POLIMORFISMOS DE MARCADORES

POLIMORFISMOS DE MARCADORES ISOENZIMÁTICOS E RAPD EM Cereus
jamacaru DC
Silvia Braz Rodrigues de Oliveira (bolsista ICV-UFPI), Gleice Ribeiro Orasmo (Orientadora,
Departamento de Biologia-UFPI)
INTRODUÇÃO
O gênero Cereus Juss. pertence à família Cactaceae que constitui a flora de vários estados
brasileiros com destaque na região nordeste (DAVET, 2005). É de grande utilidade na atividade
forrageira, na alimentação de bovinos, caprinos e ovinos, na manutenção da sustentabilidade e
conservação do bioma caatinga. Por todo o Brasil as plantas de mandacaru do gênero Cereus
constituem espécies diferentes, mas com morfologia semelhante. Devido à dificuldade de descrição e
definição das linhagens evolutivas, a avaliação do polimorfismo em nível molecular e bioquímico é
uma boa estratégia para estabelecer a relação de similaridade ou de divergência genética ocorridas
entre diferentes amostras de mandacaru cultivadas na região Meio-Norte do Brasil, situada no oeste
nordestino, abrangendo os Estados do Maranhão e Piauí (RIBEIRO, 2008).
Assim, o objetivo do presente estudo foi estimar a diversidade genética em populações de
mandacaru (C. jamacaru) em nível bioquímico, usando os padrões de α- e β-esterases, e em nível
molecular, usando os polimorfismos de DNA amplificado ao acaso (RAPD); a fim de propiciar uma
análise da estrutura populacional desta espécie típica da região Meio-Norte brasileira.
METODOLOGIA
Frutos maduros de mandacaru foram coletados em jardins e zonas rurais nos municípios de
Teresina, Parnaíba, São Félix do Piauí e Itaueira, no Estado Piauí, e transportados ao Laboratório de
Biologia Molecular e Recursos Genéticos do Dept.º de Biologia da UFPI. As sementes foram
germinadas em placa de Petri, da qual uma parte dos caules jovens (com cerca de 1 cm) foram
usados na extração de enzimas e outra parte foi transplantada em vasos contendo uma mistura de
areia e argila. Ao atingirem cerca de 4 cm, os caules jovens foram usados na extração de DNA.
A extração do DNA genômico baseou-se no protocolo de Al-Janabi et al. (1999), com
modificações. A solução para as reações de amplificação nos ensaios de RAPD tiveram uma
concentração final de 10 µl, contendo 3,8 µl de água, 1 µl de DNA (10 ng. µl), 1 µl de dNTP, 1,5 µl de
primer, 1,5 µl de MgCl2, 1 µl de tampão de reação e 0,2 da Taq polimerase. A desnaturação do DNA
foi feita a 96 ºC por 5 min, seguida de 45 ciclos de amplificação (94 ºC: 45 seg.; 35 ºC: 1 min,; 72º C:
1 min. 30 seg.) e uma extensão de 7 min a 72 ºC. Foram testadas das condições de amplificação,
baseadas em Resende (2006) e Gomes et al (2012). Um total de 17 primers RAPD (UBC-1, UBC125, UBC-243, UBC-272, UBC-625, UBC-386, UBC-436, UBC-088, UBC-247, UBC-663, UBC-097,
UBC-378, OPA-09, OPI-07, OPJ-19, OPI-01 e OPI-02) foi testado para amplificação.
Para análise de isoenzimas, caules jovens de 196 plântulas de mandacaru foram
individualmente homogeneizados em solução de extração (tampão fosfato 1,0 M pH 7,0, EDTA 10%,
glicerol 10%, PVP-40 5% e β-mercaptoetanol). As amostras foram centrifugadas e aplicadas no gel
de poliacrilamida 12%, preparado com tampão Tris/ HCl 1,5 M pH 8,8, bis/acrilamida 30%, persulfato
de amônio 2% e TEMED. O gel de empilhamento foi preparado com bis-acrilamida 8%, Tris-HCl 0,24
M pH 6,8, persulfato de amônio 2% e TEMED. A eletroforese durou 5h a 200V em tampão o trisglicina 0,1M pH 8,3. As isoesterases foram evidenciadas com tampão fosfato de sódio 0,1M pH 6,2,
α- e β-naftil acetato e Fast blue RR salt. Para a análise da diversidade foi utilizado o programa
POPGENE 1.32.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 17 primers testados, apenas dois (UBC-125 e UBC-243) forneceram produtos para a
amplificação. No entanto, mostraram-se pouco nítidos e insuficientes para serem usados na análise
do polimorfismo em C. jamacaru. É provável que a pouca amplificação dos primers analisados no
presente estudo, seja devido à qualidade do DNA, uma vez que para o anelamento do primer à
sequencia de DNA, o mesmo deva estar em alto grau de pureza. Assim, a etapa de extração do DNA
torna-se uma etapa crucial para a amplificação dos fragmentos via PCR.
Na eletroforese de isoenzimas foram detectados onze loci de isoesterases (Est-2, Est-3,
Est-4, Est-5, Est-6, Est-7, Est-8, Est-9, Est-10, Est-11 e Est-12) (Figura 01), sendo revelados três
alelos para os loci Est-4 e Est-11, um alelo para a isoesterase Est-9 e dois alelos para os demais loci,
totalizando 23 alelos.
Figura 01: Isoenzimas - e -esterases extraídas de plântulas de Cereus jamacaru, acessos de
Teresina (amostras 1 a 6) e Parnaíba (7 a 18) em gel de poliacrilamida no sistema PAGE.
Dos onze loci de isoesterases detectados em caules jovens de mandacaru, dez foram
polimórficos. O número médio de alelos por loci foi de 2,0, em contraste, o número de alelos efetivos
foi de 1,3, indicando que há flutuações de alelos entre as populações. Embora a porcentagem de loci
polimórficos foi 90,91%, a heterozigosidade média observada (18%) foi menor que a esperada (23%),
assim, a quantidade de heterozigotos está abaixo do esperado para as populações estudadas.
Mangolin et al. (2010) encontraram 42,85% de loci polimórficos em Cereus peruvianos. Desta forma,
se comparado ao presente estudo, a espécie C. jamacaru pode ser considerada mais polimórfica que
C. peruvianus, entretanto, estudos posteriores são necessários para confirmar esta indicação.
A maior similaridade genética foi observada entre as populações de Teresina e Paranaíba
(99%), e a maior distância genética foi encontrada entre as populações de São Félix do Piauí e
Itaueira (29%). Aguiar et al. (2013) afirmam a existência de uma correlação entre as distâncias
geográficas e genéticas. A divergência genética por isoenzimas em Eugenia dysenterica mostrou
padrões espaciais de agrupamentos em populações locais (TELLES et al., 2003), indicando que uma
distância cerca de 120 km entre as populações é suficiente para a conservação da diversidade
genética. Dessa forma, explica-se a grande similaridade genética entre as populações de Teresina e
Parnaíba, sendo estas geograficamente mais próximas, dentre as populações estudadas.
O dendrograma gerado pelo método de agrupamento UPGMA mostrou a formação de dois
grupos, no qual a população de Itaueira ficou isolada das demais populações (Figura 02). Assim,
dentre as quatros populações analisadas, os genótipos de mandacaru da população de Itaueira são
mais recomendados para ser usado em cruzamentos nos programas de melhoramento genético da
espécie, por apresentarem maior divergência genética.
Figura 02: Dendrograma representativo da divergência genética entre quatro populações estudadas,
obtido pelo método UPGMA.
CONCLUSÃO
Os marcadores RAPD mostraram-se pouco amplificáveis, não permitindo a análise nas
populações de mandacaru analisadas. O polimorfismo de α- e β-esterases foi capaz de distinguir as
quatro populações de mandacaru analisadas. Os acessos de mandacaru da população de Itaueira
podem ser utilizados em programas de melhoramento genético na espécie. .
APOIO: Universidade Federal do Piauí- UFPI
REFERÊNCIAS
AGUIAR, R.V. et al. Variabilidade genética de Eugenia uniflora L. em remanescentes florestais em
diferentes estádios sucessionais. Rev. Ceres ,vol.60 no.2 ,Viçosa, 2013.
AL-JANABI S.M. et al. An improved and rapid protocol for the isolation of polysaccharide and
polyphenol-free sugarcane DNA. Plant Mol. Biol. Rep., v. 17, p. 1-8, 1999.
DAVET, A. Estudo fitoquímico e biológico do cacto Cereus jamacaru De Candolle, Cactaceae.
2005. 121p. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)- Universidade Federal do Paraná,
Curitiba, 2005.
GOMES, S. O. et al. Determinação da temperatura de anelamento com marcadores ISSR em
acessos de pinhão-manso. In: 2º CONGRESSO BRASILEIRO DE RECURSOS GENÉTICOS. II,
2012, Belém. Anais... Belém. 2012. p 4.
MANGOLIN ET AL. Esterase Polymorphism and the Analysis of Genetic Diversity and Structure in
Cactus Populations Descended from Cereus peruvianus Plants Regenerated In Vitro. Springer
Science+Business Media, LLC 2011.
RESENDE, A. G. Polimorfismo de DNA em plantas regeneradas in vitro e nos descendentes
RF1 de Cereus peruvianus Mill. (Cactaceae). 2006. 56p. Tese (Doutorado em Biologia Celular) Universidade Estadual de Maringá, Paraná, 2006.
RIBEIRO, J. L. Manejo da cultura de girassol no Meio-Norte do Brasil. Embrapa, 2008 (Circular
Técnica, 48).
TELLES, M. P. C, et al. Genetic diversity and population structure of Eugenia dysenterica DC.
("cagaiteira" - Myrtaceae) in Central Brazil: Spatial analysis and implications for conservation and
management. Conservation Genetics, p.685-695, 2013.
Palavras-chaves: Esterase. Mandacaru. Marcadores moleculares.