leandro silva willish martos avaliação da apoptose nas populações

LEANDRO SILVA WILLISH MARTOS
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE NAS POPULAÇÕES LEUCOCITÁRIAS
DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES SÉPTICOS
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências
São Paulo
2010
LEANDRO SILVA WILLISH MARTOS
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE NAS POPULAÇÕES LEUCOCITÁRIAS
DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES SÉPTICOS
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
para obtenção do título de Mestre em
Ciências pelo programa de pós-graduação
em Infectologia.
Orientador:
Prof. Dr. Reinaldo Salomão
São Paulo
2010
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Angelo Amato Vincenzo De Paola
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
iii
LEANDRO SILVA WILLISH MARTOS
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE NAS POPULAÇÕES LEUCOCITÁRIAS
DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES SÉPTICOS
Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Salomão
BANCA EXAMINADORA
TITULARES
Dr. Paulo Sérgio Martins
Prof. Dr. Fernando Dall-Pizzol
Dra. Aparecida Dalboni
SUPLENTE
Prof. Dr. Francisco Soriano
Aprovado em:___/___/___
iv
Martos, Leandro Silva Willish
Avaliação da apoptose nas populações leucocitárias do sangue
periférico de pacientes sépticos
xiv, 60f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Evaluation of apoptosis in leukocytes populations of
the peripheral blood of septic patients.
1. Apoptose 2. Leucócitos
5. Linfócitos 6. Citometria de fluxo
3. Sepse
4. Choque séptico
v
Canção da América
Amigo é coisa para se guardar
Debaixo de sete chaves
Dentro do coração
Assim falava a canção que na América ouvi
Mas quem cantava chorou
Ao ver o seu amigo partir
Mas quem ficou, no pensamento voou
Com seu canto que o outro lembrou
E quem voou, no pensamento ficou
Com a lembrança que o outro cantou
Amigo é coisa para se guardar
No lado esquerdo do peito
Mesmo que o tempo e a distância digam "não"
Mesmo esquecendo a canção
O que importa é ouvir
A voz que vem do coração
Pois seja o que vier, venha o que vier
Qualquer dia, amigo, eu volto
A te encontrar
Qualquer dia, amigo, a gente vai se encontrar.
Composição: Fernando Brant e Milton Nascimento
vi
Dedicatória
A um grande amigo, um companheiro de
estrada que nas curvas da vida acabou nos
deixando, meu pai Manoel.
A minha mãe Eunice por acreditar e
ensinar- me a ser o que sou hoje.
A minha irmã Lílian pelo seu carinho.
A Deus pela vida que tenho.
vii
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Reinaldo Salomão, o qual abriu as portas da pesquisa em
meu caminho, pela confiança em meu trabalho, pela paciência e
entendimento das dificuldades que encontrei em meu caminho.
À Drª. Milena Karina Coló Brunialti, pela orientação em meu trabalho,
pela paciência de ensinar-me; sua ética, responsabilidade, experiência em
laboratório, pela ajuda em meus protocolos, pela amizade.
A Amanda Barba Alvez, pela ajuda em todo esse trabalho, pela disposição
e compreensão.
Ao Dr. Paulo Sérgio Martins, por acreditar e confiar em meu trabalho e
tambem pela grande amizade que construimos.
Ao Dr. Ricardo Bertolla, por toda ajuda na microscopia.
A Camila Guindaline, pela ajuda em toda parte estatística.
A minha irmã Lilian pelo seu carinho e amor
A todos amigos que torcem pelo meu sucesso e dividem comigo muitos
momentos felizes e tristes da vida. Obrigado pelo apoio.
Aos amigos do laboratório Maria da luz, Aline, Natalia, Sidneia, Charlis,
Giovana, Thais, Michelle.
Aos colegas do laboratório de Imunologia e Virologia que trocaram
experiências de laboratório e vivenciaram comigo todas as dificuldades que
passei.
Aos médicos que colaboraram para a realização deste estudo através da
inclusão de pacientes.
viii
Aos voluntários que aceitaram participar do estudo. Aos familiares dos
pacientes por estarem passando momentos difíceis com seu ente querido e
aceitaram colaborar com este estudo. Muito obrigado.
ix
Resumo
A sepse apresenta crescente incidência com elevada morbidade e
mortalidade, sendo a principal causa de óbito nas unidades de terapia
intensiva. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento dos
microrganismos pelas células do hospedeiro e de resposta efetora
competente. Os linfócitos, monócitos e neutrófilos são as principais
populações celulares do sangue periférico envolvidas nesse processo. A
apoptose representa um importante mecanismo de controle da resposta
imune, mas em condições críticas, a apoptose desregulada dessas células
pode levar o hospedeiro a imunossupressão, dificultando o controle da
sepse.
Este trabalho avaliou-se a porcentagem de apoptose em linfócitos
monócitos e neutrófilos do sangue periférico de pacientes sépticos pela
exposição de fosfatidilserina na superfície celular e pela detecção
intracelular de caspase-3, também foi avaliado o número absoluto e
percentual de linfócitos e suas subpopulações por citometria de fluxo. Foram
incluídos 40 pacientes, sendo 4 em sepse, 9 em sepse grave e 27 em
choque séptico, classificados de acordo com as definições do consenso de
1992. Quinze voluntários sadios foram incluídos para comparação. Nos
ensaios de detecção de apoptose foi feita a separação dos leucócitos totais
seguida de lise hipotônica das hemácias e marcação com anticorpos de
superfície para identificação das populações leucocitarias. Para verificação
da apoptose as amostras foram marcadas com anexina-V e coradas com
Iodeto de Propídeo (PI) em tampão apropriado ou incubadas com anticorpo
anti-caspase-3 após fixação e permeabilização. A contagem de linfócitos foi
realizada em tubos TruCOUNT após a marcação com anticorpos anti-CD45,
CD3, CD4, CD8, CD16/56 e CD19.
Não houve diferença no percentual de linfócitos totais em apoptose,
porém observou-se menor apoptose tardia em linfócitos T nos pacientes
sépticos quando comparados aos sadios ( P<0,05). Foi observada menor
contagem absoluta de linfócitos totais, linfócitos T, TCD4+, TCD8+ e NK de
pacientes sépticos (p<0,01), embora o percentual destas populações
celulares tenha se mantido inalterado. Os resultados mostram que o menor
número de linfócitos circulantes observados durante o quadro de sepse não
pôde ser explicado pela presença de apoptose. A diminuição da contagem
destas células na periferia pode significar uma migração para os tecidos ou
órgãos linfóides desencadeada pela infecção.
Nos neutrófilos não foi observada diferença no percentual de células em
apoptose precoce entre pacientes e indivíduos sadios. Houve queda no
percentual de apoptose tardia e conseqüente aumento no percentual de
células viáveis dos pacientes em comparação aos sadios (p<0,05). Não se
observou diferença significativa na mensuração intracelular de caspase 3 em
neutrófilos de pacientes comparado a indivíduos sadios. A análise da
apoptose durante a evolução da sepse não mostrou diferença entre os
grupos D0, D7 e D14. Não houve diferença na proporção de células em
apoptose entre pacientes com sepse que sobreviveram e pacientes que
evoluíram a óbito até o vigésimo oitavo dia após o diagnóstico de sepse. A
apoptose tardia em neutrófilos parece estar diminuída. O possível efeito
biológico da redução de apoptose tardia seria uma resposta adaptada à
x
lesão, talvez prolongando a meia vida e atividade dos neutrófilos, entretanto,
essa apoptose diminuída pode contribuir para a lesão inflamatória sistêmica e
predispor o desenvolvimento da síndrome de disfunção de múltiplos órgãos.
Os monócitos foram avaliados unicamente pela detecção intracelular de
caspase-3, todavia, não foi encontrado diferença entre pacientes sépticos e
indivíduos sadios. O mesmo ocorreu em amostras obtidas na admissão, 7º e
14º dia de seguimento. O percentual de monócitos com positividade para
caspase-3 nos dias 0, 7 e 14 de sepse foi relacionado com a evolução dos
pacientes em sobreviventes e óbitos, após 28 dias do diagnóstico. A análise
realizada com amostras do D0 não indicou diferença na porcentagem de
células apoptóticas entre os pacientes sobreviventes e que evoluíram a óbito.
Entretanto, o percentual de apoptose observado no D7 mostrou que
pacientes que evoluíram a óbito apresentaram menor porcentagem de células
positivas para caspase-3 após 28 dias, e essa associação persistiu no
seguimento de 60 e 180 dias. O papel da apoptose em monócitos parece ser
muito importante na sepse, todavia são necessários novos estudos para
elucidar a correlação entre apoptose de monócitos e sobrevida.
Palavras-chave: Apoptose, linfócitos, sepse, citometria de fluxo, anexina-V e
caspase-3.
xi
Abstract
Sepsis incidence continues to rise with significant morbidity and
mortality and is the leading cause of death in intensive care units. Infection
control depends on proper recognition of the microorganisms by immune cells
and an adequade effector immune response. Lymphocytes, monocytes and
neutrophils are the major peripheral blood cell populations involved in this
process. Apoptosis is an important mechanism for controlling the immune
response, however, in critical conditions, deregulated apoptosis can lead to
immune suppression, difficulting the control of sepsis.
This study evaluated the percentage of apoptosis in peripheral blood
derived lymphocytes, monocytes and neutrophils by means of exposure of
phosphatidylserine on the cell surface and detection of intracellular caspase-3
and evaluated the absolute number and percentage of lymphocytes and their
subpopulations by flow cytometry. Forty septic patients were included, of
whom, 4 were septic, 9 presented severe sepsis and 27 were in septic shock,
classified according to the definitions of the 1992´s consensus. Fifteen healthy
volunteers’ were included for comparison. For apoptosis assays, total
leucocytes were isolated from the whole blood by hypotonic lysis of the red
blood cells and stained with surface antibodies in order to identify the
leukocyte subpopulations. For apoptosis evaluation samples were stained
with annexin-V and propidium iodide (PI) in an appropriate buffer or labeled
with anti-caspase-3 after fixation and permeabilization. Lymphocyte counts
were performed in TruCOUNT tubes after labeling the cells with anti-CD45,
CD3, CD4, CD8, CD16/56 and CD19.
There were no statistical differences in the percentage of apoptosis in
total leukocytes, however, lower late apoptosis was observed in T
lymphocytes of septic patients when compared to healthy subjects (P<0.05).
Septic patients showed a smaller absolute count of total lymphocytes, T
lymphocytes, CD4+, CD8+ and NK cells when compared to the healthy
individuals (P<0.01), although the percentage of these cell populations has
remained unchanged. These results demonstrate that the smallest number of
circulating lymphocytes observed during sepsis could not be explained by the
presence of apoptosis. The decrease of peripheral blood cell counts could be
xii
a result of the cell migration to the lymphoid tissues or organs triggered by
infection.
There were no differences in the percentage of early apoptosis in
neutrophils of patients and healthy individuals. There was a decrease in the
percentage of late apoptosis and a consequent increase in the percentage of
viable cells in the patients when compared to the healthy subjects (P<0.05).
There was no significant differences in the measurement of intracellular
caspase-3 in neutrophils of patients compared to the healthy individuals.
Analysis of apoptosis during the development os sepsis did not differ among
the D0, D7 an D14 groups. There was no difference in the proportion of cells
undergoing apoptosis between patients with sepsis who survived and those
who died by the twenty-eight (D28) after the diagnosis of sepsis. Late
apoptosis in neutrophils appears to be diminished. The possible biological
effect of the reduction of apoptosis would be an adapted response to the
injury, perhaps extending the half life and activity of neutrophils, however, this
decreased apoptosis may contibute to inflammatory injury and predispose to
the development of the multiple organ dysfunction syndrome.
Only intracellular caspase-3 was evaluated in monocyte population,
and no differences were found between this marker on septic patients and
healthy individuals. The same results were observed in samples from
adminssion, 7 and 14 days of follow-up. The percentage of monocytes with
caspase-3 activity on days 0, 7 and 14 of sepsis was related to patient
outcome as regards of survival and non-survival, after 28 days of diagnosis.
The analysis performed on samples from D0 did not indicate differences in the
percentage of apoptotic cells among the survivors and non-survivors. To
counterpoint, when this analysis was performed on D7, the percentage of cells
positive for caspase-3 were lower in those who died when compared with the
survivors after 28 days; besides, this association persisted on 60 and 180
days follow-up. The role of apoptosis in monocytes seems to be important in
sepsis, however, further research is needed to elucidate the correlation
between monocyte apoptosis and survival.
Key Words: Apoptosis, lymphocytes, sepsis, flow cytometry, annexin-V,
caspase-3.
xiii
Sumário
DEDICATÓRIA.............................................................................................. vii
AGRADECIMENTOS.. .................................................................................
viii
RESUMO......................................................................................................
x
LISTAS.......................................................................................................... xvi
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................
1
1.1 Definição da Sepse............................................................................ 2
1.2 Epidemiologia da Sepse ...................................................................
3
1.3 Fisiopatologia.....................................................................................
4
1.4 Desencadeamento da resposta inflamatória.....................................
6
1.5 Necrose e Apoptose. ........................................................................
8
1.6 Apoptose na sepse............................................................................
16
2. OBJETIVOS..............................................................................................
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
21
3.1. Reagentes e soluções......................................................................
22
3.2 Anticorpos..........................................................................................
23
3.3. Grupo de indivíduos sadios e pacientes sépticos............................. 24
3.4. Coleta de sangue..............................................................................
25
3.5. Casuística.........................................................................................
25
3.5.1 Critérios de Inclusão..................................................................
25
3.5.2 Critérios de exclusão.................................................................
26
3.5.3 Estadios da Sepse..................................................................
26
3.5.4 Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes
sépticos e indivíduos sadios.........................................................................
27
3.6. Extração de leucócitos totais............................................................
30
3.7. Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V e
Iodeto de Propídeo (PI)................................................................................. 31
3.8. Detecção de apoptose através da marcação intracelular de
Caspase 3.....................................................................................................
3.9 Contagem absoluta de linfócitos com TruCount................................
32
34
xiv
3.10 Citometria de fluxo...........................................................................
35
3.10.1 Estratégia de aquisição para contagem absoluta de linfócitos
39
3.10.2 Análise das populações de linfócitos totais e subpopulações.
40
3.11. Análise estatística...........................................................................
45
4. RESULTADOS.......................................................................................... 46
4.1 Linfócitos............................................................................................
47
4.2 Linfócitos T......................................................................................... 54
4.3 Monócitos........................................................................................... 60
4.4 Neutrófilos..........................................................................................
65
4.5 Contagem absoluta e percentual das populações e subpopulações
de linfócitos...................................................................................................
72
5. DISCUSSÃO.............................................................................................
87
6. CONCLUSÃO...........................................................................................
96
7. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................
99
8. ANEXOS...................................................................................................
104
xv
Lista de figuras
Figura 1: Representação esquemática do LPS de Salmonella...................
7
Figura 2: Principais diferenças entre apoptose e necrose...........................
9
Figura 3: Características morfológicas da apoptose....................................
11
Figura 4: Exteriorização da fosfatidilserina……………………………………
12
Figura 5: Representação esquemática das vias de ativação da apoptose..
13
Figura 6: Representação esquemática dos eventos apoptóticos................
16
Figura 7: Estratégia de aquisição………………………………………………
36
Figura 8: Estratégia de análise de linfócitos................................................
37
Figura 9: Estratégia de análise de monócitos e neutrófilos.........................
37
Figura 10: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da
marcação por Anexina-V e Iodeto de Propídeo (PI).....................................
38
Figura 11: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da
marcação de caspase-3................................................................................
38
Figura 12: Aquisição de eventos para contagem linfócitos..........................
39
Figura 13: Estratégia de análise de linfócitos T...........................................
40
Figura 14: Estratégia de análise das subpopulações de linfócitos T................41
Figura 15: Contagem das partículas de referências....................................
42
Figura 16: Estratégia de análise das populações de linfócitos B e NK........
43
Figura 17: Contagem das partículas de referências....................................
43
Figura 18: Linfócitos em apoptose e células viáveis no sangue periférico
de indivíduos sadios e pacientes sépticos....................................................
48
Figura 19: Apoptose em linfócitos de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e
14 de seguimento.........................................................................................
50
Figura 20: Linfócitos dos pacientes sépticos durante os 14 dias de
evolução da sepse relacionado com sobrevida............................................
53
Figura 21: Células em apoptose e células viáveis em linfócitos T do
sangue periférico de indivíduos sadios e pacientes sépticos avaliada pelo
método de anexina V e iodeto de propídeo..................................................
55
Figura 22: Apoptose em linfócitos T de pacientes sépticos nos 14 dias de
seguimento....................................................................................................
57
xvi
Figura 23: Linfócitos T de pacientes sépticos durante os 14 dias de
evolução da sepse relacionado com sobrevida............................................
59
Figura 24: Percentuais de monócitos do sangue periférico em apoptose
de indivíduos sadios e pacientes sépticos avaliada pela detecção
intracelular de caspase-3..............................................................................
60
Figura 25: Percentuais de monócitos em apoptose de pacientes sépticos
nos 14 dias de seguimento.
61
Figura 26: Monócitos positivos para marcação intracelular de caspase-3..
64
Figura 27: Neutrófilos em apoptose e viáveis no sangue periférico de
indivíduos sadios e pacientes sépticos.........................................................
66
Figura 28: Neutrófilos de pacientes sépticos durante os 14 dias de
acompanhamento.........................................................................................
68
Figura 29: Apoptose de neutrófilos de pacientes sépticos durante os 14
dias de evolução da sepse relacionado com sobrevida...............................
71
Figura 30: Contagem de linfócitos por microlitro de sangue periférico de
indivíduos sadios e pacientes sépticos (D0).................................................
74
Figura 31: Porcentagem de linfócitos T entre indivíduos sadios e
pacientes sépticos.........................................................................................
75
Figura 32: Porcentagem de linfócitos T CD4+ entre indivíduos sadios e
pacientes sépticos.........................................................................................
76
Figura 33: Porcentagem de linfócitos T CD8+ entre indivíduos sadios e
pacientes sépticos.........................................................................................
77
Figura 34: Porcentagem de linfócitos B entre indivíduos sadios e
pacientes sépticos.........................................................................................
78
Figura 35: Porcentagem de células NK entre indivíduos sadios e
pacientes sépticos.........................................................................................
79
Figura 36: Linfócitos por microlitro de sangue periférico de pacientes
sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento...................................................
81
Figura 37: Percentual e numero absoluto de linfócitos T por microlitro de
sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento.
82
Figura 38: Percentual e numero absoluto de linfócitos T CD4+ por
microlitro de sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de
xvii
seguimento....................................................................................................
83
Figura 39: Percentual e numero absoluto de linfócitos T CD8+ por
microlitro de sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de
seguimento....................................................................................................
84
Figura 40: Percentual de linfócitos e numero absoluto de linfócitos B por
microlitro de sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de
seguimento....................................................................................................
85
Figura 41: Percentual e contagem absoluta de células NK do sangue
periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento..............
86
.
xviii
Lista de tabelas
Tabela 1: Lista de anticorpos utilizados no estudo......................................
23
Tabela 2: Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes sépticos.
28
Tabela 3: Painel de anticorpos utilizados em cada tubo para o ensaio de
anexina-V e iodeto de propídeo.................................................................... 31
Tabela 4: Painel de marcação com anexina v e iodeto de propídeo...........
32
Tabela 5: Painel de anticorpos utilizados em cada tubo para o ensaio de
caspase-3...................................................................................................... 32
Tabela 6: Painel de marcação com caspase-3............................................
33
Tabela 7: Apoptose em linfócitos, avaliada pelo método de anexina V e
iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, em
indivíduos sadios e pacientes sépticos......................................................... 48
Tabela 8: Apoptose em linfócitos, avaliada pelo método de anexina V e
iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, durante a
evolução dos pacientes sépticos..................................................................
49
Tabela 9: Avaliação da apoptose em linfócitos e sobrevida dos pacientes
D0 em 28 dias após o diagnóstico de sepse................................................
51
Tabela 10: Avaliação da apoptose em linfócitos e sobrevida dos
pacientes D7 em 28 dias após o diagnóstico de sepse...............................
52
Tabela 11: Avaliação da apoptose em linfócitos e sobrevida dos
pacientes D14 em 28 dias após o diagnóstico de sepse.............................
52
Tabela 12: Apoptose em linfócitos T, avaliada pelo método de anexina V
e iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, em
indivíduos sadios e pacientes sépticos......................................................... 54
Tabela 13: Apoptose em linfócitos T, avaliada pelo método de anexina V
e iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, durante a
evolução dos pacientes sépticos..................................................................
56
Tabela 14: Avaliação da apoptose em linfócitos T e sobrevida dos
pacientes D0 em 28 dias após o diagnóstico de sepse...............................
58
Tabela 15: Avaliação da apoptose em linfócitos T e sobrevida dos
pacientes D7 em 28 dias após o diagnóstico de sepse...............................
58
xix
Tabela 16: Avaliação da apoptose em linfócitos T e sobrevida dos
pacientes D14 em 28 dias após o diagnóstico de sepse.............................
59
Tabela 17: Detecção intracelular de caspase-3, em indivíduos sadios e
pacientes sépticos......................................................................................... 60
Tabela 18: Apoptose em monócitos, avaliada pela detecção intracelular
de caspase-3, durante a evolução dos pacientes sépticos..........................
61
Tabela 19: Avaliação da apoptose em monócitos e sobrevida dos
pacientes em 28 dias após o diagnóstico de sepse.....................................
62
Tabela 20: Avaliação da apoptose em monócitos e sobrevida dos
pacientes em 60 dias após o diagnóstico de sepse.....................................
63
Tabela 21: Avaliação da apoptose em monócitos e sobrevida dos
pacientes em 180 dias após o diagnóstico de sepse...................................
63
Tabela 22: Apoptose em neutrófilos, avaliada pelo método de anexina V
e iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, em
indivíduos sadios e pacientes sépticos......................................................... 65
Tabela 23: Apoptose em neutrófilos, avaliada pelo método de anexina V
e iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, durante
a evolução dos pacientes sépticos...............................................................
67
Tabela 24: Avaliação da apoptose em neutrófilos e sobrevida dos
pacientes D0 em 28 dias após o diagnóstico de sepse...............................
69
Tabela 25: Avaliação da apoptose em neutrófilos e sobrevida dos
pacientes D7 em 28 dias após o diagnóstico de sepse...............................
70
Tabela 26: Avaliação da apoptose em neutrófilos e sobrevida dos
pacientes D14 em 28 dias após o diagnóstico de sepse.............................
70
Tabela 27.1: Contagem absoluta e percentual de linfócitos em amostras
de sangue periférico de pacientes................................................................
73
Tabela 27.2: Contagem absoluta e percentual de linfócitos em amostras
de sangue periférico de voluntários sadios..................................................
73
Tabela 28: Contagem percentual e absoluta realizada nas populações de
linfócitos, linfócitos T, linfócitos T auxiliar (CD4+), linfócitos T citotóxico
(CD8+), linfócitos B e células NK, durante a evolução dos pacientes
sépticos........................................................................................................
80
xx
Lista de Abreviaturas e Símbolos
AP-1: proteína ativadora-1
APC: aloficocianina
BD: Becton Dickinson
BSA: albumina bovina
Bpm: batimentos por minuto
CD: “cluster of differentiation”
CO2:dióxido de carbono
°C: graus Celsius
EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético
Eros: espécies reativas de oxigênio
FADD: proteína associada ao domínio de morte de FAS
FC: freqüência cardíaca
FCS: soro fetal bovino
FITC: fluoresceína isotiocianato
FR: freqüência respiratória
G: gravidade (velocidade de centrifugação)
g: grama
IκB: inibidor de NF-κB
ICS: infecções da corrente sanguínea
IFN: interferon
IL: interleucina
IL-1β: interleucina-1 beta
IL-1R: receptores de IL-1
IL-6: interleucina-6
IL-10: interleucina-10
IRAK: quinase associada ao IL-1R
IRF: fator regulador de interferon
LBP: proteína ligante de lipopolisacarídeo
LPS: lipopolissacarídeo
µg: micrograma
µl: microlitro
M: molaridade
Mal/TIRAP: proteína adaptadora tipo MyD88
MALP-2: lipopeptídeo estimulador de macrófagos
MAPKs: proteínas quinases ativadoras de mitose
MD-2: proteína de diferenciação mielóde-2
Min: minuto
ml: mililitro
MyD88: proteína de diferenciação mielóide 88
mRNA: ácido ribonucléico mensageiro
NF-κ
κβ: fator nuclear-kappa B
NO: óxido nítrico
NOD: “nucleotide-binding oligomerization domain”
PAMP: padrão molecular associado à patógenos
PBS: solução tampão fosfatada
xxi
PE: ficoeritrina
PerCP: clorofila peridinina
PRR: receptor de reconhecimento padrão
ROS: espécies reativas de oxigênio
SIRS: síndrome da resposta inflamatória sistêmica
sCD14: CD14 sóluvel
TGF-β
β: fator transformador de crescimento-beta
TICAM-1/TRIF: molécula adaptadora contendo o domínio TIR-1
TIR: domínio homólogo ao receptor Toll/IL-1
TIRAP/MAL: proteína adaptadora tipo MyD88
TLR: “Toll-like Receptor”
tlr4: “toll-like receptor-4 gene”
TNF-α
α: fator de necrose tumoral-alfa
TNFR: receptor de TNF
TRAM: molécula adaptadora relacionada à TRIF
TRIF: molécula indutora de interferon-beta
UTI: unidade de terapia intensiva
xxii
_______________________
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Definição da Sepse
A sepse pode ser definida como a repercussão sistêmica da infecção.
Manifestando-se como diferentes estadios clínicos de um mesmo processo
fisiopatológico, é, para o médico, um de seus maiores desafios, uma
emergência médica associada à elevada morbidade e mortalidade. No início da
década de 90, em reunião de consenso das Sociedades de Terapia Intensiva e
de Pneumonologistas (American College of Chest Physicians/ Society of
Critical Care - Bone et al.; 1992a) se procurou estabelecer uma padronização
para o diagnóstico de sepse e suas complicações, levando-se em consideração
os avanços da compreensão de sua fisiopatologia. Reconheceu-se que uma
grande diversidade de causas poderia levar um quadro clínico comum,
caracterizado pelo desencadeamento da resposta inflamatória do hospedeiro.
Este quadro foi definido como Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica
(SIRS, do inglês Systemic Inflammatory Response Syndrome) e seria
desencadeado por pancreatite, queimaduras, trauma e outros, ficando o termo
sepse restrito a SIRS causada por infecção, ou seja, resposta inflamatória
causada por infecção. SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico representam
um continuum clínico de gravidade fisiopatológica. O processo começa com
uma infecção, com ou sem resposta inflamatória sistêmica, podendo progredir
a resposta sistêmica com sepse grave ou choque séptico. SIRS/sepse seria
reconhecida pela presença de dois ou mais dos seguintes critérios: alteração
2
de temperatura (hipotermia ou hipertermia), elevação de freqüência respiratória
(FR>20 irpm), de freqüência cardíaca (FC> 90 bpm), e presença de
leucocitose, leucopenia ou de células imaturas no sangue periférico. A
presença de sepse e pelo menos uma disfunção orgânica caracteriza a sepse
grave. A existência de hipotensão refratária à adequada administração de
fluído com hipoperfusão evidencia o choque séptico onde representa sua
expressão mais grave. (Bone et al., 1992b).
1.2 - Epidemiologia da Sepse
A importância da sepse pode ser inferida pela sua elevada morbidade e
mortalidade. Avaliando incidência e mortalidade associadas às infecções de
corrente sanguínea (ICS) no Hospital São Paulo, hospital de ensino da
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), entre 1985 e 1986, foram
encontrados 21,7 episódios por 1000 admissões, com mortalidade de 33,4%
(Salomão et al., 1992; 1993). Estudo conduzido na Universidade de Iowa,
Estados Unidos da América (EUA), entre 1980 e 1992, mostrou aumento de
praticamente três vezes na incidência de ICS adquiridas no hospital (Pittet &
Wenzel, 1995). Mais recentemente estudos utilizando diagnósticos clínicos e
laboratoriais de sepse e com base populacional foram conduzidos. O mais
completo, avaliando internações entre o ano de 1979 a 2000, com amostragem
representativa do conjunto dos hospitais americanos, mostrou que a incidência
aumentou de 82,7 episódios/100.000 habitantes em 1979 para 240,4 episódios/
100.000 habitantes em 2000 (Martin et al., 2003).
3
Outro estudo estimou a ocorrência de 750.000 casos de sepse anualmente nos
EUA, com cerca de 210.000 óbitos (Angus et al., 2001). Um estudo brasileiro
multicêntrico observacional (BASES - Brazilian Sepsis Epidemiological Study)
conduzido em cinco unidades de terapia intensiva, de maio de 2001 a janeiro
de 2002, mostrou incidência de sepse 61,4; sepse grave 35,6 e choque séptico
30,0 para cada 1000 pacientes-dia. As taxas de mortalidade para os pacientes
em sepse, sepse grave e choque séptico foram de 34,7%; 47,3% e 52,2%;
respectivamente (Silva et al., 2004).
1.3 - Fisiopatologia
A compreensão da sepse é complexa porque envolve múltiplos fatores
simultaneamente como virulência, tamanho do inóculo, doenças de base,
estado nutricional, idade e presença de polimorfismos que interferem na
resposta imune. Os mecanismos adaptativos da resposta imune e inflamatória
do hospedeiro na sepse são imperativos no controle da infecção, e ao mesmo
tempo, é mediadora de alterações funcionais, que são a base fisiopatológica
das manifestações clínicas. Importantes progressos foram obtidos no
entendimento da patogenia da sepse nos últimos anos destacando-se o
mecanismo de reconhecimento de antígenos bacterianos e a melhor
compreensão dos mecanismos de sinalização celular, que são descritos a
seguir.
As citocinas inflamatórias e outros mediadores desencadeados por estas
ou por agentes patogênicos induzem uma série de alterações nas células alvo.
Embora um amplo espectro de células seja sensível aos seus efeitos, na
4
sepse, as alterações induzidas na célula endotelial constituem um importante
substrato fisiopatológico. Há alterações do seu citoesqueleto, alterações
funcionais, como síntese de mediadores com efeitos quimiotáticos, além do
aumento da expressão de moléculas de adesão. Ainda, a liberação de
vasodilatadores potentes como o óxido nítrico (NO) pelas células inflamatórias
e endoteliais leva a uma importante vasodilatação. As citocinas inflamatórias
desencadeiam também a cascata de coagulação, principalmente pela
exposição do fator tissular, criando um ambiente de exacerbação da inflamação
e coagulação.
A regulação negativa de proteínas com função anticoagulante contribui
ainda mais para a indução da coagulação. Como resultado tem-se a adesão de
neutrófilos e monócitos às células endoteliais, migração para o extravascular,
extravasamento de fluídos para o interstício, coagulação intravascular, que em
conjunto com alteração do tônus resultam em alterações da microcirculação e
levam à hipóxia tecidual e consequente disfunção de órgãos e sistemas.
Importante ainda, a disfunção celular desencadeada pela sepse pode persistir
mesmo após estabelecimento do fluxo sanguíneo aos tecidos, por mecanismos
de sofrimento celular, referido como choque citopático (Salomão et al., 1999;
Rigato et al., 2001; Cohen, 2002; Hotchkiss & Karl, 2003).
A melhor percepção da fisiopatologia da sepse é importante para
identificar possíveis alvos e estratégias de tratamento na sepse.
5
1.4 - Desencadeamento da resposta inflamatória
A similaridade entre os efeitos fisiopatológicos agudos induzidos pelo
LPS e as manifestações da sepse por Gram-negativos levou a hipótese de que
o LPS, liberado da bactéria in vivo, é responsável pela indução dos sintomas
da septicemia. As bactérias Gram-negativas possuem em sua membrana
externa o LPS, que desempenha importante função na viabilidade bacteriana e
na interação com o hospedeiro (Rietschel et al., 1982).
Após a morte e lise, e também quando a bactéria se multiplica, o LPS é
liberado da superfície bacteriana. A molécula do LPS pode ser dividida,
estrutural e funcionalmente, em três sub-regiões: polissacarídeo O, região
central ("core") e o lipídeo A (figura 1). O lipídeo A representa a estrutura mais
conservada do LPS e retém a toxicidade da molécula (Galanos et al., 1979a).
Por intermédio do lipídeo A, o LPS interage com vários tipos celulares, como
células mononucleares, células endoteliais, polimorfonucleares e de particular
importância os monócitos e macrófagos. A ativação dos macrófagos pelo LPS
resulta na liberação de mediadores como o fator de necrose tumoral-alfa (TNFα), interleucina-1 (IL-1), IL-6, IL-8 e IL-10. Estes mediadores têm atividade
bioativa potente e podem atuar em sinergismo ou ter efeito antagônico a
endotoxina (Rietschel et al., 1994). In vivo, estas moléculas podem ter ação
local ou serem liberadas na circulação, através da qual são transportados para
diferentes células e órgãos suscetíveis, resultando na repercussão sistêmica da
infecção (Rietschel et al., 1982).
6
Figura 1: Representação esquemática do LPS de Salmonella (adaptado de Galanos et
al., 1979a).
A ação biológica do LPS é modulada por proteínas presentes no soro,
como a proteína ligante de lipopolissacarídeo (LBP) (Schumann et al., 1990). A
LBP facilita a ligação do LPS ao CD14, potencializando a ativação do
macrófago induzida pelo LPS, e subsequente produção de citocinas proinflamatórias, como o TNF-α (Schumann et al., 1990; Wright et al., 1990).
O CD14, caracterizado inicialmente como o mais importante receptor de
LPS, apresenta-se em duas formas: o CD14 solúvel (sCD14) e o CD14 ligado à
membrana celular (mCD14) (Wright et al., 1990). O CD14 é encontrado na
membrana de monócitos, macrófagos e em menor proporção em granulócitos
(Ziegler-Heitbrock & Ulevitch, 1993).
O CD14 não possui porção intracelular e para transmitir o sinal de
ativação utiliza o receptor tipo Toll (“Toll-like receptor 4” - TLR4). O receptor
Toll foi originalmente descoberto na Drosophila melanogaster. O primeiro
homólogo humano do Toll de Drosophila foi descrito por Medzhitov et al em
1997, devido sua capacidade de ativar a imunidade adaptativa.
Os TLRs são compostos por proteínas transmembranas ricas em leucina
com porção citoplasmática muito similar ao receptor de interleucina-1,
consequentemente funcionam como transdutores de sinalização. A descoberta
do TLR4 e sua importância na sinalização do LPS deu-se através da
7
investigação em camundongos sensíveis (C3H/HeN) e resistentes (C3H/HeJ e
C57Bl10/ScCR) ao LPS por Poltorak et al. (1998).
O TLR4 necessita da
proteína de diferenciação mielóide-2 (MD-2) que se encontra acoplada a parte
extracelular
do
TLR4,
conferindo
uma
maior
sensibilidade
ao
LPS,
provavelmente através da estabilização dos dímeros do TLR4 (Shimazu et al.,
1999).
A cascata de sinalização tem caminhos que se sobrepõem e resultam na
ativação de fatores de transcrição. A cascata de ativação é desencadeada
após a ligação do LPS ao complexo TLR4/MD-2, existem quatro proteínas
adaptadoras envolvidas na sinalização da ativação pelo TLR4: fator de
diferenciação mielóide 88 (MyD88), adaptadora tipo MyD88 (Mal) também
chamada de proteína adaptadora contendo o domínio TIR (TIRAP), molécula
adaptadora contendo o domínio TIR-1 (TICAM-1) também chamada de
adaptadora indutora de interferon-β (TRIF) e molécula adaptadora relacionada
à TRIF (TRAM) (Takeda & Akira, 2005).
1.5 - Necrose e Apoptose
Definição e vias de ativação
A necrose é uma forma patológica de morte celular que pode ser induzida
por injúria grave, como hipertemia, hipóxia ou altas concentrações de
substâncias tóxicas. A necrose é caracterizada por um aumento no volume
total da célula e de suas organelas, seguindo-se a autólise, que envolve
dissolução das membranas e ruptura da célula, com liberação de seus
8
subprodutos,
os
quais
estimulam
uma
inflamação
exudativa.
Essa
característica é importantíssima na diferenciação de apoptose e necrose, pois
na apoptose não ocorre esse processo inflamatório intenso devido a não
liberação das enzimas lisossomais tóxicas e proteases no espaço intersticial.
Nas células necróticas o núcleo sofre desorganização da cromatina e
intumescimentos, podendo exibir estruturas vacuolizadas (figura 2) (Hotchkiss
et al., 2003).
Figura 2: Principais diferenças entre apoptose e necrose (Adaptado de
http://ihome.cuhk.edu.hk/~b105122/n6.htm).
O termo morte celular programada ou apoptose é uma forma fisiológica
de morte celular, proporcionando um mecanismo seguro para eliminação de
células potencialmente nocivas ao nosso organismo (Cooper, 2001).
9
A palavra apoptose é de origem grega e descreve o processo da queda
de folhas das árvores no outono, uma parte necessária no ciclo de vida das
plantas. O termo apoptose foi utilizado pela primeira vez por Kerr, Wyllie e
Currie em 1972 onde descreveram morfologicamente a forma distinta das
células mortas. No entanto, certos componentes do conceito de apoptose já
haviam sido descritos vários anos antes. Este é um fenômeno muito frequente,
tanto em estados fisiológicos como patológicos, onde a célula é estimulada a
acionar mecanismos que culminam em sua morte (Kerr et al., 1972; Kerr,
2002).
Em condições normais é um mecanismo importante na remodelação de
órgãos durante a embriogênese e na vida pós-natal, além do controle da
diferenciação e proliferação celular. Em estados patológicos, os danos podem
ser associados à resistência da apoptose, como no caso de alguns tipos de
câncer, doenças autoimunes e malformações; ou podem ser associados ao
excesso
de
apoptose,
como
processos
infecciosos,
doenças
neurodegenerativas e neuromusculares (Brasileiro & Bogliolo, 2001).
A morte celular por apoptose é geneticamente mediada por um percurso
bioquímico e foi primeiramente caracterizada como tal por mudanças nos
aspectos morfológicos celulares identificados ao microscópio. Muitos estudos
utilizam um fenômeno clássico para investigar o decurso da apoptose como a
exposição da fosfatidilserina, que em células viáveis encontra-se interiorizada e
em células apoptóticas apresenta-se exteriorizada, devido as mudanças na
estrutura da membrana (Engeland et al., 1998).
Morfologicamente, a apoptose é caracterizada pela perda da integridade
celular, havendo condensação e segregação da cromatina, que passa a ocupar
10
a margem nuclear contra o envelope nuclear e concentração do citoplasma. A
condensação da cromatina é acompanhada por invaginação das membranas
celular e nuclear, seguida pela ruptura do núcleo em fragmentos, que se
tornam circundados por partes do envoltório nuclear (figura 3). Surgem então
os corpos apoptóticos (ou vesículas apoptóticas), contendo parte do citoplasma
e do núcleo, expressando marcadores de superfície que permitem serem
rapidamente reconhecidos e fagocitados por macrófagos ou outras células do
sistema imune ou ainda, por células adjacentes (“fagócitos”) (Elmore S, 2007).
Figura 3: Características morfológicas da apoptose (Adaptado de KERR, 1972).
O encolhimento e a condensação do citoplasma se devem à perda de
água e ao acúmulo de proteínas desnaturadas, embora haja evidências de
aumento de proteólise. Os brotamentos se fazem por rearranjo ativo do
citoesqueleto, que formam verdadeiras depressões na superfície da célula,
11
culminado com sua fragmentação. A condensação da cromatina parece
decorrer da ação de endonucleases que clivam os filamentos de cromatinas
nos espaços entre os nucleossomos gerando fragmentos de DNA (Schroeder
et al., 2001).
Durante a formação dos corpos apoptóticos ocorre a inversão da
localização dos fosfolípides da membrana plasmática devido às mudanças em
sua estrutura. A fosfatidilserina é um fosfolipídio presente nas camadas mais
internas da membrana plasmática. Quando a célula entra em apoptose e se
formam os corpos apoptóticos este fosfolípide é exteriorizado, ou seja, está
presente na porção externa da célula como mostra a figura 4 (Azevedo, 2007).
Figura 4: Exteriorização da fosfatidilserina (Adaptado de Van Engeland, 1998).
De maneira geral, a morte celular por apoptose resulta de uma das duas
vias possíveis: via mitocondrial ou retículo endoplasmático (via intrínseca), via
do receptor de morte celular (via extrínseca) (Figura 5).
12
Via Intrínseca
Via Extrínseca
estresse, viroses, etc
Citoplasma
Fragmentação do
DNA do hospedeiro
APOPTOSE
Figura 5: Representação esquemática das vias de ativação da apoptose.
(http://homepage.usask.ca/~vim458/advirol/SPCV/mitochondria/mitochondria.html).
A via intrínseca pode ser desencadeada em diversas situações, como na
presença de citocinas, espécies reativas de oxigênio (EROs), esteróides, danos
no DNA e carência de fator de crescimento.
A sinalização por esta via é
mediada através de um complexo de estímulos que envolvem a mitocôndria e,
algumas vezes a via do retículo endoplasmático, proporcionando a liberação do
citocromo C, que em condições normais de sobrevivência celular encontra-se
junto ao espaço intermembrana da mitocôndria (Lindoholm et al., 2004). As
proteínas da família Bcl-2 são determinantes principais da sobrevivência da
célula, controlando a formação de poros na membrana da mitocôndria
induzidos pelos diferentes sinais de morte que convergem na organela. Esses
poros são importantíssimos na liberação do citocromo C para o citosol (Danial
&
Korsmeyer,
2004),
onde forma-se um
complexo
conhecido
como
13
apoptossomo, constituído por citocromo C, adaptador (Apaf-1) e caspase-9
(Hengartner, 2000), levando a ativação por autoclivagem da caspase-9 e assim
ativando a cascata de caspases, que são enzimas, ou seja, proteases de
cisteínas, que clivam cadeias de proteínas após resíduos de ácido aspártico,
resultando em morte celular (Aceham et al., 2002). A complexidade deste
caminho permite a regulação minuciosa da morte da célula e fornece a
possibilidade de intervenção na cascata antes ou após o envolvimento da
mitocôndria. Em geral, os principais estímulos pró-apoptóticos responsáveis
pela ativação da via intrínsica são decorrentes da ativação de proteínas da
família Bcl-2, como por exemplo, Bax (Bcl-2 associated X protein) e Bak (Bcl-2
antagonist/killer).
Portanto,
células
desprovidas
dessas
proteínas
são
resistentes a apoptose mediada por essa via (Lindoholm & Arumae, 2004).
A via do retículo endoplasmático é importante devido o seu mecanismo
aparentemente envolver o aumento de cálcio no conteúdo intracelular. Há
indícios que moléculas como Bax, Bak e Bcl-2, também induzem as alterações
de cálcio no conteúdo do retículo endoplasmático proporcionando liberação de
cálcio no citossol e propagação do estímulo apoptótico. A ativação da apoptose
via liberação de cálcio pode liberar o citocromo C da mitocôndria, sendo a
interação mais conhecida entre as vias mitocondriais e do retículo
endoplasmático na apoptose. Entretanto o aumento de cálcio é capaz de
induzir apoptose por clivagem da Bid ou por ativação de caspase 12, que
aparentemente migra para o citosol e ativa a caspase-9 independente da
formação do apoptossomo (Silva & Velascos 2007).
A via extrínseca é melhor caracterizada. Um dos mecanismos mais
importantes é a interação da molécula receptora Fas (CD95) e seu ligante
14
FasL. Tanto o Fas quanto o seu ligante, são normalmente induzidos durante
uma resposta imune adaptativa (Marsik et al., 2003). A apoptose é iniciada pela
estimulação do receptor Fas através da ligação do FasL, induzindo
trimerização do receptor. As porções citoplasmáticas dos receptores ligam-se
às moléculas adaptadoras (FADD) que, por sua vez, ligam-se à uma caspase
contracorrente, chamada caspase-8. Isso leva à ativação de caspase-8 por
autoclivagem, que então ativa a cascata de caspases (Engeland et al., 1998).
As vias intrínseca e extrínseca interagem em suas cascatas de ativação
intracelular. A caspase-8 não cliva somente outras caspases, mas também um
membro da família Bcl-2, chamado Bid. A Bid, ao contrário de outros membros
da família Bcl-2, induz a apoptose. Normalmente, ela está retida em forma
inativa no citosol. Entretanto, a clivagem por caspase-8 permite à Bid translocar
para a mitocôndria, onde ela rompe a membrana e libera o citocromo C para o
citosol. Isto leva à ativação de caspase-9, promovendo a amplificação da
cascata de caspases iniciada pela ativação direta de caspase-8 em receptores
de morte celular (Hotchkiss et al., 2005).
Embora existam diferentes vias de sinalização, todas culminam em uma
única caspase denominada caspase-3 efetora (figura 6). Em seguida ocorre a
ativação de uma DNAse (CAD), esta por sua vez entra no núcleo e cliva o
DNA, produzindo fragmentos característicos de uma célula apoptótica. Uma
das descobertas mais emocionantes foi a elucidação do mecanismo de
ativação da nuclease. Essa nuclease fragmenta o DNA genômico entre os
nucleossomos, gerando fragmentos de DNA. A presença desta fragmentação
do DNA foi usada extensivamente como marcador para a morte apoptótica da
célula (Hengartner, 2000).
15
Figura 6: Representação esquemática dos eventos apoptóticos (VENKATACHALAM,
2000).
1.6 - Apoptose na sepse
Os modernos conhecimentos da biologia celular têm revelado a cada dia
que a morte celular programada e seus indutores e inibidores podem ser a
chave para a compreensão de muitas patologias e doenças. Apoptose e suas
disfunções têm um papel crucial na sepse, onde tem sido observado mudanças
na dinâmica e regulação da apoptose. Essas mudanças são observadas nos
neutrófilos, entre outras células do sistema imune inato, e nos linfócitos T, que
fazem parte do sistema imune adaptativo (Mahidhara & Billiar, 2000).
Os linfócitos B e T têm papel importante no desenvolvimento da resposta
imune adaptativa e rapidamente se expandem em resposta a citocinas e
apresentação de antígeno. Normalmente, a apoptose de linfócitos é um
16
processo relacionado à deleção de linfócitos auto-reativos ou à contenção da
ativação de células imunes. Em condições críticas, a apoptose desregulada no
timo, no baço e no tecido linfóide associado a mucosas pode levar o
hospedeiro a imunossupressão, dificultando o controle da sepse (Silva &
Velascos, 2007).
Modelos animais demonstram que o bloqueio da apoptose de linfócitos
melhora a sobrevida na sepse. A utilização de estratégias para inibir a
apoptose pode melhorar a sobrevida e proporcionar uma terapia eficaz
(Hotchkiss et al., 2005).
Em modelo experimental Hotchkiss et al. observaram a melhora na
sobrevida de camundongos sépticos depletados de caspase-3 quando
comparado com camundongos selvagens. O uso de inibidor seletivo de
caspase-3 nos animais selvagens também resultou em melhora, indicando que
a redução da apoptose pode aumentar a sobrevida na sepse (Hotchkiss et al.,
2000).
Tulzo et al. e Schroeder et al. mensuraram a apoptose através da
detecção da fosfatidilserina na membrana celular de linfócitos em sangue total
de pacientes sépticos e observaram um aumento significativo da apoptose nos
linfócitos T (Tulzo et al., 2002; Schroeder et al., 2001). Além disso, Salomão et
al. observaram uma expressão aumentada de CD95 em linfócitos T de
pacientes com sepse quando comparado com voluntários sadios (Salomão et
al., 2002).
Adrie et al. estudaram monócitos de sangue periférico e observaram um
aumento significativo da porcentagem de monócitos com despolarização
mitocondrial e aumento no potencial de membrana no grupo de pacientes
17
sépticos comparado ao grupo controle. Neste mesmo estudo, ao dividir-se o
grupo de pacientes com sepse grave em sobreviventes e não sobreviventes
obtiveram um aumento significativo na porcentagem de células com
despolarização na mitocôndria no grupo de não sobreviventes. Ao verificar a
expressão de Bcl-2 detectaram um aumento também significativo desta
proteína nos indivíduos sobreviventes quando comparado com os não
sobreviventes (Adrie et al., 2001).
Utilizando-se a citometria de fluxo, Taneja et al. observaram diminuição
da apoptose em neutrófilos de pacientes sépticos em relação ao grupo
controle, demonstrado pela redução da expressão de caspase-9 e 3 (Taneja et
al., 2004). Em oposição, Martins et al. observaram um aumento na apoptose de
neutrófilos de pacientes sépticos, ( Martins et al., 2003).
Desta forma, a apoptose é um evento regulado de forma complexa na
sepse. Por um lado, estudos experimentais demonstram que o bloqueio da
apoptose em linfócitos pode ser protetor na sepse. Entretanto, estudos clínicos
apontam para exacerbação da apoptose em linfócitos circulantes de pacientes
sépticos (Silva & Velascos, 2007).
A melhor caracterização do papel da apoptose na sepse e na disfunção
de múltiplos órgãos pode ser de grande importância na decisão de qual ou
quais métodos terapêuticos devem ser adotados no controle dessas patologias
(Martins et al., 2003).
18
_____________________
Objetivos
2. OBJETIVOS
Avaliar a ocorrência de apoptose precoce, apoptose tardia e células
viáveis em linfócitos, linfócitos T e neutrófilos através do método de anexina V
e iodeto de propídeo assim como pela marcação intracelular de caspase-3
ativa em linfócitos, linfócitos T, monócitos e neutrófilos do sangue periférico de
pacientes sépticos.
Investigar se o índice de apoptose em pacientes sépticos está
relacionado com a sobrevida dos pacientes sépticos.
Avaliar a contagem absoluta dos linfócitos, linfócitos T, linfócitos T CD4,
CD8, linfócitos B e de células NK em sangue periférico de voluntários sadios e
pacientes séptico durante os 14 dias de acompanhamento.
20
________________________
Materiais e Métodos
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Reagentes e soluções
-
PBS 0,15M pH 7,2 (8g NaCl (Labsynth, Diadema, SP, Brasil); 0,2g KH2PO4
(Labsynth); 1,15g Na2HPO4 (Labsynth); 0,2g KCl (Labsynth) diluído em 1 litro
de água destilada).
-
Tampão de Marcação pH 7,4-7,6 (PBS 1% Soro Fetal Bovino (Invitrogen,
cidade, estado, país); 0,1% Azida Sódica (Sigma, Saint Louis, MO, EUA).
-
Solução de NaCl 0,2% (1g de NaCl diluído em 500mL de água destilada).
-
Solução de NaCl 1,6% (8g de NaCl diluído em 500mL de água destilada).
-
Kit para Detecção de Apoptose por Anexina V (BDBioscience, San Diego,
CA, EUA) composto por Anexina V-FITC, Iodeto de Propídeio e tampão de
marcação 10x concentrado.
-
Trypan Blue ( Sigma) 0,1% em PBS.
-
Tampão de Fixação [PBS 4% paraformaldeído (Polysciences, Warrington,
PA ,EUA), pH 7,4-7,6].
-
Tampão de Permeabilização [solução de lise BDBiocience diluída para 2
vezes concentrada em água destilada; 0,05% Tween 20 (Casa Americana
de Artigos para Laboratório, São Paulo, SP, Brasil)].
-
Tampão de marcação pH 7,4-7,6 (soro bovino fetal 1%, Azida sódica 0,1%
diluídos em PBS)
22
3.2 Anticorpos
Os anticorpos utilizados para caracterização das diferentes populações
leucocitárias encontram-se listados na tabela1, com descrição dos clones e
isotipos dos mesmos.
Tabela 1: Lista de anticorpos utilizados no estudo.
Anticorpo
Quantidade
Clone
Isotipo
Fabricante
CD3 APC1
2µL
HIT3a
mouse IgG2a
BD Biosciences
CD19 APC
2µL
SJ25C1
mouse IgG1
BD Biosciences
CD14 PerCP2
4µL
MφP9
mouse IgG2b
BD Biosciences
CD45 FITC3
5µL
2DI
mouse IgG1
BD Biosciences
HLA-DR PE4
2µL
27-35
mouse IgG2b
BD Biosciences
CD3 APC
2µL
HIT3a
mouse IgG2a
BD Biosciences
CD19 PerCP3
6µL
4G7
mouse IgG1
BD Biosciences
CD14 FITC
5µL
MφP9
mouse IgG2b
BD Biosciences
CD15 APC
5µL
HI98
mouse IgM
BD Biosciences
CD3 FITC
SK7
CD8 PE
SK1
CD45 PerCP3
2D1
BD Biosciences
10µL
SK3
CD4 APC
with
BD
23
trucount tubes
CD3 FITC
SK7
CD16/56 PE
B73.1
CD45 PerCP3
NCAM 16.2
BD Biosciences
10µl
CD19 APC
2D1
with
BD
SJ25C1
trucount tubes
Caspase-3
10µL
C92-605
rabbit IgG
BD Biosciences
ativa PE
CD45: Marcador leucocitário.
CD3: Marcador de linfócitos T.
CD4: Marcador de linfócitos T auxiliador.
CD8: Marcador de linfócitos T citotóxicos.
CD19: Marcador de linfócitos B.
CD14: Marcador de monócitos.
CD 15: Marcador de neutrófilos.
CD 16/56: Marcador de células NK.
3.3. Grupo de indivíduos sadios e pacientes sépticos
Voluntários sadios e pacientes sépticos, de diferentes faixas etárias, que
preencheram os critérios de inclusão do estudo e participaram espontaneamente
do estudo.
Foi solicitada aos voluntários ou responsáveis legais a assinatura de um
termo de consentimento (anexo) previamente aprovado pelo comitê de ética e
24
pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo, Hospital
Israelita Albert Einstein e Hospital Sírio Libanês (anexo).
3.4. Coleta de sangue
Foram coletados 10mL de sangue de voluntários sadios e pacientes
sépticos em tubos à vácuo contendo heparina sódica (BD, Plymouth, Inglaterra) e
5mL de sangue em tubo de EDTA (BD). As amostras de sangue colhidas foram
imediatamente processadas no Laboratório de Virologia e Imunologia I da
Disciplina de Infectologia, UNIFESP.
3.5 Casuística
3.5.1 Critérios de Inclusão
Voluntários: Voluntários sadios, de diferentes faixas etárias, que não esteja
em uso de medicação e que participe espontaneamente do estudo.
Pacientes: Foram incluídos pacientes com quadro clínico e laboratorial de
sepse, sepse grave ou choque séptico, classificados de acordo com as definições
adaptadas do consenso de 1992, admitidos no Hospital São Paulo, Hospital Sírio
Libanês, Hospital Albert Einstein e Hospital Santa Marcelina, na cidade de São
Paulo. Os pacientes foram incluídos nas primeiras 72 horas do diagnóstico de
sepse, ou nas primeiras 48 horas do evento definidor de sepse grave ou choque
25
séptico. Novas amostras foram coletadas nos dias 7, 14, 28 após a coleta da
primeira amostra.
3.5.2 Critérios de exclusão
1.
Pacientes menores de 18 anos ou com doença em estádio terminal, como
neoplasias ou Aids.
2.
Pacientes que estejam recebendo alguma terapia experimental.
3.
O evento definidor de sepse grave ou choque ocorreu há mais de 48 horas.
4.
Pacientes moribundos ou com morte iminente.
3.5.3 Estadios da Sepse
Sepse: entidade clínica presente em um paciente com sítio de infecção
identificado, associando-se uma resposta inflamatória sistêmica decorrente dessa
infecção, onde estejam presentes sinais como: a) temperatura >38°C ou <36°C;
contagem de leucócitos >12.000 ou <4.000 células/mm3 ou formas imaturas
>10%; c) freqüência cardíaca >90 bpm; d) freqüência respiratória >20 ipm ou
necessidade de ventilação mecânica; e) alteração do estado mental; f) edema
significativo ou balanço positivo (>20 mL/Kg/24h); g) hiperglicemia (glicose
plasmática >120 mg/dL) na ausência de diabete.
Sepse grave: sepse complicada por alguma disfunção orgânica refletida por
hipoxemia (PaO2/FiO2 <300), disfunção renal (oligúria <0,5 mL/Kg/h ou aumento
de creatinina >0,5mg/dL), distúrbios de coagulação (RNI >1,5 ou TTPA >60
segundos),
trombocitopenia
<100.000,
hiperbilirrubinemia
>
4
mg/dL,
hiperlactatemia, alteração da perfusão da pele e íleo paralítico.
Choque séptico: sepse grave associada à hipotensão a despeito de
adequada reposição volêmica. Entende-se por hipotensão uma pressão sistólica
26
<90 mmHg ou redução de mais de 40 mmHg na pressão sistólica basal, ou ainda
se houver necessidade de infusão de inotrópicos para manter níveis pressóricos
adequados.
3.5.4 Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes sépticos e
indivíduos sadios
Foram incluídos em nosso protocolo 15 voluntários sadios e 40 pacientes
sépticos após assinatura do consentimento livre e esclarecido por eles mesmos ou
responsáveis.
Voluntários sadios: foram incluídos 15 indivíduos sadios, de diferentes
faixas etárias. A média das idades foi de 63±16 anos, sendo 66,7% do gênero
masculino.
Pacientes: foram incluídos 40 pacientes, admitidos no Hospital São Paulo,
Hospital Universitário da Escola Paulista de Medicina, UNIFESP,na cidade de São
Paulo, Hospital Sírio Libanês e Hospital Israelita Albert Einstein. O grupo de
pacientes foi constituído de 67,5% do gênero masculino com idade média de
63±19 anos.
De acordo com as definições do consenso de sepse de 1992
(American College of Chest Physicians/ Society of Critical Care - Bone et al.;
1992a), 4 pacientes apresentavam quadro clínico e laboratorial de sepse, 9 sepse
grave e 27 choque séptico.
27
Os principais focos primários de infecção foram: pneumonia, associada ou
não a outra doença, em 18 pacientes; infecção abdominal em 12 pacientes;
infecção do trato urinário em 5 pacientes.
O desfecho clínico foi avaliado em relação a evolução na UTI e após 28
dias do diagnóstico de sepse. Vinte e oito pacientes (70%) receberam alta da UTI
e 12 evoluíram para óbito na própria unidade. A mortalidade após 28 dias foi de
35%. A mediana do escore APACHE destes pacientes foi de 19, com mínimo de
10 e máximo de 35, e a mediana do SOFA de admissão foi de 7, com mínimo de 1
e máximo de 14.
Tabela 2: Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes sépticos
Paciente
Idade
(anos)
Gênero
1
59
H
2
84
H
44
H
82
H
3
4
Estadio
Foco
infeccioso
Primário
Escores de Gravidade
Evolução
Escore
APACHE
SOFA
ADM
SOFA
D1
SOFA
D3
Desfecho
na UTI
28 dias
Pneumonia
13
3
2
1
Alta
Óbito
Pneumonia
28
11
8
7
Alta
internado
ICS
20
10
10
9
Óbito
Óbito
choque
séptico
Pneumonia
23
6
6
5
Alta
domicílio
22
7
8
9
Óbito
Óbito
sepse
grave
choque
séptico
choque
séptico
5
53
H
choque
séptico
Pneumonia /
Inf.
Abdominal
6
51
M
choque
séptico
Pneumonia
35
5
5
11
Óbito
Óbito
7
19
M
choque
séptico
Pneumonia
14
5
7
7
Alta
domicílio
8
92
H
choque
séptico
Inf.
Abdominal
21
2
9
6
Alta
internado
9
73
H
ITU
19
5
5
Óbito
Óbito
10
49
H
Inf.
Abdominal
19
7
9
10
Alta
domicílio
11
69
H
Pele ou
partes moles
19
5
5
alta
Alta
internado
12
50
H
Pneumonia
12
10
6
6
Alta
internado
13
71
H
Inf. Urinária
23
6
10
15
Alta
internado
14
66
M
Inf. Urinária
12
2
2
0
Alta
internado
choque
séptico
choque
séptico
sepse
grave
choque
séptico
choque
séptico
sepse
grave
28
15
87
M
choque
séptico
Inf.
Abdominal
25
6
3
3
Alta
domicílio
16
74
H
choque
séptico
Inf. Urinária
11
3
4
6
Alta
internado
17
80
M
choque
séptico
21
7
12
7
Óbito
Óbito
18
81
H
choque
séptico
24
10
10
6
Alta
Óbito
19
47
H
choque
séptico
10
10
6
0
Alta
domicílio
20
93
M
sepse
grave
Pneumonia
29
7
2
7
Alta
internado
21
49
H
sepse
grave
Pneumonia
16
10
9
7
Alta
domicílio
22
75
M
sepse
Inf. Urinária
33
5
7
4
Alta
internado
23
71
H
24
77
H
25
78
26
Inf.
Abdominal
Inf.
Abdominal /
Endocardite
Inf.
Abdominal
choque
séptico
choque
séptico
Pneumonia
17
7
9
9
Óbito
Óbito
Pneumonia /
Inf.urinária
21
2
6
7
Óbito
Óbito
H
sepse
Inf.abdominal
25
11
8
11
Alta
internado
68
H
choque
séptico
26
13
Óbito
Óbito
27
57
H
sepse
grave
12
5
2
2
Alta
internado
28
75
M
choque
séptico
19
9
8
8
Óbito
Óbito
29
48
M
sepse
Ferida
Operatória
Inf. Da
Corrente
Sanguínea
Inf.
Abdominal
Inf.
Abdominal
15
1
1
3
Alta
domicílio
30
75
M
choque
séptico
Inf.
Abdominal
18
10
7
2
Alta
domicílio
31
45
H
choque
séptico
Pneumonia
15
10
3
alta
Alta
domicílio
32
58
H
choque
séptico
19
14
13
14
Óbito
Óbito
33
53
M
choque
séptico
20
10
11
11
Alta
internado
34
47
H
sepse
grave
Pneumonia
16
11
7
7
Alta
35
80
M
choque
séptico
Pneumonia
15
7
4
3
Alta
internado
36
87
M
Pneumonia
28
11
11
12
Alta
internado
37
71
H
Pneumonia
10
3
3
3
Alta
internado
38
78
H
Inf.
Abdominal
22
3
3
Alta
domicílio
39
53
H
Pneumonia
13
9
9
9
Óbito
Óbito
40
57
H
Pneumonia
14
10
10
11
Óbito
Óbito
choque
séptico
sepse
grave
sepse
sepse
grave
choque
séptico
Inf.
Abdominal
Inf. Da
Corrente
Sanguínea
M = Masculino, F = Feminino, APACHE = do inglês, Acute Physiology and Chronic Health
Evaluation, SOFA = do inglês, Sequential Organ Failure Assessment, Adm = Admissão no
estudo, D1 = Primeiro dia após admissão, D3 = Terceiro dia após admissão, ICS =
infecção da corrente sanguinea, ITU = infecção do trato urinário,
29
3.6. Extração de leucócitos totais
O sangue heparinizado foi centrifugado a 1300g durante 15 minutos a
temperatura ambiente. A camada de leucócitos acima das hemácias foi transferida
para tubo cônico de 50mL. Foi realizada a lise hipotônica com adição de 20mL de
NaCl 0,2% (gelado). O tubo foi homogeneizado durante 20 segundos por inversão.
Em seguida, a amostra recebeu 20mL de NaCl 1,6% (gelado),foi homogeneizada
e ajustado o volume com PBS (gelado) para 50 mL . As amostras foram
centrifugadas a 650 g durante 5 minutos a 4°C, e a lise repetida de duas a três
vezes, se necessário.
Após a lise das hemácias o botão de leucócitos foi suspendido em 5mL de
PBS, para a contagem em câmara de Neubauer, para isso uma alíquota da
suspensão de células foi diluída 1:10 em trypan blue e as células foram contadas
no microscópio. Após a contagem a concentração celular foi ajustada para 2x106
células por mL.
30
3.7. Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V e
Iodeto de Propídeo (PI)
Após
obtenção
dos
leucócitos
totais
como
previamente
descrito,
distribuímos uma alíquota de 1x106 células nos tubos nos seguintes tubos para a
descritos na tabela 3:
Tabela 3: Painel de anticorpos utilizados em cada tubo para o ensaio de
anexina-V e iodeto de propideo.
Tubo
FL1
FL2/FL3
FL4
1
-
-
CD3
2
3
CD19
-
-
CD15
Os tubos foram centrifugados a 650g durante 5 minutos a 4°C e os
sobrenadantes desprezados. Foi realizada a marcação de superfície celular com
os anticorpos da tabela acima. Os tubos foram homogeneizados em vórtex e
incubados durante 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em seguida,
receberam 2mL de PBS e foram novamente centrifugados a 650g durante 5
minutos a 4°C. As células foram suspendidas em 100µL de tampão de marcação
do kit diluído em água destilada até a concentração de uso (1x), e acrescentado
anexina V e PI como descrito na tabela 4:
31
Tabela 4: Painel de marcação com anexina v e iodeto de propideo.
Tubo
Células
Anexina V
Iodeto de Propideo
Tampão de anexina
1
1x106
5µL
10µL
300µL
2
1x106
5µL
10µL
300µL
3
1x106
5µL
10µL
300µL
4
1x106
5µL
10µL
300µL
As amostras foram novamente incubadas durante 20 minutos a temperatura
ambiente no escuro. Após este tempo, foram acrescentados 200µL de tampão de
marcação 1x para a leitura em citômetro de fluxo.
3.8. Detecção de apoptose através da marcação intracelular de
caspase-3
Após a extração dos leucócitos totais como previamente descrito no item
3.6., distribuímos uma alíquota de 1x106 células nos seguintes tubos descritos na
tabela 5:
Tabela 5: Painel de anticorpos utilizados em cada tubo para o ensaio de caspase-3
Tubo
FL1
FL2
FL3
FL4
1
-
-
CD14
CD15
2
CD45
-
CD19
CD3
32
Os tubos foram centrifugados a 650g durante 5 minutos a 4°C e os
sobrenadantes desprezados. Foi realizada a marcação de superfície celular com
os anticorpos descritos na tabela 5. Os tubos foram homogeneizados em vórtex e
incubados durante 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em seguida,
receberam 2mL de PBS, novamente centrifugados a 650g durante 5 minutos e os
sobrenadantes
desprezados.
As
células
foram
fixadas
com
2mL
de
paraformaldeído 4% e deixadas em repouso durante a noite ao abrigo da luz em
geladeira (2-8°C). No dia seguinte os tubos foram centrifugados a 650g durante 5
minutos a temperatura ambiente e os sobrenadantes desprezados. As células
foram lavadas em 2mL de PBS e novamente centrifugadas. Foram acrescentados
750µL de tampão de permeabilização em cada tubo e incubados durante 30 min a
temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas com 2mL de PBS e em
seguida foi realizada a marcação intracelular com o anticorpo anti-caspase-3 como
descrito abaixo (tabela 6):
Tabela 6: Painel de marcação com caspase-3.
Tubo
células
Anti Caspase-3 PE
Tampão
1
1x106
10µL
300µL
2
1x106
10µL
300µL
As células foram incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente ao
abrigo da luz. Após a incubação foram adicionados 2mL de PBS e os tubos
novamente centrifugados. Após desprezar os sobrenadantes foram adicionados
33
300µL de tampão de marcação, e as amostras estavam prontas para serem
adquiridas em citômetro de fluxo.
3.9. Contagem absoluta de linfócitos com TruCount
Este teste determina o número absoluto de linfócitos através da técnica de
imunofenotipagem, ou seja, através da ligação específica de anticorpos marcados
com fluorocromo aos antígenos de superfície dos linfócitos. A técnica é realizada
em tubos TruCOUNT (BD Biosciences) que contêm um número conhecido de
partículas de referência liofilizadas, que possuem fluorescência. Estas partículas
são lidas na citometria de fluxo, simultaneamente com as células de interesse já
marcadas. A contagem destas partículas auxilia no cálculo da contagem absoluta
da população de linfócitos.
Os tubos TruCOUNT foram identificados e receberam 10µL da mistura de
anticorpos CD3-FITC, CD8-PE, CD45-PerCP e CD4-APC ou CD3-FITC, CD16/56PE, CD45-PerCP e CD19-APC. O sangue coletado em tubo contendo EDTA foi
homogeneizado e foram transferidos 50µL de sangue total por pipetagem reversa
para os tubos TruCOUNT. Após serem homogeneizados em vórtex, os tubos
foram incubados durante 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em
seguida, as hemácias foram lisadas acrescentando-se 450µL da solução de lise
(BD Biosciences). Os tubos foram homogeneizados em vórtex e incubados
durante 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação foi
feita a aquisição em citometro de fluxo.
34
3.10 Citometria de fluxo
A leitura das amostras foi realizada em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD
Bioscience) equipado com dois laseres, um de argônio e outro de diodo, com
emissão de comprimentos de onda de 488nm e 633nm, respectivamente. O laser
de argônio possibilita a excitação de três fluorocromos, FITC, PE e PerCP, e o de
diodo excita o fluorocromo APC. As dispersões frontal (FSC) e lateral (SSC) de luz
detectam, sem auxílio de fluorescência, tamanho e complexidade celular,
respectivamente, e foram observadas em escala linear. Desta forma foi possível
detectar até seis parâmetros para cada evento adquirido, sendo que cada evento
foi considerado como uma célula. Foi realizada compensação entre os canais de
fluorescências com a finalidade de excluir a sobreposição do comprimento de
onda dos respectivos fluorocromos. O citômetro é acoplado a unidade constituída
por microcomputador Macintosh Power PC, modelo G4 (Apple Computer Inc.,
Cupertino, CA, EUA), que permite controle sobre o citômetro e armazenamento
dos dados em arquivos.
Para a aquisição dos eventos utilizou-se um gráfico de dispersão frontal de
luz (FSC) versus dispersão lateral de luz (SSC) para identificação das populações
de leucócitos. Desta forma foi possível estabelecer a região de Linfócitos (R1).
Através da janela R1 Foram adquiridos 10.000 eventos, ou seja, células que
tivessem morfologia de linfócitos (figura 7).
Tanto a aquisição dos eventos quanto a análise dos resultados foram
realizadas através do programa CellQuest (BD Bioscience).
35
600 800 1000
400
200
Dispersão lateral de luz
R1
0
R1
0
200
400
600 800 1000
Dispersão frontal de luz
Figura 7: Estratégia de aquisição. O gráfico acima mostra a dispersão frontal de luz
(abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada), correspondendo ao tamanho e
complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a população característica
de linfócitos onde foram adquiridos 10.000 eventos. Todos os eventos, mesmo os fora da
região R1, foram armazenados.
Para a análise dos dados de linfócitos, foi utilizado gráfico de dispersão
frontal versus lateral de luz definindo-se uma região na morfologia de linfócitos R1,
onde analisamos os linfócitos totais, como mostra a figura 8A. Em outro gráfico de
dispersão lateral de luz versus expressão de CD3, desenhou-se outra região (R2)
nas células CD3+ (figura 8B). Combinando os eventos contidos nas janelas R1 e
R2 foi possível identificar os linfócitos T (CD3+) de menor tamanho e excluir a
contaminação de monócitos e neutrófilos.
36
R1
0
200
400
600 800 1000
400
R2R2
0
0
R1
B
200
Dispersão lateral de luz
600 800 1000
400
200
Dispersão lateral de luz
A
100
600 800 1000
101
102
103
104
CD45
CD3
Dispersão frontal de luz
Figura 8: Estratégia de análise de linfócitos. O gráfico A acima mostra a dispersão frontal
de luz (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada), correspondendo ao tamanho e
complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a população característica
de linfócitos. O gráfico B mostra expressão de CD3 (abscissa) e dispersão lateral de luz
(ordenada). A região 2 (R2) separa os eventos CD3+.
Na análise dos dados de monócitos e neutrófilos, utilizou-se estratégia
similar, gráfico de dispersão frontal versus lateral de luz definindo-se uma região
na morfologia de monócitos (R1) e neutrófilos (R2) figura 9A. Os monócitos foram
analisados após a combinação das regiões R1 e R4 (CD14+) e os neutrófilos após
600 800 1000
600 800 1000
200
400
600
200
800 1000
Dispersão frontal de luz
200
400
0
A
B
0
200
R1
R1
R4
400
R3
R3
100
101
102
CD15
103
104
C
0
600 800 1000
400
R2
R2
0
Dispersão lateral de luz
a combinação das regiões R2 e R3 (CD15+), conforme descrito na figura 9.
100
101
102
103
104
CD14
Figura 9: Estratégia de analise de monócitos e neutrófilos. O gráfico A acima mostra a
dispersão frontal de luz (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada), correspondendo
ao tamanho e complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a morfologia
característica de monócitos e a região 2 (R2) os neutrófilos. O gráfico B mostra a região 3
(R3) onde separa-se os eventos CD15+. Os neutrófilos foram identificados através da
combinação das regiões R2 e R3. O gráfico C mostra a região 4 (R4) onde separa-se os
eventos CD14+. Os monócitos foram identificados através da combinação das regiões R1
e R4.
37
Após a identificação das subpopulações celulares como descrito nas figuras
8 e 9, foi possível analisar a apoptose pelas técnicas de anexina-V e iodeto de
4
3
1
2
102
100
101
PI
103
104
propídeo (figura 10) e caspase-3 (figura 11).
100
101
102
103
104
Anexina V
600 800 1000
400
200
0
Dispersão lateral de luz
Figura 10: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da marcação por
Anexina-V e Iodeto de Propídeo (PI). O quadrante 1 mostra as células viáveis, quadrante
2 células em apoptose precoce (anexina-V +), quadrante 3 células em apoptose
tardia/necrose (anexina-V+ e iodeto de propídeo +), e o quadrante 4 células em necrose
(iodeto de propídeo +).
100
101
102
Caspase-3
103
104
100
101
102
103
104
Caspase-3
Figura 11: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da marcação de
caspase-3. Utilizando um tubo não marcado com caspase-3 (gráfico a esquerda)
determinou-se um quadrante para verificar a expressão basal de caspase-3. Em outro
tubo marcado com caspase-3 (gráfico a direita) utilizou-se o mesmo quadrante da
condição anterior para determinar a expressão real de caspase-3.
38
3.10.1 Estratégia de aquisição para contagem absoluta de linfócitos
A aquisição e análise das amostras para contagem de linfócitos foi
realizada no programa MultiSET (BD Biosciences). No primeiro gráfico de
dispersão lateral de luz versus CD45 (figura 12) foi possível identificar a população
de linfócitos, que tem baixa complexidade e alta expressão de CD45 (região R1).
Foram adquiridos e armazenados no total 15000 eventos.
Figura 12: Aquisição de eventos para contagem linfócitos. O gráfico acima mostra
expressão de CD45 (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada). A região R1 delimita
a população de linfócitos CD45+ onde foram adquiridos no mínino 2000 eventos.
39
3.10.2 Análise das populações de linfócitos totais e subpopulações
O primeiro tubo analisado foi aquele previamente marcado com os
anticorpos CD45, CD3, CD8 e CD4. Neste foi realizada a contagem absoluta de
linfócitos utilizando-se um gráfico de dispersão lateral de luz versus expressão de
CD45 (figura 13A) definindo-se uma região de linfócitos CD45+ (R1). Em outro
gráfico de dispersão lateral de luz versus expressão de CD3, desenhou-se outra
região (R2) nas células CD3+ (figura 13B). Combinando os eventos contidos nas
janelas R1 e R2 foi possível identificar os linfócitos T (CD3+).
Figura 13: Estratégia de análise de linfócitos T. O gráfico A apresenta expressão de
CD45 (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada) correspondendo a complexidade
celular. A região 1 (R1) delimita a população característica de linfócitos CD45+. O gráfico
B mostra expressão de CD3 (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada). A região 2
(R2) separa os eventos CD3+.
Para análise das subpopulações de linfócitos T foi utilizado um novo gráfico
de expressão de CD4 versus expressão de CD8 (figura 14). Foram definidas as
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regiões R3 e R4 que correspondem aos linfócitos T auxiliares e citotóxicos,
respectivamente.
Figura 14: Estratégia de análise das subpopulações de linfócitos T. Combinando os
eventos contidos nas regiões R1 e R2 (figura 14) obteve-se a população de linfócitos T
(CD3+). A partir desses eventos construiu-se o gráfico de expressão de CD4 (ordenada)
versus expressão de CD8 (abscissa) e foi possível identificar as subpopulações de
linfócitos T onde a região 3 (R3) separa a população característica de linfócitos T CD4+ e
a região 4 (R4) delimita a população T CD8+.
Na figura 15 observa-se uma população de partículas de referência
contidas nos tubos Trucount, cujo número varia de acordo com o lote. Estas
partículas foram utilizadas pelo programa para cálculo da contagem absoluta da
população
e
subpopulações
de
linfócitos
totais,
CD3
e
CD4,
CD8,
respectivamente.
41
Figura 15: Contagem das partículas de referências. No gráfico de expressão de CD8
(ordenada) versus expressão de CD3 (abscissa) é delimitada a região 5 (R5) onde o
programa realiza a contagem das partículas de referências adquiridas no primeiro tubo de
amostra.
O segundo tubo analisado foi aquele previamente marcado com os
anticorpos CD3, CD19 e CD16/56. Neste foi realizada a contagem de linfócitos
totais (CD45+) e linfócitos T (CD3+) de maneira similar ao tubo anterior (figura 16).
Para contagem das populações de linfócitos B (CD19+) e Natural Killer (NK
- CD16/56+) foi utilizado um novo gráfico de expressão de CD3 versus dispersão
lateral de luz (figura 16A). A região R2 delimita os linfócitos T enquanto que a
região R3 define a população de linfócitos CD3 negativos. A partir de R3 um
gráfico (figura 16B) de expressão de CD16/56 (ordenada) versus expressão de
CD19
(abscissa)
permitiu
analisar
as
células
NK
e
os
linfócitos
B,
respectivamente.
42
Figura 16: Estratégia de análise das populações de linfócitos B e NK. Utilizando os
eventos contidos na região R3, linfócitos CD3 negativos, (gráfico A) construiu-se o gráfico
B de expressão de CD16/56 (ordenada) versus expressão de CD19 (abscissa), onde foi
possível identificar as populações de linfócitos B (CD19+) contidos na região 4 (R4) e
linfócitos NK (CD16/56+) contidos na região 5 (R5).
De maneira similar ao tubo primeiro tubo observa-se a população de
partículas de referência contidas nos tubos TruCOUNT (figura 17). Estas
partículas foram utilizadas pelo programa para cálculo da contagem absoluta das
populações de linfócitos totais, CD3, CD19 e CD16/56.
Figura 17: Contagem das partículas de referências. No gráfico de expressão de CD16/56
versus expressão de CD3 delimita-se a região 6 (R6) que contém as partículas de
referência adquiridas no segundo tubo do experimento.
43
Assim, para determinação da contagem absoluta de cada população e
subpopulação de linfócitos o programa MultiSET realiza automaticamente o
cálculo:
Número de partículas
contadas pelo
citômetro
X
Quantidade de sangue total pipetado (50
µL)
Total de partículas (dados do Kit)
=
µL de sangue
aspirado pelo
citômetro
Número de linfócitos contados
µL de sangue aspirado pelo citômetro
= linfócitos / µL de sangue
O número de partículas adquiridas pelo citômetro de fluxo é multiplicado
pela quantidade de sangue pipetado (50µL) e dividido pela quantidade total de
partículas contidas no tubo TruCOUNT. Obtém-se o volume de sangue adquirido e
assim, a quantidade de células contidas na região de interesse pode ser dividida
por este volume resultando no valor absoluto da população celular de interesse.
No caso das contagens de linfócitos totais (CD45+) e linfócitos T (CD3+) o
programa libera como resultado final a média da contagem dos dois tubos.
O cálculo da porcentagem das populações de linfócitos é realizado a partir
do número absoluto das células da população de interesse dividido pelo número
absoluto de linfócitos totais (CD45+) identificados em R1 como mostrado na figura
14A. Veja a seguir o esquema do cálculo.
Número absoluto da população de interesse
Número absoluto de linfócitos CD45+
X 100
=
Porcentagem de células
da população de interesse
Assim, os resultados foram apresentados tanto em número de células por
microlitro de sangue quanto em porcentagem de células positivas em relação à
população de linfócitos totais.
44
3.11. Análise estatística.
As análises foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS
(Statistical Package for Social Sciences v15.0), Para comparação de dados
quantitativos entre 3 ou mais grupos independentes, foi utilizado o teste de
Kruskal-Wallis, seguindo o teste de Mann-Whitney U para comparar 2 grupos
independentes, quando necessário.
Quando comparamos os dados quantitativos intra-grupo dependentes, foi
realizado o teste de Friedman.
O valor de significância estatística foi estabelecido em 5%, ou p<0,05.
45
_______________________
Resultados
4. Resultados
A apoptose foi analisada nas populações de linfócitos, linfócitos T e
neutrófilos pelos métodos de anexina V e iodeto de propídeo e também pela
mensuração intracelular da caspase-3 ativa. Nos monócitos foi realizado
apenas o método de caspase-3.
4.1 Linfócitos
Os percentuais de linfócitos em apoptose, avaliada pela técnica de
anexina V e iodeto de propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, dos
pacientes sépticos e dos indivíduos sadios estão descritos na tabela 7. Dados
de apoptose em linfócitos foram obtidos de 40 pacientes.
Não houve diferença no percentual de apoptose, avaliada pelo método de
anexina V e iodeto de propídeo, entre o grupo controle e os pacientes sépticos
(D0) (, em relação a apoptose precoce (figura 18A) e apoptose tardia (figura
18B), assim como no percentual de células viáveis (figura 18C), Dado
semelhante foi observado quando se mensurou o percentual de células
positivas para caspase-3 (tabela 7; figura 18D) (p>0,05, teste de MannWhitney).
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Tabela 7: Apoptose em linfócitos, avaliada pelo método de anexina V e iodeto de
propídeo e pela detecção intracelular de caspase-3, em indivíduos sadios e
pacientes sépticos.
Linfócitos
Apoptose Precoce
Controles
Pacientes (D0)
Apoptose Tardia
Controles
Pacientes (D0)
Células Viavéis
Controles
Pacientes (D0)
Caspase-3
Controles
Pacientes (D0)
n
Média
Desvio Padrão Mediana Mínimo Máximo
15
35
13,89
13,12
8,77
5,89
11,31
11,50
6,28
4,50
34,54
30,99
15
35
20,65
15,32
17,23
12,03
20,39
9,92
2,66
2,11
63,25
53,10
15
35
58,06
64,41
15,55
15,63
57,88
66,02
26,64
22,45
85,26
84,49
15
33
6,94
7,91
7,23
6,46
3,02
5,83
0,65
0,48
24,10
22,33
B
Apoptose Tardia (%)
Apoptose Precoce (%)
A
Sadios
Pacientes (D0)
D
Células Positivas para Caspase-3 (%)
Células Viáveis (%)
C
Sadios
Pacientes (D0)
Figura 18: Linfócitos em apoptose e células viáveis no sangue periférico de indivíduos
sadios (n=15) e pacientes sépticos (D0; n= 35). São representados os percentuais de
apoptose precoce (A), apoptose tardia (B) e de células viáveis (C), avaliada pelo
método de anexina V e iodeto de propídeo. Na figura D são representados os
percentuais de células positivas para caspase-3. Estão representados os valores
máximo e mínimo, os percentis 25% e 75% (caixas), mediana dos grupos e valores
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