Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no - pgbioexp

Universidade Federal de Rondônia - UNIR
Centro de Pesquisas em Medicina Tropical - CEPEM
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO
Unidade Laboratorial de Virologia
Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia
Glauciane da Silva Bifano Tavares
Porto Velho - RO
2009
Universidade Federal de Rondônia - UNIR
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical - CEPEM
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO
Unidade Laboratorial de Virologia
Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia
Orientado(a): Glauciane da Silva Bifano Tavares
Orientador: Dr. Weber Cheli Batista
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação,
Núcleo
de
Saúde
da
Universidade Federal de Rondônia, como
requisito para obtenção do grau de mestre
em
Biologia
Experimental.
Área
Concentração: Patógeno/ Hospedeiro.
Apoio: Centro de Pesquisas em Medicina Tropical - CEPEM;
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO;
Porto Velho - RO
2009
de
FICHA CATALOGRÁFICA
Tavares, Glauciane da Silva Bifano
Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia/
Tavares, Glauciane da Silva Bifano
Porto Velho:2009
77 fls.
Dissertação (Mestrado) - Fundação Universidade Federal de Rondônia - UNIR.
Porto Velho - RO, 2009.
Área de concentração: Patógeno/ Hospedeiro
Orientador: Dr. Weber Cheli Batista
Palavras chaves dengue, RT-PCR, sequenciamento, genótipos, filogenia
Universidade Federal de Rondônia - UNIR
Centro de Pesquisas em Medicina Tropical - CEPEM
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO
Unidade Laboratorial de Virologia
Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia
Glauciane da Silva Bifano Tavares
Porto Velho - RO
2009
AGRADECIMENTOS
Ao meu Senhor Deus, que me deu o dom da vida, os dias e as noites, tendo
cada dia como um presente, me dando forças e coragem nessa caminhada.
A meus pais que mesmo distantes estiveram sempre presentes com palavras
de incentivos, amor e carinho.
Aos tios Luis Augusto, Maria Marta e prima Glauce Anne que me deram a
oportunidade para lutar pelos meus ideais e chegar até aqui.
Ao meu esposo Alcy Tavares, que de forma incondicional esteve ao meu lado,
me ensinando a ser tolerante e paciente, sempre me dando palavras de incentivos.
Aos meus sogros Hélia, Jorge, sobrinhos Cristine, Antonio, cunhados Julia e
Neto, por me acolherem tão bem quando eu mais precisei.
A minha amiga Danielle por sempre me incentivar.
Aos meus colegas de laboratório pelo aprendizado e companheirismo.
A aluna de iniciação científica Maiara, por sempre estar dispostas a me ajudar
na bancada com os experimentos.
A Marlucia (Kiki), Dona Nair, Adair e Antônio que sempre estiveram dispostos
a ajudar e facilitar a parte técnica, dando suporte para nossos experimentos.
Ao Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais- IPEPATRO e ao
Laboratório de Virologia - CEPEM.
As secretárias do CEPEM/IPEPATRO e todos aqueles que estiveram ao meu
lado, ajudando diretamente e indiretamente para a finalização desta etapa tão
importante da minha vida.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Prof. Luiz Hildebrando Pereira da Silva que possibilitou conhecer a
pesquisa, sendo exemplo de dedicação.
Ao Dr. Weber Cheli Batista, que abriu as portas do laboratório de
virologia, com todo o suporte para desenvolvimento e conclusão experimental
deste trabalho.
Ao Doutorando Christian Julián Villabona do Laboratório de Evolução
Molecular e Bioinformática da USP, por ter dado grande contribuição com as
análises filogenéticas.
A Msc. Deusilene Souza Vieira que forneceu ensinamentos científicos
nos meus primeiros passos dentro da prática laboratorial.
A Msc. Joana D´Arc e ao Biólogo Francisco que estiveram ao meu lado
quando precisei, com palavras de incentivos.
Aos Laboratórios de Epidemiologia Molecular, Plataforma Técnica de
Hepatites - CEPEM/IPEPATRO, e Dr. Eduardo Rezende Honda que me deram
suporte para clonagem das amostras.
MUITO OBRIGADA!
Índice
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Abreviaturas
Resumo
Abstract
1- Introdução
1.1- Dengue. .................................................................................................. 20
1.2- Histórico do Dengue. .............................................................................. 21
1.2.1- Dengue no Brasil. ................................................................................ 22
1.2.2- Dengue no Estado de Rondônia. ........................................................ 23
1.3- Morfologia e Genoma do vírus dengue. ................................................. 24
1.4- Diagnóstico Laboratorial. ........................................................................ 26
1.4.1- Diagnósticos Sorológicos. ................................................................... 26
1.4.2- Isolamento Viral. .................................................................................. 26
1.4.3- Diagnósticos Moleculares.................................................................... 27
1.5- Sequenciamento Viral ............................................................................ 28
2- Objetivos
2.1- Objetivo Geral......................................................................................... 31
2.2.2- Objetivos Específicos. ......................................................................... 31
3- Material e Métodos
3.1- Cadastro pessoal, coleta de dados clínicos e epidemiológicos. ............ 33
3.2- Amostra biológicas. ................................................................................ 33
3.3- Isolamento viral. ..................................................................................... 33
3.4- Extração do RNA Viral............................................................................ 34
3.5- Transcrição Reversa e Reação da Polimerase em Cadeia (RT-PCR) .. 35
3.5.1- Confecção do cDNA. ........................................................................... 35
3.5.2- PCR. .................................................................................................... 35
3.5.2.1- Primers D1 e D2. .............................................................................. 35
3.5.2.2- Primers DEN2-S e DEN2-C.............................................................. 36
3.5.3- Eletroforese dos Produtos da PCR. .................................................... 37
3.5.3.1- Gel de Agarose 1,5%.. ..................................................................... 37
3.5.4- Hemi-nested-PCR. .............................................................................. 38
3.5.4.1- Eletroforese do Produto da Hemi-nested-PCR. ............................... 39
3.5.4.2- Gel de Agarose 2,0%.. ..................................................................... 39
3.6- Clonagem. .............................................................................................. 39
3.6.1- Purificação dos amplicons para clonagen.. ......................................... 39
3.6.1.1- Confirmação da Purificação. ............................................................ 39
3.6.2- Ligação em vetor de clonagem. .......................................................... 40
3.6.3- Preparo de bactérias competentes...................................................... 40
3.6.4- Transformação Bacteriana. ................................................................. 41
3.6.5-.Extração do DNA Plasmidial. .............................................................. 41
3.6.6- Digestão do vetor ................................................................................ 42
3.6.7-.Sequenciamento ................................................................................. 42
3.7-.Análise das Sequências ......................................................................... 43
3.7.1- BLAST. ................................................................................................ 43
3.7.2- Árvore Filogenética.............................................................................. 43
4- Resultados
4.1- Isolamento viral. ..................................................................................... 45
4.1.1- Em células C6/36. ............................................................................... 45
4.2- RT-PCR. ................................................................................................. 45
4.2.1- Primers D1 e D2. ................................................................................. 45
4.2.3-.Primers TS1, TS2, TS3 e TS4 ............................................................. 46
4.2.4- Primers DEN2-C e DEN2-S................................................................. 47
4.3-.Clonagem dos fragmentos ..................................................................... 48
4.3.1-.Purificação dos fragmentos de DNA amplificados .............................. 48
4.3.2- Ligação do fragmento ao vetor. ........................................................... 49
4.3.3- Confirmação da clonagem................................................................... 49
4.4- Sequenciamento..................................................................................... 50
4.5- Árvore Filogenética................................................................................. 50
4.5.1- Genotipagem DENV-2 e DENV-3........................................................ 51
5- Discussão..................................................................................................... 57
6- Conclusões. ................................................................................................. 62
7- Referências .................................................................................................. 64
8- Anexo
8.1- Anexo I. .................................................................................................. 77
Lista de Figuras
Figura 1: Mapa do Estado de Rondônia. ........................................................... 24
Figura 2: Representação esquemática do vírus do dengue. ............................. 24
Figura 3: Genoma do dengue ............................................................................ 25
Figura 4: Monocamada de células C6/36, ......................................................... 34
Figura 5: Local de anelamento dos primers D1/D2 ........................................... 36
Figura 6: Local de anelamento dos primers DEN2-S/ DEN2-C ......................... 37
Figura 7: Representação Esquemática Vetor de Clonagem pDrive ................. 40
Figura 8: Modelo esquemático do vetor de clonagem após transformação ...... 42
Figura 9: Monocamada de células C6/36 não infectada A e infectada B .......... 45
Figura10 : Amplificação da RT-PCR com primers D1/D2.................................. 46
Figura 11: Amplificação da Hemi-nested-PCR .................................................. 46
Figura 12: Amplificação RT-PCR com primers DEN2-S/DEN2-C ..................... 47
Figura 13: Purificação dos amplicons ................................................................ 48
Figura 14: Ligação do inserto ao vetor de clonagem......................................... 49
Figura 15: Digestão enzimática ......................................................................... 50
Figura 16a: Árvore filogenética dos vírus dengue 1 a 4 .................................... 52
Figura 16b: Árvore filogenética dengue-3.......................................................... 53
Figura 16c: Árvore filogenética dengue-2 .......................................................... 54
Lista de Tabelas
Tabela 1: Distribuição de amostras analisadas nos municípios de Rondônia... 33
Tabela 2: Descrição das sequências dos primers D1/D2 .................................. 36
Tabela 3: Descrição das sequências dos primers DEN2-S/ DEN2-C ............... 37
Tabela 4: Descrições das sequências dos primers TS1 a TS4 ......................... 38
Tabela 5: Resultado da identificação do vírus dengue em Rondônia ............... 48
Tabela 6: Dados dos vírus dengue 2 e 3 isolados em Rondônia ...................... 55
Lista de Abreviaturas
AcK: Acetato de Potássio
Amp: Ampicilina
BOD: Biochemical Oxygen Demand
C-: Controle Negativo
C: Proteína Estrutural do capsídeo do vírus dengue
C+: Controle Positivo
C6/36: Célula de mosquito Aedes albopictus
CaCl2: Cloreto de cálcio
cDNA: DNA complementar
CEPEM: Centro de Pesquisa em Medicina Tropical
DENV- 1: Vírus da dengue sorotipo 1.
DENV- 2: Vírus da dengue sorotipo 2.
DENV- 3: Vírus da dengue sorotipo 3.
DENV- 4: Vírus da dengue sorotipo 4.
DENV: Vírus dengue
DMSO: DimetIl sulfoxido
DNA: Àcido desoxiribonucléico
dNTPs: Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
DO: Densidade óptica.
DTT: Ditiotreitol.
E. coli: Escherichia coli
E: Proteína estrutural de envelope do vírus dengue
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
EUA: Estados Unidos da América
FC: Fixação do Complemento
FD: Febre do Dengue
FHD: Febre hemorrágica da dengue
GI: Genótipo I
GII: Genótipo II
GIII: Genótipo III
GIV: Genótipo IV
GV: Genótipo V
GARLI: Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference
GenBank: Banco de Dados
GTR: General Time Reversible
HI: Inibição de hemaglutinação
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IFI: Imunofluorescência Indireta
IgG: Imunoglobulina da classe G
IgM: Imunoglobulina da classe M
IPEPATRO: Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais
IPTG: Tio β-galoctopiranosídeos de isopropila
Kb: kilobases
KCl: Clorete de Potássio
kDa: kilodaltons
L-15: Leibowitz-15
LB: Luria Bertani
M: Proteína Estrutural de Membrana do vírus dengue
MgCl2: Cloreto de Magnésio
MnCl2: Cloreto de Manganês
NS1: Proteína não Estrutural do vírus dengue
NS2a: Proteína não Estrutural do vírus dengue
NS2b: Proteína não Estrutural do vírus dengue
NS3: Proteína não Estrutural do vírus dengue
NS4a: Proteína não Estrutural do vírus dengue
NS4b: Proteína não Estrutural do vírus dengue
NS5: Proteína não Estrutural do vírus dengue
OMS: Organização Mundial de Saúde
ORF: Cadeia aberta de leitura
PAHO: Organização Pan-Americana de Saúde
PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony
Pb: Pares de base
PCR: Reação em cadeia da polimerase
Pd(N)6: “Primer” randômico
pH: Potencial hidrogeniônico
prM: Proteína Precursora de Membrana
PVH: Porto Velho
q.s.p: Quantidade suficiente para o volume
RNA: Ácido ribonucléico
RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa.
SCD: Síndrome de choque do dengue
SVS: Secretaria de Vigilância em Saúde
TA: Temperatura ambiente
TAE: Tris-acetato-EDTA
Tetra: Tetraciclina
TN: Teste de neutralização
U: Unidades
UV: Ultra violeta
V: Volume
WM: Marcador de peso molecular
X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosideo
YFV: Vírus da Febre Amarela
Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia
Unidade Laboratorial de Virologia, Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Porto
Velho, Rodovia BR-364, 78910-210 Porto Velho- Rondônia, Brasil.
RESUMO
O dengue, pertencente ao gênero Flavivirus, é considerado a arbovirose
de maior incidência e prevalência, constituindo um grave problema de saúde
pública em regiões tropicais e subtropicais, afetando o homem tanto em termos
de morbidade quanto em mortalidade, ocorre associado aos aspectos
epidemiológicos característico das áreas tropicais, na qual as condições do
ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do vetor. Esse trabalho
teve como objetivo desenvolver um estudo filogenético molecular dos sorotipos
2 e 3 do vírus dengue, determinando os genótipos circulantes no estado de
Rondônia entre 2002 a 2006. Foram analisadas 190 amostras sobrenadantes
de cultura celular C6/36 infectadas com o vírus dengue isolados do soro de
pacientes dos municípios: Porto Velho, Ariquemes, Cacoal, Colorado D’ Oeste,
Jarú, Ouro Preto D’ Oeste e Vilhena. As amostras foram submetidas à extração
do RNA viral, seguido da amplificação dos genes C/prM e E através da
metodologia da RT-PCR utilizando dois pares de primers diferentes: D1/D2
seguido de Hemi-nested-PCR (Lanciotti et al., 1992) e DEN2-S/DEN2-C
(Figueiredo et al., 1997), para confirmação do sorotipo viral. Os produtos foram
clonados. As sequências obtidas foram analisadas através de programas
(Garli/Paup) para obtenção de árvores filogenéticas. Das 190, somente 80
amostras foram identificadas como DENV, sendo 79 identificadas como DENV3 e apenas uma como DENV-2. Em seguida 15 amostras foram clonadas e
seis sequenciadas, e classificadas em DENV-3 genótipos III e V, DENV-2
genótipo Américo/Asiático. O genótipo III do DENV-3 formou um ramo, onde os
clados mostraram vírus de origem asiática, leste da África e América do Sul e
Central, o genótipo V formou um ramo onde os clados mostraram vírus de
origem das Américas, sul do Pacífico e Ásia. O DENV-2 genótipo
Américo/Asiático formou um ramo, onde os clados se apresentam com vírus de
origem das Américas e Ásia. Em conclusão, foram encontrados os genótipos III
e V DENV-3 e genótipo Américo/Asiático DENV-2, e o estudo filogenético provê
uma evidência da circulação do vírus dengue dentro do estado de Rondônia,
vindo de outras áreas do Brasil ou até mesmo de outros países.
Palavras-chave: dengue, RT-PCR, sequenciamento, genótipos, filogenia.
Phylogenetic analysis of Dengue 1 and 2 virus in the state or Rondônia
Virology Lab.Unit. Tropical Medicine Research Center of Porto Velho, Rodovia 364,
78910-210 Porto Velho – Rondônia, Brazil.
ABSTRACT
The dengue, which belongs to the Flavivirus gender, is considered the
most current and frequent arbovirose, causing a huge public health problem in
tropical and subtropical regions, affecting man not only in terms of morbity but
also in mortality, it occurs associated with epidemiologic aspects in tropical
areas, in which the environmental conditions are perfect to develop and spread
the vetor. The objective of this work was to develop a molecular phylogenetic
study of the serum 1 and 2 of the Dengue virus, determining the circulating
genotype in the state of Rondônia between 2002 and 2006. It was analysed 190
samples of cellular culture of C6/36 infected with dengue virus isolated from the
serum of the patient in Porto Velho, Ariquemes, Cacoal, Colorado do Oeste,
Jaru, Ouro Preto do Oeste and Vilhena counties. The samples were
subordinated to the extraction of the viral RNA, fallowed by the amplification of
the part of the gene C/PrM and E through the methodology of RT-PCR
(Lanciotti et al, 1992) and DEN2-S/DEN2-C (Figueiredo et al, 1997), for the viral
type confirmation. The products were cloned. The obtained sequences were
analysed by programs (Garli/Paup) to acquire phylogenetic trees. From 190 just
80 samples were mapped as DENV, being 79 mapped as DENV-3 and only one
as DENV-2. After that 15 samples had beem clanadas and to sequence, and
classified in DENV-3 genotype III and V, DENV-2 genotype American/Asian.
The genotype III DENV-3 formed a branch where the clades showed virus from
Asia, East Africa, also Central and South America. The genotype V formed a
branch where the clades had shown virus originated from South America, South
Pacific and Asia. The genotype Americ/Asiatic DENV-2 formed a branch of
clades where has shown virus of America and Asia origin. In conclusion, the
genotypes III and V DENV-3 and genotype Américan/Asian DENV-2 had been
found, and the phylogenetic study provides an evidence of the dengue virus
circulation inside the state of Rondônia, coming from other areas and even
other countries.
Key Words: Dengue, RT-PCR, Sequence, genotype, phylogeny.
1- INTRODUÇÃO
1.1- Dengue
A dengue é considerada a arbovirose de maior incidência e prevalência,
constituindo um grave problema de saúde pública em regiões tropicais e
subtropicais, afetando o homem tanto em termos de morbidade quanto em
mortalidade (Halstead, 1990, Monath, 1994). Atualmente, a febre do dengue e
suas formas mais graves, mostram expansiva distribuição geográfica e
atividade epidêmica. Apresenta-se como uma doença febril aguda, de etiologia
viral, transmitida ao homem pela picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti.
O vírus do dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivírus (
Westaway et al.,1985, Gubler, 1987, Ruggli & Rice, 1999).
Os DENV são classificados em quatro sorotipos específicos, devido suas
características antigênicas: dengue sorotipo 1 (DENV-1), dengue sorotipo 2
(DENV-2), dengue sorotipo 3 (DENV-3) e dengue sorotipo 4 (DENV-4)
(Scherer, 1968 apud Focaccia & Veronesi, 2002). Cada um desses sorotipos
possui genótipos que diferenciam entre si por variações na sequência de
nucleotídeos, em nível de genes da glicoproteína E, e da junção dessa
glicoproteína com a proteína NS1 (Calisher et al., 1989)
A infecção com qualquer um dos quatro sorotipos varia desde
assintomáticas, levando a uma doença febril, podendo apresentar sintomas
leves e moderados, conhecida como febre do dengue (FD), ou dengue clássico
que pode comportar-se como uma síndrome viral inespecífica e benigna. As
infecções podem evoluir para quadros mais graves ou até mesmo fatais, com o
aparecimento de hemorragias, febre hemorrágica do dengue (FHD) ou
síndrome choque do dengue (SCD) (Halstead, 1989, Gluber, 1998).
Uma infecção primária com qualquer um dos sorotipos do DENV confere
proteção parcial e temporária contra os outros sorotipos, sendo possível
ocorrência de infecções secundárias ou sequenciais. Frequentemente se
associa a gravidade da doença a infecções secundárias heterotípicas do
dengue (Rothman & Ennis, 1999). Acredita-se que infecções secundárias ou
múltiplas pelo DENV são um dos principais fatores de risco para evolução da
FHD/SCD, além de outros fatores que podem influenciar como: virulência da
cepa viral; características genéticas do hospedeiro; além do estado
imunológico do paciente (Rosen, 1977, Gubler et al.,1978, Bravo et al., 1987).
Clinicamente, as formas mais graves da dengue, a FHD/SCD, são de difícil
diagnóstico, podendo ser confundidas com outras doenças caracterizadas por
distúrbios da permeabilidade capilar (Henchal & Putnak, 1990). No entanto, o
processo fisiopatológico para o desenvolvimento da FHD/SCD da dengue ainda
não foi totalmente esclarecido (Rothman, 2004, Guzman & Kouri, 2008).
1.2- Histórico do Dengue
As primeiras descrições e registros de epidemias compatíveis com
dengue datam de aproximadamente 1779-1780, na Ásia, África e América do
Norte ( Siler et al., 1926, apud Boletim Epidemiológico, PAHO, 1997). A
primeira descrição clínica da dengue foi feita por Benjamin Rush em 1780, na
Philadelphia- EUA, embora se suspeite que o DENV venha causando
epidemias há vários séculos. Em 1906, Bancroft descreveu que a transmissão
do DENV era feita pelo mesmo vetor da febre amarela, o mosquito Aedes
aegypti. A partir de 1954, Hammon et al., descreveram uma nova manifestação
clínica causada pelo DENV, caracterizada por hemorragia generalizada e
estado de choque (Figueiredo & Fonseca, 1996).
O DENV foi isolado pela primeira vez na década de 40 no Japão, a cepa
isolada foi de dengue sorotipo 1 sendo então considerada a cepa padrão e
denominada de Mochizuki (Hotta & Kimura, 2001, Zulkarnain et al., 1994). No
ano de 1945, duas outras cepas de DENV foram isoladas, no Havaí e em Nova
Guiné, observando a presença de características antigênicas distintas, levando
a conclusão de que havia mais de um sorotipo (Sabin, 2002, Martinez-Torres,
1990).
Em 1968, Scherer sugeriu ao comitê da Organização Mundial de Saúde
(OMS) a classificação do DENV de acordo com suas características
antigênicas, sendo assim, as cepas isoladas do Japão e Havai, foram
classificadas em DENV sorotipo 1, de Nova Guiné em DENV sorotipo 2 e os
isolados do sudeste asiático como DENV sorotipo 3 e 4 (Scherer, 1968 apud
Veronesi, R. and Focaccia, R. Tratado de Infectologia, 2002).
Na década de 50, a Organização Pan-americana de Saúde (PAHO,
1997), estabeleceu uma campanha para erradicar o Aedes aegypti, resultando
na erradicação do ciclo viral na América Central e do Sul. Porém, os sorotipos
DENV-2 e DENV-3 permaneceram circulando em algumas ilhas do Caribe
durante esse período, resultando em uma mudança de perfil clínico e
epidemiológico da doença (Gubler e Clark, 1995).
A primeira epidemia de febre hemorrágica ocorreu entre os anos de
1953 e 1954, nas Filipinas e Tailândia, expandindo-se para vários países
asiáticos, ilhas do sul do Pacífico e nas Américas (Hammon et al., 2002).
Na década de 70, o problema de epidemias do DENV agravou-se
particularmente nos países tropicais de todos os continentes. A primeira
epidemia de FHD/SCD descritas nas Américas, onde foi isolado DENV-2
acorreu nos anos 80, em Cuba (Kouri et.al., 1986). A severidade da doença foi
associada à circulação do sorotipo DENV-2 de origem asiática (Rico-Hesse.,
1990, Guzman et al., 1995). A FHD foi registrada na Venezuela em 1989, e em
seguida foi notificado em outros países da América do Sul, simultaneamente
com a introdução do DENV-3 que não havia sido notificado nas Américas
desde 1977. A FHD não havia sido diagnosticada na América Central até o ano
de 1994 (Gubler & Clark.,1995).
Na década de 90, epidemias de dengue clássica e/ou FHD/SCD foram
descritas em vários centros urbanos, afetando cerca de 25 países do
continente americano (Pinheiro & Corber, 1997). Em 1994, registrou-se a reintrodução do sorotipo 3 que ocorreu simultaneamente no Panamá e
Nicarágua, causando uma epidemia grave de dengue hemorrágico (Guzman et
al., 1996, Harris et al., 1999), e em 1995, no México (PAHO, 1997).
1.2.1- Dengue no Brasil
A primeira epidemia do vírus dengue com confirmação laboratorial
aconteceu em 1982, na cidade de Boa Vista, capital do Estado de Roraima,
onde foram isolados DENV-1 e DENV-4. Estes agentes estavam circulando em
diversos países do Caribe, no norte da América do Sul e sua introdução,
possivelmente, ocorreu por via terrestre, pela fronteira da Venezuela (Osanai et
al.,1986).
Na década de 80 a dengue tornou-se um problema de saúde pública
nacional quando houve a dispersão do DENV-1 por diversos estados do país,
sendo introduzido na cidade de Nova Iguaçu-RJ (Schatzmayr et al., 1986). A
situação da dengue foi agravada pela introdução do DENV-2 no estado do Rio
de Janeiro no ano de 1990, que resultou no aparecimento das formas mais
graves da doença (Nogueira et al., 1990). No período compreendido entre 1986
e 1993, as epidemias atingiram mais os grandes centros urbanos, porém, a
ausência de uma política nacional eficaz de combate ao vetor resultou na
rápida dispersão do vírus pelo país e, consequentemente, na ocorrência de
epidemias em diversos Estados (Boletim Epidemiológico- Fundação Nacional
de Saúde, Ministério da Saúde, 1999)
O DENV-3 foi introduzido no Brasil em 1998, oriundo de casos
importados em São Paulo e se disseminou por todo país de forma rápida e
desde então várias epidemias vêm ocorrendo simultaneamente em todo o país.
Dois anos após a introdução, o mesmo sorotipo viral causou epidemias no
estado do Rio de Janeiro com confirmação laboratorial de 91 casos em três
diferentes municípios (Rocco et al., 2001).
1.2.2- Dengue no estado de Rondônia
O estado de Rondônia, localizado totalmente na Amazônia Legal e na
região norte do Brasil, possui 238.512,80 km2. Faz fronteira com Bolívia em
uma extensão de 1.342 km de linha divisória em sua totalidade delimitada por
rios. Os limites territoriais são: ao norte, nordeste e noroeste com o Estado do
Amazonas; ao leste e sudeste com o Mato Grosso; ao sul e sudoeste com a
República da Bolívia. Possui 32 municípios localizados na Amazônia Legal e 20
municípios situados em faixa de fronteira. Tem uma população estimada em
1.453.756 habitantes (IBGE, 2007). Está em uma região favorável a
propagação de arbovírus. Primeiro, por sua posição geográfica, ligando por
rodovia o estado do Acre e atualmente o Peru através da Rodovia
Interoceânica, uma rota importante para os portos do Pacífico, aos outros
estados do Brasil, assim, havendo intensa circulação de caminhões das mais
diversas regiões do país. Segundo, por fazer fronteira com a Bolívia possibilita
a entrada de novos arbovírus. Terceiro, o Estado ainda está em plena
expansão de suas fronteiras agrícolas, com a derrubada de floresta, colocando
o homem como hospedeiro acidental e favorecendo o aparecimento de
arboviroses silvestres. A figura 1 mostra a localização do estado de Rondônia
em relação ao Brasil e em destaque a rodovia BR 364 e a fronteira com a
Bolívia.
BR - 364
Fronteira
Brasil/Bolívia
BOLIVIA
Fonte: http://br.geocities.com/rondonianaweb/mapa_rondonia.jpg
Figura 1- Mapa mostrando a localização do estado de Rondônia em relação à
região norte do Brasil. Em destaque vermelho o contorno da BR 364 e em azul
a fronteira com a Bolívia.
1.3- Morfologia e Genoma do vírus dengue
Os vírus dengue são esféricos, envelopados, com projeções na
superfície e medem aproximadamente 50-60 nm de diâmetro. O RNA viral é
envolto por um nucleocapsídeo de simetria icosaédrica, composto por uma
única proteína denominada proteína de capsídeo (C), circundada por uma
bicamada lipídica associada às proteínas de membrana (M) e de envelope (E)
(Russell et al., 1980, Schlesinger et al., 1990), conforme esquema ilustrado na
figura 2.
Figura 2- Representação esquemática do vírus do dengue. Em M: proteína da
Membrana. Em E: proteínas do Envelope. Em C: proteína do Capsídio. Em ssRNA: o material
genético constituído por RNA de fita simples.
O genoma dos Flavivirus é constituído por uma única molécula de RNA
de fita simples e polaridade positiva, com comportamento de RNA mensageiro.
Com cerca de 11.000 nucleotídeos (11Kb), é traduzido em uma poliproteína
com peso molecular de 3.3x106 daltons (Rice, 1996; Monath, 1990), possui
uma fase aberta de leitura, codificando proteínas estruturais e não estruturais.
Os genes que codificam proteínas estruturais são: do nucleocapsídeo (C),
proteínas da membrana (prM/M), envelope (E), estão localizados na região 5’
do genoma viral.
As proteínas estruturais têm um papel importante na biologia do vírus,
uma vez que, são responsáveis por várias atividades biológicas, incluindo
montagem e maturação do vírus, fusões celulares, imunogenicidade, induzindo
anticorpos neutralizantes e anticorpos inibidores da hemaglutinação. Na
extremidade 3’, estão localizados os genes que codificam as proteínas não
estruturais: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 que atuam como
helicases, proteases e polimerases virais (Chambers et al., 1990; Lindenbach &
Rice, 2003), conforme representado na figura 3. As proteínas não estruturais
são responsáveis pela replicação do vírus e processamento da poliproteína,
embora o mecanismo exato de ação da maioria delas ainda não esteja
completamente esclarecido (Rice et al., 1985; Rice, 1996).
Figura 3- Esquema representativo do genoma do dengue e proteínas codificadas
(adaptado de Chambers et al., 1990)
1.4- Diagnósticos Laboratoriais
O diagnóstico da infecção pelo vírus dengue pode ser realizado através
de testes sorológicos, isolamento viral ou detecção do genoma viral (King et
al.,1991, Guzman et.al, 1996).
1.4.1- Diagnósticos Sorológicos
Atualmente é usado o ensaio imunoenzimático - ELISA para
detectar a presença de anticorpos anti-dengue no soro do paciente. O ELISA e
suas variantes, como por exemplo, o MAC-ELISA, discrimina imunoglobulinas
das classes M e G (IgM/IgG) distinguindo por indicações dos níveis séricos de
uma ou outra a possibilidade de uma primo-infecção ou infecção secundária.
Outros testes sorológicos menos utilizados por sua complexidade técnica são:
inibição da hemaglutinação (IH), fixação do complemento (FC) e teste de
neutralização (TN) (Chunguer et al., 1989).
1.4.2- Isolamento Viral
Quatro métodos são habitualmente usados para o isolamento viral:
inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos; inoculação em
cultura de células de mamíferos ou mosquitos e inoculação intratorácica em
mosquitos; (King et al., 1991, Guzman & Kouri, 1996).
A inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos foi
inicialmente utilizada para o isolamento viral dos 4 sorotipos do DENV, no
entanto, apresenta desvantagens tais como: elevado custo, demora para
isolamento; e baixa sensibilidade. Esses problemas fazem com que a
metodologia não seja recomendada para isolamento viral (Gubler et al., 1988).
A inoculação em cultura de células de mamíferos, apresenta limitações e
desvantagens similares com a metodologia descrita anteriormente. Esta
metodologia embora empregada por muitos laboratórios, atualmente não é
recomendada para isolamento de rotina do DENV, principalmente por ser uma
metodologia que requer tempo e custo elevado (Guzman & Kouri, 1996).
O cultivo em células de mosquito é uma das metodologias mais
empregadas no isolamento viral (Gubler et al.,1988). A linhagem mais utilizada
é a C6/36, clone do Aedes albopictus (Gubler et al.,1984). As células C6/36
proporcionam uma metodologia rápida, sensível e econômica para o
isolamento do vírus (Gubler et al., 1988). A confirmação do isolamento
independente de alteração morfológica, efeito citopático, realizado após sete
dias de incubação, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais, sendo
estes para o sorotipo-específico em teste de IF (Figueiredo et al., 1992).
A metodologia de inoculação intratorácica em mosquitos é a mais
sensível, no entanto, é o método menos utilizado para isolamento do DENV. As
espécies de vetores mais utilizadas para o isolamento viral: Toxorhynchities
amboinensis e Toxorhynchities splendens, onde ambos os sexos são
suscetíveis. O DENV replica-se geralmente em altos títulos (106 a 107 MID50),
em cerca de quatro a cinco dias, dependendo da temperatura de incubação. A
detecção viral é realizada através de imunofluorescência indireta (IFI) nos
tecidos do mosquito, normalmente do cérebro ou glândulas salivares. As
desvantagens são o intenso trabalho e a necessidade de insetário para a
produção de um grande número de mosquitos (Kuberski et.al.,1977, Gluber et
al., 197, Gubler et al., 1988).
1.4.3- Diagnósticos Moleculares
Nas décadas de 80 e 90, com o surgimento da técnica de Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) e da reação em cadeia da polimerase precedida
da Transcrição Reversa (RT-PCR) a identificação de vírus tornou-se mais
rápida (Chomczynski & Sacchi, 1987, Mullis et al., 1987). Diversos primers
foram desenvolvidos e metodologias complementares, tais como a nested-RTPCR foram incluídas na detecção do genoma viral (Henchal et al., 1991, Morita
et al., 1991; Lanciotti et al., 1992, Tanaka et al., 1993, Deubel et al., 1997).
A metodologia de RT-PCR foi descrita por Saiki e desenvolvida por Kari
em 1986, sendo considerada uma técnica que possibilita da amplificação “in
vitro” de uma determinada região do genoma viral. É considerada uma
metodologia rápida e sensível, se corretamente padronizada, pode ser usada
para detecção do genoma em amostras clínicas humanas, biópsias ou tecidos
de autópsia (Deubel et al., 1990).
Atualmente, novas metodologias moleculares vêm sendo desenvolvidas
para o diagnóstico do DENV, tais como: hibridação de ácidos nucléicos e PCR
em tempo real (Real time PCR).
No teste de hibridação dos ácidos nucléicos, é usado RNA extraído do
sobrenadante de células infectadas com vírus ou “pools” de A. albopictus
utilizando sondas biotiniladas ou com
32
P (Igarashi, 1978). Esta metodologia
apresenta alta sensibilidade, sendo utilizado em estudos epidemiológicos,
diagnóstico viral em amostras clínicas e também em tecidos fixados de
autopsias (Henchal et al., 1987, Khan et al., 1987).
O diagnóstico molecular baseado na amplificação de sequências de
ácidos nucléicos através das técnicas de RT-PCR e Real-Time-PCR, estão
substituindo gradualmente os métodos de isolamento viral de soro em fases
agudas da infecção, podendo em alguns casos, determinar resultados mais
rápidos e sensíveis (Lanciotti et al., 2000, Lanciotti., 2003, Shu & Huang, 2004).
A metodologia de Real-Time-PCR, por ser um processo semiautomatizado, é considerada de alta confiabilidade e reprodutíbilidade (Bustin,
2002). Os avanços no desenvolvimento de fluoróforos e nucleotídeos
quimicamente marcados permitiram o desenvolvimento da técnica de
fluorocromos para Real-Time-PCR. Vários protocolos de aprimoramento e
aplicação desta técnica, visando o diagnóstico do DENV, foram publicados
demonstrando a sua aplicabilidade (Callahan et al., 2001, Houng et al., 2001,
Drosten et al., 2002), no entanto, esta técnica requer aparelho sofisticado e
pessoal qualificado.
1.5- Sequenciamento Viral
Desde a década de 80, o genoma completo de vários Flavivírus foram
sequenciados, começando pelo vírus da febre amarela (YFV), seguido pelos 4
tipos de DENV (Rice et al., 1985, Mason et al., 1987, Hahn et al., 1988,
Osatomi et al., 1990). Através do sequenciamento do genoma pode se fazer o
alinhamento dos nucleotídeos usando uma extensa variedade de programas
com diversos algoritmos que fazem inferências na análise de similaridade das
sequências nucleotídicas permitindo construir árvores filogenéticas com
finalidade de analisar e comparar as relações evolutivas e até mesmo a origem
dos sorotipos sequenciados.
Atualmente o sequenciamento do genoma do DENV é utilizado não
apenas para indicar a origem do vírus, mas também mutações que
provavelmente podem causar diferença em sua patogenia (Aquino et al., 2005).
Diante da presença de diferentes sorotipos do vírus dengue no quadro
epidemiológico do estado de Rondônia, e do fato de serem constantes as
epidemias. Justifica-se esse estudo para possibilitar o conhecimento
filogenético dos genótipos dos vírus dengue circulante, bem como suas
origens, pois a presença de mais de um genótipo podem causar diferentes
perfis clínico e uma maior incidência de Febre Hemorrágica do Dengue.
2- OBJETIVOS
2.1- Objetivo Geral
•
Identificar os genótipos dos vírus dengue sorotipos 2 e 3, entre os
períodos 2002 a 2006, através da análise filogenética e estabelecer a
origem dos vírus circulantes no estado de Rondônia.
2.2- Objetivos Específicos
•
Repassar em células C6/36 todas as amostras virais utilizadas no
estudo, correspondente ao período de 2002 a 2006;
•
Realizar a RT-PCR para obtenção dos fragmentos (amplicons) a serem
utilizados na clonagem, ao mesmo tempo reconfirmar o sorotipo viral.
•
Clonar em vetor
pDrive (QIAgen) os amplicons obtidos para
sequenciamento gênico;
•
Obter árvores filogenéticas comparando os vírus isolados em Rondônia
com os isolados no Brasil e em outros locais do mundo.
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Cadastro de dados do estudo
Este estudo foi realizado durante o período de 2007 a 2009, com
amostras sobrenadantes de cultura celular C6/36 infectadas com vírus dengue,
caracterizadas
pela
unidade
laboratorial
de
virologia,
de
indivíduos
apresentando sintomas de 1 a 4 dias (período agudo da viremia) sugestivos
para dengue, Anexo I, e que estavam estocadas a -80 ºC. Segundo parecer do
Comitê de Ética em Pesquisa do CEPEM/IPEPATRO.
3.2- Amostras biológicas
Foram analisadas 190 amostras, coletadas entre os períodos de 2002
a 2006, nas localidades: Porto Velho no Ambulatório do CEPEM; na Policlínica
Municipal Dr. Hamilton Gondin, na Policlínica Dr. José Adelino. Em Ouro Preto
D’ Oeste no Hospital Municipal e no município de Colorado D’ Oeste na
Unidade Mista Drª Laura Maria de Carvalho Braga, nos Prontos Socorros
Municipais de Ariquemes, Cacoal, Jarú e Vilhena. Como demonstrado na
tabela 1.
Tabela 1: Distribuição das amostras analisadas nos municípios de Rondônia.
Municípios
Número de
amostras
Ariquemes
6
Cacoal
19
Colorado D’Oeste
22
Jarú
13
Ouro Preto
D’Oeste
24
Porto Velho
94
Vilhena
12
Total
190
3.3- Isolamento viral
Para o isolamento viral foram cultivadas células de mosquito Aedes
albopictus, clone C6/36 em placas estéreis de 24 orifícios (Corning, USA)
(Figueiredo, 1990). As células foram mantidas com meio Leibowitz-15 (L-15)
(Gibco BRL, USA), suplementadas com 10% de soro fetal bovino (Gibco BRL,
USA) 1000U/mL de penicilina e 1mg/mL de estreptomicina. As células foram
mantidas em estufa BOD a 28ºC e visualizadas em microscópio invertido
(Nikon, USA) diariamente até a formação de monocamadas celular confluente
conforme figura 4.
Figura 4: Fotografia de uma monocamada de células C6/36,
obtida em microscópio óptico com aumento 400x.
Para infecção da monocamada o fluído celular infectado foi diluído em
1:10 com volume final de 500 µL em meio L-15 completo. Foi inoculado o
diluído por 1 hora em estufa BOD a 28ºC. Após esse período de incubação foi
acrescentado 1mL do meio L-15 completo em cada poço das placas e
armazenado a 28ºC durante 7 dias. As monocamadas celulares inoculadas
eram inspecionadas diariamente em microscópio invertido (Nikon, USA) para
detecção de efeito citopático, uma alteração morfológica que o vírus causa na
célula formando vacuolização, arredondamento, aumento do núcleo e
inclusões. No sétimo dia foi recolhido todo o material inoculado e armazenado
no -80ºC até o momento do uso. Para obtenção de um maior título viral foram
realizadas três passagens sucessivas do fluído em cultura celular. Como
controles foram utilizados: controles positivos cepas de DENV-2 (CEA 2462) e
DENV-3 (PVH) e controle negativo, sobrenadante de cultura de C6/36 não
infectada.
3.4- Extração do RNA Viral
Para extração do RNA viral contido no sobrenadante de cultura celular
infectada, foi utilizado o Kit QIAamp® Viral RNA (QIAgen,, Alemanha), conforme
instruções do fabricante.
3.5. Transcrição Reversa e Reação da Polimerase em Cadeia (RT-PCR)
3.5.1 Confecção do cDNA
Para a confecção da fita de DNA complementar (cDNA) através da
transcrição reversa, incubou-se 5µL do RNA extraído com 1µL (3µg) de primer
randômico pd(N)6 (GIBCO® BRL, USA), 1µL de dNTPs 10mM (Gibco BRL,
USA). Aqueceu-se as amostras por 1 minuto a 95°C, em seguida incubou-se
no gelo por 5 minutos e logo após acrescentou-se 4µL do tampão Buffer 5x
(Gibco BRL, USA), 1µL DTT 0.1M, 200U/µL SuperScript (Gibco BRL, USA),
10U/µL de inibidor RNase (Gibco BRL, USA) e completou-se com água ultrapura volume para 20µL, incubou-se as amostras por 25°C por 10 minutos, 2
horas a 37°C e ao final por 5 minutos a 85°C para desnaturação da enzima
transcriptase reversa.
3.5.2- PCR
3.5.2.1. Primers D1 e D2 (Lanciotti et al., 1992)
Para a amplificação do fragmento do gene das proteínas C-prM e
identificar o vírus dengue, foram utilizados o par de primers D1 e D2, que
amplifica um fragmento de 511pb, correspondente a sequência gênica que
codifica parte das proteínas estruturais do capsídeo e pré-membrana (C-prM).
As sequências dos primers estão indicadas na tabela 2, assim como uma
representação do local de anelamento dos primers é mostrado na figura 5
(Lanciotti et al., 1992). Para a PCR misturou-se 5µL de cDNA com 50nM de
iniciadores específicos, sense e anti-sense, 0,2 mM de desoxinucleotídeos,
1,5mM de MgCl2, 2,5U de Taq DNA polimerase termoestável (Invitrogen USA), solução tampão 10X da enzima (Invitrogen - USA), e água para
completar um volume final de 50µL.
As amostras foram submetidas a aquecimento inicial 94ºC por 5 min
seguido de 30 ciclos térmicos nas temperaturas de 94ºC por 1min para
desnaturação; 53ºC por 1min para anelamento, seguido de, 72ºC por 2min para
extensão e uma extensão final de 72ºC por 10min em termociclador
(Eppendorf, Alemanha). Os produtos da PCR, foram estocados a 4ºC até
serem utilizados.
Tabela 2: Descrição das sequências dos primers utilizados para amplificação
da intersecção dos genes correspondente as proteínas do capsídeo e prémembrana do vírus do dengue.
Primers
D1
D2
Sequências
5’TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G
3’
5’TTG CAC CAA CAG TCA ATG TCT TCA GGT TC
3’
Região do
genoma
C-prM
C-prM
Figura 5: Esquema representado o local de anelamento dos primers
utilizados para a PCR no genoma do dengue.
3.5.2.2. Primers DEN2-S e DEN2-C (Figueiredo et al., 1997)
Para identificação do vírus do dengue sorotipo 2, foi utilizado o par de
primers DEN2-S e DEN2-C específicos para DENV-2, amplificando um
fragmento de 210pb (Figueiredo et al., 1997). Para a PCR as amostras foram
submetidas a aquecimento inicial de 94ºC por 5min seguido de 30 ciclos
térmicos nas temperaturas de 94ºC por 1min para desnaturação; 54ºC por 1min
para anelamento seguido de 72ºC por 2min para extenção e uma extenção
final de 72ºC por 10min. Os produtos da PCR, foram estocados a 4ºC até
serem utilizados. As sequências dos primers DEN2-S e DEN2-C estão
descritas na tabela 3 assim como o gene amplificado por ele. Na figura 6 está
representado o local de anelamento dos primers em relação ao genoma do
vírus dengue.
Tabela 3: Descrição das sequências dos primers utilizados para amplificação
do gene E do vírus do dengue.
Primers
Região do
Sequências
genoma
DEN2-S
5’ GTT CCT CTG CAA ACA CTC CA 3’
E
DEN2-C
5’ GTG TTA TTT TGA TTT CCT TG 3’
E
Primer DEN2-S
E
Primer DEN2-C
Figura 6:- Esquema descritivo representado o local de anelamento dos primers
utilizados na PCR com DEN2-C e DEN2-S específicos para dengue sorotipo 2.
3.5.3. Eletroforese dos Produtos da PCR.
3.5.3.1. Gel de Agarose 1,5%.
Para confirmação da amplificação correspondente aos genes de
interesse, foi realizada eletroforese em gel de agarose a 1,5% (GIBCO BRL,
USA), com solução tampão TAE 1X (0.09M de Tris base, 0,09M de ácido
bórico e 0,002M de EDTA) e acrescido de brometo de etídio 0.1% (Sigma
Chemical Company, St.Louis, USA). Um volume de 5µL de cada amostra foi
aplicada no gel de agarose e submetida à eletroforese, a 100V; 400W; por 30
minutos. Após, o gel foi visualizado em transluminador ultravioleta (UV). Os
amplicons foram comparados a um marcador peso molecular de 100pb e
controles positivos de DENV (Invitrogen® - USA). Através da análise de relação
com a migração dos amplicons e o marcador de peso molecular obteve-se os
tamanhos de 511 pb e 210pb, respectivamente.
3.5.4. Hemi-nested-PCR (Lanciotti et al., 1992)
Para caracterização do sorotipo viral do dengue foi realizado uma Heminested-PCR, utilizando os amplicons obtidos na PCR, juntamente com o primer
D1 e os primers TS1, TS2, TS3 e TS4, que geram fragmentos de peso
molecular conforme mostrados na tabela 4. A diferença de peso molecular
determina qual é o sorotipo viral do dengue.
Tabela 4- Descrições das sequências dos primers anti-sense utilizados para
obtenção
do
sorotipo
do
vírus
da
dengue
e
seu
peso
molecular
correspondente.
Tamanho
Primers
Sequências
do
Sorotip
o viral
Amplicon
TS1
5’CGT CTC AGT GAT CCG GGG G 3’
482 pb
DENV 1
TS2
5’CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG 3’
119 pb
DENV 2
TS3
5’ TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C 3’
290 pb
DENV 3
TS4
5’ CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A 3’
392 pb
DENV 4
Para a Hemi-nested-PCR as amostras foram submetidas a um
aquecimento inicial de 94ºC por 5 minutos seguido de 25 ciclos térmicos nas
temperaturas de 94ºC por 1min; 53ºC por 1min e 72ºC por 2min seguido de
uma extensão final de 72ºC por 10min em termociclador (Eppendorf,
Alemanha).
3.5.4.1- Eletroforese do Produto da Hemi-nested-PCR.
3.5.4.2- Gel de Agarose 2,0%.
Para a confirmação da amplificação correspondente aos fragmentos de
tamanhos diferentes, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose a 2,0%
(GIBCO BRL, USA), com solução tampão TAE 1X (0.09M de Tris base, 0,09M
de ácido bórico e 0,002M de EDTA) e acrescido de brometo de etídio 0.1%
(Sigma Chemical Company, St.Louis, USA). Um volume de 5µL de cada
amostra foi aplicada no gel de agarose e submetida à eletroforese, a 100V;
400W; por 30 minutos. Após, os fragmentos foram visualizados em
transluminador ultravioleta (UV). Os amplicons foram então comparados a um
marcador de 100pb e controle positivo para DENV-3 (Invitrogen® - USA).
3.6 Clonagem
3.6.1. Purificação dos amplicons para clonagen.
Os amplicons correspondentes a 511pb foram seccionados do gel de
agarose. Posteriormente colocados em microtubo de 1,5 mL, a purificação foi
realizada com QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Alemanha) de acordo com
instruções do fabricante.
3.6.1.1. Confirmação da purificação
Para a confirmação da purificação foi realizada eletroforese em gel de
agarose a 1,0% (GIBCO BRL, USA), com solução tampão TAE 1X (0.09M de
Tris base, 0,09M de ácido bórico e 0,002M de EDTA) e acrescido de brometo
de etídio 0.1% (Sigma Chemical Company, St.Louis, USA). Um volume de 5µL
de cada amostra foi aplicada no gel de agarose e submetida à eletroforese, a
100V; 400W; por 30 minutos. Após, o gel foi visualizado em transluminador
ultravioleta (UV). O produto purificado foi comparado com um marcador de
250pb (Invitrogen® - USA). Em seguida ligado a um vetor de clonagem.
3.6.2. Ligação em vetor de clonagem
Utilizou-se o kit de clonagem (QIAgen, Alemanha), para a inserção de
fragmentos do gene da proteína C-prM. O vetor está representado
esquematicamente na figura 7. Para ligação do fragmento ao vetor de
clonagem foram utilizados: 3,0µL do produto de purificação, com cerca de
220ng, 0,5 µL do vetor, 2,5µL de tampão 5X com ligase, incubou-se a 4°C por
16 horas. O produto da ligação foi estocado a –20°C até o momento do uso.
Fonte: http://www1.qiagen.com/literature/images/pDrive_cloning_vector.gif
Figura 7- Representação esquemática do vetor pDrive (QIAgen, Alemanha).
3.6.3. Preparo de bactérias competentes
Para obtenção de células competentes foram utilizadas bactérias da
espécie Escherichia coli, linhagem TOP 10 F’ estocadas a -80oC em meio LB/
DMSO 10%, foram semeadas em placas contendo meio sólido LB-agar 1,5%,
12,5µg/mL de tetraciclina e posteriormente incubadas a 37oC por 18 horas.
Após o crescimento das colônias, uma de cada foi inoculada em 5mL de meio
LB líquido com tetraciclina para crescimento a 37oC durante 20 horas em
agitação constante (250 rpm/minutos) e 0,5 mL da cultura foi inoculada em 50
mL de meio LB acrescido de 5µL de tetraciclina. As culturas foram coletadas
em fase exponencial de crescimento determinada pela absorbância de 600 nm
em 0,45 e 0,55 nm de densidade óptica (D.O.). Logo após foram adicionados
às bactérias 1mL de MgCl2 a 1M gelado e incubou-se a cultura por 15 minutos
a 4oC. Em seguida, as bactérias foram centrifugadas a 4500rpm por 15 minutos
a 4oC. O sedimento foi ressuspendido em 20mL de tampão contendo Acetato
de potássio (AcK) 30mM pH:7,5, MnCl2 50mM, CaCl2 10mM e glicerol
autoclavado a 15%, e novamente incubada por 15 minutos a 4oC. E em
seguida centrifugadas a 4500rpm por 15 minutos a 4oC, o sedimento final foi
ressuspendido em 2mL do tampão contendo: MOPS 10mM pH:7,0, CaCl2
75mM, KCl 10mM e glicerol autoclavado a 15%. Para o armazenamento
distribuiu
alíquotas
de
200µL
e
em
seguida
foram
congeladas
o
instantaneamente em nitrogênio líquido e estocadas a -80 C.
3.6.4. Transformação Bacteriana
As células competentes TOP 10 F’ foram transformadas com DNA
plasmideal utilizando a metodologia descrita por Sambrock et al. (1989) com
algumas modificações. Brevemente, 2µL da reação de ligação ou 0,1 ng de
DNA de plasmídeo pDrive (QIAgen, Alemanha), foram adicionadas a 50µL da
suspensão de células competentes. A mistura foi colocada em gelo por 30
minutos. Após este período, as células foram mantidas a 42oC por 1 minuto e
novamente retornadas ao gelo por 10 minutos, logo após foram acrescentados
110µL de meio S.O.C (GIBCO BRL, USA) e incubada por 30 minutos a 37oC
para crescimento bacteriano e posteriormente semeadas em placas de LB-agar
1,5% suplementadas com ampicilina (100µg /mL), tetraciclina (50µg /mL) e
adicionalmente IPTG (100µg /mL), X-gal (200µg /mL). As placas foram
incubadas por 12 horas a 37°C.
3.6.5.Extração do DNA Plasmidial
As colônias resultantes da transformação foram selecionadas com base
em sua coloração, foram escolhidas as colônias brancas. A representação de
uma placa com colônias com inserto (brancas) e sem inserto (azuis) são
representadas na figura 8. As colônias brancas foram escolhidas ao acaso nas
placas LB-agar/Tetra/Amp/IPTG/X-gal e processadas para isolamento de DNA
plasmideal.
As colônias selecionadas das placas foram cultivadas em 2mL de meio
LB-líquido/tetraciclina/ampicilina a 37oC por 18 horas, em agitação constante
(280 rpm/minuto). Os plasmídeos foram extraídos usando o procedimento de
mini-preparação descrito em Sambrock et al. (1989.)
Colônias
Brancas
A
B
Figura 8- Em A: Modelo esquemático do vetor de clonagem. Em B: Após as bactérias sofrerem
transformação.
3.6.6. Digestão do vetor
Para verificar se os vetores extraídos pela metodologia de mini
preparação possuíam o inserto, foi utilizada a enzima de restrição Eco RI
(Promega, USA). Para isso, foram utilizados 3µL dos plasmídeos extraídos,
1µL de tampão 10X Buffer, 0,3µL de Eco RI e água q.s.p 10µL a mistura foi
incubada a 37°C por 2 horas.
Foi utilizada a eletroforese em gel de agarose a 1,5%, acrescido de
brometo de etídio a 0,1% (Sigma Chemical Company, St.Louis, USA), para a
confirmação visual da digestão e comparação ao marcador de 250pb
(Invitrogen®, USA).
3.6.7. Sequenciamento
Para determinação das sequências nucleotídicas da região C-prM
as amostras de clones foram selecionados para o sequenciamento. Cada
clone foi sequenciado utilizando o Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit
(Applied Biosystem, USA). A PCR seguiu os seguintes ciclos: um ciclo para
desnaturação das fitas de 96ºC por 2 min; 25 ciclos de 96ºC por 45 segundos,
50ºC por 30 segundos e 60ºC por 90 segundos. Após os ciclos as amostras
foram deixadas em 60ºC por 4 min e no gelo por 2 min conforme o manual do
fabricante. (Applied Biosystem), o sequenciamento das reações foram
realizados no sequenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, USA), realizado no Instituto de Ciências Biológicas -ICB2 da USP,
Dr. Gerhard Wunderlich.
3.7. Análise das Sequências
Para obter a sequência do gene C-prM de DENV-2 e DENV-3 foi
utilizado o programa ENTREZ do National Center for Biotecnology Informática
– NCBI. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query).
3.7.1- BLAST
O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) encontra regiões de
similaridade
entre
as
sequências.
O
programa
compara
sequências
nucleotídeos ou proteínas com as contidas no banco de dados e calcula uma
estatística significante. Foi usado para uma busca de similaridade após o
sequenciamento, entre os clones e as sequências contidas no banco de dados.
3.7.2. Árvore Filogenética
O método de bootstrap foi utilizado para testar a significância estatística
para cada ramo da árvore gerada. Os valores de bootstrap foram obtidos por
re-amostragem dos dados com 100 replicatas utilizando-se os programas Garli
(Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference) e Paup (Phylogenetic
Analysis Using Parsimony), realizado no Laboratório de Evolução Molecular e
Bioinformática- LEMB da USP, Dr. Paolo Zanotto.
Os dados foram compilados nos softwares Garli, que usa um algoritmo
genético modificado para inferir rapidamente filogenias baseadas em dados
dos nucleotídeos. Ele usa o General Time Reversible (GTR), que é um modelo
de substituição nucleotídica e simultaneamente verifica a mistura de topologia,
ramos, taxa de heterogeneidade e modelo parâmetros que maximiza a
probabilidade dos dados da filogenia. O Paup é usado para inferência
evolucionária de árvores filogenéticas.
4- RESULTADOS
4.1. Isolamento viral
4.1.1 - Em células C6/36
As 190 amostras de sobrenadante de cultura celular, infectados com
sorotipos 2 e 3 do dengue, foram reinoculadas em monocamada célular C6/36
para obtenção do volume sobrenadante e título viral para o trabalho. Essas
amostras foram observadas diariamente em microscópio invertido (Nikon, USA)
e 20 amostras (10,5%) apresentaram alterações na sua morfologia,
apresentando efeito citopático provocado pela multiplicação viral, indicando a
presença de infecção viral figura 9. Porém, como o efeito citopático é um
indicativo subjetivo da infecção viral, aqueles poços que não apresentaram
efeito citopático também foram submetidos a RT-PCR.
A
B
Figura 9: Fotografia de monocamada de células C6/36. Em A, monocamada celular sem
infecção viral. Em B, monocamada celular infectada com o vírus da dengue. Em destaque
no círculo vermelho o efeito citopático provocado pela infecção viral.
4.2. RT-PCR
4.2.1. Primers D1 e D2 (Lanciotti et al., 1992)
Após a extração de RNA viral, as 190 amostras foram submetidas a
transcrição reversa para obtenção do cDNA através de uso de primers
randômicos pd(N)6 (Invitrogen® - USA). Em seguida, submetidas a PCR
utilizando os primers específicos. Foram amplificadas 80 amostras gerando
fragmentos com 511pb, conforme mostrado na figura 10 e 110 não
amplificaram.
MW
C+
C-
1
2
3
4
5
511pb
Figura 10: Fotografia representativa demonstrando os amplicons após corrida eletroforética
em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio 0,1% e visualizado com luz
ultravioleta, para a infecção por dengue. A seta corresponde ao fragmento com 511pb, peso
molecular obtido com a RT-PCR com o primer D1 e D2. Em MW: marcador de peso molecular
+
100pb; em C (controle positivo) DENV-3 PVH; em C (controle negativo) constituído de
sobrenadante de cultura celular C6/36 não infectada. Na linhas de 1 a 5: amplificados do
genoma do DENV das amostras.
4.2.3- Primers TS1, TS2, TS3 e TS4 (Lanciotti et al., 1992)
As 80 amostras foram submetidas a uma Hemi-nested-PCR com primers
TS1 a TS4, 79 amostras apresentaram amplificações de 290pb, caracterizando
o sorotipo DENV-3 conforme mostrado na figura 11.
Figura 11 – Fotografia representativa demonstrando os amplicons após corrida eletroforética
em gel de agarose 2,0%, corado com brometo de etídio 0,1% e visualizado com luz ultravioleta,
para caractrizar o sorotipo viral. A seta corresponde ao fragmento com 290pb, peso molecular
obtido com a Hemi-nested-PCR com o primer D1 e TS3. Em MW: marcador de peso molecular
+
100pb; em C (controle positivo) DENV-3 PVH; em C (controle negativo) constituído de
sobrenadante de cultura celular C6/36 não infectada. Nas linhas de 1 a 5: amplificados do
genoma do DENV-3 das amostras.
4.2.4. Primers DEN2-C e DEN2-S (Figueiredo et al., 1997)
Das 80 amostras apenas uma não foi amplificada através da Heminested-PCR. Sua identificação ocorreu através dos primers demoninados
DEN2-C e DEN2-S, identificando o DENV-2 para essa amostra. A amplificação
do genoma de DENV-2 é mostrado na figura 12.
MW
C+
1
2
210pb
Figura 12- Fotografia demonstrando os amplicons após corrida eletroforética em gel de
agarose 1,5%, corado com brometo de etídio 0,1% e visualizado com luz ultravioleta, para
caracterização viral. A seta corresponde ao fragmento com 210pb, peso molecular obtido com
a RT-PCR com o par de primer DEN2S e DEN2C.para DENV-2 com fragmento correspondente
+
a 210pb. Em: MW, marcador de peso molecular de100pb; em C (controle positivo) DENV-2
CEA 2462. Em 1, amplificação do DENV-2 do soro de paciente. Em 2, (controle negativo)
sobrenadante de cultura celular C6/36 não infectada.
Assim, confirmou-se o genoma do DENV-2 e 3 nos materiais clínicos de
80 pacientes dos municípios que compõem o eixo da BR 364 conforme
disposto na tabela 5.
Tabela 5: Resultado por município da identificação do DENV em Rondônia
durante os períodos de 2002 a 2006.
Amostras
Amostras
Sorotipo
Sorotipo
Positivas
Negativas
Viral
Viral
Ariquemes
1
5
DENV-3
-
Cacoal
1
18
DENV-3
-
Colorado D’Oeste
6
16
DENV-3
-
Jarú
3
10
DENV-3
-
OuroPretoD’Oeste
12
12
DENV-3
-
Porto Velho
54
40
DENV- 3
DENV-2
Vilhena
3
9
DENV-3
-
Total
80
110
79
1
Municípios
4.3- Clonagem dos fragmentos
4.3.1- Purificação dos fragmentos de DNA amplificados
Para clonagem foram purificadas 15 amostras de fragmentos de DNA
conforme figura 13.
Figura 13 – Fotografia representativa de uma corrida eletroforética em gel de agarose 1,0%,
acrescido de brometo de etídio 0,1% e visualizado com luz ultravioleta, contendo os fragmentos
purificados após RT-PCR com primers D1 e D2. Em MW, marcador de peso molecular de
+
250pb; em C , controle positivo DENV-3 PVH. Em DENV os fragmentos purificados.
4.3.2 - Ligação do fragmento ao vetor
Os 15 fragmentos obtidos por RT-PCR, apos purificados como mostrado
na figura 13 foram ligados ao vetor de clonagem pDrive (QIAgen, Alemanha)
conforme mostrado na figura 14 e inseridos em E.coli.
MW
C+
INSERTOS
4,36Kb
Figura 14 – Fotografia representativa de um gel de agarose 1,5%, corado com brometo de
etídio 0,1%, submetido à corrida eletroforética para a confirmação da ligação do vetor pDrive
de 3,85Kb com o fragmento da RT-PCR de 511pb, obtendo um fragmento de 4,36 kb. Em MW,
+
marcador de peso molecular de 1kb; em C , controle positivo DENV-3 PVH. Em Insertos, a
união do fragmento correspondente a intersecção do gene C-prM ligado ao vetor de clonagem
pDrive.
4.3.3. Confirmação da clonagem
Após a transformação bacteriana e extração do plasmídeo, foi realizado
a digestão enzimática com Eco RI (Promega, USA). Todas as 15 amostras
foram clonadas. Na figura 15 podem ser visualizados os plasmídeos cortados
e os fragmentos correspondentes a intersecção dos genes C-prM, com
tamanho de 511pb.
MW
C+
Digestão Enzimática
3,85 kb
511pb
Figura 15 – Fotografia representativa de um gel de agarose 1,5%, corado com brometo de
etídio 0,1%, submetido à corrida eletroforética para a confirmação da digestão enzimática com
+
Eco RI. Em MW, marcador de peso molecular de 250pb; e em C , (controle positivo) DENV-3
PVH. Em digestão Enzimática, a digestão das amostras clonadas com 511pb, acima o vetor
3,85Kb.
4.4- Sequenciamento
Para confirmar os resultados do isolamento viral e construir a árvore
filogenética, foi realizado o sequênciamento gênico das 15 amostras, porém,
apenas 6 foram sequênciadas. Estas foram alinhadas com sequências obtidas
no GenBank.
4.5- Árvore Filogenética
A árvore filogenética obtida pelo programa Garli (Genetic Algorithm for
Rapid Likelihood Inference), mostrou na figura 16a que as seis amostras
sequênciadas de Rondônia agruparam-se com sequências dos vírus dengue
sorotipos 2 e 3 obtidas no GenBank. A sequência de DENV-2 do nosso estudo
agrupou-se com sequências de DENV-2 isolados em Nicarágua e Tailândia, o
mesmo pode ser notado para as sequências de DENV-3 do nosso estudo que
se agrupou com sequências de DENV-3 dos Estados Unidos, Brasil, Venezuela
e China, mostrando assim, que os sorotipos foram corretamente identificados.
4.5.1- Genotipagem DENV-2 e DENV-3
A análise filogenética genotípica das seis sequências do gene C-prM dos
DENV-2 e DENV-3 apresentaram três genótipos descritos previamente para
estes sorotipos (Wittke et al., 2002; Holmes, 2004) tabela 7. Sugeriu a
existência da co-circulação de genótipos distintos de um mesmo sorotipo em
uma única localidade figura 16b, porém, em períodos diferentes. O DENV-3
genótipo V esteve presente em amostras de Rondônia entre (2002 a 2003) e o
genótipo III em amostras coletadas de (2004 a 2006). Em 2006 juntamente com
o DENV-3 genótipo III, ocorreu a entrada de um novo sorotipo no estado de
Rondônia
o
DENV-2
que
Américo/Asiático figura 16c.
em
nosso
estudo
foi
genotipado
como
DV3US00
DV3VE08
DV3BR03
DV3BR01
DV3BR02
DV3BR06
DV3BR04
DV3BR04B
DV3SG05
DV3SK00
DV3TW99
DV3PH97
DV3PF94
DV3ID04
DV3ID98
DV3BR02B
DV3CH80
DV3BR02C
DV3BR03B
DV3VN08
DV3KH07
DV3CO94
DV3BDH02
DV3TH01
DV2NI08
DV2BR06
DV2TH01
DV4PR94
DV4VE01
DV1KH07
DV1TH01
0.1
Figura 16a: Árvore filogenética dos vírus dengue 1- 4, obtida pelo método maximum likelihood,
o nome dos isolados representados incluem: sorotipo, país de origem e ano de isolamento. AS
amostras de Rondônia encontram-se em negrito.
Figura 16b: Árvore filogenética DENV-3, obtida pelo método maximum likelihood, mostrando
as 5 sequências do gene C-prM, isoladas em Rondônia juntamente com amostras
selecionadas do Genbank. Os clados de genótipos específicos são indicados em numerais
romanos. As referencias dos isolados usados na análise incluem, país de origem, número de
acesso ao GenBank e ano, os números à esquerda dos nós representam valores de confiança.
O país e Estado em estudo são representados em azul Brasil (RO).
Figura 16c: Árvore filogenética DENV-2, obtida pelo método maximum likelihood, mostrando
uma sequência do gene C-prM, isolada em Rondônia juntamente com amostras selecionadas
do Genbank. Os clados dos genótipos específicos são indicados por nomes. As referências dos
isolados usados na análise incluem, país de origem, número de acesso ao GenBank e ano, os
números à esquerda dos nós representam valores de confiança. O país e Estado em estudo
são representado em azul Brasil (RO).
Tabela 6: Dados dos vírus dengue 2 e 3 isolados em Rondônia.
Gene
C-prM
Local/ Ano
Municípios
Vírus
Genótipo
Max
Ident
Origem
Geográfica
Brasil/RO_02
Brasil/RO_03
Brasil/RO_04
Brasil/RO_04
Brasil/RO_06
Brasil/RO_06
Porto Velho
Porto Velho
Ouro Preto
Vilhena
Porto Velho
Porto Velho
DENV-3
DENV-3
DENV-3
DENV-3
DENV-3
DENV-2
GV
GV
GIII
GIII
GIII
Américo/Asiático
99%
90%
98%
98%
99%
92%
Leste da Ásia
Sul das Américas
Sul das Américas
5- DISCUSSÂO
5 - Discussão
No presente trabalho, o objetivo foi aplicar embasamentos filogenéticos
nos estudos sobre os genótipos dos sorotipos 2 e 3 do vírus do dengue
isolados entre 2002 a 2006, para mostrar quais os genótipos circulantes em
Rondônia e compará-los com seus similares circulantes no Brasil e no mundo.
A região escolhida para o seqüenciamento das amostras foi a junção dos
genes C/prM, por se tratar de uma junção mais conservada, e que fornece as
inferências ideais para se estudar os genótipos dos vírus dengue. A região
escolhida está de acordo com os realizados por Klungthong et al., (2008), que
estudou, filogeneticamente, em separado cada região do genoma viral.
Segundo o autor, os alvos mais apropriados para o estudo do dengue foram
identificados para o vírus do dengue sorotipo 1, os nove genes com exceção do
NS4a; para sorotipo 2 os genes prM/M e, NS1, NS3, NS4a e NS5; para dengue
sorotipo 3 todos os dez genes e 3’ não-codificante (3’NTR) e para o dengue
sorotipo 4, os genes C, prM/M, E, NS1, NS2a, NS2b, NS4a e NS5 são todos
apropriados para gentotipagem.
Das 190 amostras selecionadas para o estudo, 80 foram positivas para o
vírus do dengue quando usados os primers D1/D2 (Lanciotti et al., 1992),
dessas, 79 tiveram o sorotipo caracterizado como DENV-3 através da Heminested-PCR (Lanciotti et al., 1992), e uma como DENV-2 com primers DEN2S/DENV-C (Figueiredo et al., 1997) específicos para o sorotipo 2 do dengue. A
falta de êxito no experimento de 110 amostras pode esta relacionada com o
tempo e as variações de temperatura durante o armazenamento. Foram
escolhidos
15
amplicons
para
clonagem
que
posteriormente
foram
seqüuenciados. Os resultados obtidos com as digestões confirmaram o mapa
de restrição do vetor, pois foram liberados os fragmentos dos tamanhos
esperado para a região em estudo totalizando 15 clones, dos quais, apenas
seis foram sequenciadas, um de DENV-2 e cinco de DENV-3, possivelmente
devido a problemas na técnica ou na qualidade dos clones. Amostras obtidas
no GenBank, associadas as sequências do nosso estudo, foram analisadas
através de pesquisa de alinhamento de dados pelo programa MUSCLE
(multiple alignment software for protein and nucleotide sequences) e
apresentaram em porcentagem, uma identidade (>90%) quando comparadas
com sequências já publicadas do gene das proteínas em estudo.
Para construção das árvores filogenéticas utilizou-se os programas
GARLI
(Genetic
Algorithm
for
Rapid
Likelihood
Inference)
e
PAUP
(Phylogenetic Analysis Using Parsimony). Com a construção das árvores
filogenéticas foi possível identificar os genótipos dos vírus e suas origens
geográficas. Essas árvores revelaram a presença dos genótipos III e V para o
DENV-3 e genótipo Américo/Asiático para o DENV-2, com origem no sul das
Américas e leste da Ásia. Quando comparados os genótipos de cada sorotipo
do DENV-3, com o ano de coleta das amostras, observamos que o primeiro
genótipo a entrar no estado de Rondônia foi o V em 2002 com sucessiva
entrada do genótipo III em 2004..
Com relação aos genótipos do DENV-3, o genótipo V foi encontrado em
duas amostras de Porto Velho, coletadas em 2002 e 2003, o genótipo III foi
encontrado em três amostras, Vilhena e Ouro Preto D’ Oeste em 2004 e em
Porto Velho no ano de 2006. O genótipo Américo/Asiático foi encontrado em
apenas uma amostra de Porto Velho em 2006.
Cinco genótipos distintos do DENV-3 foram identificados até o momento
(Lanciotti et al., 1994, Wittke et al., 2002). Genótipos I a III (GI, GII e GIII)
responsáveis pela maioria de infecções pelo DENV-3, são associados a
epidemias de DF/FHD no sudeste Asiático, subcontinente Indiano, Sul do
Pacífico, Leste da África, e nas Américas. Os genótipos IV e V (GIV e GV) não
foram associados a epidemias de DHF, e são representados por uma pequena
quantidade de seqüências nas Américas, Sul do Pacífico, e Ásia. Estudos
filogenéticos documentaram o DENV-3 com distribuição dentro de países
individuais (Aquino et al., 2006, Chungue et al., 1993, Díaz et al., 2006, Islam et
al.,2006, Kobayashi et al., 1999, Peyrefitte et al ., 2003, 2005, Podder et al.,
2006, Raekiansyah et al., 2005, Rodriguez-Roche et al., 2005, Usuku et al.,
2001 Uzcategui et al., 2003, Wittke et al., 2002, Zhang et al., 2005) ou regiões
específicas (Messer et al., 2003), mas a compreensão da dispersão global e da
história evolucionária dos distintos genótipos de DENV-3 ainda é incompleta
Estudos revelam que o genótipo III foi o mais propagado de todos os
genótipos de DENV e a maioria das amostras encontradas na Ásia, sul da
África e Américas. As sequências mais antigas do genótipo III nas Américas
foram identificadas no Panamá e em Nicarágua em 1994 (CDC, 1995, Guzman
et al., 1996), mas em estudos realizados por Araújo et al., (2008), sugeriu que o
genótipo III estivesse introduzido nas Américas através do México onde as
primeiras amostras de genótipo III foram identificadas em 1995 (Briseno-García
et al., 1996). Em todo caso, os vírus de genótipo III espalharam rápidamente
para outros países, usando diversas rotas independentes na América Central e
América do Sul. (Nogueira et al., 2001, Usuku et al., 2001, Rigau-Pérez et al.,
2002, Peyrefitte et al., 2003, Uzcategui et al., 2003).
Um novo genótipo DENV-3 tem sido relatado circulante no Brasil e
na Colômbia, sendo classificado recentemente como genótipo I por
Figueiredo et al., (2008) e por Usme-Ciro et al., (2008), mas como
genótipo V por Nogueira et al., (2008). Porém estudos realizados
recentemente confirmam a existência de dois genótipos distintos (GI e
GV) para o DENV-3 no Brasil (Araújo et al., 2009), e ainda alertam para a
identificação do genótipo V em amostras com DF/DHF na América do Sul
entre 2002-2004, pois este foi considerado uma linhagem extinta com
apenas três cepas (Filipinas/1956, no Japão/1973 e na China/1980)
encontradas mundialmente antes da identificação do genótipo V na
América do Sul. No entanto, outros os estudos realizados por Araújo et
al., (2009) em amostras do estado do Pará revelaram uma maior
similaridade dos vírus encontrados naquela região com as amostras
isoladas nas Filipinas, porém, não conseguiram definir qual era a origem
das cepas do genótipo V isoladas e o porquê das cepas brasileiras de
GV isoladas durante o ano 2000 indicarem uma similaridade mais
elevada ao isolado das Filipinas/1956 do que as cepas asiáticas do GV
isoladas durante o período de 1973 e 1980. Contudo, o genótipo V do
DENV-3 do nosso estudo mostrou uma maior similaridade com vírus
isolados na China.
Portanto, mais sequências do DENV-3 GV do Brasil e de outras
partes na América do Sul devem ser analisadas para responder a estas
questões. Pois uma maior vigilância, uma classificação genética exata
dos vírus DENV-3 e os estudos moleculares de epidemiologia são
importantes para fornecer uma compreensão adequada das infecções
causadas por DENV-3 GV na América do Sul.
Este estudo mostrou que em 2006 ocorreu a co-circulação dos DENV-2
e DENV-3. Estudos realizados em Karach no Paquistão mostraram que a cocirculação de DENV-2 e DENV-3 foram os responsáveis pela manifestação
mais severa de FHD, eles sugeriram que a entrada de um novo genótipo do
DENV-3 GIII, pode ser um dos fatores responsáveis para a manifestação em
2004 naquela região (Dash et al., 2006). E no caso do DENV-2 genótipo
Américo/Asiático, estudos revelaram que cepas asiáticas encontradas
nas Américas estavam associadas com uma maior incidência de FHD e
SCD (Rico-Hesse et al., 1997). Embora, não é nosso objetivo avaliar o perfil
clinico para estes casos, torna-se necessário relatar os fatores que podem
levar ao aumento da incidência de casos DHF/SCD.
A crescente propagação e co-circulação global de diferentes sorotipos
do DENV, junto com características naturais, estão sujeita a erros da RNA
polymerase conduzindo ao aumento da diversidade genética destes vírus e a
evolução de novos genótipos dentro de cada sorotipo (AbuBakar et al., 2002,
Bennett et al., 2006, Foster et al., 2003, Holmes and Burch, 2000, Klungthong,
et al., 2004, Salda et al., 2005, Uzcategui et al., 2001, 2003).
Sendo assim, a filogenia é uma ferramenta fundamental, que além de
estimar o passado evolutivo e a origem, fornece informações importantes sobre
a dispersão do vírus, sendo este tipo de informação de relevante importância
para ser usada, e alertar as autoridades de uma potencial epidemia,
mobilizando a implementação de recursos apropriados para a prevenção e
controle desta doença (Miagostovich et al., 2003), assim como identificar a
entrada de um novo genótipo presente na epidemia que é talvez um dos
fatores que conduzem a severas manifestações do FHD.
6- CONCLUSÕES
6- Conclusões
Diante dos resultados apresentados neste estudo pode-se concluir que:
•
A RT-PCR seguida da Hemi-nested-PCR utilizando primers específicos
para o diagnóstico molecular do DENV identificou os DENV-2 e DENV-3
em Rondônia;
•
A confirmação do DENV-2 ocorreu através dos primers DEN2-S/DENV2C específicos para o sorotipo 2 do vírus dengue.
•
Nas sequências obtidas ratificaram os sorotipos 2 e 3 do dengue,
quando comparadas as sequências publicadas no GenBank;
•
A origem geográfica e os genótipos dos vírus dengue do estado de
Rondônia são: DENV-2 (genótipo Américo/Asiático) no Sul das Américas
e DENV-3 (genótipos III e V) no Sul das Américas e Leste da Ásia,
•
O estudo filogenético provê uma evidência da circulação dos vírus
dengue dentro do estado de Rondônia, vindo de outras áreas do Brasil
ou até mesmo de outros países.
7- REFERÊNCIAS
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http://www1.qiagen.com/literature/images/pDrive_cloning_vector.gif em 07-07-09
.
8- ANEXO
8.1. Anexo I
QUETIONÁRIO PARA PESQUISA DE DENGUE
Paciente nº:
Nome:
Idade:
Procedência:
Sexo:
Telefone:
Endereço:
Ponto de Referência:
Faz uso de algum medicamento.
( ) Sim
( ) Não
Qual?
Tem febre?
( ) Sim Qual temperatura?
( ) Não
Há quanto tempo demonstra esses sintomas?
( ) 1 a 4 dias
( ) 5 a 7 dias
( ) 8 a 15 dias
( ) mais de 15 dias
Quais os sintomas?
(
(
(
(
(
(
(
) Cefaléia
) Dor ocular
) Mialgia
) Artralgia
) Calafrio
) Prurido
) Dor abdominal
(
(
(
(
(
(
) Gengivorrágia
) Epistaxe
) Vômitos
) Diarréia
) Exantema
) Náuses
Qual o último episódio de Malária?
( ) abaixo de 1 mês ( ) entre 1 a 3 meses ( ) acima de 6 meses
Qual? ( ) P. falciparum ( ) P. vivax
( ) P. malarie