FABIANA FIGUEREDO MOLIN DE BARBA ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS DE Pleurotus djamor SOBRE SARCOMA 180 IN VIVO JOINVILLE 2010 FABIANA FIGUEREDO MOLIN DE BARBA ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS DE Pleurotus djamor SOBRE SARCOMA 180 IN VIVO Dissertação de mestrado apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde e Meio Ambiente, na Universidade da a Região de Joinville. Orientadora: Profa. Dr . Sandra Aparecida Furlan. Co-orientador: Prof. Dr. Mauro de Souza Leite Pinho. JOINVILLE 2010 “Por amor à pesquisa, a ciência a favor da Vida” Dedico esta pesquisa a minha amada e encantadora Mãe Maria Ignez, meu maior exemplo de vida, ao Ilustre Médico e terno Cientista Dr. Francisco Fajardo e à Terra do Sol. Aos dois grandes amores da minha vida, meus dois Franciscos, aos meus queridos irmãos Marcos, Jane, Rafael e Beatriz, a minha amada afilhada e sobrinha Victória Eduarda e a todas as pessoas que lutam contra o câncer. ii AGRADECIMENTOS Inicialmente quero agradecer a Deus, a Jesus, ao amado amigo, Mestre, Mentor, Médico e Cientista Dr. Francisco de Paula Fajardo Júnior e a toda Espiritualidade de Luz, pela confiança depositada em mim, por terem me conduzido de mãos dadas até este lindo momento de minha vida. Quero fazer uma referência especial de gratidão aos dois grandes amores de minha vida. Meu amado esposo Francisco, pelos beijos e abraços, pela orientação, pelo apoio, carinho, incentivo, companheirismo, exemplo, força e amor dedicados a mim durante estes anos. Ao meu encantado Francisco Paulo, filho amado de apenas sete meses de vida, que chegou em um dos momentos em que eu mais precisei me fazer ausente. Chegou timidamente e além de me entender, é uma das criaturinhas que mais me deu e me dá forças para seguir adiante. Com seu encanto e beleza, ele me traz, a cada amanhecer, um entusiasmo novo, para a realização deste projeto. Quero agradecer também em especial a minha sábia e amada Mãe Maria Ignez Figueredo, principalmente pelo seu grande exemplo de vida, de conduta pautada em valores Divinos, valores de amor e de Espiritualidade. Agradeço também pelos ensinamentos da Ciência do Pensar, pela força, dedicação, carinho, companheirismo, amor, pela amizade, por ser esta Jóia tão rara que faz parte de mim e que me ensina a cada dia mais, o verdadeiro caminho a seguir. Obrigada mãe amada por ter me oportunizado chegar até aqui. Obrigada pela coragem que me deste a partir da tua fé, me direcionando e caminhando comigo, lado a lado, para o sucesso de todos os meus desafios. Agradeço a minha amada amiga e também mãe Mareli, pela oportunidade que me deu em fazer parte de sua família, por todos os ensinamentos, pela acolhida, pelo amor e carinho que tem por mim, por ser parte também de nós e pelo amor dedicado ao nosso pequeno Francisco Paulo. Ao meu amado e encantador irmão e também Pai, Marcos Paulo e a sua esposa, minha irmã Jane e a minha afilhada do coração Victória por todos os momentos em que estiveram comigo, motivando-me a ultrapassar cada obstáculo com muita fé e determinação. Dando-me forças para continuar a trajetória com garra e vontade para que eu, neste dia, conseguisse chegar ao meu objetivo com muita alegria a sucesso. Ao meu irmão Rafael e sua esposa, minha irmã Beatriz, por terem iii acreditado em mim, desde o início, me dando forças e coragem. Agradeço pelo companheirismo, entusiasmo e dedicação a mim sempre. A minha Vó Velha e Vó Alcina, por fazerem parte de mim e me conduzirem nesta vida, pelo exemplo, pelo carinho e também, principalmente, pelo amor. Ao meu Pai querido, pelo incentivo e oportunidade de vida. À Família de meu marido, minha família, pelo carinho e entusiasmo. Em especial a minha querida Orientadora Professora Sandra, por ter acreditado em mim, pelo companheirismo, pelos ensinamentos, pelo carinho, pelo exemplo, pela conduta fantástica que teve comigo e por tudo o que fez para que eu chegasse até aqui. Ao meu querido Co-orientador Professor Mauro, pelos ensinamentos e mais ainda pela oportunidade em dividir comigo o seu conhecimento sobre o câncer. À Márcia, pela aprendizagem, carinho, dedicação e companheirismo durante os experimentos e pesquisas. A todos os alunos companheiros do Mestrado, alunos de Iniciação Científica que se disponibilizaram em me ajudar nos experimentos, à Débora e à Patrícia pela atenção e carinho. A toda Família Terra do Sol e CELE pela fé depositada em mim, pelo amor, entusiasmo e força para esta caminhada e em especial aos Mestres e Mentores. Com muito carinho e gratidão, agradeço a Equipe da Saúde pela forte torcida, pelos momentos de incentivo e carinho, pelo amor e pela compreensão e responsabilidade diante de Deus em minha ausência. Ao amigo e irmão Bruno que esteve comigo e acompanhou a minha trajetória desde o início e que ao meu lado me deu forças e coragem. A sua esposa e minha amiga irmã Elaine e a minha princesinha afilhada Sophia, pelo carinho e amor dedicados. A minha amada mana Aline que, com sua simplicidade, exemplo de superação e auxílio me ensina a cada dia. Ao seu esposo, meu amado primo e também irmão Jonas, e ao nosso pequeno e fofinho Davi Carlos, por dividirem comigo a sua alegria e o seu amor. Ao meu querido e também Pai Almir, por se fazer tão presente em minha vida, por me dar tanto amor e carinho e sempre me apoiar em muitos momentos de minha vida. iv Aos meus queridos pacientes, pela compreensão de minha ausência e pelos momentos em que cresci e aprendi com cada um deles durante estes anos de pesquisa. Também quero agradecer imensamente a todas as pessoas que me abriram as portas para o mundo científico desde o ano de 2003. A todas as pessoas que contribuíram para que eu realizasse esta etapa fantástica de minha vida e que fizeram com que, em passos firmes, eu chegasse até aqui. Enfim, dedico também este trabalho a minha amada e encantadora amiga Rosane, meu grande exemplo de fé e determinação e a todas as pessoas que lutam contra o câncer e que têm esperanças de que um dia ainda haveremos de ter a oportunidade de nos depararmos com a sua cura. “É preciso ter coragem para ousar e fé para garantir a ousadia.” (Dr. Francisco Fajardo) v RESUMO O câncer é caracterizado por um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células anormais que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se pelo corpo todo. Estimativas do Instituto Nacional do Câncer - INCA, do Ministério da Saúde, indicam que em 2008 o câncer foi responsável por 7,6 milhões de mortes no mundo. A estimativa de incidência do Câncer no Brasil em 2010 revela que aproximadamente 490 mil novos casos da doença estão previstos para este ano no país. Essa grande incidência faz com que aumentem as pesquisas na busca de terapias mais seguras e eficazes para a prevenção e o combate da doença. As principais modalidades de tratamento para o câncer são a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia. No entanto, esses tratamentos utilizam agentes que interferem nos mecanismos de sobrevivência, proliferação e migração celular, gerando toxicidades e reações diversas. A busca por novas substâncias biologicamente ativas aumentou o interesse no uso dos cogumelos devido aos seus vários efeitos terapêuticos. Polissacarídeos sintetizados por alguns fungos, como os do gênero Pleurotus, entre eles os β-glucanos, são considerados os principais responsáveis pelas suas propriedades terapêuticas, destacando-se a atividade antitumoral. Este trabalho teve como objetivo investigar in vivo a atividade antitumoral dos polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor, cultivado em meio líquido, sobre sarcoma 180 (S180). Foi avaliada a atividade antitumoral de polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor, obtidos por precipitação com etanol (PE1) e com acetona (PE2), administrados em camundongos por via intraperitoneal. O tratamento dos animais foi iniciado 24 horas após o implante tumoral e foi conduzido durante 10 dias, utilizando as doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg para as duas substâncias. A avaliação do desenvolvimento tumoral foi realizada 21 dias após a indução do tumor pela determinação do peso e do volume tumoral. Os resultados mostraram que ambos os precipitados foram efetivos contra S180, com taxas de inibição de 60%, 83%, 94% e 64% para as doses de 3, 10, 30 e 100mg/Kg de PE1, respectivamente, e de 55%, 82%, 93% e 89% para as doses de 3, 10, 30 e 100mg/Kg de PE2, respectivamente. O teste de sobrevida revelou 100%, 100% e 80% de sobrevivência dos animais para as doses de 30, 100 e 300 mg/Kg de PE1, respectivamente, e de 100%, 100% e 0% para as doses de 30, 100 e 300 mg/Kg de PE2, respectivamente. Palavras-chave: Pleurotus djamor, Sarcoma 180, sobrevida, polissacarídeos. vi câncer, tratamento intraperitoneal, ABSTRACT Cancer is characterized by a set of more than 100 diseases that have in common the division of abnormal cells without control, and these cells are able to invade other tissues and organs and can spread throughout the body. The National Cancer Institute - INCA, estimates that in 2008 cancer was responsible for 7.6 million deaths worldwide. The estimated incidence of cancer in Brazil in 2010 shows that approximately 490 thousand new cases are expected this year in the country. This high incidence makes increase research for safer and more effective therapies to prevent and combat this disease. The main types of cancer treatment are surgery, radiotherapy and chemotherapy. However these treatments use agents that interfere with the mechanisms of cell survival, proliferation and migration, generating many reactions and toxicity. The research for new bioactive substances increased interest in the use of mushrooms, because of their various therapeutic effects. Polysaccharides synthesized by some fungi, such as the Pleurotus genus, include the β-glucan, and are considered the main responsible for its therapeutic properties, including antitumor activity. This study aimed to investigate in vivo antitumor activity of extracellular polysaccharides of Pleurotus djamor grown in liquid medium against Sarcoma 180 (S180) cells. Antitumor activity of extracellular polysaccharide from Pleurotus djamor was evaluated in vivo. The test substances were obtained by ethanol (PE1) and acetone (PE2) precipitation and were administered intraperitoneally in mice. Animal treatment started 24 hours after tumor implantation and was conducted for 10 days, using doses of 3, 10, 30 and 100 mg /Kg for both substances. The assessment of tumor development was performed 21 days after tumor induction by determination of tumor weight and volume. The results showed that both extracts were effective against sarcoma 180, with inhibition rates of 60%, 83%, 94% and 64% for doses of 3, 10, 30 and 100 mg/kg of PE1, respectively, and 55%, 82%, 93% and 89% for doses of 3, 10, 30 and 100 mg/kg of PE2, respectively. Survival test showed 100%, 100% and 80% animal survival for doses of 30, 100 and 300 mg/Kg of PE1, respectively, and 100%, 100% and 0% for doses of 30, 100 and 300 mg/Kg of PE2, respectively. Key words: Pleurotus djamor, cancer, intraperitoneal treatment, Sarcoma 180, survival, polysaccharide. vii LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Percentuais de inibição tumoral por origem da substância e tipo de tumor.................................................................................................. 51 Tabela 2 - Taxas de sobrevida por origem da substância e tipo de tumor............... 53 Tabela 3 - Dose de PE2, taxa e tempo de mortalidade dos animais do grupo controle substância. ................................................................................ 53 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Diferença de peso (g) ± erro padrão dos animais tratados com as substâncias PE1 (precipitado obtido com etanol) e PE2 (precipitado obtido com acetona), nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg e dos animais dos grupos controle positivo (CP) e negativo (CN). CS é o grupo controle substância e GT é o grupo teste. As letras de “a” a “s” representam a existência ou não de diferença significativa entre os grupos: a ausência de uma ou mais letras sobre a barra representativa de um determinado grupo, indica a existência de diferença significativa entre este grupo e aquele representado pela ausente. ........................................... 42 Figura 2 - Peso médio do tumor ± erro padrão (g) dos animais do grupo controle positivo (CP) e daqueles tratados com doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2). As letras de “a” a “i” representam a existência ou não de diferença significativa entre os grupos: a ausência de uma ou mais letras sobre a barra representativa de um determinado grupo, indica a existência de diferença significativa entre este grupo e aquele representado pela ausente. .......................................................................................... 43 Figura 3 - Volume médio do tumor (cm3) dos animais do grupo controle positivo e daqueles tratados com doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg de precipitado obtido com etanol (PE1) e precipitado obtido com acetona (PE2). As letras de “a” a “i” representam a existência ou não de diferença significativa entre os grupos: a ausência de uma ou mais letras sobre a barra representativa de um determinado grupo, indica a existência de diferença significativa entre este grupo e aquele representado pela ausente. .................................................................................................. 44 Figura 4 - Taxa média de inibição (%) de crescimento tumoral com as doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg de precipitado obtido com etanol ix (PE1) e precipitado obtido com acetona (PE2) em relação ao grupo controle positivo (CP). .................................................................. 45 Figura 5 - Efeito do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2) na dose de 30 mg/Kg na sobrevida dos animais com tumor. PE1S e PE2S representam os controles substância para PE1 e PE2, respectivamente. CN e CP são os controles negativo e positivo, respectivamente. ..................................... 46 Figura 6 - Efeito do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2) na dose de 100 mg/Kg na sobrevida dos animais com tumor. PE1S e PE2S representam os controles substância para PE1 e PE2, respectivamente. CN e CP são os controles negativo e positivo, respectivamente. ..................................... 47 Figura 7 - Efeito do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2) na dose de 300 mg/Kg na sobrevida dos animais com tumor. PE1S e PE2S representam os controles substância para PE1 e PE2, respectivamente. CN e CP são os controles negativo e positivo, respectivamente. ..................................... 48 Figura 8 - Relação entre a dose do precipitado obtido com acetona (PE2), a taxa e o tempo de mortalidade dos animais do grupo controle substância............................................................................................... 54 x LISTA DE ABREVIATURAS AT - Açúcares Totais CBIN - Caldo de Cultivo in natura CN - Grupo Controle Negativo CP - Grupo Controle Positivo CS - Grupo Controle Substância DNA - Ácido Desoxirribonucleico ECB - Extrato do Caldo de Cultura EFB - Extrato dos Corpos Frutíferos FB - Corpo Frutífero GT - Grupo Teste H22 - Hepatoma 22 IDO - Indolamina-2,3-dioxigenase IFN-α - Interferon alfa IFN-γ - Interferon gama IL-2 - Interleucina 2 IL-6 - Interleucina 6 IL-12 - Interleucina 12 IP - Intraperitoneal INCA - Instituto Nacional do Câncer MAC - Medicina Alternativa e Complementar NCI - National Cancer Institute (Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos da América) NK - Natural Killer (células de defesa) OMS - Organização Mundial da Saúde PBS - Tampão fosfato-salino PE1 - Polissacarídeos Extracelulares de Pleurotus djamor obtidos por precipitação com etanol PE2 - Polissacarídeos Extracelulares de Pleurotus djamor obtidos por precipitação com acetona S180 - Sarcoma 180 xi TAE - Tumor Ascítico de Ehrlich TDA - Trigo-Dextrose-Ágar TNF-α - Fator de Necrose Tumoral alfa xii SUMÁRIO AGRADECIMENTOS ...................................................................................... iii RESUMO ......................................................................................................... vi ABSTRACT .................................................................................................... vii LISTA DE TABELAS..................................................................................... viii LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... ix LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... xi SUMÁRIO ...................................................................................................... xiii 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 15 2 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 17 2.1 NEOPLASIAS ...................................................................................... 17 2.1.1 Conceito e Características ............................................................. 17 2.1.2 Incidência no Brasil e no Mundo .................................................... 18 2.1.3 Tratamentos ................................................................................... 19 2.1.3.1 Cirurgia .................................................................................... 19 2.1.3.2 Quimioterapia .......................................................................... 20 2.1.3.3 Radioterapia ............................................................................ 21 2.1.3.4 Imunoterapia............................................................................ 22 2.1.3.5 Terapias Alternativas ............................................................... 24 2.2 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS ....................................................... 25 2.2.1 Características e Aplicações Gerais .............................................. 25 2.2.2 Ação Antitumoral............................................................................ 26 2.2.3 Fungos do Gênero Pleurotus ......................................................... 29 2.2.4 Métodos de Separação .................................................................. 31 2.2.4.1 Fundamentos do Processo de Separação com Solvente ........ 32 2.2.4.2 Influência do Tipo de Solvente no Processo............................ 32 2.2.4.3 Solventes Utilizados para Obtenção de Polissacarídeos Fúngicos .................................................................................. 33 xiii 3 METODOLOGIA ........................................................................................ 35 3.1 MICRORGANISMO E MANUTENÇÃO ................................................ 35 3.2 OBTENÇÃO DOS PRECIPITADOS POLISSACARÍDICOS ................. 35 3.2.1 Produção dos polissacarídeos extracelulares (PE)........................ 35 3.2.2 Obtenção dos polissacarídeos extracelulares (PE) ....................... 35 3.2.3 Dosagem da concentração de açúcares totais (AT) ...................... 36 3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DOS PRECIPITADOS POLISSACARÍDICOS .............................................. 37 3.3.1 Substâncias e doses de tratamento ............................................... 37 3.3.2 Animais e manutenção .................................................................. 37 3.3.3 Tumor e manutenção ..................................................................... 37 3.3.4 Delineamento experimental do tratamento antitumoral .................. 38 3.3.4.1 Avaliação da ação antitumoral por meio de teste dose x resposta ................................................................................... 38 3.3.4.2 Avaliação do desenvolvimento tumoral ................................... 39 3.3.4.3 Avaliação do tempo de sobrevida ............................................ 39 3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................... 40 4 RESULTADOS .......................................................................................... 42 4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE Pleurotus djamor CONTRA SARCOMA 180 (S180) ........................................................ 42 4.2 ESTUDO DO TEMPO DE SOBREVIDA .............................................. 46 5 DISCUSSÃO ............................................................................................. 49 5.1 ATIVIDADE ANTITUMORAL ................................................................ 49 5.2 TEMPO DE SOBREVIDA ..................................................................... 52 6 CONCLUSÕES ......................................................................................... 56 7 PERSPECTIVAS ....................................................................................... 57 7.1 SUGESTÕES PARA A CONTINUIDADE DO TRABALHO .................. 57 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 58 xiv 1 INTRODUÇÃO Estimativas do Instituto Nacional do Câncer - INCA, do Ministério da Saúde, revelam que em 2008 surgiriam 12,4 milhões de novos casos de câncer, com 7,6 milhões de óbitos no mundo. No Brasil, desde 2003 o câncer se constitui na segunda causa de morte, representando quase 17% dos óbitos por causa conhecida notificados em 2007. Os tipos de câncer com maior incidência foram o de pulmão (1,52 milhões de casos novos), mama (1,29 milhões) e cólon e reto (1,15 milhões), sendo a principal causa de morte o câncer de pulmão (1,31 milhões de óbitos), seguido pelo câncer de estômago (780 mil óbitos) e de fígado (699 mil óbitos). Para o ano de 2010, no Brasil, estima-se a ocorrência de 489.270 novos casos de câncer, sendo os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, os cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e de colo do útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil de magnitude observado para a América Latina (INCA, 2009). Nesse contexto, a procura de novas moléculas, novos alvos e novas formulações para o tratamento do câncer passa a ser estudo altamente prioritário para os governos. A chance de sucesso do tratamento aumenta a partir de estudos prévios que indicam atividade antiproliferativa e antitumoral in vitro ou in vivo (FORTES; NOVAES, 2006). O uso de produtos naturais para o tratamento de doenças é associado à medicina popular em todo mundo. Pesquisas realizadas em Universidades e Institutos de Pesquisa têm revelado substâncias ativas de origem natural com potencial atividade antitumoral, antiviral, analgésica, antioxidante, entre outras. Produtos naturais de plantas, fungos, bactérias e outros organismos continuam sendo usados em preparações farmacêuticas na forma de compostos puros ou extratos (VIEGAS JR.; BOLZANI, 2006). Atualmente, estudos epidemiológicos e testes pré-clínicos têm revelado um grande potencial dos compostos naturais no combate ao câncer (THANGAPAZHAM et al., 2006). Entre as substâncias de origem natural com potencial aplicação no tratamento do câncer, destacam-se as de origem fúngica. Estudos têm demonstrado que esta atividade antitumoral está relacionada aos polissacarídeos constituintes da 16 parede celular do fungo, os β-glucanos (BORCHERS et al., 1999; MIZUNO et al., 2000; BEROVIC et al., 2003; CHEN; SEVIOUR, 2007; ZHANG et al., 2007). Assim, diversos grupos de pesquisas envidaram esforços no sentido de produzir estes polissacarídeos a partir do cultivo de diferentes espécies fúngicas (WISBECK, 2003; GERN et al., 2008) e validar sua atividade antitumoral in vitro (FLORÊNCIO et al., 2007) e in vivo (WOLF et al., 2008; DRISCOLL et al., 2009; DALONSO et al., 2010). Diante desses aspectos, o presente trabalho consistiu em desenvolver estudos sobre a aplicação de substâncias provenientes do cultivo submerso de Pleurotus djamor, espécie isolada na mata do entorno da Univille, como agentes antitumorais. Os objetivos específicos deste estudo foram: investigar in vivo a atividade dos polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor, obtidos por precipitação com etanol e com acetona, em diferentes concentrações, sobre o sarcoma 180 (S180), de modo a identificar o método de precipitação e a concentração mais eficientes para regressão tumoral; e avaliar o tempo de sobrevida dos animais tratados com os polissacarídeos obtidos. 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 NEOPLASIAS 2.1.1 Conceito e Características Segundo o Dicionário de Termos do Câncer do Instituto Nacional do Câncer (NCI) dos Estados Unidos (NCI, 2009), pode-se definir neoplasia como um crescimento celular anormal e descontrolado, resultando em massas onde as células se dividem mais do que deveriam ou não morrem quando deveriam. Essa massa também pode ser chamada de tumor. O câncer é caracterizado por um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se pelo corpo todo. As células cancerígenas dividem-se rapidamente e tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores ou neoplasias malignas. Já as neoplasias benignas são definidas como uma massa localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido original, raramente constituindo um risco de vida (INCA, 2009). Os termos câncer, neoplasia maligna e tumor maligno são sinônimos e são diferentes dos tumores benignos pelas suas propriedades de invasão e capacidade de metastatizar. Ambos agem de forma proliferativa e descontrolada, causando mutações genéticas em decorrência dos padrões alterados das características anormais celulares e perda de função (RANG, 2004). Em quase todos os casos, o câncer é causado por uma ativação anômala dos genes celulares. Já foram identificados mais de 100 genes anormais, chamados de oncogenes (GUYTON; HALL, 1997). O câncer pode ser chamado de carcinoma, quando inicia em tecidos epiteliais, como pele ou mucosas, e de sarcoma, quando inicia em tecidos conjuntivos, como osso, músculo ou cartilagem. Os diversos tipos de câncer ainda podem ser diferenciados pela sua velocidade de multiplicação e pela capacidade de 18 invadir tecidos e órgãos vizinhos ou distantes (INCA, 2008). Essa capacidade de propagação do seu local de origem para outro ponto do corpo pelos sistemas sanguíneo ou linfático é definida como metástase (NCI, 2009). Segundo Sato et al. (2005), o câncer metastático é a segunda causa mais frequente de mortalidade em humanos. De acordo com Fortes e Novaes (2006), o câncer é resultado do acúmulo de mutações sequenciais múltiplas e alterações moleculares que culminam com metástases, sendo que este desenvolvimento é resultado da interação entre fatores endógenos e ambientais. 2.1.2 Incidência no Brasil e no Mundo Estimativas do Instituto Nacional de Câncer (INCA), do Ministério da Saúde, revelam que em 2008 o câncer foi responsável por 7,6 milhões de mortes no mundo. Os tipos de câncer com maior mortalidade foram os de pulmão (1,31 milhão), estômago (780 mil) e fígado (699 mil) (INCA, 2009). Segundo Michailowsky et al. (2003) e Bucker et al. (2007), tumores malignos primários do sistema nervoso central constituem a principal causa de morte por tumores sólidos em crianças e a terceira principal causa de morte por câncer em adolescentes e adultos com idades compreendidas entre 15 e 34 anos, apresentando sintomas que incluem dor de cabeça, convulsões e alterações do estado mental. A estimativa de incidência do câncer no Brasil feita pelo INCA em 2009 revela que aproximadamente 489.270 novos casos da doença estão previstos para o ano de 2010. O tipo mais incidente deverá ser o câncer de pele não melanoma, com 114 mil casos. Na sequência tem-se: câncer de próstata (52 mil novos casos), mama feminina (49 mil), cólon e reto (28 mil), pulmão (28 mil), estômago (21 mil) e colo de útero (18 mil) (INCA, 2009). As estimativas para 2010 apontam ainda que a região Sul terá as mais altas taxas de incidência de câncer de pulmão, estômago, próstata, cólon e reto, assim como câncer de pele não melanoma. Estima-se que ocorrerão na região Sul em 2010 aproximadamente 4.900 novos casos de câncer de pulmão em homens, com 19 um risco estimado de 35 novos casos a cada 100 mil homens. A região Sudeste, encontra-se em segundo lugar, com risco estimado de 21 casos novos a cada 100 mil homens. O tabagismo, considerado o fator de risco mais importante para o desenvolvimento do câncer de pulmão, pode ser uma das explicações para a maior incidência na região Sul, uma vez que, em países ou regiões onde existe uma longa história de consumo de tabaco, cerca de 90% dos casos de câncer de pulmão em homens seriam tabaco-relacionados (INCA, 2009). 2.1.3 Tratamentos 2.1.3.1 Cirurgia Tendo sido a primeira modalidade empregada com êxito, posteriormente ao desenvolvimento da anestesia com éter na década de 1840, a cirurgia continua sendo o principal tipo de tratamento dentro da oncologia para a grande maioria dos tumores sólidos (FAUCI et al., 1998). Segundo Gates e Fink (2009), a cirurgia pode atuar de várias formas, tais como, tratamento antineoplásico em casos de profilaxia, diagnóstico, estadiamento, tratamento curativo ou definitivo, tratamentos em caso de recorrência, terapia paliativa, reconstrução e reabilitação. Existem vários tipos de procedimentos cirúrgicos para pacientes com câncer, como as biópsias, que servem para obter amostras de tecidos para exames patológicos, outras para fins de diagnóstico do tecido e existem aquelas que são realizadas para remover ou determinar o estágio do tumor (GATES; FINK, 2009). Em casos em que ocorre a malignidade neoplásica, quando atinge um órgão sem condições de sobrevivência, a cirurgia é uma das práticas médicas mais indicadas. Neste caso a biópsia histológica é necessária para validar o diagnóstico e identificar a histologia ou o tipo específico de câncer (GATES; FINK, 2009). Cuidados específicos devem ser tomados na cirurgia oncológica, tais como: incisão cirúrgica ampla e adequada; proteção da ferida operatória com campos secundários; realização de inventário minucioso de cavidades; laqueação das veias 20 antes das artérias; manuseio cuidadoso da área afetada; cuidados para não se cortar o tecido tumoral; remoção tumoral com margem de segurança; troca de luvas, de campos operatórios e de instrumental cirúrgico, após o tempo de ressecção tumoral. Existe uma margem de segurança adequada para o melanoma maligno, sarcoma, tumores de pulmão, tumor de cólon, entre outros, que deve ser seguida na cirurgia oncológica. Esta margem varia de acordo com a localização e o tipo histológico do tumor. Ao contrário do tumor benigno, cuja margem de segurança é o seu limite macroscópico, o câncer, pelo seu caráter de invasão microscópica, exige ressecção mais ampla (INCA, 2008). É importante, ainda, distinguir os conceitos de ressecabilidade e operabilidade. Entende-se por tumor ressecável aquele que apresenta condições de ser removido. Por outro lado, a operabilidade diz respeito à possibilidade de realização da terapêutica cirúrgica, de acordo com as condições clínicas apresentadas pelo paciente (INCA, 2008). O principal desafio da cirurgia oncológica são os tumores mais avançados. Neste caso a cirurgia se torna mais difícil e as chances de complicações são maiores, e é por este fato que se dá a necessidade de um diagnóstico preciso e seguro (LO BELLO; RODRIGUEZ, 2003). 2.1.3.2 Quimioterapia Segundo Costa e Lima (2002), a quimioterapia começou a ser aplicada por volta de 1865, por Lisauer, sendo mantida até 1964 como método empírico, quando bases mais científicas, resultados curativos mais consistentes e diminuição dos efeitos tóxicos tornaram-na uma terapêutica tão importante quanto a cirurgia e a radioterapia. A quimioterapia é chamada de quimioterapia antineoplásica ou quimioterapia antiblástica no caso de aplicação em tratamentos de câncer (INCA, 2008). Segundo dados do INCA (2008), “o primeiro quimioterápico antineoplásico foi desenvolvido a partir do gás mostarda, usado nas duas Guerras Mundiais como arma química”. Após certa exposição de soldados a este agente, observou-se que eles desenvolveram hipoplasia medular e linfóide, o que incentivou a liberação de seu 21 uso no tratamento dos linfomas malignos. A partir da publicação, em 1946, dos estudos clínicos feitos com o gás mostarda e das observações sobre os efeitos do ácido fólico em crianças com leucemias, verificou-se um avanço expressivo da quimioterapia antineoplásica. Atualmente, quimioterápicos mais ativos e menos tóxicos encontram-se disponíveis para uso na prática clínica (INCA, 2008). O tratamento por quimioterapia consiste na administração de drogas químicas, por via oral, venosa, intramuscular, entre outros, atuando no bloqueio da sequência metabólica, impedindo a divisão ou amadurecimento da célula (FAUCI et al., 1998). Muitos quimioterápicos são caracterizados com base na sua atividade bioquímica, ou de origem, e a grande maioria dos fármacos é proveniente de produtos naturais (GATES; FINK, 2009). Segundo Gates e Fink (2009), os fármacos quimioterápicos interferem nos passos do ciclo celular especificamente envolvidos na síntese do DNA e na replicação das células tumorais. De acordo com os autores, a quimioterapia apresenta um efeito maior em tumores com altas taxas de proliferação. Tumores pequenos e vascularizados são os que mais respondem à quimioterapia. Apesar de a quimioterapia ter uma ação benéfica no tratamento contra o câncer, apresenta também efeitos colaterais que podem surgir de acordo com a droga e a dose usada. Os mais frequentes são: apatia, perda do apetite, perda de peso, alopecia, hematomas, sangramento nasal e bucal, mucosite, náuseas, vômitos e diarreia. A quimioterapia pode, ainda, apresentar risco de morbidade e mortalidade por processos infecciosos (COSTA; LIMA, 2002). De acordo com Gates e Fink (2009), em geral, os efeitos adversos da quimioterapia variam também de acordo com a via de administração, com o tratamento prévio de quimioterapia ou radioterapia, com a administração conjunta de outros agentes e com a sensibilidade individual de cada paciente. Segundo o INCA (2008), os quimioterápicos não atuam exclusivamente sobre as células tumorais. As estruturas normais que se renovam constantemente, como a medula óssea, os pelos e a mucosa do tubo digestivo, são também atingidas pela ação dos quimioterápicos. 2.1.3.3 Radioterapia 22 A radioterapia é uma das grandes modalidades terapêuticas e pode ser associada a outros tratamentos em neoplasias (SAWADA et al., 2006). Segundo O'Connor et al. (2008), pode ser usada num aspecto multidisciplinar no controle e tratamento do câncer e os seus procedimentos estão aumentando o espectro das terapias oncológicas. A radioterapia é realizada por radiação ionizante, ou seja, os tecidos normais e tumorais são afetados pela aplicação de uma quantidade precisa de radiação ionizante para um volume determinado de tumor, a fim de eliminar as células neoplásicas. A radioterapia provoca dano celular, alterando biologicamente o DNA, impedindo que a célula tumoral se divida e promovendo a sua morte (SAWADA et al., 2006; GATES; FINK, 2009). As funções da radiação no tratamento das neoplasias são: ação curativa, que exerce a cura como tratamento único; adjuvante, quando usada após a cirurgia definitiva; e paliativa, quando a cura não é possível, proporcionando a melhoria da qualidade de vida do paciente (GATES; FINK, 2009). A radioterapia geralmente é menos invasiva que a cirurgia, portanto sendo considerada minimamente invasiva (SAWADA et al., 2006; O‟CONNOR et al., 2008). Alguns dos efeitos colaterais da radioterapia estão associados a um aumento do risco de ocorrer leucemias e tumores secundários, além de reações agudas que ocorrem ao longo do tratamento, como náuseas, vômitos, diarreia entre outras (FAUCI et al., 1998). Embora existam muitos efeitos colaterais com esta terapia, avanços tecnológicos são crescentes no planejamento terapêutico da radioterapia, gerando tratamentos precisos com menos efeitos adversos, na tentativa de evitar a morte celular dos tecidos normais ou sadios (GATES; FINK, 2009). 2.1.3.4 Imunoterapia A eficácia dos tratamentos contra o câncer está aumentando e a compreensão dos mecanismos de regulação do sistema imunitário está conduzindo ao desenvolvimento de novas estratégias para promover respostas imunes mais eficazes, visando à ativação do sistema imunológico. Esse sistema consiste em 23 células e em moléculas com função especializada em defender o corpo de processos de infecção e neoplasia promovendo a homeostasia (SATO et al., 2005). O sistema imune pode responder às células do câncer de duas formas: (1) reagindo contra antígenos específicos, que são exclusivos das células tumorais, ou (2) reagindo contra antígenos relacionados ao tumor, ou seja, produzidos de forma diferente pelas células tumorais e pelas células normais (FINN, 2008). De acordo com o autor, estudos de um antígeno específico do melanoma, que estimula as células T humanas in vitro, mostraram que o sistema imune humano pode responder aos antígenos tumorais, e esses achados estimularam um esforço para descobrir outros antígenos tumorais, resultando numa longa e crescente lista de antígenos de diferentes tipos de tumores que podem servir como alvos de tratamento. Porém, os tumores também têm a capacidade de suprimir o sistema imune, tanto de forma sistêmica quanto no ambiente do tumor pela produção de moléculas imunossupressoras, entre elas a enzima indolamina-2,3-dioxigenase (IDO), conhecidamente relacionada à tolerância materna aos antígenos fetais e à mediação da inibição da ativação das células T. No entanto, testes de inibição dessa enzima permitiram restaurar a imunidade em ratos, levando à rejeição do tumor pelo sistema imune (FINN, 2008). Estudos in vivo demonstraram ainda que ratos com deficiência de células T, células “natural killer” (NK) ou moléculas específicas, como os IFN-α, IL-12 e TNF-α, apresentam alta incidência de tumores em desenvolvimento (FORTES et al., 2006). O potencial da imunoterapia contra o câncer foi documentado pela primeira vez por William Colley em 1890, quando toxinas bacterianas administradas em portadores de câncer avançado que não poderiam ser submetidos à cirurgia, promoveram respostas significativas. Porém, esse potencial foi ignorado até o fim do século XX, quando estudos levantaram a especulação de que a resposta imunológica poderia contribuir para a regressão de tumores (KIRKWOOD et al., 2008). Nos últimos anos, muito tem se aprendido sobre o potencial do sistema imune de controlar o câncer e as várias formas em que a imunoterapia pode potencializar esse sistema em benefício do paciente. Esse conhecimento estimulou o desenvolvimento de novas terapias, possibilitando não só o tratamento para o câncer, mas também para sua prevenção (FINN, 2008; WEINER, 2008). 24 2.1.3.5 Terapias Alternativas Atualmente, centros de pesquisa, estudiosos e governos têm se dedicado a compreender e avaliar as práticas não biomédicas no campo da saúde. Tanto nos Estados Unidos como na Europa, um termo genérico tem ganhado força diante de um conjunto rico de serviços, terapeutas, medicamentos, clínicas e associações profissionais. Esse território de saberes e intervenções na área da saúde tem sido denominado Medicina Alternativa e Complementar (MAC), iniciando uma discussão sobre esta realidade rica do campo da saúde, com desdobramentos no âmbito médico, filosófico, político e econômico (ANDRADE, 2006). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estabelece o seguinte conceito ao termo medicina alternativa ou complementar: “Os termos medicina complementar ou medicina alternativa são usados de modo intercambiável com a medicina tradicional em alguns países. Eles se referem a um amplo conjunto de práticas e cuidados de saúde os quais não fazem parte da tradição própria de certos países e não estão integrados ao sistema dominante de cuidados médicos” (OMS, 2008). Um artigo de revisão publicado por Ernst e Cassileth (1998) relatou que de 21 estudos envolvendo pacientes adultos com câncer, metade apontou que até 27% dos participantes usou algum tipo de MAC. De acordo com a literatura (BOON et al., 2000; RICHARDSON et al., 2000; SHEN et al., 2002), de 48% até 73% das pacientes com câncer de mama utilizam a MAC. Segundo Shen et al. (2002), as razões primárias que as levam a buscar a MAC são: em primeiro lugar (40%), estimular o sistema imune; em segundo (32%), tratar o câncer; em terceiro (21%), aliviar os sintomas relacionados ao estresse e aos efeitos colaterais dos tratamentos convencionais, como a cirurgia, radio e quimioterapia, ou seja, melhorar a qualidade de vida por meio de um sentimento de maior controle e responsabilidade sobre sua vida. Ainda segundo Shen et al. (2002), existem vários métodos de tratamento que utilizam MAC, que têm tido a eficácia comprovada em casos clínicos. Algumas das terapias utilizadas pela MAC são: a fitoterapia, com o uso de produtos herbários e botânicos; o consumo de altas doses de vitaminas; e a mudança de estilo de vida por meio de dietas. Estes métodos são relatados como importantes no tratamento 25 por 20%, 14% e 60% dos pacientes pesquisados, respectivamente (GATES; FINK, 2009). A busca por novas substâncias terapêuticas aumentou o interesse no uso dos cogumelos devido aos seus efeitos antitumorais, anticarcinogênicos, antivirais, antiinflamatórios, hipoglicemiantes, hipotensivos e indicações no tratamento das neoplasias malignas (FORTES; NOVAES, 2006). Fortes e Novaes (2006) relatam que o interesse pelos produtos naturais, como cogumelos e seus extratos, vem crescendo significativamente devido às suas características nutricionais que, associadas aos seus efeitos terapêuticos, facilitam seu uso pelo consumo de suplementos alimentares ou na forma de fármacos que contenham o princípio ativo dos cogumelos já estudados (FORTES; NOVAES, 2006). 2.2 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS 2.2.1 Características e Aplicações Gerais Polissacarídeos são macromoléculas naturais existentes em todos os organismos vivos, constituindo um grupo de compostos dos mais abundantes e importantes da biosfera. Grandes exemplos são a celulose e o amido nas plantas (SILVA et al., 2006). Segundo Silva et al. (2006), os polissacarídeos constituem uma importante porcentagem da biomassa fúngica. De acordo com os autores, a parede celular da hifa é composta de polissacarídeos, que atuam como elementos de suporte para as hifas e para a adesão das enzimas que participam da degradação da lignina. Certos polissacarídeos fúngicos têm capacidade de formar géis, que são utilizados em diversos setores industriais, como alimentar, farmacêutico, cosmético, químico, têxtil e petrolífero, na função de emulsificantes, texturizantes, estabilizantes, espessantes, controladores da formação de cristais de gelo, agentes gelificantes e coagulantes, lubrificantes, entre outros (SUTHERLAND, 1985). Os polissacarídeos fúngicos também podem ser usados para formar coberturas sem 26 odor ou sabor sobre alimentos, como pré-bióticos. Contudo várias pesquisas sobre polissacarídeos têm se concentrado nas suas ações medicinais como antiinflamatórios, antitumorais, no tratamento da artrite reumatoide, na produção de anticorpos para imunização, como antioxidantes, como agentes hipolipemiantes, hidratantes, entre outras possíveis aplicações (WASSER, 2002; CORRADI DA SILVA et al., 2006). 2.2.2 Ação Antitumoral Conforme reportado por Nosál‟ová et al. (2001) e Pausen (2002), a atividade biológica dos polissacarídeos fúngicos foi caracterizada pela presença de βglucanos e o primeiro teste biológico foi realizado em 1969. A utilização deste polissacarídeo em tumores transplantados fez com que os tumores parassem de crescer. Segundo Mizuno et al. (1999), a atividade antitumoral dos polissacarídeos pode ser causada pela potencialização da resposta imune e pelo envolvimento da ativação de linfócitos. Diversos fungos, como os do gênero Pleurotus, possuem substâncias como os glucanos, ergosterol, lecitina, proteoglucanas, arginina e glutamina que participam do mecanismo de ação antitumoral. Os possíveis mecanismos de ação destas substâncias são a ativação e a expansão clonal de células T, inibição da neovascularização induzida pelo crescimento tumoral nas células do Sarcoma 180 in vitro, indução de apoptose nas células tumorais, estimulação das funções imunológicas, aumento das células NK e T Helper e estímulo e síntese de interleucinas, prolongamento da sobrevida e maior tolerância à quimioterapia (FORTES; NOVAES, 2006). Kohguchi et al. (2004) administraram um extrato de corpos frutíferos secos de Ganoderma lucidum por via oral, em camundongos, por 14 dias, na concentração de 500 mg/Kg e observaram um aumento na produção de interferon-gama (IFN-γ) de 0,55 ± 0,25 UI/mL (no grupo controle) para 1,17 ± 0,52 UI/mL (no grupo tratado), mostrando que o tratamento melhora não apenas a atividade dos macrófagos, mas também dos linfócitos T, demonstrando que são imunomoduladores. 27 Os possíveis mecanismos de ação dos polissacarídeos presentes no fungo do gênero Ganoderma lucidum envolvem a estimulação do sistema imunológico, pela regulação de aspectos específicos em relação à resposta do hospedeiro e podem ser classificados como imunomoduladores ou modificadores da resposta biológica. Estes polissacarídeos modulam ainda a atividade de células apresentadoras de antígenos, células NK, linfócitos T e B, alterando as concentrações plasmáticas de algumas citocinas, incluindo IL-2, IL-6, IFN-γ e TNF-α (CAO; LIN, 2004; KOHGUCHI et al., 2004; LIN, 2004; ZHANG, 2004; MORADALI et al., 2007). Ajith e Janardhanan (2003), testando os extratos aquoso, metanólico e etilacetato de Phellinus rimosus, na dose de 25 mg/Kg, administrados por via oral por 10 dias, sobre o Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE) inoculado na concentração de 1x106 células/mL em camundongos machos Swiss albinos, observaram uma taxa de mortalidade, após 25 dias, de 6/6, 6/6 e 3/6, respectivamente. Utilizando uma dose de 50 mg/Kg a taxa foi de 6/6, 2/6 e 0/6, respectivamente. Lee et al. (2003) testaram as propriedades antineoplásicas do extrato de Agaricus blazei em camundongos ICR e KSN, inoculados com Sarcoma 180 (1x107 células/animal), tratados via oral. Os extratos foram obtidos pelo processo de difusão em água, mantidos por 12 horas a 90 °C, sendo posteriormente filtrados, precipitados com etanol, liofilizados e utilizados para o estudo, nas doses de 100 e 300 mg/Kg de peso. Nos camundongos KSN o volume tumoral aumentou, do 10º ao 24º dia, em 100% nos grupos tratados e em cerca de 460% no grupo controle positivo. Nos camundongos ICR entre o 10° e o 24° dia, houve redução do volume tumoral nos grupos tratados, enquanto que no grupo controle, o volume tumoral aumentou em 180%. Segundo os autores, a taxa de inibição foi aumentada em todos os grupos tratados quando comparados ao controle, sendo mais evidente entre os dias 17 e 24. Os dados apresentados pelos autores permitem chegar a valores entre 55 e 60% de redução de volume tumoral entre o 10º e o 24º dia após a inoculação do tumor, sendo que a inibição do crescimento do tumor dos camundongos ICR foi maior quando comparado ao KSN. O tamanho do tumor em camundongos tratados com a dose de 100 mg/Kg foi menor do que o tamanho daqueles tratados com 300 mg/Kg no 24° dia. Zhao et al. (2003) avaliaram a inibição de Sarcoma 180 em camundongos BALB/c inoculados com 0,1 mL de uma suspensão com 1,18x10 8 células tumorais/mL, tratados in situ com injeções de 0,1mg/animal de uma lectina extraída 28 do fungo Agrocybe aegerita, obtendo uma taxa de inibição de 36,36%, com uma redução da taxa de morte de 50% no grupo controle, sem tratamento, para 10% no grupo tratado. Nakamura et al. (2004) observaram que algumas frações de micélio de Phellinus linteus apresentaram atividade antitumoral contra Sarcoma 180 (1x106 células/animal) implantado no dorso de camundongos, com taxas de inibição variando entre 40,0% e 81,2%, sendo que esta última foi obtida com extrato purificado (fração FIII-I). Após caracterização, descobriram que esta fração é uma glicoproteína formada por 39,3% de polissacarídeos e 49,4% de proteínas, sendo a maior parte dos polissacarídeos α-1,3-glucano. Cao e Lin (2004) investigaram a atividade antitumoral e antiangiogênica de polissacarídeos extraídos de Ganoderma lucidum em camundongos BALB/c, inoculados com Sarcoma 180 (2x106 células/animal), tratados por via oral por 10 dias e os animais sacrificados no décimo dia, obtendo taxas de inibição do crescimento tumoral de 35,2%, 45,2% e 61,9% para as doses de 50, 100 e 200 mg/Kg, respectivamente. Unursaikhan et al. (2006) observaram que quatro extratos insolúveis de corpos frutíferos de Lentinus edodes, após serem sulfonados, tornaram-se solúveis e apresentaram inibição tumoral superior a 50% contra o Sarcoma 180 sólido. As substâncias foram administradas intraperitonealmente nas doses de 20 e 60 mg/Kg, por 10 dias, iniciados 24 horas após a indução tumoral em camundongos, com 5x106 células tumorais por animal. Li et al. (2008) isolaram dois proteoglicanos, PNW1 e PNM1, do micélio de Phellinus nigricans cultivado em meio líquido e testaram a sua ação antitumoral contra o Sarcoma 180 inoculado em camundongos machos BALB/c (0,2mL de solução com 1x106 células/mL). Os animais foram tratados por via intragástrica, com os extratos nas doses de 100, 200 e 400 mg/Kg, por 10 dias, e os tumores avaliados no décimo dia. Observou-se uma inibição significativa do tumor, sendo que com PNW1 as taxas foram de 67,23%, 71,98% e 74,70% para as doses de 100, 200 e 400 mg/Kg, respectivamente, e com PNM1 foram de 35,29%, 37,19% e 55,84%, para as doses de 100, 200 e 400 mg/Kg, respectivamente. Masuda et al. (2009) avaliaram a atividade antitumoral de um polissacarídeo extraído do fungo Grifola frondosa em camundongos fêmeas BALB/Ca inoculados por via subcutânea (1x105 células/animal) com células de câncer de cólon (Collon- 29 26). Os animais foram tratados durante 17 dias por via intraperitoneal com o extrato na concentração de 8 mg/Kg, o que resultou numa inibição tumoral de 47,6% em relação ao grupo controle. No mesmo estudo, a avaliação in vitro não demonstrou ação do extrato sobre a proliferação das células tumorais. Um polissacarídeo complexo obtido do fungo Agaricus blazei Murrill foi testado por Gonzaga et al. (2009) para verificar a inibição do crescimento do Sarcoma 180 em camundongos Swiss machos. Os animais foram inoculados com 2,9x106 células e receberam o polissacarídeo dissolvido em solução salina (NaCl 0,9%) por via intraperitoneal ou oral, por gavagem, por sete dias consecutivos, nas doses de 25 e 50 mg/Kg. A avaliação foi feita no oitavo dia de experimento, obtendose taxas de inibição de 42,1% e 47,2%, no tratamento intraperitoneal, para as doses de 25 e 50 mg/Kg, respectivamente, e de 38,8% e 46,0% no tratamento oral, para as doses de 25 e 50 mg/Kg, respectivamente. O mesmo estudo ainda aponta um aumento na sobrevida dos animais tratados com o polissacarídeo. Enquanto os animais do grupo controle sobreviveram apenas 15,4 ± 0,50 dias após a indução tumoral, os tratados com o polissacarídeo na dose de 25 mg/Kg/dia sobreviveram 20,2 ± 1,06 dias. O tratamento com o polissacarídeo aumentou o tempo de vida em 26,4%. Niu et al. (2009) investigaram a atividade antitumoral de um polissacarídeo de baixo peso molecular isolado do fungo Agaricus blazei em camundongos BALB/c inoculados intraperitonealmente com células de Sarcoma 180 e tratados por 14 dias com o extrato nas doses de 50, 100 e 200 mg/Kg, obtendo taxas de inibição tumoral de 9,5%, 23% e 32% respectivamente. Chang et al. (2009) pesquisaram o efeito do extrato obtido do fungo Ganoderma lucidum na sobrevida de camundongos BALB/c inoculados com 1x10 5 células de leucemia mielomonocítica WEHI-3 e tratados por 28 dias com o extrato nas doses de 3 e 6 mg/Kg. As taxas de sobrevida encontradas foram de 100% no grupo controle sem tumor, 30% no grupo controle com tumor e sem tratamento, 40% no grupo com tumor e tratado com 3 mg/Kg do extrato e 50% no grupo com tumor e tratado com 6 mg/Kg do extrato. 2.2.3 Fungos do Gênero Pleurotus 30 Os fungos do gênero Pleurotus possuem elevados teores de proteínas, aminoácidos essenciais, ácidos graxos insaturados, vitaminas e minerais, tendo alto potencial medicinal (SILVEIRA et al., 2004). Estudos comprovam diversas propriedades terapêuticas dos polissacarídeos sintetizados por Pleurotus, como a ação antimicrobiana (WISBECK et al., 2002) e antitumoral (ZHANG et al., 2001; WOLFF et al., 2008; FURLAN et al., 2009; DALONSO et al., 2010). Um estudo realizado para investigar os componentes de quatro espécies de cogumelos comestíveis mostra que a espécie Pleurotus djamor apresenta quantidades significativas de carboidratos, polissacarídeos, fibra bruta, proteína bruta, gordura bruta e cinzas nas concentrações de 59,9%, 9,02%, 17,2%, 15,6%, 1,65% e 5,83%, respectivamente (GUO et al., 2007). Wang et al. (2000) testaram extratos de corpos frutíferos frescos de Pleurotus ostreatus contra o Sarcoma 180 e Hepatoma H22 inoculados na concentração de 5x107 cel/mL em ratos, obtendo 88,46% e 75,42% de inibição do crescimento tumoral, respectivamente. O tratamento foi realizado por via intraperitoneal, por 20 dias, na dosagem de 1,5 mg/Kg. Os autores observaram de 21,9 a 106,7% de aumento do tempo de sobrevida dos animais tratados. Shamtsyan et al. (2004) utilizaram o melanoma B16 como modelo de tumor para testes conduzidos com camundongos fêmeas C75BL, alimentados com 100mg/Kg de extrato obtido de Pleurotus ostreatus. No décimo quinto dia de experimento os animais receberam injeções subcutâneas com 10 6 células de melanoma B16, sendo a avaliação tumoral feita no vigésimo sexto dia após a indução tumoral, obtendo uma inibição de 80% no crescimento do tumor. No mesmo estudo, foi observado um aumento na sobrevida média e máxima no grupo tratado com o extrato. Três frações obtidas do micélio de Pleurotus ostreatus, formadas de proteoglicanos, foram administradas intraperitonealmente, na dose de 5 mg/Kg por 6 dias, em camundongos previamente inoculados com Sarcoma 180 (1x106 células/animal), para observar sua ação sobre este tumor no modelo ascítico. Foi constatada a atividade antitumoral com redução de até 90% no número de células tumorais, elevação do número de células NK e produção de óxido nítrico (SARANGI et al., 2006). Wolff (2007) investigou o efeito antineoplásico do caldo de cultivo in natura (CBIN), do extrato obtido do caldo de cultura (ECB) e dos corpos frutíferos (EFB) de 31 Pleurotus ostreatus, em camundongos Swiss albinos fêmeas, inoculados com Sarcoma 180. O tratamento foi realizado por 6 dias consecutivos nas doses de 10 mL/Kg para CBIN e 10 mg/Kg para ECB e EFB, observando-se taxas de redução variando entre 72% e 86%. Furlan et al. (2009) investigaram a atividade antineoplásica de Pleurotus ostreatus e Pleurotus sajor-caju contra o Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE), em camundongos Swiss fêmeas, inoculados intraperitonealmente com 5x106 células/animal, utilizando diferentes extratos. Para ambos os fungos foram testados o caldo de cultivo in natura (CBIN) e o extrato do caldo de cultivo (ECB). Para Pleurotus ostreatus foram utilizados também os corpos frutíferos (FB) e o extrato dos corpos frutíferos (EFB). O tratamento foi realizado intraperitonealmente com CBIN, ECB e EFB e por via oral com FB. Os tratamentos foram iniciados 24 horas após a indução tumoral, sendo que o tratamento intraperitoneal teve duração de 6 dias, com doses diárias de 10 mL/Kg de CBIN e 10 mg/Kg de ECB e EFB, enquanto que o tratamento via oral teve duração de 15 dias. Os resultados obtidos com Pleurotus ostreatus foram de 70%, 76%, 71% e 51% de redução no número de células tumorais, quando comparados com o grupo controle positivo, para o tratamento feito com CBIN, ECB, EFB e FB, respectivamente, e com Pleurotus sajor-caju foram de 86% e 81% de redução utilizando CBIN e ECB, respectivamente. Dalonso et. al. (2010) pesquisaram a atividade antineoplásica de quatro frações (FI, FII, FIII-I e FIII-II) de polissacarídeos obtidos do corpo frutífero de Pleurotus sajor-caju. O experimento foi realizado em camundongos Swiss fêmeas, inoculados com 5x106 células de Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE). Os extratos foram administrados intraperitonealmente durante um período de 6 dias consecutivos, iniciando 24 horas após indução tumoral, na dose de 10 mg/Kg, sendo que as frações FI e FII proporcionaram os maiores percentuais de redução no número de células tumorais em relação ao grupo controle positivo, com 86% e 85%, respectivamente, enquanto as frações FIII-I e FIII-II foram menos efetivas, com percentuais de redução de 54% e 52%, respectivamente. 2.2.4 Métodos de Separação 32 2.2.4.1 Fundamentos do Processo de Separação com Solvente A separação com solventes é uma técnica relativamente moderna, usada para obter maior rendimento de determinadas substâncias. O efeito exercido pelo solvente é caracterizado pela aceleração ou retardamento das reações, além de ativar o envolvimento entre as moléculas – um efeito ambiental – formar ligações que fornecem energia necessária para romper as existentes entre partículas do soluto e a formar novas ligações, entre outras funções (MORRISON; BOYD, 2005). Segundo Barbosa (2004), compostos químicos se dissolvem facilmente em solventes com polaridades semelhantes, ou seja, compostos iônicos e polares tendem a se dissolver em solventes polares e compostos pouco polares tendem a se dissolver bem em solventes pouco polares. De acordo com Silva et al. (2008) a extração de compostos antioxidantes de tecidos de plantas é, portanto, dependente da polaridade dos solventes. A mudança de um solvente para outro pode produzir variações da ordem de milhões na velocidade de reação. Os efeitos dos solventes podem ser maiores do que os efeitos exercidos por qualquer outro fator. O solvente pode ser o principal fator comandante da velocidade com que a reação acontece. Pode, ainda, determinar o caminho a ser seguido efetivamente pela reação, entre os vários possíveis (MORRISON; BOYD, 2005). Solventes diversos têm sido reportados na literatura, como o etanol (PARK et al., 2003; CAO; LIN, 2004; SARANGI et al., 2006; GONZAGA et al., 2009; MASUDA et al., 2009; DALONSO et al., 2010), a acetona (ZHANG et al., 2001), o ácido acético (DALONSO et al., 2010) e o metanol (AJITH; JANARDHANAN, 2003; WANG et al., 2000). 2.2.4.2 Influência do Tipo de Solvente no Processo Várias metodologias são descritas na literatura para extração de constituintes químicos, sendo que processos que utilizam etanol ou acetona são métodos 33 considerados adequados para a extração de substâncias com propriedades farmacológicas. Os extratos obtidos com álcool ou acetona são chamados de tinturas. São obtidas a partir de materiais vegetais, animais e minerais em estado seco. As principais funções das tinturas de álcool e de acetona são: (1) extrair grande quantidade de princípios ativos; (2) manter boa concentração antimicrobiana; e (3) facilitar a posologia (DESTRUTI, 2004). O etanol (CH3CH2OH) e a acetona (CH3COCH3) são considerados solventes comuns e, em relação à polaridade, o primeiro é mais polar. Uma das funções da polaridade é a habilidade que o solvente tem em isolar cargas opostas entre si – separar os íons (SOLOMONS; FRYHLE, 2005). Alasalvar et al. (2006) sugerem que tanto o etanol quanto a acetona são capazes de extrair compostos fenólicos, como ácido gálico, ácido cafeico, ácido ciringico, ácido vanílico, ácido ρ-hidroxibenzóico, a partir do núcleo e de folhas verdes de avelã, mas a acetona foi mais eficaz para o processo de extração destes compostos. Pinelo et al. (2004) testaram a extração de fenóis antioxidantes dos substratos Prunus amydalus e Pinus pinaster com três solventes distintos: etanol, metanol e água. Neste caso, o etanol foi o melhor agente de extração para ambos os substratos. Turkmen et al. (2007) testaram o efeito das condições de extração de polifenóis totais, medindo as atividades antioxidante e antibacteriana de chá preto. No geral, os extratos de acetona aquosa ou DMF (N,N-dimetilformamida) exibiram o mais alto conteúdo de polifenóis e maior atividade antioxidante, enquanto que acetona absoluta demonstrou-se um solvente menos eficiente. 2.2.4.3 Solventes Utilizados para Obtenção de Polissacarídeos Fúngicos A obtenção de polissacarídeos fúngicos tem sido reportada na literatura a partir da extração com diferentes solventes, dentre os quais se destacam o etanol (PARK et al., 2003; CAO; LIN, 2004; NAKAMURA et al., 2004; SARANGI et al., 34 2006; GONZAGA et al., 2009; MASUDA et al., 2009; DALONSO et al., 2010), e a acetona (MAZIERO, 1996; ZHANG et al., 2001; NAKAMURA et al., 2004). Park et al. (2003) isolaram polissacarídeos a partir do corpo frutífero de Phellinus linteus, utilizando método de precipitação com etanol, para testar a maturação funcional e fenotípica de células dendríticas. Cao e Lin (2004) extraíram um polissacarídeo de Ganoderma lucidum utilizando água fervente seguida de precipitação por etanol, para avaliar sua atividade antitumoral contra Sarcoma 180. Sarangi et al. (2006) testaram os efeitos antitumorais e imunomoduladores de proteoglicanos obtidos de Pleurotus ostreatus a partir de extração com etanol, obtendo três frações com diferentes concentrações de polissacarídeos. Gonzaga et al. (2009) testaram a atividade antitumoral contra Sarcoma 180 de polissacarídeos extraídos com etanol, a partir de corpos frutíferos de Agaricus blazei Murill. Masuda et al. (2009) obtiveram uma fração bruta de polissacarídeos de corpos frutíferos de Grifola fondosa por extração com etanol e avaliaram sua atividade antitumoral contra células de câncer colon-26. Maziero (1996) avaliou a produção de exopolissacarídeos por basidiomicetos em cultura submersa, sendo que a acetona proporcionou a maior quantidade deste biopolímero por precipitação. Zhang et al. (2001) avaliaram um polissacarídeo obtido de Pleurotus tuber-regium seguido por extração com acetona, como um potencial agente antitumoral. O uso combinado de solventes também foi avaliado por alguns autores. Nakamura et al. (2004) obtiveram, a partir do micélio de Phellinus linteus, utilizando extração com etanol e acetona, cinco frações e testaram a sua atividade antitumoral contra Sarcoma 180. Dalonso et al. (2010) estudaram o efeito antineoplásico de extratos obtidos a partir de corpos frutíferos de Pleurotus sajor-caju, contra o Tumor Ascítico de Ehrlich. Os melhores resultados foram obtidos com as frações F1 (extração com etanol, seguido de extração aquosa e precipitação com etanol) e F2 (F1, seguido de extração com oxalato de amônio e precipitação com etanol), que resultaram em 86 e 85% de redução do número de células tumorais. 3 METODOLOGIA 3.1 MICRORGANISMO E MANUTENÇÃO Pleurotus djamor UNIVILLE 001 foi isolado pelo Grupo de Pesquisa de “Processos Biotecnológicos” da Univille e utilizado para síntese e extração de polissacarídeos. A linhagem foi mantida em meio sólido Trigo-Dextrose-Ágar (TDA) (FURLAN et al., 1997), sob refrigeração (4 ºC) e os repiques feitos a cada três meses. 3.2 OBTENÇÃO DOS PRECIPITADOS POLISSACARÍDICOS 3.2.1 Produção dos polissacarídeos extracelulares (PE) Os precipitados polissacarídeos utilizados neste trabalho foram disponibilizados pelo Grupo de Pesquisa “Processos Biotecnológicos” da Univille, tendo sido obtidos conforme descrito a seguir. 3.2.2 Obtenção dos polissacarídeos extracelulares (PE) Dois métodos foram avaliados para a obtenção dos polissacarídeos extracelulares (PE) do caldo de cultivo, conforme descritos a seguir: Os polissacarídeos extracelulares foram produzidos em cultivo submerso de Pleurotus djamor em meio POL (5,0 gL-¹ (NH4)2SO4, 0,2 gL-¹ MgSO4.7H2O, 1,0 gL -¹ K2HPO4, 2,0 gL-¹ extrato de levedura, 1,0 gL-¹ peptona, 50,0 gL-¹ glicose, pH 3,0) (CAVAZZONI; ADAMI, 1992), a 30 0C, com vazão de ar de 0,25 L/min e agitação de 300 min-1, em biorreator de 5,0 L, com 4,0 L de volume de trabalho. 36 a) Segundo metodologia descrita por Pokhrel e Ohga (2007), ao caldo de cultivo foi adicionado etanol na proporção 1:4 (caldo: etanol, v/v) e mantidos “overnight” a 4 ºC. Após, o precipitado formado (PE1) foi separado por centrifugação, liofilizado e mantido em frasco vedado, em temperatura ambiente, até sua utilização. b) De acordo com método proposto por Maziero (1996), PE foram precipitados com acetona P.A. a 8 ºC, adicionada ao caldo de cultivo na proporção 1:3 (caldo:acetona), mantidos “overnight” a 4ºC. O precipitado formado foi lavado, separado da acetona por centrifugação, lavado duas vezes com solução álcoolacetona-água (3:1:1, v/v/v). O excesso de solvente foi evaporado em estufa a 50ºC por 24 horas e o pó resultante (PE2) foi mantido em frasco vedado, em temperatura ambiente, até sua utilização. 3.2.3 Dosagem da concentração de açúcares totais (AT) Um mg de cada precipitado obtido foi adicionado de 4 mL de ácido sulfúrico 72% (v/v) e mantidos em banho de gelo por 3 h (PARK et. al., 2003, modificado) até a total dissolução do precipitado. O volume foi completado para 10 mL com H2O destilada, obtendo-se uma solução de 0,1 g/L, com a qual foi realizada a quantificação dos polissacarídeos dos precipitados através do método fenolsulfúrico. Preparou-se uma curva de calibração de glicose com padrões nas concentrações entre 0,01 a 0,1 g/L. 0,5 mL das soluções de precipitados e dos padrões foram adicionados de 0,5 mL de fenol 5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico PA e mantidos por 20 minutos em temperatura ambiente. Após, a medida de absorbância foi obtida em espectrofotômetro a 490 nm. Esta curva foi utilizada para obter-se a concentração de AT dos precipitados (DUBOIS et al., 1956; AOAC, 1995). 37 3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DOS PRECIPITADOS POLISSACARÍDICOS 3.3.1 Substâncias e doses de tratamento Os dois precipitados obtidos (PE1 e PE2) foram solubilizados em solução tampão fosfato (PBS 0,01 M, pH 7,0) e testados nas doses de 3 mg/Kg, 10 mg/Kg, 30 mg/Kg e 100 mg/Kg, dependendo do experimento. 3.3.2 Animais e manutenção Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos, com peso de 25 ± 5g, mantidos em biotério, com água e ração ad libitum, controle de temperatura em 21±1° C e fotoperíodo de 12 horas. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da UNIVILLE. 3.3.3 Tumor e manutenção A linhagem tumoral Sarcoma 180 (S180) foi cedida pelo Departamento de Farmacologia da UNIVALI (Itajaí – SC) e mantida por meio de repiques intraperitoneais semanais em camundongos albinos Swiss machos. Sete dias após o implante tumoral, os animais eram sacrificados por deslocamento cervical, sendo retirados 20 mL de líquido ascítico. Ao líquido ascítico foram adicionados 180 mL de corante azul de tripan e 200 mL de PBS 0,01M (SHIRAI et al., 1991; LEE et al., 2003). A contagem de células foi realizada em microscópio óptico utilizando-se câmara de Neubauer (PAGNO et al., 2006). O líquido ascítico foi utilizado, na concentração de 25x106 cel/mL, para inoculação dos camundongos de manutenção. 38 3.3.4 Delineamento experimental do tratamento antitumoral 3.3.4.1 Avaliação da ação antitumoral por meio de teste dose x resposta Os grupos para avaliação dos precipitados PE1 e PE2 foram formados por 50 animais, divididos em: Grupo Teste (GT) - Composto por 20 animais nos quais foi realizada a indução tumoral e administração do precipitado. De acordo com a dose do precipitado utilizado, este grupo foi subdividido em 4 subgrupos: - Grupo T1 (n=5): administrados 3 mg/Kg do precipitado; - Grupo T2 (n=5): administrados 10 mg/Kg do precipitado; - Grupo T3 (n=5): administrados 30 mg/Kg do precipitado; - Grupo T4 (n=5): administrados 100 mg/Kg do precipitado. Grupo Controle Substância (CS) - Composto por 20 animais nos quais foi realizada apenas a administração do precipitado, sem indução tumoral. De acordo com a dose do precipitado utilizada, este grupo foi subdividido em 4 subgrupos: - Grupo CS1 (n=5): administrados 3 mg/Kg do precipitado; - Grupo CS2 (n=5): administrados 10 mg/Kg do precipitado; - Grupo CS3 (n=5): administrados 30 mg/Kg do precipitado; - Grupo CS4 (n=5): administrados 100 mg/Kg do precipitado. Grupo Controle positivo (CP) - Composto por 5 animais nos quais foi realizada a indução tumoral e administração de PBS na dose de 10 mg/kg. Grupo Controle negativo (CN) - Composto por 5 animais nos quais foi realizada a administração de PBS na dose de 10 mg/kg, porém sem a indução tumoral. A indução tumoral foi realizada, via subcutânea, no dorso de cada camundongo dos grupos teste e controle positivo na concentração de 25x10 6 cel/mL. 39 As soluções de tratamento foram preparadas na concentração de 1g/L do precipitado (equivalente a 0,058 g/L de AT para PE1 e 0,065 g/L de AT para PE2) para as doses de 3 e 10 mg/Kg de peso do animal. Para as doses de 30 e 100 mg/Kg de peso do animal as soluções foram preparadas na concentração de 10 g/L do precipitado (equivalente a 0,58 g/L de AT para PE1 e 0,65 g/L de AT para PE2) (CARBONERO et al., 2006). Os precipitados PE1 e PE2 foram administrados nos animais dos grupos teste e controle substância, via intraperitoneal (i.p.), iniciando-se 24 h após indução tumoral (pós-indução), por 10 dias, uma vez ao dia de acordo com a literatura (ZHUANG et al., 1993; ZHANG et al., 1994; MIZUNO et al., 1999; AJITH; JANARDHANAN, 2003). 3.3.4.2 Avaliação do desenvolvimento tumoral A avaliação do desenvolvimento tumoral foi realizada 21 dias após a indução tumoral (HARHAJI et al., 2008), pela observação do peso do animal, da determinação do peso (g) do tumor (MISAKI et al., 1984), do volume tumoral (AJITH; JANARDHANAN, 2003) e da taxa de inibição (MIZUNO et al.,1999; ZHANG et al., 2004). A taxa de inibição foi obtida pela relação: [(1-(T/C)]*100, onde T é o peso do tumor do grupo teste e C é o peso do tumor do grupo controle positivo (ZHAO et al., 2003). 3.3.4.3 Avaliação do tempo de sobrevida Os grupos para avaliação de sobrevida dos precipitados PE1 e PE2 foram formados por 40 animais, divididos em: Grupo Sobrevida Teste (GT) - Composto por 15 animais nos quais foi realizada a indução tumoral e a administração do precipitado. De acordo com a dose do precipitado utilizada, este grupo foi subdividido em 3 subgrupos: 40 - Grupo T1 (n=5): administrado 30 mg/Kg do precipitado; - Grupo T2 (n=5): administrado 100 mg/Kg do precipitado; - Grupo T3 (n=5): administrado 300 mg/Kg do precipitado. Grupo Sobrevida Controle Substância (CS) - Composto por 15 animais nos quais foi realizada apenas a administração do precipitado, sem indução tumoral. De acordo com a dose do precipitado utilizado, este grupo foi subdividido em 3 subgrupos: - Grupo CS1 (n=5): administrado 30 mg/Kg do precipitado; - Grupo CS2 (n=5): administrado 100 mg/Kg do precipitado; - Grupo CS3 (n=5): administrado 300 mg/Kg do precipitado. Grupo Sobrevida Controle Positivo (CP) - Composto por 5 animais nos quais foi realizada a indução tumoral e administração de PBS na dose de 10 mg/kg. Grupo Sobrevida Controle Negativo (CN) - Composto por 5 animais nos quais foi realizada a administração de PBS na dose de 10mL/kg, porém sem a indução tumoral. A indução tumoral foi realizada, via subcutânea, no dorso de cada camundongo dos grupos teste e controle positivo na concentração de 25x106 cel/mL. A dose diária de PE1 ou PE2 foi de 30, 100 ou 300mg/Kg de peso do animal, via intraperitoneal, iniciando-se 24 h após a indução tumoral e mantida durante 5 dias consecutivos. O tempo de sobrevivência foi avaliado até 30 dias após a inoculação tumoral. A avaliação foi realizada em termos percentuais: % de sobrevida (número de vivos em relação ao número de animais testados) e % de mortalidade (número de animais mortos em relação ao número de animais testados) após 30 dias. 3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todos os dados obtidos para o peso do animal, peso e volume do tumor, foram analisados pelo do teste estatístico para rejeição de valores desviantes, 41 denominado Teste „Q‟ de Dixon, com nível de confiança de 95%, conforme Rorabacher (1991). Foram também submetidos à análise de variância dos valores médios das amostras, pelo Teste F com nível de significância de 5% (ANOVA). As comparações múltiplas foram realizadas pelo método de Tukey para verificar as diferenças significativas entre as médias, com nível de significância de 5%. 4 RESULTADOS 4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE Pleurotus djamor CONTRA SARCOMA 180 (S180) A Figura 1 apresenta a diferença de peso dos animais após tratamento com as substâncias PE1 (precipitado obtido com etanol) e PE2 (precipitado obtido com acetona) nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg, assim como dos respectivos animais dos grupos controle positivo (CP), negativo (CN) e controle substância (CS). Figura 1 - Diferença de peso (g) ± erro padrão dos animais tratados com as substâncias PE1 (precipitado obtido com etanol) e PE2 (precipitado obtido com acetona), nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg e dos animais dos grupos controle positivo (CP) e negativo (CN). CS é o grupo controle substância e GT é o grupo teste. As letras de “a” a “s” representam a existência ou não de diferença significativa entre os grupos: a ausência de uma ou mais letras sobre a barra representativa de um determinado grupo, indica a existência de diferença significativa entre este grupo e aquele representado pela ausente. 43 Este estudo foi realizado com o objetivo de verificar a influência das diferentes variáveis – substâncias teste (PE1 e PE2), dosagens (3, 10, 30 e 100 mg/Kg) e tumor (presença e ausência) – sobre o desenvolvimento dos animais. Pode-se observar que não houve diferença significativa no peso dos animais quando comparados os grupos controle entre eles (CN e CP). Comparando-se o grupo controle negativo com todos os grupos teste, observa-se a existência de diferença significativa apenas em relação ao grupo tratado com PE1 na concentração de 3 mg/Kg (grupo “g”). Comparando-se, por sua vez, o grupo controle positivo com os grupos teste, só observou-se diferença significativa em relação ao grupo tratado com PE2 na concentração de 100 mg/Kg (grupo “s”). Isso revela que a presença do tumor, assim como das substâncias apresentaram pouca interferência no ganho de peso dos animais durante o período do teste. A Figura 2 apresenta o peso tumoral médio dos animais do grupo controle positivo e daqueles tratados por via intraperitoneal (i.p.) nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg com as substâncias PE1 e PE2. Figura 2 - Peso médio do tumor ± erro padrão (g) dos animais do grupo controle positivo (CP) e daqueles tratados com doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2). As letras de “a” a “i” representam a existência ou não de diferença significativa entre os grupos: a ausência de uma ou mais 44 letras sobre a barra representativa de um determinado grupo, indica a existência de diferença significativa entre este grupo e aquele representado pela ausente. Houve diferença significativa entre o peso do tumor dos animais do grupo controle positivo (CP) e o peso do tumor dos animais de todos os grupos teste. Isso revela que, independentemente da dose e do método de obtenção, os precipitados foram capazes de reduzir o desenvolvimento do tumor. Analisando-se o peso do tumor para as diferentes doses testadas de PE1, observaram-se diferenças significativas apenas entre a dose de 30 mg/Kg e as demais, sendo esta dose a que promoveu menor desenvolvimento tumoral. No caso da variação da dose de PE2, numericamente, o melhor resultado foi observado para a dose de 30 mg/Kg que, no entanto, não apresentou diferença significativa em relação à dose de 100 mg/Kg. Perfil semelhante foi observado quando se avaliou a influência da dosagem e do método da extração sobre o volume tumoral. Figura 3 - Volume médio do tumor (cm3) dos animais do grupo controle positivo e daqueles tratados com doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg de precipitado obtido com etanol (PE1) e precipitado obtido com acetona (PE2). As letras de “a” a “i” representam a existência ou não de diferença significativa entre os grupos: a ausência de uma ou mais letras sobre a barra representativa de um determinado grupo, indica a existência de diferença significativa entre este grupo e aquele representado pela ausente. 45 Para ambas as substâncias, menor volume tumoral foi observado numericamente, para a dose de 30 mg/Kg. Existe diferença significativa entre o volume dos tumores extraídos dos animais do grupo controle positivo e o dos animais de todos os grupos teste. Conforme observado anteriormente na análise estatística da influência da dosagem de PE1 sobre o peso do tumor, apenas a dose de 30 mg/Kg apresentou diferença significativa em relação às demais sobre o volume tumoral. A Figura 4 apresenta a taxa de inibição do crescimento do tumor dos animais tratados com PE1 e PE2 por via intraperitoneal (i.p.) nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg. Figura 4 - Taxa média de inibição (%) de crescimento tumoral com as doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg de precipitado obtido com etanol (PE1) e precipitado obtido com acetona (PE2) em relação ao grupo controle positivo (CP). Como se pode observar na Figura 4, o aumento da dose dos precipitados entre 3 e 30 mg/Kg promoveu o aumento da taxa de inibição tumoral, chegando a 93-94% nesta dose. No caso do PE1, observou-se uma drástica redução (30%) da taxa de inibição tumoral quando a dose passou de 30 para 100 mg/Kg, o que não foi observado com PE2, onde esta redução foi de apenas 4%. 46 4.2 ESTUDO DO TEMPO DE SOBREVIDA Um dos critérios mais importantes e aceitos cientificamente para julgar o valor dos agentes antitumorais é o aumento no tempo de sobrevida dos animais (CLARKSON; BURCHENAL, 1965). As Figuras 5, 6 e 7 apresentam o tempo de sobrevida dos animais tratados com PE1 e PE2 por via intraperitoneal (i.p.) nas doses de 30, 100 e 300 mg/Kg, respectivamente. Taxa de sobrevivência (%) 100 80 60 40 20 0 0 5 10 30 mg/Kg PE1 15 Tempo (dias) PE1S PE2 20 PE2S 25 CP 30 CN Figura 5 - Efeito do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2) na dose de 30 mg/Kg na sobrevida dos animais com tumor. PE1S e PE2S representam os controles substância para PE1 e PE2, respectivamente. CN e CP são os controles negativo e positivo, respectivamente. Conforme pode ser observado na figura 5, todos os animais tratados com PE1 e PE2 na concentração de 30 mg/Kg tiveram 100% de sobrevida durante 30 dias, enquanto que os animais do grupo Controle Positivo começaram a morrer a partir do 12º dia, chegando a uma taxa de sobrevida de apenas 20% em 30 dias. A taxa de sobrevida dos animais do grupo Controle Substância (PE2S) caiu para 80% a partir do 22º dia. 47 100 Taxa de sobrevivência (%) 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 PE2S CP CN Tempo (dias) PE1 PE1S PE2 Figura 6 - Efeito do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2) na dose de 100 mg/Kg na sobrevida dos animais com tumor. PE1S e PE2S representam os controles substância para PE1 e PE2, respectivamente. CN e CP são os controles negativo e positivo, respectivamente. Como pode ser observado na figura 6, os tratamentos com a dose de 100 mg/Kg apresentaram perfil similar ao observado para a dose de 30 mg/Kg. No entanto, neste caso, a taxa de sobrevida dos animais do grupo Controle Substância acetona (PE2S) caiu para 60% já no 13º dia, mantendo-se assim até o final do experimento. 48 Taxa de sobrevivência (%) 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (dias) PE1 PE1S PE2 PE2S CP CN Figura 7 - Efeito do precipitado obtido com etanol (PE1) e do precipitado obtido com acetona (PE2) na dose de 300 mg/Kg na sobrevida dos animais com tumor. PE1S e PE2S representam os controles substância para PE1 e PE2, respectivamente. CN e CP são os controles negativo e positivo, respectivamente. Analisando-se a Figura 7, para o tratamento com 300 mg/Kg de PE1 observou-se 20% de mortalidade no 3º dia, enquanto que no seu Controle Substância (PE1S), esta taxa de mortalidade foi atingida no 6º dia. Já o tratamento com PE2 nesta mesma dosagem revelou um perfil similar para o grupo tratado (PE2) e o seu Controle Substância (PE2S), com 100% de mortalidade no 6º dia do experimento. 5 DISCUSSÃO 5.1 ATIVIDADE ANTITUMORAL Wang et al. (2000) estudaram a atividade antisarcoma e antihepatoma de uma lectina derivada do fungo Pleurotus ostreatus e demonstraram taxas de inibição do S180 e do Hepatoma H22 de 88,46% e 75,42%, respectivamente. E refletindo a atividade antitumoral da lectina, os animais com tumor sofreram uma redução no ritmo de ganho de peso ao seguir o tratamento com a substância estudada. Neste trabalho, porém, não foi observada qualquer redução no ganho de peso dos animais tratados, quando comparados com o controle negativo. Estudo realizado por Unursaikhan et al. (2006), avaliando a atividade antitumoral de extratos de Lentinus edodes contra S180, relacionou a manutenção do ganho de peso nos grupos tratados com derivados sulfonados (31,7% a 57,6% de ganho de peso) com uma toxicidade menor dessas substâncias, quando comparadas ao quimioterápico 5-Fluorouracil (20,4% de ganho de peso), que mata células normais além das células tumorais. Os autores atribuem esse fato a uma ação antitumoral relacionada ao estímulo das respostas do sistema imune. Nesse trabalho não foi possível fazer este tipo de correlação em função da pouca diferença estatística obtida entre os grupos controle e os grupos teste. Unursaikhan et al. (2006), em estudos utilizando α-glucanos nativos extraídos de Lentinus edodes contra o S180, observaram taxas de inibição de 4,0% a 25,4% para a dose de 20 mg/Kg e de 11,5% a 31,7% para a dose de 60 mg/Kg. Já para os derivados sulfonados, as taxas variaram entre 10,8% e 33,8% para a dose de 20 mg/Kg e entre 48,4% e 59,0% para a dose de 60 mg/Kg. Estes resultados são inferiores aos obtidos neste trabalho, com exceção do precipitado PE2 na dose de 3 mg/Kg, onde a taxa de inibição foi de 55%. Lee et al. (2003) conduziram estudo para testar as propriedades antineoplásicas do extrato de Agaricus blazei em camundongos ICR e KSN, inoculados com S180, tratados via oral demonstrando uma diminuição no tamanho do tumor no decorrer do tratamento, quando comparado ao controle. Os dados apresentados pelos autores permitem chegar a valores entre 55 e 60% de redução 50 de volume tumoral entre o 10º e o 24º dia após a inoculação do tumor. Recentemente, Gonzaga et al. (2009) testaram um polissacarídeo (α-(1→4)-glucan (β-(1→6)-glucan-protein) obtido do mesmo fungo em camundongos Swiss machos inoculados com Sarcoma 180, obtendo taxas de inibição de 42,1% e 47,2%, no tratamento intraperitoneal, para as doses de 25 e 50 mg/Kg, respectivamente. Em ambos os casos, os resultados foram consideravelmente inferiores aos obtidos neste trabalho. Nakamura et al. (2004) testaram algumas frações de micélio de Phellinus linteus contra S180, obtendo taxas de inibição que variaram entre 40,0% e 81,2%, resultados semelhantes aos obtidos neste trabalho para tratamento com PE1 nas doses de 3, 10 e 100 mg/Kg e para tratamento com PE2 nas doses de 3 e 10 mg/Kg, porém inferiores aos demais. Sarangi et al. (2006) testaram três frações de proteoglicanos solúveis obtidas do micélio de Pleurotus ostreatus, por via intraperitoneal, em camundongos inoculados com S180 no modelo ascítico, obtendo uma redução de até 90% no número de células tumorais. Como nesse trabalho utilizou-se tumor sólido, não foi possível efetuar contagem do número de células tumorais, no entanto, fazendo-se uma comparação direta dos valores obtidos para a redução tumoral, observa-se que são muito próximos (93% - 94%) aos observados pelos autores (90%). Wolff (2007) pesquisou o efeito antineoplásico do caldo de cultivo in natura (CBIN), do extrato obtido do caldo de cultura (ECB) e dos corpos frutíferos (EFB) de Pleurotus ostreatus, em camundongos inoculados com S180, sendo observadas taxas de redução variando entre 72% e 86%, resultados similares aos obtidos no presente trabalho para a mesma dose (10 mg/Kg), porém, novamente inferiores aos aqui obtidos com a dose de 30mg/Kg. Niu et al. (2009) avaliaram a atividade antitumoral de um polissacarídeo de Agaricus blazei contra S180, obtendo apenas discretas reduções no peso do tumor nos grupos tratados com as doses de 50 e 100 mg/Kg. Contudo, quando a dose foi aumentada para 200 mg/Kg, o peso do tumor é significativamente reduzido, sendo que as taxas de inibição para as doses de 50, 100 e 200 mg/Kg foram de 9,5%, 23% e 32%, respectivamente. Estes valores são inferiores aos observados neste trabalho, mesmo para doses similares. Furlan et al. (2009) e Dalonso et al. (2010) investigaram a atividade antineoplásica de extratos de Pleurotus ostreatus e Pleurotus sajor-caju sobre o 51 Tumor Ascítico de Ehrlich, utilizando frações e métodos de extração variados, obtendo taxas de inibição que variaram entre 51% e 81% no primeiro caso, e entre 52% e 86% no segundo. Os valores de taxa de inibição obtidos pelos autores são inferiores aos valores máximos obtidos neste trabalho. No entanto, deve-se considerar que se trata de outras espécies de Pleurotus e de outra linhagem tumoral. Observando os resultados obtidos neste trabalho referentes à inibição do crescimento do tumor e comparando-os com a literatura (Tabela 1), pode-se concluir que a utilização de precipitados de polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor como agentes antitumorais é promissora, independentemente do método de obtenção utilizado (etanol ou acetona). Tabela 1 - Percentuais de inibição tumoral por origem da substância e tipo de tumor. Origem da Tumor(es) Substância Taxa de Inibição Autores Tumoral (%) Sarcoma 180 88,46% Hepatoma H22 75,42% Lentinus edodes Sarcoma 180 4 – 59% Unursaikhan et al., 2006 Agaricus blazei Sarcoma 180 55 – 60% Lee et al., 2003 Sarcoma 180 38,8 – 47,2% Gonzaga et al., 2009 Phellinus linteus Sarcoma 180 40,0 – 81,2% Nakamura et al., 2004 Pleurotus ostreatus Sarcoma 180 90% Pleurotus ostreatus Sarcoma 180 72 – 86% Agaricus blazei Sarcoma 180 9,5 – 32,0% Tumor Ascítico de Ehrlich 51 – 81% Furlan et al., 2009 Tumor Ascítico de Ehrlich 52 – 86% Dalonso et al., 2010 Sarcoma 180 60 – 94% este estudo Sarcoma 180 55 – 93% este estudo Pleurotus ostreatus Agaricus blazei Murill Pleurotus ostreatus Pleurotus sajor-caju Pleurotus sajor-caju Pleurotus djamor (PE1) Pleurotus djamor (PE2) Wang et al., 2000 Sarangi et al., 2006 Wolff, 2007 Niu et al., 2009 52 5.2 TEMPO DE SOBREVIDA Os resultados relacionados à taxa de sobrevida dos animais revelam que, independentemente do tipo de polissacarídeo obtido por precipitação com etanol ou com acetona –, as doses de 30 e de 100 mg/Kg mostraram-se eficazes, com 100% de sobrevida dos animais tratados após 30 dias de experimento contra 20% de sobrevida dos animais do grupo Controle Positivo, que não foram tratados. Zhao et al. (2003) avaliaram a inibição de Sarcoma 180 por uma lectina extraída do fungo Agrocybe aegerita, obtendo aumento na taxa de sobrevida de 50%, (grupo controle), para 90% (grupo tratado). Este resultado é inferior ao obtido neste trabalho para tratamentos com ambos os precipitados na dose de 30 mg/Kg, que proporcionaram aumento da taxa de sobrevida de 20 para 100%. Gonzaga et al. (2009) testaram um polissacarídeo obtido do fungo Agaricus blazei Murill, na dose de 25 mg/Kg/dia, que proporcionou aumento do tempo de vida dos animais em 26,4% em relação ao controle. Os animais mantiveram-se vivos por cerca de 20 dias. Os valores são, novamente, inferiores aos obtidos neste estudo, já que para uma dose semelhante (30 mg/Kg), todos os animais estavam vivos 30 dias após a indução tumoral. Wang et al. (2000), testando extratos de Pleurotus ostreatus contra S180 e Hepatoma H22, observaram de 21,9 a 106,7% de aumento do tempo de sobrevida dos animais tratados. Shamtsyan et al. (2004), quando avaliaram a ação do extrato de Pleurotus ostreatus contra melanoma B16, observaram taxa de sobrevida no grupo tratado de 60%, contra 100% de sobrevida, no mesmo período e com a mesma dose (100 mg/Kg), obtidos neste estudo. A Tabela 2 apresenta um comparativo entre os resultados obtidos neste trabalho e aqueles reportados na literatura para taxa de sobrevida, revelando que a utilização de precipitados de polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor como agentes antineoplásicos tem um impacto significativo no aumento da sobrevida dos animais tratados, reforçando o que já foi observado durante a avaliação da sua atividade antitumoral. 53 Tabela 2 - Taxas de sobrevida por origem da substância e tipo de tumor. Origem da Tumor Substância Agrocybe aegerita Agaricus blazei Murill Pleurotus ostreatus Pleurotus ostreatus Pleurotus djamor (PE1) Pleurotus djamor (PE2) S180 S180 S180 H22 Melanoma B16 Dose Período de Taxa de Sobrevida (mg/Kg) Avaliação (dias) (%) 20 90% Até todos os Aumento de 26,4% animais morrerem em relação ao CP Até 50% dos Aumento de 21,9% a animais do grupo 106,7% em relação controle morrer ao CP 30 60% 0,1 mg/animal 25 mg/Kg 1,5 mg/Kg 100 mg/Kg 30 mg/Kg S180 S180 Autores Zhao et al., 2003 Gonzaga et al., 2009 Wang et al., 2009 Shamtsyan et al., 2004 100% 100 mg/Kg 30 100% 300 mg/Kg 80% 30 mg/Kg 100% 100 mg/Kg 30 300 mg/Kg 100% este estudo este estudo 0% No entanto, como pode ser observado na Tabela 3 e na Figura 8, existe uma relação direta entre a dose de PE2 e a taxa de mortalidade dos animais do grupo Controle Substância PE2S. Observa-se ainda a existência de uma relação inversa entre a dose e o tempo de mortalidade dos animais deste grupo. Tabela 3 - Dose de PE2, taxa e tempo de mortalidade dos animais do grupo controle substância. Dose Taxa de mortalidade Tempo (mg/Kg) (%) (dias) 30 20 22 100 40 13 300 100 6 54 Figura 8 - Relação entre a dose do precipitado obtido com acetona (PE2), a taxa e o tempo de mortalidade dos animais do grupo controle substância. Conclui-se, portanto, que o aumento da dose de PE2 tem efeito nocivo sobre os animais saudáveis. Este efeito não foi observado no grupo dos animais inoculados com tumor e tratados com as doses de 30 e 100 mg/Kg (Figuras 5 e 6), tendo sido observado sobre os animais tratados com a dose de 300 mg/Kg (Figura 7). Kviecinski (2007) revela que efeitos adversos são associados à elevada toxicidade apresentada pelas substâncias utilizadas no tratamento do câncer, podendo levar à morbidez significativa. Cheng et al. (2003) avaliaram o efeito antineoplásico de extratos da erva Bupleurum scorzonerifolium, obtidos com acetona, metanol e água, contra células de câncer de pulmão humano A549 in vitro. Os autores observaram que o extrato obtido com acetona foi citotóxico às células em menor concentração do que a dos extratos obtidos com metanol e com água (59±4,5 µg/mL, 580±36 µg/mL e >1000 µg/mL, respectivamente). Em outro estudo, Cheng et al. (2004) observaram o efeito antitumoral de extratos de Angelica sinensis, utilizando os mesmos métodos de extração, contra células A549, células de câncer de cólon humano HT29, células de glioblastoma humano DBTRG-05MG e células de hepatoma humano J5, obtendo resultados semelhantes aos do estudo anterior. Os autores destes estudos demonstram que o efeito antitumoral se deve à atuação na mitose e à indução da 55 apoptose das células tumorais, e como as células tumorais tendem a se dividir rapidamente, o efeito mais marcante do precipitado se dá sobre essas células, porém, por atuar na divisão celular, o precipitado poderia também atuar em células saudáveis, induzindo a sua apoptose e danificando tecidos sadios. Deste modo considera-se que o precipitado obtido com acetona não deve ser utilizado neste tipo de tratamento. Considerando que os resultados obtidos com as doses de 30 e de 100 mg/Kg do precipitado obtido com etanol são similares e que a dose de 300 mg/Kg apresentou efeito nocivo sobre os animais, sugere-se, com base nos testes realizados neste trabalho, a utilização deste precipitado na dose de 30 mg/Kg para a continuidade dos estudos. 6 CONCLUSÕES Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que: a substância PE1 (precipitado de polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor obtido com etanol), quando administrada por via intraperitoneal, promoveu uma taxa de inibição do crescimento de S180 de 60%, 83%, 94% e 64% para as doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg, respectivamente. a substância PE2 (precipitado de polissacarídeos extracelulares de Pleurotus djamor obtido com acetona), quando administrada por via intraperitoneal, promoveu uma taxa de inibição do crescimento de S180 de 55%, 82%, 93% e 89% para as doses de 3, 10, 30 e 100 mg/Kg, respectivamente. a substância PE1, quando administrada por via intraperitoneal, promoveu uma taxa de sobrevida em 30 dias de 100%, 100% e 80% para as doses de 30, 100 e 300 mg/Kg, respectivamente. a substância PE2, quando administrada por via intraperitoneal, promoveu uma taxa de sobrevida em 30 dias de 100%, 100% e 0% para as doses de 30, 100 e 300 mg/Kg, respectivamente. o aumento da dose da substância PE2 tem efeito nocivo sobre os animais saudáveis, sendo que este efeito aumenta com o aumento da dosagem. PE1 na dose de 30 mg/Kg é sugerido para continuidade dos estudos por proporcionar maior taxa de inibição tumoral (94%), 100% de sobrevida em 30 dias e por não ter apresentado efeito nocivo sobre os animais. 7 PERSPECTIVAS 7.1 SUGESTÕES PARA A CONTINUIDADE DO TRABALHO Avaliar a atividade antitumoral dos polissacarídeos miceliais; Avaliar a citotoxicidade das substâncias teste in vivo e in vitro; Estudar os efeitos do tratamento preventivo; Estudar a atividade antinociceptiva dos extratos de polissacarídeos extracelulares e miceliais do Pleurotus djamor; Caracterizar os polissacarídeos presentes em PE1 e PE2; Avaliar o mecanismo extracelulares e miceliais. de ação dos extratos de polissacarídeos REFERÊNCIAS AJITH, T. A.; JANARDHANAN, K. K. Cytotoxic and antitumor activities of a polypore macrofungus, Phellinus rimosus (Berk) Pilat. J Ethnopharmacol, v.84, p.157-162, 2003. ALASALVAR, C.; KARAMAC, M.; AMAROWICZ, R.; SHAHIDI, F. 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