oxigênio 21 (ROS), proteases e citocinas IL-1β e TNF-α (SAVILL et al., 1989; SOUSA et al., 2010). A migração e acúmulo contínuo de neutrófilos nos tecidos é uma característica de condições inflamatórias agudas e crônicas, tais como glomerulonefrite, doença inflamatória intestinal, vasculite autoimune, dermatite e artrite reumatoide (WEISSMANN e KORCHAK 1984; KASAMA et al., 2005; RANDIS et al., 2008; LARSEN et al., 2009). Portanto, a inibição da migração e redução do número de neutrófilos no sítio inflamatório representa um benefício no controle das doenças relacionadas (NATHAN 2006; MCDONALD et al., 2010). Os monócitos por sua vez se apresentam em menor proporção correspondendo de 5 a 10 % dos leucócitos periféricos circulantes. Estas células se desenvolvem na medula óssea, circulam no sangue periférico e migram para o tecido inflamado mediante a presença de estímulos tais como a quimiocina proteína-1 quimiotática do monócito (MCP-1/CCL2) (VAN FURTH 1985; CHOI et al., 2009). Os monócitos se diferenciam em macrófagos ou células dendríticas, por isso, estas células são comumente denominadas derivadas de monócitos (KUMAR e JACK, 2006; GEISSMANN et al., 2010). A diferenciação dos monócitos em macrófagos é influenciada por eventos de adesão durante o extravasamento e por mediadores presentes no local inflamado (WANG et al., 2001; SUDHAKARAN et al., 2007). Em comparação com a cinética de aparecimento dos neutrófilos, no sítio inflamatório, os macrófagos têm um início mais lento durante os estágios iniciais da inflamação (DALE et al., 2008). Os macrófagos já residentes nos tecidos fazem parte da rede do estroma em associação com o endotélio. Eles são rapidamente ativados em caso de lesão tecidual ou na presença de micro organismos e fornecem sinais para ativação endotelial com aumento da expressã o de moléculas de adesão como as selectinas e ligantes de integina (VCAM e ICAM) que possibilitam a migração celular (MEDZHITOV 2008; MORI et al., 2011). No processo inflamatório, os macrófagos possuem três funções principais: fagocitose, apresentação de antígenos e imunomodulação por meio da produção de várias citocinas e fatores de crescimento, desempenhando papeis fundamentais 22 na iniciação, manutenção e resolução do processo inflamatório como a fagocitose de restos celulares e proteicos somados a secreção de citocinas como o TGF-β que estimula a proliferação de fibroblastos (WILLOUGHBY et al., 2000; FUJIWARA e KOBAYASHI, 2005). Os sinais de ativação para estas células incluem citocinas tais como TNF α, Interferon (IFN)-γ, IL-12, fator estimulante de colônias de granulócitosmonócitos (GM-CSF), componentes bacterianos (LPS) assim como proteínas da matriz extracelular (FUJIWARA e KOBAYASHI, 2005). Após a estimulação, os macrófagos produzem e liberam várias citocinas (IL-1β, TNF-α e IL-6) e quimiocinas (CXCL1, CXCL8, CCL2 e CCL5), desempenhando um papel fundamental na iniciação da inflamação ( FEGHALI e WRIGHT, 1997; CASTELLHEIM et al., 2009; MEDZHITOV, 2008). Devido à produção de uma grande variedade de mediadores e de participarem de processos homeostáticos de limpeza tecidual e secreção de fatores de crescimento, os macrófagos podem apresentar sinais prejudiciais ao organismo no desenvolvimento do processo inflamatório. Desta forma intervenções terapêuticas que agem direta ou indiretamente nessas célula s e em seus produtos podem abrir novos caminhos para o controle de doenças inflamatórias (RODERO e KHOSROTEHRANI, 2010). A inflamação, portanto, protege uma região definida do tecido infectado ou danificado para inibir a progressão da lesão isolando a área e evitando a disseminação do agente infectante ou de produtos celulares tóxicos aos tecidos e, uma vez a inflamação sendo resolvida, a função tecidual é restaurada ao normal. Contudo os mecanismos da inflamação aguda são responsáveis pelo início da resposta imune adaptativa e caso o agente infeccioso ou os produtos celulares continuem presentes desenvolver-se-á uma inflamação crônica (MONTELEONE, PALLONE e MONTELEONE, 2011). 1.3. INFLAMAÇÃO CRÔNICA Os mecanismos da inflamação crônica são responsáveis pela agressão tecidual contínua associada a várias doenças dentre elas a doença de Crohn e as hipersensibilidades como as alergias (CHOY, 2012, MONTELEONE, PALLONE e MONTELEONE, 2011; MACDONALD e MONTELEONE, 2005). 23 A manutenção das doenças inflamatórias crônicas é dependente das respostas imunes adaptativas e mais especificamente de linfócitos T CD4+ (Linfócitos T helper (Th)). A resposta imune celular é dependente de linfócitos Th1, que receberam essa numeração por ser a primeira resposta imune estudada. A IL-12 proveniente de macrófagos, de células dendríticas, é a principal citocina responsável pela sua indução e o IFNγ como a principal citocina responsável por sua ação (NEURATH et a., 2002). O IFNγ ativa macrófagos e linfócitos T CD8+ a produzirem enzimas associadas à destruição de micro-organismos e de células infectadas respectivamente, entretanto mesmo na ausência de infecção essas células podem encontrar-se ativadas resultando em lesão tecidual (RINCÓN e FLAVEL, 1997). A artrite reumatoide é um exemplo de doença sistêmica que é caracterizada pela inflamação crônica das articulações com graus variáveis de erosão óssea e cartilaginosa assim como com hiperplasia do tecido sinovial, cuja patofisiologia é classicamente associada às células Th1 tanto em huma nos quanto em modelos experimentais (SAKKAS et al., 1998; HOLLÓ et al., 2000). Na contra mão da resposta Th1 associada à artrite, por exemplo, há a resposta Th2, induzida por IL-4 proveniente de mastócitos e/ou basófilos ou de células dendríticas (MIN, BROWN e LEGROS, 2012), que é caracterizada pela secreção aumentada de IL-4, IL-5 e IL-13. A IL-4 possui funções inibitórias ou de controle da secreção de IFN-γ, ou seja, da resposta Th1 e consequentemente da artrite reumatoide e outras doenças associadas ao perfil Th1 de citocinas (JOOSTEN et al., 1999). A inibição ou controle da resposta Th1, associada a inflamação crônica, pela resposta Th2 também pode ser observada na doença inflamatória intestinal na forma de doença de Crohn (THOMAS e BAUMGART, 2011). O equilíbrio entre o IFN-γ e IL-4 controla a inflamação intestinal crônica e as vias moleculares são dependentes da inibição dos fatores de transcrição T -bet e STAT-4, responsáveis pela indução/manutenção da resposta Th1, pelos fatores de transcrição GATA-3 e STAT-6, associados à resposta Th2 (KWEON et al., 2000; NEURATH et al., 2002; USUI et al., 2003). O perfil de resposta Th2, com função de estímulo na inflamação crônica independente de Th1, também está presente em doenças inflamatórias crônicas a exemplo das alergias (CHAPLIN, 2002). A inflamação alérgica e caracterizada 24 por infiltrado de eosinófilos, mastócitos, linfócitos T e B presentes no sítio anatômico afetado pela alergia como nos pulmões no caso da asma, vias respiratórias superiores como a rinite alérgica ou no trato intestinal observado na alergia alimentar (BARRETT e AUSTEN, 2009; SINAND E TOGIAS, 2011; SMIT et al., 2011). As doenças inflamatórias crônicas ricas em neutrófilos e monócitos, classicamente associadas a resposta Th1 como a artrite ou a doença de Crohn citadas, tem ganhado um novo enfoque com a descoberta da subpopulação de células denominadas de Th17 cuja principal citocina é a IL-17. Os estímulos caracterizados que polarizam para Th17 é a presença constante das citocinas IL 1, IL-6 associadas a citocina regulatória Fator de crescimento e transformação -β (TGF- β) que aumentam a expressão do fator de transcrição RORγt induzindo a resposta Th17 (ANNUNZIATO et al., 2008). A IL-17 é responsável pelo estímulo contínuo à ativação e migração de neutrófilos para o sítio inflamatório (ROUSSEL et al., 2010). Associados inicialmente a inflamação aguda, os neutrófilos passam a ser ativos produzindo agressão tecidual crônica exigindo o controle na sua produção para a reversão de doenças associadas (BELGI e FRIEDMANN, 2002). 1.4. MEDIADORES DA INFLAMAÇÃO Uma variedade de mediadores da inflamação de diferentes fontes como leucócitos, plaquetas e endotélio, liberados a partir do metabolismo do ácido araquidônico como PGs e leucotrienos (LTs), são reconhecidos por exercerem papéis importantes no processo inflamatório. Os mediadores podem ser considerados de ação rápida como as aminas vasoativas (histamina e serotonina) e as cininas ou de ação prolongada, como as citocinas (ALLER et al., 2006; GONZALEZ-REY et al., 2007). As aminas vasoativas são substâncias hidrossolúveis que contêm grupamentos amino em sua estrutura, como a histamina e serotonina, que agem sobre os vasos sanguíneos para alterar a sua permeabilidade ou para causar vasodilatação (SHEPRO e DUNHAM, 1986; BRAND et al., 2002). A histamina é responsável por inúmeras respostas celulares, incluindo o estímulo à secreção do ácido gástrico, neurotransmissão, vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular observadas nas reações alérgicas e inflamatórias, 25 (JONES e KEARNS, 2011). Os efeitos da histamina são mediados por receptores do tipo H1, H2, H3 e H4 que são acoplados à proteína G. Os receptores H1 e H2 são responsáveis pela maioria das ações inflamatórias induzidas pela histamina (JONES e KEARNS, 2011). O aumento da permeabilidade vascular leva ao angioedema e urticária que são os sintomas clínicos mais comuns na anafilaxia (hipersensibilidade tipo I ou imediata) sendo visto em 88 % dos casos de reações anafiláticas (OGAWA e GRANT, 2007). A histamina é liberada dos mastócitos por exocitose durante as reações inflamatórias ou alérgicas, a exemplo quando o antígeno interage com moléculas de Imunoglobulina (Ig) do isotipo E (IgE) fixadas as células; ou ainda, por meio de outros estímulos, como substância P e citocinas (SHERWOOD e TOLIVERKINSKY, 2004; JONES e KEARNS, 2011). Os efeitos dos mediadores hidrossolúveis liberados durante a inflamação somam-se aos das substâncias lipossolúveis denominadas prostanóides provenientes do metabolismo do ácido araquidônico (AA), tais como PGD2, PGE2, PGF2, PGI2, prostaciclinas e tromboxanos que apresentam suas biossínteses significantemente aumentadas nos tecidos inflamados (NARUMIYA, 2009). A PGE2 e PGI2 são os principais prostanóides com ação pró-inflamatória (SMYTH et al., 2009). A PGE2 é dotada de potente atividade vasodilatadora, sendo umas das substâncias responsáveis pela vasodilatação e pelo eritema presentes na inflamação aguda (SMYTH et al., 2009). É formada a partir do AA por ação das COXs que catalisam a síntese de PGH2, para posteriormente ser transformada em PGE2 pela ação da PGE2 sintase (PGES) (SAMUELSSON et al., 2007). Existem pelo menos três isoformas de PGES humanas clonadas e caracterizadas, como duas PGES associadas à membrana, chamada PGE sintase-1 microssomal (mPGES-1, mPGES-2), e uma PGES citosólica (cPGES) (KAWABATA, 2011). A cPGES é dependente de glutationa e é expressa constitutivamente sendo mais eficiente em metabolizar os produtos da COX-1 (CLAVEAU et al., 2003). Por outro lado, a expressão da mPGES é induzida principalmente por estímulos inflamatórios e é funcionalmente acoplada à COX-2 (KAMEI et al., 2004). 26 As evidências associam prostanóides, como a PGE2, e a via da COX-2 na inflamação como observado na expressão de ambos em muitos tecidos inflamados dentre eles a articulação de pacientes com artrite reumatoide (CROFFORD et al., 1994), bem como em vários modelos experimentais de inflamação (VANE et al., 1994; ANDERSON et al., 1996). A injeção de PGE2 diretamente no tecido reproduz os sinais clássicos da inflamação (WILLIAMS e HIGGS, 1988). Há estudos que sugerem que a PGE2 atua sinergicamente com outros mediadores, como a histamina e a bradicinina, especialmente na dor e no edema associados aos processos inflamatórios (ANDERSON et al., 1996; LAVICH et al., 2003). O bloqueio da ação de PGE2 pela inibição de sua síntese ou pela administração de anticorpos seletivos são capazes de inibir a inflamação, a hiperalgesia e a produção da IL-6 na inflamação induzida pela carragenina (PORTANOVA et al., 1996) . Por outro lado, diferente das aminas vasoativas e das PGs as cininas são moléculas maiores constituídas de polipeptídios que também apresentam tempo de ação imediato. As cininas são IFN-formados no plasma e em tecidos periféricos em resposta a ativação de enzimas denominadas calicreínas, atuando em substratos denominados de cininogênios. As cininas atuam em diferentes mecanismos fisiológicos, incluindo o controle da pressão arterial, da contração ou do relaxamento de músculo liso, da permeabilidade vascular e da transmissão da dor (BHOOLA et al., 1992; FERREIRA et al., 2002). Em mamíferos foram identificadas três cininas importantes: bradicinina (BK), Lys-bradicinina e des-Arg9-bradicinina (MARCEAU e REGOLI, 2004). Os efeitos da BK (nonapeptídeo) no processo inflamatório dependem da sua interação com os subtipos de receptores B1 e/ou B2 (MARCEAU e REGOLI, 2004). Os receptores B1 são escassamente expressos em tecidos saudáveis, mas sua expressão pode ser aumentada pela injúria e infecção. (EHRENFELD et al., 2006) A administração de LPS ou citocinas como TNF-α e IL-1β podem induzir a expressão de receptores B1 por meio da ativação de componentes da via das proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPKs) ou Fator Nuclear (NF) -kB (NODA et al., 2003). Por outro lado, os receptores B2 são expressos 27 constitutivamente e distribuídos em diversos tecidos (MARCEAU e REGOLI, 2004). Estudos têm demonstrado que o receptor B2 participa na indução dos sinais da inflamação aguda, incluindo aumento de permeabilidade vascular, de vasoconstrição, da migração celular e da dor por meio da ativação de fibras sensoriais (MCLEAN et al., 2000, SHAW e HARPER, 2011), ao passo que, o receptor B1 participa da fase crônica da resposta inflamatória (CALIX TO et al., 2001; NODA et al., 2003). As PGs, aminas vasoativas e cininas são moléculas cujos mecanismos de ação são dependentes de receptores acoplando a proteína G (GPCR). Por outro lado, as citocinas utilizam os receptores do tipo tirosina cinase, e estão envolvidos no processo inflamatório cuja atividade deve ser regulada para a inibição eficiente da inflamação (VAN HAUWERMEIREN et al., 2 011; DINARELLO et al., 2012). As citocinas produzidas durante o processo inflamatório dependem da natureza do agente causador. Assim, a presença de patógenos bacterianos ou das substâncias carragenina, zimosan ou Concanavalina-A são detectados por receptores celulares do sistema imunológico inato, como os TLRs, que são expressos em macrófagos residentes e induzem a produção de citocinas inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IL-1, IL-6) e quimiocinas (por exemplo, CCL2, CXCL1 e CXCL8) (TOGBE et al., 2006; MEDZHITOV 2008). O TNF-α é produzido principalmente por fagócitos mononucleares, mas pode ser produzido por outras células inflamatórias (neutrófilos, linfócitos, células NK, e mastócitos) ou não inflamatórias (células endoteliais). Estímulos indutores de TNF-α são transmitidos intracelularmente por meio dos membros da família das MAPKs, NF-kB e p38 que elevam a síntese de citocinas como o próprio TNF-α e a IL-6 (EL ALWANI et al., 2006; VANDEN et al., 2000). O TNF-α exerce potente efeito inflamatório pela capacidade de induzir a expressão das moléculas de adesão endotelial ICAM-1 (intercelular adhesion molecule-1) e VCAM-1(vascular adhesion molecule-1) (ZHANG et al., 2002; TSOYI et al., 2010); ativa neutrófilos e fagócitos mononucleares; induz a produção do fator de crescimento para fibroblastos e angiogênese (SHERWOOD, e TOLIVER-KINSKY, 2004; MAMBOLE et al., 2010) além do aumento da 28 permeabilidade vascular, tendo essas ações associadas a liberação do NF -kB no citosol ao estimular a degradação da subunidade inibitória IkB. O mediador intracelular NF-kB regula a síntese de muitas proteínas que funcionam em vias inflamatórias incluindo o próprio TNF-α, a IL-1β, o IFN-γ e as COXs (EL ALWANI et al., 2006; SUN, 2011; ZHENG et al., 2011). Assim como o TNF-α, a IL-1β é um potente mediador da inflamação e da febre (DINARELLO, et al., 2012). Os quatro membros da família da IL-1 (IL-1α, IL-1β, IL-1Ra e IL-18) são produzidos de forma diferente ao TNF-α, contudo são encontrados em inúmeros cenários inflamatórios (DINARELLO et al., 2012; EL ALWANI et al., 2006). Seus efeitos fisiológicos são essencialmente idênticos aos do TNF-α, entretanto, a IL-1β não induz, por si só, lesão tecidual ou morte apoptótica, embora possa intensificar os efeitos lesivos do TNF-α (DINARELLO, et al., 2012; SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; EL ALWANI et al., 2006). A secreção das citocinas TNF-α e IL-1β, mesmo que transitória, é suficiente para induzir a síntese e liberação de uma cascata de citocinas pró inflamatórias secundárias, incluindo IL-6, CXCL8, IL-12, IL-18, GM-CSF e CCL3/4 (FEGHALI e WRIGHT, 1997; WITKAMP e MONSHOUWER, 2000; HE et al., 2007). Em associação a IL-1β e ao TNF-α liberados pelos macrófagos, células endoteliais e fibroblastos secretam IL-6, que exibe ações inflamatórias como o principal sinal para a resposta de fase aguda hepática e como fator de crescimento para linfócitos B (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; EL ALWANI et al., 2006). Contudo, enquanto o TNF-α e a IL-1β induzem a produção de IL-6, esta última inibe a síntese dos primeiros, resultando em uma forma de resolução da inflamação induzida pelas próprias citocinas pró inflamatórias (DI SANTO et al.,1997). A IL-6 somada a presença do Fator de Crescimento e Transformação β (TGF-β), citocina anti-inflamatória que é liberada durante a resolução da inflamação, estimula a diferenciação e ativação de linfócitos T a liberar IL -17 (McGEACHY et al., 2007) citocina que está associada a processos inflamatórios crônicos (TOUSSIROT, 2012). O processo inflamatório mostra-se essencial durante a sensibilização alérgica em modelos experimentais nos quais a introdução de um antígeno 29 associado à adjuvante, como os sais de alumínio, induz a fagocitose e posterior liberação dos mediadores inflamatórios tais como IL-1β e TNF-α (HORNUNG et al., 2008) seguido do desenvolvimento de resposta imune dependente de linfócitos T (GHIMIRE et al., 2011; MORI et al., 2012). Kubo e col. (2004) demonstraram, em modelo experimental, que a PGE2 e análogos químicos são capazes de direcionar a resposta imune para o tipo Th2 (T helper-2) e inibir a liberação de IL-12p70 por macrófagos, portanto a redução na liberação ou ação de mediadores da inflamação aguda pode resultar em inibição no desenvolvimento do processo alérgico, configurando um possível modo de ação pelo qual uma substância pode apresentar atividade antialérgica. Contudo foi demonstrado que anti-inflamatórios não esteroidais clássicos como o diclofenaco e o ácido acetilsalicílico, cujos mecanismos de ação são o bloqueio estérico das enzimas COX e a inibição da liberação de PGE2, podem exacerbar as reações alérgicas, a exemplo, da desencadeada pelo trigo (HARADA et al., 2001; SHIRAI et al., 2003). O diclofenaco foi capaz de aumentar a resposta alérgica em modelo de alergia alimentar a amendoim (BOLSCHOENMAKERS et al., 2010) sendo os anti-inflamatórios não esteroidais considerados fatores de risco nas reações alérgicas (CARDONA et al., 2012) Substâncias anti-inflamatórias com propriedades antialérgicas devem apresentar outros mecanismos de ação além do bloqueio da síntese de PGs tornando-as hábeis em inibir a inflamação aguda e o processo alérgico crônico. Como exemplos desta classe de substâncias há o honokiol (análogo do neurotransmissor GABA) apresentando efeito anti-inflamatório e antialérgico por inibir a liberação de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 e estimular a liberação de citocinas anti-inflamatórias e antialérgicas tais como IL-10 e TGF-β (MUNROE et al., 2010), A substância AQX-1125, ligante da fosfatase1 de inositol (SHIP-1), inibiu a inflamação e a alergia em modelos de lesão pulmonar aguda induzida por LPS e alergia pulmonar induzida por ovalbumina (OVA) (STENTON et al., 2 012), cujo mecanismo de ação é dependente da ligação ao SHIP-1. Outra substância que apresenta esse efeito benéfico duplo é a IMD-0354, inibidor da cinase beta do IB (SUGITA et al., 2008). Os produtos naturais possuem representantes com esses efeitos com o os extratos da planta Agrimonia pilosa (KIM et al., 2012) e um derivado de planta 30 denominado brazilina (LEE et al., 2012) com ações dependentes da inibição de secreção de citocinas IL-4 e TNF-α, representando uma categoria de fármacos com efeito mais amplo e com mecanismo determinado contra doenças cuja fisiopatologia é fundamentalmente imunológica a exemplo das alergias. 1.5. ALERGIAS As doenças alérgicas são de interesse em saúde pública devido ao número de indivíduos que apresentam afecções relacionadas. Dentre as doenças alérgicas há a dermatite atópica, alergia alimentar, rinite, asma alérgica e o choque anafilático que são classificadas como reações de hipersensibilidade do tipo I – imediato, cuja fisiopatologia são semelhantes diferindo no sítio anatômico onde se manifestam. (SICHERER e LEUNG, 2012). O mecanismo imunológico responsável pelo início das reações alérgicas em humanos e camundongos, na maioria das vezes, depende da produção de IgE que ativam células efetoras como mastócitos, basófilos, eosinófilos e macrófagos. Essas células, que são amplamente distribuídas nos tecidos, quando ativadas são responsáveis pela liberação de mediadores da resposta inflamatória, tais como PGE2, histamina e serotonina, contribuindo assim para exacerbação e manutenção do processo alérgico (FINKELMANN et al., 2005; SICHERER e LEUNG, 2012). Segundo Punphrey (2004) a reação alérgica do tipo imediato ou anafilático ocorre dentro de alguns minutos e persiste por até cerca de 6 h após a exposição ao alérgeno. Essa reação pode ser desencadeada por picadas de insetos, pelo contato com moléculas estranhas ao organismo como os medicamentos e aquelas presentes na poeira e pela ingestão de alimentos (PEDEN 2005; SICHERER e LEUNG, 2006). Na fisiopatologia das alergias a presença de células T CD4 + com o fenótipo Th2 é essencial para o início e manutenção do processo inflamatório que as caracteriza (GEORAS et al., 2005). As citocinas secretadas por células Th2, tais como IL-4, IL-5 e IL-13 são importantes mediadoras da inflamação alérgica, pois determinam o fenótipo dos anticorpos produzidos e posterior ativação de células como mastócitos, basófilos e eosinófilos (WALKER et al., 1992). Essas células encontram-se aumentadas em indivíduos alérgicos e podem ser observadas principalmente no sítio onde ocorre a alergia como nos pulmões de 31 asmáticos e no trato gastrointestinal de quem apresenta alergia alime ntar (FORBES et al., 2008). 1.6. ALERGIA ALIMENTAR O trato gastrointestinal (TGI) é uma região no qual se destacam duas funções essenciais ao organismo: a absorção de nutrientes e a defesa do hospedeiro. A sua grande superfície de absorção e o fino epitélio que o compreende, exercem um papel facilitador na defesa do hospedeiro uma vez que, parte deste mecanismo, se deve a íntima associação entre células epiteliais vizinhas (MACDONALD e MONTELEONE, 2005; YU, 2012). A barreira celular primária do TGI e os processos de digestão previnem o contato dos antígenos com o sistema imune (PERRIER e CORTHÉSY, 2010). O lúmen intestinal mantém um largo contato com antígenos provenientes da dieta. Em particular o íleo e o cólon compartimentalizam muitos antígenos da com plexa microflora comensal existente nessa área, esses micro-organismos possuem funções relevantes para o sistema imune (PERRIER e CORTHÉSY, 2010). A barreira epitelial não previne completamente a entrada de antígenos luminais para o tecido (HUSBY et al., 1985). Alguns antígenos podem cruzar a superfície epitelial por meio do rompimento das finas conexões que unem o epitélio associado aos folículos – FAE (follicles-associatedepithelium), que são estruturas acomodadas no tecido linfóide organizado nas parede s do intestino (O'BOYLE et al, 1998). Um tipo especial de célula presente no FAE é a célula M, que funciona como célula transportadora de antígeno do lúmen para o folículo (CORR, GAHAN e HILL, 2008). As células dendríticas localizadas na mucosa intestinal, cuja função essencial é a de apresentação antigênica, emitem prolongamentos por entre as células do epitélio intestinal favorecendo o reconhecimento de partículas estranhas (RESCIGNO et al, 2001). A presença de uma vasta microflora residente com a possibilidade de invasões infecciosas, no intestino, estimula uma intensa resposta imunológica, evidenciada pela presença de um abundante tecido linfoide e de células do sistema imunológico nessa região. Em países ocidentais desenvolvidos, as doenças infecciosas intestinais são largamente controladas, entretanto as alergias 32 gastrointestinais e as inflamações idiopáticas têm aumentado dramaticamente, e as causas desses eventos ainda não estão claramente determinadas (BIRD 2008). Os estudos epidemiológicos da alergia alimentar são limitados, mas tem sido observada uma prevalência dessa afecção aos antígenos derivados do amendoim, ovo e leite, principalmente em crianças de países ocidentais ( LACK 2008). Estudos de prevalência desta patologia, utilizando como parâmetros os testes dérmicos, demonstraram 3,5 a 10% de desencadeamento de alergia a qualquer tipo de alimento (ZUIDMEER et al., 2008; SANTOS e LACK, 2012) Mudanças na dieta podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de alergia, como a deficiência de ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega 3 que favorece o desenvolvimento da resposta tipo Th2 (KULL et al., 2006). Da mesma forma, o aumento de ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega 6 podem favorecer a formação de PGE2 e inibir a resposta Th1 resultando em prevalência da resposta imune do tipo Th2 (LACK, 2008) A resposta imune aos antígenos alimentares proteicos resulta da interação entre alimentos, células efetoras e seus mediadores. A maioria das reações agudas aos alimentos é devido a interação entre antígenos alimentares, IgE alérgeno-específica e o receptor de alta afinidade (FcεRI) expressos em mastócitos (GOULD e SUTTON, 2008). A interação do antígeno com o mastócito sensibilizado estimula uma série de eventos que resulta na liberação de mediadores tais como serotonina, histamina e fator de agregação plaquetária (BRANDT et al. 2003). A manifestação da alergia alimentar ocorre imediatamente após a ingestão do alérgeno levando aos sintomas clínicos incluindo náusea, vômitos e diarreia (LEHRER et al., 2002). O evento celular inicial que induz as manifestações alérgicas a alimentos está diretamente relacionado a mediadores tais como histamina, bradicinina e PGE liberados de mastócitos no intestino (HOLGATE, 2000; BRANDT et al., 2003). Portanto moléculas que inibam a produção ou o efeito destes mediadores provavelmente minimizarão os sintomas como diarreias observadas nas hipersensibilidades do trato digestório. O desenvolvimento da resposta alérgica no TGI é dependente de célula Th2 secretora de IL-4, IL-5 e IL-13 (YAMAMOTO et al., 2008). A IL-9 também tem sido implicada na ativação de mastócitos durante o desenvolvimento da 33 alergia alimentar, estimulando a migração dessas células para o intestino (FORBES et al., 2008) No intestino delgado são encontradas também estruturas linfóides denominadas placas de Peyer em forma de agregados de tecidos linfóides (NEUTRA et al., 2001). Os linfonodos mesentéricos e as placas de Peyer, presentes no TGI, possuem uma função inibitória no desenvolvimento da diarreia alérgica, possivelmente por serem o local de acomodação das células T regulatórias (Treg) CD4 + CD25 + foxp3 + produtoras de IL-10 (TAKAYAMA et al., 2007). Outra forma de minimizar o desenvolvimento de alergia alimentar é induzir os mecanismos de tolerância ao alérgeno, isto é, o reconhecimento deste produto, até então estranho ao sistema imunológico, como inócuo (STROBEL e FERGUSON, 1986). A tolerância que se desenvolve no trato digestório e pode se tornar sistêmica dando ao TGI a função de indutora de tolerância a antígenos estranhos, essa tolerância é chamada de tolerância periférica para diferenciar da tolerância central realizada pelos órgãos linfoides primários tais como timo e medula óssea (MATHIS e BENOIST, 2010). A falha no desenvolvimento ou na manutenção da tolerância tem como consequência, no trato digestivo, a presença de doenças como alergia alimentar e doença inflamatória intestinal (RACHID e UMETSU, 2012; BERGSTROM et al., 2012). Essa falha pode acontecer devido a presença do antígeno associado a substâncias inflamatórias como PAMPs ligantes de TLR-7 como o RNA, ou ligantes de TLR-9 como o DNA (SHLOMCHIK, 2009). A falha na tolerância imunológica pode ser resultando de uma apresentação antigênica eficiente com moléculas estimulatórias e citocinas aos linfócitos T CD4+ específicos que se tornam responsivos a presença deste antígeno. Contudo ocorre em paralelo o desenvolvimento de linfócitos T CD4+ específicos inibidores da ativação imune frente ao antígeno, esta célula com função inibidora é denominado de Treg cujos mecanismos de ação a torna o principal tipo de célula responsável pela tolerância periférica (RACHID e UMETSU, 2012). Os modelos experimentais de estímulo à tolerância ou indução de alergia alimentar auxiliam nos estudos dos mecanismos que dão origem a ambos ao 34 mesmo tempo em que permitem a avaliação de terapias que auxiliem no combate aos sintomas alérgicos, como a imunoterapia oral e a descoberta de substâncias terapêuticas contra alergias (BERIN e MAYER, 2009; SICHERER e SAMPSON, 2009). 1.7. PLANTAS, COMPOSTOS E INFLAMAÇÕES A necessidade de intervenções terapêuticas que possam trazer benefício ao paciente com inflamação, independente da origem, tornam os estudos em modelos experimentais de inflamação relevantes permitindo a avaliação dos efeitos de diferentes substâncias nos mais variados parâmetros presentes nesta afecção (SICHERER e SAMPSON, 2009). As plantas e seus produtos são amplamente estudados em modelos de inflamação aguda e crônica objetivando a descoberta de novas formas de tratamento com ações terapêuticas e alvos farmacológicos diversificados (LOURENÇO, FERREIRA e BRANCO, 2012). Os produtos de origem natural podem ser o ponto de partida para a descoberta de novas estruturas químicas com ação terapêutica ou para o inicio de síntese de novas substâncias (LOURENÇO , FERREIRA e BRANCO, 2012). Uma classe química de origem natural com representantes antiinflamatórios são os alcaloides. O cetorolaco, o etodolaco e a indometacina são anti-inflamatórios, produtos de síntese, que apresentam estrutura química de alcaloide pirrolizínico, pirano e indólico respectivamente ( British national formulary, 2005). Dentre os medicamentos, atualmente usados na clínica, que apresentam origem em produtos naturais, há o ácido salicílico que foi originalmente isolado das cascas do salgueiro (Salix alba) que após reação de síntese deu origem ao ácido acetilsalicílico, um dos fármacos mais utilizados como anti-inflamatório na clínica médica (VANE e BOTTING, 1998) Plantas da família Menispermaceae como a Tinospora smilacina e a Cissampelos parreira tiveram seus extratos testados e demonstraram efeitos em modelos inflamatórios de edema de pata e artrite respectivamente (LI, R. W. et al., 2004; AMRESH et al., 2007). O extrato de Stephania tetrandra (Menispermaceae) e o seu alcaloide isolado tetrandrine, do tipo 35 bisbenzilisoquinilínico, demonstram efeitos anti-inflamatórios pela redução de citocina IL-8 e IL-6 (KANG et al., 1996; WU e NG, 2007) Em modelo de inflamação crônica como na alergia alimentar alguns trabalhos vem demonstrando o potencial das plantas como, por exemplo, o Kakkonto, uma formulação produzida a partir da mistura de sete plantas medicinais, que reduziu a diarreia alérgica, os neutrófilos e mastócitos no intestino assim como as citocinas IL-4, IL-10 e IFN-γ sem modificar os níveis de IgE séricos em modelo de alergia alimentar (YAMAMOTO et al., 2008). Huang, Liu e Jan (2010) demonstraram que a diosgenina, saponina derivada da planta Dioscorea opposita, aumentou o número de células FoxP3+ e IL-10+ no tecido duodenal entretanto sem diminuir a diarreia alérgica induzida por OVA em modelo murino. Outro trabalho, em modelo de alergia alimentar, mostra que o tratamento com polifenóis extraídos de maçã reduziu os níveis de IgE séricos elevando a proporção de células CD8+ sem avaliar a presença de diarreia alérgica ou alterações no peso induzida pelos desafios com o antígeno OVA (AKIYAMA et al., 2005). Em adição o uso de extrato de raízes Panax ginseng em modelo de alergia alimentar a OVA não alterou a diarreia ou os níveis de IgE, entretanto aumentou a proporção de células CD8+ no intestino e os experimentos in vitro demonstraram aumento nos níveis de IFN-γ e IL-12 estimulados com Con-A (SUMIYOSHI et al., 2010). A redução na diarreia induzida por alimento em animais hipersensíveis pode ser observada com o pré-tratamento (antes das sensibilizações e desafios) com os extratos de Actinidia arguta (KIM et al., 2009)e de Nigella sativa (DUNCKER et al., 2012). O extrato de Actinidia arguta reduziu os níveis de IgE, efeito este não observado pela administração de Nigella sativa. A formulação produzida a partir de plantas medicinais denominada de FAHF-2 (Food Allergy Herbal Formula-2) apresentou resultados satisfatórios na alergia alimentar envolvendo os mecanismos como redução de IgE, inibição da desgranulação de mastócitos, aumento de células Treg e CD8+ com secreção de INF-γ, incluindo a inibição o choque anafilático. Esses efeitos foram demonstrados em modelo de alergia a amendoim, não tendo sido demonstrados 36 efeitos no trato gastrointestinal em modelo de OVA (SRIVASTAVA et al., 2009; 2012). Com base nos escassos trabalhos realizados em modelos experimentais de alergia e seu tratamento com plantas ou compostos derivados de plantas é possível portanto destacar dois pontos importantes: 1) a dificuldade de atenuar os diversos parâmetros mensurados durante a alergia alimentar, e 2) não há padronização completa das metodologias que possam determinar todo potencial antialérgico em modelos de alergias experimentais. Os extratos das plantas e formulações derivadas de plantas acima citadas já são utilizadas como antialérgicas pela população e representaram estímulo primordial à pesquisa para o tratamento de alergia alimentar. 1.8. A PLANTA Cissampelos sympodialis E SEUS ALCALOIDES. A planta Cissampelos sympodialis Eichl. (Menispermaceae) (Figura 1) é endêmica no nordeste brasileiro (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997) apresentando os nomes populares de milona, abútua ou orelha de onça. As suas raízes são utilizadas, em forma de maceração, pela medicina popular para o tratamento de diarreias, doenças do trato geniturinário e doenças do trato respiratório tais como: asma, influenza e bronquite (CORRÊA, 1984). Fonte: Arquivo particular dos autores. Figura 1 - Folhas da planta Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae) 37 Ensaios farmacológicos demonstraram que o extrato hidroalcoólico das raízes de Cissampelos sympodialis (AFR- alcoholic fraction from roots) apresentou ação espasmolítica na musculatura lisa de traqueia de cobaias sensibilizados com OVA (THOMAS et al., 1995). Contudo para a produção do AFR se faz necessária a destruição da planta o que limita os estudos e a possível produção de um medicamento fitoterápico. A alternativa para transpor tal barreira foi realizar os estudos com o extrato hidroalcoólico de suas f olhas (AFLalcoholic fraction from leaves), os quais demonstraram apresentar atividade espasmolítica na musculatura lisa de traqueia de cobaias semelhante a do AFR (THOMAS et al., 1997a) Posteriormente foi demonstrado que o AFL inibiu a resposta proliferativa de células esplênicas de camundongos BALB/c (PIUVEZAM et al., 1999; ALEXANDRE-MOREIRA et al., 2003a), a proliferação de linfócito B e a produção de IgM, quando as células foram estimuladas com LPS bacteriano ou com Ig-anti-IgM (ALEXANDRE-MOREIRA et al., 2003b), demonstrando que o extrato das folhas da planta interfere na atividade imunológica e que tem potencial contra doenças relacionadas, estimulando a continuidade da pesquisa. A atividade anti-inflamatória do AFL foi inicialmente demonstrada utilizando o método clássico de edema de orelha induzido por mediadores farmacológicos tais com capsaicina ou acetato de tetradecanoilforbol (BATISTALIMA et al., 2001). Bezerra-Santos e colaboradores (2004) demonstraram que AFL quando administrado por via oral (v.o.) inibiu a produção de imunoglobulina E (IgE OVA-específica) em modelo experimental de asma, possivelmente por um mecanismo que envolveu a produção de IFN- e da citocina reguladora IL-10, ambas produzidas por linfócitos T (PIUVEZAM et al., 1999). O AF L também inibiu o recrutamento de leucócitos inflamatórios para o lavado bronco alveolar e tecido pulmonar induzido por antígenos (ovalbumina ou extrato de ácaro Blomia tropicalis) e o remodelamento pulmonar associado à inflamação crônica (BEZERRA-SANTOS et al., 2006; CERQUEIRA-LIMA et al., 2010; BEZERRASANTOS et al., 2012). Vieira e col. (2012) demonstraram que o AFL administrado pela via inalatória foi capaz de reduzir a migração específica de células da inflamação para o lavado bronco alveolar e reduzir a produção de muco e de fibras 38 associadas ao remodelamento tecidual pulmonar presente na inflamação crônica induzida por alérgeno. Em paralelo aos estudos na área de imunofarmacologia foram realizados estudos fitoquímicos que resultaram no isolamento, identificação e caracterização dos compostos dos extratos de Cissampelos sympodialis. Dentre eles estão os alcaloides bisbenzilisoquinolínicos - warifteina e metil-warifteina (Figuras 2A e 2B respectivamente), o alcaloide morfinânico - milonina e o alcaloide aporfínicolaurifolina (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997). O alcaloide roraimina, do tipo bisbenzilisoquinolínico, foi isolado posteriormente (DE LIRA et al., 2002) demonstrando que a maior parte de metabólitos secundários presentes nos extratos de C. sympodialis são representados por alcaloides. (A) (B) Fonte: BARBOSA-FILHO et al., 2012. Figura 2 – Estrutura química da warifteina (A) e da metil-warifteina (B) A warifteina (W) é um alcaloide do tipo bisbenzilisoquinolínico com peso molecular igual a 592 u, possuindo em sua molécula uma ponte metilênica, que é uma característica pouco comum às substâncias desta classe (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997). A warifteina foi o alcaloide isolado e encontrado em maior proporção nos extratos hidroalcoólicos das raízes e das folhas da planta Cissampelos sympodialis (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997; MARINHO et al., 2012) o que vem justificar a sua escolha como um marcador químico, pré-requisito para a produção de um fitoterápico a partir de um extrato padronizado (MARINHO, 2012; RESOLUÇÃO-RDC Nº- 48, DE 14 DE MARÇO DE 2004). A warifteina demonstrou ter ampla atividade farmacológica, dentre elas: bloqueadora neuromuscular (GORINSKY et al. 1972); relaxante de músculos lisos de íleos de cobaias (CÔRTES et al.,1995) e ação espasmolítica em músculo liso de aorta de coelho por modificação do metabolismo do cálcio (Ca ++ ) (FREITAS et al., 1996). A warifteina também foi capaz de aumentar os níveis de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) em cultura de músculo liso de cobaia 39 pela inibição da atividade enzimática da fosfodiesterase IV e V (THOMAS et al., 1997b). Ensaios de toxicidade aguda da warifteina em camundongos demonstrar am que a dose letal para 50% (DL 50 ) dos animais é de 511 mg/kg, por via intraperitoneal (i.p.). Entretanto, por via oral (v.o.), doses até 1000 mg/kg não induziram mortalidade nos animais durante o tempo de avaliação (CÔRTES, 1992). As avaliações de citotoxicidade de warifteina em culturas de hepatócitos e fibroblastos mostraram que a concentração inibitória de 50% das células (CI 50 ) varia de 10 a 35 μM de acordo com a metodologia empregada (MELO et al. 2003). Estudos em modelo de alergia experimental demonstraram que o tratamento com warifteina (v.o.) reduziu a eosinofilia provocada pelo antígeno na pleura e no lavado bronco-alveolar (BAL) de animais sensibilizados com OVA, assim como reduziu os níveis pleurais de cistenil-leucotrienos e a inflamação alérgica pulmonar (BEZERRA-SANTOS et al., 2006). Em estudo posterior, foi observado que o tratamento com warifteina, inibiu o desenvolvimento da hiperalgesia induzida por IgE, na presença de antígeno ou por mediadores fisiológicos, inibiu a produção de IgE tota l e de IgE antígeno-específica e ainda reduziu a formação de edema de pata pelo mecanismo dependente da produção de IgE, assim como inibiu a desgranulação de mastócitos e a proliferação de esplenócitos in vitro (COSTA et al., 2008). No entanto, a warifteina induziu a produção de óxido nítrico (NO) de macrófagos peritoneais (COSTA et al., 2008) demonstrando estimular um perfil de resposta imunológica inibitória ao desenvolvimento da resposta imune alérgica. A warifteina exibiu similaridades aos efeitos demonstrados com o AFL, Rocha e colaboradores (2010) demonstram que a warifteina age diretamente na função dos linfócitos B inibindo a proliferação e secreção de Ig, modificando o padrão de fosforilação de tirosina cinase ativada por mitógeno ERK e os níveis intranucleares de NFκB. Associado à inibição da atividade dos sinalizadores intracelulares, a warifteina promove o aumento de AMPc em linfócitos B e em homogenato de musculo liso. A metil-warifteina, um derivado natural da warifteina induziu aumento nos níveis de AMPc em homogenato de músculo liso com potência superior à warifteina (THOMAS et al., 1997b), contudo a menor quantidade deste alcaloide 40 nos extratos limitou as pesquisas anteriores. Em adição a metil-warifteina reduziu o número de linfócitos T no BAL sugerindo que a planta com seus compostos estejam regulando esta população de células (VIEIRA et al. 2012). De acordo com o exposto acima em que o extrato das folhas da planta C. sympodialis tem apresentado efeitos anti-inflamatório e antialérgico em modelos clássicos de inflamação (BATISTA-LIMA et al. 2001) e de alergia pulmonar (BEZERRA-SANTOS et al. 2006, 2012) e ainda os relatos de que macerados de partes da planta são utilizados na medicina popular para o tratamento de inflamações e diarreias, o objetivo deste estudo foi estudar o efeito anti inflamatório de Cissampelos sympodialis e de warifteina em modelos de inflamação aguda e alergia alimentar e comparar os resultados obtidos com os da metil-warifteina no sentido de determinar a relação estrutura atividade. 41 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Estudar o potencial anti-inflamatório da warifteina (W) e metil-warifteina (MW) em modelos de inflamação aguda e o potencial antialérgico do extrato das folhas de C. sympodialis (AFL), W e MW em modelo experimental de alergia alimentar. 2.2 Específicos -Avaliar o efeito do tratamento oral com a W ou MW no desenvolvimento dos edemas de pata induzidos por carragenina, lipopolissacarídeo (LPS), histamina, prostaglandina E2 (PGE2) e bradicinina; -Determinar o efeito do tratamento oral com os alcaloides na permeabilidade vascular e migração celular para a cavidade peritoneal de camundongos desafiados com ácido acético ou zimosan respectivamente; - Em modelo experimental de alergia alimentar avaliar o efeito do tratamento oral com o AFL, W ou MW no desenvolvimento da diarreia alimentar e do peso de animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina; -Determinar, no tecido do intestino delgado, o número de células tais como mastócitos e eosinófilos e quantificar o muco nos animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com AFL, W ou MW; -Quantificar a concentração de IgE-ovalbumina específica nos soros dos animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com AFL, W ou MW; -Determinar o percentual das subpopulações de linfócitos T CD4/CD8 E Treg em linfonodos mesentéricos de animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina; -Quantificar as citocinas IL-12. IL-10, IFN-γ e IL-13 nos sobrenadantes de culturas celulares de linfonodos mesentéricos animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina. 42 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 LISTA DE REAGENTES QUÍMICOS E BIOLÓGICOS Acetato de Dexametasona (HENRIFARMA) Ácido acético (VETEC) Ácido clorídrico (VETEC) Azul de Evans (VETEC) Azul de Tripan (Sigma-Aldrich) Bradicinina (Sigma-Aldrich) Carragenina (Sigma-Aldrich) Cetamina (König) Clorofórmio (VETEC) Composto 48/80 (Sigma-Aldrich) Concanavalina A (Sigma-Aldrich) Etanol (QEEL) Hepes (Sigma-Aldrich) Hidróxido de amônio (Merck) Hidróxido de sódio (Sigma-Aldrich) Histamina (Sigma-Aldrich) IgG anti-CD25 conjugada com APC (eBIOSCIENCE) IgG anti-CD4 de camundongo conjugado com FITC (eBIOSCIENCE) IgG anti-CD4 de camundongo conjugado com PE (eBIOSCIENCE) IgG anti-CD8 conjugados com FITC (eBIOSCIENCE) IgG anti-foxp3 conjugada com PE (eBIOSCIENCE) Indometacina (ASPEN Port Elisabeth ltd) Kit de ELISA para a detecção das Citocinas IL-12, IL-10, IL-13 e IFN- (eBIOSCIENCE) L-glutamina (Sigma-Aldrich) Lps de Escherichia coli sorotipo O111:B4 (Sigma-Aldrich) Ovalbumina (Sigma-Aldrich) Penicilina G (Sigma-Aldrich) PGE2 (Sigma-Aldrich) 43 Piruvato de sódio (Sigma-Aldrich) Prometazina (Aventis) RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) Solução de tampão fosfato (SIGMA) Soro Bovino Fetal (Gibco) Sulfato de estreptomicina (Sigma-Aldrich) Sulfato de sódio anidro (Merck) Sulfato potássico de alumínio (alúmen) (Sigma-Aldrich) Tween20 (VETEC) Violeta de genciana (Merck) Xilazina (Syntec) Zimosan (Sigma-Aldrich) 3.2 LISTA DE MATERIAL PLÁSTICO E EQUIPAMENTOS Balanças (Marte Y220) Celite (545 FISCHER SCIENTIFIC) Centrífugas (CR422, JONAM) Citômetro de Fluxo (BD Biosciences ™, FACScalibur) Estufas de CO2 (Forma Scientific 3110) Espectrofotômetro (Elx808 Absorbance Microplate Reader) Placas de cultura de tecido com 24 poços (NUNC BRAND PRODUTS) Placas de ELISA com 96 poços (Costar) Tubos de 15 ou 50 mL (Falcon) Tubos de 1,5 mL (Global trade) Microscópios (OPTON e MOTIC) Paquímetro Digital (GREAT, MT – 04513), 44 3.3 LOCAL DE PESQUISA. A pesquisa foi realizada no Laboratório de Imunofarmacologia da Universidade Federal da Paraíba, Campus I em João Pessoa – PB. 3.4. ANIMAIS EXPERIMENTAIS. Camundongos fêmeas das linhagens isogênica BALB/c (18-25 g), e não isogênica Swiss (25-30 g), e ratas da linhagem não isogênica Wistar (250-300 g) provenientes do Biotério Prof. George Thomas da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) foram utilizadas neste estudo. Os animais tiveram livre acesso à água e alimentação balanceada a base de ração tipo Pellets e sementes de girassol. Os animais experimentais foram mantidos em uma temperatura ambiente variando de 21 2 °C e um ciclo de 12 h de claro/escuro. Todos os experimentos foram realizados com estrita observância às diretrizes éticas e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal/UFPB (CEPA N º 0302/11). 3.5. PREPARAÇÃO DO EXTRATO E DAS SOLUÇÕES DOS ALCALOIDES. As folhas de C. sympodialis foram obtidas do Jardim Botânico da Universidade Federal da Paraíba (voucher espécime Agra 1456) (3000 kg). As folhas foram secas a 50 °C e pulverizadas. O pó foi extraído com solução de etanol a 70% à temperatura ambiente, durante cinco dias em percolador. O álcool foi evaporado em rotavapor resultando no extrato seco (AFL) O AFL foi dissolvido em água e filtrado em papel de filtro comum, os filtros foram secados para determinar a concentração final dos componentes solúveis em água resultando em solubilidade de 78 % em média. Parte deste extrato foi submetido a um tratamento com uma solução de ácido clorídrico (HCl) a 3 % e filtrado em celite. Esta solução ácida foi extraída com clorofórmio e em seguida alcalinizada a frio com hidróxido de amônio (NH4 OH) até pH 8, após a alcalinização a solução foi extraída com clorofórmio e submetida aos testes de Mayer e Dragendorff até apresentarem resultados negativos. A fase clorofórmica foi seca com sulfato de sódio anidro (Na 2 SO4 ) e concentrada em rotavapor a 50 ºC, obtendo-se a fração de alcaloides terciários totais. A fração de alcaloides terciários foi submetida a cromatografia em coluna, cromatografia em camada delgada analítica e preparativa para o isolamento dos 45 alcaloides warifteina e metil-warifteina (DE LIRA et al., 2002). Os alcaloides foram extraídos pelo Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho e cedidos para a realização deste trabalho. Cada solução de alcaloide foi preparada usando 1 mg do cristal em 50 μL de HCl 1 N e 800 μL de água destilada. O pH foi ajustado para 7,0 com NaOH 1 N. O volume foi completado até 1000 μL e as diluições foram realizadas em solução salina a 0,9% de NaCl para o ensaio in vivo e em meio de cultura para o ensaio in vitro. O AFL foi avaliado para padronização pelo prof. Dr. Eduardo Jesus de Oliveira e apresentou uma concentração nominal de 0,95 % de warifteina. 3.6. EDEMA DE PATA INDUZIDO POR AGENTES FLOGÍSTICOS E MEDIADORES DA INFLAMAÇÃO. Esta abordagem experimental baseia-se no fato de que a administração de agentes inflamatórios (flogísticos) na pata de um animal produz uma reação inflamatória local caracterizada pela formação de edema, reprodutível e facilmente mensurável (VAJJA et al., 2004; POSADAS et al., 2004; NAIDU et al., 2010). Antes da realização dos experimentos, a espessura das patas traseiras dos camundongos foram medidas com um paquímetro digital, e a diferença entre a pata direita e esquerda foi considerada como a medida basal. Os animais (n=5-6) foram tratados com warifteina ou metil-warifteina nas doses de 2,0 mg/kg (W2 ou MW2) ou 10,0 mg/kg (W10 ou MW10), ou solução salina para o controle positivo (CTR+) e uma hora após os camundongos foram desafiados pela administração intraplantar (pata esquerda) com 20 μL de soluções contendo carragenina (500 μg/pata), LPS de Escherichia coli sorotipo O111:B4 (25 μg/pata), histamina (20 μg/pata), PGE2 (5 nmol/pata) ou bradicinina (3 nmol/pata). A pata direita recebeu apenas 20 μL da mesma solução salina usada para dissolver os agentes flogísticos, o grupo de animais considerado controle negativo (CTR-) recebeu pré-tratamento de solução salina e apenas salina em ambas as patas. As doses de 2 e 10mg/kg foram estudadas devido à resultados observado em estudos anteriores (COSTA et al., 2008; BEZERRA-SANTOS et al., 2006) onde foram demonstrados que essas doses foram efetivas em parâmetros avaliados em modelo de hipersensibilidade cutânea e pulmonar. 46 A diferença entre a espessura da pata traseira direita e esquerda foi avaliada nos tempos de 1, 2, 3, 4, 6 e 24 h após a aplicação da ca rragenina sendo a indometacina à dose de 10 mg/kg (indometacina 10), a droga padrão para a inibição deste edema. O edema induzido por LPS foi mensurado somente após 24h e foi utilizada a dexametasona na dose de 2 mg/kg (DEXA) como droga padrão. Quando o edema foi induzido por histamina foram mensurados nos tempos de 30 e 60 min e foi utilizado a prometazina na dose de 10 mg/kg (PROME 10), administrada por via intramuscular na pata direita, como droga padrão. Os edemas induzidos por PGE2 foram mensurados nos tempos de 15, 30 e 60 minutos e o edema induzido por bradicinina mensurado nos tempos de 15 e 30 min. Os edemas foram calculados pela diferença obtida entre o diâmetro da pata esquerda e direita nos tempos indicados usando novamente o paquímetro digital (CASTARDO et al., 2008; NAIDU et al., 2010). 3.7. AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR. A administração intraperitoneal de uma solução de ácido acético a 0,6% provoca reação inflamatória local envolvendo a liberação de mediadores como a PGE2 e óxido nítrico, que induzem o aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de líquido rico em proteínas (exsudato) para o interstício. Esta reação pode ser quantificada por meio do corante azul de Evans (método colorimétrico) que se combina à albumina plasmática formando um complexo corante-albumina que extravasa através da barreira endotelial lesada (KOU et al., 2005). Para este experimento, utilizaram-se cinco grupos de animais (n=4-5). Os quais foram tratados com warifteina nas doses de 2,0 ou 10,0 mg/kg (W2 ou W10), metil-warifteina na dose de 2,0 mg/kg (MW2), indometacina 10,0 mg/kg (indometacina 10) ou somente solução salina para o controle positivo (CTR+). Uma hora após, os animais receberam o ácido acético (300μL a 0,6 %) intraperitonealmente, uma solução contendo azul de Evans (1 % -intravenosa) que foi injetada 20-30 min antes da inoculação do ácido acético. Vinte minutos após o desafio com ácido acético os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e tiveram posteriormente os peritônios lava dos com 10 mL de água destilada. Após esse procedimento as amostras obtidas dos peritônios foram transferidas para tubos de 12 mL. As soluções foram centrifugadas por 47 10min/1500 rpm/8 °C e os sobrenadantes foram transferidos para placas de 96 poços, analisados com comprimento de onda de 620 nm, utilizando o espectrofotômetro (WHITTLE, 1964). 3.8. AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS DA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ZIMOSAN. Para avaliar a capacidade de warifteina em alterar a migração celular inflamatória foi utilizado o modelo de peritonite induzido por zimosan, (SCHWAB et al., 2007). Grupos de camundongos Swiss (n=5) foram tratados com warifteina ou metil-warifteina nas doses de 2,0 mg/kg (W2 ou MW2) ou 10,0 mg/kg (W10 ou MW10), indometacina 10,0 mg/kg (indometacina 10) ou somente solução salina para o controle positivo (CTR+) e controle negativo (CTR-). Uma hora após o tratamento foi administrado 1 mL de uma suspensão de zimosan (1mg/mL de PBS) por via intraperitoneal. O controle negativo (CTR-) recebeu apenas uma solução salina diluente do zimosan. Após quatro horas da administração de zimosan foi realizado o lavado do peritônio com PBS gelado, uma alíquota com a suspensão celular foi retirada e foi realizada a contagem de leucócitos totais com auxílio do líquido de Turk (violeta de Genciana 0,01% em ácido acét ico a 2%) em câmara de Newbauer (SCHWAB et al., 2007). 3.9. INDUÇÃO DE ALERGIA ALIMENTAR EXPERIMENTAL. A alergia alimentar experimental é um bom modelo para estudar as manifestações ou parâmetros observados na inflamação crônica (MACDONALD e MONTELEONE, 2005) Os camundongos BALB/c foram sensibilizados por injeção intraperitoneal, por duas vezes em um intervalo de duas semanas entre as sensibilizações, com 50 μg de ovalbumina (OVA grau V) na presença de 1 mg de adjuvante sulfato potássico de alumínio (alúmen: AlK(SO 4 )2 - 12H 2 O). Duas semanas após segunda sensibilização, iniciou-se o protocolo de desafio antigênico no qual os camundongos receberam uma solução de OVA (50 mg/250 mL) administrada por via oral (gavagem). O desafio alergênico foi repetido a cada dois dias em um total de 10 vezes (Figura 3). Antes de cada desafio intragástrico, os camundongos 48 foram privados de alimento por 3 h para reduzir a digestão da OVA no estômago (BRANDT et al.,2009). Os grupos de animais (n =6-10) foram tratados 1 h antes de cada desafio alergênico com as diferentes drogas e foram divididos em: controle negativo (CTR-, não-sensibilizados, tratados com salina e desafiado com OVA), controle positivo (CTR +, sensibilizado e desafiado com OVA e tratado com solução salina), AFL200 (sensibilizado e desafiado com OVA e tratado com AFL 200 mg/kg), W2 (sensibilizado e desafiado com OVA e tratado com warifteina 2 mg/kg) e MW2 (sensibilizado e desafiado com OVA e tratado com metilwarifteina 2 mg/kg). A dose de 200mg/kg do AFL para os tratamentos foi criteriosamente escolhida a partir de estudos prévios de Bezerra -Santos e col. (2004, 2005 e 2006) e Vieira e col. (2012) nos quais se observou reprodutibilidade nos resultados em modelos de hipersensibilidade pulmonar. A dose de 2 mg/kg de W foi definida neste estudo considerando que o extrato AFL a quantidade desse alcaloide é de aproximadamente 1%. Quanto a MW, devido a diferir da W apenas por uma metilação utilizou-se a fim de comparação a dose de 2mg/kg. Após cada tratamento os animais ficaram por 60 minutos em observação para determinar se o próprio tratamento não seria capaz de induzir alteração visível na fisiologia normal do trato intestinal. Após cada desafio com OVA, os animais foram mantidos isolados e observados por 60 min, se o animal apresentasse fezes líquidas (diarreia profusa) eram registrados como positivo para diarreia alérgica (BRANDT, E. B. et al.,2009), dos sintomas anafiláticos exibidos pelos animais também foram determinados os escores de acordo com o que se segue: 0, fezes normais; 1, fezes úmidas e não formadas; 2, fezes úmidas e deformadas com moderada coloração da pelagem perianal; 3, fezes aquosas com grande coloração perianal da pelagem; 4, fezes aquosas em mais de um ponto da caixa com grande coloração perianal da pelagem (YAMAKI e YOSHINO, 2011; DUNCKER et al., 2012). 49 . Figura 3. Desenho esquemático do protocolo experimental para a indução de alergia alimentar e tratamentos 3.10. AVALIAÇÃO DO PESO CORPORAL. O peso corporal foi determinado a cada dia de tratamento durante o protocolo experimental. O peso corporal de cada grupo foi obtido a partir das médias dos valores individuais e expressos em gramas (g). O ganh o de peso foi expresso em porcentagem para cada animal do grupo e foi determinado pela equação: peso do animal no 50 dia % de ganho de peso ( peso do animal no 28 . dia A média ± EPM do peso e da percentagem do ganho de peso corporal em cada grupo foi determinada e comparada entre os grupos (CARDOSO et al., 2009; DOURADO et al.; 2010). 3.11. COLETA DE SANGUE PARA RETIRADA DE SORO. No quinquagésimo dia do protocolo de sensibilização e desafios, os camundongos, de cada grupo experimental, foram anestesiados pela administração de 100 μL de solução anestésica, cetamina-xilazina (12,5-0,166 mg/mL respectivamente) por via intramuscular, para a coleta de sangue pelo plexo braquial, após a coleta do sangue para tubos de 1.5 mL e retração do coágulo, os soros foram separados por centrifugação, a 5000 rpm por 5 min em temperatura ambiente, e congelados a -20 ºC para posterior titulação de IgE. 3.12. TITULAÇÃO DE IgE-OVA-ESPECÍFICA POR ANAFILAXIA CUTÂNEA PASSIVA. Para a determinação do título de IgE-OVA específica, os soros de camundongos BALB/c foram descongelados e diluídos (razão 2) em salina: 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1: 16, 1: 64, 1: 128, 1: 256, 1: 512 e 1:1024. Um volume de 50 l dos soros diluídos foram injetados (via intradérmica) em diferentes s ítios dos dorsos de ratos Wistar previamente tricotomizados. Após 24 h, os ratos foram 50 anestesiados com 0,5 mL por via intraperitoneal de anestésico de cetamina/xilazina (12,5-0,166 mg/mL respectivamente) e as caudas lavadas com água e sabão para realização do desafio antigênico. O desafio antigênico consistiu na administração de 0,5 mL de uma solução salina contendo o corante Azul de Evans a 1 % e 2,0 mg de OVA na veia da cauda. Após 30 min, os animais foram eutanaziados por excesso de anestésico de cetamina/xilazina e os diâmetros das manchas formados no dorso foram mensurados com o auxílio de uma régua. O título foi determinado pela maior diluição do soro capaz de promover mancha mensurável 5 mm (HOLT et al., 1981). 3.13. COLETA DE TECIDO E MORFOMETRIA. Segmentos dos tecidos de 2 a 3 cm do intestino delgado (jejuno) foram coletados e limpos com salina gelada, fixados imediatamente em solução de formol 10% e posteriormente parafinizadas. Secções de 5 μm foram geradas por microtomia, fixadas em lâminas para microscopia e coradas para a quantificação diferencial das células com: hematoxilina&eosina para o infiltrado eosinofílico, azul de toluidina o infiltrado de mastócitos no tecido intestinal. As secções foram coradas com ácido periódico de Schiff (PAS) para a quantificação de células produtoras de muco. No mínimo 10 campos foram escolhidos no aumento de 40X (56.000 μm2/campo) para a contagem do número de eosinófilos e de mastócitos, os dados foram registrados como número de células por campo. Para a análise de muco, três seções do jejuno corados com PAS foram submetidos à análise morfométrica utilizando um programa de análise de imagem em execução em um microcomputador sistema operacional Windows 7, 64 bits. As imagens foram obtidas em 40x (56.000 μm2/campo) com uma microcâmara moticam5 (5MP) e analisados com o software AVsoftBioview (Spectra Module) versão 4.0. Para a determinação da área ocupada pelas células caliciformes, todos os pixels (componentes unitários que juntos formam a imagem digital) co m tons variáveis de magenta foram selecionadas para a criação de uma imagem binária e posterior cálculo da área total. Os dados foram quantificados e expressos como área ocupada por muco. (BRANDT et al., 2003; DE MATOS et al., 2011; DOURADO et al., 2010) 51 3.14. CITOMETRIA DE FLUXO PARA ANÁLISE DO FENÓTIPO DOS LINFÓCITOS T. Os linfonodos mesentéricos (MLNs) dos animais foram removidos, triturados com auxílio de um tubo de vidro esmerilhado em meio de cultura RPMI-1640 completo (10 % Soro Bovino Fetal (SBF)), o meio de cultura foi lavado com PBS (4ºC) por duas vezes e foi realizada a contagem das células totais em câmara de Newbauer. Duas alíquotas de 1,0 x 10 6 células/1 mL de PBS (4 °C) dos MLNs de cada animal foram centrifugadas (1200 rpm, 10 min, 4 °C), o sobrenadante foi descartado e os pellets ressuspensos para 100 μL. Para evitar ligações inespecíficas, as suspensões de células foram mantidas em PBS com 2 μL de soro de camundongo (diluídos 1:100 em PBS) durante 5 min. Uma alíquota foi utilizada para avaliar a quantidade de células T CD4+ ou CD8+, utilizando anticorpos monoclonais (0,03 μg de IgG anti-CD4 de camundongo conjugado com PE e 0,06 μg de IgG anti-CD8 conjugado com FITC). Após 30 min de incubação em local escuro, as amostras foram lavadas com adição de 1mL de PBS em cada, seguida de centrifugação (4 °C, 1200 rpm, 10 min, 4 ° C), o sedimento foi ressuspenso em 300 μL de PBS (4 °C) o conteúdo celular foi submetido ao citômetro de fluxo. Outra alíquota de células foi utilizada para avaliar a proporção de células T reguladoras na qual foi utilizado o kit da eBiosciences para marcação de células T regulatórias de camundongo (Mouse Regulatory T Cell Staining Kit #1). A marcação inicia-se após a ressuspenção das células no volume residual de 100 μL. Para evitar ligações inespecíficas, as suspensões de células foram mantidas em PBS com 2μL de soro de camundongo (diluídos 1:100 em PBS) durante 5 min. À alíquota adicionando-se anticorpos monoclonais (0,06 μg de IgG antiCD4 de camundongo conjugado com FITC e 0,03 μg de IgG anti-CD25 conjugada com APC). Após 30 min de incubação em ambiente escuro, as células foram lavadas com 300 μL de tampão de marcação de citometria (Flow Cytometry Staining Buffer) e ressuspensos em 500 μL de solução de permeabilização/Fixação (Permeabilization/Fixation working solution), incubadas em ambiente escuro por 30 min., cada suspensão celular as células foi lavada com 1 mL de tampão de permeabilização (Permeabilization Buffer) e, após a centrifugação, foram adicionadas 0,125 μg de IgG anti-FoxP3 conjugada 52 com PE diluídas em tampão de permeabilização. As amostras foram incubadas por 30 min a 4 °C em ambiente escuro, foi realizada uma lavagem com 1 mL de tampão de permeabilização e o sedimento foi ressuspenso com 300 μL de tampão de marcação de citometria em seguida o conteúdo celular foi submetido ao citômetro de fluxo. Para aquisição dos dados foi utilizado o programa de computador CellQuest ™ versão 2.1 para Macintosh OS (BD Biosciences ™), e para analisar os dados foi usado o programa de computador Win MDI versão 2.9 para Windows OS (YAMADA et al., 2009; FUKAYA et al., 2010). 3.15. CULTURA CELULAR E COLETA DE SOBRENADANTE. Os linfonodos mesentéricos dos animais do grupo CTR+ foram removidos, triturados com auxílio de um tubo de vidro esmerilhado em meio de cultura RPMI-1640 completo (10 % Soro Bovino Fetal (SBF), 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G,1 nM de piruvato de sódio, 2 nM de L glutamina e 2 mg/mL de hepes) para obtenção das células totais. Estes foram transferidos e incubados em tubo de 50 mL com RPMI-1640 completo. A contagem de células totais foi realizada em câmara de Neubauer e a viabilidade celular avaliada pelo teste de exclusão pelo corante azul de Tripan 0,2 %. Após este procedimento as suspensões celulares foram semeadas em duplicata, em placa de polipropileno de 24 cavidades de fundo chato com volume final de 1000 L por cavidade contendo 1 x 10 6 células viáveis. Foram adicionados os estímulos: meio RPMI completo, Concanavalina-A (5 g/mL de meio RPMI completo) ou os alcaloides W ou MW (0,1 e 1 M) com ou sem ConcanavalinaA. As concentrações foram escolhidas a partir de estudos prévios (VIEIRA et al., 2013). As culturas celulares foram incubadas por 48h em estufa com atmosfera úmida a 37 C e 5 % CO 2 (PIUVEZAM et al., 1999). Os sobrenadantes das culturas (100 l) foram coletados em 12 e 48 horas para a realização das dosagens das citocinas. 3.16. DOSAGENS DE CITOCINAS. As citocinas IL-12, IL-10, IL-13 e IFN- nos sobrenadantes das culturas de células dos linfonodos mesentéricos foram quantificadas pela técnica de 53 ELISA. As metodologias utilizadas para tais dosagens foram às recomendadas pelo fabricante dos kits (eBioscience). Para tal, as placas de ELISA com 96 poços receberam 50 μL de anticorpo de captura (para cada citocina específica) diluído em tampão de cobertura (Coating buffer). Em seguida foram seladas com plástico tipo parafilme e mantidas em repouso por 12 hs a 4 °C. Após este período, aspirou-se um volume de 50 μL de cada poço seguido das lavagens, que consistiram em adicionar cerca de 250 μL de tampão de lavagem (wash buffer-PBS Tween20 0,05 %) em cada poço e após aproximadamente 1 min a solução foi removida eliminando todo o conteúdo em um reservatório de descarte. As placas foram secas sobre papel absorvente para remoção completa de resíduos de tampão. Esse procedimento foi repetido por mais quatro vezes. A curva de concentração padrão de cada citocina foi adicionada a placa (50 μL/poço), em duplicata, em seguida adicionou-se as amostras provenientes da cultura celular nos poços previamente determinados (50 μL/poço). Repetindo -se o tempo de repouso (overnight) a 4 °C. Após o procedimento de lavagem adicionou-se 50 μL/poço de anticorpo de detecção devidamente diluído, em seguida selou-se as placas deixando-a em repouso, em temperatura ambiente, por 1 hora. Em seguida adicionou -se 100 μL/poço de avidina-HRP devidamente diluída, selou-se a placa e deixou-a em repouso a temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente adicionou -se 100 μL/poço de solução de substrato a cada poço, e incubou-se as placas à temperatura ambiente durante 15 minutos em local escuro. A reação enzimática foi parada pela adição de 50 μL/poço de solução de parada (H 2 SO4 1M), resultando em coloração amarela de intensidade proporcional a concentração da citocina dosada. As placas foram lidas em leitor de microplaca no comprimento de onda de 450 nm. Os dados de densidade ótica (D.O.) foram transformados para concentração de acordo com a curva de soluções padrão de cada citocina. 3.17. ANÁLISES ESTATÍSTICAS. Os resultados obtidos foram expressos em média erro padrão da média e analisados estatisticamente com auxílio do programa de computador (software) GraphPad Prisma versão 5.0. Os dados foram submetidos ao teste T student 54 quando o grupo tratado foi comparado somente ao CTR+ ou ANOVA seguido de pós-teste de Tukey quando todos os grupos foram comparados entre si. Os testes estatísticos foram escolhidos conforme a natureza dos dados obtidos e descritos nas legendas das figuras. 55 4. RESULTADOS 4.1. EFEITO DA WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA OU LIPOPOLISSACARÍDEO. O tratamento por via oral com a warifteina nas doses de 2,0 e 10,0 mg/kg 1 h antes do desafio com a carragenina (500 μg/pata) inibiu o edema de pata quando comparado ao grupo CTR+. O efeito foi mais pronunciado nos tempo de 6 e 24 horas, não havendo diferença estatística entre as concentrações do alcaloide warifteina (Gráfico 1A). O efeito observado com o alcaloide warifteina foi semelhante àquele observado com a droga padrão indometacina. Como esperado o grupo CTR- não apresentou edema de pata. Contudo, o alcaloide metil-warifteina apresentou efeito anti- edematogênico, com ambas as doses apenas no tempo de 3 h, e também observado em 24 h apenas na dose de 10 mg/kg (Gráfico 1B) demonstrando que a metil-warifteina é menos potente que a warifteina em modelo de edema induzido por carragenina. No edema de pata induzido por LPS (Gráfico 1C) os tratamento com warifteina ou metil-warifteina 2 mg/kg (W 2 e MW 2), uma hora antes do desafio, não reduziram o edema mensurado no tempo de 24 h após o desafio. 56 Gráfico 1. Efeito da warifteina e metil-warifteina na formação do edema de pata em camundongos Swiss desafiados com carragenina ou lipopolissacarideo (LPS). A Edema (mm x 10-3) 1500 1000 *** 500 *** 0 B * *** *** *** 0 1 2 3 4 *** *** 6 24 5 Tempo (h) 1500 Edema (mm x 10-3) ** * * CTRCTR+ indometacina 10 W2 W10 CTRCTR+ Indometacina 10 MW2 MW10 1000 * 500 * ** *** *** *** *** 0 0 1 2 3 *** 4 5 6 24 Tempo (h) C +++ 800 600 * 400 200 2 M W 2 W ex a D + TR C TR - 0 C Edema (mm x 10-3) 1000 57 Camundongos foram tratados com a warifteina (A) ou metil-warifteina (B) nas doses de 2mg/kg (W2, MW2) ou 10 mg/kg (W10, MW10), indometacina 10 mg/kg (indometacina 10), ou salina (CTR+) e após 1 h, receberam a injeção intraplantar de carragenina (500 μg/pata) (A e B) na pata direita e salina na pata esquerda. (C) Camundongos Swiss foram tratados com a warifteina ou metil warifteina na dose de 2 mg/kg (W2, MW2), Dexametasona 2 mg/kg (DEXA), ou salina (CTR+) e após 1 h, receberam a injeção intraplantar de LPS (25 μg/pata) na pata direita e salina na pata esquerda. O grupo controle negativo (CTR -) recebeu injeção de salina em ambas as patas. A formação do edema foi quantifica pela diferença entre a espessura da pata direita e esquerda nos tempos de 1, 2, 3, 4, 6 e 24 horas após a administração da carragenina (A e B) e 24 horas após a administração do LPS (C). Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,01 quando comparados ao grupo CTR+ e, +++ p< 0,001 comparados ao grupo CTR-, ANOVA “one-way” seguido do pós-teste de Tukey. 58 4.2. EFEITO DA WARIFTEINA E DA METIL-WARIFTEINA NO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR MEDIADORES DA INFLAMAÇÃO, HISTAMINA, PROSTAGLANDINA E2 (PGE2) OU BRADICININA. O tratamento com a warifteina, (2,0 e 10,0 mg/kg) 1 h antes da administração de histamina inibiu significantemente o edema de pata (Gráfico 2A) nos primeiros 30 min após a injeção da histamina, com redução de aproximadamente 25% do diâmetro da pata quando comparado ao grupo CTR+. Contudo, o mesmo não foi observado no tempo de 60 min. O tratamento com a metil-warifteina (2,0 e 10,0 mg/kg) 1 h antes da administração de histamina não inibiu o desenvolvimento do edema. O tratamento com a droga padrão prometazina (10,0 mg/kg) reduziu significantemente o edema de pata induzido pela histamina em 30 e 60 min com a porcentagem de inibição variando de 82 a 95 % respectivamente (Gráfico 2A). O gráfico 2C mostra que o tratamento oral com a warifteina na dose de 10 mg/kg administrada 1 h antes da inoculação da PGE2 inibiu significantemente o edema de pata nos tempos de 15 e 30 min reduzindo respectivamente em 36 e 28 % no diâmetro da pata em comparação ao CTR+. Resultado semelhante foi observado com a droga padrão indometacina. Entretanto, a dose de 2 mg/kg de warifteina inibiu o edema de pata apenas no tempo de 30 min. com a porcentagem de inibição em torno de 37 % em relação ao CTR+. O tratamento com metil-warifteina (2 e 10 mg/kg) não inibiu o edema induzido por PGE2 nos tempos avaliados (Gráfico 2D) confirmando os resultados observados no edema induzido por carragenina. No edema de pata induzido com a bradicinina os tratamentos com warifteina e metil-warifteina não demonstraram eficácia na inibição do edema nos tempos avaliados (Gráficos 2 E e F) apenas a indometacina, no tempo de 30min, reduziu o edema provocado por este mediador da inflamação comparado ao grupo CTR+. 59 Gráfico 2. Efeito da warifteina e da metil-warifteina na formação do edema de pata de camundongos Swiss desafiados com histamina, prostaglandina E2 e bradicinina. B 1600 CTR- 1600 1400 CTR+ 1400 1200 PROME 10 1000 W2 W 10 * 800 600 400 *** *** 200 Edema (mm x 10-3) Edema (mm x 10 -3) A 1200 1000 * 800 * 600 400 200 0 0 0 30 0 60 30 Tempo (min) Edema (mm x 10-3) 1800 * 1200 * 900 600 300 * D 1600 Edema (mm x 10-3) CTRCTR+ Indometacina 10 W2 W 10 2100 1500 60 Tempo (min) C CTRCTR+ Indometacina 10 MW2 MW10 1200 800 400 0 0 0 15 30 45 0 60 CTRCTR+ Indometacina 10 W2 W 10 1600 1400 1200 1000 * 600 400 * 200 30 45 60 0 F 1200 Edema (mm x 10 -3) E 800 15 Time (h) Tempo (min) Edema (mm x 10 -3) CTRCTR+ PROME 10 MW 2 MW 10 1000 * 800 600 400 200 * 0 0 15 Tempo (min) 30 0 15 30 Tempo (min) Camundongos foram tratados com a warifteina ou metil-warifteina nas doses de 2mg/kg (W2 ou MW2) ou 10 mg/kg (W10 ou MW10), indometacina 10 mg/kg (indometacina 10), ou salina (CTR+) e após 1 h, receberam injeções intraplantar de histamina (20μg) (A e B) PGE2 (5 nmol) (C e D) ou bradicinina (3 nmol) (E e F) na pata direita e salina na pata esquerda. O grupo controle negativo (CTR -) recebeu injeção de salina em ambas as patas. A formação do edema foi quantifica pela diferença entre a espessura da pata direita e esquerda de acordo como os tempos indicados nos gráficos. Os resultados são apresentados como média ± CTRCTR+ Indometacina 10 MW 2 MW 10 60 erro padrão da média. * p < 0,05; *** p < 0,001quando comparados ao grupo CTR+. ANOVA “one-way” seguido do pós-teste de Tukey. 61 4.3. EFEITO DA WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA PERMEABILIDADE VASCULAR INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO. O gráfico 3A apresenta os resultados do tratamento de camundongos com a warifteina (2 ou 10 mg/kg) no extravasamento de proteínas para o peritônio induzido por ácido acético. O tratamento reduziu significantemente, o extravasamento de proteínas plasmáticas para o peritônio quando comparada com o grupo de animais tratados com salina (CTR+). Esse efeito inibitório foi da ordem de 58 % para o grupo W (2mg/kg) e 62 % para o grupo W (10mg/kg). Comparando-se as doses mínimas testadas que apresentam efeito no edema induzido por carragenina pode-se observar que a metil-warifteina apresenta efeito mais significantemente pronunciado que a warifteina neste modelo (p<0,05) (Gráfico 3B). O grupo indometacina apresentou inibição na ordem de 80 %, não havendo diferença entre os grupos W (2mg/kg) e W (10mg/kg) (Gráfico 3A). Gráfico 3. Efeito da warifteina e metil-warifteina no extravasamento de líquido para o peritônio de camundongos Swiss desafiados com ácido acético. B 0.5 +++ 0.4 (48%) * * (86%) (95%) *** *** 0.3 0.2 0.1 M W 2 W 10 + et ac in a TR In do m C TR C 2 0.0 - Densidade ótica (620nm) A Camundongos Swiss foram tratados com a warifteina e metil-warifteina na dose de 2mg/kg (W2, MW2 ) (A e B) ou warifteina na dose de 10 mg/kg (W10) (A), indometacina 10 mg/kg (indometacina 10), ou salina (CTR+)1 h antes de uma injeção intraperitoneal de ácido acético (0,6% em salina). O efeito foi avaliado pelo extravasamento do corante azul de Evans, para a cavidade peritoneal dos camundongos, 1 hora após o desafio com ácido acético. Os resultados são 62 apresentados como média ± erro padrão da média (n=4-6). * p < 0,05 e ** p < 0,01; *** p < 0,001 quando comparados ao grupo CTR+, ++p<0,01; +++p<0,01 quando comparados ao grupo CTR-. ANOVA “one-way” seguido do teste de Tukey. 63 4.4. EFEITO DA WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA MIGRAÇÃO DE CÉLULAS INFLAMATÓRIAS INDUZIDA POR ZIMOSAN. A migração de células é essencial para a gênese e manutenção da inflamação, contudo os tratamentos com warifteina ou metil -warifteina (2 ou 10mg/kg) não inibiram a migração celular para o peritônio (Gráfico 4). A indometacina mostrou redução da migração de células totais apresentando níveis basais no peritônio semelhantes àqueles observados no grupo CTR -. Gráfico 4. Efeito da warifteina e metil-warifteina na migração de células da inflamação para o peritônio de camundongos Swiss desafiados com zimosan. Celulas/mL 105 4 3 ++ 2 *** 1 2 10 M W W M 10 W 2 W C TR et + ac in a 10 In do m C TR - 0 Camundongos Swiss foram tratados com a warifteina ou metil-warifteina nas doses de 2mg/kg (W2 ou MW2) ou 10 mg/kg (W10 ou MW10), indometacina 10 mg/kg (indometacina 10), ou salina (CTR+) 1 h antes de uma injeção intraperitoneal suspensão de zimosan (1mg/mL em salina). O efeito foi avaliado pela contagem total de leucócitos que migraram para a cavidade peritoneal dos camundongos, 4 horas após a administração de zimosan. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (n=4-6). *** p < 0,001quando comparados ao grupo CTR+ e ++ p < 0,01 quando comparados ao grupo CTR-, ANOVA “one-way” seguido do teste de Tukey. 64 4.5. EFEITO DO EXTRATO DE Cissampelos sympodilais (AFL) E DOS ALCALOIDES CORPORAL WARIFTEINA EM MODELO E METIL-WARIFTEINA EXPERIMENTAL DE NO PESO ALERGIA ALIMENTAR. Os tratamentos com o extrato das folhas de C. sympodialis (AFL) na dose de 200 mg/kg, warifteina (2 mg/kg) ou metil-warifteina (2 mg/kg) foram avaliados na inflamação intestinal causada por desafios com OVA em camundongos sensibilizados. No modelo experimental de alergia alimentar observou-se que o peso corporal médio dos animais dos grupos experimentais não diferiu entre si durante o primeiro dia do desafio com OVA (Gráfico 5A). No entanto, a partir do segundo até o último desafio (10 desafios) o grupo experimental tratado com a warifteina apresentou média de peso corporal significantemente maior (p<0,05) do que o grupo sensibilizado e tratado co m salina (CTR +) e dos demais grupos tratados com substâncias ou extrato (Gráfico 5A). O grupo de animais tratados com a metil-warifteina não teve a média de peso corporal afetada durante os desafios com OVA (Gráfico 5A). Contudo o grupo tratado com o extrato apresentou média de peso corporal inferior à média do grupo CTR+ do 4 o até o 7 o desafios antigênicos (Gráfico 5A). Comparando-se a percentagem de ganho de peso corporal entre os grupos de animais tratados durante os dez desafios com ovalbumina, obse rvou-se que apenas o grupo tratado com warifteina demonstrou aumento no peso em aproximadamente 80% relativo ao CTR+ (Gráfico 5B). Entretanto os demais grupos tratados não apresentaram melhoria no ganho de peso quando comparados com o grupo CTR+ (Gráfico 5B). 65 Gráfico 5. Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina no peso corporal durante os desafios com o alérgeno e no ganho de peso corporal em modelo experimental de alergia alimentar. A * 26 CTRCTR+ Pesos (g) 24 AFL 200 W2 MW 2 22 20 18 16 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Desafios 25 20 * 15 + 10 5 2, 0 0 W 2, M FL A W + TR C TR C 20 0 0 - % de Ganho de peso B Camundongos da linhagem BALB/C sensibilizados com ovalbumina (OVA) foram tratados com solução salina (CTR +), extrato da planta (AFL 200 mg/kg), warifteina (W 2mg/kg) ou metil-warifteina (MW 2mg/kg) durante os desafios com OVA. O controle negativo (CTR-) representa animas não-sensibilizados, tratados com solução salina e desafiados com OVA. A. Representa o peso corporal (g) durante os desafios com OVA (10 vezes). B. Representa percentual de ganho de peso (%) entre o primeiro e o décimo desafios. Os dados sã o representativos de 2 experimentos independentes (n=6-10). Os dados foram analisados por ANOVA seguido de pós-teste de Tukey e os resultados são expressos como a média ± SEM. +p<0,05 significantemente diferente ao controle negativo (CTR-), * p<0,05 significantemente diferente ao controle positivo (CTR+) e + p < 0,05 quando comparados ao grupo CTR-. 66 4.6. EFEITO DO TRATAMENTO COM AFL OU COM OS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA DIARREIA ALÉRGICA. A maioria (83,3%) dos animais do grupo CTR+ (sensibilizados com OVA e tratados com salina) desenvolveu diarreia aguda desde o primeiro desafio intragástrico com OVA, diferentemente dos animais do grupo CTR - (não sensibilizados e tratados com salina) (Gráfico 6A e B) demonstrando que o modelo empregado funcionou adequadamente. Os animais dos grupos tratados com os alcaloides não apresentaram diarreia no primeiro desafio com OVA. No entanto, estes tratamentos não foram eficazes em inibir o aparecimento da diarreia nos demais desafios com OVA, os resultados podem ser claramente observados pela demonstração dos escores da manifestação alérgica onde foi possível observar o efeito protetor dos tratamentos nos grupos W e MW (Gráfico 6B). Entretanto, o AFL não foi capaz de proteger os animais da manifestação alérgica causada pelos desafios com OVA (Gráfico 6A). Gráfico 6. Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na diarreia provocada pelos desafios com o alérgeno em modelo experimental alergia alimentar. A Escore CTRCTR+ AFL 200 3 * 2 * * * Escore B 4 3 ** 2 ** 1 1 CTRCTR+ W2 MW 2 4 ** ** 2 3 ** ** 0 0 0 1 2 3 4 5 6 Desafios 7 8 9 10 0 1 4 5 6 7 8 9 10 Desafios Camundongos da linhagem BALB/C sensibilizados com ovalbumina (OVA) foram tratados com solução salina (CTR +) ou extrato da planta (AFL 200 mg/kg) (A), warifteina (W 2mg/kg) ou metil-warifteina (MW 2mg/kg) (B) durante os desafios com OVA. O controle negativo (CTR-) representa animas não-sensibilizados, tratados com solução salina e desafiados com OVA. Os dados representam a ocorrência da diarreia durante os desafios com ovalbumina. Os dados são representativos de 2 experimentos independentes (n=6 -10). Os 67 resultados expressos em escore foram analisados pelo método de ANOVA seguido de pós-teste de Tukey. * p < 0,05; ** p<0,01;*** p<0,001 significantemente diferente ao controle positivo (CTR+). 68 4.7. EFEITO DO TRATAMENTO COM AFL OU COM OS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA PRODUÇÃO DE MUCO E INFILTRADO DE EOSINÓFILOS E MASTÓCITOS. O número de células presentesna inflamação alérgica tais como mastócitos e eosinófilos foram avaliados nos tecidos intestinais (jejuno), nos animais sensibilizados e desafiados (CTR+), tratados (W, MW ou AFL) ou não sensibilizados (CTR-). O gráfico 7A e figura 4 demonstram que houve aumento (p<0,001) de mastócitos no tecido intestinal nos animais sensibilizados, desafiados e não tratados quando comparados aos animais não sensibil izados e desafiados (CTR-). A W e a MW reduziram o número de mastócitos e eosinófilos (p<0,05, p<0,001 respectivamente) no intestino quando comparado ao CTR+ (Gráficos 7A e B, Figuras 4 e 5), entretanto, o AFL não foi capaz de inibir o aparecimento de mastócitos no intestino (Gráfico 7A) mas reduziu o número de eosinófilos no tecido (Gráfico 7 B). O AFL e a W apresentam efeito significantemente superior (p<0,05) em relação ao grupo WM quanto a diminuição do infiltrado de eosinofilos (Grafico 7B). A avaliação da área ocupada por células caliciformes, que representa a medida direta da quantidade de muco no tecido, tanto o AFL quanto os tratamentos com os alcaloides foram capazes de diminuir esse parâmetro da alergia (Gráfico 7C, Figura 6). 69 CTR+ CTR- AFL200 W2 A Mastócitos/campo 8 MW2 +++ 6 4 * * 2 2 2 W M FL A W 20 0 + TR C C TR - 0 Figura 4. Microfotografias dos jejunos (40x), corado com Azul de toluidina, dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar. Destaques com as setas vermelhas para os mastócitos. 70 CTR+ CTR- AFL200 W2 B Eosinófilo/campo 6 MW2 +++ 5 * 4 * *** 3 2 *** *** 1 2 W M 2 W A FL 20 0 + TR C C TR - 0 Figura 5. Microfotografias dos jejunos (40x), corados com Hematoxilina&Eosina., dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar. Destaques com as setas vermelhas para os eosinófilos. 71 W2 40000 +++ 30000 20000 * * ** 10000 Figura 6. Microfotografias dos jejunos (40x), corados com ácido periódico de Shiff, dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar. 2 W M 2 W FL A + TR C TR - 0 C MW2 m2 PAS/campo C 72 Gráfico 7. Camundongos da linhagem BALB/c sensibilizados com OVA foram tratados com solução salina (CTR +), extrato da planta (AFL 200 mg/kg), warifteina (W 2mg/kg) ou metil-warifteina (MW 2mg/kg). O controle negativo (CTR-) representa animas não-sensibilizados, tratados com solução salina e desafiados com OVA. Os dados representam o número de mastócitos (A) por campo de maior aumento do tecido jejunal (40x); o número de eosinófilos (B) por campo e a área ocupada por células caliciformes (C). Os dados são representativos de 2 experimentos independentes (n=4-6). Os dados expressos em número de foram analisados por pelo método de ANOVA seguido de pós-teste de Tukey. * p < 0,05; ** p<0,01;*** p<0,001 significantemente diferente ao controle positivo (CTR+) e +++ p<0,001 significantemente diferente ao controle negativo (CTR-). 73 4.8. EFEITO DO TRATAMENTO COM AFL OU COM OS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA PRODUÇÃO DE IgE. Após o período dos desafios alergênicos foi avaliada a capacidade do s tratamentos (W, MW ou AFL) em modular a produção de IgE-OVA específica no soro dos animais. Este parâmetro imunológico está diretamente relacionado à severidade da reação de hipersensibilidade do tipo anafilática. O ensaio de anafilaxia cutânea passiva (PCA) foi realizado para mensurar o título de IgEOVA específica. Como observado no gráfico 8 os tratamentos com o extrato da planta (AFL) e com os alcaloides (W e MW) foram significantemente efetivos em reduzir os níveis de IgE-OVA específica nesses animais (títulos de 1:288 52, 1:227 117, 1:268 78, 1:248 65, respectivamente) quando comparados ao do grupo CTR+ (titulo de 1:632 65). Gráfico 8. Efeito do AFL ou alcaloides warifteina e metil-warifteina na produção de IgE-OVA específica no modelo experimental de alergia alimentar. Título de IgE OVA-Específica 1024 512 ** 256 2 2 W M W FL A C TR + 20 0 128 Camundongos da linhagem BALB/c sensibilizados com ovalbumina (OVA) foram tratados com solução salina (CTR +), , extrato da planta (AFL 200 mg/kg), warifteina (W 2mg/kg) ou metil-warifteina (MW 2mg/kg) durante os desafios com OVA. O título de IgE-OVA específica foi mensurado pela técnica de anafilaxia cutânea passiva (PCA) e no eixo Y do gráfico estão as diluições dos soros (razão 2). Os dados são representativos de 3 experimentos independentes (n=6-10). Os dados foram analisados pelo método do Teste t Student e os resultados são expressos como a média ± SEM. ** p< 0,01; *** p<0,001 significantemente diferente ao controle positivo (CTR+). 74 4.9. EFEITO DO TRATAMENTO COM AFL OU COM OS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA PROPORÇÃO DE CÉLULAS T. O percentual de células CD4+ ou CD8+ foi avaliado por citometria, e como pode ser observado no gráfico 9 (A, B e C), o processo de sensibilização e desafios (grupo CTR+) reduziu, no MLN, o percentual de célula CD4+ (38,9%) e células CD8+ (13,3%) em comparação ao grupo CTR- (CD4+ 49,1%, e CD8+ 17,9%) (p<0,01) (Gráfico 9A). Os grupos de animais tratados com AFL, W2 ou MW2 apresentam aumento significante (p<0,01; 0,01 e 0,05 respectivamente) nos percentuais de células CD4+ (48,2%, 51,1% e 43,8% respectivamente) (Gráficos 9A e B), e os grupos tratados com AFL ou W2 apresentaram aumento (p<0,01) nos percentuais de células CD8+ (15,9% e 16,5% respectivamente) em comparação ao grupo CTR+ (Gráficos 9A e C). Na análise da subpopulação CD4+CD25+FoxP3+ observou-se que os processos de sensibilização e desafios não resultaram em difer ença na proporção dessas células entre o CTR- (9,8%) e o CTR+ (11,9%) (Gráficos 10 A, B e C). Ao analisar os tratamentos com AFL, W2 ou MW2 observou-se que esses induziram aumento na população de células CD4+CD25+FoxP3+ no MLN em comparação ao CTR+ (Gráficos 10 A, B e C). A proporção de células dupla marcada (CD25+FoxP3+) dentro da população total de células CD4+ nos MLNs nos grupos tratados com AFL, W e MW não se alterou quando comparados ao grupo CTR+ (Gráfico 10 B), contudo, vale salientar que, levando em consideração o aumento de as células CD4+ e analisando as células CD25+FoxP3+ nos MLNs dos animais tratados com AFL, W e MW (5,6%, 6,2% e 6,7% respectivamente) houve aumento significante (p<0,05) dessa população quando comparados ao CTR+(3,7%) (Gráfico 10 C). 75 Gráfico 9. Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na proporção de células T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico (MLN). A CTR- CTR+ 17.9 13.3 49.1 38.9 AFL 200 W2 MW2 15.9 16.5 9.9 48.2 51.1 43.8 CD4 C ** 50 ** * ** 40 30 20 *** ** * ** 15 10 2 W M 2 W FL 20 0 A C TR + TR 2 W M 2 A W + TR C TR C FL 20 0 5 - 20 25 C % of CD4+ cells 60 % de células CD8+ B A. Dotplot da medida por citometria de fluxo de células do linfonodos mesentéricos marcados para CD4+ e CD8+ e analisados por citometria de fluxo , representativo de um experimento. B. Percentagem de células CD4+ dos grupos CTR-, CTR+, AFL 200, W2, MW2. C. Percentagem de células CD8+. B e C, resultados representativos de dois experimentos independentes. Os dados foram analisados pelo método do Teste T Student os resultados expressos em média ± S.E.M. *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001 foram considerados significantes quando comparado ao grupo CTR+. 76 Gráfico 10. Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na proporção de células T CD25 e FoxP3 no linfonodo mesentérico (MLN). A CTR- CTR+ 11.8 9.8 AFL200 W2 12.4 MW2 12.4 14.6 FoxP3 C 20 % de células CD4+ CD25+ FoxP3+ no MLN 15 10 5 0 8 * ** 6 ** 4 2 2 M W 2 W + FL 20 0 A TR C TR - 2 W M W 2 + A FL 20 0 C TR C TR - 0 C % de células CD25+ FoxP3+ nas células CD4+ B A. Dotplot da medida por citometria de fluxo de células do linfonodos mesentéricos com anti-CD25 e FoxP3. B. Percentagem de células CD25+ e FoxP3+ dos grupos de animais CTR-, CTR+, AFL 200, W2, MW2. C. Percentagem de células CD25+ FoxP3+ CD4+ presentes no MLN. Resultados representativos de dois experimentos independentes. Os dados foram analisados pelo método do Teste T Student e os resultados expressos em média ± S.E.M. +p< 0.05, ++p< 0.01, +++p< 0.001foram considerados significantes quando comparado ao grupo CTR-.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 foram considerados significantes quando comparado ao grupo CTR +. 77 4.10. EFEITO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA NA PRODUÇÃO DE CITOCINAS. Estudos anteriores demonstram que o AFL apresenta afeito inibidor na produção de citocinas do perfil Th2 no lavado bronco alveolar no modelo experimental de alergia respiratória (BEZERRA-SANTOS, C. R., et al., 2006) e efeito estimulador de citocinas do perfil Th1. Portanto avaliamos o perfil de citocinas nos células do linfonodo mesentérico de animais provenientes do processo de sensibilização e desafio do modelo experimental de alergia alimentar na presença dos alcaloides warifteina ou metil-warifteina. Os gráficos 11 e 12 apresentam a quantificação de citocinas IL-12 (A), IL10 (B), IFN-γ (C) e IL-13 (D), onde se observa que a Concanavalina-A (Con-A 5 μg/mL) induziu a produção das quatro citocinas nas células de linfonodo mesentérico de animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina, enquanto que, em presença da W (0,1 e 1 μM) observou-se inibiu na produção de IL-12 e IL-10 induzidas por Con-A (Gráficos 11A e B), embora estas mesmas concentrações não apresentaram efeito na produção de IFN-γ ou IL-13 (Gráficos 11C e D) O gráfico 12 apresenta a quantificação das citocinas IL-12 (A), IL-10 (B), IFN-γ (C) e IL-13 (D) em presença da MW. A MW na concentração de 1μM inibiu a produção de IL-12 enquanto as concentrações de 0,1 e 1 μM inibiram a produção de IL-10 induzidas por Con-A (Gráficos 11 A e B). A inibição na produção de IL-12 se refletiu na inibição da produção de IFN-γ na concentração de 1μM de MW, embora não tenha apresentado efeito na produção de IL-13 (Gráficos 11C e D) 78 Gráfico 11. Efeito do alcaloide warifteina na produção de citocinas em células de linfonodo mesentérico de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina. A B 100 150 100 + 80 + [IL-10] pg/mL [IL-12] pg/mL + * 50 60 * 40 20 0 0 Meio Con-A Warifteina 0,1 M 1,0 M + - + - + + + + + + - + - + - + - + Meio Con-A Warifteina 0,1 M 1,0 M D 150 + - + - + + + + + + - + - + - + - + 200 + 100 + - 250 [IL-13] pg/mL [IFN-] pg/mL C + - 50 + 150 100 50 0 Meio Con-A Warifteina 0,1 M 1,0 M 0 + - + - + - + + + + + + - + - + - + - + Meio Con-A Warifteina 0,1 M 1,0 M + - + - + - + + + + + + - + - + - + - + As células mononucleares isoladas do linfonodo mesentérico (MLN) foram cultivadas na presença (ou ausência) de concanavalina-A (Con-A 5 g/mL) associada a diferentes concentrações da warifteina ou metil -warifteina ou apenas em meio de cultura RPMI completo por 12 horas para a IL-12 ou 48 horas para as demais. Os sobrenadantes foram coletados e a produção de citocinas foi analisada pelo método de ELISA. A. IL-12p70, B. IL-10, C. IFN-γ e D. IL-13 em pg/mL. Os dados foram analisados por ANOVA seguido por Tukey e os resultados são expressos como a média ± SEM de dois experimentos realizados de modo independente. +p<0,05 significantemente diferentes, em comparação com células não tratadas (meio) e *p<0,05 significantemente diferentes em comparação com células tratadas a Con-A. 79 Gráfico 12. Efeito do alcaloide metil-warifteina na produção de citocinas em células de linfonodo mesentérico de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina. 150 100 B 100 + 80 + [IL-10] pg/mL [IL-12] pg/mL A * 50 60 * 40 20 0 0 + Meio Con-A M-Warifteina 0,1 M 1,0 M - + - + + + + + + + - + - + - + + Meio Con-A M-Warifteina 0,1 M 1,0 M - D 150 + 100 * 50 + - + - + + + + + + + - + - + - + 250 [IL-13] pg/mL [IFN-] pg/mL C + - + 200 150 100 50 0 0 + Meio Con-A M-Warifteina 0,1 M 1,0 M - + - + - + + + + + + + - + - + - + + Meio Con-A M-Warifteina 0,1 M 1,0 M - + - + - + + + + + + + - + - + - + As células mononucleares isoladas do linfonodo mesentérico (MLN) foram cultivadas na presença (ou ausência) de concanavalina-A (Con-A 5g/ml) associada a diferentes concentrações da warifteina ou metil -warifteina ou apenas em meio de cultura RPMI completo por 12 horas para a IL-12 ou 48 horas para as demais. Os sobrenadantes foram coletados e a produção de citocinas foi analisada pelo método de ELISA. A. IL-12p70, B. IL-10, C. IFN-γ e D. IL-13 em pg/mL. Os dados foram analisados por ANOVA seguido por Tukey e os resultados são expressos como a média ± SEM de dois experimentos realizados de modo independente. +p<0,05 significantemente diferentes, em comparação com células não tratadas (meio) e *p<0,05 significantemente diferentes em comparação com células tratadas a Con-A. 80 5. DISCUSSÃO. O processo inflamatório, nos organismos vertebrados, compreende, no mínimo, dois processos antagônicos: a resolução do processo inflamatório no sítio inflamado e, portanto homeostasia ou a não resolução do processo e, portanto, destruição do tecido no sítio inflamado. No primeiro caso ocorre a denominada inflamação aguda que é um processo celular e molecular do sistema de defesa do organismo a uma agressão ao tecido que pode levar até sete dias, mas no final o tecido inflamado se recupera e no segundo caso ocorre a denominada inflamação crônica que também é um processo celular e molecular do sistema de defesa a uma agressão ao tecido, mas que não leva a recuperação e sim a permanência do processo com destruição do tecido (TOUSSIROT, 2012). Dentre os principais fármacos utilizados na clínica para os processos inflamatórios encontram-se os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) com aplicação ampla e os esteroidais com aplicações mais restritas devido aos graves efeitos adversos. Os AINEs, em sua maioria, agem inibindo a atividade da COX-1 e/ou COX-2, inibindo assim, a síntese de prostaglandinas (PG) e tromboxanos (TX) (BURIAN e GEISSLINGER, 2005). O ácido acetilsalicílico (AAS), extraído em 1828 das cascas do salgueiro (Salixalba) é o protótipo da classe e é capaz de acetilar irreversivelmente a COX (AMANN e PESKAR, 2002;VANE e BOTTING, 1998). Além do AAS, outros fármacos como o ibuprofeno, derivado do ácido propiônico e o piroxicam, são considerados anti-inflamatórios não-esteroidais. Todos estes derivados de ácidos competem com o acido araquidônico pelo local ativo da COX (WIDLANSKY, et al., 2003). Embora os AINEs sejam os medicamentos mais comumente usados nas doenças inflamatórias, causam sérios efeitos adversos no trato gastrointestinal, além de falência renal e asma. (VANE e BOTTING,1998). Os glicocorticoides, anti-inflamatórios esteroidais são mediadores antiinflamatórios endógenos potentes, liberados em minutos em resposta ao estresse e à lesão tecidual para controlar a severidade da resposta inflamatória. Fármacos glicocorticoides sintéticos agem da mesma forma que mediadores endógenos, através de receptores intracelulares (GR) ativados pelo complexo glicocorticoide-GR que migram para o núcleo e interagem com elementos responsivos aos glicocorticoides (GRE). Esta ligação leva à ativação ou à inibição da transcrição de genes alvo, modulando a resposta inflamatória de maneira efetiva e duradoura. (GILROY et al., 2004; WAGNER e ROTH, 2000). Apesar de sua eficácia em controlar quadros inflamatórios graves, a 81 aplicação clínica dos glicocorticoides deve ser cuidadosa e limitada a curtos períodos de tempo, uma vez que os efeitos colaterais destes, principalmente quando da utilização sistêmica, incluem a supressão da liberação do cortisol (principal glicocorticoide endógeno) pelas glândulas adrenais (SCHIMMER et al., 2003) e como efeitos adversos temos distúrbios cardiovascular, crises de psicose, câncer e osteoporose (POETKER e REH, 2010; STROHMAYER e KRAKOFF, 2011.). Levando em consideração que as drogas comumente utilizadas nos processos inflamatórios apresentam graves efeitos adversos e isto tem impulsionado a busca por novos fármacos, nosso grupo de pesquisa tem sistematicamente estudado extratos e compostos derivados de plantas no sentido de descobrir novos protótipos de moléculas com efeitos anti-inflamatórios. Nesse sentido a planta Cissampelos sympodialis (Menispermaceae), comumente utilizada na medicina popular para o tratamento de inflamações do trato respiratório e gastrointestinal, vem sendo estudada e o extrato hidroalcoólico das folhas e o alcaloide warifteina apresentaram efeitos antiinflamatórios e antialérgicos em modelos experimentais (BATISTA-LIMA et al 2001, BEZERRA-SANTOS et al. 2006 e 2012). Portanto, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito dos alcaloides warifteina e metil-warifteina nos modelos de inflamação aguda (induzidas por agentes flogisticos) bem como iniciar os estudos do extrato das folhas de Cissampelos sympodialis (Menispermaceae) e os alcaloides warifteina e metil-warifteina no modelo de inflamação crônica representada pela alergia alimentar (modelo de alergia alimentar induzida por ovalbumina). A inflamação aguda experimental pode ser obtida pela administração subcutânea de agentes flogísticos como a carragenina, o lipopolissacarideo (LPS), o zimosan ou ainda mediadores da inflamação como as PGs, a histamina ou a bradicininas em camundongos que provarão uma reação inflamatória localizada levando ao inchaço (edema) do local pelo imediato extravasamento de líquido e proteínas dos vasos e posterior migração de leucócitos para o tecido. Entretanto, cada modelo desses apresenta modos de ação diferenciados na indução de inflamação sendo, portanto, considerados eficazes na identificação de novos compostos com ação anti-inflamatória (POSADAS et al., 2004; NAIDU et al., 2010). A warifteina, administrada por via oral, induziu redução no edema de pata provocado por carragenina, um agente flogistico que causa edema mediado por 82 moléculas tais como PG, histaminas e bradicininas bem como pela produção local de citocinas tais como TNF-α, IL-1 e IL-6. Essa inibição pode ser devida a ação desse composto sobre os mediadores acima citados. Nessa perspectiva observamos que a warifteina inibiu o edema provocado pela PGE2 e histamina mas, não aquele provocado pela bradicinina. Lavich e col. (2003) demonstram que a inibição de um dos mediadores inflamatórios, quando esse se encontra em associação com os demais, pode resultar na inibição geral do evento inflamatório avaliado. Quanto à metilwarifteina, essa molécula quando administrada pela via oral, inibiu o edema causado pela carragenia apenas nas primeiras horas e não foi capaz de inibir os edemas provocados por PGE2, histamina ou bradicinima. Os efeitos edematogenicos ocasionados pelos mediadores tais como carragenina, PGE2, histamina ou bradicinina ocorrem por vias de sinalizações intracelulares. Por exemplo, os receptores de histamina e PGE2 presentes nas membranas citoplasmáticas de diversos tecidos são do tipo GPCR ligados a proteína Gαq/11 e Gαs respectivamente e que ativam a enzima fosfolipase C e adenililciclase (PAWEL KALINSKI., 2012; JONES, B. L. e KEARNS G. L., 2011), todavia os receptores de bradicinina denominados B1 e B2 são do tipo GPCR e estão ligados a proteína Gαi e Gαq repectivamente (BERTRAM C. M. et al., 2007). Portanto, a warifteina pode estar bloqueando a via de sinalização produzida pela proteína Gα sem, entretanto inibir a via de sinalização Gαi. No caso da indometacina, droga padrão utilizada, o efeito antiedematogenica está associado a inibição direta da enzima COX (YAMADA, T. et al., 1993). A metilação natural da warifteina parece não potencializar o efeito antiedematogenico da molécula, pois os dados mostraram que a metil-warifteina não foi capaz de inibir e/ou manter a inibição do edema induzido pelos diferentes agentes flogisticos. O edema está ligado ao extravasamento de líquidos e proteínas para o tecido, nos primeiros momentos da inflamação, logo após ocorre a migração, da luz do vaso, de células para o tecido inflamado. O ácido acético, quando administrado no peritônio de camundongos, provoca diretamente um aumento de íons H+ pelas células do endotélio, com consequente contração das células vasculares dependente da ativação de canais iônicos (YUAN, et al. 2012) e indiretamente a produção de PGE2 produzindo e extravasamento de plasma para o tecido inflamado (SCHUMACHER, et al. 2011). Os alcaloides testados reduziram a concentração de proteínas provavelmente pela redução 83 na ativação dos canais de Calcio e/ou de K+. Freitas e col (1996) e Assis e col (2013) demonstraram que a warifteina foi capaz de inibir a ativação desses canais iônicos. Portanto esses dados corroboram com os anteriormente publicados sugerindo que o alcaloide da planta C. sympodialis, warifteina, independente da metilação, interfere nos canais iônicos responsáveis pelo extravasamento de proteínas no modelo de peritonite induzida pelo acido acético. A migração, do interior dos vasos, de células para o tecido inflamado pode ser avaliada pelo modelo de peritonite induzido por zimosan, uma fração insolúvel da parede celular de leveduras que induz a desgranulação de mastócitos e ativação de macrófagos com liberação de quimiocinas, citocinas pro inflamatórias, PAF, PGE e NO (RIDGER et al. 1997). Os tratamentos com os alcaloides não reduziram o número de células no lavado peritoneal de camundongos desafiados com o zimosan indicando, portanto que esses alcaloides não interferiram na migração de monócitos e, portanto liberação de agentes quimiotáticos e mediadores da inflamação Já quanto a desgranulação de mastócitos o trabalho anterior de Costa e col (2008) demonstraram que a warifteina inibe a desgranulação de mastócitos sensibilizados com IgE-DNP-BSA e desafiados com DNP entretanto diminui a produção de NO de macrófagos. O edema induzido por lipoplissacarídeo (LPS) da parede de bactérias Gram negativa é um modelo experimental útil para identificar moléculas anti-inflamatórias associadas a regulação de citocinas pro inflamatórias (VAJJA et al. 2004) isto se deve ao fato de que o LPS liga aos receptores do tipo TOLL (TLR4) na membrana de células da inflamação que produzem e liberam citocinas tais como TNF-α, IL-1β, IL-6 e quimiocinas tais como CXCL1 e CCL2 (AKIRA e TAKEDA, 2004). O tratamento com os alcaloides de animais desafiados com LPS não apresentou efeito inibidor na formação do edema de pata, portanto não foram capazes de inibir as citocinas liberadas pelas células do tecido. Vieira e col (2013) demonstraram que a warifteina inibiu a fosforilação da JNK de macrófagos estimulados com LPS e, o mesmo não ocorreu com a metil-warifteina possivelmente inibindo a produção de citocinas proinflamatórias. Em adição, Rocha e col (2010) demonstraram que a warifteina inibiu também a fosforilação da ERK em linfócitos B estimulados com moléculas especificas tais como anti-IgM inibindo a produção de imunoglobulinas. Esses resultados demonstram claramente que a warifteina inibe a ativação das MAP cinases, portanto inibindo a produção de citocinas proinflamatórias. 84 No entanto no presente estudo, o alcaloide warifteina apresentou efeito antiinflamatório nos modelos de inflamação induzida por agentes flogísticos e seu efeito parece estar associado a receptores ligados a proteína Gα e consequentemente a inibição das MAP cinases. Entretanto, parece que a metilação da molécula não interfere no sentido de potencializar o efeito anti-inflamatório. Estudos deverão ser realizados para caracterizar os mecanismos de ação de ambos os alcaloides e identificar se a metilação natural da warifteina interfere ou não em vias diferentes de sinalizações celulares (REF). Investigamos também o efeito do extrato da planta (AFL) e seus dois alcaloides no modelo de alergia alimentar (inflamação crônica) devido à evidencias anteriores que demonstraram efeito antialérgico no modelo experimental de asma tanto para o extrato quanto para o alcaloide warifteina. Os estudos com a metil-warifteina foi realizado no sentido de entender se a metilação natural da warifteina seria ou não capaz de potencializar os possíveis efeitos da warifteina nesse modelo (REF). As alergias são condições patológicas que podem estar presentes em crianças e adultos predisponente sendo a alergia alimentar uma patologia crônica sem cura e de difícil controle. Alguns métodos de tratamento vêm sendo desenvolvidos na tentativa de amenizar os sintomas desta doença crônica e entre estes métodos está à indução de tolerância oral aos alérgenos (SICHERER e SAMPSON, 2009). Nos procedimentos para a indução de tolerância a um determinado alérgeno podem ocorrer acidentes que levam a consequências drásticas como reações de choque anafilático (KERZL et al., 2007). Para evitar essas reações utiliza-se a modulação do sistema imunológico do paciente com o uso de substâncias com propriedades antialérgicas como, por exemplo, o cromoglicato de sódio. Porém, alternativas terapêuticas devem ser investigadas com o objetivo de descobrir novas moléculas que ajam como adjuvantes nos tratamentos de tais condições crônicas assim como respaldar cientificamente o uso de produtos como as plantas medicinais que são utilizadas, pela população, no tratamento dos sintomas das alergias. Os grupos tratados com os alcaloides apresentaram inibição da diarreia apenas no processo inicial após o desafio com o alérgeno. Este efeito pode também estar associado à inibição da degranulação de mastócito, pois em trabalhos anteriores foi demonstrado que a warifteina reduziu a degranulação 85 mastocitária, inibiu a ação da histamina nos modelos experimentais de hiperalgesia e a coceira (scrathing behavior) (COSTA et al. 2008). Entretanto, o AFL não apresentou efeito inibitório no desenvolvimento da manifestação alérgica. Esse dado pode ser explicado devido ao fato que trabalhos anteriores demonstraram que extrato AFL inibiu a atividade da fosfodieterase IV (PDE IV) de músculo liso intestinal, com consequente aumento dos níveis de AMPc (THOMAS et al. 1997b) e Rocha e col (2010) também mostram o efeito do AFL sobre o aumento de AMPc em linfócitos B ativados. DURAN e col. (2010) demonstraram que o aumento nos níveis de AMPc no intestino está associado a um aumento da atividade dos canais de Cl-, cujo resultado é o aumento no influxo de Na+ e H 2 O para o trato intestinal que consequentemente aumenta a diarreia. Em associação ao efeito do AMPc, Stadnicki (2011) demonstrou que as cininas estão dentre os mediadores mais importantes para a ocorrência de diarreia, corroborando portanto com aqueles observados onde a warifteina que não foi capaz de inibir a ação desta substância (bradicinina) no modelo de edema de pata. No AFL é encontrado cerca de 0,95% de warifteina podem portanto explicar a baixa atividade antidiarreica do extrato no modelo de diarreia alérgica. No desenvolvimento normal dos camundongos observou-se ganho gradual de peso corporal nos 50 dias de experimento, entretanto observou-se inibição do ganho de peso durante os desafios alergênicos tornando esse parâ metro importante na alergia alimentar (DOURADO et al., 2011). Nesse estudo foi observado que os animais tratados com a warifteina apresentaram ganho de peso semelhante aos animais não sensibilizados, entretanto este efeito benéfico não foi observado nos animais que receberam AFL ou metil-warifteina. Almeida e col. (2005) demonstraram que a administração do extrato da planta (AFL) em ratas promoveu efeito anorexígeno, entretanto, dados conflitantes foram descritos por Bezerra-Santos e col. (2006) onde camundongos da linhagem BALB/c tratados com AFL por 40 dias não apresentaram alterações no ganho de peso. Considerando os dados da literatura e os obtidos nesse trabalho sugerem que estudos posteriores deverão ser realizados para esclarecer se a planta apresenta ou não efeito anorexígeno em camundongos BALB/c. Os desafios alergênicos foram realizados por 10 vezes, procedimento esse, que eleva os níveis de IgE-alérgeno especifica. Esta elevação de IgE está 86 diretamente associada com a gravidade da doença (MASUDA et al., 2010). Os tratamentos com o extrato e com os alcaloides promoveram redução nos níveis de IgE-OVA específica no modelo de alergia alimentar. Estes dados corroboram com aqueles apresentados por Bezerra-Santos e col (2006), Costa e col. (2008) e Cerqueira-Lima e col. (2010) onde, em diferentes modelos de alergias, observou se uma forte queda nos níveis séricos de IgE-alérgeno especifica. Alexandre-Moreira e col. (2003 a e b) e Rocha e col. (2010) estudando a ação do AFL e seu alcaloide em linfócitos B e as diferentes maneiras de modular essas células, demonstraram que o extrato e a warifteina inibiram as funções dessas células quanto a proliferação bem como a produção de imunoglobulinas. Este efeito parece ser devido a uma ação direta sobre a célula B em um mecanismo dependente do aumento de cAMP, no qual a warifteina inibe a fosforilação da ERK e reduziu os níveis de NFκ-B no núcleo (ROCHA, et al., 2010). A redução nos níveis de IgE representam um importante parâmetro nas alergias, contudo a ação da IgE depende da ligação cruzada ao mastócito e ao antígeno. Os mastócitos são essenciais parta o desenvolvimento e progressão das alergias, em especial da alergia alimentar. Brandt e col. (2003) e Forbes e col. (2008) demonstram que a inibição farmacológica de mastócitos, por substâncias como o cromoglicato, e em animais deficientes de c-Kit observou-se redução dos parâmetros da alergia alimentar, inclusive a reação do choque anafilático. Nesse estudo demonstramos que os alcaloides warifteina e metilwarifteina reduziram a quantidade de mastócitos no tecido intestinal o que pode ser responsável pela redução da manifestação alérgica. O AFL, fonte dos alcaloides, não apresentou o mesmo efeito possivelmente pela presença de outros compostos com estruturas químicas diversas que podem inibir ou interferir na ação da warifteina e/ou metil-warifteina. Portanto, se faz necessário mais estudos sobre o conteúdo do AFL e verificar a possibilidade da presença de substancias que hajam de forma antagônica. Em associação aos mastócitos, os eosinófilos também estão relacionados com a gravidade nas inflamações alérgicas (BRANDT et al., 2003). Os tratamentos com os alcaloides e com o AFL reduziram o número dessas células no tecido jejunal. Bezerra-Santos e col. (2006) demonstraram, em modelo de asma, que tanto o AFL quanto o alcaloide warifteina, administrados por via oral, 87 reduziram a o número de eosinófilos e do agente quimiotático para essa célula a eotaxina nos pulmões bem como os corpúsculos lipídicos. Em adição, Vieira e col. (2012) demonstram a redução de eosinófilos nos pulmões pela administração intranasal tanto do extrato quanto dos alcaloides. Portanto os resultados da inibição no número dessas duas células, no trato intestinal, de animais alérgicos corroboram com aqueles anteriormente demonstrados. Nos sítios mucosos que sofrem reações alérgicas são observadas alterações nos constituintes epiteliais como o aumento de células caliciformes produtoras de muco (MEYLAN, RICHARD e SIEGEL, 2011; MCGUCKIN et al., 2011). Tanto o tratamento com AFL quanto com os alcaloides induziram redução do conteúdo de muco nas células caliciformes o que, associados aos outros efeitos observados, resultou na redução dos escores da diarreia alérgica. Os efeitos exercidos pelo extrato e pelos alcaloides isolados podem ser resultados da ação direta nos tecidos intestinais. Na tentativa de explorar possíveis efeitos imunoduladores da planta no modelo experimental de alergia alimentar, foi observado que os tratamentos com AFL ou warifteina promoveram a recuperação no número das células T CD4+ e T CD8+ aos níveis normais nos linfonodos mesentéricos. As células T CD8 + estão associadas a um perfil de proteção nas alergias devido a liberação de IFN -γ e inibição da sensibilização alérgica e progressão das alergias, independentemente dos mecanismos regulatórios de IL-10 (SRIVASTAVA et al., 2009; SUMIYOSHI et al., 2010; YAMADA et al., 2009). Nesse contexto, a metilação da warifteina não potencializou seu efeito inclusive, não recuperou a proporção de TCD8+ no linfonodo mesentérico. Linfócitos T CD4 + CD25 + Foxp3 + (Treg) são células importantes para o controle de uma grande variedade de patologias imuno mediadas incluindo as autoimunidades e alergias. As células Treg podem ser geradas na periferia a partir de células T naive após o contato com o antígeno por via oral ou a peptídeo ligado a uma célula dendrítica (ZHANG et al., 2001; KRETSCHMER, et al., 2005; SMIT, 2011). Os tratamentos com AFL e os alcaloides promoveram aumento no número de células Treg nos linfonodos mesentéricos o que pode resultar em efeitos positivos contra as alergias. Estudos deverão ser realizados para demonstrar tal hipótese. 88 Estudos demonstraram que a quantidade de 1,7 x 10 5 células Treg (CD4+ CD25+) transferidas de animais tolerantes a um alérgeno para outro animal foi capaz de conferir proteção contra alergia alimentar. Essa transferência de células resultou na inibição da expressão de IL-4 associada ao aumento nos níveis de IL10 e TGF-β classicamente associadas as funções regulatórias, sem alteração na expressão de IFNγ (YAMASHITA et al., 2011). Um dos mecanismos de regulação imune por células Treg é a secreção de IL-10 (HAWRYLOWICZ e O’GARRA, 2005). No entanto, neste estudo foi mostrado que os tratamentos in vitro com os alcaloides induziram inibição na secreção de IL-10 em células de linfonodo mesentérico. Esse resultado pode estar associado a inibição de macrófagos e não diretamente das células Treg. Outros mecanismos regulatórios incluindo a secreção de TGF-β (JOETHAM et al.. 2007), o aumento do número do receptor de membrana - proteína-4 associada ao linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) (TAI et al., 2012) e a privação de citocinas como a IL-2, devido ao aumento de CD25 (IL-2Rα) (THORNTON e SHEVACH, 1998) podem estar envolvidos na modulação realizada pelos produtos da planta. Diferentemente da metil-warifteina, a warifteina, presente nas culturas de células de linfonodo mesentérico induziu a produção da IL-12p70, contudo inibiu a ação estimuladora da Concanavalina-A. A IL-12 p70 é comumente encontrada nas respostas imunes inatas e produzida por células apresentadoras de antígenos (APCs) tais como macrófagos e células dendríticas e, normalmente está associada com o desenvolvimento de resposta imune do perfil Th1. As citocinas produzidas pelas células Th1 regulam as células Th2 responsáveis pelo desenvolvimento das alergias. Lee, S. Y. e col (2001) e Hino e col (2005) demonstraram que a administração exógena da IL-12 está associada com a proteção no desenvolvimento de alergia alimentar. Portanto sugerimos que a warifteina (não metilada) está agindo como agonista parcial dos receptores da Con -A responsáveis pelo estímulo da IL-12 e na presença de ambas as moléculas ocorre somente o antagonismo não-competitivo, pois o antagonismo químico parece estar descartado, devido a secreção de IFN-γ e IL-13 induzida pela Con-A mesmo na presença do alcaloide. A IL-13 é uma das citocinas relevantes na alergia alimentar, com funções de auxiliar a troca de isotipo de imunoglobulina e o aumento da secreção de muco pelas células da mucosa (WYNN, 2001). A sua ausência em camundongos 89 causa uma redução na diarreia alérgica e nos níveis de IgE (BRANDT et al.; 2009). Os tratamentos das células do linfonodo mesentérico, de animais com alergia alimentar, com warifteina ou metil-warifteina não alterou a secreção de IL-13 induzida por Con-A. Esses resultados sugerem que os dois alcaloides da planta C. sympodialis estejam, neste modelo experimental, modulando as células dendriticas e/ou macrófagos independente das células do mecanismo adaptativo. Costa e col. (2008) demonstram que o pré-tratamento com warifteina antes das sensibilizações com ovlabumina (OVA) inibiu o desenvolvimento do edema induzido pelo antígeno e a produção de IgE-OVA-específica sugerindo interferência da molécula na apresentação antigênica por APCs. Em trabalhos anteriores foram descritos que a warifteina induziu a produção de AMPc e diminuiu a atividade da fosfodiesterase (PDE) (THOMAS et al 1997b; ROCHA et al, 2010). Giordano e col. (2003) demonstrou que o AMPc inibe a maturação de células dendríticas com diminuição na secreção de IL-12p70 induzida por LPS. Portanto sugerimos que a warifteina, nesse modelo, esteja atuando nas células dendríticas aumentando o AMPc intracelular com diminuição na produção de IL-12 interferido portanto na apresentação antigênica. Estudos posteriores deverão ser conduzidos para comprovar tal hipótese. Recentemente foi patenteada a primeira formulação farmacêutica composta de nove diferentes extratos de plantas denominada de FAHF-2R (food allergic herbal formule) com efeito protetor na alergia alimentar em humanos sendo um dos mecanismos de ação é dependente do desenvolvimento de resposta Th1 com secreção de IFN-γ (SRIVASTAVA, K. D. et al., 2009). Portanto os resultados apresentados nesse trabalho fornecem subsídios para que o extrato da planta Cissampelos sympodialis, com seus alcaloides, possa ser utilizado em uma formulação farmacêutica para tratar, como terapia adjuvante, doenças inflamatórias e alérgicas do trato gastrointestinal. 90 6. CONCLUSÕES Frente aos resultados obtidos nesse estudo concluímos que a wa rifteina, o alcaloide bisbenzilisoquinolinico majoritário, presente no extrato da planta Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) possui efeito anti-inflamatório com inibição da ação da prostaglandina E2 e histamina independentemente de cinina (bradicinina). A metilação natural da molécula não potencializou seu efeito, entretanto, a metil-warifteina apresentou efeito significantemente mais pronunciado na inibição da permeabilidade vascular quando comparado com a molécula não metilada warifteina. Não desenvolveu efeito inibitório da migração celular. No modelo de alergia alimentar os dois alcaloides warifteina e metil warifteina foram eficazes em reduzir a diarreia alérgica com diminuição sérica da IgE-alergeno especifica. Os dois alcaloides também foram responsáveis pela redução no número de mastócitos e eosinófilos no intestino delgado bem como a redução do muco. Quanto aos mecanismos imunomoduladores dos alcaloides, ambos induziram o aumento no número de células T reg no linfonodo mesentérico de animais sensibilizados com diminuição de citocinas oriundas de células do mecanismo imune inato independente das do mecanismo imune adaptativo. 91 7. REFERÊNCIAS AGGARWAL, B. B. et al. Inflammation and cancer: how hot is the link? Biochemical pharmacology, v. 72, n. 11, p. 1605-1621, 2006. AKIRA, S.; TAKEDA, K. Toll-like receptor signalling. Nature reviews. Immunology, v. 4, n. 7, p. 499-511, 2004. AKIYAMA, H. et al. Dietary unripe apple polyphenol inhibits the development of food allergies in murine models. FEBS Letters, v. 579, p. 4485–4491, 2005. ALEXANDRE-MOREIRA, M. S. et al. Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) leaf extract induces interleukin-10-dependent inhibition of Trypanosoma cruzi killing by macrophages. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 36. p. 199-205, 2003a. ALEXANDRE-MOREIRA, M. S.; PIUVEZAM, M. 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