Instruções de Uso - Biometrix

Instruções de Uso
1. Nome Comercial e marca da família de produtos
FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE II
Marca: One Lambda
2. Formas de apresentação do produto e composição
2.1. Descrição de cada item que constitui a família
Código do produto
MDR172
CDR5
CDR50
CDR1D
ABSG
ABSM
FB2-100
PC1-500
NS
Descrição do produto
Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR172 10 placas
Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR5 - 1 x 5mL
Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR50 - 1 x 50mL
Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado - CDR1D 1 x 1mL
Reagente Controle Anti-Linfócito B IgG - ABSG - 1 x 1mL
Reagente Controle Anti-Linfócito B IgM - ABSM - 1 x 1mL
Reagente de Isolamento (separação) - FB2-100 - 1 x 10mL
Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato - PC1-500 - 1 x
500mL
Reagente Controle Negativo - NS - 1 x 1mL
3. Descrição da finalidade ou uso do produto
A Placa para tipagem de HLA Terasaki é uma placa de poliestireno com 60, 72 ou
96 poços contendo anticorpos alo ou monoclonais conhecidos contra antígenos HLA.
Cada poço contém 1 µl de um antissoro específico ou anticorpo monoclonal e 5 µl de
óleo mineral. Cada placa contém um controle positivo e um negativo. Para uso na
determinação de antígenos HLA classe II na superfície da célula através da
metodologia de microlinfocitotoxicidade dependente de complemento.
Os controles ABSG, ABSM e NS são usados para testar a pureza das preparações
celulares. Podem também ser usados em combinação para identificar a contaminação
de preparo de células.
Os complementos CDR5, CDR50 e CDR1D são utilizados em ensaios de
citotoxicidade dependentes de complementos para determinar os antígenos HLA de
Classe II da superfície celular.
1
O componente Fluorobeads B fornece um procedimento simples para o
isolamento de Linfócitos B para uso em testes de tipagem HLA classe II usando
corantes fluorescentes. PBS/Citrato é um reagente para ser usado no método de
isolamento Fluorobeads B.
Material para uso em laboratório de imunologia na tipagem HLA, através deste
teste determina-se a compatibilidade HLA entre indivíduos. Este teste é denominado
de teste de histocompatibilidade.
4. Princípio de ação e reação do produto: base científica, explicação da
metodologia, técnicas e reações envolvidas
Linfócitos viáveis são incubados com uma mistura de anticorpos ligados a
complemento. Se o linfócito possuir um antígeno reconhecido por um anticorpo
específico, a porção FAB do anticorpo se liga ao antígeno, formando um complexo
antígeno-anticorpo. Após a formação destes complexos, com a fração C1q e o Ca++ do
complemento ligam-se à porção FC do anticorpo.
Um anticorpo IgM é necessário para ligar uma molécula C1q ou dois anticorpos
IgG são necessários para ligar uma molécula C1q. A ligação C1q inicia a cascata do
sistema complemento qual induz a uma lise da célula com o complexo antígenoanticorpo. Em uma reação negativa, os linfócitos se mantêm viáveis. Em uma reação
positiva, os linfócitos estão mortos.
5. Componentes fornecidos e não fornecidos com o produto: especificações ou
características qualitativas ou quantitativas
Código do
produto:
MDR172
Material Fornecido:
1) 10 placas de Tipagem de Tecido
Monoclonal Classe II - HLA MDR172;
2) Worksheets
identificando
a
especificidade de cada anticorpo
monoclonal;
3) Instruções de uso.
Materiais necessários, porém, não fornecidos:
1) Microsseringas HLA (micro dispensadores/dosadores);
2) Insta-Seal (OLI cat. TIS250U) lâminas cobertas ou lâminas
de vidro e óleo mineral (Vaseline);
3) Reagentes corantes e fixadores:
- Para teste de exclusão de corante: eosina-Y (base sódica)
e formaldeído, ou Stain-Fix (cat. SF-500 da One Lambda);
- Para teste fluorescente: FluoroQuench AO/EB (cat. #
FQAE-500 da One Lambda).
4) Eliminação da Hemoglobina:
- De soro bovino liofilizado: EDTA PBS a 5%; azida sódica a
1%.
- De células vermelhas totais: solução salina; EDTA PBS a
5%; solução azida a 1%.
2
5) Solução a 1% de tinta: soro albumina bovino (BSA); EDTA
PBS 5%; azida sódica; tinta preta de caligrafia Higgins;
6) Solução 5% EDTA (dissódico) PBS;
7) Solução estoque de Brometo de etídio (EB): água destilada;
PBS;
8) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA);
- Solução stock: Dissolva 10 mg de CFDA em 1ml de
acetona num tubo de vidro. Armazene a –20 °C em tubos
de Beckman.
- Solução de trabalho: Use uma das seguintes:
• Preparado em PBS a pH 7,2: Acrescente 30 µl de solução
stock CFDA a 5ml de PBS (pH 7,2). Armazene a 2–5 °C
durante um período máximo de 1 semana.
• Preparado em PBS a pH 5,5: Acrescente 30 µl de solução
stock CFDA a 5ml de PBS (pH 5,5). Armazene a 2–5 °C
durante um período máximo de 1 semana.
CDR-5
CDR-50
CDR-1D
ABSG
ABSM
NS
FB2-100
1) 1 frasco com 5 mL de Complemento
de Coelho para HLA Classe II;
2) Instruções de uso.
1) 1 frasco com 50mL de Complemento
de Coelho para HLA Classe II;
2) Instruções de uso.
1) 1 frasco com 5mL de Complemento
de Coelho para HLA Classe II Liofilizado;
2) Instruções de uso.
1) 1 frasco com 1mL de Reagente
Controle Anti-Linfócito B IgG;
2) Instruções de uso.
1) Reagente Controle Anti-Linfócito B
IgM - ABSM - 1 x 1mL;
2) Instruções de uso.
1) 1 frasco com 1mL de Reagente
Controle Negativo;
2) Instruções de uso.
1) 1 frasco com 10mL de Reagente de
Isolamento (separação);
2) Instruções de uso.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
Não aplicável.
1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou
equivalentes);
2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 ml e 1,5
ml, com tampas;
3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e
Mg++ (ou seja, Irvine Scientific, Nº de Catálogo 9249);
4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%;
5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente);
6) Aspirador ou pipetas descartáveis;
7) Reagente PBS/Citrato:
- Número de catálogo OLI PC1-500, ou
- Reagente PBS/Citrato
(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g. de citrato
trissódico dihidratado e 2,5 g. de ácido cítrico em 90 ml de
água destilada. Perfaça um volume final de 100 ml. Filtre,
esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 ml de
10X citrato a 90 ml de PBS. Filtre, esterilize e armazene
entre 2 a 5°C.
8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)
- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30 minutos
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PC1-500
1) 1 frasco com 500mL de Reagente
Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato;
2) Instruções de uso.
para inativar o complemento. Armazene a uma
temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e congele a –20°C;
- Solução de trabalho: Adicione 5 ml de solução stock de
HIFCS a 95 ml de meio de McCoy ou equivalente.
1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou
equivalentes);
2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 ml e 1,5
ml, com tampas;
3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e
Mg++ (ou seja, Irvine Scientific Nº de Catálogo 9242);
4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%;
5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente);
6) Aspirador ou pipetas descartáveis;
7) Reagente PBS/Citrato:
- Número de catálogo OLI PC1-500, ou
- Reagente PBS/Citrato
(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g. de citrato
trissódico dihidratado e 2,5 g. de ácido cítrico em 90 ml de
água destilada. Perfaça um volume final de 100 ml. Filtre,
esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 ml de
10X citrato a 90 ml de PBS. Filtre, esterilize e armazene
entre 2 a 5°C.
8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)
- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30 minutos
para inativar o complemento. Armazene a uma
temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e congele a –20°C;
- Solução de trabalho: Adicione 5 ml de solução stock de
HIFCS a 95 ml de meio de McCoy ou equivalente.
5.1. Instrumentos requeridos, porém, não fornecidos:
• Microscópio de contraste de fase, que poderá ser invertido e com
fluorescência, dependendo da metodologia de separação de linfócitos utilizada.
Consultar sempre a Biometrix Diagnóstica para maiores esclarecimentos.
6. Condições de armazenamento, transporte, limites de temperatura, umidade
ou proteção à luz
Validade e condições de armazenamento e transporte de cada um dos
produtos pertencentes a esta família estão indicados a seguir:
Código do
produto
MDR172
CDR-5
CDR-50
Informações sobre transporte
Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco.
Temperatura de
armazenamento
-65°C ou inferior
-65°C ou inferior
-65°C ou inferior
4
NS
Os produtos devem ser transportados
refrigerados, acondicionados com gelo reciclável.
Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco.
Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco.
FB2-100
Os produtos devem ser transportados
refrigerados, acondicionados com gelo reciclável.
2°C-8°C
PC1-500
Os produtos devem ser transportados
refrigerados, acondicionados com gelo reciclável.
2°C-8°C
de
o
CDR-1D
ABSG
ABSM
No
caso
material
congelado,
somente
2°C-8°C
-20°C ou inferior.
-20°C ou inferior.
-20°C ou inferior.
descongelar
que
será
imediatamente utilizado. Se necessário, aliquotar o conteúdo em tubos de menor
volume. Este volume deve ser determinado por cada laboratório, pois é dependente
da rotina de cada um.
7. Precauções e esclarecimentos sobre riscos com o uso do produto
Somente para uso em diagnóstico in vitro.
Cuidados especiais: quando do manuseio do produto, utilizar luvas descartáveis.
Descartar se houver descongelamento prematuro.
CUIDADO: Todos os produtos de origem sanguínea devem ser tratados como
potencialmente infecciosos. A fonte de material do qual esse produto foi derivado foi
dada como negativa quando testada de acordo com os requerimentos para testes
pela FDA. Nenhum método de teste conhecido pode assegurar que produtos derivados
de sangue humano não transmitirão agentes infecciosos.
Não existem padrões Americanos que indiquem potência ou especificidade.
8. Orientação sobre os cuidados com a amostra biológica objeto do diagnóstico
Manipular como material potencialmente infeccioso por tratar-se de material
para teste diagnóstico que envolve amostra de origem sanguínea humana.
9. Descrição do Processo de Medição
9.1. Coleta e preparo da amostra
a. Sangue armazenado por menos de 24 horas: coloque 15-20 ml de sangue
total em heparina de sódio (1000 unidades/10 ml de sangue) em tubo
“vacutainer” tampa verde.
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b. Sangue armazenado por mais de 24 horas: coloque 15-20 ml de sangue total
em tubo “Vacutainer” ACD ou CPDA.
c. Não use heparina de lítio. IMPORTANTE: o sangue deve ser armazenado
horizontalmente entre 22 e 25°C. Não refrigere.
9.2. Isolamento de Linfócito a partir de Sangue Fresco
a. Centrifugue sangue citrificado ou heparinizado por 10 minutos a 400g.
b. Colete a camada tamponada e dilua em volume igual de PBS (fosfato salino
tamponado); misture bem.
c. Espalhe um máximo de 2 ml da mistura da camada tamponada/PBS sobre
1,5ml de Ficoll-Hypaque em tubos de 5ml, e centrifugue por 10 minutos a
1000g.
d. Colete aproximadamente 1 ml da interfase de cada tubo e transfira para
tubos tipo “Fisher”. Centrifugue por 1 a 1 ½ minuto a 3000g em uma
centrífuga tipo “Fisher”.
e. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o botão em PBS. Centrifugue por 1
min a 1000g (isto remove a maioria das plaquetas).
f. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o botão em PBS, e então, adicione 1
gota de trombina (100 unidades/ml). Misture.
g. Coloque os tubos para girar em uma roda vertical a 8 rpm ou inverta os
tubos por 2-5 minutos ou até que apareçam agregados brancos.
h. Centrifugue por 3 minutos a 1000g em uma centrífuga tipo “Fisher” e
transfira o sobrenadante para limpar os tubos tipo “Fisher”. Os agregados
remanescentes podem ser poupados para o procedimento de isolamento de
monócitos. Centrifugue o sobrenadante por 1 minuto a 1000g.
i. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o botão por 1 minuto a 1000g.
Repita.
j. Ressuspenda o botão em meio de McCoy e ajuste as células para uma
concentração de 2x106 células/ml de linfócitos totais para tipagem.
Separando/Isolando linfócitos B
Atualmente existem diferentes procedimentos para o isolamento de linfócitos B,
sendo que os mais utilizados são:
6
a. Através da observação empírica, notou-se que os linfócitos B têm a
tendência de se aderir às superfícies sólidas, enquanto que os linfócitos T são
relativamente não aderentes. Com isso, o uso da técnica de aderência em lã
de nylon ainda pode ser usado por alguns laboratórios, sendo que a
viabilidade em células não frescas é bem baixa, dificultando no processo de
tipagem de classe II.
b. Através do processo onde pérolas imunomagnetizadas se ligam aos
linfócitos (T ou B) e desta forma através da atração magnética esses linfócitos
são isolados das demais células presentes na amostra. (FluoroBeads
específicas para linfócito T ou B).
Seguem explicações mais detalhadas sobre as técnicas a seguir:
9.3. Micro técnica do canudo com lã de nylon: As proporções dadas abaixo
são para coluna capaz de manusear até 10 x 106 células/mL.
a. Feche uma das saídas de um canudo plástico, flexível e transparente (0,6 x
12-14 cm) em ângulo de 45º;
b. Proceda com um bom retalhamento de 0,1g de lã de nylon esfregado
encharcando-o em HBSS ou PBS em uma placa de Petri;
c. Encha ¾ do canudo com HBSS ou PBS, então, usando a ponteira de uma
pipeta, gradualmente e emparelhadamente coloque a lã de nylon dentro do
canudo para uma altura de aproximadamente 6 cm. Nesse estágio a coluna
pode ser armazenada a 4°C por até 2 semanas;
d. Corte ou perfure o lado selado do canudo fazendo uma abertura de
aproximadamente 2 mm;
e. Lave a lã de nylon com 5 ml HBSS ou PBS e então com 5ml de meio
contendo HIFCS a 5%;
f. Quando o meio cobrir a lã de nylon, gire o canudo para a posição horizontal
e incube por 30 min. a 37°C. Alternativamente, use meio pré-aquecido
(morno);
g. Adicione 0,5ml de suspensão de linfócitos purificados (procedimento
descrito acima) em HIFCS a 5% ao topo da coluna e permita ás células
moverem-se por todo o percurso dentro da lã. Uma boa separação de célula T
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e B dependem da pureza da preparação de linfócitos iniciais; Portanto, a
suspensão deverá ser isenta de granulócitos e plaquetas.
h. Adicione aproximadamente 0,2ml de HIFCS a 5% ao topo da coluna para
prevenir ressecamento. Deixe a coluna deitada e incube a 37°C por 30min;
i. Para recuperar os linfócitos T, realize 2 lavagens (8ml cada) com HIFCS a
5% morno (37°C) gotejando através da coluna que deverá estar na posição
vertical. O eluente contém células T não aderentes;
j. Para recuperar as células B aderentes, adicione 1,5ml de HIFCS a 5% à
coluna e repetidamente esprema o canudo. Continue esta etapa até que 8 ml
do meio tenha sido usado;
k. Centrifugue ambas as suspensões de células T e B por 5 min a 1000g e laveas 1 vez com 1ml de HIFCS a 5%;
l. Resuspenda as células em quantidade mínima de meio (e.g. 0,5ml),
verifique a viabilidade, conte as células e ajuste a concentração para 2x106
células/ml;
m. Na média, esse procedimento deverá fornecer uma recuperação de 80-90%
das células.
9.4.
Isolamento de linfócitos B puros através de pérolas imunomagnetizadas
– Fluorobeads B (One Lambda, Inc.)
Este procedimento leva menos de 10 minutos para ser completado, sendo que o
procedimento é realizado totalmente à temperatura ambiente. Fluorobeads B é um
reagente de separação composto de partículas imunomagnéticas acopladas a
anticorpo monoclonal (CD19)
específico para o linfócito B. Essas pérolas
seletivamente se ligam aos linfócitos B e são então isoladas com o auxílio de um
magneto (FBAMAG6 + 6 – One Lambda, Inc.).
- Isolamento a partir de Sangue Total:
a. Dispense 5 ml de sangue dentro de um tubo de 15ml
b. Adicione 5 ml de PBS/Citrato 1X e misture por inversão
c. Ressuspenda as FluoroBeads B completamente antes do uso. Agite em
aparelho agitador tipo Vortex por 10 segundos.
d. Adicione 100 ul de FluoroBeads T à amostra teste. Imediatamente tampe o
tubo e inverta-o por 2-3 minutos para dispersar as pérolas magnéticas
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e. Agite delicadamente o tubo através de rotação por 5 minutos à
temperatura de 22-25°C para permitir que as pérolas se liguem às células B
(não exceder 5 minutos). Pode ser usada rotação manual ou mecânica.
f. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 5 minutos.
Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Remova
então o tubo do magneto.
g. Adicione 2-3 ml de PBS/Citrato 1X (PC1-500). Agite o tubo para a
ressuspensão das beads.
h. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 1 minuto.
i. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Remova
então o tubo do magneto.
j. Repita esta etapa de lavagem somente com o PBS/Citrato 1X mais duas
vezes.
k. Proceda com os procedimentos de identificação e marcação da célula
descrita abaixo, ou ressuspenda as células (beads) em 0,5 mL de meio McCoy
ou equivalente com 5% HIFCS.
9.5.
Procedimento de Marcação e Concentração da Célula
A. Pelo método CFDA:
1. Destampe e coloque o tubo em um separador magnético por 1 minuto.
Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células (beads) com PBS.
Repita esta etapa duas vezes.
2. Adicione 0,5mL de CFDA (solução de trabalho, pH 5.5) e misture.
3. Incube o tubo horizontalmente no escuro por 10 minutos a 20-25°C.
4. Repetir etapa #1
5. Ressuspenda as células em 0,5mL de meio McCoy ou equivalente com
5% HIFCS.
6. Adicione 1µL de suspensão celular a um poço branco de uma placa
Terasaki. Verifique a contagem de células através de um microscópio
de fluorescência. Ajuste a concentração para 2 x 106/mL (2.000
células por poço).
9
7. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5ml e
armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até 2 dias antes de serem
aplicadas nas placas para o teste.
B. Método do FQAE – FluoroQuench (corante) com Brometo de etídeo e
Laranja de acridina:
1. Transfira 1 µl de células (beads/pérolas) para um poço branco de uma
placa Terasaki
2. Adicione 5 µl de FQAE (cat. OLI # FQAE-500) ao poço.
3. Verifique a contagem da célula através de um microscópio de
fluorescência. Ajuste, remova e descarte o sobrenadante com uma
pipeta descartável. Remova então o tubo do magneto.
4. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5ml e
armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até 2 dias antes de serem
aplicadas nas placas para o teste.
Após este procedimento, teremos células B prontas para tipagem HLA de classe II.
Obs.: o protocolo a seguir é um protocolo recomendado, partindo-se do pressuposto
de que o laboratório estará utilizando a metodologia do FQAE como corante das
células. Tempos de incubação podem variar dependendo da força de tipagem dos
reagentes e/ou complemento utilizado. (A One Lambda sugere 30 minutos com o
anticorpo e 60 minutos com o complemento, nas placas de tipagem de HLA).
- Procedendo com o teste:
Devido à resistência de cada reagente, tome os cuidados necessários quando
dispensar as células e os reagentes. Não toque o fundo dos poços com as agulhas das
seringas.
Descongele as placas à temperatura ambiente (20-25°C) por 15 minutos, e useas dentro de 1 hora após a retirada do freezer. Agite o tubo contendo sua amostra
por inversão – não agite através do procedimento de pipetagem repetitiva.
1. Para cada poço adicione 1µl de uma suspensão de linfócitos B (2 x 106
células/ml) para as placas de tipagem HLA, usando uma seringa de 50 µl
conectada a um dispensador de repetição.
2. Misture as micro-gotas, usando um misturador eletrostático ou um arame.
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3. Incube as placas à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 60 minutos para as
placas monoclonais e avance para a etapa # 6.
Para placas com alosoro, incube por 30 minutos a 20-25°C.
4. Adicione 5uL de complemento DR (CDR-5, CDR-50 ou CDR1D) a cada poço da
placa com alosoro. Incube por 1 hora no escuro.
OBS.: Placas Monoclonais (LMT ou SMT): Não é necessária esta etapa de adição
de complemento de coelho e este período de incubação. Da etapa (4) avance
diretamente para a etapa (6)
5. Em cada poço adicione 5uL de FQAE.
6.
As placas podem ser lidas de imediato ou então poderão ser armazenadas a
2-5°C por até 2 dias.
Célula morta ocorrerá em qualquer poço teste onde o antígeno HLA na superfície
da célula é reconhecido pelo seu anticorpo anti-HLA conjugado. Para teste de
fluorescência, os linfócitos negativos (vivos) aparecem verdes, e os linfócitos
positivos (mortos) aparecem vermelhos (quando usando corante fluorescente da One
Lambda com laranja de acridina e brometo de etídio – FQAE-500).
9.6.
Avaliação Microscópica dos Testes
- É feito o “score” da reação pela estimativa de percentual de células mortas. Se
houver linfócitos mortos no controle negativo, o percentual de células mortas nos
poços restantes tem que ser ajustado de acordo. O padrão ASHI de leitura é:
Score
1
2
4
6
8
0
% de células mortas
0 - 10 %
11 - 20 %
21 - 50 %
51 - 80 %
81 - 100 %
-------
Interpretação
Negativo
Negativo duvidoso
Positivo fraco
Positivo
Fortemente positivo
Ilegível
As frequências fenotípicas para HLA de classe I variarão de modo diferente
nas diferentes populações (i.e., caucasóides, negróides, orientais, etc.). Referência
4.
11
10. Procedimentos de calibração do processo de medição
Não existe procedimento de calibração para a metodologia em questão.
11. Procedimentos de cálculos e obtenção dos resultados da medição
Não existe cálculo para a obtenção dos resultados da medição. O resultado é
feito pelo “score” da reação pela estimativa de percentual de células mortas
realizada pela leitura microscópica.
12. Limitações do processo de medição (utilização de testes adicionais mais
específicos ou sensíveis, quando os resultados obtidos assim o sugerirem)
Dificuldades na separação celular e contaminação da preparação de linfócitos
com células vermelhas, leveduras, monócitos, plaquetas ou granulócitos podem
causar resultados errôneos. Ainda cabe salientar, que resultados errôneos podem
ocorrer quando concentrações de células estão acima ou abaixo do nível aceitável.
Contaminação bacteriológica ou mudança no pH de reagentes monoclonais podem
causar reações falso negativas. Certos antígenos HLA frequentemente exibem
especificidades fracas. Estes são chamados antígenos de reação cruzada e são
detalhados por antígenos e anticorpos de cada placa na folha guia de reação modelo
que acompanha a placa.
13. Controle interno de qualidade a ser adotado pelo usuário para assegurar o
desempenho adequado do processo de medição
Uma amostra com tipagem previamente conhecida deverá ser utilizado
anterior ao início dos testes de rotina para averiguar a confiabilidade do novo lote de
placa recebido no laboratório. Somente utilizar as placas dentro de seu prazo de
validade.
Caso o laboratório deseje testar a pureza de suas preparações celulares ou
ainda em combinação identificar a contaminação da preparação de células, os
Controles da One Lambda poderão ser utilizados conforme explicados abaixo:
NS = soro controle normal é usado para determinar o background de células
mortas. Este soro é proveniente de soro humano do sexo masculino que não tenha
sofrido transfusão com sangue AB negativo.
12
ABSM, ABSG, ABSMD = Controles anti-linfócitos B são usados para determinar a
pureza dos linfócitos B. Os controles anti linfócitos B são anticorpos monoclonais os
quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos B sem reatividade contra granulócitos,
linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. (OBS.: ABSG
na diluição de trabalho fornecida, não é recomendado para o teste de células com
leucemia crônica linfocitária, nas placas LCT30D da One Lambda).
AGSM, AGSMD = Controles anti-granulócitos são utilizados para determinar a
pureza dos granulócitos. Estes controles são anticorpos monoclonais os quais são
fortemente citotóxicos aos granulócitos, mas sem reatividade contra linfócitos B,
linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste.
AMSM, AMSMD = Controles anti-monócitos são usados para determinar a
pureza de monócitos. Os controles anti-monócitos são anti-corpos monoclonais os
quais são fortemente citotóxicos a monócitos, mas sem reatividade contra
granulócitos, linfócitos B, linfócitos T, plaquetas e células vermelhas do sangue
teste.
ATSG, ATSM, ATSMX, ATSMD = Controles anti-linfócitos T que são utilizados
para determinar a pureza de linfócitos T. Os controles anti-linfócitos T são anticorpos
monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a linfócitos T, mas sem reatividade
contra granulócitos, linfócitos B, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue
teste. OBS.: ATSMX é o único controle anti-T para ser utilizado com células isoladas
com FluoroBeads T.
ALSG, ALSM = Controle anti-linfócitos totais são usados para determinar a
reatividade do complemento. Este controle é feito com anticorpos monoclonais os
quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos humanos. OBS.: não utilize ALSG como
controle para teste com DTT (Ditiotreitol), pois o DTT irá degradá-lo.
14. Valores de referência obtidos em populações sadias ou valores demográficos,
epidemiológicos, estatísticos, desejáveis, terapêuticos ou tóxicos
Este dado não está disponível para a metodologia em questão.
15. Características de desempenho do produto
A. Potência e especificidade:
13
Reagentes-teste foram precisamente caracterizados por screenings separados
sequenciais sorológicos. Painéis de amostras de referência de linfócitos
congelados foram usados em dois screenings separados.
Dois terços de todos os reagentes selecionados são fortes com reatividade HLA
específica claramente definida (com 70% de índice de força), permitindo não
mais que 10% de reações falso positivas e 15% de reações falso negativas. O
restante um terço de reagentes não vão de encontro com esse critério, mas
são exaustivamente investigados quanto à sua utilidade quando usados para
sustentar outros anticorpos bem-definidos. Anticorpos multiespecíficos são
usados somente se anticorpos não monoespecíficos são disponíveis para uma
especificidade em particular. Anticorpos multiespecíficos foram escolhidos
com o mesmo desempenho característico para todas as especificidades como
o anticorpo monoespecífico. Screening contra um painel de linfócitos frescos
preparados é utilizado para confirmar e validar a força do soro e sua
especificidade. As análises são feitas usando técnicas computadas no Eighth
International Histocompatibility Workshop em 1980. (referência 4).
B. Controle Negativo
O antissoro do controle negativo é originário de um sangue saudável humano
masculino do tipo AB, o qual não possui reatividade citotóxica em testes com
doadores de linfócitos selecionados ao acaso. Este controle é usado para
determinar a viabilidade do linfócito.
C. Controle Positivo:
O controle positivo trata-se de um anticorpo monoclonal com ação
fortemente citotóxico aos linfócitos humanos. Este controle é usado para
determinar a atividade de complemento.
16. Referências Bibliográficas que comprovem ou fundamentem as informações
fornecidas
1. Terasaki PI, Bernoco F, Park MS, Ozturk G, and Iwaki Y. Microdroplet testing
for HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol 69:103-120, 1978.
2. Danilovs J, Terasaki PI, Park MS, Ayoub G. B lymphocyte isolation by thrombin
nylon wool. In Histocompatibility Testing. Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue
Typing Laboratory, Los Angeles, CA 287-288, 1980.
14
3. ASHI Laboratory Manual, 2nd ed. Edited by Zachary, Andrea A. and Teresi,
Gary, p. 199, 1990.
4. Terasaki PI, Ed., Histocompatibility Testing. Los Angeles, CA, 1980.
5. Nikaein A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3rd Edition, ASHI, Lenexa, KS.
17. Identificação do Distribuidor do produto
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR
CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
www.biomertix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
18. Identificação do Fabricante do produto
País de Origem: Estados Unidos da América
Fabricante: One Lambda, Inc.
21001 Kittridge Street
Canoga Park – CA
EUA
19. Registro ANVISA número
80298490001
20. Responsável Técnica
Ana Carolina Martins
CRF/PR: 12700
21. Revisões
Revisão
Descrição da Alteração
Data
00
Elaboração
09/2006
01
Revisão: Formação, layout, produtos descontinuados,
alteração nas condições de armazenagem e
transporte, inclusão das denominações comerciais de
cada item da família, inclusão de número de registro
e alteração de Responsável Técnica.
02/2011
02
Alteração do DDG.
09/2012
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