ESTUDO DE MIOSINA-V E CaMKII NO CÉREBRO DA ABELHA Apis

ESTUDO DE MIOSINA-V E CaMKII NO CÉREBRO DA ABELHA Apis mellifera:
COMPARAÇÃO ENTRE ZANGÃO, RAINHA E OPERÁRIAS
CLAUDIA TAVARES DOS SANTOS1, LUCIANA KAREN CALÁBRIA1, FOUED
SALMEN ESPINDOLA1, MILTON VIEIRA COELHO 1
RESUMO
As abelhas são himenópteros sociais e vivem em colônias permanentes com
indivíduos divididos em três castas: rainha, zangão e operárias. A miosina-V é um motor
molecular que realiza importantes processos celulares. A CaMKII é conhecida por ser central
na coordenação e execução de transdução de sinal mediado por cálcio. O presente trabalho
visou analisar a expressão de miosina-V e CaMKII no cérebro das abelhas rainha, zangão e
operárias Apis mellifera, visando um estudo comparativo dos polipeptídios no cérebro desses
indivíduos além de correlacionar esses dados com a morfologia e a localização de zinco.
Ensaios bioquímicos foram realizados com homogeneizado dos cérebros das abelhas Apis
mellifera por Western blot e eletroforese, e análises histológicas por H.E., impregnação
metálica, Nissl e histoquímica. Os resultados mostram a diferença de expressão de miosina-V
e CaMKII no cérebro das abelhas, sua localização coincidente com processos sinápticos e a
relação entre determinados polipeptídios com as castas e comportamento. Nossos dados
também mostram as diferenças morfológicas relacionadas à casta e comportamento e apontam
a utilização de técnicas histológicas e histoquímica como importantes ferramentas em estudos
comparativos.
Palavras chave: cérebro, abelha, miosina-V, CaMKII.
ABSTRACT
STUDY OF MIOSIN-V AND CAMKII IN THE BRAIN OF HONEYBEE Apis
mellifera : COMPARISON BETWEEN DRONE, QUEEN AND WORKERS
Honeybees are social hymenoptera living in permanent colonies with individuals
divided into three castes: queen, drone and workers. The myosin-V is a molecular motor that
plays important cellular processes. The CaMKII is known to be central in the coordenation
1
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Av. Pará 1720, Bloco 2E, sala 39,
Uberlândia, Minas Gerais, CEP 38405-925. [email protected]
and execution of signal transduction. The present study aimed to analyze the expression of
myosin-V and CaMKII in the honeybee brain of queen, drone and workers Apis mellifera,
looking for a comparative study of the polypeptides in the brain correlating those data with
the morphology and the location of zinc. Biochemical assays were performed with honeybee
Apis mellifera homogenized brains by Western blot and electrophoresis, and the histological
analyses by H.E., metallic impregnation, Nissl and histochemistry. The results shows the
different patterns of expression of myosin-V and CaMKII in the honeybee brain, the
correspondent localization with synaptic processes and the relation between some
polypeptides with castes and behavior. Our data also shows the morphological differences
related to caste and behavior and histological techniques and histochemistry like important
tools in comparative studies.
Key words: brain, honeybee, myosin-V, CaMKII
As operárias podem ser divididas
INTRODUÇÃO
conforme a função exercida dentro da
A abelha Apis mellifera é um inseto
social e sua colônia é composta de uma
rainha, zangões e operárias (Winston,
1979). Delas são extraídos o mel, a cera, a
geléia real, a própolis e outros subprodutos
(Camargo e Stort, 1973).
Na colônia, a rainha tem a função
de pôr ovos, através de um ferrão
modificado em ovopositor e produzir uma
substância que inibe a reprodução das
operárias, o feromônio (Winston, 1987).
Com relação ao zangão, sabe-se
que possui a única função de fecundar a
rainha. Para isso, exibe intensa adaptação
comportamental e morfológica (Michener,
1944). Além disso, não participa da divisão
de trabalho da colônia (Giray e Robinson,
1996).
colônia. Nos primeiros dias de vida, só
executam serviços de faxina e, quando as
glândulas que produzem geléia real já
estão
desenvolvidas,
nutrizes
trabalham
(operárias
alimentando
as
como
nutridoras),
larvas.
Quando
desenvolvem as glândulas de veneno e do
cheiro, as operárias exercem funções de
guarda,
sinalização
e
forrageamento
(operárias campeiras) (Winston, 1987). Em
paralelo com essa mudança de papel
dependente
da
idade,
mudanças
fisiológicas ocorrem em certos órgãos das
operárias (Winston, 1987).
As abelhas garantiram seu sucesso
adaptativo por possuírem um sistema
sensorial eficiente, baseado em um sistema
nervoso composto por cérebro e cordão
nervoso ventral (Oleskevick e Clements,
estrutura corresponde ao bulbo olfatório
1997). Seu cérebro é dividido em três
em vertebrados (Lancet, 1986).
regiões:
protocérebro,
deutocérebro
e
tritocérebro (Snodgrass, 1956).
No
protocérebro
estruturas
bilaterais
e
O método histoquímico para metais
pesados, descrito inicialmente por Timm,
localizam-se
especializadas
em 1958 (Danscher, 1984), tem sido
extensivamente
utilizado
para
a
denominadas mushroom bodies, corpora
visualização de metais de transição e
pedunculata ou corpos de cogumelo. Elas
metais do grupo IIb, em secções de tecido
recebem informações de diferentes áreas
(Danscher, et al., 1987; Santos, 1999).
do cérebro, como do lobo antenal e do lobo
O
processo
se
baseia
na
óptico, e são estruturas essenciais para a
transformação dos metais, presentes no
associação e integração das informações
tecido, em sulfetos de metais, utilizando-se
recebidas. Os corpos de cogumelo são os
uma solução de sulfeto de sódio. O sulfeto
supostos sítios de armazenamento de
reage com os metais presentes no tecido e
memória nos cérebros de insetos (Hammer
se depositam sob a forma de sulfetos de
e Menzel 1995) sendo comparados ao
metais nas regiões de origem (Zimmer,
hipocampo de vertebrados (Oleskevich et
1974). Como a prata se deposita nos locais
al, 1997).
onde estão presentes os sulfetos, é muito
O lobo óptico das abelhas é uma
provável que a visualização da prata
massa de fibras e células nervosas,
corresponda aos locais do tecido onde os
presentes em três gânglios sinápticos
metais pesados podem ser encontrados
internos: lâmina, medula e lóbula, nos
(Danscher, 1981).
quais
existem
receptores
sinápticos
O método Neo-Timm (Mello et
específicos para as projeções de axônios
al.,1993) é uma modificação do tradicional
enviados de fotorreceptores da retina
método de Timm (1958) a fim de aumentar
(Nässel et al., 1986).
a especificidade da marcação de zinco e
No lobo antenal estão presentes 156
glomérulos,
considerados
regiões
de
sinapses (Nässel, 1986), envoltos por
promover,
desta
forma,
uma
melhor
visualização do sistema de fibras musgosas
em vertebrados (Babb et al., 1991).
corpos celulares que possuem projeções de
As miosinas participam de vários
axônios vindas da antena mecanossensorial
eventos celulares, desde a contração
e de dendritos vindos dos neurônios
muscular; passando pelo transporte de
motores
vesículas,
(Kloppenburg,
1995).
Essa
organelas
e
RNAm;
até
ancoragem e estabilização de esteriocílios,
entre outros (Mermall et al., 1998).
Miosinas
da
classe
V
são
MATERIAL E MÉTODOS
motores
moleculares conservados evolutivamente,
Coleta de material biológico
sendo encontradas em plantas, leveduras,
Neste trabalho, utilizamos abelhas
nematóides e vertebrados, incluindo o ser
zangão e rainha Apis mellifera que foram
humano (Reck-Peterson et al., 2000).
fornecidas pela Universidade Estadual
A CaMKII é conhecida como uma
Paulista (UNESP) de Rio Claro e rainhas,
central de coordenação e execução de
zangões e operárias nutridoras e campeiras
transdução de sinais mediados por cálcio.
A. mellifera, fornecidas pelo Apiário
Os substratos fosforilados pela CaMKII
Girassol Ltda, de Uberlândia-MG.
estão implicados em importantes processos
celulares
e,
principalmente,
nas
Dissecação
modificações dependentes de sinapses das
Inicialmente, as abelhas foram
funções neuronais que estão por trás de
anestesiadas em gelo e, a seguir, fixadas
complexas
em placa de Petri contendo parafina, com o
respostas
cognitivas
e
comportamentais, incluindo aprendizagem
auxílio
e memória. A CaMKII compreende uma
Adicionou-se uma quantidade de tampão
família de enzimas com 28 isoformas
fosfato suficiente para cobrir o material,
similares que são derivadas de quatro
mantendo-o em condições fisiológicas e
genes (α, β, γ e δ), as subunidades α e β
facilitando o processo de remoção do
são as formas predominantes em cérebro
cérebro.
de
alfinetes
entomológicos.
A remoção foi feita com auxílio de
(Lisman et al., 2002).
Tendo em vista a importância da
material
adequado
(pinças
e
tesoura
abelha Apis mellifera, seu sistema nervoso,
oftalmológica). Os cérebros das abelhas
suas características sociais e a divisão de
foram dissecados no plano sagital mediano
trabalho, casta e sexo, neste trabalho nós
e imediatamente após a dissecação, o
buscamos caracterizar a presença de
material foi imerso em nitrogênio líquido e
miosina-V e CaMKII no cérebro das
armazenado em microtubos no ultrafreezer
abelhas
à -80°C ou imersos em solução fixadora.
rainha,
zangão
e
operárias
campeira e nutridora, correlacionando com
a
presença
de
zinco
nos
terminais
sinápticos e com a morfologia diferenciada
de regiões específicas do cérebro.
Estudo morfológico
Hematoxilina e Eosina (H.E.) e
vezes
por
30
segundos
cada.
P
osteriormente, as lâminas foram montadas
contagem de células
A fixação dos tecidos foi feita
com Entelan e lamínula.
segundo Mc Lean e Nakane (1974). Os
A contagem de células foi realizada
cérebros foram mantidos em solução
à partir da fotomicrografias do cérebro das
fixadora periodato-lisina-paraformaldeído
abelhas Apis mellifera corados com H.E.
contendo paraformaldeído 4% por 1 hora e
utilizando-se o programa HLImage. O teste
30 minutos. Posteriormente, os tecidos
Kolmogorov-Smirnov foi aplicado para
foram desidratados em álcool etílico
verificar se a amostra possuía distribuição
absoluto por 1 hora com três trocas a cada
normal. Para as amostras que apresentaram
20 minutos e 1 hora no xilol com duas
distribuição normal foi empregado o teste t
trocas de 30 minutos. A seguir foram
e para as amostras que apresentaram
emblocados
distribuição não-normal foi aplicado o
em
parafina
líquida
permanecendo em moldura até a secagem.
teste
Cortes de 8 µm foram montados em lâmina
estatisticamente os resultados utilizando-se
pré-tratada
o programa S-plus.
com
gelatina
0.2%
e,
Wilcoxon
para
se
comparar
posteriormente, desparafinizados em 3
banhos de xilol, o primeiro de 10 minutos,
Nissl (Klüver e Barrera, 1953)
o segundo de 5 minutos e o terceiro de 30
Os tecidos foram fixados em
segundos, e hidratados em concentrações
solução de Carnoy (álcool etílico 60%,
decrescentes de álcool etílico (3 banhos no
clorofórmio 30%, ácido acético glacial
álcool etílico absoluto, um banho no 95%,
10%) com sulfeto de sódio 1.2% por 1
um no 85% e um no 70%, 30 segundos
hora e 30 minutos. Posteriormente, os
cada), água corrente por 10 minutos e água
tecidos foram desidratados em álcool
destilada por 5 minutos. As secções foram
etílico absoluto por 1 hora com três trocas
imersas em Hematoxilina-Harris por 15
a cada 20 minutos e 1 hora no xilol com
minutos e lavadas em água corrente por 10
duas trocas de 30 minutos. Os tecidos
minutos e água destilada por 5 minuots.
foram emblocados em parafina líquida
Em seguida, os cortes foram imersos na
para serem cortados em micrótomo. Cortes
solução de Eosina por 12 segundos e
de 8 µm foram montados em lâminas
enxaguados rapidamente em água destilada
previamente
(aproximadamente 3 segundos). Os cortes
contendo gelatina 0.5% e bicromato de
passaram por uma bateria de álcool etílico
potássio
(70%, 85%, 95% e 3 vezes 100%) e xilol 3
incubadas em solução contendo violeta de
tratadas
0.05%.
As
com
secções
solução
foram
cresila, pH 3.9, por 40 minutos. Os cortes
dia. Seguiu-se a desidratação em álcool
foram lavados em água destilada por 1
(50%, 70%, 100%) por 5 minutos cada,
minuto e desidratados em álcool em
clareamento em xilol (5 minutos) e
concentrações
montagem das lâminas com Entelan e
crescentes
(50%,
70%,
100%), finalizando com incubação em
lamínula.
xilol por 5 minutos cada. Em seguida, as
lâminas foram montadas com Entelan e
Estudo histoquímico
lamínula.
Método histoquímico Neo-Timm
As lâminas foram previamente
Impregnação metálica (Behmer
tratadas com solução contendo 0,5%
et al., 1986)
Após a dissecação dos cérebros,
gelatina e 0,05% bicromato de potássio. Os
estes foram fixados em álcool absoluto
tecidos foram fixados em solução Carnoy
acrescido de amônia, mantendo-os em
(60% álcool etílico, 30% clorofórmio, 10%
imersão por 1 hora e 30 minutos. Em
ácido acético glacial) com 1.2% sulfeto de
seguida, os tecidos foram desidratados em
sódio
álcool etílico absoluto por 1 hora com três
desidratados em álcool etílico 100% por 1
trocas a cada 20 minutos e 1 hora no xilol
hora, imersos em xilol por 1 hora e
com
incluídos em parafina.
duas
trocas
Posteriormente,
os
de
30
minutos.
fragmentos
por
1
hora
e
30
minutos,
foram
Cortes de 8 µm foram incubados
imersos em parafina líquida à 56 0C por 30
em solução de desenvolvimento físico
minutos. A seguir foram colocados em
contendo 60% goma arábica, 10% tampão
formas plásticas contendo parafina líquida
citrato, 30% hidroquinona e 0.5% nitrato
onde permaneceram overnight. Secções de
de prata à temperatura ambiente. O tempo
8 µm foram colocadas em lâminas
de incubação foi de 2 horas. Em seguida,
previamente tratadas com cola 0.5%. As
os cortes foram lavados em água corrente
lâminas foram tratadas em solução de
por 10 minutos, desidratados em álcool
nitrato de prata 1.5% a 37°C no escuro por
etílico 50%, 70% e 100%, 5 minutos cada,
05 dias. Foram feitos controles negativos
imersos em xilol por 5 minutos e as
com a omissão do nitrato de prata. Em
lâminas foram montadas com Entelan e
seguida, as lâminas foram lavadas em água
lamínula.
corrente por duas horas. Os cortes foram
tratados
com
solução
contendo
hidroquinona 2% em formalina 5% por 01
Estudo bioquímico
Homogeneização do tecido
regressão linear baseados nos valores
Os microtubos contendo o cérebro
obtidos a partir da curva-padrão, obtida
do indivíduo foi retirado do ultrafreezer à -
utilizando-se
80°C e, imediatamente, colocados em
(Microsoft Office 97).
o
programa
EXCEL
nitrogênio líquido até o momento da
homogeneização. Os cérebros das abelhas
Eletroforese
em
gel
de
foram homogeneizados em gelo, em
poliacrilamida na presença de SDS
tampão de extração de miosina-V (Cheney
(SDS-PAGE)
et al., 1993) contendo 40 mM Hepes pH
O sistema de tampão descontínuo
7.7, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM
descrito por Laemmili e Favre (1973) foi
ATP, 2 mM DTT, 1 mM benzamidina, 0.1
utilizado,
M aprotinina e 0.1 mM PMSF, utilizando-
acrilamida de 5 a 22% e no empilhamento
se um homogeneizador potter-Elvehjen.
de 3%. Os géis de separação foram
com.
géis
gradiente
de
Para as amostras utilizadas no perfil
preparados com glicerol 0.7%, tampão de
protéico acrescentou-se um volume de 500
separação 360 mM pH 6.8 (Tris-base
µL de tampão de homogeneização em cada
45.38%, 6N HCl 10%), SDS 10%,
microtubo e homogeneizou-se por dois
acrilamida/bisacrilamida
minutos, sendo duas séries de um minuto
devidas concentrações, TEMED 0.003% e
no gelo.
PSA 0.0128%. O gel de empilhamento foi
(30:0.8)
nas
preparado com tampão de empilhamento
Dosagem de proteína
124 mM pH 6.8 (Tris-base 15.32% e HCl
A concentração de proteína total de
12N
10%),
SDS
0.12%,
cada amostra foi determinada utilizando-se
acrilamida/bisacrilamida (30:1.6) a 3%,
como padrão a concentração protéica de
TEMED 0.006% e PSA 0.150%.
BSA (Bradford, 1976). As determinações
A eletroforese foi realizada com
foram feitas em duplicatas ou triplicatas e
tampão eletrodo (100mM Tris, 7.8mM
a
EDTA, 770mM glicina, SDS 3% pH 8.3) e
absorbância
medida
em
espectrofotômetro a 595 nm.
corrente constante de 45mA. Após a
Fez-se uma curva padrão de BSA
corrida, o gel foi corado em solução
(0.1 mg/mL) em concentrações crescentes
corante (Croomasie Brilhant Blue R
variando de 2 a 20 µg, A concentração
0.125%, metanol 50% e ácido acético 9%)
final de proteína total em µg/µL foi
por 1 hora e descorado em solução
determinada a partir de cálculos de
descorante (metanol 5% e ácido acético
9%). Os géis foram armazenados em água
quimioluminescência,
destilada.
protocolo ECL.
seguindo
o
Western blot (Towbin et al., 1979)
Imunohistoquímica
As amostras separadas por SDS-
Os cérebros das abelhas Apis
PAGE foram transferidas para membrana
mellifera
de de nitrocelulose 0.45 µm em corrente
fixadora periodato-lisina-paraformaldeído
constante de 100 mA por 2 horas,
contendo paraformaldeído 4% segundo o
utilizando-se tampão eletroblot (25 mM
protocolo de McLean e Nakane (1974) por
Tris-HCl
pH 8.3, 192 mM glicina e
1 hora e 30 minutos. Posteriormente, os
metanol 40%). Após a transferência, as
tecidos foram desidratados em álcool
membranas de nitrocelulose foram coradas
etílico absoluto por 1 hora com três trocas
com Ponceau
0.5% (Ponceau 0.2% em
a cada 20 minutos e 1 hora no xilol com
ácido tricloroacético 3%) por quinze
duas trocas de 30 minutos. A seguir, foram
minutos e descoradas com água destilada.
incubados em parafina líquida à 56°C na
foram
fixados
em
solução
estufa por 30 minutos e incluídos em
Imunodetecção
formas plásticas permanecendo overnight
As membranas de nitrocelulose
para secar.
foram bloqueadas com solução de bloqueio
Cortes de 5 µm de espessura foram
(leite desnatado 5% e PBS-T) por 4 horas à
colocados em lâminas previamente tratadas
temperatura ambiente. Em seguida, as
com gelatina 0.2%. As lâminas foram
membranas foram lavadas em PBS-T, 3
desparafinizadas e hidratadas com 1 banho
vezes de 5 minutos e incubadas com o
de xilol por 10 minutos e banhos em álcool
anticorpo primário anti-miosina-Va (sonda
etílico 100%, 70%, 50% por 5 minutos
para o domínio cabeça) e anti-α-CaMKII,
cada. Em seguida foram colocadas em
diluído em PBS-T a 0.2 µg/µL. Essa
água destilada por 5 minutos.
incubação foi feita overnight à temperatura
Após a hidratação, as secções
ambiente e sob agitação. As membranas
foram submetidas ao bloqueio com água
foram lavadas em PBS-T, 3 vezes de 5
oxigenada 4,5% em solução de tampão
minutos cada e incubadas com o anticorpo
fosfato pH 7.4, por 15 minutos à
secundário anti-coelho e anti-camundongo
temperatura ambiente e, em seguida
conjugado com peroxidase, diluído em
lavadas com água destilada. As lâminas
PBS-T por 4 horas. A reatividade dos
foram incubadas em couplin plástico com
anticorpos
10 mM tampão citrato pH 6.0 (10 mM
foi
detectada
por
ácido cítrico) e submetidos à recuperação
posteriormente,
antigênica
de
corrente por 10 minutos. As lâminas foram
aquecimento numa panela à vapor por 15
desidratadas em álcool etílico 50%, 70% e
minutos.
100% por 5 minutos cada e em xilol,
através
do
método
lavando-se
em
água
As secções foram incubadas com
também 5 minutos. As lâminas foram
tampão Tris-glicina por 30 minutos em
montadas com Entelan (Merck) e lamínula.
câmara úmida e à temperatura ambiente.
Em
seguida,
foram
bloqueadas
com
RESULTADOS
tampão B (20 mM fosfato de sódio, pH 7.4
contendo 0.4 M NaCl e Triton X-100
0.3%) acrescido de leite desnatado 5% por
Estudo morfológico do cérebro
das abelhas Apis mellifera por H.E.
4 horas. Após o bloqueio, as secções foram
A análise morfológica revelou o
incubadas com o anticorpo primário anti-
mesmo padrão de distribuição das regiões
miosina-Va (sonda para o domínio cabeça)
constituintes nos lobos ópticos, antenais e
e anti-α-CaMKII overnight, à temperatura
corpos de cogumelo no cérebro das abelhas
ambiente. Foram feitos controles negativos
rainha, zangão e operárias campeira e
com a omissão dos anticorpos primários,
nutridora (fig. 01).
permanecendo a solução bloqueio nos
corte.
As regiões constituintes do lobo
óptico
foram
mostradas
em
corte
As secções foram lavadas com
histológico (fig. 01 A, D, G, I). Os corpos
tampão B por 1 hora e, posteriormente, as
de neurônios monopolares, se localizaram
lâminas foram incubadas com anticorpo
na
secundário anti-coelho e anti-camundongo
compactada. Na medula e na lóbula, a
conjugados
distribuição dos neurônios, assim como na
com
peroxidase
por
45
lâmina
de
forma
lâmina,
câmara úmida. Após a incubação, as
ordenada. No zangão e rainha, nota-se
secções foram lavadas com tampão B por 1
maior número de omatídeos na retina, em
hora.
comparação com as operárias.
utilizando-se
o
Kit
DAB
(Sigma
homogênea
e
minutos à temperatura ambiente e em
A revelação da peroxidase foi feita
encontrou-se
ordenada
e
Nos corpos de cogumelo (fig. 01 B,
E, H, K) foi possível distinguir as células
Chemical). A reação foi interrompida com
Kenyon
compactadas
água após 12 minutos. Os cortes foram
compactadas
contra-corados com Hematoxilina Harris
Além dessas, as regiões do cálice (lábio,
por, aproximadamente, 3 segundos e,
colar e basal) e o pedúnculo também foram
e
internas,
compactadas
não
externas.
identificados. Nos lobos antenais (fig. 01
internas
C, F, I, L), foi possível distinguir os
bem mais numerosas na rainha (Fig. 02 B)
interneurônios
e nutridora (fig. 02 H) do que nas operárias
glomerulares
e
os
glomérulos.
apresentaram-se,
visualmente,
(fig. 02 E), além das células Kenyon não
A contagem de células foi analisada
pelo programa S-plus empregando-se os
compactadas que se mostraram maiores e
mais arredondadas.
testes t e Wilcoxon. Foram analisadas a
Os
interneurônios
glomerulares
área, o perímetro e o número de células
foram observados no lobo antenal (fig. 02
dos lobos ópticos, antenais e corpos de
C, F, I)), envolvendo os glomérulos não
cogumelo. Devido ao pequeno número de
corados. Em operária campeira (fig. 02 F),
amostras não foi possível obter resultados
os interneurônios estavam mais dispersos e
significantes (p<0.05), somente a área do
degradados, comparado com nutridora (fig.
lobo óptico apresentou distribuição normal
02
(tabela 01).
interneurônios
I).
Na
rainha
(fig.
02
C)
os
apresentaram-se,
visualmente, mais abundantes, maiores e
Estudo morfológico do cérebro
mais globulares.
da abelha Apis mellifera por coloração
de Nissl
Estudo morfológico do cérebro
A análise por coloração de Nissl
mostrou o mesmo padrão de localização
das abelhas Apis mellifera por coloração
pela prata
dos corpos neuronais (corados em azul),
A análise histológica da secção
porém revelou diferenças no tamanho,
horizontal do cérebro de rainha, zangão e
quantidade e arranjo dos corpos de
operárias
neurônios nas abelhas rainha, zangão e
impregnados com prata (fig. 03), revelou
operárias campeira e nutridora (fig. 02).
componentes do tecido como os corpos de
Nos lobos ópticos (fig. 02 A, D, G)
campeira
evidenciando
lâmina, quiasma externo, medula, quiasma
neurofibrilas.
interno e lóbula, exceto em rainha, pois os
estavam
lesionados.
nutridora,
cogumelo, lobo óptico e lobo antenal,
observou-se a retina, camada fenestrada,
cortes
e
nas
neurópilas
as
Com essa metodologia foi possível
Pôde-se
visualizar as regiões do lobo óptico bem
observar que a retina da rainha apresentou-
definidas, como a retina, a lâmina, o
se mais espessa (fig. 02 A).
quiasma externo, a medula, o quiasma
Nos corpos de cogumelo (fig. 02 B,
E, H), as células Kenyon compactadas
interno
e
a
lóbula,
que
também
impregnaram-se diferencialmente (fig. 03
A, D, G). Na lâmina observaram-se os
A marcação pela técnica de Neo-
corpos neuronais monopolares localizados
Timm é mais forte nas regiões que
na camada fenestrada e outros corpos de
coincidem com as fibras dos neurônios,
neurônios em negro. A região do quiasma
podendo
externo revelou as neurofibrilas evidentes
comparado com as fotromicrografias de
que se condensam na medula e lóbula.
Nissl, onde há apenas a marcação dos
Apesar das estruturas analisadas
comparativamente
quando
corpos neuronais (fig. 05 A e B).
Nas regiões constituintes do lobo
diferença
óptico nota-se a localização do zinco nas
morfológica entre elas, em zangão (fig.
fibras longas das células da camada
03A) nota-se uma retina maior no lobo
fenestrada e a ausência de coloração dos
óptico, comparado com as operárias.
corpos celulares no quiasma externo no
que
não
as
evidenciado
castas
mostrarem
entre
ser
há
No corpo de cogumelo foi possível
lobo óptico em todas as abelhas. É possível
identificar as regiões do cálice (fig. 03 B,
visualizar
E, H). Na operária campeira (fig. 03E)
centrifugais presentes na medula.
a
impregnação
nas
fibras
observou-se a presença das células Kenyon
Os corpos de cogumelo mostraram
e fibras do cálice espaçadas comparando-
o mesmo padrão de distribuição de zinco
se com a mesma região na operária
no cálice (lábio, colar e basal) e no
nutridora (fig. 03 H) e zangão (fig. 03 B).
pedúnculo, e a sua ausência nas células
Nos lobos antenais foi possível visualizar
Kenyon (fig. 05 C). No lobo antenal, nota-
os glomérulos e nervo antenal nas abelhas
se a localização de zinco nos campos
rainha, campeira e nutridora (fig. 03 C, F,
terminais das fibras nos glomérulos (fig.
I).
05 D).
Não
se
obteve
lâminas
que
Estudo morfológico-funcional do
contivessem marcação nos lobos antenais e
cérebro das abelhas Apis mellifera por
corpos de cogumelo das abelhas rainha e
método histoquímico Neo-Timm
operárias campeira e nutridora.
Os dados histoquímicos mostraram
que o zinco está localizado nas fibras dos
lobos
ópticos
das
abelhas
rainha
e
operárias campeira e nutridora (fig. 04), e
Diferenças no perfil de proteínas
no cérebro das abelhas Apis mellifera
Através
da
análise
do
perfil
nos lobos óptico, antenais e corpos de
eletroforético
cogumelo do cérebro dos zangões (fig. 05)
cérebro
Apis mellifera e não nos corpos neuronais.
polipeptídios que migraram na mesma
do
homogeneizado
observou-se
a
presença
de
de
posição e outros que se expressaram
miosina-V nas amostras de cérebro das
diferencialmente quanto ao sexo (zangão e
abelhas operária campeira, tanto para o
rainha),
desenvolvimento
(pupa)
e
sobrenadante com 30 cérebros, quanto para
campeira
e
os homogeneizados de um cérebro de
nutridora) de A. mellifera, com a massa
campeira, rainha e zangão, em que a
molecular relativa (Mr) variando de 190 a
miosina-V está diferencialmente expressa.
14 kDa, aproximadamente.
Porém, para o homogeneizado de um
comportamento
(operárias
Na figura 06 A observa-se que os
polipeptídios de Mr 73, 45, 36, 28, 27, 18,
cérebro de operária nutridora a miosina-V
foi fracamente detectada.
17, 15 e 14 kDa estão presentes nas duas
castas. Algumas bandas se destacaram por
apresentarem grande concentração, com as
Mrs aproximando 36 a 30 kDa, estando
Detecção de CaMKII no cérebro
das abelhas Apis mellifera
Na análise de CaMKII (fig. 06 C)
mais evidente em zangão e nutridora, e a
observou-se
de 29 kDa mais expressa em zangão.
polipeptídio que migra com Mr de 60 kDa,
Os polipeptídios de Mr aproximada
73, 46, e 38 kDa estão expressos somente
em
pupa,
rainha
e
zangão,
a
marcação
de
um
aproximadamente, correspondente à sua
subunidade alfa.
Os
polipeptídios
de,
respectivamente. Já os polipeptídios de 28
aproximadamente, 49, 42.7, 25.5 e 23 kDa
e 18 kDa não foram detectados em pupa.
também foram detectados com o anticorpo
anti-α-CaMKII.
Detecção
de
miosina-V
no
Na
amostra
de
homogeneizado de 30 cérebros de abelha
operária campeira foram marcadas bandas
cérebro das abelhas Apis mellifera
A fim de determinar a presença de
de 60, 49, 25.5 e 23 kDa.
miosina-V no cérebro de abelhas rainha,
Indivíduos de operária campeira e
zangão e operárias campeira e nutridora
nutridora tiveram o mesmo padrão de
de
imunomarcação nos polipeptídios de 60,
homogeneizado do cérebro das castas e
49, 42.7, 25.5 e 23 kDa, porém, em
comportamento foram aplicadas em SDS-
campeira a marcação foi mais intensa; em
PAGE (fig. 06 A) e as amostras analisadas
indivíduos de rainha e zangão 49, 42.7,
em Western blot (fig. 06 B).
25.5 e 23 kDa; e em pupa, 25.5 e 23 kDa,
Apis
as
mellifera,
amostras
Por Western blot imunodetectou-se
um
polipeptídio
correspondente
de
a
Mr
cadeia
190
pesada
kDa,
da
podendo representar uma degradação da
subunidade de 60 kDa.
Imunolocalização de miosina-V
no cérebro das abelhas Apis mellifera
A
análise
anticorpo não se detectou nenhum tipo de
marcação.
imunohistoquímica
revelou a presença da miosina-V no
cérebro das abelhas A. mellifera rainha,
zangão, campeira e nutridora nos lobos
óptico, antenal e corpos de cogumelo.
Houve marcação em todas as
Imunolocalização de CaMKII no
cérebro das abelhas Apis mellifera
Na análise imunohistoquímica do
cérebro das abelhas utilizando-se anticorpo
anti-CaMKII
observou-se
a
regiões do lobo óptico como a retina, a
imunomarcação dos lobos ópticos, antenais
camada fenestrada, a lâmina, o quiasma
e corpos de cogumelo, para rainha, zangão
externo, a medula, o quiasma interno e a
e operárias.
lóbula (fig. 07). A camada fenestrada foi o
Os lobos ópticos (fig. 10) foram
local onde a marcação foi mais intensa em
marcados em todas as regiões, porém a
todos os indivíduos.
reatividade
foi
maior
na
camada
Os corpos de cogumelo (fig. 08)
fenestrada. Nos corpos de cogumelo (fig.
apresentaram a marcação da miosina-V
11) a reatividade foi mais intensa no cálice
mais fortemente na região do cálice e nas
e nas células Kenyon. Já nos lobos antenais
células Kenyon, já nos lobos antenais (fig.
(fig. 12) a marcação foi predominante nos
09) observou-se a reatividade de miosina-
glomérulos.
V nos glomérulos.
Os corpos de cogumelo de zangão e
lobos antenais de nutridora e zangão não
foram
fotografados,
pois
não
houve
marcação. No controle com a omissão do
FIGURAS
Figura 01: Fotomicrografias dos lobos ópticos, corpos de cogumelo e lobos antenais das abelhas rainha,
zangão e operárias campeira e nutridora Apis mellifera corados com H.E.
A-C: rainha; D-F: zangão; G-I: campeira; J-L: nutridora
A, D, G, J: lobos ópticos; B, E, H, K: corpos de cogumelo; C, F, I, L: lobos antenais
(lm) lâmina; (me) medula; (ck) células Kenyon; (cki) células Kenyon compactadas internas; (ckn) células
Kenyon não compactadas; (cke) células Kenyon compactadas externas; cx (cálice); (pe) pedúnculo; (in)
interneurônios; (gl) glomérulos.
(Bar=100µm)
Figura 02: Fotomicrografias dos lobos ópticos, corpos de cogumelo e lobos antenais das abelhas rainha,
campeira e nutridora Apis mellifera corados com Nissl.
A-C: rainha; D-F:campeira; G-I: nutridora
A, D, G: lobos ópticos; B, E, H: corpos de cogumelo; C, F, I: lobos antenais
(lm) lâmina; (me) medula; (qe) quiasma externo; (qi) quiasma interno (cki) células Kenyon compactadas
internas; (ckn) células Kenyon não compactadas; (pe) pedúnculo; (la) lábio; (co) colar; (ba) basal; (in)
interneurônios; (gl) glomérulos.
(Bar=100µm)
Figura 03: Fotomicrografias dos lobos ópticos, corpos de cogumelo e lobos antenais das abelhas Apis
mellifera corados com impregnação metálica.
A-C: zangão; D-F:campeira; G-H: nutridora; I: rainha
A, D, G: lobos ópticos; B, E, H: corpos de cogumelo; C, F, I: lobos antenais
(lm) lâmina; (me) medula; (qe) quiasma externo; (lo) lóbula; (ck) células Kenyon; (la) lábio; (co) colar; (ba)
basal; (in) interneurônios; (gl) glomérulos.
(Bar=100µm)
Figura 04: Fotomicrografias dos lobos ópticos das abelhas rainha, campeira e nutridora Apis mellifera
mostrando o mesmo padrão de marcação de zinco nas neurofibrilas.
(A,B) rainha; (C,D) campeira; (E,F) nutridora
(lm) lâmina; (cf) camada fenestrada; (qe) quiasma externo; (me) medula; (qi) quiasma interno, (lo) lóbula
(Bar= 100µm) A, B, C, E; (Bar=10 µm) D, F; (*) fibras
Figura 05: Fotomicrografias do lobo óptico, corpo de cogumelo e lobo antenal de zangão Apis mellifera
(A) lobo óptico mostrando a marcação de zinco nas neurofibrilas e, (B) coloração de Nissl mostrando os corpos
neuronais. (C) corpo de cogumelo com marcação de zinco no cálice e (D) lobo antenal evidenciando a marcação
de zinco nas neurofibrilas dos glomérulos.
(re) retina; (cf) camada fenestrada; (lm) lâmina; (qe) quiasma externo; (me) medula; (la) lábio; (co) colar; (ba)
basal; (gl) glomérulos
(Bar= 100µm)
Figura 06: Comparação do perfil eletroforético do cérebro das abelhas Apis mellifera e imunodetecção de
miosina-V e CaMKII
A: Perfil eletroforético (SDS-PAGE 5-16%) das amostras de homogeneizado de 30 cérebros (S1) de operária
campeira, um (C) indivíduo de operária campeira, operária nutridora (N), rainha (R), zangão (Z) e pupa (P) com
20µg por poço mostrando as bandas diferenciais e coincidentes.
B: Identificação de miosina-V em imunoblot de amostra de homogeneizado de cérebro da abelha Apis mellifera.
C: Western blot com imunodetecção de CaMKII de amostras de homogeneizado de cérebro.
Figura 07: Imunohistoquímica dos lobos ópticos do cérebro das abelhas Apis mellifera rainha(A), zangão
(B), campeira (C) e nutridora (D) mostrando a localização da miosina-V.
(re) retina; (cf) camada fenestrada; (qe) quiasma externo; (lm) lâmina; (me) medula; (qi) quiasma interno; (lo)
lóbula.
(Bar=100 µm)
Figura 08: Imunohistoquímica dos corpos de cogumelo do cérebro das abelhas Apis mellifera rainha (A),
campeira (C) e nutridora (D) mostrando a localização da miosina-V e controle (B) com a omissão de
anticorpo.
(ck) células Kenyon; (cx) cálice; (la) lábio; (co) colar; (ba) basal; (pe) pedúnculo
(Bar=100 µm)
Figura 09: Imunohistoquímica dos lobos antenais do cérebro das abelhas Apis mellifera rainha(A) e
campeira (B) mostrando a localização da miosina-V.
(Bar=100 µm)
Figura 10: Imunohistoquímica dos lobos ópticos do cérebro das abelhas Apis mellifera rainha(A), zangão
(C), campeira (E) e nutridora (G) mostrando a localização da CaMKII e os controles com a omissão do
anticorpo de rainha (B), zangão (D), campeira (F) e nutridora (H)
(Bar=100 µm)
Figura 11: Imunohistoquímica dos corpos de cogumelo do cérebro das abelhas Apis mellifera rainha(A),
zangão (C), campeira (E) e nutridora (G) mostrando a localização da CaMKII e os controles com a
omissão do anticorpo de rainha (B), zangão (D), campeira (F) e nutridora (H)
(Bar=100 µm) A, B, E,G, H; (Bar=30 µm) C, D, F.
Figura 12: Imunohistoquímica dos lobos antenais do cérebro das abelhas Apis mellifera rainha (A),
zangão (C) e campeira (E) mostrando a localização da CaMKII e os controles com a omissão do anticorpo
de rainha (B), zangão (D), campeira (F).
(Bar=100 µm)
Tabela 01:Média das áreas em µm dos lobo ópticos das abelhas Apis mellifera
Rainha
LO
Zangão
Campeira
Nutridora
15175.19a 10575.53b 14107.33a,b 13782.81a,b
variedade
DISCUSSÃO
de
tipos
de
neurônios,
a
coloração não possibilitou essa distinção.
Nos
Estudo morfológico das regiões
corpos
de
cogumelo
foi
do cérebro da abelha Apis mellifera por
possível distinguir as células Kenyon
H.E.
compactadas e não compactadas, além das
A análise morfológica das imagens
regiões do cálice (lábio, colar e basal) e o
revelou o mesmo padrão de localização
pedúnculo. As células Kenyon aparecem
dos corpos neuronais nos lobos ópticos,
preenchendo o corpo de cogumelo das
corpos de cogumelo e lobos antenais das
operárias campeira e nutridora num mesmo
abelhas rainha, zangão, operárias campeira
padrão. Porém, analisando a morfologia e
e nutridora. As regiões constituintes do
aspecto
lobo óptico no cérebro, para as abelhas
alterações podendo estar relacionadas com
rainha, zangão e operárias, revelaram os
o
corpos de neurônio monopolares, que se
mostrado por Cruz-Landim e Mello (1981)
localizam na lâmina de forma ordenada e
para a abelha Scaptotrigona postica, em
no quiasma externo, onde se observa um
que abelhas nutridoras apresentam células
aglomerado de células neuronais. Nässel e
maiores, e em abelhas campeiras o
colaboradores
tamanho das células diminui e passam a
(1986)
estudaram
a
organização dos neurônios laminares e
das
estágio
células,
e
observaram-se
envelhecimento,
como
apresentar sinais de degradação.
observaram que existem 10 tipos de
As diferenças entre os corpos de
neurônios que conectam a lâmina à
cogumelo entre rainha, zangão e operárias
medula, e apenas um tipo conecta aquela
devem estar relacionadas aos diferentes
região à lóbula. A medula é formada por
comportamentos e estímulos. Dados de
aproximadamente 60 tipos de neurônios,
Farris e colaboradores (2001) confirmam
em que neurônios colunares conectam a
que o aumento no volume das neurópilas
medula à lóbula e neurônios tangenciais
dos corpos de cogumelo têm determinantes
projetam-se para focos do lóbo óptico.
relacionados tanto com a idade quanto com
Apesar de ser constatado que existe uma
a experiência e comportamento.
Os lobos antenais apresentaram-se
A
impregnação
metálica
organizados em glomérulos circundados
diferenciada nos lobos ópticos evidenciou
por interneurônios e o nervo óptico. Esses
a composição das neurópilas: lâmina,
dados confirmam dados de microscopia
quiasma externo, medula, quiasma interno
realizados por Brandt e colaboradores
e lóbula no cérebro das abelhas. Esses
(2005).
dados coincidem com os já descritos por
A análise da área, do perímetro e do
Strausfeld e Nässel (1980) no cérebro de
número de células nos lobos ópticos,
Calliphora
antenais e corpos de cogumelo das abelhas
domestica utilizando impregnação com
Apis mellifera rainha, zangão e operárias
prata.
erythrocephala
e
Musca
campeira e nutridora não apresentou
Os prolongamentos de neurônios
diferenças estatísticas. Os resultados não
foram observados na região do cálice dos
apresentaram diferenças estatísticas, pois
corpos de cogumelo conforme a diferença
apresentaram p>0.05 devido ao número de
de coloração, comparada com a marcação
amostras ter sido insuficiente para que
dos corpos de neurônio, além de distinguir
pudéssemos aplicar o teste t, portanto,
as diferentes regiões do cálice. Utilizando
novas contagens deverão ser feitas para
impregnação metálica, outros estudiosos
que se possa avaliar com mais certeza a
mostraram a morfologia do cérebro da
relação entre área, perímetro e número de
abelha,
células nas regiões do cérebro das abelhas
exemplo, Coss e colaboradores (1980)
fazendo
realizando uma coloração rápida de Golgi
uma
comparação
entre
as
diferentes castas e comportamento.
em
diferentes
âmbitos.
Por
quantificaram a morfologia das espículas
dendríticas no cálice dos corpos de
Estudo morfológico no cérebro
cogumelo no cérebro de A. mellifera. Para
das abelhas Apis mellifera por coloração
o estudo do desenvolvimento dos dendritos
pela prata
das células Kenyon na região do colar dos
As características gerais observadas
no
cérebro
da
abelha
corpos
de
cogumelo,
Farris
e
mellifera
colaboradores (2001) também utilizaram o
utilizando a impregnação metálica, no que
protocolo de coloração de Golgi, com
se refere à constituição anatômica e
modificações.
Isso
morfológica,
impregnação
metálica
concordam
A.
com
as
indica
que
utilizada
a
neste
observações descritas para A. mellifera por
trabalho é eficiente no estudo morfológico
Snodgrass (1956).
do cérebro da abelha com relação à
distribuição de fibras e corpos de neurônio.
Portanto, usando a técnica de
impregnação metálica, proposta em 1903
somente foi possível a visualização dos
lobos ópticos.
por Cajal para estudos de degenaração e
regeneração
do
sistema
nervoso
A análise morfológica dos cortes
de
histológicos de cérebro de zangões Apis
vertebrado, sendo adaptada para o cérebro
mellifera revelou um mesmo padrão de
de inseto, foi possível visualizar os corpos
distribuição do zinco nos corpos de
neuronais e identificar as regiões onde se
cogumelo
localizam as neurofibrilas no cérebro da
observados para abelhas operárias por
abelha A. mellifera, sendo o primeiro relato
Calábria (2004).
e
nos
lobos
ópticos
já
usando essa técnica em abelhas zangão e
Os dados histoquímicos obtidos
operária nutridora, sendo que Calábria e
mostraram que não houve marcação nos
colaboradores
corpos neuronais. Esse resultado confirma
(2005)
utilizaram-a
em
operária campeira.
Além
técnicas
disso,
a validade do método no sistema nervoso
a
histológicas
utilização
de
abelha,
pois
em
vertebrados
a
H.E.
e
histoquímica Neo-Timm promove uma
possibilitou
a
melhor visualização de fibras musgosas
confirmação das diferenças morfológicas
(Babb et al., 1991), identificando a
relacionadas à casta e ao comportamento e
presença de traços metálicos em axônios
sugere a utilização dessa metodologia
glutamatérgicos, mas não em corpos
como importante ferramenta em estudos
celulares (Frederickson et al., 2000).
impregnação
básicas
das
metálica
comparativos.
A localização do zinco nas fibras
longas da camada fenestrada no lobo
Distribuição
dos
corpos
de
neurônios e zinco
óptico possibilitou a visualização das
fibras centrifugais na medula, sugerindo
A análise morfológica dos cérebros
que essa neurópila esteja relacionada com
revelou o mesmo padrão de localização
processos pré-sinapticos. Nässel et al.
dos corpos neuronais e de distribuição do
(1986) e Meyer et al. (1986) mostraram a
zinco nos lobos ópticos das abelhas rainha,
imunorreatividade dos neurônios da lâmina
zangão, operária campeira e operária
à serotonina, ao GABA e à catecolamina.
nutridora.
Nos corpos de cogumelo observou-
A coloração por Nissl foi útil na
se marcação de zinco no cálice e no
visualização da morfologia dos lobos
pedúnculo, mas não nos corpos das células
ópticos, antenais e corpos de cogumelo de
Kenyon. Isso é justificado pela transição
rainha, campeira e nutridora. Já em zangão
de impulsos que os cálices recebem vindos
do lobo antenal (olfatório) através do trato
É a primeira vez que a técnica Neo-
anteno-glomerular, e vindos da lóbula e da
timm é utilizada no cérebro de zangões
medula (visual) via o trato óptico (Moobs,
Apis mellifera. Esse estudo mostrou que
1982). Estudos mostram evidências de que
essa técnica é válida para a investigação da
os corpos de cogumelo equivalem ao
distribuição de zinco, que se sabe está
hipocampo dos vertebrados em relação à
envolvido em muitos processos catalíticos,
aprendizagem
estruturais e regulatórios, bem como no
espacial
(Capaldi
et
al.,1999), onde o zinco é especialmente
papel da neurotransmissão sináptica.
abundante (Zimmer, 1973).
As diferenças de marcação entre as
castas e comportamentos da abelha Apis
que
no cérebro das abelhas Apis mellifera
diferentes
A análise do perfil protéico do
graus de marcação desde uma coloração
cérebro da abelha permitiu a identificação
muito
de polipeptídios casta-, desenvolvimento- e
mellifera,
ocasionaram
Diferenças no perfil de proteínas
enegrecida,
passando
para
tonalidades de marrom, amarelo e até a
comportamento-
falta de marcação em um mesmo tempo,
abelhas rainha, zangão, pupa e operárias
pode ter sido um artefato ou conseqüência
campeira e nutridora, A. mellifera. Alguns
das diferentes concentrações de zinco em
polipeptídios
diferentes regiões do cérebro e também
coincidentes,
pelas
apresentaram-se
diferenças
fisiológicas
comportamentais
apresentaram
enquanto
que
as
Mr
outros
diferencialmente
expressos.
A
comparativo da distribuição de zinco no
diferentes
castas
cérebro de ratos neonatais (5 dias), jovem
diferença no perfil dos polipeptídios
(5
(48-73)
podem indicar que eles sejam sexo-
semanas mostra que o zinco está mais
específicos. Vários genes já identificados
expresso no cérebro do rato neonatal
em
(Sawashita et al., 1997). Para o estágio
diferenciação na expressão gênica, sendo
neonatal, o zinco está mais presente no
que sete locus caracterizando a evolução e
cerebelo, enquanto para o estágio adulto,
a função do grupo (Evans e Wheeler,
no telencéfalo, especialmente no sistema
1998).
e
cérebros.
para
Estudo
semanas)
desses
e
específicos
envelhecido
abelhas
heterogeneidade
são
e
a
ocorrência
responsáveis
nas
de
pela
límbico. Altas concentrações no sistema
Evans e Wheeler (2000) mostraram
límbico estão associadas com a função
a expressão diferencial de alguns genes
(emoção, memória e aprendizagem) (Scott
como, citocromo oxidase I (60 kDa),
et al.,1997).
dineína (12 kDa), hexamerina II (70 e 90
kDa) e ATP sintase (270 kDa), entre as
manutenção do organismo e dos estágios
castas.
como tal.
Kamikouchi
identificaram
et
al.
dois
(2004)
candidatos
Oliveira-Junior (1999) analisando a
proteínas/genes envolvidos em casta e/ou
expressão gênica na divisão de trabalho em
sexo
A.
específicos
olfatório
de
do
detectou
mellifera
fragmentos
diferencialmente
diferenciados de acordo com a idade e a
expressos em operária, rainha e zangão.
atividade da abelha na colônia, e outras
Com a conclusão do genoma observou-se
que se expressão independente da idade e
que
da experiência do indivíduo.
vários
abelhas,
processamento
genes
são
expressos
diferentemente entre as castas. A recente
conclusão do genoma da abelha mostrou
que, por exemplo, rainhas e campeira
apresentam
diferentes
padrões
Detecção
de
miosina-V
no
cérebro das abelhas Apis mellifera
de
Para investigar a expressão de
expressão do gene para oxidorredutases
miosina-V
(mais expressos em larvas de rainhas) e
policlonal gerado contra a cadeia pesada de
hidrolases (mais expressos em larvas de
miosina-V que reconhece um polipeptídio
operárias)
Genome
de 190 kDa (Espreáfico et al., 1992). Este
Sequencing Consortium, 2006). Takeuchi e
anticorpo foi produzido a partir de
colaboradores
a
proteínas recombinantes de um biblioteca
diferença na expressão de genes entre
de cDNA de cérebro de galinha que
castas e sexos. Nossos resultados também
contêm domínios específicos da miosina-
sugerem que existe essa diferença para
V. Estudos utilizando este anticorpo
polipeptídios.
mostram a expressão de miosina-V no
(The
Honeybee
(2003)
mostraram
utilizou-se
um
anticorpo
Em pupa, uma banda expressa de
cérebro de galinha (Espíndola et al., 2000);
Mr entre 53 e 45 kDa está bem expressa,
no gânglio da raiz dorsal de embrião de
indicando um espectro de polipeptídios.
galinha (Suter et al., 2000) e nas células
Setti e Boneti (2001) identificaram em
neuronais e gliais de cérebro de rato
Melipona scutelaris, nas fases de pupa de
(Espreáfico et al., 1992).
rainha e de operária, proteínas de Mr 10.1
e
67
kDa
grande
anticorpo citado foi útil na identificação da
concentração em todos os estágios do
miosina-V no homogeneizado de cérebro
desenvolvimento de pupa, caracterizando-
de operárias campeira e nutridora, como
as
também de rainha e zangão, sugerindo que
como
presentes
proteínas
em
Neste trabalho, verificamos que o
necessárias
à
os
epítopos
reconhecidos
por
este
anticorpo para miosina-V de vertebrado
associadas. Peixoto (2002) e Silva (2003)
estão conservados em himenópteros. Os
mostraram
dados apresentados concordam com os
bioquímicas, como solubilidade em ATP,
resultados de Coletto (1999) e de Passos-
co-sedimentação
Lima (2001) que identificaram no cérebro
imunopreciptação com NaCl e associação
de abelha Mellipona scutellaris e Apis
com
mellifera a miosina-V utilizando o mesmo
miosina-V de cérebro de galinha foram
anticorpo. Além disso, Colleto (1999)
também conservadas na abelha operária
mostrou que o anticorpo reconhece a
campeira A. mellifera.
que
as
propriedades
com
membranas
e
actina,
sinaptossoma,
da
miosina-V em homogeneizado do sistema
nervoso de M. scutellaris e Calábria (2004)
revelou a distribuição desta proteína em
cortes de cérebro de operária campeira A.
Detecção de CaMKII no cérebro
das abelhas Apis mellifera
Para o estudo da expressão da
proteína quinase II dependente de cálcio e
mellifera.
O resultado diferencial de miosina-
calmodulina (CaMKII) foi utilizado um
V no cérebro das abelhas indica que
anticorpo monoclonal gerado contra a
provavelmente este motor molecular se
subunidade α da CaMKII, que reconhece
expressa
comportamento
um polipeptídio de 60 kDa. Por sua
desempenhado na colônia, apesar de que,
participação em mecanismos básicos de
não foi investigado se a miosina-V seria
memória em vários organismos como
alvo
também na sua ação na fosforilação da
de
conforme
o
regulação diferencial
nessas
condições. No entanto, Calábria (2004)
miosina-V,
revelou a expressão não diferencial dessa
presença da CaMKII em frações de cérebro
proteína
de abelha A. mellifera.
entre
operárias
campeira
e
nutridora; e Passos-Lima (2001) mostrou
buscou-se
identificar
a
Em tecido nervoso de abelha,
padrão diferencial de expressão entre
Hartfelder
operária campeira e rainha.
identificaram
e
colaboradores
duas
(1991)
subunidades
da
É a primeira vez que a miosina-V é
CaMKII de 52 e 60 kDa. Apesar desses
mostrada expressa no cérebro de zangão.
dados o anticorpo dirigido contra a
Nesse trabalho, a identificação comparada
subunidade α da CaMKII reconheceu
entre as diferentes castas complementa
cinco polipeptídios diferentes em cérebro
estudos anteriores, e abre perspectivas para
de abelha. Esses dados podem indicar uma
estudos futuros de regulação utilizando
degradação da proteína ou de reação
este motor molecular e suas proteínas
cruzada com polipeptídios inespecíficos.
coincidam devido à sua relação de
Imunolocalização de miosina-V e
fosforilação e ativação.
A
CaMKII no cérebro das abelhas Apis
relação
localizações
mellifera
A
análise
imunohistoquímica
de
existente
entre
miosina-V,
as
CaMKII,
neurofibrila e zinco pode estar relacionada
mostrou a localização da miosina-V nos
aos
lobos ópticos, antenais e corpos de
envolvendo neurotransmissores como o
cogumelo, evidenciando, assim, sua ampla
glutamato,
distribuição no cérebro da abelha Apis
vertebrados.
sítios
de
assim
conexões
como
sinápticas
ocorre
em
mellifera.
No lobo óptico houve intensa
CONCLUSÕES
marcação de miosina-V na retina e nas
neurópilas, regiões onde se evidenciou
impregnação de prata, devido à presença
de células nervosas fotossensíveis, e
localização de zinco nas fibras longas das
células da retínula e nas fibras centrifugais
da medula, sugerindo que essa neurópila
esteja
relacionada
com
processos
mostraram-se importantes ferramentas para
a análise morfológica do cérebro, servindo
como base para o estudo dos resultados de
imunohistoquímica e histoquímica;
A coloração de Nissl possibilitou a
discriminação dos corpos neuronais e da
observação da sua morfologia, podendo ser
sinápticos.
A localização da CaMKII no
cérebro da abelha Apis mellifera também
foi ampla em todas as neurópilas. Assim
como na miosina-V, a CaMKII foi
imunodetectada
A coloração H.E. e a impregnação metálica
preferencialmente
nas
regiões de conexão sináptica. Dados de
Karcher e colaboradores (2001) mostraram
que a CaMKII regula a atividade da
miosina-V através de sua fosforilação no
seu domínio C-terminal, uma parte do
motor que está envolvida com o transporte
de vesículas em Xenopus. Acreditamos que
a localização de miosina-V e CaMKII
utilizada em associação com outros tipos
de colorações sob forma de contracoloração ou em estudos morfológicos
isolados, servindo como base para o estudo
dos resultados de histoquímica;
O perfil eletroforético das proteínas do
cérebro das abelhas rainha, zangão, pupa e
operárias
mellifera
campeira
e
mostrou
nutridora
Apis
polipeptídios
diferencialmente expressos dependendo da
casta e do comportamento da abelha;
A imunomarcação de miosina-V e CaMKII
por Western blot revelou que ambas
proteínas estão expressas no cérebro das
abelhas
rainha,
zangão
e
operárias
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