Nanopartículas de ouro: Uma ferramenta diagnóstica e terapêutica

NANOPARTÍCULAS DE OURO:
UMA FERRAMENTA DIAGNÓSTICA E TERAPÊUTICA
Pryscila Rodrigues da costa1, Anayive Perez-Rebolledo1, Demétrio Abreu Sena Costa1,
Dawidson Assis Gomes2, Michele Angela Rodrigues2, Rogéria Serakides2,
Raquel Gouvêa dos Santos1,3
1
Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, Brasil
2
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil
3
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Medicina Molecular, Belo Horizonte, Brasil
Email: [email protected]
Resumo. Nanopartículas de ouro (AuNp's) possuem um grande potencial como sondas para o diagnóstico e
nanocarreadores de agentes terapêuticos contra o câncer e outras doenças humanas. O interesse pelo
desenvolvimento das AuNp’s deve-se as suas extraordinárias propriedades físicas e químicas resultantes do
efeito de seu tamanho em escala nano e de possuir uma superfície de fácil modificação química. A fim de obter
nanopartículas de ouro biocompatíveis e específicas para tumores que superexpressam receptores de folato,
neste estudo, foram sintetizadas AuNp's funcionalizadas com um polímero biocompatível (polietilenoglicol
modificado) e ácido fólico. Estudos de biocompatibilidade in vitro e in vivo das amostras foram realizados. Foi
avaliada também, a internalização de nanopartículas de ouro funcionalizadas com tiol-PEG-folato-FITC em
células que superexpressam receptores de folato. Os resultados mostraram que foram obtidas AuNp's-tiol-PEGfolato-FITC variando de 7-12 nm e com baixa toxicidade. Verificou-se que estas nanopartículas são capazes de
entrar nas células tumorais que superexpressam receptores de folato distribuindo-se por todo o citoplasma e
núcleo. Pode-se concluir que as AuNp's-tiol-PEG-folato-FITC produzidas foram furtivas e especificas para
tumores que superexpressam receptores de folato.
Palavras-chave: Nanopartículas de ouro, Biocompatibilidade, Citotoxicidade, Internalização
1. INTRODUÇÃO
O câncer é responsável por 13% de todas as mortes ocorridas no mundo e estima-se
que em 2030 esse número será equivalente a 12 milhões (WHO, 2006). Os tratamentos
básicos para o câncer são a cirurgia, quimioterapia e radioterapia, sendo a cirurgia e a
radioterapia consideradas tratamentos locais e a quimioterapia como tratamento sistêmico,
sendo que estes podem ser usados isolados ou associados. Segundo Bonassa (2005), a
quimioterapia é definida como o emprego de substâncias químicas isoladas ou em
combinação com o objetivo de tratar as neoplasias malignas, entretanto, atua sem
especificidade, não destruindo seletivamente e exclusivamente as células tumorais e
conseqüentemente agride as células normais. Os principais efeitos colaterais da quimioterapia
são as toxicidades hematológicas, gastrointestinais, renais, dentre outras.
Para contornar a toxicidade indesejável e tornar as terapias mais efetivas, a idéia da
chamada “bala mágica” surge como uma alternativa interessante na qual uma substância
direcionada ao alvo tumoral é capaz de matar especificamente as células cancerosas sem
causar lesões no tecido saudável (Bhattacharya, Mukherjee, 2008).
A vetorização de fármacos, baseada na teoria de Paul Ehrlich sobre a capacidade de
minúsculas partículas em carrear moléculas ativas aos sítios específicos de ação, tem sido
considerada uma das principais linhas da pesquisa biofarmacêutica das últimas décadas,
fazendo parte de uma grande área que rapidamente emergiu no Brasil e no mundo,
denominada nanotecnologia. É consenso que a utilização de sistemas coloidais
nanoestruturados, tais como os lipossomas, nanoemulsões e as nanopartículas metálicas e
poliméricas, constitui-se uma alternativa que visa alterar a biodistribuição de fármacos após
administração por diferentes vias (Banker, Rhodes, 1996).
Em particular, as nanopartículas de ouro (AuNp’s) têm mostrado grande potencial em
uma variedade de aplicações biológicas, incluindo a utilização de testes de diagnóstico
altamente sensíveis, ablação térmica, transportadores de drogas para a entrega diretamente no
local de ação e radioterapia (Hamoudeh, Kamleh, 2008 ; Hainfeld, Slatikin, Focella, 2006).
Estas possuem propriedades físico-químicas interessantes, e sua síntese data desde trabalhos
pioneiros de Faraday que mostram dispersões aquosas estáveis de nanopartículas de ouro
(hidrosóis). Em paralelo com o desenvolvimento de novos processos experimentais para a
síntese de nanopartículas de ouro em meio aquoso ou orgânico, controle de tamanho,
monodispersibidade e forma, a química relacionada à modificação da superfície também tem
evidenciado considerável interesse.
Trabalhos recentes indicam que nanopartículas de ouro cobertas com polietilenoglicol
(PEG) apresentam uma excelente biodistribuição in vivo e propriedades farmacocinéticas
adequadas para injeção sistêmica (Pooja M. et al, 2011). A peguilação é um dos métodos mais
utilizados para a funcionalização de nanocarreadores. Estes podem ser revestidos somente
com o PEG ou conjugados com diversas moléculas, tais como biotina, péptidos, ácido fólico,
transferrina, facilitando assim, a internalização desses nanocarreadores para as células alvo.
Diante do exposto, pode-se considerar que os nanocarreadores e, em particular, as
nanopartículas de ouro, são compostos bastante promissores para o tratamento e diagnóstico
de doenças, dentre elas, o câncer.
O presente estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade in vitro, in vivo e a eficácia
de internalização celular de nanopartículas de ouro, previamente sintetizadas pelo grupo, as
quais apresentaram tamanhos entre 7-12 nm. (Perez-Rebolledo A. et al, 2012). Essas
nanopartículas foram funcionalizadas com um polímero biocompatível (polietilenoglicol
modificado) e ácido fólico que possui alta afinidade por receptores que estão superexpressos
em alguns tipos de tumores.
2.
MATERIAIS E MÉTODOS
2.1
Ensaios pré-clínicos in vitro e in vivo para avaliar a toxicidade das Nanopartículas
de ouro
2.1.1 Células
As linhagens utilizadas foram de Fibroblastos de pulmão humano (MRC5) e
carcinoma cervical humano (HELA).
2.1.2 Cultivo celular
Todas as células foram cultivadas em estufa de CO2 (5% CO2 - Cole Parmer) com
atmosfera úmida à 37ºC, em meio Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM) suplementado com
10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (meio DMEM completo).
Ao atingirem 80% de confluência, as células foram tripsinizadas e a viabilidade celular
avaliada.
2.1.3 Análise da citotoxicidade in vitro das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato em células sadias
A análise da citotoxicidade, in vitro, das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato foi realizada
através do ensaio de MTT, seguindo metodologia padronizada no nosso laboratório.
Quantidades pré definidas das células de fibroblastos de pulmão humano (MRC5) foram
expostas a diferentes concentrações de AuNP’s-Tiol-PEG-Folato (10µM a 50µM) por
diferentes tempos (24, 48 e 72 horas). As amostras foram medidas por espectrofotometria em
um leitor de microplaca UV-visível (Molecular Devices) a 570 nm. A fração de sobrevivência
foi calculada como porcentagem do controle (Absorbância no controle =100% de
sobrevivência).
2.1.4 Análise das alterações morfológicas
Para análises morfológicas das células foi utilizando Microscópio Óptico Invertido
Nikon. Estas análises foram realizadas em conjunto com os testes de citototoxidade, onde, as
culturas foram fotografadas para registros de possíveis alterações na morfologia celular, sendo
as imagens adquiridas com Câmera Digital Nikon Coolpix 4500 utilizando contraste de fase.
2.1.5 Análise da toxicidade in vivo das nanopartículas de ouro
2.1.6 Animais
Para os estudos de toxicidade in vivo, os camundongos Swiss foram obtidos no Centro
de bioterismo (CEBIO) do ICB/UFMG e foram manipulados de acordo com as normas
internacionais descritas no Manual sobre os cuidados no uso de animais de laboratório
(Institute of Laboratory Animal Resources – Comission on Life Sciences – National Research
Council – Washington D.C.), como recomendado pelo SBCAL (Sociedade Brasilerira em
Ciência de Animais de Laboratório). Os estudos também foram realizados de acordo com
protocolo105/2008 aprovado junto ao Comitê de ética em experimentação animal da UFMGCETEA-UFMG.
2.1.7 Análise Histopatológica
Para a análise histológica foram avaliados cortes de tecidos, com cerca de 5µm de
espessura, com o objetivo de verificar possíveis alterações provocadas pelas nanopartículas de
ouro funcionalizadas com Tiol-PEG-Folato.
Os animais do grupo tratado (n=3) receberam 200µL (51,6 µg AuNp’s/Kg de animal),
via endovenosa, caudal. Os animais do grupo controle (n=2) foram tratados com 200µl de
salina 0,9%. A coleta dos órgãos foi realizada 48 horas e 14 dias após a administração das
nanopartículas de ouro. Imediatamente após a coleta, os órgãos foram imersos em solução de
formol 10% e encaminhados para a confecção das lâminas. As lâminas foram coradas com os
corantes Hematoxilina e eosina. Os cortes histológicos foram fotografados utilizando-se
câmara da marca Sony, acoplada ao microscópio, em aumento final de 100x.
2.1.8 Análise da internalização das AuNP-Tiol-PEG-Folato-FITC
Células Hela, as quais superexpressam receptores de folato, foram adicionadas na
densidade de 2x105 células/mL em placas de 35 mm sobre lamínulas de 22 x 22 mm.
As células foram incubadas com AuNp’s-Tiol-PEG-Folato-FITC (530 µM) por 6h.
Para a visualização dos núcleos, as células foram incubadas com uma solução Hoechst (Life
Technologies). Controles negativos foram incubados apenas com FITC.
As imagens foram obtidas em microscópio confocal Zeiss 5 Live usando a objetiva de
imersão a óleo com aumento de 63X (1,4 AN). Foi utilizado o laser argon 488 nm para excitar
o FITC, e a emissão foi coletada entre 505 e 530 nm. Para o Hoechst foi utilizado o laser de
405 nm para excitação e a emissão foi coletada entre 420 a 480 nm. As imagens foram
adquiridas mantendo-se a íris com valores de aproximadamente uma unidade de Airy.
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Ensaios pré-clínicos in vitro e in vivo para avaliar a toxicidade das Nanopartículas
de ouro
3.1.1 Análise da citotoxicidade in vitro das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato em células sadias
% de sobrevivência
Os resultados obtidos mostraram que as AuNP’s-Tiol-PEG-Folato são muito pouco
tóxicas, sendo que a maior concentração testada (50µM) apresentou 75% (fig.2). Pode-se
observar também que a toxicidade não se altera de forma significativa com o passar do tempo.
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24h
48h
72h
0
10
18
35
50
Concentração (µM)
Figura 2- Efeito citotóxico,em diferentes concentrações e tempo, das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato sobre células
MRC5.
3.1.2 Análise das alterações morfológicas
As células MRC5, submetidas ao tratamento com de AuNp’s-tiol-PEG-Folato foram
visualizadas e fotografadas. A morfologia das células tratadas com 35µM da solução de
nanopartículas de ouro, nos tempos de 24, 48 e 72 horas, foi ilustrada na fig.3. Pode-se
observar que as células testadas apresentaram características (número de células,
diferenciação, volume citoplasmático) comparáveis com as do controle.
Controle
AuNp’s-Tiol-PEG-Folato
24 horas
48 horas
72 horas
Figura 3: Fotomicrografias ópticas das análises morfológica da célula MRC5 tratadas com AuNp’s-Tiol-PEGFolato (35 µM), nos tempos de 24,78 e 72 horas. Imagens adquiridas em câmera fotográfica digital, modelo
Nikon Coolpix 4500, acoplada ao M.O.(aumento 200x).
3.1.3 Análise Histopatológica
Os cortes histológicos do fígado, rins, encéfalo, pulmão, intestino delgado, tecido
muscular, coração, baço, pâncreas, bexiga e osso dos animais tratados revelaram arquitetura e
morfologia celular normal. Na fig.4, observa-se a fotomicrografias de alguns órgãos
selecionados (fígado, rins, pulmão, encéfalo) nos tempos de 48h e 14 dias após a
administração de AuNp’s-Tiol-PEG-Folato.
Figura 4- Fotomicrografias das análises histopatológicas do fígado (A), rim (B), pulmão (C) e cérebro (D) dos
animais do grupo tratado com AuNp’s-Tiol-PEG-Folato, após 48 horas e 14 dias de tratamento. Imagens
adquiridas em câmera fotográfica digital, modelo Nikon Coolpix 4500, acoplada ao M.O.(aumento 400x).
3.1.4 Análise da internalização das AuNP-Tiol-PEG-Folato-FITC
Observa-se na fig.5 que as células Hela, incubadas com AuNp’s-Tiol-PEG-FolatoFITC (2-A) apresentaram forte sinal fluorescente no citoplasma e núcleo. No entanto, células
Hela incubadas com a mesma concentração de FITC livre (1-A) apresentou sinal fluorescente
muito fraco. Na fig.6, observa-se a superposição da imagem coletada para a visualização das
AuNp’s-Tiol-PEG-Folato-FITC com a imagem realizada para a visualização do núcleo. Nessa
imagem, pode-se verificar que as nanopartículas, após o processo de internalização, se
distribuiram no citoplasma e foram capazes de penetrar no núcleo celular.
Figura 5- Análise da internalização das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato-FITC no meio intracelular. No campo 1-A
observam-se as células Hela tratadas com o controle FITC livre; no 2-A observam-se as células tratadas com as
nanopartículas fluorescentes. No campo A, a emissão foi coletada entre 505 e 530 nm para a visualização da
fluorescência do controle de FITC e das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato-FITC. Nos campos B-1 e B-2, a emissão foi
coletada entre 420 a 480 nm para a visualização dos núcleos corados com Hoescht. No campo C-1 e C-2, as
células foram visualizadas em campo claro do microscópio.
Figura 6- Superposição da imagem coletada para a visualização das AuNp’s-Tiol-PEG-Folato-FITC e da
imagem realizada para visualização do núcleo. Observa-se que as nanopartículas foram capazes de penetrar nas
células se distribuindo pelo citoplasma e núcleo .
Em suma, os resultados obtidos indicam que foram produzidas AuNp’s-Tiol-PEGFolato biocompatíveis tanto in vitro quanto in vivo. Estas nanopartículas têm a propriedade de
serem específicas para tumores que superexpressam receptores de folato e foram
internalizadas por estas células se distribuindo no citoplasma e núcleo, como demonstrado
pelas AuNp’s-Tiol-PEG-Folato-FITC.
4.
CONCLUSÕES
Pode-se concluir que as AuNp’s-Tiol-PEG-Folato avaliadas neste trabalho foram
biocompatíveis e específicas para tumores que superexpressam receptores de folato. Estes
dados apontam a potencial aplicação destas AuNp’s como nanocarreadores de substâncias
para o interior celular, podendo ser usadas tanto para entrega de droga no citoplasma quanto
no núcleo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o suporte financeiro dos órgãos de fomento CNEN, CAPES, CNPQ,
FAPEMIG e ao INCT-MM.
REFERÊNCIAS
Banker, S. G.; Rhodes, C. T. Modern pharmaceutics. (1996), “New York: Marcel Dekker”.
Bhattacharya, R., Mukherjee, P.(2008), “Biological propreties of “naked”metal nanoparticles.”Adv. Drug
Deliver. Rev.v.60, p. 1289-1306.
Bonassa, E.M.A. (2005), “Conceitos gerais de quimioterápicos antineoplásicos”. Enfermagem em terapêutica
oncológica. 3° ed.Atheneu. 3p.
Hainfeld, J.F.; D N Slatikin.; T M Focella.; H M Smilowitz (2006), “Gold nanoparticles: a new X-Ray contrast
agent”; The British Journal of Radiology 79, 248-253.
Hamoudeu, M.; Kamleh, M. A.; Diab, R.; Fessi, H.( 2008), Adv. Drug Deliv. Rev.
Perez-Rebolledo, A.,et.al. (2012), “Síntese de Nanopartículas de Ouro e sua funcionalização com Tiol-PEGFolato”, 35a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, São Paulo.
Pooja M. Tiwari.; Komal Vig.; Vida A. Dennis and Shree R. Singh(2011), Functionalized Gold Nanoparticles
and Their Biomedical Applications; Nanomaterials, 1, 31-63.
World Health Organization, (2006).
Gold nanoparticles:
A diagnostic and therapeutic tool
Pryscila Rodrigues da costa1, Anayive Perez-Rebolledo1, Demétrio Abreu Sena Costa1,
Dawidson Assis Gomes2, Michele Angela Rodrigues2, Rogéria Serakides2,
Raquel Gouvêa dos Santos1,3
1
CDTN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, Brasil
2
UFMG- Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte
IMCT-MM - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Medicina Molecular
Email: [email protected]
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Gold nanoparticles (AuNp's) have immense potential as platforms for building imaging and
therapeutic agents against cancer and other human diseases. The interest in the development
of AuNp's is due to their extraordinary physical and chemical properties resulting from the
effect of its size in the nanoscale, in addition of their surface chemistry easy to modify. In
order to obtain biocompatible gold nanoparticles and specific for tumors that overexpress
folate receptors, in this study were synthesized AuNp's functionalized with a biocompatible
polymer (thiol-modified poly (ethylene) glycol) and folic acid. Biocompatibility studies in
vitro and in vivo of the samples were carried out. The internalization of functionalized gold
nanoparticles with Thiol-PEG-Folate-FITC in cells overexpressing folate receptors was
evaluated. Results showed that AuNp's-Thiol-PEG-Folate-FITC ranging from 7-12 nm were
successfully obtained with low toxicity. It was found that these nanoparticles are able to enter
the tumor cell overexpressing folate receptors and distributed throughout the cytoplasm and
nucleus. It can be concluded that it was produced AuNp's-Thiol-PEG-Folate-FITC dispersed
stealth and specific for tumors that overexpressed the folate receptor.
Keywords: Gold nanoparticles, biocompatibility, cytotoxicity, internalization