Otimização de um método econômico e rápido de extração de DNA

51º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 51º Congresso Brasileiro de Genética • 7 a 10 de setembro de 2005
Hotel Monte Real • Águas de Lindóia • São Paulo • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 85-89109-05-4
[email protected]
Palavras-chaves: DNA, Extração, Análises moleculares, Espécies Florestais
Alzate-Marin, AL1; Guidugli, MC1,2; Soriani, HH1,2; Mestriner, MA1
Laboratório de Genética Vegetal, Departamento de Genética, 2Departamento de Biologia, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
1
Otimização de um método
econômico e rápido de extração de DNA
para quatro espécies de árvores tropicais
Métodos baseados em PCR são amplamente utilizados em plantas para melhoramento assistido por marcadores,
mapeamento de alta resolução e para análises de genética de populações. Estes estudos requerem análises de
populações grandes dependendo inicialmente da capacidade de extrair DNA em qualidade e quantidade de
forma rápida e eficiente. Assim, este trabalho teve como objetivo otimizar um método rápido, econômico e eficaz
de minipreparação de DNA a partir do protocolo descrito por Doyle & Doyle (1990) para as espécies florestais
Copaíba langsdorfii (Óleo de Copaíba), Hymaneae courbaril (Jatobá), Eugenia uniflora (Pitanga) e Tabebuia roseo alba
(Ipê Branco). Para isso, folhas dessas espécies foram coletadas em florestas localizadas na região de Ribeirão
Preto e preservadas a -20oC por aproximadamente um ano. Na maceração de cerca de 300 mg de tecidos de
amostras das quatro espécies foi dispensada a utilização de nitrogênio líquido e seguiram-se as condições de
extração do DNA das folhas do protocolo Doyle & Doyle (1990) com algumas adaptações. Dois tratamentos
relacionados à adição ou não de Proteinase K no tampão de extração foram realizados para cada espécie. Nos
dois tratamentos as amostras com os tampões foram incubadas a 65˚C por meia hora, sendo homogeneizadas
a cada 10 minutos. Subsequentemente, somente foi realizada uma etapa de separação com clorofórmio-álcool
isoamílico, fazendo-se inversões suaves durante 10 minutos e centrifugando-as por 5 minutos. Ao sobrenadante
foi adicionada RNAse (40 µg/ml), procedendo-se a incubação em banho-maria a 37˚C por 30 minutos. Em
seguida, acrescentou-se isopropanol gelado e as amostras foram colocadas a -20o C por 30 minutos. Após esse
período houve centrifugação por 10 minutos, sendo o sobrenadante descartado e o precipitado submetido
a duas lavagens, uma com etanol 70% e outra com etanol 95%. O DNA extraído foi secado à temperatura
ambiente e ressuspendido com TE (Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M pH 8,0). Amostras de DNA das quatro
espécies extraídas com e sem o uso de Proteinase K, foram amplificadas com primers microssatélites (Jatobá
e de Óleo de Copaíba) e RAPD (Pitanga e Ipê Branco). Como resultado foi observado que o DNA extraído
das quatro espécies estudadas com e sem o uso de Proteinase K, apresentou alto rendimento e boa qualidade,
obtendo-se cerca de 300 a 880 ng/µl de DNA a partir de 250-300 mg de tecido foliar congelado. Também
ocorreram similares perfis de amplificação utilizando os primers microssatélites e RAPD para os tratamentos
mencionados. No presente, rotineiramente no Laboratório de Genética Vegetal da USP/RP, esta metodologia
de extração de DNA sem o uso de nitrogênio líquido na maceração (o que eliminou os custos da compra do
gás, do botijão e sua manutenção) e sem adição de proteinase K está sendo empregada nas análises moleculares
de populações das espécies florestais descritas.
Apoio financeiro: FAPESP.
510