Iniciação Científica

Iniciação Científica CESUMAR
Jul./Dez. 2007, v. 09, n.02, p. 89-94
AVALIAÇÃO DE DOIS MÉTODOS DE SEPARAÇÃO, DIFERENCIAÇÃO E COLORAÇÃO
DE LINFÓCITOS POR MEIO DA REAÇÃO DE MICROLINFOCITOTOXICIDADE
Glicélia da Rosa*
Alessandra Valéria de Oliveira**
Sueli Donizete Borelli***
Luciene Christina Marques da Silva Pereira****
RESUMO: A reação de microlinfocitotoxicidade é rotineiramente utilizada para realizar a prova cruzada. Os linfócitos do doador, nesta
reação, são alvos dos aloanticorpos anti-HLA que podem estar presentes no soro do receptor, e por isso é importante definir a metodologia
de separação, diferenciação e coloração dos linfócitos. Devido à fragilidade celular dos linfócitos, principalmente dos linfócitos B, os
métodos de separação, diferenciação e coloração apresentam influência direta no resultado da reação. O objetivo deste estudo foi
comparar duas metodologias de separação, diferenciação e coloração de linfócitos: os métodos de ficoll-hypaque/fluorobeads e azul de
tripan/fluoroquent, respectivamente. Vinte e sete provas cruzadas foram desenvolvidas utilizando o método de ficoll-hypaque/tripan e 42
provas cruzadas pelo método de fluorobeads/fluoroquent. Os resultados mostraram a superioridade do método fluorobeads/fluoroquent
no processo de separação, diferenciação e coloração para as duas populações de linfócitos, T e B.
PALAVRAS-CHAVE: Microlinfocitotoxicidade; Prova cruzada; Anticorpos.
EVALUATION OF TWO METHODS OF ISOLATION, DIFFERENTIATION AND STAINING
OF LYMPHOCYTES BY MEANS OF MICROLYMPHOCYTOTOXICITY REACTION
ABSTRACT: The Microlymphocytotoxicity reaction routinely is used to carry the cross match. The donor’s lymphocytes, in this reaction,
are target to anti-HLA alloantibodies that could be present on the receptor’s serum, and because of this is so important to define the
methodology of isolation, differentiation and staining of lymphocytes. Due to cellular fragility of lymphocytes, mainly B-lymphocytes, the
methods of isolation, differentiation and staining show direct influence on the reactions result. The aim of this study was to compare two
methodologies of isolation, differentiation and staining of lymphocytes: by ficoll-hypaque/fluorobeads and tripan blue/fluoroquent methods
respectively. Twenty-seven crossed match were developed using ficoll-hypaque/tripan method and 42 crossed match by fluorobeads/
fluoroquent methods. The final results showed that fluorobeads/fluoroquent method had better performance in the process of isolation,
differentiation and staining for both lymphocytes populations, T and B.
KEY WORDS: Microlymphocytotoxicity; Cross match; Antibodies.
INTRODUÇÃO
A escolha de um doador para um determinado receptor de órgãos
envolve várias etapas, entre elas a realização de testes imunológicos
no intuito de minimizar as diferenças alogênicas entre ambos. Entre
os testes realizados estão a tipagem ABO, Rh, HLA, reatividade contra
painel de células e a prova cruzada. Embora métodos mais sensíveis
estejam sendo estudados para a avaliação da resposta imuno-humoral
específica, a prova cruzada realizada pelo método CDC (citotoxicidade
celular dependente de complemento) é ainda rotineiramente utilizada
na prevenção da rejeição hiperaguda em transplantes (AKALIN;
BROMBERG, 2005; ALTERMANN et al., 2006).
Acadêmica do curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Maringá – CESUMAR. E-mail: [email protected]
Docente do Departamento de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Maringá – CESUMAR. E-mail: [email protected]
***
Docente do Departamento de Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá – UEM. E-mail: [email protected]
****
Acadêmica do curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá – UEM. E-mail: [email protected]
*
**
90
Avaliação de Dois Métodos de Separação, Diferenciação e Coloração...
A reação de microlinfocitotoxicidade celular dependente de
complemento foi proposta por Terasaki e Mc Clelland em 1964 e
modificada em 1977 por Bodmer e Bodmer. Esta reação pode ser
utilizada para detectar a presença de anticorpos anti-HLA (Human
Leukocyte Antigen) pré-formados no soro do receptor, dirigidos contra
antígenos HLA presentes nos linfócitos do potencial doador de órgãos
ou tecidos, sendo denominada de prova cruzada ou cross match.
A prova cruzada é realizada em microplacas de Terasaki, onde o
soro do receptor é incubado com as células do potencial doador, mediante
a adição do complemento, sendo que, caso haja anticorpos pré-formados
no soro do receptor contra as células do doador, estas serão lisadas e o
resultado será positivo, indicando, desta maneira, que este doador não é
apropriado para o receptor. Esta sensibilização prévia dos candidatos a
transplante decorre, freqüentemente, da produção de aloanticorpos antiHLA da classe IgG, podendo ser dirigida contra os antígenos de classe I
e/ou classe II. Quando presentes, estes anticorpos podem fixar-se na
superfície das células do enxerto e provocar a fixação do complemento,
com a conseqüente lise celular (SEIGNALET; MOURAD; MION, 1990).
Esta reação é também muito utilizada na reatividade contra painel (do
inglês, Panel Reactivity Antibodies), onde o soro do receptor é analisado
contra um painel de células provenientes de diferentes indivíduos previamente tipados para os antígenos HLA. Este painel de células é selecionado
para representar a distribuição dos antígenos HLA da população, e, por
conseguinte, a positividade contra esse painel reflete o grau de sensibilização
do receptor frente aos antígenos contidos no painel, e da mesma forma
contra a população estudada (DUQUESNOY et. al., 1990).
A avaliação do receptor quanto à possível presença de anticorpos
de histocompatibilidade contra o doador específico, bem como a
análise do percentual de reatividade contra o painel de células (PRA),
é de fundamental importância no preparo de um paciente para o
transplante (GEBEL; BRAY, 2000).
Para o desenvolvimento da reação de microlinfocitotoxicidade é
necessário definir a metodologia de separação, diferenciação e coloração
das células provenientes do doador e/ou receptor. A separação de
linfócitos consiste na retirada das células mononucleadas do sangue
periférico, onde a predominância é de linfócitos. Essa separação pode
ser realizada pelo método de ficoll-hypaque, e resultará em um concentrado de linfócitos totais.
Os métodos empregados para essa separação podem ser
inespecíficos, utilizando-se fibras de náilon ou hemácias de carneiro, as
quais se ligam espontaneamente aos receptores dos linfócitos T, formando
rosetas (FRÖLAND, 1972; JONDAL; HOLM; WIGZELL, 1972.); ou
podem ser específicos, através da separação por esferas
imunomagnéticas, que constituem partículas superparamagnéticas com
anticorpos monoclonais anti-CD2 para linfócitos T e anti-CD19 para linfócitos
B, acoplados nas respectivas superfícies. As esferas podem ser recolhidas
utilizando-se um campo magnético, que após a retirada não deixa nenhum
magnetismo residual nas esferas (BOLHUIS et al., 1986).
Quando se realiza a separação de linfócitos pelo método do Ficollhypaque, frequentemente, é utilizada a coloração destes pelos corantes
azul de Tripan ou Hematoxilina-Eosina (BOYUM, 1968; BELL;
MATHESON; HO-YEN, 1990). A separação de linfócitos por
microesferas, “beads”, requer a coloração por reagentes fluorescentes.
Devido à fragilidade celular dos linfócitos, principalmente dos
linfócitos B, os métodos de separação, diferenciação e coloração têm
influência direta no resultado final da reação de microlinfocitotoxicidade,
podendo dificultar a leitura e a interpretação dos resultados.
Este trabalho teve como objetivo realizar um estudo comparativo entre duas metodologias de separação/diferenciação e coloração de linfócitos:
os métodos de ficoll-hypaque/fluorobeads e azul de tripan/fluoroquent
respectivamente, através da reação de microlinfocitotoxicidade.
2 METODOLOGIA
2.1 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO
2.1.1 Soro
Foram coletados 5mL de sangue periférico humano, em tubo
seco sem anticoagulante, e posteriormente centrifugados a 800g durante
15 minutos. Em seguida o sobrenadante foi retirado e armazenado
em microtubos de 1,5mL, a uma temperatura de -20°C.
2.1.2 Linfócitos
Os linfócitos foram obtidos a partir de 10mL de sangue periférico
humano, coletados em tubos com anticoagulante ACD (ácido
citratodextrose), e posteriormente utilizados conforme recomendado.
2.2 MÉTODO DE SEPARAÇÃO DE LINFÓCITOS POR
FICOLL-HYPAQUE
2.2.1 Separação de linfócitos (T)
O sangue periférico foi centrifugado a 800g, durante 10 minutos,
para separar a camada leucocitária (buffy coat). Com auxílio da pipeta
Pasteur, o buffy-coat foi retirado e diluído em aproximadamente 7mL de
PBS (phosphate buffer saline) e adicionado delicadamente sobre 2mL
da solução de Ficoll-HypaqueTMplus. Em seguida o material foi
centrifugado a 1000g por 20 minutos para obtenção do anel de linfócitos.
Após a obtenção do anel de linfócitos, foram efetuadas duas lavagens,
centrifugando a amostra a 600g, durante 10 minutos, desprezando-se o
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ROSA, G.; OLIVEIRA, A.V.; BORELLI, S.D.; PEREIRA, L.C.M.
sobrenadante após cada uma das centrifugações. Após a última lavagem
os linfócitos foram ressuspensos em meio enriquecido McCoy (McCoy
5A MEDIUM CAT. CODM 4892. SIGMA). A concentração dos linfócitos
foi acertada para 3x106 linfócitos/mL.
.
2.2.2 Separação de linfócitos (B)
O sangue periférico foi centrifugado a aproximadamente 800g, durante
10 minutos, para separar a camada leucocitária (buffy coat). Com auxílio
da pipeta Pasteur o buffy-coat foi retirado e diluído em aproximadamente
7mL de PBS (phosphate buffer saline) e adicionado delicadamente sobre
2 mL da solução de Ficoll-HypaqueTMplus. Em seguida o material foi
centrifugado a 1000g por 20 minutos para obtenção do anel de linfócitos.
Após obtenção do anel de linfócitos, foram efetuadas duas lavagens,
centrifugando a amostra a 600g, durante 10 minutos, desprezando-se o
sobrenadante após cada uma das centrifugações.Após a última lavagem,
os linfócitos totais foram ressuspensos em 1mL de meio enriquecido
McCoy e distribuídos na superfície de um cotonete de fibras de náilon (préaquecido em banho-maria) e levados à estufa durante 30 minutos, à
temperatura de 37°C. Em seguida, com o auxílio da pipeta Pasteur, foram
efetuadas lavagens com PBS para a liberação dos linfócitos T da superfície
das fibras. Os linfócitos B foram obtidos após agitação do cotonete em
7mL de meio enriquecido e posterior centrifugação a 600g, durante 10
minutos.Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e os linfócitos
B foram ressuspensos em meio enriquecido.A concentração dos linfócitos
T e B foi acertada para 3x106 linfócitos/mL.
2.3 SEPARAÇÃO DE LINFÓCITOS POR FLUOROBEADS
2.3.1 Separação de linfócitos (T)
Em tubo de ensaio de 5mL foram adicionados 60µL de fluorobeadsT (One Lambda, Inc., 2004) em 2mL de sangue periférico. Após
homogeneização manual por 3 minutos foram adicionados 2mL de solução
Developer (One Lambda, Inc., 2004) e em seguida o sangue foi
homogeneizado novamente. A seguir, o tubo de ensaio com o material
biológico foi colocado em uma base magnética por 3 minutos, para
separação dos linfócitos juntamente com as “beads” específicas para
linfócitos T. O sobrenadante foi retirado cuidadosamente com auxílio de
uma pipeta Pasteur. Após 2 lavagens com 2mL de PBS o sobrenadante
foi ressuspenso em 500ìL de meio enriquecido com soro bovino fetal.
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a 800g de 10mL de sangue periférico e 4mL de PBS Citrato, (One Lambda,
Inc.). Após adição de 100µL de fluorobeads-B (One Lambda, Inc.) e
agitação manual da amostra por 3 minutos, esta foi colocada em um
suporte magnético durante 2 minutos. Com o auxílio de uma pipeta
Pasteur, o sobrenadante foi removido cuidadosamente. Após lavagens
com PBS Citrato, as “beads” foram ressuspensas em 100µL de meio
enriquecido com soro bovino fetal.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As provas cruzadas, realizadas através da reação de
microlinfocitotoxicidade, foram desenvolvidas em paralelo e com o
mesmo material biológico, utilizando dois métodos de separação,
diferenciação e coloração de linfócitos. A separação dos linfócitos totais
a partir do sangue periférico foi desenvolvida pelo método de ficollhypaque (BELL; MATHESON; HO-YEN, 1990). A diferenciação dos
linfócitos a partir desta separação foi realizada através do método nãoespecífico, utilizando fibras de náilon (BOYUM, 1986). Ao final desta
diferenciação foram obtidas as duas populações de linfócitos - T e B necessárias para a realização da prova cruzada.
Através da reação de microlinfocitotoxicidade foram realizadas 27
provas cruzadas com linfócitos T e 12 para linfócitos B utilizando o método
de ficoll-hypaque para a separação de linfócitos totais, diferenciação destes
linfócitos com fibras de náilon e posterior coloração com azul de tripan.
Conforme a Tabela 1, das 27 provas cruzadas realizadas, 24
apresentaram, ao final da reação, viabilidade linfocitária superior a
80%. Três reações apresentaram viabilidade inferior a 80%, sendo
necessária ra ealização de nova separação de linfócitos através da
obtenção de novo material biológico.
Tabela 1. Análise da viabilidade dos linfócitos T ao final da reação de
microlinfocitotoxicidade utilizando o método de ficoll-hypaque para a
separação, fibras de náilon para a diferenciação e azul de tripan
como corante das células mortas
2.3.2 Separação de linfócitos (B)
Em um tubo de ensaio de 5mL, foram adicionados aproximadamente
2mL de camada leucocitária, obtida a partir da centrifugação por 10 minutos
Conforme mostra a Tabela 2, foram realizadas 12 provas
cruzadas para linfócitos B utilizando o método de ficoll-hypaque
para a separação de linfócitos totais, a diferenciação destes linfócitos
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Avaliação de Dois Métodos de Separação, Diferenciação e Coloração...
com fibras de nylon e posterior coloração com azul de tripan. Dentre
estas provas, 7 apresentaram, ao final da reação, viabilidade igual
ou superior a 80%. Cinco amostras apresentaram viabilidade inferior
a 70%, impossibilitando a análise e interpretação da reação.
Tabela 2. Análise da viabilidade dos linfócitos B ao final da reação de
microlinfocitotoxicidade utilizando o método de ficoll-hypaque para a
separação, fibras de náilon para a diferenciação e azul de tripan
como corante das células mortas.
al., 1983; CHAPMAN et al., 1985; TALBOT et.al., 1988). Na tentativa de
aprimorar a obtenção de linfócitos para o desenvolvimento desta reação,
propusemo-nos a melhorar a viabilidade destas células através de um
estudo comparativo entre duas metodologias de separação,
diferenciação e coloração de linfócitos.
A literatura é escassa no que se refere à utilização de diferentes
metodologias para separação, diferenciação e coloração de linfócitos
e sua utilização na reação de microlinfocitotoxicidade, e, justamente
por esta razão, dispusemo-nos a relatar os resultados encontrados
neste estudo, com o intuito de auxiliar os profissionais da área na
escolha de uma metodologia adequada.
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Conforme mostra a Tabela 3, foram realizadas 42 provas
cruzadas utilizando o método de separação das células pelo método
de fluorobeads e coloração com o corante fluoroquent. Dentre estas
provas, 30 foram realizadas com linfócitos T e 12 com linfócitos B.
Dentre as 42 provas cruzadas realizadas, 41 apresentaram
percentual de viabilidade celular superior a 80%. Podemos ressaltar
que, das 41 provas cruzadas, 37 tiveram percentual de viabilidade
igual ou superior a 90%. Somente em uma prova cruzada foi
observado um percentual de viabilidade celular inferior a 80%.
Tabela 3. Análise da viabilidade dos linfócitos T e B ao final da reação de
microlinfocitotoxicidade utilizando o método de separação das células pelo
método de fluorobeads e coloração com o corante fluoroquent.
Para a realização da prova cruzada, os linfócitos devem apresentar
viabilidade, preferencialmente, igual ou superior a 80%. Devido aos
períodos de incubação exigidos pela técnica de microlinfocitotoxicidade,
os linfócitos podem sofrer, ao final da reação, alguma alteração em sua
viabilidade celular, sugerindo uma escolha cuidadosa da metodologia a
ser utilizada para a separação, diferenciação e coloração destas células.
De acordo com os resultados obtidos neste estudo, a metodologia de
diferenciação e coloração pelo método fluorobeads/fluoroquent respectivamente mostrou-se superior ao método de separação, diferenciação e coloração por ficoll-hypaque, fibras de náilon e azul de tripan respectivamente,
pois, além de apresentar viabilidade superior tanto para linfócitos T como
para linfócitos B, a leitura da reação e sua interpretação foi possível até 2
dias após a coloração dos linfócitos, sem afetar sua viabilidade.
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complemento, utilizado para a realização das provas cruzadas. depende,
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