Plano de Trabalho O presente trabalho faz parte de um grande

Plano de Trabalho
O presente trabalho faz parte de um grande projeto intitulado Araucaria angustifolia:
era uma vez...conservação genética de suas populações em Minas Gerais, processo
n.: 480569/2011-8. O pós-doutorando desenvolverá experimentos com a espécie
Araucaria angustifolia no intuito de agregar valores sobre o papel do estudo da
diversidade genética de populações de plantas visando garantir a conservação de
espécies arbóreas e o manejo de fragmentos florestais. Serão realizados trabalhos de
filogeografia, genética de populações e ecologia da paisagem em populações de
Araucaria angustifolia provenientes de diferentes áreas do estado de Minas Gerais,
Brasil.
Título
“Araucaria angustifolia: era uma vez...conservação genética de suas populações em
Minas Gerais”
Objetivo geral
O projeto visa a conservação ex situ de populações de Araucaria angustifolia do
estado de Minas gerais em forma de teste de procedências. Pretende-se investigar a
sua filogeografia, a diversidade e estrutura genética destas populações que poderão
ser conservadas ex situ.
Objetivos específicos
 Determinar quais os fatores evolutivos (seleção natural, deriva genética ou
imigração) tem maior efeito na formação da estrutura genética de populações de A.
angustifolia no seu limite norte de distribuição natural;
 Estudar a variação genética de diferentes populações de ocorrência no limite
norte de distribuição da espécie estado de Minas Gerais por caracteres quantitativos e
marcadores moleculares;
 Realizar a conservação ex situ dos recursos genéticos de populações de A.
angustifolia da região norte de distribuição da espécie (estado de Minas Gerais) para
as futuras gerações;
 Formação de uma população base de A. angustifolia para utilização em
programas de melhoramento genético da espécie para a região sul do estado de
Minas Gerais.
Hipóteses
i. Haplótipos filogeneticamente relacionados estão geograficamente próximos uns com
os outros, indicando um padrão antigo de fluxo gênico restrito?
ii. A habilidade de dispersão determina a estrutura filogeográfica?
iii. Devido a ampla e restrita distribuição da espécie, a descontinuidade genética define
adequadamente as áreas prioritárias para o seu manejo e a sua conservação?
iv. Fatores naturais, antrópicos e ecológicos devem refletir nos níveis de diversidade
genética e na estruturação dos genótipos em macro-escala?
Espécie
Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. (Araucária) é uma conífera dióica,
polinizada pelo vento e de grande valor econômico para a produção de madeira de
alta qualidade e pinhões para alimentação humana e, valor ecológico, por servir de
alimento para diversas espécies de animais. A espécie é endêmica do Brasil, exceto
para umas pequenas populações ocorrentes no noroeste da Argentina (Província de
Missiones) e leste do Paraguai. Sua distribuição geográfica encontra-se entre as
latitudes 19°15' S (Conselheiro Pena-MG, no alto do Rio Doce) a 31°30' S (CanguçuRS) e entre as longitudes 41°30 W até 54°30 L, entre 500 a 2.300 m de altitude,
preferencialmente entre 500 a 1.500 m. Seu habitat é a Floresta Ombrófila Mista
(Floresta de Araucária), nas formações Aluvial (galeria), Submontana, Montana e AltoMontana. Nesses ambientes ocorre com alta densidade de indivíduos, que pode variar
de cinco a mais de 200 indivíduos reprodutivos por hectare. A espécie também é
encontrada em áreas de tensão da Floresta Estacional Semidecidual e Floresta
ombrófila Densa (Carvalho, 1994).
Sua área original de ocorrência era de cerca de 200 mil Km2, de formato
irregular, cujos limites se estabeleciam pela Serra Geral e Serra do Mar, a leste, e pelo
rio Paraná, a oeste. Segundo Guerra et al. (2002) e Koch & Corrêa (2002), estimativas
recentes indicam que a espécie cobria principalmente os estados do Paraná (40% de
sua superfície), Santa Catarina (31%) e Rio Grande do Sul (25%) e como manchas
esparsas no sul de São Paulo (3%), internando-se até o sul de Minas Gerais (1%) e
Rio de Janeiro, em áreas de altitudes elevadas (1%).
A espécie tem diversas utilidades, podendo ser utilizada como madeira serrada
e roliça, geração de energia, produção de resina, celulose e papel. Suas sementes
servem para alimentação humana e animal. O reflorestamento ambiental com A.
angustifolia é recomendado, visto seus frutos servirem de alimento para inúmeros
animais silvestres (Carvalho, 1994).
Atividades a serem desenvolvidas:
Extração do nDNA e do cpDNA
A extração do nDNA e cpDNA para a espécie A. angustifolia será otimizada
com base no protocolo CTAB, descrito por Doyle & Doyle (1987) podendo ser
modificado para solucionar eventuais problemas. Após a extração, o DNA estoque
será armazenado a -20°C e o DNA diluído a ser utilizado serão mantidos em geladeira.
Seleção de primers e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Para a amplificação do cpDNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
serão testados pares de primers universais descritos por Demesure et al. (1995),
Dumolin-Lapegue et al. (1997) e Taberlet et al. (1991), para amplificação das
sequências específicas do cpDNA. Após a quantificação e diluição do DNA, as
reações de amplificação serão conduzidas em termociclador GeneAmp PCR System
9700. A amplificação será realizada seguindo o programa descrito em Grivet e Petit
(2002): 4’ a 94°C, seguido de 30 ciclos com 45” de desnaturação a 94°C, 45” de
anelamento a 47 - 62°C (dependendo do par de primer), 1 a 4’ de extensão a 72°C
(dependendo do tamanho do fragmento a ser amplificado) e 10’ de extensão final a
72°C.
O produto da PCR será digerido por várias enzimas de restrição, seguindo as
informações de temperatura e tempo de digestão requerida. Serão utilizadas várias
combinações de primer-enzima para obter o polimorfismo. Os fragmentos de restrição
serão separados por eletroforese em géis de agarose 1%, utilizando o tampão de
corrida TBE 1X. A voltagem aplicada será de 50 V durante 140’. Após a corrida
eletroforética, os géis serão corados com brometo de etídio à concentração de 0,5
μL/mL, visualizados em luz ultravioleta e fotografados.
Marcadores ISSR
As reações serão preparadas em microplacas para PCR (PCR-96-Axygen
Scientific). Às amostras de DNA serão acrescentadas 10μl de mix de reação contendo:
1,2 μl de tampão PCR 10X (constituído de 500 mM de Tris-HCl pH 8,0; 200 mM de
KCl; 2,5 mg/mL de BSA; 200 mM de Tartazine e 1% de Ficol), 1,04 μl de dNTP +
MgCl2 (dNTP a 2,5 mM; MgCl2 a 25 mM), 0,96 μl de diluente da enzima Taq
polimerase, 0,3 μl de Taq polimerase (5 u/μl) e 2 μl de primer (2 μM) e completado o
volume final com água ultrapura. Os primers ISSR a serem utilizados são
apresentados no Anexo 1.
Os ciclos de amplificação serão constituídos de uma etapa de iniciação de 4
minutos a 96oC, seguidos por uma etapa de desnaturação a 94oC por 1 minuto, uma
etapa de ligação do primer ISSR ao DNA molde (pareamento) a 47oC por 2 minutos, e
uma etapa de extensão a 72oC, por 1 minuto. Depois de 37 ciclos se efetuará uma
última etapa de extensão a 72oC, por 10 minutos. Os produtos da amplificação serão
separados em gel de agarose ou acrilamida e 1X TBE (Tris-Borato 90 mM, EDTA 1
mM, pH 8,0). A partir da leitura cuidadosa das fotografias dos géis, serão considerados
apenas os fragmentos robustos e inequívocos, sendo descartados aqueles com fraca
intensidade ou baixa definição. Assim, os indivíduos serão genotipados quanto à
presença (1) e ausência (0) de fragmentos, gerando uma matriz binária
Análise dos dados
A diversidade de haplótipos serão avaliados considerando todos os indivíduos
quanto aos haplótipos de cpDNA, definidos pela combinação das variantes de cada
fragmento de restrição. A diversidade de haplótipos dentro das populações (HS) e a
total (HT) serão estimadas conforme Pons & Petit (1995), usando o programa
HAPLODIV. A contribuição de cada população para a diversidade genética total (CT) e
para a riqueza alélica total (CTR) será calculada de acordo com Petit et al. (1998), com
o uso do programa CONTRIB (Wu et al., 2006).
Duas medidas de diferenciação genética entre populações serão usadas: GST
e NST. O GST é um parâmetro comumente usado para estimar a proporção da
diversidade genética entre populações (Nei, 1973). O NST é semelhante ao GST, mas
considera a similaridade entre as variantes moleculares ou haplótipos (Pons & Petit,
1996). A comparação entre os dois parâmetros permite fazer algumas conclusões
sobre a dinâmica histórica da população. Por exemplo, se o valor de NST>GST, as
variantes relatadas filogeneticamente são encontradas nas mesmas populações e com
maior frequência do que o esperado pela casualidade. Sendo, assim o NST integra
uma dimensão filogeográfica, ao contrário de GST. Os valores desses coeficientes
variam entre 0 e 1. As duas medidas serão comparadas estatisticamente pelo teste U
(Mann-Whitney) (Pons & Petit, 1996).
O número de mutações entre os pares de haplótipos será obtido no programa
MEGA (Kumar et al., 2004) e, com base nelas, os haplótipos serão agrupados pelo
método minimum spanning network (MSN) (Excoffier & Smouse, 1994), usando
MINSPNET (http://lgb.unige.ch/software). Adicionalmente, o método nested clade
analysis (NCA) (Templeton et al., 1987) será utilizado para inferir sobre as causas
históricas que conduziram à variação geográfica.
Serão adotadas três metodologias para a estruturação da variabilidade
genética. A primeira será a análise de variância de frequências alélicas, conforme
descrita em Weir (1996). A segunda metodologia utilizada será a análise de variância
molecular (AMOVA) (Excoffier et al. 1992). A terceira metodologia para estimar a
divergência entre as populações será baseada em estimadores obtidos pela estatística
Bayesiana (Holsinger et al. 2002), com auxilio do programa HICKORY v. 1.0
(Holsinger & Lewis, 2003).
A divergência genética entre as populações será avaliada com base na matriz
de distância genética obtida pela AMOVA. A matriz de distâncias genéticas será
analisada, inicialmente, a partir de uma análise de agrupamento tipo UPGMA
(unweighted pair-group method by arithmetic averages). A representatividade deste
dendrograma será testada por meio da correlação entre as distâncias genéticas e as
distâncias entre as populações no dendrograma (correlação cofenética). As distâncias
genéticas também serão analisadas por uma técnica de ordenação que visa
representar graficamente a dissimilaridade entre as populações, o escalonamento
multidimensional não-métrico (non-metric multidimensional scaling). Para a análise dos
padrões de variação espacial em um contexto multivariado.
As correlações matriciais e o teste de Mantel serão também utilizados para
avaliar o padrão multivariado de estrutura espacial entre as populações. Serão
calculados coeficientes de correlação matricial entre as distâncias genéticas e
matrizes de conectividade espacial, com valor 1,0 indicando pares de populações
“ligadas”, se a distância geográfica entre elas se encontra em cada uma das classes
de distância previamente definidas. Essas classes de distância geográfica serão
estabelecidas de modo a manter o mesmo número de conexões ente populações.
Assim, é possível relacionar o coeficiente de correlação matricial, cuja significância
será estabelecida pelo teste de Mantel, com o aumento das distâncias geográficas,
gerando assim um correlograma multivariado (Sokal et al., 1986).
A análise da descontinuidade genética será baseado nas distâncias genéticas
no intuito de acessar a descontinuidade dos dados genéticos no espaço geográfico
(Manel et al., 2003; Telles et al., 2003). Para esta análise, as populações serão
localizadas em um mapa de acordo com suas posições geográficas relativas e o
método de triangulação de Delaunay será utilizado para conectá-las, resultando em
uma rede que conecta todas as populações. A rede de Delaunay é formada
conectando-se as em conjuntos de três populações (A, B e C), sendo que a ligação
entre elas só ocorre se e somente se um círculo passando sobre elas não incluir
nenhuma outra população (Legendre & Legendre, 1998).
A partir desta rede de Delaunay e das distâncias genéticas, a descontinuidades
dos dados multivariados será obtida pela divisão das distâncias genéticas associadas
a cada ligação entre as populações ABC na rede de Delaunay pela distância
geográfica (Legendre & Legendre, 1998).
A Definição de unidades operacionais para a conservação da variabilidade
genética será conforme proposto por Diniz-Filho & Telles (2002), que com base no
correlograma de Mantel, indicariam quantas unidades operacionais seriam
necessárias para se conservar a variabilidade genética de A. angustifolia em diversas
localidades de Minas Gerais. A eficiência desse conjunto de populações, no sentido de
representar efetivamente a variabilidade genética, será avaliada pela proporção de
unidades operacionais que contém pelo menos um indivíduo com bandas para todos
os locos ISSR.
Resultados esperados
 Conservação ex situ da variação genética de populações de A. angustifolia de
ocorrência no limite norte da espécie;
 Disponibilidade fácil de material genético (sementes e propágulos) de A.
angustifolia, para utilização atual e futura em programas de melhoramento,
recuperação de áreas alteradas e degradas e reflorestamentos comerciais;
 Contribuir para o entendimento da estrutura genética de espécies arbóreas
brasileiras.
Calendário de atividades
Atividades
Preparo e produção de progênie das populações
Extração de DNA
Amplificação de DNA
Geração de perfis
Análises dos géis
Análises dos dados
Relatório Final
Mês
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2
3
4
5
6
7
8
9
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12