EFEITOS DA TEMPERATURA E DO MATE (Ilex paraguariensis

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”
Instituto de Biociências
CAMPUS DE BOTUCATU
“EFEITOS DA TEMPERATURA E DO MATE (Ilex paraguariensis) SOBRE O
PROCESSO DE CARCINOGÊNESE DE ESÔFAGO EM RATOS WISTAR
MACHOS.”
Juliana Ferreira da Silva
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências, Câmpus de Botucatu,
UNESP, para obtenção do título de
Mestre no Programa de Pós Graduação
em Biologia Geral e Aplicada
Botucatu – SP
2008
Juliana Ferreira da Silva
“EFEITOS DA TEMPERATURA E DO MATE (Ilex paraguariensis) SOBRE O
PROCESSO DE CARCINOGÊNESE DE ESÔFAGO EM RATOS WISTAR
MACHOS.”
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências, Câmpus de Botucatu,
UNESP, para obtenção do título de
Mestre no Programa de Pós Graduação
em Biologia Geral e Aplicada
Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Barbisan
Botucatu-SP
2008
Banca examinadora
Prof. Dr. Luís Fernando Barbisan
Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
Profa. Dra. Lígia Souza Lima Silveira da Mota
DEDICATÓRIA
Bendito seja o Senhor, minha rocha, que adestra as minhas mãos
para a peleja e os meus dedos para a guerra;
Aquele que habita no esconderijo do Altíssimo,
à sombra do Onipotente descansará.
Direi do Senhor: Ele é o meu Deus, o meu refúgio,
a minha fortaleza, e nele confiarei.
Porque ele te livrará do laço do passarinheiro, e da peste perniciosa.
Ele te cobrirá com as suas penas, e debaixo das suas asas estarás seguros; a sua verdade será o teu escudo e broquel.
Não terás medo do terror de noite nem da seta que voa de dia,
Nem da peste que anda na escuridão,
nem da mortandade que assola ao meio-dia.
Mil cairão ao teu lado,
e dez mil à tua direita, mas tú não serás atingido.
O Senhor é a minha luz e a minha salvação; a quem temerei? O
Senhor é a força da minha vida; de quem me recearei?
Ainda que um exército se acampe contra mim, o meu coração não
temerá; ainda que a guerra se levante contra mim, conservarei a
minha confiança.
Bem-aventurado o povo cujo Deus é o Senhor.
Salmo 27,91 e 144.
Primeiramente a DEUS, Jesus e Maria nossa mãe
Por estarem sempre comigo, me amparando, auxiliando e iluminando á todos os meus caminhos.
Segurando nas minhas mãos nos momentos em que mais precisei, cuidando de mim em todos os
momentos desta caminhada e me livrando de todo o mal.
À minha mãe Maria
A minha eterna gratidão, por sempre acreditar em mim, por lutar para que eu conseguisse chegar onde
cheguei, por todas as noites que chorou por mim, que orou por mim e por todo amor e carinho que
sempre me dedicou.
Ao Meu esposo Emerson
Que teve tanta paciência, que me incentivou, nunca me deixou desistir, cuidou de mim quando eu mais
precisei, me deu apoio, amor e confiança.
À minha irmã Joseane
Que sempre acreditou em mim, meu deu conselhos na hora em que eu mais precisei, me deu apoio e
carinho mesmo distante.
À minha Vó Rosina
Agradeço pelo carinho, amor, cuidado e paciência que sempre teve comigo
Às minhas Grandes amigas Valquíria e Edilene
Que me ensinaram grande parte de tudo que sei hoje, que tiveram carinho e muita paciência, que sempre
me incentivaram, sempre me auxiliaram nos momentos em que mais precisei.
Ao meu pai Paulino
Apesar de o senhor não estar aqui comigo, apesar de nem sequer eu lembrar de seu rosto, tenho certeza
que onde o senhor estiver estará sempre torcendo por mim, cuidando de mim e orando por mim.
Sei que algum dia nós vamos nos encontrar novamente e eu poderei chama-lo de “Pai” pois a vida não
nos deu esta oportunidade.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Orientador Luís Fernando Barbisan por me orientar e me conduzir pelo caminho correto,
por acreditar em mim, pela acolhida, pelo respeito e por me tornar à pessoa que sou hoje. Obrigada por
tudo que me ensinou, você sempre será uma referência em minha vida pessoal e profissional.
A Profa. Dra. Lígia por me ajudar no início de minha caminhada, por me orientar no momento em que
mais precisei, por me ensinar grande parte de tudo que sei hoje, por acreditar em mim.
Ao Paulo César Georgette que me ensinou muito, que se tornou um grande amigo, que me ajudou em
tudo que precisei, sei que sempre poderei contar com você.
A minha amiga Lívia Lacorte que sempre esteve comigo em todos os momentos desta caminha,
sofremos, lutamos, estudamos e também chegamos lá juntas.
A todos os professores do programa de Biologia Geral e Aplicada por todos os ensinamentos.
Aos secretários da pós-graduação pela atenção.
A todos os meus familiares que sempre acreditaram em mim.
Lista de Abreviaturas
AD – Adenocarcinoma (s)
NSAIDS – Drogas antiinflamatórias não-esteroidais
CE - Carcinoma Epidermóide
COX-2 - Ciclooxigenase 2
CYP - Citocromo
DEN - Dietilnitrosamina
DRGE - Doença do Refluxo Gastroesofágico
EB - Esôfago de Barret
EUA - Estados Unidos da América
INCA - Instituto Nacional do Câncer
NMBA - N-nitrosometilbenzilamina
MNNG - N-metil-N'-nitrosoguanidina
HPV - Papilomavírus Humano
PHAs- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
URSS - União Soviética
Sumário
Resumo .....................................................................................................................9
Abstract...................................................................................................................10
Introdução...............................................................................................................11
Introdução geral as neoplasias..............................................................................11
Câncer de esôfago: epidemiologia, fatores de risco e subtipos...........................13
Álcool e cigarro como fatores de risco para o câncer de esôfago.......................17
O consumo de bebidas quentes como fator de risco para o câncer de esôfago.20
Dados controversos sobre o consumo do mate....................................................21
Modelos de indução de câncer de esôfago em ratos.............................................23
Considerações finais e objetivos............................................................................25
Referências*............................................................................................................26
Artigo científico.......................................................................................................39
Conclusões...............................................................................................................67
9
1.
Resumo
O consumo de mate em altas temperaturas tem sido considerado um fator de risco para o
desenvolvimento do carcinoma epidermóide de esôfago (CE) na América do Sul. Desta forma,
os efeitos da ingestão de mate sobre danos de DNA e a carcinogênese de esôfago, induzidos
pela dietilnitrosamina (DEN) e injúria térmica, foram avaliados em ratos Wistar machos. Na
fase de iniciação, os animais foram iniciados com injeções i.p. da DEN (8 x 80 mg/Kg p.c.) e
submetidos a injúria térmica (água a 65 0C, 1ml/rato, instilado no interior do esôfago) e
receberam, concomitantemente, mate (2.0% p/v, grupo teste) ou chá-verde (2.0% p/v, grupo
controle positivo) como única fonte de líquidos por oito semanas. Nenhum tratamento
adicional foi introduzido durante a fase de pós-iniciação (nona a vigésima semana do
experimento). Amostras de sangue periférico foram coletadas quatro horas após a última
administração da DEN para o teste do cometa na oitava semana e amostras de esôfago e
fígado foram coletadas na oitava e vigésima semanas do experimento. Na oitava semana, a
ingestão de mate e chá-verde por si não foi genotóxica e reduziu de forma significativa os
níveis de danos no DNA de leucócitos de sangue periférico nos animais tratados com a DEN.
Além disso, uma redução significativa nos níveis de proliferação celular no epitélio do
esôfago e no parênquima hepático e no número de lesões hepáticas pré-neoplásicas foram
também observadas nos grupos iniciados e que receberam mate ou chá-verde. Na vigésima
semana, uma menor incidência de neoplasias de esôfago e fígado foi observada nos grupos
que receberam previamente mate e chá-verde quando comparado ao grupo iniciado pela DEN
e submetido à injúria térmica. Os resultados do presente estudo indicam que a ingestão de
mate se mostrou benéfica contra danos no DNA e a carcinogênese de esôfago e fígado
induzidos pela DEN.
10
2. Abstract
Drinking hot mate has been associated with risk for esophageal squamous cell carcinoma
in South America. Thus, the modifying effects of mate tea intake on DNA damage and
esophageal carcinogenesis induced by diethylnitrosamine (DEN) plus thermal injury were
evaluated in male Wistar rats. In the initiation phase, rats were treated with DEN injections (8
x 80 mg/Kg b.w.) plus thermal injury (water 65 0C, 1ml/rat, instilled into the esophagus) and
concomitantly received mate tea (2.0% w/v, test group) or green tea (2.0% w/v, positive
control group) as the sole source of drinking fluid for 8 weeks. Any additional treatment was
introduced at post-initiation until week 20. Peripheral blood was collected 4 hr after the last
DEN application for comet assay at week 8 and samples from esophagus and liver were
collected at weeks 8 and 20. At week 8, mate or green tea intake itself were non-genotoxic and
significantly decreased DNA damage levels in peripheral blood leucocytes from DEN-treated
animals. Also, a significant reduction of cell proliferation rates in both esophageal epithelium
and liver parenchyma and on the number of putative preneoplastic liver lesions were observed
in initiated and mate or green tea-treated animals at week 8. A significant lower incidence of
esophageal and liver neoplasms and tumor multiplicity was observed in the groups previously
treated with mate or green tea when compared to the DEN initiated/thermal injury group at
week 20. These data indicate that mate tea presented protective effects against DNA damage
and esophageal and liver carcinogenesis induced by DEN.
11
3. Introdução
3.1.) Introdução geral a neoplasias
As neoplasias malignas têm sido apontadas como uma das principais causas de morbimortalidade no mundo ocidental moderno (WCRF, 1997; WHO, 1998). Além disso, através
de análises estatísticas de morbi-mortalidade, resultantes dos vários tipos de cânceres,
observa-se que a doença vem aumentando em níveis mundiais (Parkin, 2001). São doenças
crônico-degenerativas, multifatoriais que envolvem alterações genéticas progressivas,
expressas por alterações celulares metabólicas e morfológicas. Cada tipo de neoplasia possui
características clínicas e biológicas peculiares que devem ser investigadas para aprimorar seu
diagnóstico, tratamento e prognóstico (Robbins e Cotran, 2005).
As neoplasias corresponderam a 16% dos casos de morte no período entre 1999 a 2001,
no estado de São Paulo (Batista et al., 2004). Estas taxas elevadas de mortalidade relacionadas
ao câncer podem ser atribuídas ao diagnóstico tardio e as dificuldades (Parkin, 2001).
A divisão e morte celulares são eventos controlados por fatores genéticos, capazes de
permitir a manutenção da homeostase tecidual e do organismo. No entanto, há circunstâncias
especiais em que estes controles falham e as células passam a se dividir de forma autônoma ou
tornam-se mais resistentes à morte celular por apoptose. Esta capacidade de se dividir de
forma autônoma, ou seja, de se libertar dos controles de crescimento, é a principal
característica da célula neoplásica, em decorrência de mutações que ocorrem no material
genético da célula (Loeb et al., 2003). Além disso, essa capacidade de escape aos controles
regulatórios se transmite a toda progênie da célula, isto é, as mutações são fixadas no genoma
celular gerando clones celulares com deleções ou amplificações em genes críticos, o que leva
ao desequilíbrio entre as taxas de proliferação, morte celular (apoptose), na comunicação com
células vizinhas e com a matriz extracelular, angiogênese, diferenciação e finalmente a
compressão, invasão de tecidos adjacentes e disseminação metastática (Robbins e Cotran,
2005). Esses danos genéticos podem afetar duas classes de genes os proto-oncogenes e os
genes supressores tumorais. Nos proto-oncogenes amplificação, deleção, rearranjo ou
mutações de ponto resultam em aumento de sua função (oncogenes). Nos genes supressores as
alterações na metilação ou perda cromossômica que resultam em perda de sua função
(Griffiths et al., 2006).
O processo de carcinogênese ou oncogênese ocorre através de múltiplas etapas, ou seja,
a iniciação, promoção e progressão (Pitot e Dragan, 1996; Pitot, 2001). A iniciação se
caracteriza pela ocorrência de uma ou mais mutações no DNA de uma célula alvo. Essas
12
mutações podem ser causadas por diversos fatores, entre eles pela exposição a agentes
químicos cancerígenos, vírus oncogênicos ou radiação. As células que fixaram as lesões de
DNA (i.e., após um ciclo de divisão celular) são consideradas então “células iniciadas”, estas
células podem então sofrer a ação de agentes promotores (epigenéticos) (Pitot e Dragan, 1996;
Pitot, 2001). A célula iniciada sofre outras mutações genéticas adicionais (i.e., protooncogenes e genes supressores de tumores) podendo transformar-se em uma célula com
fenótipo maligno. Para que ocorra essa transformação, é necessário um longo e/ou persistente
contato com outros fatores, incluindo a exposição a agentes cancerígenos epigenéticos (Pitot e
Dragan, 1996; Pitot, 2001). Na fase de promoção, a suspensão da exposição a esses agentes
muitas vezes interrompe ou reverte o processo de carcinogênese. Alguns componentes
contidos nos alimentos ou cigarro (i.e., aminas aromáticas, hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos - PHAs, nitrosaminas, etc), e a exposição excessiva e prolongada a hormônios ou
xeno-estrógenos são exemplos de fatores que promovem a transformação de células iniciadas
em malignas (Wogan et al., 2004; Safe, 2004).
O terceiro e último estágio da carcinogênese, a progressão, se caracteriza pela
multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas. Nesse estágio, a neoplasia já
está instalada, evoluindo até o surgimento de metástases e dos sintomas clínicos da doença
(Pitot, 2001). As substâncias químicas podem atuar nas diferentes fases do processo da
carcinogênese. Assim, existem substâncias químicas que podem induzir a formação de células
iniciadas que atuam como agentes promotores ou agentes completos (Pitot e Dragan, 1996).
Por exemplo, o cigarro contém inúmeras substâncias mutagênicas/cancerígenas, atuando,
portanto como um agente cancerígeno completo, pois possui componentes que atuam nos três
estágios da carcinogênese (Stoner et al., 2001; Wogan et al., 2004).
A proliferação e morte celular são eventos essenciais às etapas de iniciação, promoção e
progressão da carcinogênese (Pitot e Dragan, 1991; Tomatis, 1993; Shulte-Hermann et al.,
1993). A maioria das células neoplásicas contém alterações genéticas que estão envolvidas na
perda do controle desses processos (Lehrbach et al., 2003). Por exemplo, para as neoplasias
esofágicas, várias alterações genéticas estão envolvidas, incluindo a perda da função no gene
TP53 e amplificação do gene da ciclina D1, entre outros (Ransford e Jankowski, 2000; Stoner
et al., 2001). Mutações no gene TP53, que colaboram para a progressão de lesões displásicas
em CE do esôfago, têm conferido vantagens na sobrevivência de clones celulares mutados
pela diminuição de sua eliminação por apoptose (Ransford e Jankowski, 2000).
13
3.2.) Câncer de esôfago: epidemiologia, fatores de risco e subtipos
O esôfago é um tubo longo, de ± 25 cm, músculo-membranoso e estreito, que comunica
a orofaringe ao estômago. Ele permite a passagem do alimento ou líquido deglutido até o
interior do estômago, através de contrações musculares peristálticas (Sobotta, 2006).
Sendo sua mucosa revestida com um epitélio estratificado pavimentoso ou escamoso, as
neoplasias podem surgir em qualquer região do esôfago, podendo manifestar-se como uma
estenose, como uma lesão papilífera ou nodular ou como uma área achatada anormal (em
forma de placa). Neste órgão, o desenvolvimento do câncer de esôfago, é um processo
progressivo de múltiplas etapas, com aumento na proliferação das células epiteliais esofágicas,
hiperplasia das células basais, displasia, carcinoma in situ e carcinoma avançado de células
escamosas do esôfago (Lehrbach et al., 2003).
As neoplasias de esôfago apresentam desenvolvimento rápido e, na maioria dos casos, o
prognóstico é desfavorável com sobrevida média abaixo de cinco anos (Enzinger e Mayer,
2003; Kollarova et al, 2007). A prevalência das neoplasias de esôfago em humanos tem
aumentado significativamente nas últimas décadas (Stoner et al., 2001; Engel et al., 2003). O
câncer de esôfago já é enquadrado entre as dez neoplasias mais freqüentes que acometem o ser
humano (Parkin et al., 2001; Stoner et al., 2001; Enzinger e Mayer, 2003; Kollarova et al,
2007) e, entre as localizadas no trato gastrintestinal, a terceira de maior incidência (Parkin et
al., 2001). A incidência do CE do esôfago em humanos é influenciada por fatores ambientais
locais, predisposição genética e estilo de vida, sendo mais freqüente em algumas áreas da
França, China, Irã, África do Sul e América do Sul (Craddock, 1992; Day e Varghese, 1994).
As áreas de alto risco estão localizadas ao longo do chamado “cinturão do câncer do esôfago”
que vai do Irã às repúblicas do sudoeste da antiga União Soviética (URSS), oeste e noroeste
da China. Alguns países da América do Sul, sudoeste da África e da Europa também
apresentam alta incidência deste tipo de neoplasia (Tomatis et al., 1990; Craddock, 1992; Day
e Varghese, 1994). Esta neoplasia é predominante em indivíduos do sexo masculino e sua
incidência aumenta com a idade, sendo o pico de freqüência entre os 50-70 anos de idade
(Kollarova et al, 2007). No Brasil, o câncer de esôfago está entre os dez tipos de maior
incidência e o sexto em mortalidade de acordo com dados obtidos dos Registros de Base
Populacional de 2000 (INCA, 2005). Em especial, no Rio Grande do Sul a incidência de
câncer de esôfago está em torno de 14,3/100.000 casos entre os homens e 4,2/100.000 entre as
mulheres (Barros et al., 2000).
14
De acordo com o INCA - Instituto Nacional do Câncer, no período de 1979 e 1983 e
entre 1995 e 1999 houve um percentual de 10,61/ 8,91 de mortes causadas por câncer de
esôfago em homens e 5,03/3,69 em mulheres no Rio grande do Sul. De acordo com
estimativas do INCA 2008 haverá 19,73/100.000 casos de morte por câncer esôfago entre os
homens e 7,58/100.000 casos de morte por câncer de esôfago entre as mulheres.
Cerca de 90% das neoplasias do esôfago incluem CE que provém de seu epitélio de
revestimento e cerca de 7% dos casos incluem AD que podem originar-se de glândulas da
submucosa do esôfago e, mais comumente, do epitélio cilíndrico do chamado EB (Pera et al.,
1993; Cameron et al., 1995; Stoner et al., 2001). Entretanto nos Estados Unidos da América
(EUA), ambos possuem taxas semelhantes de incidência, a qual é mais freqüente em homens
sendo que os negros possuem um risco maior do que os brancos de até quatro vezes (Blot et
al., 1991; Parkin et al., 2001).
A etiologia de câncer esofágico nas regiões de alto risco (maior incidência) não foi ainda
elucidada. Nas regiões de incidência mais baixa ou intermediária, estudos epidemiológicos
têm mostrado que o uso de álcool, o tabagismo, a deficiência de micronutrientes, o consumo
de bebidas quentes (em especial de chás) e o baixo nível socioeconômico são os principais
fatores de risco envolvidos, mas com uma predisposição genética pouco definida (Blot et al.,
1991; Craddok, 1992). A maioria das neoplasias de esôfago na Europa e nos EUA é
freqüentemente atribuída ao consumo do álcool e do cigarro, visto que estes apresentam
quantidades significativas de substâncias mutagênicas e/ou cancerígenas, em especial de
nitrosaninas (Lu et al., 1991; Yang et al., 1992; Straif et al., 2000). HPV é freqüentemente
encontrado no CE de regiões com alta incidência (Stoner et al., 2001), dos vários tipos já
identificados de HPV apenas 24 são associados às lesões esofágicas, (HPV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10,
11, 13, 16, 18, 30, 32, 33, 35, 45, 52, 55, 57, 59, 69, 72 e 73) e apenas o tipo HPV-6 e 11 não
estão associados aos tumores esofágicos (Oliveira et.al., 2003). Entretanto o consumo de
vegetais verdes e de frutas parece exercer algum fator protetor (Stefani et al., 1990; Li et al.,
1993; Tampi et al., 2005; Farhadi et al., 2005).
Baseado nas considerações precedentes supõe-se que os fatores ambientais e nutricionais
possam aumentar o risco, enquanto as deficiências nutricionais possam atuar como
promotoras ou potencializadoras de cancerígenos ambientais. Por exemplo, compostos Nnitrosos presentes nos alimentos e no tabaco podem ser os responsáveis pelo amplo espectro
de mutações de ponto do gene supressor de tumores TP53 nos éxons 5-8 e mutações de
transição, transversão e deleções que estão presentes em mais de 50% dos cânceres
esofágicos. As mutações no gene P16 e a perda de alelos envolvendo outros genes em outros
15
cromossomos também são prevalentes nessas neoplasias, de acordo com o conceito de que a
aquisição escalonada e o acumulo de alterações genéticas levam ao desenvolvimento do
câncer (Putz et al., 2002). As mutações somáticas no gene supressor tumoral TP53 são
encontradas em aproximadamente 50% de todos os tumores humanos, fazendo dele o gene
mais comumente alterado, são mais frequentes mutações do tipo missense e se acumulam nos
éxons 5-8, a maioria destas mutações altera a estrutura da proteína p53 e condiciona a perda
de sua função de supressor tumoral . As mutações no gene TP53 ocorrem em mais de 50 tipos
diferentes de tumores, incluindo os de bexiga, cérebro, cólon, esôfago entre outros (Stoner et.
al, 2001, Putz et al., 2002).
Várias alterações moleculares no CE do esôfago foram descritas, como perda de
heterozigose no cromossomo 1p, 3p, 4, 5q, 9, 11q, 13q, 17q, 18q; perda da função de genes
supressores tumorais dentre eles TP53, metilação e perda do P16MST1 ou P15 e redução da
expressão de Rb; amplificação gênica de D1 ciclina; HST-1, EGFR, INT-2; aumento na
expressão de iNOS, hTERT, BMP-6, COX-2, c-myc e β-catenina (Stoner et. al, 2001, Putz et
al., 2002).
No processo de inflamação crônica devido ao uso do mate em temperaturas elevadas,
ocorre a formação de nitrosaminas e radicais livres endógenos que podem ser responsáveis
pela alta freqüência de mutações de transição G>A e C>T no gene TP53 observado em CE de
pacientes do sul do Brasil. A prevalência de transição G>A destes casos do Rio Grande do Sul
foi mais alta do que as encontradas depositadas nas bases de dados mundiais (IARC, LionFrança) (Putz et al., 2002).
O CE é derivado do epitélio escamoso estratificado da mucosa esofágica. Nessas
neoplasias formam-se quantidades variáveis de queratina, com relação ao grau de
diferenciação normal e, quando a queratina não está na superfície, ela se acumula na forma
córneas; nos casos em que as células estão bem diferenciadas, podem-se observar pontes
intercelulares (desmossomos) entre células adjacentes (Stedman, 1996). Neste tipo de tumor
freqüentemente há presença de invasão de fungos, ulceração e lesões que invadem o epitélio
do esôfago. No CE podem ocorrer áreas bem diferenciadas e poucas áreas de necrose, mas
também podemos encontrar tumores com taxas de mitoses elevadas e grandes áreas de necrose
(Stoner et al., 2001, Putz et al., 2002). A maioria dos pacientes com este tipo de neoplasia
apresenta metástase, prognóstico pouco favorável, e uma sobrevida acima de cinco anos
apenas para 10% dos casos.
As principais intervenções preventivas para reduzir a incidência de CE seriam a
abstinência de bebidas alcoólicas e do cigarro e o consumo de alimentos que contenham
16
propriedades antioxidantes e/ou antiflamatória como o chá-verde, frutas frescas vermelhas e
vegetais (Wang et al., 2006, Stoner et al., 2001, Stoner et al., 2007).
O AD de esôfago está mais relacionado com as doenças que acometem o esôfago, entre
elas a DRGE, esofagite de refluxo e EB, com o desenvolvimento de metaplasia intestinal,
displasia e AD de esôfago (Ransford e Jankowski, 2000).
Existem muitos fatores de risco para o desenvolvimento do AD de esôfago, dentre eles
estão: idade, sexo, DRGE, EB, hérnia de hiato, esofagites, úlceras e disfagia, o uso de
medicamentos que relaxam o esfíncter esofágico e causam refluxo gastroesofágico (i.e.,
nitroglicerinas, aminofilina, β receptor agonista, anticolinérgicos e benzodiazepinas),
obesidade, dieta rica em gordura, colesterol e proteína animal e consumo de cigarros (Chow et
al., 1998; Lagergren, 2000; Wu et al., 2001; Lagergren, 2006; Murray et al., 2006; Dodaran et
al., 2006). O EB, um dos fatores de alto risco para o desenvolvimento do AD, é uma condição
secundária desencadeada pela DRGE (Olliver et al., 2005; Dodaran et al., 2006; Murray et al.,
2006; Fléjou, 2006). Pacientes que apresentam esta condição pré-maligna apresentam maior
risco para o desenvolvimento da doença, pois a maioria dos casos de AD de esôfago provém
do EB. (Olliver et al., 2005; Murray et al., 2006; Fléjou, 2006; Dodaran et al., 2006;
Lagergren, 2006).
A influência de fatores genéticos na etiologia do AD de esôfago tem importância
limitada na maioria dos casos. Nenhuma evidência de histórico familiar tem sido estabelecida
para este tipo de neoplasia, ou seja, não está relacionado com a hereditariedade (Lagergren,
2006). Mutações no gene TP53 foram encontradas na maioria dos AD (Olliver et. Al., 2005).
Em alguns estudos foi possível verificar que a infecção por Helicobater pilori diminuiu
o risco para o desenvolvimento de AD de esôfago em 60%. O efeito protetor do H. pilori se
deve a sua habilidade de induzir gastrite atrófica e a produção de amônia (Lagergren, 2006).
Sabe-se também que o consumo de uma alimentação rica em frutas, vegetais e alimentos com
alto teor de antioxidantes contribuem para a diminuição do risco de desenvolvimento da
doença neoplásica (Chow et al., 1998; Ye et al., 2004; Lagergren, 2006).
Estudos epidemiológicos mostram uma redução do risco de desenvolvimento de
neoplasias gastrintestinal associados à utilização de antiinflamatórios não esteroidais
(NSAIDS), especialmente pelo uso de inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2) (Lagergren,
2000; Lagergren, 2006). As neoplasias de esôfago apresentam aumento da expressão de COX2 e, portanto, o tratamento com inibidores COX-2 poderia retardar o desenvolvimento dessas
neoplasias (Taketo,1998; Wilson et al., 1998; Zimmerman et al., 1999; Lagergren, 2006).
17
O AD que surge no EB geralmente está localizado no esôfago distal e pode invadir o
cárdia gástrico adjacente. Inicialmente, aparece como manchas planas ou elevadas de uma
mucosa intacta, podendo evoluir para grandes massas nodulares de até cinco centímetros, ou
pode exibir características infiltrativas e difusas ou profundamente ulcerativas.
A incidência mundial de AD de esôfago está aumentando e seu prognóstico é pouco
favorável assim como a do CE (Parkin, 2001). Esta neoplasia é de alta morbidade, ou seja,
apenas 10% dos pacientes diagnosticados têm uma sobrevivência de até cinco anos, sendo
mais freqüente em homens com idade acima de 60 anos (Lagergren, 2006).
3.3.) Álcool e cigarro como fatores de risco para o câncer do esôfago
A maioria das neoplasias do esôfago na Europa e nos EUA é freqüentemente atribuída
ao consumo do álcool e do cigarro, visto que apresentam quantidades significativas de
substâncias mutagênicas e/ou cancerígenas, em especial PHAs e nitrosaminas (Lu et al., 1991;
Yang et al., 1992; Straif et al., 2000; Wogan et al., 2004).
O consumo crônico de etanol está relacionado diretamente com o desenvolvimento de
tumores no trato aéreo-digestivo superior, principalmente a cavidade oral, faringe, laringe e
esôfago, sendo que cerca de 25% a 80% desses tipos de neoplasias podem ser atribuídas ao
consumo crônico de etanol (Brown, 2005). Além desses órgãos, o desenvolvimento de
neoplasias no fígado, intestino grosso, mama e pâncreas, está também relacionado ao consumo
excessivo de álcool (Brown, 2005; Boffeta e Hashibe, 2006). Vários estudos epidemiológicos,
revisados em Poschl e Seitz (2004), mostram forte correlação entre a ocorrência dessas
neoplasias e a ingestão de álcool, sugerindo que o etanol é um fator de risco importante para o
desenvolvimento dessas doenças. O consumo abusivo de etanol ainda é uma das principais
causas de desnutrição em adultos nos países desenvolvidos (Bunout, 1999). A ingestão de
álcool causa deficiências nutricionais tais como alterações no metabolismo lipídico, protéico,
de carboidratos, de vitaminas, em especial vitamina A e do complexo B, e micronutrientes,
como o zinco (Bunout, 1999). Essas deficiências contribuem para a carcinogênese, uma vez
que o consumo excessivo de etanol promove hipometilação do DNA, inclusive de genes
supressores de tumor, aumentando a necessidade de ingestão de doadores de grupos metil,
cuja absorção fica comprometida após o consumo de álcool (Stickel et al., 2002; Pöschl e
Seitz, 2004). Não obstante, o aldeído causa destruição do folato na célula, o que inibe a
transmetilação de genes envolvidos na carcinogênese (Pöschl e Seitz, 2004).
18
O etanol pode apresentar efeito co-carcinogênico, pois seu consumo abusivo pode
reduzir os níveis de substâncias antioxidantes, como as glutationas (redutases e transferases),
α-tocoferol e β-caroteno, seja pela perda de estoques teciduais, por inibição de síntese ou por
destruição através da geração de radicais livres, além de alterar a função de enzimas hepáticas
antioxidantes, como a glutationa-S-transferase em decorrência da formação de adutos
acetaldeído-enzima (Sultana et al., 2005). O consumo de etanol aumenta a expressão da
enzima CYP2E1 em vários órgãos, em especial no fígado e esôfago (Kushida et al., 2005;
Tsutsumi et al., 1993; Stickel et al., 2002; Pöschl e Seitz, 2004; McKillop e Schrum, 2005).
Essa enzima pertence à família do citocromo P450, que é responsável pela biotransformação
de vários pró-cancerígenos, tais como as aflatoxinas, nitrosaminas, hidrocarbonetos
policíclicos, em suas formas reativas (Tsutsumi et al., 1993; Stickel et al., 2002; Yu e Yuan,
2004; Pöschl e Seitz, 2004). Estas substâncias estão presentes no ar e em alimentos
contaminados com micotoxinas, sendo que as mesmas são produzidas no preparo de carnes e
no cozimento dos alimentos, e estão presentes ainda no cigarro e em bebidas alcoólicas
(Tsutsumi et al., 1993; Stickel et al., 2002; Karim et al., 2003; Pöschl and Seitz, 2004;
McKillop and Schrum, 2005; Marrero, 2005; Kushida et al., 2005). A CYP2E1 também é
responsável pela biotransformação do etanol a acetaldeído e pela geração de radicais livres de
oxigênio (RLO) (Stickel et al., 2002; Karim et al., 2003; Pöschl and Seitz, 2004; McKillop
and Schrum, 2005), sendo que o estresse oxidativo é um evento promotor da carcinogênese
(Bunout, 1999; Karim et al., 2003; Stickel et al., 2002; Petersen, 2005; Donohue et al., 2006).
O acetaldeído apresenta efeitos mutagênicos e carcinogênicos, uma vez que reage com o
DNA, formando adutos e inibindo o sistema de reparo, induzindo aberrações cromossômicas e
estimulando a apoptose e outros danos celulares (Stickel et al., 2002; Pöschl and Seitz, 2004;
Brooks e Theruvathu, 2005).
Entre os fatores de risco associados ao desenvolvimento de neoplasias do esôfago, o
consumo de cigarros é um dos mais importantes (Vaughan et al., 1995; Gammon et al., 1997).
Entretanto, há poucos estudos sobre a importância da inalação da fumaça (fumantes passivos)
e do tipo de tabaco, para a etiologia dos cânceres de esôfago.
Launoy et al. (2000) demonstraram que a melhor relação entre o risco para o câncer do
esôfago e o cigarro, depende do tipo de tabaco e do padrão morfológico da neoplasia, sendo
consistentes com estudos que revelam que o fumo de rolo ou corda apresentam maior risco
para o desenvolvimento dessa doença (Stephani et al., 1990). O nível de exposição ao cigarro
e o risco para o desenvolvimento do CE depende da intensidade e duração do contato com a
19
fumaça do cigarro (Doll et al., 1994; Castellsague et al., 1999; Lagergren et al., 2000). Há
evidências de que o fumo está mais associado com o CE do que com o desenvolvimento de
AD de esôfago (Lagergren et al., 2000).
Estudos realizados na França demonstraram aumento de 4,6 e 10,9 vezes maior de
desenvolvimento de câncer do esôfago em pacientes que fumaram 35 ou mais cigarros ou que
beberam três ou mais doses de álcool por dia, respectivamente (Kollarova et al, 2007). Esses
fatores, quando associados, tiveram seus efeitos potencializados, apresentando risco final
multiplicado (Kollarova et al, 2007). Ex-fumantes, após 15-19 anos, apresentam redução do
risco para 1,2 vezes.
Entre os vários elementos cancerígenos presentes na fumaça do tabaco, os
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, as aminas aromáticas e as nitrosaminas apresentamse como os componentes mais importantes para o desenvolvimento de neoplasias em humanos
(Hoffmann et al.,1990; Wogan et al., 2004). As nitrosaminas tais como a 4(metilnitrosamina)1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) e a N´-nitrosonornicotina (NNN) têm sido associadas ao
desenvolvimento do câncer oral, de esôfago, pulmão e pâncreas em fumantes (Hoffman et al.,
1990; Hecht et al., 1990; Hecht, 1998, 1999; Wogan et al., 2004) e são potentes indutores de
neoplasias do esôfago em roedores (Craddock, 1992).
A exposição às nitrosaminas pode se dar através da alimentação, do tabaco e da síntese
endógena que ocorre no estômago pela reação do nitrito com aminas secundárias (Magee,
1989). O rato é a espécie mais suscetível ao desenvolvimento de neoplasias de esôfago
induzido por nitrosaminas, independentemente da via de administração (Lijinsk, 1992). A
ativação metabólica das nitrosaminas é catalisada pelo citocromo P450 (CYP), e o produto
formado é extremamente instável podendo reagir com o DNA, induzindo mutações (Magee,
1989), sendo que no fígado, a CYP2E1 é a enzima mais importante envolvida nesta ativação
(Yang et al., 1992). O esôfago de ratos não expressa de forma significante a enzima CYP2E1,
mas em contrapartida, expressa a CYP2A3 responsável em grande parte pelo metabolismo das
nitrosaminas (Pinto et al., 2001, 2003).
Como o etanol altera a biotransformação das nitrosaminas em animais experimentais e
no homem (Pinto, 2000), verifica-se experimentalmente aumento no número de tumores
esofágicos frente administração concomitante de etanol e nitrosaminas (Aze et al., 1993;
Tsutisumi et al., 1993).
20
3.4.) O consumo de bebidas quentes como fator de risco para o câncer do esôfago
O efeito do consumo de bebidas quentes como fator de risco para o desenvolvimento do
CE de esôfago ainda é um tema controverso (Stoner et al., 2001; Putz et al., 2002; Pinto et al.,
2003; Ishikawa et al., 2006). Por exemplo, o consumo de chá-verde (~60°C a 80°C) tem sido
considerado como um fator de proteção para o câncer de esôfago em estudos epidemiológicos
desenvolvidos na China (Wang et al., 2006, Wang et al., 2007), mas, no entanto foi
considerado um fator de risco em um estudo populacional desenvolvido no Japão (Ishikawa et
al., 2006). Além disso, o consumo regular de chá-verde é um importante fator de proteção
contra o desenvolvimento do CE, pois possui componentes antioxidantes e/ou
antiinflamatórios (Steele, 2003; Wang et al., 2006, Wang et al., 2007). Experimentalmente, o
consumo
de
chá
verde
inibiu
a
carcinogênese
de
esôfago
induzida
pela
N-
nitrosometilbenzilamina (composto carcinogênico encontrado em algumas modalidades de
alimento como vegetais em conserva) (Wang et al., 2006).
A erva-mate, produzida a partir das folhas da Ilex paraguariensis (família das
aqüifoliáceas), é originária da região subtropical da América do Sul. O uso habitual de
chimarrão ou mate, uma infusão quente de folhas secas e picadas de Ilex paraguariensis, tem
sido relacionado ao aumento nas taxas de incidência de câncer esofágico (CE) na América do
Sul, incluindo o sul do Brasil, Uruguai e nordeste da Argentina (Victora et al., 1987; Victora
et al., 1990; Castelletto et al., 1994; Leitão e Braga, 1994; Winge et al., 1995; Rolón et al.,
1995; Fonseca et al., 2000; Stoner et al., 2001; Putz et al., 2002; Pinto et al., 2003; Fagundes
et al., 2006; Ishikawa et al., 2006; Bates et al., 2007; Stefani et al., 2007). Os índíos Guaranis
e Quínchuas que habitavam essas regiões tinham o hábito de beber infusões com as folhas da
erva mate. Esse hábito foi transmitido aos respectivos colonizadores, por volta do século XVI.
A forma de consumo do mate foi modificada pelos colonizadores e transmitida aos seus
descendentes e aos imigrantes que hoje ocupam essa região (Barros et al., 2000). Hoje em dia,
a erva mate é tradicionalmente consumida como uma infusão quente ou chimarrão (RS), ou
gelado (tererê) (Mato Grosso do Sul e Paraguai).
O chimarrão também é consumido no Chile e principalmente no Uruguai, país de maior
consumo per capita (cerca de 8-10 kg de erva/habitante/ano). Na Argentina a taxa de consumo
é em torno de 6,5 kg de erva/habitante/ano e, na região sul do Brasil, 3-5 kg de
erva/habitante/ano. Análises químicas da erva-mate têm revelado a presença de diversas
propriedades nutricêuticas e medicinais no produto, o que lhe confere um grande potencial de
21
aproveitamento para a saúde humana. Alguns compostos químicos encontrados na erva-mate
são alcalóides (cafeína, metilxantina, teofilina e teobromina); taninos (ácidos fólico e caféico);
vitaminas (A, B1, B2, C e E); sais minerais (alumínio, cálcio, fósforo, ferro, magnésio,
manganês e potássio); proteínas (aminoácidos essenciais); glicídios (frutose, glucose, rafinose
e sacarose); lipídeos (óleos essenciais e substâncias ceráceas); celulose; dextrina; sacarina e
gomas (Keys, 1993; Souza et al., 1991; Perez, 1993, Heck et al., 2007).
O consumo de chimarrão, ingerido normalmente em grandes volumes e em alta
temperatura (entre 65°C a 71°C), é um conhecido fator de risco para CE. Existem hipóteses
relacionando a temperatura elevada do mate ao desenvolvimento do processo de
carcinogênese de esôfago (Winge et al., 1995; Kinjo et al., 1998). Por exemplo, o consumo de
grandes quantidades de mate (ao redor de 1,8 L/dia) em temperaturas na ordem de 69,5°C
(~65°C a 71°C) tem sido considerado um fator de risco para desenvolvimento de câncer
esofágico, em especial quando associado a outros fatores de risco bem estabelecidos como
cigarro e álcool (Victora et al., 1990; Prolla et al., 1993).
Existem três prováveis hipóteses relacionando o aumento da incidência de câncer de
esôfago em humanos pelo consumo de mate em altas temperaturas (Victora et al., 1987; Rolón
et al., 1995): 1) a injúria térmica da mucosa esofágica poderia desencadear a liberação de
mediadores inflamatórios que seriam importantes para o desenvolvimento do processo
carcinogênico nesse órgão (Putz et al, 2002); 2) durante o processo de secagem e
processamento das folhas do mate (defumação) ocorreria a produção de substâncias
mutagênicas e/ou carcinogênicas (PHAs) que são potencialmente carcinogênicas para o
esôfago (Zuin et al., 2005; Kamangar et al., 2008); 3) a associação de ambos os fatores
anteriores, citados acima.
3.5.) Dados controversos sobre o consumo do mate
Em um recente estudo experimental, o tratamento com mate reduziu o estresse
oxidativo, o influxo de células inflamatórias e a expressão de MMP-9 e TNF- α no pulmão de
camundongos expostos a fumaça do cigarro (Lanzetti et al., 2008). Desta forma, os resultados
desse experimento sugerem que o mate poderia ser um recurso no tratamento da inflamação
aguda de pulmão em pessoas exposta ao cigarro (Lanzetti et al., 2008).
Alguns estudos recentes apontam para a relação do consumo de mate com o
desenvolvimento de câncer de bexiga, em estudos de casos na Argentina e Uruguai. O
22
consumo de mate ingerido através de uma bomba metálica durante 20 anos foi associado com
câncer de bexiga em pessoas que sempre fumaram, mas não demonstrou o mesmo efeito em
não fumantes. Já o mate cozido (feito através de infusão tradicional da erva), não foi associado
ao desenvolvimento do câncer de bexiga (Bates et al., 2007).
Outro estudo indica que o consumo mate está envolvido no desenvolvimento de câncer
de bexiga, mas os dados ainda são controversos (Stefani et al., 2007; Bates et al., 2007).
Pessoas que bebem grandes quantidades de mate apresentam aumento de risco para o
desenvolvimento de neoplasia de bexiga, principalmente quando associada ao consumo de
cigarros, mas estudos adicionais são necessários para confirmar ou rejeitar esta hipótese
(Stefani et al., 2007).
As folhas de Ilex paraguariensis contem substâncias com atividade antioxidante
(Schinella et al., 2000; Actis-Goretta, et al., 2002; Chandra et al., 2004; Schinella et al., 2005;
Bixby et al., 2005), que inibem a proliferação de células endoteliais (Arbiser et al., 2005) ou
que inibem a atividade da enzima topoisomerase II (Ramirez- Mares et al., 2004; Meijia et al.,
2005). Desta forma, o consumo de erva mate poderia compensar os efeitos deletérios da
temperatura sob a mucosa do esôfago. Experimentos em ratos indicam que a administração
intra-esofágica de água em temperatura superior a 60°C pode potencializar o efeito de
carcinógenos sob o esôfago. Ratos Fischer 344 que receberam administração intra-esofágica
de água a 65°C durante ou após as aplicações de N-nitrosometilbenzilamina (NMBA),
desenvolveram mais neoplasias de esôfago do que os grupos controles de animais que
recebem somente água 65°C ou NMBA (Li et al., 2003). A administração crônica intraesofágica de água a 65°C induziu o aparecimento de sarcomas no esôfago em ratos Wistar
machos tratados com N-metil-N'-nitrosoguanidina (MNNG), um típico carcinógeno para o
estômago de ratos (Yioris et al., 1984). Desta forma, suspeita-se que a alta temperatura em que
é ingerido o mate seja o principal fator de risco para o desenvolvimento de câncer de esôfago.
Existem muitos dados controversos a respeito da mutagenicidade do mate, Segundo
Leitão e Braga (1994) o mate apresentou efeito citotóxico e clastogênico em células de
Escherichia coli e Salmonella typhimurium em cultura. Outro estudo do mesmo grupo
mostrou efeito genotóxico e mutagênico do mate em linfócitos humanos em cultura (Fonseca
et al., 2000). Entretanto, estudos recentes com mate apontam para ausência de efeito
clastogênico ou aneugênico, cromossomos inteiros que não completam a migração anafásica
da divisão celular semelhante à não disjunção, em linfócitos humanos em cultura e efeito
antimutagênico em células hepáticas, renais e de bexiga de camundongos expostas ao
peróxido de hidrogênio (Alves et al., 2008, Miranda et al., 2008).
23
As diferenças dos resultados de mutagenicidade/genotoxicidade do mate poderiam estar
relacionadas às diferentes amostras de mate utilizadas, visto que processo de secagem das
folhas do mate (defumação com contaminação por PHAs) podem ser potencialmente
carcinogênicas para o esôfago (Zuin et al., 2005; Kamangar et al., 2008). As variáveis
agronômicas podem também contribuir para diferenças de composição química das amostras
de mate influenciando nos resultados de experimentos in vitro e in vivo (Jacques et al., 2007 a
e b).
Embora existam alguns estudos que apontam para a relação entre o consumo do mate em
grandes quantidades e em altas temperaturas (chimarrão) e o aumento no risco de
desenvolvimento de carcinoma, outros estudos mostram resultados favoráveis ao uso do mate
devido ao efeito antioxidante dos polifenóis encontrados no mate (Steele, 2003; Wang et al.,
2006; Stoner et al., 2007; Lanzetti et al., 2008).
O efeito cancerígeno do mate sempre foi relacionado às altas temperaturas em que ele é
consumido, mas o desenvolvimento de neoplasias em outros órgãos como rins, pulmão e
bexiga, relacionados ao consumo de mate sugerem a contaminação da erva com compostos
cancerígenos como benzopireno, compostos N-nitrososos e outros, ou da água em que o mate
é preparado (Bates et al., 2007; Stefani et al., 2007). Por exemplo, estudos sobre a composição
química do mate sugerem que o mate pode ter efeito carcinogênico devido aos altos conteúdos
de ácido caféico (Stefani et al., 2007).
3.6.) Modelos de indução de câncer de esôfago em ratos.
Existem vários modelos experimentais em roedores para estudo do processo de
carcinogênese de esôfago. Esses modelos in vivo podem ser divididos em dois grandes grupos,
em decorrência do tipo de neoplasia envolvida: 1) os modelos de indução de carcinomas de
células escamosas (Lehnert et al., 1982; Balansky et al., 2002) e 2) os modelos de indução de
AD e EB sob influência de refluxo gastro/duodeno/esofágico (Seto et al., 1991; Attwood et
al., 1992; Ireland et al., 1996; Goldstein et al., 1997).
Nos carcinógenos químicos (nitrosaminas) mais utilizados na indução química de CE
encontram-se dietilnitrosamina (DEN) (Peto et al., 1991; Salet et al., 2002) e a Nnitrosometilbenzilamina (NMBA) (Wargovich e Imada, 1993; Siglin et al., 1995). Para os
experimentos de carcinogênese química de esôfago a DEN tem sido administrada
preferencialmente pela a via oral e intraperitoneal (Yioris et al., 1984; Wargovich e Imada,
24
1993). A DEN apresenta alta especificidade para o esôfago, induzindo grande número de
tumores em ratos e camundongos, semelhantes aos carcinomas de células escamosas em
humanos (Peto et al., 1991; Aze et al. 1993; Salet et al., 2002). Assim os modelos de
carcinogênese experimental utilizando-se a DEN poderiam ser úteis no estudo de vários
fatores relacionados ao desenvolvimento dessa neoplasia (Aze et al. 1993; Balansky et al.,
1994; 2002).
O CE de esôfago induzido quimicamente em roedores ocorre através do
desenvolvimento de alterações seqüenciais caracterizadas inicialmente por lesões esofágicas
pré-neoplásicas (hiperplasias) e neoplásicas (CE) (Aze et al. 1993, Stoner et al., 2001).
Os modelos animais representam ferramenta essencial para investigar a evolução da
DRGE porque permitem estudar a biologia e evolução dessa doença. Esses modelos têm sido
empregados para mimetizar a doença no ser humano e simplificar estudos sobre os efeitos de
fatores exógenos sobre o sistema digestório (Soren et al., 2003; Piazuelo et al., 2005).
Uma das técnicas cirúrgicas é a anastomose látero-lateral da transição esôfago-gástrica
com uma alça de jejuno. Goldstein et al. (1997) avaliaram o desenvolvimento de lesões
esofágicas em função do tempo em ratos submetidos ao refluxo duodeno-gastroesofágico e
constataram que os animais desenvolveram esofagite leve 3 semanas após a cirurgia; leve a
moderada após 5 semanas, esofagite moderada entre a 9a. e 17 a. semana e esofagite moderada
a severa (EB) entre a 23a. e 31a. semanas após a cirurgia. O AD foi diagnosticado após 30
semanas do procedimento cirúrgico que proporcionou a instalação do refluxo gástrico.
Miwa et al., 2004, observaram em ratos machos Wistar, submetidos à gastrectomia total
e ligação do esôfago com o jejuno, hiperplasia e erosões das células basais do epitélio
escamoso do esôfago, e posteriormente, o desenvolvimento de AD.
25
4. Considerações finais e objetivos
O câncer de esôfago já é enquadrado entre as dez neoplasias mais freqüentes que
acometem o ser humano (Parkin et al., 2001; Stoner et al., 2001; Enzinger e Mayer, 2003;
Kollarova et al, 2007) e, entre as localizadas no trato gastrintestinal, a terceira de maior
incidência (Park et al., 2001). A etiologia de câncer esofágico nas regiões de alto risco (maior
incidência) não foi ainda elucidada.
De acordo com estimativas do INCA 2008 haverá 19,73/100.000 mortes por câncer de
esôfago entre os homens e 7,58/100.000 casos de morte por câncer de esôfago entre as
mulheres. Considerando a crescente incidência mundial de câncer de esôfago, em especial no
Rio Grande do Sul; a importância da identificação de fatores de risco associados à promoção
da carcinogênese de esôfago e a existência de poucos estudos epidemiológicos sobre a
provável relação entre o consumo do mate (chimarrão) em altas temperaturas e o câncer de
esôfago, o presente estudo teve a finalidade de investigar a possível ação da Ilex
paraguariensis no desenvolvimento de pré-neoplasias e neoplasias de esôfago em ratos.
Para determinar os efeitos do mate (Ilex paraguariensis) e da temperatura sobre o processo
de promoção da carcinogênese de esôfago foram realisados os seguintes estudos:
1) avaliar a habilidade da infusão de mate em potenciar ou inibir os efeitos da injúria térmica
(água a 65 0C) no processo de iniciação da carcinogênese de esôfago em animais iniciados
pela DEN;
2) avaliar o potencial diferencial de amostras orgânica e comercial a Ilex paraguariensis em
inibir a carcinogênese de esôfago induzida com a DEN associada a injuria térmica (água a 65
0
C);
3) Comparar os efeitos da infusão de Ilex paraguariensis com a da Camellia sinensis (chá
verde). O chá-verde é a bebida herbal mais consumida no mundo e apresenta efeitos
anticarcinogênicos comprovados em estudos experimentais e em estudos (Yang et al., 2002;
Chung et al., 2003.
26
5. Referências*
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39
6. Artigo científico
Mate tea attenuates DNA damage and carcinogenesis induced by
diethylnitrosamine and thermal injury in the rat esophagus
Trabalho a ser publicado na revista Environment and Molecular Mutagenesis
* Observação: O artigo segue as normas de formatação estabelecidas pela revista em que será
publicado.
40
Mate tea attenuates DNA damage and carcinogenesis induced by
diethylnitrosamine and thermal injury in the rat esophagus
Juliana Ferreira da Silva1, Lucas Tadeu Bidinotto2, Kelly Silva Furtado2, Daisy Maria Fávero
Salvadori2, Maria Aparecida Marchesan Rodrigues2, Luis Fernando Barbisan1,2*
1
UNESP São Paulo State University, Institute of Biosciences, Department of Morphology,
18618-000 Botucatu, SP, Brazil.
2
UNESP São Paulo State University, School of Medicine, Department of Pathology, 18618-000
Botucatu, SP, Brazil.
Running title: mate tea and DNA damage and esophageal carcinogenesis
*Address correspondence to:
Luis Fernando Barbisan, Ph.D.
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP),
18618-000 Botucatu, SP, Brazil.
Telephone/Fax-simile: 55-14-38116264/ e-mail: [email protected]
41
Abstract
Drinking hot mate has been associated with risk for esophageal squamous cell carcinoma
in South America. Thus, the modifying effects of mate tea intake on DNA damage and
esophageal carcinogenesis induced by diethylnitrosamine (DEN) plus thermal injury were
evaluated in male Wistar rats. In the initiation phase, rats were treated with DEN injections (8
x 80 mg/Kg b.w.) plus esophageal thermal injury and concomitantly received mate tea (2.0%
w/v, test group) or green tea (2.0% w/v, positive control group) as the sole source of drinking
fluid for 8 weeks. Any additional treatment was introduced at post-initiation until week 20.
Peripheral blood was collected 4 hr after the last DEN application for comet assay at week 8
and samples from esophagus and liver were collected at weeks 8 and 20. At week 8, mate or
green tea intake itself were non-genotoxic and significantly decreased DNA damage levels in
peripheral blood leucocytes from DEN-treated animals. Also, a significant reduction of cell
proliferation rates in both esophageal epithelium and liver parenchyma and on the number of
putative preneoplastic liver lesions were observed in mate or green tea-treated animals at week
8. A significant lower incidence of esophageal and liver neoplasms and tumor multiplicity was
observed in the groups previously treated with mate or green tea when compared to the DEN
initiated/thermal injury group at week 20. These data indicate that mate tea presented
protective effects against DNA damage and esophageal and liver carcinogenesis induced by
DEN.
Key words: Mate tea, Green tea, DNA damage, diethylnitrosamine-induced esophageal and
liver lesions
42
Introduction
Esophageal cancer is the eight most common human cancer worldwide and ranks sixth
as a cause of cancer mortality (Parkin et al., 2001). Squamous cell carcinoma (SCC) is the
predominant histological type with a variable geographic distribution and occurs at very high
incidence in certain parts of China, Central Asia, Iran, South Africa, South America, France
and Italy (Stoner and Gupta, 2001; Parkin et al., 2001). In Brazil, the highest incidence of
esophageal SCC occurs in the most Southern region, Rio Grande do Sul, with age-adjusted
mortality rates reported as 20.4/100,000/year for men and 6.5/100,000/year for women
(Fagundes et al., 2006). The marked variations in geographical distribution of esophageal SCC
indicate that environmental factors are involved in its pathogenesis (Stoner and Gupta, 2001).
Thus, there is a need to develop effective strategies for the prevention of this malignancy and
the detection of potential risk factors and chemoprevention are potentially viable approaches.
Tobacco and alcohol are the main agents involved in the etiology of esophageal SCC
in Europe and North America, where over 90% of cases can be attributed to these causes
(Parkin et al., 2001). Besides, drinking a local hot beverage has been shown to increase the
risk for development of this malignancy in Uruguay, Paraguay, northeastern Argentina and
southern Brazil (Victora et al., 1990; Pintos et al., 1994; Castelletto et al., 1994; Rolón et al.,
1995;; Castellasagué et al., 2000; De Barros et al., 2000; Sewran et al., 2003; De Stefani et al.,
2003; Goldenberg et al., 2003). Populations from these high risk areas share the habit of
drinking a local tea known by the folk name of “mate”, “yerba mate” or “erva-mate”, an
infusion of dried leaves of the perennial tree Ilex paraguariensis St. Hil., a native species of
South America (Heck and Mejia, 2007). In Brazil, the leaves and stems of mate are used to
prepare different beverages, such as chimarrão (green dried leaves brewed with hot water in a
vessel called ‘cuia’ through a metal straw), tererê (green dried leaves brewed with cold water
in the same kind of vessel and straw) and the mate tea (roasted leaves brewed with hot water
and drank as any other herbal tea) (De Barros et al., 2000; Alves et al., 2008; Miranda et al
2008,). In southeastern South America where the “gaucho” culture is widespread, large
amounts of mate are drunk at high temperatures (65 to 71 0C), placing the oropharynx and
esophagus with very hot fluids (de Barros et al., 2000). This might partially explain the highincidence rates of SCC cancer in this region (Castellsagué et al., 2000; Pütz et al., 2002).
The potential mutagenic/genotoxic of mate aqueous extracts is still controversial. Mate
solutions showed mutagenic activity in different Salmonella typhimurium strains, at
43
concentrations of 20 to 50 mg/plate, and genotoxic activity in the inductest (WP2s (lambda)
strain), with a maximal phage induction at concentrations of 10 to 20 mg/plate (Leitão and
Braga, 1994). Additionally, mate aqueous extracts (range doses 100–750 μg/ml) increased the
frequency of chromosomal aberrations in cultured human peripheral lymphocytes, but was not
clastogenic to bone marrow cells of male Wistar rats (at oral doses up to 2 g/kg) (Fonseca et
al., 2000). Recently, Alves et al. (2008) demonstrated that mate tea was not a clastogenic
or/and aneugenic agent (range doses of 175–1400 μg/ml) for culture of human peripheral
lymphocytes using a cytokinesis-block micronucleus assay in the absence of exogenous
metabolic activation. Also, mate tea intake (0.5, 1.0 or 2.0 g/kg, for 60 days) was non
genotoxic to the liver, kidney and bladder cells from male Swiss mice. Besides, the regular
ingestion of mate tea increased the DNA resistance to H2O2-induced DNA strand breaks and
improved DNA repair after H2O2 challenge in liver cells from male Swiss mice (Miranda et
al., 2008).
Various studies have detected contamination with polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAH) in different samples of commercial mate leaves and hot and cold mate infusions (Zuin
et al., 2005; Kamangar et al., 2008). Also, an increase in urine 1-hydroxypyrene glucuronide
(1-OHPG) levels was detected in healthy subjects with mate drinking habits from Rio Grande
do Sul (Fagundes et al., 2006). Besides the association with upper aerial-digestive cancer,
mate drinking has been associated with cancer development in other organs like the bladder,
which is not influenced by thermal injury (Bates et al., 2007; De Stefani et al., 2007).
Therefore, it is unclear whether the increased risk of esophageal SCC previously attributed to
hot mate consumption is related to thermal injury at which mate is often drunk, or due to
carcinogenic contaminantion, or both (Castellsagué et al., 2000; Pütz et al., 2002; Zuin et al.,
2005; Kamangar et al., 2008).
The purpose of this study was evaluate the modifying influence of mate tea intake on
DNA-damage, assessed by the Comet assay on peripheral blood leukocytes, and the
development of esophageal preneoplastic and neoplastic lesions in male Wistar rats treated
with the carcinogen diethylnitrosamine (DEN) plus esophageal thermal injury by instillation
with hot water 650C. Additionally, positive control groups treated with green tea were
included in this study due to be one of the most common beverages worldwide with
remarkable chemopreventive properties (Yang et al., 2002; Chung et al., 2003).
44
Materials and Methods
Animals and treatments
The animals were handled in accordance with the Ethical Principles for Animal
Research adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). Four-weekold male Wistar rats were obtained from CEMIB (UNICAMP Campinas, SP, Brazil). The
animals were housed in polypropylene cages (four animals/cage) covered with metallic grids
under standard conditions (22 ± 2 0C, 55 ± 10% humidity under a 12-hr light-dark cycle).
They were fed commercial NUVILAB-CR-1 chow (NUVITAL, Curitiba, PR, Brazil) and
water ad libitum for a 2-week acclimation period before beginning the experiment. Samples of
leaves of Ilex paraguariensis St. Hil (mate) and Camelia sinensis (green tea) were generously
supplied by the CentroFlora Group (Botucatu-SP, Brazil).
The animals were randomly allocated into seven groups, consisting of 20 rats in
Groups G1 to G3 and 05 rats in Groups G4 to G7 (Figure 1). Groups 1 to 3 were treated once
a week with intraperitoneal (i.p.) injections of diethylnitrosamine (DEN, Sigma-Aldrich Co.,
St. Louis Mo, USA) (8 x 80 mg/kg of body weight) and received hot water 650C (1ml/rat,
instilled into the esophagus) twice a week for 8 consecutive weeks. This esophageal DEN
initiation and thermal injury protocol was adopted with minor modifications from previously
described protocols (Balansky et al., 1994; Li et al., 2003). Group 4 was treated with DEN and
received water 25 0C (1ml/rat, instilled into the esophagus) twice a week for 8 consecutive
weeks. Groups 5, 6 and 7 received i.p. injections of NaCl 0.9% (DEN vehicle) once a week
and water 250C (1ml/rat) twice a week for 8 consecutive weeks. Concomitantly, the groups
received drinking water (groups G1, G4 and G7) or mate tea (2.0% w/v, groups G2 and G5) or
green tea (2.0% w/v, groups G3 and G6) as the sole source of drinking fluid for 8 weeks. After
the initiation period, animals from groups G1 to G3 received drinking water and food ad
libitum until at week 20. The groups were sacrificed at weeks 8 and 20 by a CO2 atmosphere.
Body weight and food/liquid consumption were measured twice a week during the entire
experimental period. Tea solutions (2.0% w/v) were prepared by adding 20 g of minced leaves
of Ilex paraguariensis or Camelia Sinensis to 1000 ml hot water (70 0C) for 20 min, filtering
and allowed to cool down at room temperature. Tea solutions were prepared daily and offered
ad libitum in dark bottles.
45
Comet assay
Samples of peripheral blood from the periorbital vein plexus were collected from all
groups at 4 hr after the last DEN treatment at week 8 to perform the Comet assay. The singlecell gel electrophoresis assay or Comet assay was performed under alkaline conditions
according to a previously described protocol (Tice et al., 2000). Briefly, 5 µl of each blood
sample were mixed with 120 µl of 0.5% low-melting-point agarose (Invitrogen, Carlsbad,
CA) at 37ºC and layered onto conventional microscope slides, precoated with 1.5% normalmelting-point agarose (Invitrogen). The slides were placed overnight in cold freshly-prepared
lysing solution (1% Triton X-100, 2.5 mM NaCl, 0.1 mM Na2EDTA, 10 mM Tris with 10%
dimethylsufoxide, pH 10.0) and then into a horizontal electrophoresis apparatus containing
alkaline electrophoresis buffer (0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, pH>13) at 4ºC for 20 min.
Using the same buffer, electrophoresis then was performed at 25 V and 300 mA for 20 min.
After electrophoresis, the slides were washed twice for 5 min in neutralizing buffer (0.4 M
Tris-HCl, pH 7.5), fixed for 5 min in absolute alcohol, air-dried, and stored at room
temperature.
Immediately before analysis, the DNA was stained with 50 µl of 20 µg/ml ethidium
bromide. The slides were examined with a 40X objective using an epi-illumined fluorescence
microscope (Olympus-Bx60) attached to a color CCD video camera, and connected to an
image analysis system (Comet II; Perspective Instruments, Suffolk, UK) (Figure 2 A). Coded
slides were scored blindly and 50 blood cells were randomly analyzed for each animal (25
cells per slide from two slides per animal)
Tail intensity (the quantity of DNA in the tail of the comet) and tail moment (product
of DNA density in the tail and the mean distance of DNA migration in the tail) were used to
measure the extent of DNA damage. The comet images with a “cloudy” appearance or a very
small head and a tail like a balloon (necrotic/apoptotic cells) were excluded from the
evaluation under the assumption that they represent dead cells (Hartmann and Speit, 1997).
Tissue processing, histology and immunohistochemical procedures.
At necropsy, the esophagus was excised, opened longitudinally and fixed flat in 4%
phosphate-buffered formalin during 24 hours for paraffin embedding. Serial sections of
esophagus (at least 4-6 strips per animal) were routinely processed. The paraffin blocks were
cut into 5-μm-thick sections and stained with hematoxylin-eosin (HE) for histophatological
analysis or for immunohistochemical analysis of epithelial cell proliferation using
proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (Figure 2 B) (Siglin et al., 1995).
46
The liver was excised, weighted, and representative samples were fixed in 4%
phosphate-buffered formalin during 24 hours for paraffin embedding. The paraffin blocks
were cut into 5-μm-thick sections and stained with HE for histophatological analysis or for
immunohistochemical analysis of preneoplastic hepatocellular lesions positive for glutathione
S-transferase P form (GST-P) and PCNA (Figure 2 C and D) (Ito et al., 1988; Eldridge et al.,
1993).
At week 20, macroscopically visible lesions on the esophageal mucosa and in the liver
were mapped and registered. The classification scheme for esophageal and liver preneoplastic
and neoplastic lesions was based on criteria previously described (Goodman et al., 1994;
Whiteley et al., 1996). Preneoplastic esophageal and liver lesions and tumor yield within each
experimental group were expressed in terms of both incidence and multiplicity.
GST-P and PCNA expression were detected by the avidin-biotin peroxidase complex
(ABC) method. Briefly, deparaffinated 5-μm tissue sections on poly-L-lysine-coated slides
were treated sequentially with 3% H2O2 in phosphate-buffered saline (PBS) for 10 min, nonfat
milk for 60 min, anti-GSTP antibody (clone 311, 1:1000 dilution; MBL laboratory, Tokyo,
Japan) or anti-PCNA antibody (clone PC10, 1:200 dilution; Dako, Glostrup, Denmark)
overnight, biotinylated horse anti-rabbit or anti-mouse IgG (1:300 dilution) for 60 min, and
avidin-biotin-peroxidase solution (1:50 dilution) for 45 min (Elite ABC kit; Vector Laboratory,
Burlingame, CA). Chromogen color development was accomplished with 3,3´-diaminobenzidine
tetrahydrochroride (Sigma). The slides were counterstained with Harris haematoxylin.
GST-P positive lesions and PCNA labeling analysis.
Morphometric analyses of putative preneoplastic hepatocellular lesions (PNL) positive for
GST-P were measured using a Nikon photomicroscope (Microphot-FXA, Tokyo, Japan)
connected to a KS-300 apparatus (Kontron Electronic, Munich, Germany). Liver area was
measured in a special Macro-Stand device (supported by Canon TV zoom lens V6x16/16-100
mm plus a Canon 58 mm close-up 240 lens connected to a CCD black-and-white video
camera module with a Sony DC-777 camera unit) connected to the KS-300. GST-P-positive
PNL were also classified according to two different classes: AFH and hepatic nodules ≤ 3 or >
3 mm in diameter. Data were expressed as number of GST-P-positive PNL per liver area
(lesions/cm2).
47
The PCNA-labeling indices, expressed as a percentage, were calculated by dividing the
number of squamous epithelial cells or hepatocytes with PCNA-labeled nuclei (S phase) by
the total number of cells counted in the each tissue sample (1000 to 2000 cells for esophagus
and 5,000 to 10,000 cells for liver).
Statistical analysis.
Statistical analysis was performed using the Jandel Sigma Stat Software (Jandel
Corporation, San Rafael, CA, USA). The body weight, body weight-gain food and liquids
intake, relative liver weight, PCNA-labeling indices, GST-P-positive data and tumor
multiplicity were analyzed by ANOVA test or the Kruskal-Wallis test. The incidence of
different types of preneoplastic or neoplastic lesions was examined using χ2 test or the
Fischer exact test. Significance was set at P< 0.05.
Results
General findings
Seven animals were found dead during the course of the experiment: three rats from
the DEN/TI-treated group (G1), two rats from the DEN/IT/mate tea-treated group (G2) and
one rat from the DEN/TI/green tea-treated group (G3). A complete necropsy was not
performed due to advanced postmortem changes and/or cannibalism.
Table I shows the mean values of the final body weight, body-weight gain, and, mate
tea, green tea, water and food consumption during the first 8 week. Values of the final body
weight, body-weight-gain and liquid intake were higher for the DEN/TI plus mate or green
tea-treated groups (G2 and G3) than to the DEN/TI and DEN-treated groups (G1 and G4)
(Table I). No differences in relative liver weight were observed among the DEN-treated
groups but the values for alanine aminotransferase (ALT) were lower in mate (G2) and green
tea-treated groups (G3) (P= 0.062 and P < 0.05, respectively). At week 8, the final body
weight, body-weight-gain, ALT levels were significantly different in DEN-treated groups (G1
to G4) when compared to the non-DEN-treated groups (G5 to G7) (P < 0.001).
During the post-initiation phase, food and water consumption did not differ between
the groups (G1 to G3). No differences in final body weight and body-weight gain values were
observed at week 20 (data not shown). Moreover, an increase in relative liver weight values
was detected in DEN/TI-treated group (G1, 5.3 ± 0.7) when compared to the DEN/TI plus
mate or green tea-treated groups (G2 and G3, 4.2 ± 0.5 and 4.1 ± 0.6) (P < 0.001).
48
Genotoxicity data and esophagus and liver analysis at week 8
Figure 3A shows the values obtained in the Comet assay analyses (tail moment and tail
Intensity parameters) on peripheral blood leukocytes evaluated 4 hours after the last DEN
injection. The levels of DNA damage were significantly higher in the DEN-treated groups (G1
to G4) when compared to the non-initiated groups (G5 to G7) (P < 0.001). Mate or green tea
intake itself was non genotoxic (G5 and G6 vs. G7). Significantly decreased levels of DNA
damage were detected in the peripheral blood leucocytes, when these teas were administered
simultaneously with DEN treatment (G2 and G3 vs. G1 and G4, P < 0.001).
Thermal injury regimen induced mild hyperkeratosis and hyperplasia in the squamous
epithelial of esophagus from DEN-treated animals (G1 vs. G4). A significant reduction of
incidence of animals with hyperkeratosis/hyperplasia (40 and 50%) and in cell proliferation
rates in esophageal epithelium were observed in mate or green tea-treated animals (G2 and G3
vs. G1) at the end of DEN treatment and thermal injury regimens (Figure 3B).
GST-P positive hepatocellular lesions were observed only in DEN-initiated groups (G1
to G4). The number of preneoplastic lesions (PNL > 3 mm) was significantly lower in mate or
green tea-treated groups (G2 and G3) when compared to the DEN/TI group (G1).
Mate or green tea treatments per si did not cause any histological changes in the
esophageal epithelium or in the liver parenchyma in the non-initiated groups (G5 and G6 vs.
G7).
Esophagus and liver histopathological analysis at week 20
Table II summarizes the incidence data of histologically-diagnosed esophagus and
liver preneoplastic and neoplastic lesions and tumor multiplicity. Specially, there was a
reduction on the incidence of esophageal dysplastic lesions in DEN/TI plus green tea group
(G3) (Figure 4A) and esophageal papilloma (Figure 4B) and hepatic adenoma in DEN/TI plus
mate or green tea-treated groups (G2 and G3) when compared to the DEN/TI-treated group
(G1) (P = 0.054; P < 0.04 and P < 0.09, respectively). The morphology of the hepatocellular
carcinomas (Figure 4C) was more undifferentiated in DEN/TI group (G1) that in the groups
receiving mate or or green tea (G2 and G3). Cholangiocellular neoplasms (Figure 4D) were
detected only in DEN/TI group. Also, tumor multiplicity for both esophagus and liver
neoplasms was lower among the groups receiving mate or green tea (G2 and G3) when
compared to the DEN/TI-treated group (G1) (P < 0.05).
49
Discussion
The results described herein indicate that mate tea intake reduced the levels of DNA
damage in peripheral blood leukocytes and esophageal carcinogenesis induced by
DEN/thermal injury protocol in male Wistar rats. Besides, liver carcinogenesis was also
inhibited in the DEN-initiated group receiving concomitantly mate tea. The protective effects
of mate tea on chemically-induced DNA damage and carcinogenesis were similar to the
observed in the positive control group treated with green tea. In fact, green tea or their specific
catechins have been proved to inhibit DNA damage and carcinogenesis in rodents and human
(Yang et al., 2002; Chung et al., 2003).
Experimental and epidemiological studies have supported the role of thermal injury on
the promotion of esophageal carcinogenesis (Yioris et al., 1983; Kinjo et al., 1998;
Castellsagué et al., 2000; Li et al., 2003; Sewram et al., 2003). The consumption of hot
beverages can provoke changes in esophageal epithelium that could increase the risk of
damage from contact with refluxed gastric/duodenal contents or others potential carcinogens
(Tobey et al., 1999; Yang et al., 2002; Pütz et al., 2002; Li et al., 2003). Besides, chronic
exposure to high luminal temperature can result in an inflammatory process that may led to
the formation of nitrosamines and free radicals able to initiate and/or promote the esophageal
carcinogenesis process (Pütz et al., 2002). The thermal injury protocol used in this study
resulted in an increase in the rates of cell proliferation, a well established parameter for cancer
risk development on esophageal epithelium from DEN-treated animals (group G1 vs. group
G4). Moreover, Li et al. (2003) showed that thermal injury abolished the inhibitory effects of
epillocatechin-3 gallate from green tea against esophageal carcinogenesis process induced by
N-nitrosomethylbenzylamine in male Fisher 344 rats. In contrast, using a more suitable
thermal injury protocol, our findings indicate that the morphological and proliferative changes
induced by thermal injury were attenuated by treatment with mate or green tea.
Various chemicals with antioxidant properties have been found to inhibit chemicallyinduced mutagenesis and carcinogenesis in different animal models (Kelloff, 2000; De Flora
et al., 2001). In the present study, we have observed that the treatment with mate or green tea,
during the initiation phase of carcinogenesis, significantly reduced the levels of DNA damage
induced
by
DEN
in
peripheral
blood
cells.
Since
mate
has
demonstrated
antimutagenic/antigenotoxic and antioxidant properties (Schinella et al., 2000; Actis-Goretta
et al., 2002; Bracesco et al., 2003; Bixiby et al., 2005; Miranda et al., 2008), this tea-like
50
beverage could be classified as a potential chemopreventive agent against DNA damage
(Kelloff, 2000; De Flora et al., 2001). On the other hand, we have examined the possible
adverse effects of mate tea per si on male Wistar rats since it has been reported that
contamination of carcinogenic PAHs can occur in mate leaves or their infusions (Zuin et al.,
2005; Kamangar et al., 2008), Importantly, rats receiving mate tea for two months did not
present any adverse effect, as indicated by unaltered body and liver weights, transaminase
levels, esophagus and liver morphology and cell proliferation indices. Also, mate tea treatment
per si was not able to induce DNA damage in blood cells by the comet assay analysis. Similar
results have been observed by Miranda et al (2008) that showed that mate tea, administered at
0.5, 1.0 or 2.0 g/kg for two months, was non genotoxic to the liver, kidney and bladder cells
from male Swiss mice. This care with toxicity should be taken into account if safety measures
for public health are to be implemented in response to increased ingestion of this tea-like
beverage by human populations of Southern America (Heck and de Mejia, 2007).
The exact mechanisms involved in the protective effects of mate tea against DNA
damage and carcinogenesis are not clearly understood. The inhibitory action of mate tea could
be explained by its putative antioxidant activity or their modifying influence on
mutagenic/carcinogenic metabolic pathways. It has been reported that DEN biotransformation
produces 8-hydroxyguanine (8-OHG), a parameter of oxidative DNA damage that play a role
on the initiation step of carcinogenesis (Verna et al., 2002). Besides, mate tea was found to
induce quinone reductase activity, a surrogate marker of phase II enzymes, in Hepa1c1c7
murine hepatoma cell line (Chandra and De Mejia Gonzalez, 2004). Therefore, it could be
suggested that mate tea intake during initiation phase with DEN might provide a protective
effect against mutagenesis and carcinogenesis, since a possible increase on phase II enzymes
could imply the elimination of DEN electrophilic metabolites which would be able to
covalently bind to DNA (DNA alkylation) leading to mutations (Verna et al., 2002).
Moreover, the free radical scavenger properties could explain the protective effect of this
herbal tea on the oxidative DNA damage induced by DEN metabolites, thus reducing the
deleterious effects of this carcinogen on their targets. Therefore, an association between phase
II enzyme induction and antioxidant properties could be responsible for the reduction of DNA
damage and the development of preneoplastic and neoplastic lesions induced by DEN. Also,
as mate tea has been shown to induce cell totoxicity in HepG2 human hepatocellular cancer
and SCC-61 and OSCC-3 squamous cancer cell lines, this herbal tea may be useful for the
51
prevention of tumor promotion and progression probably due to the inhibitory activity on
topoisomerase II enzyme (Ramirez-Mares et al., 2004, Gonzales de Mejia, et al., 2005),.
In conclusion, the results of the present study indicate that mate tea intake presented
inhibitory effects against DNA damage and rat esophageal and liver carcinogenesis induced
by DEN. Our findings are of potential interest for their possible application on human cancer
chemoprevention. The underlying mechanism(s) of chemoprevention of mate tea on
mutagenesis and carcinogenesis should be further investigated.
Acknowledgements
This study was supported by CAPES and TOXICAM.
52
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58
Table I – Body weight, food and liquid consumption, relative liver weight (RLW) and alanine aminotransferase (ALT) levels at week 81.
Number
Group/Treatment 2
of rats
Body Weight
Consumption
Final
Gain
Liquid
Food
(g)
(g)
(ml/rat/day)
(g/rat/day)
RLW
ALT
(%)
(U/L)
Initiated groups
(G1) DEN+TI
20
260.8 ± 29.5
†**
59.1 ± 24.1
28.9 ± 8.2
†**
18.3 ± 5.4
2.9 ± 0.7
88.6 ± 14.8
†**
(G2) DEN+TI+ Mate tea
20
296.8 ± 32.8
97.6 ± 27.6
33.6 ± 8.1
18.8 ± 4.1
2.8 ± 0.3
69.6 ± 8.1§
(G3) DEN+TI+ Green tea
20
317.2 ± 31.2†,‡**
118.4 ± 28.8†,‡**
34.8 ± 7.7†**
19.7 ± 4.9
2.8 ± 0.4
63.6 ± 9.8†*
(G4) DEN
05
266.8 ± 27.8
82.4 ± 24.3
30.6 ± 8.0
17.2 ± 4.1
2.7 ± 0.4
85.4 ± 19.5
(G5) Mate tea
05
380.8 ± 36.5†**
188.0 ± 30.8†**
37.0 ± 7.0
23.3 ± 2.3
3.7 ± 0.4
55.8 ± 10.2†**
(G6) Green tea
05
394.4 ± 28.0†**
198.6 ± 29.6†**
34.6 ± 6.9
23.0 ± 3.8
3.8 ± 0.3
58.8 ± 7.3†**
(G7) Control
05
380.2 ± 32.4†**
177.0 ± 30.1†**
34.0 ± 7.6
22.5 ± 2.5
3.6 ± 0.4
57.6 ± 14.2†**
Non-initiated groups
1
Values are mean ± SD; 2DEN = diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p. once a week) and TI= Thermal injury, hot water 650C (1ml/rat,
p.o, twice a week) for 8 consecutive weeks;
†‡
, Different from G1 and G4 groups or G2 group, respectively. *P < 0.05 or ** P < 0.001. § Trend 0.05 < P < 0.1
58
59
Table II– Incidence (%) of preneoplastic and neoplastic lesions in esophagus and liver and tumor
multiplicity (mean ± SD) at week 20.
Group/Treatment 1
Parameters
G1
DEN+TI
G2
G3
DEN+TI+Mate tea DEN+TI+Green tea
12
13
14
Dysplasia
8 (67)
6 (46)
3 (21) §
Papilloma
7 (58)
2 (14)†*
1 (7)†**
CCF/ECF
11 (92)
13 (100)
13 (93)
BCF
6 (50)
8 (62)
7 (50)
Adenoma
8 (67)
1 (8)†**
1 (7)**
HCC
4 (33)
2 (14)
1 (7)
Cholangioma
1 (8)
0
1 (7)
Cholangiocarcinoma
1 (8)
0
0
Mixed
3 (25)
3 (23)
0
4.09 ± 1.81 (34) 4
1.67 ± 0.82 (10)*
1.50 ± 0.55 (9)*
Number of rats
Esophagus
Liver 2
Tumor multiplicity 3
1
DEN = diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal injury, hot water
650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks; 2Prenoplastic lesions with the following
phenotypes: CCF/ECF, clear cell/eosinophilic cell foci or BCF, basophilic cell foci; HCC=
Hepatocellular carcinoma, Mixed= Hepatocholangioma or hepatocholangiocarcinoma; 3 Mean
number of tumors in rat bearing-tumor; 4 Total number of esophagus and liver tumors/group.
†
Different from G1 group, *P < 0.05 or **P < 0.001; § P= 0.054, trend for G1 group.
59
60
Legends for Figures
Figure 1- Experimental protocol (details in Material and Methods section)
Figure 2- A) Comet image of peripheral blood leukocytes from a DEN-treated group (G4)
animal (40x objective); B) Epithelial cells positive for PCNA (dark nuclei) in
esophagus from a DEN/TI-treated group (G1) animal (40 x objective); C)
Preneoplastic lesion positive for GST-P in the liver from a Group DEN/TI plus
mate tea (G2) animal (20 x objective); D) Hepatocytes positive for PCNA (dark
nuclei) in the liver from a DEN/TI-treated group (G1) animal (40x objective). DEN
= diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal
injury, hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks.
Figure 3- Effects of mate tea intake on DNA damage levels in peripheral blood leukocytes and
development of hepatocellular lesions: A) Data on tail moment and tail Intensity
using the comet assay; B) Number of preneoplastic lesions (PNL) positive for
GSTP per liver area (PNL/cm2) divided into two different size classes. G1=
DEN/TI-treated group, G2= DEN/TI plus mate tea group, G3= DEN/TI plus green
tea group, G4= DEN-treated group, G5= mate tea group (G5), G6= green tea group
(G6) and G7= non-treated group. DEN = diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w.,
i.p., once a week) and TI= Thermal injury, hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a
week) for 8 consecutive weeks.
†, ‡, #
Different from G1 group, G1 and G4 groups and G1 to G4 groups, respectively.
* P < 0.05, ** P < 0.001, §. P= 0.065, trend for G1 group.
Figure 4- Effects of mate tea intake on PCNA labeling index in the esophagus and liver in the
different groups. G1= DEN/TI-treated group, G2= DEN/TI plus mate tea group,
60
61
G3= DEN/TI plus green tea group, G4= DEN-treated group, G5= mate tea group
(G5), G6= green tea group (G6) and G7= non-treated group. DEN =
diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal injury,
hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks.
†, ‡, #
Different from G1 group, G1 and G4 groups and G1 to G4 groups,
respectively. * P < 0.05, ** P < 0.001.
Figure 5- Morphological phenotypes of the lesions in the esophagus and liver diagnosed at
week 20. A-B) Displastic squamous lesion and papilloma in the esophageal
mucosa from DEN/TI-treated group animals (10x and 20x objective, respectively)
and C-D) Poorly differentiated hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma
in the liver from DEN/TI-treated group animals (40x objective). DEN =
diethylnitrosamine (8 x 80 mg/kg b.w., i.p., once a week) and TI= Thermal injury,
hot water 650C (1ml/rat, p.o., twice a week) for 8 consecutive weeks.
61
62
1
Group
2
7
8
9
11
10
17
18
19
20 Week
s
s
s
s
s
s
n= 20
1
n=20
2
n= 20
3
s
4
5
n= 05
s
n= 05
NaCl 0.9%, 8 x 5ml/kg, i.p.
Water 250C, 1ml/rat, p.o.
DEN, 8 x 80 mg/kg, i.p.
Hot water 650C, 1ml/rat, p.o.
s
n = Number of rats
Mate tea 2.0% in drinking water
6
n= 05
s
s = Sacrifice
Green tea 2.0% in drinking water
7
n= 05
Figure 1
62
63
A
B
C
D
Figure 2
63
64
A
15.0
†**
†**
10.0
#** #** #**
5.0
Tail moment
5.0
DNA damage levels
DNA damage levels
Tail intensity
20.0
4.0
3.0
2.0
†**
†**
#**
1.0
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 Group
#** #**
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 Group
B
Number of AFH/cm2
70.0
PNL = 0.3mm
PNL > 0.3mm
All
60.0
§
50.0
§
40.0
30.0
20.0
†*
10.0
G1 G2 G3 G4
†,‡*
G1 G2 G3 G4
Figure 3
64
G1 G2 G3
G4
Group
PCNA labeling index (%)
65
Esophagus
70.0
60.0
50.0
†*
40.0
†*
†*
†*
†*
G5
G6
G7
30.0
20.0
10.0
G1
PCNA
P
CNA lab
labe
eling index (%)
†*
G2
G3
G4
Group
Liver
12.0
10.0
8.0
†,‡*
6.0
†,‡*
4.0
2.0
G1
G2
G3
G4
Figure 4
65
#**
#**
G5
G6
#**
G7
Group
66
A
B
C
D
Figure 5
66
67
7. Conclusões Finais
1) A ingestão de mate apresentou efeitos benéficos contra a ação mutagênica/carcinogênica da
DEN em animais submetidos ao protocolo de injúria térmica. Esses efeitos foram similares ao
do chá-verde, embora as folhas de mate não apresentem catequinas em sua composição (Heck
and de Mejia, 2007).
2) A ausência de genotoxicidade do mate em leucócitos de sangue periférico de ratos Wistar,
poderia ser indicativo de ausência de contaminação por PHAs. A análise de resíduos de
pesticidas e de contaminação por PHAs na amostra utilizada neste estudo enriqueceria os
nossos resultados e conclusões.
3) A ingestão de mate sem resíduos de PHAs e em temperaturas mais amenas ou mesmo
gelado (tererê) poderia trazer efeitos benéficos a saúde humana inclusive retardando o
aparecimento de doenças crônico-degenerativas como o câncer
Perceptivas futuras
1) Avaliar os efeitos da ingestão de mate sobre a expressão das enzimas de biotransformação
da DEN no esôfago (CYP 2A3) e fígado (CYP 2E1) através da análise por Western blot e/ou
RT-PCR.
2) Avaliar os efeitos da ingestão de mate na fase de pós-iniciação da carcinogênese de esôfago
e hepática induzida pela DEN.
67