SOBREVIVÊNCIA DE Xanthomonas campestris PV. campestris NO

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
SOBREVIVÊNCIA DE Xanthomonas campestris PV. campestris NO
SOLO, NO FILOPLANO E NA RIZOSFERA DE PLANTAS
DANINHAS
JOÃO CÉSAR DA SILVA
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP Campus de Botucatu, para obtenção do
título de Mestre em Agronomia (Proteção
de Plantas).
BOTUCATU – SP
Novembro – 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
SOBREVIVÊNCIA DE Xanthomonas campestris PV. campestris NO
SOLO, NO FILOPLANO E NA RIZOSFERA DE PLANTAS
DANINHAS
JOÃO CÉSAR DA SILVA
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Maringoni
Co-orientador: Prof. Dr. Tadeu Antônio Fernandes da Silva Júnior
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP Campus de Botucatu, para obtenção do
título de Mestre em Agronomia (Proteção
de Plantas).
BOTUCATU – SP
Novembro – 2015
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO – DIRETORIA TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP –
FCA – LAGEADO – BOTUCATU (SP)
S586s
Silva, João César da, 1991Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris
no solo, no filoplano e na rizosfera de plantas daninhas /
João César da Silva. – Botucatu : [s.n.], 2015
x, 62 f.: fots. color., tabs.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2015
Orientador: Antonio Carlos Maringoni
Coorientador: Tadeu Antônio Fernandes da Silva Júnior
Inclui bibliografia
1. Xanthomonas campestris. 2. Plantas invasoras. 3. Solos. 4. Bactérias. 5. Fitopatologia. I. Maringoni, Antonio
Carlos. II. Silva Júnior, Tadeu Antônio Fernandes da. III.
Univer- sidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
(Campus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronômicas.
IV. Título.
III
“Seu trabalho vai preencher uma parte grande da sua vida, e a única maneira de ficar
realmente satisfeito é fazer o que você acredita ser um ótimo trabalho. E a única maneira
de fazer um excelente trabalho é amar o que você faz. ”
Steve Jobs
IV
Aos meus pais Juarez e Ivonete, a meu irmão André e a minha avó Alzira.
DEDICO
V
AGRADECIMENTOS
Ao meu bom Deus que ilumina meu caminho;
Aos meus pais Juarez Francolino da Silva e Ivonete Lourencetti da
Silva, pelo amor incondicional, apoio, paciência e compreensão durante meus estudos;
Ao meu irmão André Luiz da Silva, sua namorada Bruna Stephanie
Rossi Soares e a minha avó Alzira Mantovani Lourencetti, pelo apoio e incentivo;
Aos meus avós Agenor Lourencetti, Elisiário Francolino da Silva e
Mariana Rosa da Silva (in memorian), pelas lições deixadas em vida e por terem me amado
até o último minuto de suas vidas;
A todos meus familiares, pelo reconhecimento, amizade e suporte
oferecido sempre que necessário;
Ao professor e orientador Antonio Carlos Maringoni, pela
oportunidade, confiança, paciência, incentivo e ensinamentos;
Ao co-orientador Tadeu Antônio Fernandes da Silva Júnior, pela
amizade, ensinamentos, incentivo e pela grande contribuição na realização desse trabalho;
A todos os professores do Departamento de Proteção Vegetal, em
especial a professora Renate Krause Sakate, pela amizade, apoio e ensinamentos;
Aos amigos do Laboratório de Bacteriologia Vegetal, Ricardo
Marcelo Gonçalves e José Marcelo Soman, pela ajuda na realização dos trabalhos, pelas
opiniões e conselhos;
A todos os amigos da Faculdade de Ciências Agronômicas, Bruna
Favetti, Bruno de Marchi, Cristiana Araújo, Daiana Bampi, David Spadotti, Djanira
Negrão, Érika Correia, Evelynne Urzedo, Guilherme Gotardi, Isabela Seixo, Júlio
Marubayashi, Laís Fontana, Letícia Moraes, Leysimar Pitzr, Luis Watanabe, Martha
Passador, Milena Leite, Mônika Fecury, Paula Leite e Vinicius Bello, obrigado pela grande
amizade, apoio, ensinamentos, companhia e pela ajuda muitas vezes prestada;
Aos estagiários, Bianca Gêa, Bruna Faria, Marcos Roberto, Thiago
Tomasini e Thiago Benetom, pela amizade, momentos compartilhados e pela ajuda
imprescindível;
Aos funcionários do Departamento de Proteção Vegetal, pela
amizade e apoio prestado;
VI
Aos amigos de longa data, Alisson Fernando, Gilson Pereira, Diego
Frutuoso e Lilian Utraga, pela amizade e companhia em todos os momentos;
À Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” por
todo o apoio institucional e disponibilidade da estrutura;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de Mestrado;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP), pelo auxílio financeiro da presente pesquisa.
VII
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ IX
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... X
1 RESUMO ........................................................................................................................... 1
2 SUMMARY ....................................................................................................................... 3
3 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 4
4 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 6
4.1 Podridão negra das brássicas ...................................................................................... 6
4.2 Sobrevivência de bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas no solo, com
ênfase em Xanthomonas campestris pv. campestris ....................................................... 11
4.3 Sobrevivência de bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas associadas ao
filoplano de plantas daninhas. ......................................................................................... 14
4.4 Sobrevivência de bactérias fitopatogênicas associadas a rizosfera de plantas
daninhas .......................................................................................................................... 18
5 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................. 21
5.1 Isolado bacteriano, condição de cultivo e preservação ............................................. 21
5.2 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em condições de
campo .............................................................................................................................. 22
5.2.1 Épocas de instalação dos experimentos ............................................................ 22
5.2.2 Área experimental e amostragem do solo ......................................................... 22
5.2.3 Processamento das amostras de solo coletadas ................................................. 23
5.3 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em condições
controladas ...................................................................................................................... 23
5.3.1 Amostragem do solo ......................................................................................... 23
5.3.2 Instalação do experimento, delineamento experimental e processamento das
amostras de solo coletadas ......................................................................................... 24
5.4 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera
de plantas daninhas ......................................................................................................... 25
5.4.1 Obtenção das plantas daninhas.......................................................................... 25
5.4.2 Épocas de instalação dos experimentos ............................................................ 25
5.4.3 Instalação dos experimentos e processamento das amostras ............................ 26
VIII
5.4.4 Preservação e caracterização dos isolados bacterianos ..................................... 28
6 RESULTADOS ................................................................................................................ 29
6.1 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em condições de
campo .............................................................................................................................. 29
6.2 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em condições
controladas ...................................................................................................................... 31
6.3 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera
de plantas daninhas ......................................................................................................... 31
6.3.1 Caracterização dos isolados bacterianos ........................................................... 36
7 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 39
7.1 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em condições de
campo e controladas........................................................................................................ 39
7.2 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera
de plantas daninhas ......................................................................................................... 41
8 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 45
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 46
APÊNDICE ......................................................................................................................... 56
IX
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Propriedades físico-químicas dos solos utilizados nos experimentos de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris................................................ 24
Tabela 2. Plantas daninhas utilizadas na avaliação da capacidade de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera (Experimento 1). ........ 27
Tabela 3. Plantas daninhas utilizadas na avaliação da capacidade de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera (Experimento 2). ......... 27
Tabela 4. Plantas daninhas utilizadas na avaliação da capacidade de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera (Experimento 3). ......... 27
Tabela 5. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv.
campestris (ufc/g de solo seco) associado ao solo sob condições de campo em cinco
experimentos durante o ano de 2014. ................................................................................. 30
Tabela 6. Temperatura máxima e mínima (ºC), precipitação (mm) e umidade do solo (%)
em diferentes períodos, durante a condução dos experimentos de sobrevivência do isolado
3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo sob condições de campo. .... 30
Tabela 7. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv.
campestris (ufc/g de solo seco) associado ao solo sob condições controladas. ................ 31
Tabela 8. Períodos de sobrevivência do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv.
campestris em dias, após a inoculação do filoplano e rizosfera de plantas daninhas........ 32
Tabela 9. Temperatura máxima e mínima (ºC), umidade do solo (%), precipitação (mm), e
umidade relativa (%) em diferentes períodos, durante a condução do experimento de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 1). ..................................................................................... 34
Tabela 10. Temperatura máxima e mínima (ºC), umidade do solo (%), precipitação (mm),
e umidade relativa (%) em diferentes períodos, durante a condução do experimento de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 2). ..................................................................................... 35
Tabela 11. Temperatura máxima e mínima (ºC), umidade do solo (%), precipitação (mm) e
umidade relativa (%) em diferentes períodos, durante a condução do experimento de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 3). ..................................................................................... 36
X
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Hidrólise positiva de amido para Xanthomonas campestris pv. campestris, a
partir do filoplano de Cyperus rotundus (T1) e Raphanus raphanistrum (T2). ................ 37
Figura 2. Teste de patogenicidade em folhas destacadas de couve. T- Testemunha negativa;
Xanthomonas campestris pv. campestris provenientes de plantas daninhas inoculadas; T1
–
Cyperus rotundus; T2 – Raphanus raphanistrum; T3 – Sonchus oleraceus; T4 –
Lepidium virginicum; T5 – Senna obtusifolia; T6 – Physalis angulata; T7 – Portulaca
oleraceae; T8 – Amaranthus viridis; T9 – Conyza bonariensis. ........................................ 37
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1% resultante das amplificações dos isolados de
Xanthomonas campestris pv. campestres utilizando iniciadores específicos. MM Marcador Molecular, 1Kb Plus Invitrogen®; CP - Controle positivo, isolado 3098C; CNControle negativo; Xanthomonas campestris pv. campestris provenientes de plantas
inoculadas; T1 –
Cyperus rotundus; T2 – Raphanus raphanistrum; T3 – Sonchus
oleraceus; T4 – Lepidium virginicum; T5 – Senna obtusifolia; T6 – Physalis angulata; T7
– Portulaca oleraceae; T8 – Amaranthus viridis; T9 – Conyza bonariensis; T10 –
Commelina benghalensis. .................................................................................................... 38
1
1 RESUMO
A podridão negra, incitada por Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), é
considerada a doença bacteriana mais destrutiva das brássicas em muitos países, podendo
promover consideráveis reduções na produtividade. O estudo dos nichos ecológicos de
sobrevivência de bactérias fitopatogênicas possui grande importância no manejo de
fitobacterioses, uma vez que uma pequena quantidade de inóculo sobrevivente entre os
ciclos de cultivo pode ser suficiente para iniciar uma nova epidemia no campo. Baseado
nisso, o presente trabalho avaliou a sobrevivência de Xcc em diferentes ensaios, através da
utilização do isolado 3098C de Xcc resistente a 100 µg/mL de rifampicina. A
sobrevivência de Xcc na forma de células livres no solo foi avaliada em cinco
experimentos, desenvolvidos em condições de campo, entre maio e agosto de 2014. Em
condições controladas¸ foram utilizados seis tipos de solo, amostrados de diferentes áreas
com cultivo ou não de brássicas. A colonização do filoplano e rizosfera de 26 espécies de
plantas daninhas por Xcc também foi avaliada em experimentos de campo, entre agosto de
2014 a outubro de 2015. Nos experimentos de campo, Xcc sobreviveu entre 4 e 7 dias no
solo, sendo influenciada diretamente pela temperatura e umidade, ocorridas durante os
experimentos. Em condições controladas, a bactéria sobreviveu de 10 a 24 dias, sendo
esses períodos influenciados pela textura, pH e teor de matéria orgânica em cada tipo de
2
solo. Na rizosfera das plantas daninhas, Xcc apresentou baixa capacidade de sobrevivência,
tendo sobrevivido por no máximo 28 dias em Raphanus raphanistrum. No filoplano, Xcc
foi capaz de sobreviver por mais de 42 dias em Lepidium virginicum, e por até 70 dias em
Raphanus raphanistrum. Plantas daninhas das famílias Poaceae e Amaranthaceae não
demonstraram potencial para a sobrevivência epifítica de Xcc.
Palavras-chave: Podridão negra, sobrevivência, solo, plantas invasoras.
3
SURVIVAL OF Xanthomonas campestris PV. campestris IN SOIL, PHYLLOPLANE
AND RHIZOSPHERE OF WEEDS. Botucatu, 2015. 62 p. Dissertação (Mestrado em
Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual “Julio de Mesquita Filho” – UNESP.
Author: JOÃO CÉSAR DA SILVA
Adviser: Prof. Dr. ANTONIO CARLOS MARINGONI
Co-Adviser: Prof. Dr. TADEU ANTÔNIO FERNANDES DA SILVA JÚUNIOR
2 SUMMARY
Black rot, incited by Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), is the most destructive
bacterial disease of brassicas in many countries, and can promote substantial reductions in
productivity. The study of survival ecological niches of phytopathogenic bacteria has great
importance in the management of plant bacteriosis, since a small amount of inoculum
surviving among the cultivation cycle may be sufficient to initiate a new outbreak in the
field. Based on this, this study evaluated the survival of Xcc in different experiments using
Xcc strain 3098C, resistant to 100 µg/mL of rifampicin. The survival of Xcc as free cells in
the soil was evaluated in five experiments, carried out in field conditions, between May
and August, 2014. Under controlled conditions, six types of soil were used, sampled from
different areas, with or without brassicas cultivation. The colonization of phylloplane and
rhizosphere of 26 weed species by Xcc was also evaluated in field experiments, between
August, 2014 and October, 2015. In field experiments, Xcc survived between 4 and 7 days
in the soil, being directly influenced by temperature and humidity that occurred during the
experiments. Under controlled conditions, the bacteria survived for 10 to 24 days, and
these periods were influenced by texture, pH and organic matter content in each soil type.
In weeds rhizosphere, Xcc had low capacity to survive, at most 28 days on Raphanus
raphanistrum. In phylloplane, Xcc survived more than 42 days in Lepidium virginicum,
and up to 70 days in Raphanus raphanistrum. Weeds from Amaranthaceae and Poaceae
families did not show potential for the epiphytic survival of Xcc.
Keywords: Black rot, survival, soil, invasive plants.
4
3 INTRODUÇÃO
A família Brassicaceae inclui muitas espécies hortícolas de grande
importância econômica. Dentre elas, Brassica oleracea L. var. capitata (repolho), B.
oleracea L. var. italica (brócolis), B. oleracea L. var. botrytis (couve-flor), B. oleracea L.
var. acephala (couve-de-folha), B. oleracea L. var. tronchuda (couve-trunchuda), B.
oleracea L. var. gemmifera (couve-de-bruxelas), B. rapa L. var. pekinensis (couvechinesa), B. juncea L. (mostarda) e Raphanus sativus L. (rabanete) são as mais cultivadas
(DIXON, 2006; MICHEREFF et al., 2012). A produção mundial de brássicas na safra de
2013 foi de aproximadamente 94 milhões de toneladas, ocupando uma área de 3,7 milhões
de hectares (FAO, 2015). No Brasil foram produzidas mais de 87 mil toneladas nesse
período, destacando-se os cultivos de brócolis, couve, couve-flor e repolho
(HORTIFRUTI, 2015).
Entre os fatores que afetam a produtividade, a ocorrência de
doenças possui significativa importância, principalmente bacterioses como a podridão
negra, incitada por Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Essa doença que
apresenta distribuição mundial é responsável por debilitar a planta, podendo conduzi-la à
morte em regiões quentes e úmidas, principalmente se a cultivar for extremamente
suscetível. Em regiões temperadas e costeiras, as lesões amarelas cloróticas em formato
5
“V” nas margens das folhas, típicas da doença, depreciam o produto comercializado em
folhas frescas, causando redução do seu valor no mercado. O controle dessa bacteriose é
difícil e depende do emprego de material propagativo sadio para plantio isento do
patógeno, a eliminação de fontes de inóculo e o emprego de cultivares resistentes.
Para a eliminação de fontes de inóculo é necessário conhecer os
nichos de sobrevivência do agente causal, uma vez, que uma pequena quantidade de
inóculo sobrevivente entre os ciclos de cultivo pode ser suficiente para que inicie a
epidemia no campo. Bactérias fitopatogênicas podem sobreviver associadas a sementes,
plantas hospedeiras perenes ou estruturas propagativas, insetos, resíduos vegetais, no solo
como populações residentes, na superfície ou interior de plantas cultivadas ou plantas
daninhas (SCHUSTER; COYNE, 1974; OKECHUKWU; EKPO, 2008).
No Brasil, há poucos estudos sobre ecologia de bactérias
fitopatogênicas, e até o presente momento não foram publicados trabalhos referentes aos
nichos de sobrevivência de Xcc. Dessa maneira, o presente trabalho teve por objetivo
avaliar a capacidade de sobrevivência de Xcc no solo, sob condições de campo e
controladas, assim como também, no filoplano e rizosfera de plantas daninhas, sob
condições de campo, trabalho esse, que contribuirá para que novas práticas sejam
adotadas para o manejo mais eficiente da podridão negra nas condições brasileiras.
6
4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 Podridão negra das brássicas
A podridão negra, causada por Xanthomonas campestris pv.
campestris (Pammel) Dowson (Xcc), foi descrita pela primeira vez por Garman em 1890,
como uma doença de repolho em Lexington, Kentucky (ALVAREZ, 2000). Em 1895,
Pammel comprovou a natureza parasitaria da doença, atribuindo o nome de Bacillus
campestris à bactéria que estava causando doença em couve-nabo e nabo no estado de Iowa,
EUA (VICENTE; HOLUB, 2013). Russell, na década de 1890, também concluiu que essa
bactéria era a responsável por destruir campos de repolho ao Sudeste Wiscosin (WILLIAMS,
1980). Desde então, esta doença tem sido relatada em todas as regiões do mundo onde se
cultivam brassicáceas (ALVAREZ; CHO, 1978; SCHAAD; THAVEECHAI, 1983;
MASSOMO et al., 2003; MIRIK et al., 2008; JENSEN et al., 2010; POPOVIĆ et al.,
2013).
Segundo Bradbury (1986) e Alvarez (2000), a podridão negra é
mais frequente em Brassica oleracea (incluindo repolho, brócolis, couve, couve-flor e
couve-de-bruxelas), mas também ocorre em rabanete, brássicas ornamentais, plantas
daninhas e Arabidopsis thaliana. Quanto às condições climáticas, assim como em muitas
7
doenças bacterianas, a podridão negra se desenvolve em climas quentes e úmidos, sendo mais
problemática nas regiões tropicais, subtropicais e continentais úmidas. Em climas frios essa
doença também ocorre, porém raramente evolui a ponto de destruir toda a planta
(WILLIAMS, 2007).
Os sintomas da podridão negra podem ser observados em qualquer
estádio fenológico da planta. No campo, é possível observar a formação de lesões amareladas
em formato de “V”, com o vértice voltado para a nervura central da folha, comumente
associadas à presença da bactéria e a goma xantana, que obstruem os vasos do xilema e
restringem o fluxo de água (WILLIAMS, 1980; ALVAREZ, 2000; MARINGONI, 2005). O
escurecimento das nervuras também pode ser observado, resultante da colonização do sistema
vascular (WILLIAMS, 2007). Os tecidos afetados podem tornar-se necróticos e as folhas
podem cair prematuramente (VICENTE; HOLUB, 2013). Em alguns casos, pode ser
observado subdesenvolvimento, murcha e o apodrecimento das plantas afetadas em infecções
causadas por outras espécies bacterianas como Pectobacterium carotovorum ou Pseudomonas
marginalis (WILLIAMS, 1980; ALVAREZ, 2000; MARINGONI, 2005). Schaad (1982)
complementa que os sintomas da podridão negra podem muitas vezes serem mascarados. A
ocorrência de míldio em brássicas, por exemplo, dificulta a observação dos sintomas da
podridão negra. Plantas de repolho jovens em estádio vegetativo melhor expressam os
sintomas da doença do que plantas em floração. Temperaturas baixas contribuem para
infecções latentes, onde a bactéria persiste no sistema vascular sem produzir sintomas.
De acordo com Kado (2010) e Lugo et al. (2013), Xcc é um bastonete
Gram-negativo, aeróbico obrigatório, que se movimenta por meio de um único flagelo polar.
Em meio de cultura produz colônias amarelas, mucoides e brilhantes (VAUTERIN et al.,
1995). A coloração amarela, típica do gênero Xanthomonas, deve-se à presença de um
pigmento denominado xanthomonadina (STARR; STEPHENS, 1964; HE et al., 2011), que
possui importante papel na aptidão ecológica da bactéria, protegendo-a do estresse fotooxidativo (POPLAWSKY et al., 2000; VICENTE; HOLUB, 2013). As colônias mucóides
ou viscosas, devem-se ao exopolissacarídeo xantana (EPSs) (VAUTERIN et al., 1995),
importante na agressividade (KATZEN et al., 1998) e na sobrevivência epifítica
(POPLAWSKY; CHUN, 1998; RIGANO et al., 2007). Dados recentes sugerem que
xantana não é necessária para a patogenicidade (DUNGER et al., 2007; VORHÖLTER et
al., 2008).
8
Xanthomonas campestris pv. campestris possui vários nichos de
sobrevivência, como sementes, podendo ser encontradas alojadas em seu interior e/ou
superfície (GRIESBACH et al., 2003; MARINGONI, 2005), solo, como células livres
(LÓPEZ et al., 1999; ARIAS et al., 2000), restos culturais de plantas doentes (SCHAAD;
WHITE, 1974; SCHULTZ; GABRIELSON, 1986), plantas daninhas (SCHAAD;
DIANESE, 1981; KUAN et al., 1986), e plantas remanescentes no campo (MARINGONI,
2005). A bactéria também pode sobreviver de forma epifítica na superfície da planta
hospedeira, plantas não hospedeiras como tomate e alface, e plantas daninhas (TIMMER et
al., 1987; DANE; SHAW, 1996; ARIAS et al., 2000). Quanto à disseminação do patógeno,
à curta distância ocorre por respingos de água da chuva e irrigação, aerossóis, insetos e
máquinas contaminadas; à longa distância é realizada por sementes ou mudas infectadas
(ALVAREZ, 2000; KOCKS et al., 1999; GRIESBACH et al., 2003; MARINGONI, 2005;
VAN DER WOLF; VAN DER ZOUWEN, 2010; KRAUTHAUSEN et al., 2011).
A penetração da bactéria na planta ocorre principalmente por meio
dos hidatódios, aberturas naturais localizadas nas margens das folhas (MEIER, 1934;
VICENTE; HOLUB, 2013). Por essas estruturas a água no estado líquido é eliminada,
acumulando-se na forma de gotas nas bordas das folhas. Esse fenômeno chamado
“gutação”, normalmente ocorre no início da manhã, quando o solo está úmido e a
transpiração reduzida (HUANG, 1986; HUGOUVIEUX et al., 1998). Gotas contaminadas
com a bactéria epífita podem ser reabsorvidas pela folha, levando consigo a bactéria em
suspensão para cavidade dos hidatódios e para dentro do sistema vascular
(BRETSCHNEIDER et al., 1989; HUGOUVIEUX et al., 1998). O patógeno também pode
penetrar pelos estômatos, raízes e ferimentos (SHELTON; HUNTER, 1985; ALVAREZ,
2000; GUDESBLAT et al., 2009; LUGO et al., 2013). Cook et al. (1952), citados por
Vicente e Holub (2013), complementam que os estômatos não são importantes para
infecção de Xcc, pois, ainda que a bactéria penetre por estas estruturas e cause pequenas
manchas escuras, não é capaz de colonizar os tecidos circundantes.
Após penetrar pelos hidatódios, Xcc é capaz de colonizar os vasos
de xilema da planta suscetível (GAY; TUZUN, 2000; GRIESBACH et al., 2003). Zoller
(1972), citado por Gay e Tuzun (2000), complementam que o movimento bacteriano pelos
tecidos da planta ocorre por difusão passiva, pois Xcc perde a mobilidade dentro do tecido
vegetal. Temperaturas (25 - 35 ºC) e umidade relativa elevadas (80 - 100 %) contribuem
para a colonização do sistema vascular e produção de elevadas quantidades de goma
9
xantana, levando ao aparecimento do sintoma em “V”, típico da doença (WILLIAMS,
1980; GRIESBACH et al., 2003). O tempo estimado para o aparecimento dos sintomas da
podridão negra, nestas condições, é de 10 a 14 dias após a penetração da bactéria no tecido
(WILLIAMS, 1980).
O controle da podridão negra é realizado por meio de práticas de
manejo e saneamento, que incluem a rotação de culturas, a remoção de resíduos de
brássicas, a eliminação de plantas daninhas, o tratamento de sementes, o emprego de
sementes livres de Xcc e o uso de cultivares resistentes (GRIESBACH et al., 2003;
VICENTE; HOLUB, 2013). Arias et al. (2000) ao avaliarem a capacidade de
sobrevivência de Xcc associada ao filoplano de plantas cultivadas utilizadas em rotação
com repolho, concluíram que as espécies a serem empregadas na rotação devem ser
selecionadas de modo a contribuírem para redução da persistência do patógeno no campo,
já que a bactéria foi capaz de sobreviver por 48 dias em couve, mostarda e alface, mas por
apenas 9 dias em arroz.
O tempo de rotação é variável, pois dependendo das condições
ambientais, a bactéria pode sobreviver por um longo período no solo quando associada a
restos culturais de brássicas (WILLIAMS, 1980; SCHULTZ; GABRIELSON; 1986;
KOCKS et al.,1998; ARIAS et al., 2000). Schaad e White (1974) estimaram que Xcc seria
capaz de sobreviver por até 615 dias em resíduos de repolho no solo, sob as condições da
Georgia, EUA, sendo a rotação de culturas sugerida por dois anos. Na Holanda,
experimentos conduzidos por Kocks et al. (1998) indicaram que o cultivo de repolho pode
ser realizado sem a rotação de culturas, desde que o resíduo da colheita seja desintegrado e
incorporado ao solo, com tempo suficiente para se decompor. Maringoni (2005)
recomenda a eliminação total dos resíduos culturais por meio da aração profunda, podendo
também ser empregado na eliminação de plantas voluntárias e plantas daninhas
hospedeiras do patógeno. Além, da eliminação de plantas daninhas pertencentes à família
Brassicaceae, Schaad e Dianese (1981) recomendam evitar o plantio de mudas e sementes
de brássicas em áreas altamente infestadas com plantas daninhas dessa família botânica.
O uso de sementes livres de Xcc é uma prática indispensável no
controle da podridão negra (WILLIAMS, 1980; MARINGONI, 2005). Sementes
infectadas são importantes fontes de inóculo para epidemias, mesmo que a taxa de infecção
seja baixa (ROBERTS et al., 1999; KRAUTHAUSEN et al., 2011). No EUA, Reino Unido
e na Europa, adota-se 0,01% como nível de tolerância de infecção em sementes de
10
brássicas (ROBERTS et al., 1999; MARINGONI, 2005). Além da alta taxa de transmissão,
à bactéria pode sobreviver por até três anos associada às sementes (CLAYTON 1925,
citado por GRIESBACH et al., 2003). O tratamento de sementes de brássicas através de
métodos físicos e produtos químicos, podem ser empregados na erradicação de Xcc, no
entanto, nenhum tratamento é totalmente eficaz (VICENTE; HOLUB, 2013).
O desenvolvimento e utilização de cultivares resistentes à podridão
negra têm sido foco de inúmeras pesquisas no mundo, sendo reconhecido como importante
método de controle, mas que na prática tem apresentado sucesso limitado. A maioria dos
estudos concentram-se em B. oleracea, porém um número reduzido de fontes úteis de
resistência foram encontradas nessa espécie (TAYLOR, 2002; VICENTE; HOLUB, 2013).
Os genótipos relatados em sua maioria apresentam resistência de raça-não-específica,
incluindo a cultivar de repolho Fuji Precoce, o repolho acesso PI 436.606 (cv. He Yeh da
Ping Tou) e suas linhagens derivadas, amplamente utilizadas no melhoramento do repolho
(TAYLOR, 2002; LEMA et al., 2012; VICENTE; HOLUB, 2013). Segundo Lema (2012)
a resistência de raça-não-específica é parcial e quantitativa, sendo dependente da ação
combinada de vários genes com pequeno efeito, que apesar de normalmente ser mais
durável, é incompleta e também mais difícil de gerir e fazer a transferência entre cultivares.
Nove raças de Xcc foram descritas, o que dificulta ainda mais a obtenção de cultivares
resistentes (VICENTE et al., 2001; FARGIER; MANCEAU, 2007). Fontes mais comuns e
potencialmente úteis de resistência de raça especifica estão sendo identificadas em outras
espécies de brássicas, como B. carinata, B. juncea, B. napus, B. nigra e B. rapa (LEMA et
al., 2012). Genes presentes nessas espécies poderiam potencialmente fornecer um controle
durável da podridão negra em genótipos suscetíveis (VICENTE; HOLUB, 2013). No
Brasil, há descrição de alguns cultivares/híbridos comerciais que apresentam bons níveis
de resistência a Xcc tais como: repolho (esmeralda, fênix, fuyutoyo, green valley, klabish),
brócolis (hanabi, ramoso brasília) e couve-flor (HT 116, juliana, sarah, sharon, verediana),
conforme algumas empresas que comercializam sementes no país (HORTEC, 2015; ISLA,
2015; SAKATA, 2015; SYNGENTA, 2015).
11
4.2 Sobrevivência de bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas no solo,
com ênfase em Xanthomonas campestris pv. campestris
As bactérias fitopatogênicas podem sobreviver entre as estações de
cultivo no solo como células livres ou associadas ao tecido de plantas mortas (HABTE;
ALEXANDER, 1975; LEBEN, 1981). Bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas são
pouco adaptadas à sobrevivência no solo, desta maneira, necessitam da proteção e alimento
proporcionado pelo tecido da planta infectada. A sobrevivência no solo torna-se
dependente da quantidade desse substrato. Em muitas situações o tecido vegetal é
suficiente apenas para manter o patógeno durante o inverno e raramente permite a
sobrevivência por mais de dois anos (MENZIES, 1963; HIRANO; UPPER, 1983). Schaad
e White (1974) ao avaliarem a capacidade de sobrevivência de Xcc no solo sob as
condições da Georgia, verificaram que a bactéria sobreviveu por pouco tempo quando
separada do hospedeiro, apenas 14 dias no verão e 42 dias no inverno. Quando protegida
pelo tecido do caule de repolho, a bactéria foi capaz de sobreviver por até 244 dias.
Segundo Schuster e Coyne (1974), uma das explicações para a
baixa capacidade de sobrevivência das bactérias no solo é a atuação da microflora
antagonista. Habte e Alexander (1975) esclarecem essa afirmação ao comparar a
persistência de Xcc em solo esterilizado e solo não esterilizado. Em solo esterilizado a
população do patógeno, apesar de uma ligeira queda no sexto dia, se manteve constante
durante os 12 dias do período avaliado. Já em solo não esterilizado, a população do
patógeno sofreu acentuado declínio durante o período avaliado, podendo ser explicado
devido à existência de organismos antagonistas responsáveis pela eliminação significativa
de células de Xcc.
López et al. (1999) empregando um isolado de Xcc selvagem e
derivados mutantes deficientes em exopolissacarídeo (Eps-) e protease extracelular (Prt-),
avaliaram se a sobrevivência da bactéria no microscosmo do solo era dependente destas
duas características. Como resultados, observaram que em microcosmo do solo esterilizado
o período de sobrevivência do isolado selvagem foi maior quando comparado ao isolado
mutante em Eps-. Já para o isolado mutante em Prt-, não houve diferença na capacidade de
sobrevivência em relação ao isolado selvagem. Em solo não esterilizado, os isolados
mutantes (Prt- e Eps-) sobreviveram de forma menos eficiente que o isolado selvagem,
12
comprovando a hipótese de que essas duas características são essenciais para a
sobrevivência, permitindo a bactéria competir com os microrganismos do solo.
Diferentes microrganismos podem atuar na redução da população
de bactérias fitopatogênicas no solo como actinobactérias, fungos, bacteriófagos
protozoários e outras bactérias (HABTE; ALEXANDER, 1975; SIGEE, 1993). Habte e
Alexander (1977) verificaram que o protozoário Paramecium sp. foi essencial na regulação
de Xcc no solo. A população bacteriana foi consideravelmente reduzida após ser
introduzida no solo em que havia a presença do protozoário. Romeiro (2011) argumenta
que o solo é composto por uma comunidade biológica complexa, onde os microrganismos
que nela coabitam competem entre si por nichos ecológicos, água, nutrientes e, muitas das
vezes, produzem, substâncias antimicrobianas como antibióticos e bacteriocinas.
Segundo Menzies (1963), apesar dos microrganismos do solo e a
disponibilidade de alimentos serem os principais fatores que influenciam a sobrevivência
bacteriana, outros fatores, como teor de matéria orgânica, umidade, temperatura e aeração,
também são considerados importantes, podendo influenciar na sobrevivência das bactérias
não apenas no solo, como em outros substratos. Em relação à matéria orgânica, a
influência exercida na sobrevivência dos patógenos, se dá de maneira direta, afetando o
suprimento de alimento, ou de maneira indireta, por meio da competitividade exercida
entre os microrganismos. Disckey (1961), citado por Schuster e Coyne (1974),
complementam que o incremento de matéria orgânica ao solo tende a aumentar a
população de microrganismos antagônicos e reduzir a população de bactérias
fitopatogênicas.
A temperatura possui efeito pronunciado na sobrevivência de
bactérias no solo, como observado por Srivastava e Bais (1987) ao avaliarem a capacidade
de sobrevivência de X. campestris pv. glycines no solo, sob condições controladas. A
bactéria sobreviveu por um período maior em temperaturas mais baixas (6 a 8 ºC) por até
60 dias, em solo autoclavado, e 30 dias, em solo não autoclavado. Em temperaturas mais
elevadas (14 a 40 ºC), a sobrevivência foi menor, sendo 30 dias em solo autoclavado e 10
dias em solo de campo. Resultados semelhantes foram obtidos por Dzhalilov e Tiwari
(1995) ao estudarem a sobrevivência de Xcc em solo não autoclavado. A bactéria foi capaz
de sobreviver por até 47 dias, a 5 ºC, e apenas 20 dias, a 20 °C.
Mesmo quando as bactérias estão em posição protegida no interior
dos tecidos das plantas, suas populações são afetadas por influência da temperatura
13
(MENZIES, 1963). Kocks et al. (1998) comprovaram isto, ao avaliar a dinâmica
populacional de Xcc em fragmentos de repolho incorporados ao solo, incubados em
diferentes temperaturas (-12, 0, 5, 10, 15 e 20 ºC) durante 20 semanas. A população de Xcc
não declinou durante as 20 semanas em temperaturas de -12 ºC e 0 ºC, já a 5 ºC ou superior
diminuiu com o tempo. Quando exposta a 20ºC, a população se encontrava em baixa
densidade na décima segunda semana. Os autores concluíram que em temperaturas mais
elevadas a decomposição dos tecidos vegetais é mais rápida, tornando a bactéria menos
protegida, o que consequentemente colabora para uma rápida diminuição da população.
O efeito da umidade do solo na sobrevivência de X. campestris pv.
musacearum (Xcm) foi avaliado por Mwebaze et al. (2006), em experimentos conduzidos
sob condições controladas. Os autores verificaram que os períodos de sobrevivência de
Xcm variaram conforme a umidade reduziu de 28 % para 14 %. Em solo esterilizado, a
bactéria foi capaz de sobreviver por 90 e 30 dias, sob alta e baixa umidade,
respectivamente. Não foi observada diferença entre os períodos de sobrevivência no solo
não esterilizado, tendo a bactéria sobrevivido por 15 dias, tanto em alta, como baixa
umidade. Segundo os autores, uma explicação para a baixa sobrevivência no solo não
esterilizado, é que Xcm apresenta baixa capacidade competitiva com os microrganismos
presentes no solo e, portanto, sucumbe mais facilmente a competição do que o estresse
gerado pela umidade do solo.
Arias et al. (2000) obtiveram resultados diferentes ao estudarem a
sobrevivência de Xcc associada a detritos vegetais incorporados ao solo em diferentes
potenciais matriciais (0, -10, -30, -50, -100, -200, -900 e kPa). Em solos saturados (0 kPa),
o período de sobrevivência de Xcc foi menor, 19 - 28 dias, enquanto em solos secos (- 900
kPa) a população se manteve praticamente constante durante esse período. Os autores
argumentam que em ambientes saturados a água pode produzir um ambiente anaeróbico
prejudicial a Xcc que é uma bactéria aeróbica.
As propriedades fisioquímicas do solo também podem influenciar
na sobrevivência das bactérias. A mineralogia do solo, por exemplo, foi estudada por
Hattori (1973), citado por Marshall (1975). O autor observou uma maior sobrevivência de
bactérias Gram-negativas quando presentes no interior dos agregados de argila sob
condição de baixa umidade, do que na superfície dos mesmos, sendo atribuída a uma maior
disponibilidade de água no interior desses agregados. Essa observação pode indicar que em
solos arenosos com baixa formação de agregados, as bactérias possuem baixa capacidade
14
de sobrevivência, quando comparadas aos solos de textura mais pesada com maior
formação dos agregados. Marshall (1975) completa que os agregados de argila formam um
involutório ao redor das células, protegendo-as durante os períodos de dessecação e
reidratação do solo.
O pH do solo afeta diretamente ou indiretamente a sobrevivência e
multiplicação de bactérias fitopatogênicas (GOTO, 1990). Alvarez e Cho (1978)
compararam a sobrevivência de Xcc em dois tipos de solos, um com pH 4,9 e o outro de
pH 6,5, no entanto, não verificaram grandes diferenças na sobrevivência, sendo que as
populações diminuíram aproximadamente na mesma taxa. Santiranjan et al. (1986)
verificaram que o pH ótimo para o desenvolvimento desta bactéria foi próximo da
neutralidade (pH 6,8). Além disso, constataram que a acidez, alcalinidade e salinidade,
afetam negativamente a sobrevivência da bactéria no solo.
4.3 Sobrevivência de bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas
associadas ao filoplano de plantas daninhas
Dada a dificuldade de sobrevivência no solo exibida por muitas
fitobactérias, algumas são capazes de sobreviver na superfície das plantas hospedeiras,
constituindo-se como uma fonte de inóculo potencial na ausência da doença (SCHUSTER;
COYNE, 1974; ROMEIRO, 2011). Bactérias do gênero Xanthomonas são especificamente
conhecidas por essa capacidade de sobrevivência (SWINGS; CIVEROLO, 1993).
Beattie e Lindow (1995) consideram que as bactérias presentes na
superfície das plantas hospedeiras estão em uma fase residente ou epifítica. Nessa fase, as
bactérias multiplicam-se na superfície de plantas sadias sem infecta-las, utilizando
pequenas quantidades de nutrientes secretadas na superfície das plantas. Em condições
desfavoráveis para a multiplicação, entram na fase de hipobiose (GOTO, 1990;
ROMEIRO, 2011). Segundo Leben (1981), as células bacterianas têm seu metabolismo
reduzido na fase de hipobiose e se encontram envoltas por substâncias químicas produzidas
pelas próprias células, pelas plantas, ou pela interação bactéria-planta, que as protegem do
dessecamento e de outras condições adversas. Além da sobrevivência como populações
residentes ou epifíticas na superfície de plantas hospedeiras, as fitobactérias também
podem sobreviver em plantas não hospedeiras e plantas daninhas (ROMEIRO, 2011).
15
A sobrevivência epifítica de X. campestris pv. vesicatoria (Xcv),
agente causal da mancha bacteriana do tomate, em plantas daninhas foi avaliada por Jones
et al. (1986) na Florida. Várias amostras de plantas invasoras foram coletadas em campos
de produção de tomate e campos de tomate em pousio com histórico da mancha bacteriana.
A bactéria foi detectada nas invasoras: Ambrosia artemisiifolia, Eclipta alba, Trifolium
repens, Eupatorium capillifolium e nas solanáceas infestantes, Solanum americanum e
Physalis pubescens. A detecção de populações de Xcv foi considerada muito baixa, apenas
11 de 203 amostras de plantas daninhas continha a bactéria, sugerindo que as plantas
invasoras não foram importantes para epidemiologia da mancha bacteriana.
Schaad e Dianese (1981) estudaram o potencial das plantas
daninhas da família Brassicaceae como fonte de inóculo de Xcc na Geórgia e Califórnia. O
patógeno foi detectado infectando Brassica campestris, Lepidium virginicum, Coronopus
didymus, Raphanus sativus, B. geniculata, B. niger e Cardaria pubescens. Os autores
também avaliaram a presença de Xcc na superfície das folhas e em raízes de Lepidium
virginicum coletadas em diferentes áreas. A bactéria pôde ser detectada nas folhas, no
entanto, não foi encontrada nas raízes. Xcc também foi encontrada sobrevivendo
epifiticamente sobre Centella asiatica em Bangalore, Índia (KISHUN; CHAND, 1988).
Diferentes órgãos das plantas podem servir de nicho para a
sobrevivência epifítica de fitobacterias (SCHUSTER; COYNE, 1974). Karavina et al.
(2011), estudando a sobrevivência epifítica de X. axonopodis pv. phaseoli (Xap), em três
variedades de feijão no campo, constataram que além da sobrevivência em folhas, a
bactéria também esteve presente em caules, flores e vagens das variedades de feijão. Não
foram constatadas diferenças quanto ao tamanho da população epifítica em relação ao
órgão da planta, assim como também não foram observadas diferenças quanto à influência
das variedades sobre a população epifítica.
De acordo com Lindow e Brandl (2003), a superfície aérea das
plantas colonizadas por microrganismos é denominada filosfera ou filoplano e seus
habitantes são chamados epífitas. As bactérias são de longe, os habitantes mais abundantes
da filosfera e, apesar de haverem investigações referentes às populações epífitas em órgãos
como flores e brotos, a maioria dos trabalhos se concentram nas folhas. Karavina et al.
(2011), por exemplo, estudaram a capacidade de sobrevivência epifítica de Xap em folhas
de oito espécies de plantas invasoras e Zea mays, encontradas dentro e nas bordaduras de
um campo de feijão infectado com crestamento bacteriano comum. Populações epífitas de
16
Xap de até 1,02 x 104 a 2,14 x 104 ufc/ml foram detectadas em folhas de Zea mays, Oxalis
latifolia, Cyperus rotundus, Amarathus hybridus e Bidens pilosa. Não foram observados
sintomas da infecção pelo patógeno nessas espécies.
As folhas têm sido consideradas como um ambiente hostil para a
sobrevivência bacterina, pois, exposta à atmosfera e ao sol, a superfície das folhas e,
consequentemente, a população residente, são submetidas às variações ambientais, tais
como temperatura, umidade relativa, velocidade do vento, radiação e umidade, que
contribuem para a contínua flutuação da população (HIRANO; UPPER, 2000; LINDOW;
BRANDL, 2003). Sikirou e Wydra (2004), ao avaliarem a sobrevivência de X. axonopodis
pv. vignicola em folhas de plantas daninhas sob condições de campo e controladas,
puderam constatar que o tempo de sobrevivência do patógeno sobre as espécies daninhas
foi maior sob condições controladas. Uma explicação para isso, segundo os autores, seria a
ocorrência de chuvas, que poderiam ter contribuído para que as bactérias presentes na
superfície das folhas das plantas daninhas fossem removidas e depositadas sobre o solo.
Além da influência de fatores ambientais, as populações epífitas
apresentam comportamento diferente frente a plantas da mesma espécie, assim como
espécies diferentes (LINDOW; BRANDL, 2003). Gent et al. (2005), estudando o potencial
de sobrevivência de X. axonopodis pv. allii (Xaa) no filoplano de plantas daninhas, sob
condições controladas, puderam verificar que a população epifítica de Xaa variou entre as
espécies. Em Convolvulus arvensis, Cyperus esculentus e Solanum sarrachoides a
população aumentou quatro dias após a inoculação de Xaa. Já nas espécies Amaranthus
retroflexus e Chenopodium album, a população reduziu nesse mesmo período.
Diferenças quanto ao tamanho da população de X. campestris pv.
vitians (Xcv) em relação a diferentes espécies de plantas invasoras, também foram
constatadas por Toussaint et al. (2012). A sobrevivência de Xcv no filoplano de plantas
daninhas foi avaliada através da inoculação artificial em espécies pertencentes às famílias
Asteraceae, Chenopodiaceae, Malvaceae, Polygonaceae e Portulacaceae, em condições
controladas. Populações maiores de Xcv foram recuperadas na 4ª semana após a
inoculação nas espécies Lactuca biennis e L. serriola, membros da família Asteraceae,
cujas populações, excederam o tamanho da população encontrada em L. sativa, empregada
como controle. Populações mais baixas foram encontradas em membros da família
Chenopodiaceae, Polygonaceae, Portulacaceae e membros da tribo Astereae.
17
Estas variações no tamanho das populações bacterianas são
causadas em grande parte pelas condições físicas e nutricionais da filosfera das plantas
(LINDOW; BRANDL, 2003). Arias et al. (2000), ao estudarem a capacidade de
sobrevivência de Xcc no filoplano de diferentes espécies de plantas cultivadas, verificaram
que a sobrevivência do patógeno em folhas de couve foi similar ao da mostarda e alface,
tendo sobrevivido por até 48 dias nessas espécies, diferindo apenas do arroz, na qual
sobreviveu por nove dias. Uma explicação para isso segundo os autores seria que a
superfície das folhas do arroz estaria impedindo a aderência da bactéria.
A
topografia
da
superfície
das
folhas
apresenta
certas
características que geram questionamentos intrigantes sobre a forma como que as bactérias
se adaptaram a sobrevivência epífita na interface entre a folha e a atmosfera. A cutícula,
camada que reveste a epiderme, é composta por cutina e ceras que formam uma barreira
lipofílica com baixa permeabilidade, protegendo a superfície da folha contra uma
variedade de tensões (HIRANO; UPPER, 2000; TOUSSAINT et al., 2012). Plantas com
cutículas cerosas tendem a ter populações bacterianas menores do que às plantas com
folhas tricromáticas (O'BRIEN; LINDOW, 1989). Segundo Beattie e Lindow (1995),
estudos utilizando microscopia eletrônica de varredura demonstram que os locais mais
comuns onde às bactérias podem ser encontradas são na base dos tricomas, nos estômatos e
nas junções das células epidérmicas, especialmente nos sulcos ao longo das nervuras. Os
autores complementam que a presença das bactérias na base dos tricomas, se deve a
abundância de nutrientes exsudados de fissuras na camada cuticular, ou então, por conta do
grande número de ectodesmata localizados em torno da base do tricomas.
Em adição as características físicas, a disponibilidade de nutrientes
nas folhas é um dos fatores determinantes para a sobrevivência epifítica (LINDOW;
BRANDL, 2003). Segundo Mercier e Lindow (2000), para que a colonização epifítica
ocorra é necessário que sobre as folhas das plantas esteja presente, uma fonte de carbono
para a produção de energia e crescimento, nitrogênio e certas moléculas inorgânicas
essenciais. A abundância de nutrientes, no entanto, varia de acordo com a espécie, idade da
folha e as condições de condições de crescimento. Vários estudos têm revelado que
pequenas quantidades de nutrientes podem ser lixiviadas das folhas por ação de soluções
aquosas, tais como chuva, orvalho, névoa e nevoeiro (TUKEY JUNIOR, 1970). Wilson e
Lindow (1994) argumentam que a comunidade bacteriana é limitada pela disponibilidade
de nutrientes. Populações epífitas de Pseudomonas syringae foram mais limitadas pela
18
disponibilidade de carbono do que pela disponibilidade de nitrogênio.
A população bacteriana também pode encontrar na superfície das
plantas, compostos químicos tóxicos, produzidos pelas próprias plantas ou por outros
microrganismos (TOUSSAINT et al., 2012; VORHOLT, 2012). Segundo Yadav et al.
(2005), metabolitos secundários exsudados ou lixiviados do interior da folha para a
superfície, tais como alcalóides, isoprenóides e ácidos fenólicos inibem o crescimento de
fungos e bactérias. Hayet et al. (2009) realizaram uma triagem fitoquímica do extrato
metanólico de Conyza canadensis, que revelou a presença de flavonóides, terpenóides e
taninos. Os autores correlacionaram à presença desses compostos a atividade
antimicrobiana do extrato metanólico in vitro.
4.4 Sobrevivência de bactérias fitopatogênicas associadas à rizosfera de plantas
daninhas
Além da capacidade de sobrevivência no filoplano, as fitobactérias
também têm sido encontradas sobrevivendo na rizosfera de plantas hospedeiras, plantas
não hospedeira e plantas daninhas (GOTO, 1990; ROMEIRO, 2011). Segundo Vorholt
(2012), a rizosfera compreende a área no solo em torno das raízes das plantas. Comparando
com o solo livre de raízes, a rizosfera forma um nicho rico em nutrientes para as bactérias,
resultante da exsudação de compostos pelas raízes, tais como ácidos orgânicos, açúcares e
aminoácidos (LUGTENBERG et al., 2001), que estimulam o crescimento bacteriano e
aumentam a capacidade de competição com outros microrganismos (GOTO, 1990).
Burr e Schroth (1977), empregando um meio de cultura diferencial
(PT) avaliaram a capacidade de sobrevivência Pectobacterium carotovora subsp.
carotovora (Pcc) e P. carotovora subsp. atroseptica (Pca) no solo e na rizosfera de plantas
daninhas e cultivadas, coletadas de diferentes localidades. Verificaram que em áreas de
solos em pousio, desprovidos de vegetação ou restos vegetais, as bactérias estavam
ausentes, porém, foram encontradas como habitantes comuns na rizosfera das plantas
daninhas e cultivadas. Os autores não consideraram Pcc e Pca verdadeiras habitantes do
solo, apesar de possuírem uma fase prolongada no solo em associação com as raízes de um
grande número de plantas.
19
Segundo Brencic e Winans (2005), quando comparada ao filoplano,
a rizosfera oferece às bactérias maior proteção a fatores como dissecação, temperatura e
luz, além, de possuir fontes de carbono e minerais mais abundantes. Mariano e McCarter
(1993) ao estudarem a capacidade de sobrevivência epífita de Pseudomonas viridiflava
(Pv) nas raízes e folhas de duas cultivares de tomate e 16 espécies de ervas daninhas,
puderam observar que apesar da influência ambiental, no geral, as raízes foram melhores
para sobrevivência de Pv do que as folhas.
Mendonça e Stanghellini (1979) avaliaram a capacidade de
sobrevivência de Pca, agente causal da podridão mole na beterraba açucareira. A bactéria
pode ser detectada na rizosfera de plantas de trigo e milho, semeadas após um período de
pousio do solo, onde antes havia histórico de ocorrência da doença. Pca também foi
detectada em caruru e várias outras plantas daninhas, plantas voluntárias de beterraba, e na
espécie nativa Lupinus blumerii, encontrada a 50 km dos campos de produção. Na
rizosfera de beterraba infestada artificialmente, Pca sobreviveu por um período de quatro
meses. Uma distribuição vertical foi exibida pela bactéria na rizosfera ao longo do tempo,
sendo encontrada em profundidades maiores que 12 cm.
Diferentes espécies de plantas podem selecionar comunidades
bacterianas especificas na rizosfera. Isso pode ser explicado devido à liberação de
compostos químicos pelas raízes, que além de servir como nutrientes para as bactérias
servem de “sinais”. Estes sinais são detectados pelas bactérias que alteram seu movimento
em direção à fonte, processo esse conhecido como quimiotaxia, importante para a
colonização e sobrevivência de certas bactérias na rizosfera (MARK et al., 2005; WU et
al., 2015). Yao e Allen (2006) estudando o comportamento de quimiotáxico de Ralstonia
solanacearum (Rs), contataram que a bactéria foi especificamente atraída por diversos
aminoácidos e ácidos orgânicos encontrados em tomate, planta hospedeira. Em arroz,
planta não hospedeira de Rs, os exsudatos foram menos atraentes para a bactéria.
De acordo com Broek e Vanderleyden (1995) a maioria das
bactérias habitantes do solo possui capacidade de movimentação em direção a fontes
atrativas. Bais et al. (2006) argumentam que os componentes químicos exsudados pelas
raízes tanto podem afastar um organismo, como ao mesmo tempo, atrair outro, ou então,
dois organismos diferentes são atraídos com diferentes consequências para a planta. Hartel
et al. (1993) estudando a concorrência de Burkholderia cepacia (Bc), B. pickettii (Bp) e Rs
na rizosfera de plantas de tomate, observaram que a população Rs diminuiu quando
20
inoculada com Bc, já quando Rs foi inoculada com Bp, ambas populações aumentaram. Os
autores argumentam que os possíveis mecanismos de competitividade de Bc sobre Rs estão
relacionados ao tempo de geração mais rápido e, a maior versatilidade nutricional,
reduzindo a quantidade de nutrientes disponíveis para o crescimento de Rs na rizosfera.
A sobrevivência de bactérias que causam lesões na parte aérea das
plantas é um fenômeno ainda pouco explicado, sendo objeto de especulação,
principalmente no que diz respeito aos mecanismos que governam esse tipo de
sobrevivência e o modo como essas populações podem servir de inóculo para subsequentes
infecções na parte aérea (ROMEIRO, 2011). Como exemplo de bactérias do gênero
Xanthomonas encontradas na rizosfera tem-se Xcv, capaz de sobreviver em plantas não
hospedeiras como sorgo, ervilha, pepino, feijão e trigo, durante o inverno (BASHAN, et
al., 1982). Pereira et al. (1976) relataram que X. campestris pv. citri foi encontrada
sobrevivendo na rizosfera da planta daninha Trichachne insularis em pomares de citros
erradicados no Estado de São Paulo. Thaveechai et al. (1993) estudando a sobrevivência de
X. campestris pv. manihotis em condições de campo, verificaram que a bactéria foi capaz
de sobreviver no solo da rizosfera das plantas daninhas Digitaria sp., Dactyloctenium
aegyptium e Fimbristylis monostachya, por 7 a 14 dias.
21
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Isolado bacteriano, condição de cultivo e preservação
Empregou-se o isolado 3098C de Xcc, resistente a 100 μg/mL de
rifampicina, pertencente à coleção do Laboratório de Bacteriologia Vegetal da Faculdade
de Ciências Agronômicas - FCA/UNESP. O isolado apresenta patogenicidade às plantas de
brássicas, assim como seu isolado selvagem, obtido de plantas sintomáticas provenientes
de regiões produtoras do Estado de São Paulo. Para obtenção do isolado resistente e
crescimento durante a condução dos experimentos de sobrevivência (incubação a 28°C por
48 h) foi utilizado o meio de cultura NSAR, consistido de extrato de carne 3 g/L, peptona
de carne 5 g/L, ágar 12g/L, acrescido de 5 g/L de sacarose e 100 μg/mL de rifampicina.
Para a preservação durante longos períodos, manteve-se o isolado em 30 % de glicerol
(v/v) à - 80 ºC.
22
5.2 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em
condições de campo
5.2.1 Épocas de instalação dos experimentos
Cinco experimentos foram conduzidos durante 2014, em uma área
experimental pertencente ao Departamento de Proteção Vegetal, FCA-UNESP
(22°50'40"S, 48°26'08"W), para avaliar a capacidade de sobrevivência de Xcc no solo em
condições de campo e a influência das condições climáticas sobre a sobrevivência da
bactéria. Os experimentos foram instalados nos dias 24/05/2014 (Experimento 1),
09/06/2014 (Experimento 2), 17/07/2014 (Experimento 3), 11/08/2014 (Experimento 4) e
20/08/2014 (Experimento 5). Dados climáticos de temperatura (temperatura máxima,
média e mínima) e precipitação ocorridos durante os períodos experimentais, foram
obtidos de uma estação meteorológica localizada a 300 m da área experimental.
5.2.2 Área experimental e amostragem do solo
Em uma área experimental sem cultivo anterior ao de brássicas e
com solo A, cujas propriedades físico-químicas estão descritas na Tabela 1, foram
distribuídos 45 quadrados de madeira com 30 cm de lado, espaçados em 0,5 m entre si.
Plantas daninhas presentes na área foram removidas manualmente antes da instalação de
cada experimento. O solo de cada quadrado foi infestado com 500 mL de suspensão (108
ufc/mL) do isolado 3098C, e a sobrevivência de Xcc monitorada a uma profundidade de 5
cm. Para amostragem do solo, anéis de PVC (60 mm de diâmetro) foram utilizados, sendo
retiradas cinco amostras simples por quadrado (posições norte, sul, leste, oeste e centro).
As amostras simples de cada quadrado foram transferidas para um becker de 1L
esterilizado e homogeneizadas com bastão de vidro, obtendo-se uma amostra composta. As
amostragens foram realizadas diariamente, incluindo o dia da instalação dos experimentos,
e para cada avaliação, o solo de três quadrados foi amostrado ao acaso. A sobrevivência de
Xcc em cada experimento foi avaliada durante 20 dias ou até a não recuperação de células
viáveis das amostras. Em cada período de amostragem, a umidade das amostras compostas
23
foi determinada por meio de um analisador de umidade por infravermelho (Gehaka, IV
2500, Brasil).
5.2.3 Processamento das amostras de solo coletadas
Após a amostragem, dez gramas de solo de cada amostra composta
foram pesadas em balança semi-analítica, e transferidas para frascos de Duran de 250 mL
contendo 100 mL de tampão salina fosfato esterilizado (PBS) 0,01M, pH 7,0. Os frascos
foram agitados (30 min/200 rpm) em mesa agitadora, seguido de repouso (30 min), para
sedimentação (SILVA JUNIOR et al., 2012). As suspensões foram diluídas em série (100 a
10-4) e 100 µL plaqueadas em triplicata no meio de cultura NSAR, suplementado com os
fungicidas chlorothalonil (0,06 g/L) e tiofanato metílico (0,06 g/L) (meio de cultura
NSARF), e incubadas (28 °C/ 72 h). Colônias semelhantes a Xanthomonas foram
quantificadas e os dados transformados em log10 do número de ufc.g de solo seco-1,
baseando-se nos teores de umidade obtidos de cada amostra de solo composta.
5.3 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em
condições controladas
5.3.1 Amostragem do solo
Para os experimentos em condições controladas, foram empregados
seis solos (A, B, C, D, E e F) coletados em diferentes localidades em maio de 2014. O solo
A foi amostrado da mesma área em que foram realizados os experimentos de sobrevivência
de Xcc associada ao solo sob condições de campo. Solos B a F foram coletados em campos
de produção de brássicas na região de Campinas, São Paulo. Após a coleta, os solos foram
peneirados em peneira de malha 8 (2,8 mm de abertura), secos em casa-de-vegetação
durante sete dias, e armazenados em caixas plásticas de 70 x 35 x 35 cm (largura x
comprimento x altura). As partes superiores das caixas foram vedadas com folhas de papel
kraft e mantidas em casa de vegetação (temperatura de 22-28°C e umidade relativa de 60-
24
90%) até a instalação dos ensaios. As propriedades físico-químicas dos seis solos
encontram-se descritas na Tabela 1.
Tabela 1. Propriedades físico-químicas dos solos utilizados nos experimentos de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris.
Propriedades físico-químicas do solo
Solo
Areia
Silte
Argila
Matéria Orgânica
pH
Textura
3
(g/kg)
(g/kg)
(g/kg)
(g/dm )
(CaCl2)
A
782
29
189
Média
13
4.2
B
422
144
434
Argilosa
25
5.9
C
345
113
542
Argilosa
27
5.0
D
488
81
431
Argilosa
28
5.3
E
441
90
469
Argilosa
18
5.0
F
477
74
449
Argilosa
23
5.2
5.3.2
Instalação
do
experimento,
delineamento
experimental
e
processamento das amostras de solo coletadas
Em copos de poliestireno de 50 mL, 37,5 g de cada solo foram
pesadas, seguida da infestação com suspensão bacteriana (108 ufc/mL) (SILVA JUNIOR,
et al., 2012). Considerando uma capacidade de campo de 100%, foram adicionados 7,5 mL
de suspensão bacteriana mais 7,5 mL de água destilada. Logo após, os copos foram selados
com folha de papel alumínio (7,5 x 7,5 cm) e incubados em B.O.D (temperatura de 20 ºC).
O delineamento experimental empregado foi em blocos ao acaso, com 90 copos por
tratamento. A cada dois dias, amostragens foram realizadas, na qual o solo de três copos de
cada tratamento foram transferidos para um becker de 1L e homogeneizados com bastão de
vidro, obtendo-se amostras compostas. As etapas de processamento do solo foram
semelhantes às descritas no item 5.2.3.
25
5.4 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e
rizosfera de plantas daninhas
5.4.1 Obtenção das plantas daninhas
As plantas daninhas utilizadas para os experimentos de
sobrevivência foram selecionadas de acordo com o nível de ocorrência em campos
agrícolas no Brasil (LORENZI, 2008). Ao todo, 26 espécies foram selecionadas,
pertencentes a 14 famílias botânicas. Bandejas de 128 células contendo substrato organomineral foram utilizadas para a semeadura das espécies invasoras, sendo mantidas sob
condições de casa-de-vegetação (temperatura de 12-28 °C e umidade relativa de 28-87 %).
Cerca de 20 dias após a emergência, as plântulas foram transferidas para vasos de 2L
contendo substrato, constituído de terra, areia grossa lavada e esterco de curral curtido na
proporção 1:1:1, suplementado com 0,6 kg de sulfato de amônio, 1,7 kg de superfosfato
simples, 0,6 kg de cloreto de potássio e 0,8 kg de calcário dolomítico para cada m3 da
mistura. Cerca de 35 dias após o transplante, as plantas foram levadas a área experimental
para a instalação dos experimentos.
5.4.2 Épocas de instalação dos experimentos
Para a avaliação da sobrevivência de Xcc no filoplano e rizosfera
de plantas daninhas, as 26 espécies selecionadas foram distribuídas em três experimentos
conforme descrito nas Tabelas 2, 3 e 4. Os experimentos foram instalados nos dias
27/08/2014 (Experimento 1), 24/09/2014 (Experimento 2), 06/11/2014 (Experimento 3), e
repetidos nos dias 03/02/2015 (Experimento 1), 24/03/2015 (Experimento 2) e 05/08/2015
(Experimento 3). A área experimental foi a mesma empregada para os experimentos de
sobrevivência de Xcc associada ao solo. Dados climáticos (temperatura máxima, mínima,
precipitação e umidade relativa) ocorridos durante os períodos experimentais, foram
obtidos de uma estação meteorológica localizada a 300 m da área experimental.
26
5.4.3 Instalação dos experimentos e processamento das amostras
As plantas daninhas após levadas a área experimental, foram
inoculadas com suspensão bacteriana (107 ufc/mL) do isolado 3098C de Xcc. Para a parte
aérea, a suspensão foi pulverizada com auxílio de um pulverizador manual (pressão
máxima de trabalho 3,5 bar) até o ponto de escorrimento. Para a rizosfera, o solo dos vasos
foi infestado com 250 mL da suspensão. Vasos contendo apenas solo foram infestados com
suspensão bacteriana para comparação da capacidade de sobrevivência de Xcc associada à
rizosfera das plantas daninhas com o solo na ausência de plantas.
As avaliações procederam com a amostragem da parte aérea e do
solo aderido às raízes de três plantas, escolhidas ao acaso, para cada espécie estudada.
Amostras compostas de material vegetal foram obtidas em sacos plásticos de 2 L, a partir
do seccionamento, seguida da homogeneização da parte aérea. Assim como, amostras
compostas de solo foram obtidas após a homogeneização do solo removido das raízes das
plantas.
Após a obtenção das amostras compostas, o material foi levado ao
laboratório para o processamento. Cinco gramas de tecido vegetal e dez gramas de solo,
foram pesadas separadamente e transferidas para frascos de Duran contendo 100 mL de
solução salina tampão fosfato (PBS) 0,01M, pH 7,0 esterilizada, sendo levados para
agitação em seguida (200 rpm/30 min). As suspenções obtidas do tecido vegetal da parte
aérea e após o repouso do solo da rizosfera (30 min.), foram diluídas em série (100 a 10-4),
e 100 µL plaqueadas em triplicata no meio de cultura NSARF, e incubadas (28 °C/ 72 h).
Colônias semelhantes a Xcc foram quantificadas, sendo dados da parte aérea
transformados em log10 do número de ufc.g de tecido-1, e os dados da rizosfera
transformados em log10 do número de ufc.g de solo seco-1. A umidade das amostras
compostas do solo da rizosfera foi determinada por meio de um analisador de umidade por
infravermelho (Gehaka, IV 2500, Brasil).
As avaliações foram realizadas a cada sete dias, por 70 dias (dez
avaliações), ou até a não recuperação de células viáveis de Xcc das amostras. O
delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com dez repetições por
planta daninha. Cada repetição foi representada por um vaso contendo três plantas. A
umidade do solo foi mantida em todos os experimentos adicionando-se 250 mL de água em
cada vaso, de acordo com a necessidade das espécies infestantes. Para a avaliação da
27
influência da umidade do solo na sobrevivência de Xcc associada à rizosfera de plantas
daninhas, dados de umidade foram coletados diariamente, por meio da amostragem do solo
de três vasos, seguida da leitura no analisador de umidade por infravermelho, até não
sobrevivência de Xcc.
Tabela 2. Plantas daninhas utilizadas na avaliação da capacidade de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera (Experimento 1).
Família botânica
Asteraceae
Brassicaceae
Convolvulaceae
Euphorbiaceae
Malvaceae
Rubiaceae
Solanaceae
Nome científico
Bidens pilosa
Raphanus raphanistrum
Ipomea grandifolia
Euphorbia heterophylla
Sida rhombifolia
Richardia brasiliensis
Nicandra physaloides
Nome comum
Picão preto
Nabiça
Corda-de-viola
Leiteira
Guanxuma
Poaia
Joá de Capote
Tabela 3. Plantas daninhas utilizadas na avaliação da capacidade de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera (Experimento 2).
Família botânica
Amaranthaceae
Asteraceae
Asteraceae
Asteraceae
Brassicaceae
Cyperaceae
Fabaceae
Poaceae
Portulacaceae
Solanaceae
Nome científico
Amaranthus viridis
Conyza bonariensis
Galisonga parviflora
Sonchus oleraceus
Raphanus raphanistrum
Cyperus rotundus
Senna obtusifolia
Cenchrus echinatus
Portulaca oleraceae
Physalis angulata
Nome comum
Caruru-de-mancha
Buva
Picão-branco
Serralha verdadeira
Nabiça
Tiririca
Fedegoso
Capim-carrapicho
Beldroega
Bucho de rã
Tabela 4. Plantas daninhas utilizadas na avaliação da capacidade de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera (Experimento 3).
Família botânica
Amaranthaceae
Asteraceae
Asteraceae
Brassicaceae
Brassicaceae
Commelinaceae
Lamiaceae
Poaceae
Poaceae
Poaceae
Solanaceae
Nome científico
Alternanthera tenella
Emilia fosbergii
Gnaphalium purpureum
Lepidium virginicum
Raphanus raphanistrum
Commelina benghalensis
Leonorus sibiricus
Brachiaria decumbens
Digitaria insularis
Rhynchelytrum repens
Datura stramonium
Nome comum
Apaga-fogo
Falsa-serralha
Macela
Mastruz
Nabiça
Trapoeraba
Rubim
Capim braquiária
Capim-amargoso
Capim-favorito
Quinquilho
28
5.4.4 Preservação e caracterização dos isolados bacterianos
Colônias semelhantes a Xcc foram selecionadas de alguns
tratamentos dos experimentos de sobrevivência no filoplano e rizosfera de plantas daninhas
e preservadas em 30% glicerol (v/v) a -80°C, para caracterização. A caracterização dos
isolados foi realizada através do teste bioquímico de hidrólise de amido, teste de
patogenicidade em folhas destacadas de couve, e reação da PCR (reação de polimerização
em cadeia), utilizando os iniciadores específicos HrcCF2 (5’–CGTGTGGATGTGCAGA
CC–3’) e HrcCR2 (5’–CAGATCTGTCTGATCGGTGTCG–3’), que amplificam um
fragmento de 519 pb do gene cromossomal hrcC, associado à patogenicidade de Xcc em
brássicas, conforme Zaccardelli et al. (2007).
Para extração do DNA bacteriano, os isolados foram cultivados em
meio de cultura NSA a 28°C, por 48h. Porções de colônias presentes na superfície do meio
de cultura foram transferidas para tubos de centrifuga contendo 500 µL de água destilada e
esterilizada de forma a obter suspensões à 108 ufc/mL, sendo submetidas ao tratamento
térmico, 95 °C por 15 minutos. Para a reação de PCR, empregou-se 6,25 µL de GoTaq®
Green Master Mix (Promega, EUA), 0,25 µL de cada um dos iniciadores (concentração de
uso 100mM), 4,25 µL de água Milli-Q® e 1,5 µL do DNA bacteriano, obtendo-se um
volume total de 12,5 µL. O programa utilizado no termociclador (Eppendorf, Mastercycler
nexus gradient, EUA) para reação de PCR foi adaptado Zaccardelli et al. (2007), e
consistiu de uma desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos de 95°C
por 1 minuto para desnaturação, 58°C por 30 segundos para o anelamento, 72°C por 1
minuto para extensão, e 72°C por 15 minutos para extensão final. Os produtos da
amplificação foram submetidos a eletroforese horizontal (100 V por 40 minutos) em gel
constituído de agarose 1% (p/v), tampão TBE 1X (Tris/Ácido bórico/EDTA), e o corante
Neotaq Brilliant Green Plus (7 µL/100 mL). Empregou-se Marcador Molecular de 1Kb
Plus da Invitrogen®. As bandas de DNA foram visualizadas e registradas em
fotodocumentador, sob luz UV (GelDoc-It, Imaging Sytem UVP, EUA).
29
6 RESULTADOS
6.1 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em
condições de campo
O período de sobrevivência do isolado 3098C de Xcc variou entre
os experimentos realizados sob condições de campo (Tabela 5). Nos experimentos 2 e 3 o
isolado sobreviveu por quatro dias e por sete dias, nos demais experimentos. A população
média inicial do isolado 3098C foi de 6,3x106 ufc/g de solo seco, sendo a maior população
inicial observada no experimento 2 (1,4x107 ufc/g de solo) e a menor, no experimento 4
(2,8x106 ufc/g de solo) (Tabela 5).
Dados de temperatura, precipitação e umidade do solo registrados
durante a condução dos ensaios foram distribuídos de acordo com os períodos
sobrevivência, para uma melhor compreensão da influência das condições climáticas na
sobrevivência de Xcc (Tabela 6). Nos primeiros quatros dias, maiores médias de
temperaturas máxima e mínima, ocorreram nos experimentos 5 (29,6 ºC) e 2 (14,6 ºC), e os
menores valores, experimentos 1 (18 ºC) e 3 (10, 2ºC), respectivamente. Baixos índices de
precipitação ocorreram nesse período, sendo 8,6 mm (experimento 4) o maior volume
acumulado. Com relação aos teores médios de umidade do solo, o maior valor ocorreu no
30
experimento 1 (10.7 %) e o menor, experimento 5 (5.4%). Aos sete dias da sobrevivência
de Xcc, os maiores valores médios de temperatura máxima e mínima foram observados nos
experimentos 5 (29.5 °C e 12,7 °C), e os menores valores, experimento 1 (19,8 ºC) e 4
(10,9 ºC), respectivamente. Para a precipitação, 9,9 mm (experimento 4) foi o maior valor
observado. Com relação à umidade do solo, o maior valor observado foi no experimento 1
(9.0%) e o menor, experimento 5 (3,9 %).
Tabela 5. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv.
campestris (ufc/g de solo seco) associado ao solo sob condições de campo em cinco
experimentos durante o ano de 2014.
Dia
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Exp. 1
7,8x106
1,9x106
1,9x106
3,6x105
7,2x104
4,1x104
1,5x103
2,4x102
0
Exp. 2
1,4x107
1,3x106
1,7x105
6,3x103
2,4x103
0
-
Exp. 3
2,9x106
6,8x105
8,3x104
3,5x102
1,2x103
0
-
Exp. 4
2,8x106
8,1x104
1,6x104
9,3x103
1,5x103
1,7x103
1,7x103
7,9x102
0
Exp. 5
4,4x106
2,5x105
3,4x104
1,3x104
7,7x103
4,9x103
1,6x103
5,4x102
0
Tabela 6. Temperatura máxima e mínima (ºC), precipitação (mm) e umidade do solo (%)
em diferentes períodos, durante a condução dos experimentos de sobrevivência do isolado
3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo sob condições de campo.
Experimento
1
2
3
4
5
Experimento
1
2
3
4
5
Temp. Mínima
11,2
14,6
10,2
10,5
12,3
Temp. Mínima
11,4
10,9
12,7
4° dia
Temp. Máxima
Precipitação
18,0
6,4
24,4
0,0
22,7
2,5
25,1
8,6
29,6
0,0
7° dia
Temp. Máxima
Precipitação
19,8
6,4
25,2
9,9
29,5
0,0
Umidade do Solo
10,7
6,8
6,9
8,0
5,4
Umidade do Solo
9,0
6,5
3,9
31
6.2 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em
condições controladas
Os diferentes tipos de solo influenciaram na sobrevivência do
isolado 3098C de Xcc sob condições controladas (Tabela 7). O maior período de
sobrevivência foi de 24 dias no solo B, e o menor 10 dias, no solo A. Nos demais solos
avaliados, a sobrevivência variou de 14 a 16 dias. A população média inicial do isolado
3098C foi de 1,8x107 ufc/g de solo seco, sendo a maior população inicial verificada no
solo F (2,6x107 ufc/g de solo) e a menor, solos A e B (1,4x107 ufc/g de solo).
Tabela 7. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv.
campestris (ufc/g de solo seco) associado ao solo sob condições controladas.
Dia
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Solo A
1,4x107
1,0x106
3,3x104
3,0x103
1,2x102
1,2x102
0
-
Solo B
1,4x107
1,1x106
1,9x105
7,5x104
4,5x104
2,6x104
2,9x104
8,7x103
5,4x103
3,3x103
3,7x102
3,7x102
2,5x102
0
Solo C
1,5x107
4,3x105
1,2x105
8,4x103
9,9x102
6,2x102
1,2x102
0
-
Solo D
1,9x107
1,2x106
1,5x105
2,6x104
4,9x103
2,6x103
2,6x103
4,9x102
1,2x102
0
-
Solo E
2,1x107
2,0x106
8,8x104
1,5x104
2,4x103
1,4x103
7,4x102
2,5x102
0
-
Solo F
2,6x107
1,2x106
6,4x104
1,9x104
1,7x103
9,9x102
8,6x102
7,4x102
0
-
6.3 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e
rizosfera de plantas daninhas
Os períodos de sobrevivência do isolado 3098C de Xcc no
filoplano das plantas daninhas variaram conforme a espécie e época de condução dos
experimentos (Tabela 8). No filoplano de R. raphanistrum, planta hospedeira empregada
como controle em todos os experimentos, Xcc foi capaz de sobreviver por 70 dias (período
de duração dos experimentos), exceto no experimento 2 conduzido em 2015, na qual
sobreviveu por 35 dias, pois não foi possível fazer outras avaliações devido à falta de
32
plantas.
Para as espécies B. pilosa, I. grandifolia, E. heterophylla, R.
brasiliensis e N. physaloides empregadas no experimento 1, os períodos de sobrevivência
de Xcc variaram de 14 a 21 dias no filoplano. Baixa sobrevivência da bactéria foi
observada em S. rhombifolia (família Malvaceae), tendo sobrevivido por menos de 7 dias.
Quando esse mesmo experimento foi instalado em 2015, os períodos de sobrevivência de
Xcc no filoplano dessas plantas daninhas variaram entre 21 e 49 dias (Tabela 8).
Tabela 8. Períodos de sobrevivência do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv.
campestris em dias, após a inoculação do filoplano e rizosfera de plantas daninhas.
Família
Amaranthaceae
Amaranthaceae
Asteraceae
Asteraceae
Asteraceae
Asteraceae
Asteraceae
Asteraceae
Brassicaceae
Brassicaceae
Commelinaceae
Convolvulaceae
Cyperaceae
Euphorbiaceae
Fabaceae
Lamiaceae
Malvaceae
Poaceae
Poaceae
Poaceae
Poaceae
Portulacaceae
Rubiaceae
Solanaceae
Solanaceae
Solanaceae
-
Espécie
Amaranthus viridis
Alternanthera tenella
Bidens pilosa
Conyza bonariensis
Galisonga parviflora
Sonchus oleraceus
Emilia fosbergii
Gnaphalium purpureum
Raphanus raphanistrum
Lepidium virginicum
Commelina benghalensis
Ipomea grandifolia
Cyperus rotundus
Euphorbia heterophylla
Senna obtusifolia
Leonorus sibiricus
Sida rhombifolia
Cenchrus echinatus
Brachiaria decumbens
Digitaria insularis
Rhynchelytrum repens
Portulaca oleraceae
Richardia brasiliensis
Nicandra physaloides
Physalis angulata
Datura stramonium
Solo
Filoplano*
<7c,d
≤7e,f
21a - 42b
7d - 28c
28c - 42d
14c - 21d
7e - 56f
14f - 35e
35d - 70a,b,c,e,f
42f -56e
7f - 35e
14a - 49b
<7c - 21d
14a - 42b
14c - 28d
<7f - 35e
<7a - 35b
7c,d
7e - 14f
<7e,f
7e,f
7c - 42d
14a - 35b
21a,b
14c - 28d
7e,f
-
Rizosfera*
7d - 14c
<7e,f
≤7b,a
<7d- 14c
≤7c,d
≤7d,c
7e - 14f
7e,f
7e - 21a,b,c,f - 28d
7e,f
<7e,f
≤7a,b
≤7c,d
7a - 14b
≤7c,d
<7e,f
7a,b
<7c,d
≤7f,e
<7e - 14f
<7e - 14f
7d - 14c
<7b - 14a
7a - 14b
7d - 14c
<7e,f
≤7b,c,d,f, a
*Períodos de sobrevivência em ordem crescente, para os experimentos conduzidos em 2014 e 2015. aPlantas daninhas empregadas no experimento 1, conduzido em 2014; b- Plantas daninhas empregadas no
experimento 1, conduzido em 2015; c- Plantas daninhas empregadas no experimento 2, conduzido em 2014;
d- Plantas daninhas empregadas no experimento 2, conduzido em 2015; e- Plantas daninhas empregadas no
experimento 3, conduzido em, 2014; f- Plantas daninhas empregadas no experimento 3, conduzido em 2015.
33
No experimento 2, Xcc sobreviveu menos de 7 dias em C. rotundos
(família Cyperaceae). Nas espécies C. bonariensis, G. parviflora, S. oleraceus, S.
obtusifolia, P. oleraceae e P. angulata, os períodos de sobrevivência variaram de 7 a 28
dias. Maiores períodos de sobrevivência foram observados nessas espécies (21 a 42 dias)
quando o experimento 2 foi instalado em março de 2015, exceto para C. bonariensis, na
qual a bactéria sobreviveu por 7 dias no filoplano. Foi verificada uma baixa sobrevivência
de Xcc no filoplano de A. viridis e C. echinatus, (famílias Amaranthaceae e Poaceae,
respectivamente).
No filoplano de L. virginicum, espécie descrita como hospedeira de
Xcc na literatura, a bactéria sobreviveu por 56 dias no experimento 3. Nas espécies G.
purpureum, C. benghalensis e L. sibiricus, a bactéria sobreviveu por 35 dias, porém em E.
fosbergii, apenas 7 dias. Períodos de sobrevivência menores foram observados para essas
espécies em 2015, exceto para E. fosbergii, tendo a bactéria sobrevivido por 56 dias no
filoplano. Em L. sibiricus Xcc sobreviveu por período inferior a 7 dias, C. benghalensis 7
dias, G. purpureum, 14 dias, em L. virginicum por até 42 dias no filoplano. Membros da
família Poaceae, Solanaceae e Amaranthaceae, não demonstraram potencial para a
sobrevivência epifítica de Xcc.
Dados climáticos registrados durante a condução dos experimentos
de sobrevivência no filoplano foram agrupados de acordo com os períodos de maior
sobrevivência de Xcc (Tabelas 9, 10 e 11). Temperaturas mínimas médias superiores a 14
ºC e máximas médias inferiores a 29 ºC, precipitações frequentes (acima de 32 mm) e
umidades relativas elevadas (acima de 70%) nas primeiras semanas de condução dos
experimentos, contribuíram para períodos de sobrevivência de Xcc prolongados no
filoplano das plantas daninhas. Entretanto, sob temperaturas mínimas média inferiores a 14
ºC e temperaturas máximas média superiores a 30 ºC, precipitação descontínua e umidade
relativa baixa (abaixo de 70%) nas primeiras semanas, contribuíram para que a bactéria
sobrevivesse por um tempo limitado no filoplano das plantas daninhas.
Baixa capacidade de sobrevivência do isolado 3098C foi observada
na rizosfera de um grande número de espécies quando comparada ao controle (solo), na
qual Xcc sobreviveu por até 7 dias. Na espécie R. raphanistrum, os períodos de
sobrevivência da bactéria variaram de 7 a 28 dias, com predominância para 21 dias (Tabela
8). Em A. viridis, C. bonariensis, E. fosbergii, E. heterophylla, D. insularis, R. repens, P.
oleraceae, R. brasiliensis¸ N. physaloides e P. angulata Xcc sobreviveu por até 14 dias. As
34
demais não apresentaram potencial para a sobrevivência de Xcc na rizosfera. Apesar de
haver diferença entre os períodos de sobrevivência de algumas espécies, não foi encontrada
relação entre as épocas de instalação dos experimentos e a capacidade se sobrevivência na
rizosfera.
A quantificação da população do isolado 3098C de Xcc no
filoplano e rizosfera das plantas daninhas foi realizada e os resultados estão apresentados
no apêndice (Tabelas 1 a 12).
Tabela 9. Temperatura máxima e mínima (ºC), umidade do solo (%), precipitação (mm), e
umidade relativa (%) em diferentes períodos, durante a condução do experimento de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 1).
Tempo
0-7
8-14
15-21
22-28
29-35
36-42
43-49
50-56
57-63
64-70
Tempo
0-7
8-14
15-21
22-28
29-35
36-42
43-49
50-56
57-63
64-70
Experimento 1
Temp. Min. Méd. Temp. Máx. Méd. Umidade solo Precipitação U. R.
10,6
27,3
18,8
35,4
70,1
12,1
27,6
17,2
0,0
63,9
13,3
30,8
16,5
0,0
56,2
12,1
27,2
17,5
25,7
82,7
13,8
27,1
50,4
85,5
9,1
24,1
0,0
66,2
17,9
34,2
0,0
45,5
13,5
31,8
0,0
67,2
12,8
29,9
30,8
66,9
14,7
30,3
69,7
71,5
Experimento 1 - Repetição
Temp. Min. Méd. Temp. Máx. Méd. Umidade solo Precipitação U. R.
17,6
27,6
21,3
95,0
90,0
17,9
28,3
19,0
115,5
86,6
18,9
28,7
18,4
34,4
76,5
17,2
29,4
18,0
1,5
76,0
17,6
27,6
142
85,1
17,6
26,9
36,4
87,8
16,4
24,9
31,8
74,8
17,4
28,0
55,2
77,5
16,1
26,6
0,9
78,9
12,4
27,5
0,0
76,8
35
Tabela 10. Temperatura máxima e mínima (ºC), umidade do solo (%), precipitação (mm),
e umidade relativa (%) em diferentes períodos, durante a condução do experimento de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 2).
Tempo
0-7
8-14
15-21
22-28
29-35
36-42
43-49
50-56
57-63
64-70
Temp. Min. Méd.
13,8
9,1
17,9
13,5
12,8
14,7
14,2
11,7
14,1
15,2
Tempo
0-7
8-14
15-21
22-28
29-35
36-42
43-49
Temp. Min. Méd.
17,2
16,1
14,4
17,3
17,3
13,8
12,8
Experimento 2
Temp. Máx. Méd. Umidade solo
27,8
18,3
24,1
17,1
34,2
11,3
31,8
13,1
29,9
30,3
28,9
27,8
27,1
27,7
Experimento 2 - Repetição
Temp. Máx. Méd. Umidade solo
27,9
20,3
26,6
19,5
27,5
18,6
28,3
19,1
26,7
16,1
25,2
22,3
-
Precipitação
61,9
0,0
0,0
0,0
30,8
69,7
10,5
4,5
59,1
0,0
U. R.
84,8
66,2
45,5
67,2
66,9
71,5
77,7
70,0
88,8
75,9
Precipitação
55,1
0,9
0,0
44,5
1,0
35,1
18,9
U. R.
77,3
78,9
76,8
84,0
82,2
71,1
81,8
36
Tabela 11. Temperatura máxima e mínima (ºC), umidade do solo (%), precipitação (mm) e
umidade relativa (%) em diferentes períodos, durante a condução do experimento de
sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 3).
Tempo
0-7
8-14
15-21
22-28
29-35
36-42
43-49
50-56
57-63
64-70
Temp. Min. Méd.
14,4
11,6
14,4
15,6
14,4
14,0
15,2
18,5
18,8
20,4
Tempo
0-7
8-14
15-21
22-28
29-35
36-42
43-49
50-56
57-63
64-70
Temp. Min. Méd.
14,1
15,2
12,0
11,9
12,5
12,6
18,8
17,4
14,6
16,2
Experimento 3
Temp. Máx. Méd. Umidade solo
29,1
16,2
26,9
13,7
27,5
27,6
27,3
28,1
27,6
32,6
31,5
33,0
Experimento 3 -Repetição
Temp. Máx. Méd. Umidade solo
27,8
15,8
27,3
15,4
24,2
15,3
26,6
14,7
24,1
24,2
33,2
29,2
27,3
29,4
-
Precipitação
15,0
0,0
59,1
32,5
44,3
73,9
112,2
1,6
119,8
50,5
U. R.
78,1
70,3
90,4
71,2
78,1
100,0
88,6
70,5
79,6
68,1
Precipitação
0,0
0,0
50,6
3,8
83,4
63,6
0,0
71,9
4,1
23,0
U. R.
59,0
58,9
69,5
48,8
80,2
82,6
49,2
80,7
80,1
72,6
6.3.1 Caracterização dos isolados bacterianos
Os isolados selecionados dos experimentos de sobrevivência de
Xcc no filoplano e na rizosfera de plantas daninhas apresentaram resultados positivos para
hidrólise de amido (Figura 1), desenvolveram sintomas de podridão negra em folhas de
couve no teste de patogenicidade (Figura 2), e reação positiva de PCR com os iniciadores
específicos para Xcc (Figura 3).
37
Figura 1. Hidrólise positiva de amido para Xanthomonas campestris pv. campestris, a
partir do filoplano de Cyperus rotundus (T1) e Raphanus raphanistrum (T2).
T8
T3
T5
T
T4
T6
T9
T2
T7
T1
Figura 2. Teste de patogenicidade em folhas destacadas de couve. T- Testemunha negativa;
Xanthomonas campestris pv. campestris provenientes de plantas daninhas inoculadas; T1
– Cyperus rotundus; T2 – Raphanus raphanistrum; T3 – Sonchus oleraceus; T4 –
Lepidium virginicum; T5 – Senna obtusifolia; T6 – Physalis angulata; T7 – Portulaca
oleraceae; T8 – Amaranthus viridis; T9 – Conyza bonariensis.
38
.
519 Pb
519 Pb
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1% resultante das amplificações dos isolados de
Xanthomonas campestris pv. campestris utilizando iniciadores específicos. MM Marcador Molecular, 1Kb Plus Invitrogen®; CP - Controle positivo, isolado 3098C; CNControle negativo; Xanthomonas campestris pv. campestris provenientes de plantas
inoculadas; T1 – Cyperus rotundus; T2 – Raphanus raphanistrum; T3 – Sonchus
oleraceus; T4 – Lepidium virginicum; T5 – Senna obtusifolia; T6 – Physalis angulata; T7
– Portulaca oleraceae; T8 – Amaranthus viridis; T9 – Conyza bonariensis; T10 –
Commelina benghalensis.
39
7 DISCUSSÃO
7.1 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no solo em
condições de campo e controladas
O solo é um ambiente diversificado na qual seus atributos
químicos, físicos e biológicos, somados aos fatores climáticos, influenciam no desempenho
dos mecanismos de sobrevivência dos fitopatógenos (MENZIES, 1963). É de
conhecimento que bactérias do gênero Xanthomonas são pouco adaptadas a sobrevivência
no solo, tendo suas populações reduzidas em um curto espaço de tempo. Entretanto, há
poucas informações referentes à sobrevivência de Xcc e os atributos do solo que interferem
na ecologia da bactéria (HIRANO; UPPER, 1983; LÓPEZ et al., 1999), principalmente nas
condições brasileiras.
No presente estudo, Xcc apresentou baixa capacidade de
sobrevivência como células livres no solo em condições de campo. Mesmo empregando-se
uma concentração elevada de inóculo para infestação do solo em campo, condição pouco
provável de acontecer em condições naturais, a população de Xcc declinou rapidamente.
Ao analisar os cinco experimentos realizados em condições de campo, é possível verificar
que a temperatura influenciou a sobrevivência de Xcc no solo. Embora nos primeiros
40
quatros dias dos experimentos a maior temperatura máxima média tenha sido registrada no
experimento 5 (29,6 ºC), Xcc foi capaz de sobreviver por até 7 dias, assim como nos
experimentos 1 e 4 (temperaturas máximas médias de 18 e 25 ºC, respectivamente). No
experimento 2, a temperatura máxima média (24,4 ºC) foi menor que nos experimentos 5 e
4, porém sua temperatura mínima média foi superior a todos os experimentos (14,2 ºC).
Um maior período de sobrevivência de Xcc era esperado no experimento 3 (temperatura
máxima e mínima de 22,7 e 10, 2 ºC), porém a bactéria sobreviveu por apenas 4 dias.
A precipitação e os teores de umidade podem também ter
influenciado na sobrevivência da bactéria. Durante os quatro primeiros dias dos
experimentos 1 e 4, por exemplo, foram registrados 6,4 e 8,6 mm de chuva,
respectivamente, assim como, 10,7 e 8,0 % de umidade no solo, e a bactéria sobreviveu por
7 dias. Já no experimento 2, na qual não houve precipitação e a umidade do solo foi de 6,8
%, o tempo de sobrevivência foi menor. No experimento 3, entretanto, apesar de um
pequeno volume de chuva ter ocorrido (2,5 mm), um baixo teor de umidade foi registrado
(6,9%), o que poderia ter contribuído para o curto período de sobrevivência de Xcc.
Comportamento não esperado ocorreu no experimento 5, pois mesmo não havendo
precipitação e o teor de umidade do solo sendo baixo (5,4 %), Xcc sobreviveu por até 7
dias.
Além dos fatores climáticos, as propriedades físico-químicas e a
microbiota do solo poderiam explicar a diferença entre os períodos de sobrevivência de
Xcc obtidos no presente estudo. Períodos estes considerados muito baixos quando
comparados aos estudos desenvolvidos em outros países. Na Geórgia (EUA), Xcc
sobreviveu por 14 dias no solo durante o verão, e por até 42 dias no inverno (SCHAAD;
WHITE, 1974). No Hawaii, Xcc sobreviveu de 48 a 98 dias no solo após a colheita de
plantas de couve em áreas naturalmente e artificialmente infestadas com a bactéria
(ALVAREZ; CHO, 1978).
No experimento realizado com diferentes solos em condição
controlada, ficou clara a influência de determinados fatores físico-químicos, como textura,
pH e teor de matéria orgânica, na sobrevivência de Xcc. O solo A, coletado na mesma área
onde foram realizados os experimentos de campo, foi o único de textura média e menor pH
(4.2) e teor de matéria orgânica (13 g/dm3), tendo Xcc sobrevivido por 10 dias. Já nos
demais solos, coletados em áreas com cultivo de brássicas, apresentaram textura argilosa,
faixas de pH entre 5.0 e 5.9, e teores de matéria orgânica entre 18 a 28 g/dm3, os períodos
41
de sobrevivência de Xcc foram 12 e 24 dias.
Uma explicação para o maior período de sobrevivência em solos
argilosos, é que as bactérias Gram-negativas em condição de baixa umidade se abrigam no
interior dos agregados de argila devido a uma maior disponibilidade de água e proteção a
organismos antagonistas. Isso sugere que em solos arenosos, com baixa formação de
agregados, as bactérias apresentam menor capacidade de sobrevivência, em comparação
com solos de textura argilosa (HATTORI 1973, citado por MARSHALL, 1975). Com
relação ao pH, quanto mais próximo da neutralidade, melhor para a sobrevivência da
bactéria (SANTIRANJAN et al., 1986), como observado no solo B, de pH mais elevado, e
que provavelmente favoreceu a sobrevivência de Xcc. A matéria orgânica, entretanto, tanto
pode favorecer, como desfavorecer a sobrevivência de bactérias no solo, pois afeta
diretamente a disponibilidade de nutrientes, assim como, favorece indiretamente o
crescimento de microrganismos antagonistas (MENZIES, 1963).
Como os períodos de sobrevivência em condição controlada foram
maiores nos solos coletados em campos de brássicas do que no solo A, provavelmente Xcc
pode sobreviver por períodos maiores em condição de campo, do que nos períodos de
sobrevivência obtidos neste estudo. O solo A, apesar de possuir características físicoquímicas, e possivelmente biológicas, diferentes dos solos utilizados no cultivo de
brássicas, foi selecionado para servir de modelo para compreender a influência das
condições climáticas na sobrevivência de Xcc. Além disso, o experimento de
sobrevivência em condição controlada, contribuiu para elucidar quais parâmetros podem
afetar a sobrevivência da bactéria no solo.
7.2 Sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris no filoplano e
rizosfera de plantas daninhas
As plantas daninhas são consideradas importantes reservatórios de
bactérias fitopatogênicas, contribuindo para a persistência do inóculo no campo (JONES et
al., 1986).
É de conhecimento que plantas daninhas da família Brassicaceae são
importantes hospedeiras de Xcc (SCHAAD; DIANESE,1981; KISHUN; CHAND, 1988).
Porém, até o momento, poucos trabalhos foram realizados visando avaliar a sobrevivência
42
no filoplano e rizosfera dessas espécies, assim como em espécies de outras famílias
botânicas.
O filoplano é um ambiente hostil para as fitobactérias, pois
encontra-se exposto à atmosfera, sofre a influência da luz solar, de rápidas flutuações de
temperatura, umidade relativa e precipitação, além de possuir fontes limitadas de nutrientes
(LINDOW; BRANDL, 2003; VORHOLT, 2012). A rizosfera, em contrapartida, oferece
maior proteção às variações climáticas e possui fontes mais abundantes de carbono e
minerais (BRENCIC; WINANS, 20005). Resultados obtidos no presente estudo
demonstraram que o filoplano das plantas daninhas é um importante nicho para Xcc, capaz
de assegurar a sobrevivência da bactéria por longos períodos, ao contrário do que foi
observado na rizosfera. Uma explicação para este comportamento é que bactérias do
gênero Xanthomonas são altamente especializadas em se multiplicar nos tecidos vegetais
(RUDOLPH, 1993) e pouco adaptadas à sobrevivência no solo (MENZIES, 1963;
SCHUSTER; COYNE, 1974), mesmo no solo da região da rizosfera.
Dentre as plantas daninhas utilizadas neste estudo, L. virginicum e
R. raphanistrum apresentaram elevado potencial para sobrevivência epifítica de Xcc.
Ambas espécies são membros da família Brassicaceae e foram descritas como hospedeiras
de Xcc por Schaad em 1976 (LEYNS et al., 1984). R. raphanistrum empregada como
controle em todos os experimentos, foi a única espécie que possibilitou a sobrevivência da
bactéria no filoplano durante os 70 dias dos experimentos. A presença de sintomas foi
observada em algumas plantas, porém não foi realizado o isolamento para comprovação. L.
virginicum assegurou a sobrevivência de Xcc por 42 dias no filoplano, porém não foram
verificados sintomas da infecção pela bactéria nesta espécie. A capacidade de
sobrevivência epifítica de Xcc em L. virginicum, também foi comprovada por Schaad e
Dianese (1981), a partir de folhas coletadas em diferentes áreas com histórico da podridão
negra na Geórgia, EUA.
Espécies de plantas daninhas não hospedeiras de Xcc, das famílias
Asteraceae, Commelinaceae, Convolvulaceae, Cyperaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae,
Lamiaceae, Malvaceae, Rubiaceae e Solanaceae, mostraram-se potenciais a sobrevivência
da bactéria, porém foram influenciadas pelas condições ambientais. Toussaint et al. (2012)
verificaram que melhores condições umidade e temperatura empregadas em condições
controladas contribuiram para que X. c. vitians sobrevivesse 30 dias com uma elevada
população no filoplano de plantas não hospedeiras da bactéria. Neste trabalho, apesar de
43
maiores períodos de sobrevivência serem observados em melhores condições de umidade e
temperatura, suas populações foram baixas quando comparadas Raphanus raphanistrum
(Apêndice, tabelas de 1 a 12).
Plantas
daninhas
das
famílias
Poaceae
e
Amaranthaceae
apresentaram baixo potencial para sobrevivência de Xcc no filoplano, sendo pouco
influenciadas pelas condições ambientais. Vários fatores podem explicar a menor
capacidade de sobrevivência da bactéria nestas famílias. A topografia das folhas é um dos
fatores que pode influenciar na dinâmica das populações epifíticas (O'BRIEN; LINDOW,
1989; TOUSSAINT et al., 2012). Arias et al. (2000) observaram que a superfície das
folhas do trigo (Poaceae) impediu a aderência de Xcc, o que justifica o menor período de
sobrevivência nessa espécie, ao contrário do que ocorreu em folhas de couve, mostarda
(Brassicaceae) e alface (Asteraceae), na qual a bactéria sobreviveu por períodos elevados.
O’Brien e Lindow (1989) argumentam que plantas que possuem folhas com cutícula cerosa
tendem a assegurar populações bacterianas inferiores às plantas com folhas tricomáticas. A
disponibilidade de nutrientes no filoplano varia de acordo com a espécie, idade da folha e
as condições de crescimento, e pode influenciar na sobrevivência das fitobactérias
(MERCIER; LINDOW, 2000). Compostos químicos contidos na superfície das plantas,
produzidos por elas próprias ou por outros microrganismos também influenciam na
sobrevivência (VORHOLT, 2012).
De modo geral, é possível verificar que a temperatura, precipitação
e umidade relativa ocorridos durante os experimentos influenciaram na sobrevivência de
Xcc no filoplano das plantas daninhas, exceto para as espécies R. raphanistrum, A. viridis,
C. echinatus, N. physaloides e D. stramonium, cujos períodos de sobrevivência não foram
afetados. Temperaturas máximas inferiores a 29,4 ºC nas primeiras semanas, baixa
variação entre as temperaturas máxima e mínima, elevados índices pluviométricos e
umidades relativas elevadas, contribuíram para que Xcc sobrevivesse por um período
maior no filoplano das plantas daninhas. Nos experimentos em que as temperaturas foram
elevadas nas primeiras semanas e com grande variação entre temperaturas máxima e
mínima, assim como baixo índice pluviométrico e baixa umidade relativa, os períodos de
sobrevivência no filoplano foram menores. Gent et al. (2005) verificaram que sob altas
temperaturas e baixa umidade, o grão de bico e a soja apresentaram baixo potencial para a
sobrevivência epifítica de X. axonopodis pv. allii. Os autores argumentaram que melhores
condições ambientais poderiam favorecer a sobrevivência dessa bactéria no filoplano das
44
leguminosas.
Poucas espécies de plantas daninhas demostraram potencial à
sobrevivência de Xcc na rizosfera quando comparadas ao controle negativo (solo). O
controle positivo (R. raphanistrum), foi a espécie que manteve a população bacteriana por
maior tempo na rizosfera (até 28 dias). As plantas daninhas A. viridis, C. bonariensis, E.
fosbergii, E. heterophylla, D. insularis, R. repens, P. oleraceae, R. brasiliensis¸ N.
physaloides e P. angulata possibilitaram que Xcc sobrevivesse até 14 dias na rizosfera.
Período semelhante de sobrevivência foi verificado por Thaveechai et al. (1993), para X.
axonopodis pv. manihotis, na rizosfera de Digitaria sp., Dactyloctenium aegyptium e
Fimbristylis monostachya. Bashan et al. (1982) verificaram que plantas de ervilha, feijão,
pepino, sorgo e trigo, foram capazes de manter populações de X. vesicatoria por até 30 dias
na rizosfera. No presente estudo, as demais espécies de plantas, não apresentaram potencial
para sobrevivência de Xcc na rizosfera, já que seus períodos de sobrevivência não
diferiram do controle negativo.
Vários autores argumentam que diferentes espécies de plantas
podem selecionar populações microbianas específicas na rizosfera (WU et al., 2015;
GRAYSTON et al., 1998; SMALLA et al., 2001), graças à liberação de compostos
químicos pelas raízes que alteram a composição química do solo da rizosfera e servem de
substrato para o crescimento de comunidades microbianas específicas (YANG;
CROWLEY, 2000). Esse fato, poderia explicar os resultados aqui obtidos, na qual
determinadas espécies de plantas daninhas não hospedeiras de Xcc foram capazes de
manter a população bacteriana por maiores períodos na rizosfera, enquanto outras espécies
não. Outros fatores podem estar relacionados como o tipo de solo, práticas de cultivo,
disponibilidade de nutrientes, estado nutricional da planta, estágio de crescimento, pH e
umidade (GUO et al., 2015; GRAYSTON et al., 1998; LATOUR et al., 1999; SMALLA et
al., 2001). No presente estudo não foi encontrada relação entre a persistência de Xcc na
rizosfera das diferentes espécies de plantas daninhas, e os fatores climáticos registrados
durante a condução dos experimentos.
Os resultados aqui obtidos sustentam a hipótese de que plantas
daninhas presentes em áreas com histórico da podridão negra são potenciais fontes de
inóculo de Xcc para novos cultivos de brássicas, sendo recomendado a erradicação dos
campos de cultivo.
45
8 CONCLUSÕES
 O solo e a rizosfera de várias espécies de plantas daninhas não
foram nichos apropriados para a sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. campestris.
 Xanthomonas campestris pv. campestris apresentou maior
período de sobrevivência epifítica em plantas de Lepidium virginicum e Raphanus
raphanistrum, pertencentes à família Brassicaceae, do que em plantas daninhas de outras
famílias botânicas avaliadas.
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188, n. 10, p. 3697-3708, 2006.
55
ZACCARDELLI, M. et al. Detection and identification of the crucifer pathogen,
Xanthomonas campestris pv. campestris, by PCR amplification of the conserved Hrp/type
III secretion system gene hrcC. European Journal of Plant Pathology, Dordrecht, v. 118,
n. 3, p. 299-306, 2007.
56
APÊNDICE
APÊNDICE
57
Tabela 1. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado ao filoplano de
plantas daninhas (Experimento 1).
Tempo
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
Nabiça
2,6x104
2,0x104
1,2x105
8,0x105
1,1x106
5,9x106
2,1x106
3,8x107
0
1,1x107
9,8x107
Joá-de-capote
3,4x104
6,0x102
1,0x103
8,0x102
0
-
Corda-de-viola
4,0x104
0
5,8x103
0
-
Planta Daninha
Picão Preto
1,2x105
1,0x103
1,0x103
4,0x102
0
-
Poaia
5,0x104
3,4x103
2,0x102
0
-
Leiteira
7,4x104
4,0x103
6,0x102
0
-
Guanxuma
2,2x105
0
-
Tabela 2. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado a rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 1).
Planta Daninha
Tempo
Nabiça
Joá-de-capote Corda-de-viola Picão Preto
Poaia
Leiteira
Guanxuma
Solo
6
6
6
6
6
6
6
0
4,3x10
3,5x10
1,4x10
1,2x10
3,1x10
1,7x10
2,3x10
1,4x106
2
2
2
3
2
2
7
1,4x10
7,3x10
0
3,6x10
2,1x10
9,2x10
3,7x10
4,8,x102
14
1,8x103
0
0
1,0x102
0
0
0
2
21
3,9x10
0
28
0
-
58
Tabela 3. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado ao filoplano de
plantas daninhas (Repetição - experimento 1).
Tempo
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
Nabiça
3,9x106
2,7x105
1,3x108
1,4x106
1,5x108
1,1x107
2,9x107
2,4x106
2,0x105
9,0x106
1,4x106
Joá de Capote
6,8x104
2,0x103
5,6x104
8,8x102
0
-
Planta Daninha
Corda de Viola
Picão Preto
7,0x104
1,6x105
4
1,2x10
1,6x103
4,4x103
1,8x103
3
4,8x10
1,4x103
2,4x103
4,0x102
3
6,0x10
0
4
1,2x10
5,8x103
2
3,4x10
0
0
-
Poaia
1,0x106
4,0x104
1,4x105
7,0x104
2,8x103
1,2x104
0
-
Leiteira
4,0x105
1,4x104
3,2x103
5,8x103
1,7x104
1,3x104
9,0x104
0
-
Guanxuma
5,4x104
2,2x104
2,9x104
6,0x102
4,3x102
8,7x104
0
-
Tabela 4. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado a rizosfera de
plantas daninhas (Repetição - experimento 1).
Planta Daninha
Tempo
Nabiça
Joá de Capote
Corda de Viola
Picão Preto
Poaia
Leiteira
Guanxuma
Solo
6
7
7
6
6
7
8
0
6,2x10
1,2x10
1,1x10
7,9x10
9,6x10
3,7x10
1,4x10
1,3x107
2
2
2
2
7
0
1,3x10
1,3x10
0
0
1,2x10
2,4x10
0
14
1,4x104
2,6x102
0
6,3x102
0
21
3,0x104
0
0
28
0
-
59
Tabela 5. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado ao filoplano de
plantas daninhas (Experimento 2).
Planta Daninha
Tempo
Nabiça
Picão branco
Buva
Serralha Fedegoso Bucho-de-rã Beldroega Carrapicho Tiririca
Carurú
4
2
2
2
4
0
1,5x10
*
*
*
*
4,0x10
4,0x10
2,0x10
1,1x10
6,0x102
7
7,3x104
1,1x104
4,0x102
9,2x103
1,5x104
1,4x103
4,0x102
2,8x103
0
0
6
4
3
3
2
3
14
9,2x10
1,2x10
7,2x10
1,4x10
4,0x10
1,6x10
0
0
7
3
3
21
1,5x10
1,0x10
1,2x10
0
0
0
28
0
3,3x102
1,2x103
5
35
1,7x10
0
0
42
0
7
49
5,0x10
56
1,4x107
8
63
2,1x10
70
6,0x107
*Ausência de dados devido a problemas no isolamento
Tabela 6. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado a rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 2).
Tempo
0
7
14
21
28
Nabiça
2,9x106
7,9x103
7,3x103
8,5x102
0
Picão branco
9,3x105
0
-
Buva
8,3x105
4,8x102
6,7x102
0
-
Planta Daninha
Serralha Fedegoso Bucho-de-rã Beldroega Carrapicho Tiririca Carurú
2,5x106 9,2x105
1,2x106
1,7x106
4,4x105 4,0x105 6,4x105
3,5x102
0
1,9x103
3,7x102
0
0
2,4x102
2
2
0
8,0x10
8,7x10
3,5x102
0
0
0
-
Solo
1,6x106
0
-
60
Tabela 7. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado ao filoplano de
plantas daninhas (Repetição- experimento 2).
Tempo
Nabiça
Picão branco
Buva
0
5,2x105
5,0x105
4,1x104
7
6,0x106
4,6x104
3,8x103
5
4
14
6,8x10
3,4x10
0
5
4
21
1,7x10
1,5x10
28
0
1,2x104
6
4
35
3,8x10
2,4x10
42
*
8,0x102
49
*
0
56
*
63
*
70
*
*Ausência de dados devido à falta de plantas.
Serralha
2,1x106
3,4x103
0
2,2x103
0
-
Planta Daninha
Fedegoso
Bucho-de-rã
6,0x104
2,5x104
3,5x104
3,0x103
4
2,7x10
1,1x103
2,0x102
0
6,0x102
8,0x102
0
0
-
Beldroega
8,6x105
1,0x103
4,0x102
2,6x103
3,4x103
4,0x102
4,0x102
0
-
Carrapicho
2,0x105
7,2x104
0
-
Tiririca
1,6x105
7,4x103
2,2x104
3,2x103
0
-
Carurú
1,6x105
0
-
Tabela 8. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado a rizosfera de
plantas daninhas (Repetição- experimento 2).
Tempo
0
7
14
21
28
35
Nabiça
4,7x105
3,6x102
8,9x103
4,4x103
4,8x102
0
Picão branco
2,5x106
1,3x102
0
-
Buva Serralha
5,3x105 4,9x105
0
0
-
Fedegoso
8,3x105
1,2x102
0
-
Planta Daninha
Bucho-de-rã
8,1x105
1,3x102
0
-
Beldroega
1,9x106
1,3x102
0
-
Carrapicho
5,6x105
0
-
Tiririca Carurú
Solo
5
6
1,4x10 1,7x10 2,6x105
3,7x102 2,6x102
0
0
0
-
61
Tabela 9. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestres (ufc/g de tecido) associado ao filoplano de
plantas daninhas (Experimento 3).
Tempo
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
Nabiça
Mastruz
Trapoeraba
Rubim
Macela
2,3x105
2,2x104
4,4x106
2,6x107
3,1x107
2,2x107
1,9x107
1,2x107
1,1x108
4,0x105
3,4x105
5,0x104
5,2x104
1,6x103
1,4x104
1,0x105
2,4x104
3,6x104
1,3x105
3,3x103
0
-
8,4x104
2,8x103
4,0x102
5,3x104
4,0x102
1,1x104
0
-
1,6x105
8,0x102
8,0x102
2,2x103
2,4x103
1,6x104
0
-
3,7x105
1,6x104
1,0x103
9,4x103
6,9x103
4,6x103
0
-
Planta Daninha
FalsaQuinquilho Braquiária
serralha
5,8x104
1,1x105
9,2x104
4
4
1,2x10
2,6x10
2,0x102
0
0
0
-
Capimfavorito
0
8,0x102
0
-
Capimamargoso
2,4x104
0
-
Apagafogo
1,6x105
0
-
Tabela 10. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado a rizosfera de
plantas daninhas (Experimento 3).
Planta Daninha
Tempo
FalsaCapimCapimApagaNabiça Mastruz Trapoeraba Rubim
Macela
Quinquilho Braquiária
serralha
favorito
amargoso
fogo
0
2,0x106 1,1x106
8,6x105
9,9x105 8,6x105
1,1x106
8,1x106
2,5x105
1,4x106
1,2x106
3,0x106
7
2,4x103 1,1x102
0
0
1,1x102
3,3x102
0
2,3x102
0
0
0
14
0
0
0
0
0
21
-
62
Tabela 11. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado ao filoplano de
plantas daninhas (Repetição - Experimento 3).
Tempo
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
Nabiça
Mastruz
Trapoeraba
Rubim
Macela
4,2x105
2,0x104
1,4x106
9,4x105
0
6,9x106
1,9x104
2,7x107
1,2x106
2,4x105
2,0x105
5,0x104
1,2x103
7,5x104
0
4,0x102
0
5,3x102
0
-
3,4x104
1,4x104
0
-
5,1x105
0
-
2,7x105
6,0x102
2,4x103
0
-
Planta Daninha
FalsaQuinquilho Braquiária
serralha
1,4x105
4,8x104
6,6x104
4,4x103
2,2x103
0
0
0
5,0x102
0
0
4,0x102
3
1,4x10
8,0x102
0
8,0x102
0
-
Capimfavorito
5,6x103
4,0x103
0
-
Capimamargoso
7,3x104
0
-
Apagafogo
3,2x104
2,0x102
0
-
Tabela 12. Dinâmica populacional do isolado 3098C de Xanthomonas campestris pv. campestris (ufc/g de tecido) associado a rizosfera de
plantas daninhas (Repetição - Experimento 3).
Tempo
0
7
14
21
Nabiça Mastruz Trapoeraba
Rubim
6,3x105 4,1x105
1,1x102 3,2x102
1,1x102
0
2,6x103
-
4,0x105 4,0x105
0
1,1x102
0
-
3,3x105
0
-
Macela
Planta Daninha
FalsaQuinquilho
serralha
3,9x105
3,9x105
0
0
2
1,1x10
0
-
Braquiária
1,1x106
0
0
-
Capimfavorito
7,9x105
0
1,2x102
0
Capimamargoso
7,5x105
0
1,7x102
0
ApagaSolo
fogo
3,1x105 1,6x106
0
0
-